JP6576546B2 - ウイルス除去膜及びウイルス除去膜の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、溶液からウイルスを除去するためのウイルス除去膜及びウイルス除去膜の製造方法に関する。

近年、人血液由来の血漿分画製剤に加え、バイオ医薬品においても、ウイルス安全性を向上させる対策が必要となってきた。そのため医薬品メーカーにおいては製造工程中にウイルス除去／不活化工程を導入する検討を行っている。中でも、ウイルス除去膜を用いたろ過によるウイルス除去法は、有用なタンパク質を変性させることなく、ウイルスを低減することができる有効な方法である。

例えば特許文献１には、膜内壁面より壁内部に進むに従って面内空孔率が当初減少し、少なくとも１個の極小部を経過した後、外壁部で再び増大する孔構造（以下、「グラジェント構造」ともいう。）を有する高分子多孔質中空糸膜、及びこの膜を用いてタンパク質水溶液をろ過するウイルス除去方法が開示されている。このようなグラジェント構造を持ち、特定の平均孔径を有するウイルス除去膜は、タンパク水溶液からウイルスを除去するにあたり、高い除去率でウイルスを除去し、タンパク質を変性させることなく、高透過効率でタンパク質を回収するのに好適であるとされている。

特許文献２には、銅アンモニアセルロース溶液をＵ字管中で凝固させることで、ミクロ相分離の構造形成中に、延伸による構造破壊を限りなく抑制し、高いウイルス除去性を達成できる中空糸膜の製造方法が開示されている。特許文献４には、平均孔径が１３ｎｍ以上２１ｎｍ以下である、パルボウイルスの除去に適したウイルス除去膜が開示されている。特許文献３には、ウイルスやタンパク質を用いたウイルス除去膜の特性評価が開示されている。

特開平１−１４８３０５号公報 特開平４−３７１２２１号公報 国際公開第２０１５／１５６４０１号 特開２０１０−１４５６４号公報

ウイルス除去膜には、高いウイルス除去性能、ろ過に伴う膜の目詰まりが抑制された高いろ過性能、並びにウイルス除去性能及びろ過時間の製品間における差が小さいこと、が求められる。そこで、本発明は、ろ過性能及び製品間の差が小さいことによる安全性が高いウイルス除去膜及びウイルス除去膜の製造方法を提供することを課題の一つとする。

本発明の態様によれば、タンパク質を含有する溶液からウイルスを除去するためのウイルス除去膜が提供される。当該ウイルス除去膜は、セルロースを備え、タンパク質を含有する溶液が供給される一次側の表面と、当該ウイルス除去膜を透過した透過液が排出される二次側の表面と、を有し、バブルポイントが０．５ＭＰａ以上１．０ＭＰａ以下であり、一次側から当該ウイルス除去膜に直径３０ｎｍの金コロイドを含有する溶液を供給して当該ウイルス除去膜で金コロイドを捕捉し、当該ウイルス除去膜の断面において輝度を測定すると、輝度の変位のスペクトルの面積値の標準偏差を輝度の変位のスペクトルの面積値の平均値で除した値が０．０１以上０．３０以下であり、当該ウイルス除去膜の断面において、直径３０ｎｍ以上直径４０ｎｍ以下の金コロイドが捕捉される部位の厚さが、湿潤状態で、１７．０μｍ以上２０．０μｍ以下である。

上記のウイルス除去膜において、湿潤状態の当該ウイルス除去膜の断面において、直径５０ｎｍの金コロイドが捕捉される部位が、一次側から当該ウイルス除去膜の膜厚の５％以上３５％以下のところにあり、直径４０ｎｍの金コロイドが捕捉される部位が、一次側から膜厚の８％以上５０％以下のところにあり、直径３０ｎｍの金コロイドが捕捉される部位が、一次側から膜厚の１０％以上８０％以下のところにあってもよい。

上記のウイルス除去膜において、直径４０ｎｍの金コロイドの対数除去率が１．００以上であり、直径３０ｎｍの金コロイドの対数除去率が１．００以上であり、直径２０ｎｍの金コロイドの対数除去率が０．１０未満であってもよい。直径２０ｎｍの金コロイドが捕捉されなくてもよい。

上記のウイルス除去膜において、孔径が３２．０ｎｍ以上３８．０ｎｍ以下であってもよい。当該ウイルス除去膜の断面において、一次側から二次側に向けて、孔径が減少した後増加に転じてもよい。直径３０ｎｍの金コロイドが捕捉される部位が、孔径が最小となる部位を含んでいてもよい。

上記のウイルス除去膜の乾燥状態の膜厚が２５．０μｍ以上４５．０μｍ以下であってもよい。膜厚の標準偏差が５．０μｍ以下であってもよい。

上記のウイルス除去膜において、バブルポイントが０．７ＭＰａ以上１．０ＭＰａ以下であってもよい。

上記のウイルス除去膜において、純水透過速度が、１００Ｌ／ｍ^２／ｈｒｓ／０．１ＭＰａ以上５００Ｌ／ｍ^２／ｈｒｓ／０．１ＭＰａ以下であってもよい。

上記のウイルス除去膜が平膜であってもよい。あるいは、上記のウイルス除去膜が中空糸膜であってもよい。この場合、乾燥状態で内径が２５０μｍから４００μｍであってもよい。内径の標準偏差が１５．０μｍ以下であってもよい。

上記のウイルス除去膜において、４０ｎｍ以上のウイルスの対数除去率（ＬＲＶ）が４．０以上であってもよい。牛ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）の対数除去率（ＬＲＶ）が４．０以上であってもよい。

また、本発明の態様によれば、セルロース、銅、及び二酸化ケイ素を含む紡糸原液を３０℃以上４０℃以下に保つエイジング工程と、紡糸原液を用いて製膜する製膜工程と、を備える、ウイルス除去膜の製造方法が提供される。

上記のウイルス除去膜の製造方法において、エイジング工程を、４５時間以上１００時間以下行ってもよい。

上記のウイルス除去膜の製造方法の製膜工程において、セルロースの濃度が６．０重量％以上８．５重量％以下であってもよい。セルロースの濃度に対する銅の濃度の比が０．３０以上０．４０以下であってもよい。二酸化ケイ素の濃度が５ｐｐｍ以上１００ｐｐｍ以下であってもよい。

上記のウイルス除去膜の製造方法において、紡糸原液がアンモニアをさらに備え、製膜工程においてセルロース濃度に対するアンモニアの濃度の比が０．６以上１．０以下であってもよい。

上記のウイルス除去膜の製造方法の製膜工程において、凝固液に紡糸原液を吐出してもよい。紡糸原液を、環状紡出口を用いて吐出してもよい。あるいは、支持体上に紡糸原液をキャスティングした後、凝固液に浸漬してもよい。

本発明によれば、ろ過性能及び製品間の差が小さいことによる安全性が高いウイルス除去膜及びウイルス除去膜の製造方法を提供可能である。

本発明の実施の形態に係る中空糸膜の形状を有するウイルス除去膜の模式図である。 本発明の参考例に係る中空糸膜の形状を有するウイルス除去膜におけるウイルス捕捉部位の模式図である。 本発明の実施の形態に係る中空糸膜の形状を有するウイルス除去膜におけるウイルス捕捉部位の模式図である。 本発明の実施の形態に係る平膜の形状を有するウイルス除去膜の模式図である。 本発明の実施の形態に係るウイルス除去膜の製造工程を示す模式図である。 本発明の実施例に係るウイルス除去膜の製造条件を示す表である。 本発明の実施例に係るウイルス除去膜の評価結果を示す表である。 本発明の比較例に係るウイルス除去膜の評価結果を示す表である。

以下に本発明の実施の形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号で表している。但し、図面は模式的なものであり、具体的な寸法等を正確に示したものではない。したがって、具体的な寸法等は以下の説明を照らし合わせて判断するべきものであり、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることは勿論である。

図１に示すように、実施の形態に係るタンパク質を含有する溶液からウイルスを除去するためのウイルス除去膜１０は、タンパク質を含有する溶液が供給される一次側の表面１と、当該ウイルス除去膜１０を透過した透過液が排出される二次側の表面２と、を有する。ウイルス除去膜１０で測定されるバブルポイントは、０．５ＭＰａ以上１．０ＭＰａ以下、０．６ＭＰａ以上１．０ＭＰａ以下、あるいは０．７ＭＰａ以上１．０ＭＰａ以下である。

ウイルス除去膜１０で除去されるウイルスは、例えば３０ｎｍ以上、３５ｎｍ以上、あるいは４０ｎｍ以上、またあるいは５０ｎｍ以上、２００ｎｍ以下、１５０ｎｍ以下、あるいは１００ｎｍ以下、またあるいは７０ｎｍ以下の直径を有する。ウイルスの具体例としては、牛ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、及びＢ型肝炎ウイルスが挙げられる。牛ウイルス性下痢ウイルスは、約５０ｎｍから７０ｎｍの直径を有する。Ｂ型肝炎ウイルスは、約４２ｎｍの直径を有する。

ウイルス除去膜１０は、その断面において、ウイルスが捕捉されるウイルス捕捉部位を有する。ウイルス除去膜１０においては、溶液が進入するろ過面（一次側の表面１）上の場所によらず、断面において、ウイルス捕捉部位におけるウイルス捕捉量が均一であることが好ましい。これは、ウイルス除去膜１０のウイルス捕捉量が、ろ過面上の場所によって不均一である場合、ろ過面上のある箇所に溶液が集中することとなり、部分的にその箇所へのウイルスの負荷量が増えることになるため、高圧条件下で大容量のろ過を行うと、その箇所からウイルスが漏れる可能性があるからである。また、ウイルス除去膜１０が中空糸膜の形状を有する場合は、その糸長方向に垂直な断面における周回方向において、ウイルス捕捉部位におけるウイルス捕捉量が、図２に示すように不均一であることがなく、図３に示すように均一であることが好ましい。

さらに、ウイルス除去膜１０は、ウイルスが捕捉される部位の厚みが、ウイルス捕捉部位内で均一であることが好ましい。また、ウイルス除去膜１０が中空糸膜の形状を有する場合は、周回方向において、ウイルス捕捉部位の厚みが均一であることが好ましい。ウイルス捕捉部位の厚みが均一であると、周回方向に均一に溶液が広がって、ウイルスが漏れる可能性が低下するためである。

ウイルス除去膜１０の構造は、一次側から二次側に向けて、空孔の孔径が減少した後、増加に転じる非対称構造であることが好ましい。ウイルス除去膜１０の断面において、ウイルス捕捉部位は、空孔の孔径が最小となる部位を含む。空孔の孔径が最小となる部位を含む構造は、ウイルス除去性能が高い傾向にある。

ここで、ウイルス除去膜１０に捕捉されたウイルスを視覚的に検出することは、困難である場合がある。これに対し、金コロイドは、ウイルスと同程度の直径を有しながら光を透過させないことから、視覚的に検出することが容易である。そのため、例えば、金コロイドを含有する溶液をウイルス除去膜１０でろ過した後、ウイルス除去膜１０の断面における、金コロイドを捕捉したウイルス除去膜１０の金コロイド捕捉部位の相対的な輝度を測定することにより、ウイルス除去膜１０の特性を評価することが可能である。

実施の形態に係るウイルス除去膜１０について、一次側の表面１からウイルス除去膜１０に直径３０ｎｍの金コロイドを含有する溶液を供給してウイルス除去膜１０で金コロイドを捕捉し、ウイルス除去膜１０の断面において輝度を測定するとき、輝度の変位のスペクトルの面積値の標準偏差を輝度の変位のスペクトルの面積値の平均値で除した値が、０．０１以上０．３０以下である。この値は、ウイルス除去膜１０における金コロイドの捕捉量の変動係数を示している。変動係数が小さいほど、ウイルス除去膜１０における金コロイド捕捉部位における金コロイドの捕捉量の均一性が高く、ウイルス除去膜の透水性能及びウイルス除去能が高いことを示している。

実施の形態に係るウイルス除去膜１０について、上記の変動係数を示す値は、０．０１以上０．３０以下、０．０１以上０．２９以下、０．０１以上０．２８以下、０．０１以上０．２７以下、０．０１以上０．２６以下、あるいは０．０１以上０．２５以下である。変動係数について、０．０１未満は測定限界である。また、変動係数が０．３０より大きいと、膜の周回方向の少なくともある一箇所に溶液が集中しうるため、ウイルスが漏れる可能性がある。

上記の変動係数が０．０１以上０．３０以下であれば、膜のウイルス捕捉部位（中空糸膜については周回方向）において、ウイルスが均一に捕捉されることとなり、ウイルス除去膜に負荷するウイルスの総量（ウイルスのタンパク製剤に対するスパイク量、又は総ろ過量）が増加した場合においても、高いウイルス除去性能を保つことができる。

上記の変動係数は、例えば以下の方法により測定される。金コロイド溶液をろ過した後のウイルス除去膜から切片を切り出し、切片の断面において金コロイドによって染まった部分の複数箇所の輝度プロファイルを、光学顕微鏡で測定する。金コロイドは光を吸収するため、輝度の変位は、金コロイドの捕捉量に依存する。なお、必要に応じて、輝度プロファイルからバックグランドノイズを除去してもよい。その後、横軸に膜厚、縦軸に輝度の変位を有するグラフを作成し、グラフに現れた輝度の変位のスペクトルの面積を算出する。さらに、複数箇所における輝度の変位のスペクトルの面積の標準偏差を、複数箇所における輝度の変位のスペクトルの面積の平均で除した値を、ウイルス除去膜１０における金コロイド捕捉部位の金コロイドの捕捉量の変動係数を示す値として算出する。

湿潤状態のウイルス除去膜１０の断面において、直径３０ｎｍ以上４０ｎｍ以下の金コロイドを捕捉する部位の厚さは、１７．０μｍ以上２０．０μｍ以下、１７．５μｍ以上１９．８μｍ以下、あるいは１８．０μｍ以上１９．６μｍ以下である。金コロイド捕捉部位の厚さが２０．０μｍより厚いと、金コロイド含有溶液のみならず、ウイルス含有溶液のろ過の効率が低下する傾向にある。また１７．０μｍよりも薄いとウイルス除去膜に負荷するウイルスの総量（ウイルスのタンパク製剤に対するスパイク量又は総ろ過量）が増加した場合にウイルスが漏れる可能性がある。

直径３０ｎｍ、直径４０ｎｍ、及び直径５０ｎｍの金コロイドが捕捉される部位は、例えば以下の方法により測定される。直径３０ｎｍ、４０ｎｍ、及び５０ｎｍの金コロイド溶液のそれぞれをろ過したウイルス除去膜から切片を切り出す。切片の断面において金コロイドによって染まった部分複数箇所の輝度プロファイルを、光学顕微鏡で測定する。ここで、膜厚方向において、ウイルス除去膜１０の一次側の表面１から、金コロイド捕捉部位の最も一次側の表面に近い部分までの第１の距離ａを測定する。また、膜厚方向において、ウイルス除去膜１０の一次側の表面１から、金コロイド捕捉部位の最も二次側の表面２に近い部分までの第２の距離ｂを測定する。

次に、複数箇所のそれぞれにおいて、第１の距離ａを湿潤したウイルス除去膜の膜厚ｃで除して百分率で表した値Ａ（＝ａ／ｃの百分率表示）を算出し、複数箇所における値Ａの平均値を第１の到達度として算出する。また、複数箇所のそれぞれにおいて、第２の距離ｂを湿潤したウイルス除去膜の膜厚ｃで除して百分率で表した値Ｂ（＝ｂ／ｃの百分率表示）を算出し、複数箇所における値Ｂの平均値を第２の到達度として算出する。

さらに、下記（１）式に示すように、直径３０ｎｍの金コロイドをろ過したウイルス除去膜における第２の到達度の平均値Ｂ_３０と、直径４０ｎｍの金コロイドをろ過したウイルス除去膜における第１の到達度の平均値Ａ_４０と、の差に、直径３０ｎｍの金コロイドをろ過した湿潤したウイルス除去膜の膜厚の平均値Ｃ_３０と直径４０ｎｍの金コロイドをろ過し、湿潤したウイルス除去膜の膜厚の平均値Ｃ_４０の平均値Ｃ_ＡＶＥを乗じた値を、直径３０ｎｍの金コロイド及び直径４０ｎｍの金コロイドを流通させた時に、ウイルス除去膜１０の断面において、直径３０ｎｍ以上４０ｎｍ以下の金コロイドが捕捉される部位の厚さＴとして算出する。
Ｔ＝（Ｂ_３０−Ａ_４０）×Ｃ_ＡＶＥ （１）

なお、上記の方法では、直径３０ｎｍ以上直径４０ｎｍ以下の金コロイド捕捉部位を、直径４０ｎｍの金コロイドをろ過したウイルス除去膜における第１の到達位置と、直径３０ｎｍの金コロイドをろ過したウイルス除去膜における第２の到達位置と、の間の領域の厚みとして求めているが、誤差の範囲を除いて、直径３０ｎｍ以上直径４０ｎｍ以下の金コロイドであれば、上記の範囲に捕捉されることを確認している。

直径５０ｎｍの金コロイドを含有する溶液をウイルス除去膜１０でろ過した場合、湿潤状態のウイルス除去膜１０の断面において、直径５０ｎｍの金コロイドが捕捉される部位は、光学顕微鏡で測定すると、例えば、一次側の表面１から膜厚の５％以上３５％以下、あるいは６％以上３０％以下のところにある。一次側の表面から膜厚の５％未満の部位で直径５０ｎｍの金コロイドが捕捉される膜では、ウイルスや不純物が膜の一次側の表面に近い位置で捕捉されてしまい、目詰まりを起こす可能性が高くなる。また、一次側の表面から膜厚の３５％より遠い部位で直径５０ｎｍの金コロイドが捕捉される膜では、目的とするウイルスが膜の二次側の表面に近い位置で捕捉されてしまい、ウイルスが捕捉できない可能性がある。

なお、一次側の表面１から、膜厚の５％未満、又は、３５％より遠い領域に、直径５０ｎｍの金コロイドの少量が捕捉される場合であっても、光学顕微鏡による観察で、定数（２５５）から測定した輝度プロファイルを引いた輝度の変位について、そのスペクトルの絶対値が、スペクトルの絶対値の最大値の１０％以下の場合は、当該ウイルス除去膜のウイルス除去能の観点から当該領域における金コロイドの捕捉は誤差の範囲内とみなすことができる。したがって、この場合、直径５０ｎｍの金コロイドが捕捉される部位は、一次側の表面１から膜厚の５％以上３５％以下のところにあるものとみなしうる。

直径４０ｎｍの金コロイドを含有する溶液をウイルス除去膜１０でろ過した場合、湿潤状態のウイルス除去膜１０の断面において、直径４０ｎｍの金コロイドが捕捉される部位は、光学顕微鏡で測定すると、例えば、一次側の表面１から膜厚の８％以上５０％以下、あるいは９％以上４０％以下のところにある。一次側の表面から膜厚の８％未満の部位で直径４０ｎｍの金コロイドが捕捉される膜では、ウイルスや不純物が膜の一次側の表面に近い位置で捕捉されてしまい、目詰まりを起こす可能性が高くなる。また、一次側の表面から膜厚の５０％より遠い部位で直径４０ｎｍの金コロイドが捕捉される膜では、目的とするウイルスが膜の二次側の表面に近い位置で捕捉されてしまい、ウイルスが捕捉できない可能性がある。

なお、直径５０ｎｍの金コロイドの場合と同様に、一次側の表面１から膜厚の８％未満、又は、５０％より遠い領域で、金コロイドが観察されたとしても、光学顕微鏡による観察で、定数（２５５）から測定した輝度プロファイルを引いた輝度の変位について、そのスペクトルの絶対値が、スペクトルの絶対値の最大値の１０％以下の場合は、誤差の範囲内とみなしうる。

直径３０ｎｍの金コロイドを含有する溶液をウイルス除去膜１０でろ過した場合、湿潤状態のウイルス除去膜１０の断面において、直径３０ｎｍの金コロイドが捕捉される部位は、光学顕微鏡で測定すると、例えば、一次側の表面１から膜厚の１０％以上８０％以下、あるいは１５％以上７０％以下である。一次側の表面から膜厚の１０％未満の部位で直径３０ｎｍの金コロイドが捕捉される膜では、ウイルスや不純物が膜の一次側表面に近い位置で捕捉されてしまい、目詰まりを起こす可能性が高くなる。また、一次側の表面から膜厚の８０％より遠い部位で直径３０ｎｍの金コロイドが捕捉される膜では、目的とするウイルスが膜の二次側表面に近い位置で捕捉されてしまい、ウイルスが捕捉できない可能性がある。

なお、直径５０ｎｍ、４０ｎｍの金コロイドの場合と同様に、一次側の表面１から膜厚の１０％未満、又は、８０％より遠い領域で、金コロイドが観察されたとしても、光学顕微鏡による観察で、定数（２５５）から測定した輝度プロファイルを引いた輝度の変位について、スペクトルの絶対値の最大値の１０％以下の場合は誤差の範囲内とみなしうる。

金コロイドを一次側の表面から二次側の表面にかけて膜厚方向に通液した際、金コロイドが捕捉される部位は、膜構造によって、厚み方向に連続的に形成される場合と断続的に形成される場合がある。実施の形態に係るウイルス除去膜では、一次側の表面の内側から二次側の表面内側にかけて、直径５０ｎｍの金コロイドが捕捉される部位が、連続的に形成されることが好ましく、直径４０ｎｍの金コロイドが捕捉される部位が、連続的に形成されることが好ましく、直径３０ｎｍの金コロイドが捕捉される部位が、連続的に形成されることが好ましい。通液方向に対して金コロイドが捕捉される部位が途切れることなく連続に形成されると、目詰まりが生じにくくなる。

直径５０ｎｍ、４０ｎｍ及び３０ｎｍの金コロイドの捕捉位置の測定については、あくまで、膜に捕捉された金コロイドについて、測定を行う。したがって、膜に捕捉されず、膜を透過した金コロイドについては測定しない。つまり、膜に透過させた金コロイドの全てについて捕捉位置を測定するのではなく、膜に捕捉された金コロイドについて、その膜上の捕捉位置を測定する。

直径２０ｎｍの金コロイドを含有する溶液をウイルス除去膜１０でろ過する場合、ウイルス除去膜１０の断面には直径２０ｎｍの金コロイドは、ほぼ捕捉されない。このことは、光学顕微鏡（Ｂｉｏｚｅｒｏ、ＢＺ８１００、キーエンス社製）を用いた観察で、輝度のスペクトルを有意な値として検出できないことから確認できる。また、対数除去率が低くなることからも確認できる。なお、直径２０ｎｍの金コロイドが捕捉されないことは、ウイルスを除去しつつ、ＩｇＧ（分子量１５００００程度）などの直径１０ｎｍ程度の有用タンパク質はもちろん、フィブリノーゲン（分子量３４００００）、及びＩｇＭ（分子量９０００００）などの分子量の大きい有用タンパク質においても高い透過率で透過できることを示している。

ウイルス除去膜１０の材質は、セルロースからなる。セルロースとしては、再生セルロース、天然セルロース、酢酸セルロース等を用いることができる。再生セルロースを製造する方法としては、銅アンモニアセルロース溶液から作成する方法(銅安法)や、酢酸セルロースをアルカリでケン化させて作成する方法（ケン化法）が挙げられる。

ウイルス除去膜１０は、例えば、中空糸膜の形状を有している。あるいは、ウイルス除去膜１０は、図４に示すように、平膜の形状を有していてもよい。中空糸膜であれば、膜面積が大きくても、膜を容器に装填して小型のフィルタを作成できる。

図１に示すウイルス除去膜１０の膜厚は、例えば、乾燥状態で２５．０μｍ以上４５．０μｍ以下、あるいは３０．０μｍ以上４０．０μｍ以下である。膜厚の標準偏差は、５．０μｍ以下、あるいは４．０μｍ以下である。膜厚が２５μｍより薄いと膜の強度が低下し、ろ過圧に耐えられなくなる可能性があり、また４５μｍより厚いとろ過速度が低下する可能性がある。膜厚の標準偏差が５．０μｍより大きいと、膜厚のムラが大きく、均一性が低下する傾向にある。

ウイルス除去膜１０の内径は、例えば、乾燥状態で２５０μｍ以上４００μｍ以下、あるいは３００μｍ以上３６０μｍ以下である。内径の標準偏差は、１５．０μｍ以下、あるいは１０．０μｍ以下である。内径が２５０μｍより小さいと中空糸の入口や中空糸内での圧力損失が大きくなり、ろ過速度が低下する可能性があり、４００μｍより大きいとデッドスペースである中空部の体積が増えるため、フィルタが大型化する傾向にある。また、内径の標準偏差が１５．０μｍより大きいと、中空糸膜の構造のムラが大きく、金コロイド捕捉位置の均一性が低下する傾向にある。

ウイルス除去膜１０が有する空孔の孔径は、例えば、３２．０ｎｍ以上３８．０ｎｍ以下、あるいは３２．０ｎｍ以上３７．０ｎｍ以下である。孔径が３２ｎｍより小さいとろ過速度が低下する可能性があり、また、３８ｎｍより大きいとウイルスが漏れる可能性がある。ウイルス除去膜１０の断面において、一次側から二次側に向けて、空孔の孔径は、減少した後増加に転じる。例えば、ウイルス除去膜１０の断面において、ウイルス捕捉部位は、空孔の孔径が最小となる部位を含む。例えば、直径３０ｎｍの金コロイドが捕捉される部位は、空孔の孔径が最小となる部位である。

ウイルス除去膜１０で測定される純水透過速度は、例えば、１００Ｌ／ｍ^２／ｈｒｓ／０．１ＭＰａ以上５００Ｌ／ｍ^２／ｈｒｓ／０．１ＭＰａ以下、１００Ｌ／ｍ^２／ｈｒｓ／０．１ＭＰａ以上４００Ｌ／ｍ^２／ｈｒｓ／０．１ＭＰａ以下、あるいは１５０Ｌ／ｍ^２／ｈｒｓ／０．１ＭＰａ以上３００Ｌ／ｍ^２／ｈｒｓ／０．１ＭＰａ以下である。

ウイルス除去膜１０による直径が４０ｎｍ以上のウイルスの対数除去率（ＬＲＶ：Ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｖａｌｕｅ）は、例えば４．００以上、４．５０以上、５．００以上、あるいは５．５０以上である。ＬＲＶが高いほど、ウイルスが除去される。ＬＲＶが５．５０以上であれば、ほとんどウイルスが漏れないと考えられる。

ウイルス除去膜１０による牛ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）のＬＲＶは、例えば４．００以上、４．５０以上、５．００以上、あるいは５．５０以上である。ＬＲＶが高いほど、ＢＶＤＶが除去される。ＬＲＶが５．５０以上であれば、ほとんどＢＶＤＶが漏れないと考えられる。

ウイルス除去膜１０による直径４０ｎｍの金コロイドの対数除去率（ＬＲＶ）は、例えば１．００以上、１．２０以上、あるいは１．４０以上である。ウイルス除去膜１０による直径３０ｎｍの金コロイドの対数除去率は、例えば１．００以上、１．２０以上、あるいは１．４０以上である。ウイルス除去膜１０による直径２０ｎｍの金コロイドの対数除去率は、例えば、０．１０未満である。

ウイルス除去膜１０の破裂強度は、例えば０．２８ＭＰａ以上、０．３０ＭＰａ以上、あるいは０．３２ＭＰａ以上である。０．２８ＭＰａ以下の場合、ろ過圧に耐えられなくなる可能性がある。また、破裂強度が低い場合、ろ過圧により孔構造が変形し、ウイルス捕捉性能が低下する可能性がある。

以上説明した特性を有する実施の形態に係るウイルス除去膜は、例えば、以下で説明する方法により製造される。中空糸膜状のウイルス除去膜を製造する際には、まず、セルロースを銅アンモニア溶液に溶解させた、セルロース濃度が例えば６．０重量％以上８．５重量％以下、あるいは７．０重量％以上８．５重量％以下、あるいは７．０重量％以上８．０重量％以下のセルロース銅アンモニア溶液を用意し、これにケイ酸塩を添加して、紡糸原液とする。なお、図５に示すように、ケイ酸塩の添加は、セルロースを銅アンモニア溶液に溶解させる前でも同時でもよい。ケイ酸塩としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、及びマグネシウムのケイ酸塩を用いることができる。これらのうち、ナトリウム及びカリウムのケイ酸塩が好ましく、メタケイ酸ナトリウムがより好ましい。

ケイ酸塩の添加量は、セルロース銅アンモニア溶液中の二酸化ケイ素濃度が、例えば５ｐｐｍ以上１００ｐｐｍ以下、５ｐｐｍ以上７０ｐｐｍ以下、あるいは５ｐｐｍ以上６０ｐｐｍ以下となるようにする。また、セルロース濃度に対する銅の濃度の比は、例えば、０．３０以上０．４０以下である。セルロース濃度に対するアンモニアの濃度の比は、例えば、０．６以上１．０以下である。

次に、紡糸原液を一定温度で加温し、紡糸原液のエイジングを行う。エイジング温度は３０℃以上４０℃以下、３０℃以上３７℃以下、あるいは３０℃以上３５℃以下であり、エイジング時間は４５時間以上１００時間以下、より好ましくは４８時間以上９６時間以下である。エイジング温度は、例えば、上記の範囲内で一定である。エイジング温度が４０℃を超える場合やエイジング時間が１００時間を超える場合、セルロース溶液中に酸化銅が発生し、製膜時に構造欠陥が生じる場合がある。加温の方法としては、例えば、室温をエイジング温度に設定する方法、熱交換器を使用する方法等がある。熱交換器としてはジャケット式、二重管式、シェル＆チューブ式、及びプレート式熱交換器等を用いることができる。紡糸原液のエイジングは、紡糸原液を配管中に送液しながら行ってもよいし、紡糸原液を貯槽内に滞留させて行ってもよい。

次に、水酸基を有さず、２８重量％のアンモニア水溶液への溶解度が１０重量％以上であり、かつ、セルロースを膨潤させない有機溶媒を少なくとも１種含む、紡糸原液に対してミクロ相分離を生じさせる溶液を凝固液として用意する。ミクロ相分離については、後に説明する。例えば、凝固液は、アセトン、アンモニア、及び水からなる。中空糸膜を製造する際には、後述するように、内部凝固液と、外部凝固液と、を用意する。内部凝固液においては、例えば、アセトン濃度が約４０重量％以上約６０重量％以下であり、アンモニア濃度が約０．５重量％以上約１．０重量％以下である。外部凝固液においては、例えば、アセトン濃度が約３０重量％以上約５０重量％以下であり、アンモニア濃度が約０重量％以上約０．２重量％以下である。

次に、紡糸原液を環状二重紡口より１．５ｃｃ／分以上８．０ｃｃ／分以下の一定量で吐出し、同時に、環状二重紡口の中央部に設けられた中央紡出口より内部凝固液を吐出する。吐出された紡糸原液及び内部凝固液を、直ちに凝固浴槽中の外部凝固液に浸漬する。ここで、内部及び外部凝固液の作用で、紡糸原液においてミクロ相分離が生じる。ミクロ相分離とは、セルロース濃厚相が、直径０．０１から数μｍの粒子として、溶媒又はセルロース希釈相から分離し、分散して安定化することをいう。ミクロ相分離は、最初、紡糸原液と内部及び外部凝固液との界面で生じ、次第に紡糸原液の内部でも生じていく。ミクロ相分離によって形成された粒子は、衝突や融合を繰り返しながら大きな粒子を形成していく。同時に、凝固液の作用により、粒子は次第に固化され、粒子が三次元的につながった高分子多孔質構造を有する中空糸膜が形成されていく。形成された中空糸膜は、巻き取られる。

凝固浴槽が細管で構成されている場合、凝固浴槽中における紡糸原液の流速は、例えば、５ｍ／分以上２０ｍ／分以下、８ｍ／分以上１５ｍ／分以下、あるいは９ｍ／分以上１２ｍ／分以下である。なお、凝固浴槽中における紡糸原液の流速は、形成される中空糸膜の巻き取り速度（紡速）に等しい。また、凝固浴槽に送液する外部凝固液の流量は、例えば、５０ｃｃ／分以上５００ｃｃ／分以下、６０ｃｃ／分以上３００ｃｃ／分以下、あるいは７０ｃｃ／分以上１５０ｃｃ／分以下である。

巻き取られた中空糸膜は、２重量％以上１０重量％以下の希硫酸に浸漬され、その後、純水で水洗される。これにより、セルロースが再生される。さらに、中空糸膜の水分を有機溶媒で置換する。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、及びアセトン等を用いることができる。その後、中空糸膜束の両端を固定し、１％から８％延伸した後、３０℃以上６０℃以下、５ｋＰａ以下の減圧下で中空糸膜束の乾燥を行い、実施の形態に係る中空糸膜状のウイルス除去膜が得られる。

セルロース銅アンモニア溶液は、セルロース溶解時に持ち込まれる空気や銅アンモニア溶液中に含まれる酸素と触れることで酸化崩壊し、重合度の低下が生じ、ひいては粘度の低下が生じる。そのため、配管で送液中の紡糸原液に粘度ムラが生じる。紡糸原液に粘度ムラが生じると、紡糸原液の配管中の流れに脈動等が生じるため、環状二重紡口からの紡糸原液の吐出安定性に影響を与え、形成される中空糸膜の糸長方向の膜厚や中空糸径にバラつきが生じ、その結果、糸切れが生じる場合もある。さらに、紡糸原液に粘度ムラが生じると、紡口円周方向の紡糸原液の吐出量にバラつき等が生じるため、形成される中空糸膜の円周方向の膜厚や中空糸径にバラつきが生じ、その結果、円周方向の膜構造にもバラつきが生じる場合もある。また、重合度は紡糸原液の凝固速度にも影響する。そのため、紡糸原液において重合度のムラが大きいと、紡糸原液の凝固速度にばらつきが生じる。凝固速度にばらつきが生じると、形成される膜構造にばらつきが生じ、孔径分布が大きくなる。その結果、孔径のグラジエント構造がブロードになる。これは例えば直径３０ｎｍ以上直径４０ｎｍ以下の金コロイドが捕捉される部位の厚みが広がることにつながる。これに対し、本発明者らは鋭意検討した結果、セルロース溶解後のセルロース銅アンモニア溶液をエイジングすることで、セルロース銅アンモニア溶液を配管で送液中に酸化崩壊が抑制され、粘度ムラを低減させることができることを見出した。そのため、セルロース銅アンモニア溶液のエイジングにより、環状二重紡口からの紡糸原液の吐出安定性を向上させることができ、内径ムラや膜厚ムラが少なく、円周方向に均一な膜構造を有する中空糸膜を製膜できる。また、ムラが少ないことから、中空糸膜の耐破裂強度も向上する。

さらに、本発明者らは、セルロース銅アンモニア溶液中に二酸化ケイ素を添加することで、エイジングによる酸化銅の発生を抑制できることを見出した。エイジングの際に紡糸原液を加温すると、酸化銅が発生する。酸化銅は固形異物であるため、紡糸原液中に酸化銅が混入したまま製膜されると、後の酸で再生する工程で酸化銅が溶解し、膜構造に欠陥が生じる。そのため、酸化銅は、円周方向での孔径のばらつきの原因となる。また、極端な場合は膜にピンホールが形成される原因となったり、マクロボイド等の構造欠陥が生じる原因となったりする。したがって、セルロース銅アンモニア溶液のエイジングと、二酸化ケイ素添加と、の両方を実施することで、本実施形態に係るウイルス除去膜を安定的に製造することが可能である。

また、酸化銅が環状二重紡口の吐出口に付着すると、流路の一部が汚れたり、閉塞したりして、膜厚の一部が薄くなった偏肉状の中空糸や、一部に筋が入ったような形状の中空糸が形成される場合がある。そのため、酸化銅は、製膜される中空糸膜のバブルポイントやウイルス除去性能を低下させる。これに対し、二酸化ケイ素は銅と錯体を形成し、酸化銅の発生を抑制するため、二酸化ケイ素をセルロース銅アンモニア溶液に添加することで、酸化銅の発生を抑制しつつ、セルロース銅アンモニア溶液のエイジングを行うことができる。また、形成されるウイルス除去膜の膜厚が均一になることで、膜強度が向上し、ろ過加圧時のリーク発生を抑制することが可能となる。ただし、二酸化ケイ素が多すぎると、二酸化ケイ素が異物となる場合もあるので、二酸化ケイ素の濃度は１００ｐｐｍ以下であることが好ましい。

また、平膜状のウイルス除去膜は、例えば、以下の方法により製造される。銅アンモニアセルロース溶液にケイ酸塩を添加して混合し、製膜溶液を得る。続いて、製膜溶液をエイジングした後、製膜溶液をろ過及び脱ガス処理する。

次に、製膜溶液を凝固浴中を走行する支持体上にキャスティングして流延し、凝固させる。支持体の移動速度は毎分約１．０〜１０．０ｍとする。形成した平膜を酸で再生処理後、追加の水浴に通して引き出し、その後、乾燥機を使用して乾燥させる。

上述した方法で製造される中空糸、及び平膜状のウイルス除去膜は、被ろ過液入り口側の一次側空間とろ過液出側の２次側空間が膜によって仕切られたフィルタを作成するのに用いることができる。

上記のように本発明を実施の形態によって記載したが、この開示の一部をなす記述及び図面はこの発明を限定するものであると理解するべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかになるはずである。本発明はここでは記載していない様々な実施の形態等を包含するということを理解すべきである。

（ウイルス除去膜の製造）
コットンリンター（平均分子量１．４４×１０^５）とメタケイ酸ナトリウム（キシダ化学株式会社）を公知の方法で調製した銅アンモニア溶液中に溶解せしめ、二酸化ケイ素濃度が図６に記載のとおりであり、セルロース濃度が７．０重量％、アンモニア濃度が４．５重量％、銅濃度が２．５重量％の銅アンモニアセルロース溶液を調製した。セルロース濃度に対する銅濃度の比は０．３６であった。セルロース濃度に対するアンモニア濃度の比は０．６４であった。

次に、ジャケット式で加温可能な貯槽内で、銅アンモニアセルロース溶液を、図６に記載の温度及び滞留時間でエイジングした。その後、銅アンモニアセルロース溶液を脱泡し紡糸原液を得た。

次に、環状二重紡口の外側紡出口より、紡糸原液を３．６５ｃｃ／分で吐出し、同時に、環状二重紡口の中央紡出口より、図６に示す重量比のアセトン／アンモニア／水から成る内部凝固液を１．８ｃｃ／分で吐出した。環状二重紡口から吐出された紡糸原液及び内部凝固液を、図６に示す重量比のアセトン／アンモニア／水から成る外部凝固液で満たされた凝固浴槽中に導入して中空糸膜を形成し、巻き取り速度（紡速）１０ｍ／分で巻き取った。凝固浴槽には、特開平４−３７１２２１号公報に記載される直径７ｍｍのＵ字型漏斗細管を用い、外部凝固液の流速は２．６ｍ／分であった。

中空糸膜の巻き取りは、３０℃の水中で行った。１２０分間中空糸膜を巻き取った後、巻き取った中空糸膜を別の３０℃の水に６０分間浸漬した。その後、３重量％の硫酸水溶液で中空糸膜のセルロースを再生し、さらに水洗した。さらに、中空糸膜束の水分をメタノールで置換した。その後、中空糸膜束の両端を固定し、中空糸膜束を５．０％延伸した状態で、５０℃、３ｋＰａの条件下で中空糸膜束を真空乾燥させた。以上の方法で得られた中空糸膜を、実施例に係るウイルス除去膜とした。また、図６に示すように、エイジング条件を変えた製造条件下、あるいは二酸化ケイ素濃度を変えた製造条件下で、比較例に係るウイルス除去膜を製造した。

（ウイルス除去膜の物性）
（１）内径及び膜厚（乾燥中空糸）
１２０分間巻き取った糸束内の任意の乾燥中空糸１０本のそれぞれの糸長方向に垂直な断面切片を投影機（Ｖ‐１２Ｂ、Ｎｉｋｏｎ社製）で観察し、一つの中空糸断面に対し縦方向及び横方向の内径２カ所及び膜厚４ヶ所を測定し、それぞれ平均したものを内径及び膜厚の測定値とした。得られた実施例及び比較例に係るウイルス除去膜の平均内径、内径の標準偏差、平均膜厚、及び膜厚の標準偏差は、図７に示すとおりであった。

（２）滅菌前の純水透過速度
膜の液供給側である一次側とろ液が排出される二次側の両方を純水で満たし、その後温度２５℃の純水を２０ｋＰａの膜間差圧でろ過して、一次側から二次側に出てくる純水透過量を乾燥中空糸の膜面積１ｍ^２当たりＬ／ｈｒｓ／０．１ＭＰａの単位に換算した値を算出した。なお、純水とは、限外ろ過により精製した水をいう。得られた実施例及び比較例に係るウイルス除去膜の純水透過速度は、図７に示すとおりであった。

（３）平均孔径
空孔率Ｐｒは以下の方法で算出した。下記（２）式を用いて、膜厚、面積、及び重量の測定値から中空糸の見掛け密度ρａを求め、さらに下記（３）式を用いて、空孔率Ｐｒ（％）を求めた。
ρａ＝Ｗｄ／Ｖｗ＝４Ｗｄ／πｌ（Ｄｏ^２−Ｄｉ^２） （２）
Ｐｒ（％）＝（１−ρａ／ρｐ）×１００ （６） （３）
ここで、ρａは中空糸の見掛け密度（ｇ／ｃｍ^３）、Ｗｄは中空糸の絶乾重量（ｇ）、Ｖｗは中空糸の見かけ体積（ｃｍ^３）、ｌは中空糸の長さ（ｃｍ）、Ｄｏは中空糸の外径（ｃｍ）、Ｄｉは中空糸の内径（ｃｍ）、ρｐはセルロースの密度（ｇ／ｃｍ^３）を示す。

平均孔径は以下の方法で算出した。１０本の糸を束ね、１６ｃｍの有効長さになるようにモジュールを作成した。このモジュールの一端を閉とし、他端に２００ｍｍＨｇの圧力をかけ、３７℃で水を通した。このとき膜を通して出てくる水の量を透水量として測定した。また、あらかじめ、乾燥状態で内径と膜厚を測定し、これらの値から膜面積を算出した。平均孔径（ｎｍ）は下記式（４）を用いて算出した。
２ｒ＝２×１０^３×√（Ｖ・ｄ・μ／Ｐ・Ａ・Ｐｒ） （４）
ここで、２ｒは平均孔径（ｎｍ）、Ｖは透水量（ｍＬ／分）、ｄは膜厚（μｍ）、μは水の粘度（ｃｐ）、Ｐは圧力差（ｍｍＨｇ）、Ａは膜面積（ｃｍ^２）、Ｐｒは空孔率（％）を示す。以上の測定方法は、特許第２７０７２７４号公報に記載の測定方法を参考にした。得られた実施例及び比較例に係るウイルス除去膜の平均孔径は、図７に示すとおりであった。

（４）バブルポイント
表面張力γ（Ｎ／ｍ）の液体で膜を湿潤させた後、その膜に、気体で徐々に圧力をかけていくと、ある圧力で膜表面から連続的に気泡が発生するようになる。この時の気体圧力は、バブルポイント（ＭＰａ）と呼ばれている。バブルポイントの公知の測定方法はいずれも、連続気泡の発生を目視確認した時点での圧力をバブルポイントとしている。しかし、この判定法は、膜面積が小さい場合には気泡の発生量が少なく、見過ごす恐れがあること、及び、加圧以前から膜表面に付着していた気泡（界面破壊現象によって生じたものではない）の膜表面からの離脱を界面破壊現象による気泡であると見誤る恐れがあることから、誤差がでやすい。

本実施例では、より測定誤差を小さくするために、膜面積１ｃｍ^２当たり３．０ｍＬ／分の定量的な連続気泡の発生があった時点の圧力（ＭＰａ）をもってバブルポイントと定義した。また、湿潤液体には表面張力０．０１２（Ｎ／ｍ）のパーフルオロカーボン（ＦＸ３２５０、住友スリーエム株式会社製）を用い、加圧気体には窒素を用いた。以上の測定方法は、国際公開２００１／０１４０４７号に記載の測定方法を参考にした。計測された実施例及び比較例に係るウイルス除去膜のバブルポイントは、図７に示すとおりであった。

（５）破裂強度
実施例及び比較例に係るウイルス除去膜を用いて、９ｃｍの有効長さを有する１本の糸からなるモジュールを作製した。作製したモジュールを２５℃の水中に浸漬し、中空糸膜の一端を閉塞させ、他端から窒素で加圧した。加圧する圧力を徐々に上げていき、中空糸が破裂した時の圧力を中空糸破裂強度とした。計測された実施例及び比較例に係るウイルス除去膜の破裂強度は、図７に示すとおりであった。

（金コロイドを用いたウイルス除去膜の評価）
（１）金コロイド溶液の調製
粒径が２０、３０、４０、及び５０ｎｍの金コロイドをそれぞれ含む溶液（Ｃｙｔｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を購入した。次に、紫外・可視分光光度計（ＵＶｍｉｎｉ−１２４０、島津製作所製）で測定した各金コロイド溶液の金コロイドに応じた最大吸収波長における吸光度が０．２５になるよう、金コロイド溶液を、注射用蒸留水、ポリオキシエチレン−ナフチルエーテル（１．５９ｖｏｌ％）、及びポリ（４−スチレンスルホン酸ナトリウム）（０．２０ｖｏｌ％）で希釈した。

（２）金コロイド溶液のろ過
調製した金コロイド溶液のそれぞれ４０ｍＬを、７８．４ｋＰａの加圧下にて、製造した実施例及び比較例に係るウイルス除去膜でろ過した。ウイルス除去膜のろ過面積は、０．００１ｍ^２であった。なお、一つのウイルス除去膜に対して、一つの種類の金コロイド溶液を流した。

（３）ウイルス除去膜による金コロイドの除去率
紫外・可視分光光度計ＵＶｍｉｎｉ−１２４０（島津製作所製）を用いて、金コロイド溶液のそれぞれについて、金コロイドの最大吸収波長におけるろ過前の金コロイド溶液の吸光度Ａと、ろ液の吸光度Ｂと、を測定し、下記（５）式で与えられる、実施例及び比較例に係るウイルス除去膜による金コロイドの対数除去率（ＬＲＶ）を算出した。結果を、図８に示す。
ＬＲＶ＝ｌｏｇ_１０（Ａ／Ｂ） （５）

（４）金コロイド捕捉部位の均一性（変動係数）
金コロイド溶液をろ過した後の実施例及び比較例に係るウイルス除去膜から切片（厚みは８μｍ）を切り出し、切片の断面において金コロイドによって染まった部分２４０カ所の輝度プロファイルを、光学顕微鏡（Ｂｉｏｚｅｒｏ、ＢＺ８１００、キーエンス社製）で測定した。次に、定数（２５５）から測定した輝度プロファイルを引いた。その後、横軸に膜厚（１００分率）、縦軸に輝度の変位を有するグラフを作成し、グラフに現れた輝度の変位のスペクトルの面積を算出した。さらに、２４０カ所における輝度の変位のスペクトルの面積の標準偏差を、２４０カ所における輝度の変位のスペクトルの面積の平均で除した値を、実施例及び比較例に係るウイルス除去膜における金コロイド捕捉部位の金コロイドの捕捉量の変動係数を示す値として算出した。直径３０ｎｍの金コロイドのみを流したときの結果を、図８に示す。比較例に係るウイルス除去膜と比較して、実施例に係るウイルス除去膜のほうが、変動係数の値が小さい傾向にあった。よって、実施例に係るウイルスの除去膜における金コロイド捕捉部位における金コロイドの捕捉量の均一性が高いことが示された。これは、実施例に係るウイルスの除去膜のウイルス捕捉量の均一性が高いことを示している。

（５）金コロイド捕捉部位の厚さ
３０及び４０ｎｍの金コロイド溶液をそれぞれろ過した湿潤状態のウイルス除去膜から切片（厚みは８μｍ）を切り出した。湿潤状態の切片の断面において金コロイドによって染まった部分２４０カ所の輝度プロファイルを、光学顕微鏡（Ｂｉｏｚｅｒｏ、ＢＺ８１００、キーエンス社製）で測定した。ここで、膜厚方向において、ウイルス除去膜の一次側の表面から、金コロイドが捕捉された部位の最も一次側の表面に近い部分までの第１の距離ａを測定した。また、膜厚方向において、ウイルス除去膜の一次側の表面から、金コロイドが捕捉された部位の最も二次側の表面に近い部分までの第２の距離ｂを測定した。

次に、２４０カ所のそれぞれにおいて、第１の距離ａを湿潤状態のウイルス除去膜の膜厚ｃで除して百分率で表した値Ａ（＝ａ／ｃの百分率表示）を算出し、２４０カ所における値Ａの平均値を第１の到達度として算出した。また、２４０カ所のそれぞれにおいて、第２の距離ｂを湿潤状態のウイルス除去膜の膜厚ｃで除して百分率で表した値Ｂ（＝ｂ／ｃの百分率表示）を算出し、２４０カ所における値Ｂの平均値を第２の到達度として算出した。

さらに、上記（１）式に示すように、直径３０ｎｍの金コロイドをろ過したウイルス除去膜における第２の到達度の平均値Ｂ_３０と、直径４０ｎｍの金コロイドをろ過したウイルス除去膜における第１の到達度の平均値Ａ_４０と、の差に、直径３０ｎｍの金コロイドをろ過した湿潤状態のウイルス除去膜の膜厚の平均値Ｃ_３０と直径４０ｎｍの金コロイドをろ過した湿潤状態のウイルス除去膜の膜厚の平均値Ｃ_４０の平均値Ｃ_ＡＶＥを乗じた値を、ウイルス除去膜における金コロイド捕捉部位の厚さＴとして算出した。結果を図８に示す。

上記方法においては、直径３０ｎｍの金コロイドをろ過したウイルス除去膜と、直径４０ｎｍの金コロイドをろ過したウイルス除去膜と、の少なくとも２つのウイルス除去膜を用いて、緻密層の厚さを測定した。しかし、１つのウイルス除去膜のみを用いて、緻密層の厚さを測定することも可能である。この場合、１つのウイルス除去膜を用いて、直径３０ｎｍ及び４０ｎｍの両方の金コロイドを含む金コロイド溶液をろ過する。あるいは、１つのウイルス除去膜を用いて、直径３０ｎｍの金コロイド溶液をろ過した後、直径４０ｎｍの金コロイド溶液をろ過する。

その後、直径３０ｎｍ及び４０ｎｍの金コロイド溶液をろ過したウイルス除去膜から切片を切り出し、切片の断面において金コロイドによって染まった部分２４０カ所の輝度プロファイルを、光学顕微鏡（Ｂｉｏｚｅｒｏ、ＢＺ８１００、キーエンス社製）で測定する。ここで、膜厚方向において、ウイルス除去膜の一次側の表面から、金コロイド捕捉部位の最も一次側の表面に近い部分までの第１の距離ａ_１を測定する。また、膜厚方向において、ウイルス除去膜の一次側の表面から、金コロイド捕捉部位の最も二次側の表面に近い部分までの第２の距離ｂ_１を測定する。

次に、２４０カ所のそれぞれにおいて、第１の距離ａ１を湿潤したウイルス除去膜の膜厚ｃで除して百分率で表した値Ａ_１（＝ａ_１／ｃ_１の百分率表示）を算出し、２４０カ所における値Ａ_１の平均値を第１の到達度として算出する。また、２４０カ所のそれぞれにおいて、第２の距離ｂ_１を湿潤したウイルス除去膜の膜厚ｃで除して百分率で表した値Ｂ_１（＝ｂ_１／ｃ_１の百分率表示）を算出し、２４０カ所における値Ｂ_１の平均値を第２の到達度として算出する。

さらに、下記（６）式に示すように、ウイルス除去膜における第２の到達度の平均値Ｂ_１と、ウイルス除去膜における第１の到達度の平均値Ａ_１と、の差に、湿潤したウイルス除去膜の膜厚の平均値Ｃを乗じた値を、ウイルス除去膜における金コロイド捕捉部位の厚さＴとして算出する。（１）式で算出される厚さＴと、（６）式で算出される厚さＴと、の間に、大きな差は生じないことが確認されている。
Ｔ＝（Ｂ_１−Ａ_１）×Ｃ （６）

（６）ウイルス除去膜の金コロイド捕捉部位の粒径依存性（グラジエント性）
直径３０ｎｍ、４０ｎｍ及び５０ｎｍの金コロイド溶液をそれぞれろ過したウイルス除去膜から切片（厚みは８μｍ）を切り出した。湿潤状態のウイルス除去膜の膜厚は、光学顕微鏡（Ｂｉｏｚｅｒｏ、ＢＺ８１００、キーエンス社製）用いて測定した。切片の断面において金コロイドによって染まった部分２４０カ所の輝度プロファイルを、光学顕微鏡（Ｂｉｏｚｅｒｏ、ＢＺ８１００、キーエンス社製）で測定した。ここで、膜厚方向において、ウイルス除去膜の一次側の表面から、金コロイドが捕捉された部位の最も一次側の表面に近い部分までの第１の距離ａを測定した。また、膜厚方向において、ウイルス除去膜の一次側の表面から、金コロイドが捕捉された部位の最も二次側の表面に近い部分までの第２の距離ｂを測定した。

次に、２４０カ所のそれぞれにおいて、第１の距離ａを湿潤したウイルス除去膜の膜厚ｃで除して百分率で表した値Ａ（％）を算出し、２４０カ所における値Ａ（％）の平均値を第１の到達度として算出した。また、２４０カ所のそれぞれにおいて、第２の距離ｂを湿潤したウイルス除去膜の膜厚ｃで除して百分率で表した値Ｂ（％）を算出し、２４０カ所における値Ｂ（％）の平均値を第２の到達度として算出した。直径３０ｎｍ、４０ｎｍ及び５０ｎｍの金コロイドのそれぞれについて、第１の到達度の平均値と、第２の到達度の平均値と、を、図８に示す。なお、図８において、左側の数値が第１の到達度の平均値を表し、右側の数値が第２の到達度の平均値を表している。なお、直径５０ｎｍ、４０ｎｍ及び３０ｎｍの金コロイドの捕捉位置の測定について、あくまで、膜によって捕捉された金コロイドに関して測定したものであり、膜に捕捉されていない金コロイドについて測定するものではない。

（ウイルス除去膜のウイルス除去能）
（１）ウイルス含有抗体溶液の調製
ポリクローナル抗体（ヒトＩｇＧ）（ヴェノグロブリン−ＩＨ、日本血液製剤機構製）を用いて、抗体濃度が１０ｍｇ／ｍＬになるようにダルベッコＰＢＳ（−）で希釈した抗体溶液を得た。得られた抗体溶液に、牛ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）を５．０ｖｏｌ％添加し、十分に撹拌して、ウイルス含有抗体溶液を得た。

（２）ウイルス含有抗体溶液のろ過
７８．４ｋＰａのろ過圧力で、製造した膜面積０．００１ｍ^２のウイルス除去膜を用いて、ろ過量が１００Ｌ／ｍ^２に到達するまで、ウイルス含有抗体溶液のデッドエンドろ過を行った。ろ過圧力は供給液容器側に圧力計を設置して測定した。

（３）ウイルス除去率の測定
ＪＣＲＢ細胞バンクより入手し、培養したＭＤＢＫ（ＮＢＬ−１）細胞（ＪＣＲＢ ９０２８）を用意した。また、５６℃の水浴で３０分間加熱し非働化させた後の馬血清（ＨＳ、Ｇｉｂｃｏ社製）１０ｖｏｌ％と、ペニシリン／ストレプトマイシン（＋１００００ Ｕｎｉｔｓ／ｍＬ ペニシリン、＋１００００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、インビトロジェン製）１ｖｏｌ％含有Ｄ−ＭＥＭ（インビトロジェン製、高グルコース）と、の混合液を用意した。以下、この混合液を、１０ｖｏｌ％ＨＳ／Ｄ−ＭＥＭという。次に、ＭＤＢＫ細胞を１０ｖｏｌ％ＨＳ／Ｄ−ＭＥＭで希釈し、細胞濃度２．０×１０^５（細胞／ｍＬ）の希釈細胞懸濁液を調製した。その後、９６ウェル平底細胞培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の全てのウェルに、希釈細胞懸濁液を１００μＬずつ分注した。

ウイルス含有抗体溶液のろ液について、１０％ＨＳ／Ｄ−ＭＥＭによる１０倍、１０^２倍、１０^３倍、１０^４倍及び１０^５倍希釈液を調製した。また、ろ過直前に採取した元液（ウイルス含有抗体溶液）についても、１０％ＨＳ／Ｄ−ＭＥＭによる１０^２倍、１０^３倍、１０^４倍、１０^５倍、１０^６倍及び１０^７倍希釈液を調製した。

希釈細胞懸濁液を分注した細胞培養プレートの８ウェルごとに、ウイルス含有抗体溶液のろ液及び同ろ液の１０倍、１０^２倍、１０^３倍、１０^４倍及び１０^５倍希釈液と、元液の１０^２倍、１０^３倍、１０^４倍、１０^５倍、１０^６倍及び１０^７倍希釈液と、のそれぞれを、１００μＬずつ分注した。その後、３７℃、５％二酸化炭素雰囲気下にあるインキュベーターの中に細胞培養プレートを配置し、細胞を３日間培養した。

３日間培養した細胞について、細胞変性効果（ＣＰＥ）の有無を顕微鏡観察により確認し、細胞変性効果が確認されたものをウイルス感染が起きたウェル、細胞変性効果が確認されなかったものをウイルス感染が起きなかったウェルとして数えた。さらに、ウイルス含有抗体溶液のろ液及び同ろ液の希釈液と、元液希釈液のそれぞれが分注されたウェルごとに、ウイルス感染の割合を確認し、Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法（ウイルス実験学総論、国立予防衛生研究所学友会編、ｐ．４７９−４８０参照）により、感染価としてｌｏｇ_１０（ＴＣＩＤ_５０／ｍＬ）を算出し、下記（７）式を用いてウイルスの対数除去率（ＬＲＶ）を算出した。結果を、図８に示す。比較例に係るウイルス除去膜と比較して、実施例に係るウイルス除去膜のほうが、ウイルス除去率が高い傾向にあった。
ＬＲＶ＝ｌｏｇ_１０（Ｃ_０／Ｃ_Ｆ） （７）
ここで、Ｃ_０は、ウイルス除去膜でろ過する前の元液（ウイルス含有抗体溶液）中の感染価を表し、Ｃ_Ｆはウイルス除去膜でろ過した後のろ過液中の感染価を表す。

１ 一次側の表面
２ 二次側の表面
１０ ウイルス除去膜

Claims (25)

1. タンパク質を含有する溶液からウイルスを除去するためのウイルス除去膜であって、
   当該ウイルス除去膜は、
   セルロースを備え、
   前記タンパク質を含有する溶液が供給される一次側の表面と、
   当該ウイルス除去膜を透過した透過液が排出される二次側の表面と、
   を有し、
   バブルポイントが０．５ＭＰａ以上１．０ＭＰａ以下であり、
   前記一次側から当該ウイルス除去膜に直径３０ｎｍの金コロイドを含有する溶液を供給して当該ウイルス除去膜で前記金コロイドを捕捉し、当該ウイルス除去膜の断面において輝度を測定すると、前記輝度の変位のスペクトルの面積値の標準偏差を前記輝度の変位のスペクトルの面積値の平均値で除した値が０．０１以上０．３０以下であり、
   当該ウイルス除去膜の断面において、直径３０ｎｍ以上直径４０ｎｍ以下の金コロイドが捕捉される部位の厚さが、湿潤状態で、１７．０μｍ以上２０．０μｍ以下である、
   ウイルス除去膜。
2. 湿潤状態の当該ウイルス除去膜の断面において、
   直径５０ｎｍの金コロイドが捕捉される部位が、前記一次側から当該ウイルス除去膜の膜厚の５％以上３５％以下のところにあり、
   直径４０ｎｍの金コロイドが捕捉される部位が、前記一次側から前記膜厚の８％以上５０％以下のところにあり、
   直径３０ｎｍの金コロイドが捕捉される部位が、前記一次側から前記膜厚の１０％以上８０％以下のところにある、
   請求項１に記載のウイルス除去膜。
3. 直径４０ｎｍの金コロイドの対数除去率が１．００以上であり、
   直径３０ｎｍの金コロイドの対数除去率が１．００以上であり、
   直径２０ｎｍの金コロイドの対数除去率が０．１０未満である、
   請求項１又は２に記載のウイルス除去膜。
4. 直径２０ｎｍの金コロイドが捕捉されない、請求項１から３のいずれか１項に記載のウイルス除去膜。
5. 孔径が３２．０ｎｍ以上３８．０ｎｍ以下である、請求項１から４のいずれか１項に記載のウイルス除去膜。
6. 当該ウイルス除去膜の断面において、前記一次側から前記二次側に向けて、孔径が減少した後増加に転じる、請求項１から５のいずれか１項に記載のウイルス除去膜。
7. 前記直径３０ｎｍの金コロイドが捕捉される部位が、前記孔径が最小となる部位を含む、請求項６に記載のウイルス除去膜。
8. 乾燥状態で膜厚が２５．０μｍ以上４５．０μｍ以下である、請求項１から７のいずれか１項に記載のウイルス除去膜。
9. 前記膜厚の標準偏差が５．０μｍ以下である、請求項８に記載のウイルス除去膜。
10. バブルポイントが０．７ＭＰａ以上１．０ＭＰａ以下である、請求項１から９のいずれか１項に記載のウイルス除去膜。
11. 純水透過速度が、１００Ｌ／ｍ²／ｈｒｓ／０．１ＭＰａ以上５００Ｌ／ｍ²／ｈｒｓ／０．１ＭＰａ以下である、請求項１から１０のいずれか１項に記載のウイルス除去膜。
12. 平膜である、請求項１から１１のいずれか１項に記載のウイルス除去膜。
13. 中空糸膜である、請求項１から１１のいずれか１項に記載のウイルス除去膜。
14. 乾燥状態で内径が２５０μｍから４００μｍである、請求項１３に記載のウイルス除去膜。
15. 前記内径の標準偏差が１５．０μｍ以下である、請求項１４に記載のウイルス除去膜。
16. ４０ｎｍ以上のウイルスの対数除去率（ＬＲＶ）が４．０以上である、請求項１から１５のいずれか１項に記載のウイルス除去膜。
17. 牛ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）の対数除去率（ＬＲＶ）が４．０以上である、請求項１から１６のいずれか１項に記載のウイルス除去膜。
18. セルロース、銅、及び二酸化ケイ素を含む紡糸原液を３０℃以上４０℃以下に保つエイジング工程と、
    前記紡糸原液を用いて製膜する製膜工程と、
    を備え、
    前記エイジング工程を、４５時間以上１００時間以下行う、
    ウイルス除去膜の製造方法。
19. 前記製膜工程においてセルロースの濃度が６．０重量％以上８．５重量％以下である、請求項１８に記載のウイルス除去膜の製造方法。
20. 前記製膜工程においてセルロースの濃度に対する銅の濃度の比が０．３０以上０．４０以下である、請求項１８又は１９に記載のウイルス除去膜の製造方法。
21. 前記製膜工程において二酸化ケイ素の濃度が５ｐｐｍ以上１００ｐｐｍ以下である、請求項１８から２０のいずれか１項に記載のウイルス除去膜の製造方法。
22. 前記紡糸原液がアンモニアを更に備え、前記製膜工程においてセルロース濃度に対するアンモニアの濃度の比が０．６以上１．０以下である、請求項１８から２１のいずれか１項に記載のウイルス除去膜の製造方法。
23. 前記製膜工程において、凝固液に前記紡糸原液を吐出する、請求項１８から２２のいずれか１項に記載のウイルス除去膜の製造方法。
24. 前記製膜工程において、前記紡糸原液を、環状紡出口を用いて吐出する、請求項１８から２３のいずれか１項に記載のウイルス除去膜の製造方法。
25. 前記製膜工程において、支持体上に前記紡糸原液をキャスティングした後、凝固液に浸漬する、請求項１８から２３のいずれか１項に記載のウイルス除去膜の製造方法。