JP5763546B2 - ウイルス不活化剤 - Google Patents
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Description
〔1〕 水酸化カルシウム、エタノール及び乳酸ナトリウムが配合されてなる水溶液又は水分散体であり、水酸化カルシウムの配合割合が0.01〜30重量%、エタノールの配合割合が5〜30重量%、乳酸ナトリウムの配合割合が1〜30重量%であることを特徴とする、ノロウイルス不活化剤、
〔2〕 水酸化カルシウム、エタノール及び乳酸ナトリウムが配合されてなる水溶液又は水分散体であり、水酸化カルシウムの配合割合が0.01〜30重量%、エタノールの配合割合が5〜30重量%、乳酸ナトリウムの配合割合が1〜30重量%であることを特徴とする、A型インフルエンザウイルス不活化剤、
〔3〕 水酸化カルシウムに代えて、又は該水酸化カルシウムとともに、酸化カルシウム及び/又は焼成カルシウムが配合されてなる、前記〔1〕又は〔2〕記載のウイルス不活化剤、
〔4〕 水酸化カルシウム、酸化カルシウム及び焼成カルシウムの平均粒径がともに0.1〜10μmである、前記〔1〕〜〔3〕のいずれか記載のウイルス不活化剤、
〔5〕 前記〔1〕〜〔4〕のいずれか記載のウイルス不活化剤でウイルス不活化処理して得られる食品、
〔6〕 食品が鮮魚貝類である、前記〔5〕記載の食品。
A.試験概要
水酸化カルシウム、エタノール、乳酸ナトリウムを配合し、残部を水として下記処方の水分散体(本発明品)を検体とし、(財)日本食品分析センターにて、ネコカリシウイルスに対する本発明品の不活化効果について検証試験を実施した。すなわち、ノロウイルス自体は安定した培養がなされていないため、本試験では、形態的特徴やゲノムの構造からノロウイルスの近縁であるネコカリシウイルスを代替ウイルスとして用いた。試験の詳細は以下のとおりである。
1)検体:水分散体(本発明品)
水酸化カルシウム 12.8重量%
エタノール 19.7重量%
乳酸ナトリウム 9.9重量%
水 57.6重量%
2)試験ウイルス
Feline calicivirus F-9 ATCC VR-782(ネコカリシウイルス)
3)使用細胞
CRFK細胞(大日本製薬社)
4)使用培地
細胞増殖培地
(1)イーグルMEM培地「ニッスイ」(1)(日水製薬社)に牛胎仔血清を10%加えたもの。
(2)細胞維持培地
イーグルMEM培地「ニッスイ」(1)(日水製薬社)に牛胎仔血清を2%加えたもの。
5)ウイルス浮遊液の調製
(1)細胞の培養
細胞増殖培地を用い、使用細胞を組織培養用フラスコ内に単層培養した。
(2)ウイルスの接種
単層培養後にフラスコ内から細胞増殖培地を除き、試験ウイルスを接種した。次に、細胞維持培地を加えて37℃の炭酸ガスインキュベーター(CO2濃度:5%)内で1〜5日間培養した。
(3)ウイルス浮遊液の調製
培養後、倒立位相差顕微鏡を用いて細胞の形態を観察し、細胞に形態変化(細胞変性効果)が起こっていることを確認した。次に、培養液を遠心分離(3,000r/min,10分間)し、得られた上澄み液をウイルス浮遊液とした。
6)試験操作
精製水を用いて検体の2%懸濁液を調製し、試験液とした。試験液1mlにウイルス浮遊液0.1mlを添加、混合した後、80〜90r/minで振とうしながら室温保存し、6及び24時間後に試験液を細胞維持培地を用いて100倍に希釈した。
なお、精製水を対照の試験液として同様に試験した。ただし、開始時についても測定を行った。
7)ウイルス感染価の測定
細胞増殖培地を用い、使用細胞を組織培養用マイクロプレート(96穴)内で単層培養した後、細胞増殖培地を除き細胞維持培地を0.1mlずつ加えた。次に、試験液の希釈液0.1mlを4穴ずつに接種し、37℃の炭酸ガスインキュベーター(CO2濃度:5%)内で4〜7日間培養した。培養後、倒立位相差顕微鏡を用いて細胞の形態変化(細胞変性効果)の有無を観察し、Reed-Muench法により50%組織培養感染量(TCID50)を算出して試験液1ml当たりのウイルス感染価に換算した。表1に結果を示す。
(1) 水酸化カルシウム、エタノール、乳酸ナトリウムを配合し、残部を水として下記処方の水溶液(本発明品)を検体とし、ビジョンバイオ株式会社食品検査センターにて、本発明品のノロウイルスに対する不活化効果について検証試験を実施した。
<検体:水溶液(本発明品)>
水酸化カルシウム 0.26重量%
エタノール 10重量%
乳酸ナトリウム 5重量%
水 84.74重量%
<試料>
1:ノロウイルス懸濁液500μlに何も添加しない試料(対照区1)
2:ノロウイルス懸濁液100μlに精製水400μlを添加した試料(対照区2)
3:ノロウイルス懸濁液100μlに本発明品400μlを添加した試料(本発明品添加区1)
4:上記3と同一の試料(本発明品添加区2)
<検体:水溶液(本発明品)>
水酸化カルシウム 0.26重量%
水 99.74重量%
1:ノロウイルス懸濁液500μlに何も添加しない試料(対照区1)
2:ノロウイルス懸濁液100μlに精製水400μlを添加した試料(対照区2)
3:ノロウイルス懸濁液100μlに本発明品400μlを添加した試料(本発明品添加区1)
4:上記3と同一の試料(本発明品添加区2)
A.試験概要
上記「2.ノロウイルスに対する不活化効果の検証」の(1)と同一の検体を用いて、(財)日本食品分析センターにて、本発明品のA型インフルエンザウイルスに対する不活化効果について検証試験を実施した。試験の詳細は以下のとおりである。
1)検体:水溶液(本発明品)
水酸化カルシウム 0.26重量%
エタノール 10重量%
乳酸ナトリウム 5重量%
水 84.74重量%
2)試験ウイルス
A型インフルエンザウイルス(H1N1)
3)使用細胞
MDCK(NBL−2)細胞 ATCC CCL-34株(大日本製薬社)
4)使用培地
(1)細胞増殖培地
イーグルMEM培地「ニッスイ」(1)(日水製薬社) 1,000ml
10%NaHCO3 14ml
L−グルタミン(30g/l) 9.8ml
100×MEM用ビタミン液 30ml
10%アルブミン 20ml
0.25%トリプシン 20ml
5)ウイルス浮遊液の調製
(1)細胞の培養
細胞増殖培地を用い、使用細胞を組織培養用フラスコ内に単層培養した。
(2)ウイルスの接種
単層培養後にフラスコ内から細胞増殖培地を除き、試験ウイルスを接種した。次に、細胞維持培地を加えて37℃の炭酸ガスインキュベーター(CO2濃度:5%)内で1〜5日間培養した。
(3)ウイルス浮遊液の調製
培養後、倒立位相差顕微鏡を用いて細胞の形態を観察し、細胞に形態変化(細胞変性効果)が起こっていることを確認した。次に、培養液を遠心分離(3,000r/min,10分間)し、得られた上澄み液をウイルス浮遊液とした。
6)試験操作
検体1mlにウイルス浮遊液0.1mlを添加,混合し、作用液とした。室温で作用させ、30秒、1分及び5分後に細胞維持培地を用いて100倍に希釈した。なお、対照として精製水を用いて同様に試験し、開始時及び5分後に測定を行った。
7)ウイルス感染価の測定
細胞増殖培地を用い、使用細胞を組織培養用マイクロプレート(96穴)内で単層培養した後、細胞増殖培地を除き細胞維持培地を0.1mlずつ加えた。次に、作用液の希釈液0.1mlを4穴ずつに接種し、37℃の炭酸ガスインキュベーター(CO2濃度:5%)内で4〜7日間培養した。培養後、倒立位相差顕微鏡を用いて細胞の形態変化(細胞変性効果)の有無を観察し、Reed-Muench法により50%組織培養感染量(TCID50)を算出して作用液1ml当たりのウイルス感染価に換算した。表2に結果を示す。
食中毒菌(黄色ブドウ球菌、サルモネラ、0−157、腸炎ビブリオ又は大腸菌)を103〜104cfu/ml含む人工海水(SEA WATER,ジェックス社)に殻付き生牡蠣を常温で12時間浸漬し(浸漬工程)、次いで浸漬後の汚染生牡蠣を取り出し、下記除菌剤を含む別の人工海水に常温で浸漬し(除菌工程)、浸漬時,3,6,9及び24時間後における汚染生牡蠣の生菌数を測定し、除菌剤の除菌効果を調べた。
なお、対照として、浸漬工程では、食中毒菌を添加していない人工海水に殻付き生牡蠣を浸漬した試験区を使用し、除菌工程では、除菌剤を添加していない人工海水に汚染生牡蠣を浸漬したものを使用し、上記と同様の試験を行った。図3〜図8に結果を示す。
<除菌工程の試験区>
1:人工海水中、次亜塩素酸ナトリウムを1ppm含有する。
2:人工海水中、上記「1.ネコカリシウイルスに対する不活化効果の検証」で用いた検体(本発明品)を2重量%含有する。
3:人工海水のみ(除菌剤を添加していない)
表3および表4に示す配合処方で、貝殻焼成カルシウム(エヌ・シ−・コーポレーション)とエタノールを配合し、残部を水とした組成物(本発明品)を調製し、大腸菌(Esherichia coli NIHJ)および黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus 209P)(以下、「供試菌」という場合がある)に対する殺菌効果を検討した。
上記組成物の殺菌効果は、消毒剤の殺菌効果判定法として知られているKelsey-Sykes法(The pharmaceutical journal、1974年11月30日発行、第528 〜530 頁)の藤本変法(「防菌防黴」、技報堂出版、第683〜684 頁)により判定した。操作手順の概略は以下のとおりである。
(2)2分後(ステップ(1)の注加開始時から10分経過後)、反応液に上記供試菌1mlを注入し、8分後(ステップ(1)の注加開始時から18分経過後)、反応液を採取し、後培養培地(Bacto(TM)Tryptic Soy Broth)を入れた5本の試験管に0.02ml(1滴)ずつ注加接種する。
(3)2分後(ステップ(1)の注加開始時から20分経過後)、反応液に上記供試菌1mlを注入し、8分後(ステップ(1)の注加開始時から28分経過後)、反応液を採取し、後培養培地(Bacto(TM)Tryptic Soy Broth)を入れた5本の試験管に0.02ml(1滴)ずつ注加接種する。
ステップ(1)〜(3)で得られた各5本の試験管を37℃で24時間培養し、各ステップにおいて5本中3本以上の試験管で供試菌の増殖が認められない場合、殺菌効果ありと判断した。
具体的な評価は以下のとおりである。結果を表3と表4に示す。
×:殺菌効果なし
△:ステップ(1)では殺菌効果あるがステップ(2)では殺菌効果なし
○:ステップ(2)までは殺菌効果あるがステップ(3)では殺菌効果なし
◎:ステップ(3)まで殺菌効果あり
表5および表6に示す配合処方で、貝殻焼成カルシウム(エヌ・シ−・コーポレーション)とエタノールおよび乳酸ナトリウム(60重量%水溶液、武蔵野化学研究所)を配合し、残部を水とした種々の組成物(本発明品)を調製し、大腸菌および黄色ブドウ球菌に対する殺菌効果を検討した。殺菌効果の判定試験および評価方法は、上記「5.焼成カルシウムとエタノールからなる組成物の殺菌効果」と同様に行った。結果を表5と表6に示す。
この傾向は黄色ブドウ球菌に対する殺菌効果で顕著に認められた。すなわち、エタノールを5重量%、焼成カルシウムを0.1重量%配合した場合、乳酸ナトリウムを4.5重量%以上配合すると殺菌効果が評価×から△になり(表6の中央列を参照)、エタノールを10重量%、焼成カルシウムを0.2重量%配合した場合、乳酸ナトリウムを6重量%以上配合すると殺菌効果が評価△から◎になった(表6の右列を参照)。
Claims (6)
- 水酸化カルシウム、エタノール及び乳酸ナトリウムが配合されてなる水溶液又は水分散体であり、水酸化カルシウムの配合割合が0.01〜30重量%、エタノールの配合割合が5〜30重量%、乳酸ナトリウムの配合割合が1〜30重量%であることを特徴とする、ノロウイルス不活化剤。
- 水酸化カルシウム、エタノール及び乳酸ナトリウムが配合されてなる水溶液又は水分散体であり、水酸化カルシウムの配合割合が0.01〜30重量%、エタノールの配合割合が5〜30重量%、乳酸ナトリウムの配合割合が1〜30重量%であることを特徴とする、A型インフルエンザウイルス不活化剤。
- 水酸化カルシウムに代えて、又は該水酸化カルシウムとともに、酸化カルシウム及び/又は焼成カルシウムが配合されてなる、請求項1又は2記載のウイルス不活化剤。
- 水酸化カルシウム、酸化カルシウム及び焼成カルシウムの平均粒径がともに0.1〜10μmである、請求項1〜3のいずれか記載のウイルス不活化剤。
- 請求項1〜4のいずれか記載のウイルス不活化剤でウイルス不活化処理して得られる食品。
- 食品が鮮魚貝類である、請求項5記載の食品。
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