JP4921794B2

JP4921794B2 - Ｅｄ−７１製剤

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Publication number: JP4921794B2
Application number: JP2005517763A
Authority: JP
Inventors: 久和香月; 応生柴田; 和則村松; 明彦水谷; 剛山内; 公司鈴木
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2004-02-06
Filing date: 2005-02-07
Publication date: 2012-04-25
Anticipated expiration: 2025-02-07
Also published as: EP1714656A4; CN1938034A; HK1144179A1; EP1714656B1; KR20070003904A; WO2005074943A1; EP1714656A1; CN1938034B; HK1101139A1; ES2638836T3; CN101721708A; EP1714656B8; JP5529104B2; KR101166394B1; CN101721708B; US20070129340A1; JPWO2005074943A1; JP2012072169A; ES2638836T8

Description

本発明は、（５Ｚ，７Ｅ）−（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ）−２−（３−ヒドロキシプロポキシ）−９，１０−セココレスタ５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール（以下、「ＥＤ−７１」とも称する）を含有する製剤に関する。また、ＥＤ−７１のトランス型異性体である（５Ｅ，７Ｅ）−（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ）−２−（３−ヒドロキシプロポキシ）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール（以下、「トランス体」とも称する）にも関する。

（５Ｚ，７Ｅ）−（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ）−２−（３−ヒドロキシプロポキシ）−９，１０−セココレスタ５，７，１０（１９）−トリエンー１，３，２５−トリオールは、中外製薬株式会社により開発された骨形成作用を有する活性型ビタミンＤ₃の合成誘導体であり、骨粗鬆症治療薬として現在臨床試験中の薬物である（Ｂｏｎｅ，Ｖｏｌ．３０（４），５８２−５８８，２００２）。

ＥＤ−７１の製剤化においては、公知のビタミンＤ誘導体と同様に、ソフトカプセル剤などの製剤化手法を利用しうる。公知のビタミンＤ誘導体製剤については、例えば、１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールを含有する医薬組成物に０．０１〜５重量％のトコフェロール類を添加することにより、１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールを安定に保つことができるとの報告（特開平６−８７７５０）、アルファカルシドールを含有するソフトカプセル剤にｄｌ−α−トコフェロールとジブチルヒドロキシトルエンを１：１の重量比で、抗酸化剤の総量として０．００５％以上添加することにより、アルファカルシドールの保存安定性を向上させることが可能であるとの報告（特開平５−４９２５）などがある。しかしながら、これらは何れも、ビタミンＤ類の分解物の生成を抑制できるかについては触れられていなかった。

厚生労働省発行のガイドライン（ICH Harmonized Tripartite Guideline (Impurities in New Drug Products, Q3B(R), ICH Steering Committee, 2003）によると、製剤中のある分解物の含量が１％を越える場合は、その分解物の安全性を確認することが必須条件とされている。したがって、薬物の製剤化に際しては、製剤中の各分解物の含量がそれぞれ１％を越えないことが重要となる。

したがって、ＥＤ−７１の製剤化に際しても、単に有効成分であるＥＤ−７１の保存安定性を向上させるだけではなく、主分解物の生成を抑制することも実務上重要となる。

本発明は、ＥＤ−７１の分解物の生成を抑制しうる製剤化処方を提供することを目的とする。

本発明者らは、上述の問題点を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ＥＤ−７１の油脂中における主分解物が、下記の構造式で表されるＥＤ−７１のタキステロール型異性体：

（６Ｅ−（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ）−２−（３−ヒドロキシプロポキシ）−９，１０−セココレスタ−５（１０），６，８（９）−トリエン−１，３，２５−トリオール：以下、「タキステロール体」とも記する）、および、下記の構造式で表されるＥＤ−７１のトランス体：

（（５Ｅ，７Ｅ）−（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ）−２−（３−ヒドロキシプロポキシ）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール）であることを見出した。そして、ＥＤ−７１含有油状製剤において、抗酸化物質を添加することにより、これら分解物の生成を抑制できることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明によれば、（１）（５Ｚ，７Ｅ）−（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ）−２−（３−ヒドロキシプロポキシ）−９，１０−セココレスタ５，７，１０（１９）−トリエンー１，３，２５−トリオール；（２）油脂；および（３）抗酸化剤を含む製剤が提供される。

上記製剤において、（５Ｚ，７Ｅ）−（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ）−２−（３−ヒドロキシプロポキシ）−９，１０−セココレスタ５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオールの分解物の生成が抑制されることが好ましい。（５Ｚ，７Ｅ）−（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ）−２−（３−ヒドロキシプロポキシ）−９，１０−セココレスタ５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオールの分解物は、６Ｅ−（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ）−２−（３−ヒドロキシプロポキシ）−９，１０−セココレスタ−５（１０），６，８（９）−トリエン−１，３，２５−トリオールおよび／または（５Ｅ，７Ｅ）−（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ）−２−（３−ヒドロキシプロポキシ）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオールであってもよい。（５Ｚ，７Ｅ）−（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ）−２−（３−ヒドロキシプロポキシ）−９，１０−セココレスタ５，７，１０（１９）−トリエンー１，３，２５−トリオールの分解物が、６Ｅ−（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ）−２−（３−ヒドロキシプロポキシ）−９，１０−セココレスタ−５（１０），６，８（９）−トリエン−１，３，２５−トリオールおよび（５Ｅ，７Ｅ）−（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ）−２−（３−ヒドロキシプロポキシ）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオールであることが、好ましい。

あるいは、上記製剤において、（５Ｚ，７Ｅ）−（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ）−２−（３−ヒドロキシプロポキシ）−９，１０−セココレスタ５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオールの、６Ｅ−（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ）−２−（３−ヒドロキシプロポキシ）−９，１０−セココレスタ−５（１０），６，８（９）−トリエン−１，３，２５−トリオールおよび／または（５Ｅ，７Ｅ）−（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ）−２−（３−ヒドロキシプロポキシ）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオールへの分解が抑制されることが好ましい。

上記製剤において、抗酸化剤が、ｄｌ−α−トコフェロール、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、没食子酸プロピルから選ばれる１種であることが好ましく、ｄｌ−α−トコフェロールであることが更に好ましい。

上記製剤が、油状製剤であることが好ましく、ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤または油状液剤（特には、ソフトカプセル剤）であることが好ましい。

上記製剤において、（５Ｚ，７Ｅ）−（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ）−２−（３−ヒドロキシプロポキシ）−９，１０−セココレスタ５，７，１０（１９）−トリエンー１，３，２５−トリオールが油脂に対して０．０００００１〜０．０１重量％含まれ、抗酸化剤が油脂に対して０．０００１〜１２重量％含まれることが好ましい。

さらに、本発明の別の側面によれば、ＥＤ−７１のトランス型異性体である、（５Ｅ，７Ｅ）−（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ）−２−（３−ヒドロキシプロポキシ）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオールが提供される。

本発明のＥＤ−７１製剤により、ＥＤ−７１の分解物の生成を抑制しうる製剤化処方を提供することが可能である。トランス体は、ＥＤ−７１の製剤分析における標準品としても、また、種々のビタミンＤ系化合物の合成原料としても使用可能である。

以下、本発明のより具体的な態様、並びに本発明を実施するための方法につき説明する。

（５Ｚ，７Ｅ）−（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ）−２−（３−ヒドロキシプロポキシ）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール（ＥＤ−７１）は、下記の構造式で表される化合物である。

ＥＤ−７１は、例えば特開平１０−７２４３２号に記載された方法に従い、（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ）−２−（３−ヒドロキシプロポキシ）コレスタ−５，７−ジエン−１，３，２５−トリオールを出発物質として、紫外線照射及び熱異性化反応後、逆相ＨＰＬＣで精製し、濃縮後、酢酸エチルで結晶化させることにより得ることができる。

本発明に用いる「抗酸化剤」としては、亜硝酸塩（例えば亜硝酸ナトリウム）、亜硫酸塩（例えば亜硫酸ナトリウム、乾燥亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム）、チオ硫酸塩（例えばチオ硫酸ナトリウム）、アルファチオグリセリン、１，３−ブチレングリコール、チオグリコール酸およびその塩（例えばチオグリコール酸ナトリウム）、チオリンゴ酸塩（例えばチオリンゴ酸ナトリウム）、チオ尿素、チオ乳酸、エデト酸塩（例えばエデト酸ナトリウム）、ジクロルイソシアヌール酸塩（例えばジクロルイシアヌール酸カリウム）、クエン酸、システイン及びその塩（例えば塩酸システイン）、ベンゾトリアゾール、２−メルカプトベンズイミダゾール、エリソルビン酸およびその塩（例えばエリソルビン酸ナトリウム）、アスコルビン酸およびそのエステル化合物（例えばＬ−アスコルビン酸ステアリン酸エステル、パルミチン酸アスコルビン酸）、リン脂質（例えば大豆レシチン）、金属キレート剤およびその塩（例えば、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四酢酸カルシウム二ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム）、酒石酸およびその塩（例えばロッシェル塩）、ポリフェノール類（例えばカテキン）、グルタチオン、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、没食子酸プロピル、天然ビタミンＥ、酢酸トコフェロール、濃縮混合トコフェロール、トコフェロール同族体（例えばｄ−α−トコフェロール、ｄｌ−α−トコフェロール、５，８−ジメチルトコール、７，８−ジメチルトコール、δ−メチルトコール、５，７，８−トリメチルトコトリエノール、５，８−ジメチルトコトリエノール、７，８−ジメチルトコトリエノール、８−メチルトコトリエノール）などが挙げられ、これらを単独で或いは２種以上を組み合わせて用いることができる。この中でも、酢酸トコフェロール、ジブチルヒドロキシトレン、天然ビタミンＥ、ｄｌ−α−トコフェロール、ｄ−α−トコフェロール、濃縮混合トコフェロール、パルミチン酸アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸ステアリン酸エステル、ブチルヒドロキシアニソール、没食子酸プロピルから選ばれる１種が好ましく、ｄｌ−α−トコフェロール、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、没食子酸プロピルから選ばれる１種がより好ましく、ｄｌ−α−トコフェロールが特に好ましい。

本発明に用いられる「油脂」としては、中鎖脂肪酸トリグリセリド（以下、「ＭＣＴ」とも記す）、トリカプリリン、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、植物油等が挙げられる。ここで、植物油としては、ヤシ油、オリーブ油、菜種油、落下生油、コーン油、大豆油、綿実油、ぶどう油、紅花油等が挙げられる。これらのうち、不飽和脂肪酸を含んでいない、ＭＣＴ、トリカプリリン、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸が好ましく、ＭＣＴが特に好ましい。

本発明において「ＥＤ−７１の分解物」とは、ＥＤ−７１を油状製剤として保存した際に検出される主要な分解物をいい、具体的にはＥＤ−７１のタキステロール体およびＥＤ−７１のトランス体等である。

ＥＤ−７１のタキステロール体は、タキステロール骨格を有する下記の構造式で表される化合物であり、その化学名は６Ｅ−（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ）−２−（３−ヒドロキシプロポキシ）−９，１０−セココレスタ−５（１０），６，８（９）−トリエン−１，３，２５−トリオール）である。

タキステロール体は、例えば特開平１０−７２４３２号に記載された方法に従って合成することができ、或いは次の方法でも合成することができる。すなわち、（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ）−２−（３−ヒドロキシプロポキシ）−コレスタ−５，７−ジエン−１，３，２５−トリオールを出発物質として、そのテトラヒドロフラン溶液を低温、アルゴン雰囲気下、紫外線照射後、逆相ＨＰＬＣで精製し、濃縮乾固することにより、タキステロール体を得ることができる。

ＥＤ−７１のトランス体は、５−６位の二重結合がトランス配置である下記の構造式で表される化合物であり、その化学名は（５Ｅ，７Ｅ）−（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ）−２−（３−ヒドロキシプロポキシ）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオールである。

上述したように、薬物の製剤化に際しては、有効成分の各分解物の含量がそれぞれ１％を越えないことが重要となる。

本発明者らの検討によると、ＥＤ−７１をＭＣＴに溶解した溶液をソフトカプセルに内封した製剤を、「室温」の上限温度である３０℃で１２ヶ月保存した場合、タキステロール体およびトランス体の生成量はいずれも１％を越えたことから（後記の表２〜３参照）、ＥＤ−７１の製剤化に際しては、これら主分解物の生成を抑制することが必要である。つまり、ＥＤ−７１製剤の実用化に際しては、単にＥＤ−７１の分解を防ぐだけではなく、特に、タキステロール体およびトランス体への分解を防ぐことが重要である。

タキステロール体およびトランス体は逆相液体クロマトグラフィーにより検出し、測定波長２６５ｎｍにおける吸光度を測定することにより、これらの存在を確認することができる。

ＥＤ−７１の分解物の生成が抑制されている状態としては、室温、遮光下で１２ヶ月保存時のタキステロール体およびトランス体の生成量がそれぞれ１％以下であることが好ましく、０．３％以下であることがより好ましく、０．１％以下であることが特に好ましい。

本発明において「油状製剤」とは、薬物を油脂に溶解した溶液を、経口投与が可能な剤形に製剤化したものをいう。

本発明において利用可能な油状製剤としては、ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤、油状液剤等が挙げられる。

ソフトカプセル剤とは、ゼラチン等のフィルム形成成分を主成分とする皮膜に、薬物を油脂に溶解した配合液を封入したものをいう。ソフトカプセル剤の製法は、滴下法やロータリー・ダイ法等のソフトカプセルの製造が可能な製法であればいずれを用いてもよい。滴下法とは、カプセルの芯となる物質をカプセルの皮膜となる物質と同時にノズルから冷却液中へ滴下する際、界面張力によって二相液流が液滴となり、それが冷却されて皮膜が硬化しカプセルとなることを利用した方法である。ロータリー・ダイ法とは、２本の向かい合って回転する形成ローラーを連続したシート（ゼラチン等のゲル形成成分を含有するシート）が通過し、ローラーによってシートからカプセル形成体が押し抜かれ、同時に充填物は両方の押抜片の間に注入され、かつ押抜片の端部は熱作用により、相互に溶接され、シームソフトカプセルを形成する方法である。ビタミンＤ類のソフトカプセル剤およびその製造方法としては、例えば、国際公開公報ＷＯ０１／１５７０２号、国際公開公報ＷＯ０２／１３７５５号、国際公開公報ＷＯ０３／０９４８９７号、国際特許出願ＰＣＴ／ＪＰ０３／０７８８５号などに記載されたものを挙げることができる。

ハードカプセル剤とは、ゼラチン等のフィルム形成成分を主成分とするキャップとボディーからなる殻カプセルに、薬物を含有する溶液を充填し、溶液が漏れないようにキャップとボディーの重合部にゼラチン液等を塗りシールを施したものである。

ソフトカプセル剤およびハードカプセル剤の皮膜は、フィルム形成成分、可塑剤、遮光剤等からなり、これらを配合したものである。

フィルム形成成分は、各種ゼラチン等の動物由来成分であっても、各種水溶性高分子等の非動物由来成分であってもよく、これら成分を任意の割合で１種以上配合して用いることができる。動物由来成分とは、アルカリ処理ゼラチン、酸処理ゼラチン、化学修飾ゼラチン等が挙げられる。化学修飾ゼラチンとしては、その修飾様式は特に限定されないが、ゼラチンのアミノ基とコハク酸、フタル酸、酢酸等の物質を反応させて製造したものを用いることができる。化学修飾ゼラチンに用いるゼラチンはアルカリ処理ゼラチンでも酸処理ゼラチンであってもよい。非動物由来成分としては、寒天、カラギーナン、アルギン酸などの海藻から抽出される多糖類、ロースカトビーンガム、グアーガム、タマリンドガム、カシアガム、タラビーンガムなどの植物種子より得られる多糖類、アラビアガム、トラガントガム、アーモンドガム、ダムソンガムなどの植物が分泌する多糖類、ペクチン、アラビノガラクタン、グルコマンナンなどの植物から抽出される多糖類、ジェランガム、キサンタンガム、プルラン、デキストラン、カードランなどの微生物から得られる多糖類、結晶セルロース、メチルセルロース、カルボキシルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど繊維素粘質物などが挙げられる。

可塑剤としては、グリセリン、ソルビトール、マルトース、グルコース、マルチトース、蔗糖、キシリトール、マンニトール、エリスリトール、ポリエチレングリコール類（分子量４００〜６０００）等が挙げられ、本発明ではこれらの可塑剤を1種以上使用することができる。

遮光剤としては、酸化チタン、三二酸化鉄（ベンガラ）、黄色三二酸化鉄、黄酸化鉄、酸化亜鉛等の金属酸化物、タルク、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、ケイ酸マグネシウム、軽質無水ケイ酸等の無機化合物、カラメル、食用赤色３号アルミニウムレーキ、食用黄色４号アルミニウムレーキ、食用黄色５号アルミニウムレーキ、食用緑色３号アルミニウムレーキ、食用青色２号アルミニウムレーキ、銅クロロフィリンナトリウム等の食用色素等であり、本発明ではこれらの非水溶性遮光剤を1種以上使用することができる。

「油状液剤」とは、薬物を含有する油状溶液を密封容器（例えば、ガラス容器、プラスチック容器やスティック包装容器等）に充填したものである。

本製剤に用いる油脂の量は特に限定されないが、カプセル剤（ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤）については、１カプセル当たり５０〜５００ｍｇであることが好ましく、６０〜２５０ｍｇであることが特に好ましい。油状液剤の場合に用いる油脂の量としては、１容器当たり０．５〜５ｇであることが好ましく、１〜３ｇであることが特に好ましい。

製剤中に含まれるＥＤ−７１含量は特に限定されないが、単位製剤当たりのＥＤ−７１量として０．０５〜５μg含まれているものが好ましく、０．５〜０．７５μｇ含まれているものが特に好ましい。これを油脂中ＥＤ−７１濃度に換算すると、カプセル剤の場合は、０．００００１重量％以上が好ましく、０．０００２重量％以上が特に好ましく、０．０１重量％以下が好ましく、０．００１２５重量％以下が特に好ましい。油状液剤の場合は、０．０００００１重量％以上が好ましく、０．００００１７重量％以上が特に好ましく、０．００１重量％以下が好ましく、０．００００７５重量％以下であることが特に好ましい。

抗酸化剤の油脂への配合量も特に限定されないが、抗酸化剤として使用可能な最大使用量以下の量（例えば、医薬品添加物辞典（薬事日報社，２０００）に記載されている承認前例の最大使用量以下、食品添加物公定書（日本食品添加物協会，１９９９）に記載されている使用制限量以下の量など）を通常用いることができる。

中でも、ｄｌ−α−トコフェロールについては、カプセル剤の場合、油脂中に０．０００１重量％以上含まれていることが好ましく、０．００２重量％以上であることがより好ましく、０．０１重量％以上であることが特に好ましく、１２重量％以下含まれていることが好ましく、１重量％以下であることがより好ましく、０．１重量％以下であることが特に好ましい。油状液剤の場合は、油脂中に０．０００１重量％以上含まれていることが好ましく、０．００２重量％以上であることがより好ましく、０．０１重量％以上であることが特に好ましく、１．２重量％以下含まれていることが好ましく、１重量％以下であることがより好ましく、０．１重量％以下であることが特に好ましい。ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、没食子酸プロピル等についても、上記のｄｌ−α−トコフェロールと同様である。

なお、本出願が主張する優先権の基礎となる出願である特願２００４−３０７０２号の開示は全て引用により本明細書の中に取り込まれる。

以下に実施例を挙げて、本発明を具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。尚、以下の実施例において、ＥＤ−７１およびタキステロール体は、特開平１０−７２４３２号に記載の方法により合成したものを用いた。

実施例１：トランス体（（５Ｅ，７Ｅ）−（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ）−２−（３−ヒドロキシプロポキシ）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール）の合成および物性データ
（合成および精製方法）
ＥＤ−７１５００ｍｇを窒素雰囲気下、５０ｍＬナス型フラスコに入れ、そこに液体二酸化硫黄３０ｍＬを注入し、３時間還流(約−１５℃)攪拌した。二酸化硫黄を留去して、（５Ｚ，７Ｅ）−（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ）−２−（３−ヒドロプロポキシ）−６，１９−スルフォン−９，１０−セココレスタ−５（１０），７−ジエン−１，３，２５−トリオール（以下「二酸化硫黄付加体」と記す）を淡黄色固体として５６０ｍｇ得た。５０ｍＬナス型フラスコ中に、二酸化硫黄付加体２００ｍｇ、炭酸水素ナトリウム５００ｍｇ、エタノール２０ｍＬを加え、攪拌下２１０分間還流した。冷却後、不溶物を濾別し、溶液を濃縮乾固した。濃縮乾固物をエタノール１０ｍＬ、ジエチルエーテル１０ｍＬに溶解し、濾過後、溶液を濃縮乾固した。

乾固物を逆相系分取ＨＰＬＣ（装置：日立製作所製、カラム：ＫｒｏｍａｓｉｌＯＤＳ（ＫＲ１００−７−Ｃ１８，２５０×２０ｍｍＩ．Ｄ．，ＥｋａＣｈｅｍｉｃａｌｓ製）、移動相：５０％−アセトニトリル水溶液、流速：９．９９ｍＬ／ｍｉｎ、検出：ＵＶ＝２２０ｎｍ及び２６５ｎｍ）で展開処理し、５４分から６８分の溶出部分を分取した。分取液を濃縮乾固して約５０ｍｇの白色固体を得た。得られた白色固体は少量のエタノールと酢酸エチル０．５ｍＬを用いて溶解し、−２０℃設定の冷凍庫中で結晶化した。析出してきた結晶を分離し、微量の酢酸エチルで洗浄し、乾燥してトランス体３９ｍｇ（収率２２％）を得た。

（物性データ）
ＨＰＬＣ純度：９９．６％（ＨＰＬＣ条件：ＫｒｏｍａｓｉｌＯＤＳ１００−５Ｃ１８，５μｍ，４．６ｍｍＩ．Ｄ．×２５０ｍｍ、５５％アセトニトリル水溶液、流速０．９ｍＬ／分、２２０ｎｍ、１ｍｇ／ｍＬ１０μＬ、面積測定範囲４〜３０分）．
¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）（ｐｐｍ）：６．６３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ），５．８５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ），５．１８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１．８Ｈｚ），５．１３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１．８Ｈｚ），４．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），４．２８（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，３．６Ｈｚ，３．６Ｈｚ），３．７〜４．０（３Ｈ，ｍ），３．３４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，８．４Ｈｚ），１．２１（６Ｈ，ｓ），０．９３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），０．５６（３Ｈ，ｓ）．
¹³Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）（ｐｐｍ）：１４９．２，１４５．４，１３２．０，１２３．４，１１６．０，１０９．０，８４．２，７１．３，７１．１，６６．３，６１．２，５６．５，４５．９，４４．４，４０．５，３６．４，３６．０，３１．８，２９．３，２９．２，２９．１，２７．６，２３．５，２２．３，２０．８，１８．８，１８．４，１２．２．
ＵＶ（エタノール）（λｍａｘ）：２０９．８ｎｍ（ε１２３００），２７４．６ｎｍ（ε２３２００）．
ＩＲ（ＫＢｒ）（ｃｍ^-1）：３３６５，２９５１，２９３５，２８７７，２８４５，１６２８，１４６８，１４５８，１４３７，１３７５，１３６３，１３５０，１３３３，１２１５，１１２０，１０８０，１０５９，１０３４，９９７，９５８，９４７，９３３，９０４，８９１，８７２，７２９，７１５，６８３，６３８，６２７。

実施例２：ＥＤ−７１含有ソフトカプセル剤における主分解物の同定
（方法）
トリチウム標識したＥＤ−７１（２β−（[３−³Ｈ]−３−ヒドロキシプロピル）−１α，３β−２５−トリヒドロキシコレスタ−５、７、１０（１９）−トリエン（または、（５Ｚ，７Ｅ）−（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ）−２−（[３−³Ｈ]−３−ヒドロキシプロポキシ）−９，１０−セココレスタ５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオールとも標記する。以下「³Ｈ−ＥＤ−７１」と記す）を用い（Ｊ．ＬａｂｅｌｅｄＣｐｄ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．４２，５１９−５２５（１９９９））、これを未標識のＥＤ−７１とともにＭＣＴに溶解した（ＥＤ−７１濃度：１μｇ／１００ｍｇ，³Ｈ−ＥＤ−７１濃度：１．３８ＭＢｑ／ｍＬ）。この薬液を空のソフトカプセル（カプセル剤皮はゼラチン４７．６７ｍｇ，グリセリン１６．６８ｍｇおよび酸化チタン０．６５ｍｇから成るもので、ロータリー・ダイ法により製造したもの）に注射針付シリンジを用い充填し（０．０８ｍＬ／カプセル）、ゼラチンでシールし、４０℃／７５％ＲＨ、遮光下で、３３日間放置した。薬液中に生成した分解物を、ＵＶおよびＲＩ検出器を装備したＨＰＬＣ（島津製作所製）により検出した。

ＨＰＬＣ分析条件
カラム：ＹＭＣ−ＰａｃｋＯＤＳＡＭ−３０３（２５０×４．６ｍｍ，5 μｍ）、ＹＭＣ製
移動相：アセトニトリル／水=１：１
流速：１．２ｍＬ／分
ピーク検出：ＵＶ２６５ｎｍ，ＲＩ
カラム温度：３０℃
（結果）
４０℃／７５％ＲＨ下で３３日間放置後の薬液をＨＰＬＣにより測定したクロマトグラムを、それぞれ図１および図２に示す。ＲＩのクロマトグラムには、ＥＤ−７１に対応する主たるピークおよびプレ体に対応する１７分付近のマイナーピーク以外に、１６分付近と２４分付近にもそれぞれマイナーピークが検出された。これら２種のピークは４０℃／７５％ＲＨで保存する前のサンプルには検出されないこと、およびＲＩ−ＨＰＬＣで検出されたピークは³Ｈ−ＥＤ−７１由来のピークであることから、これら２種の成分がＥＤ−７１の主分解物であることが示唆された。１６分付近に溶出したピークは、タキステロール体の標準溶液を同一ＨＰＬＣ条件で分析した場合に検出された主ピークの溶出位置とほぼ一致したため、このピークはタキステロール体由来のピークであると考えられる。また、２４分付近に溶出したピークは、トランス体の標準溶液を同一ＨＰＬＣ条件で分析した場合に検出された主ピークの溶出位置とほぼ一致したため、このピークはトランス体由来のピークであると考えられる。

なお、ＥＤ−７１のプレ体（化学名：６Ｚ−（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ）−２−（３ヒドロキシプロポキシ）−９，１０−セココレスタ−５（１０），６，８（９）−トリエン−１，３，２５−トリオール）は、ＥＤ−７１と、油液中、水溶液中またはエタノールなどの有機溶媒中において平衡関係にある異性体として存在する化合物であり（特開平１０−７２４３２号）、下記の構造式で示される。

実施例３：
ＥＤ−７１含有製剤における主分解物の生成に及ぼす抗酸化剤の影響を調べるために、ＥＤ−７１および抗酸化剤を含有するＭＣＴ溶液を充填したソフトカプセル剤を各種条件で保存し、タキステロール体およびトランス体の生成挙動を評価した。

（処方）
表１に被験ソフトカプセルの処方を示す。ＥＤ−７１はＭＣＴに対して、０．０００１重量％となるよう配合した。抗酸化剤としては、ｄｌ−α−トコフェロール（和光純薬工業製）およびBHT（ジブチルヒドロキシトルエン）（和光純薬工業製）を、単独または併用して用いた。各抗酸化剤の添加量は、ＭＣＴに対してそれぞれ０．０２重量％となるように配合した。抗酸化剤を含有する処方を処方１、２、３とし、抗酸化剤を含有しない処方を対照処方１とした。

（ソフトカプセル製法）
ソフトカプセルは、シームレスカプセル充填機（スフェレックス、フロイント産業製）を用いて滴下法で、１カプセルあたりの薬液重量および皮膜重量がそれぞれ１００ｍｇおよび６５ｍｇとなるように製造した。

（保存条件）
ソフトカプセルをガラス瓶に約１００カプセルずつ入れ、密栓した状態および密栓しない状態で、３０℃／６０％ＲＨ、遮光下にそれぞれ１２ヶ月間保存した。

（タキステロール体、トランス体の確認法）
保存期間終了後に、各ソフトカプセルから薬液を抜き取り、そのうち５０μLをＨＰＬＣ分析に供した。

カラム：ＹＭＣ−ＰａｃｋＯＤＳＡＭ−３０３（２５０×４．６ｍｍ，5 μｍ）、ＹＭＣ製
移動相：アセトニトリル／水=１：１
流速：１．２ｍＬ／分
検出波長：２６５ｎｍ
カラム温度：３０℃
検出ピークエリアの総和に対するタキステロール体またはトランス体のピーク面積比を算出し、生成量の指標として用いた。

（ＥＤ−７１含量の測定法）
ED−７１含量を以下に示すＨＰＬＣ法により測定し、保存期間終了後の残存率を求めた。

・内部標準用液の調製法：
４−ヒドロキシ安息香酸ヘプチル約２ｍｇを精密に量り取り、エタノールを加え正確に１００ｍＬとした。この溶液をエタノールにより１０倍に希釈したものを内部標準溶液とした。

・標準溶液の調製法：
ＥＤ−７１標準品約２ｍｇを精密に量り取り、エタノールを加えて正確に２００ｍＬとした。この溶液２．５ｍＬを正確にとり、エタノールを加え正確に２０ｍＬとしたものを標準原液とした。

ＭＣＴ約３００ｍｇを１０ｍＬナシ型フラスコにとり、標準原液２ｍＬおよび内部標準溶液２ｍＬを加えた。これを室温にてエバポレータで１０分間以上減圧乾燥し、残留したＭＣＴ溶液を標準溶液とした。

・試料溶液の調製法：
カプセルから薬液を抜き取り、そのうち約３００ｍｇを精密に１０ｍＬナシ型フラスコに量り取った。これに内部標準溶液を正確に２ｍＬ加えた後、室温にてエバポレータで１０分間減圧乾燥し、残留したＭＣＴ溶液を試料溶液とした。

・ＨＰＬＣ分析条件：
試料溶液および標準溶液５０μLを、下記の条件でカラムスイッチング方式のＨＰＬＣ分析に供した。

カラム：ＹＭＣ−ＰａｃｋＯＤＳＡＭ−３０３（２５０×４．６ｍｍ，５μｍ）、ＹＭＣ製
移動相：（プレカラム）Ａ液にアセトニトリル・水混液（１：１）、Ｂ液にアセトニトリルを用いて、グラジエントによりＭＣＴを溶出する。

（分析カラム）：アセトニトリル・水混液（１：１）
流速：１．２ｍＬ／分
検出波長：２６５ｎｍ
カラム温度：２３℃．
（結果）
HPLCによる、タキステロール体、トランス体、ED−７１の検出結果を表２〜４に示す。

表２〜３から明らかなように、開放状態で１２ヶ月保存時の対照処方製剤におけるタキステロール体およびトランス体の生成量は、ピークエリア比としてそれぞれ、１．７４1％および２．０６％であったのに対し、処方２、３では、いずれも検出限界以下（０．１％）にまで抑制されていた。表４から明らかなように、処方１、２、３の方が対照処方に比べてＥＤ−７１の残存率も高かった。以上の結果から、抗酸化剤を添加した処方１、２、３では、いずれも対照処方に比べて、タキステロール体およびトランス体の生成が抑制されていることが示された。

実施例４：
ＥＤ−７１含有製剤における主分解物の生成に及ぼす抗酸化剤の添加量の影響を調べるために、ｄｌ−α−トコフェロールの添加量が異なるＥＤ−７１含有ＭＣＴ溶液を充填したソフトカプセルを各種条件で保存し、タキステロール体、トランス体の生成挙動を評価した。

（処方）
表５に被験ソフトカプセルの処方を示す。ＥＤ−７１はＭＣＴに対して、０．００１重量％となるよう配合した。抗酸化剤としては、ｄｌ−α−トコフェロール（エーザイ製）を用いて、ＭＣＴに対して０．００２％, ０．００５％, ０．０１％, ０．０２％および０．０４重量％となるように配合した（それぞれ、処方４，５、６、７，８）。ｄｌ−α−トコフェロールを含有しない処方を対照処方２とした。

（保存条件とタキステロール体、トランス体の確認法）
ソフトカプセルをガラス瓶に約１００カプセルずつ入れ、密栓した状態で、４０℃、遮光下に３ヶ月間保存した。保存期間終了後に、各ソフトカプセルから薬液を抜き取り、タキステロール体およびトランス体の生成量を実施例３に記載の方法で測定した。

（結果）
HPLCによる、タキステロール体、トランス体の検出結果を表６、７に示す。

表６、７から明らかなように、ｄｌ−α−トコフェロール添加量が０．００２重量％の場合でも、対照処方に比べて、タキステロール体およびトランス体の生成抑制効果が認められた。タキステロール体については、ｄｌ−α−トコフェロール添加量依存的な生成抑制効果が認められた。一方、トランス体の生成抑制効果は、ｄｌ−α−トコフェロールの添加量が０．０１％以上の領域ではいずれの添加量においてもトランス体の生成量は０．１％以下であった。以上の結果から、ｄｌ−α−トコフェロールはＥＤ−７１主分解物の生成を濃度依存的に抑制し、ｄｌ−α−トコフェロール添加量０．００２重量％においても、顕著な主分解物生成抑制効果を有することが示された。

実施例５：
ＥＤ−７１含有製剤における主分解物の生成に及ぼす各種抗酸化剤の効果を評価するために、ＥＤ−７１含有ＭＣＴ溶液に各種抗酸化剤を添加し、５０℃下で１ヶ月保存し、タキステロール体、トランス体の生成挙動を評価した。

（処方）
ＥＤ−７１はＭＣＴに対して、０．００１７重量％となるよう配合した。抗酸化剤としては、ｄｌ−α−トコフェロール（和光純薬工業製）、ジブチルヒドロキシトルエン（和光純薬工業製）、ブチルヒドロキシアニソール（和光純薬工業製）、没食子酸プロピル（和光純薬工業製）を、それぞれ単独で使用した。各抗酸化剤の添加量はＭＣＴに対して０．２重量%となるように配合した。抗酸化剤を含有する処方を処方９、１０、１１、１２とし、抗酸化剤を含有しない処方を対照処方３とした。

（保存条件とタキステロール体、トランス体の確認法）
上記処方９〜１２の各薬液の約１ｇを、それぞれスピッツ管に入れ、密栓し、５０℃、遮光下に１ヶ月間保存した。保存期間終了後に、各薬液中のタキステロール体およびトランス体の生成量を実施例３に記載の方法で測定した。

（結果）
HPLCによる、タキステロール体、トランス体の検出結果を表８に示す。

表８から明らかなように、いずれの抗酸化剤を使用した場合も、タキステロール体およびトランス体の生成は顕著に抑制された。

実施例６：
被験カプセルを下記処方のソフトカプセルとした以外は実施例４記載の方法に従って、ＥＤ−７１含有製剤を作成しタキステロール体、トランス体の生成挙動を評価した。いずれの処方においてもタキステロール体、トランス体の生成が抑制されていた。

本発明のＥＤ−７１製剤により、ＥＤ−７１の分解物の生成を抑制しうる製剤化処方を提供することが可能である。トランス体は、ＥＤ−７１の製剤分析における標準品として有用であり、また、種々のビタミンＤ系化合物の合成原料としても有用である。

４０℃／７５％ＲＨ下で３３日間放置後の薬液のＵＶ−ＨＰＬＣクロマトグラフ（２６５ｎｍ）を示す。４０℃／７５％ＲＨ下で３３日間放置後の薬液のＲＩ−ＨＰＬＣクロマトグラフを示す。

Claims

（５Ｚ，７Ｅ）−（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ）−２−（３−ヒドロキシプロポキシ）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール（ＥＤ−７１）含有油状製剤に抗酸化剤を加えることを含む、当該製剤においてＥＤ−７１の分解物である６Ｅ−（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ）−２−（３−ヒドロキシプロポキシ）−９，１０−セココレスタ−５（１０），６，８（９）−トリエン−１，３，２５−トリオールおよび／または（５Ｅ，７Ｅ）−（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ）−２−（３−ヒドロキシプロポキシ）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオールの生成を抑制する方法。
室温、遮光下で１２ヶ月保存時の前記製剤中の前記分解物の生成量がそれぞれ１％以下に抑制される、請求項１に記載の方法。