JP4508649B2 - コルチコトロピン放出因子レセプター2アゴニスト - Google Patents
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Description
現在までに、少なくとも2つのコルチコトロピン放出因子(CRF)レセプター(CRF1R及びCRF2R)が同定されており、これは、Gタンパク質結合レセプター(GPCR)クラスに属する。CRF1R及びCRF2Rのアゴニスト活性化によって、アデニレートサイクラーゼのGαS活性化がもたらされる。アデニレートサイクラーゼは、cAMPの形成を触媒し、次にこれがプロテインキナーゼAの活性化、細胞内カルシウム放出、及びマイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPキナーゼ)の活性化を含む多様な効果を有する。他の研究では、CRFレセプターのアゴニスト活性化後の細胞内イノシトールトリホスフェート合成の増強によって、CRFRもGαqに結合することが示唆される。
加えて、CRF2Rは、骨格筋萎縮の調節及び肥大の誘導に関与する。骨格筋は、作業又は代謝要件についての生理学的要求の変化に容易に適応する形成組織である。肥大とは、骨格筋量の増大をいうが、骨格筋萎縮とは、骨格筋量の減少をいう。急性の骨格筋萎縮の様々な原因としては:外科手術、ベッド上療養又は骨折に起因する非活動;脊椎損傷、自己免疫疾患又は感染性疾患に起因する除神経/神経障害;無関係の状態でのグルココルチコイドの使用;感染又は他の原因に起因する敗血症;疾病又は飢餓に起因する栄養制限;及びスペーストラベルが挙げられるが、これらに限定されない。骨格筋萎縮は、正常な生物学的プロセスを通じて生じるが、特定の医学的状況では、この正常な生物学的プロセスは結果として、筋萎縮のレベルを減弱することになる。例えば、急性の骨格筋萎縮は、整形処置に付随する固定が挙げられるが、それに限定されない固定のある患者のリハビリテーションに大きな限界を呈する。このような場合、骨格筋萎縮を逆転させるのに必要なリハビリテーション期間は、もとの傷害から回復するために必要な期間よりもかなり長いことが多い。このような急性の非活動性萎縮は、筋肉の機能及び量の実質的な加齢関連欠損を既に被っている可能性のある高齢者では特に問題である。なぜならこのような萎縮は、永続的な身体障害及び早発性の死亡をもたらし得るからである。
筋ジストロフィーとは、骨格筋衰弱の選択的分布によって臨床的に識別される、ある群の遺伝性、進行性の筋障害を包含する。筋ジストロフィーの2つの最も一般的な形態は、デュシェンヌ(Duchenne)型筋ジストロフィー及びベッカー(Becker)型筋ジストロフィーであり、その各々はXp21遺伝子座に位置するジストロフィー遺伝子における変異の遺伝から生じる。他のジストロフィーとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない:p94カルパイン、アドハリン(adhalin)、γサルコグリカン及びβサルコグリカンの遺伝子座を含む多数の遺伝子座の変異から生じる肢帯型筋ジストロフィー;顔面肩甲上腕筋ジストロフィー(ランドゥジー・デジュリン(Landouzy-Dejerine)筋ジストロフィー)、筋強直緊張性ジストロフィー及びエメリードレイフュス(Emery-Dreifus)筋ジストロフィー。ほぼ独占的に男性で生じるデュシェンヌ型筋ジストロフィーの症状としては、アヒル歩行、つま先歩行、脊柱前弯症、頻繁な転倒、ならびに起立及び着席の困難性が挙げられる。症状は3〜7歳で始まり、ほとんどの患者は10〜12年間車椅子に拘束されて、多くは呼吸の合併症によってほぼ20歳で死ぬ。デュシェンヌ型筋ジストロフィーに対する現在の治療としては、治癒的ではないが、筋の強度の低下を遅らせて、身体障害を遅らせる、プレドニゾン(コルチコステロイド薬)の投与が挙げられる。プレドニゾンのようなコルチコステロイドは、疾患から生じる筋繊維障害によって誘発される免疫細胞の活性化及び浸潤をブロックすることによって作用すると考えられる。残念なことに、コルチコステロイド治療は骨格筋の萎縮をも生じ、これはこれらの患者の免疫応答をブロックする潜在的利益の一部を打ち消してしまう。従って、筋ジストロフィーを有する患者において筋繊維障害を遅らせて、身体障害の発生を遅らせるが、現在の治療法よりも骨格筋萎縮を生じる程度が低い治療薬剤を同定する必要性は依然として存在する。
本発明は、CRF2Rアゴニストである、単離されたペプチドを提供する。具体的に本発明は、CRF、ウロコルチンI、ウロコルチンII、ウロコルチンIII、ソーバジン、ウロテンシンI又は関連のペプチド誘導体である、単離されたペプチド又はこのペプチドをコード化する核酸を提供する。本発明また、本発明の単離されたペプチドの安全且つ有効な量、及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。本発明はさらに、単位投薬形態の単離されたペプチド、及び使用説明書を備えるキットを提供する。
式(I):
α−β−γ−δ−ε−ζ−η−θ (I)
に従う、単離された非天然型ペプチドであって、ここで:
(a)αは、式X1X2X3X4X5X6の配列を含み;ここで:
X1、X2及びX3は各々、無、A、E、D、G、N、P、Q、S、T、及びZからなる群より選択され;
X4は、F、I、L、P、T、及びVからなる群より選択され;
X5は、A、I、P、S、T、及びVからなる群より選択され;
X6は、I、L、M、及びNからなる群より選択され;
(b)βは、式SX8DX10の配列を含み、ここでX8及びX10は各々独立して、I、L及びVからなる群より選択され;
(c)γは、X11X12X13の配列を含み;ここでX11は、P、T、V、及びSからなる群より選択され、そしてX12及びX13は、各々独立して、A、ナフチルアラニン(Naphthylalanine)(Bとして示される)、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、及びYからなる群より選択され;
(d)δは、式X14X15X16の配列を含み、ここで:
X14は、I、L、及びMからなる群より選択され;
X15は、L及びMからなる群より選択され;そして
X16は、S、N、Q、及びRからなる群より選択され;
(e)εは、式X17X18X19X20X21の配列を含み、ここで:
X17は、V、I、L、T、K、E、N、及びQからなる群より選択され;
X18は、L、M、V、A、及びTからなる群より選択され;
X19は、I、F、L、及びMからなる群より選択され;
X20は、D、E、N、及びHからなる群より選択され;そして
X21は、L、V、I、Q、M、及びRからなる群より選択され;
(f)ζは、式X22X23X24X25の配列を含み、ここで:
X22は、無、A、D、E、S、及びTからなる群より選択され;
X23は、無、K、及びRからなる群より選択され;
X24は、無、A、H、M、N、Q、T、及びYからなる群より選択され;
X25は、無、E、D、I、K、N、Q、及びRからなる群より選択され;
(g)ηは、式X26X27X28X29X30X31の配列を含み、ここで:
X26は、A、D、G、H、K、N、Q、及びSからなる群より選択され;
X27は、A、E、I、L、M、及びQからなる群より選択され;
X28は、A、H、K、Q、R、及びVからなる群より選択され;
X29は、A、E、K、N、M、及びQからなる群より選択され;
X30は、H、K、N、Q、及びRからなる群より選択され;
X31は、A及びKからなる群より選択され;
(h)θは、式X32X33NX35X36X37X38X39X40X41の配列を含み、ここで:
X32は、A、E、H、及びTからなる群より選択され;
X33は、A、D、E、I、L、N、Q、R、S、及びTからなる群より選択され;
X35は、A及びRからなる群より選択され;
X36は、E、H、I、K、L、N、Q、及びRからなる群より選択され;
X37は、F、I、L、M、及びYからなる群より選択され;
X38は、L、F、及びMからなる群より選択され;
X39は、A、D、E、N、及びQからなる群より選択され;
X40は、A、D、E、H、I、K、N、Q、R、S、及びTからなる群より選択され;
X41は、A、F、I、及びVからなる群より選択される、
ペプチド;
ならびにそれらの変異体。
表1は、CRFレセプターに結合する種々のタンパク質及びタンパク質フラグメントの配列を記載する。これらの選択された配列は、対応するジーンバンク(Genbank)又はダーウェント(Derwent)のアクセッション番号及びそれが報告されている動物種、ならびに同一又はほぼ同一のアミノ酸配列をコード化する関連のヌクレオチド配列のアクセッション番号とともに含まれる。本発明のこれらの公知の配列及び新規な配列をさらに配列表に示す。
以下は、本明細書において用いた用語の定義のリストである。
antiboy)」とは、その抗体に天然に付随する、タンパク質及び天然に存在する有機分子から部分的に又は完全に分離された抗体を意味する。
antibodies)」として既知の抗体が挙げられるがこれらに限定されない。ヒト化抗体としては、相補性決定領域移植として公知の技術によって作製されたキメラ抗体が挙げられるがこれらに限定されない。
Lett.)335:1〜5(1993))、又はCRHレセプター。
Natl.Acad.Sci.USA)92:2969〜2973(1995))。
associated)」といわれる。例えば、コード化配列及び調節配列は、それらが調節配列の影響又は制御下にコード化配列の転写を置くような方式で共有結合されている場合に、作動可能に会合されている。従って、プロモーター領域は、このプロモーター領域がそのDNA配列の転写を達成し得る場合にコード化配列と作動可能に会合され、その結果得られた転写物は、所望のペプチドへと翻訳され得る。
Acids Res.)25、3389〜3402、及びカーリン(Karlin)ら(1990)プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・USA(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87、2264〜2268)によって使用されるアルゴリズムを用いるBLAST(ベーシック・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール(Basic
Local Alignment Search Tool)解析によって決定される。ブラスト(BLAST)プログラムによって用いられるアプローチは、最初は、クエリー(問い合わせ)配列とデータベース配列との間に、ギャップ有り(非連続的)、及びギャップなし(連続的)の類似のセグメントを考慮して、次いで同定される全てのマッチの統計的な有意性を評価し、最後に予め選択した有意性の閾値を満たすマッチのみをまとめる。配列データベースの類似性検索における基本的な問題の考察については、アルトシュル(Altschul)ら(1994)ネイチャージェネティックス(Nature
Genetics)6,119〜129を参照のこと。ヒストグラム、ディスクリプション、アラインメント、期待値(すなわち、データベース配列に対するマッチを報告するための統計的有意性閾値)、且つトオフ、マトリックス及びフィルター(低複雑性)の検索パラメーターは、デフォールト設定である。blastp、blastx、tblastn、及びtblastxによって用いられるデフォールトスコアリングマトリックスは、ヌクレオチド又はアミノ酸の長さが85を上回るクエリー(問い合わせ)配列に対して推奨される、BLOSUM62マトリックスである(ヘニコフ(Henikoff)ら(1992)プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・USA(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89,10915〜10919)。
本発明は、式(I)
α−β−γ−δ−ε−ζ−η−θ (I)
に従う、単離された非天然型ペプチドを包含する。
in Enzymol.)154:367−382;米国特許第4,873,192号;ウォーカー(Walker)及びガストラ(Gasstra)編、(1983)分子生物学技術(Techniques
in Molecular Biology)(マクミラン・パブリッシング・カンパニー(MacMillan Publishing Company)、ニューヨーク)、ならびにそこに引用された参考文献を参照のこと。この変異体の1つの実施形態において、式(I)のペプチドの置換(単数又は複数)は、この変異体の生化学的な特性の破壊が最小限であるという点で保存的である。従って、変異を導入してアミノ酸残基を置換する場合、正に荷電された残基(H、K及びR)は好ましくは、正に荷電された残基で置換され;負に荷電された残基(D及びE)は好ましくは、負に荷電された残基で置換され;そして中性の非極性残基(A、F、I、L、M、P、V及びW)は好ましくは、中性の非極性残基で置換される。この変異体の別の実施形態では、このペプチドの全体的な電荷、構造又は疎水性/親水性特性は、CRF2Rアゴニズムに実質的に有害に影響することなく、変更することができる。なお別の実施形態において、この変異体は、式(I)のペプチドの活性フラグメントである。変異体のさらに別の実施形態において、式(I)のペプチドは、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン結合及び標識によって修飾される。その修飾は、このタンパク質のインビボもしくはインビトロの酵素処理によって、又は修飾されたアミノ酸を用いるこのペプチドの合成によって達成される。アミノ酸に対する修飾の通常の非限定的な例としては:チロシン、セリン及びトレオニン残基のリン酸化;リジン残基のメチル化;リジン残基のアセチル化;プロリン及びリジン残基の水酸化;グルタミン酸残基のカルボキシル化;セリン、トレオニン又はアスパラギン残基のグリコシル化;ならびにリジン残基のユビキチン結合。この変異体はまたエピトープタグ及びHisタグのような他のドメインを含んでもよい(例えば、このペプチドは融合タンパク質であってもよい)が挙げられる。
本発明のペプチドは、CRF2Rによって又はCRF2R活性によって調節される様々な疾患、障害及び状態の処置のために有用である。本明細書において用いる場合、「疾患(disease)」、「障害(disorder)」及び「状態(condition)」という用語は、交換可能に用いられる。本明細書において用いる場合、「CRF2Rによって調節された(modulated
by CRF2R)」又は「CRF2R活性によって調節された(modulated by CRF2R
activity)」という用語によって記載される障害は、障害、状態又は疾患であって、CRF2R活性が、この障害、又は疾患もしくは障害の生物学的兆候の1つ以上を緩和する有効な手段であるか;又は障害をもたらすかもしくは基礎にある障害の原因であるかのいずれかである生物学的カスケードの1つ以上の点を妨害する;又はこの障害の1つ以上の症状を緩和する、障害、状態又は疾患をいう。従って、「調節(modulation)」に供される障害としては、以下に関する障害が挙げられる:(1)CRF2R活性が、感染によって、照射によって、内部刺激によって、又は他のいくつかの原因によって遺伝的に変更されていようといまいと、CRF2R活性の欠失が、この障害又は1つ以上の生物学的兆候の「原因(cause)」である障害;(2)この疾患もしくは障害、又はこの疾患もしくは障害の観察可能な兆候(単数又は複数)が、CRF2R活性によって緩和される障害(CRF2R活性の欠失は、この疾患もしくは障害、又はその観察可能な兆候に原因として関連している必要はない);(3)CRF2R活性が、その疾患もしくは障害を生じるか又はその疾患もしくは障害に関連する生化学的カスケード又は細胞的カスケードの一部を妨害する障害。これに関して、CRF2R活性は、このカスケードを変更し、それによってこの疾患、状態又は障害を制御する。
さらに別の実施形態において、CRF2R調節性障害の治療としては、詳細には変形性関節症及び関節リウマチにおける関節炎が挙げられるがこれらに限定されない、関節に影響する障害が挙げられる。
さらに別の実施形態において、CRF2R調節性障害の治療としては、肥満及び糖尿病を含む代謝性疾患が挙げられる。
さらに別の実施形態において、CRF2R調節性障害の治療としては、以下が挙げられる:疼痛軽減;腫脹軽減;アレルギー反応;アレルギー;体温低下;食欲減退;うっ血性心不全;ストレス及び不安;望ましくない低レベルの副腎皮質刺激ホルモン(「ACTH」)分泌の変更;食欲、覚醒状態及び認知機能の制御;ならびに不安障害、拒食症及び憂鬱性抑うつのようなストレスの長期間の影響を防止すること。
Ninth Collegiate Dictionary)を参照のこと)。むしろ、本明細書において用いる場合、「予防する(preventing)」という用語は、本発明のペプチド及びキットの投与をCRF2R調節性障害の症状の発現の前に行なうことができるように、当業者がCRF2R調節性障害に罹り易い集団を同定する能力をいう。特定のCRF2R調節性障害のリスクのある集団は容易に同定可能である。例えば、筋ジストロフィーを発症するリスクのある集団は、この障害の遺伝子特徴における変異を同定することによって決定することができる。例えば、そして以前に考察されたように、デュシェンヌ(Duchenne)型及びベッカー(Becker)型のジストロフィーは、Xp21遺伝子座に位置する、ジストロフィー遺伝子における変異の遺伝から生じる。これらの変異を保有する集団の個体は、筋ジストロフィーを発症するリスクにある。従って、患者集団は同定可能であり、そして疾患の進行の前に本発明のキットの組成物又は単位用量形態の投与を受けることができる。このように、このような個体における筋萎縮又は消耗の進行は、「予防される(prebented)」。
本発明はさらに、式(I)のペプチド、及びその変異体をコード化する核酸分子を、好ましくは単離型で提供する。本明細書において用いる場合、「核酸(nucleic
acid)」は、上記のように本発明のペプチドをコード化するか、このようなペプチドをコード化する核酸配列に相補的である、RNA又はDNAとして規定される。特に意図されるのは、ゲノムDNA、cDNA、mRNA及びアンチセンス分子、ならびに別の骨格に基づく核酸であり、又は天然の供給源に由来しようと、もしくは合成されようと代替的な塩基を含む。
本発明のペプチドは、CRF2R調節性障害の治療のための薬学的試薬としての使用が挙げられるがこれらに限定されない、様々な使用のために調製され得る。本発明の特定の実施形態については、精製されたペプチドが最も有用であるが、他の実施形態ではこのペプチドを発現する細胞株が最も有用であることが当業者には明白である。
of Peptide Synthesis)、シュプリンガー出版(Springer-Verlag)、ハイデルベルク(Heidelberg)(1984);及び、例えば、固相合成を介して、例えば、メリーフィールド(Merrifield)、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイェティ(J.Am.Chem.Soc.)85:2149〜54(1963);バラニー(Barany)ら、インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペプチド・アンド・プロテイン・リサーチ(Int.J.Peptide
Protein Res.)30:705〜739(1987);及び米国特許第5,424,398号。
Technology,Inc)(PTI)のマルチリアクターシンセサイザー(モデル シンフォニー(商標)(Symphony(商標))のいずれを用いて合成することもできる。ABIシンセサイザーを用いて合成されたペプチドに関して、全ての試薬はABIから購入する(ただし、ピペリジンは、アルドリッチ(Aldrich)から購入する)。Fmocアミノ酸は、ABIから購入する(ただし、Fmoc−L−Pyrは、ケム−インペック(Chem-Impek)から購入する)。リンク(Rink)アミド残基は、ノバ・ケミカルズ(Nova
Chemicals)から購入する。単一の且つプリングを用いる標準的な0.1mmoleのFast Moc化学を用いる。SPPS(固相ペプチド合成)についての一般的なFmoc化学プロトコールは、:1)ピペリジンを用いたFmocタンパク質基の切断;2)アミノ酸のカルボキシル基の活性化;及び3)ペプチド結合を形成するための、樹脂結合したペプチド鎖のアミノ末端への活性化アミノ酸の且つプリングを含む。2−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)を用いてアミノ酸を活性化する。カートリッジ中で乾燥保護したアミノ酸(1.0mmol)を、HBTU、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)及び1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)を含有するN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)にさらにN−メチルピロリドン(NMP)を添加した溶液中で溶解する。活性化されたFmocアミノ酸はほぼ即時に形成され、そしてこの溶液を反応容器に直接移す。Fmoc脱保護の工程を伝導率測定によってモニターして制御する。C末端アミドが必要なので、リンク(Rink)アミド樹脂上にペプチド鎖を構築する。NMP及びジクロロメタン(DCM)を用いて、最終生成物を徹底的に洗浄する。
System Gold)の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)システムを用いる。アセトニトリルの直線勾配をプログラムして、カラムに導入して、ペプチド産物を他の物質から分離する。溶出物をファルマシア(Pharmacia)フラクションコレクターで収集して、個々の分離画分を特徴付けのために分析的HPLC及び(マトリックス支援レーザーイオン化飛行時間型質量分析計)MALDI−TOF MSの両方に供して、同一性及び純度を確認した。
Cloning-A Laboratory Manual)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor
Laboratory Press)(1989)を参照のこと。本発明の組み換えペプチドを発現するために、1つ以上の調節エレメントの制御下に目的のポリペプチドをコード化する核酸を含む発現ベクターを調製する。本発明のペプチドをコード化する核酸の配列は、本明細書において考察されるか又は請求されるペプチド配列から推定することができる。
本発明のペプチドの1つ以上のエピトープを選択的に認識する抗体も、本発明に包含される。このような抗体としては、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fab発現ライブラリーを用いて生成された分子、トランスジェニックマウスで生成されたヒト抗体(ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体)、及び上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられる。
この抗体を遺伝子治療技術と組み合わせて利用して、例えば、これらの遺伝子が導入されている細胞で、又は患者組織で直接、本発明のペプチドの発現を評価することができる。
本発明のペプチドの薬理学的活性及び選択性は、公開された試験手順を用いて決定することができる。例えば、米国特許出願第09/799978号を参照のこと。CRF2R及びCRF1Rは、相同なタンパク質であるので、CRF2Rのアゴニストの特定の割合がまたCRF1Rのアゴニストとして機能することが予想される。上記で考察したように、CRF1Rの活性は、HPA系の活性化を誘導する。なぜならコルチコステロイド産生の増大は、骨格筋萎縮をもたらすからである。筋量又は筋機能の増大が所望されるほとんどの場合、HPA系を活性化することは所望されない。筋ジストロフィーに関連しない、CRF2R調節性障害の治療に有用なペプチドを選択する場合、このペプチドがCRF2Rに選択性であることが好ましい。好ましくは、このペプチドは、CRF2R対CRF1Rについて10倍の選択性(すなわち、CRF1Rに対してよりもCRF2Rに対して10倍大きい活性)、より好ましくは100倍の選択性、そして最も好ましくは1000倍以上の選択性を示す。公表された研究では、筋ジストロフィーの治療におけるコルチコステロイド療法の利益が実証されているので、CRF2Rアゴニストは、筋ジストロフィーを治療するために用いられる場合、同じレベルのCRF1Rアゴニズムを保持しているという利点があるかもしれない。従って、筋ジストロフィーの治療のためには、同様の濃度範囲にわたって、CRF2R及びCRF1Rを活性化する選択性のさらに低いペプチドが好ましい。好ましくは、このペプチドは、CRF2R対CRF1Rについて100倍選択性であり、より好ましくはCRF2R対CRF1Rについて10倍選択性、そして最も好ましくは選択性でない(すなわち、この候補化合物の活性は実質的に、CRF2R及びCRF1Rについて同様である)。また、この場合、ペプチドがCRF2Rの完全なアゴニストであるが、CRF1Rの部分的なアゴニストであることがさらに好ましいかもしれない。従って、このようなペプチドは、コルチゾール上昇の最大程度及び筋萎縮の可能性に対する本来備わった限界を有するが、一方CRF2Rを通して調節された抗萎縮効果はこの用量を増大することによって強化することができる。当業者は、当該分野で既知の方法を用いてペプチドがCRF1R又はCRF2Rの完全なアゴニストであるか又は部分的アゴニストであるかを容易に決定することができる。
Fluorescent Protein))、又はアルカリホスファターゼが挙げられるがこれらに限定されない。ペプチドに対して細胞を曝した後、レポーター遺伝子発現のレベルを定量して、ペプチドがcAMPレベルを増大する能力を決定することが可能で、これによってこのペプチドがCRFRを活性化する能力を決定することができる。
Pharmacol.Sci.)20:383〜389(1999)。この細胞はまた好ましくは、例えば、CRFレポーター遺伝子の強力な誘導を検出するためにCRF又はCRFアナログによる誘導性応答を最大化するように、読み取り値に依存して多数の特徴を保有する;(a)低い天然のレベルのcAMP;(b)CRFRと相互作用し得るGタンパク質;(c)高レベルのアデニリルシクラーゼ;(d)高レベルのプロテインキナーゼA;(e)低レベルのホスホジエステラーゼ;及び(f)高レベルのcAMP応答エレメント結合タンパク質が有利である。CRF又はCRFアナログに対する応答を増大するように、宿主細胞を操作して、より大量の好ましい因子を発現させるか、又は望ましくない因子の発現を少量にさせることができる。さらに、CREレポーターの誘導のための別の経路を、基礎レベルを低下するように排除してもよい。
本発明のペプチドの薬理学的な活性を、公表された試験手順を用いて決定することができる。例えば、骨格筋の萎縮又は肥大のモデルとしては、骨格筋萎縮のインビトロ細胞培養モデル及びインビボ動物モデルの両方が挙げられる。
Vitro)、24:609〜619(1988)、ファンデンベルク・エイチ・エイチ(Vandenburgh,H.H.)ら、ジャーナル・オブ・バイオメカニクス(J.Biomechanics)、24補遺1:91〜99(1991)、ファンデンベルク・エイチ・エイチ(Vandenburgh,H.H)ら、インビトロ・セルラー・アンド・デベロップメンタル・バイオロジー(In
Vitro Cell. Dev. Biol.)、24(3):166〜174(1988)、クロミアク・ジェイ・エイ(Chromiak,J.A.)ら、インビトロ・セルラー・アンド・デベロップメンタル・バイオロジー・アニマル(In
Vitro Cell.Dev.Biol.Anim.)、34(9):694〜703(1998)、シャンスキイ・ジェイ(Shansky,J.)ら、インビトロ・セルラー・アンド・デベロップメンタル・バイオロジー・アニマル(In
Vitro Cell.Dev.Biol.Anim.)、33(9):659〜661(1997)、ペロン・シー・イー(Perrone,C.E.)ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.)270(5):2099〜2106(1995)、クロミアク・ジェイ・エイ(Chromiac,J.A.)及びファンデンベルク・エイチ・エイチ(Vandenburgh,H.H.)、ジャーナル・オブ・セル・フィジオロジー(J.Cell.Physiol.)、159(3):407〜414(1994)及びファンデンベルク・エイチ・エイチ(Vandenburgh,H.H.)及びカーリッシュ・ピー(Karlisch,P.)、インビトロ・セルラー・アンド・デベロップメンタル・バイオロジー(In
Vitro Cell.Dev.Biol.)、25(7):607〜616(1989)。
Medicine)10:42〜58(1990)、ハッセルグレン・ピー・オー(Hasselgren,P-O.)及びフィッシャー・ジェイ・エイチ(Fischer,J.E.)ワールド・ジャーナル・オブ・サージェリー(World
J.Surg.)22:203〜208(1998)、アグベニエガ・イー・ティー(Agbenyega,E.T.)及びワレンハム・エー・シー(Wareham,A.C.)コンパラティブ・バイオケミストリー・アンド・フィジオロジー(Comp.Biochem.Physiol.)102A:141〜145(1992)、トマソン・ディー・ビー(Thomason,D.B.)及びブース・エフ・ダブリュ(Booth、F.W.)ジャーナル・オブ・アプライド・フィジオロジー(J.Appl.Physiol.)68:1〜12(1990)、フィッツ・アール・エイチ(Fitts,R.H.)ら、ジャーナル・オブ・アプライド・フィジオロジー(J.Appl.Physiol.)60:1946〜1953(1986)、ブラマンチ・ピー(Bramanti,P.)ら、イタリアン・ジャーナル・オブ・アナトミー・アンド・エンブリオロジー(Int.J.Anat.Embryol.)103:45〜64(1998)、カルッティー・ジー・ディー(Cartee,G.D.)ザ・ジャーナル・オブ・ゲロントロジー・シリーズ・エイ・バイオロジカル・サイエンス・アンド・メディカル・サイエンス(J.Gerontol.A
Biol.Sci.Med.Sci.)、50:137〜141(1995)、コーク・エル・シー(Cork,L.C.)ら、プログレス・イン・クリニカル・アンド・バイオロジカル・リサーチ(Prog.Clin.Biol.Res.)229:241〜269(1987)、ブース・エフ・ダブリュ(Booth,F.W.)及びゴルニック・ピー・ディー(Gollnick,P.D.)メディシン・アンド・サイエンス・イン・スポーツ・アンド・エクササイズ(Med.Sci.Sports
Exerc.)、15:415〜420(1983)、ブルームフィールド・エス・エイ(Bloomfield,S.A.)メディシン・アンド・サイエンス・イン・スポーツ・アンド・エクササイズ(Med.Sci.Sports
Exerc.)29:197〜206(1997)。これらのモデルのための好ましい動物は、マウス及びラットである。これらのモデルとしては、肢を型固定(キャスティング)するかさもなければ固定すること、後肢懸垂、完全な動物の不動化、及び重力状態の軽減のような、例えば、非活動誘導性萎縮のモデルが挙げられる。神経障害誘導性の萎縮のモデルとしては、例えば、神経挫滅、特定の筋を支配する神経の一部の除去、神経への毒素の付与、及びウイルス、細菌又は真核生物感染性因子による神経の感染が挙げられる。グルココルチコイド誘導性萎縮のモデルとしては、動物に対する外因性グルココルチコイドの萎縮誘導用量の付与、例えば、視床下部−下垂体−副腎(HPA)系を活性化するホルモンの付与による、内因性コルチコステロイド産生の刺激が挙げられる。敗血症誘導性萎縮のモデルとしては、例えば、細菌のような敗血症誘導性の生物体での接種、細菌細胞壁抽出物又は内毒素(エンドトキシン)のような免疫活性化化合物による動物の治療、及び腸壁の穿刺が挙げられる。悪液質誘導性萎縮のモデルとしては、例えば、悪液質形成能を有する腫瘍形成性細胞による動物への接種、悪液質を生じる感染性因子(例えば、AIDSを生じるウイルス)を用いた動物の感染、及び悪液質を誘導する、CNTF、TNF、IL−6、IL−1などのようなホルモン又はサイトカインによる動物の治療が挙げられる。心不全誘導性萎縮のモデルとしては、心不全が骨格筋萎縮を伴って生じるような動物の操作が挙げられる。神経変性性疾患誘導性萎縮のモデルとしては、自己免疫動物モデル、例えば、神経成分による動物の免疫から生じるモデルが挙げられる。萎縮の筋ジストロフィー誘導性モデルとしては、筋ジストロフィーの天然の又は人為的な遺伝的に誘導されたモデル、例えば、Mdxマウスで生じるジストロフィン遺伝子の変異が挙げられる。
Alto)、カリフォルニア)の埋め込みを介する持続注入によって投与して、除神経誘導性骨格筋萎縮に対する試験ペプチドの影響を決定する。除神経後の種々の時点で、動物を安楽死させて、下肢の筋肉を、除神経した脚及び除神経していない脚の両方から迅速に切り出し、この筋肉から腱及び結合組織を除去して、秤量する。罹患した筋肉における萎縮の程度を、例えば、筋質量、筋断面積、筋原繊維断面積、又は収縮性タンパク質含量の測定によって解析する。
Alto)、カリフォルニア)の埋め込みを介する持続注入によって投与して、型固定誘導性骨格筋萎縮に対する試験ペプチドの影響を決定する。脚の型固定後の種々の時点で、除神経モデルについて上記されたように、罹患した筋肉における萎縮の程度を解析する。
本発明の別の局面は、以下を含む組成物である:(a)本発明の安全且つ有効な量のペプチド;及び薬学的に許容可能なキャリア。レミントンの薬学書(Remington's
Pharmaceutical Sciences)、マック・パブリッシング・カンパニー(Mack Publishing Company)、ペンシルバニア州、イーストン(Easton,Pa.)最終版に開示されるような、標準的な薬学的処方の技術が用いられる。
B.)、臨床研究及び開発プロトコールのガイド(Guide to Clinical Studies and Developing Protocols)、ラバン・プレス・ブック・エルティーディー(Raven
Press Books,Ltd.)、ニューヨーク(New York)、1984、pp.7〜13、54〜60;スピルカー・ビー(Spilker B.)、クリニカルトライアルガイド(Guide
to Clinical Trials)、ラバン・プレス・ブック・エルティーディー(Raven Press,Ltd.)、ニューヨーク(New York)、1991、pp.93〜101;クレイグ・シー(Craig
C.)及びアール・スティッツェル(R.Stitzel)編、現代薬理学(Modern Pharmacology)、第二版、リトル・ブラウン・アンド・コーポレイテッド(Little、Brown
and Co.)、ボストン(Boston)、1986、pp.127〜33;ティー・スペート(T.Speight)編、アベリーズ薬物治療:臨床薬理学及び治療の原理及び実践(Avery’s
Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and
Therapeutics)第3版、ウィリアムス・アンド・ウィルキンス(Williams and Wilkins)、ボルチモア(Baltimore)、1987、pp.50〜56;アール・タラリダ(R.Tallarida)、アール・ラファ(R.Raffa)及びピー・マクゴニグル(P.McGonigle)、一般薬理学における原理(Principles
in General Pharmacology)、シュプリンガー出版(Springer-Verlag)、ニューヨーク(New York)、1988、pp.18〜20。
carrier)」という用語は、本明細書において用いる場合、1つ以上の適合可能な固体又は液体の充填剤希釈剤又はカプセル化物質であって、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトへの投与に適切なものを意味する。「適合する(compatible)」という用語は、本明細書において用いる場合、この組成物の成分が、本発明のペプチドと混合可能であり、且つこのとき、通常の使用状況のもとでこの組成物の薬学的有効性を実質的に低下させる相互作用がないような方式でお互いに混合することが可能であることを意味する。薬学的に許容可能なキャリアは、当然ながら、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくは治療されているヒトに対する投与に適切になるように、実質的に高純度で且つ十分に低い毒性でなければならない。
本発明のペプチドが注射される場合、好ましい薬学的に許容可能なキャリアは滅菌の生理食塩水であって、血液適合性のコロイド性懸濁化剤を有し、そのpHは約7.4に調節されている、生理食塩水である。
Pharmaceutics)第9章及び10章(バンカー(Banker)&ロード(Rhode)編、1979);リーバーマン(Lieberman)ら、薬剤投薬形態(Pharmaceutical
Dosage Forms):錠剤(Tablets)(1981);及びアンセル(Ansel)、薬剤投薬形態の紹介(Introduction to
Pharmaceutical Dosage Forms第二版(1976)。
agents)及び溶融剤を含む。液体の経口投薬形態としては、水溶液、エマルジョン、懸濁液、溶液、及び/又は非発泡性顆粒(non-effervescent
granules)から再構成された懸濁液、発泡性顆粒から再構成された発泡性調製物が挙げられ、これは、適切な溶媒、防腐剤(保存剤)、乳化剤、懸濁剤、希釈剤、甘味料、溶融剤、着色剤、及び着香料を含む。
本発明の組成物は必要に応じて、他の活性剤を含んでもよい。活性剤の非限定的な例は、PCT国際公開特許WO99/15210に列挙される。
本発明はまた、被験体に安全且つ有効な量のペプチドを投与することによって、ヒト又は他の動物被験体において、CRF2R調節性障害を治療する方法を提供する。本発明の方法は、上記の障害を予防又は治療するのに有用である。
Applications of Controlled Release)、CRC・プレス(CRC Pres.)、フロリダ州ボカ・ラトン(Boca
Raton,Fla.)(1974);セフトン(Sefton)、CRC・クリティカル・レビュー・イン・バイオメディカル・エンジニアリング(CRC
Crit.Ref.Biomed.Eng.)、14:201(1987);バックウォルド(Buchwald)ら、サージェリー(Surgery)、88:507(1980);ソーデック(Saudek)ら、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディスン(N.Engl.J.Med.)321:574(1989)。別の実施形態において、ポリマー材料を用いてもよい。ランガー(Langer)、1974、前出;セフトン(Sefton)、1987、前出;スモーレン(Smolen)ら編、制御された薬物バイオアベイラビリティー、薬物作製デザイン及び能力(Controlled
Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance)、ウィリー・エヌ・ワイ(Wiley,N.Y.)(1984);レンジャー(Ranger)ら、ジャーナル・オブ・マクロモレュラー・サイエンス・レビュー・イン・マクロモレキュラー・ケミストリー(J.
Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.)23:61(1983);以下も参照のこと:リービ(Levy)ら、サイエンス(Science)228:190(1985);ダーリング(During)ら、アナルズ・オブ・ニューロロジー(Ann.Neurol.)25:351(1989);ハワード(Howard)ら、ジャーナル・オブ・ニューロサージェリー(J.
Neurosurg.)71:105(1989)。さらに別の実施形態において、徐放性システムを、治療標的の近位に配置してもよく、これによって全身用量のわずかな画分しか必要でなくなる。例えば、グッドソン(Goodson)の徐放性放出の医学的適用(Medical
Applications of Controlled Release)第二巻、第115〜138頁(1984)を参照のこと。さらに別の実施形態において、ポリマーベースの薬物送達システムでは、薬物は、ポリマー又は脂質システムから送達される。これらのシステムは、以下の3つの一般的機構によって薬物を送達する:(1)このシステムから、又はこのシステムを通じた薬物種の拡散;(2)このシステムの分解をもたらす化学反応もしくは酵素反応、又はこのシステムからの薬物の切断;及び(3)このシステムの浸透性又は膨張のいずれかを通じた溶媒活性化。適切なシステムは、以下の引用文献に記載されている:ランガー(Langer)、ロバート(Robert)、「薬物送達及び標的化(Drug
delivery and targeting)」、ネイチャー(Nature):392(補遺):5〜10(1996);クマー(Kumar)、マエティ・エヌ・ヴィー(Majeti
N.V.)「徐放性薬物送達デバイスとしてのナノ粒子よびマイクロ粒子(Nano and Microparticles as Controlled Drug
Delivery Devices)」J Pharm Pharmaceut Sci、3(2):234〜258(2000);ブランノン−ペパース(Brannon-Peppas)、「徐放性薬物送達におけるポリマー(Polymers
in Controlled Drug Delivery)」、医療用プラスチック及び生体材料(Medical Plastics and Biomaterials)(1997年、11月)。また、ランガー(Langer)、1990、前出;Treatらの感染性疾患及び癌の治療におけるリポソーム(Liposomes
in the Therapy of Infectious Disease and Cancer)、ロペス−ベレステイン(Lopez-Berestein)及びフィドラー(Fidler)編、リス(Liss)、ニューヨーク、353〜365頁(1989);ランガー(Langer)、サイエンス(Science)、249:1527〜1533(1990)も参照のこと。適切なシステムとしては、以下を挙げることができる:アトリックス・ラブズ(Atrix
Labs)のアトリゲル(Atrigel)(商標)薬物送達システム;スカイファーマ(SkyPharma)のデポフォーム(DepoFoam)(商標);インファイムド・セラピューティクス・インコーポレイテッド(Infimed
Therapeutics,Inc.)のポリエチレングリコールベースのヒドロゲル;マクロメド(MacroMed)のReGel(商標)、SQZGez(商標)経口、HySolv(商標)、及びReSolv(商標)可溶化薬物送達システム;プロゲルツ・プロダクツ(ProGelz'
Products)のProGelz(商標);及びアルケルムス(Alkermes)の注射可能なProLease(商標)。
遺伝子治療の一部として細胞に本発明の核酸を導入するために、発現ベクターを用いてもよい。このようなベクターは一般に、核酸配列の挿入を行なうために、プロモーター配列の近位に配置される好都合な制限部位を有している。転写開始領域、標的遺伝子又はそのフラグメント、及び転写終止領域を含む転写カセットを調製してもよい。転写カセットは、様々なベクター、例えば、プラスミド、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスなど中に導入することが可能であり、ここで、ベクターを細胞中で一過性に又は安定に、通常少なくとも約1日、より好ましくは通常少なくとも約数日〜数週間、維持することができる。
gun)」によって皮内に送達してもよい。例えば、タン(Tang)ら、ネイチャー(Nature)356:152〜154(1992)を参照のこと、ここでは金微粒子銃をDNAでコーティングし、続いて皮膚細胞にボンバードメントしている。
本発明は、CRF2R調節性障害を予防又は治療するためのキットを備え、このキットは以下:(a)単位用量形態の式(I)のペプチド;及び(b)使用説明書を備える。このようなキットは好ましくは、多数の単位投薬量を含む。このようなキットは、その意図する用途の順序で並べられた投薬量を記入したカードを備えてもよい。このようなキットの例は、「ブリスターパック(blister
pack)」である。ブリスターパックは、包装産業では周知であり、薬学的な単位投薬形態を包装するために広範に用いられる。所望の場合、記憶補助が、例えば、数、文字、もしくは他の印の形で、又はカレンダーの挿入によって提供されて、これが投薬を行ない得る治療スケジュールの日にちを示してもよい。キットの例はPCT国際公開特許WO01/45636に記載される。治療スケジュールは、医療技術の当業者の権限の範囲内である。非限定的な例としては、毎日、毎週、隔週、毎月、又は隔月が挙げられる。
ソーバジン及び他の非選択性のCRFRアゴニストは一般にCRF2R調節性障害の治療において有効ではない。なぜなら、これらのアゴニストはまたCRF1Rを活性化し、それによって望ましくない副作用を生じるからである。
表3は、本発明の種々の実施形態の競合的CRF結合を示す。
(インビトロ有効性の増大)
本発明のペプチドは、公知のネイティブな配列、例えばUroIIペプチドフラグメント(配列識別番号4)に比べて、特に低用量の条件下で、拡大された生物学的可用性を示す。
Claims (11)
- 下記配列(1):
IVLSLDVPIGLLQILLEQEKX21X22X23X24X25X26QATTNARILARV
からなる非天然型ペプチドであって、配列識別番号3、107、121、125及び167よりなる群から選択されることを特徴とする、コルチコトロピン放出因子レセプター2(CRF 2 R)に対する選択的アゴニストである非天然型ペプチド。 - 配列識別番号3、107、121、125及び167よりなる群から選択される下記配列(1):
IVLSLDVPIGLLQILLEQEKX21X22X23X24X25X26QATTNARILARV
及びその変異体からなる非天然型ペプチドであって、前記変異体は前記配列(1)から1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加された配列を有し、且つ、前記変異体はCRF2Rに対する選択的アゴニストであることを特徴とする非天然型ペプチド。 - 下記配列(2)からなる非天然型ペプチド。
IVLSLDVPIGLLQILLEQEKARAAREQATTNARILARV (配列識別番号3) - 下記配列(2):
IVLSLDVPIGLLQILLEQEKARAAREQATTNARILARV (配列識別番号3)
及びその変異体からなる非天然型ペプチドであって、前記変異体は前記配列(2)から1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加された配列を有し、且つ、前記変異体はCRF2Rに対する選択的アゴニストであることを特徴とする非天然型ペプチド。 - 配列(1)に対して少なくとも97%の同一性を有する変異体であり、且つ、該変異体はCRF 2 Rに対する選択的アゴニストである請求項2に記載の変異体。
- 配列(2)に対して少なくとも97%の同一性を有する変異体であり、且つ、該変異体はCRF 2 Rに対する選択的アゴニストである請求項4に記載の変異体。
- 骨格筋萎縮であるCRF2R調節性障害の予防又は処置に使用するための請求項1から6のいずれか一項に記載のペプチド。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載のペプチドをコード化することを特徴とする単離された核酸。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載のペプチドに特異的であることを特徴とする単離された抗体。
- a.安全かつ有効な量の請求項1から7のいずれか一項に記載ペプチド;及び
b.薬学的に許容可能なキャリア、
を含むことを特徴とする薬学的組成物。 - a.単位用量形態での請求項1から7のいずれか一項に記載のペプチド;及び
b.使用説明書、
を備えることを特徴とする、骨格筋萎縮であるCRF2R調節性障害を予防又は処置するためのキット。
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