JP5272023B2 - 薬学的組成物および脳血管疾患の治療用医薬の調製におけるその使用 - Google Patents

薬学的組成物および脳血管疾患の治療用医薬の調製におけるその使用 Download PDF

Info

Publication number
JP5272023B2
JP5272023B2 JP2010547939A JP2010547939A JP5272023B2 JP 5272023 B2 JP5272023 B2 JP 5272023B2 JP 2010547939 A JP2010547939 A JP 2010547939A JP 2010547939 A JP2010547939 A JP 2010547939A JP 5272023 B2 JP5272023 B2 JP 5272023B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
edaravone
brain
borneol
pharmaceutical composition
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2010547939A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2011513249A (ja
Inventor
殷暁進
楊士豹
李暁強
江征
和健
張安元
黄▲しん▼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Simcere Pharmaceutical R&D Co Ltd
Original Assignee
Jiangsu Simcere Pharmaceutical R&D Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu Simcere Pharmaceutical R&D Co Ltd filed Critical Jiangsu Simcere Pharmaceutical R&D Co Ltd
Publication of JP2011513249A publication Critical patent/JP2011513249A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5272023B2 publication Critical patent/JP5272023B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/415—1,2-Diazoles
    • A61K31/4152—1,2-Diazoles having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. antipyrine, phenylbutazone, sulfinpyrazone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D231/00—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings
    • C07D231/02—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings
    • C07D231/10—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D231/14—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D231/18—One oxygen or sulfur atom
    • C07D231/20—One oxygen atom attached in position 3 or 5
    • C07D231/22—One oxygen atom attached in position 3 or 5 with aryl radicals attached to ring nitrogen atoms

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

本出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、２００８年３月４日に出願された中国特許出願第２００８１００２０３８７．１号（表題「３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンを含む組成物」）の優先権を主張する。
技術分野
本発明は、薬学的組成物および脳血管疾患の治療用医薬の調製におけるその使用に関する。
背景技術
脳血管疾患（ＣＶＤ）は、ヒトの健康に非常に有害で、現在ヒトの障害および死亡率の重大な因子の１つになっている１つの疾患群である。
脳血管疾患とは、脳血管異常による脳障害である。脳卒中とは、一般的に急性脳血管疾患である。
脳血管疾患は、簡単に２つの種類、すなわち（１）血流の低下もしくは閉塞によって引き起こされる虚血性脳血管疾患、および（２）血管の破損によって引き起こされる出血性脳血管疾患に分類できる。虚血性脳血管疾患は、主に脳梗塞（脳血栓および脳塞栓症を包含する）として発現する。さらに、虚血性脳血管疾患の別の徴候は、一過性虚血性発作（通常、医師等によってＴＩＡと略記される）と呼ばれ、これは続発症がなく２４時間以内に完全に回復し得る。出血性脳血管疾患は、さらに２つの種類、すなわち（１）血管が破損し、血液が脳実質中に流入する、脳出血、および（２）血管が破損し、脳を取り巻くクモ膜下腔に血液が流入する、くも膜下出血（医師等によりＳＡＨと略記される）に分類できる。
３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンは、エダラボンとも呼ばれ、
Figure 0005272023
の構造式、分子式Ｃ１０Ｈ１０Ｎ２Ｏおよび分子量１７４．１９を有する。
３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンは、脳保護薬であり、フリーラジカルを除去し、脂質過酸化を抑制し、その結果、脳細胞、血管内皮細胞および神経細胞の酸化的損傷を抑制する。エダラボンを虚血／再灌流後のラットに静脈内投与すると、脳浮腫および脳梗塞の発症が抑制され、付随する神経学的症状が軽減され、遅発性神経死が抑制される。３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンは、成人に対する６０mg/日の臨床用量で、程度は不明であるが急性腎不全、肝機能障害、血小板減少症、汎発性血管内血栓症などのある有害な副作用を有することが判明している。
ボルネオールは、漢方で一般的に用いられ、蘇生を誘発する芳香性漢方薬として知られ、他の薬物を刺激して上級にする。ボルネオールは、一般的に、他の薬物の有効性を促進するためのプライミング剤として使用される。Augmented Materia Medica（Bencao Yanyi）では、ボルネオールは単独で用いられる場合は不十分であるが、その代わり、助剤として用いられる場合は有意であることが記載されている。
発明の概要
本発明の目的は、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンおよびボルネオールを含む薬学的組成物を提供することである。組み合わせられた薬学的組成物は、相乗効果を有し、脳血管疾患の治療に関する有効性が改善されている。
好ましくは、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンのボルネオールに対する重量比は、４：１〜１：４であり、さらに好ましくは２：１〜１：２である。
前記ボルネオールは、天然ボルネオールおよび合成ボルネオールを含み、好ましくは天然ボルネオールが使用される。中華人民共和国薬局方（Pharmacopeia of People's Republic of China)２００５年版で記載されている天然ボルネオール、すなわち、右旋性の竜脳（ＬｏｎｇＮａｏ）を用いることができる。
前記薬学的組成物は、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンとボルネオールとの混合を促進できる溶媒をさらに含んでもよい。溶媒は、水溶性有機溶媒または水溶性有機溶媒と水との混合物からなる群より選択することができる。一般的に使用される水溶性有機溶媒は、アルコール性溶媒、エーテル溶媒およびケトン溶媒を含むが、それらに限定されない。一般的に使用されるアルコール性溶媒は、エタノール、イソプロパノール、エチレングリコールおよびプロピレングリコールを含むが、それらに限定されない。一般的に使用されるエーテル溶媒は、エチレングリコールモノエチルエーテルおよびエチレングリコールモノブチルエーテルを含むが、それらに限定されない。一般的に使用されるケトン溶媒は、アセトンおよびＮ−メチル−２−ピロリドンを含むが、それらに限定されない。好ましくは、水溶性有機溶媒は、プロピレングリコールである。
本発明の別の目的は、脳血管疾患の治療用医薬の調製における前記薬学的組成物の使用を提供することである。
好ましくは、前記薬学的組成物は、虚血性脳血管疾患または脳梗塞の治療用医薬の調製において用いられる。
本明細書において提供される薬学的組成物は、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンおよびボルネオールを含み、脳血管疾患の治療において相乗効果を有し、その結果、著しく改善された有効性を有する。したがって、薬学的組成物は、低用量３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンを有し得、それでも有効であり、その結果、毒性が減少する。
発明の詳細な説明
本発明を以下の実施例を参照してさらに説明する。実施例において記載されるエダラボンは３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンである。記載される天然ボルネオールは、中華人民共和国薬局方（２００５年版）に記載されているもの、すなわち右旋性の竜脳である。
実施例１
２ｇのエダラボンを、２００ｇのプロピレングリコールの溶液に添加し、撹拌することによって完全に溶解させた。次いで、注射用水をゆっくりと添加し、混合物を溶解させて、１０００mLの容積にした。
実施例２
２ｇの合成ボルネオールを、２００ｇのプロピレングリコールの溶液に添加し、撹拌することによって完全に溶解させた。次いで、注射用水をゆっくりと添加し、混合物を溶解させて、１０００mLの容積にした。
実施例３
２ｇの天然ボルネオールを、２００ｇのプロピレングリコールの溶液に添加し、撹拌することによって完全に溶解させた。次いで、注射用水をゆっくりと添加し、混合物を溶解させて、１０００mLの容積にした。
実施例４
２ｇのエダラボンおよび１ｇの合成ボルネオールを、２００ｇのプロピレングリコールの溶液に添加し、撹拌することによって完全に溶解させた。次いで、注射用水をゆっくりと添加し、混合物を溶解させて、１０００mLの容積にした。
実施例５
２ｇのエダラボンおよび１ｇの天然ボルネオールを、２００ｇのプロピレングリコールの溶液に添加し、撹拌することによって完全に溶解させた。次いで、注射用水をゆっくりと添加し、混合物を溶解させて、１０００mLの容積にした。
実施例６
１ｇのエダラボンおよび２ｇの天然ボルネオールを、１００ｇのプロピレングリコールの溶液に添加し、撹拌することによって完全に溶解させた。次いで、注射用水をゆっくりと添加し、混合物を溶解させて、１０００mLの容積にした。
実施例７
４ｇのエダラボンおよび１ｇの天然ボルネオールを、４００ｇのプロピレングリコールの溶液に添加し、撹拌することによって完全に溶解させた。次いで、注射用水をゆっくりと添加し、混合物を溶解させて、１０００mLの容積にした。
実施例８
１ｇのエダラボンおよび１ｇの天然ボルネオールを、２００ｇのプロピレングリコールの溶液に添加し、撹拌することによって完全に溶解させた。次いで、注射用水をゆっくりと添加し、混合物を溶解させて、１０００mLの容積にした。
実施例９
１ｇのエダラボンおよび２ｇの天然ボルネオールを、２００ｇのプロピレングリコールの溶液に添加し、撹拌することによって完全に溶解させた。次いで、注射用水をゆっくりと添加し、混合物を溶解させて、１０００mLの容積にした。
実施例１０
２ｇのエダラボンおよび０．５ｇの天然ボルネオールを、２００ｇのプロピレングリコールの溶液に添加し、撹拌することによって完全に溶解させた。次いで、注射用水をゆっくりと添加し、混合物を溶解させて、１０００mLの容積にした。
実施例１１
４．５ｇのエダラボンおよび０．５ｇの天然ボルネオールを、４００ｇのプロピレングリコールの溶液に添加し、撹拌することによって完全に溶解させた。次いで、注射用水をゆっくりと添加し、混合物を溶解させて、１０００mLの容積にした。
実施例１２
２ｇのエダラボンおよび１ｇの天然ボルネオールを、１００ｇのプロピレングリコールの溶液に添加し、撹拌することによって完全に溶解させた。次いで、注射用水をゆっくりと添加し、混合物を溶解させて、１０００mLの容積にした。
実施例１３
８ｇのエダラボンおよび４ｇの天然ボルネオールを、５００ｇのプロピレングリコールの溶液に添加し、撹拌することによって完全に溶解させた。次いで、注射用水をゆっくりと添加し、混合物を溶解させて、１０００mLの容積にした。
実施例１４
２ｇのエダラボンを、１００ｇのプロピレングリコールの溶液に添加し、撹拌することによって完全に溶解させた。次いで、注射用水をゆっくりと添加し、混合物を溶解させて、１０００mLの容積にした。
実施例１５
８ｇのエダラボンを、４００ｇのプロピレングリコールの溶液に添加し、撹拌することによって完全に溶解させた。次いで、注射用水をゆっくりと添加し、混合物を溶解させて、１０００mLの容積にした。
実施例１６〜１９は、有効性を比較するための実施例である。
実施例１６
１ 材料および方法
１．１ 動物：体重２８０〜３２０ｇの健常な雄性Ｗｉｓｔａｒラット。
１．２ 薬物および試薬：実施例１の注射用エダラボン（２mg/mL）、実施例３の天然ボルネオール注射（２mg/mL）および実施例５のエダラボン＋天然ボルネオール注射。
１．３ 方法
１．３．１ 限局性脳虚血再灌流モデルの調製
主な工程は以下に記載するとおりである。１０％の抱水クロラール（３５０mg/kg）を腹腔内注射して、ラットを麻酔した。右外頸動脈を分離し、結紮し、切断した。末端が太くなったナイロン糸をゆっくりと右外頸動脈の残留末端中に深さ約１８mmまで挿入し、総頸動脈および内頸動脈を通って、中大脳動脈の入口を塞ぐことによって虚血を誘発した。２時間の虚血後、２４時間再灌流するためにナイロン糸を除去した。擬似群の動物は、動脈を分離するためだけにナイロン糸を使用する以外は、モデル群と同様に処置した。動物の蘇生後のホーマー症状の発現および反対側の側体運動障害は、モデル化が成功したことを意味する。
１．３．２ 動物のグループ分けおよび投与
実験動物を、擬似群、対照群および薬物群を含む５つの群にランダムに分けた。薬物群の動物には、虚血３０分前および再灌流１２時間後の２回、薬物を腹腔内注射した。擬似群および対照群の動物には、そのかわりにそれぞれ等体積の生理食塩水を注射した。
１．３．３ 神経学的欠損採点、脳梗塞の大きさおよび脳水分量の測定
神経学的欠損採点：挙動評価は、Ｌｏｎｇａの５ポイント採点システムにしたがって再灌流の２４時間後に行った。
脳梗塞の大きさの測定：最終神経学的欠損採点後に、動物の首を切り脳を採取した。嗅脳、下部脳幹および小脳を除去し、残りの脳を直ちに秤量して、湿潤重量を得た。脳を氷上で冠状に切断して、実質的に同じ厚さの５枚の切片を得、次いで２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド中、３０分間３７℃でインキュベートした。正常脳組織はバラ色に見えたが、梗塞部分は白色に見えた。次に、脳切片を１０％ホルムアルデヒド中で固定し、白色組織を慎重に除去し、秤量した。全脳重量中の梗塞組織重量のパーセンテージによって梗塞の大きさを決定した。
脳水分量の測定：脳水分量を乾式および湿式法によって測定した。動物を屠殺して、全脳を採取した。嗅脳、下部脳幹および小脳を除去し、残りの脳の湿潤重量を直ちに測定した。約１８時間、オーブン中、１２０℃で乾燥させた後、乾燥重量を得た。脳水分量を次の式にしたがって計算した：脳水分量（％）＝（脳湿潤重量−脳乾燥重量）／脳湿潤重量×１００。
２ 結果
２．１ 虚血／再灌流後の脳梗塞の大きさおよび神経学的欠損採点に対する影響
虚血灌流後の梗塞の大きさは、対照群と比較して、全ての薬物群のラットで有意に減少した（Ｐ＜０．０１）。エダラボン単独もボルネオール単独もどちらもラットにおいて神経学的欠損の症状に対して有意な影響を及ぼさなかった。しかし、エダラボンと天然ボルネオールとの組み合わせは、神経学的欠損の症状を有意に改善し、このことは、この２つの薬物が相乗効果を有することを意味する。結果を表１に示した。
Figure 0005272023
２．２ 虚血／再灌流後の脳水分量に対する影響
虚血／再灌流によって誘発される脳浮腫は、全ての薬物群のラットにおいて有意に軽減された。エダラボン単独も、天然ボルネオール単独もどちらも、対照群と比較して脳水分量に対して有意な影響を及ぼした（Ｐ＜０．０５）。エダラボンと天然ボルネオールとの組み合わせは、対照群と比較して脳水分量に対して非常に有意な影響を及ぼし（Ｐ＜０．０１）、このことは、２つの薬物が相乗効果を有することを意味する。結果を表２に示した。
Figure 0005272023
実施例１７
１ 材料および方法
１．１ 動物：体重２８０〜３２０ｇの健常な雄性Ｗｉｓｔａｒラット。
１．２ 薬物および試薬：実施例５、８および９の注射用のエダラボン＋天然ボルネオール。
１．３ 方法
１．３．１ 限局性脳虚血／再灌流モデルの調製
中脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）、脳虚血／再灌流モデルを、内頸動脈スレッド法を用いて調製した。動物を１０％抱水クロラール（３．５mL/kg）で麻酔し、次いで手術台上に腹臥位で固定した。皮膚を消毒し、頸部を正中線から切開した。右総頸動脈、外頸動脈および内頸動脈を分離し、迷走神経を注意深く分離した。外頸動脈を結紮し、切断した。内頸動脈に沿って前方に移動し、次いで翼口蓋動脈を結紮した。総頸動脈の隣接部分をクランプで固定し、外頸動脈結紮部の遠位端で切断した。外径０．２８５mmのナイロン糸を切断部に挿入し、総頸動脈の分岐を通り、次いで若干抵抗を受けるまで（分岐点から約２０mmの距離）内頸動脈中にゆっくりと挿入した。中脳動脈中の血液供給はこれによって完全に阻止された。レーザードップラー脳流量測定法を用いて脳血流をモニタリングした。右脳において２．０時間虚血後、ナイロン糸をゆっくりと抜き取り、次いで再灌流するために血液供給を回復した。頭皮を縫合し、消毒した。擬似群では、ナイロン糸を挿入せずに、血管のみを分離した。手術中、ラット加熱プレートおよび６０Ｗの電気スタンドを用いて、ラットの体温を３７．０±０．５℃に保った。
１．３．２ 動物のグループ分けおよび投与
実験動物を、擬似群、モデル群、陽性対照群および薬物群（エダラボン＋天然ボルネオールの合計用量は０．７５mg/kgであった）を含む６つの群にランダムに分けた。脳虚血を実験動物においてモデル化した後、全動物を同じ確率で単純盲検的にグループに分けた。各薬物を脳虚血後ただちに１回投与し、次いで連続して２時間後、４時間後、および２４時間後に投与した。４回の投与は各動物に対して全体的に行った。モデル群のラットには、尾静脈から等容積の生理食塩水を注射した。擬似群のラットには、尾静脈から等容積の生理食塩水を注射した。陽性対照群のラットには、ニモジピン注射を投与した。陽性対照群における用量は、３回の投与については各動物につき１．２mg/kgであり、１回の投与は各動物につき０．４mg/kgであった。
１．３．３ 神経学的欠損採点および脳梗塞の大きさの測定
神経学的欠損採点：神経学的欠損症状は、修飾Ｂｅｄｅｒｓｏｎ５ポイント採点システムにしたがって評価した。ラットにおける脳外傷後の神経学的欠損症状を、単純盲検法を用いることによって評価した。すなわち、実験設計者は動物をグループに分け、神経学的欠損症状を採点する実験実施者は、動物のグループ分けについては知らされなかった。評価が完了した後、採点者は分類された動物の採点結果を設計者に提示した。設計者は実験を開示し、それぞれの群の各動物の採点を得た。
神経学的欠損採点：Ｂｅｎｄｅｒｓｏｎ５ポイント採点システムの詳細な基準は次の通りである：
０：動物の尾をつかんでぶら下げた状態にした場合、動物の両前脚が床に向かって伸び、他の挙動欠陥は観察されない。
１：動物は損傷を受けた側と反対（左）の前脚で、手および肘関節屈曲、肩内転、肘外転および胸壁への密着を示す。
２：動物を平滑な板上に置き、損傷を受けた側の肩を反対側へ押した場合、抵抗が弱い。
３：自由に歩き回る場合、動物は損傷を受けた側と反対に円運動をする。
４：動物の四肢が弛緩し、麻痺し、活発に四肢を動かせない。
脳梗塞面積および脳病変の測定：動物を１０％抱水クロラールで麻酔し、首を切断して脳を採取した。嗅脳、小脳および下部脳幹を除去した後、脳表面上の血液を生理食塩水で洗浄し、表面上に残った水を拭き取った。−８０℃で７分間おいた後、脳を取り出し、直ちに視束交差から垂直かつ下方向に冠状に切断し、それによって、後方へ２mmごとに切片に切り出した。脳切片を、０．２モル／ＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４〜７．８）中に新たに配合した２０ｇ／ＬのＴＴＣ染色溶液（３７℃、９０分）中に浸漬した。正常脳組織は深紅色に染まったが、虚血脳組織は白色に見えた。生理食塩水ですすいだ後、脳切片を連続して素早く一列に並べた。表面上に残る水を拭き取り、切片を写真撮影した。左および右脳組織を分離し、それぞれＷｌｅｆｔ（左脳の重量）およびＷｒｉｇｈｔ（右脳の重量）として秤量した。１５mLの新たに配合した抽出溶液（ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）：エタノール＝１：１）を左および右脳組織にそれぞれ添加した。組織を２５℃、暗所で２４時間抽出した。生成した赤色物質であるホルマザンを脳切片が白色になるまで十分に抽出した。
（１）画像分析ソフトウェアを用いて写真の分析を行った。右側虚血面積（白色）および右側全面積をマークし、梗塞面積のパーセンテージを次式によって計算した：
Figure 0005272023
（２）各抽出物（抽出物１００μL＋抽出溶液１９００μL）の吸光度を４８５nmで測定し、４回の独立した測定を平均し、ＡleftとＡrightとした。脳病変のパーセンテージを次式によって計算した：
Figure 0005272023
１．３．４ 統計分析
定量データを平均±ＳＤで表した。脳梗塞面積および神経学的欠損採点を一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）によって評価した。２群間の差の有意性を、Ｓｃｈｅｆｆｅ試験によって決定した。動物の死亡率をグループ間でＸ２試験によって比較した。Ｐ＜０．０５を有意な差として定義した。
２ 結果
２．１ 神経学的欠損症状に対する影響
神経学的欠損症状の採点を表３に示した。モデル群と比較して、様々な割合のエダラボンおよび天然ボルネオールの配合物ならびにニモジピンは、神経学的欠損症状を有意に改善した（Ｆ４．３５＝１４．５９、Ｐ＝０．０００）。エダラボンおよび天然ボルネオールの組み合わせは、神経学的欠損症状を有意に改善できることが示された。
Figure 0005272023
２．２ 脳梗塞面積に対する影響
様々な群における脳梗塞面積を表４に示した。モデル群と比較して、エダラボンおよび天然ボルネオール（２：１および１：１の割合）、ならびにニモジピンによる処置は、脳梗塞面積を有意に減少させた（Ｆ４．３５＝５．３８、Ｐ＝０．００２）。モデル群と比較して、エダラボンおよび天然ボルネオール（１：２の割合）による処置は、脳梗塞面積を減少させる傾向を有していた（Ｆ４．３５＝５．３８、Ｐ＝０．３５８）。
Figure 0005272023
２．３ 脳病変に対する影響
様々な群における脳病変を表５に示した。モデル群と比較して、エダラボンおよび天然ボルネオール（２：１および１：１の割合）による処置、ならびにニモジピンによる処置は、脳病変の重篤度を有意に減少させた（Ｆ４．３５＝５．３６、Ｐ＝０．００２）。モデル群と比較して、エダラボンおよび天然ボルネオール（１：２の割合）による処置は、脳病変の重篤度を減少させる傾向を有していた（Ｆ４．３５＝５．３６、Ｐ＝０．２３９）。
Figure 0005272023
実施例１８
１ 材料および方法
１．１ 動物：体重２８０〜３２０ｇの健常な雄性Ｗｉｓｔａｒラット。
１．２ 薬物および試薬：実施例１の注射用エダラボン（２mg/mL）、および実施例５、７および１１の注射用エダラボン＋天然ボルネオール。
１．３ 方法
実験法および評価法は実施例１３と同じである。
２ 結果
２．１ 神経学的欠損症状に対する影響
神経学的欠損症状の採点を表６に示した。モデル群と比較して、様々な割合のエダラボンおよび天然ボルネオールによる処置、ならびにニモジピンによる処置は、神経学的欠損症状を有意に改善した（Ｆ４．３５＝１０．３１、Ｐ＝０．０００）。エダラボンおよび天然ボルネオールの組み合わせは、神経学的欠損症状を有意に改善することが示された。
Figure 0005272023
２．２ 脳梗塞面積に対する影響
様々な群における脳梗塞面積を表７に示した。モデル群と比較して、エダラボンおよび天然ボルネオール（２：１の割合）による処置、ならびにエダラボン３mg/kgによる処置は、脳梗塞面積を有意に減少させた（Ｆ４．３５＝４．６２、Ｐ＝０．０３）。モデル群と比較して、エダラボンおよび天然ボルネオール（４：１および９．１の割合）による処置は、脳梗塞面積を減少させる傾向を有していた（Ｆ４．３５＝４．６２、Ｐ＝０．０８１）。
Figure 0005272023
２．３ 脳病変に対する影響
様々な群における脳病変を表８に示した。モデル群と比較して、エダラボンおよび天然ボルネオール（２：１の割合）による処置、ならびにエダラボン３mg/kgによる処置は、脳病変の重篤度を有意に減少させた（Ｆ４．３５＝５．７８、Ｐ＝０．０４）。モデル群と比較して、エダラボンおよび天然ボルネオール（４：１および９．１の割合）による処置は、脳病変の重篤度を減少させる傾向を有していた（Ｆ４．３５＝５．７８、Ｐ＝０．１５９）。
Figure 0005272023
実施例１９
１ 材料および方法
１．１ 動物：３６匹のＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄウサギ、一般的等級、体重２．０〜３．０kg、それぞれ♀１８匹および♂１８匹（メスおよびオス）。
１．２ 薬物および試薬：実施例１２、１３、１４および１５から得られる薬物；１，２−プロピレングリコール、０．９％塩化ナトリウム注射。
１．３ 用量およびグループ分け
溶媒 ０．９％塩化ナトリウム注射（重量基準） １０mL/kg
ビヒクル ４０％プロピレングリコール溶液（容積基準） １０mL/kg
エダラボン ８０mg/kg（プロピレングリコール含量：４０％）
エダラボン ２０mg/kg（プロピレングリコール含量：１０％）
併用エダラボン １２０mg/kg（プロピレングリコール含量：５０％）
併用エダラボン ３０mg/kg（プロピレングリコール含量：１０％）
この実施例における併用エダラボンとは、エダラボン＋天然ボルネオール（重量比＝２：１）を意味する。
前記用量群において、ウサギ１匹につき１日あたりの投与量を、各ウサギの実際の体重にしたがって計算した。試験薬物を、各ウサギの体重にしたがって等容積で投与した。
２ 方法
３６匹のウサギに番号を付け、体重によって、４つの用量群、「エダラボン＋天然ボルネオール（重量比＝２：１）」１２０mg/kg、３０mg/kg；「エダラボン」８０mg/kg、２０mg/kg；ならびにビヒクル群（４０％プロピレングリコール溶液）および溶媒群（０．９％塩化ナトリウム注射）を含む６群にランダムに分けた。各群には、それぞれ３匹のオスおよび３匹のメスを含む６匹のウサギが含まれていた。ウサギを試験前３日間慣らし、観察した。試験の間、ウサギに、辺縁耳静脈注射によって毎朝同じ時間に１回投与した。高用量群のウサギには１３日間連続して投薬し、低用量群、溶媒群およびビヒクル群には、２０日間投与した。用量を体重の変動にしたがって調整した。動物の応答、注射部位での刺激ならびに腎臓および注射部位における組織病理学検査を用いて、併用エダラボンまたはエダラボンのいずれかのウサギに対する毒性を包括的に評価した。
３ 結果
血尿：連続静脈内投与の間、エダラボン８０mg/kgもしくは２０mg/kg、併用エダラボン１２０mg/kgもしくは３０mg/kg、または４０％プロピレングリコール溶液１０mL/kgで処置した群において、投与後３０分〜２時間で一時的血尿が起こった。血尿の発生率は、エダラボン８０mg/kg群では１００％、エダラボン２０mg/kg群では１００％、併用エダラボン１２０mg/kg群では１００％、併用エダラボン３０mg/kg群では５０％、４０％プロピレングリコール溶液１０mL/kg群では１００％であった。しかし、０．９％塩化ナトリウム注射群では血尿は起こらなかった。
肉眼剖検および組織病理学検査：１）肉眼剖検：エダラボン８０mg/kg群では、６匹のウサギのうち３匹がカーキ色で、表面が平らでない肥大した腎臓を有し、１匹のウサギは肝壊死になり、カーキ色で堅い肝臓を有していた。エダラボン２０mg/kg群において、６匹のウサギのうち３匹は、肥大した腎臓を有していた。併用エダラボン１２０mg/kg群では、６匹のウサギのうち２匹は、淡色の肥大した腎臓を有していた。併用エダラボン３０mg/kg群および４０％プロピレングリコール溶液１０mL/kg群では腎臓の明らかな変化は観察されなかった。２）組織病理学検査：エダラボン８０mg/kgおよび２０mg/kg群ならびに併用エダラボン１２０mg/kgおよび３０mg/kg群では、刺激性変化、たとえば様々な程度の血管閉塞が注射部位で観察された。前記群では、ウサギの腎臓障害も観察され、その主な兆候は、進行性腎臓障害、たとえば尿細管障害、間充組織の炎症性浸潤、および糸球体障害であった。４０％プロピレングリコール溶液１０mL/kg群では、刺激性変化、例えば血管閉塞も注射部位で観察されるが、その腎臓からは軽度の尿細管肥大および空胞変性しか観察されなかった。
前記実験結果から、前記投与条件では、次のように結論づけられた。１：エダラボンおよび併用エダラボンはウサギの注射部位に対して実質的に同様の影響を示す。２：エダラボンは併用エダラボンよりもウサギにおいて高い発生率で血尿を誘発する。３：エダラボンは併用エダラボンよりもウサギの腎臓に対して高い毒性を有する。
本発明のいくつかの好適な実施形態のみを前述のように記載する。本発明の本質を逸することなく、当業者がさらなる改善および／または修飾を行うことができ、それらは本発明においてさらにクレームされることに注意すべきである。

Claims (10)

  1. 有効成分として、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンおよびボルネオールを含む薬学的組成物。
  2. ３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンのボルネオールに対する重量比が４：１〜１：４であることを特徴とする、請求項１記載の薬学的組成物。
  3. ３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンのボルネオールに対する重量比が２：１〜１：２であることを特徴とする、請求項２記載の薬学的組成物。
  4. ボルネオールが天然ボルネオールであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の薬学的組成物。
  5. 組成物が溶媒をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の薬学的組成物。
  6. 溶媒が、水溶性有機溶媒、または水溶性有機溶媒と水との混合物であることを特徴とする、請求項５記載の薬学的組成物。
  7. 水溶性有機溶媒がプロピレングリコールであることを特徴とする、請求項６記載の薬学的組成物。
  8. 脳血管疾患の治療用医薬の調製における、請求項１〜７のいずれか１項記載の薬学的組成物の使用。
  9. 脳血管疾患が虚血性脳血管疾患であることを特徴とする、請求項８記載の使用。
  10. 脳血管疾患が脳梗塞であることを特徴とする、請求項８記載の使用。
JP2010547939A 2008-03-04 2009-03-03 薬学的組成物および脳血管疾患の治療用医薬の調製におけるその使用 Active JP5272023B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN200810020387.1 2008-03-04
CN200810020387A CN101524352A (zh) 2008-03-04 2008-03-04 一种含有3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮的组合物
PCT/CN2009/070612 WO2009109132A1 (zh) 2008-03-04 2009-03-03 一种药物组合物及其在制备治疗脑血管病药物中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2011513249A JP2011513249A (ja) 2011-04-28
JP5272023B2 true JP5272023B2 (ja) 2013-08-28

Family

ID=41055553

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2010547939A Active JP5272023B2 (ja) 2008-03-04 2009-03-03 薬学的組成物および脳血管疾患の治療用医薬の調製におけるその使用

Country Status (9)

Country Link
US (1) US8658684B2 (ja)
EP (1) EP2255804B1 (ja)
JP (1) JP5272023B2 (ja)
CN (3) CN101524352A (ja)
AU (1) AU2009221546B2 (ja)
CA (1) CA2716874C (ja)
ES (1) ES2398794T3 (ja)
HK (1) HK1150390A1 (ja)
WO (1) WO2009109132A1 (ja)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101732247B (zh) * 2010-01-06 2012-04-25 长沙易睿医药科技有限公司 一种含有依达拉奉的注射液
CN102579432B (zh) * 2011-01-12 2016-05-11 江苏先声药物研究有限公司 3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮与2-莰醇组合物的应用
CN102648908B (zh) * 2011-02-26 2015-05-20 江苏先声药物研究有限公司 3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮与龙脑组合物的应用
CN102180832B (zh) * 2011-03-18 2012-09-12 苏州沪云肿瘤研究中心有限公司 脑缺血保护用化合物及制备方法
CN102920697B (zh) * 2011-08-12 2015-08-19 江苏先声药物研究有限公司 3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮与2-莰醇组合物的新用途
CN103070861B (zh) * 2011-10-25 2014-12-17 江苏先声药物研究有限公司 一种药物组合物及其在制备治疗脑血管病药物中的应用
CN102526035B (zh) * 2011-12-08 2015-09-30 南京优科生物医药研究有限公司 一种用于制备抗脑血管疾病药物的组合物
CA2985219C (en) * 2015-06-10 2020-04-28 Jiangsu Simcere Pharmaceutical Co., Ltd Use of composition for preparing a medicament for treatment of amyotrophic lateral sclerosis
CN106727287B (zh) * 2015-11-23 2020-01-24 江苏先声药业有限公司 依达拉奉和天然冰片的高浓度注射液
CN111840218B (zh) * 2016-03-16 2022-07-12 苏州澳宗生物科技有限公司 依达拉奉剂型
US10494933B2 (en) * 2016-03-18 2019-12-03 General Electric Company Airfoil with multi-material reinforcement
CN107773545A (zh) * 2016-08-29 2018-03-09 烟台益诺依生物医药科技有限公司 依达拉奉与(+)‑2‑莰醇的舌下用药物组合物
CN106580966A (zh) * 2017-01-16 2017-04-26 江苏先声药业有限公司 一种组合物在制备治疗脑震荡的药物中的应用
CN108314652A (zh) * 2017-01-18 2018-07-24 周意 依达拉奉衍生物及其用途
RU2693627C2 (ru) * 2017-11-03 2019-07-03 Общество С Ограниченной Ответственностью "Валента - Интеллект" Комбинации эдаравона для лечения ишемических повреждений мозга
CN111346090A (zh) * 2018-12-22 2020-06-30 江苏先声药业有限公司 一种药物组合物
CN112206229A (zh) * 2019-07-11 2021-01-12 烟台益诺依生物医药科技有限公司 一种组合物在制备治疗脂肪肝、肝炎和肝纤维化中的应用
WO2022007833A1 (zh) * 2020-07-08 2022-01-13 先声药业有限公司 一种组合物在治疗脑卒中的用途
WO2022007831A1 (zh) * 2020-07-08 2022-01-13 先声药业有限公司 一种组合物的医药用途
US20240033247A1 (en) * 2020-07-08 2024-02-01 Simcere Pharmaceutical Co., Ltd. Use of composition in treatment of cerebral stroke
EP4431093A1 (en) 2021-11-08 2024-09-18 Neurodawn Pharmaceutical Co., Ltd. Application of composition containing edaravone and dexborneol in improving or treating cognitive impairment
CN117815238A (zh) * 2022-09-29 2024-04-05 中山大学孙逸仙纪念医院 一种治疗银屑病的外用制剂及其制备方法

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK169672B1 (da) 1985-05-20 1995-01-09 Mitsubishi Chem Ind Farmaceutiske præparater indeholdende pyrazolonderivater som aktiv bestanddel og anvendelsen af pyrazolonderivater til fremstilling af farmaceutiske præparater
JPH0725765A (ja) 1993-07-07 1995-01-27 Mitsubishi Chem Corp 眼疾患用薬剤
WO2002034264A1 (fr) 2000-10-24 2002-05-02 Mitsubishi Pharma Corporation Medicaments pour traiter la sclerose laterale amyotrophique (sla)
US7211596B2 (en) * 2001-05-11 2007-05-01 Mitsubishi Pharma Corporation Stable high-concentration injection containing pyrazolone derivative
JP2003081830A (ja) 2001-09-12 2003-03-19 Mitsubishi-Tokyo Pharmaceuticals Inc 酸化ストレス抑制剤
US8183206B2 (en) 2001-09-14 2012-05-22 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Drugs comprising combination of antithrombotic agent with pyrazolone derivative
JP2004123716A (ja) 2002-08-06 2004-04-22 Mitsubishi Pharma Corp 化学物質に起因する肝障害の予防及び／又は治療のための医薬
JP2005029573A (ja) 2003-06-18 2005-02-03 Mitsubishi Pharma Corp 腫瘍転移抑制剤
CN100339085C (zh) * 2003-09-23 2007-09-26 天津天士力制药股份有限公司 治疗心脑血管疾病的中药组合物
US7977366B2 (en) 2003-10-14 2011-07-12 Cornell Research Foundation, Inc. Treating an inflammatory disorder or inhibiting respiratory burst in adherent neutrophils with chemical inhibitors of neutrophil activation
EP1685837A4 (en) 2003-11-12 2009-03-25 Lead Chem Co Ltd BRAIN PROTECTIVE AGENT OF THE TYPE ADMINISTERED BY PERCUTANEOUS ABSORPTION
KR20060130649A (ko) 2004-02-09 2006-12-19 미츠비시 웰파마 가부시키가이샤 근위축성 측색경화증(ａｌｓ) 또는 ａｌｓ에 기인하는질환의 신규 치료제
CN100450501C (zh) * 2004-03-17 2009-01-14 天津天士力制药股份有限公司 一种治疗心脑血管疾病的中药制剂及其制备方法
KR101255578B1 (ko) 2004-08-10 2013-04-17 미쓰비시 타나베 파마 코퍼레이션 뇌경색에 연관된 뇌혈관 장애를 치료하는데 유용한피라졸론 화합물
JP4746856B2 (ja) 2004-08-12 2011-08-10 三笠製薬株式会社 ピラゾロン系製剤
CN100391489C (zh) 2005-12-26 2008-06-04 深圳市生物谷科技有限公司 含有冰片的药物组合物
CN100400037C (zh) 2006-01-26 2008-07-09 深圳市生物谷科技有限公司 含有冰片、麝香的药物组合物
JP2008001607A (ja) 2006-06-20 2008-01-10 Mitsubishi Pharma Corp ピラゾロン化合物を含有する水溶液剤
JP2008001605A (ja) 2006-06-20 2008-01-10 Mitsubishi Pharma Corp ピラゾロン化合物を含有する水溶液剤
JP2008001606A (ja) 2006-06-20 2008-01-10 Mitsubishi Pharma Corp ピラゾロン化合物を含有する水溶液剤
CN101239053A (zh) 2007-02-06 2008-08-13 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 1,7,7-三甲基二环[2.2.1]庚烷(莰烷、菠烷,樟烷)类似物及其衍生物在治疗氧化损伤神经性疾病中的新用途
JP2009143902A (ja) 2007-11-21 2009-07-02 Kowa Co エダラボンを含有する安定な水溶性製剤
US8784852B2 (en) 2009-02-27 2014-07-22 Audrey Kunin Topical skin care composition

Also Published As

Publication number Publication date
EP2255804A1 (en) 2010-12-01
CN101524352A (zh) 2009-09-09
WO2009109132A1 (zh) 2009-09-11
US20110003873A1 (en) 2011-01-06
CN101848711B (zh) 2012-04-18
CA2716874A1 (en) 2009-09-11
US8658684B2 (en) 2014-02-25
AU2009221546A1 (en) 2009-09-11
CN101848711A (zh) 2010-09-29
ES2398794T3 (es) 2013-03-21
EP2255804A4 (en) 2011-08-03
EP2255804B1 (en) 2013-01-02
HK1150390A1 (en) 2011-12-23
JP2011513249A (ja) 2011-04-28
AU2009221546B2 (en) 2012-07-05
CN102614171A (zh) 2012-08-01
CA2716874C (en) 2012-12-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5272023B2 (ja) 薬学的組成物および脳血管疾患の治療用医薬の調製におけるその使用
KR101478728B1 (ko) 안과 및 수의 안과에서 사용하기 위한 약학적 조성물
US11904024B2 (en) Eye drop composition
ES2541141T3 (es) Composición farmacéutica para el tratamiento de las enfermedades del hígado graso
ES2274075T3 (es) Utilizacion de inhibidores de c-kit para tratar enfermedades inflamatorias intestinales (eii).
JP5558348B2 (ja) シロスタゾールを含むカルボスチリル誘導体の脂肪肝治療剤
JP6889493B2 (ja) 脳卒中からの回復のための方法および組成物
CN105267212A (zh) 依达拉奉与（-）-2-莰醇组合物的新应用
TWI828155B (zh) 吡咯并嘧啶類化合物的用途
Oroszi et al. Microcirculatory effects of sildenafil in experimental testicular torsion in rats
CN105592849A (zh) 用于减轻神经系统损伤的组合物及该组合物的制造方法和用途
US20050196478A1 (en) Methods using Lycium barbarum extracts as neuroprotective agents for retinal ganglion cells degeneration
JP2002275061A (ja) 抗うつ・抗不安剤
BR112021004661A2 (pt) composto, composição farmacêutica, método para tratamento de dor neuropática e/ou prurido, e, uso do composto
Sutton et al. Nervous disorders in dogs associated with levamisole therapy
JPH0987174A (ja) 鎮痛性および抗炎症性組成物
Ali et al. THE POTENTIAL RENOPROTECTIVE EFFECT OF TILIANIN IN RENAL ISCHEMIA REPERFUSION INJURY IN MALE RAT MODEL
Kaur et al. Toxicities and toxicodynamic of anesthetics
JP2007084514A (ja) 炎症性腸疾患用グリチルリチン製剤
NZ625518B2 (en) Eye drop composition

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20121030

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20130129

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20130205

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20130227

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20130423

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20130513

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 5272023

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

S111 Request for change of ownership or part of ownership

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250