KR102061823B1 - 산-가용화된 구리-암모늄 착체 및 구리-아연-암모늄 착체, 조성물, 제제, 방법 및 용도 - Google Patents

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Abstract

병원성 또는 환경성 세균, 진균, 바이러스 등과 같은 미생물에 대하여 효과적인 산-가용화된 구리 암모늄 또는 구리-아연 암모늄 착체를 함유하는 항균 조성물이 개시된다. 상기 항균 조성물은 미생물 또는 미생물 감염을 치료하기 위한 약제의 제조에 사용될 수 있으며, 크림, 비누, 세척액, 스프레이, 드레싱, 클렌저, 화장품, 국소 약물 제품 또는 다른 항균 제품을 생성하는 담체를 포함할 수 있다.

Description

산-가용화된 구리-암모늄 착체 및 구리-아연-암모늄 착체, 조성물, 제제, 방법 및 용도{ACID-SOLUBILIZED COPPER-AMMONIUM COMPLEXES AND COPPER-ZINC-AMMONIUM COMPLEXES, COMPOSITIONS, PERPARATIONS, METHODS, AND USES}
본 발명은 일반적으로 항균 활성을 갖는 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 산-가용화된 구리-암모늄 또는 산-가용화된 구리-아연 암모늄 착체를 활성 성분으로 함유하는 조성물에 관한 것이다.
구리 금속 및 구리 염의 항균 효과는 고대 이래로 알려져 있다. 항균제로서 구리의 역할은 흉부외상 및 음용수를 살균하는데 구리의 응용을 기재한 기원전 2600 년경에 기록된 이집트 의학 문헌인 스미스 파피루스에 최초로 기재되어 있었다.
그리스인, 로마인 및 아즈텍인들은 구리 금속 또는 그 화합물을 만성 감염의 치료 및 일반 위생용으로 사용하였다. 예를 들면, 히포크라테스 전집에, 구리는 정맥류와 연관된 하퇴 궤양의 치료에 권장된다. 신선창의 감염을 방지하기 위하여, 그리스인들은 상처에 산화구리 및 황산구리로 구성된 건조 분말을 흩뿌렸다. 그 당시 다른 소독 상처 치료는 꿀과 붉은 산화구리의 비등 혼합물이었다. 그리스인들은 이 금속이 구리에 대한 라틴명인 큐프럼(cuprum)이 유래한 키프로스(Kpros)(사이프러스(Cyprus)) 섬에서 용이하게 이용할 수 있기 때문에 구리에 대한 접근이 쉬웠다.
고대 인도 아유르베타(ayurvedic) 문헌인 차라카 삼히타(Charaka Samhita)(기원전 300년)도 음용수의 정제에서 구리의 역할을 포함하여, 구리가 어떻게 치명적인 세균을 살균하는 지에 대하여 언급한다. 플리니(기원후 23 내지 79년)는 구리를 포함하는 많은 요법들을 기재하였는데, 예를 들면, 검정 산화구리를 꿀과 함께 처방하여 회충을 제거하였다.
더 현대에 들어와서는, 면역체계 내에서 구리의 역할을 최초로 관찰한 것은 1832, 1849 및 1852 년에 파리에서 콜레라가 유행하는 동안에, 구리 작업자들은 이 질환에 면역이 있었다는 보고가 있던 1867 년에 발표되었다. 또한, 구리가 결핍된 동물은 살모넬라균(Salmonella) 및 리스테리아균(Listeria)과 같은 병원성 미생물에 대한 감수성이 증가한 것으로 나타났다.
황산구리는 19 세기에 발명된 살균제인 “보르도액(Bordeaux mixture)”의 핵심 활성 성분이며, 수많은 다른 구리계 농약이 사용되는 바와 같이, 오늘날 농업에서 여전히 사용된다.
세균, 진균 및 바이러스와 같은 병원성 미생물은 하기 비한정 예에 의해 도시된 바와 같이 다세포 생물에서 많은 질환들의 원인이 된다.
약학 분야에서, 세균 감염은 여드름(프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)) 및 습진(스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)과 같은 피부 질환에 관련되어 있다. 메티실린 내성인 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus: MRSA), 아시네토박터속(Acinetobacter sp.), 클레브시엘라 프네우모니아(Klebsiella pneumonia)(NDM-1 효소 유전자가 최초로 동정됨) 및 레지오넬라병의 원인인 레지오넬라 프네우모필라(Legionella pneumophila)에 의한 의료 관련 감염(HAIs). 대장균(E. coli)은 요로감염의 공통된 원인이다. 이러한 HAI와 다른 HAI들은 매년 미국에서 거의 10만명의 사망 원인이 되는 것으로 추정된다. 병원성 대장균 O157:H7은 오염된 식품을 통해 섭취되는 경우 위장염을 유발한다. 진균에 의하여 유발된 질환은 무좀(트리코피톤 속(Tricophyton sp .)), 비듬(말라세지아 글로보사(Malassezia globosa)) 및 아구창(캔디다 알비칸스(Candida albicans))와 같이 상대적으로 약하지만, 아스페르길루스 후미가투스(Aspergillus fumigatus ; A. fumigatus ) 및 캔디다 알비칸스(Candida albicans ; C. albicans)와 같은 진균 및 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans)와 같은 효모는 면역 약화 환자들에게서 생명을 위협하는 감염을 유발할 수 있다. 바이러스는 감기(라이노바이러스) 및 독감(독감 바이러스 A, B 및 C)와 같은 일반 질환 및 단순포진(헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 내지 광견병 및 에볼라와 같은 더 심각한 바이러스성 질환에 대한 원인이기도 하다.
욕창 및 당뇨병 다리 궤양과 같은 피부 상처의 세균 감염은 상태를 악화시킬 수 있고, 구리염 및 구리계 조성물은 이러한 항균 효과 및 성장 인자 생성을 향상시킴으로써 상처 치유를 자극하는 이들의 능력에 의해 이러한 질환에 대하여 효과적인 것을 보였다.
화장품 분야에서, 구리 또는 구리-아연 조성물은 예를 들면, 약한 것 내지 중간 정도의 일광화상 및 약한 화상의 영향을 완화시키며, 또한 곤충 물림에 의한 가려움 및 염증을 감소시키고 주름살의 발생을 감소시키는데 효과적인 것을 보였다.
농업 분야에서, 진균 질환은 현재 미국 서부의 참나무를 죽이고 있으며(파이토프토라 라모룸(Phytophthora ramorum)) 유럽에서는 물푸레 나무를 죽이고 있다(칼라라 프락시네아(Chalara fraxinea)). 포도 덩굴, 과일 및 식물과 곡물 작물을 맺는 채소의 진균 및 세균 질환은 세계 식량 생산에 위협이 된다.
병원 및 일반적인 환경에서 점점 더 많은 수의 병원성 미생물의 약물 내성 균주의 존재는 하기 예들에 도시된 바와 같이 심각한 우려가 되고 있다. MRSA, 반코마이신-내성 스타필로코쿠스 아우레우스(VRSA), 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 대장균 및 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)와 같은 병원성 세균의 항생제-내성 및 다중-약물 내성 균주는 이제 흔한 일이다. 케토코나졸-내성 C. albicans 및 A. fumigatus와 같은 병원성 진균의 내성 균주는 특히 면역 약화 환자들에게서 점점 더 문제가 되고 있다. 살진균제-내성 식물 병원성 진균은 끊임없이 진화하며 이들의 처리를 위한 새로운 항-진균제를 필요로 한다. 예를 들면, 감자 마름병의 원인인 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans)는 20 세기 말에 메탈락실(Metalaxyl)에 대단히 내성이 생겼다. 병원성 바이러스는 항-바이러스 약물에 대한 내성을 유사하게 발전시키고 있는데, 지난 5 년 동안에 인산오셀타미비르(타미플루(TAMIFLU®), 미국, 캘리포니아 주 샌프란시스코 소재 Genetch의 등록 상표)에 대한 H1N1 “돼지 독감” 인플루엔자 A의 내성의 발전은 최근의 예이다.
본 발명에 따르면, 물에 구리염을 포함하는 용액; 구리염 용액에 첨가되어 비가용성 구리-암모늄 착체를 생성하는 염기성 암모늄염; 및 구리염 용액에 첨가되어 구리-암모늄 착체를 가용화시키고 그렇게 형성된 맑은 청색 산-가용화된 구리-암모늄 용액의 pH를 조절하는 적어도 하나의 수용성 산을 포함하는 항균 조성물이 제공된다.
상기 단락은 도입으로 제공되었으며, 본 명세서, 청구의 범위 및 첨부한 도면에 기재된 바와 같이 발명의 범위를 제한하는 의도는 아니다.
본 발명은 유사한 숫자는 유사한 요소를 가리키는 하기 도면을 참조하여 기재될 것이다:
도 1은 세균성 균주 S1(S. aureus)의 성장에 미치는 황산구리 및 조성물 Cu#1의 효과를 묘사하는 그래프이다;
도 2는 세균성 균주 S1(S. aureus)의 성장에 미치는 황산아연 단독 및 조성물 Cu#1과 조합의 효과를 묘사하는 그래프이다;
도 3은 S1(S. aureus)의 성장에 미치는 겔, 황산아연(100 ㎍/ml) 단독 및 조성물 Cu#9 또는 Cu#10(200 ㎍/ml) 단독 및 황산아연과 조합의 효과를 묘사하는 막대 차트이다;
도 4는 황산구리 및 조성물 Cu#9, Cu#10 및 Cu-Zn#1: 겔(Gel) + Cu#9, Gel + Cu-Zn#1로 24 시간 배양 후 인간 피부 세포 생존율의 그래프이다: 그리고
도 5는 겔 + Cu#9, 겔 + Cu-Zn#1 및 활성 화합물인 살리실산과 과산화벤조일을 함유하는 2 개의 CLEARASIL®(영국, 버크셔 소재의 레킷 벤키저(Reckitt Benckiser LLC의 상표) 항-여드름 크림 제품으로 24 시간 배양 후 인간 피부 세포 생존율의 그래프이다.
본 발명은 바람직한 일 실시형태와 연계하여 기재될 것이지만, 발명을 기재된 실시형태로 한정할 의도는 없다는 것을 이해할 것이다. 이에 반하여, 의도는 이 명세서, 청구의 범위 및 첨부된 도면에 의하여 정의된 바와 같이 발명의 취지 및 범위 내에 포함될 수 있는 바와 같은 모든 대안, 변형 및 균등물을 포함하는 것이다.
본 발명은 실시예에 의해 기재될 것이며 한정되지 않는다. 본원에 기재된 발명에 대한 변형, 개선 및 첨가는 이 명세서를 숙독하고 첨부된 도면을 고찰한 이후에 결정될 수 있으며; 그러한 변형, 개선 및 첨가는 본 발명의 취지 및 광 범위 및 본원에 기재되거나 상정된 이의 다양한 실시형태들에 포함되는 것으로 한다.
발명자는 본원에 기재된 산-가용화된 구리-암모늄 및 구리-아연-암모늄 착체들은 특정한 세균의 경우에 항생제-내성이 있거나 그외 특정한 세균 및 진균 균주의 경우에 처리하거나 제어하기 어려운 특이적인 병원성 미생물과 싸우는데 유용한 것을 놀랍게도 발견하게 되었다. 또한, 발명자는 이 산-가용화된 구리-암모늄 착체는 처리하기 어려운 세균, 예를 들면, 유사한 농도에서의 배양에서 인간 피부 세포에 대하여 독성이 동시에 부족한 MRSA 및 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)에 대하여 매우 효과적일 수 있다는 것을 놀랍게도 발견하게 되었다.
환경, 특히 수성 환경에서 식물 및 동물에 의하여 안전하게 섭취되거나(성인에서 매일 6 밀리그램 이하) 견딜 수 있는 구리의 상대적으로 낮은 양으로 인하여, 본원에 기재된 산-가용화된 구리-알루미늄 또는 구리-아연-암모늄 조성물의 도포는 가정 또는 병원과 같은 환경에서 예를 들면, 동물 및 인간의 피부 또는 점막상, 식물의 잎상, 또는 예를 들면, 표면 상에서 주로 국소 사용을 위한 것이다.
국소 사용에 대한 예외는 예를 들면, (i) 산-가용화된 구리-암모늄 또는 산-가용화된 구리-아연-암모늄 조성물을 사용하여 미생물을 제거하거나 살균함으로써 휴대할 수 있게 될 수 있는 하나 이상의 미생물에 의하여 오염된 물의 처리 또는 (ii) 본원에 기재된 산-가용화된 구리 또는 구리-아연 조성물을 하나 이상 첨가함으로써 수영장 또는 온수 욕조와 같은 구조물 내에서 물을 오염시키는 미소조류 또는 세균의 제거 또는 살균에 의하여 물을 사용 적합하도록 하는 것을 포함한다.
본원에 기재된 산-가용화된 구리-암모늄 착체 조성물은 예를 들면, MRSA 감염 또는 C. albicans와 같은 진균 감염을 방지 또는 치료하기 위하여 환자의 피부에 국소적으로 도포될 수 있다. 이들은 예들 들면, 백분병과 같은 진균 감염이 있는 식물의 잎에 살포함으로써 국소적으로 도포될 수도 있다. 일단 표면상에, 구리 이온 착체의 소독 특성은 상당한 시간 동안 유효한 것으로 남을 수 있다.
산-가용화된 구리-암모늄 착체는 예를 들면, 분사하거나 천으로 도포하여 표면에 도포될 수도 있고, 예상치 않게 다양한 상이한 병원성 미생물에 대하여 동시에 효과가 있을 수 있으며, 그러한 미생물과의 감염 및 재-감염에 대하여 보호를 제공할 수 있다. 일단 표면상에, 구리 이온 착체의 소독 특성은 상당한 시간 동안 유효한 것으로 남을 수 있다.
본 산-가용화된 구리-암모늄 착체 및 이와 함께 함침된 기질은 종래 약물 및/또는 종래 소독 레짐(regimes)으로는 지금까지 치료하기 어려운 병원성 미생물의 성장의 매우 효과적인 억제를 제공할 수 있다. 병원성 미생물의 성장의 억제는 놀랍게도 인간 피부 세포에 독성이 없는 농도에서 일 수 있다.
산-가용화된 구리-암모늄 조성물은 가정, 병원, 공장, 차량 등에서 피부 및 점막 표면, 식물의 잎 및 작업 표면에 도포를 위한 것일 수 있는 크림, 겔, 분무 용액, 관류 용액 및 함침 드레싱과 같은 국소 제형으로 제작될 수 있다.
산-가용화된 구리-암모늄 및 구리-아연-암모늄 조성물은 하기에 약술된 일반적인 절차에 따라 통상적으로 제조된다. 본 발명의 이 개시된 실시형태들은 특정한 바람직한 조성물을 예시한다; 그러나, 이 실시예들은 발명의 범위를 한정하는 의도는 아니다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 본 발명의 취지 및 광범위를 이탈하지 않으면서 다양한 변형 및 개질을 할 수 있다.
하기 실시예는 산-가용화된 구리-암모늄 착체 제형 Cu#3을 제작하기 위한 일반적인 프로토콜을 기재한다. 모든 화학물질들은 영국 디 올드 브릭야드(The old Brickyard), 뉴 로드(New Road), 그릴링햄(Grillingham), 도르셋(Dorset) SP8 4XT 소재 시그마-알드리치 사 또는 영국 웨이드 로드(Wade Road), 바싱스토크(Basingstoke), 햄프셔(Hampshire) RG24 8PW 소재 옥소이드 사(Oxoid Ltd.)로부터 구입하였다.
황산구리 5수화물 16.0 그램을 유리 비이커 내 증류수 80 밀리리터에 첨가하여 자석 교반기 및 교반 막대를 이용하여 격렬히 혼합하여 맑은 푸른 용액을 형성하였다. 탄산 암모늄의 분취량의 첨가 사이에서 가라 앉도록 하는 이산화탄소의 격렬한 전개로 인하여 탄산 암모늄 4.0 그램을 0.5 내지 1 그램 양의 황산구리 용액에 첨가하였다. 황산구리 용액에 상기 탄산 암모늄의 첨가 중에 옅은 청색 비가용성 구리-암모늄 착체가 형성되었으며, 이는 현탁액에서 격렬히 교반되며 유지되었다. 인산(85% 용액) 10 밀리리터는 이산화탄소의 전개 및 구리-암모늄 착체의 가용화와 함께 점진적으로 첨가되었다. 구리-암모늄 착체를 완전히 가용화하고 용액의 pH를 조절하도록 충분한 산을 첨가하여야 한다. 얻어진 맑은 빛나는 청색 용액을 5 분 더 격렬히 교반한 이후에 증류수로 100 밀리리터의 최종 체적까지 제작하였다.
조성물 내의 구리의 성분 농도는 용매상이 증류수 또는 탈이온수로서, 1 내지 10 그램/데시리터, 바람직하게는 3 내지 7 그램/데시리터, 더 바람직하게는 3.5 내지 5 그램/데시리터 정도인 것이 바람직하다.
이 프로토콜을 기반으로 하여 다른 산-가용화된 구리-암모늄 착체 제형의 예는, 하기 표 1을 참조. 표에서, 그램은 글자 g로 약기되며 밀리리터는 글자 ml로 약기된다.
산 가용화된 구리-암모늄 착체 조성물(Cu#)의 실시예
증류수 데시리터 당 첨가된 성분들
조성물 CuSO4.5H20 (NH4)2CO3 산
Cu#1 16.0 g* 2.0 g 5.0 g H3PO4 (85%)
Cu#3 16.0 g 4.0 g 10.0 g H3PO4 (85%)
Cu#3a 16.0 g NH4OH(10% 용액) 3.2 ml 2.0 g H3PO4 (85%)
Cu#9 16.0 g 2.0 g 2.3 ml HCl (~18 M)
Cu#10 16.0 g 2.0 g 1.5 ml 빙초산
Cu#10a 16.0 g NH4OH(10% 용액) 1.6 ml 1.5 ml 빙초산
Cu#11a 16.0 g NH4OH(10% 용액) 1.6 ml 1.5 g 시트르산
Cu#12 16.0 g 1.5 g 1.0 ml H2SO4 (37%)
Cu#13 CuCl2.2H2O 10.7 g* 3.0 g 2 ml H2SO4 (37%)
Cu#16 15.0 g** NH4HCO3 6.0 g 8.0 g H3PO3
Cu#27 15.0 NH4OH(10% 용액) 2.0 ml 2.4 g H3PO3
*표시된 양은 대략 4.0 그램/데시리터 또는 **원소 구리 3.75 그램/데시리터의 스탁 용액을 생성한다.
하기 실시예는 산-가용화된 구리-아연-암모늄 제형 Cu-Zn#10에 대한 일반적인 프로토콜을 기재한다.
황산구리 5수화물 6.0 그램을 유리 비이커 내 증류수 80 밀리리터에 첨가하여 자석 교반기 및 교반 막대를 이용하여 격렬히 혼합하여 맑은 푸른 용액을 형성하였다. 황산아연 7수화물 6.6 그램을 황산 구리 용액에 첨가하였고 용해될 때까지 교반하였다. 수산화암모늄(10% 용액) 2.0 밀리리터를 황산구리/황산아연 용액에 적가하였다. 상기 수산화 암모늄 용액의 황산구리/황산아연 용액으로의 첨가 중에 옅은 청색 비가용성 구리-아연-암모늄 착체가 형성되었으며, 이는 현탁액에서 격렬히 교반되며 유지되었다. 인산 4.0 그램을 대략 0.5 그램 분취량에 점진적으로 첨가하여 구리-아연-암모늄 착체를 가용화하였다. 구리-아연-암모늄 착체를 완전히 가용화하고 용액의 pH를 조절하도록 충분한 산을 첨가하여야 한다. 얻어진 맑은 옅은 청색 용액을 5 분 더 격렬히 교반한 이후에 증류수로 100 밀리리터의 최종 체적까지 제작하였다.
조성물 내의 구리 및 아연의 성분 농도는 용매상이 증류수 또는 탈이온수로서, 1:1 정도인 것이 바람직하다.
이 프로토콜을 기반으로 다른 산-가용화된 구리-아연-암모늄 제형에 대하여는 표 2 참조. 표에서, 그램은 글자 g로 약기되며 밀리리터는 글자 ml로 약기된다.
산-가용화된 구리-아연 조성물(Cu-Zn#)의 실시예
증류수 데시리터 당 첨가된 성분들
조성물 CuSO4.5H20 ZnSO4.7H2O (NH4)2CO3 산
Cu-Zn#1 6.0 g* 6.6 g* 2.0 g 3.0 ml HCl (~18 M)
Cu-Zn#2 6.0 g 2.2 g 2.0 g 3.0 ml HCl (~18 M)
Cu-Zn#3 6.0 g 1.1 g 2.0 g 3.0 ml HCl (~18 M)
Cu-Zn#4 2.0 g 6.6 g 2.0 g 3.0 ml HCl (~18 M)
Cu-Zn#5 1.0 g 6.6 g 2.0 g 3.0 ml HCl (~18 M)
Cu-Zn#7 6.0 g 6.6 g 2.0 g 5.0 g H3PO3
Cu-Zn#10 6.0 g 6.6 g NH4OH(10% 용액) 2.0 ml 5.0 g H3PO3
*표시된 양은 원소 구리 및 원소 아연 양쪽 모두 대략 1.5 그램/데시리터의 스탁 용액을 생성한다.
본 발명의 알로에 베라-계 겔을 제조하는 방법은 제공된 실시예들과 함께 본원에 기재되어 있다.
실시예 1. 잔탄검 1.0 그램을 60℃ 부근에서 300 밀리리터 붕규산염 유리 비이커 내의 증류수 150 밀리리터 상에 뿌리고 30 초 동안 거품이 나도록 격렬히 혼합하여 잘 섞인 거품이 있는 용액을 형성한다. 알로에 베라 분말 1.0 그램을 잔탄검 용액 상에 뿌리고 다시 30 초 동안 또는 알로에 베라 분말이 용액으로 완전히 용해될 때까지 격렬히 흔든다. 실온의 증류수를 200 밀리리터의 최종 체적으로 첨가한다. 4℃에서 겔을 저장하고 1 달 내에 사용한다. 이 겔을 한천 플레이트 항균 시험에서 구리 및 구리/아연 조성물을 희석하기 위하여 사용하였다. 상기 겔이 화장 목적으로 사용되고/되거나 실온에서 저장하려고 하면, 항균 방부제를 첨가하여야 한다. 이 방부제는 예를 들면, 만델산, 글리세롤, 소르빈산칼륨, 페녹시에탄올, 벤조산나트륨을 포함할 수 있다. 효과적인 조합은 소르빈산칼륨(KS) 및 벤조산나트륨(NaB)이다. KS 및 NaB의 10.0% 중량/체적의 분리된 스탁 용액을 제조하였고, 상기 기재된 잔탄검-알로에 베라 용액에 각 생성물 2.0 밀리리터를 격렬히 혼합하면서 첨가하였고 이후, 실온의 증류수를 200 밀리리터의 최종 체적으로 첨가하였다. 산-가용화된 구리-암모늄 또는 구리-아연-암모늄 착체 조성물을 이 겔에 예를 들면, 1:100 체적/체적으로 희석하였다.
실시예 2. 칭량 비이커 내에서 잔탄검 3.0 그램을 약 1 그램 분취량으로 실온(20℃ 부근)에서 글리세롤 3 그램과 잘 섞인 균질한 페이스트를 형성할 때까지 서서히 혼합하라. 상기 비이커 및 그 내용물을 재 칭량하라. 글리세롤-잔탄검 혼합물 5 그램(혼합물 1 그램은 비이커 내에 잔류하여야 한다)을 60℃ 부근에서 800 밀리리터 붕규산염 유리 비이커 내의 증류수 400 밀리리터에 맑은 거품이 있는 용액이 형성되기까지 격렬히 거품이 나도록 하면서 서서히 첨가하라. 알로에 베라 분말 2.5 그램을 용액 상에 뿌리고, 알로에 베라 분말이 용액에 완전히 용해될 때까지 계속 흔들어라. 항균 방부제(예컨대, 상기 기재된 바와 같이 KS 및 NaB의 10% 스탁 용액 5.0 밀리리터)를 이 단계에서 실온의 증류수를 500 밀리리터의 최종 체적에 첨가하기 전에 흔들면서 첨가할 수 있다.
본 발명이 예시되고, 당업자에 의하여 더 용이하게 이해되며 용이하게 실행될 수 있도록, 이 실시형태들은 이제 비-한정 실시예들에 의해서만 제시될 것이며 첨부된 도면들을 참조하여 설명될 것이다.
실시예 1. 선택된 조성물들의 세균에 미치는 항균 효과를 위한 한천 플레이트 시험
습진 환자의 피부로부터 단리된 스타필로코쿠스 아우레우스 균주(S1)를 트립톤-소야 한천(TSA) 상에 배양하였고, 단독 집락을 37℃의 RPMI-1640 배지 내에서 하룻밤 동안 배양하였다. 상기 S1(S. aureus) 배양물을 신선한 RPMI-1640 배지와 1:10으로 희석하였고, 0.2 밀리리터를 TSA를 함유하는 9 센티미터 페트리 접시 상에 엷게 칠하였고 건조되도록 하였다. 프로피오니박테리움 아크네스 균주 ATCC 11828 (P. acnes)을 아나에로겐 향주머니(AnaeroGen sachet)을 이용하여 혐기성 조건 하의 37℃에서 72 시간 동안 1% 글루코오스(BHI)가 보충된 뇌-심장 조직 주입 액체 배지 내에서 배양하였다. 상기 P. acnes 배양물의 0.2 밀리리터 표본을 BHI 한천을 함유하는 9 센티미터 페트리 접시 상에 엷게 칠하였고 건조되도록 하였다.
시험 대상인 조성물을 증류수로 희석하고 5 마이크로미터를 5 밀리리터 여과지 디스크 상에 놓거나 다양한 농도에서 상기 기재된 (방부제가 없는) 알로에 베라계 겔에 첨가하고 5 밀리리터 방울을 한천 표면 상에 놓았다. 이후, 플레이트들을 (P. acnes를 위한 혐기성 조건 하) 37℃에서 24 시간 동안 배양하였고, 이 때 자를 이용하여 90도 각도에서 억제 지대들(ZoI)을 2회 측정하였고(밀리리터) 평균 직경(D)을 계산하였다. 식을 이용하여 ㎟의 억제 면적을 계산하였다: AoI = π x (D/2)2.
결과:
1. 도 1의 결과들은 TSA 상에서 세균 균주 S1(S. aureus)의 성장에 미치는 겔에 용해된 황산구리 및 조성물 Cu#1의 효과를 비교한다. 800 마이크로그램/밀리리터의 황산구리 및 200 마이크로그램/밀리리터의 조성물 Cu#1은 동일한 AoI(28 ㎟)을 가지기 때문에, Cu#1 조성물은 S1(S. aureus)의 성장을 억제하는데 있어서 황산구리보다 4-배 더 강력하다는 것은 명백하다. 결과들은 산-가용화된 구리-암모늄 착체들의 조성물들이 황산구리 단독보다 놀랍게도 더 항균적이라는 것을 보여준다.
2. 도 2의 결과들은 TSA 상에서 세균 균주 S1(S. aureus)의 성장에 미치는 겔에 용해된 황산아연 단독 및 조성물 Cu#1과의 조합의 효과를 비교한다. 황산아연 단독은 시험된 임의의 농도(50 내지 200 마이크로그램/밀리리터)에서 S1(S. aureus) 의 성장에 미치는 효과를 가지지 않았다. 이에 반하여, 조성물 Cu#1(100 마이크로그램/밀리리터)가 황산아연의 증가하는 농도와 조합되는 경우, S1(S. aureus)의 성장에 미치는 명백한 상승 억제 효과가 있었다. 따라서, 조성물 Cu#1 단독으로는 AoI가 3 ㎟였지만, 50, 100 및 200 마이크로그램/밀리리터의 농도에서 황산아연과 조합되는 경우 각각 13, 20 및 28 ㎟로 증가하였다. 이 결과들은 항균 산-가용화된 구리-암모늄 착체들이 단독으로는 균주 S1(S. aureus)에 대하여 항균 활성을 갖지 않는 황산아연과 상승적으로 작용할 수 있다는 것을 놀랍게도 보여준다. 이 결과들은 산-가용화된 구리-아연-암모늄 착체들이 특정 유기체에 대하여 유리한 항균 활성을 가질수 있다는 것을 제시한다.
3. 도 3은 겔 내에서 두 가지 조성물인 Cu#9 및 Cu#10(200 마이크로그램/밀리리터) 단독 및 겔 내에서 황산아연(100 마이크로그램/밀리리터)와의 조합이 S1(S. aureus)의 성장에 미치는 효과를 보여준다. 결과는 겔 단독 및 겔 내의 황산아연은 S1(S. aureus)의 성장에 미치는 효과를 갖지 않는다는 것을 보여준다. 겔 단독 내의 조성물 Cu#9 및 Cu#10 양쪽 모두는 각각 20 ㎟ 및 33 ㎟의 AoI로 S1(S. aureus)의 성장을 억제하였다. 이에 반하여, 조성물 Cu#9 및 Cu#10은 겔 내의 황산아연과 조합되는 경우 각각 38 ㎟ 및 57 ㎟의 AoI로 S1(S. aureus)의 성장의 증가된 억제를 보여주었다. 이 결과들은 도 2에 도시된 것을 확인하고 연장하는 것으로서, 산-가용화된 구리-암모늄 착체들 및 황산아연 사이에 균주 S1(S. aureus)의 성장에 미치는 명백한 상승적인 억제 효과가 있다는 것을 보여준다.
4. 표 3은 상기 방법 섹션에서 기재된 바와 같이 BHI 한천 상에 P. acnes의 성장에 미치는 황산구리, 5 개의 상이한 산-가용화된 구리-암모늄 착체들 및 하나의 산-가용화된 구리-아연-암모늄 착체의 효과를 보여준다. 상기 산-가용화된 구리-암모늄 착체들의 스탁 용액들 모두는 1:200(체적/체적)으로 희석되었고, 원소 구리의 동일한 농도(200 마이크로그램/밀리리터)의 황산구리 용액도 제조하였다. 조성물 Cu-Zn#1의 스탁 용액(표 2 참조)도 시험을 위해 1:200으로 희석되었다. 모든 희석물들은 증류수 내에서 였다.
BHI 한천 상에서 P. acnes의 성장에 미치는 (표 1 및 2에 기재된) 황산구리 및 다양한 조성물들의 효과. 조성물의 항균 활성과 pH 사이에는 상관관계가 없었다.
조성물 억제 지대(㎜) 스탁 용액의 pH
황산구리 13 3.4
Cu#3 16 1.6
Cu#9 16 2.2
Cu#10 18 4.4
Cu#12 19 2.0
Cu#13 16 1.0
Cu-Zn#1 18 1.5
표 3의 결과들은 산-가용화된 구리-암모늄 착체들 모두가 황산구리 형태의 원소 구리의 당량 농도보다 P. acnes의 성장에 대하여 더 억제적이었다는 것을 보여준다. 비록 시험된 5 개의 Cu# 조성물들에 대한 ZoI들은 유사하였다고 하더라도, 조성물들의 제형은 표 1에 도시된 바와 같이 아주 상이하였다. Cu#3, Cu#9 및 Cu#13은 동일한 ZoI를 가졌지만, 구리-암모늄 착체(각각 인산, 염산 및 황산)를 가용화하는데 사용된 산이 상이하였으며, Cu#13은 황산구리 보다는 염화구리를 포함한다. Cu#12(황산구리 및 황산)는 P. acnes에 대하여 최대 ZoI를 가졌지만, 조성물에 사용된 구리염에 대해서만 Cu#13과 상이하다(표 1 참조).
구리-암모늄 및 구리-아연-암모늄 조성물들은 산들과 가용화되기 때문에 조성물들의 산도는 황산구리와 비교했을 때 이들이 더 높은 항균 활성에 대한 원인이 된다는 것이 제시될 수 있었다. 그러나, 표 3에 도시된 바와 같이, Cu#10의 스탁 용액은 황산구리의 당량 용액보다 더 높은 pH를 가지며, 또한 P. acnes의 성장에 미치는 억제 효과가 더 높다. 또한, 표 3에 도시된 화합물/조성물들의 ZoI 및 pH들 사이의 비-매개변수 스피어만(Spearman) 상관관계 시험은 (캘리포니아 La Jolla 소재의 GraphPad Software 사에 의한 프리즘(Prism) 6 통계 패키지를 사용하여) p = 0.81를 갖는 상관관계 계수 = -0.056를 산출했는데, 이는 이 실험에서 시험된 조성물들에 대하여 pH 및 항균 활성 사이에 현저한 상관관계가 없다는 것을 보여준다.
흥미롭게도, 조성물 Cu-Zn#1은 Cu# 조성물들의 원소 구리를 37.5% 만 갖는 것에도 불구하고 더 억제적인 조성물들 중 하나였지만, 원소 아연의 등몰 농도(스탁 용액 내 1.5 그램/데시리터)와 연계되었다. Cu-Zn#1의 인상적인 활성은 도 2 및 3에 제시된 결과들로부터 도출된 구리 및 아연 이온들 사이에 상승효과가 있다는 결론을 지지하며, 이 산-가용화된 구리-아연-암모늄 착체는 P. acnes에 대하여 예상된 억제 효과보다 더 큰 억제 효과를 실증한다는 것을 보여준다. 이 결과들은 조성물 Cu-Zn#1은 P. acnes 와 강하게 연관된 질병인 여드름의 치료에 있어서 치료적 가치를 가질 수 있다는 것도 제시한다. 또한, P. acnes는 “정상” 피부의 pH 범위인 pH 4.5 내지 5에서 잘 성장하지 않는다는 것이 알려져 있기 때문에, 산-가용화된 구리-아연-암모늄 착체 Cu-Zn#1은 P. acnes의 성장을 강력하게 억제하고, 방부제가 있는 겔 내에서 Cu-Zn#1의 1%(체적/체적) 제형의 pH 수치가 pH 4.6 부근이기 때문에 여드름의 치료에 있어서 치료 가치가 있을 수 있다.
실시예 2. 세균 마이크로플레이트 배양
호기성 세균 균주인 아시네토박터 바우마니(A. baumannii), 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스(MRSA) 및 클레브시엘라 프네우모니아(K. pneumoniae)를 병원 병동에서 취한 면봉들로부터 단리하였다. 대장균 (NCTC 9001; E. coli)은 환자의 방광으로부터의 임상 분리주이며; 모든 균주들을 RPMI-1640 내에서 배양하였다. 시험 대상인 화합물들/조성물들의 스탁 용액들을 희석하여 마이크로플레이트 분석에서 이중 희석은 1% 체적/체적 농도에서 시작하였다. 시험 대상인 조성물들의 이중 희석을 96-웰 조직 배양 플레이트 내의 RPMI-1640 내에서 제조하였다. 세균 배양물을 신선한 RPMI로 1:40으로 희석하였고, 상기 조성물들에 첨가하였다. P. acnes를 실시예 1에 기재된 바와 같이(한천 플레이트 시험 방법) 배양하였으며, 표본을 신선한 BHI로 1:100으로 희석하였다. 시험 대상인 조성물들의 이중 희석물들을 96-웰 조직 배양 플레이트(100 마이크로리터) 내에서 증류수에서 상기 기재된 바와 같이 제조하였으며, 희석된 P. acnes 배양물 100 마이크로리터를 첨가하였다. 이후 상기 플레이트들을 (P. acnes에 대한 혐기성 조건 하) 37℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 상기 조성물들의 최소 억제 농도(MIC)를 가시적인 세균 성장이 관찰되지 않았던 최저 농도로 정의하였다.
결과
1. 표 4는 표 1 및 2에 기재된 황산구리, 황산아연 및 다양한 조성물들에 대한 MIC 결과들을 보여준다. 실험 #1에서, 시험된 2 개의 구리계 조성물들(Cu#3 및 Cu#9)은 황산구리보다 2 배 더 활성이 있었다. 놀랍게도, 황산아연은 구리계 생성물들 어느 것보다 더 P. acnes 와의 MIC가 더 낮았으며, 산-가용화된 구리-아연-암모늄 제형 Cu-Zn#1은 시험된 가장 활성인 조성물이었다. Cu-Zn#1와 동일량의 원소 구리를 갖지만 원소 아연보다 6-배 더 적은 Cu-Zn#3은(표 2 참조) Cu-Zn#1보다 4-배 덜 활성이었다.
세균 마이크로플레이트 배양물 내에서 P. acnes의 성장에 미치는 (표 1 및 2에 기재된) 황산구리 및 황산 아연 및 다양한 조성물들의 효과.
실험 #1 실험 #2
조성물 MIC (㎍/ml) 조성물 MIC (㎍/ml)
황산구리 100 황산구리 200
Cu#3 50 Cu#3 100
Cu#9 50 Cu#12 100
황산아연 25 Cu#13 100
Cu-Zn#1 12.5 Cu-Zn#1 12.5
Cu-Zn#3 50 Cu-Zn#3 50
실험 #2에서, P. acnes와의 황산구리 및 Cu#3에 대한 MIC들은 최초 실험에서 보여진 것보다 2배였지만, Cu#3은 여전히 2배 더 활성이었다. Cu#12 및 Cu#13은 Cu#3 내에서 인산보다는 황산을 포함함에도 불구하고 Cu#3과 동일한 MIC를 가졌다; Cu#13은 Cu#3 및 Cu#12에서 황산구리보다는 염화구리를 포함하였다. 이 결과들은 산-가용화된 구리-암모늄 착체들은 황산구리 단독보다는 일반적으로 더 활성이 있다는 것을 나타낸다. 실험 #1에서와 같이, Cu-Zn#1은 P. acnes의 성장에 대하여 가장 활성이 있는 조성물이었으며, Cu-Zn#3보다 다시 4-배 더 활성이 있었다.
전체적으로 이 실험들은 상기 기재되고 표 3에 보여진 한천 플레이트 시험 결과들을 확인하고 연장한 것이다. 결과들은 산-가용화된 구리-암모늄 조성물들이 황산구리 단독보다는 더 활성이 있다는 것을 확인한다. 본 결과들은 놀랍게도 황산아연이 P. acnes 의 성장을 억제하는 것을 보여주었으며, Cu-Zn#1은 원소 구리를 37.5%만 함유함에도 불구하고 Cu# 조성물들보다 상당히 더 활성이 있다는 것을 보여주었다. 결과들은 조성물 Cu-Zn#1 내에서 등몰 원소 아연 및 구리의 조합은 황산아연 단독보다는 더 활성이 있으며, 구리와 비교하여 6-배 덜 원소 아연을 함유하는 Cu-Zn#3보다 훨씬 더 활성이 있다는 것을 보여준다. 전체적으로, 이 실험들의 결과는 Cu-Zn#1은 여드름에서 치료적 이익을 가질 수 있다는 것을 확인한다.
2. 표 5는 원소 구리 및 아연의 다양한 비율을 갖는 Cu-Zn 조성물 #1 내지 #5에 대한 MIC 결과들을 보여주는 반면에, Cu-Zn 착체들을 제조하는데 이용된 탄산 암모늄의 양들 및 Cu-Zn 착체들을 가용화하는데 이용된 염산의 양은 일정하게 유지되었다(표 2 참조). 이 실험에서, (실험들 사이에 참조로 이용된) 조성물 Cu#3은 황산아연이 그랬던 것처럼 MIC = 50 마이크로그램/밀리리터를 가졌다. 이전 실험들에서와 같이, 조성물 Cu-Zn#1은 P. acnes의 성장에 대하여 Cu-Zn#3보다 4-배 더 활성이 있었고, 이 실험에서는 Cu-Zn#2 보다 4-배 더 활성이 있었다. Cu-Zn#4 및 #5는 양쪽 모두 Cu-Zn#2 및 #3과 동일하게 절반 활성이 있었으며, Cu-Zn#1보다 8-배 덜 활성이 있었다. 이 결과들은 동몰의 원소 구리 및 아연을 포함하는 조성물 Cu-Zn#1은 시험된 모든 것들의 P. acnes의 성장에 대하여 가장 활성이 있는 조성물이다는 것을 보여준다. Cu-Zn#2 및 #3과의 결과들은 P. acnes의 성장에 대한 구리의 역할은 아연의 역할보다 어느 정도 더 높다는 것을 제시하지만, 등물 등가물(Cu-Zn#1) 내에서의 경우에 있어서 상기 2 금속들이 함께 내는 놀라운 상승 효과는 P. acnes의 성장에 대하여 훨씬 가장 효과적인 조성물을 생성한다.
세균 마이크로플레이트 배양물들 내에서 P. acnes의 성장에 미치는 다양한 Cu-Zn# 조성물들, Cu#3 및 황산아연의 효과.
조성물 원소 Cu:Zn의 비율 MIC (㎍/ml)
Cu#3 - 50
황산아연 - 50
Cu-Zn#1 1:1 6.3
Cu-Zn#2 1:0.33 25
Cu-Zn#3 1:0.17 25
Cu-Zn#4 0.33:1 50
Cu-Zn#5 0.17:1 50
3. 표 6은 마이크로플레이트 배양물들 내에서 MRSA, E. coli, A. baumannii 및 K. pneumoniae의 성장에 대하여 황산구리 및 다양한 Cu# 및 Cu-Zn# 조성물들에 대한 MIC 결과들을 보여준다. MRSA 및 A. baumannii는 양쪽 모두 E. coli 및 K pneumonia보다 황산구리, Cu# 및 Cu-Zn# 조성물들의 효과에 대하여 명백히 더 민감하고, A. baumannii는 Cu-Zn# 조성물들의 억제 효과에 놀랍만큼 민감하다. A. baumannii는 의료 관련 감염(HAIs)을 유발하는 특히 잠복기가 긴 박테리아이기 때문에, 조성물 Cu-Zn#1으로 세정 및/또는 무화(fogging)는 점점 더 만연되고 미생물을 처리하기 힘든 이것으로부터 병원 및 기타 의료 시설을 빠져 나가는 것에 특히 유용할 수 있다.
세균 마이크로플레이트 배양물들 내에서 MRSA, E. coli, A. baumannii 및 K. pneumoniae의 성장에 미치는 (표 1 및 2에 기재된) 황산구리 및 다양한 Cu# 및 Cu-Zn# 조성물들의 효과. NT = 미시험.
조성물 MRSA E. coli A. baumannii K. pneumoniae
황산구리 12.5 100 6.3 50
Cu#3 6.3 50 3.1 12.5
Cu#9 6.3 50 3.1 25
Cu#10 6.3 100 3.1 25
Cu#12 6.3 50 1.6 25
Cu#13 6.3 100 3.1 25
Cu-Zn#1 25 200 0.31 3.1
Cu-Zn#3 25 200 0.63 6.3
Cu#3a 6.3 50 1.6 NT
Cu10a 6.3 50 1.6 NT
Cu#11a 6.3 50 1.6 NT
MRSA 및 E. coli는 양쪽 모두 Cu-Zn# 조성물들 및 황산구리보다 Cu# 조성물들의 성장 억제 효과에 더 민감한 반면에, A. baumannii 및 K. pneumoniae에 대하여는 그 반대가 사실이었다. 그러나, E . coli는 일반적으로 MRSA보다 시험된 조성물들 모두에 대하여 8-배 정도 덜 민감하였다.
탄산 암모늄 또는 탄산 수소 암모늄으로 제조되고 아세트산(Cu#10) 및 시트르산(Cu#11; 표 1에 미도시 또는 침전이 24 시간 이후에 현저하기 때문에 시험됨)을 이용하는 특정한 조성물들은 제조한 지 며칠 내에 침전되기 시작하였다는 것에 주목하였다. 수산화 암모늄을 이용하여 매우 유사한 조성물들을 제조하였으며, 이 조성물들(Cu#10a 및 Cu#11a)은 놀랍게도 더 안정적인 것으로 증명되었으며 (실온에서 저장) 제조한지 몇 개월 후에 침전의 조짐을 보이지 않았다. 이 조성물들은 수산화 암모늄을 이용하여 제조하였으며 (상세함에 대하여는 표 1 참조), 표 6의 하단에 나타난 바와 같이 MRSA, A. baumannii 및 E. coli에 대하여 시험하였다. Cu#3은 안정한 조성물이며, Cu#3a은 시험된 상기 3 가지 세균 균주들에 대하여 동일하게 안정적이고 활성이 있었다. Cu10a는 Cu#10에 대하여 유사한 활성을 보였으며, 시트르산을 갖는 Cu#11a는 다른 Cu# 조성물들만큼 활성이 있었다. 이 조성물들 (및 수산화 암모늄으로 제조한 다른 조성물들 - 이하 참조)은 더 안정적일뿐만 아니라, 이들은 이산화탄소가 배출되지 않기 때문에 제조하는데 더 빠르고 더 용이하며, 수산화 암모늄으로 형성된 Cu-/Cu-Zn-암모늄 착체들은 가용화에 대하여 산을 덜 필요로 하므로, 조성물들의 pH는 더 높을 수 있는데, 이는 이들의 제형들에 있어서 장점들을 나타내는 것이다.
MRSA는 HAIs를 유발하는 아마도 가장 잘 알려지고 가장 문제가 있는 병원성 세균이지만, USA300 MRSA 균주는 특히 피부의 공동체-연관 감염에 있어서 점점 더 커지는 우려가 되기도 하였다. 카바페넴-내성 K. pneumoniae(CRKP)는 지난 10년에 걸쳐서 부상하여 거의 전체적으로 약물-내성인 세계적인 병원성 병원균이 되어 버렸다. 그러나, Cu# 및 Cu-Zn# 조성물들에 대하여 시험한 세균성 균주의 민감도(표 6)는 이러한 조성물들이 이러한 유기체들을 제거하기 위하여 병원, 가정 및 다른 건물들 내에서 세정, 무화 등에 유용할 수 있다는 것을 제시한다. 전체적으로, A. baumannii는 또한 Cu# 조성물들에 오히려 민감하기 때문에, Cu#3은 이러한 병원성 미생물들을 건물들로부터 제거하기 위하여 세정 및 소독을 위하여 특히 유효한 조성물일 수 있다.
실시예 3. 인간 편평 상피 피부 세포주(A-431)과의 세포독성 시험.
A-431(ATCC)을 공기 분위기에서 5% CO2가 첨가된 습식 배양기 내에서 37℃에서 10% 우태 혈청 및 2 mM L-글루타민(완전 배지)로 보충한 RPMI-1640 배지 내에 배양하였다. 세포독성 시험을 위하여, 세포들을 트립신처리하고, 세척하고, 계수하였으며, 2 x 104 개의 세포들을 완전 배지 내에서 편평-바닥 96-웰 플레이트들의 웰들에 플레이팅하였고, 컨플루언트 단층(confluent monolayer)이 형성되기까지 3 일 동안 배양하였다. 시험한 생성물들은 다음과 같다: (i) 도 4에 도시된 바와 같이 황산구리, Cu#9, Cu#10 및 Cu-Zn#1, 및 (ii) 2 개의 시판중인 여드름 크림들과 함께 방부제로 알로에 베라 겔 내에서 희석한 조성물 Cu#9 및 Cu-Zn#1: 도 5에 도시된 바와 같이 2% 살리실산과 CLEARASIL®(영국 버크셔 소재의 레킷 벤키저 사의 등록 상표) 초신속 작용 처리 겔 및 10% 과산화벤조일과 CLEARASIL®(영국 버크셔 소재의 레킷 벤키저 사의 등록 상표) 일간 청정 여드름 치료 크림. 모든 시험 생성물들을 완전 배지 내에서 희석한 이후에, 세포독성/세포 생존율을 하기에 기재된 바와 같이 술포로다민 B(SRB) 시험을 이용하여 정량적으로 평가하였던 경우에 24 시간 더 배양하였던 컨플루언트 A-431 세포들에 세벌 첨가하였다.
세포들을 RPMI-1640 배지로 2회 세척한 이후에, 4℃에서 1 시간 동안 10% 트리클로로아세트산으로 고정하였다. 수돗물로 2회 세척한 이후에, 세포들을 실온에서 30 분 동안 SRB(1% 아세트산 내의 0.4% w/v SRB)로 염색하였다. 수돗물로 2회 세척한 이후에, 잔류 염색을 10 mM 트리스(Tris) 염기에 용해하였으며, 웰들의 흡광도를 540 ㎚에서 다이나테크 멀티플레이트(Dynatech Multiplate) ELISA 판독기 상에서 측정하였다. 시험 생성물 흡광도를 대조 흡광도로 나누고 100을 곱하여 퍼센트 세포 생존율을 계산하였다.
결과
도 4는 황산구리 및 조성물 Cu#9 및 #10은 50 밀리그램/밀리리터의 50% 세포독성 농도(CC50)를 갖는 인간 피부 세포들과 거의 동일한 세포독성 프로파일들을 갖는데, 이는 구리 이온들이 상기 3 개의 생성물들의 세포독성 효과들의 원인이 된다는 것을 보여주고 있다. 조성물 Cu-Zn#1은 상기 다른 3 개의 생성물들의 원소 구리 농도들이 37.5%에 불과하다는 것에도 불구하고 아마도 구리 및 아연 이온들의 존재로 인하여, 상기 다른 3 개의 생성물들보다 약간 더 세포독성이 있었는데(CC50 = 30 마이크로그램/밀리리터), 이는 아연 이온들이 구리 이온들보다 인간 피부 세포들에 훨씬 더 세포독성이 있고/있거나 이들은 구리 이온들의 세포독성을 향상시킨다는 것을 제시하고 있다.
중요하게도, 이 결과들은 Cu#3, #3a, #9, #10, #10a, #11a, #12, #13 및 Cu-Zn#1 및 #3과 같이, 본원에 기재된 조성물들은 배양물(30 마이크로그램/밀리리터 부근) 내에서 인간 피부 세포들에 세포독성을 유발하는 것들에 훨씬 못 미치는 농도들(MIC 1.6 내지 6.3 마이크로그램/밀리리터 - 표 6 참조)에서 MRSA and A. baumannii와 같은 세균의 성장을 억제할 수 있는 것을 보여준다. Cu-Zn#1도 인간 피부 세포들에 세포독성이 아닌 농도인 MIC = 12.5 마이크로그램/밀리리터(표 4)를 갖는 P. acnes의 성장을 억제한다.
도 5는 조직 배양물 내에서 인간 피부 세포들의 생존율에 미치는 1% 체적/체적의 조성물 Cu#9(400 마이크로그램/밀리리터 원소 구리) 및 Cu-Zn#1(150 마이크로그램/리터 원소 구리 및 아연)을 함유하는 겔 및 2 개의 시판중인 CLEARASIL®(영국 버크셔 소재의 레킷 벤키저 사의 등록 상표) 여드름 크림의 효과를 보여준다. 활성 성분들로서 10% 과산화벤조일을 함유하는 것과 2% 살리실산을 함유하는 또 다른 것인 상기 CLEARASIL®(영국 버크셔 소재의 레킷 벤키저 사의 등록 상표) 생성물들 양쪽 모두는 각각 0.02% 및 0.05%의 CC50 수치들의 유사한 세포독성 프로파일들 및 0.5% 부근 및 그 이상의 농도에서 100% 세포독성(0% 세포 생존율)을 생성하였다. 여드름을 치료하기 위한 바람직한 조성물일 것인 조성물 Cu-Zn#1을 1% 함유하는 겔은 4%의 CC50을 갖는 반면에, 조성물 Cu#9를 1% 함유하는 겔은 시험에서 10% 체적/체적에서도 CC50을 달성하지 않았다. 이 겔 제형 CC50 수치들은 조성물 단독으로 얻은 CC50 수치들과 상용가능하다(도 4 참조). 그러므로, 상기 CLEARASIL®(영국 버크셔 소재의 레킷 벤키저 사의 등록 상표) 생성물들은 겔 제형들의 어느 것보다 인간 피부 세포들에 약 200-배 이상 더 독성이 있다는 것이 명백하다.
피부의 복잡한 구조와 비교하여 피부 세포 배양물들의 상대적인 단순함으로 인하여, 의료관련 합병증은 주의깊게 해석해야 할 필요가 있으며, 이러한 시험관 내(in vitro) 결과들은 임상 차이들로 해석할 수 없다는 것에 주목하는 것이 중요하다. 그럼에도 불구하고, 상기 CLEARASIL®(영국 버크셔 소재의 레킷 벤키저 사의 등록 상표) 생성물들 내에서 활성 성분들인 여드름 치료 생성물들에 널리 이용되는 살리실산과 과산화벤조일은 여드름을 앓고 있는 사람들의 피부에 더 노출될 수 있는 피부 세포들에 특히 독성이 있는 것으로 보인다. 따라서, Cu-Zn#1 제형이 있는 겔은 여드름과 연관된 세균인 P. acnes에 대하여 활성이 높으면서 여드름을 앓는 사람들의 피부에 피해가 덜할 수 있다(실시예 1 및 2 참조).
실시예 4. 식물 병원성 진균을 이용한 항-진균 시험
칼라라 프락시네아 분리주 196/28(C. fraxinea), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger; A. niger) 및 백분병으로부터 단리된 균주(Pm; 사과잎으로부터 단리됨)를 실온(22℃ 부근)에서 감자 덱스트로스 한천(PDA) 상에 배양하였다. 진균 성장에 미치는 조성물들의 효과를 평가하기 위하여, 살균 증류수에 희석된 시험 조성물들 10 마이크로리터를 12-웰 조직 배양 플레이트의 웰들에 놓았고 PDA 1 밀리리터를 피펫으로 각각의 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 교반하여 상기 한천 전체에 걸쳐서 고르게 시험 조성물을 고르게 분포시켰고(증류수 단독은 대조군으로 이용하였다), 이후 한천이 굳어지도록 하였다. 정착된 진균 배양물로부터 진균사(3 ㎟)를 함유하는 한천의 플러그들(plugs)을 외과용 메스를 이용하여 조심스럽게 절단하였으며 이후 실온(22℃ 부근)에서 배양된 12-웰 플레이트의 각각의 웰 내에 한천의 중심의 천공들에 삽입하였다. 진균 성장 속도는 균주에 따라 달라지기 때문에, Pm에 대하여 3 일 이후 및 A. niger에 대하여 3 내지 4 일 및 C. fraxinea에 대하여 7 일 정도의 적절한 간격으로 실험들을 평가하였다. 진균 성장에 미치는 조성물들의 효과를 평가하기 위하여, 진균사의 직경을 자를 이용하여 90도 각도에서 2회 측정하였고, 평균 직경을 밀리미터로 계산하였다. 진균 성장이 육안으로 검출될 수 없다면, 배양물들을 상 현미경(40 배)로 관찰하여 육안 검사에 의하여 판단한 바로는 성장이 없었음을(NG) 확인하였다.
결과
1. 표 7은 C. fraxinea의 성장에 미치는 황산구리 및 조성물 Cu#16의 효과를 보여준다. 조성물 Cu#16은 양쪽의 시간점들에서 125 마이크로그램/밀리리터의 농도에서 진균 성장을 강하게 억제하였으며, 아마도 항-진균 활성을 갖는 것으로 알려진 인산(표 1 참조)으로 Cu#16 내에서 구리-암모늄 착체의 가용화로 인하여, 황산구리보다 진균 성장에 30-배 정도 더 억제적이었다(3.75 마이크로그램/밀리리터 Cu#16의 결과들은 황산구리 125 마이크로그램/밀리리터를 갖는 것들과 매우 유사하였다).
PDA상에서 C. fraxinea의 성장에 미치는 황산구리 및 조성물 Cu#16의 효과. *40 배 확대 상 현미경으로 관찰한 미미한 성장 **20 밀리미터는 웰들의 폭이며 컨플루언트 진균 성장을 나타낸다.
진균 성장의 직경(㎜)
CuSO4 (μg/ml) 7 일째 15 일째
125 10 18
37.5 13 20**
12.5 14 20
3.75 14 20
Cu#16 (μg/ml)
125 3* 4
37.5 7 10
12.5 9 15
3.75 10 17
대조군 14 20
2. 표 8은 C. fraxinea의 성장에 미치는 조성물 Cu-Zn#1 및 Cu-Zn#7의 효과를 보여준다. 조성물 Cu-Zn#1은 C. fraxinea의 성장을 억제하는데 있어서 조성물 Cu-Zn#7보다 덜 효과적이며, 상기 2 개 조성물들의 제형이 매우 유사하다고 하더라도(표 2), 조성물 Cu-Zn#7은 구리-아연 가용화산으로서 인산을 함유하는 반면에, Cu-Zn#1은 염소산을 포함한다. 인산은 항진균 활성을 갖는 것으로 알려져 있으며, 조성물 Cu-Zn#7에 있어서 이의 사용으로 인하여 시험한 지 각각 7 일 및 14 일 째에 Cu-Zn#1보다 3- 내지 10-배 더 활성이 있는 항-진균 조성물을 생성한다.
Cu-Zn#7의 1% 농도는 원소 구리를 150 마이크로그램/밀리리터를 함유함으로써, Cu-Zn#7의 효과를 표 7에서 황산구리 및 Cu#16의 효과와 비교하면 Cu-Zn#7은 Cu#16보다 C. fraxinea 성장의 약간 덜 효과적인 억제제이지만, 황산구리보다는 상당히 더 효과적이라는 것을 보여준다.
PDA상에서 C. fraxinea의 성장에 미치는 조성물 Cu-Zn#1 및 Cu-Zn#7의 효과. 상기 Cu-Zn# 조성물들을 스탁 용액들의 퍼센트 희석물로 이용하였기 때문에 (표 2), 1% 용액은 원소 구리 (및 아연)을 150 ㎍/ml 함유한다: *20 밀리리터는 웰들의 폭이며 컨플루언트 진균 성장을 나타낸다.
진균 성장의 직경(㎜)
Cu-Zn#1 (%) 7 일째 14 일째
1 7 18
0.3 16 20*
0.1 16 20
0.03 16 20
0.01 16 20
Cu-Zn#7 (%)
1 4 8
0.3 8 14
0.1 15 17
0.03 16 19
0.01 16 20
대조군 16 20
3. 표 9는 A. niger의 성장에 미치는 황산구리 및 조성물 Cu#16의 효과를 보여준다. 조성물 Cu#16은 125 마이크로그램/밀리리터의 농도에서 진균 성장을 완전히 억제하였으며, 3 개 시간점들 모두에서, C. fraxinea로 관찰된 바와 같이(표 7) 황산구리보다 진균 성장에 3-배 내지 10-배 더 억제적이었다.
PDA상에서 A. niger의 성장에 미치는 황산구리 및 조성물 Cu#16의 효과. NG는 40 배 확대 상 현미경으로 평가된 바와 같이 무성장을 나타낸다.
진균 성장의 직경(㎜)
CuSO4 (㎍/ml) 4 일째 7 일째 11 일째
125 7 10 15
37.5 13 16 18
12.5 15 17 18
Cu#16 (㎍/ml)
125 NG NG NG
37.5 8 11 12
12.5 11 14 14
대조군 15 17 18
4. 표 10은 인산을 양쪽 모두 함유하는 Cu# 조성물들 양쪽 모두는 Pm의 성장을 억제하는데 있어서 황산구리보다 더 효과적이라는 것을 보여준다. 조성물 Cu#16은 탄산 수소 암모늄으로 제조되는 반면에 Cu#27은 수산화 암모늄을 함유하며, 앞에서 나타낸 바와 같이(표 6), 이는 조성물의 항-진균 활성에 현저한 차이를 만들지 않았다. 그러나, 실온에서 며칠 후에 조성물 Cu#16에서 침전이 보여진 반면에, Cu#27에서는 이것이 관찰되지 않았는데, 이는 수산화 암모늄은 인산을 착체를 가용화하는데 이용하는 경우 구리-암모늄 착체들의 제조에 있어서 놀랄만큼 유리할 수 있다는 것을 제시하고 있다. Pm 성장의 동일하게 유효한 억제제들인 조성물 Cu-Zn#7 및 Cu-Zn#10은 각각의 경우에 있어서 인산으로 가용화된 Cu-Zn-암모늄 착체들을 생성하는데 각각 탄산 암모늄 및 수산화 암모늄의 사용하는 것에 있어서 상이하였다(표2). 그러나, 탄산 암모늄을 인산으로 가용화된 Cu-Zn-암모늄 착체들을 제조하는데 이용하였던 경우에 아무런 침전이 보여지지 않았다. 놀랍게도, Cu-Zn# 조성물들은 원소 구리 함유량의 측면에서 Cu# 조성물들보다 Pm 성장의 더 효과적인 억제제들이었다. 따라서, 1 퍼센트 희석(구리 150 마이크로그램/밀리리터)에서는, 원소 구리375 마이크로그램/밀리리터를 제외하고는, Cu# 조성물에서와 같이 Cu-Zn# 조성물들은 완전히 성장을 억제하였다. 0.3 퍼센트 희석(구리 45 마이크로그램/밀리리터)에서는, Cu-Zn# 조성물들은 여전히 Pm 성장을 강하게 억제한 반면에, 37.5 마이크로그램/밀리리터에서, Cu# 조성물들은 Pm 성장에 대하여 미미하게 억제적일 뿐이다. 계산에 의하면 Pm 성장을 50% 억제하는데 요구되는 농도는 Cu-Zn# 조성물들에 대하여 40 마이크로그램/밀리리터 근방이었고 Cu# 조성물들에 대하여 170 마이크로그램/밀리리터 근방이었다는 것을 나타낸다. 그러므로, 이 결과들은 착체들을 형성하는데 사용된 암모늄 염에 관계없이, 인산으로 가용화된 Cu-Zn# 조성물들은 Pm의 성장을 억제하는데 인산으로 가용화된 Cu# 조성물들보다 놀랍게도 더 효과적이라는 것을 보여준다.
배양한 지 3 일 후에 PDA 상에서 Pm의 성장에 미치는 황산구리, 2 개의 Cu# 조성물들 및 2 개의 Cu-Zn# 조성물들의 효과. 상기 Cu-Zn# 조성물들을 스탁 용액들의 퍼센트 희석물로 이용하였기 때문에(표 2), 1% 용액은 원소 구리 (및 아연)을 150 ㎍/ml를 함유한다. NG는 40 배 확대 상 현미경으로 평가된 바와 같이 무성장을 나타낸다. *40 배 확대 상 현미경으로 관찰한 미미한 성장
진균 성장의 직경(㎜)
조성물 12.5 ㎍/ml 37.5 ㎍/ml 125 ㎍/ml 375 ㎍/ml
CuSO4 17 17 13 3*
Cu#16 17 15 10 NG
Cu#27 17 16 10 NG
0.03% 0.1 % 0.3% 1%
Cu-Zn#7 17 14 4 NG
Cu-Zn#10 17 14 3* NG
대조군 17
C. fraxinea는 유럽에서 심각한 임업 문제인 물푸레 나무 마름병의 원인이다. A. niger는 포도, 양파 및 땅콩과 같은 특정한 과일 및 채소 상의 흑색 곰팡이를 유발하며 식품의 흔한 오염균이다. Blumeria 속의 진균은 포도덩굴, 쿠르쿠비츠(Curcubits), 양파, 사과 및 배 나무를 포함하는 많은 식물들의 잎 상에 백분병을 유발하는 널리 퍼져있는 식물 병원균이다. 상기 기재된 결과는 인산으로 가용화된 구리-암모늄 및 구리-아연-암모늄 착체들은 시험한 다양한 식물 병원성 진균의 성장을 억제하는데 대단히 효과적이므로, 작물, 식물, 나무, 꽃 및 장식용 관목의 보호를 위한 농업 분야에 있어서 실제적으로 응용될 수 있다는 것을 나타낸다. 놀랍게도, Cu-Zn#7 및 #10은 백분병의 성장을 억제하는데 있어서 Cu#16 및 #27보다 현저히 더 효과적인데, 이는 이러한 조성물들은 특정한 식물 병원균에 대하여 유리한 항-진균 활성을 가질 수 있다는 것을 제시하는 것이다.
실시예 5. 인간 병원균 캔디다 알비칸스 및 크립토코쿠스 네오포르만스를 이용한 항-진균/효모 시험
사용된 캔디다 알비칸스(C. albicans)의 3 가지 균주들: 1-1, 3-1 및 4-1을 각각 인간 혈액, 질 및 중인후로부터 단리하였다. 크립토코쿠스 네오포르만스(C. neoformans) 균주 CCTP13을 사용하였다. 모든 균주들을 37℃의 RPMI-1640 배지 내에서 배양하였다. 황산구리 및 Cu# 조성물들은 200 마이크로그램/밀리리터의 고농도에서 시작한 반면에, Cu-Zn# 조성물들은 스탁 용액의 1%의 고농도에서 시작하였으며(표 2), 황산아연 및 인산은 96-웰 조직 배양 플레이트 내에서 RPMI-1640에 제조된 조성물들의 희석물들(100 마이크로리터)을 배증하는 Cu-Zn#7 및 #10(상세한 사항은 표 11의 범례 참조)에서의 농도와 동등한 고농도로 시작하였다. C . albicans 및 C. neoformans 배양물들을 40 mM MOPS 완충액을 함유하는 신선한 RPMI로 각각 1:40 및 1:10으로 하룻밤 동안 희석하였으며, 90 마이크로리터를 플레이트 내의 조성물들에 첨가하였다. 레자주린 A(증류수 내의 0.0675% 중량/체적 용액의 10 마이크로리터)를 성장의 지시약으로 첨가하였으며, 배양물들을 37℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 상기 화합물들/조성물들의 최소 억제 농도(MIC)는 레자주린 A 지시약이 푸른색으로 남아있는 (살아있는 세포들은 푸른 염료를 분홍색으로 변환시킨다) 최저 농도로 정의되었다.
결과
표 11은 황산구리 또는 산-가용화된 구리-암모늄 조성물들(Cu#)의 형태이든지 상기 시험된 균주들 모두가 놀랍게도 구리에 대하여 민감하였는데, 이는 MRSA 및 A. baumannii 에서 관찰된 MIC(6 마이크로그램/밀리리터 부근; 표 6)들과 MIC들이 유사한 것을 보여준다.
염산 및 인산과 함께 각각 동몰량의 원소 구리 및 아연을 함유하는 산-가용화된 Cu-Zn-암모늄 착체 조성물 #1 및 #7은 구리 이온 농도의 측면에서 황산구리 및 상기 Cu# 조성물들보다 C. albicans 성장의 약간 더 효과적인 억제제들이었다(MIC = 원소 Cu2 +의 4.7 마이크로그램/밀리리터). 효모 C. neoformans도 형태에 관계없이 구리에 고도로 민감하였지만, C. albicans 균주들보다 Cu-Zn#1에 덜 민감하였다. C. albicans 균주들의 성장은 황산아연 또는 인산에 의하여 영향받지 않았다(각각 MIC >150 및 >500 마이크로그램/밀리리터). C. neoformans의 성장도 황산아연에 의하여 영향을 받지 않았다.
3 개의 C. albicans 균주들 및 C. neoformans의 1 개 균주의 성장에 미치는 다양한 조성물들의 효과. *상기 Cu-Zn# 조성물들은 Cu2 + 및 Zn2 + 양쪽 모두를 4.7 ㎍ml 함유한다. **Cu-Zn#7 및 #10 스탁 조성물들(표 2 참조)의 1% 체적/체적 용액은 황산아연 150 ㎍/ml 및 인산 500 ㎍/ml를 함유한다. NT = 미시험.
MIC (㎍/mlCu2+)
조성물 1-1 3-1 4-1 C. neoformans
CuSO4 6.3 6.3 6.3 6.3
Cu#3 6.3 6.3 6.3 6.3
Cu#9 6.3 6.3 6.3 6.3
Cu#12 6.3 6.3 6.3 6.3
Cu#16 6.3 6.3 6.3 NT
Cu-Zn#1 4.7* 4.7 4.7 18.8
Cu-Zn#7 4.7 4.7 4.7 NT
ZnSO4 >150 >150 >150 >150
H3PO3 >500 >500 >500 NT
이 결과들은 다양한 상이한 해부 부위들로부터 단리된 C. albicans 균주들은 RPMI 배지 내에서 성장되는 경우 구리의 존재에 모두 고도로 민감하다는 것을 보여준다. 따라서, Cu# 또는 Cu-Zn# 조성물들 중 어느 하나는 질 및 아구창과 같은 C. albicans-관련 질병들의 국소 치료에 유용할 수 있다고 결론내릴 수 있다.
C. neoformans도 황산구리 및 상기 Cu# 조성물들에 매우 민감하였지만, Cu-Zn#1 및 황산아연에 훨씬 덜 민감하였다. C. neoformans는 HIV/AIDS가 있는 사람들에게서 중증 수막염을 유발하며, 대뇌에 구리-함유 착체의 선택적 전달은 이 치명적인 질환에 대한 잠재적인 치료법일 수 있다.
실시예 6. 안정성 시험.
조성물 Cu#1의 1% 체적/체적을 함유하는 방부제가 있는 조성물 Cu#1 및 알로에 베라 겔의 표본들(3 밀리리터)를 7 밀리리터 살균 플라스틱 튜브들 내에 두었으며, 반복시험 표본들을 4 가지 조건들 하에 저장하였다; 습식 배양기 내 37℃, 찬장 내 실온(22℃ 부근), 저온실 내 4℃, 및 냉장고 내 -20℃. 5 개월 동안 저장한 후에, Cu#1표본 및 1% Cu#1를 함유하는 겔의 표본 한 세트를 실온에 이르도록 하였다. 상기 겔 표본들(5 마이크로리터) 및 Cu#1의 표본들(종이 디스크 상에 놓은 증류수 및 5 마이크로리터에 1:1 또는 1:10으로 희석됨)을 한천 플레이트 시험에서 세균 균주 S1(S. aureus)에 대하여 시험하였으며, 37℃에서 24 시간 배양한 이후에, 억제 지대들의 직경들을 실시예 1에 기재된 바와 같이 측정하였다.
결과
조성물 Cu#1를 1% 함유하는 겔의 표본들은 모두 S1(S. aureus)에 대하여 6 밀리리터의 억제 지대들을 생성하였는데, 이는 광범위한 온도에서 저장은 겔들의 항균 활성에 미치는 효과가 없다는 것을 나타내는 것이다.
표 12는 다양한 온도들에서 5 개월 동안 저장된 조성물 Cu#1의 표본들에 대한 억제 지대들을 보여준다. 37℃에서 저장된 표본은 시험된 양쪽의 농도에서 매우 유사한 억제 지대들을 생성했던 다른 표본들보다 S1(S. aureus)의 성장에 대하여 약간 더 억제적이었다. 이 결과들은 조성물 Cu#1은 광범위한 온도에서 5 개월 저장한 이후에 자신의 항균 활성을 유지한다는 것을 보여준다.
한천 플레이트 시험에서 세균 균주 S1(S. aureus)의 성장에 미치는 다양한 온도에서 5 개월 동안 저장된 조성물 Cu#1의 표본들의 효과
억제 지대(㎜)
Cu#1 저장 온도 1:1 희석 1:10 희석
37°C 23 12
실온(22℃ 부근) 19 10
4°C 20 9
-20°C 18 8
본 발명의 다양한 목적들을 그 바람직한 실시형태들과 연계하여 기재하였지만, 많은 대안, 수정 및 변형이 당업자에게 명백할 것이라는 것은 분명하다. 따라서, 본 명세서, 청구의 범위 및 첨부한 도면들의 취지 및 광범위 내에 속하는 모든 그러한 대안, 수정 및 변형을 포함하는 것으로 한다.

Claims (27)

  1. 항균 조성물로서, 상기 항균 조성물은,
    물에 수화된 황산구리를 포함하는 용액;
    상기 황산구리 용액에 첨가되어 비가용성 구리-암모늄 착체를 생성하는 염기성 암모늄염으로서 수산화 암모늄, 탄산 암모늄 및 탄산 수소 암모늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 염기성 암모늄염; 및
    황산, 염산, 인산 및 아인산으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 수용성 산을 포함하며,
    상기 황산구리 용액은 상기 염기성 암모늄염을 첨가시에 구리-아연-암모늄 착체를 형성하는 용액 내 동몰량의 아연염을 더 포함하며,
    상기 수용성 산은 상기 황산구리 용액에 첨가되어 상기 구리-아연-암모늄 착체를 가용화시키고 그렇게 형성된 맑은 청색 산-가용화된 구리-아연-암모늄 용액의 pH를 조절하는 항균 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 물은 증류수, 탈이온수, 정제수, 여과수, 의약 용수, 의료 용수 및 역삼투수로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항균 조성물.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서,
    상기 아연염은 무수 황산아연, 무수 염화아연, 수화 황산아연 및 수화 염화아연으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항균 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 암모늄염은 물에 용해되는 것인 항균 조성물.
  12. 제1항에 있어서,
    겔, 연고, 오일, 페이스트, 약제, 분무성 용액, 드레싱 용액, 관류 용액, 크림, 비누, 세제, 세척액 및 폼(foam)으로 이루어진 군으로부터 선택된 담체를 더 포함하는 것인 항균 조성물.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 항균 조성물은 식물 보호 제품인 것인 항균 조성물.
  14. 수화된 황산구리 및 동몰량의 아연염을 물과 조합하는 공정;
    상기 조합된 황산구리와 아연염의 물 혼합물을 교반하는 공정;
    상기 얻어진 혼합물에 염기성 암모늄염을 첨가하여 비가용성 구리-아연-암모늄 착체를 생성하는 공정; 및
    상기 구리-아연-암모늄 착체에 황산, 염산, 인산 및 아인산으로 이루어진 군으로부터 선택된 수용성 산을 첨가하여 상기 구리-아연-암모늄 착체를 가용화시키고 그렇게 형성된 맑은 청색 용액의 pH를 조절하는 공정에 의해 생성된 항균 조성물.
  15. 삭제
  16. 제14항에 있어서,
    상기 물은 증류수, 탈이온수, 정제수, 여과수, 의약 용수, 의료 용수 및 역삼투수로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항균 조성물.
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 제14항에 있어서,
    상기 염기성 암모늄염은 수산화 암모늄, 탄산 암모늄 및 탄산 수소 암모늄으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항균 조성물.
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 제14항에 있어서,
    상기 아연염은 무수 황산아연, 무수 염화아연, 수화 황산아연 및 수화 염화아연으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항균 조성물.
  24. 제14항에 있어서,
    상기 염기성 암모늄염은 상기 황산구리와 아연염의 물 혼합물과 조합되기 전에 물에 용해되는 것인 항균 조성물.
  25. 제14항에 있어서,
    겔, 연고, 오일, 페이스트, 약제, 분무성 용액, 드레싱 용액, 관류 용액, 크림, 비누, 세제, 세척액 및 폼으로 이루어진 군으로부터 선택된 담체를 더 포함하는 것인 항균 조성물.
  26. 물에 수화된 황산구리 및 동몰량의 아연염을 조합하는 단계;
    상기 조합된 황산구리와 아연염의 물 혼합물을 교반하는 단계;
    상기 얻어진 혼합물에 염기성 암모늄염을 첨가하여 비가용성 구리-아연-암모늄 착체를 생성하는 단계; 및
    상기 구리-아연-암모늄 착체에 황산, 염산, 인산 및 아인산으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 수용성 산을 첨가하여 상기 구리-아연-암모늄 착체를 가용화시키고 그렇게 형성된 맑은 청색 항균 조성물의 pH를 조절하는 단계를 포함하는 항균 조성물을 제조하는 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    황산구리 5수화물을 물에 용해시켜 투명한 황산구리 용액을 형성하는 단계;
    황산아연 7수화물을 교반하에 상기 황산구리 용액에 첨가하여 상기 황산아연 7수화물을 상기 황산구리 용액에 용해시켜 황산구리 및 황산아연 용액을 형성하는 단계;
    암모늄 소스(ammonium source)를 상기 황산구리 및 황산아연 용액에 첨가하여 비가용성 구리-아연-암모늄 착체를 생성하고 상기 비가용성 구리-아연-암모늄 착체를 물 중에서 현탁 상태로 유지하면서 혼합하는 단계; 및
    상기 구리-아연-암모늄 착체 현탁액에 수용성 산을 첨가하여 현탁 상태의 상기 비가용성 구리-아연-암모늄 착체를 용해시키는 단계를 포함하는 항균 조성물을 제조하는 방법.
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