MX2011004718A - Péptidos agonistas de crhr2 y usos de éstos. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a novedosos péptidos que son agonistas selectivos del receptor de hormona de tipo 2 que liberan corticotropina (CRHR2) y composiciones de los mismos para el tratamiento la mejor o la inhibición de padecimientos cardiovasculares, incluyendo sin limitación insuficiencia cardiaca; el novedoso agonista de péptidos comprende preferiblemente modificaciones que incluyen péptidos pegilados; además, la presente invención se refiere también a métodos para el tratamiento y la prevención de una enfermedad o trastorno relacionado con la actividad de CRHR2.

Description

PÉPTIDOS AGONISTAS DE CRHR2 Y USOS DE ÉSTOS REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de las solicitudes de patente provisionales de EUA, números de serie 61/111 ,233 presentada el 4 de noviembre, 2008 y 61/178,890, presentada el 15 de mayo, 2009.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona, generalmente, con un péptido mimético de la estrescopina útil para el tratamiento de las indicaciones médicas mediadas por la actividad del receptor 2 de la hormona de liberación de corticotropina, las construcciones para el suministro del péptido, las composiciones farmacéuticas que los comprenden, y los métodos de tratamiento de un sujeto diagnosticado con una enfermedad, trastorno o afección médica mediada por el receptor 2 de la hormona de liberación de corticotropina.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La insuficiencia cardíaca es una afección cardiovascular común y ha alcanzado proporciones epidémicas en los Estados Unidos y Europa (Remme y otros, Eur. Heart J., 2001 , vol. 22, págs. 1527-1560). El número de ingresos hospitalarios por insuficiencia cardiaca aguda se acerca a 1 millón cada año sólo en los Estados Unidos. En la actualidad, las tasas de reingresos y la mortalidad alcanzan de 30 % a 40 % en los 60 días después del alta (Cuffee y otros, JAMA, 2002, vol. 287(12), págs. 1541-7). En la insuficiencia cardíaca aguda es común el empeoramiento de la función hemodinámica, particularmente con muy alta presión diastólica final ventricular izquierda.

El tratamiento actual para la insuficiencia cardíaca aguda es multifactorial y, frecuentemente, difiere entre los pacientes. Si bien los diuréticos, vasodilatadores e inótropos positivos son el pilar en el tratamiento de pacientes con insuficiencia cardíaca aguda, estos tratamientos están asociados con las altas tasas de reingreso y mortalidad.

Por otra parte, las terapias inotrópicas existentes (por ejemplo, dobutamina) resultan en la mejora del gasto cardíaco, pero con un aumento del ritmo cardíaco y aumento del consumo de oxígeno por el miocardio. Estos agentes inotrópicos también llevan consigo un potencial proarítmico en pacientes con insuficiencia cardíaca. Se cree que este riesgo cardiaco está asociado con el gasto de energía y la cantidad de calcio asociados con las acciones inotrópicas positivas directas de estos agentes.

En un esfuerzo por satisfacer esta necesidad médica creciente no satisfecha, muchos enfoques nuevos se estudiaron con un éxito limitado para mejorar el estado hemodinámico en forma segura y la evolución de los pacientes con este síndrome. Uno de estos agentes, el péptido humano urocortina 2 (h-UCN2), se estudió en sujetos sanos y pacientes con insuficiencia cardíaca. Se demostró que el péptido aumenta la fracción de eyección ventricular izquierda (FEVI) y el gasto cardíaco (CO) en un modelo de insuficiencia cardíaca en ganado ovino (Rademaker y otros., Circulation, 2005, vol. 1 12, págs. 3624-3624). En posteriores estudios de perfusión intravenosa en 8 sujetos saludables (Davis y otros, J. Am. Coll. Cardiol. , 2007, vol. 49, págs. 461-471) y en 8 pacientes con insuficiencia cardíaca (Davis y otros, Eur. Heart J., 2007, vol. 28, págs. 2589-2597), el aumento de la FEVI y el CO se acompañaron por un aumento en la frecuencia cardíaca y la disminución de la presión arterial en ambas dosis examinadas, en cada uno de los dos estudios. Aparentemente, las infusiones intravenosas de una hora de h-UCN2 en sujetos sanos y pacientes se toleraron bien.

La estrescopina humana (h-SCP), un péptido de 40 aminoácidos, se relaciona con la h-UCN2 y ambos son miembros de la familia de péptidos de la hormona de liberación de corticotropina (CRH). Las acciones biológicas de la familia de péptidos CRH son producidas por dos proteínas G con 7 dominios transmembrana acopladas a receptores, el receptor CRH de tipo 1 (CRHR1) y el receptor CRH de tipo 2 (CRHR2). A pesar de que estos receptores contienen alta homología de secuencia, los diferentes miembros de la familia de péptidos CRH expresan diferencias significativas en su afinidad de unión relativa, el grado de activación del receptor y la selectividad de estos dos receptores.

A diferencia de muchos de los miembros de la familia CRH, la h-SCP expresa una mayor selectividad para el CRHR2 y actúa como un mediador que ayuda en el proceso de atenuación de la iniciación y mantenimiento del estrés fisiológico (Bale y otros, Nal Genet, 2000, vol. 24, págs. 410-414; Kishimoto y otros, Nat. Genet, 2000, vol. 24, págs. 415-419). Además de su función aparente en el estrés fisiológico, se reportó que la h-SCP produce una serie de otras acciones fisiológicas. Ejerce efectos sobre el sistema endocrino (Li y otros, Endocrinology, 2003, vol. 144, págs. 3216-3224), el sistema nervioso central, los sistemas cardiovascular (Bale y otros, Proc. Nati. Acad. Sci., 2004, vol. 101 , págs. 3697-3702; Tang y otros, Eur. Heart J., 2007, vol. 28, págs. 2561-2562), pulmonar, gastrointestinal, renal, músculo esquelético e inflamatorio (Moffatt y otros, FASEB J., 2006, vol. 20, págs. 1877-1879).

Además, la actividad del CRHR2 se asoció con la enfermedad de atrofia del músculo esquelético, tal como la sarcopenia (Hinkle y otros, Endocrinology, 2003, vol. 144(1 1 ), págs. 4939-4946), la actividad motora y la ingesta de alimentos (Ohata y otros, Peptides, 2004, vol. 25, págs. 1703-1709), participa en un papel cardioprotector (Brar y otros, Endocrinology, 2004, vol. 145(1), págs. 24-35) y expresa actividad bronco relajante y antiinflamatoria (Moffatt y otros, FASEB J., 2006, vol. 20, págs. E1181-E1 187).

La pegilación es un proceso de unir a las moléculas uno o más polímeros de polietilenglicol (PEG). Frecuentemente, el proceso de pegilación se aplica a los anticuerpos, péptidos y proteínas para mejorar sus propiedades biofarmacéuticas y superar la susceptibilidad de un compuesto a las enzimas proteolíticas, la vida media corta en circulación, la utilidad corta en vivo, la baja solubilidad, el aclaramiento renal rápido y el potencial para generar anticuerpos contra el fármaco administrado (Harris y otros, Nature, 2003, vol. 2, págs. 214- 221; Hamidi y otros, Drug Delivery, 2006, 3, págs. 399-409; Bailón y otros, PSTT, 1998, vol. 1(8), págs. 352356). Recientemente, la FDA aprobó los polímeros PEG para su uso como un vehículo o una base en alimentos, cosméticos y productos farmacéuticos. Generalmente, los polímeros PEG son relativamente no inmunogénicos, tienen poca toxicidad, y se eliminan intactos por los ríñones o en las heces. Estas características pueden dar lugar a una serie de beneficios clínicos del compuesto si este proceso se desarrolla para preservar o mejorar la afinidad, la eficacia y el perfil farmacológico de la molécula original.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a las modalidades generales y preferidas que se definen, respectivamente, en las reivindicaciones independientes y dependientes que se anexan, las cuales se incorporan como referencia en la presente descripción. Las características preferidas e ilustrativas de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción detallada a continuación con referencia a las figuras de los dibujos.

En ciertas modalidades la invención se refiere a un péptido que tiene actividad agonista hacia el receptor de tipo 2 de la hormona de liberación de la corticotropina (CRHR2), que comprende la secuencia de aminoácidos de LSLDV PTNIM NLLFN IAKAK NLRAQ AAANA HLMAQ I, en donde por lo menos un aminoácido del péptido se sustituye por X, siempre que la sustitución no se hace en las posiciones 3, 29 y 33 de la secuencia de aminoácidos, y en donde X es la cisteína, la tirosina, o el ácido glutámico, o una sal farmacéuticamente aceptable o amida de éstas.

Los péptidos agonistas del CRHR2 contenidos en la presente invención comprenden secuencias de aminoácidos que son relativamente similares a las secuencias de la estrescopina humana y la urocortina III humana.

En una modalidad, una sustitución de aminoácido para la secuencia de aminoácido referida anteriormente se selecciona del grupo que consiste de: X por L en la posición 1 ; X por S en la posición 2; X por D en la posición 4; X por V en la posición 5; X por P en la posición 6; X por T en la posición 7; X por N en la posición 8; X por I en la posición 9; X por M en la posición 10; X por N en la posición 11 ; X por L en la posición 12; X por L en la posición 13; X por F en la posición 14; X por N en la posición 15; X por I en la posición 16; X por A en la posición 17; X por K en la posición 18; X por A en la posición 19; X por K en la posición 20; X por N en la posición 21 ; X por L en la posición 22; X por R en la posición 23; X por A en la posición 24; X por Q en la posición 25; X por A en la posición 26; X por A en la posición 27; X por A en la posición 28; X por A en la posición 30; X por H en la posición 31 ; X por L en la posición 32; X por A en la posición 34; X por Q en la posición 35; y X por I en la posición 36.

La invención se refiere, además, a una sal farmacéuticamente aceptable o una amida de los péptidos agonistas del CRHR2 y está dirigida, además, a una composición farmacéutica de dichos péptidos en combinación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

En aun otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del péptido agonista del CRHR2 se selecciona del grupo que consiste de: XLSLD VPTNI MNLLF NIAKA KNLRA QAAAN AHLMA QI-NH2; XTLSL DVPTN IMNLL FNIAK AKNLR AQAAA NAHLM AQI-NH2; XFTLS LDVPT NIMNL LFNIA KAKNL RAQAA ANAHL MAQI- NH2; y XKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI- NH2.

En otra modalidad un conjugado comprende la secuencia de aminoácidos y un enlazador unido a la X del péptido agonista del CRHR2. Preferentemente, la X es la cisteína. Preferentemente, el enlazador es la acetamida o la N-etilsuccinimida.

En aún otra modalidad un conjugado del péptido agonista comprende polietilenglicol (PEG) unido al enlazador que posee un peso molecular de no más de 80 kDa. Preferentemente, el PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 2 kDa, aproximadamente 5 kDa, aproximadamente 12 kDa, aproximadamente 20 kDa, aproximadamente 30 kDa o de aproximadamente 40 kDa.

Un enlazador permite más fácilmente y de forma selectiva fijar el PEG al péptido con respecto a la posición en la secuencia de aminoácidos, mientras que la pegilación del péptido prolonga la vida media del péptido pegilado, lo que amplía la duración del beneficio terapéutico a un paciente. Por lo tanto, la sustitución de la secuencia de aminoácidos del péptido agonista del CRHR2 es, preferentemente, de tal manera que haya al menos un aminoácido de tipo X en la secuencia. Esto asegurará que la pegilación del péptido se dirige al menos a una posición en la secuencia.

En ciertas modalidades el péptido agonista del CRHR2 comprende una de las siguientes secuencias de aminoácidos contenidas en las SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 35, 36, 37, 39, 40 y 41.

Otro aspecto de la invención se refiere al método de tratar a un sujeto que padece de o diagnosticado una enfermedad, trastorno o afección médica mediada por la actividad del receptor de tipo 2 de la hormona de liberación de corticotropina, que es una enfermedad metabólica o una insuficiencia cardíaca. El método comprende la administración a un sujeto en necesidad de dicho tratamiento de una cantidad efectiva de un péptido agonista del CRHR2 contenido en la presente invención.

Las modalidades adicionales y las ventajas de la invención serán evidentes de la discusión detallada, esquemas, ejemplos, y reivindicaciones a continuación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras 1A y 1 B muestran el seguimiento analítico por HPLC de un agonista del péptido con SEQ ID NO:102 derivado con yodoacetamida-PEG después de 2 horas de tiempo de reacción y después de la purificación, respectivamente.

La Figura 1 C muestra el gráfico de espectroscopia de masa de un agonista del péptido con SEQ ID NO: 102 derivatizado con yodoacetamida-PEG.

La Figura 2 muestra la potencia del agonista y la selectividad de los agonistas del péptido contra el CRHR1 y el CRHR2 humanos, respectivamente.

La Figura 3 muestra los efectos de antagonismo competitivo entre un péptido agonista con SEQ ID NO:1 y una anti-sauvagina 30 (SEQ ID NO: 118).

La Figura 4 muestra las curvas de concentración-efecto del agonista, de varios péptidos agonistas obtenidos mediante la medición de la estimulación del AMPc en células SK-N-MC transfectadas con h-CRHR2.

La Figura 5 muestra las curvas de concentración-efecto del (SEQ ID NO: 1) agonista de la h-SCP medido a través de la estimulación del AMPc en células SK-N-MC transfectadas con h-CRHR2 en ausencia y presencia de 10 µ? de los péptidos agonistas del CRHR2 con la secuencia, la SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 y SEQ ID NO: 112, respectivamente.

La Figura 6 muestra la relajación de la aorta de rata aislada, precontraída, por los agonistas del péptido con la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 115(h-UCN2).

La Figura 7 ilustra los cambios de la frecuencia cardíaca, la presión desarrollada del ventrículo izquierdo, y la presión de perfusión coronaria, en los corazones de conejo perfundidos según Langendorff, en presencia del péptido agonista con la SEQ ID NO: 1 y un placebo de control de vehículo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a nuevos péptidos que son péptidos agonistas del CHRH2 y composiciones de éstos para el tratamiento, la mejoría o la inhibición de las afecciones cardiovasculares que incluyen, pero no están limitadas a, la insuficiencia cardíaca, así como las enfermedades metabólicas.

En una modalidad de la invención, un método para tratar o aliviar la insuficiencia cardiaca en un sujeto que lo necesite comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un péptido agonista del CRHR2.

En ciertas modalidades el péptido del CRHR2 es un péptido de mamíferos, específicamente un péptido de rata, ratón, cobaya, conejo, perro, gato, caballo, vaca, cerdo, o primates, o modificaciones de éstos. Preferentemente, el péptido es un péptido humano modificado. Los ejemplos de los péptidos agonistas del CRHR2 de la invención se describen con más detalle en la sección de abajo.

Otra modalidad de la invención comprende un grupo reactivo unido covalentemente a un péptido agonista. El grupo reactivo es elegido por su capacidad para formar un enlace covalente estable con un polímero o fracción, otra fracción química que extiende la vida media en circulación del péptido en el sujeto. En una modalidad tal polímero comprende un polímero de polietilenglicol (PEG) que prolonga la duración del péptido en la circulación del sujeto antes de su eliminación. En esta forma el grupo reactivo actúa como enlace entre el péptido mediante la reacción de una parte con uno o más aminoácidos del péptido y por la otra con el polímero. En una modalidad alternativa el grupo reactivo está inicialmente unido al PEG antes de formar un enlace químico con el péptido. En una modalidad preferida de los péptidos modificados, el grupo enlazador es una succinimida, más particularmente, la N-etilsuccinimida, o una acetamida. Por otra parte, el enlazador puede ser sulfona de vinilo u ortopiridil disulfuro. Preferentemente, las modificaciones químicas se realizan en péptidos aislados, por ejemplo, para aumentar la eficiencia de la reacción.

Los enlazadores que son útiles para unir al péptido y a la fracción de PEG transmitirían mínima inmunogenicidad y toxicidad al huésped. Ejemplos de tales enlazadores se pueden encontrar en Bailón y otros, PSTT, 1998, vol. 1(8), págs. 352-356 o Roberts y otros, 2002, Adv. Drug Del. Rev., vol. 54, págs. 459-476. Los ejemplos de fracciones químicas adecuadas, particularmente PEG y los polímeros equivalentes, se describen en Greenwald y otros, Adv. D g Del.

Rev., vol. 55, págs. 217-250. Por ejemplo, el copolímero de estireno anhídrido maleico-neocarzinostatina, el copolímero hidroxilo metacrilamida propilo, el dextrano, el ácido poliglutámico, el hidroxiletil almidón y el ácido poliaspártico son otros sistemas poliméricos que se pueden emplear para llevar a cabo el suministro y con características farmacocinéticas similares a un sistema de PEG.

En ciertas modalidades de la invención el péptido agonista CRHR2 contiene un terminal C amidado. Tales procedimientos de modificación se pueden realizar en un péptido aislado purificado o, como en el caso de la síntesis en fase sólida, se puede realizar durante el procedimiento de síntesis. Tales procedimientos se revisan en Ray y otros, Nature Biotech., 1993, vol. 1 1 , págs. 64-70; Cottingham y otros, Nature Biotech., 2001 , vol. 19, págs. 974-977; Walsh y otros, Nature Biotech., vol. 24, págs. 1241-1252; y la pub. de patente de los Estados Unidos núm. 2008/0167231.

En una modalidad particular de la invención el compuesto comprende el péptido de una secuencia de aminoácidos según lo dispuesto en la SEQ ID NO: 82 o en la SEQ ID NO: 102 que contiene un CONH2 en su extremo carboxilo y un enlazador unido al residuo de cisteína en la posición 28 de la secuencia de aminoácidos, en donde el enlazador es la N-etilsuccinimida o la acetamida, y el enlazador unido a un polímero de PEG de aproximadamente 20 kDa.

Por otra parte, una modalidad de la presente invención también incluye un método para tratar un sujeto que sufre o ha sido diagnosticado una enfermedad, trastorno o afección mediada por la actividad del CHRH2 que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un péptido agonista del CRHR2.

Otra modalidad de la presente invención también incluye un método para el tratamiento o la inhibición de la progresión de una o más afecciones, enfermedades o trastornos mediados por el CHRH2, dicho método comprende administrar a un paciente en necesidad de tratamiento una cantidad farmacéuticamente efectiva de al menos un péptido agonista del CRHR2.

Es una modalidad adicional de la invención proporcionar un proceso para elaborar una composición farmacéutica, el proceso comprende mezclar cualquiera de los péptidos agonistas del CRHR2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Términos y definiciones La presente invención se entiende mejor con referencia a las siguientes definiciones, las figuras y la descripción ejemplar proporcionada en la presente descripción.

Las siguientes son las abreviaturas que en ocasiones se usan en esta descripción: pA5o o pEC5o = logaritmo negativo en base 10 de la concentración de agonista necesaria para producir un medio del máximo efecto; SEM = error estándar de la media; log DR = logaritmo en base 10 de la relación de la dosis de agonista; PM = peso molecular; A Pc = adenosina-3',5'-monofosfato cíclico; ADNc = ADN complementario; kb = kilobases (1000 pares de bases); kDa = kilodalton; ATP = adenosina 5'-tr¡fosfato; nt = nucleótidos; pb = par de bases; PAGE = electroforesis en gel de poliacrilamida; PCR = reacción en cadena de la polimerasa, nm = nanomolar.

Los términos "que incluye", "que contiene" y "que comprende" se usan en la presente en su sentido abierto, no limitativo.

"Administrar" o "administración" significa el abastecimiento de un medicamento a un paciente de una manera que es farmacológicamente útil.

"Composición", significa un producto que contiene un compuesto de la invención (tal como un producto que comprende los ingredientes especificados en las cantidades especificadas, así como cualquier producto que resulte, directa o indirectamente, de tales combinaciones de los ingredientes especificados en las cantidades especificadas).

"Compuesto" o "fármaco" significa un péptido agonista del CRHR2 o formas farmacéuticamente aceptables de éste. "Conjugado", significa un compuesto químico que se forma por la unión de dos o más compuestos.

"La forma de dosificación" significa uno o más compuestos en un medio, portador, vehículo o dispositivo adecuado para su administración a un paciente. "Forma de dosificación oral", significa una forma de dosificación adecuada para la administración oral.

"Dosis", significa una unidad del fármaco. Convencionalmente, una dosis se ofrece como una forma de dosificación. Las dosis se pueden administrar a los pacientes de acuerdo a una variedad de regímenes de dosificación. Los regímenes de dosificación comunes incluyen por vía oral una vez al día (qd), dos veces al día por vía oral (bid) y tres veces al día por vía oral (t¡d).

"Formas" significan varios isómeros y mezclas de uno o más péptidos agonistas del CRHR2. El término "isómero" se refiere a los compuestos que tienen la misma composición y peso molecular pero difieren en las propiedades físicas y/o químicas. Dichas sustancias tienen la misma cantidad y tipos de átomos pero difieren en la estructura. La diferencia estructural puede darse en la constitución (isómeros geométricos) o en una capacidad para rotar el plano de la luz polarizada (estereoisómeros). El término "estereoisómero" se refiere a isómeros de constitución idéntica que difieren en la disposición de los átomos en el espacio. Los enantiomeros y diastereómeros son estereoisómeros, en donde un átomo de carbono sustituido asimétricamente actúa como un centro quiral. El término "quiral" se refiere a una molécula que no puede superponerse sobre su imagen exacta, lo que implica la ausencia de un eje y un plano o centro de simetría.

"Medicamento" significa un producto para su uso en la prevención, tratamiento o mejora de trastornos relacionados con sustancias, tales como la dependencia de sustancias, el abuso de sustancias o trastornos inducidos por sustancias en un sujeto que lo necesite.

"Paciente" o "sujeto" significa un animal, preferentemente, un mamífero, con mayor preferencia, un humano, en necesidad de la intervención terapéutica.

"Farmacéuticamente aceptable" significa las entidades moleculares y composiciones que son de la pureza y calidad suficientes para ser usadas en la formulación de una composición o medicamento de la presente invención. Dado que tanto el uso humano (clínico y de venta libre) y uso veterinario se incluyen igualmente en el alcance de la presente invención, una formulación incluirá una composición o medicamento, ya sea para uso humano o veterinario.

El "excipiente farmacéuticamente aceptable se refiere" a una sustancia que es no tóxica, biológicamente tolerable y biológicamente adecuada de cualquier otra forma para su administración a un sujeto, tal como una sustancia inerte agregada a una composición farmacológica o usada como vehículo, portador o diluyente para facilitar la administración de un agente, y que es compatible con ellos. Como ejemplos de excipientes se incluyen carbonato cálcico, fosfato cálcico, varios azúcares y tipos de almidón, derivados de la celulosa, gelatina, aceites vegetales y glicoles de polietileno.

"Sal farmacéuticamente aceptable" significa, una sal de ácido o de base de los compuestos de la invención que es de pureza y calidad suficiente para su uso en la formulación de una composición o medicamento de la presente invención y son toleradas y lo suficientemente no tóxicas para usar en una preparación farmacéutica. Las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen las sales de adición ácidas las cuales pueden, por ejemplo, formarse al reaccionar el compuesto fármaco con un ácido farmacéuticamente aceptable adecuado tales como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico, ácido acético, ácido benzoico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido carbónico o ácido fosfórico.

"Péptido agonista del CRHR2" significa, un péptido o derivado éste que presenta actividad agonista hacia el receptor de la hormona de liberación de corticotropina de tipo 2 (CRHR2). Preferentemente, un péptido agonista del CRHR2 es un derivado o variante de la estrescopina que también puede exhibir actividad hacia el receptor de la hormona de liberación de corticotropina de tipo 1 (CRHR1 ). Un péptido agonista del CRHR2 es, generalmente, un agonista selectivo del CRHR2 con menos actividad hacia CRHR1. Selectividad hacia un receptor en la presente se refiere a la potencia de un péptido para inducir una respuesta de actividad en el receptor hacia el que el péptido es selectivo en comparación con otros receptores, en los que el péptido puede también inducir actividad, pero con menos potencia. La definición de un péptido agonista del CRHR2 no se limita a agonista, pero también puede incluir los agonistas parciales. La actividad CRHR1 y CRHR2 de un péptido agonista del CRHR2 por ejemplo, se puede evaluar en un ensayo de 3 ', 5 -monofosfato cíclico de adenosina (AMPc).

Se parecen mucho a la actividad CRHR2 de la estrescopina (h-SCP), "Cantidad terapéuticamente efectiva" significa la cantidad del compuesto que provoca la respuesta biológica o medicinal en un sistema de tejidos, animal o humano, que busca el investigador, veterinario, médico, u otro especialista, que incluye el alivio terapéutico de los síntomas de la enfermedad o trastorno que se trata y profiláctico.

El término "tratamiento", como se usa en la presente descripción, a menos que se indique de cualquier otra forma, significa invertir, aliviar, inhibir el progreso, o prevenir el trastorno o afección en que dicho término se aplica, o uno o más síntomas de tal trastorno o afección. El término "tratamiento", como se usa en la presente descripción, a menos que se indique de cualquier otra forma, se refiere al acto de tratar.

Compuestos La presente invención se refiere a los siguientes péptidos y las modificaciones de éstos. Los compuestos de la presente invención incluyen, además, péptidos agonista del CRHR2 nuevos y selectivos y las modificaciones de éstos.

Además, los compuestos de la presente invención se refieren a entidades peptídicas que se unen a o se acomplejan con el CRHR2, tal como la h-SCP o péptidos miméticos de h-SCP. Los compuestos preferidos son péptidos que tienen actividad agonista hacia el CRHR2 como por ejemplo medido en un ensayo de AMPc con pA50 que está dentro del intervalo de aproximadamente 7.5 y superior, o pKi(logaritmo negativo de Ki) medida en un ensayo de unión de radioligando que está dentro del intervalo de aproximadamente 7.5 y superior. Además de mostrar afinidad de unión, los péptidos agonistas del CRHR2 deben demostrar un cierto nivel de activación del receptor. Los péptidos que son homólogos a la h-SCP son, por lo tanto, preferibles, ya que estos péptidos poseen de forma natural propiedades físicas y químicas similares.

Los miembros de la familia de factores de liberación de la corticotropina presentan una vida media moderadamente corta. Los péptidos agonistas del CRHR2 prometen un perfil terapéutico único. Para el tratamiento de los trastornos que están mediados por el CRHR2, que incluyen pero sin limitarse a, las enfermedades cardiovasculares y metabólicas, una modalidad de la presente invención está dirigida a una forma de acción prolongada de los péptidos agonistas. Un péptido agonista del CRHR2 de larga acción ofrece beneficios especiales para el tratamiento de enfermedades crónicas, en donde la necesidad de la exposición terapéutica continua y el cumplimiento del paciente con el tratamiento prescrito es un desafío.

En consecuencia, una modalidad de la presente invención se dirige, generalmente, a la variación(es) de la secuencia de la h-SCP, las variaciones de sitios específicos de la secuencia, y las consideraciones de interferencia espacial o estérica de tal manera que el perfil terapéutico deseado y/o la relación estructura-actividad en relación con el CRHR2 se conservan.

Los ejemplos de péptidos agonistas del CRHR2, que están opcionalmente amidados en el extremo terminal C, se proporcionan en las Tablas 1 a 5. El grupo reactivo o enlazador es, preferentemente, la succinimida o la acetamida. Los péptidos modificados contienen opcionalmente un grupo PEG. El PEG varía en longitud y peso y es, preferentemente, aproximadamente 0 kDa. Opcionalmente, el número de grupos reactivos pueden ser más de uno, on un grupo reactivo que es preferible.

TABLA 1 : Estrescopina humana con péptidos agonistas del CRHR2 de variante Cvs v terminal C amidado TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 1 CKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 2 TCFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO:3 TKCTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 4 TKFCL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 5 TKFTC SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 6 TKFTL CLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 7 TKFTL SCDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 8 TKFTL SLCVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO:9 TKFTL SLDCP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 10 TKFTL SLDVC TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 11 TKFTL SLDVP CNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 12 TKFTL SLDVP TCIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 13 TKFTL SLDVP TNCMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 14 TKFTL SLDVP TNICN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 15 TKFTL SLDVP TNIMC LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 16 TKFTL SLDVP TNIMN CLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 17 TKFTL SLDVP TNIMN LCFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 18 TKFTL SLDVP TNIMN LLCNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 19 TKFTL SLDVP TNIMN LLFCI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 20 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNC AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 21 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI CKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 22 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI ACAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 23 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKCKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 24 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKACN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 25 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKC LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 26 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN CRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 27 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LCAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 28 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRCQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 29 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRACA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 30 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQC AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 31 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA CANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 32 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA ACNAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 33 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AACAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 34 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANCH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 35 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAC LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 36 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH CMAQI-NH2 SEQ ID NO: 37 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LCAQI-NH2 SEQ ID NO: 38 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMCQI-NH2 SEQ ID NO: 39 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMACI-NH2 SEQ ID NO: 40 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQC-NH2 SEQ ID NO: 41 TABLA 2: Variante Cvs del péptido estrescopina con grupo reactivo N-etilsuccinimida ÍNESi TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQC(-NES)-NH2 SEQ ID NO: 42 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAC(-NES) LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 43 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AAC(-NES)AH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 44 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AC(-NES)NAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 45 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA C(-NES)ANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 46 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRC(-NES)QA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 47 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN C(-NES)RAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 48 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKC(-NES) LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 49 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAC(-NES)N LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 50 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNC(-NES) AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 51 TKFTL SLDVP TNIMN LLFC(-NES)I AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 52 TKFTL SLDVP TNIMN LC(-NES)FNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 53 TKFTL SLDVP TNIMN C(-NES)LFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 54 TABLA 3: Péptidos agonistas del CRHR2 variante Cys pegilados con enlazador de N-etilsuccinimida (NES) v PEG con un peso de aproximadamente 20 kPa C(-NES-PEG)KFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 55 TC(-NES-PEG)FTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 56 TKC(-NES-PEG)TL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 57 TKFC(-NES-PEG)L SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 58 TKFTC(-NES-PEG) SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 59 TKFTL C(-NES-PEG)LDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 60 TKFTL SC(-NES-PEG)DVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 61 TKFTL SLC(-NES-PEG)VP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 62 TKFTL SLDC(-NES-PEG)P TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 63 TKFTL SLDVC(-NES-PEG) TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 64 TKFTL SLDVP C(-NES-PEG)NIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 65 TKFTL SLDVP TC(-NES-PEG)IMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 66 TKFTL SLDVP TNC(-NES-PEG)MN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 67 TKFTL SLDVP TNIC(-NES-PEG)N LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 68 TKFTL SLDVP TNIMC(-NES-PEG) LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 69 TKFTL SLDVP TNIMN C(-NES-PEG)LFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 70 TKFTL SLDVP TNIMN LC(-NES-PEG)FNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 71 TKFTL SLDVP TNIMN LLC(-NES-PEG)NI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 72 TKFTL SLDVP TNIMN LLFC(-NES-PEG)I AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 73 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNC(-NES-PEG) AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 74 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI C(-NES-PEG)KAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 75 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AC(-NES-PEG)AKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 76 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKC(-NES-PEG)KN LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 77 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAC(-NES-PEG)N LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 78 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKC(-NES-PEG) LRAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 79 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN C(-NES-PEG)RAQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 80 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LC(-NES-PEG)AQA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 81 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRC(-NES-PEG)QA AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 82 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAC(-NES-PEG)A AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 83 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQC(-NES-PEG) AANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 84 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA C(-NES-PEG)ANAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 85 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AC(-NES-PEG)NAH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 86 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AAC(-NES-PEG)AH LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 87 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANC(-NES-PEG)H LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 88 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAC(-NES-PEG) LMAQI-NH2 SEQ ID NO: 89 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH C(-NES-PEG)MAQI-NH2 SEQ ID NO: 90 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LC(-NES-PEG)AQI-NH2 SEQ ID NO: 91 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMC(-NES-PEG)QI-NH2 SEQ ID NO: 92 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAC(-NES-PEG)I-NH2 SEQ ID NO: 93 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQC(-NES-PEG)-NH2 SEQ ID NO: 94 TABLA 4, Péptidos agonistas del CRHR2 variante Cvs pegilados con PEG de peso molar variable y enlazador de N-etilsuccinimida (NES) o acetamida ??) TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRC(-NES-PEG MW2000)QA AANAH SEQ ID NO: 95 LMAQI-NH2 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRC(-NES-PEG MW5000)QA AANAH SEQ ID NO: 96 LMAQI-NH2 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRC(-NES-PEG MW12000)QA AANAH SEQ ID NO: 97 LMAQI-NH2 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRC(-NES-PEG MW20000)QA AANAH SEQ ID NO: 82 LMAQI-NH2 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRC(-NES-PEG-NEMa MW20000)QA SEQ ID NO: 98 AANAH LMAQI-NH2 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRC(-NES-PEG MW30000)QA AANAH SEQ ID NO: 99 LMAQI-NH2 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRC(-NES-PEG MW40000)QA AANAH SEQ ID NO: 100 LMAQI-NH2 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRC(-NES-PEG MW80000 & SEQ ID NO: 101 BRANCHED)QA AANAH L AQI-NH2 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRC(-IA-PEG MW20000)QA AANAH LMAQI- SEQ ID NO: 102 NH2 TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRC(-IA-PEG MW30000)QA AANAH SEQ ID NO: 103 LMAQI-NH2 TKFTL SLDVP TNI N LLFNI AKAKN LRC(-IA-PEG W40000)QA AANAH SEQ ID NO: 104 LMAQI-NH2 TKFTL SLDVP TC(-IA-PEG W20000)IMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH SEQ ID NO: 105 LMAQI-NH2 TKFTL SLDVP TNI N LLFNI AKAKN LRAQA AANAC(-IA-PEG MW20000) SEQ ID NO: 106 LMAQI-NH2 NES-PEG-NEM: PEG lineal de doble-terminación con un tapón de N-etilmaleimida en el extremo enlazado de la cadena PEG.

TABLA 5: Péptidos agonistas del CRHR2 con secuencia de aminoácido (aa) acortada comparado con el péptido de SEQ ID NO:1 Los compuestos de fármacos de la presente invención incluyen, además, una mezcla de estereoisómeros, o cada isómero puro o sustancialmente puro Por ejemplo, el presente compuesto puede tener opcionalmente uno o más centros asimétricos en un átomo de carbono que contiene cualquiera de los sustituyentes. Por lo tanto, el compuesto puede existir en la forma de enantiómero o diastereómero o una mezcla de éstos. Cuando el presente compuesto contiene un enlace doble, el presente compuesto puede existir en la forma de isomerismo geométrico (compuesto-cis, compuesto-trans) y cuando el presente compuesto contiene un enlace insaturado tal como carbonilo, entonces el presente compuesto puede existir en la forma de un tautómero y el presente compuesto también incluye estos isómeros o una mezcla de éstos. El compuesto inicial en la forma de una mezcla racémica, enantiómero o diastereómero se puede utilizar en los procesos para la preparación del presente compuesto. Cuando el presente compuesto se obtiene en la forma de un diastereómero o enantiómero, se pueden separar mediante un método convencional tal como cromatografía o cristalización fraccionada. Adicionalmente, el presente compuesto incluye una sal intramolecular, hidrato, solvato o polimorfismo de éstos.

Además, los compuestos de fármacos adecuados son aquellos que ejercen un efecto local fisiológico, o un efecto sistémico, ya sea después de penetrar la mucosa o en el caso de la administración oral después del transporte en el tracto gastrointestinal con la saliva. Las formas de dosificación preparadas a partir de las formulaciones de acuerdo con la presente invención son particularmente adecuadas para los compuestos de fármacos que ejercen su actividad durante un período prolongado de tiempo, particularmente los fármacos que tienen una vida media de al menos varias horas.

Rutas de síntesis y purificación Un péptido "aislado" es un péptido sustancialmente libre de o separado del material celular u otras proteínas contaminantes de la fuente de células o tejido del que se produce y aisla el péptido, o casi libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando el péptido es de síntesis química. Por ejemplo, la proteína que está sustancialmente libre del material celular puede incluir las preparaciones de proteína que tiene menos de aproximadamente 30 %, o preferentemente 20 %, o con mayor preferencia 10 %, o incluso con mayor preferencia 5 %, o aún con mayor preferencia 1 % (en peso seco), de proteínas contaminantes.

En modalidades preferidas el péptido aislado está sustancialmente puro. Así, cuando el péptido se produce por recombinación, está sustancialmente libre de medio de cultivo, por ejemplo, medio de cultivo que representa menos de aproximadamente 20 %, o con mayor preferencia 10 %, o incluso con mayor preferencia 5 %, o aún con mayor preferencia 1 %, del volumen de la preparación de proteína. Cuando la proteína se produce por síntesis química, está sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos, es decir, se separa a partir de precursores químicos u otros productos químicos que están involucrados en la síntesis de la proteína. En consecuencia, tales preparaciones del péptido tienen menos de aproximadamente 30 % o, preferentemente, 20 %, o con mayor preferencia 10 %, o incluso con mayor preferencia 5 %, o aún con mayor preferencia 1 % (en peso seco), de precursores químicos u otros compuestos que el péptido de interés.

Producción recombinante La expresión del péptido en ambientes celulares se puede lograr mediante el uso de polinucleótidos aislados. Un polinucleótido "aislado" es uno que está sustancialmente separado de o libre de moléculas de ácido nucleico con diferentes secuencias de ácido nucleico. Las modalidades de las moléculas de ADN incluyen ADNc, ADN genómico, ARN, y ARN no codificante. Los polinucleótidos preferidos se obtienen a partir de muestras biológicas derivadas de un humano, por ejemplo, de muestras de tejido.

Los vectores se pueden usar para transportar y propagar polinucleótidos que codifican el péptido de SEQ ID NO: 1. La introducción de tales vectores en las células huéspedes puede provocar la producción del ARNm o proteína codificados de la estrescopina mimética. Por otra parte, los vectores de expresión se pueden combinar con elementos purificados que incluyen, pero no se limitan a, los factores de la transcripción, la polimerasa de ARN, los ribosomas, y los aminoácidos para producir de manera eficiente las reacciones de transcripción/traducción en condiciones libres de células. Los péptidos miméticos de la estrescopina expresados a partir de las reacciones resultantes se pueden aislar para una mayor purificación, modificación y/o formulación.

El término vector de expresión se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar a otro ácido nucleico al cual se enlazó. Un tipo ejemplar de vector es un plásmido, que se refiere a un lazo de ADN circular de doble cadena en la que los segmentos adicionales de ADN se pueden insertar. Otro ejemplo de un vector es un vector viral en donde se pueden insertar segmentos adicionales de ADN. Algunos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, los vectores de bacterias que tiene un origen bacteriano de replicación y vectores episomales de mamíferos). Otros vectores (por ejemplo, los vectores, no episomales de mamíferos) se integran en el genoma de una célula huésped a la introducción en la célula huésped y, por lo tanto, se replica junto con el genoma del huésped. Por otra parte ciertos vectores de expresión son capaces de dirigir la expresión de los genes a los que están vinculados operativamente. Los vectores de utilidad en las técnicas de ADN recombinante pueden ser en forma de plásmidos. Por otra parte, otras formas de vectores, tales como los vectores virales (por ejemplo, los retrovirus de replicación defectuosa, los adenovirus y los virus adeno-asociado), que cumplen funciones equivalentes, se pueden seleccionar por el experimentado en la materia como adecuado para el uso previsto.

Una célula huésped se refiere a una célula que contiene una molécula de ADN ya sea en un vector o integrado en un cromosoma de la célula. Una célula huésped puede ser una célula huésped nativa que contiene la molécula de ADN endógenamente o una célula huésped recombinante. Un ejemplo de una célula huésped es una célula huésped recombinante, que es una célula que se transformó o transfectó por una secuencia de ADN exógeno. Una célula se transformó por el ADN exógeno cuando el ADN exógeno, se introduce en el interior de la membrana celular. El ADN exógeno puede o no estar integrado (enlace covalente) en el ADN de los cromosomas que componen el genoma de la célula. En procariotas y levaduras, por ejemplo, el ADN exógeno se puede mantener en un elemento episomal, tal como un plásmido. Con respecto a las células eucariotas, una célula establemente transformada o transfectada es aquella en el que el ADN exógeno llega a estar integrado en el cromosoma de modo que sea heredado por las células hijas a través de la replicación del cromosoma. Esta estabilidad se demuestra por la capacidad de las células eucariotas para establecer líneas celulares o clones que comprenden una población de células hijas que contienen el ADN exógeno. Un clon se refiere a una población de células derivadas de una sola célula o ancestro común por mitosis. Una línea celular se refiere a un clon de una célula primaria que es capaz de un crecimiento estable in vitro por muchas generaciones. Las células recombinantes huéspedes pueden ser procariotas o eucariotas, incluidas las bacterias tales como E. coli, las células de hongos como la levadura, las células de mamíferos, tales como líneas celulares de origen humano, bovino, porcino, de mono, y de roedores, insectos y células, tales como Drosophila y líneas celulares derivadas del gusano de seda. Una célula huésped recombinante se refiere no sólo a la célula particular del sujeto, sino también a la progenie o descendencia potencial de una célula. Particularmente porque ciertas modificaciones pueden ocurrir en las generaciones venideras ya sea debido a una mutación o influencias del medio ambiente, la progenie puede no ser idéntica a la célula madre, pero todavía están destinadas a ser incluidas en el alcance del término.

Los vectores ilustrativos de la presente invención incluyen, además, sistemas de expresión diseñados específicamente que permitan la traslación del ADN entre huéspedes como bacterias-levaduras o bacterias-células animales o bacterias-hongos o bacterias-células de invertebrados. Aquellos con experiencia en la materia conocen numerosos vectores de clonación y la selección de un vector de clonación apropiado está en el ámbito del experimentado en la materia. Para otros sistemas de expresión adecuados tanto para las células procariotas y eucariotas véase, por ejemplo, los capítulos 16 y 17 de Maniatis y otros, ( 990), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," 2:16.3-16.81.

Con el fin de obtener alto nivel de expresión de un gen clonado o de un ácido nucleico, como un ADNc que codifica un péptido mimético de la estrescopina, una secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia del péptido mimético de la estrescopina se subclona preferiblemente en un vector de expresión que contiene un promotor fuerte para dirigir la transcripción, un terminador de la transcripción/traducción, y para un ácido nucleico que codifica una proteína, un sitio de unión al ribosoma para la iniciación de la traducción. Los promotores bacterianos adecuados se conocen en la materia y se describen, por ejemplo, por Sambrook y otros, (1989), Molecular cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York y Macrides, 1996, Microbiol. Rev. 60(3):512-38. Los sistemas bacterianos de expresión para expresar las proteínas miméticas de la estrescopina descritas en la presente invención están disponibles en, por ejemplo, E. coli, Bacillus sp., y Salmonella (Palva y otros, 1983, Gene, 22:229-235; Mosbach y otros, 1983, Nature, 302:543-545). Los kits para los sistemas de expresión están disponibles comercialmente. Los sistemas de expresión eucarióticos para células de mamíferos, levaduras y células de insectos se conocen en la materia y también están disponibles en el mercado. En modalidades ejemplares, el vector de expresión eucariota es un vector de baculovirus, vector de adenovirus, un vector adeno-asociado, o un vector retroviral.

El promotor se refiere a una secuencia reguladora de ADN que está implicado en la unión de la ARN polimerasa para iniciar la transcripción de un gen. Los promotores están, frecuentemente, corriente arriba (es decir, 5 ') en el sitio de iniciación de la transcripción del gen. Un gen se refiere a un segmento de ADN implicado en la producción de un péptido, péptido o proteína, que incluye la región de codificación, las regiones anteriores no codificantes (5'UTR) y las siguientes (3'UTR) a la región de codificación, así como las secuencias intermedias no codificantes (intrones) entre los distintos segmentos de codificación (exones). La codificación se refiere a la especificación de determinados aminoácidos o señales de terminación en tripletes de tres bases (codones) de ADN o ARNm.

El promotor para la expresión directa del polinucleótido se puede seleccionar regularmente para adaptarse el uso particular. El promotor se coloca, opcionalmente, a la misma distancia del sitio de inicio de transcripción heterologa, ya que está desde el sitio de inicio de transcripción en su entorno natural. Como será evidente para el experimentado en la materia, sin embargo, alguna variación en esta distancia se puede acomodar sin pérdida de la función de promotor.

Además del promotor, el vector de expresión puede contener una unidad de transcripción o cásete de expresión que contiene todos los elementos adicionales necesarios para la expresión del polinucleótido de codificación del mimético de la estrescopina en las células huéspedes. Un cásete de expresión ilustrativo contiene un promotor unido operativamente a la secuencia del polinucleótido que codifica un péptido mimético de la estrescopina, y las señales necesarias para la poliadenilación eficiente del transcripto, los sitios de unión del ribosoma, y la terminación de la traducción. La secuencia del polinucleótido de codificación de un péptido mimético de la estrescopina canina puede estar enlazada a una secuencia de péptido señal escindible para promover la secreción de la proteína codificada por la célula transfectada. Los péptidos señal ilustrativos incluyen los péptidos señal del activador tisular del plasminógeno, la insulina y del factor de crecimiento neuronal, y la hormona esterasa juvenil de Heliothis virescens. Los elementos adicionales del cásete pueden incluir potenciadores y, si se usa el ADN genómico como gen estructural, los intrones con los sitios de empalme donantes y aceptares funcionales.

Además de una secuencia promotora, el cásete de expresión puede contener, además, una región de terminación de la transcripción corriente abajo del gen estructural para proporcionar la terminación eficiente. La región de terminación se puede obtener del mismo gen que la secuencia del promotor, el gen de la estrescopina humana, o se puede obtener a partir de genes diferentes.

En modalidades ilustrativas, se puede usar cualquiera de los vectores adecuados para la expresión en células eucariotas o procariotas conocidos en la materia. Los vectores bacterianos de expresión ilustrativos incluyen plásmidos, tales como los plásmidos que se basan en el pBR322, pSKF, pET23D, y los sistemas de fusión de expresión como GST y LacZ. Los ejemplos de vectores de expresión de mamíferos incluyen, por ejemplo, el pCDM8 (Seed, 1987, Nature, 329:840) y el pMT2PC (Kaufman y otros, 1987, EMBO J., 6:187-195). Los vectores de expresión de mamíferos comercialmente disponibles que pueden ser adecuados para la expresión de péptidos recombinantes de la invención incluyen, por ejemplo, pMAMneo (Clontech, Mountain View, CA), pcDNA4 (Invitrogen, Carlsbad, CA), pCiNeo (Promega, Madison, Wl), pMCI neo (Stratagene, La Jolla, CA), pXT1 (Stratagene, La Jolla, CA), pSG5 (Stratagene, La Jolla, CA), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-1(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460), e IZD35 (ATCC 37565).

Las etiquetas del epítopo se pueden agregar, además, a las proteínas recombinantes para proporcionar métodos convenientes de aislamiento, por ejemplo, c-myc, la etiqueta hemoglutinina (HA), la etiqueta 6-His, la proteína de unión a maltosa, la etiqueta VSV-G, o la etiqueta anti-FLAG, y otras disponibles en la materia.

Los vectores de expresión que contiene los elementos reguladores de los virus eucarióticos se pueden usar en vectores de expresión eucariota, por ejemplo, los vectores de SV40, vectores del virus del papiloma, y los vectores derivados del virus de Epstein-Barr. Otros vectores eucarióticos ilustrativo incluyen el pMSG, el pAV009/A +, el pMTO10/A +, el pMAMneo 5, el baculovirus pDSVE, y cualquier otro vector que permite la expresión de proteínas, bajo la dirección del promotor de CMV, el promotor temprano de SV40, el promotor tardío de SV40, el promotor de la metalotioneína, el promotor del virus del tumor mamario murino, el promotor del virus del sarcoma de Rous, el promotor polihedrina, u otros promotores que muestran eficacia para la expresión en células eucariotas.

Algunos sistemas de expresión tienen marcadores que proporcionan la amplificación del gen, tal como la neomicina, la timidina quinasa, la higromicina fosfotransferasa B, y la dihidrofolato reductasa. Por otra parte, los sistemas de expresión de alto rendimiento que no impliquen la amplificación del gen son también adecuados, tales como mediante el uso de un vector de baculovirus en células de insecto, con una secuencia que codifica un péptido mimético de la estrescopina bajo la dirección del promotor polihedrina u otros promotores fuertes de baculovirus.

Los elementos que se pueden incluir en los vectores de expresión incluyen, además, un replicón que funciona en E. coli, un gen que codifica la resistencia a los antibióticos para permitir la selección de bacterias que albergan los plásmidos recombinantes, y los sitios de restricción únicos en las regiones del plásmido que no sean esenciales para permitir la inserción controlada de secuencias eucariotas. El gen particular de resistencia a antibióticos se puede seleccionar de los muchos genes de resistencia conocidos en la materia. Las secuencias de procariotas se pueden elegir de tal manera que no interfieren con la replicación del ADN en las células eucariotas, si es necesario o deseado.

Los métodos de transfección conocidos se pueden usar para producir las líneas celulares de bacterias, levadura, mamíferos, insectos que expresan grandes cantidades de una mimética de SCP, que luego se purifica mediante el uso de técnicas estándar, tales como la precipitación selectiva con sustancias como el sulfato de amonio, la cromatografía en columna, y los métodos de inmuno-purificación.

La transformación de las células eucariotas y procariotas se puede realizar de acuerdo a técnicas estándar (véase, por ejemplo, Morrison, 1977, J Bact., 132:349-351 ; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology, 101 :347-362).

Cualquiera de los procedimientos conocidos adecuados para la introducción de secuencias de nucleótidos extrañas en las células huéspedes se puede usar para introducir el vector de expresión. Estos incluyen el uso de reactivos tales como el Superfect (Qiagen), los liposomas, la transfección con fosfato de calcio, el polibreno, la fusión de protoplastos, la electroporación, la microinyección, los vectores de plásmido, los vectores virales, la aceleración de partículas biolística (pistola de genes), o cualquier otro método conocido para introducir el ADN genómico clonado, el ADNc, el ADN sintético u otro material genético extraño en una célula huésped (véase, por ejemplo, Sambrook y otros, supra). El procedimiento particular de ingeniería genética seleccionado debe ser capaz de introducir con éxito al menos un gen en la célula huésped capaz de expresar el ARN, el ARNm, el ADNc, o el gen de una estrescopina mimética.

Como sería evidente para los experimentados en la materia, para la transfección estable de células de mamíferos, según el vector de expresión y la técnica de transfección usada, sólo una pequeña fracción de las células puede integrar el ADN extraño en su genoma. Con el fin de identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica para un marcador de selección (por ejemplo, para la resistencia a los antibióticos) puede introducirse en las células huéspedes junto con el gen de interés. Los marcadores de selección ejemplares son los que confieren resistencia a fármacos, tales como el G-418, la puromicina, la geneticina, la higromicina y el metotrexato. Las células transfectadas establemente con el ácido nucleico introducido se pueden seleccionar y localizar por la selección del fármaco (por ejemplo, las células que han incorporado el gen marcador de selección sobrevivirán, mientras que las otras células mueren).

Un elemento de regulación heterólogo se puede insertar en una línea celular estable o microorganismo clonado, de manera que esté operativamente enlazado y active la expresión de genes endógenos, mediante el uso de técnicas como la recombinación homologa dirigida, por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos núm. 5,272,071 y en la publicación internacional núm. WO 91/06667. Después de que el vector de expresión se introduce en las células, las células transfectadas se cultivan preferentemente en condiciones óptimas, que favorecen la expresión del péptido mimético de la estrescopina, el cual se recupera del cultivo mediante el uso de las técnicas estándar indicadas a continuación. Los métodos de cultivo de células procariotas o eucariotas se conocen en la materia; véase, por ejemplo, Sambrook y otros, supra; Freshney, 1993, Culture of Animal Cells, 3.° ed.

Como alternativa al uso de sistemas celulares para la producción de péptidos, los sistemas libres de células demostraron capacidad para la expresión génica y la síntesis en procariotas (Zubay G., Annu Rev Genet, 1973, 7:267-287) y los sistemas eucarióticos (Pelham y otros, Eur J Biochem., 1976, 67:247-256; Anderson y otros, Meth Enzymol., 1983, 101 :635-644). Estos sistemas pueden usar ya sea nucleótidos del ARNm o del ADN para las reacciones de síntesis de péptidos. Una técnica preferida para la producción de péptido libre de células usa el lisado de reticulocitos, la ARN polimerasa, los nucleótidos, sales, y el inhibidor de la ribonucleasa en una reacción rápida de transcripción/traducción juntas (TNT®, Promega, Madison, Wl, Estados Unidos).

Producción de sintéticos Los péptidos según lo ejemplificado en la invención se pueden preparar mediante el uso de las técnicas de síntesis en fase solida descritas inicialmente por Merrifield, in J. Am. Chem. Soc, 15:2149-2154 (1963). Otras técnicas de síntesis de péptidos se pueden encontrar, por ejemplo, en . Bodanszky y otros, (1976) Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 2o Ed.; Kent and Clark-Lewis en Synthetic Peptides in Biology and Medicine, págs. 295-358, eds. Alitalo, K., y otros, Science Publishers, (Amsterdam, 1985); así como referencia a otros trabajos conocidos por aquellos con experiencia en la materia.

Un resumen de las técnicas de síntesis de péptidos se pueden encontrar en J. Stuart and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthelia, Pierce Chemical Company, Rockford, III. (1984), que se incorpora en la presente descripción como referencia. La síntesis de péptidos por métodos de solución también se pueden usar, como se describe en The Proteins, Vol. II, 3.° Ed., págs. 105-237, Neurath, H. y otros Eds., Academic Press, Nueva York, N.Y. (1976). Los grupos de protección adecuados para su uso en tales síntesis se encuentran en los textos anteriores, así como en J. F. W. McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, Nueva York, N.Y. (1973), el cual se incorpora en la presente descripción como referencia. Generalmente, estos métodos de síntesis implican la adición secuencial de uno o más residuos de aminoácidos o residuos de aminoácidos adecuados protegidos, a una cadena peptídica en crecimiento. Normalmente, tanto el grupo amino o carboxilo del primer residuo de aminoácido está protegido por un grupo de protección adecuado selectivamente extraíble. Otro grupo de protección selectivamente extraíble se usa para los aminoácidos que contienen un grupo lateral reactivo, tal como la lisina.

Las técnicas de síntesis de bloque también se pueden aplicar a los métodos de síntesis de péptidos tanto de fase sólida y en solución. En lugar de la adición secuencial de un solo residuo de aminoácido, los bloques preformados que comprenden dos o más residuos de aminoácidos en la secuencia se usan ya sea como subunidades de partida o unidades añadidas con posterioridad, en lugar de los residuos de aminoácidos solos.

Mediante el uso de la síntesis en fase sólida como ejemplo, el aminoácido protegido o derivatizado se conecta a un soporte sólido inerte a través de su grupo carboxilo o amino desprotegido. El grupo protector del grupo amino o carboxilo se elimina entonces selectivamente y el siguiente aminoácido en la secuencia que tiene el grupo complementario (amino o carboxilo) adecuadamente protegido se mezcla y se hace reaccionar con el residuo que ya está unido al soporte sólido. El grupo protector del grupo amino o carboxilo se elimina de este residuo de aminoácido que acaba de agregarse, y el siguiente aminoácido (convenientemente protegido) se añade a continuación, y así sucesivamente. Después de que todos los aminoácidos deseados se han enlazado en la secuencia apropiada, cualquier terminal restante y el grupo lateral de protección de los grupos (y el soporte sólido) se eliminan de forma secuencial o simultánea, para proporcionar el péptido final. Los péptidos de la invención se encuentran, preferentemente, desprovistos de los aminoácidos bencilados o metilbencilados. Tales fracciones protectoras de grupos se pueden usar en el curso de la síntesis, pero se retiran antes de que los péptidos se usen. Las reacciones adicionales pueden ser necesarias, como se describe en otra parte, para formar enlaces intramoleculares para restringir la conformación.

La síntesis de soporte sólido se puede lograr con los sintetizadores de proteínas automatizados (Protemist®, CelIFree Sciences, Matsuyama Ehime 790-8577, Japón; Symphony SMPS-110, Rainin, Woburn, MA, Estados Unidos; ABI 433A peptide synthesizer, Applied Biosystems, Foster City, CA, Estados Unidos). Estas máquinas tienen la capacidad para llevar a cabo reacciones automatizadas de proteínas que permiten un mayor control y optimización de la síntesis.

Purificación Se pueden emplear un número de procedimientos para aislar o purificar el péptido de la invención. Por ejemplo, la cromatografía en columna se puede usar para purificar péptidos, basados en sus propiedades físicas, es decir, hidrofobicidad. Por otra parte, las proteínas que tienen establecidas las propiedades de adhesión molecular se pueden fusionar en forma reversible con el péptido de la invención. Con un ligando apropiado para la proteína de fusión, el péptido mimético de la estrescopina se puede adsorber selectivamente a una columna de purificación y luego liberarlo de la columna de una forma sustancialmente pura. La proteína de fusión podrá, entonces, eliminarse por la actividad enzimática. Las estrategias alternativas de purificación en columna pueden emplear anticuerpos contra el péptido mimético de la estrescopina. Estos anticuerpos pueden ser conjugados a las matrices de las columnas y los péptidos purificados a través de estas columnas de inmunoafinidad.

Las proteínas recombinantes se pueden separar de las reacciones huéspedes por técnicas de separación adecuadas, como el fraccionamiento con sal. Este método se puede usar para separar las proteínas de la célula huésped no deseadas (o proteínas derivadas de los medios de cultivo celular) de la proteína recombinante de interés. Una sal ejemplar es el sulfato de amonio, que precipita las proteínas mediante la reducción efectiva la cantidad de agua en la mezcla de proteínas (las proteínas entonces precipitan sobre la base de su solubilidad). Cuanto más hidrofóbica es una proteína, mayor es la probabilidad de precipitar a bajas concentraciones de sulfato de amonio. Un protocolo de aislamiento ilustrativo incluye la adición de sulfato de amonio saturado a una solución de proteína, de manera que la concentración de sulfato de amonio resultante es entre 20-30 %, para precipitar las proteínas más hidrofóbicas. El precipitado se descarta después (a menos que la proteína de interés sea hidrofóbica) y el sulfato de amonio se añade al sobrenadante a una concentración conocida para precipitar la proteína de interés. El precipitado se solubiliza después en tampón y el exceso de sal se elimina para lograr la pureza deseada, por ejemplo, a través de la diálisis o la diafiltración. Otros métodos conocidos que dependen de la solubilidad de las proteínas, tal como la precipitación con etanol frío, se pueden usar para fraccionar mezclas complejas de proteínas.

En otros ejemplos de técnicas de aislamiento o purificación, el peso molecular del péptido de la invención se puede usar para aislarlo de las proteínas de mayor y menor tamaño mediante el uso de la ultrafiltración a través de membranas de tamaño de poro diferentes (por ejemplo, membranas Amicon o Millipore). Como primer paso, la mezcla de proteínas se ultra-filtra a través de una membrana con un tamaño de poro que tiene un menor peso molecular de corte que el peso molecular de la proteína de interés. La materia retenida de la ultrafiltración se ultra-filtra después contra una membrana con un peso molecular de corte mayor que el peso molecular de la proteína de interés. La proteína recombinante pasará a través de la membrana en el filtrado, y el filtrado se puede pasar después por una cromatografía.

Modificaciones químicas El péptido de la invención puede ser objeto de modificaciones químicas dirigidas, tales como la nivelación con maleimida, la fijación de polietilenglicol (PEG), la maleidificación, la acilación, la alquilación, la esterificación, y la amidificación, para producir análogos estructurales del péptido. Alguien con experiencia en la materia agradecerá la existencia de una variedad de técnicas de modificación química y fracciones, véase, por ejemplo patentes de los Estados Unidos núms. 5,554,728; 6,869,932; 6,828,401 ; 6,673,580; 6,552,170; 6,420,339; pub. de pat. de los Estados Unidos núm. 2006/0210526 y la sol. int. de pat. 2006/0210526 y sol. int. de pat. núm. WO 2006/136586. Preferentemente, las modificaciones químicas se llevan a cabo en el péptido aislado, por ejemplo, para aumentar la eficiencia de reacción.

En ciertas modalidades de la invención, el péptido de la invención contiene un terminal C amidado. Tales procedimientos de modificación de péptido se pueden realizar en péptidos purificados o aislados, como en el caso de la síntesis en fase sólida, se puede realizar durante el procedimiento de síntesis. Tales procedimientos se revisan en Ray y otros, Nature Biotechnology, 1993, vol. 11 , págs. 64 - 70; Cottingham y otros, Nature Biotechnology, 2001 , vol. 19, págs. 974 - 977; Walsh y otros, Nature Biotechnology, 2006, vol. 24, págs. 1241 - 1252; Sol. pat. Estados Unidos 2008/0167231.

Los péptidos de la invención pueden contener ciertos enlazadores intermedios que sirven para unir el péptido y una fracción de PEG. Tales enlazadores transmitirán inmunogenicidad y toxicidad mínima a los huéspedes Los ejemplos de tales enlazadores se pueden encontrar en Bailón y otros, PSTT, 1998, vol. 1 (8), págs. 352-356.

En ciertas modalidades la invención se dirige a un conjugado que comprende un péptido aislado, que consiste esencialmente de una secuencia establecida en la SEQ ID NO: 29 que contiene un CONH2 en su extremo carboxilo y un enlazador intermedio conjugado con el residuo de cisteína en la posición 28 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29. En ciertas modalidades el enlazador intermedio es la N-etilsuccinimida. En modalidades adicionales el enlazador intermedio puede ser sulfona de vinilo. En modalidades adicionales el enlazador intermedio puede ser acetamida. En ciertas modalidades el enlazador intermedio puede ser ortopiridil disulfuro.

En modalidades adicionales la invención se dirige hacia un conjugado que comprende un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 29 con un CONH2 en su extremo carboxilo, un enlazador N-etilsuccinimida conjugado con el residuo de cisteína en la posición 28 de la SEQ ID NO: 29, en donde el enlazador N-etilsuccinimida también está unido a una fracción de PEG. En ciertas modalidades el peso molecular de la fracción PEG está en el intervalo de aproximadamente 2 kDa a aproximadamente 80 kDa. En ciertas modalidades la masa del PEG es aproximadamente 20 kDa. En modalidades preferidas el péptido agonista del CRHR2 comprende un péptido de SEQ ID NO: 82 o SEQ ID NO: 102. En ciertas modalidades la masa de PEG es aproximadamente 5 kDa. En ciertas otras modalidades la masa de PEG es aproximadamente 12 kDa. En ciertas modalidades la masa de PEG es aproximadamente 20 kDa. En ciertas modalidades la masa de PEG es aproximadamente 30 kDa. En ciertas modalidades la masa de PEG es aproximadamente 40 kDa. En ciertas modalidades la masa de PEG es aproximadamente 80 kDa. En ciertas modalidades la fracción de PEG es lineal. En otras modalidades la fracción de PEG es ramificada. Las fracciones de PEG se pueden sintetizar de acuerdo a los métodos conocidos por alguien con experiencia en la materia. Por otra parte, las fracciones de PEG están disponibles comercialmente, tales como Sunbright ® ME-020MA, Sunbright ® ME-050 A, y Sunbright ® ME-200MA (NOF Corp, Japón; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos.) La invención se refiere además a las sales farmacéuticamente aceptables del péptido de la invención y los métodos de uso de dichas sales. Una sal farmacéuticamente aceptable se refiere a una sal de un ácido o base libre del péptido que es no tóxica, biológicamente tolerable, o de cualquier otra forma biológicamente adecuada para la administración al sujeto. Véase, generalmente, S.M. Berge, y otros, "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci., 1977, 66:1-19, y Handbook of Pharmaceutical Salts, Pnoperties, Selection, and Use, Stahl and Wermuth, Eds., Wiley-VCH y VHCA, Zurich, 2002. Las sales farmacéuticamente aceptables son aquellas que son farmacéuticamente efectivas y adecuadas para el contacto con los tejidos de pacientes, sin toxicidad, irritación o respuesta alérgica indebida. Un péptido puede poseer un grupo suficientemente acídico, un grupo suficientemente básico, o ambos tipos de grupos funcionales, y reaccionar de manera acorde con un cierto número de bases inorgánicas u orgánicas, para formar una sal farmacéuticamente aceptable. Como ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables se incluyen sulfates, pirosulfatos, bisulfatos, sulfitos, bisulfitos, fosfatos, monohidrógeno-fosfatos, dihidrógenofosfatos, metafosfatos, pirofosfatos, cloruros, bromuros, yoduros, acetatos, propionatos, decanoatos, caprilatos, acrilatos, formatos, isobutiratos, caproatos, heptanoatos, propiolatos, oxalatos, malonatos, succinatos, suberatos, sebacatos, fumaratos, maleatos, butino-1 ,4-dioatos, hexina-1 ,6-dioatos, benzoatos, clorobenzoatos, metilbenzoatos, dinitrobenzoatos, hidroxibenzoatos, metoxibenzoatos, ftalatos, sulfonatos, xilenesulfonatos, fenilacetatos, fenilpropionatos, fenilbutiratos, citratos, lactatos, ?-hidroxibutiratos, glicolatos, tartratos, metano-sulfonatos, propanesulfonatos, naftaleno-1 -sulfonatos, naftaleno-2-sulfonatos y mandelatos.

Si el péptido de la invención contiene un nitrógeno básico, la sal farmacéuticamente aceptable deseada se puede preparar por cualquier método adecuado disponible en la materia, por ejemplo, tratamiento de la base libre con un ácido inorgánico, tal como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido yodhídrico, ácido perclórico, ácido sulfúrico, ácido sulfámico, ácido nítrico, ácido bórico, ácido fosfórico, y similares, o con un ácido orgánico, tal como ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido fenilacético, ácido propiónico, ácido esteárico, ácido láctico, ácido ascórbico, ácido maleico, ácido hidroximaleico, ácido málico, ácido pamoico, ácido isetiónico, ácido succínico, ácido valérico, ácido fumárico, ácido sacarínico, ácido malónico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido glicólico, ácido salicilico, ácido oléico, ácido palmítico, ácido láurico, un ácido piranosidilo, tal como el ácido glucurónico o ácido galacturónico, un ácido alfa-hidroxi, tal como el ácido mandélico, ácido cítrico, o ácido tartárico, un aminoácido, tal como ácido aspártico o ácido glutámico, un ácido aromático, tal como ácido benzoico, ácido 2-acetoxibenzoico, ácido naftoico, o ácido cinámico, un ácido sulfónico, tal como ácido laurilsulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido 2-naftalenosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, hidroxietanosulfónico, un ácido ciclohexanosulfámico, cualquier mezcla de ácidos compatible tal como las que se dan como ejemplos en la presente, y cualquier otro ácido y mezcla de éstos que se consideran equivalentes o sustitutos aceptables a la luz del nivel ordinario del experto en esta tecnología.

Si el péptido de la invención contiene un grupo ácido, tal como un ácido carboxílico o ácido sulfónico, la sal farmacéuticamente aceptable que se desea obtener se puede preparar por cualquier método adecuado, por ejemplo, mediante el tratamiento del ácido libre con una base inorgánica u orgánica, tal como una amina (primaria, secundaria o terciaria), un hidróxido de metal alcalino, un hidróxido de metal de tierras alcalinas, cualquier mezcla de bases compatible tal como aquellas indicadas como ejemplos en la presente descripción, y cualquier otra base o mezcla de éstos considerados como equivalentes o sustitutos aceptables de acuerdo con el conocimiento de las personas con experiencia en la materia. Como ejemplos ilustrativos de sales adecuadas se incluyen sales orgánicas derivadas de aminoácidos, tales como glicina y arginina, amoníaco, carbonatos, bicarbonatos, aminas primarias, secundarias y terciarias y aminas cíclicas, tales como benzilaminas, pirrolidina, piperidina, morfolina y piperazina, y sales inorgánicas derivadas del sodio, calcio, potasio, magnesio, manganeso, hierro, cobre, cinc, aluminio y litio. Las bases orgánicas o inorgánicas representativas incluyen adicionalmente benzatina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, meglumina y procaína.

La invención también se refiere a profármacos farmacéuticamente aceptables de los compuestos, y a métodos de tratamiento que emplean dichos profármacos farmacéuticamente aceptables. El término "profármaco" significa un precursor de un compuesto designado que, después de la administración a un sujeto produce el compuesto in vivo a través de un proceso químico o fisiológico tal como solvolisis o clivaje enzimático, o bajo condiciones fisiológicas. Un "profármaco farmacéuticamente aceptable" es un profármaco no tóxico, biológicamente tolerable y, de alguna otra manera, biológicamente adecuado para su administración al sujeto. Los procedimientos ilustrativos para la selección y preparación de derivados de profármacos adecuados se describen, por ejemplo, en "Design of Prodrugs", ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985.

Como ejemplos de profármacos se incluyen los compuestos que tienen un residuo de aminoácido o una cadena de polipéptidos de dos o más residuos de aminoácidos (por ejemplo, dos, tres o cuatro) enlazados en forma covalente mediante una amida o enlace éster un amino libre, hidroxilo o grupo de ácido carboxílico del compuesto. Como ejemplos de aminoácidos se incluyen los veinte aminoácidos de origen natural, que comúnmente se denominan con tres letras, así como 4-hidroxiprolina, hidroxilisina, demosina, isodemosina, 3-metilhistidina, norvalina, beta-alanina, gamma-ácido aminobutírico, citrulina homocisteína, homoserina, ornitina y metionina sulfona.

Se pueden producir otros tipos de profármacos, por ejemplo, al derivar grupos de estructuras de carboxilo libre del compuesto como amidas o alquilo ésteres. Como ejemplos de amidas se incluyen las derivadas del amoniaco, alquilo aminas primarias C1-6 y aminas secundarias di(Ci-6 alquilo). Las aminas secundarias incluyen entidades anulares heterocicloalquilo ó heteroarilo con 5 o 6 elementos. Como ejemplos de amidas se incluyen las que derivan del amoníaco, Ci-3aminas alquilo primarias y di(Ci-2alquilo)am¡nas. Como ejemplos de ésteres de la invención se incluyen ésteres C¿. ycicloalquilo, fenilo, y fenilo(Ci-6alquilo). Entre los ésteres preferidos se incluyen los metil ésteres. Los profármacos también se pueden preparar al derivar grupos hidroxilo por medio del uso de grupos que incluyan hemisuccinatos, ésteres fosfato, dimetilaminoacetatos y fosforiloximetiloxicarbonilos, según los procedimientos descritos en Fleisher y otros, Adv. Drug Delivery Rev. 1996, 19, 115-130. Los derivados de carbamato de los grupos hidroxilo y amino también pueden producir profármacos. Los derivados de carbonatos, ésteres sulfonatos, y ésteres sulfato de grupos hidroxilo pueden, además, proporcionar profármacos. La derivación de grupos hidroxi como ésteres (aciloxi)-metil y (aciloxi)-etil, en donde el grupo acilo puede ser un éster alquilo opcionalmente sustituido con una o más funcionalidades de éter, amina, o ácido carboxílico, o donde el grupo acilo es un éster aminoácido según se describió anteriormente, también sirve para producir profármacos. Los profármacos de este tipo se pueden preparar como se describió en Greenwald, y otros, J Med Chem. 1996, 39, 10, 1938-40. Las aminas libres pueden derivarse además como amidas, sulfonamidas o fosfonamidas. Todas estas entidades de profármacos pueden incorporar grupos que incluyen funcionalidades de éter, amina y ácido carboxílico.

La presente invención se refiere, además, a los metabolitos farmacéuticamente activos de los compuestos, los que se pueden usar también en los métodos de la invención. Un "metabolito farmacéuticamente activo" significa un producto farmacológicamente activo del metabolismo en el cuerpo del compuesto o sal de éste. Los profármacos y metabolitos activos de un compuesto se pueden determinar mediante técnicas de rutina conocidas o disponibles en la materia. Véase, por ejemplo, Bertolini, y otros, J Med Chem. 1997, 40, 201 1-2016; Shan, y otros, J Pharm Sci. 1997, 86 (7), 765-767; Bagshawe, Drug Dev Res. 1995, 34, 220-230; Bodor, Adv Drug Res. 1984, 13, 224-331 ; Bundgaard, Design of Prodrugs (Elsevier Press, 1985); y Larsen, Design and Application of Prodrugs, Drug Design and Development (Krogsgaard-Larsen y otros, eds., Harwood Academic Publishers, 1991).

Composiciones farmacéuticas En modalidades particulares de la invención, los péptidos agonistas del CRHR2 se usan solos, o en combinación con uno o más ingredientes adicionales, para formular las composiciones farmacéuticas. Una composición farmacéutica comprende una cantidad efectiva de al menos un compuesto de acuerdo con la invención.

En algunas modalidades la composición farmacéutica comprende un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 29, en donde el péptido contiene un CONH2 en su extremo carboxilo y comprende, además, un N-etilsuccinimida o un enlazador acetamida unido al residuo de cisteína en la posición 28, en donde dicho enlazador también está enlazado a una fracción de PEG. Las fracciones de PEG se clasifican por su peso molecular y las características físicas, tales como ser lineal o ramificado, y que contiene uno o más fracciones del enlazador usadas para unir el PEG al sustrato peptídico. En ciertas modalidades preferidas, el péptido contiene una o dos de dichos enlazadores.

En ciertas modalidades la composición farmacéutica que comprende la fracción de PEG puede contener una fracción de PEG cuyo peso puede estar en el intervalo entre aproximadamente 2 kDa a aproximadamente 80 kDa. En ciertas modalidades la masa de la fracción de PEG es aproximadamente 2 kDa. En modalidades adicionales, la masa de PEG es aproximadamente 5 kDa. En ciertas modalidades la masa de PEG es aproximadamente 12 kDa. En ciertas modalidades la masa de PEG es aproximadamente 20 kDa. En ciertas modalidades la masa de PEG es aproximadamente 30 kDa. En ciertas modalidades la masa de PEG es aproximadamente 40 kDa. En ciertas modalidades la masa de PEG es aproximadamente 80 kDa. Dichas composiciones pueden comprender además un excipiente farmacéuticamente aceptable.

La descripción también proporciona composiciones (que incluye composiciones farmacéuticas) que comprenden un compuesto o derivados descritos en la presente descripción, y uno o más de vehículo, excipiente, y diluyente farmacéuticamente aceptable. En ciertas modalidades de la invención, una composición puede contener, además, pequeñas cantidades de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes reguladores del pH. En una modalidad concreta, la composición farmacéutica es farmacéuticamente aceptable para la administración a un humano. En ciertas modalidades la composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva de un compuesto o derivado descritos en la presente descripción. La cantidad de un compuesto o derivado de la invención que será terapéuticamente o profilácticamente efectiva se puede determinar por las técnicas clínicas estándar. Los ejemplos de cantidades efectivas se describen con más detalle en las secciones siguientes. En ciertas modalidades de la invención, una composición puede contener, además, un estabilizador. Un estabilizador es un compuesto que reduce la velocidad de degradación química de los péptidos de la composición modificados. Los estabilizadores adecuados incluyen, pero no se limitan a, los antioxidantes, como el ácido ascórbico, los tampones de pH, o tampones salinos Las composiciones farmacéuticas pueden estar en cualquier forma adecuada para su administración a un sujeto, preferentemente, un humano. En ciertas modalidades las composiciones se encuentran en forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, pildoras, comprimidos, polvos, y formulaciones de liberación sostenida. Las composiciones pueden también ser, particularmente, formas de unidad de dosificación. Los ejemplos de las formas de unidad de dosificación incluyen, pero sin limitarse a: comprimidos, tabletas, comprimidos, tales como comprimidos de gelatina blanda elástica, obleas, grageas, tabletas para chupar, dispersiones, supositorios, ungüentos, cataplasmas (emplastos), pastas, polvos, apositos, cremas; emplastos, soluciones, parches, aerosoles (por ejemplo, aerosoles nasales o inhaladores), geles, formas de dosificación líquida adecuadas para la administración oral o de la mucosa de un paciente, que incluye suspensiones (por ejemplo, las suspensiones liquidas acuosas o no acuosas, emulsiones de aceite en agua, o emulsiones líquidas de agua en aceite), soluciones y elixires, formas de dosificación líquida adecuadas para la administración parenteral a un sujeto, y sólidos estériles (por ejemplo, sólidos cristalinos o amorfos) que se pueden reconstituir para proporcionar formas de dosificación líquidas, adecuadas para la administración parenteral a un sujeto.

En una modalidad concreta el sujeto es un mamífero tal como una vaca, caballo, oveja, cerdo, ave, gato, perro, ratón, rata, conejo o cobaya. En una modalidad preferida el sujeto es un ser humano. En una modalidad preferida el sujeto es un humano. Preferentemente, la composición farmacéutica es adecuada para la administración veterinaria y/o a humanos. De acuerdo con esta modalidad el término "farmacéuticamente aceptable" significa, aprobado para su uso en animales y, más particularmente, para el uso en humanos, por una agencia regulatoria del gobierno federal o estatal o enumerado en la Farmacopea de los Estados Unidos u otras farmacopeas generalmente reconocidas.

Los vehículos farmacéuticos adecuados para ser usadas en las composiciones son líquidos estériles, tales como el agua y aceites, se incluyen aquellos de petróleo, o de origen animal, vegetal o sintético. En una modalidad particular el aceite es el aceite de cacahuete, el aceite de soja, el aceite mineral o el aceite de sésamo. El agua es un portador preferido cuando la composición farmacéutica es administrada por vía intravenosa. Las soluciones salinas y las soluciones de dextrosa y glicerina acuosas se pueden emplear también como portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Otros ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados se conocen en la materia, por ejemplo, como lo describe E. W. Martin en Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18.° ed. (Mack Publishing, Easton Pa.).

Los excipientes adecuados para usar en las composiciones incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sílice, estearato sódico, monoestearato de glicerina, talco, cloruro sódico, leche descremada seca, glicerina, propilenglicol, agua, y etanol. Si un excipiente particular es adecuado para ser incorporada en una composición farmacéutica, depende de una variedad de factores bien conocidos en la materia, que incluye pero no se limita a, la vía de administración y los ingredientes activos específicos en la composición.

En ciertas modalidades de la invención una composición es una composición anhidra. Las composiciones anhidras se pueden preparar mediante el uso de ingredientes anhidros o que contienen baja humedad y condiciones de bajo contenido de humedad o de baja humedad. Las composiciones que comprenden péptidos modificados con una amina primaria o secundaria son preferentemente anhidros si el contacto sustancial con la humedad y/o la humedad durante la fabricación, el envasado y/o el almacenamiento es el esperado. Una composición anhidra se debe preparar y almacenar de tal manera que su naturaleza anhidra se mantenga. Por consiguiente, las composiciones anhidras se envasan, preferentemente, mediante el uso de materiales conocidos para evitar la exposición al agua de manera que se puedan incluir en los formularios de kits adecuados. Los ejemplos de envases adecuados incluyen, pero no se limitan a, láminas herméticamente selladas, plásticos, envases de dosis unitarias (por ejemplo, frascos), envases tipo burbujas, y los paquetes de tira.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos o derivados descritos en la presente descripción, o sus sales y solvatos farmacéuticamente aceptables, se formulan para ser compatibles con la ruta de administración prevista. Las formulaciones son, preferentemente, para la administración subcutánea, pero pueden ser para la administración por otros medios, tales como por inhalación o insuflación (ya sea a través de la boca o la nariz), intradérmica, oral, bucal, parenteral, vaginal o rectal. Preferentemente, las composiciones se formulan para proporcionar una mayor estabilidad química del compuesto durante el almacenamiento y el transporte. Las formulaciones pueden ser líofilizadas o formulaciones líquidas.

En una modalidad los compuestos o derivados se formulan para la administración intravenosa. Las formulaciones intravenosas pueden incluir vehículos estándar, tales como soluciones salinas. En otras modalidades los compuestos o derivados se formulan para la inyección. En una modalidad preferida los compuestos o derivados son formulaciones líofilizadas estériles, sustancialmente libres de contaminación de material celular, productos químicos, virus o toxinas. En una modalidad particular los compuestos o derivados se formulan en forma líquida. En otra modalidad particular las formulaciones de inyección se presentan en envases estériles de dosis única. En una modalidad particular las formulaciones de inyección se presentan en envases estériles de dosis única. Las formulaciones pueden o no contener un conservante añadido. Los preparados líquidos pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión.

Métodos de administración.

Un compuesto o derivado que se describe en la presente descripción, o una sal farmacéuticamente aceptable de este, se administra preferentemente como un componente de una composición que comprende, opcionalmente, un vehículo farmacéuticamente aceptable. El compuesto o derivado se administra, preferentemente, por vía subcutánea. Otro método de administración preferido es mediante inyección intravenosa o infusión intravenosa continua del compuesto o derivado. Preferentemente, la administración alcanza un estado de equilibrio en los niveles de plasma sanguíneo por la absorción sistémica lenta y el aclaramiento del compuesto o derivado o mantiene un nivel de concentración en el plasma sanguíneo en un intervalo definido por un período de tiempo.

En ciertas modalidades el compuesto o derivado se administra por cualquier otra vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en bolo, o por absorción a través de los revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, la mucosa oral, rectal, y la mucosa intestinal). Los métodos de administración incluyen, pero no se limitan a: parenteral, intradérmico, intramuscular, intraperitoneal, intravenoso, subcutáneo, intranasal, epidural, oral, sublingual, intranasal, intracerebral, intravaginal, transdérmico, rectal, por inhalación o por vía tópica, particularmente para los oídos, la nariz, los ojos o la piel. En la mayoría de los casos la administración tendrá como resultado la liberación del compuesto o derivado al torrente sanguíneo.

La preparación puede ser en forma de tabletas, cápsulas, sachets, grageas, polvos, gránulos, pastillas, polvos para reconstitución, preparaciones líquidas o supositorios. Preferentemente, las composiciones se formulan para infusión intravenosa o inyección de bolo, infusión subcutánea o inyección de bolo, o inyección intramuscular.

El compuesto se administra, preferentemente, por rutas no orales. Por ejemplo, se pueden formular composiciones para administración rectal en forma de supositorio. Para uso parenteral, que incluye rutas intravenosas, intramusculares, intraperitoneales o subcutáneas, se pueden proporcionar los agentes de la invención en soluciones o suspensiones acuosas estériles, reguladas a un pH adecuado e isotonicidad o un aceite parenteralmente aceptable. Los vehículos acuosos adecuados incluyen la solución de Ringer, solución de dextrosa, y cloruro sódico isotónico. Dichas formas pueden presentarse como dosis unitarias en forma de ampollas o dispositivos de inyección descartables, tales como multidosis, por ejemplo, frascos de los que se puede sacar la dosis adecuada, o en forma sólida o preconcentrada que se puede usar para preparar una formulación inyectable. Las dosis de infusión ilustrativas se pueden administrar durante un período en el intervalo desde varios minutos hasta varios días. En otra modalidad una cantidad efectiva del péptido de la invención se puede recubrir en nanopartículas o suministrarse en un "depósito" adecuado para el suministro por vía subcutánea (Hawkins y otros, Adv Drug Deliv Rev., 2008, vol. 60, págs. 876-885; Montalvo y otros, Nanotechnology, 2008, vol. 19, págs. 1 -7).

Los agentes activos se pueden administrar mediante métodos de inhalación. Tales métodos pueden usar técnicas de formulación en polvo seco (Johnson KA, Adv Drug Del Rev., 1997, vol. 26(1 ), págs. 3-15) y/o aerosol (Sangwan y otros, J Aerosol Med., 2001 , vol. 14(2), págs. 185-195; solicitud de patente internacional núm. WO2002/094342).

En las modalidades de los métodos de tratamiento de acuerdo con la invención, una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente activo de acuerdo con la invención se administra a un individuo que padece de o se diagnostica como que tiene una enfermedad, trastorno o afección, tales como la insuficiencia cardiaca, la diabetes, la pérdida de músculo esquelético, y la sarcopenia. Las afecciones adicionales incluyen la actividad motora inadecuada, consumo de alimento, o la necesidad de una actividad cardioprotectora, broncorelajante, y/o antiinflamatoria. Las cantidades o dosis terapéuticamente efectivas de los agentes activos de la presente invención se pueden determinar con métodos de rutina tales como modelado, estudios de aumento de dosis o pruebas clínicas, y tomando en consideración factores de rutina, por ejemplo, el modo o ruta de administración o suministro de fármaco, la farmacocinética del agente, la gravedad y curso de la enfermedad, trastorno o afección, la terapia previa o actual del sujeto, la condición de salud del sujeto y sus respuesta a los fármacos y la opinión del médico tratante. Un índice de dosis intravenosa ejemplar está en el intervalo de aproximadamente 0.2 ng a aproximadamente 52 ng de agente activo relacionado con estrescopina por kg de peso del sujeto por minuto, preferentemente, aproximadamente 0.2 ng/kg/min a aproximadamente 22 ng/kg/min, o equivalentemente de aproximadamente 0.3 pg/kg aproximadamente 32 pg/kg al día. En el caso de la infusión en bolo o inyección subcutánea, la dosis total se puede administrar en unidades de dosis única o divididas (por ejemplo, BID, TID, QID, dos veces a la semana, cada dos semanas o mensual). Para un humano de 70 kg, un intervalo ilustrativo para una cantidad de dosis adecuada es de aproximadamente 1 pg/día a aproximadamente 1 mg/día. Se pueden usar regímenes de dosis semanales como una alternativa a la administración diaria. En otra modalidad preferida, el péptido agonista CRHR2 de la SEQ ID NO: 102, el cual comprende un enlazador acetamida que une un PEG de aproximadamente 20 kDa al residuo de cisteína en la posición 28 de la secuencia del péptido, se administra a una dosis de 10 pg/kg por inyección en bolo subcutáneo a un paciente que necesite de este. La frecuencia de esta dosis debe estar en el intervalo desde una vez al día a menos frecuente lo que se basa en las necesidades terapéuticas del sujeto y otras consideraciones clínicas.

Una vez producida la mejora en la enfermedad, trastorno o afección del paciente, la dosis puede ajustarse para el tratamiento de prevención o mantenimiento. Por ejemplo, la dosificación o frecuencia de administración, o ambas, se pueden reducir en función de los síntomas, hasta un nivel en el que el efecto terapéutico o profiláctico deseado se mantenga. Si los síntomas se alivian a un nivel adecuado se puede concluir el tratamiento. Los pacientes pueden, sin embargo, requerir un tratamiento intermitente a largo plazo si vuelven a aparecer los síntomas.

En ciertas modalidades el compuesto se administra en combinación con uno o más agentes biológicamente activos como parte de un régimen de tratamiento. En ciertas modalidades el compuesto se administra antes, a la vez o con posterioridad a la administración de uno o más agentes biológicamente activos. En una modalidad el agente biológicamente activo u otros más se administran en la misma composición farmacéutica con un compuesto como se describe en la presente. En otra modalidad el agente biológicamente activo u otros más se administran en una composición farmacéutica separada con un compuesto como se describe en la presente descripción. De acuerdo con esta modalidad el agente biológicamente activo u otros más pueden administrarse a los sujetos por rutas de administración iguales o diferentes que las que se usan para administrar el compuesto.

En otra modalidad el compuesto se administra con uno o más compuestos o composiciones para reducir el riesgo o tratar una enfermedad cardiovascular. Los compuestos o composiciones que reducen el riesgo o tratan las enfermedades cardiovasculares incluyen, pero sin limitarse a, agentes antiinflamatorios, agentes anti-trombóticos, agentes anti-plaquetarios, agentes fibrinolíticos, trombolíticos, agentes que reducen lípidos, inhibidores directos de la trombina, inhibidores anti-Xa, inhibidores anti-Ma, inhibidores de los receptores de la glucoproteína llb/llla e inhibidores directos de la trombina. Los ejemplos de agentes que se puede administrar en combinación con el compuesto como se describe en la presente incluyen la bivalirudina, la hirudina, el hirugen, el Angiomax, el agatroban, PPACK, aptámeros de trombina, la aspirina, inhibidores de GPIIb / Illa (por ejemplo, el Integrilin), inhibidores de P2Y12, la tienopiridina, la ticlopidina, y el clopidogrel.

En modalidades, el compuesto se formula en formas de dosificación adecuadas para la administración a los pacientes que necesitan de este. Los procesos y equipos para la preparación de las partículas portadoras y el fármaco se describen en Pharmaceutical Sciences, Remington, 17.° Ed., págs. 1585-1594 (1985); Chemical Engineers Handbook, Perry, 6.° Ed., págs. 21-13 a 21-19 (1984); Journal of Pharmaceutical Sciences, Parrot, Vol. 61 , núm. 6, págs. 813-829(1974); y Chemical Engineer, Hixon, págs. 94-103 (1990).

La cantidad de compuesto que se incorpora en las formas de dosificación de la presente invención pueden variar, generalmente, desde aproximadamente 10 % a aproximadamente 90 % en peso de la composición en dependencia de la indicación terapéutica y el período de administración deseado, por ejemplo, cada 12 horas, cada 24 horas, y similares. Dependiendo de la dosis del compuesto que se desea administrar, se pueden administrar una o más de las formas de dosificación. Dependiendo de la formulación, el compuesto estará, preferentemente, en forma de una sal de HCI o en forma de base libre.

Además, esta invención también se relaciona con una composición farmacéutica o una forma de dosificación farmacéutica como se describió anteriormente en la presente descripción para el uso en un método de terapia o diagnóstico del cuerpo animal humano o no-humano.

Esta invención se relaciona, además, con una composición farmacéutica para usar en la fabricación de una forma de dosificación farmacéutica para la administración oral a un mamífero que necesite el tratamiento, caracterizada porque dicha forma de dosificación se puede administrar en cualquier momento del día, independientemente de los alimentos que tomó dicho mamífero.

Esta invención se relaciona, además, con un método de terapia o diagnóstico del cuerpo animal humano o no-humano, el método comprende administrar a dicho cuerpo una dosis terapéutica o diagnóstica efectiva de una composición farmacéutica que se describe en la presente descripción.

Esta invención también se relaciona con un paquete farmacéutico adecuado para la venta comercial, el paquete comprende un contenedor, una forma de dosificación como se describe en la presente descripción, y asociados a dicho paquete material escrito que no se limita a si la forma de dosificación se puede administrar con o sin alimentos.

Los siguientes ejemplos de formulación son sólo ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de las invenciones de ninguna manera.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 : Síntesis y purificación del péptido El péptido de SEQ ID NO: 29 se preparó por una reacción de síntesis de péptidos en fase sólida en un sintetizador Rainin Symphony Múltiple Peptide Synthesizer (Modelo SMPS-110) por medio del uso de la versión del software 3.3.0. Resin (NovaSyn TGR®, 440 mg, aproximadamente 0.1 mmoles, 0.23 mmol/g de sustitución, lote núm. A33379) que se usó para la síntesis de péptidos amidas fue una combinación de polietilenglicol y poliestireno funcionalizados con un enlazador amida Rink ácido-lábil modificado.

Los aminoácidos que se usaron en la síntesis contenían grupos de protección ?a-9-Fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) en el terminal C y los siguientes grupos protectores de cadena lateral: Arg (2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofurano-5-sulfonilo, PBF), Asp (butoxi terciario, OtBu), Asn(tritilo, Trt), Gln(Tr.), Cys(Trt), His(Trt), Lys(t-butoxicarbonilo, Boc), Ser(butilo terciario, tBu) y Thr(tBu).

Las reacciones de acoplamiento se llevaron a cabo mediante la mezcla de resina de N-metilpirrolidinona (NMP) pre-hinchada (0.1 mmoles), un exceso molar de 5 veces de amino ácido-Fmoc en DMF (2.5 mi) y se añadió un exceso molar de 5 veces de hexafluorofosfato (HBTU) con un exceso molar de 10 veces de la N-metilmorfolina (NMM) en DMF (2.5 mi), entonces se acoplaron por 45 minutos. Para la eliminación de Fmoc, las reacciones se incubaron con una solución 20 % de piperidina/DMF por 2 minutos. La solución se drenó y se añadió 20 % de piperidina/DMF fresca y se incubó por 18 minutos. Las reacciones se lavaron con NMP y las adiciones subsecuentes de aminoácidos se realizaron por la repetición de las etapas de acoplamiento. Para el acoplamiento de terminal C a Ile40, Gln39, Asn19, Asn12 y Val9 numeradas desde el terminal N, las etapas de acoplamiento se realizaron dos veces.

El clivaje del péptido de la resina se realizó mediante un programa de clivaje de dos horas y la incubación con 9 mi de la mezcla de clivaje que comprende ácido trifluoroacético (TFA) (100 mi), 1 ,2-etanoditiol (EDT) (20.0 mi), fenol (7.5 g), tioanisol (5 mi), triisopropilsilano (TIS) (5 mi) y agua (5 mi). La solución del péptido olivado se transfirió a un tubo de centrífuga BD de 50 mi de polipropileno, y el péptido se precipitó con éter etílico frío (40 mi). La mezcla se centrifugó y el éter etílico se decantó del péptido. Se añadió éter etílico (40 mi), la mezcla se agitó y se centrifugó, y el éter etílico se decantó. Estas etapas (adición de éter etílico fresco, agitación, centrifugación, y decantación) se repitieron dos veces más. El péptido se secó al vacío para dar 408 mg (92 % de rendimiento) del producto crudo.

La purificación del péptido se llevó a cabo en un sistema de HPLC preparativo Waters (Waters, MA, Estados Unidos). El péptido crudo (~100 mg) se disolvió en 20/30/50 de ácido acético/ acetonitrilo/ agua que contenía 0.1 % de TFA. El material se inyectó en dos columnas Vydac C-18 (10 mm, 2.5 x 25 cm). Después de la inyección, un gradiente de 0-45 % del solvente B (Solvente B= 80 % de acetonitrilo que contenía 0.1 % TFA) más de 5 min y 45-70 % del solvente B por 60 minutos con una velocidad de flujo de 6 ml/min se usó para purificar el péptido. Las fracciones se recogieron y se analizaron por RP-HPLC analítico, MALDI-TOF MS, y CE. Las fracciones más puras se reunieron y se liofilizaron para dar 23 mg del producto.

MALDI-TOF MS rindió un peso molecular del producto para igualar 4400.5, el cual es mayor que el peso molecular que se calculó para C195H326N56O53S3 de 4399.2 por un átomo de hidrógeno La liofilización se realizó mediante la congelación instantánea del líquido en un baño de hielo seco de acetona durante aproximadamente 30 minutos. Después de la congelación, el producto, en un frasco abierto, se cubrió con papel de filtro y se colocó en alto vacío. Después de 24 horas bajo alto vacío la muestra seca se retiró del vacío y se guardó en un recipiente sellado para su uso futuro.

EJEMPLO 2: Conjugación del péptido con N-etilmaleimida La nivelación sitio dirigida con N-etilmaleimida sobre los residuos de cisteína, como se muestra en el Esquema 1 , se logró bajo las condiciones siguientes.

Esquema 1 N-etilmaleimida ident.:47) TKFTLSLDVPTNI En un vial de polipropileno de 2.5 mi, se disolvió 2.0 mg del péptido de la invención en 1.0 mi de agua. Se añadieron inmediatamente veinte microlitros de 0.1 M de N-etilmaleimida acuosa. La reacción se agitó suavemente a temperatura ambiente por 2 horas. Las mezclas de reacción se purificaron en un HPLC Summit APS (Dionex, CA, Estados Unidos.) que ajustó con una columna C18 Vydac 300 Angstrom (10X250 mm; Grace Davison, IL, Estados Unidos) por medio del uso del siguiente protocolo que se muestra en la Tabla 6. Las fracciones finales se recogieron, y se analizaron por HPLC, y las fracciones puras se reunieron y se liofilizaron.

TABLA 6 Columna: Vydac C18 300 Angstrom (10X250 mm) Solventes: A: 0.1 % TFA en agua B: 0.1 % TFA con 80 %acetonitrilo/agua UV: (1) 214 nm (2) 280 nm Flujo: 2.000 ml/min a 0.000 min Gradiente (%B) al tiempo: 4.000 min 0.0 % 40.000 min 100.0 % 60.000 min 100.0 % 62.000 min 0.0 % 75.000 min 0.0 % EJEMPLO 3: Conjugación de péptidos con yodoacetamida-PEG La yodoacetamida-PEG, una cadena lineal de 20 kDa del polietilenglicol con un terminal yodoacetamida, y presente en cantidades limitantes a un pH ligeramente alcalino, con el péptido de SEQ ID NO: 29 dio lugar a la modificación de la cisteína como una reacción en exclusiva, como se muestra en el Esquema 2. El tiol de cisteína actuó como un punto de unión selectivo para la yodacetamida-PEG. La unión derivativa alfa sulfahidrilacetamida que resultó fue aquiral.

Esquema 2 MAQI-Amida (sec. con núm. de ident.:29) Péptido conjugado con núm. de ident.:102) LMAQI-Amida A un recipiente cónico de 15 mi se añadió 25 mg (5.68 mmol, 1.0 eq) de péptido de SEQ ID NO: 1. En el mismo recipiente se añadió 140 mg (6.82 mmol, 1.2 eq, 95 % activo) de PEG-20 yodoacetamida (lote núm. M77592) de Nippon, Oil and Fat (NOF) Corp. 10 mi de agua y la solución se agitó hasta que todos los sólidos se disolvieron. Para la solución turbia, se añadió 50 mi de piridina con un pH de la solución de aproximadamente 8.91. Después de 2 horas se retiró una alícuota de 20 mi de muestra y se analizó por HPLC de fase reversa por medio del uso de una columna Phenomenex C6-fenil con 0.1 % TFA /acetonitrilo como eluyente. La muestra presentó una reacción casi completa después de 2 horas (Figura 1A). La mezcla de reacción se purificó directamente por HPLC por medio del uso de una columna Phenomenex C6-fenil 10 x 150 mm. Los eluyentes para la purificación fueron 0.1 % agua TFA y 80 % de acetonitrilo en 0.1 agua TFA. Las purificaciones fueron en lotes de muestra de 2-3 mi (Figura 1 B). Las fracciones purificadas se combinaron y liofilizaron en un recipiente cónico de 50 mi. El sólido liofilizado se diluyó en 10 mi de agua y se re-liofilizó. Aproximadamente 1 mg del producto final se diluyó a 1 mg/ml y se sometió a análisis espectroscópico de masas (Figura 1C). El peso promedio del compuesto pegilado de SEQ ID NO: 102 fue de 25.449 Dalton debido en parte a la heterogeneidad en la longitud del polímero PEG, y el compuesto apareció como un sólido blanco amorfo.

EJEMPLO 4: Peqilación de péptidos con enlazador N-etilmaleimida En un vial de polipropileno de 2.5 mi se disolvió 2.0 mg (~ 0.44 nmol) del péptido en 2.5 mi de agua seguido por la adición inmediata de polietllenglicoles activados y derivados de la N-etilmaleimida de diferentes pesos moleculares por medio del uso de las cantidades que se muestran en la Tabla 7.

Esquema 3 Reactivo PEG (sec. con núm. de ident.:29) (sec. con núm. de ident.:82) La mezcla de reacción se agitó suavemente a temperatura ambiente durante 2 horas.

TABLA 7 Las mezclas de reacción se purificaron en una columna de HPLC Summit APS (Dionex, CA, Estados Unidos) ajustada a una columna Gemini 5u C6-fenil 110 Angstrom (10X100 mm; Phenomenex, CA, Estados Unidos) por medio del uso del protocolo de la Tabla 8.

TABLA 8 EJEMPLO 5: Actividad agonista de CRHR2 v CRHR1- Ensayo de AMPc La actividad agonista CRHR2 y CRHR1 de la familia de CRH se caracterizó en dos líneas celulares de SK-N-MC (neuroblastoma humano) transfectadas ya sea con el CRHR2 humanos o el CRHR1 humano en un ensayo de adenosina 3',5'-monofosfato cíclico (AMPc). El h-SCP (SEQ ID NO: 1) fue equipotente con el h-UCN2 (SEQ ID NO: 115) en este ensayo y demostró ser el agonista más selectivo de CRHR2 en la familia CRH (Figura 2). La concentración requerida para el 50 % del efecto máximo (?5?) fue de 0.4 nM.

El CRHR1 (número de acceso X72304) o CRHR2 (número de acceso U34587) humanos se clonaron en el vector de expresión pcDNA3.1/Zeo y se transfectaron establemente en células SK-N-MC por electroporación. Las células se mantuvieron en MEM w/sal de Earl con 10 % de FCS, 50 U.l. de penicilina, 50 Mg/ml de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sodio y 0.1 mM de amino ácidos no esenciales, 600 g/ml G418. Las células se cultivaron a 370 °C en 5 % de C02.

Las células se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 96 pocilios (Biocoat de BD Biosciences) durante la noche a 50.000 células/pocilio. Las células se lavaron con PBS entonces se resuspendieron en DMEM F-12 sin rojo fenol, que contenía 10 µ? isobutilmetilxantina (IBMX). Las células se incubaron con los péptidos a concentraciones en el intervalo desde 1 pM a 10 µ? por 60 minutos a 37° centígrados Para la evaluación posterior de cualquier actividad antagonista de aquellos péptidos que no producen una respuesta agonista, los péptidos se pre-incubaron a 10 µ? por 20 minutos antes de la adición de h-SCP por 60 minutos. Forescolina (10 µ?), un estimulante directo de la adenilato ciclasa, se usó como control positivo. Los ensayos se detuvieron por la adición de 0.5 M de HCI y se mezclaron por rotación orbital durante 2 horas a 4o centígrados.

Para evaluar la actividad del péptido de la invención en el CRHR2, se empleó una prueba de medición de AMPc intracelular por medio del uso de un ensayo en placa Flash (Cus56088 número de catálogo, Perkin Elmer, MA, Estados Unidos).

Las células SK-N-MC transfectadas se sembraron en placas de cultivo de tejido de 96 pocilios Biocoat (BD Biosciences, San José, CA, Estados Unidos) durante la noche a 50.000 células/pocilio. Las células se lavaron primero con PBS y luego se suspendieron con DMEM/F-12 sin rojo fenol, que contenía µ? de isobutilmetilxantina (IBMX). Las células en suspensión se transfirieron a una placa Flash de 96 pocilios recubierta con fluido de centelleo. Las células se incubaron con péptidos en el intervalo desde 1 pM a 1 µ?, por 60 minutos, a 37° centígrados. Se usó la forescolina a 10 µ? como control positivo. Después de la estimulación con el ligando, las células se Usaron por la adición de 0.5 M de HCI y se mezclaron por rotación orbital durante 2 horas a 4o centígrados con el fin de liberar el AMPc intracelular al medio.

El medio que contenía el AMPc intracelular liberado se trasladó a una placa flash de 96 pocilios recubierta con fluido de centelleo que contenía un anticuerpo anti-AMPc. En este ensayo, el AMPc intracelular compite con el AMPc marcado con I125 por la unión al anticuerpo. Para generar una curva estándar, se incluyó en el experimento AMPc en el intervalo desde 2.5 hasta 250 pmoles/ml. El [125]-AMPc se midió en un contador de centelleo TopCount (Perkin Elmer, MA, Estados Unidos).

Los datos de la curva de concentración-respuesta de los agonista individuales se ajustaron a la ecuación de Hill, véase la fórmula a continuación, por medio del uso de GraphPad Prism (software GraphPad, La Jolla, CA, Estados Unidos), para proporcionar cálculos de la concentración de agonista necesarias para generar los parámetros de una mitad de la respuesta máxima (A50), y la asíntota máxima (a) y la pendiente Hill (??). En esta ecuación, [A] es la concentración de agonista y E es el efecto medido: a -[A]"' Para fines de presentación la media de los parámetros estimados ajustados se usaron para general una curva única E/[A] que se muestra superpuesta sobre la media de los datos experimentales. Los estimados de potencia para los agonistas, pAso, se expresan como el logaritmo negativo del punto medio de cada curva y se enumeran con su error estándar de medida (SEM) Se calculó el logaritmo en base 10 de los valores de la relación de dosis de agonista (Log DR) por sustracción del valor de pA50 del compuesto de ensayo del valor de pA50 del control h-SCP correspondiente (SEQ ID NO:1) dentro del mismo lote de ensayo. Los valores de SEM de los valores Log DR se dan por la raíz cuadrada de la suma de los cuadrados de los valores SEM del control h-SCP (SEQ ID NO: 1) y el valor pA50 del compuesto del ensayo.

TABLA 10: Péptido antagonista del CRHR - anti-sauvagina-30 FHLLR KMIEI EKQEK EKQQA ANNRL LLDTI-NH2 SV30 SEQ ID NO: 118 La respuesta de CRHR2 a h-SCP mediada por AMPc (SEQ ID NO:1) se bloqueó por el antagonista selectivo de CRHR2, anti-sauvagina-30 (SV30, SEQ ID NO: 118 que se enumera en la Tabla 9), en una forma dependiente de la concentración consistente con el antagonismo competitivo superables (Figura 3). La presencia de anticuerpos anti-sauvagina-30 produjo un valor pA2 de 7.82 para el compuesto de la SEQ ID NO: 1.

TABLA 10 Los péptidos humanos y de ratas (véase la Tabla 10) se usaron en la estimulación de las células SK-N-MC transfectadas con h-CRHR1 o h-CRHR2 en el ensayo de AMPc en placa flash. Los péptidos se incubaron durante 1 hora a 37° centígrados. Las curvas se calcularon por medio del uso del análisis de regresión no lineal de concentración-respuesta sigmoidea en GraphPad Prism. Los valores de pA5o que se obtuvieron así se muestran en la Tabla 11 , en adición a los valores de la literatura.

TABLA 11 Publicado Experimental Receptor Péptido pA5o pA5o SEM nH SEM Clmáx SEM N CRHR1 r-UCN1 9.82 1 9.19 0.07 1.15 0.19 99.61 3.28 12 CRHR1 h-SRP > 7 3 6.34 0.03 1.61 0.15 NA 20 CRHR1 h-SRP > 7 3 6.2 0.04 1.33 0.17 NA 11 CRHR1 h-SRP > 7 3 6.28 0.03 1.26 0.13 NA 17 CRHR1 h-UCN2 6.02 0.02 1.69 0.18 NA 15 CRHR1 h-UCN3 <5 CRHR1 h-SCP <5 CRHR2 r-UCN1 10.062 9.08 0.05 1.07 0.11 110.5 2.49 12 CRHR2 h-UCN2 9.37 219.12 5 8.04 0.05 0.9 0.09 114.7 2.89 16 CRHR2 h-UCN3 9.922 9.26 0.05 1.02 0.11 101.8 2.18 12 CRHR2 h-SCP ~ 9 4 9.41 0.06 0.99 0.12 99.31 2.69 16 CRHR2 h-SRP ~ 9 4 9.32 0.05 1.08 0.11 113.5 2.3 16 CRHR2 h-SCP ~ 9 4 9.15 0.03 1.04 0.06 97.53 1.29 32 CRHR2 h-SCP - 9 4 9.36 0.04 1.39 0.05 116.1 2.59 20 CRHR2 h-SCP ~ 94 9.39 0.02 1.55 0.12 98.2 1.31 30 CRHR2 h-UCN2 9.37 2/ 9.12 5 9.22 0.04 0.72 0.05 128.9 2.95 40 CRHR2 h-SRP ~ 94 9.58 0.05 1.06 0.13 108.7 2.48 25 CRHR2 h-SRP ~ 9 4 9.23 0.03 0.99 0.06 98.56 1.42 36 Los datos en cursiva representan aproximaciones de potencia; NA=Datos no disponibles debido a la baja potencia y el suministro de péptido limitado, los valores de los datos publicados se obtuvieron con los péptidos del autor sintetizados en-casa que se usan para la estimulación por AMPc de los siguientes sistemas transfectados: células CHO transfectadas con 11 h-CRHR1 o 2 m-CRHR2b (Lewis, K. y otros, 2001 , PNAS, vol. 98, págs. 7570-5); células HEK-293 transfectadas con3 h-CRHR1 o h-CRHR2b valores aproximados de las curvas de concentración-respuesta (Hsu, SY y otros, 2001 , Nat. Med., vol. 7, págs. 605-11); células HEK-293 transfectadas con 5 m-CRHR2b (Braun, O. y otros, 2002, Peptides, vol. 23, págs. 881-888).

Los efectos de la amidación del dominio C terminal del h-SCP sobre la actividad agonista, en términos de potencia y/o actividad intrínseca, se investigaron, a partir de que bibliotecas de péptidos recombinantes no amidados serían difíciles de ensayar en las células SK-N-MC transfectadas con CRHR2.

Para investigar la contribución de los diferentes aminoácidos a la actividad agonista del péptido se sintetizaron varios péptidos modificados, lo que comenzó con 1-7 eliminaciones en la secuencia terminal N. Cada péptido se disolvió en agua a concentraciones de patrones de 1 mM y se almacenó en tubos Eppendorf (núm. de catálogo 022 364 111) en alícuotas a -40° centígrados. Los péptidos se descongelaron sólo una vez, en el día del experimento, y se diluyeron más en el tampón del ensayo de AMPc.

Todos los péptidos que produjeron el AMPc en las células SK-N-MC transfectadas con el h-CRHR2, lograron respuestas máximas similares dentro de cada replica experimental. Sin embargo, la respuesta máxima a h-SCP (SEQ ID NO: 1) varió entre repeticiones diarias, por lo que los datos se normalizaron a la respuesta máxima a h-SCP obtenidos dentro de cada repetición. Los datos de 3-5 experimentos repetidos se combinaron para el cálculo final de los parámetros de la curva concentración de agonista-efecto (Figura 4). Los valores de pA50 obtenidos se resumen en la Tabla 12.

El h-SCP no amidado (SEQ ID NO: 113) fue aproximadamente 200 veces menos potente que el péptido parental amidado aunque la respuesta máxima fue indistinguible. En un lote el péptido h-SCP parental de 40 amino ácidos (SEQ ID NO: 1) produjo un valor de pA50 de 9.41 ± 0.03. La amidación terminal si bien es importante para la potencia, no es esencial y se obtuvo una curva totalmente definida de concentración-efecto con el péptido no-amidado con la misma respuesta máxima que el péptido amidado parental.

La eliminación de un aminoácido (SEQ ID NO: 107) no tuvo un efecto significativo en la potencia (pA50 9.24 ± 0.05), mientras que la supresión de tres (SEQ ID NO:108) y cuatro (SEQ ID NO:109) aminoácidos resultó en una reducción progresiva de los valores de pA50 (8.49 ± 0.08 y7.33 ± 0.9), respectivamente, y también se enumeran en la Tabla 12. La eliminación de cinco o más aminoácidos (SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:111 y SEQ ID NO:112) resultó en la pérdida completa de la actividad agonista (Figura 4). En consecuencia, estos tres últimos péptidos se probaron como antagonistas de h-SCP en una concentración de 10 µ? (Figura. 5). Ninguno de los péptidos tuvo un efecto significativo en la curva de concentración-efecto de h-SCP lo que indica que los péptidos no sólo no tuvieron eficacia intrínseca detectable, sino tampoco una ocupación del receptor importante, es decir una afinidad menor de 10 µ?.

Eliminaciones de 4 o más aminoácidos en el dominio terminal N en la secuencia de h-SCP afectan la potencia del péptido. Los péptidos con una a cuatro eliminaciones de aminoácidos del dominio terminal N tuvieron una reducción progresiva de la potencia, mientras que los péptidos con eliminaciones de cinco o más aminoácidos resultaron en la pérdida completa de la actividad agonista y la afinidad del receptor (KA >10 µ?). Esto último se esperaba, basándose en un informe anterior de un análisis similar que se realizó en h-UCN2 (Isfort, R.J. y otros, 2006, Peptides, vol. 27, págs. 1806-1813), ya que las eliminaciones están cerca del aminoácido conservado serina en la posición 6 y el ácido aspártico en la posición 8.

TABLA 12 SEQ ID NO pAso SEM ?? SEM. Omáx SEM N 1 9.41 0.04 1.18 0.11 98.68 1.59 22 113 7.10 0.06 1.07 0.13 107.4 5.45 18 107 9.25 0.05 1.07 0.12 1 11.3 2.52 9 108 8.49 0.08 0.82 0.10 106.3 5.05 12 109 7.34 0.09 0.74 0.10 109.6 6.16 12 110 NR 12 111 NR 12 112 NR 12 NR = no respuesta Además, se investigaron los efectos de la mutación de cisteína, la nivelación con N-etilmaleimida y la pegilación sobre la actividad agonista del péptido. El pA50 control de h-SCP (SEQ ID NO: 1 ) varió para los diferentes lotes de ensayo desde 9.47 a 9.74 con SEM de 0.03 a 0.1 1. Una vez más, varios péptidos modificados se sintetizaron de acuerdo a los esquemas anteriores, y los resultados del ensayo para estos péptidos se enumeran en la Tabla 13.

TABLA 13 Log DR Log DR SEQ ID NO pAso SEM SEM SEQ ID NO pAso SEM SEM [M] [M] 2 8.97 0.02 0.72 0.03 55 -7.93 -1.61 3 8.97 0.03 0.72 0.03 56 -7.20 -2.34 4 8.65 0.06 1.03 0.07 57 -7.64 -1.90 5 8.93 0.04 0.76 0.05 58 -7.14 -2.40 6 9.07 0.04 0.61 0.05 59 -7.22 -2.32 7 7.60 0.09 2.08 0.10 60 -6.32 >3.22 8 -6.82 2.86 61 -6.22 >3.32 9 7.80 0.06 1.89 0.07 62 -6.06 >3.48 10 8.28 0.08 1.30 0.09 63 -7.45 -2.12 11 8.76 0.06 0.82 0.07 64 -6.98 -2.59 12 7.86 0.10 1.72 0.11 65 -6.82 -2.75 13 9.59 0.04 -0.01 0.06 66 8.31 0.04 1.26 0.05 14 -7.34 >2 67 -6.35 >3 15 8.68 0.04 0.90 0.06 68 -6.96 -2.61 16 8.93 0.03 0.76 0.03 69 7.45 0.05 2.09 0.05 17 9.50 0.07 0.02 1.02 70 -7.34 -2.07 18 8.41 0.09 1.11 1.72 71 -7.35 -2.26 19 8.01 0.04 1.67 0.04 72 8.04 0.04 1.50 0.04 20 9.00 0.08 0.52 0.74 73 8.29 0.10 1.11 0.18 21 8.75 0.06 0.77 1.44 74 -7.33 -2.28 22 9.17 0.04 0.52 0.04 75 8.24 0.06 1.30 0.06 23 8.55 0.03 1.13 0.04 76 6.84 0.09 2.70 0.09 24 8.94 0.03 0.74 0.03 77 8.27 0.05 1.27 0.05 25 9.17 0.08 0.35 2.51 78 -7.89 -1.52 26 9.44 0.04 0.08 2.58 79 8.50 0.12 1.11 0.15 27 8.76 0.10 0.76 2.61 80 7.60 0.10 1.75 0.15 28 9.36 0.07 0.16 0.09 81 7.83 0.03 1.82 0.07 29 9.47 0.06 0.00 0.07 82 8.40 0.15 1.12 0.19 30 8.40 0.05 1.28 0.05 83 7.91 0.05 1.63 0.05 31 8.02 0.08 1.61 0.09 84 -6.82 -2.84 32 9.41 0.05 0.11 2.80 85 8.51 0.08 0.89 0.17 33 9.07 0.06 0.45 2.83 86 8.79 0.12 0.82 0.15 34 -6.32 >3.19 87 -6.00 >3.68 35 8.93 0.06 0.70 0.07 88 8.12 0.03 1.55 0.04 36 9.10 0.07 0.42 2.88 89 8.48 0.08 0.98 0.14 37 8.58 0.10 1.05 0.11 90 -7.49 -2.17 38 -6.67 >2.95 91 -6.23 >3.43 39 9.21 0.04 0.41 0.06 92 8.12 0.03 1.55 0.04 40 9.08 0.04 0.55 0.06 93 8.20 0.04 1.47 0.04 41 7.45 0.27 2.07 2.94 94 -7.00 >2.39 95 9.31 0.12 0.43 0.14 42 -7.75 -1.72 96 8.74 0.11 1 0.13 43 9.79 0.04 -0.32 0.05 97 -9.00 -0.74 44 -7.5 -1.97 98 9.50 0.10 0.18 0.13 45 9.48 0.05 -0.01 0.06 99 8.94 0.1 0.8 0.12 46 9.43 0.05 0.04 0.06 100 8.64 0.07 1.1 0.1 47 9.5 0.06 -0.03 0.07 101 7.84 0.13 1.9 0.15 48 9.44 0.05 0.03 0.06 49 9.36 0.06 0.11 0.07 50 9.48 0.06 -0.01 0.07 51 8.79 0.04 0.68 0.05 52 9.42 0.04 0.05 0.05 53 -7.25 -2.22 54 9.55 0.04 -0.08 0.05 Los resultados que ejemplifican el perfil de actividad de varias modificaciones del péptido de la invención se muestran en la Tabla 14, incluido el péptido de la estrescopina (h-SCP), urocortina 2 (h-UCN2), y el péptido de h-SCP-IA-PEG (SEQ ID NO: 102), en donde h-SCP-IA-PEG es un péptido que tiene la secuencia de SCP con una sustitución de cisteína en la posición 28 según lo dispuesto en la SEQ ID NO: 29 y un polímero de PEG que se une a través de un enlazador acetamida (IA) a la cisteína en la posición 28. Los datos son la media ±SEM de una a tres repeticiones y se expresan como el % de la respuesta máxima que se obtiene a h-SCP dentro de cada repetición del experimento.

TABLA 14 SEQ ID NO pAso SEM ?? SEM Qmax SEM N 1 9.40 0.02 1.26 0.08 100.1 1.1 1 28 1 15 9.51 0.02 1.34 0.09 116.9 1.33 24 102 8.15 0.02 1.05 0.05 111.1 1.95 32 El péptido h-SCP-IA-PEG se incubó también en presencia de 100 nM de anti-sauvagina-30 un antagonista selectivo competitivo del receptor h-CRHR2, lo que resulta en un desplazamiento a la derecha en la curva de concentración de péptido h-SCP-IA-PEG- respuesta con un valor aproximado de la pAso correspondiente de 6.89, cuando la respuesta máxima se limitó a 100 %.

EJEMPLO 6: Actividad de unión de CRHR1 v CRHR2 a radioligandos El perfil de unión de h-SCP (SEQ ID NO:1 ) a CRHR2 se determinó en estudios de unión a radioligandos en una preparación de membrana de las células SK-N-MC transfectadas establemente con CRHR2 humano por medio del uso de [125l]-anti-sauvagina-30 como el radiomarcación. Las células se cosecharon por raspado y los precipitados resultantes se congelaron inmediatamente a -80° centígrados (aproximadamente 50 x 106 células/precipitado).

Los precipitados de células congelados se descongelaron en hielo en 15 mi de tampón de ensayo que estaba compuesto de 10 mM HEPES, 130 mM NaCI, 4.7 mM KCI, 5 mM MgCI2, bacitracina y 0.089 mM de bacitracina a pH 7.2 y 21 ± 3o centígrados. La solución se homogeneizó a continuación, con un triturador de tejidos Polytron en un ajuste de 10 y 7x3 s (Brinkmann Instruments, Westbury, NY). El homogeneizado se centrifugó a 4o centígrados a 800 x g durante 5 min y se desechó el precipitado. El sobrenadante se centrifugó nuevamente a 26,892 x g durante 25 min a 4o centígrados y el precipitado final se resuspendió en tampón ensayo. Todos los ensayos de unión se realizaron en placas con filtro de 96 pocilios Multiscreen GF/B (Millipore, Billericay, MA, Estados Unidos) que se empaparon previamente en tampón de ensayo con 0.3 % PEI por 1 hora. Para los estudios de competencia, las membranas celulares de 45 µ? de volumen se incubaron con 60 pM [125l]-anti-sauvagina-30 en un volumen de 50 µ? para el ensayo de CRHR2 o con [125l]-(Tyr°)-sauvagina para el ensayo de CRHR1 en presencia de 15 µ? del ligando competidor por 120 minutos con un volumen total de 150 µ?. La unión no específica se determinó por la inclusión de 1 µ? de r-UCN1 (SEQ ID NO:114). La radioactividad que se unió se separó por filtración por medio del uso de un colector Multiscreen Resist (Millipore Corp., Billerica, MA, Estados Unidos). Los filtros se lavaron tres veces con PBS helado a pH 7.5 y la radioactividad retenida en los filtros se cuantificó por su centelleo líquido que se midió por un contador TopCount (Packard BioScience, Boston, MA, Estados Unidos). Todos los experimentos se realizaron por triplicado.

Los datos de las curvas de competencia individuales se expresaron como el porcentaje de unión específico de [125l]-anti-sauvagina-30 o [125l]-(Tyr°)-sauvagina (B) dentro de cada experimento. Estos datos se analizaron por medio del uso de una logística de cuatro parámetros por medio del uso de GraphPad Prism con la asíntota superior (amáx) y la inferior (amin) ponderados al 100 % y 0 %, respectivamente, mediante la inclusión de estos valores dos unidades logarítmicas por encima y por debajo de las concentraciones mínima y máxima del competidor, respectivamente: p _ gMin. + (gMáx. ~ gMin.) l + 10((loeí 50""[il)"") La curva de competencia que se obtuvo con h-SCP (SEQ ID NO:1) fue bifásica. Esto indica un estado de alta y baja afinidad de unión al receptor que se caracteriza por un alto logaritmo negativo de concentración al 50 % de inhibición (pICso) y uno bajo pICso de 6.6. El sitio de unión de alta afinidad mostró que se inhibía por 100 µ? de guanosina 5'-O-[gamma-tio] trifosfato (GTPyS). En contraste, h-UCN2 (SEQ ID NO: 115) mostró sólo una unión de alta afinidad, lo que sugiere que h-UCN2 se comportó como un agonista de mayor eficacia intrínseca de h-SCP (SEQ ID NO:1) en el ensayo.

Los valores de pK| que resultaron de este análisis de datos se muestran en la Tabla 15.

TABLA 15 Receptor CRHR1 CRHR2 SEQ ID NO pK, nH pK, nH 1 4.6±0.28 1.16±0.65 5.71 ±0.04 1.00±0.04 114 8.69±0.15 0.91 ±0.27 8.51 ±0.05 1.19±0.14 115 ND 7.74±0.05 1 .28±0.15 116 4.96±1.69 0.79±1.21 6.49±0.07 0.68±0.08 117 ND 7.57±0.04 1.26±0.14 118 5.81 ±0.20 1.00±0.49 7.78±0.05 1.15±0.12 ND = No detectable EJEMPLO 7: La relajación del músculo liso vascular - Anillos de aorta de rata La habilidad de h-SCP (SEQ ID NO: 1 ) de relajar el músculo liso vascular se examinó en anillos de aorta de rata, aislados, pre-contraídos con fenilefrina (PE) (véase Figura 6.). Este péptido (SEQ ID NO: 1 ) produjo una relajación dependiente de la concentración con una pAso de 6.05±0.12, pero fue 10 veces menos potente que h-UCN2 (SEQ ID NO: 1 15) con una pA5o de 7.01 ±0.13. Las respuestas causadas por h-SCP (SEQ ID NO:1) se inhibieron por anti-sauvagina-30 (SEQ ID NO: 1 18).

EJEMPLO 8: Caracterización cardiovascular en corazón aislado de conejo El efecto de h-SCP (SEQ ID NO:1 ) sobre la frecuencia cardiaca (FC), la contracción del ventrículo izquierdo (LV), y el tono vascular se evaluó en un ensayo de corazón de conejo Langendorff retrogrado-perfundido. Un bolo de un vehículo de control tipo placebo o h-SCP (SEQ ID NO:1) se administraron directamente en el bloque de perfusión. El h-SCP (SEQ ID NO:1 ) produjo un aumento de la frecuencia cardíaca y la presión que se desarrolla en el ventrículo izquierdo (dP/dtm¿x) dependientes de la concentración y la correspondiente disminución en la presión de perfusión coronaria (PPC) a una concentración para el 50 % de respuesta igual a 52 nM, 9.9 nM y 46 nM, respectivamente (Figura 7), mientras que no se observó respuesta en caso del vehículo control.

Aunque la especificación anterior enseña los principios de la presente invención con ejemplos provistos para fines de ilustración, se entenderá que la práctica de la invención abarca todas las variaciones, adaptaciones o modificaciones usuales que entran dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones y sus equivalentes.

Claims (43)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Un péptido que tiene actividad agonista hacia el receptor de la hormona de liberación de corticotropina tipo 2, el péptido comprende la secuencia de aminoácidos de LSLDV PTNIM NLLFN IAKAK NLRAQ AAANA HLMAQ I en donde al menos un aminoácido del péptido se sustituye con X siempre que la sustitución no se haga en las posiciones 3, 29, y 33 de la secuencia de aminoácidos, y en donde X es cisteína, tirosina, o ácido glutámico; o una sal farmacéuticamente aceptable o amida de éste.

2. El péptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque la sustitución se selecciona del grupo que consiste de: X por L en la posición 1; X por S en la posición 2; X por D en la posición 4; X por V en la posición 5; X por P en la posición 6; X por T en la posición 7; X por N en la posición 8; X por I en la posición 9; X por M en la posición 10; X por N en la posición 11 ; X por L en la posición 12; X por L en la posición 13; X por F en la posición 14; X por N en la posición 15; X por I en la posición 16; X por A en la posición 17; X por K en la posición 18; X por A en la posición 19; X por K en la posición 20; X por N en la posición 21 ; X por L en la posición 22; X por R en la posición 23; X por A en la posición 24; X por Q en la posición 25; X por A en la posición 26; X por A en la posición 27; X por A en la posición 28; X por A en la posición 30; X por H en la posición 31 ; X por L en la posición 32; X por A en la posición 34; X por Q en la posición 35; y X por I en la posición 36.

3. El péptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el péptido se selecciona del grupo que consiste de: XLSLD VPTNI MNLLF NIAKA KNLRA QAAAN AHLMA QI-NH2, XTLSL DVPTN IMNLL FNIAK AKNLR AQAAA NAHLM AQI-NH2, XFTLS LDVPT NIMNL LFNIA KAKNL RAQAA ANAHL MAQI-NH2, y XKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2.

4. El péptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la secuencia de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 17, 18, 20, 21 , 25, 26, 27, 29, 32, 33, 34, 36, y 41 ; y X es cisteína.

5. Un conjugado que comprende el péptido de la reivindicación 1 y un enlazador unido a la X del péptido.

6. El conjugado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque X es cisteína.

7. El conjugado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el enlazador es acetamida o N-etilsuccinimida.

8. El conjugado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque comprende adicionalmente polietilenglicol (PEG) unido al enlazador, en donde el PEG tiene un peso molecular no mayor que aproximadamente 80 kDa.

9. El conjugado de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque el enlazador es acetamida.

10. El conjugado de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque el PEG tiene un peso molecular que se selecciona del grupo de pesos que consiste de aproximadamente 2 kDa, aproximadamente 5 kDa, aproximadamente 12 kDa, aproximadamente 20 kDa, aproximadamente 30 kDa, y aproximadamente 40 kDa.

1 1 . El conjugado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el PEG ramificado o lineal.

12. El conjugado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el PEG comprende adicionalmente un grupo reactivo.

13. El conjugado de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el grupo reactivo es N-etilmaleimida.

14. El péptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el péptido tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 35, 36, 37, 39, 40 y 41 .

15. Un conjugado que tiene la fórmula de: en donde R es el péptido de la reivindicación 4, y S es el átomo de azufre del grupo cisteína tiol de X.

16. El conjugado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque tiene la fórmula de: en donde n es un entero en el intervalo de aproximadamente 40 a aproximadamente 1900, R es el péptido de la reivindicación 1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de un grupo de las SEQ ID NO: que consisten de: 2, 3, 4, 5, 6, 10, 13, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 37, 39, 40 y 41 ; y S es el átomo de azufre del grupo cisteína tiol de X.

17. El conjugado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque tiene la fórmula de: en donde bPEG es un polietilenglicol ramificado con un peso molecular de aproximadamente 80 kDa, R es un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29, y S es el átomo de azufre del grupo cisteína tiol de X.

18. El conjugado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque tiene la fórmula de: en donde n es un entero en el intervalo de aproximadamente 40 a aproximadamente 1900, R es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 13, 29, y 36; y S es el átomo de azufre del grupo cisteína tiol de X.

19. El conjugado de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque n es un entero de aproximadamente 460, y R es un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29.

20. El conjugado de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque n es un entero de aproximadamente 460, y R es un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29.

21. Un polinucleótido que codifica un péptido de la reivindicación 1.

22. Una composición farmacéutica que comprende (a) un péptido de la reivindicación 1 ; y (b) un excipiente farmacéuticamente aceptable.

23. Una composición farmacéutica que comprende (a) el conjugado de la reivindicación 5; y (b) un excipiente farmacéuticamente aceptable.

24. Una composición farmacéutica que comprende (a) el conjugado de la reivindicación 19; y (b) un excipiente farmacéuticamente aceptable.

25. Una composición farmacéutica que comprende (a) el conjugado de la reivindicación 20; y (b) un excipiente farmacéuticamente aceptable.

26. Un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un péptido, el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos del péptido de la reivindicación 1.

27. El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque el péptido es pegilado.

28. El uso de un péptido de la reivindicación 1 en la elaboración de un medicamento para tratar un sujeto que padece de o se le ha diagnosticado una enfermedad, trastorno, o afección médica mediada por la actividad del receptor 2 de la hormona de liberación de corticotropina seleccionado del grupo que consiste de enfermedad metabólica e insuficiencia cardíaca.

29. El uso como el que se reclama en la reivindicación 28, en donde la enfermedad, trastorno, o afección médica es la diabetes.

30. El uso como el que se reclama en la reivindicación 28, en donde la enfermedad, trastorno, o afección médica es la insuficiencia cardíaca.

31. Un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29.

32. Un conjugado que comprende el péptido de la reivindicación 31 y un enlazador unido a la cisteína en la posición 30 de la secuencia de aminoácido.

33. El conjugado de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque el enlazador es acetamida o N-etilsuccinimida.

34. El conjugado de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque comprende adicionalmente polietilenglicol (PEG) unido al enlazador, caracterizado además porque el PEG tiene un peso molecular no mayor que aproximadamente 80 kDa.

35. El conjugado de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque el enlazador es acetamida.

36. Un conjugado que tiene la fórmula de: en donde R es el péptido de la reivindicación 31 , y S es el átomo de azufre del grupo cisteína tiol en la posición 28 de la secuencia de aminoácido.

37. El conjugado de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque tiene la fórmula de: en donde n es un entero en el intervalo de aproximadamente 40 a aproximadamente 1900, R es un péptido de la reivindicación 31 ; y S es el átomo de azufre del grupo cisteína tiol en la posición 28 de la secuencia de aminoácido.

38. El conjugado de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque tiene la fórmula de: en donde n es un entero en el intervalo de aproximadamente 40 a aproximadamente 1900, R es un péptido de la reivindicación 31 ; y S es el átomo de azufre del grupo cisteína tiol en la posición 28 de la secuencia de aminoácido.

39. Un polinucleótido que codifica el péptido de la reivindicación 31.

40. Una composición farmacéutica que comprende el péptido de la reivindicación 31 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

41. Una composición farmacéutica que comprende el conjugado de la reivindicación 32 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

42. Una composición farmacéutica que comprende el conjugado de la reivindicación 37 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

43. Una composición farmacéutica que comprende el conjugado de la reivindicación 38 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.