JP6050329B2 - ウイルス感染およびその他の疾患を治療するためのキナゾリン誘導体 - Google Patents

Description

本発明は、キナゾリン誘導体、それらの製造方法、医薬組成物、および治療におけるそれらの使用に関する。

本発明は、トール様受容体（ＴＬＲ）の調節または受容体活性化作用が関与する、ウイルス感染、免疫または炎症性疾患の治療におけるキナゾリン誘導体の使用に関する。トール様受容体は、細胞外ロイシンリッチドメインと、保存領域を含む細胞質伸長（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）とを特徴とするＩ型（ｐｒｉｍａｒｙ）細胞膜貫通タンパク質である。自然免疫系は、ある種の免疫細胞の細胞表面に発現するこれらのＴＬＲにより病原体関連分子パターンを認識することができる。外来の病原体を認識すると、サイトカインの産生と食細胞上の共刺激分子のアップレギュレーションが活性化される。これは、Ｔ細胞挙動の調節に繋がる。

大部分の哺乳動物種は１０〜１５種類のトール様受容体を有すると推定されてきた。ヒトおよびマウスで合わせて１３種類のＴＬＲ（単にＴＬＲ１〜ＴＬＲ１３と称される）が同定されており、他の哺乳動物種でもこれらの多くと同等の形態が発見されてきた。しかし、ヒトで発見された特定のＴＬＲの同等物が全ての哺乳動物に存在するわけではない。例えば、ヒトのＴＬＲ１０と類似のタンパク質をコードする遺伝子がマウスに存在するが、過去のある時点でレトロウイルスによって損傷を受けたように見受けられる。他方、マウスはＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２、およびＴＬＲ１３を発現するが、そのどれもヒトには現れない。他の哺乳動物がヒトには見られないＴＬＲを発現することもある。トラフグ属のフグ（Ｔａｋｉｆｕｇｕ ｐｕｆｆｅｒｆｉｓｈ）に見られるＴＬＲ１４によって示されるように、他の非哺乳動物種が、哺乳動物とは異なるＴＬＲを有することもある。これにより、ヒトの自然免疫のモデルとして実験動物を使用する方法が複雑になることがある。

トール様受容体に関する詳細な概説については、次の雑誌論文を参照されたい。Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｊ．Ａ．，Ｎａｔｕｒｅ，４２６，ｐ３３−３８，２００３；Ａｋｉｒａ，Ｓ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｋ．，ａｎｄ Ｋａｉｓｈｏ，Ｔ．，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２１，ｐ３３５−３７６，２００３；Ｕｌｅｖｉｔｃｈ，Ｒ．Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４，ｐ５１２−５２０，２００４．

国際公開第２００６／１１７６７０号パンフレットのプリン誘導体、国際公開第９８／０１４４８号パンフレットおよび国際公開第９９／２８３２１号パンフレットのアデニン誘導体、ならびに国際公開第２００９／０６７０８１号パンフレットのピリミジン類などのトール様受容体に対する活性を示す化合物が以前記載された。

しかし、従来技術の化合物と比較して、好ましい選択性、より高い効力、より高い代謝安定性、および改善された安全性を有する、新規なトール様受容体調節剤が強く求められている。

特定のウイルス感染の治療では、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の場合のように、インターフェロン（ＩＦＮα）を定期的に注射投与することができる（Ｆｒｉｅｄ ｅｔ．ａｌ．Ｐｅｇｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ａｌｆａ ｐｌｕｓ ｒｉｂａｖｉｒｉｎ ｆｏｒ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００２；３４７：９７５−８２）。経口投与可能な低分子ＩＦＮ誘導物質は、免疫原性の低下と投与の簡便性という利点を提供し得る。従って、新規なＩＦＮ誘導物質は、ウイルス感染の治療に有効となり得る新種の薬物である。抗ウイルス作用を有する低分子ＩＦＮ誘導物質の文献中の例については、Ｄｅ Ｃｌｅｒｃｑ，Ｅ．；Ｄｅｓｃａｍｐｓ，Ｊ．；Ｄｅ Ｓｏｍｅｒ，Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９７８，２００，５６３−５６５を参照されたい。

ＩＦＮαはまた、ある種の癌の治療では他の薬物と併用投与される（例えば、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４６，２８４９−５７、およびＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９２，５２，１０５６参照）。ＴＬＲ７／８アゴニストは、明白なＴｈ１反応を誘導することができるため、ワクチンアジュバントとしても重要である。

本発明により、式（Ｉ）

の化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは多形が提供され、式中、
Ｒ_１は、Ｃ_３〜８アルキル、Ｃ_３〜８アルコキシ、Ｃ_２〜６アルケニルまたはＣ_２〜６アルキニルであって、これらはそれぞれハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、ニトリル、エステル、アミド、Ｃ_１〜３アルキル、Ｃ_１〜３アルコキシまたはＣ_３〜６シクロアルキルから独立して選択される１個以上の置換基で任意選択により置換されており、
Ｒ_２は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アミン、Ｃ_１〜７アルキル、Ｃ_１〜７アルキルアミノ、Ｃ_１〜６アルコキシ、（Ｃ_１〜４）アルコキシ−（Ｃ_１〜４）アルキル、Ｃ_３〜６シクロアルキル、Ｃ_４〜７複素環、芳香族二環式複素環、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、カルボン酸アミド、カルボン酸エステルであって、これらはそれぞれハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、Ｃ_１〜６アルキル、ジ−（Ｃ_１〜６）アルキルアミノ、Ｃ_１〜６アルキルアミノ、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６アルコキシ、Ｃ_３〜６シクロアルキル、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボン酸アミド、複素環、アリール、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、またはニトリルから独立して選択される１個以上の置換基で任意選択により置換されており、
Ｒ_３は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アミン、Ｃ_１〜７アルキル、Ｃ_１〜７アルケニル、Ｃ_１〜７アルキニル、Ｃ_１〜７アルキルアミノ、Ｃ_１〜６アルコキシ、（Ｃ_１〜４）アルコキシ−（Ｃ_１〜４）アルキル、Ｃ_３〜６シクロアルキル、Ｃ_４〜７複素環、芳香族二環式複素環、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、ケトン、ニトリルであって、これらはそれぞれハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、Ｃ_１〜６アルキル、ジ−（Ｃ_１〜６）アルキルアミノ、Ｃ_１〜６アルキルアミノ、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６アルコキシ、Ｃ_３〜６シクロアルキル、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボン酸アミド、複素環、アリール、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、またはニトリルから独立して選択される１個以上の置換基で任意選択により置換されており、
Ｒ_４は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アミン、Ｃ_１〜７アルキル、Ｃ_１〜７アルキルアミノ、Ｃ_１〜６アルコキシ、（Ｃ_１〜４）アルコキシ−（Ｃ_１〜４）アルキル、Ｃ_３〜６シクロアルキル、Ｃ_４〜７複素環、二環式複素環、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシであって、これらはそれぞれハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、Ｃ_１〜６アルキル、ジ−（Ｃ_１〜６）アルキルアミノ、Ｃ_１〜６アルキルアミノ、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６アルコキシ、Ｃ_３〜６シクロアルキル、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボン酸アミド、複素環、アリール、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、またはニトリルから独立して選択される１個以上の置換基で任意選択により置換されており、
Ｒ_５は、水素、フッ素、塩素、またはメチルであるが、但し、
Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、およびＲ_５が全てＨであってはならない。

第１の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）（式中、Ｒ_１はブチル、ペンチルまたは２−ペンチルであり、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４およびＲ_５は前述の通りである）の化合物を提供する。

別の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）（式中、Ｒ_１はヒドロキシルで置換されたＣ_４〜８アルキルであり、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４およびＲ_５は前述の通りである）の化合物に関する。

別の実施形態は、式（Ｉ）（式中、Ｒ_１は、ヒドロキシルで置換されたＣ_４〜８アルキルである場合、次、

のうちの１つである）の化合物に関する。

別の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）（式中、Ｒ_５は好ましくは水素またはフッ素であり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、およびＲ_４は前述の通りである）の化合物を提供する。

式（Ｉ）の化合物およびそれらの薬学的に許容される塩、その溶媒和物または多形は、医薬としての、特に、トール様受容体（とりわけＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８）活性の調節剤としての活性を有する。

そこで別の態様では、本発明は、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物または多形を１種以上の薬学的に許容される医薬品添加物、賦形剤または担体と共に含む医薬組成物を提供する。

さらに、本発明による式（Ｉ）の化合物もしくはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは多形、または前記式（Ｉ）の化合物もしくはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは多形を含む医薬組成物は、医薬として使用することができる。

本発明の別の態様は、式（Ｉ）の化合物もしくはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは多形、または、前記式（Ｉ）の化合物もしくはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは多形を含む前記医薬組成物が、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８の調節が関与する障害の治療に適宜使用できることである。

「アルキル」という用語は、指定された数の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖の飽和脂肪族炭化水素を指す。

「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素を指す。

「アルケニル」という用語は、少なくとも２個の炭素原子と少なくとも１個の炭素−炭素二重結合からなる前述のアルキルを指す。

「アルキニル」という用語は、少なくとも２個の炭素原子と少なくとも１個の炭素−炭素三重結合からなる前述のアルキルを指す。

「シクロアルキル」という用語は、指定された数の炭素原子を含む炭素環を指す。

「アルコキシ」という用語は、例えば、メトキシ基またはエトキシ基のような、酸素に単結合したアルキル（炭素と水素の鎖）基を指す。

「アリール」という用語は、Ｎ、ＯおよびＳから、特にＮおよびＯから選択される１個または２個のヘテロ原子を任意選択により含む、芳香環構造を意味する。前記芳香環構造は、５、６または７個の環原子を有してもよい。特に、前記芳香環構造は、５個または６個の環原子を有してもよい。

「アリールオキシ」という用語は、芳香環構造を指す。例えば、フェノールのように、前記芳香族基は酸素に単結合している。

「ヘテロアリールオキシ」という用語は、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１個または２個のヘテロ原子を任意選択により含む芳香環構造を指す。例えば、ヒドロキシピリジンのように、前記芳香族基は５〜７個の環原子を含み、その１個が酸素に単結合している。

「二環式複素環」という用語は、縮合した２個の芳香環で構成された、「アリール」という用語について前述した芳香環構造を意味する。各環は、Ｎ、ＯおよびＳから、特にＮおよびＯから選択されるヘテロ原子で任意選択により構成される。

アリールアルキル」という用語は、アルキル基で任意選択により置換された、「アリール」という用語について前述した芳香環構造を意味する。

「ヘテロアリールアルキル」という用語は、アルキル基で任意選択により置換された、「ヘテロアリール」という用語について前述した芳香環構造を意味する。

複素環は、飽和または部分飽和であり、エチルオキサイド、テトラヒドロフラン、ジオキサンまたは他の環状エーテルを含む分子を指す。窒素を含む複素環としては、例えば、アゼチジン、モルホリン、ピペリジン、ピペラジンおよびピロリジン等が挙げられる。他の複素環としては、例えば、チオモルホリン、ジオキソリニル、および環状スルホンが挙げられる。

ヘテロアリール基は、芳香族の性質を有する複素環基である。これらは、Ｎ、ＯまたはＳから選択される１個以上のヘテロ原子を含む単環、二環、または多環である。ヘテロアリール基は、例えば、イミダゾリル、イソキサゾリル、フリル、オキサゾリル、ピロリル、ピリドニル、ピリジル、ピリダジニル、ピラジニルであってもよい。

式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容される塩には、その酸付加塩および塩基塩が含まれる。好適な酸付加塩は、無毒の塩を形成する酸から形成される。好適な塩基塩は、無毒の塩を形成する塩基から形成される。

本発明の化合物は、溶媒和していない形態および溶媒和した形態で存在することもできる。本明細書では、「溶媒和物」という用語は、本発明の化合物および１種以上の薬学的に許容される溶媒分子、例えば、エタノールを含む分子錯体を説明するのに使用される。

「多形」という用語は、２つ以上の形態または結晶構造で存在する本発明の化合物の能力を指す。

本発明の化合物は、結晶性または非晶質の生成物として投与することができる。それらは、例えば、沈殿、結晶化、凍結乾燥、噴霧乾燥、または蒸発乾固などの方法で、固体プラグ（ｓｏｌｉｄ ｐｌｕｇｓ）、粉末、またはフィルムとして得ることができる。それらは、単独で投与されても、または本発明の１種以上の他の化合物と併用投与されても、または他の１種以上の薬物と併用投与されてもよい。一般に、それらは、１種以上の薬学的に許容される医薬品添加物と共に製剤として投与される。「医薬品添加物」という用語は、本明細書では、本発明の化合物以外の任意の成分を説明するのに使用される。医薬品添加物の選択は、主に、特定の投与方法、溶解性および安定性に対する医薬品添加物の効果、ならびに剤形の種類などの要因に依存する。

本発明の化合物またはその任意の部分群を、投与の目的で、様々な医薬形態に製剤化することができる。適切な組成物として、薬物を全身投与するのに通常使用される全ての組成物を挙げることができる。本発明の医薬組成物を製造するために、有効成分として、特定の化合物、任意選択により付加塩の形態の特定の化合物を有効量、薬学的に許容される担体と均質に混合した状態に配合するが、その担体は投与に望ましい製剤の形態に応じて非常に様々な形態を取り得る。これらの医薬組成物は、例えば、経口投与、経腸投与、または経皮投与に好適な単位剤形であることが望ましい。例えば、経口剤形の組成物の製造において、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤、乳剤、および溶液剤などの経口液体製剤の場合、例えば、水、グリコール、油、およびアルコール等；または、散剤、丸剤、カプセル剤、および錠剤の場合、デンプン、糖類、カオリン、賦形剤、滑沢剤、結合剤、および崩壊剤等の固体担体などの、通常の医薬媒体のいずれかを使用することができる。投与が容易であるため、錠剤およびカプセル剤が最も有利な経口単位剤形であり、この場合、明らかに固体医薬担体が使用される。使用直前に、液体の形態に変換できる固体の形態の製剤も含まれる。経皮投与に好適な組成物では、担体は、浸透促進剤および／または好適な湿潤剤を任意選択により含み、これに、皮膚に対する顕著な有害作用を生じさせない任意の種類の好適な添加剤が少量、任意選択により配合される。前記添加剤は皮膚への投与を促進し得るおよび／または所望の組成物の製造に有用となり得る。これらの組成物は、様々な方法で、例えば、経皮パッチとして、スポット・オン製剤（ｓｐｏｔ−ｏｎ）として、軟膏として投与することができる。本発明の化合物は、このような方法で投与されるように当該技術分野で使用される方法および製剤で、吸入または吸送により投与することもできる。従って、一般に、本発明の化合物は、溶液剤、懸濁剤または乾燥粉末の形態で肺に投与することができる。

投与の容易さと投与量の均一性のため、前述の医薬組成物を単位剤形に製剤化することがとりわけ有利である。本明細書で使用する場合、単位剤形とは、単位投与量として好適な物理的に別個の単位を指し、各単位は、所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の有効成分を、必要な医薬担体と共に含有する。このような単位剤形の例としては、錠剤（割線入り錠剤およびコーティング錠を含む）、カプセル剤、丸剤、散剤分包（ｐｏｗｄｅｒ ｐａｃｋｅｔｓ）、カシェ剤、坐剤、注射用溶液剤または懸濁剤等、およびこれらのそれぞれの倍数（ｓｅｇｒｅｇａｔｅｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅｓ ｔｈｅｒｅｏｆ）がある。

感染疾患を治療する当業者は、下記に示す試験結果から有効量を決定することができるであろう。一般に、有効治療１日量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重であろうと考えられる。必要な用量を、１日を通して２、３、または４以上の部分用量（ｓｕｂ−ｄｏｓｅｓ）として適切な間隔を空けて投与することが適切な場合がある。前記部分用量は、例えば、単位剤形当たり有効成分を１〜１０００ｍｇ、特に５〜２００ｍｇ含有する単位剤形として製剤化されてもよい。

正確な投与量および投与頻度は、当業者に周知のように、使用される式（Ｉ）の特定の化合物、治療される特定の症状、治療される症状の重症度、特定の患者の年齢、体重、および全身健康状態、ならびにその個体が摂取している可能性がある他の医薬に依存する。さらに、治療される対象の反応に応じておよび／または本発明の化合物を処方する医師の評価に応じて、前記有効量を増減し得ることが明らかである。従って、前述の有効量の範囲は、ガイドラインに過ぎず、決して本発明の範囲または使用を制限するものではない。

化合物の製造
式（Ｉ）の化合物はスキーム１に従って製造される。２，４−ジクロロキナゾリン類を別々の工程で反応させ、２，４−ジアミノキナゾリン類を許容される収量で得ることができる。第１の工程では、遷移金属触媒と共にまたは遷移金属触媒なしで２，４−ジクロロ−キナゾリンをアミンと混合しまたはアミンと一緒に加熱し、２−クロロ−４−アミノキナゾリンを得ることができる。粗２−クロロ−４−アミノキナゾリンを後処理（ｗｏｒｋｕｐ）した後、中間体を圧力容器内でアンモニア源（例えば、アンモニアのメタノール溶液）と共に、および任意選択によりＣｕＯと共に加熱する。
スキーム１

式（Ｉ）の化合物はスキーム２に従って製造することもできる。置換アントラニル酸エステル（ＩＶ）を、酸性条件下、過剰のシアナミドの存在下で、アルコール系溶媒（例えば、エタノール）またはジグリムを使用し、文献（Ｏ’Ｈａｒａ ｅｔ．ａｌ．ＪＯＣ（１９９１）５６，ｐ７７６）に記載の方法に従って加熱した。その後、２−アミノ−４−ヒドロキシキナゾリン類（Ｖ）のアミノ置換を、幾つかの異なる経路で行うことができる。一例では、中間体Ｖを、オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ_３）の存在下、溶媒と共にまたは溶媒なしで加熱することができる。溶媒を除去した後、アミンをニートで、または極性溶媒（例えば、アセトニトリル）の存在下で添加し、ＶＩを室温でまたは加熱することにより得ることができる。第２の方法は、中間体ＶをＢＯＰまたはＰｙＢＯＰなどのカップリング剤と、ＤＢＵおよびアミンの存在下で反応させる方法である。反応は、極性溶媒（例えば、ＤＭＦ）中で行われる。第３の方法は、中間体Ｖの２−アミノ基をアシル基で保護する方法である。中間体Ｖを酸無水物（例えば、無水酢酸）と、通常は数時間還流して反応させる。減圧下で溶媒を除去することができ、粗製物を、その後、前述のようにＰＯＣｌ_３と反応させることができる。塩基性溶媒（例えば、ナトリウムメトキシドのメタノール溶液）中で反応させることにより、保護アシル基の除去が容易に行われる。
スキーム２

実験部分
中間体Ａの製造

２，４−ジクロロ−６，７−ジメトキシキナゾリン（５００ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（０．７３ｍＬ、４．２ｍｍｏｌ）、およびアセトニトリル（０．１ｍＬ）の混合物に撹拌しながらｎ−ブチルアミン（０．１９ｍＬ、１．９ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（５ｍＬ）溶液を滴下した。混合物を周囲温度で１日間撹拌した。酢酸エチルを添加し、有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液で洗浄した。有機層を除去し、硫酸マグネシウムで乾燥した。固体を濾過により除去し、粗製物Ａを得、そのまま次の工程に使用した。

化合物１の製造

中間体Ａ（０．５ｇ、１．７ｍｍｏｌ）を２０ｍＬの圧力容器にアンモニアの７Ｎメタノール溶液（１５ｍＬ）と共に入れ、これにＣｕＯ（２４２ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）を添加した。容器を密封し、混合物を撹拌しながら１３０℃に１８時間加熱した。反応を室温に冷却した。固体を濾過により除去し、濾液の溶媒を減圧留去した。粗製物を逆相カラムクロマトグラフィー（Ｖｙｄａｃ Ｄｅｎａｌｉ Ｃ１８カラム １０μｍ、２５０ｇ、５ｃｍ）、移動相（０．２５％ＮＨ_４ＨＣＯ_３水溶液、ＣＨ_３ＣＮ）で精製した。

９の製造

工程１。磁気撹拌子を備えた５００ｍＬ丸底フラスコに、２−アミノ−６−メトキシ安息香酸メチル（２５ｇ、１４９．６ｍｍｏｌ）、エタノール（２００ｍＬ）、シアナミド（９．４３ｇ、２２４ｍｍｏｌ）、および濃ＨＣｌ（６ｍＬ）を入れた。混合物を６時間還流撹拌した。１時間間隔で、濃ＨＣｌ（０．５ｍＬ）を添加した。反応混合物を室温に冷却し、固体、Ｖ−１を濾過により単離し、エタノールで洗浄した。
ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ＝１９２（Ｍ＋Ｈ）．
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ ｐｐｍ ３．８８（ｓ，３Ｈ），６．９６（ｄｄ，Ｊ＝８．２，３．１Ｈｚ，２Ｈ），７．６９（ｔ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），８．２８（ｂｒ．ｓ．，２Ｈ），１２．６７（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ）

工程２。

５０ｍＬバイアルに、Ｖ−１（２５０ｍｇ、１．２４ｍｍｏｌ）、無水ＤＭＦ（５ｍＬ）、ＤＢＵ（０．６ｇ、３．７３ｍｍｏｌ）、およびＢＯＰ（６５９ｍｇ、１．４９ｍｍｏｌ）を入れた。混合物を室温で２時間撹拌し、ｎ−ブチルアミン（２８７ｍｇ、３．７３ｍｍｏｌ）を添加し、反応を室温で１５時間撹拌した。溶媒の体積を減少させ、残留物をシリカカラムクロマトグラフィーで、ジクロロメタンからメタノールの１０％ジクロロメタン溶液への勾配を使用して精製した。最良の画分をプールし、溶媒を減圧留去して、９を得た。

次の中間体は、Ｖ−１の製造方法に従って製造した。

ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ＝２４０／２４２
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ ｐｐｍ ３．０９−３．５５（ｍ，２Ｈ），７．０９（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），７．２６（ｄｄ，Ｊ＝７．９，１．３Ｈｚ，１Ｈ），７．３７−７．４８（ｍ，２Ｈ）

ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ＝１９６（Ｍ＋Ｈ）
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ ｐｐｍ ７．００（ｂｒ．ｓ．，２Ｈ）７．１３（ｄ，Ｊ＝７．７８Ｈｚ，１Ｈ）７．１８（ｄ，Ｊ＝８．２８Ｈｚ，１Ｈ）７．５０（ｔ，Ｊ＝８．０３Ｈｚ，１Ｈ）、フェノールプロトンは観察されなかった。

ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ＝１７６（Ｍ＋Ｈ）

ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ＝１８０（Ｍ＋Ｈ）
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ ｐｐｍ ６．９８（ｄｄ，Ｊ＝１１．０，８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．１３（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．５１（ｂｒ．ｓ．，２Ｈ），７．６４（ｔｄ，Ｊ＝８．３，５．８Ｈｚ，１Ｈ），１２．３０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）

ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ＝１８０（Ｍ＋Ｈ）

ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ＝２３９／２４１（Ｍ＋Ｈ）
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ ｐｐｍ ７．３２（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．４９（ｓ，２Ｈ），７．７１（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），７．８１（ｄｄ，Ｊ＝８．６，２．４Ｈｚ，１Ｈ），８．００（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）

ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ＝１９２（Ｍ＋Ｈ）

ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ＝１７６（Ｍ＋Ｈ）

ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ＝１８０（Ｍ＋Ｈ）
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ ｐｐｍ ７．０１−７．１６（ｍ，２Ｈ），７．５６（ｂｒ．ｓ．，２Ｈ），７．９９（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），１０．３８−１３．４８（ｍ，１Ｈ）

ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ＝１９６（Ｍ＋Ｈ）
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ ｐｐｍ ７．４１（ｄｄ，Ｊ＝８．５，２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．９８（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），８．４９（ｂｒ．ｓ．，２Ｈ），１０．７９−１３．６９（ｍ，１Ｈ）

ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ＝１７６（Ｍ＋Ｈ）
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ ｐｐｍ ２．４３（ｓ，３Ｈ），７．２２（ｄ，Ｊ＝１．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２４（ｓ，１Ｈ），７．８９（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），８．２９（ｂｒ．ｓ．，２Ｈ），１２．６５（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）

ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ＝１９２（Ｍ＋Ｈ）

ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ＝２２０（Ｍ＋Ｈ）
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ ｐｐｍ ３．８７−３．９５（ｍ，３Ｈ），７．１２−７．４７（ｍ，１Ｈ），７．８３（ｄｄ，Ｊ＝８．３，１．４Ｈｚ，１Ｈ），７．９９（ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，１Ｈ），８．０７−８．１３（ｍ，１Ｈ），８．４３（ｂｒ．ｓ．，２Ｈ）

ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ＝１９８（Ｍ＋Ｈ）

ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ＝２９８（Ｍ＋Ｈ）
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ ｐｐｍ ３．８５（ｓ，３Ｈ），５．１０（ｓ，２Ｈ），６．１７（ｂｒ．ｓ．，２Ｈ），６．７０（ｓ，１Ｈ），７．３０−７．３６（ｍ，２Ｈ），７．４０（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．４４−７．４８（ｍ，２Ｈ），１０．８２（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ）

ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ＝１８０（Ｍ＋Ｈ）
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ ｐｐｍ ６．５１−６．６７（ｍ，２Ｈ），７．００−７．０８（ｍ，１Ｈ），７．４２（ｄｄｄ，Ｊ＝１１．２，７．９ １．３Ｈｚ，１Ｈ），７．６９（ｄｄ，Ｊ＝７．９，０．６Ｈｚ，１Ｈ），１１．０８（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ）

ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ＝１９６（Ｍ＋Ｈ）

ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ＝１７６（Ｍ＋Ｈ）
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ ｐｐｍ ２．４１（ｓ，３Ｈ），７．１５（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．４３（ｂｒ．ｓ．，２Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ），７．８０（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），１１．１７−１２．４９（ｍ，１Ｈ）

１０の製造

工程１。Ｖ−６の製造。磁気撹拌子を備えた５０ｍＬバイアルに、Ｖ−３（５００ｍｇ、２．１６ｍｍｏｌ）、フェニルボロン酸（３４２ｍｇ、２．８ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（１．１９ｇ、８．６２ｍｍｏｌ）、ジオキサン（５．５ｍＬ）、水（１．８ｍＬ）、およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（２４９ｍｇ、０．２１５ｍｍｏｌ）を入れた。窒素ガスを反応混合物に１０分間通気させた。バイアルを密封し、１３０℃に加熱した。反応を室温に冷却し、溶媒を減圧留去した。粗製物を逆相カラムクロマトグラフィー（ＲＰ Ｖｙｄａｃ Ｄｅｎａｌｉ Ｃ１８−１０μｍ、２００ｇ、５ｃｍ、移動相０．２５％ＮＨ_４ＨＣＯ_３水溶液、ＣＨ_３ＣＮ）で精製し、Ｖ−６を得た。
ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ＝２３８（Ｍ＋Ｈ）

工程２。磁気撹拌子を備えた５０ｍＬバイアルに、Ｖ−６（１４８ｍｇ、０．６２４ｍｍｏｌ）、無水ＤＭＦ（３．５ｍＬ）、ＤＢＵ（０．３７３ｍＬ、２．５ｍｍｏｌ）、ＢＯＰ（３４５ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）、次いで（Ｓ）−２−アミノペンタノール（３２２ｍｇ、３．１２ｍｍｏｌ）を入れた。反応混合物を室温で３日間撹拌した。揮発性物質を減圧留去し、粗製物を水と酢酸エチルとの間で分配した。有機層を合わせ、乾燥し（硫酸マグネシウム）、固体を濾過により除去し、濾液の溶媒を減圧留去した。粗製物を逆相カラムクロマトグラフィー（ＲＰ ＳｕｎＦｉｒｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤ−１０μｍ、３０×１５０ｍｍ）、移動相（０．２５％ＮＨ_４ＨＣＯ_３水溶液、ＣＨ_３ＣＮ）で精製し、１０を得た。

１１の製造

工程１。磁気撹拌子を備えた１Ｌ丸底フラスコに、Ｖ−１（８．８ｇ、４６．０３ｍｍｏｌ）および無水酢酸（１５０ｍＬ）を入れた。フラスコに還流冷却器を取り付け、混合物を撹拌しながら１５時間加熱還流した。沈殿物を濾過により単離し、ジイソプロピルエーテルで洗浄した後、真空乾燥し、白色固体、Ｖ−９を得た。
ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ＝２３４（Ｍ＋Ｈ）

工程２。磁気撹拌子を備えた２５０ｍＬ丸底フラスコに、Ｖ−９（４．５ｇ、１９．３ｍｍｏｌ）、およびアセトニトリル（１００ｍＬ）を添加した。ＰＯＣｌ_３（５．５６ｍＬ、５９．８ｍｍｏｌ）を３０分間にわたり滴下した後、ＤＩＰＥＡ（１０．３ｍＬ、５９．８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物は褐色溶液になり、これを室温で２時間撹拌した。反応混合物を１Ｍ ＮａＯＨ（１００ｍＬ）に注ぎ入れ、酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥し、固体を濾過により除去し、濾液をそのまま次の工程に使用した。

工程３。工程２で得られた酢酸エチル濾液をＤＩＰＥＡ（９．２ｍＬ、５３．６ｍｍｏｌ）およびｎ−ブチルアミン（３．５ｍＬ、３５．８ｍｍｏｌ）で処理した。反応混合物を周囲温度で１６時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、粗製物をジクロロメタン中で再構成し、水で洗浄した。有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、固体を濾過により除去し、濾液の溶媒を蒸発乾固して、橙色固体、Ｖ−１１を得た。
ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ＝２８９（Ｍ＋Ｈ）

工程４。３０ｍＬ圧力管に、Ｖ−１１（２．８ｇ、９．７１ｍｍｏｌ）、ピリジン塩酸塩（６．７３ｇ、５８．２６ｍｍｏｌ）、およびピリジン（５０ｍＬ）を入れ、混合物を１２０℃に１６時間加熱した。ピリジンを減圧留去した。粗製物をジクロロメタン／メタノール：９５／５の混合物に溶解し、１Ｎ ＨＣｌ溶液および水で洗浄した。有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、固体を濾過により除去し、濾液の溶媒を減圧留去して、ＶＩ−１を得た。
ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ＝２３１（Ｍ−Ｈ）
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ ｐｐｍ ０．９２（ｔ，Ｊ＝７．３７Ｈｚ，３Ｈ）１．３３−１．４３（ｍ，２Ｈ）１．５０−１．５９（ｍ，２Ｈ）３．４１−３．４９（ｍ，２Ｈ）５．７９−５．８８（ｍ，１Ｈ）６．０２（ｄ，Ｊ＝８．１４Ｈｚ，１Ｈ）６．９１（ｂｒ．ｓ．，２Ｈ）６．９９−７．０４（ｍ，１Ｈ）１０．７８（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ）１３．３５（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ）

工程５。１００ｍＬフラスコに、ＶＩ−１（１７５ｍｇ、０．７５３ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム（０．７４ｇ、２．２６ｍｍｏｌ）、およびＤＭＦ（１５ｍＬ）を入れた。混合物を周囲温度で３０分間撹拌した。２−ブロモエチルメチルエーテル（０．０８９ｍＬ、０．９４ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１６時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、粗残留物をＨＰＬＣ（ＲＰ Ｖｙｄａｃ Ｄｅｎａｌｉ Ｃ１８−１０μｍ、２５０ｇ、５ｃｍ、移動相（０．２５％ＮＨ_４ＨＣＯ_３水溶液、メタノール）で精製し、最良の画分を回収し、溶媒を減圧留去し、１１を固体として得た。

１２の製造

工程１。Ｖ−２をＤＭＦ（１５ｍＬ）に溶解し、８０℃の油浴で１０分間Ｎ_２パージした。次いで、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）クロライド（６９ｍｇ、０．０９８ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（５７．６ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）およびヨウ化銅（４２．５ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を添加した。５分間Ｎ_２パージした後、ジエチルアミン（３．１５ｍＬ、３０．３１ｍｍｏｌ）を添加し、その後、２−ピリジルエチン（１６８ｍｇ、１．６３ｍｍｏｌ）を添加した。容器を閉鎖し、反応を８０℃で１６時間撹拌した。反応混合物を氷水に注ぎ入れ、沈殿物を濾過により単離し、水で洗浄し、真空乾燥した。生成物をジクロロメタン中で３０分間撹拌した。沈殿物を濾過により単離し、ジクロロメタンおよびジイソプロピルエーテルで洗浄し、５０℃で真空乾燥して、Ｖ−１２を得た。
ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ＝２６３（Ｍ−Ｈ）

工程２。Ｖ−１２（３００ｍｇ、１．１５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５０ｍＬ）溶液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（１００ｍｇ）をＮ_２（ｇ）雰囲気下で入れた。反応混合物を室温で１６時間撹拌した後、充填されたｄｅｃａｌｉｔｅで濾過した。濾液の溶媒を減圧留去し、粗Ｖ−１３を得、そのまま次の工程に使用した。
ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ＝２６７（Ｍ−Ｈ）

工程３。実施例１２は、９の製造方法に従って製造した。

１４の製造

工程１。中間体ＶＩ−２およびＶＩ−３は、ＶＩ−１の製造方法に従って製造した。ジイソプロピルエーテルと共に室温で撹拌した後、ＶＩ−３を単離した。
ＶＩ−２：ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ＝３３７（Ｍ＋Ｈ）
ＶＩ−３：ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ＝３７９（Ｍ＋Ｈ）

工程２。化合物１４は、中間体Ｖ−１２の製造方法に従って製造した。

１５の製造

工程１。磁気撹拌子を備えた５００ｍＬ丸底フラスコに、３−アミノフタル酸塩酸塩（２５ｇ、１１５ｍｍｏｌ）、エタノール（２５０ｍＬ）、シアナミド（７．２５ｇ、１７２ｍｍｏｌ）、および濃ＨＣｌ（６ｍＬ）を入れた。フラスコに還流冷却器を取り付け、混合物を６時間還流撹拌した。１時間間隔で、濃ＨＣｌ（０．５ｍＬ）をガラスピペットで添加した。反応を室温に冷却し、溶媒を減圧留去して、黄色油状物を得た。粗製物をシリカゲルで乾燥した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで、ジクロロメタンからメタノールの１０％ジクロロメタン溶液への勾配を使用して部分的に精製した。粗黄色固体、Ｖ−１４をそのまま次の工程に使用した。
ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ＝２３４（Ｍ＋Ｈ）．

工程２。磁気撹拌子を備えた１００ｍＬ丸底フラスコに、Ｖ−１４（１．７ｇ、７．２９ｍｍｏｌ）、無水ＤＭＦ（２５ｍＬ）、ＤＢＵ（３．３ｇ、２１．８７ｍｍｏｌ）、およびＰｙＢＯＰ（４．５５ｇ、８．７５ｍｍｏｌ）を入れた。反応混合物を室温で１時間撹拌した。次いで、ｎ−ブチルアミン（２．１ｇ、２９．２ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１５時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、粗製物をシリカゲルで、メタノールの２０％ジクロロメタン溶液を使用して濾過した。濾液の溶媒を減圧留去し、粗油状物（１５、４ｇ）を逆相カラムクロマトグラフィー（ＲＰ Ｖｙｄａｃ Ｄｅｎａｌｉ Ｃ１８−１０μｍ、２００ｇ、５ｃｍ）、移動相（０．２５％ＮＨ_４ＨＣＯ_３水溶液、ＣＨ_３ＣＮ）で精製した。

１６の製造

Ｎ_２雰囲気下で１０％Ｐｄ／Ｃメタノール懸濁液（２５ｍＬ）に化合物１４（１１１ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）を添加した。窒素雰囲気を除去し、水素ガスで置換した。２当量の水素ガスが消費されるまで、混合物を室温で撹拌した。反応混合物を、充填されたｄｅｃａｌｉｔｅで濾過した。濾液の溶媒を減圧留去した。粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、ジクロロメタンからメタノールの１０％ジクロロメタン溶液への勾配を使用して精製し、１６を得た。

１８の製造

１７（６２５ｍｇ、２．２８ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶解した。ＬＡＨ（１Ｍ ＴＨＦ溶液、３．４２ｍＬ、３．４２ｍｍｏｌ）を滴下し、反応混合物を室温で３時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、所望の生成物への完全な変換を示した。反応混合物を飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液で反応停止し、固体を濾過により除去し、濾液の溶媒を減圧留去した。残留物を分取ＨＰＬＣで精製し、生成物を白色固体として得た。

１９の製造

１０ｍＬ管内でＤＭＦ（５ｍＬ）にＶＩ−２（５００ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（８６ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）、およびシアン化亜鉛（１０６ｍｇ、０．８９ｍｍｏｌ）を混合し、この混合物に１６０℃で１０分間マイクロ波を照射した。混合物を室温に冷却し、減圧濃縮した。残留物を水とジクロロメタンとの間で分配した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、溶媒を濾過により除去し、濾液の溶媒を減圧濃縮した。生成物をＣＨ_３ＣＮ中でトリチュレートし、固体を濾過により単離した。ナトリウムメトキシドのメタノール溶液で、６０℃で１時間処理した後、アシル基が脱保護された。混合物を冷却すると、生成物が沈殿した。白色固体、１９を濾過により単離し、真空乾燥した。

２０の製造

磁気撹拌子を備え、窒素ガスでスパージした５０ｍＬバイアルに、ＶＩ−３（３００ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）、ボロン酸エステル（１９８ｍｇ、０．９５ｍｍｏｌ）、水（３ｍＬ、脱気）およびＤＭＥ（６ｍＬ、脱気）を入れ、炭酸水素ナトリウム（１９９ｍｇ、２．３７ｍｍｏｌ）およびＰｄＣｌ_２（ＰＰｈ_３）_２（５５ｍｇ、０．０７９ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を９０℃に１時間加熱した。混合物を冷却し、酢酸エチルを添加した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、固体を濾過により除去し、濾液の溶媒を減圧留去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、ジクロロメタンからメタノールの１０％ジクロロメタン溶液（アンモニア含有）への勾配を使用して精製した。生成物画分を回収し、減圧濃縮した。ナトリウムメトキシドのメタノール溶液で、６０℃で１時間処理した後、アシル基が脱保護された。溶媒を減圧留去し、残留物を水とジクロロメタンとの間で分配した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、溶媒を濾過により除去し、濾液の溶媒を減圧留去した。生成物をＣＨ_３ＣＮから結晶化し、濾過により単離し、真空乾燥し、白色固体、２０を得た。

２１の製造

磁気撹拌子およびスクリューキャップセプタムを備えた第１のバイアル内で、Ｐｄ_２（ｄｂａ）_３（６ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ）および２−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィノ−３，４，５，６−テトラメチル−２’，４’，６’−トリイソプロピル−１，１’−ビフェニル（６ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）のトルエン（０．５ｍＬ）溶液をＮ_２ガスでフラッシュした後、１２０℃で３分間撹拌した。磁気撹拌子およびスクリューキャップセプタムを備えた第２のバイアルに、２−メチルイミダゾール（１０４ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ）およびＫ_３ＰＯ_４（２２４ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ）、次いでＶＩ−３（２００ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）を仕込み、同様にＮ_２（ｇ）でフラッシュした。予備混合した触媒溶液、その後、無水トルエン（０．５ｍＬ）およびｔ−ブタノール（１．０ｍＬ）をシリンジで第２のバイアルに添加した（トルエン：ｔ−ＢｕＯＨ１：１溶液、合計２ｍＬ）。反応を１２０℃に１２時間加熱した。混合物を冷却し、ナトリウムメトキシド（３０％メタノール溶液）を添加した。混合物を６０℃で１時間加熱した。混合物を室温に冷却し、減圧濃縮した。残留物を水とジクロロメタンとの間で分配した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、固体を濾過により除去し、濾液の溶媒を減圧濃縮した。粗製物を分取ＨＰＬＣ（ＲＰ Ｓｕｎ Ｆｉｒｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤ−１０μｍ、３０×１５０ｍｍ）、移動相（０．２５％ＮＨ_４ＨＣＯ_３水溶液、ＣＨ_３ＣＮ）で精製した。生成物画分を回収し、減圧濃縮して、化合物２１を得た。

２２の製造

ＤＭＦ（１０ｍＬ）にＶＩ−２（５００ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ）、トリブチル（１−エトキシビニル）スズ（０．６２６ｍＬ、１．８５ｍｍｏｌ）、ＰｄＣｌ_２（ＰＰｈ_３）_２（２２０ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）を混合し、この混合物を８０℃に１６時間加熱した。反応混合物を冷却し、ＨＣｌ（１Ｎ、２ｍＬ）を添加した。混合物を室温で２時間撹拌した後、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（１００ｍＬ）に注ぎ入れ、沈殿物を濾過により単離し、ジクロロメタン中で再構成し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、固体を濾過により除去し、濾液の溶媒を減圧濃縮した。生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、ジクロロメタンからメタノールの５％ジクロロメタン溶液への勾配を使用して精製し、生成物画分を回収し、減圧濃縮した。生成物をＤＩＰＥ中でトリチュレートし、濾過し、真空乾燥すると、淡黄色固体となった。
混合物にメタノール（６ｍＬ）およびナトリウムメトキシド（０．７１６ｍＬ）を添加し、６０℃で１時間撹拌した。混合物を冷却し、減圧濃縮した。残留物を水とジクロロメタンとの間で分配した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、固体を濾過により除去し、濾液の溶媒を減圧濃縮した。生成物をＤＩＰＥ中でトリチュレートし、濾過により単離し、真空乾燥すると、黄色固体、２２となった。

２３の製造

２２（５９ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）をメタノール（２ｍＬ）に懸濁し、水素化ホウ素ナトリウム（９ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をＮ_２（ｇ）下、室温で２時間撹拌した。混合物をジクロロメタン（５ｍＬ）で希釈した後、飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液（０．５ｍＬ）を添加し、その後ＮａＨＣＯ_３を添加した。有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、固体を濾過により除去し、濾液の溶媒を減圧濃縮した。生成物をＤＩＰＥ中でトリチュレートし、濾過により単離し、真空乾燥すると、淡黄色固体、２３となった。

２４の製造

工程１。７５ｍＬステンレス鋼製オートクレーブに、窒素雰囲気下でＶＩ−２（６２６ｍｇ、１．８７ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＯＡｃ）_２（８ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）、１，３−ビス（ジフェニルホスフィノ）プロパン（３１ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）、酢酸カリウム（３６４ｍｇ、３．７１ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ（２０ｍＬ）、およびメタノール（２０ｍＬ）を仕込んだ。オートクレーブを閉鎖し、３０バールＣＯ（ｇ）に加圧した。反応混合物を１２０℃で１６時間撹拌した。反応混合物を室温に冷却した後、減圧濃縮した。残留物を水に溶解し、ジクロロメタンで抽出した。有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、固体を濾過により除去し、濾液の溶媒を減圧濃縮した。生成物をシリカカラムで、ジクロロメタンからメタノールの５％ジクロロメタン溶液への勾配を使用して精製した。生成物画分を回収し、減圧濃縮し、オフホワイトの固体、ＶＩ−４を得た。

工程２。ＶＩ−４（１９０ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）溶液に、ＬＡＨ（１Ｍ ＴＨＦ溶液、１．０４ｍＬ、１．０４ｍｍｏｌ）を−７５℃、窒素雰囲気下で添加した。反応を０℃にゆっくり加温しながら２時間撹拌した。次いで、混合物を氷−エタノール浴で冷却し、酢酸エチル１５ｍＬ、その後、Ｎａ_２ＳＯ_４・１０Ｈ_２Ｏ（２ｇ）を添加することにより慎重に反応停止した。混合物を１時間撹拌した後、ＭｇＳＯ_４で乾燥し、固体を濾過により除去し、濾液の溶媒を減圧留去した。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＲＰ Ｖｙｄａｃ Ｄｅｎａｌｉ Ｃ１８−１０μｍ、２００ｇ、５ｃｍ）、移動相（０．２５％ＮＨ_４ＨＣＯ_３水溶液、ＣＨ_３ＣＮ）で精製した後、ＳＦＣ精製（Ｃｈｉｒａｌｐａｋ Ｄｉａｃｅｌ ＡＤ ３０×２５０ｍｍ）、移動相（ＣＯ_２、０．２％イソプロピルアミン含有メタノール）を行い、所望の画分を回収し、溶媒を減圧留去して、２４を得た。

２５の製造

工程１。化合物１４の製造方法に従って、Ｖ−１４をトリメチルアセチレンと反応させ、Ｖ−１５を得た。
ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ＝２５８（Ｍ＋Ｈ）

工程２。ＶＩ−５を化合物９の製造方法に従って製造した。ＴＭＳ基の脱保護は、ＮａＨＣＯ３、水、メタノール混合物中で行った。
ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ＝３５７（Ｍ＋Ｈ）

工程３。水素化は１６の製造方法に従って行った。

２６の製造

工程１。２−ブロモ−４−イソプロピルアニリンのパラジウム触媒によるカルボニル化は、反応を１１０℃で行ったこと以外、ＶＩ−４の製造手順に従って行い、２−アミノ−５−イソプロピル安息香酸を得た。
ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ＝１８０（Ｍ＋Ｈ）

工程２。Ｖ−１６は、Ｖ−１の製造方法に従って製造した。
ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ＝２０４（Ｍ＋Ｈ）

工程３。実施例２６は、１５の製造方法に従って製造した。

２７の製造

工程１。シアナミドをエーテルに溶解し、混合物を窒素ガス下で撹拌した。ＨＣｌ（２Ｍエーテル溶液）を反応混合物に周囲温度で滴下し、室温で２時間撹拌し続けた。沈殿物、Ａ−２を濾過により単離し、５０℃で真空乾燥した。

工程２。ＳＯ_２（ＣＨ_３）_２（２０．４ｇ、２１７ｍｍｏｌ）を加熱溶融した。Ａ−２（３．３ｇ、２９ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を撹拌し、１２０℃に加熱し、完全に溶解させた。５−（２−クロロ−４−トリフルオロメチルフェノキシ）−アントラニル酸メチル（５ｇ、１４．５ｍｍｏｌ）を反応混合物に一度に添加した。３０分間撹拌し続けた。反応混合物を水（１０ｍＬ）で処理し、１０分間撹拌した。沈殿物、Ｖ−１７、白色固体を濾過により単離し、真空オーブンで乾燥した。
ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ＝３５６（Ｍ＋Ｈ）

工程３。化合物２７を、１５の製造方法に従って生成した。

２８の製造

工程１。Ａ−３（１０１ｇ、０．４４ｍｏｌ）を硫酸（８５０ｍＬ）に溶解した。この溶液を０℃に冷却した。ＨＮＯ_３（１８．３ｍＬ、０．４４ｍｏｌ）を硫酸（２００ｍＬ）に混合した混合液を２時間にわたり滴下した。反応混合物を４５分間、−１０℃で撹拌した後、氷水（６Ｌ）に注ぎ入れた。溶媒をデカントし、残留物をジクロロメタン（１．５Ｌ）に溶解した。水層をジクロロメタン（１Ｌ）で抽出した。合わせた有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、固体を濾過により除去し、溶媒を減圧留去してＡ−４を得、副生成物である異性体Ａ−５を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで、ヘプタンから酢酸エチルへの勾配を使用して分離した。

工程２。磁気撹拌子を備え、窒素ガスでスパージした５００ｍＬエルレンマイヤーフラスコにメタノール（１００ｍＬ、２％チオフェン含有）、５％Ｐｔ／Ｃ（２ｇ、０．５１３ｍｍｏｌ）を入れた後、水素雰囲気下に置いた。反応混合物を室温で１６時間撹拌した。触媒を濾過により除去し、濾液の揮発性物質を減圧留去した。残留物をシリカで、ジクロロメタンからジクロロメタン：メタノール９：１への勾配を使用して精製し、黄色油状物、ＩＶ−２を得た。
ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ＝２４４（Ｍ＋Ｈ）

工程３。中間体Ｖ−１８は、Ｖ−１７の製造方法に従って製造した。
ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ＝２５４（Ｍ＋Ｈ）

工程４。化合物９の製造手順を、Ｖ−１８から２８を合成するのに使用した。

化合物２９の製造

工程１。実施例２９は、２５の製造に記載の方法に従い、２７を触媒で水素化した後に得られた。

９０の製造

工程１。１７（１２．５１５ｇ、４５．６２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１００ｍＬ）に溶解した。ＬｉＯＨ（３．８３ｇ、９１．２ｍｍｏｌ）を水（２０ｍＬ）に溶解したものを添加した後、メタノール（５０ｍＬ）を添加した。反応混合物を室温で終夜撹拌した。揮発性物質を減圧留去し、固体を水で洗浄し、ＤＩＰＥでトリチュレートし、ＶＩ−６をオフホワイトの固体として得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ ｐｐｍ ０．９５（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ），１．４０（ｄｑ，Ｊ＝１４．９，７．３Ｈｚ，２Ｈ），１．６８（ｑｕｉｎ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），３．５４−３．６５（ｍ，２Ｈ），７．８９−８．０５（ｍ，２Ｈ），８．１４−８．３１（ｍ，２Ｈ），９．１１（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），１１．１０（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），１６．３７（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ）

工程２。５０ｍＬバイアルに、ＶＩ−６（２００ｍｇ、０．７６８ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１０ｍＬ）、トリエチルアミン（０．６４１ｍＬ、４．６１ｍｍｏｌ）、３−アミノピリジン（１８１ｍｇ、１．９２ｍｍｏｌ）およびシアノホスホン酸ジエチル（０．２３３ｍＬ、１．５４ｍｍｏｌ）を入れた。反応を室温で２時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、粗製物を逆相カラムクロマトグラフィー（Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８、ＯＢＤ １０μｍ、３０×１５０ｍｍ、移動相（０．２５％ＮＨ_４ＨＣＯ_３水溶液、メタノール）で精製し、９０を得た。

ＡＡ−９を製造するための合成スキーム。

中間体ＡＡ−３の合成

バレルアルデヒド（４３ｇ、５００ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１Ｌ）溶液に、ＡＡ−２（２００ｇ、５３２ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残留物を石油エーテルで希釈し、濾過した。濾液の溶媒を減圧留去し、残留物をシリカクロマトグラフィーで、石油エーテルから３％酢酸エチル／石油エーテルへの勾配を使用して精製し、ＡＡ−３（９０ｇ）を無色油状物として得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ ｐｐｍ
６．８１−６．７７（ｍ，１Ｈ），５．６８−５．６４（ｔｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１５．６Ｈｚ，１Ｈ），２．１１−２．０９（ｍ，２Ｈ），１．４０６（ｓ，９Ｈ），１．３８−１．２６（ｍ，４Ｈ），０．８５−０．８１（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）．

化合物ＡＡ−５の合成

ＡＡ−４（１６５ｇ、７８１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（８００ｍＬ）に溶解し、その撹拌溶液に−７８℃でｎ−ブチルリチウム（２９０ｍＬ、７２５ｍｍｏｌ，１．５当量）を添加した。反応混合物を３０分間撹拌した後、ＴＨＦ（４００ｍＬ）中のＡＡ−３（９０ｇ、４８８．４ｍｍｏｌ）を添加し、反応−７８℃で２時間撹拌した。混合物を飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液で反応停止し、室温に加温した。生成物を酢酸エチルと水との間で分配した。有機相を飽和食塩水で洗浄し、乾燥し、蒸発させた。残留物をカラムクロマトグラフィーで、５％酢酸エチル／石油エーテルで溶出して精製し、無色油状物、ＡＡ−５（１３２ｇ）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ ｐｐｍ ７．３６−７．１６（ｍ，１０Ｈ），３．７５−３．７０（ｍ，２Ｈ），３．４３−３．３９（ｄ，Ｊ＝１５．２Ｈｚ，１Ｈ），３．３３−３．１５（ｍ，１Ｈ），１．８６−１．８０（ｍ，２Ｈ），１．４７−１．３７（ｍ，２Ｈ），１．３２（ｓ，９Ｈ），１．２６−１．１７（ｍ，７Ｈ），０．８３−０．７９（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）．

ＡＡ−６の合成

ＡＡ−５（１３０ｇ、３２８ ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１．５Ｌ）に溶解し、ＬＡＨ（２０ｇ、５２６ｍｍｏｌ）を０℃で少量ずつ添加した。得られた混合物を同じ温度で２時間撹拌した後、室温に加温した。混合物を飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液で反応停止した。生成物を酢酸エチルと水との間で分配した。有機相を飽和食塩水で洗浄し、乾燥し、蒸発させた。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、固体を濾過により除去し、濃縮して、粗製ＡＡ−６（１００ｇ）を得、これをさらに精製することなく次の工程に使用した。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ ｐｐｍ ７．３３−７．１４（ｍ，１０Ｈ），３．９１−３．８６（ｍ，１Ｈ），３．８０−３．７７（ｄ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ，１Ｈ），３．６３−３．６０（ｄ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ，１Ｈ），３．４３−３．４２（ｍ，１Ｈ），３．１５−３．１０（ｍ，１Ｈ），２．７０−２．６３（ｍ，２Ｈ），１．６５−１．２８（ｍ，１０Ｈ），０．８９−０．８１（ｍ，３Ｈ）．

ＡＡ−９の合成

ＡＡ−６（３８ｇ、１１６．７５ｍｍｏｌ）および１０％Ｐｄ／Ｃのメタノール（２００ｍＬ）溶液を５０ＰＳＩの水素下、５０℃で２４時間水素化した。反応混合物を濾過し、溶媒を蒸発させて粗生成物ＡＡ７（１７ｇ）を得た。

粗生成物をジクロロメタン（２００ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（２６．１７ｇ、２５９．１ｍｍｏｌ）および二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（８４．７ｇ、１９４．４ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。得られた混合物を室温で１６時間撹拌した。混合物をジクロロメタンと水との間で分配した。有機相を飽和食塩水で洗浄し、乾燥し、蒸発させた。残留物をシリカゲルクロマトグラフィーで、２０％酢酸エチル／石油エーテルで溶出して精製し、ＡＡ−８（１３ｇ）を無色油状物として得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ ｐｐｍ ４．０８−４．０３（ｂｒ，１Ｈ），３．６８（ｍ，１Ｈ），３．５８−３．５５（ｍ，２Ｈ），３．２０−２．９０（ｂｒ，１Ｈ），１．８０−１．７３（ｍ，１Ｈ），１．４２−１．１７（ｍ，１５Ｈ），０．８５−０．８２（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）．

ＡＡ−８（４２ｇ、０．１８２ｍｏｌ）をジオキサン（２００ｍＬ）に溶解し、ジオキサン／ＨＣｌ（４Ｍ、２００ｍＬ）を０℃で添加した。得られた混合物を室温で２時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗生成物を得た。ジクロロメタン／石油エーテル混合物（５０ｍＬ、１：１、ｖ／ｖ）を粗生成物に添加し、上清をデカントした。この手順を２回繰り返し、油状物、ＡＡ−９（２６．６ｇ）を得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ ｐｐｍ ８．０４（ｓ，３Ｈ），３．６０−３．４９（ｍ，２Ｈ），３．１６−３．１５（ｍ，１Ｈ），１．７１−１．６７（ｍ，２Ｈ），１．６０−１．５５（ｍ，２Ｈ），１．３３−１．２６（ｍ，４Ｈ），０．９０−０．８７（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）．

ＡＡ−１０の製造

ＡＡ−１０は、バレルアルデヒドの代わりにブチルアルデヒドを使用し、ＡＡ−９の製造に従って製造した。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ ｐｐｍ８．０７（ｓ，３Ｈ），４．８５（ｂｒ，１Ｈ），３．５７−３．４５（ｍ，２Ｈ），３．１４−３．１２（ｍ，１Ｈ），１．７０−１．６４（ｍ，２Ｈ），１．５６−１．４９（ｍ，２Ｈ），１．３８−１．３０（ｍ，２Ｈ），０．９０−０．８０（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）．

分析方法
化合物は全て、ＬＣ−ＭＳで特性評価した。次のＬＣ−ＭＳ方法を使用した：

方法Ａ。逆相ＵＰＬＣ（超高速液体クロマトグラフィー）を、架橋エチルシロキサン／シリカハイブリッド（ＢＥＨ）Ｃ１８カラム（１．７μｍ，２．１×５０ｍｍ；Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ）で流速０．８ｍｌ／分にて行った。２種類の移動相（１０ｍＭ酢酸アンモニウムＨ_２Ｏ溶液／アセトニトリル、９５／５；移動相Ｂ：アセトニトリル）を使用して、Ａ９５％およびＢ５％から１．３分でＡ５％およびＢ９５％への勾配条件を実施し、０．７分間維持した。注入量０．７５μｌを使用した。コーン電圧は、正イオンモードでは３０Ｖであり、負イオンモードでは３０Ｖであった。

方法Ｂ。逆相ＨＰＬＣをＸｔｅｒｒａ ＭＳ Ｃ１８カラム（３．５μｍ、４．６×１００ｍｍ）で、流速１．６ｍＬ／分にて行った。３種類の移動相（移動相Ａ：２５ｍＭ酢酸アンモニウム９５％＋アセトニトリル５％；移動相Ｂ：アセトニトリル；移動相Ｃ：メタノール）を使用して、Ａ１００％から６．５分でＢ５０％およびＣ５０％に、０．５分でＢ１００％に変化させ、１分間Ｂ１００％の勾配条件を実施し、１．５分間Ａ１００％と再平衡化させた。１０μｌの注入量を使用した。

方法Ｃ。逆相ＵＰＬＣ（超高速液体クロマトグラフィー）を架橋エチルシロキサン／シリカハイブリッド（ＢＥＨ）Ｃ１８カラム（１．７μｍ，２．１×５０ｍｍ；Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ）で、流速０．８ ｍＬ／分にて行った。２種類の移動相（移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムＨ_２Ｏ溶液／アセトニトリル、９５／５；移動相Ｂ：アセトニトリル）を使用して、Ａ９５％およびＢ５％から１．３分でＡ５％およびＢ９５％に変化させる勾配条件を実施し、０．２分間維持した。注入量０．５μｌを使用した。

式（Ｉ）の化合物の生物活性
生物学的アッセイの説明
ＴＬＲ７およびＴＬＲ８活性の評価
ＴＬＲ７またはＴＬＲ８発現ベクターおよびＮＦκＢ−ｌｕｃレポーター構成体で一過性トランスフェクションを行ったＨＥＫ２９３細胞を使用する細胞レポーターアッセイで、化合物のヒトＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８活性化能力を評価した。一例では、ＴＬＲ発現構成体は、各野生型配列、またはＴＬＲの第２のロイシンリッチリピートに欠失がある突然変異体配列を発現する。このような突然変異ＴＬＲタンパク質は、アゴニスト活性化をより受け易いことが以前示された（米国特許第７４９８４０９号明細書）。

簡潔に言えば、ＨＥＫ２９３細胞を培養培地（１０％ＦＣＳおよび２ｍＭグルタミンを補ったＤＭＥＭ）中で増殖させた。１０ｃｍ皿内で細胞のトランスフェクションを行うために、トリプシン−ＥＤＴＡで細胞を剥離し、ＣＭＶ−ＴＬＲ７またはＴＬＲ８プラスミド（７５０ｎｇ）、ＮＦκＢ−ｌｕｃプラスミド（３７５ｎｇ）およびトランスフェクション試薬の混合物でトランスフェクションを行い、加湿した５％ＣＯ_２雰囲気中、３７℃で２４時間インキュベートした。次いで、トランスフェクション細胞をトリプシン−ＥＤＴＡで剥離し、ＰＢＳ中で洗浄し、１．６７×１０^５細胞／ｍＬの密度になるように培地に再懸濁した。次いで、４％ＤＭＳＯ中の化合物１０μＬが既に存在する３８４ウェルプレートの各ウェルに細胞３０マイクロリットルを分注した。３７℃、５％ＣＯ_２で６時間インキュベートした後、Ｓｔｅａｄｙ Ｌｉｔｅ Ｐｌｕｓ基質（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）１５μｌを各ウェウルに添加することによりルシフェラーゼ活性を測定し、ＶｉｅｗＬｕｘ ｕｌｔｒａＨＴＳマイクロプレートイメージャー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で読み取りを行った。クワドルプリケート（ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅｓ）で行った測定から用量反応曲線を生成した。アッセイの標準偏差を少なくとも２倍上回る効果をもたらす濃度と定義される最低有効濃度（ＬＥＣ）値を各化合物について測定した。

３８４ウェルプレート内で、同様の一連の希釈を行った化合物を、ＣＭＶ−ＴＬＲ７構成体単独（１．６７×１０^５細胞／ｍＬ）でトランスフェクションを行った細胞１ウェル当たり３０μＬと共に使用して、化合物の毒性を並行測定した。３７℃、５％ＣＯ_２で６時間インキュベートした後、１ウェル当たりＡＴＰ ｌｉｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）１５μＬを添加し、ＶｉｅｗＬｕｘ ｕｌｔｒａＨＴＳマイクロプレートイメージャー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で読み取ることにより、細胞生存度を測定した。データはＣＣ_５０として報告した。

ＨＣＶレプリコン複製の抑制
ヒトＴＬＲ７を活性化すると、ヒト血液中に存在する血漿細胞様樹枝状細胞によるインターフェロンの堅調な産生が起こる。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から調整培地でインキュベートした時のＨＣＶレプリコンシステムの抗ウイルス活性を調べることにより、化合物のインターフェロン誘導能力を評価した。ＨＣＶレプリコンアッセイは、Ｌｏｈｍａｎｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）２８５：１１０−１１３；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００３）７７：３００７−１５ ３０１９）により記載のバイシストロニックな発現構成体に基づき、Ｋｒｉｅｇｅｒら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００１）７５：４６１４−４６２４）により記載された変更を行った。アッセイは、レポーター遺伝子（ホタル−ルシフェラーゼ）および選択可能なマーカー遺伝子（ｎｅｏＲ、ネオマイシンリン酸転移酵素）により始まる、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）由来の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）から翻訳されるＨＣＶ１ｂ型の野生型ＮＳ３−ＮＳ５Ｂ領域を含むバイシストロニックな発現構成体をコードするＲＮＡを有する、安定トランスフェクション細胞株Ｈｕｈ−７ ｌｕｃ／ｎｅｏを使用した。構成体は、ＨＣＶ１ｂ型由来の５’および３’ＮＴＲ（非翻訳領域）に隣接する。Ｇ４１８（ｎｅｏＲ）の存在下でのレプリコン細胞の継代培養は、ＨＣＶ ＲＮＡの複製に依存する。とりわけルシフェラーゼをコードする、ＨＣＶ ＲＮＡを自律的に且つ高レベルに複製する安定トランスフェクションレプリコン細胞を、調整細胞培養培地のプロファイリングに使用した。

簡潔に言えば、ＰＢＭＣは、標準的Ｆｉｃｏｌｌ遠心分離手順を使用して、少なくとも２つのドナーのバフィーコートから製造した。単離されたＰＢＭＣを、１０％ヒトＡＢ血清を補ったＲＰＭＩ培地に再懸濁し、化合物（全量７０μＬ）の入った３８４ウェルプレートに２×１０^５細胞／ウェルを分注した。終夜インキュベートした後、３０μＬ中２．２×１０^３レプリコン細胞／ウェルの入った（前日に播種した）３８４ウェルプレートに上清１０μＬを移した。２４時間インキュベートした後、４０μＬ／ウェルのＳｔｅａｄｙ Ｌｉｔｅ Ｐｌｕｓ基質（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用してルシフェラーゼ活性をアッセイすることにより複製を測定し、ＶｉｅｗＬｕｘ ｕｌｔｒａＨＴＳマイクロプレートイメージャー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で測定した。Ｈｕｈ７−ｌｕｃ／ｎｅｏ細胞に対する各化合物の抑制活性を、ＥＣ_５０値として報告したが、これはＰＢＭＣに適用するとルシフェラーゼ活性が５０％低下する化合物濃度と定義され、これはまた、所定量のＰＢＭＣ培養培地を移した時のレプリコンＲＮＡの複製の程度を示す。組み換えインターフェロンα−２ａ（Ｒｏｆｅｒｏｎ−Ａ）を標準対照化合物として使用した。

式（Ｉ）の化合物の生物活性。前述のＨＥＫ ２９３ ＴＯＸアッセイで、化合物は全て＞２４μＭのＣＣ５０を示した。

ＩＳＲＥプロモーターエレメントの活性化
ＰＢＭＣから調整培地によるインターフェロン刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）の活性化を測定することにより、化合物のＩＦＮ−Ｉ誘導能力も評価した。配列ＧＡＡＡＣＴＧＡＡＡＣＴのＩＳＲＥエレメントはＳＴＡＴ１−ＳＴＡＴ２−ＩＲＦ９転写因子に対する応答性が高く、それはＩＦＮ−Ｉがその受容体ＩＦＮＡＲ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰＴ３３７２−５Ｗ）に結合すると活性化される。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製のプラスミドｐＩＳＲＥ−Ｌｕｃ（ｒｅｆ．６３１９１３）は、このＩＳＲＥエレメントを５コピー、その後、ホタルルシフェラーゼＯＲＦを含有する。ｐＩＳＲＥ−Ｌｕｃで安定トランスフェクションを行ったＨＥＫ２９３細胞株（ＨＥＫ−ＩＳＲＥｌｕｃ）は、調整ＰＢＭＣ細胞培養培地のプロファイルに合うように樹立された。

簡潔に言えば、ＰＢＭＣは、標準的Ｆｉｃｏｌｌ遠心分離手順を使用して、少なくとも２つのドナーのバフィーコートから製造された。単離されたＰＢＭＣを、１０％ヒトＡＢ血清を補ったＲＰＭＩ培地に再懸濁し、化合物（全量７０μＬ）の入った３８４ウェルプレートに２×１０^５細胞／ウェルを分注した。終夜インキュベートした後、３０μＬ中５×１０^３ＨＥＫ−ＩＳＲＥｌｕｃ細胞／ウェルの入った（前日に播種した）３８４ウェルプレートに上清１０μＬを移した。２４時間インキュベートした後、４０μＬ／ウェルのＳｔｅａｄｙ Ｌｉｔｅ Ｐｌｕｓ基質（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用してルシフェラーゼ活性をアッセイすることによりＩＳＲＥエレメントの活性を測定し、ＶｉｅｗＬｕｘ ｕｌｔｒａＨＴＳマイクロプレートイメージャー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で測定した。ＨＥＫ−ＩＳＲＥｌｕｃ細胞に対する各化合物の刺激活性をＬＥＣ値として報告したが、これはＰＢＭＣに適用するとアッセイの標準偏差を少なくとも２倍上回るルシフェラーゼ活性が得られる化合物濃度と定義された。ＬＥＣはまた、所定量のＰＢＭＣ培養培地を移した時のＩＳＲＥ活性の程度を示す。組み換えインターフェロンα−２ａ（Ｒｏｆｅｒｏｎ−Ａ）を標準対照化合物として使用した。

所与の化合物について、このアッセイから得られたＬＥＣ値は、「ＨＣＶ複製抑制のアッセイ」から得られたＥＣ_５０値と同じ範囲であった。従って、２つのアッセイのどちらかで測定された、ＰＢＭＣでＩＦＮ−Ｉを誘導する化合物の能力を比較することが可能である。

Claims (4)

1. 式（Ｉ）
   

   

   （式中、
   Ｒ₁は、次、
   

   

   のうちの１つであり、
   Ｒ₂は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アミン、Ｃ₁〜₇アルキル、Ｃ₁〜₇アルキルア
   ミノ、Ｃ₁〜₆アルコキシ、または（Ｃ₁〜₄）アルコキシ−（Ｃ₁〜₄）アルキルであり、
   Ｒ₃は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アミン、Ｃ₁〜₇アルキル、Ｃ₂〜₇アルケニル
   、Ｃ₂〜₇アルキニル、Ｃ₁〜₇アルキルアミノ、Ｃ₁〜₆アルコキシ、または（Ｃ₁〜₄）アルコキシ−（Ｃ₁〜₄）アルキルであり、
   Ｒ₄は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アミン、Ｃ₁〜₇アルキル、Ｃ₁〜₇アルキルア
   ミノ、Ｃ₁〜₆アルコキシ、または（Ｃ₁〜₄）アルコキシ−（Ｃ₁〜₄）アルキルであり、そして、
   Ｒ₅は、水素、フッ素、塩素、またはメチルであるが、但し、
   Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、およびＲ₅が全てＨであってはならない）
   の化合物またはその薬学的に許容される塩。
2. Ｒ₅が水素またはフッ素であり、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、およびＲ₄が請求項１に記載された通
   りである、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。
3. 請求項１〜２のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩を、１種以上の薬学的に許容される医薬品添加物、賦形剤または担体と共に含む、医薬組成物。
4. ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８の調節が関与する障害の治療のための薬剤の製造における、請求項１〜２のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物もしくはその薬学的に許容される塩、または請求項３に記載の医薬組成物、の使用。