JP6220447B2 - ウイルス除去膜 - Google Patents

Description

本発明は、溶液からウイルスを除去するためのウイルス除去膜に関する。

近年、人血液由来の血漿分画製剤に加え、バイオ医薬品においても、ウイルス安全性を向上させる対策が必要となってきた。そのため医薬品製造メーカーにおいては製造工程中にウイルス除去／不活化工程を導入する検討を行っている。中でも、ウイルス除去膜を用いたろ過によるウイルス除去法は、有用なタンパク質を変性させることなく、ウイルスを低減することができる有効な方法である。

ウイルスのなかでも、特にパルボウイルスは、血漿分画製剤分野において、ヒトパルボウイルスＢ１９による感染の事例やバイオ医薬品分野でマウスのパルボウイルスのＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞への汚染の事例が報告されてきている。小ウイルスであるパルボウイルスは、エンベロープを持たないことから、物理化学的に安定で、医薬品の製造プロセス中で一般的に行われている不活化工程である加熱、低ｐＨ、化学薬品処理に対して耐性がある。そのため、不活化法とは異なる作用機序のウイルス除去方法として、ウイルス除去膜によるパルボウイルス除去のニーズが高まっている。

例えば特許文献１には、膜内壁面より壁内部に進むに従って面内空孔率が当初減少し、少なくとも１個の極小部を経過した後、外壁部で再び増大する孔構造（以下、「グラジェント構造」ともいう。）を有する高分子多孔質中空糸膜、及びこの膜を用いてタンパク質水溶液をろ過するウイルス除去方法が開示されている。このようなグラジェント構造を持ち、特定の平均孔径を有するウイルス除去膜は、タンパク水溶液からウイルスを除去するにあたり、高い除去率でウイルスを除去し、タンパク質を変性させることなく、高透過効率でタンパク質を回収するのに好適であるとされている。しかしながら、中程度のサイズ（３５ｎｍ〜５５ｎｍ）のウイルス除去性は示しても、小ウイルス（パルボウイルスなど）のウイルス除去性は担保できていない。

特許文献２には、銅アンモニアセルロース溶液をＵ字管中で凝固させることで、ミクロ相分離の構造形成中に、延伸による構造破壊を限りなく抑制し、高いウイルス除去性を達成できる中空糸膜の製造方法が開示されている。しかし、中程度のサイズ（ＪＥＶ）のウイルス除去には効果があるが、小ウイルスについては、充分な除去性が担保できていない。

特許文献３には、ウイルス除去膜のバブルポイントＢＰ（ＭＰａ）と表面張力γ（Ｎ／ｍ）との比（ＢＰ／γ）を調整することで、小ウイルスであるパルボウイルスを除去できることが開示されている。

特許文献４では、ウイルスやタンパク質を用いてウイルス除去膜の特性評価が行われている。この文献では、ウイルスとタンパク質を蛍光色素によって染色し、高いウイルス除去性能とタンパク質透過性に必要な膜構造について記述してある。しかし、ウイルス除去性を担保するための条件について充分に検討されておらず、また、ろ過効率（ろ過の処理量やろ過速度）を向上させるための検討はされていない。

特開平１−１４８３０５号公報 特開平４−３７１２２１号公報 国際公開第０１／１４０４７号 特開２０１０−１４５６４号公報

医薬品製造の現場では、有用なタンパク質とサイズが近い、小ウイルス（例としてパルボウイルス）に対する高いウイルス除去性を備えると共に、タンパク質の高いろ過効率を有するウイルス除去膜が求められており、ウイルス除去膜に対する要求は年々厳しくなっている。

これを受け、製造プロセス中のウイルス除去工程の能力を示すウイルス除去膜の評価試験では、ウイルス除去膜に負荷するウイルスの総量(ウイルスのタンパク製剤に対するスパイク量または、総ろ過量)を増加させるようになっている。このように、ウイルス除去膜の評価試験をクリアするための条件は年々厳しくなっている。

しかし、高いウイルス除去性能を維持しつつ、ろ過効率を高く維持することは、従来、困難であった。そこで、本発明は、ウイルス除去性及びろ過効率が高いウイルス除去膜を提供することを課題の一つとする。

本発明の態様によれば、タンパク質を含有する溶液からウイルスを除去するためのウイルス除去膜であって、タンパク質を含有する溶液が供給される一次側の表面と、当該ウイルス除去膜を透過した透過液が排出される二次側の表面と、を有するウイルス除去膜であって、一次側から当該ウイルス除去膜に直径２０ｎｍの金コロイドを含有する溶液を供給して当該ウイルス除去膜で金コロイドを捕捉し、当該ウイルス除去膜の断面において輝度を測定すると、輝度の変位のスペクトルの面積値の標準偏差を輝度の変位のスペクトルの面積値の平均値で除した値が０．０１以上１．５０以下であり、当該ウイルス除去膜の断面において、直径２０ｎｍ以上３０ｎｍ以下の金コロイドが捕捉される部位の厚さが、湿潤状態で、１０．０μｍ以上３０．０μｍ以下である、セルロースからなるウイルス除去膜が提供される。

例えば、湿潤状態の当該ウイルス除去膜の断面において、直径３０ｎｍの金コロイドが捕捉される部位は、一次側から当該ウイルス除去膜の膜厚の１５％以上６０％以下のところにあり、直径２０ｎｍの金コロイドが捕捉される部位は、一次側から膜厚の２５％以上８５％以下のところにあり、直径１５ｎｍの金コロイドが捕捉される部位は、一次側から膜厚の６０％以上９０％以下のところにある。

例えば、当該ウイルス除去膜は、直径１０ｎｍの金コロイドを捕捉しない。また、例えば、当該ウイルス除去膜による直径３０ｎｍの金コロイドの対数除去率は１．００以上であり、直径２０ｎｍの金コロイドの対数除去率は１．００以上であり、直径１５ｎｍの金コロイドの対数除去率は０．１０以上であり、直径１０ｎｍの金コロイドの対数除去率は０．１０未満である。例えば、当該ウイルス除去膜の平均孔径は１３ｎｍ以上２１ｎｍ以下である。例えば、当該ウイルス除去膜の断面において、一次側から二次側に向けて、孔径は、減少した後増加に転じる。例えば、当該ウイルス除去膜において、金コロイドが捕捉される部位は、孔径が最小となる部位を含む。

例えば、当該ウイルス除去膜の膜厚は、乾燥状態で２４μｍ以上４１μｍ以下である。また、例えば、当該ウイルス除去膜のバブルポイントは１.２ＭＰａ以上１.８ＭＰａ以下であり、純水透過速度は３０Ｌ／ｍ^２／ｈｒｓ／０．１ＭＰａ以上１２０Ｌ／ｍ^２／ｈｒｓ／０．１ＭＰａ以下である。当該ウイルス除去膜は、中空糸膜であってもよいし、平膜であってもよい。

例えば、輝度の変位のスペクトルの面積値の標準偏差を輝度の変位のスペクトルの面積値の平均値で除した値が０．０１以上１．２０以下であってもよい。また、例えば、当該ウイルス除去膜の断面において、直径２０ｎｍ以上直径３０ｎｍ以下の金コロイドが捕捉される部位の厚さが、湿潤状態で、１３．０μｍ以上２０．０μｍ以下であってもよい。

本発明によれば、ウイルス除去性及びろ過効率が高いウイルス除去膜を提供可能である。

本発明の実施の形態に係る中空糸膜の形状を有するウイルス除去膜の模式図である。 本発明の参考例に係る中空糸膜の形状を有するウイルス除去膜におけるウイルス捕捉部位の模式図である。 本発明の実施の形態に係る中空糸膜の形状を有するウイルス除去膜におけるウイルス捕捉部位の模式図である。 本発明の実施の形態に係る平膜の形状を有するウイルス除去膜の模式図である。 本発明の実施例に係るウイルス除去膜の製造条件を示す表である。 本発明の比較例に係るウイルス除去膜の製造条件を示す表である。 本発明の実施例に係るウイルス除去膜の評価結果を示す表である。 本発明の比較例に係るウイルス除去膜の評価結果を示す表である。

以下に本発明の実施の形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号で表している。但し、図面は模式的なものであり、具体的な寸法等を正確に示したものではない。したがって、具体的な寸法等は以下の説明を照らし合わせて判断するべきものであり、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることは勿論である。

図１に示すように、実施の形態に係るタンパク質を含有する溶液からウイルスを除去するためのウイルス除去膜１０は、タンパク質を含有する溶液が供給される一次側の表面１と、当該ウイルス除去膜１０を透過した透過液が排出される二次側の表面２と、を有する。

ウイルス除去膜１０で除去される小ウイルスは、例えば１０ないし３０ｎｍ、あるいは１８ないし２４ｎｍの直径を有する。ウイルスの具体例としては、パルボウイルスが挙げられる。パルボウイルスは、約２０ｎｍの直径を有する。ウイルス除去膜１０は、その断面において、ウイルスが捕捉されるウイルス捕捉部位を有する。ウイルス除去膜１０においては、溶液が進入するろ過面（一次側の表面１）上の場所によらず、断面において、ウイルス捕捉部位におけるウイルス捕捉量が均一であることが好ましい。これは、ウイルス除去膜１０のウイルス捕捉量が、ろ過面上の場所によって不均一である場合、ろ過面上のある箇所に溶液が集中することとなり、部分的にその箇所へのウイルスの負荷量が増えることになるため、高圧条件下で大容量のろ過を行うと、その箇所からウイルスが漏れる可能性があるからである。また、ウイルス除去膜１０が中空糸膜の形状を有する場合は、周回方向において、ウイルス捕捉部位におけるウイルス捕捉量が、図２に示すように不均一であることがなく、図３に示すように均一であることが好ましい。

さらに、ウイルス除去膜１０は、ウイルスが捕捉される部位の厚みが、ウイルス捕捉部位内で均一であることが好ましい。また、ウイルス除去膜１０が中空糸膜の形状を有する場合は、周回方向において、ウイルス捕捉部位の厚みが均一であることが好ましい。ウイルス捕捉部位の厚みが均一であると、周回方向に均一に溶液が広がって、ウイルスが漏れる可能性が低下するためである。

ウイルス除去膜１０の構造は、一次側から二次側に向けて、空孔の孔径が減少した後、増加に転じる非対称構造であることが好ましい。ウイルス除去膜１０の断面において、ウイルス捕捉部位は、空孔の孔径が最小となる部位を含む。空孔の孔径が最小となる部位を含む構造は、ウイルス除去性の向上に効果的である。

ここで、ウイルス除去膜１０に捕捉されたウイルスを視覚的に検出することは、困難である場合がある。これに対し、金コロイドは、ウイルスと同程度の直径を有しながら光を透過させないことから、視覚的に検出することが容易である。そのため、例えば、金コロイドを含有する溶液をウイルス除去膜１０でろ過した後、ウイルス除去膜１０の断面における、金コロイドを捕捉したウイルス除去膜１０の金コロイド捕捉部位の相対的な輝度を測定することにより、ウイルス除去膜１０の特性を評価することが可能である。

実施の形態に係るウイルス除去膜１０について、一次側の表面１からウイルス除去膜１０に直径２０ｎｍの金コロイドを含有する溶液を供給してウイルス除去膜１０で金コロイドを捕捉し、ウイルス除去膜１０の断面において輝度を測定するとき、輝度の変位のスペクトルの面積値の標準偏差を輝度の変位のスペクトルの面積値の平均値で除した値は、０．０１以上１．５０以下である。この値は、ウイルス除去膜１０における金コロイドの捕捉量の変動係数を示しており、小さいほど、ウイルス除去膜１０における金コロイド捕捉部位における金コロイドの捕捉量の均一性が高いことを示している。

実施の形態に係るウイルス除去膜１０について、上記の変動係数を示す値は、０．０１以上１．５０以下、０．０１以上１．４０以下、０．０１以上１．３０以下、０．０１以上１．２０以下、０．０１以上１．１０以下、あるいは０．０１以上１．００以下である。変動係数について、０．０１未満は測定限界である。また、変動係数が１．５０より大きいと、膜の周回方向の少なくともある一箇所に溶液が集中しうるため、ウイルスが漏れる可能性がある。

上記の変動係数が０．０１以上１．５０以下であれば、膜のウイルス捕捉部位（中空糸膜については周回方向）において、ウイルスが均一に捕捉されることとなり、ウイルス除去膜に負荷するウイルスの総量（ウイルスのタンパク製剤に対するスパイク量または、総ろ過量）が増加した場合においても、高いウイルス除去性能を保つことができる。

上記の変動係数は、例えば以下の方法により測定される。金コロイド溶液をろ過した後のウイルス除去膜から切片を切り出し、切片の断面において金コロイドによって染まった部分の複数箇所の輝度プロファイルを、光学顕微鏡で測定する。金コロイドは光を吸収するため、輝度の変位は、金コロイドの捕捉量に依存する。なお、必要に応じて、輝度プロファイルからバックグランドノイズを除去してもよい。その後、横軸に膜厚、縦軸に輝度の変位を有するグラフを作成し、グラフに現れた輝度の変位のスペクトルの面積を算出する。さらに、複数箇所における輝度の変位のスペクトルの面積の標準偏差を、複数箇所における輝度の変位のスペクトルの面積の平均で除した値を、ウイルス除去膜１０における金コロイド捕捉部位の金コロイドの捕捉量の変動係数を示す値として算出する。

湿潤状態のウイルス除去膜１０の断面において、直径２０ｎｍ以上３０ｎｍ以下の金コロイドを捕捉する部位の厚さは、１０．０μｍ以上３０．０μｍ以下、１０．０μｍ以上２５．０μｍ以下、１０．０μｍ以上２２．０μｍ以下、１０．０μｍ以上２０．０μｍ以下、好ましくは１１．０μｍ以上２０．０μｍ以下、より好ましくは１２．０μｍ以上２０．０μｍ以下、さらに好ましくは１３．０μｍ以上２０．０μｍ以下である。金コロイド捕捉部位の厚さが３０．０μｍより厚いと、金コロイド含有溶液のみならず、ウイルス含有溶液のろ過の効率が低下する傾向にある。また１０μｍよりも薄いとウイルス除去膜に負荷するウイルスの総量（ウイルスのタンパク製剤に対するスパイク量又は総ろ過量）が増加した場合にウイルスが漏れる可能性があるので、好ましくない。

直径２０ｎｍ以上直径３０ｎｍ以下の金コロイド捕捉部位の厚さは、例えば以下の方法により取得される。直径２０ｎｍ及び３０ｎｍの金コロイド溶液をそれぞれろ過したウイルス除去膜から切片を切り出す。切片の断面において金コロイドによって染まった部分複数箇所の輝度プロファイルを、光学顕微鏡で測定する。ここで、膜厚方向において、ウイルス除去膜１０の一次側の表面１から、金コロイド捕捉部位の最も一次側の表面に近い部分までの第１の距離ａを測定する。また、膜厚方向において、ウイルス除去膜１０の一次側の表面１から、金コロイド捕捉部位の最も二次側の表面２に近い部分までの第２の距離ｂを測定する。

次に、複数箇所のそれぞれにおいて、第１の距離ａを湿潤したウイルス除去膜の膜厚ｃで除して百分率で表した値Ａ（＝ａ／ｃの百分率表示）を算出し、複数箇所における値Ａの平均値を第１の到達度として算出する。また、複数箇所のそれぞれにおいて、第２の距離ｂを湿潤したウイルス除去膜の膜厚ｃで除して百分率で表した値Ｂ（＝ｂ／ｃの百分率表示）を算出し、複数箇所における値Ｂの平均値を第２の到達度として算出する。

さらに、下記（１）式に示すように、直径２０ｎｍの金コロイドをろ過したウイルス除去膜における第２の到達度の平均値Ｂ_２０と、直径３０ｎｍの金コロイドをろ過したウイルス除去膜における第１の到達度の平均値Ａ_３０と、の差に、直径２０ｎｍの金コロイドをろ過した湿潤したウイルス除去膜の膜厚の平均値Ｃ_２０と直径３０ｎｍの金コロイドをろ過し、湿潤したウイルス除去膜の膜厚の平均値Ｃ_３０の平均値Ｃ_ＡＶＥを乗じた値を、直径２０ｎｍの金コロイド及び直径３０ｎｍの金コロイドを流通させた時に、ウイルス除去膜１０の断面において、直径２０ｎｍ以上３０ｎｍ以下の金コロイドが捕捉される部位の厚さＴとして算出する。金コロイド捕捉部位の厚さＴは、ウイルス除去膜の緻密層の厚さＴとも表現される。
Ｔ＝（Ｂ_２０−Ａ_３０）×Ｃ_ＡＶＥ （１）
なお、上記の方法では、直径２０ｎｍ以上直径３０ｎｍ以下の金コロイド捕捉部位を、直径３０ｎｍの金コロイドをろ過したウイルス除去膜における第１の到達位置と、直径２０ｎｍの金コロイドをろ過したウイルス除去膜における第２の到達位置と、の間の領域の厚みとして求めているが、誤差の範囲を除いて、直径２０ｎｍ以上直径３０ｎｍ以下の金コロイドであれば、上記の範囲に捕捉されることを確認している。

直径３０ｎｍの金コロイドを含有する溶液をウイルス除去膜１０でろ過した場合、湿潤状態のウイルス除去膜１０の断面において、直径３０ｎｍの金コロイドが捕捉される部位は、光学顕微鏡で測定すると、例えば、一次側の表面１から膜厚の１５％以上６０％以下、あるいは２０％以上５５％以下のところにある。一次側の表面から膜厚の１５％未満の部位で直径３０ｎｍの金コロイドが捕捉される膜では、ウイルスや不純物が膜の一次側の表面に近い位置で捕捉されてしまい、目詰まりを起こす可能性が高くなる。また、一次側の表面から膜厚の６０％より遠い部位で直径３０ｎｍの金コロイドが捕捉される膜では、目的とするウイルスが膜の二次側の表面に近い位置で捕捉されてしまい、ウイルスが捕捉できない可能性がある。なお、一次側の表面１から、膜厚の１５％未満、又は、６０％より遠い領域に、直径３０ｎｍの金コロイドの少量が捕捉される場合であっても、光学顕微鏡による観察で定数（２５５）から測定した輝度プロファイルを引いた輝度の変位について、そのスペクトルの絶対値が、スペクトルの絶対値の最大値の１０％以下の場合は、当該ウイルス除去膜のウイルス除去能の観点から当該領域における金コロイドの捕捉は誤差の範囲内とみなすことができる。したがって、この場合、直径３０ｎｍの金コロイドが捕捉される部位は、一次側の表面１から膜厚の１５％以上６０％以下のところにあるものとみなしうる。

金コロイドが捕捉される部位は、金コロイドが一次側の表面から二次側の表面にかけて膜厚方向に通液した際、膜構造によって、厚み方向に連続的に形成される場合と断続的に形成される場合がある。実施の形態に係るウイルス除去膜では一次側の表面の内側から二次側の表面内側にかけて、金コロイドが捕捉される部位が、連続的に形成されることが好ましい。通液方向に対して金コロイドが捕捉される部位が途切れることなく連続に形成されると、目詰まりが生じにくくなる。

直径２０ｎｍの金コロイドを含有する溶液をウイルス除去膜１０でろ過した場合、湿潤状態のウイルス除去膜１０の断面において、直径２０ｎｍの金コロイドが捕捉される部位は、光学顕微鏡で測定すると、例えば、一次側の表面１から膜厚の２５％以上８５％以下、あるいは３０％以上８０％以下のところにある。一次側の表面から膜厚の２５％未満の部位で直径２０ｎｍの金コロイドが捕捉される膜では、ウイルスや不純物が膜の一次側の表面に近い位置で捕捉されてしまい、目詰まりを起こす可能性が高くなる。また、一次側の表面から膜厚の８５％より遠い部位で直径２０ｎｍの金コロイドが捕捉される膜では、目的とするウイルスが膜の二次側の表面に近い位置で捕捉されてしまい、ウイルスが捕捉できない可能性がある。なお、直径３０ｎｍの金コロイドの場合と同様に、一次側の表面１から膜厚の２５％未満、又は、８５％より遠い領域で、金コロイドが観察されたとしても、光学顕微鏡による観察で定数（２５５）から測定した輝度プロファイルを引いた輝度の変位について、そのスペクトルの絶対値が、スペクトルの絶対値の最大値の１０％以下の場合は、誤差の範囲内とみなしうる。なお、実施の形態に係るウイルス除去膜では、直径２０ｎｍの金コロイドが捕捉される部位が、一次側の表面内側から二次側の表面内側にかけて、膜厚方向に連続して形成されることが好ましい。

直径１５ｎｍの金コロイドを含有する溶液をウイルス除去膜１０でろ過した場合、湿潤状態のウイルス除去膜１０の断面において、直径１５ｎｍの金コロイドが捕捉される部位は、光学顕微鏡で測定すると、例えば、一次側の表面１から膜厚の６０％以上９０％以下好ましくは６０％以上８９％以下、６０％以上８８％以下、６０％以上８７％以下である。特に８７％以下にあると、ウイルスの捕捉において好ましい。さらに、８６％以下であるとより好ましい。一次側の表面から膜厚の６０％未満の部位で直径１５ｎｍの金コロイドが捕捉される膜では、ウイルスや不純物が膜の一次側表面に近い位置で捕捉されてしまい、目詰まりを起こす可能性が高くなる。また、一次側の表面から膜厚の９０％より遠い部位で直径１５ｎｍの金コロイドが捕捉される膜では、目的とするウイルスが膜の二次側表面に近い位置で捕捉されてしまい、ウイルスが捕捉できない可能性がある。なお、直径３０ｎｍ、２０ｎｍの金コロイドの場合と同様に、一次側の表面１から膜厚の６０％未満、又は、９０％より遠い領域で、金コロイドが観察されたとしても、光学顕微鏡による観察で定数（２５５）から測定した輝度プロファイルを引いた輝度の変位について、スペクトルの絶対値の最大値の１０％以下の場合は誤差の範囲内とみなしうる。なお、実施の形態に係るウイルス除去膜では、直径１５ｎｍの金コロイドが捕捉される部位層が、一次側の表面内側から二次側の表面内側にかけて、膜厚方向に連続して形成されることが好ましい。

また、なお、直径３０ｎｍ、２０ｎｍ及び１５ｎｍの金コロイドの捕捉位置の測定については、あくまで、膜に捕捉された金コロイドについて、測定を行っている。したがって、膜に捕捉されず、膜を透過した金コロイドについては測定していないものである。つまり、膜に透過させた金コロイドの全てについて捕捉位置を測定したものではなく、膜に捕捉された金コロイドについて、その膜上の捕捉位置を測定したものである。

直径１０ｎｍの金コロイドを含有する溶液をウイルス除去膜１０でろ過する場合、ウイルス除去膜１０の断面には直径１０ｎｍの金コロイドは、ほぼ捕捉されない。このことは、光学顕微鏡（Ｂｉｏｚｅｒｏ、ＢＺ８１００、キーエンス社製）を用いた観察で、輝度のスペクトルを有意な値として検出できないことから確認できる。また、対数除去率が低くなることからも確認できる。なお、直径１０ｎｍの金コロイドが捕捉されないことは、ＩｇＧなどの直径１０ｎｍ程度の有用なタンパクの高い透過性を達成できることを示している。

ウイルス除去膜１０の材質は、セルロースからなる。セルロースとしては、再生セルロース、天然セルロース、酢酸セルロース等を用いることができる。再生セルロースを製造する方法としては、銅アンモニアセルロース溶液から作成する方法(銅安法)や、酢酸セルロースをアルカリでケン化させて作成する方法（ケン化法）が挙げられる。

ウイルス除去膜１０は、例えば、中空糸膜の形状を有している。あるいは、ウイルス除去膜１０は、図４に示すように、平膜の形状を有していてもよい。中空糸膜であれば、膜面積が大きくても、膜を容器に装填して小型のフィルターを作成できる。

図１に示すウイルス除去膜１０の膜厚は、例えば、乾燥状態で２４μｍ以上４１μｍ以下であり、好ましくは２４μｍ以上４０μｍ以下であり、より好ましくは２４μｍ以上３５μｍ以下であり、よりさらに好ましくは２４μｍ以上３０μｍ以下である。膜厚が２４μｍより薄いと膜の強度が低下し、ろ過圧に耐えられなくなる可能性があり、また４１μｍより厚いとろ過速度が低下する可能性がある。

ウイルス除去膜１０が有する空孔の平均孔径は、例えば、１３ｎｍ以上２１ｎｍ以下であり、好ましくは１３ｎｍ以上２０．５ｎｍ以下であり、より好ましくは１３．５ｎｍ以上２０．５ｎｍ以下である。平均孔径が１３ｎｍより小さいとろ過速度が低下する可能性があり、また、２１ｎｍより大きいとウイルスが漏れる可能性がある。ウイルス除去膜１０の断面において、一次側から二次側に向けて、空孔の孔径は、減少した後増加に転じる。例えば、ウイルス除去膜１０の断面において、ウイルス捕捉部位は、空孔の孔径が最小となる部位を含む。

ウイルス除去膜１０によるウイルスの対数除去率（ＬＲＶ：Ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｖａｌｕｅ）は、例えば４．００以上であれば、膜ろ過によりウイルスが十分に除去されるため好ましく、４．５０以上、５．００以上あるいは６．００以上であれば、より好ましい。ウイルスの対数除去率が６．００以上であれば、ウイルスが除去され、ほとんどウイルスが漏れないと考えられる。

ウイルス除去膜１０による直径３０ｎｍの金コロイドの対数除去率（ＬＲＶ）は、例えば１．００以上、好ましくは１．２０以上である。ウイルス除去膜１０による直径２０ｎｍの金コロイドの対数除去率は、例えば１．００以上、好ましくは１．２０以上である。ウイルス除去膜１０による直径１５ｎｍの金コロイドの対数除去率は、例えば０．１０以上、好ましくは０．１５以上、より好ましくは０．２０以上である。ウイルス除去膜１０による直径１０ｎｍの金コロイドの対数除去率は、例えば、０．１０未満である。

例えば、ウイルス除去膜１０の断面において、金コロイド捕捉部位は、孔径が最小となる部位を含む。

ウイルス除去膜１０で測定されるバブルポイントは、例えば、１.２ＭＰａ以上１.８ＭＰａ以下である。ウイルス除去膜１０で測定される純水透過速度は、３０Ｌ／ｍ^２／ｈｒｓ／０．１ＭＰａ以上１２０Ｌ／ｍ^２／ｈｒｓ／０．１ＭＰａ以下、４０Ｌ／ｍ^２／ｈｒｓ／０．１ＭＰａ以上１１５Ｌ／ｍ^２／ｈｒｓ／０．１ＭＰａ以下、あるいは５０Ｌ／ｍ^２／ｈｒｓ／０．１ＭＰａ以上１１０Ｌ／ｍ^２／ｈｒｓ／０．１ＭＰａ以下である。

以上説明した特性を有する実施の形態に係るウイルス除去膜は、例えば、以下で説明する方法により製造される。中空糸膜状のウイルス除去膜を製造する際には、まず、セルロースを銅アンモニア溶液に溶解させた、セルロース濃度が例えば約７．０重量％以上約８．０重量％以下のセルロース銅アンモニア溶液を用意し、これに無機塩を添加して、紡糸原液とする。なお、無機塩の添加は、セルロースを銅アンモニア溶液に溶解させる前でもよい。無機塩としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、及びマグネシウムの硫酸塩、亜硫酸塩、並びに炭酸塩を用いることができる。これらのうち、ナトリウム及びカリウムの硫酸塩、並びに亜硫酸塩が好ましく、硫酸ナトリウム及び亜硫酸ナトリウムがより好ましい。無機塩の添加量は、０．０２重量％以上０．９０重量％以下、０．０３重量％以上０．８０重量％以下、あるいは０．０４重量％以上０．７０重量％以下である。

また、水酸基を有さず、２８重量％のアンモニア水溶液への溶解度が１０重量％以上であり、かつ、セルロースを膨潤させない有機溶媒を少なくとも１種含む、セルロース銅アンモニア溶液に対してミクロ相分離を生じさせる溶液を凝固液として用意する。ミクロ相分離については、後に説明する。例えば、凝固液は、アセトン、アンモニア、及び水からなる。中空糸膜を製造する際には、後述するように、内部凝固液と、外部凝固液と、を用意する。内部凝固液においては、例えば、アセトン濃度が約３０重量％以上約５０重量％以下であり、アンモニア濃度が約０．５重量％以上約１．０重量％以下である。外部凝固液においては、例えば、アセトン濃度が約２０重量％以上約４０重量％以下であり、アンモニア濃度が約０重量％以上約０．２重量％以下である。

次に、紡糸原液を環状二重紡口より１．５ｃｃ／分以上８．０ｃｃ／分以下の一定量で吐出し、同時に、環状二重紡口の中央部に設けられた中央紡出口より内部凝固液を吐出する。吐出された紡糸原液及び内部凝固液を、直ちに凝固浴槽中の外部凝固液に浸漬する。ここで、内部及び外部凝固液の作用で、紡糸原液においてミクロ相分離が生じる。ミクロ相分離とは、セルロース濃厚相が、直径０．０１から数μｍの粒子として、溶媒又はセルロース希釈相から分離し、分散して安定化することをいう。ミクロ相分離は、最初、紡糸原液と内部及び外部凝固液との界面で生じ、次第に紡糸原液の内部でも生じていく。ミクロ相分離によって形成された粒子は、衝突や融合を繰り返しながら大きな粒子を形成していく。同時に、凝固液の作用により、粒子は次第に固化され、粒子が三次元的につながった高分子多孔質構造を有する中空糸膜が形成されていく。形成された中空糸膜は、巻き取られる。

凝固浴槽が細管で構成されている場合、凝固浴槽中における紡糸原液の流速は、例えば、５ｍ／分以上２０ｍ／分以下、８ｍ／分以上１５ｍ／分以下、あるいは９ｍ／分以上１２ｍ／分以下である。なお、凝固浴槽中における紡糸原液の流速は、形成される中空糸膜の巻き取り速度（紡速）に等しい。また、凝固浴槽に送液する外部凝固液の流量は、例えば、５０ｃｃ／分以上５００ｃｃ／分以下、１００ｃｃ／分以上３００ｃｃ／分以下、あるいは１３０ｃｃ／分以上２００ｃｃ／分以下である。外部凝固液の流量を凝固浴槽を構成する細管の断面積で除して求められる凝固浴槽中における外部凝固液の流速は、例えば、１．８ｍ／分以上１０．４ｍ／分以下、３．２ｍ／分以上７．８ｍ／分以下、あるいは３．５ｍ／分以上５．４ｍ／分以下である。さらに、凝固浴槽中における紡糸原液の流速に対する外部凝固液の流速の比は、例えば、０．３２以上０．５４以下、あるいは０．３３以上０．５３以下である。なお、紡糸原液の流速に対する外部凝固液の流速の比が上記範囲内にあれば、紡糸原液の流速及び外部凝固液の流速のそれぞれの絶対値は、任意である。

巻き取られた中空糸膜は、２重量％以上１０重量％以下の希硫酸に浸漬され、次いで純水で水洗される。これにより、セルロースが再生される。さらに、中空糸膜の水分を有機溶媒で置換する。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、及びアセトン等を用いることができる。その後、中空糸膜束の両端を固定し、１％から８％延伸した後、３０℃以上６０℃以下、５ｋＰａ以下の減圧下で乾燥を行い、実施の形態に係る中空糸膜状のウイルス除去膜が得られる。

従来においては、紡糸原液に無機塩は添加されていない。これに対し、本発明者らが初めて見出したことであるが、紡糸原液に無機塩を添加することにより、セルロース濃厚相が形成する粒子の拡散速度を変化させ、ミクロ相分離の進行速度に影響を与えることが可能となる。そのため、ウイルス除去膜の表面から内部にかけての空孔の大きさ、及び膜厚方向における空孔の大きさの変化の程度（勾配）等の膜構造を制御することが可能となり、ウイルス捕捉部位の厚みを適切な厚みにコントロールすることができる。また、無機塩の添加によりセルロースの溶解性が安定し、ミクロ層分離の進行が円周方向で均一に進み、ウイルス捕捉量が、ろ過面上の場所によらず、ウイルス捕捉部位内で均一となる構造を形成できる。

さらに、本発明者らは、ウイルス除去膜のウイルス捕捉部位ないしは金コロイド捕捉部位を均質かつ緻密にするためには、高分子多孔質膜の凝固過程において、凝固浴中での浴抵抗を抑えることが効果的であることも見出した。凝固浴中での浴抵抗を抑えることにより、延伸による膜構造の破壊が抑制され、膜の円周方向に均一な膜構造を形成することができる。凝固浴中での浴抵抗は、紡糸原液の流速と、凝固液の流速と、の関係を適切に設定することにより、抑制することが可能である。具体的には、紡糸原液の流速に対する凝固液の流速の比を、上記範囲に設定することにより、凝固浴中での浴抵抗が抑制される。

以上説明したように、製造工程において、ミクロ相分離を制御し、かつ凝固浴中での浴抵抗を抑えることにより、ウイルス除去性が高い、中空糸膜状のウイルス除去膜を製造することが可能となる。

また、平膜状のウイルス除去膜は、例えば、以下の方法により製造される。銅アンモニアセルロース溶液に無機塩を添加して混合し、製膜溶液を得る。続いて、製膜溶液をろ過及び脱ガス処理する。使用される無機塩の種類は、上記と同様である。

次に、製膜溶液を凝固浴中を走行する支持体上にキャスティングして流延し、凝固させる。支持体の移動速度は毎分約１．０〜１０．０ｍとする。形成した平膜を酸で再生処理後、追加の水浴に通して引き出し、その後、乾燥機を使用して乾燥させる。ここで、製造される平膜状のウイルス除去膜のウイルス捕捉部位ないしは金コロイド捕捉部位を均質かつ緻密にするために、注型速度及び凝固液の移動速度を適切な関係に設定する。具体的には、支持体の移動速度に対する凝固液の移動速度の比を一定範囲に設定する。

上述した方法で製造される中空糸、及び平膜状のウイルス除去膜は、被ろ過液入り口側の一次側空間とろ過液出側の２次側空間が膜によって仕切られたフィルターを作成するのに用いることができる。

上記のように本発明を実施の形態によって記載したが、この開示の一部をなす記述及び図面はこの発明を限定するものであると理解するべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかになるはずである。本発明はここでは記載していない様々な実施の形態等を包含するということを理解すべきである。

（ウイルス除去膜の製造）
コットンリンター（平均分子量１．４４×１０^５）と硫酸ナトリウム（キシダ化学株式会社）を公知の方法で調製した銅アンモニア溶液中に溶解せしめ、ろ過脱泡を行ない、セルロース濃度、及び無機塩である硫酸ナトリウム濃度が図５及び図６に記載のとおりであり、アンモニア濃度が４．４重量％、銅濃度が２．７重量％の紡糸原液を得た。次に、紡糸原液を環状二重紡口の外側紡出口より３．０ｃｃ／分あるいは３．６５ｃｃ／分で吐出し、同時に、図５及び図６に示す重量比のアセトン／アンモニア／水から成る、内部凝固液を、環状二重紡口の中央紡出口より１．８ｃｃ／分で吐出した。

環状二重紡口から吐出された紡糸原液及び内部凝固液を、図５及び図６に示す重量比のアセトン／アンモニア／水から成る、外部凝固液で満たされた凝固浴槽中に導入して中空糸膜を形成し、巻き取り速度（紡速）１０ｍ／分で巻き取った。凝固浴槽には、特開平４−３７１２２１号公報に記載される直径７ｍｍのＵ字型漏斗細管を用いた。漏斗細管内における外部凝固液の平均流速は、図５及び図６に示すとおりであった。また、巻き取り速度（紡速）に対する外部凝固液の平均流速の比は、図５及び図６に示すとおりであった。

中空糸膜の巻き取りは、３０℃の水中で行った。６０分間中空糸膜を巻き取った後、巻き取った中空糸膜を別の３０℃の水に６０分間浸漬した。しかる後に、５重量％の硫酸水溶液で中空糸膜のセルロースを再生し、さらに水洗した。得られた中空糸膜束の水分を実施例１〜４、比較例１，２，４についてはメタノールで、実施例５〜９についてはエタノールで置換し、その後、束両端を固定し、５．０％延伸した状態で、５０℃、３ｋＰａの条件下で真空乾燥させた。以上の方法で得られた中空糸膜を、実施例又は比較例に係るウイルス除去膜とした。ただし、図５及び図６に示す比較例３及び比較例５に係る条件では、膜そのものを製造することはできなかった。得られたウイルス除去膜の内径、膜厚、平均孔径、バブルポイント、及び滅菌前の純水透過速度は、図５及び図６に示すとおりであった。

（金コロイドを用いたウイルス除去膜の評価）
（１）金コロイド溶液の調製
粒径が１０、１５、２０、及び３０ｎｍの金コロイドをそれぞれ含む溶液（Ｃｙｔｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を購入した。次に、紫外・可視分光光度計ＵＶｍｉｎｉ−１２４０（島津製作所製）にて測定した各金コロイド溶液の金コロイドに応じた最大吸収波長における吸光度が０．２５になるよう、金コロイド溶液を、注射用蒸留水、ポリオキシエチレン−ナフチルエーテル（１．５９ｖｏｌ％）、及びポリ（４−スチレンスルホン酸ナトリウム）（０．２０ｖｏｌ％）で希釈した。

（２）金コロイド溶液のろ過
調製した金コロイド溶液のそれぞれ４０ｍＬを、７８．４ｋＰａの加圧下にて、製造した実施例及び比較例に係るウイルス除去膜でろ過した。ウイルス除去膜のろ過面積は、０．００１ｍ^２であった。

（３）ウイルス除去膜による金コロイドの除去率の測定
紫外・可視分光光度計ＵＶｍｉｎｉ−１２４０（島津製作所製）を用いて、金コロイド溶液のそれぞれについて、金コロイドの最大吸収波長におけるろ過前の金コロイド溶液の吸光度Ａと、ろ液の吸光度Ｂと、を測定し、下記（２）式で与えられる、実施例及び比較例に係るウイルス除去膜による金コロイドの対数除去率（ＬＲＶ）を算出した。結果を、図７及び図８に示す。
ＬＲＶ＝ｌｏｇ_１０（Ａ／Ｂ） （２）

（４）金コロイド捕捉部位の均一性の測定
金コロイド溶液をろ過した後の実施例及び比較例に係るウイルス除去膜から切片（厚みは８μｍ）を切り出し、切片の断面において金コロイドによって染まった部分１６カ所の輝度プロファイルを、光学顕微鏡（Ｂｉｏｚｅｒｏ、ＢＺ８１００、キーエンス社製）で測定した。次に、定数（２５５）から測定した輝度プロファイルを引いた。その後、横軸に膜厚（１００分率）、縦軸に輝度の変位を有するグラフを作成し、グラフに現れた輝度の変位のスペクトルの面積を算出した。さらに、１６カ所における輝度の変位のスペクトルの面積の標準偏差を、１６カ所における輝度の変位のスペクトルの面積の平均で除した値を、実施例及び比較例に係るウイルス除去膜における金コロイド捕捉部位の金コロイドの捕捉量の変動係数を示す値として算出した。直径２０ｎｍの金コロイドのみを流したときの結果を、図７及び図８に示す。比較例に係るウイルス除去膜と比較して、実施例に係るウイルス除去膜のほうが、変動係数の値が小さい傾向にあった。よって、実施例に係るウイルスの除去膜における金コロイド捕捉部位における金コロイドの捕捉量の均一性が高いことが示された。また、実施例のなかでも、硫酸ナトリウム添加量が多いほど、また、紡速に対する外部凝固液の平均流速の比が大きいほど、金コロイド捕捉部位における金コロイドの捕捉量の均一性が高くなる傾向にあった。

（５）金コロイド捕捉部位の厚さの測定
２０及び３０ｎｍの金コロイド溶液をそれぞれろ過した湿潤状態のウイルス除去膜から切片（厚みは８μｍ）を切り出した。湿潤状態の切片の断面において金コロイドによって染まった部分１６カ所の輝度プロファイルを、光学顕微鏡（Ｂｉｏｚｅｒｏ、ＢＺ８１００、キーエンス社製）で測定した。ここで、膜厚方向において、ウイルス除去膜の一次側の表面から、金コロイドが捕捉された部位の最も一次側の表面に近い部分までの第１の距離ａを測定した。また、膜厚方向において、ウイルス除去膜の一次側の表面から、金コロイドが捕捉された部位の最も二次側の表面に近い部分までの第２の距離ｂを測定した。

次に、１６カ所のそれぞれにおいて、第１の距離ａを湿潤状態のウイルス除去膜の膜厚ｃで除して百分率で表した値Ａ（＝ａ／ｃの百分率表示）を算出し、１６カ所における値Ａの平均値を第１の到達度として算出した。また、１６カ所のそれぞれにおいて、第２の距離ｂを湿潤状態のウイルス除去膜の膜厚ｃで除して百分率で表した値Ｂ（＝ｂ／ｃの百分率表示）を算出し、１６カ所における値Ｂの平均値を第２の到達度として算出した。

さらに、下記（３）式に示すように、直径２０ｎｍの金コロイドをろ過したウイルス除去膜における第２の到達度の平均値Ｂ_２０と、直径３０ｎｍの金コロイドをろ過したウイルス除去膜における第１の到達度の平均値Ａ_３０と、の差に、直径２０ｎｍの金コロイドをろ過した湿潤状態のウイルス除去膜の膜厚の平均値Ｃ_２０と直径３０ｎｍの金コロイドをろ過した湿潤状態のウイルス除去膜の膜厚の平均値Ｃ_３０の平均値Ｃ_ＡＶＥを乗じた値を、ウイルス除去膜における金コロイド捕捉部位の厚さＴとして算出した。金コロイド捕捉部位の厚さＴは、ウイルス除去膜の緻密層の厚さＴとも表現される。結果を図７及び図８に示す。比較例に係るウイルス除去膜と比較して、実施例に係るウイルス除去膜のほうが、緻密層の厚さＴが、２０μｍ以下の範囲内で厚い傾向にあった。また、実施例のなかでも、硫酸ナトリウム添加量が多いほど、また、紡速に対する外部凝固液の平均流速の比が大きいほど、緻密層の厚さが厚くなる傾向にあった。
Ｔ＝（Ｂ_２０−Ａ_３０）×Ｃ_ＡＶＥ （３）

上記方法においては、直径２０ｎｍの金コロイドをろ過したウイルス除去膜と、直径３０ｎｍの金コロイドをろ過したウイルス除去膜と、の少なくとも２つのウイルス除去膜を用いて、緻密層の厚さを測定した。しかし、１つのウイルス除去膜のみを用いて、緻密層の厚さを測定することも可能である。この場合、１つのウイルス除去膜を用いて、直径２０ｎｍ及び３０ｎｍの両方の金コロイドを含む金コロイド溶液をろ過する。あるいは、１つのウイルス除去膜を用いて、直径２０ｎｍの金コロイド溶液をろ過した後、直径３０ｎｍの金コロイド溶液をろ過する。

その後、直径２０ｎｍ及び３０ｎｍの金コロイド溶液をろ過したウイルス除去膜から切片を切り出し、切片の断面において金コロイドによって染まった部分１６カ所の輝度プロファイルを、光学顕微鏡（Ｂｉｏｚｅｒｏ、ＢＺ８１００、キーエンス社製）で測定する。ここで、膜厚方向において、ウイルス除去膜の一次側の表面から、金コロイド捕捉部位の最も一次側の表面に近い部分までの第１の距離ａ_１を測定する。また、膜厚方向において、ウイルス除去膜の一次側の表面から、金コロイド捕捉部位の最も二次側の表面に近い部分までの第２の距離ｂ_１を測定する。

次に、１６カ所のそれぞれにおいて、第１の距離ａ１を湿潤したウイルス除去膜の膜厚ｃで除して百分率で表した値Ａ_１（＝ａ_１／ｃ_１の百分率表示）を算出し、１６カ所における値Ａ_１の平均値を第１の到達度として算出する。また、１６カ所のそれぞれにおいて、第２の距離ｂ_１を湿潤したウイルス除去膜の膜厚ｃで除して百分率で表した値Ｂ_１（＝ｂ_１／ｃ_１の百分率表示）を算出し、１６カ所における値Ｂ_１の平均値を第２の到達度として算出する。

さらに、下記（４）式に示すように、ウイルス除去膜における第２の到達度の平均値Ｂ_１と、ウイルス除去膜における第１の到達度の平均値Ａ_１と、の差に、湿潤したウイルス除去膜の膜厚の平均値Ｃを乗じた値を、ウイルス除去膜における金コロイド捕捉部位の厚さＴとして算出する。（３）式で算出される厚さＴと、（４）式で算出される厚さＴと、の間に、大きな差は生じないことが確認されている。
Ｔ＝（Ｂ_１−Ａ_１）×Ｃ （４）

（６）ウイルス除去膜の金コロイド捕捉部位の粒径依存性の測定
直径１５ｎｍ、２０ｎｍ及び３０ｎｍの金コロイド溶液をそれぞれろ過したウイルス除去膜から切片（厚みは８μｍ）を切り出した。切片の断面において金コロイドによって染まった部分１６カ所の輝度プロファイルを、光学顕微鏡（Ｂｉｏｚｅｒｏ、ＢＺ８１００、キーエンス社製）で測定した。ここで、膜厚方向において、ウイルス除去膜の一次側の表面から、金コロイドが捕捉された部位の最も一次側の表面に近い部分までの第１の距離ａを測定した。また、膜厚方向において、ウイルス除去膜の一次側の表面から、金コロイドが捕捉された部位の最も二次側の表面に近い部分までの第２の距離ｂを測定した。

次に、１６カ所のそれぞれにおいて、第１の距離ａを湿潤したウイルス除去膜の膜厚ｃで除して百分率で表した値Ａ（％）を算出し、１６カ所における値Ａ（％）の平均値を第１の到達度として算出した。また、１６カ所のそれぞれにおいて、第２の距離ｂを湿潤したウイルス除去膜の膜厚ｃで除して百分率で表した値Ｂ（％）を算出し、１６カ所における値Ｂ（％）の平均値を第２の到達度として算出した。直径１５ｎｍ、２０ｎｍ及び３０ｎｍの金コロイドのそれぞれについて、第１の到達度の平均値と、第２の到達度の平均値と、を、図７及び図８に示す。なお、図７及び図８において、左側の数値が第１の到達度の平均値を表し、右側の数値が第２の到達度の平均値を表している。なお、直径３０ｎｍ、２０ｎｍ及び１５ｎｍの金コロイドの捕捉位置の測定について、あくまで、膜によって捕捉された金コロイドに関して測定したものであり、膜に捕捉されていない金コロイドについて測定するものではない。

（ウイルス除去膜のウイルス除去能）
（１）ウイルス含有タンパク質溶液の調製
ポリクローナル抗体（ヒトＩｇＧ）（ヴェノグロブリン−ＩＨ、ベネシス社製）を用いて、抗体濃度が１ｍｇ／ｍＬになるように注射用水（大塚製薬）で希釈した抗体溶液を得た。また、１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ水溶液を用いて塩濃度を０．１ｍｏｌ／Ｌに調整した。さらに、０．１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ又は０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨを用いて、水素イオン指数（ｐＨ）を４．０に調整し、これをタンパク質溶液とした。得られたタンパク質溶液に、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ、社団法人動物用生物学的製剤協会）を１．０ｖｏｌ％添加し、よく攪拌して、ウイルス含有タンパク質溶液を得た。

（２）ウイルス含有タンパク質溶液のろ過
７８．４ ｋＰａのろ過圧力で、製造した膜面積０．００１ｍ^２のウイルス除去膜を用いて、ろ過量が７５Ｌ／ｍ^２に到達するまで、ウイルス含有タンパク質溶液のデッドエンドろ過を行った。ろ過圧力は供給液容器側に圧力計を設置して測定した。次いで、ウイルス含有タンパク質溶液のろ液について、３ｖｏｌ％ＦＢＳ／Ｄ−ＭＥＭによる１０倍、１０^２倍、１０^３倍、１０^４倍及び１０^５倍希釈液を調製した。また、ろ過直前に採取した元液（ウイルス含有タンパク質溶液）についても、３ｖｏｌ％ＦＢＳ／Ｄ−ＭＥＭによる１０^２倍、１０^３倍、１０^４倍、１０^５倍、１０^６倍及び１０^７倍希釈液を調製した。

（３）ウイルス除去率の測定
アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）より入手し、培養したＰＫ−１３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−６４８９）を用意した。また、５６℃の水浴で３０分間加熱し非働化させた後の牛血清（Ｕｐｓｔａｔｅ社製）３ｖｏｌ％と、ペニシリン／ストレプトマイシン（＋１００００ Ｕｎｉｔｓ／ｍＬ ペニシリン、＋１００００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、インビトロジェン製）１ｖｏｌ％含有Ｄ−ＭＥＭ（インビトロジェン製、高グルコース）と、の混合液を用意した。以下、この混合液を、３ｖｏｌ％ＦＢＳ／Ｄ−ＭＥＭという。次に、ＰＫ−１３細胞を３ｖｏｌ％ＦＢＳ／Ｄ−ＭＥＭで希釈し、細胞濃度２．０×１０^５（細胞／ｍＬ）の希釈細胞懸濁液を調製した。次に、９６ウェル丸底細胞培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）を１０枚準備し、全てのウェルに、希釈細胞懸濁液を１００μＬずつ分注した。

希釈細胞懸濁液を分注した細胞培養プレートの８ウェルごとに、ウイルス含有タンパク質溶液のろ液及び同ろ液の１０倍、１０^２倍、１０^３倍、１０^４倍及び１０^５倍希釈液と、元液の１０^２倍、１０^３倍、１０^４倍、１０^５倍、１０^６倍及び１０^７倍希釈液と、のそれぞれを、１００μＬずつ分注した。その後、３７℃、５％二酸化炭素雰囲気下にあるインキュベーターの中に細胞培養プレートを配置し、細胞を１０日間培養した。

１０日間培養した細胞に対し、以下説明する赤血球吸着法（ウイルス実験学 総論 国立予防衛生研究所学友会編、ｐ．１７３参照）を用いて、５０％組織培養感染値（ＴＣＩＤ５０）の測定を行った。まず、ニワトリ保存血（日本バイオテスト製）をＰＢＳ（−）（日水製薬株式会社製、製品に添付の説明書に記載の方法で調製）で５倍に希釈した後、希釈したニワトリ保存血を２５００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心して赤血球を分離し、沈殿させた。その後、上清を吸引除去して、得られた赤血球を含む沈殿物を、再度ＰＢＳ（−）で２００倍に希釈した。

次に、赤血球沈殿物のＰＢＳ（−）希釈液を、細胞培養プレートの全ウェルに１００μＬずつ分注し、２時間静置した。その後、培養した細胞組織の表面に対する赤血球の吸着の有無を目視で確認し、吸着が確認されたものをウイルス感染が起きたウェル、吸着が確認されなかったものをウイルス感染が起きなかったウェルとして数えた。さらに、ウイルス含有タンパク質溶液のろ液及び同ろ液の希釈液と、元液希釈液のそれぞれが分注されたウェルごとに、ウイルス感染の割合を確認し、Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法（ウイルス実験学総論、国立予防衛生研究所学友会編、ｐ．４７９−４８０参照）により、感染価としてｌｏｇ_１０（ＴＣＩＤ_５０／ｍＬ）を算出し、下記（５）式を用いてウイルスの対数除去率（ＬＲＶ）を算出した。結果を、図７及び図８に示す。比較例に係るウイルス除去膜と比較して、実施例に係るウイルス除去膜のほうが、ウイルス除去率が高い傾向にあった。また、実施例のなかでも、硫酸ナトリウム添加量が多いほど、また、紡速に対する外部凝固液の平均流速の比が大きいほど、ウイルス除去率が高くなる傾向にあった。
ＬＲＶ＝ｌｏｇ_１０（Ｃ_０／Ｃ_Ｆ） （５）
ここで、Ｃ_０は、ウイルス除去膜でろ過する前の元液（ウイルス含有タンパク質溶液）中の感染価を表し、Ｃ_Ｆはウイルス除去膜でろ過した後のろ過液中の感染価を表す。

（４）バブルポイントの測定方法（国際公開２００１／０１４０４７号に記載の測定方法）
膜を表面張力γ（Ｎ／ｍ）の液体で湿潤させた後、その膜に、気体で徐々に圧力をかけていくと、ある圧力で膜表面から連続的に気泡が発生するようになるため、この時の気体圧力を測定するというものである。このときの気体圧力をバブルポイント（ＭＰａ）と呼んでいる。

公知の測定方法はいずれも、連続気泡の発生を目視確認した時点での圧力をバブルポイントとしている。しかし、この判定法は、膜面積が小さい場合には気泡の発生量が少なく、見過ごす恐れがあること、及び、加圧以前から膜表面に付着していた気泡（界面破壊現象によって生じたものではない）の膜表面からの離脱を界面破壊現象による気泡であると見誤る恐れがあることから、誤差がでやすい。

本実施例では、より測定誤差を小さくするために、膜面積１ｃｍ^２当たり３．０ｍＬ／ｍｉｎの定量的な連続気泡の発生があった時点の圧力（ＭＰａ）をもってバブルポイントと定義した。また、湿潤液体には表面張力０．０１２（Ｎ／ｍ）のパーフルオロカーボンを用い、加圧気体には窒素を用いた。

（５）内径及び膜厚の測定方法（乾燥中空糸）
本実施例では、乾燥中空糸の断面切片を投影機（Ｖ‐１２Ｂ、Ｎｉｋｏｎ社製）で観察し、一つの中空糸断面に対し垂直方向及び水平方向の内径2カ所及び膜厚４ヶ所を測定し、それぞれ平均したものを内径及び膜厚の測定値とした。

（６）膜厚の測定方法（湿潤中空糸）
本実施例で、湿潤状態の中空糸の膜厚を測定する際は、直径３０ｎｍ、２０ｎｍ及び１５ｎｍの金コロイドを４０Ｌ／ｍ^２ろ過した際の湿潤中空糸について、光学顕微鏡（Ｂｉｏｚｅｒｏ、ＢＺ８１００、キーエンス社製）用いて測定を行っている。

（７）平均孔径の測定方法（特許第２７０７２７４号公報に記載の測定方法）
本実施例において、空孔率Ｐｒは以下の方法で算出した。膜厚、面積、重量測定から中空糸の見掛け密度ρａを求め、空孔率を式（６）で求めた。
ρａ＝Ｗｄ／Ｖｗ＝４Ｗｄ／πｌ（Ｄｏ^２−Ｄｉ^２）
Ｐｒ（%）＝（１−ρａ／ρｐ）×１００ （６）
ここで、ρａは中空糸の見掛け密度（ｇ／ｃｍ^３）、Ｗｄは中空糸の絶乾重量（ｇ）、Ｖｗは中空糸の見かけ体積（ｃｍ^３）、ｌは中空糸の長さ（ｃｍ）、Ｄｏは中空糸の外径（ｃｍ）、Ｄｉは中空糸の内径（ｃｍ）、ρｐはセルロースの密度（ｇ／ｃｍ^３）を示す。

平均孔径は以下の方法で算出した。１０本の糸を束ね、１６ｃｍの有効長さになるようにモジュールを作成した。このモジュールの一端を閉とし、他端に２００ｍｍＨｇの圧力をかけ、３７℃で水を通した。このとき膜を通して出てくる水の量を透水量として測定した。

あらかじめ、乾燥状態で内径と膜厚を測定した。この値から膜面積を算出した。
平均孔径（ｎｍ）は式（７）で算出した。
２ｒ＝２×１０^３×√（Ｖ・ｄ・μ／Ｐ・Ａ・Ｐｒ） （７）
ここで、２ｒは平均孔径（ｎｍ）、Ｖは透水量（ｍＬ／分）、ｄは膜厚（μｍ）、μは水の粘度（ｃｐ）、Ｐは圧力差（ｍｍＨｇ）、Ａは膜面積（ｃｍ^２）、Ｐｒは空孔率（％）を示す。

（８）平均分子量の測定方法
本実施例では、特公昭５９−２０４９１２号公報に記載の方法と同一の方法で測定した。

（９）滅菌前の純水透過速度の測定方法
膜の液供給側である一次側とろ液が排出される二次側の両方を純水で満たし、その後温度３７℃の純水を３５ｋＰａの膜間差圧でろ過して、一次側から二次側に出てくる純水透過量を乾燥中空糸の膜面積１ｍ^２当たりＬ／ｈｒｓ／０．１ＭＰａの単位に換算した値である。また純水とは、限外ろ過により精製した水をいう。

１ 一次側の表面
２ 二次側の表面
１０ ウイルス除去膜

Claims (14)

1. タンパク質を含有する溶液からウイルスを除去するためのウイルス除去膜であって、
   当該ウイルス除去膜は、
   前記タンパク質を含有する溶液が供給される一次側の表面と、
   当該ウイルス除去膜を透過した透過液が排出される二次側の表面と、
   を有し、
   前記一次側から当該ウイルス除去膜に直径２０ｎｍの金コロイドを含有する溶液を供給して当該ウイルス除去膜で前記金コロイドを捕捉し、当該ウイルス除去膜の断面の膜厚方において輝度を測定すると、前記輝度の変位のスペクトルの面積値の標準偏差を前記輝度の変位のスペクトルの面積値の平均値で除した値が０．０１以上１．５０以下であり、
   当該ウイルス除去膜の断面において、直径２０ｎｍ以上直径３０ｎｍ以下の金コロイドが捕捉される部位の厚さが、湿潤状態で、１０．０μｍ以上３０．０μｍ以下である、
   セルロースからなるウイルス除去膜。
2. 湿潤状態の当該ウイルス除去膜の断面において、
   直径３０ｎｍの金コロイドが捕捉される部位が、前記一次側から当該ウイルス除去膜の膜厚の１５％以上６０％以下のところにあり、
   直径２０ｎｍの金コロイドが捕捉される部位が、前記一次側から前記膜厚の２５％以上８５％以下のところにあり、
   直径１５ｎｍの金コロイドが捕捉される部位が、前記一次側から前記膜厚の６０％以上９０％以下のところにある、
   請求項１に記載のウイルス除去膜。
3. 直径１０ｎｍの金コロイドが捕捉されない、請求項１又は２に記載のウイルス除去膜。
4. 直径３０ｎｍの金コロイドの対数除去率が１．００以上であり、
   直径２０ｎｍの金コロイドの対数除去率が１．００以上であり、
   直径１５ｎｍの金コロイドの対数除去率が０．１０以上であり、
   直径１０ｎｍの金コロイドの対数除去率が０．１０未満である、
   請求項１ないし３のいずれか１項に記載のウイルス除去膜。
5. 平均孔径が１３ｎｍ以上２１ｎｍ以下である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のウイルス除去膜。
6. 当該ウイルス除去膜の断面において、前記一次側から前記二次側に向けて、孔径が減少した後増加に転じる、請求項１ないし５のいずれか１項に記載のウイルス除去膜。
7. 前記金コロイドが捕捉される部位が、前記孔径が最小となる部位を含む、請求項６に記載のウイルス除去膜。
8. 乾燥状態で膜厚が２４μｍ以上４１μｍ以下である、請求項１ないし７のいずれか１項に記載のウイルス除去膜。
9. バブルポイントが１．２ＭＰａ以上１．８ＭＰａ以下である、請求項１ないし８のいずれか１項に記載のウイルス除去膜。
10. 純水透過速度が、３０Ｌ／ｍ²／ｈｒｓ／０．１ＭＰａ以上１２０Ｌ／ｍ²／ｈｒｓ／０．１ＭＰａ以下である、請求項１ないし９のいずれか１項に記載のウイルス除去膜。
11. 中空糸膜である、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のウイルス除去膜。
12. 平膜である、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のウイルス除去膜。
13. 前記輝度の変位のスペクトルの面積値の標準偏差を前記輝度の変位のスペクトルの面積値の平均値で除した値が０．０１以上１．２０以下である、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載のウイルス除去膜。
14. 当該ウイルス除去膜の断面において、直径２０ｎｍ以上直径３０ｎｍ以下の金コロイドが捕捉される部位の厚さが、湿潤状態で、１３．０μｍ以上２０．０μｍ以下である、請求項１ないし１３のいずれか１項に記載のウイルス除去膜。

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