JP5763546B2 - ウイルス不活化剤 - Google Patents

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Description

本発明はウイルス不活化剤に関し、特にノロウイルス及びA型インフルエンザウイルスに対して不活化効果を有するウイルス不活化剤に関するものである。
従来から、アルコールを主剤とする組成物は除菌剤として広く使用されており、さらにノロウイルスに対して不活化効果を有するものとして、例えば、醸造用アルコールにグレープフルーツ種子抽出液とフィチン酸を配合した組成物(特許文献1)、エタノールにアルカリ性物質と界面活性剤を配合した組成物(特許文献2)、及びエタノールに有機酸塩とユーカリ抽出物を配合した組成物(特許文献3)等が開示されている。
一方、近年、貝殻焼成カルシウム、酸化カルシウム及びその水和物である水酸化カルシウムに抗菌性があることが開示され(特許文献4)、この貝殻焼成カルシウムに有機酸塩を配合した食品の制菌剤(特許文献5)、焼成カルシウムに多価アルコール脂肪酸エステル及びエタノールを配合した食品用除菌剤(特許文献6)等が開示されている。しかし、貝殻焼成カルシウム等のノロウイルスに対する不活化効果は不明であった。
特開2007−320924号公報 特開2008−189645号公報 特開2009−179577号公報 特開平11−222796号公報 特開平11−290044特号公報 特開2002−272434号公報
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、焼成カルシウム等のウイルス不活化効果を明らかにし、特にノロウイルス不活化効果を有する新規なウイルス不活化剤を提供することを課題とする。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、水酸化カルシウムを配合した水溶液又は水分散体がノロウイルス不活化効果を有するだけでなく、さらにA型インフルエンザウイルス不活化効果をも有することを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
〔1〕 水酸化カルシウム、エタノール及び乳酸ナトリウムが配合されてなる水溶液又は水分散体であり、水酸化カルシウムの配合割合が0.01〜30重量%、エタノールの配合割合が5〜30重量%、乳酸ナトリウムの配合割合が1〜30重量%であることを特徴とする、ノロウイルス不活化剤、
〔2〕 水酸化カルシウム、エタノール及び乳酸ナトリウムが配合されてなる水溶液又は水分散体であり、水酸化カルシウムの配合割合が0.01〜30重量%、エタノールの配合割合が5〜30重量%、乳酸ナトリウムの配合割合が1〜30重量%であることを特徴とする、A型インフルエンザウイルス不活化剤、
〔3〕 水酸化カルシウムに代えて、又は該水酸化カルシウムとともに、酸化カルシウム及び/又は焼成カルシウムが配合されてなる、前記〔1〕又は〔2〕記載のウイルス不活化剤、
〕 水酸化カルシウム、酸化カルシウム及び焼成カルシウムの平均粒径がともに0.1〜10μmである、前記〔1〕〜〔3〕のいずれか記載のウイルス不活化剤、
〕 前記〔1〕〜〔4〕のいずれか記載のウイルス不活化剤でウイルス不活化処理して得られる食品、
〕 食品が鮮魚貝類である、前記〔5〕記載の食品。

本発明によれば、ノロウイルス不活化効果とA型インフルエンザウイルス不活化効果を有するウイルス不活化剤が提供される。
PCR産物の電気泳動図である。 PCR産物の電気泳動図である。 黄色ブドウ球菌で汚染された生牡蠣を除菌処理したときの、生牡蠣の生菌数の経時変化を示した図である。 サルモネラで汚染された生牡蠣を除菌処理したときの、生牡蠣の生菌数の経時変化を示した図である。 0−157で汚染された生牡蠣を除菌処理したときの、生牡蠣の生菌数の経時変化を示した図である。 腸炎ビブリオで汚染された生牡蠣を除菌処理したときの、生牡蠣の生菌数の経時変化を示した図である。 大腸菌で汚染された生牡蠣を除菌処理したときの、生牡蠣の生菌数の経時変化を示した図である。 人工海水に浸漬した生牡蠣を除菌処理したときの、生牡蠣の生菌数の経時変化を示した図である。
本発明のウイルス不活化剤は、水酸化カルシウムを水に配合して得られる水溶液又は水分散体であり、ノロウイルス不活化効果、A型インフルエンザウイルス不活化効果及びネコカリシウイルス不活化効果を有し、さらに一般の食中毒菌に対して除菌効果を有するものである。
本発明の配合成分としては、水酸化カルシウムに代えて、又は水酸化カルシウムとともに、例えば、酸化カルシウムや焼成カルシウム等の水と反応して水酸化カルシウムを生成する成分の1種以上を使用することもできる。以下、本明細書では、水酸化カルシウム、及び酸化カルシウム、焼成カルシウム等の水と反応して水酸化カルシウムを生成する成分をまとめて言うときは「ウイルス不活化成分」という。
上記ウイルス不活化成分のうち焼成カルシウムは、牡蠣殻、ホタテ貝殻、ホッキ貝殻、卵殻あるいは珊瑚殻等、焼成前の成分が炭酸カルシウムである動物性由来のカルシウムを600℃以上、好ましくは900〜1200℃の温度で15〜60分程度焼成もしくは通電加熱して得られ、主成分を酸化カルシウムとするものである。得られた焼成カルシウムの飽和水溶液のpHが11〜13の範囲にあることが好ましい。焼成カルシウムは食品添加物規格に適合したものが通常用いられる。
ウイルス不活化成分の平均粒径は特に限定されず、通常0.1〜10μmである。また、ウイルス不活化剤中のウイルス不活化成分の配合割合は特に限定されず、通常0.01〜30重量%である。
本発明では、ウイルス不活化効果又は食中毒菌に対する除菌効果を高めるため、ウイルス不活化成分以外の他の配合成分として、例えば、エタノールや有機酸塩を配合することができる。エタノールは通常食品添加物規格に適合したものが好ましい。ウイルス不活化剤中のエタノールの配合割合は特に限定されず、通常5〜30重量%の範囲で配合される。
有機酸塩としては、例えば、クエン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、グルコンサン塩等が挙げられ、これらは単独で又は2種以上を適宜組み合わせて用いることができる。塩としてはアルカリ金属塩等が挙げられる。これらの中でも、乳酸塩が好ましく、乳酸ナトリウムがより好ましい。ウイルス不活化剤中の有機酸塩の配合割合は特に限定されず、通常1〜30重量%の範囲で配合される。
本発明のウイルス不活化剤には、上述した成分の他、本発明の効果を妨げない範囲で、除菌剤に配合し得る公知の成分を適量含有させることができる。このような成分としては、防腐剤、酸化防止剤、界面活性剤、色素、香料、染料等が挙げられる。
本発明のウイルス不活化剤のpHは、ウイルス不活化効果又は食中毒菌に対する除菌効果の点で、11〜14が好ましく、11〜13がより好ましい。
本発明のウイルス不活化剤は、特にノロウイルス不活化効果とA型インフルエンザウイルス不活化効果が顕著であり、さらに一般の食中毒菌に対しても除菌効果に優れている。本発明では上述した配合成分の濃度により、各成分が実質的に水に溶解した水溶液タイプとして、または各成分のうち一部が水に溶解し、一部が水中に分散している水分散タイプとして使用することができる。本発明のウイルス不活化剤は使用時に水で希釈せずそのまま使用することもできるが、水分散タイプを使用する場合は、水で希釈して使用することが望ましい。水溶液タイプ若しくは水分散タイプをそのまま使用する場合、又はこれらを水希釈して使用する場合等、いずれの使用方法を採用する場合でも、ウイルス不活化剤中のウイルス不活化成分の配合割合は実際の使用濃度で0.01〜5重量%が好ましい。
水溶液タイプを用いる場合はスプレー容器等に充填し、例えば、食品工場、飲食店の厨房又は家庭の台所等にて、作業者の手、腕等の皮膚、包丁、鍋等の調理器具、皿、容器等の食器、鮮魚貝類、野菜、肉類等の生鮮食品、加工食品等、上記ウイルスの付着のおそれがある部分に噴霧して使用することができる。また、水分散タイプを用いる場合は、使用時に水で希釈し、上記例示した適用対象物のうち、持ち運び可能なものを浸漬して使用することができる。
以下、試験例などにより本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらによりなんら限定されるものではない。
1.ネコカリシウイルスに対する不活化効果の検証
A.試験概要
水酸化カルシウム、エタノール、乳酸ナトリウムを配合し、残部を水として下記処方の水分散体(本発明品)を検体とし、(財)日本食品分析センターにて、ネコカリシウイルスに対する本発明品の不活化効果について検証試験を実施した。すなわち、ノロウイルス自体は安定した培養がなされていないため、本試験では、形態的特徴やゲノムの構造からノロウイルスの近縁であるネコカリシウイルスを代替ウイルスとして用いた。試験の詳細は以下のとおりである。
B.試験方法
1)検体:水分散体(本発明品)
水酸化カルシウム 12.8重量%
エタノール 19.7重量%
乳酸ナトリウム 9.9重量%
水 57.6重量%
2)試験ウイルス
Feline calicivirus F-9 ATCC VR-782(ネコカリシウイルス)
3)使用細胞
CRFK細胞(大日本製薬社)
4)使用培地
細胞増殖培地
(1)イーグルMEM培地「ニッスイ」(1)(日水製薬社)に牛胎仔血清を10%加えたもの。
(2)細胞維持培地
イーグルMEM培地「ニッスイ」(1)(日水製薬社)に牛胎仔血清を2%加えたもの。
5)ウイルス浮遊液の調製
(1)細胞の培養
細胞増殖培地を用い、使用細胞を組織培養用フラスコ内に単層培養した。
(2)ウイルスの接種
単層培養後にフラスコ内から細胞増殖培地を除き、試験ウイルスを接種した。次に、細胞維持培地を加えて37℃の炭酸ガスインキュベーター(CO濃度:5%)内で1〜5日間培養した。
(3)ウイルス浮遊液の調製
培養後、倒立位相差顕微鏡を用いて細胞の形態を観察し、細胞に形態変化(細胞変性効果)が起こっていることを確認した。次に、培養液を遠心分離(3,000r/min,10分間)し、得られた上澄み液をウイルス浮遊液とした。
6)試験操作
精製水を用いて検体の2%懸濁液を調製し、試験液とした。試験液1mlにウイルス浮遊液0.1mlを添加、混合した後、80〜90r/minで振とうしながら室温保存し、6及び24時間後に試験液を細胞維持培地を用いて100倍に希釈した。
なお、精製水を対照の試験液として同様に試験した。ただし、開始時についても測定を行った。
7)ウイルス感染価の測定
細胞増殖培地を用い、使用細胞を組織培養用マイクロプレート(96穴)内で単層培養した後、細胞増殖培地を除き細胞維持培地を0.1mlずつ加えた。次に、試験液の希釈液0.1mlを4穴ずつに接種し、37℃の炭酸ガスインキュベーター(CO濃度:5%)内で4〜7日間培養した。培養後、倒立位相差顕微鏡を用いて細胞の形態変化(細胞変性効果)の有無を観察し、Reed-Muench法により50%組織培養感染量(TCID50)を算出して試験液1ml当たりのウイルス感染価に換算した。表1に結果を示す。
表1から、本発明品は3.1×10 TCID50/mlのネコカリシウイルスを6時間以内に完全に不活化した。
2.ノロウイルスに対する不活化効果の検証
(1) 水酸化カルシウム、エタノール、乳酸ナトリウムを配合し、残部を水として下記処方の水溶液(本発明品)を検体とし、ビジョンバイオ株式会社食品検査センターにて、本発明品のノロウイルスに対する不活化効果について検証試験を実施した。
<検体:水溶液(本発明品)>
水酸化カルシウム 0.26重量%
エタノール 10重量%
乳酸ナトリウム 5重量%
水 84.74重量%
ノロウイルスの検出試験は厚生労働省が公表した「ノロウイルスの検出法」(最終改正 平成19年5月14日食安監発第0514004号)にしたがって実施した。ノロウイルスとしては糞便由来ノロウイルス(NV遺伝子2群に属するもの)を使用した。実験手順としては、下記4つの試料をボルテックスミキサーで攪拌し、静置10分後にRNAの抽出を開始し、次いでDNase処理及びRT−PCR反応(逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応)を行ない、得られたPCR産物を2.5%アガロースゲル電気泳動した。電気泳動が終了した後、ゲル染色と写真撮影を行い、バンドの確認を行なった。RT−PCR反応では、Genogroup(G)II検出用に、プライマーとしてG2-SKF/G2-SKR(増幅断片344bp),G2-SKF/G2AL-SKR(増幅断片344bp)を用いた。図1にPCR産物の電気泳動図を示す。
<試料>
1:ノロウイルス懸濁液500μlに何も添加しない試料(対照区1)
2:ノロウイルス懸濁液100μlに精製水400μlを添加した試料(対照区2)
3:ノロウイルス懸濁液100μlに本発明品400μlを添加した試料(本発明品添加区1)
4:上記3と同一の試料(本発明品添加区2)
本検証試験ではノロウイルス陽性の場合は344bpの位置にバンドが出現する。そこで図1を見ると、本発明品を添加した試料3,4ではバンドが確認されずノロウイルス遺伝子が検出されなかったのに対し、本発明品を添加しなかった試料1,2ではノロウイルス遺伝子のバンドが検出された。したがって、本検証試験条件下において、本発明品はノロウイルスに対して不活化効果を有することが確認された。
(2) 下記処方に示すとおり、エタノールと乳酸ナトリウムを配合せず、水酸化カルシウムを水に配合して得られた水溶液(本発明品)を検体としたこと、及び下記4つの試料をボルテックスミキサーで攪拌し、静置30分後にRNAの抽出を開始したこと以外は、上記(1)と同様の方法でノロウイルスに対する不活化効果について検証試験を実施した。図2にPCR産物の電気泳動図を示す。
<検体:水溶液(本発明品)>
水酸化カルシウム 0.26重量%
水 99.74重量%
<試料>
1:ノロウイルス懸濁液500μlに何も添加しない試料(対照区1)
2:ノロウイルス懸濁液100μlに精製水400μlを添加した試料(対照区2)
3:ノロウイルス懸濁液100μlに本発明品400μlを添加した試料(本発明品添加区1)
4:上記3と同一の試料(本発明品添加区2)
図2より、本発明品を添加した試料3,4ではバンドが確認されずノロウイルス遺伝子が検出されなかったのに対し、本発明品を添加しなかった試料1,2ではノロウイルス遺伝子のバンドが検出された。したがって、本検証試験条件下において、本発明品はノロウイルスに対して不活化効果を有することが確認された。
上記(1)と(2)の実験条件を比較すると、(1)ではノロウイルスに対して本発明品(水酸化カルシウム、エタノール、乳酸ナトリウムを配合し、残部を水としたもの)の処理時間が10分であるのに対し、(2)ではノロウイルスに対して本発明品(水酸化カルシウムを配合し、残部を水としたもの)の処理時間が30分である。そして、図1,2によれば、(1)の試料3,4と(2)の試料3,4はともにノロウイルス遺伝子のバンドが検出されなかった。ノロウイルスに対する本発明品の処理時間はウイルス不活化効果の程度と相関すると考えられ、上記(1),(2)の結果から、(1)の本発明品の方が(2)の本発明品よりもウイルス不活化効果の点で優れていると考えられる。
3.A型インフルエンザウイルスに対する不活化効果の検証
A.試験概要
上記「2.ノロウイルスに対する不活化効果の検証」の(1)と同一の検体を用いて、(財)日本食品分析センターにて、本発明品のA型インフルエンザウイルスに対する不活化効果について検証試験を実施した。試験の詳細は以下のとおりである。
B.試験方法
1)検体:水溶液(本発明品)
水酸化カルシウム 0.26重量%
エタノール 10重量%
乳酸ナトリウム 5重量%
水 84.74重量%
2)試験ウイルス
A型インフルエンザウイルス(H1N1)
3)使用細胞
MDCK(NBL−2)細胞 ATCC CCL-34株(大日本製薬社)
4)使用培地
(1)細胞増殖培地
イーグルMEM培地「ニッスイ」(1)(日水製薬社) 1,000ml
10%NaHCO 14ml
L−グルタミン(30g/l) 9.8ml
100×MEM用ビタミン液 30ml
10%アルブミン 20ml
0.25%トリプシン 20ml
5)ウイルス浮遊液の調製
(1)細胞の培養
細胞増殖培地を用い、使用細胞を組織培養用フラスコ内に単層培養した。
(2)ウイルスの接種
単層培養後にフラスコ内から細胞増殖培地を除き、試験ウイルスを接種した。次に、細胞維持培地を加えて37℃の炭酸ガスインキュベーター(CO濃度:5%)内で1〜5日間培養した。
(3)ウイルス浮遊液の調製
培養後、倒立位相差顕微鏡を用いて細胞の形態を観察し、細胞に形態変化(細胞変性効果)が起こっていることを確認した。次に、培養液を遠心分離(3,000r/min,10分間)し、得られた上澄み液をウイルス浮遊液とした。
6)試験操作
検体1mlにウイルス浮遊液0.1mlを添加,混合し、作用液とした。室温で作用させ、30秒、1分及び5分後に細胞維持培地を用いて100倍に希釈した。なお、対照として精製水を用いて同様に試験し、開始時及び5分後に測定を行った。
7)ウイルス感染価の測定
細胞増殖培地を用い、使用細胞を組織培養用マイクロプレート(96穴)内で単層培養した後、細胞増殖培地を除き細胞維持培地を0.1mlずつ加えた。次に、作用液の希釈液0.1mlを4穴ずつに接種し、37℃の炭酸ガスインキュベーター(CO濃度:5%)内で4〜7日間培養した。培養後、倒立位相差顕微鏡を用いて細胞の形態変化(細胞変性効果)の有無を観察し、Reed-Muench法により50%組織培養感染量(TCID50)を算出して作用液1ml当たりのウイルス感染価に換算した。表2に結果を示す。
表2から、本発明品は2.0×10TCID50/mlのインフルエンザウイルスを1分以内に完全に不活化した。
4.生牡蠣の除菌テスト
食中毒菌(黄色ブドウ球菌、サルモネラ、0−157、腸炎ビブリオ又は大腸菌)を10〜10cfu/ml含む人工海水(SEA WATER,ジェックス社)に殻付き生牡蠣を常温で12時間浸漬し(浸漬工程)、次いで浸漬後の汚染生牡蠣を取り出し、下記除菌剤を含む別の人工海水に常温で浸漬し(除菌工程)、浸漬時,3,6,9及び24時間後における汚染生牡蠣の生菌数を測定し、除菌剤の除菌効果を調べた。
なお、対照として、浸漬工程では、食中毒菌を添加していない人工海水に殻付き生牡蠣を浸漬した試験区を使用し、除菌工程では、除菌剤を添加していない人工海水に汚染生牡蠣を浸漬したものを使用し、上記と同様の試験を行った。図3〜図8に結果を示す。
<除菌工程の試験区>
1:人工海水中、次亜塩素酸ナトリウムを1ppm含有する。
2:人工海水中、上記「1.ネコカリシウイルスに対する不活化効果の検証」で用いた検体(本発明品)を2重量%含有する。
3:人工海水のみ(除菌剤を添加していない)
図3〜図8より、本発明品を配合した試験区2は、次亜塩素酸ナトリウムを配合した試験区1と比較して、同等又はそれ以上の除菌効果を示すことが認められた。
5.焼成カルシウムとエタノールからなる組成物の殺菌効果
表3および表4に示す配合処方で、貝殻焼成カルシウム(エヌ・シ−・コーポレーション)とエタノールを配合し、残部を水とした組成物(本発明品)を調製し、大腸菌(Esherichia coli NIHJ)および黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus 209P)(以下、「供試菌」という場合がある)に対する殺菌効果を検討した。
(殺菌効果の判定試験)
上記組成物の殺菌効果は、消毒剤の殺菌効果判定法として知られているKelsey-Sykes法(The pharmaceutical journal、1974年11月30日発行、第528 〜530 頁)の藤本変法(「防菌防黴」、技報堂出版、第683〜684 頁)により判定した。操作手順の概略は以下のとおりである。
(1)20℃に設定した反応容器に上記で調製した混合液ないし水分散体3mlを分注し、10〜10 cfu/mlに濃度調整した供試菌1mlを注加し(この時点を供試菌の最初の注加開始時とする)、その8分後、反応液を採取し、後培養培地(Bacto(TM)Tryptic Soy Broth)を入れた5本の試験管に0.02ml(1滴)ずつ注加接種する。
(2)2分後(ステップ(1)の注加開始時から10分経過後)、反応液に上記供試菌1mlを注入し、8分後(ステップ(1)の注加開始時から18分経過後)、反応液を採取し、後培養培地(Bacto(TM)Tryptic Soy Broth)を入れた5本の試験管に0.02ml(1滴)ずつ注加接種する。
(3)2分後(ステップ(1)の注加開始時から20分経過後)、反応液に上記供試菌1mlを注入し、8分後(ステップ(1)の注加開始時から28分経過後)、反応液を採取し、後培養培地(Bacto(TM)Tryptic Soy Broth)を入れた5本の試験管に0.02ml(1滴)ずつ注加接種する。
(評価)
ステップ(1)〜(3)で得られた各5本の試験管を37℃で24時間培養し、各ステップにおいて5本中3本以上の試験管で供試菌の増殖が認められない場合、殺菌効果ありと判断した。
具体的な評価は以下のとおりである。結果を表3と表4に示す。
×:殺菌効果なし
△:ステップ(1)では殺菌効果あるがステップ(2)では殺菌効果なし
○:ステップ(2)までは殺菌効果あるがステップ(3)では殺菌効果なし
◎:ステップ(3)まで殺菌効果あり
表3の結果から、大腸菌に対しては、焼成カルシウムを0.05重量%以上配合した場合、エタノールを10重量%以上配合すると十分な殺菌効果(評価:◎)が認められた。また、表4の結果から、黄色ブドウ球菌に対しては、焼成カルシウムを0.05重量%以上配合した場合、エタノールを20重量%以上配合すると十分な殺菌効果(評価:◎)が認められた。
6.乳酸ナトリウムを配合した組成物の殺菌効果
表5および表6に示す配合処方で、貝殻焼成カルシウム(エヌ・シ−・コーポレーション)とエタノールおよび乳酸ナトリウム(60重量%水溶液、武蔵野化学研究所)を配合し、残部を水とした種々の組成物(本発明品)を調製し、大腸菌および黄色ブドウ球菌に対する殺菌効果を検討した。殺菌効果の判定試験および評価方法は、上記「5.焼成カルシウムとエタノールからなる組成物の殺菌効果」と同様に行った。結果を表5と表6に示す。
表5の結果から、乳酸ナトリウム単独では、乳酸ナトリウムを9重量%配合した場合でも大腸菌に対する殺菌効果が全く認められなかったのに対し(表5の左列を参照)、エタノールを5重量%、焼成カルシウムを0.1重量%配合した場合、乳酸ナトリウムを1.5重量%以上配合すると殺菌効果が評価○から◎になった(表5の中央列を参照)。すなわち、エタノールと焼成カルシウムを含有する組成物に対して乳酸ナトリウムを配合することで、大腸菌に対する殺菌力の増強効果が認められた。
この傾向は黄色ブドウ球菌に対する殺菌効果で顕著に認められた。すなわち、エタノールを5重量%、焼成カルシウムを0.1重量%配合した場合、乳酸ナトリウムを4.5重量%以上配合すると殺菌効果が評価×から△になり(表6の中央列を参照)、エタノールを10重量%、焼成カルシウムを0.2重量%配合した場合、乳酸ナトリウムを6重量%以上配合すると殺菌効果が評価△から◎になった(表6の右列を参照)。
乳酸ナトリウムによる殺菌力の増強効果は、組成物中の水酸化カルシウムの溶解性を向上させたことによるものと推測される。すなわち、配合された焼成カルシウムは組成物中の水と反応して水酸化カルシウムとして存在し、この水酸化カルシウムが殺菌効果を示すものと一般的に考えられている。そして、水酸化カルシウムは水に対する溶解度が小さく、このため本来の殺菌効果を発揮していないと考えられるが、上記の結果は、乳酸ナトリウムの添加により、生成した水酸化カルシウムの溶解度が向上したことを示唆するものといえる。
本発明のウイルス不活化剤は食品そのものの他、調理器具、調理設備等の食品製造設備にも適用できるウイルス不活剤として広く利用可能である。

Claims (6)

  1. 水酸化カルシウム、エタノール及び乳酸ナトリウムが配合されてなる水溶液又は水分散体であり、水酸化カルシウムの配合割合が0.01〜30重量%、エタノールの配合割合が5〜30重量%、乳酸ナトリウムの配合割合が1〜30重量%であることを特徴とする、ノロウイルス不活化剤。
  2. 水酸化カルシウム、エタノール及び乳酸ナトリウムが配合されてなる水溶液又は水分散体であり、水酸化カルシウムの配合割合が0.01〜30重量%、エタノールの配合割合が5〜30重量%、乳酸ナトリウムの配合割合が1〜30重量%であることを特徴とする、A型インフルエンザウイルス不活化剤。
  3. 水酸化カルシウムに代えて、又は該水酸化カルシウムとともに、酸化カルシウム及び/又は焼成カルシウムが配合されてなる、請求項1又は2記載のウイルス不活化剤。
  4. 水酸化カルシウム、酸化カルシウム及び焼成カルシウムの平均粒径がともに0.1〜10μmである、請求項1〜のいずれか記載のウイルス不活化剤。
  5. 請求項1〜のいずれか記載のウイルス不活化剤でウイルス不活化処理して得られる食品。
  6. 食品が鮮魚貝類である、請求項記載の食品。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104255793B (zh) * 2014-10-16 2017-07-18 李卫平 绿色食品消毒剂活性牡蛎钙及其制备方法
JP2017071566A (ja) * 2015-10-06 2017-04-13 株式会社かわかみ 化粧料
JP7298908B2 (ja) * 2017-10-16 2023-06-27 株式会社日本抗菌総合研究所 抗菌性組成物
KR20210108945A (ko) * 2018-12-27 2021-09-03 도아고세이가부시키가이샤 비엔벨로프형 항바이러스제 및 그것을 포함하는 조성물 그리고 항바이러스 제품 및 그의 제조 방법
CN111449084A (zh) * 2020-05-09 2020-07-28 同济大学 一种杀灭和抑制细菌及病毒的制剂及使用方法
WO2022055311A1 (ko) * 2020-09-10 2022-03-17 건국대학교 산학협력단 항균 또는 항바이러스 활성을 갖는 수산화 인회석 및 수산화 칼슘을 포함하는 조성물 및 이의 제조 방법

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001226210A (ja) * 2000-02-18 2001-08-21 Hozawa Hiroki 滅ウィルス剤およびその製造方法
WO2005013695A1 (ja) * 2003-08-12 2005-02-17 Mochigase Electrical Equipment Co., Ltd. 抗ウイルス剤、これを用いた繊維及び抗ウイルス部材
WO2009078447A1 (ja) * 2007-12-17 2009-06-25 Adept Co., Ltd. 抗ノロウイルス剤、抗インフルエンザウイルス剤、およびこれらを用いた抗ウイルス処理方法
WO2009084211A1 (ja) * 2007-12-27 2009-07-09 Johnsondiversey Co., Ltd. 殺菌消毒剤組成物およびこれを含有する殺菌消毒材、ならびにこれらを用いた殺菌消毒方法
WO2009104670A1 (ja) * 2008-02-19 2009-08-27 東京ナノ・バイオテクノロジー株式会社 抗菌抗ウイルス剤及びその使用方法
WO2010044194A1 (ja) * 2008-10-15 2010-04-22 株式会社イオンコマース アルカリ洗浄水
JP2011012000A (ja) * 2009-06-30 2011-01-20 Kyoto Sangyo Univ カキ殻由来の石灰を含有する抗鳥インフルエンザウイルス剤、哺乳類または鳥類のための畜産用資材、哺乳類または鳥類のための畜産用飼料、食品容器および衛生用品

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5350361A (en) * 1977-08-04 1978-05-08 Hiroe Ogawa Method of preserving smoked food products
US4371560A (en) * 1980-04-07 1983-02-01 Dca Food Industries Seafood product and method of producing same
JPS63133972A (ja) * 1986-11-26 1988-06-06 De-Baa Youshiyu Boeki Kk 食品防腐用組成物
JPH11222796A (ja) 1998-02-02 1999-08-17 Toyo Ink Mfg Co Ltd 抗菌紙および包装材
JPH11290044A (ja) 1998-04-16 1999-10-26 Sankyo Foods Kk カルシウム溶液製剤
US6773737B1 (en) * 1998-11-19 2004-08-10 The Procter & Gamble Company Microorganism reduction methods and compositions for food
JP2002272434A (ja) * 2001-03-16 2002-09-24 Riken Vitamin Co Ltd 食品用除菌剤組成物
WO2003059074A1 (fr) * 2002-01-15 2003-07-24 Japantechno Ltd.,Co. Procede de prevention du brunissement ou du noircissement de mollusques a tentacules
CN100386026C (zh) * 2002-05-30 2008-05-07 味之素株式会社 纯肉食品用制剂及使用该制剂的纯肉食品的制造方法
CN100482079C (zh) * 2003-08-12 2009-04-29 用濑电机株式会社 抗病毒剂、使用它的纤维和抗病毒部件
JP4875913B2 (ja) * 2006-03-29 2012-02-15 公益財団法人函館地域産業振興財団 活魚介類の保存又は輸送方法
US20070254015A1 (en) * 2006-04-28 2007-11-01 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware Sanitizing surfaces
JP4126068B2 (ja) 2006-06-02 2008-07-30 株式会社ドゥリーム・ドゥ ネコカリシウイルス不活化剤、ネコカリシウイルス不活化剤の製造方法及びネコカリシウイルス不活化スプレー剤
JP2008189645A (ja) 2007-02-01 2008-08-21 Saraya Kk 親水性ウイルスの不活化に有効な組成物
JP5158352B2 (ja) 2008-01-30 2013-03-06 ライオンハイジーン株式会社 抗ウイルス剤
WO2009098786A1 (ja) * 2008-02-08 2009-08-13 Mochigase Co., Ltd. 抗ウイルス材、環境型抗ウイルス材及び包装材料に収容した抗ウイルス材
CN102802448B (zh) * 2009-06-26 2014-03-05 株式会社川上 食品用杀菌剂

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001226210A (ja) * 2000-02-18 2001-08-21 Hozawa Hiroki 滅ウィルス剤およびその製造方法
WO2005013695A1 (ja) * 2003-08-12 2005-02-17 Mochigase Electrical Equipment Co., Ltd. 抗ウイルス剤、これを用いた繊維及び抗ウイルス部材
WO2009078447A1 (ja) * 2007-12-17 2009-06-25 Adept Co., Ltd. 抗ノロウイルス剤、抗インフルエンザウイルス剤、およびこれらを用いた抗ウイルス処理方法
WO2009084211A1 (ja) * 2007-12-27 2009-07-09 Johnsondiversey Co., Ltd. 殺菌消毒剤組成物およびこれを含有する殺菌消毒材、ならびにこれらを用いた殺菌消毒方法
WO2009104670A1 (ja) * 2008-02-19 2009-08-27 東京ナノ・バイオテクノロジー株式会社 抗菌抗ウイルス剤及びその使用方法
WO2010044194A1 (ja) * 2008-10-15 2010-04-22 株式会社イオンコマース アルカリ洗浄水
JP2011012000A (ja) * 2009-06-30 2011-01-20 Kyoto Sangyo Univ カキ殻由来の石灰を含有する抗鳥インフルエンザウイルス剤、哺乳類または鳥類のための畜産用資材、哺乳類または鳥類のための畜産用飼料、食品容器および衛生用品

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