BR112021004661A2 - composto, composição farmacêutica, método para tratamento de dor neuropática e/ou prurido, e, uso do composto - Google Patents

Abstract

A presente invenção se refere a 2-(3-(3-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)fenil)-3H-imidazo[4,5-b]piridin-6-il)propan-2-ol, que é útil como um modulador do receptor GABA. Em uma modalidade, o dito composto é útil no tratamento de dor, dor neuropática e/ou prurido.

Description

1 / 36 COMPOSTO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO PARA TRATAMENTO DE DOR NEUROPÁTICA E/OU PRURIDO, E, USO DO

COMPOSTO Campo técnico

[001] A presente invenção refere-se a 2-(3-(3-(2,4- dimetoxipirimidin-5-il)fenil)-3H-imidazo[4,5-b]piridin-6-il)propan-2-ol, que é útil como um modulador do receptor GABA. Em uma modalidade, o dito composto é útil no tratamento da dor, dor neuropática e/ou prurido. Fundamentos

[002] O GABA é o principal neurotransmissor inibitório no SNC, incluindo lamina-II do corno dorsal da medula espinhal, onde as fibras nociceptivas terminam. A neurotransmissão inibitória na medula espinhal é de grande importância na transmissão da dor e a melhora na inibição leva à analgesia (Zeilhofer HU. et. al. (2009), Trends in pharmacological science).

[003] Foi verificado que os moduladores dos receptores GABAA medeiam analgesia profunda em modelos animais de dor neuropática (Munro, G. et. al. (2013) European Journal of Pharmacology, 716, 1-3, 17-23). As terapias atuais para o controle da dor neuropática são de benefício limitado para muitos pacientes, e envolvem efeitos colaterais indesejados ou toxicidades limitadas pela dose. Além do mais, as terapias atuais são sintomáticas, não modificando a doença. Ainda há a necessidade de terapias melhoradas para o controle e tratamento de dor neuropática, especialmente aquelas capazes de modificar a doença.

[004] Além do mais, foi demonstrado anteriormente que os ligantes do receptor GABAA podem ser úteis no tratamento de prurido (ver, por exemplo, WO 2017/129801).

[005] Os receptores GABAA são canais controlados por ligante que existem em múltiplas isoformas. Cada receptor é um complexo pentamérico compreendendo subunidades retiradas de isoformas de subunidade α1-6, β1-3,

2 / 36 γ1-3, δ, ε e θ. A maioria dos receptores GABAA presentes no SNC contém duas unidades α, duas β, e uma γ (Mckernan RM. et. al. (1996). Trends in Neuroscience 19, 139-43). Os efeitos farmacológicos de ativar um receptor GABAA dependem principalmente de quais tipos de subunidades o receptor contém. As benzodiazepinas ansiolíticas clássicas não apresentam seletividade para o subtipo. Foi sugerido que um dos elementos principais das desvantagens das benzodiazepinas clássicas (como sedação, dependência e comprometimento cognitivo) se refere à subunidade α1 do receptor GABAA. Estudos recentes usando camundongos com mutações pontuais que tornam as diferentes subunidades α insensíveis ao diazepam, sugerem que as subunidades α2 e α3 medeiam os efeitos analgésicos das benzodiazepinas (Knabl J. et. al. (2009). Dor 141, 233-38). Isto é suportado por estudos farmacológicos que mostram efeitos analgésicos dos moduladores positivos seletivos de receptores GABAA contendo α2/3 em modelos pré-clínicos de dor (Munro G. et. al (2008). JPET, 327, 969-81). Assim, espera-se que os compostos com seletividade para as subunidades α2 e/ou α3 sobre a subunidade α1 tenham um perfil de efeito colateral melhorado.

[006] Adicionalmente, a falta de inibição mediada por interneurônio GABAérgico na medula espinhal mostrou ser responsável pelo prurido crônico em camundongos mutantes Bhlhb5 (Ross SE. et. al. (2010). Neuron 65, 886-98) sugerindo potencial atividade terapêutica por meio da melhora da inibição espinhal.

[007] Os documentos WO 98/34923, EP 0616807, WO 2004/087690, WO 2007/110374 e WO 2010/055132 descrevem derivados de benzimidazol úteis no tratamento de doenças e transtornos do sistema nervoso central, que são responsivos à modulação do complexo do receptor GABAA.

[008] Os documentos WO 03/086406, WO 03/087099, WO 03/099816 e WO 01/18000 descrevem derivados de imidazo-piridina úteis como ligantes para receptores GABA.

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[009] Os documentos WO 2000/044752 e WO 99/67245 descrevem derivados de triazolo-piridazina úteis como ligantes para receptores GABA.

[0010] Estes moduladores do receptor GABA apresentados anteriormente indicam que pequenas diferenças estruturais podem ter um grande impacto na atividade biológica.

[0011] No entanto, muitos destes moduladores de receptores GABA apresentados anteriormente estão associados a efeitos indesejados. Portanto, há uma grande necessidade de compostos com um perfil farmacológico aprimorado e sem os efeitos colaterais indesejados. Sumário

[0012] Em um aspecto principal, a presente invenção se refere a 2-(3- (3-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)fenil)-3H-imidazo[4,5-b]piridin-6-il)propan-2- ol, representado na fórmula 1 (composto 1).

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[0013] Ademais, a presente invenção se refere ao uso do composto 1 como um medicamento. Os presentes inventores identificaram que o composto 1 é um receptor α3 de GABAA inovador que prefere modulador alostérico positivo. Assim, em um aspecto, o composto 1 é usado no tratamento, prevenção e/ou alívio de dor neuropática. Em um outro aspecto, o composto 1 é usado no tratamento, prevenção e/ou alívio de prurido. Descrição dos Desenhos

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[0014] Figura 1. (A) Composto 1, (B) Composto 9. Perfil de eficácia de receptores GABAA em registros de fixação de tensão de dois eletrodos de oócito. Para cada conjunto experimental de dados, GABA foi dissolvido em uma solução de ringer de oócito em uma concentração (0,5 a 3 µM) dando origem a correntes desencadeadas EC10-20 para uma dada combinação de subtipo de receptor GABAA. As correntes de pico foram lidas e normalizadas para uma concentração máxima eficaz de diazepam, após o que os pontos de dados foram ajustados à equação de Hill empírica por regressão não linear, n=3-14. Composto 1 apresenta uma potenciação preferencial de correntes mediadas por GABA em receptores contendo GABAA-α3, uma pequena ativação (menor que 10%) de subunidades de GABAA-α2/5 e nenhuma ativação de receptores contendo GABAA-α1.

[0015] Figura 2. Efeitos do composto 1 após dosagem aguda no comportamento de coçar em camundongos machos CD-1. O tratamento agudo com o composto 1 reverteu a alodinia mecânica em ratos submetidos a lesões CCI com uma dose eficaz mínima menor ou igual a 1 mg/kg após administração oral. Após 7 dias de tratamento crônico, um efeito analgésico significativo de todas as 3 doses foi mantido, embora o efeito da morfina (6 mg/kg) fosse mais completamente perdido. A morfina foi administrada subcutaneamente. Lesão de estrangulamento crônica (CCI) em ratos machos Sprague Dawley foi realizada conforme descrito por Bennette e Xie’s, (1998). Os animais foram testados após 14 dias da cirurgia. **p <0,01,****p<0,0001 vs veículo, ANOVA bidirecional pós-teste LSD de Fisher, n=7-9.

[0016] Figura 3. Efeitos do composto 1 após dosagem aguda e crônica no limiar de retração da pata em raros lesionados CCI. Composto 1 reduziu de forma dependente a dose, composto 48/80 induziu o comportamento de coçar em camundongos machos CD-1. Composto 48/80, injetado em 50µL subcutaneamente na nuca, induziu um aumento acentuado e significativo nos surtos de coceira em comparação aos camundongos

5 / 36 injetados com veículo. O antagonista H1 histaminérgico, cloridrato de difenidramina foi usado como referência e administrado oralmente 60 min antes do Composto 48/80, enquanto o composto 1 foi administrado oralmente 30 min antes da administração do composto 48/80. #### p<0,0001 vs. Solução fisiológica; ***p<0,001, **p<0,01, vs veículo+composto 48/80. ANOVA unidirecional teste post hoc LSD de Fisher, n=7-9.

[0017] Figura 4. Efeitos do composto 1 na atividade locomotora exploratória em ratos machos SD. Composto 1 dosado até 30 mg/kg, correspondendo a uma concentração de cérebro livre de 494 não afetou a atividade locomotora exploratória em ratos machos Sprague Dawley (p > 0,05 medições ANOVA repetidas duas vezes com tempo e dose como fatores). Composto 1 foi administrado oralmente a 3,10 e 30 mg/kg, 10 ml/kg, 120 minutos antes de introduzir os ratos nas gaiolas novas em condições de luz fraca. A atividade dos ratos foi automaticamente registrada por 30 minutos (TSE MoTil, Alemanha).

[0018] Figura 5. Efeitos do composto 1 no desempenho na haste rotatória em ratos SD machos. Composto 1 dosado até 30 mg/kg não afetou a capacidade dos ratos de manter o equilíbrio em uma haste rotatória em aceleração, medido como latência para cair da haste. Ao contrário, o modulador positivo do receptor de GABAA não seletivo, Diazepam, significativamente encurtou a latência ao cair (p<0,05). Composto 1 e diazepam foram administrados oralmente 2h e 1h antes de iniciar o teste, respectivamente. Os ratos foram treinados na haste rotatória por dois dias a 4 a 40 rpm por 5 min antes de avaliar os efeitos do fármaco no 3o dia. Os ratos que fracassaram na execução por mais de 90 s após o treinamento não foram incluídos no experimento. *p<0,05, vs veículo, ANOVA unidirecional pós teste LSD de Fisher, n=6-7. Descrição detalhada

[0019] Em um aspecto, a presente invenção se refere a 2-(3-(3-(2,4-

6 / 36 dimetoxipirimidin-5-il)fenil)-3H-imidazo[4,5-b]piridin-6-il)propan-2-ol, representado na fórmula 1.

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[0020] Em uma modalidade, o composto 1 é um sal farmaceuticamente aceitável.

[0021] O composto da invenção pode existir em uma forma tautomérica. Sais farmaceuticamente aceitáveis

[0022] O composto químico da invenção pode ser provido em qualquer forma adequada para a administração pretendida, incluindo sais farmaceuticamente (ou seja, fisiologicamente) aceitáveis. Exemplos de sais de adição farmaceuticamente aceitáveis incluem, sem limitação, sais de adição de ácido inorgânico e orgânico não tóxicos, como cloridrato, bromidrato, nitrato, perclorato, fosfato, sulfato, formato, acetato, aconato, ascorbato, benzenossulfonato, benzoato, cinnamato, citrato, embonato, enantato, fumarato, glutamato, glicolato, lactato, maleato, malonato, mandelato, metanosulfonato, naftaleno-2-sulfonato, ftalato, salicilato, sorbato, estearato, succinato, tartrato, tolueno-p-sulfonato, e semelhantes. Esses sais podem ser formados por procedimentos bem conhecidos e descritos na técnica. Outros ácidos, como ácido oxálico, que podem não ser considerados farmaceuticamente aceitáveis, podem ser úteis na preparação de sais úteis

7 / 36 como intermediários na obtenção de um composto químico da invenção e seu sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável.

[0023] Exemplos de sais catiônicos farmaceuticamente aceitáveis do composto 1 da invenção incluem, sem limitação, o sal de sódio, potássio, cálcio, magnésio, zinco, alumínio, lítio, colina, lisínio e o amônio, e semelhantes, do composto 1 da invenção contendo um grupo aniônico. Tais sais catiônicos podem ser formados por procedimentos bem conhecidos e descritos na técnica. No contexto desta invenção os “sais de ônio” de compostos contendo N também são contemplados como sais farmaceuticamente aceitáveis. Os “sais de ônio” preferidos incluem os sais de alquil-ônio, os sais de cicloalquil-ônio, e os sais de cicloalquilalquil-ônio. Compostos marcados

[0024] O composto químico da presente invenção pode ser usado na sua forma marcada ou não marcada. No contexto desta invenção, o composto marcado tem um ou mais átomos substituídos por um átomo que tem uma massa atômica ou número de massa diferente da massa atômica ou número de massa normalmente encontrado na natureza. A marcação permitirá a fácil detecção quantitativa do dito composto.

[0025] Os compostos marcados da invenção podem ser úteis como ferramentas de diagnóstico, radio rastreadores, ou agentes de monitoramento em vários métodos de diagnóstico, e para geração de imagem in vivo. O isômero marcado da invenção preferivelmente contém pelo menos um radionuclídeo como uma marca. Os radionuclídeos de emissão de pósitron são todos candidatos para uso. No contexto desta invenção, o radionuclídeo é preferivelmente selecionado a partir de 2H (deutério), 3H (trítio), 13C, 14C, 131I, 125 I, 123I, e 18F.

[0026] O método físico para detectar o isômero marcado da presente invenção pode ser selecionado a partir de Tomografia de Emissão de Pósitron (PET), Tomografia Computadorizada de Geração de Imagem de Fóton único

8 / 36 (SPECT), Espectroscopia de Ressonância Magnética (MRS), Geração de Imagem por Ressonância Magnética (MRI), e Tomografia de raios-X Axial Computadorizada (CAT), ou combinações dos mesmos. Métodos de Preparação

[0027] Os compostos químicos da invenção podem ser preparados por métodos convencionais para síntese química, por exemplo, os descritos nos exemplos de trabalho. Os materiais de partida para os processos descritos no presente pedido são conhecidos ou podem ser rapidamente preparados por métodos convencionais a partir de produtos químicos comercialmente disponíveis.

[0028] Os produtos finais das reações descrias neste documento podem ser isolados por técnicas convencionais, por exemplo, por extração, cristalização, destilação, cromatografia, etc.

[0029] Os compostos desta invenção podem existir em formas não solvatadas, bem como solvatadas com solventes farmaceuticamente aceitáveis, como água, etanol e semelhantes. No geral, as formas solvatadas são consideradas equivalentes às formas não solvatadas para as finalidades desta invenção. Composições farmacêuticas

[0030] A invenção também provê composições farmacêuticas compreendendo quantidade terapeuticamente eficaz de composto 1, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, junto com pelo menos um carreador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.

[0031] Embora o composto 1 da presente invenção para uso em terapia possa ser administrado na forma do composto químico bruto, é preferido introduzir o ingrediente ativo, opcionalmente na forma de um sal fisiologicamente aceitável, em uma composição farmacêutica junto com um ou mais adjuvantes, excipientes, carreadores, tampões, diluentes, e/ou outros auxiliares farmacêuticos comuns.

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[0032] Em uma modalidade preferida, a invenção provê composições farmacêuticas compreendendo o composto químico da invenção, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, junto com um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis e, opcionalmente, outros ingredientes terapêuticos e/ou profiláticos, conhecidos e usados na técnica. O(s) carreador(es) deve(m) ser “aceitável(s)” no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação e não nocivos ao receptor da mesma. As composições farmacêuticas da invenção podem ser as adequadas para administração oral, retal, bronquial, nasal, pulmonar, tópica (incluindo bucal e sub-lingual), transdérmica, vaginal ou parenteral (incluindo injeções ou infusões cutâneas, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, intra-arterial, intracerebral, intraocular), ou as em uma forma adequada para administração por inalação ou insuflação, incluindo administração de pós e aerossol líquido, ou por sistemas de liberação prolongada. Exemplos adequados de sistemas de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o composto da invenção, cujas matrizes podem ser na forma de artigos modelados, por exemplo, películas ou microcápsulas.

[0033] O composto 1 da invenção, junto com um adjuvante, carreador ou diluente convencional, pode assim ser colocado na forma de composições farmacêuticas e dosagens unitárias das mesmas. Tais formas incluem sólidos, e em particular comprimidos, cápsulas preenchidas, formas de pó e grânulo, e líquidos, em particular soluções, suspensões, emulsões, elixires aquosas ou não aquosas, e cápsulas preenchidas com as mesmas, todos para uso oral, supositórios para administração retal, e soluções injetáveis estéreis para uso parenteral. Tais composições farmacêuticas e formas de dosagem unitária das mesmas podem compreender ingredientes convencionais em proporções convencionais, com ou sem compostos aditivos ou princípios adicionais, e essas formas de dosagem unitária podem conter qualquer quantidade eficaz

10 / 36 adequada do ingrediente ativo proporcional à faixa de dosagem diária pretendida a ser empregada. O composto 1 da presente invenção pode ser administrado em uma grande variedade de formas de dosagem oral e parenteral. Será evidente para os versados na técnica que as seguintes formas de dosagem podem compreender, como o componente ativo, seja um composto químico da invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável de um composto químico da invenção.

[0034] Para preparar as composições farmacêuticas a partir do composto 1 da presente invenção, carreadores farmaceuticamente aceitáveis podem ser tanto sólidos quanto líquidos. As preparações de forma sólida incluem pós, comprimidos, pílulas, cápsulas, cápsulas pequenas, supositórios, e grânulos dispersíveis. Um carreador sólido pode ser uma ou mais substâncias que também podem agir como diluentes, agentes flavorizantes, solubilizantes, lubrificantes, agentes de suspensão, aglutinantes, conservantes, agentes de desintegração de comprimido, ou um material de encapsulação.

[0035] As preparações farmacêuticas são preferivelmente em formas de dosagem unitária. Em tal forma, a preparação é subdividida em doses unitárias contendo quantidades apropriadas do componente ativo. A forma de dosagem unitária pode ser uma preparação embalada, a embalagem contendo quantidades distintas de preparação, como comprimidos, cápsulas, e pós embalados em frascos ou ampolas. Também, a forma de dosagem unitária pode ser uma cápsula, comprimido, cápsula pequena, ou pastilha propriamente dita, ou pode ser o número apropriado de qualquer um destes na forma embalada.

[0036] Uma dose terapeuticamente eficaz se refere à quantidade de ingrediente ativo que alivia os sintomas ou condição. A eficácia terapêutica e toxicidade, por exemplo, ED50, podem ser determinadas por procedimentos farmacológicos padrão em culturas de células ou animais experimentais. A razão de dose entre efeito terapêutico e tóxico é o índice terapêutico e pode

11 / 36 ser expressa pela razão entre níveis plasmáticos resultando em efeitos terapêuticos e razões plasmáticas resultando em efeitos tóxicos. As composições farmacêuticas que apresentam grandes índices terapêuticos são preferidas.

[0037] A dose administrada deve, certamente, ser cuidadosamente ajustada para a idade, peso e condição do indivíduo a ser tratado, bem como a via de administração, forma e regime de dosagem, e o resultado desejado, e a dosagem exata, certamente, deve ser determinada pelo médico.

[0038] A dosagem real depende da natureza e severidade da doença que está sendo tratada, e está a critério do médico, e pode variar por titulação da dosagem para as circunstâncias particulares desta invenção para produzir o efeito terapêutico desejado. Entretanto, atualmente contempla-se que composições farmacêuticas contendo de cerca de 0,1 a cerca de 10.000 mg de ingrediente ativo por dose individual, preferivelmente de cerca de 1 a cerca de

1.000 mg, mais preferido de cerca de 10 a cerca de 500 mg, são adequadas para tratamentos terapêuticos. O ingrediente ativo pode ser administrado em uma ou diversas doses por dia. Um resultado satisfatório pode, em certos casos, ser obtido a uma dosagem dede 0,1 μg/kg i.v. e 1 μg/kg p.o. O limite superior da faixa de dosagem é atualmente considerado como cerca de 10 mg/kg i.v. e 100 mg/kg p.o. As faixas preferidas são de cerca de 0,1 μg/kg a cerca de 10 mg/kg/dia i.v., e de cerca de 1 μg/kg a cerca de 100 mg/kg/dia p.o. Atividade biológica

[0039] O composto 1 da presente invenção é capaz de modular o complexo do receptor GABAA, e demonstrou ser um modulador alostérico positivo (PAM) de receptores GABAA contendo a subunidade a3 e em menor quantidade, subunidade a2 e a5. O composto 1 reverte alodinia mecânica em um modelo de rato para dor neuropática após tratamento agudo e crônico e alivia a coceira em camundongos tratados com um composto indutor de

12 / 36 prurido sugerindo efeitos analgésicos, bem como antipruríticos. O composto 1 não apresenta responsabilidade para efeitos sedativos e de piora motora como medido na atividade locomotora exploratória e desempenho na haste rotatória. Métodos de terapia

[0040] Sendo um ligante para receptores GABAA, o composto 1 é de uso no tratamento, prevenção e/ou alívio de transtornos de um corpo vivo, incluindo humano. Preferivelmente, o composto 1 é de uso no tratamento, prevenção e/ou alívio de dor, como dor neuropática, e/ou prurido. Tratamento de dor neuropática

[0041] Em um aspecto, a presente invenção se refere ao uso de 2-(3- (3-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)fenil)-3H-imidazo[4,5-b]piridin-6-il)propan-2- ol, representado na fórmula 1 no tratamento, prevenção e/ou alívio de dor neuropática.

[0042] A dor neuropática é uma categoria de dor que inclui diversas formas de dor crônica e que resulta da disfunção do tecido nervoso em vez de somático. A dor neuropática, que é a dor derivada de disfunção do sistema nervoso central ou periférico, também pode ser uma consequência do dano ao nervo periférico ou a regiões do sistema nervoso central, que resulta da doença, ou pode ser idiopática. Os sintomas da dor neuropática incluem sensações de queimação, dormência, eletricidade, pinos e agulhas, parestesia, diestesia, rigidez, falta de sensibilidade nas extremidades, sensação de distorção corporal, alodinia (dor gerada pela estimulação que é normalmente inócua), hiperalgesia (sensibilidade anormal à dor), hiperpatia (uma resposta exagerada à dor que persiste após o estímulo à dor parar), dor fantasma e dor espontânea. Tratamento de prurido

[0043] Em um aspecto, a presente invenção se refere ao uso de 2-(3- (3-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)fenil)-3H-imidazo[4,5-b]piridin-6-il)propan-2- ol, representado na fórmula 1, no tratamento, prevenção e/ou alívio de

13 / 36 prurido.

[0044] O prurido (também conhecida como Pruritis) é uma sensação que causa o desejo ou reflexo de coçar. Foi mostrado que o prurido tem muitas semelhanças com a dor. A maioria dos casos de prurido está relacionada à histamina, e são tratados com anti-histamínicos. Entretanto, alguns casos de prurido não são tratáveis com anti-histamínicos. As possíveis causas do prurido incluem pele seca, condições e rachaduras da pele, doenças internas, transtornos dos nervos, irritação e reações alérgicas, fármacos e gravidez.

[0045] Muitos transtornos de pele, como condições de pele, caspa, queradoderma palmoplantar pontual, sarna, crescimento de ferida, xerose, piolho, catapora e urticária, causam prurido. As ditas condições de pele incluem psoríase, eczema (dermatite), queimadura de sol, pé de atleta, e hidradenite supurativa.

[0046] A pele com prurido pode ser um sintoma de uma doença subjacente. Estas incluem doença hepática, falha renal, diabetes mellitus, hiperparatiroidismo, anemia por deficiência de ferro, icterícia, colestase, uraemia, policitemia, problemas da tireoide e cânceres, incluindo leucemia e linfoma. As condições que afetam o sistema nervoso, como esclerose múltipla, diabetes mellitus, nervos comprimidos e herpes zóster, podem causar prurido.

[0047] O prurido pode ser provocado ou intensificado por inúmeros materiais ou substâncias químicas, como lã, cosméticos, sabões, histamina, opioides, prostaglandinas, proteases, cicotinas, neuropeptídeos, em particular substância P, serotonina, cloroquina Composto48/80 (CAS NO. 94724-12-6) e sais biliares. As alergias alimentares também podem fazer com que a pele coce.

[0048] Os fatores considerados como intensificadores da sensação de prurido incluem a secura da epiderme e derme, anoxia dos tecidos, dilatação

14 / 36 dos capilares, estímulo de irritação, doenças primárias da pele e transtornos psiquiátricos.

[0049] Em uma modalidade, o prurido é Pruritis. Em uma modalidade, o Pruritis é Pruritus ani. Em uma modalidade, o Pruritis é Pruritus scroti. Em uma modalidade, o Pruritis é Pruritus vulvae. Em uma modalidade, o Pruritus é Anogenital pruritus. Exemplos Exemplo 1: Preparação de 2-(3-(3-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)fenil)-3H- imidazo[4,5-b]piridin-6-il)propan-2-ol (1) ETAPA 1: Preparação de 6-((3-bromofenil)amino)-5-nitronicotinato de metila (4)

[0050] A uma solução agitada de ácido 6-cloro-5-nitro-nicotínico 2 (100 g, 461,72 mmol) em tetra-hidrofurano anidro (750 mL) a 0°C foi adicionada N,N-di-isopropiletilamina (120,6 mL, 692,58 mmol) seguido por 3-Bromoanilina 3 (55 ml, 494,1 mmol) em gotas. A mistura de reação foi agitada a temperatura ambiente por 24 h sob atmosfera de nitrogênio. A reação foi monitorada por TLC e UPLC. A mistura de reação foi concentrada até a metade de seu volume inicial sob pressão reduzida. Éter pet (800 mL) foi adicionado à mistura de reação e a suspensão foi agitada por 1h. O sólido laranja que apareceu foi filtrado sob sucção e lavado completamente com éter pet (8 x 300 mL) para fornecer 6-((3-bromofenil)amino)-5-nitronicotinato de metila 4 (132 g, 81%) como sólido laranja.

[0051] RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): δ = 10,31 (s, 1H, próton

15 / 36 permutável), 8,94 (s, 1H), 8,82 (s, 1H), 7,92 (s, 1H), 7,63 (d, J = 7,60 Hz, 1H), 7,41-7,36 (m, 2H), 3,88 (s, 3H); LCMS (ESI): m/z: 352,9 (M+H)+. ETAPA 2: Preparação de 5-amino-6-((3-bromofenil)amino)nicotinato de metila (5)

[0052] A uma suspensão resfriada (0°C) de 6-((3-bromofenil)amino)- 5-nitronicotinato de metila 4 (485 g; 1377,28 mmol) em uma mistura de Etanol: THF [1:1; (2600 mL)], foi adicionado cloreto estanoso di-hidratado (932,3 g; 4131,8 mmol) em porções a 0°C e a mistura de reação foi agitada por 20 h sob atmosfera de nitrogênio embora permitindo a temperatura da mistura de reação a temperatura ambiente. O progresso da reação foi monitorado por TLC e UPLC. Após 20 h, a mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida, e o resíduo obtido foi diluído com água (1.000 mL). A mistura aquosa foi basificada com bicarbonato de sódio sólido (até pH~ 9-10) a 5°C. Então clorofórmio (1.500 mL) foi adicionado à parte aquosa e agitado por 15 minutos, o insolúvel inorgânico que apareceu foi filtrado sobre um leito de Celite. O leito foi lavado completamente com clorofórmio (5 * 500 mL) A camada orgânica foi separada, lavada com solução de salmoura saturada (800 mL), seca sobre sulfato de sódio anidro, filtrada e concentrada para disponibilizar 5-amino-6-((3-bromofenil)amino)nicotinato de metila 5 (350 g, 78,88%) como um sólido acinzentado.

[0053] RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): δ = 8,38 (s, 1H, próton

16 / 36 permutável), 8,13 (s, 1H), 8,06 (s, 1H), 7,70 (d, J = 10,00 Hz, 1H), 7,42 (s, 1H), 7,27-7,22 (m, 1H), 7,13-7,10 (m, 1H), 5,31 (s, , 2H, próton permutável), 3,80 (s, 3H); LCMS (ESI): m/z: 324,0 (M+H)+. ETAPA 3: Preparação de 3-(3-bromofenil)-3H-imidazo[4,5-b]piridina-6- carboxilato de metila (6

[0054] A uma solução agitada de 5-amino-6-((3- bromofenil)amino)nicotinato de metila 5 (350 g, 1086,41 mmol) em THF anidro (3.000 mL) foi adicionado ortoformato de trimetila (172,94 g, 1629,6 mmol) seguido por ácido p-toluenossufônico (pTSA) (61,99 g, 325,92 mmol) em uma porção, e a massa da reação foi aquecida a 80°C sob atmosfera de nitrogênio. O progresso da reação foi monitorado por TLC e UPLC. Após 3 h, a mistura de reação atingiu naturalmente a temperatura ambiente, e solvente foi removido sob pressão reduzida. O bruto obtido foi diluído com água (1.000 mL), e a parte aquosa foi basificada com bicarbonato de sódio até pH ~ 9 a 10, mantendo-se a agitação a RT. A agitação continuou por mais 1h. O sólido que apareceu foi filtrado sob sucção e seco completamente sob vácuo para fornecer massa bruta (380 g, 105,3% de equilíbrio de massa) como um sólido esbranquiçado. O bruto foi dissolvido em clorofórmio (5.000 mL), lavado com salmoura, seco sobre Na2SO4, filtrado e concentrado sob pressão reduzida para fornecer 3-(3-bromofenil)-3H-imidazo[4,5-b]piridina-6- carboxilato de metila 6 (335 g, 92,83%) como um sólido esbranquiçado.

[0055] RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): δ = 9,12 (s, 1H), 9,03 (d, J =

17 / 36 2,00 Hz, 1H), 8,67 (d, J = 2 Hz, 1H), 8,27-8,26 (m, 1H), 8,04-8,01 (m, 1H), 7,73-7,71 (m, 1H), 7,63-7,59 (m, 1H), 3,94 (s, 3H); LCMS (ESI): m/z: 334,0 (M+H)+. ETAPA 4: Preparação de 2-(3-(3-bromofenil)-3H-imidazo[4,5-b]piridin- 6-il)propan-2-ol (7)

[0056] A uma suspensão agitada de 3-(3-bromofenil)-3H- imidazo[4,5-b]piridina-6-carboxilato de metila 6 (50 g, 150,53 mmol) em THF anidro (600 mL) a -20°C foi adicionada solução de MeMgCl [(72 mL, 143,92mmol); 2M em THF] em gotas de um período de 30 minutos sob atmosfera de nitrogênio. A mistura de reação foi agitada por 3,5 h sob atmosfera de nitrogênio mantendo a reação temperatura a -20°C a 0°C. O progresso da reação foi monitorado por TLC e UPLC. Após 3,5 h, a massa da reação interrompida com solução de cloreto de amônio saturada (1.500 mL), a camada aquosa foi extraída com acetato de etila (3*1.000 mL), a camada orgânica combinada foi lavada com solução de salmoura saturada (500 mL), seca sobre sulfato de sódio anidro, filtrada e concentrada para fornecer massa bruta (51 g, 102% de equilíbrio de massa) como uma goma marrom. O bruto foi purificado por coluna flash sobre um leito de alumina neutra usando 20% de acetato de etila em hexano como eluente para fornecer produto desejado 2- (3-(3-bromofenil)-3H-imidazo[4,5-b]piridin-6-il)propan-2-ol 7 (22 g, 44%) como uma goma marrom.

[0057] RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): δ = 8,95 (s, 1H), 8,62 (s, 1H),

18 / 36 8,33 (s, 1H), 8,23 (s, 1H), 8,06 (d, J = 8,00 Hz, 1H), 7,65 (d, J = 8,00 Hz, 1H), 7,59-7,55 (m, 1H), 5,32 (s, 1H, próton permutável), 1,55 (s, 6H); LCMS (ESI): m/z: 334,0 (M+H). ETAPA 5: Preparação de 2-(3-(3-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)fenil)-3H- imidazo[4,5-b]piridin-6-il)propan-2-ol (1)

[0058] A uma solução agitada de 2-(3-(3-bromofenil)-3H- imidazo[4,5-b]piridin-6-il)propan-2-ol 7 (0,75 g, 2,25 mmol) em uma mistura de 1,2-dimetoxie-hxano:água [2:1; (45 mL)], foi adicionado ácido 2,4- dimetoxipirimidina-5-borônico 8 (0,456 g, 2,48 mmol), seguido por Na2CO3 (0,478 g, 4,51 mmol). A mistura foi desgaseificada com gás nitrogênio por 25 minutos. Dicloreto de bis(trifenilfosfina)paládio (II) (0,079 g, 0,112 mmol) foi adicionado à mistura de reação anterior e foi aquecido a 90°C sob atmosfera de nitrogênio. O progresso da reação foi monitorado por TLC e UPLC. Após 15 h, a mistura de reação atingiu naturalmente a temperatura ambiente e foi finalizada com água fria (75 mL). A parte aquosa foi extraída com acetato de etila (3*200 mL), e a camada orgânica combinada foi lavada com salmoura (2*50 mL), seca sobre sulfato de sódio anidro, filtrada e concentrada para fornecer o bruto (0,865 g; equilíbrio de massa 97,8%) como uma goma marrom. O bruto foi purificado por coluna flash usando 50% de acetato de etila em hexano como eluente para fornecer produto desejado (0,575 g) como um sólido esbranquiçado, que foi ainda triturado, filtrado e

19 / 36 seco sob sucção para fornecer 2-(3-(3-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)fenil)-3H- imidazo[4,5-b]piridin-6-il)propan-2-ol (1) (0,5 g, 56,62%) como um sólido esbranquiçado.

[0059] RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): δ = 8,94 (s, 1H), 8,60 (d, J = 2,00 Hz, 1H), 8,54 (s, 1H), 8,24 (d, J = 2,00 Hz, 1H), 8,13-8,12 (m, 1H), 8,01-7,98 (m, 1H), 7,70-7,63 (m, 2H), 5,3 (s, 1H, próton permutável), 3,98 (d, J = 4,00 Hz, 6H), 1,55 (s, 6H); LCMS (ESI): m/z: 392,3 (M+H)+, MR: 86,0°C - 93,4°C. Exemplo 2: Inibição in vitro de ligação ao ³H-flumazenil Preparação do tecido

[0060] Linhas celulares HEK-293 com expressão estável de receptores GABA α3β3γ2 recombinantes foram cultivados (37°C, 5 % de CO2) em Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) com Ultraglutamina 1,

4.500 mg/l de D-glicose, 10 % de soro bovino fetal e contendo os seguintes antibióticos: zeocina (0,1 mg/ml), higromicina B (0,15 mg/ml) e G418 (0,5 mg/ml).

[0061] Quando as culturas atingiram confluência em frascos de cultura grandes (175 cm2) o DMEM foi removido e as células foram lavadas uma vez em Solução Fisiológica Tamponada com Fosfato de Dulbecco (DPBS; KCl: 0,2 g/l, KH2PO4: 0,2 g/l, NaCl: 8 g/l, Na2HPO4: 1,15 g/l). As células foram colhidas após a adição de 2 ml de DPBS à cultura por aproximadamente 5 min seguido por raspagem suave das células da base do frasco de cultura. Após a adição de mais 15 ml de DPBS, a suspensão de células foi transferida para tubos Falcon e centrifugada a 3.000 rpm por 10 min. O precipitado foi lavado uma vez em 15 ml de tampão Tris-HCl ou Tris- citrato (50 mM, pH 7,1) usando um homogeneizador Ultra-Turrax e centrifugado a 2°C por 10 min a 27.000 x g. O precipitado lavado foi ressuspenso em 15 ml de tampão Tris-HCl ou Tris-citrato (50 mM, pH 7,1) e congelado a -80°C até o dia do experimento de ligação.

20 / 36 Ensaio

[0062] No dia do experimento, a preparação de membrana foi descongelada a temperatura ambiente e centrifugada a 2°C por 10 min a

27.000 x g. O precipitado foi ressuspenso usando um homogeneizador Ultra- Turrax em tampão Tris-citrato (50 mM, pH 7,1) para 30 a 150 µg de proteína por ensaio e então usado para ensaios de ligação. As alíquotas de 0,5 ml de suspensão de células foram adicionadas a 25 µl de solução de teste e 25 µl de 3 H-flumazenil (1 nM, concentração final), misturadas e incubadas em duplicata por 40 min a 2°C. A ligação não específica foi determinada usando clonazepam (1 µM, concentração final).

[0063] Todas as diluições de compostos de teste e incubação de ensaio foram realizadas em frascos/placas de vidro. As soluções dos compostos de teste e ³H-flunitrazepam foram preparadas 22x a concentração final desejada. Os compostos foram dissolvidos em 100% de DMSO (10 mM de estoque), diluídos em 48% de etanol-água, e testados em triplicata em diluições em série.

[0064] A ligação foi terminada por filtração rápida sobre filtros de fibra de vidro Whatman GF/C usando um Brandel Cell Harvester, seguido por 10 lavagens com 1 ml de tampão Tris-citrato resfriado em gelo.

[0065] A quantidade de radioatividade nos filtros foi determinada por contagem de cintilação líquida convencional usando um contador Tri-CarbTM (PerkinElmer Life e Analytical Sciences). A ligação específica é a ligação total menos a ligação não específica. Resultados Tabela 1. Valores Ki e IC50 para o composto 1. Composto Ki (μM) IC50 (μM) 2-(3-(3-(2,4-dimetoxipirimidin-5- 0,015 0,038 il)fenil)-3H-imidazo[4,5- b]piridin-6-il)propan-2-ol (1)

[0066] O valor IC50 é a concentração da substância de teste que inibe a ligação específica de ³H-flumazenil em 50%,

21 / 36 IC50 = (concentração aplicada de 1) * onde C0 é a ligação específica no ensaio de controle, e Cx é a ligação específica no ensaio de teste. Conclusão

[0067] Foi descoberto que 2-(3-(3-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)fenil)- 3H-imidazo[4,5-b]piridin-6-il)propan-2-ol (1) tem um valor Ki de 0,015 μM e um valor IC50 de 0,038 μM. Exemplo 3: Eletrofisiologia do oócito

[0068] O ensaio reportado neste documento é realizado para determinar a potência funcional in vitro, bem como eficácia de PAMs nos principais subtipos de receptores GABAA do cérebro. Para estabelecer isto, um perfil de resposta de concentração completa foi determinado a uma concentração de GABA dando origem a 5 a 20% da resposta evocada por GABA máxima a partir de receptores α1β2γ2, α2β2γ2, α3β2γ2 e α5β2γ2 expressos em oócitos de Xenopus laevis. Preparação de oócito de Xenopus

[0069] Os oócitos de X. laevis desfoliculados de colagenase foram obtidos da Ecocyte Bioscience. Para injeção, os oócitos foram colocados em uma câmara projetada personalizada em solução de Mod. Barth (90 mM de NaCl, 1 mM de KCl, 0,66 mM de NaNO3, 2,4 mM de NaHCO3, 0,74 mM de CaCl2, 0,82 mM de MgCl2, 100 µg/ml de Gentamicina e 10 mM de HEPES ajustado para pH 7,55) e injetados com 25 a 50 nl de mistura de cRNA usando uma Bomba Pico (WPI). A mistura de cRNA contém subunidades αx, β2, e γ2s de GABAAR na razão de 3:1:3 e em uma concentração total de 0,5 µg/µl. Após a injeção, os oócitos foram mantidos a 18°C em Mod. Barth’s por 1 a 5 dias. Experimentos de fixação de tensão de dois eletrodos

[0070] As respostas eletrofisiológicas de oócitos de X. laevis foram

22 / 36 medidas usando a técnica de fixação de tensão de dois eletrodos. Oócitos únicos foram colocados em câmaras de registro projetadas personalizadas que foram continuamente perfundidos com >2 ml/min de OR2 (90 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 2,5 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2 e 5 mM de HEPES pH 7,4). A solução de ensaio experimental foi uma solução tampão de OR2 padrão que teve uma osmolaridade medida de aproximadamente 180mOsm. Os eletrodos de registro foram fabricados a partir de tubos de vidro de borossilicato com filamento (Sutter BF150-110-10) usando um puxador DMZ-Universal (Zeitz Instrument), aterrado com 2 M de KCl e, quando submerso em solução de OR2, as resistências do eletrodo foram na faixa de 0,5 a 1 MΩ. O oócito foi empalado usando micro manipuladores manuais e equilibraram naturalmente a um potencial de espera de -50 mV a -80 mV por pelo menos 1 min para garantir uma corrente de fuga máxima de 100 nA antes de o experimento ser iniciado. O potencial de espera foi normalmente ajustado a -60 mV, que é significativamente menor que um potencial de repouso típico de -25 mV. No caso de amplitudes de corrente serem baixas em um lote de oócitos, um potencial de espera de -80 mV foi usado, desde que a corrente de fuga não excedesse 100 nA. As correntes foram amplificadas por um amplificador Geneclamp 500B (Axon), filtrado passa- baixo a 20Hz, digitalizado a 200 Hz por um Digidata 1322A (Axon) e então registradas, bem como analisadas por um PC (Compaq Evo) usando o pacote pClamp9 (Axon).

[0071] As soluções do composto foram aplicadas através de um tubo capilar, com um diâmetro interno de 1,5 mm (Modulohm 214813), colocadas aproximadamente 2 mm do oócito e conectadas através do tubo de Teflon a um autoamostrador Gilson 233XL. O pacote de software Gilson 735 foi usado para controlar todo o equipamento Gilson (autoamostrador 233XL, diluidor 402 e bombas Minipuls 3) e acionar o registro por pCLAMP9. Uma vazão de 2,5 ml/min através do tubo capilar durante as aplicações garantiu uma troca

23 / 36 rápida de líquido que circunda o oócito. O tamanho da aplicação foi ajustado para durar 60 s, que foi suficiente para obter correntes de pico. O intervalo de tempo entre os registros foi 5 min, durante o qual o oócito foi perfundido com OR2 também através do tubo capilar. Dados experimentais

[0072] Para cada conjunto experimental de dados, GABA foi dissolvido em OR2 em uma concentração conhecida para dar origem a correntes desencadeadas EC5-EC20 para uma dada combinação de subtipo do receptor GABAA (0,5 a 5 µM) e esta solução foi então usada para controles, bem como uma solução estoque para dissolver os compostos para testar no experimento. Um conjunto experimental completo continha quatro traços de controle de GABA, um traço de referência de diazepam 0,5 μM, 10 traços de controle GABA, e finalmente traços de um composto de teste em concentrações crescentes. Os oócitos individuais foram descartados após um conjunto experimental.

[0073] Os efeitos modulatórios do diazepam foram calculados comparando o traço de diazepam ao traço de controle imediatamente antes. Da mesma forma, os efeitos modulatórios do composto nos traços de teste foram obtidos comparando ao controle imediatamente antes dos traços de teste. Para possibilitar a comparação dos efeitos de um composto entre oócitos individuais, todas as potencializações do composto foram normalizadas para a potencialização de diazepam de controle no mesmo oócito. Resultados

[0074] O ensaio foi conduzido para os compostos 1 e 9, ver a seguir, e os resultados são apresentados na Figura 1.

24 / 36 1 9 Conclusão

[0075] Como pode ser visto a partir dos perfis de resposta de concentração, a modulação por compostos 1 e 9 varia, especialmente com relação à modulação de receptor α1β2γ2. De forma importante, a modulação do receptor α1β2γ2 é próxima de zero para o composto 1, enquanto que é evidentemente negativa para o composto 9. Este Exemplo também demonstra que uma diferença estrutural relativamente pequena entre duas moléculas tem grande impacto na atividade biológica. Exemplo 4: Efeitos agudos e crônicos do composto 1 na alodinia mecânica em lesão de constrição crônica (CCI) em ratos. Método Animais:

[0076] Ratos machos SPRD (Taconic), 140 a 160 gramas em cirurgia Cirurgia:

[0077] A anestesia foi induzida e mantida por 2,5 % de isoflurano combinado com oxigênio (30%) e óxido nitroso (68%). O nervo ciático foi exposto no nível da coxa média proximal à trifurcação ciática. Quatro ligaduras do intestino crômico (4/0) (Ethicon, New Brunswick, NJ) foram amarradas de forma frouxa em torno do nervo, 1 a 2 mm de distância, de modo que o abastecimento vascular não fosse explicitamente comprometido.

25 / 36 O músculo suprajacente foi fechado em camadas com sutura cirúrgica absorvível sintética 4/0. A pele foi fechada com 1 a 2 grampos. Teste comportamental de ratos lesionados no nervo:

[0078] 3 a 14 dias após a cirurgia, os animais foram monitorados com relação à presença de alodinia mecânica. Antes da avaliação, ratos individuais foram removidos de suas gaiolas e se habituaram por 60 min em uma gaiola de teste Plexiglass branca de 15 x 20 cm ventilada, colocados em uma estrutura de metal elevada permitindo acesso à superfície plantar da pata traseira lesionada. A presença de alodinia mecânica foi avaliada usando uma série de pelos von Frey calibrados (limite inferior=0,1 e limite superior=26 g, Stoelting Co, Wood Dale IL), que foram aplicados à superfície plantar da pata com força crescente até que um filamento individual usado logo começasse a dobrar. O filamento foi aplicado por um período de 1 a 2 s e foi repetido 5 vezes em intervalos de 1 a 2 s. O filamento que induziu uma retração da pata em 3 das 5 aplicações foi considerado para representar o limiar da pata (PWT) para uma resposta alodínica mecânica ocorrer. Somente os animais que mostram diferentes comportamentos de dor neuropática (alodinia) foram incluídos nos experimentos de teste de fármaco. Animais apresentando PWT menor/ou igual a 4 g na para ipsilateral e PWT maior/igual a 8 g na pata contralateral foram considerados alodínicos. Nos dias do teste de fármaco, o experimentador foi cego para o tratamento.

[0079] O tratamento com fármaco acontece dia 15 após a cirurgia. Tratamento com fármaco: Efeito agudo do fármaco:

[0080] Composto 1: 1, 3, 10 mg/kg, 10 ml/kg, por administração oral.

[0081] Pré-tratamento: 2 h

[0082] Morfina-cloridrato: 6 mg/kg de peso de base livre, 1 ml/kg, administração subcutânea. Pré-tratamento: 30 minutos

[0083] Veículo para o Composto 1 e morfina: 5% de DMSO + 30%

26 / 36 (2-Hidroxipropil)-β-ciclodextrina (HPBCD) em água.

[0084] Avaliação estatística: ANOVA unidirecional seguido por testes LSD de Fisher para múltiplas comparações. Efeito crônico do fármaco:

[0085] Composto 1: 1, 3, 10 mg/kg, 10 ml/kg, por administração oral uma vez ao dia por 7 dias. Cloridrato de morfina: 6 mg/kg de peso de base livre, 1 ml/kg, administração subcutânea uma vez ao dia por 7 dias. No dia 8, alodinia mecânica foi monitorada aplicando filamentos de von Frey (“nível basal”) após os ratos serem administrados Composto 1 ou cloridrato de morfina, e alodinia mecânica foi monitorada por filamentos de von Frey novamente 2 h e 3 h após a dosagem (Composto 1) ou 30 minutos após a dosagem (cloridrato de morfina).

[0086] Veículo: 5% de DMSO + 30% de HPBCD (em água)

[0087] Avaliação estatística: ANOVA unidirecional seguido por testes LSD de Fisher para múltiplas comparações. Resultados

[0088] A dosagem aguda do Composto 1 resultou em alívio significativo dos comportamentos de dor neuropática conforme avaliado monitorando a alodinia mecânica usando pelos de von Frey. A menor dosagem testada de 1 mg/kg, e 3 mg/kg significativamente melhorou o limiar de retração da pata em comparação ao tratamento com veículo, monitorado 2 h e 3 h pós tratamento, ver Figura 2 (2 h: p<0,01, 3 h: p<0,05, ANOVA unidirecional seguido por teste post hoc LSD de Fishers LSD). 10 mg/kg fracassaram para atingir significância estatística. Cloridrato de morfina 6 mg/kg também significativamente melhoraram o limiar de retração da pata em comparação ao tratamento com veículo 2 h e 3 h pós tratamento (p<0,05 e p<0,001 vs. Veículo, respectivamente). Após 7 dias de dosagem diária do Composto 1, a melhora significativa do limiar de retração da pata foi mantido após 1 a 3, e 10 mg/kg pré-tratado 3 h antes do teste (p<0,05, 0,01 e 0,01 vs.

27 / 36 Veículo, respectivamente) e 10 mg/kg dosados 2 h antes do teste (p<0,001 vs.veículo) (ANOVA unidirecional seguido por teste post hoc LSD de Fishers LSD). Ao contrário, tratamento crônico com morfina antes da administração aguda do fármaco completamente aboliu o efeito alodínico indicando desenvolvimento de tolerância (figura 2). Conclusão

[0089] Este Exemplo demonstra que o composto 1 alivia comportamentos de dor neuropática após a administração aguda de fármaco e que o efeito é mantido após a administração crônica de fármaco, indicando falta de desenvolvimento de tolerância. Ao contrário, o efeito de um opioide, cloridrato de morfina, é completamente perdido após a administração crônica de fármaco devido ao desenvolvimento de tolerância. Exemplo 5: Efeitos agudos do composto 1 no composto 48/80 induziu coceira em camundongos CD-1 machos Método Animais:

[0090] Camundongos CD-1 machos (22-30g) (InterVivo Solutions, Canadá) Tratamento com fármaco:

[0091] Os animais foram dosados com um dos seguintes tratamentos: composto 1, veículo (controle negativo) ou cloridrato de difenidramina (controle positivo); N=8 camundongos por grupo. O composto 1 foi dosado por gavagem oral a uma concentração de 3, 10 e 30 mg/kg em veículo (5% de DMSO + 30% de HPBCD em água) 30 minutos antes do teste. Cloridrato de difenidramina foi dosado por gavagem oral a uma dose de 60 mg/kg em 5% de Tween 80 em água destilada (BEW=1,14) 60 minutos antes do teste. Todos os tratamentos foram dosados a um volume de dose de 10 ml/kg. O composto 48/80 foi administrado intradérmico no pescoço a 50 ug/0,02 ml em solução fisiológica.

28 / 36 Monitoramento comportamental:

[0092] A observação visual de surtos de coceira durante 30 minutos. Avaliações visuais foram realizadas à cega para o tratamento. Avaliação estatística:

[0093] ANOVA unidirecional seguido por testes LSD de Fisher para comparações post hoc. Resultados

[0094] O composto 1 significativamente aliviou o prurido, avaliada como surtos de coceira, com uma dose eficaz mínima de 10 mg/kg em comparação ao tratamento com veículo (p<0,01/0,001 vs. tratamento com veículo para 10 e 30 mg/kg, respectivamente, ANOVA unidirecional seguido por testes LSD de Fisher para comparações post hoc), ver Figura 3. Conclusão

[0095] Este Exemplo demonstra que o composto 1 significativamente alivia o comportamento de coçar em camundongos que indicam efeitos positivos no prurido. Exemplo 6: Efeitos agudos do composto 1 na atividade locomotora exploratória em ratos machos Sprague dawley (SD). Método Animais:

[0096] Ratos SD machos (180 a 250 gramas, NTac:SD, Taconic, Dinamarca) Tratamento com fármaco:

[0097] Os animais foram dosados com um dos seguintes tratamentos: Veículo (5% de DMSO + 30% de HPBCD em água) ou composto 1 (3, 10, 30 mg/kg, 10 ml/kg, por administração oral), 120 minutos antes do teste. n = 6-7 por grupo de dose. Monitoramento comportamental:

[0098] 2 h após a dosagem, os ratos foram colocados individualmente

29 / 36 em gaiolas padrão novas com forro de serragem reduzido. As gaiolas foram colocadas em estruturas equipadas com fotocélulas e feixes permitindo o registro automático do comportamento locomotor (TSE MoTil, Alemanha). A atividade locomotora exploratória foi registrada por 30 minutos. Avaliação estatística:

[0099] ANOVA unidirecional seguido por testes LSD de Fisher para comparações post hoc. Resultados

[00100] O composto 1 não exerceu nenhum efeito na atividade locomotora exploratória em ratos SD machos na maior dose testada (30 mg/kg) (ANOVA unidirecional seguido por testes LSD de Fisher para comparações post hoc), ver Figura 4. Conclusão

[00101] Este Exemplo demonstra que composto 1 não afetou a atividade locomotora exploratória em ratos nas doses testadas, indicando falta de propensão a causar sedação. Exemplo 7: Efeitos agudos do composto 1 no desempenho na haste rotatória em ratos machos Sprague dawley (SD). Método Animais:

[00102] Ratos SD machos (150 a 180 gramas, NTac:SD, Taconic, Dinamarca) Tratamento com fármaco:

[00103] Os animais foram dosados com um dos seguintes tratamentos: Veículo (5% de DMSO + 30% de HPBCD em água), composto 1 (3, 10, 30 mg/kg, 10 ml/kg, por administração oral) ou Diazepam 10 mg/kg (10 ml/kg, por administração oral) 120 minutos ou 60 minutos antes do teste respectivamente. n = 6 a 7 por grupo de dose. Monitoramento comportamental:

30 / 36

[00104] Os ratos foram treinados em uma haste rotatória em aceleração (4 a 40 rpm, PanLab), um experimento de 5 minutos por dia, por dois dias antes do teste com fármaco. Somente os ratos que foram capazes de permanecer na haste rotatória em aceleração por mais de 90 segundos após dois dias de treinamento foram incluídos no estudo. No dia do teste, os ratos foram colocados na haste rotatória em aceleração, acelerando com uma velocidade de 4 a 40 rpm/5 minutos com o mínimo tempo possível para ficar na haste rotatória designado como 0 s, e o tempo máximo para ficar na haste rotatória ajustado para 300 s. O composto 1 foi dosado 2 h antes do teste, enquanto o controle positivo, Diazepam, foi dosado 60 minutos antes do teste. Avaliação estatística:

[00105] ANOVA unidirecional seguido por testes LSD de Fisher para comparações post hoc. Resultados

[00106] O composto 1 não afeta a capacidade do rato de equilibrar-se na haste rotatória em aceleração, medida como latência para cair, na maior dose testada (30 mg/kg) em comparação aos ratos tratados com veículo. Ao contrário, Diazepam significativamente encurtou o tempo para cair da haste rotatória (p<0,05 vs. tratamento com veículo) (ANOVA unidirecional seguido por testes LSD de Fisher para comparações post hoc), ver Figura 5. Conclusão

[00107] Este exemplo demonstra que o composto 1 não piorou a capacidade do rato de manter o equilíbrio em uma haste rotatória em aceleração nas doses testadas, indicando uma ausência de propensão a causar piora motora. Exemplo 8: Ligação de proteína plasmática estimada por diálise de equilíbrio rápido

[00108] O propósito deste ensaio é determinar o grau de ligação de um composto de teste às proteínas plasmáticas.

31 / 36 Método Dispositivos de Diálise de Equilíbrio Rápido (RED):

[00109] Pastilhas descartáveis compostos por duas câmaras lado a lado (plasma e tampão) separadas por um cilindro vertical de membrana de diálise (MWCO ca. 8000) foram usadas. Os dispositivos de RED foram colocados em uma Placa de Base de Teflon e incubados por 4 hours a 37 oC em um incubador Heidolph ajustado para 100 rpm. Ensaio

[00110] O ensaio foi realizado em sistema de manuseio de líquido de acordo com a seguinte descrição do ensaio: - Preparação de plasma marcado - Colocar número relevante de dispositivos de RED em placas de base de Teflon e pré-aquecer a placa no incubador.

[00111] - Adicionar 400 µl de plasma à câmara de plasma e 600 µl de tampão de PBS para tamponar a câmara.

[00112] - Incubar por 4 horas a 37oC no incubador Heidolph ajustado para 140 rpm.

[00113] - Após a incubação, transferir 50 µl das câmaras de plasma para tubos eppendorf e adicionar 50 µl de tampão de PBS.

[00114] - De acordo, transferir 50 µl das câmaras de tampão para tubos eppendorf e adicionar 50 µl de plasma.

[00115] - Precipitar todas as amostras com 300 µl de MeCN.

[00116] - Centrifugar por 25 minutos a 5 oC e 14.000 rpm (16.000 g).

[00117] - Transferir o sobrenadante para frascos de HPLC com igual volume de água MilliQ

[00118] - Analisar por LC-MS/MS com detecção por SRM Resultados

[00119] A ligação à proteína foi calculada usando a seguinte fórmula:

32 / 36

[00120] Função livre: fu = 100 - %de Ligação à proteína onde, Atampão é a Área determinada por LC-MS/MS para a amostra da câmara de tampão.

[00121] Aplasma é a Área determinada por LC-MS/MS para a amostra da câmara de plasma.

[00122] A fração de plasma livre do composto 1 foi 16% em camundongo e 19% em rato. Conclusão

[00123] O composto 1 está abundantemente livre no plasma para exercer os efeitos farmacológicos. Exemplo 9: Ligação ao tecido cerebral

[00124] O proposito deste exemplo é avaliar a ligação à proteína do composto 1 ao homogenato de cérebro de rato usando o método de Diálise de Equilíbrio Rápido (RED). Material e Equipamento Homogenato de cérebro de rato

[00125] A fração de proteína de cérebro de rato foi preparada a partir de tecidos de cérebro fresco isolados de ratos adultos Wistar. Os ratos machos Wistar (Harlan, Holanda) são eutanizados (de acordo com o método aprovado) e o tecido cerebral foi coletado imediatamente. A matéria branca foi dissecada e um homogenato de tecido (10% p/v) é preparado em solução fisiológica tamponada com fosfato, pH 7,4. Esta fração é denominada homogenato cerebral e foi usada no experimento. Procedimento para Diálise de Equilíbrio Preparação da Placa de Base de Teflon

[00126] Polos de Placa de Base de Teflon® foram enxaguados com

33 / 36 20% de etanol por 10 minutos. O etanol foi removido e os poços foram enxaguados duas vezes com água destilada, daí em diante a placa secou naturalmente antes do uso. Diálise de Equilíbrio

[00127] 1 μl do composto 1 (estoque a 2 mM em 100% de DMSO) foi adicionado em 200 μl de extrato cerebral (concentração final 10 μM). 200 μl de amostra foram colocados na câmara da amostra. 350 μl de PBS 10 mM foram adicionados na câmara do tampão. A unidade foi coberta com fita de vedação e incubada a 37°C em um agitador orbital a aproximadamente 350 rpm por 4 horas para alcançar o equilíbrio. Volumes iguais tanto da câmara do tampão quanto do extrato foram então removidos e colocados em tubos de microcentrífuga separados. Procedimento para Análise da Amostra

[00128] 50 μl de cada amostra pós diálise foram pipetados das câmaras do tampão e do extrato em tubos de microcentrífuga separados. 50 μl de extrato foram adicionados às amostras de tampão, bem como um volume igual de PBS às amostras de extrato coletadas. 300 μl de tampão de precipitação (90/10 acetonitrila: água contendo 0,1% de ácido fórmico + padrão interno viz. Tolbutamida ou Ibuprofeno, 5 μg/ml)) foram adicionados para precipitar proteína e liberar o composto, que foram vortexados e incubados 30 minutos em gelo antes de 10 minutos de centrífuga a 13.000 a

15.000 g. O sobrenadante foi então transferido para um frasco ou placa de 96 poços, e medições quantitativas por LC/MS/MS foram realizadas. As concentrações do composto 1 nas câmaras de tampão e de extrato foram determinadas a partir das áreas de pico em relação ao padrão interno. Resultados

[00129] A fração não ligada (fu) foi calculada usando a seguinte fórmula:

34 / 36 onde, Atampão é a Área determinada por LC-MS/MS para a amostra a partir da câmara do tampão.

[00130] Ahomogenato cerebral é a Área determinada por LC-MS/MS para a amostra a partir da câmara de homogenato cerebral.

[00131] Compostos de referência: Haloperidol (alta ligação) e Cafeína (baixa ligação).

[00132] A fração livre do composto 1 no tecido cerebral foi 7% em ratos. Conclusão

[00133] O composto 1 está abundantemente livre no cérebro para exercer os efeitos farmacológicos. Exemplo 10: Perfil farmacocinético

[00134] O propósito deste exemplo é obter dados farmacocinéticos. Amostras de plasma foram retiradas tipicamente em 6 a 8 pontos de tempo (N = 3 a 4). As amostras foram analisadas usando uma curva padrão longa usando 10 padrões. As amostras de plasma foram precipitadas por proteína e diluídas usando um sistema de manuseio de líquido e, em seguida, análise usando LC-MS/MS. Ensaio Preparação de padrões

[00135] Dois conjuntos individuais de padrões foram tipicamente preparados nos seguintes níveis de concentração: 1, 3, 10, 100, 300, 1.000,

3.000, 5.000 e 10.000 ng/ml. O primeiro conjunto de padrões foi analisado no

35 / 36 início da execução e foi usado para calibração. O segundo conjunto de padrões foi analisado no final da execução e foi usado como CQ´s. Preparação da amostra de plasma

[00136] - 50 μl de plasma foram precipitados com 150 µl de padrão interno em acetonitrila - Em seguida, a centrifugação 25 min a 5 ºC a 16.000 g (tubos Eppendorf) ou placa de microtitulação a 3.000 g (MTP) - 50 μl de sobrenadante e 150 de água Milli-Q foram transferidos para um frasco de HPLC/MTP Resultados Critérios de aceitação

[00137] Cada ponto nas curvas de calibração varia naturalmente 15% do valor nominal (LLOQ pode variar 20%). Um ponto pode ser excluído se ele variar mais. A curva padrão deveria conter no mínimo 5 pontos e dois pontos consecutivos não podem ser excluídos. Os CQ´s têm os mesmos critérios de aceitação que os padrões na curva de calibração.

[00138] Os parâmetros farmacocinéticos foram calculados em WinNonlin. Tabela 2. Parâmetros farmacocinéticos. Composto 1 foi dosado em uma solução límpida de 30% de HP-Beta-CD e 5% de DMSO. Dose AUC(0-8h) C0 t½ Cl Vz Via B/P (mg/kg) (h*ng/ml) (ng/ml) (h) (l/h/kg) (l/kg) IV 0,5 985 863 4,3 0,38 2,4 0,5 Tabela 3. Parâmetros farmacocinéticos. Composto 1 foi dosado em uma solução límpida de 30% de HP-Beta-CD e 5% de DMSO. Dose AUC(0-24h) Cmax Tmax B/P (mg/kg) (h*ng/ml) (ng/ml) (h) 3h 1 1134* 163 4 0,4 3 8005 552 6 0,5 10 34528 2267 8 0,5 30 98537 6591 4 0,6 *AUC calculado 0 a 8h, concentração após 8h foi 149 ng/ml.

Conclusão

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[00139] O composto 1 apresenta longa meia-vida e baixa depuração em rato. O composto 1 também apresenta linearidade de dose (Cmax), alta exposição ao e alta exposição. Exemplo 11: Estudo de depuração intrínseca usando hepatócitos humanos e de rato

[00140] Neste ensaio, o composto 1 foi incubado com hepatócitos crioconservados para diferentes pontos de tempo e o desaparecimento do composto 1 foi monitorado por LC-MS/MS.

[00141] As condições usadas no ensaio estão sumarizadas a seguir.

[00142] - Concentração do composto no ensaio: 1µM - Tempo de incubações com hepatócito: 0, 15, 30, 60, 90 e 120 minutos a 37°C com 5% de CO2 - Densidade celular de hepatócito: 106 células/ml - Volume do ensaio: 500 µl - No. de replicatas: 2 - Composto de referência: Testosterona (alta depuração) Resultados Tabela 4. Depuração de hepatócitos em humano e rato. Depuração de hepatócitos Espécies Clint in vivo (µl/min/ Milhão de células) Humano 1,87 Rato 2,11 Conclusão

[00143] O composto 1 tem baixa depuração em hepatócitos humanos e de rato.

Claims (12)

REIVINDICAÇÕES

1. Composto, caracterizado pelo fato de ser da fórmula 1: 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

2. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto como definido na reivindicação 1.

3. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para uso em medicamento.

4. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento da dor neuropática.

5. Composto para uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a dor neuropática é alodinia.

6. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento de prurido.

7. Composto para uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o prurido é Pruritus.

8. Composto para uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o prurido é causado por uma condição da pele.

9. Composto para uso de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a condição da pele é psoríase.

10. Composto para uso de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a condição da pele é eczema.

11. Método para tratamento de dor neuropática e/ou prurido, caracterizado pelo fato de que compreende a administração do composto como definido na reivindicação 1 a um indivíduo em necessidade do mesmo.

12. Uso do composto como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para tratamento de dor neuropática e/ou prurido.