KR100735586B1

KR100735586B1 - 코르티코트로핀 방출 인자 2 수용체 작용제

Info

Publication number: KR100735586B1
Application number: KR1020047011051A
Authority: KR
Inventors: 이스포트로버트조셉; 마주르위즐로애덤
Original assignee: 더 프록터 앤드 갬블 캄파니
Priority date: 2002-01-16
Filing date: 2003-01-16
Publication date: 2007-07-04
Also published as: EP1465921B1; MXPA04006884A; MXPA04006883A; HK1078095A1; US7897731B2; PL373529A1; TW200302278A; EP1465922B1; DE60307044T2; ES2269976T3; EP1724283B1; US6936585B2; AR038143A1; JP4489434B2; TW200302276A; ES2299701T3; CA2470731A1; NO20043396L; SA03230565A; EP1465921A2

Abstract

단리된 코르티코트로핀 방출 인자 유도체, 및 그를 코딩하는 핵산은 근이영양증과 같은 코르티코트로핀 방출 인자 2 수용체에 의해 조절되는 장애의 치료에 유효하다.

코르티코트로핀, 수용체, 유도체, 근이영양증, 펩티드, 변이체

Description

코르티코트로핀 방출 인자 2 수용체 작용제{CORTICOTROPIN RELEASING FACTOR 2 RECEPTOR AGONISTS}

본 발명은 CRF₂R에 의해 조절되는 장애를 치료하기 위한 신규 펩티드, 및 그를 코딩하는 핵산의 용도에 관한 것이다.

CRFR 및 리간드

G-단백질 커플링 수용체(G-protein coupled receptor, GPCR)류에 속하는 것으로서 현재까지 동정된 두가지 이상의 코르티코트로핀 방출 인자(corticotropin releasing factor, CRF) 수용체(CRF₁R 및 CRF₂R)가 존재한다. CRF₁R 또는 CRF₂R의 작용제 활성화에 의해 아데닐레이트 사이클라제의 G_αs 활성화가 일어난다. 아데닐레이트 사이클라제는 cAMP의 형성을 촉매하며, cAMP는 다시 단백질 키나제 A의 활성화, 세포내 칼슘 방출 및 미토겐-활성화 단백질 키나제(MAP 키나제)의 활성화를 비롯한 다수의 효과를 나타낸다. 다른 연구에 있어서, CRF 수용체의 작용제 활성화 후의 세포내 이노시톨 트라이포스페이트 합성의 증강은 CRFR이 G_αq에 또한 커플링되어 있음을 암시한다.

CRF₁R 및 CRF₂R이 인간, 쥐, 생쥐, 닭, 암소, 메기, 개구리 및 양으로부터 클로닝되었다. CRF₁R 및 CRF₂R 각각은 독특한 분포 패턴을 가진다. 인간에서는, CRF₂R 수용체의 세가지의 이소형(isoform)인 알파, 베타 및 감마형이 클로닝되었다. 알파 및 베타 CRF₂R의 호몰로그가 쥐에서 동정되었다.

CRFR의 여러 리간드/작용제는 공지되어 있으며 코르티코트로핀 방출 인자(또는 호르몬, CRF, CRH), 유로코르틴(urocortin) I, 유로코르틴 II(또는 스트레스코핀(stresscopin) 관련 펩티드), 유로코르틴 III(또는 스트레스코핀), 유로텐신(urotensin) I, 사우바긴(sauvagine) 및 기타 관련 펩티드를 포함한다. 코르티코트로핀 방출 인자는 CRF₁R 및 CRF₂R에 결합하여 CRF₁R 및 CRF₂R을 활성화시킨다. CRF는 스트레스에 대한 신체 응답의 주요 조절체이다. 상기 41-아미노산의 펩티드는 시상하부-뇌하수체-부신 호르몬 축(HPA 축)의 일차적인 조절체로서 뉴런, 내분비선, 및 면역 작용의 의식을 지배한다. 또한, 모든 공지된 CRFR 리간드들 사이에는 상당한 서열 상동성이 존재한다. 게다가, 두가지 CRF₂R 선택성 리간드들인 유로코르틴 II(또는 스트레스코핀 관련 펩티드) 및 유로코르틴 III(스트레스코핀)이 동정되었다. 상기 펩티드는 다수의 포유류 및 어류 종으로부터 동정되었다.

CRF 수용체는 수용체 선택성 작용제 및 길항제의 사용을 통하여 약리학적으로 비-CRFR과 구별될 수 있다. 이러한 선택성 작용제 및 길항제는 CRFR 넉아웃(knockout) 생쥐와 함께 어느 CRF 수용체가 특정의 생물학적 응답을 매개하는지를 결정하는 데에 유용하다.

CRF₁R의 역할이 꽤 잘 입증되었다. CRF₁R 유전자가 제거된(CRF₁R 넉아웃) 생쥐에 의해 스트레스 응답 손상 및 불안 유사 거동 감소가 증명된다. CRF₁R은 HPA 축의 주요 매개체이다. 구체적으로는, 시상하부로부터 방출되어 시상하부-뇌하수체 문맥 시스템을 통하여 뇌하수체 전엽으로 수송되는 CRF는 뇌하수체 전엽에 위치하는 세포 상에 존재하는 CRF₁R과 상호 작용한다. CRF₁R의 작용제 활성화에 의해 뇌하수체 전엽의 세포로부터 체순환계 내로 ACTH가 방출된다. 방출된 ACTH는 부신 피질에 위치하는 세포 상에 존재하는 ACTH 수용체에 결합하여 코르티코스테로이드를 비롯한 부신 호르몬이 방출되게 한다. 코르티코스테로이드는, 그에 한정되는 것은 아니지만, 흉선 및 비장 위축을 포함하는 메커니즘을 통하여 면역계 억제를 비롯한 다수의 결과를 매개한다. 이와 같이 CRF₁R의 활성화에 의해 HPA 축의 활성화를 통하여 간접적으로 면역계가 하향 조절된다.

CRF₂R의 역할은 덜 충분하게 입증되어 있다. CRF₂R 유전자가 제거된(CRF₂R 넉아웃) 생쥐에 의해 유로코르틴을 이용한 자극 이후 식품 섭취는 손상 또는 감소되고, 혈관 확장은 결여되지만, 스트레스 응답은 정상적임이 증명된다. CRF₂R을 이용한 실험에 의하면 CRF₂R이 CRFR 작용제의 저혈압/혈관 확장 효과 및 CRFR 작용제로 생쥐를 처리한 이후에 관찰되는 식품 섭취에서의 감소를 초래한다는 것이 증명되었다.

골격근 위축 및 비대

또한, CRF₂R은 골격근 위축의 조절 및 비대의 유도에 연관되어 있다. 골격근은 성형성(plastic) 조직인데, 이는 일에 대한 생리학적인 요구 사항 또는 대사적 필요성에 있어서의 변화에 손쉽게 적응한다. 비대는 골격근 질량의 증가를 나타내는 반면, 골격근 위축은 골격근 질량의 감소를 나타낸다. 급성 골격근 위축은, 그에 한정되는 것은 아니지만, 수술, 침상 안정(bed rest) 또는 골절로 인한 불용; 척수 손상, 자가면역 질환 또는 감염성 질환으로 인한 탈신경/신경 손상; 관련성 없는 병에 있어서의 글루코코르티코이드 사용; 감염 또는 기타 원인으로 인한 패혈증; 질병 또는 기아로 인한 영양소 제한; 및 우주 여행을 포함한 다양한 원인으로 거슬러 올라갈 수 있다. 골격근 위축은 정상적인 생물학적 과정을 통하여 발생하지만, 어떤 의학적 상황에서는 이러한 정상적인 생물학적 과정이 쇠약 수준의 근육 위축으로 이어진다. 예를 들어, 급성 골격근 위축은, 그에 한정되는 것은 아니지만, 정형외과적 처치를 수반하는 것을 포함한, 고정(immobilization)으로부터의 환자의 재활에 있어서 상당한 제한성을 나타낸다. 이러한 경우, 골격근 위축의 반전에 요구되는 재활 기간은 종종 원래의 상해의 회복에 요구되는 기간보다 훨씬 더 길다. 이러한 급성 불용 위축은 근육 기능 및 질량에 있어서의 상당한 연령관련 부족으로 이미 고통받을 수도 있는 중장년층에서 특히 문제가 되는데, 이는 이러한 위축이 영구적인 장애 및 조기 사망으로 이어질 수 있기 때문이다.

골격근 위축은 암악액질, 만성 염증, 에이즈(AIDS) 악액질, 만성 폐쇄성 폐 질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD), 울혈성 심부전, 유전 질환, 예를 들어 근이영양증(muscular dystrophies), 퇴행성 신경 질환(neurodegenerative disease) 및 사르코페니아(sarcopenia)(연령 관련 근육 손실)와 같은 만성 병으로부터도 생길 수 있다. 이러한 만성 병에 있어서, 골격근 위축은 이동성의 조기 손실로 이어짐으로써 질환-관련 이환률에 부가될 수 있다.

골격근의 위축 또는 비대를 제어하는 분자적 과정에 관해서는 거의 알려져 있지 않다. 골격근 위축의 유발 개시는 다양한 위축 개시 사건에 있어서 서로 다르지만, 단백질 합성 감소 및 단백질 분해 증가와 느린 섬유(고도의 산화 대사/느린 수축성의 단백질 이소형)에서 빠른 섬유(고도의 해당 대사/빠른 수축성의 단백질 이소형)로의 전환을 특징으로 하는 수축성 및 대사성 효소 단백질 동질효소들 모두에서의 변화를 포함한 몇몇의 공통적인 생화학적 변화가 감염된 골격근 섬유에서 발생한다. 골격근에서 발생하는 부가적인 변화는 맥관계 손실 및 세포외 매트릭스의 재형성을 포함한다. 빠른 전환의 근육과 느린 전환의 근육 둘 모두에 의하면 적절한 조건 하에서의 위축이 증명되는데, 상대적인 근육 손실량은 특정의 위축 자극 또는 조건에 따라 달라진다. 중요한 것은, 이러한 모든 변화가 대등하게 조절되며 생리학적 및 대사적 필요성에 따른 변화에 따라 온(on) 또는 오프(off)로 전환된다는 것이다.

위축 및 비대가 발생하는 과정은 포유류 종들에 걸쳐 보존되어 있다. 다수의 연구에 의하면 설치류와 인간 둘 모두에 있어서 위축 동안 동일한 기본적 분자, 세포, 및 생리학적 과정이 발생한다는 것이 증명되었다. 이와 같이, 골격근 위축 의 설치류 모델은 인간 위축 응답의 이해 및 예측에 성공적으로 이용되었다. 예를 들어 설치류 및 인간 둘 모두에 있어서 다양한 방법으로 유도된 위축은 근육 해부체, 단면적, 기능, 섬유 유형 전환, 수축성 단백질 발현, 및 조직적 특성에서의 유사한 변화로 이어진다. 또한, 여러 약제가 설치류 및 인간 둘 모두에 있어서 골격근 위축을 조절하는 것으로 증명되었다. 이러한 약제는 동화 스테로이드(anabolic steroids), 성장 호르몬, 인슐린 유사 성장 인자 I, 베타-아드레날린 작용제, 및 CRF₂R 작용제를 포함한다. 이와 함께, 상기 데이터에 의하면 골격근 위축이 설치류 및 인간 둘 모두에서 공통 메커니즘으로부터 생긴다는 것이 증명된다.

몇몇 약제가 골격근 위축을 조절하는 것으로 밝혀졌으며 인간에 있어서 상기 징후에 사용하는 것이 승인되었다고는 하지만, 상기 약제는 심근 비대, 신생물, 조모증, 여성의 남성화, 이환률 및 사망률의 증가, 간 손상, 저혈당증, 근골격통, 조직 터거(turgor) 증가, 빈맥 및 부종 등의 바람직하지 못한 부작용을 가진다. 현재로는 급성 또는 만성 골격근 위축에 대한 고도로 유효한 선택적 치료법은 없다. 따라서, 골격근 위축을 치료하는 다른 치료제를 동정하는 것이 계속적으로 필요하다.

근이영양증

근이영양증은 골격근 무력증의 선택적인 분포에 의해 임상적으로 구별되는 유전성의 진행성 근육 장애군을 포함한다. 가장 일반적인 근이영양증의 두가지 유형은 듀센(Duchenne)형 및 베커(Becker)형 근이영양증인데, 이들 각각은 Xp21 유전 자 좌에 위치하는 디스트로핀 유전자의 돌연변이의 유전에 의해 생긴다. 다른 근이영양증은, 그에 한정되는 것은 아니지만, p94 칼파인(calpain), 아드할린(adhalin), γ-사르코글리칸(sarcoglycan), 및 β-사르코글리칸 유전자 좌를 비롯한 다수의 유전자 좌의 돌연변이로 인해 생기는 지대형 근이영양증; 안면견갑상완형(란도즈-디제린(Landouzy-Dejerine)형) 근이영양증, 근긴장성 근이영양증, 및 에머리-드레이푸스(Emery-Dreifuss)형 근이영양증을 포함한다. 거의 배타적으로 남성에게서만 발생하는 듀센형 근이영양증의 증상은 동요성 보행(waddling gait), 발가락 끝으로 걷기(toe walking), 척추 전만(lordosis), 빈번한 넘어짐(frequent falls), 및 일어서거나 계단을 오를 때의 어려움을 포함한다. 증상은 약 3-7세에 시작되며 대부분의 환자는 10-12세까지 휠체어에 갇혀지내게 되고 다수는 호흡기 합병증으로 인하여 약 20세에 사망한다. 현재의 듀센형 근이영양증 치료법은 프레드니손(prednisone)(코르티코스테로이드계 약물)의 투여를 포함하는데, 프레드니손은 치유적인 것은 아니지만 근육 강도 감퇴를 늦추고 장애를 지연시킨다. 프레드니손과 같은 코르티코스테로이드는 상기 질환으로부터 생기는 근육 섬유 손상에 의해 촉진되는 면역 세포 활성화 및 침윤을 차단함으로써 작용하는 것으로 생각된다. 불행하게도, 코르티코스테로이드 치료법도 골격근 위축으로 이어지는데 이는 상기 환자에 있어서의 면역 응답 차단의 잠재적인 이득의 일부를 무효로 하게 된다. 따라서, 근이영양증에 걸린 환자에 있어서 근육 섬유 손상을 늦추고 장애의 발병을 지연시키며, 현재의 요법보다 덜한 정도의 골격근 위축을 야기하는 치료제를 동정하는 것이 계속적으로 필요하다.

발명의 개요

본 발명은 CRF₂R 작용제인 단리 펩티드를 제공한다. 구체적으로는, 본 발명은 CRF, 유로코르틴 I, 유로코르틴 II, 유로코르틴 III, 사우바긴, 유로텐신 I 또는 관련 펩티드 유도체인 단리 펩티드, 또는 그를 코딩하는 핵산을 제공한다. 또한 본 발명은 안전한 유효량의 본 발명의 단리 펩티드 및 제약적으로 허용가능한 부형제를 함유하는 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 추가로 단위 투여형의 단리 펩티드 및 사용 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명의 펩티드, 또는 그를 코딩하는 핵산, 제약 조성물, 또는 키트를 그를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것은 근육 위축 또는 소모와 같은 CRF₂R에 의해 조절되는 장애의 치료에 효과적이다. 본 발명은 또한 본 발명의 펩티드에 특이적인 항체를 제공한다. 마지막으로, 본 발명은 CRF₂R에 의해 조절되는 장애의 치료를 필요로 하는 대상에 있어서 CRF₂R에 의해 조절되는 장애를 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서의 본 발명의 펩티드, 또는 그를 코딩하는 핵산의 용도를 제공한다.

본 발명은 하기 화학식 I에 따른 단리된 비-천연 펩티드, 또는 그의 변이체를 포함한다:

알파 - 베타 - 감마 - 델타 - 입실론 - 제타 - 에타 - 세타

여기서,

(a) 알파는 식 X₁X₂X₃X₄X₅X₆의 서열을 포함하며; 여기서,

X₁, X₂ 및 X₃은 각각 존재하지 않거나 A, E, D G, N, P, Q, S, T 및 Z로 구성된 군으로부터 선택되며;

X₄는 F, I, L, P, T 및 V로 구성된 군으로부터 선택되며;

X₅는 A, I, P, S, T 및 V로 구성된 군으로부터 선택되며;

X₆은 I, L, M 및 N으로 구성된 군으로부터 선택되며;

(b) 베타는 식 SX₈DX₁₀의 서열을 포함하며; 여기서,

X₈ 및 X₁₀은 각각 독립적으로 I, L 및 V로 구성된 군으로부터 선택되며;

(c) 감마는 식 X₁₁X₁₂X₁₃의 서열을 포함하며; 여기서,

X₁₁은 P, T, V 및 S로 구성된 군으로부터 선택되며,

X₁₂ 및 X₁₃은 각각 독립적으로 A, 나프틸알라닌(B로 나타냄), C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 및 Y로 구성된 군으로부터 선택되며;

(d) 델타는 식 X₁₄X₁₅X₁₆의 서열을 포함하며, 여기서,

X₁₄는 I, L 및 M으로 구성된 군으로부터 선택되며;

X₁₅는 L 및 M으로 구성된 군으로부터 선택되며;

X₁₆은 S, N, Q 및 R로 구성된 군으로부터 선택되며;

(e) 입실론은 식 X₁₇X₁₈X₁₉X₂₀X₂₁의 서열을 포함하며, 여기서,

X₁₇은 V, I, L, T, K, E, N 및 Q로 구성된 군으로부터 선택되며;

X₁₈은 L, M, V, A 및 T로 구성된 군으로부터 선택되며;

X₁₉는 I, F, L 및 M으로 구성된 군으로부터 선택되며;

X₂₀은 D, E, N 및 H로 구성된 군으로부터 선택되며;

X₂₁은 L, V, I, Q, M 및 R로 구성된 군으로부터 선택되며;

(f) 제타는 식 X₂₂X₂₃X₂₄X₂₅의 서열을 포함하며, 여기서,

X₂₂는 존재하지 않거나 A, D, E, S 및 T로 구성된 군으로부터 선택되며;

X₂₃은 존재하지 않거나, K 및 R로 구성된 군으로부터 선택되며;

X₂₄는 존재하지 않거나, A H, M, N, Q, T 및 Y로 구성된 군으로부터 선택되며;

X₂₅는 존재하지 않거나, E, D, I, K, N, Q 및 R로 구성된 군으로부터 선택되며;

(g) 에타는 식 X₂₆X₂₇X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁의 서열을 포함하며, 여기서,

X₂₆은 A, D, G, H, K, N, Q 및 S로 구성된 군으로부터 선택되며;

X₂₇은 A, E, I, L, M 및 Q로 구성된 군으로부터 선택되며;

X₂₈은 A, H, K, Q, R 및 V로 구성된 군으로부터 선택되며;

X₂₉는 A, E, K, N, M 및 Q로 구성된 군으로부터 선택되며;

X₃₀은 H, K, N, Q 및 R로 구성된 군으로부터 선택되며;

X₃₁은 A 및 K로 구성된 군으로부터 선택되며;

(h) 세타는 식 X₃₂X₃₃NX₃₅X₃₆X₃₇X₃₈X ₃₉X₄₀X₄₁의 서열을 포함하며, 여기서,

X₃₂는 A, E, H 및 T로 구성된 군으로부터 선택되며;

X₃₃은 A, D, E, I, L, N, Q, R, S 및 T로 구성된 군으로부터 선택되며;

X₃₅는 A 및 R로 구성된 군으로부터 선택되며;

X₃₆은 E, H, I, K, L, N, Q 및 R로 구성된 군으로부터 선택되며;

X₃₇은 F, I, L, M 및 Y로 구성된 군으로부터 선택되며;

X₃₈은 L, F 및 M으로 구성된 군으로부터 선택되며;

X₃₉는 A, D, E, N 및 Q로 구성된 군으로부터 선택되며;

X₄₀은 A, D, E, H, I, K, N, Q, R, S 및 T로 구성된 군으로부터 선택되며;

X₄₁은 A, F, I 및 V로 구성된 군으로부터 선택된다.
한 구현예로, 본 발명은 하기 아미노산 서열 또는 이에 대해 97% 이상의 서열 동일성을 갖는 그의 변이체를 포함한다:
IVLSLDVPIGLLQILLEQX₂₂KX₂₄X₂₅X₂₆X₂₇X₂₈X₂₉QATTNARILARV
여기서,
(a) X₂₂는 D 및 E 로 이루어진 군으로부터 선택되며;
(b) X₂₄는 A 및 Q 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
(c) X₂₅는 R, E 및 K 로 이루어진 군으로부터 선택되며;
(d) X₂₆은 A, K 및 N 으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
(e) X₂₇은 A, E 및 L 로 이루어진 군으로부터 선택되며;
(f) X₂₈은 R 및 K 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
(g) X₂₉는 E 및 Q 로 이루어진 군으로부터 선택된다.

인용된 모든 문헌은 관련 부분이 참조되어 본 명세서에 포함되어 있으며, 임 의의 문헌의 인용 내용은 본 발명과 관련된 종래 기술로서 인정하는 것으로 해석되지 않는다.

서열 목록 설명

표 1에는 CRF 수용체에 결합하는 다양한 단백질 및 단백질 단편 서열이 기술되어 있다. 이러한 선택된 서열은 상응하는 젠뱅크(Genbank) 또는 더웬트(Derwent) 등록 번호(들) 및 등록 번호가 보고된 동물종과, 동일하거나 거의 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 관련 뉴클레오티드 서열의 등록 번호가 함께 포함되어 있다. 이러한 본 발명의 신규한 서열 및 공지 서열은 서열 목록에 추가로 제시되어 있다.

용어 설명

이하는 본 명세서에서 사용되는 용어 정의의 목록이다.

"작용제"는, 그에 한정되는 것은 아니지만, 항체를 비롯하여 수용체를 활성화시키는 임의의 화합물을 의미한다. 예를 들어 CRFR 작용제는, 그에 한정되는 것은 아니지만, CRF, 유로코르틴, 유로코르틴 II, 유로코르틴 III, 유로텐신(urotensin) I, 사우바긴 및 관련 유사체를 포함한다.

다양한 문법적인 형태의 "항체"는 면역글로불린 분자 및 면역학적으로 활성을 가지는 면역글로불린 분자의 일부, 즉 항원과 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 분자를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "단리된 항체"는 본래 결합된 천연 유기 분자 및 단백질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 항체를 의미한다.

"결합 친화도"는 리간드가 수용체와 상호 작용하는 경향을 의미하며 특이적 CRF 리간드-CRFR 상호 작용의 해리 상수와 반비례한다. 해리 상수는 표준 포화법, 경쟁법 또는 동역학적 결합 기술을 통하여 직접적으로, 또는 기능 분석 및 종점(endpoint)을 수반하는 약리학적 기술을 통하여 간접적으로 측정될 수 있다.

"키메라 항체"는 두가지 이상의 상이한 항체 분자, 즉 상이한 동물 종으로부터의 구조 요소를 포함하는 항체를 의미한다. 키메라 항체는, 그에 한정되지는 않는 상보성 결정 영역 그래프팅으로 알려진 기술로 생성되는 키메라 항체를 포함하는 "인간화 항체"로 알려진 항체를 포함하지만, 그에 한정되는 것은 아니다.

"CRF"는 코르티코트로핀 방출 호르몬(CRH)과 동일한 코르티코트로핀 방출 인자를 의미한다. CRF 펩티드의 예로는 r/h CRF 및 양(ovine) CRF (미국 특허 제 4,415,558호 참조) 등을 들 수 있다.

"CRF 유사체"는 CRFR의 리간드로 작용하는 물질을 의미한다. 적합한 CRF 유사체는 다양한 척추 동물 종으로부터 얻어질 수 있으며, 사우바긴과 같은 물질(예를 들어, 미국 특허 제4,605,642호 참조), 유로텐신(예를 들어, 미국 특허 제4,908,352호; 및 제4,533,654호 참조), 생쥐 유로코르틴 II, 인간 유로코르틴-관련 펩티드(문헌[Reyes, T.M. et al., Proc. Nat l Acad Sci 98:2843-2848 (2001)]), 유로코르틴(예를 들어, WO 97/00063호 참조), 인간 유로코르틴 II(스트레스코핀 관련 펩티드), 인간 유로코르틴 III(스트레스코핀), 복어 URP 1, 복어 URP II, 유로텐신 I, 및 미국 특허 제4,415,558호; 제4,489,163호; 제4,594,329호; 제4,605,642호; 제5,109,111호; 제5,235,036호; 제5,278,146호; 제5,439,885호; 제5,493,006호; 제5663292호; 제5,824,771호; 제5,844,074; 및 제5,869,450호에 기술되어 있는 CRF 유사체를 포함하지만 그에 한정되는 것은 아니다. 구체적인 CRF 유사체는 hUcnI (인간 유로코르틴 I, AF038633 (GB)); hUroII (인간 유로코르틴 II 또는 스트레스코핀 관련 펩티드)(AF320560); hUroIII (인간 유로코르틴 III 또는 스트레스코핀, AF361943); hCRF (인간 코르티코트로핀 방출 인자)(V00571(GB)); oCRF (양 코르티코트로핀 방출 인자 E00212 (GB)); Svg (사우바긴, P01144 (SP))을 포함한다.

"CRFR 작용제"는 CRF₁R_, CRF₂R 또는 이들 둘 모두를 활성화시키는 능력을 가지는 화합물 또는 분자를 의미한다.

"CRFR"은 CRF₁R 또는 CRF₂R을 의미한다. CRFR 이라는 용어는 리간드 결합 또는 신호 전송에 요구되지 않는 수용체 분자 영역이 결실되거나 변형된 절단(truncated) 및/또는 돌연변이화 단백질도 포함한다.

"CRF₁R"은 임의의 동물 종으로부터 유래된 CRF₁R의 이소형을 의미한다. CRF₁R은 이전에는 CRF-RA, PC-CRF, CRF, (문헌[Perrin, M.H., et al. Endocrinology 133:3058-3061 (1993)], 문헌[Chen, R., et al. Proc. Natl. Acad. Sci.USA 90:8967-8971 (1993)], 문헌[Chang, C-P. et al., Neuron 11:1187-1195 (1993)], 문헌[Kishimoto, T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 92:1108-1112 (1995)] 및 문헌[Vita, N. et al., FEBS Lett. 335: 1-5 (1993)]), 또는 CRH 수용체라고 불리웠다.

CRF₁R의 정의는 이 수용체를 코딩하는 cDNA 또는 게놈 서열이 서열 데이터베이스에 기탁된 수용체를 포함하지만 그에 한정되는 것은 아니다. 이러한 서열은 등록 번호 X72304, E11431, L23332, I92584, T37068, T28968, Q81952, L23333, NM_004382, AF180301, T28970, L25438, L24096, I92586, Q81954, AH006791, NM_007762, X72305, AF054582, Y14036, AF229359, AF229361, AB055434 및 L41563을 포함한다. 상기 수용체의 뉴클레오티드 및 단백질 서열은 젠뱅크 또는 더웬트로부터 입수가능하다.

"CRF₂R"은 임의의 동물 종으로부터 유래된 CRF₂R의 이소형을 의미한다. CRF ₂R 은 HM-CRF, CRF-RB , (문헌[Kishimoto, T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 92:1108-1112 (1995)] 및 문헌[Perrin, M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci.USA 92:2969-2973 (1995)])로도 불리웠다.

CRF₂R 수용체의 정의는 이 수용체를 코딩하는 DNA 서열이 서열 데이터베이스에 기탁된 수용체를 포함하지만 그에 한정되는 것은 아니다. 이러한 서열은 등록 번호 U34587, E12752, NM_001883, T12247, T66508, AF011406, AF019381, U16253, T12244, T28972, U17858, NM_009953, Y14037 및 AF229360을 포함한다. 상기 수용체의 뉴클레오티드 및 단백질 서열은 젠뱅크 또는 더웬트로부터 입수가능하다.

"억제"는 특정 과정 또는 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단하는 것을 의미한다. 예를 들어, 화합물이 근육 위축을 완전히 또는 부분적으로 방지한다면 화합물은 골격근 위축을 억제하는 것이다.

"펩티드 단리"는 물리적, 기계적 또는 화학적 방법을 이용하여 단백질과 정상적으로 결합된 세포 구성 요소로부터 펩티드가 제거된 경우 펩티드 분자가 "단리"되었다고 하는 것을 의미한다. 숙련자라면 손쉽게 표준 정제 방법을 이용하여 단리 펩티드를 얻을 수 있다.

"핵산 단리"는 핵산 분자가 다른 폴리펩티드를 코딩하는 오염 핵산 분자로부터 실질적으로 분리된 것을 의미한다. 정제 및 서열 확인 기술은 당 업계에 잘 알려져 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 두가지 DNA 서열은 두가지 DNA 서열 사 이의 연관성의 성질이 (1) 프레임-쉬프트(frame-shift) 돌연변이의 도입으로 이어지지 않거나, (2) 프로모터 영역이 코딩 서열의 전사를 지휘하는 능력을 간섭하지 않거나, (3) 상응하는 RNA 전사체가 단백질로 번역되는 능력을 간섭하지 않는 경우 "작동가능하게 결합"되어 있다고 한다. 예를 들어, 코딩 서열 및 조절 서열은, 코딩 서열의 전사가 조절 서열의 영향 또는 제어 하에 있는 것과 같은 방식으로 이들이 공유 결합적으로 결합되어 있을 경우 작동가능하게 결합되어 있는 것이다. 이와 같이, 프로모터 영역은, 프로모터 영역이 코딩 서열의 전사를 초래할 수 있어 생성된 전사체가 원하는 펩티드로 번역될 수 있는 경우 그 코딩 DNA 서열과 작동가능하게 결합되어 있는 것이다.

"선택성 작용제"는 일반적으로 이 작용제가 다른 수용체에 비하여 특정 수용체(들)에 대하여 더 큰, 바람직하게는 유의하게 더 큰 활성을 가지지만, 다른 수용체에 관해서 완전히 불활성인 것은 아님을 의미한다.

아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 수준에서의 "서열 동일성" 또는 "상동성"은 서열 유사성 검색에 맞추어진 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx 프로그램(문헌[Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402] 및 문헌[Karlin et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2264-2268])에 의해 이용되는 알고리즘을 사용하여 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 분석으로 결정된다. BLAST 프로그램에 의해 이용되는 접근법은 쿼리 서열과 데이터베이스 서열 사이에서 갭을 갖거나(비-인접성) 갖지 않는(인접성) 유사한 절편들을 먼저 고려하고, 이어서 확인된 모든 매치(match)의 통계학적 유의성을 평가하며 마지막 으로 미리 선택된 유의성 역치를 충족시키는 매치만을 요약하는 것이다. 서열 데이터베이스의 유사성 검색에서의 기본적인 논점에 대한 논의에 대해서, 문헌[Altschul et al. (1994) Nature Genetics 6, 119-129] 참조. 막대 그래프, 설명, 정렬, 기대치(즉, 데이터베이스 서열에 대한 매치 보고에 있어서의 통계학적 유의성 역치), 컷오프(cutoff), 매트릭스 및 필터(낮은 복잡성)의 검색 파라미터는 자동으로 설정되어 있다. blastp, blastx, tblastn 및 tblastx에 의해 이용되는 자동설정 점수 매트릭스(default scoring matrix)는 길이가 85 뉴클레오티드 또는 아미노산보다 긴 쿼리 서열에 있어서 권고되는 BLOSUM62 매트릭스이다 (문헌[Henikoff et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915-10919]).

blastn의 경우, 점수 매트릭스는 M(즉, 매칭 잔기쌍의 보상 점수(reward score)) 대 N (즉, 미스매칭(mismatching) 잔기의 벌점 점수(penalty score)의 비로 설정되며, 여기서 M 및 N의 자동 설정 값은 각각 +5 및 -4이다. 4개의 blastn 파라미터는 하기와 같이 조정하였다: Q=10 (갭 생성 벌점); R=10 (갭 연장 벌점); wink=1 (매 wink번째 위치에서 쿼리를 따라서 워드 히트(word hits)를 생성); 및 gapw=16 (갭이 있는(gapped) 정렬이 생성되는 윈도우 폭 설정). 동등한 Blastp 파라미터 설정치는 Q=9; R=2; wink=1; 및 gapw=32이었다. GCG 패키지 버전(package version) 10.0에서 이용가능한 서열들 사이의 가장 우수하게 합치되는(bestfit) 비교에서는 DNA 파라미터 GAP=50 (갭 생성 벌점) 및 LEN=3 (갭 연장 벌점)이 이용되며 단백질 비교에 있어서의 동등한 설정치는 GAP=8 및 LEN=2이다.

"골격근 비대"는 골격근 질량 또는 골격근 기능 또는 이들 둘 모두의 증가 를 의미한다.

"골격근 위축"은 "골격근 쇠약"과 동일한 의미이며 골격근 질량 또는 골격근 기능 또는 이들 둘 모두의 감소를 의미한다.

단백질 구조 및 기능의 기술에 있어서는 이 단백질이 포함하는 아미노산에 대해서 언급되어진다. 아미노산은 하기에 나타낸 바와 같이 그의 통상적인 약어로도 나타내어질 수 있다: A = Ala = 알라닌; T = Thr = 트레오닌; V = Val = 발린; C = Cys = 시스테인; L = Leu = 류신; Y = Tyr = 타이로신; I = Ile = 이소류신; N = Asn = 아스파라긴; P = Pro = 프롤린; Q = Gln 글루타민; F = Phe = 페닐알라닌; D = Asp = 아스파르트산; W = Trp = 트립토판; E = Glu = 글루탐산; M = Met = 메티오닌; K = Lys = 라이신; G = Gly = 글리신; R = Arg = 아르기닌; S = Ser = 세린; H = His = 히스티딘. 문자 Z = Glx = 피롤리돈 카르복실산은 내부 환상 락탐이 형성된 N-말단 글루탐산 또는 글루타민을 나타내는 데에 사용된다. 이는 서열 목록에서 적절한 곳에 MODIFIED_RES 특징 하에 기술되어 있다. 본 명세서에서 문자 B는 특정 펩티드에서 알라닌의 변형체인 나프틸알라닌을 나타내기 위하여 사용되며, 펩티드 서열의 서열 목록에서 그가 발생하는 곳에서 "기타 특징(miscellaneous feature)" 하에 서열 목록에서 나타내어져 있다. 본 명세서에서 약어 Ac 는 변형된 아세틸화 NH₂-말단을 나타내기 위하여 사용되었으며 적절한 곳에서 "MODIFIED_RES" 특징 하에 기술되어 있다. 또한 본 발명의 펩티드는 카르복시-말단에서 아미드기를 가지도록 변형된다. 이는 서열 목록에서 "MODIFIED_RES" 특징 하에 나타내어져 있다. 천연 호몰로그와 관련해서는 아미노산의 결실 또는 부재를 나타내기 위하여 "-" 또는 "존재하지 않음"이 본원 전반에 걸쳐 사용된다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 단백질 화학, 약리학 또는 분자 생물학 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기술된 방법, 재료 및 실시예는 한정하려는 것이 아니다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 동등한 다른 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있다.

펩티드

본 발명은 하기 화학식 I에 따른 단리된 비-천연 펩티드를 포함한다:

[화학식 I]

알파 - 베타 - 감마 - 델타 - 입실론 - 제타 - 에타 - 세타

화학식 I에서, 알파는 식 X₁X₂X₃X₄X₅X₆의 서열을 포함하며; 여기서, X₁, X₂ 및 X₃은 각각 존재하지 않거나, A, E, D G, N, P, Q, S, T 및 Z로 구성된 군으로부터 선택되며; X₄는 F, I, L, P, T 및 V로 구성된 군으로부터 선택되며; X₅는 A, I, P, S, T 및 V로 구성된 군으로부터 선택되며; X₆은 I, L, M 및 N으로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명의 일 태양에 있어서, 알파는 식 X₁X₂X₃X₄X₅X₆의 서열을 포함하며; 여기서, X₁은 존재하지 않으며, X₂는 D, E 및 Z로 구성된 군으로부터 선택되며; X₃은 D, G 및 N으로 구성된 군으로부터 선택되며; X₄는 L 및 P로 구성된 군으로부터 선택되며; X₅는 P 및 S로 구성된 군으로부터 선택되며; X₆은 I, L, M 및 N으로 구성된 군으로부터 선택된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 알파는 추가로 -EDLPL (서열 번호: 388), -DNPSL (서열 번호: 389), -DDPPL (서열 번호: 390), -ZGPPI (서열 번호: 391), ---PSL, 및 ---IVL로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는데, 여기서, "-" 는 존재하지 않음을 나타낸다. 다른 실시 형태에 있어서, 알파는 서열 -ZGPPI를 포함한다. 다른 실시 형태에 있어서, 알파는 서열 -DNPSL을 포함한다. 다른 실시 형태에 있어서, 알파는 서열 ---IVL을 포함한다. 다른 실시 형태에 있어서, 알파는 서열 ---PSL을 포함한다.

본 발명의 다른 태양에 있어서, 알파는 식 X₁X₂X₃X₄X₅X₆을 포함하며; 여기서, X₁은 존재하지 않으며; X₂는 존재하지 않으며; X₃은 존재하지 않으며; X ₄는 F, I, L, P 및 V로 구성된 군으로부터 선택되며; X₅는 A, I, S, T 및 V로 구성된 군으로부터 선택되며; X₆은 L이다. 하나의 실시 형태에 있어서, 알파는 ---IVL, ---FTL, ---LTL, ---FAL, ---VIL 및 ---PSL로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에 있어서, 알파는 서열 ---IVL을 포함한다.

본 발명의 또 다른 태양에 있어서, 알파는 SQEPPI (서열 번호: 392), SEEPPI (서열 번호: 393), -DNPSL, ---IVL, -TKFTL (서열 번호: 394), -ZGPPI, SQEIVL (서열 번호: 395), SEEIVL (서열 번호: 396), DNPIVL (서열 번호: 397), TKIVL (서열 번호: 398), ZGIVL (서열 번호: 399), SDNPSL (서열 번호: 401), STKFTL (서열 번 호: 402), SZGPPI (서열 번호: 403) 및 NDDPPI (서열 번호: 404)로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다.

본 발명의 또 다른 태양에 있어서, 본 발명의 펩티드의 정제 또는 검출에 유용할 수 있는 폴리히스티딘(HHHHHH, 서열 번호: 400) 또는 기타 펩티드 태그가 알파에 선행할 수 있다.

화학식 I에서, 베타는 식 SX₈DX₁₀의 서열을 포함하며, 여기서, X₈ 및 X ₁₀은 각각 I, L 및 V로 구성된 군으로부터 선택된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 베타는 SIDL (서열 번호: 405), SLDV (서열 번호: 406), SLDL (서열 번호: 407), SIDI (서열 번호: 408), 및 SIDV (서열 번호: 409)로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에 있어서, 베타는 추가로 SIDL 및 SLDV로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 또 다른 실시 형태에 있어서, 베타는 서열 SIDL을 포함한다. 또 다른 실시 형태에 있어서, 베타는 서열 SLDV를 포함한다. 또 다른 실시 형태에 있어서, 베타는 서열 SIDV를 포함한다.

화학식 I에서, 감마는 식 X₁₁X₁₂X₁₃의 서열을 포함하며; 여기서, X₁₁은 P T, V 또는 S이며, X₁₂ 및 X₁₃은 각각 A, B(나프틸알라닌), C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 및 Y로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명의 하나의 실시 형태에 있어서, X₁₁은 P이다. 다른 실시 형태에 있어서, 감마는 PAB, PAF, PAH, PAQ, PAY, PFB, PFE, PFF, PFG, PFH, PFI, PFL, PFQ, PFV, PFW, PFY, PGY, PHB, PHF, PHH, PHQ, PHW, PHY, PIA, PIB, PID, PIE, PIF, PIG, PIH, PII, PIL, PIQ, PIR, PIT, PIV, PIW, PIY, PKY, PLB, PLE, PLF, PLG, PLH, PLI, PLL, PLQ, PLV, PLW, PLY, PNY, PQB, PQF, PQH, PQI, PQL, PQQ, PQV, PQW, PQY, PRY, PSY, PTB, PTE, PTF, PTH, PTI, PTL, PTV, PTW, PTY, PVB, PVY, PWF, PWH, PWQ, PWW, PWY, PYB, PYF, PYH, PYI, PYL, PYQ, PYT, PYV, PYW, PYY, SLE, SLG, SIG 및 VIG로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시 형태에 있어서, 감마는 PFE, PFG, PFH, PFQ, PFY, PLE, PLG, PLH, PLQ, PLY, PTE, PTH, PTY, PIE, PIH, PIQ, PIY, PIG, PTN 및 PTS로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 또 다른 실시 형태에 있어서, 감마는 PFE, PFG, PFH, PFQ, PFY, PLE, PLG, PLH, PLQ, PLY, PTE, PTH, PTY, PIE, PIH, PIQ, PIY, PYY, PFE, PTW, PQY, PHY, PII, PIL, PTI, PTF, PTL, PIV, PIT, PTV 및 PIE로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 또 다른 실시 형태에 있어서, 감마는 PIG, PTN, PTS 및 PIG로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 또 다른 실시 형태에 있어서, 감마는 PFQ, PYW, PLQ, PIG, PLY, PUY, PTY, PIG, PLL, PLF 및 PFF로부터 선택되는 서열을 포함한다. 또 다른 실시 형태에 있어서, 감마는 서열 PIG를 포함한다. 또 다른 실시 형태에 있어서, 감마는 PFQ를 포함한다.

화학식 I에서, 델타는 식 X₁₄X₁₅X₁₆의 서열을 포함하며, 여기서, X₁₄는 I, L 및 M으로 구성된 군으로부터 선택되며; X₁₅는 L 및 M으로 구성된 군으로부터 선택되며; X₁₆은 S, N, Q 및 R로 구성된 군으로부터 선택된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 델타는 ILS, IMN, LLQ, LLR 및 MLR로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함한 다. 하나의 실시 형태에 있어서, 델타는 서열 LLQ 또는 LLR을 포함한다.

화학식 I에서, 입실론은 식 X₁₇X₁₈X₁₉X₂₀X₂₁의 서열을 포함하며, 여기서, X₁₇은 V, I, L, T, K, E, N 및 Q로 구성된 군으로부터 선택되며; X₁₈은 L, M, V, A 및 T로 구성된 군으로부터 선택되며; X₁₉는 I, F, L 및 M으로 구성된 군으로부터 선택되며; X₂₀은 D, E, N 및 H로 구성된 군으로부터 선택되며; X₂₁은 L, V, I, Q, M 및 R로 구성된 군으로부터 선택된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 입실론은 VLIDL (서열 번호: 410), VLFDV (서열 번호: 411), VLIEI (서열 번호: 412), ILFNI (서열 번호: 413), LLIEI (서열 번호: 414), LLFNI (서열 번호: 415), ILLEQ (서열 번호: 416), ILIEI (서열 번호: 417), ILLEI (서열 번호: 418), TLLEL (서열 번호: 419), KMIEI (서열 번호: 420), KVIEI (서열 번호: 421), EVLEM (서열 번호: 422), EMIEI (서열 번호: 423), EVIEI (서열 번호: 424), EAIEI (서열 번호: 425), ETIEI (서열 번호: 426), EIIEI (서열 번호: 427), ELIEI (서열 번호: 428), NMIEM (서열 번호: 429), NMIHR (서열 번호: 430), NMIHM (서열 번호: 431), QMMEM (서열 번호: 432) 및 LLFNI (서열 번호: 433)로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 본 발명의 하나의 실시 형태에 있어서, 입실론은 VLIDL, VLFDV, ILFNI, LLFNI, ILLEQ, TLLEL 및 KMIEI로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에 있어서, 입실론은 VLIDL, VLFDV, ILFNI 및 ILLEQ로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 또 다른 실시 형태에 있어서, 입실론은 KMIEI 및 ILLEQ로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 또 다른 실시 형태에 있어서, 입실론은 서열 KVIEI, KMIEI, ILLEI, ILLEQ 또는 TLLEL을 포함한다. 또 다른 실시 형태에 있어서, 입실론은 서열 KMIEI를 포함한다. 또 다른 실시 형태에 있어서, 입실론은 서열 ILLEQ를 포함한다.

화학식 I에서, 제타는 식 X₂₂X₂₃X₂₄X₂₅의 서열을 포함하며, 여기서, X₂₂는 존재하지 않거나, A, D, E, S 및 T로 구성된 군으로부터 선택되며; X₂₃은 존재하지 않거나, K 및 R로 구성된 군으로부터 선택되며; X₂₄는 존재하지 않거나, A H, M, N, Q, T 및 Y로 구성된 군으로부터 선택되며; X₂₅는 존재하지 않거나, E, D, I, K, N, Q 및 R로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명의 하나의 실시 형태에 있어서, 제타는 식 X₂₂X₂₃X₂₄X₂₅의 서열을 포함하며; 여기서, X₂₂는 존재하지 않거나, D 및 E로 구성된 군으로부터 선택되며; X₂₃은 존재하지 않거나, K 및 R로 구성된 군으로부터 선택되며; X₂₄는 존재하지 않거나, A H, M, N, Q, T 및 Y로 구성된 군으로부터 선택되며; X₂₅는 존재하지 않거나, E, D, I, K, N, Q 및 R로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 실시 형태에 있어서, 제타는 SRAE (서열 번호: 434), EKAR (서열 번호: 435), ERAR (서열 번호: 436), EKQE (서열 번호: 437), TKDR (서열 번호: 438), TKAD (서열 번호: 439), AKAR (서열 번호: 440), AKQR (서열 번호: 441), ERQR (서열 번호: 442), AKAE (서열 번호: 443), ERAE (서열 번호: 444), ARQR (서열 번호: 445), EKQR (서열 번호: 446), TKAN (서열 번호: 447), TKAR (서열 번호: 448), EAAR (서열 번호: 449), ERQE (서열 번호: 450), ARAD (서열 번호: 451), EKTQ (서열 번호: 452), ARAR (서열 번호: 453), ARAE (서열 번호: 454), ARQE (서열 번호: 455), AKQE (서열 번호: 456), TRAD (서열 번호: 457), AKAD (서열 번호: 458), TRAR (서열 번호: 459), EKQQ (서열 번호: 520), --RR, --AA, -AAR, ---R, -RAR, ---A, --AR, -ARA, -R-R, A-AR, A-A-, A---, ARA- 및 ----로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 또 다른 실시 형태에 있어서, 제타는 EKAR, ERAR, EKQE 및 TKDR로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 또 다른 실시 형태에 있어서, 제타는 EKQE, EKTQ, ARAR 또는 EKAR을 포함한다.

화학식 I에서, 에타는 식 X₂₆X₂₇X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁의 서열을 포함하며, 여기서, X₂₆은 A, D, G, H, K, N, Q 및 S로 구성된 군으로부터 선택되며; X₂₇은 A, E, I, L, M 및 Q로 구성된 군으로부터 선택되며; X₂₈은 A, H, K, Q, R 및 V로 구성된 군으로부터 선택되며; X₂₉는 A, E, K, M, N 및 Q로 구성된 군으로부터 선택되며; X₃₀은 H, K, N, Q 및 R로 구성된 군으로부터 선택되며; X₃₁은 A 및 K로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명의 하나의 실시 형태에 있어서, 에타는 AAREQA (서열 번호: 460); KEKKRK (서열 번호: 461); SQRERA (서열 번호: 462), KEKQQA (서열 번호: 463), and QLAQQA (서열 번호: 464) AARNQA (서열 번호: 521), KERNQA (서열 번호: 522), KEKNQA (서열 번호: 523), KQRERA (서열 번호: 524), KERERA (서열 번호: 525), KEKERA (서열 번호: 526), KEKQRA (서열 번호: 527), AEAAAK (서열 번호: 528), AAHAAA (서열 번호: 529) 및 HAHAHA (서열 번호: 530)로 구성된 군으로부터 선택되 는 서열을 포함한다. 또 다른 실시 형태에 있어서, 에타는 AAREQA 및 KEKKRK로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 또 다른 실시 형태에 있어서, 에타는 서열 AAREQA를 포함한다. 또 다른 실시 형태에 있어서, 에타는 SQRERA 및 KEKQQA로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 또 다른 실시 형태에 있어서, 에타는 서열 KEKQQA를 포함한다.

화학식 I에서, 세타는 식 X₃₂X₃₃N₃₄X₃₅X₃₆X₃₇X₃₈X₃₉X₄₀X₄₁의 서열을 포함하며, 여기서, X₃₂는 A, E, H 및 T로 구성된 군으로부터 선택되며; X₃₃은 A, D, E, I, L, N, Q, R, S 및 T로 구성된 군으로부터 선택되며; X₃₅는 A 및 R로 구성된 군으로부터 선택되며; X₃₆은 E, H, I, K, L, N, Q 및 R로 구성된 군으로부터 선택되며; X₃₇은 F, I, L, M 및 Y로 구성된 군으로부터 선택되며; X₃₈은 L, F 및 M으로 구성된 군으로부터 선택되며; X₃₉는 A, D, E, N 및 Q로 구성된 군으로부터 선택되며; X₄₀은 A, D, E, H, I, K, N, Q, R, S 및 T로 구성된 군으로부터 선택되며; X₄₁은 A, F, I 및 V로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명의 하나의 실시 형태에 있어서, 세타는 식 X₃₂X₃₃NX₃₅X₃₆X₃₇X₃₈X₃₉X ₄₀X₄₁의 서열을 포함하며, 여기서, X₃₂는 A, E 및 T로 구성된 군으로부터 선택되며; X₃₃은 A, D, E, N, Q, S 및 T로 구성된 군으로부터 선택되며; X₃₅는 A 및 R로 구성된 군으로부터 선택되며; X₃₆은 H, I, L, N, Q 및 R로 구성된 군으로부터 선택되며; X₃₇은 F, I, L, M 및 Y로 구성된 군으로부터 선택되며; X₃₈은 L, F 및 M으로 구성된 군으로부터 선택되며; X₃₉는 A, D, E, N 및 Q로 구성된 군으로부터 선택되며; X₄₀은 존재하지 않거나, A, D, H, Q, R, S 및 T로 구성된 군으로부터 선택되며; X₄₁은 I 및 V로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 실시 형태에 있어서, 세타는 AANRLLLDTV (서열 번호: 465), AAQEQILAHV (서열 번호: 466), ANNAELLAEI (서열 번호: 467), ANNAHLLAHI (서열 번호: 468), ANNAKLLAKI (서열 번호: 469), ANNALLLATI (서열 번호: 470), ANNALLLDTI (서열 번호: 471), ANNANLLANI (서열 번호: 472), ANNAQLLAHI (서열 번호: 473), ANNAQLLAQI (서열 번호: 474), ANNARILARV (서열 번호: 475), ANNARLLARI (서열 번호: 476), ANNARLLDTI (서열 번호: 477), ANNRLLLATI (서열 번호: 478), ANNRLLLDTI (서열 번호: 479), EQNAHIFAHV (서열 번호: 480), EQNAQIFAHV (서열 번호: 481), EQNARIFARV (서열 번호: 482), EQNRIIFDSV (서열 번호: 483), ETNARILARV (서열 번호: 484), HAQAHILAHV (서열 번호: 485), HSNRKIIDIA (서열 번호: 486), HSNRKLLDIA (서열 번호: 487), HSNRKLMEII (서열 번호: 488), HTNARILARV (서열 번호: 489), TNNRLLLATV (서열 번호: 490), TNNRLLLDTI (서열 번호: 491), TSNRKLMEII (서열 번호: 492), TTNARILARN (서열 번호: 493), TTNARILARV (서열 번호: 494), TTNARLLATV (서열 번호: 495), TTNARLLDRV (서열 번호: 496), TTNARLLDTV (서열 번호: 497), TTNRLLLARV (서열 번호: 498), TTNRLLLATV (서열 번호: 499), TTNRLLLDTV (서열 번호: 500), TTQARILARV (서열 번호: 501) 및 TTVARILARV (서열 번호: 502)로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 또 다른 실시 형태에 있어서, 세타는 TTNARILARV, ANNALLLDTI, ANNALLLATI, TTNARLLDTV 및 TTNARLLDRV로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 또 다른 실시 형태에 있어서, 세타는 서열 ANNARLLDTI, ANNARLLARI, ANNALLLDTI, ANNALLLATI, TTNARLLDRV, TTNARILARV, ANNRLLLDTI, EQNARIFARV, EQNAHIFAHV 또는 EQNAQIFAHV를 포함한다. 당 업계의 숙련자라면 세타가 본 펩티드의 C-말단의 마지막을 포함한다는 것을 손쉽게 인식할 것이다.

본 발명의 펩티드는 특정의 바람직한 서열을 가지는 41개의 아미노산의 펩티드로서도 기술되어 있다. 하기의 펩티드 열이 구체적으로 예시되어 있다: 잔기 X₂-X₁₁의 경우 ZGPPISIDLP (서열 번호: 503), 잔기 X₁₄-X₁₇의 경우 LLRK (서열 번호: 504), 잔기 X₁₉-X₃₁의 경우 IEIEKQEKEKQQA (서열 번호: 505), 잔기 X₄-X ₉의 경우 PSLSID (서열 번호: 506), 및 잔기 X₁₄-₃₅의 경우 LLRTLLELEKTQSQRERAEQNA (서열 번호: 507).

개시된 펩티드의 변이체와 그를 코딩하는 뉴클레오티드 서열도 본 발명에 포함된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "변이체"는 화학식 I로 기술되는 펩티드와 실질적으로 유사하며 CRF₂R 작용제로 사용될 수 있는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질, 또는 그를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 화학식 I의 펩티드는 아미노산 치환, 결실, 절단, 삽입 및 변형을 비롯한 본 발명에 포함되는 변이체를 생성하기 위한 다양한 방식으로 변경될 수 있다. 이러한 조작 방법은 일반적 으로 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 변이체는 그를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 돌연변이에 의해 제조될 수 있다. 돌연변이 유발 및 뉴클레오티드 서열 변경 방법은 당 업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492]; 문헌[Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382]; 미국 특허 제4,873,192호; 문헌[Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York)] 및 이들에 인용된 참고 문헌 참조. 변이체의 하나의 실시 형태에 있어서, 화학식 I의 펩티드의 치환(들)은 이 치환이 변이체의 생화학적 특성을 최소로 파괴한다는 점에서 보존성을 가진다. 따라서, 돌연변이가 아미노산 잔기의 치환을 위하여 도입될 경우, 양으로 하전된 잔기(H, K, 및 R)는 바람직하게는 양으로 하전된 잔기로 치환되며; 음으로 하전된 잔기(D 및 E)는 바람직하게는 음으로 하전된 잔기로 치환되며; 중성의 비극성 잔기(A, F, I, L, M, P, V, 및 W)는 바람직하게는 중성의 비극성 잔기로 치환된다. 변이체의 다른 실시 형태에 있어서, 펩티드의 전체 전하, 구조 또는 소수성/친수성 특성은 CRF₂R 작동성에 실질적으로 악영향을 끼치지 않고서 변경될 수 있다. 또 다른 실시 형태에 있어서, 변이체는 화학식 I의 펩티드의 활성 단편이다. 변이체의 또 다른 실시 형태에 있어서, 화학식 I의 펩티드는 변형 아미노산을 이용한 펩티드 합성에 의해, 또는 단백질의 생체내 또는 시험관내 효소 처리에 의해 성취될 수 있는 아세틸화, 카복실화, 포스포릴화, 글리코실화, 유비퀴틴화 및 표지화에 의해 변경된다. 아미노산에 대한 일반적인 비제한적 변형 예는 티로신, 세린 및 트레오닌 잔기의 포스포릴화; 라이신 잔기의 메틸화; 라이신 잔기의 아세틸화; 프롤린 및 라이신 잔기의 하이드록실화; 글루탐산 잔기의 카복실화; 세린, 트레오닌 또는 아스파라긴 잔기의 글리코실화; 및 라이신 잔기의 유비퀴틴화를 포함한다. 변이체는 또한 항원 결정 부위(epitope) 태그 및 His 태그와 같은 다른 도메인을 포함할 수 있다(예를 들어, 펩티드는 융합 단백질일 수 있음).

또 다른 실시 형태에 있어서, 화학식 I의 펩티드의 펩티드 모사체(mimic)가 변이체의 의미 내에 포함된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "모사체"는 아미노산 또는 아미노산과 동일하거나 유사한 기능상의 특징을 가지는 아미노산 유사체를 의미한다. 따라서, 예를 들어 아르기닌 유사체는 이 유사체가 아르기닌의 구아니디늄 측쇄 반응기의 특징과 마찬가지로 생리학적 pH에서 양전하를 가지는 측쇄를 포함한다면 아르기닌의 모사체일 수 있다. 적합한 모사체일 수 있는 유기 분자의 예는 미국 특허 제5,807,819호의 표 1에 열거되어 있다. 일반적으로, 본 발명의 변이체 또는 그를 코딩하는 핵산 서열은 그의 각각의 천연 아미노산 서열과 적어도 70%, 일반적으로 80%에서, 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95%, 더욱 더 바람직하게는 97%, 한층 더욱 더 바람직하게는 98%, 가장 바람직하게는 99%까지의 서열 동일성을 가질 것이다. 융합 단백질, 또는 N-말단, C-말단 또는 내부의 연장, 결실, 또는 펩티드 서열 내로의 삽입은 상동성에 영향을 주는 것으로 해석되어서는 아니된다.

CRF ₂ R 작용제로서의 본 발명의 펩티드의 용도

본 발명의 펩티드는 CRF₂R 또는 CRF₂R 활성에 의해 조절되는 다양한 질환, 장애 및 병의 치료에 유용하다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "질환", "장애" 및 "병"이라는 용어는 서로 바꾸어서 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, CRF₂R에 의해 조절되는", 또는 "CRF₂R 활성에 의해 조절되는"이라는 용어로 설명되는 장애는 CRF₂R 활성이 장애 또는 하나 이상의 질환 또는 장애의 생물학적 징후를 경감시키는 효과적인 수단이거나, 장애가 되게 하거나 잠재적인 장애의 원인이 되는 생물학적인 단계적 반응(cascade) 중의 하나 이상의 지점들과 간섭하거나, 장애의 하나 이상의 증상을 경감시키는 경우에서의 장애, 병 또는 질환을 나타낸다. 따라서, "조절"을 받는 장애는 하기에 대한 것을 포함한다: (1) CRF₂R 활성의 결여는 이 활성이 감염, 과민성(irritation), 내부 자극 또는 기타 몇몇 원인에 의해 유전적으로 변경될 수 있는 이러한 장애 또는 하나 이상의 생물학적 징후의 원인인 것; (2) 질환 또는 장애 또는 이 질환 또는 장애의 관찰가능한 징후(들)가 CRF₂R 활성에 의해 경감되는 것(CRF₂R 활성의 결여는 질환 또는 장애 또는 그의 관찰가능한 징후와 인과적으로 관련될 필요는 없음); (3) CRF₂R 활성이 질환 또는 장애로 이어지거나 질환 또는 장애와 관련된 생화학적인 단계적 반응 또는 세포의 단계적 반응의 일부를 간섭하는 것. 이와 관련하여, CRF₂R 활성은 상기 단계적 반응을 변경시켜서, 질환, 병 또는 장애를 제어한다.

본 발명의 하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 펩티드는 CRF₁R 작용제 활 성을 전혀 가지지 않거나 단지 약한 CRF₁R 작용제 활성을 가진다. 따라서, 본 발명의 펩티드는 CRF₂R에 의해 조절되는 장애의 치료에 특히 유용하다. 이러한 CRF₂R에 의해 조절되는 장애 중 하나로는 골격근 위축이 있다. 골격근 위축은 수술, 침상 안정 또는 골절로 인한 불용; 척수 상해로 인한 탈신경/신경 손상; 자가면역 질환; 감염성 질환; 관련성 없는 병에서의 글루코코르티코이드 사용; 감염 또는 기타 원인으로 인한 패혈증; 질병 또는 기아로 인한 영양소 제한; 암 악액질; 만성 염증; 후천성 면역 결핍 증후군(AIDS); 악액질; 만성 폐쇄성 폐질환; 울혈성 심부전; 사르코페니아 및 유전 장애; 예를 들어 근이영양증, 퇴행성 신경 질환에 의해 유도될 수 있다.

다른 실시 형태에 있어서, CRF₂R에 의해 조절되는 장애의 치료에 의해 근육 질량 및 기능이 증가된다. 골격근 질량 및 기능에 영향을 주는 질환 및 병은, 그에 한정되는 것은 아니지만, 질병, 수술, 침상 안정 또는 사고로 인한 불용; 척수 상해, 자가면역 질환, 또는 감염성 질환으로 인한 신경 손상; 관련성 없는 병에서의 글루코코르티코이드 사용; 감염 또는 기타 원인으로 인한 패혈증; 질병 또는 기아로 인한 영양소 제한; 및 우주 여행으로부터 생기는 급성 위축/소모와, 암 악액질, 만성 염증, 에이즈 악액질, COPD, 울혈성 심부전, 유전 장애, 예를 들어 근이영양증, 퇴행성 신경 질환 및 사르코페니아(연령 관련 근육 손실)를 비롯한 만성 위축/소모를 포함하는 골격근 위축 또는 소모를 포함한다.

또 다른 실시 형태에 있어서, CRF₂R에 의해 조절되는 장애의 치료는 뼈에 영 향을 주는 장애를 포함한다. 뼈에 영향을 주는 질환 및 병은, 그에 한정되는 것은 아니지만, 질병, 수술, 침상 안정 또는 사고로 인한 불용; 척수 상해, 자가면역 질환, 또는 감염성 질환으로 인한 신경 손상; 관련성 없는 병에서의 글루코코르티코이드 사용; 감염 또는 기타 원인으로 인한 패혈증; 질병 또는 기아로 인한 영양소 제한; 및 우주 여행으로부터 생기는 골 손실을 포함한다. 연령 및 호르몬 관련 골 손실(골다공증)도 포함된다.또 다른 실시 형태에 있어서, CRF₂R에 의해 조절되는 장애의 치료는 그에 한정되는 것은 아니지만 고혈압, 울혈성 심부전, 심장 마비(heart attack)에 의해 생기는 심장 손상, 허혈 재관류 상해, 발작, 편두통, 기억 상실증, 알쯔하이머병, 치매 등을 비롯한 심장 및 순환계에 영향을 주는 장애를 포함한다.

또 다른 실시 형태에 있어서, CRF₂R에 의해 조절되는 장애의 치료는 그에 한정되는 것은 아니지만, 관절염, 특히 골관절염 및 류머티즘성 관절염을 비롯하여 관절에 영향을 주는 장애를 포함한다.

또 다른 실시 형태에 있어서, CRF₂R에 의해 조절되는 장애의 치료는 비만증 및 당뇨병을 비롯한 대사성 질환을 포함한다.

또 다른 실시 형태에 있어서, CRF2R에 의해 조절되는 장애의 치료는 하기를 포함한다: 통증 감소; 부종 감소; 알러지 반응, 알러지; 체온 감소; 식욕 억제; 울혈성 심부전; 스트레스 및 불안; 바람직하지 못한 저수준의 부신피질 자극 호르몬(adrenocorticotropic hormone, ACTH ) 분비의 변경; 식욕, 각성 및 인지 기능의 제어; 및 장기간의 영향의 스트레스, 예를 들어 불안 장애, 신경성 식욕부진증 및 불안성 우울증의 예방.

본 명세서에서 "치료"라는 용어는 포유류 대상, 바람직하게는 인간에 있어서, CRF₂R에 의해 조절되는 장애를 완화시키는 본 발명의 펩티드를 최소량으로 투여하는 것을 의미한다. 따라서, "치료라는 용어는 하기를 포함한다: CRF₂R에 의해 조절되는 장애의 포유류에서의 발병, 특히 포유류에게서 CRF₂R에 의해 조절되는 장애의 획득 경향이 있지만 포유류가 아직 그 질환으로 진단되지는 않은 경우의 포유류에서의 발병의 예방; CRF₂R에 의해 조절되는 장애의 억제; 및/또는 CRF₂R에 의해 조절되는 장애의 경감 또는 역전. 본 발명의 방법이 CRF₂R에 의해 조절되는 장애의 예방을 위한 것인 한, "예방"이라는 용어는 CRF₂R에 의해 조절되는 장애가 완전히 저지될 것을 요구하지는 않음을 알아야 한다(문헌[Webster s Ninth Collegiate Dictionary] 참조). 오히려, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "예방"이라는 용어는 본 발명의 펩티드 및 키트의 투여가 CRF₂R에 의해 조절되는 장애의 증상의 발병 이전에 일어날 수 있도록, 숙련자가 CRF₂R에 의해 조절되는 장애에 걸리기 쉬운 집단을 확인할 수 있는 능력을 말한다. CRF₂R에 의해 조절되는 특정의 장애의 위험이 있는 집단은 손쉽게 확인가능하다. 예를 들어 근이영양증의 발병 위험이 있는 집단은 이 장애에 특징적인 유전자 돌연변이를 확인함으로써 결정될 수 있다. 예 를 들어 이전에 논의된 듀센형 및 베커형 이영양증은 Xp21 유전자 좌에 위치하는 이영양증 유전자에서의 돌연변이의 유전에 의해 생긴다. 이러한 돌연변이를 보유하는 집단의 개체에게는 근이영양증 발병의 위험이 있다. 따라서, 환자 집단의 확인이 가능하며 이 질환의 진행 이전에 본 발명의 조성물 또는 단위 제형의 키트를 투여받을 수 있다. 따라서, 이러한 개체에서의 근육 위축 또는 소모의 진행이 "예방"된다.

핵산 분자

본 발명은 또한 화학식 I의 펩티드를 코딩하는 핵산 분자 및 그의 변이체를 바람직하게는 단리 형태로 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 "핵산"은 상기에서 정의된 본 발명의 펩티드를 코딩하거나 이러한 펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 대하여 상보성인 RNA 또는 DNA로 정의된다. 구체적으로는 게놈 DNA, cDNA, mRNA 및 안티센스 분자와, 다른 골격을 기초로 하거나 천연원으로부터 유래되거나 합성될 수 있는 다른 염기를 포함하는 핵산이 고려된다.

본 발명은 또한 코딩 핵산 분자의 단편을 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 코딩 핵산 분자의 단편은 전체 단백질 코딩 서열의 작은 일부를 나타낸다. 단편의 크기는 사용 의도에 의해 결정된다. 예를 들어 단편이 본 발명의 펩티드의 활성 부분을 코딩하도록 선택될 경우, 단편은 본 펩티드의 작용 영역을 코딩하기에 충분히 커야 할 필요가 있다.

폴리머라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)을 위한, 또는 본 발명의 펩티드를 코딩하는 유전자 서열의 합성을 위한 프로브(probe) 또는 특정 프라 이머(primer)로 사용되는 본 발명의 코딩 핵산 분자의 단편(즉, 합성 올리고뉴클레오티드)은 화학적 기술, 예를 들어 문헌[Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc., 103:3185-3191 (1981)]의 포스포트라이에스테르 방법에 의해, 또는 자동 합성 방법을 이용하여 용이하게 합성할 수 있다. 또한, 더 큰 DNA 절편은 잘 알려진 방법, 예를 들어 유전자의 다양한 모듈(modular) 절편을 규정하는 올리고뉴클레오티드 군의 합성, 이어서 올리고뉴클레오티드의 라이게이션으로 완전한 변형 유전자를 생성하는 것에 의해 손쉽게 제조될 수 있다.

본 발명의 코딩 핵산 분자는 진단 및 프로브용의 검출가능한 표지(label)를 포함하도록 추가로 변형될 수 있다. 이러한 다양한 표지는 당 업계에 알려져 있으며 본 명세서에 기술된 코딩 분자와 함께 손쉽게 이용될 수 있다. 적합한 표지는, 그에 한정되는 것은 아니지만, 바이오틴, 방사선 동위 원소 표지 뉴클레오티드 등을 포함한다. 숙련자라면 손쉽게 이러한 표지를 이용하여 본 발명의 핵산 분자의 표지된 변이체를 얻을 수 있다. 번역 동안 단백질 서열 내로 혼입되는 아미노산의 결실, 부가 또는 변경에 의해 일차 구조 그 자체를 변형시키는 것은 단백질의 활성을 파괴하지 않고도 이루어질 수 있다. 이러한 치환 또는 기타 변경에 의해 단백질은 본 발명의 고려되는 범주 내의 핵산에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 가지게 된다.

펩티드 또는 펩티드를 발현하는 세포주의 제조

본 발명의 펩티드는, 그에 한정되는 것은 아니지만, CRF₂R에 의해 조절되는 장애의 치료를 위한 제약적 약제로서의 용도를 비롯하여 다양한 용도로 제조될 수 있다. 당 업계의 숙련자에게는 본 발명의 특정의 실시 형태에 있어서는 정제 펩티드가 가장 유용한 반면, 다른 실시 형태에 있어서는 본 펩티드를 발현하는 세포주가 가장 유용하다는 것이 자명할 것이다.

화학식 I의 펩티드는 짧은 폴리펩티드이기 때문에 숙련자라면 본 발명의 펩티드가 당 업계에 잘 알려진 기술을 이용하여 재조합 방법에 의해서가 아닌 직접적인 합성법에 의해 합성될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 문헌[Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg (1984)] 참조. 그리고 고체상 합성을 통한 것과 같은 합성법은 예를 들어 문헌[Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-54 (1963)]; 문헌[Barany et al., Int. J. Peptide Protein Res., 30:705-739 (1987)]; 및 미국 특허 제5,424,398호 참조.

예를 들어 펩티드는 어플라이드 바이오시스템, 인크.(Applied Biosystem, Inc., ABI) 모델 433 자동 합성기 또는 프로틴 테크놀로지, 인크(Protein Technology, Inc., PTI)제의 다중 반응 합성기(모델 Symphony(상표명))로 합성될 수 있다. ABI 합성기로 합성되는 펩티드에 대해서는, 모든 시약은 ABI사로부터 구매된다 (알드리치(Aldrich)사로부터 구매되는 피페리딘은 제외). Fmoc 아미노산은 ABI사로부터 구매된다 (켐-임펙(Chem-Impek)사로부터 구매되는 Fmoc-L-Pyr은 제외). 링크(Rink) 아미드 수지는 노바 케미칼즈(Nova Chemicals)사로부터 구매된다. 단일 커플링을 이용한 표준의 0.1 mmole FastMoc 화학적 방법이 이용된다. SPPS (고체상 펩티드 합성)에 있어서의 일반적인 Fmoc 화학 프로토콜은, 1) 피페리딘을 이용하여 Fmoc 보호기를 절단하는 단계; 2) 아미노산의 카복실기를 활성화시키는 단계; 및 3) 활성화 아미노산을 수지 결합 펩티드 사슬의 아미노-말단에 커플링시켜 펩티드 결합을 형성하는 단계를 포함한다. 아미노산은 2-(1H-벤조트라이아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU)로 활성화시킨다. 카트리지 중의 건조 보호 아미노산(1.0 mmol)을 N,N-다이메틸포름아미드(DMF) 중의 1-하이드록시벤조트라이아졸(HOBt), N,N-다이아이소프로필에틸아민(DIEA), 및HBTU의 용액에 용해시키고 추가의 N-메틸피롤리돈(NMP)을 첨가한다. 활성화 Fmoc 아미노산이 거의 즉시 형성되는데 이 용액을 반응 용기로 직접 옮긴다. Fmoc 탈보호 단계를 전도율 측정으로 모니터링 및 제어한다. 펩티드 사슬은, C-말단 아미드가 필요하기 때문에 링크 아미드 수지 상에 생성시킨다. 최종 생성물을 NMP 및 다이클로로메탄(DCM)으로 광범위하게 세척한다.

PTI 다중 합성기로 합성되는 펩티드에 대해서는, 모든 Fmoc 아미노산은 노바바이오켐(NovaBiochem)사로부터 구매한다 (켐-임펙스(Chem-Impex)사로부터 구매되는 Fmoc-Pyr은 제외). 표준의 0.05 mmole Fmoc 합성 프로토콜을 합성에 이용한다. Fmoc 아미노산(0.4 mmol)을 HBTU (200 mM), N-메틸모르폴린(NMM, 0.4 M) 및 N,N-다이메틸포름아미드(DMF)의 용액에 용해시키고 추가의 N-메틸피롤리돈(NMP)을 첨가한다. 활성화 Fmoc 아미노산이 거의 즉시 형성되는데 이 용액을 반응 용기로 직접 옮긴다. Fmoc 탈보호 단계를 2회 수행한다. 펩티드 사슬은, C-말단 아미드가 필요하기 때문에 링크 아미드 수지 상에 생성시킨다. 최종 합성 생성물을 NMP 및 다이클로로메탄(DCM)으로 광범위하게 세척한다.

새롭게 합성된 펩티드를 탈보호시킨다. 합성된 펩티드를 포함하는 수지를 합성기로부터 빼내어 잠시동안 공기 건조시킨다. 실온에서 4시간 동안 1.5-2.0 ml의 절단 칵테일(95% 트라이플루오로아세트산(TFA), 2.5% 에타노다이티올, 2.5% 티오아니솔, 및 물 중 2.5%의 페놀(W/V)을 포함)을 사용하여, 펩티드를 수지로부터 절단해 내고 동시에 측쇄 보호기[Asp, Glu, Tyr, Thr 및 Ser의 경우 O-t-부틸(OtBu); Arg의 경우 펜타메틸크로만-6-설포닐(Pmc); Trp 및 Lys의 경우 t-부톡시카르보닐(Boc); His, Asn 및 Gln의 경우 트라이틸(Trt)]를 탈보호 조건 하에 제거한다. 절단 용액을 여과에 의해 수지로부터 분리한다. 이어서 여과액을 15 ml의 물로 희석시킨다. 6회의 에테르 추출을 수행하여 펩티드 생성물을 세정한다. 펩티드를 동결건조시키고 정제 이전에는 -20℃에서 보관한다.

탈보호 펩티드를 정제 및 특성화한다. 펩티드 분말을 50% 아세트산 용액에 용해시키고 정제의 경우 입자 크기가 5 μm이고 기공 크기가 300 옴스트롬인 Vydac 1.0 cm I.D. 25 cm 길이의 C-8 컬럼에 주입한다. 이중 파장(220 nm 및 280 nm)의 자외선 검출기가 갖추어진 베크만 시스템 골드(Beckman System Gold) 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 시스템을 사용한다. 선형 구배의 아세토니트릴을 프로그래밍하고 컬럼에 도입하여 다른 물질로부터 펩티드 생성물을 분리한다. 용출액을 파마시아(Pharmacia) 분획 수집기로 수집하고, 개개의 분리 분획을 분석용 HPLC 및 특성화를 위한 (매트릭스 보조 레이저 탈착 비행시간형 질량 분석기(matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectroscopy) MALDI-TOF MS 둘 모두에서 처리하여 동일성 및 순도를 보증한다.

펩티드 제조에서의 재조합 DNA 기술, 또는 이러한 펩티드를 발현하는 세포주의 사용이 또한 고려된다. 이러한 재조합 방법은 당 업계에 잘 알려져 있다. rDNA 분자의 생성 방법이 당 업계에 잘 알려져 있는데, 예를 들어 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]을 참조하기 바란다. 본 발명의 재조합 펩티드의 발현을 위하여, 하나 이상의 조절 요소의 제어 하의 목적 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제조한다. 본 발명의 펩티드를 코딩하는 핵산의 서열은 본 명세서에서 논의되거나 청구된 펩티드 서열로부터 추정할 수 있다.

당 업계에 잘 알려진 방법에 의해, 목적 펩티드를 코딩하는 단리 핵산 분자를 적합한 발현 벡터 내로 라이게이션시킬 수 있다. 본 발명의 용도에 사용될 수 있는 숙주-발현 벡터 시스템은, 그에 한정되는 것은 아니지만, 본 발명의 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA, 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환되는 박테리아와 같은 미생물(예를 들어, 이. 콜라이(E. coli), 비. 서틸리스(B. subtilis)); 본 발명의 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환되는 효모(예를 들어, 사카로마이세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia)); 본 발명의 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어 바큘로바이러스(baculovirus))로 감염되는 곤충 세포 시스템; 본 발명의 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어 꽃양배추 모자이크 바이러스, 담배 모자이크 바이러스)로 감염되거나 본 발명의 펩티 드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어 Ti 플라스미드)로 형질전환되는 식물 세포 시스템; 또는 포유류 세포의 게놈(예를 들어 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유류 바이러스(예를 들어 레트로바이러스 LTR)로부터 유래되는 프로모터를 포함하며 본 발명의 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 재조합 발현 제작물을 보유하는 포유류 세포 시스템(예를 들어 COS, CHO, HEK293, NIH3T3)을 포함한다.

박테리아 시스템에 있어서, 다수의 발현 벡터가 발현시킬 펩티드에 있어서의 사용 의도에 따라 선택되는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어 이러한 단백질이 다량 필요할 경우, 높은 수준의 단백질 생성물을 발현시키는 벡터가 바람직하다. 당 업계의 숙련자라면 이러한 벡터 제작물을 생성하고 융합 단백질 선택성 컬럼 및 항체 컬럼과 같은 선택적 정제 기술, 및 비-선택적 정제 기술을 비롯한 다양한 방법으로 단백질을 정제할 수 있다.

곤충 단백질 발현 시스템에 있어서, 바큘로바이러스 에이. 칼리포니카(A. californica) 핵 다각체 바이러스(nuclear polyhedrosis virus)(AcNPV)를 벡터로 사용하여 에스. 프루기페르다(S. frugiperda) 세포에서 외래 유전자를 발현시킨다. 이러한 경우, 본 발명의 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 바이러스의 중요하지 않은(non-essential) 영역 내로 클로닝하며 AcNPV 프로모터의 제어 하에 둔다. 이어서 재조합 바이러스를 사용하여 삽입된 유전자가 발현되는 세포를 감염시키고 당 업계의 숙련자에게 공지된 다수의 기술 중 하나로 단백질을 정제한다.

포유류 숙주 세포에 있어서, 다수의 바이러스-기반 발현 시스템이 이용될 수 있다. 이러한 발현 시스템의 이용에는 삽입된 뉴클레오티드 서열의 효율적인 번역을 위하여 벡터에 특정의 개시 신호를 생성할 것이 종종 요구된다. 이는 사용되는 뉴클레오티드 서열 부분이 내인성 개시 신호를 포함하지 않는 경우 특히 중요하다. 이러한 개시 신호를 삽입된 뉴클레오티드 서열의 코딩 영역과 프레임이 맞게(in frame) 배치하는 것과, 전사 및 번역 증강 요소의 부가 및 재조합 단백질의 정제는 당 업계의 숙련자에게 공지된 다수의 방법 중 하나로 성취된다. 포유류 숙주 세포에서 또한 중요한 것은 필요한 재조합 단백질의 번역 후 변형이 가능한 적절한 세포형의 선택이다. 이러한 변형, 예를 들어 절단, 포스포릴화, 글리코실화, 아세틸화 등은 변형 효소를 포함하는 적절한 숙주 세포의 선택을 필요로 한다. 이러한 숙주 세포는, 그에 한정되는 것은 아니지만, CHO, HEK293, NIH3T3, COS 등을 포함하며 당 업계의 숙련자에게 공지되어 있다.

재조합 단백질의 장기간의 높은 발현을 위해서는 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어, 본 발명의 펩티드를 안정하게 발현하는 세포주가 조작될 수도 있다. 당 업계의 숙련자라면 전기천공법, 인산칼슘 트랜스펙션, 또는 리포좀 매개 트랜스펙션과 같은 공지된 방법에 따라 본 발명의 펩티드를 안정하게 발현하는 세포주를 생성할 수 있다. 이는 일반적으로 적절한 발현 제어 요소(예를 들어, 프로모터 서열, 인핸서 서열, 전사 종결 서열, 폴리아데닐화 부위, 번역 개시 부위 등), 선발 마커(selectable marker), 및 목적 유전자를 포함하는 발현 벡터를 사용하여 세포를 트랜스펙션시킴으로써 성취된다. 선발 마커는 목적 유전자와 동일한 벡터 내에 포함되거나, 펩티드 코딩 서열을 포함하는 벡터와 함께 공동-트랜스펙션되는 개별 적인 벡터 상에 포함될 수 있다. 발현 벡터 내의 선발 마커는 선발에 대한 내성을 부여할 수 있으며 세포가 벡터를 그의 염색체 내로 안정하게 통합하게 하고 생장하여 중심체(focus)를 형성하게 하는데 이 중심체는 다시 클로닝하여 세포주로 확장시킬 수 있다. 이와는 달리, 발현 벡터는 마커의 물리적 속성을 이용하여 선발 마커를 발현하는 세포가 선발될 수 있게 하는데, 즉, 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein, GFP)의 발현은 형광 활성화 세포 분리(fluorescence activated cell sorting, FACS) 분석법을 사용한 마커 발현 세포의 선발을 가능하게 한다.

당 업계의 숙련자라면 목적 서열이 성공적으로 통합된 세포의 선발을 가능하게 하기 위하여 트랜스펙션을 위한 적절한 세포형을 선택할 수 있다. 예를 들어, 선발 마커가 단순포진 바이러스 타이미딘 키나제, 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 또는 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제일 경우, 적절한 세포형은 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt-세포이다. 또는, 선발 마커가 각각 메토트렉세이트, 마이코페놀산, G-418 또는 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 dhfr, gpt, neo 또는 hygro일 경우 정상 세포가 사용될 수 있다.

항체의 제조

본 발명의 펩티드의 하나 이상의 항원 결정 부위를 선택적으로 인식하는 항체도 본 발명에 포함된다. 이러한 항체는, 예를 들어 다중클론 항체, 단일클론 항체, 키메라 항체, 인간 항체, 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab )₂ 단편, Fab 발현 라이브 러리를 사용하여 생성되는 분자, 유전자 도입 생쥐에서 생성된 인간 항체(다중클론 또는 단일클론) 및 상기 중 임의의 것의 항원 결정 부위 결합 단편을 포함한다.

항체는, 예를 들어 이러한 유전자가 도입된 세포 또는 직접적으로 환자 조직에서의 본 발명의 펩티드의 발현을 평가하는 유전자 치료법 기술과 함께 이용될 수 있다.

항체의 제조에 있어서, 당 업계에 잘 알려진 방법으로 본 발명의 펩티드, 항-펩티드 항체, 항-펩티드 유사체 항체, 또는 그의 면역성 단편을 이용한 주사에 의해 다양한 숙주 동물을 면역화할 수 있다. 항-유전자형 항체의 제조에 있어서, 면역원은 항-펩티드 항체 또는 항-펩티드 유사체 항체이다. 항-유전자형 항체의 제조는 예를 들어 미국 특허 제4,699,880호에 기술되어 있다. 적합한 숙주 동물은, 그에 한정되는 것은 아니지만, 토끼, 생쥐, 염소, 양 및 말을 포함한다. 면역화 기술은 당 업계에 잘 알려져 있다. 다중클론 항체는 면역화 동물의 혈청으로부터 정제될 수 있으며, 단일클론 항체는 당 업계에 잘 알려진 방법에 의해 생성될 수 있다. 이러한 기술은, 그에 한정되는 것은 아니지만, 잘 알려진 쾰러(Kohler)와 밀스타인(Milstein)의 하이브리도마(hybridoma) 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술, 및 EBV 하이브리도마 기술을 포함한다. 단일클론 항체는 카파 또는 람다 경쇄를 포함하는 IgG, IgE, IgM, IgA 및 IgD를 비롯한 임의의 면역글로불린류일 수 있다. 키메라 항체의 생성 및 사용 기술은 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 제5,807,715호; 제4,816,397호; 제4,816,567호; 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,761호; 제5,693,762호; 제6,180,370호; 및 제5,824,307호에 기술되어 있다.

CRF ₂ R 선택성을 측정하는 분석법

본 발명의 펩티드의 약리학적 활성 및 선택성을 공개된 시험 절차를 사용하여 측정할 수 있다. 예를 들어 미국 특허 출원 제09/799978호 참조. CRF₂R 및 CRF₁R은 상동성 단백질이기 때문에 특정 부분의 CRF₂R 작용제가 CRF₁R의 작용제로도 기능할 것이 기대된다. 상기에서 논의된 바와 같이, CRF₁R의 활성화는 HPA 축의 활성화를 유도하는데 이는 코르티코스테로이드 생성 증가에 의해 골격근 위축이 일어나기 때문이다. 근육 질량 또는 기능의 증가가 요망되는 대부분의 경우, HPA 축의 활성화는 바람직하지 않다. 근이영양증과 관련되어 있지 않은 CRF₂R에 의해 조절되는 장애의 치료에 유용한 펩티드를 선택할 경우, 이 펩티드는 CRF₂R에 대하여 선택성인 것이 바람직하다. 바람직하게는 본 펩티드는 CRF₁R에 대한 CRF₂R에의 선택성이 10배(즉, CRF₂R에 대한 활성이 CRF₁R에 대한 활성보다 10배 더 큼), 더욱 바람직하게는 100배, 가장 바람직하게는 1000배 이상이다. 공개된 연구에 의하면 근이영양증의 치료에 있어서의 코르티코스테로이드 요법의 이득이 증명되었기 때문에 CRF₂R 작용제가 근이영양증의 치료에 사용될 경우 소정 수준의 CRF₁R 작동성을 유지하는 것이 유익할 수 있다. 따라서, 근이영양증의 치료에 있어서, 유사한 농도 범위에 걸쳐 CRF₁R 뿐만 아니라 CRF₂R도 활성화하는 낮은 선택성의 펩티드가 바람직하 다. 바람직하게는 본 펩티드는 CRF₁R에 대한 CRF₂R에의 선택성이 100배, 더욱 바람직하게는 10배이며, 가장 바람직하게는 CRF₁R에 대하여 CRF₂R에의 선택성이 없다(즉, 후보 화합물의 활성이 CRF₂R 및 CRF₁R에 대하여 실질적으로 유사함). 또한, 상기의 경우 본 펩티드가 CRF₂R에 대해서는 완전한 작용제이지만 CRF₁R에 대해서는 불완전한 작용제인 것이 더욱 바람직할 수 있다. 따라서, 이러한 펩티드는 근육 위축에 있어서 최대의 코르티솔 상승 정도 및 잠재력에 대한 고유의(built-in) 제한성을 가지며, 반면 CRF₂R을 통하여 조절되는 항-위축 효과는 투여량의 증가에 의해 증강될 수 있다. 당 업계의 숙련자라면 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 펩티드가 CRF₁R 또는 CRF₂R의 완전한 작용제인지 불완전한 작용제인지를 손쉽게 결정할 수 있다.

CRF₁R과 비교하여 CRF₂R 사이의 결합을 구별하는 것이 바람직하기 때문에 단지 CRF₂R을 발현하는 세포, 또는 세포로부터의 막을 사용하여 상기 분석을 수행할 수 있거나, 이 분석을 재조합 CRF₂R원을 이용하여 수행할 수 있다. 둘 모두의 CRFR형을 발현하는 세포를 상동 재조합법을 사용하여 변형시켜 CRF₁R 유전자를 불활성화시키거나 그렇지 않으면 불능으로 만들 수 있다. 이와는 달리, CRFR원이 하나 이상의 CRFR 형을 포함할 경우, 목적으로 하지 않는 수용체에 의해 생성되는 배경 신호를 분석에서 얻어지는 신호로부터 빼야 한다. 배경 응답은 안티센스, 항체 또는 선택성 길항제를 사용하여 목적으로 하지 않는 CRFR로부터의 신호를 제거하는 것을 비롯한 다수의 방법으로 측정될 수 있다. 공지된 CRFR의 길항제는, 그에 한정되는 것은 아니지만, 안탈라르민(antalarmin) (CRF₁R 선택성), 안티사우바긴-30 (CRF₂R 선택성) 및 아스트레신(astressin) (CRF₁R / CRF₂R에 대하여 비선택성)을 포함한다.

펩티드가 CRF₂R 및/또는 CRF₁R을 활성화시키는지를 측정하기 위해서는, 일반적으로 분석은 세포를 기반으로 하지만, 상기한 바와 같이 작용제 및 길항제 결합을 구별지을 수 있는 무세포 분석법이 공지되어 있다. 세포 기반 분석법은 CRF₁R 또는 CRF₂R을 발현하는 세포를 본 발명의 펩티드 또는 대조와 접촉시키는 단계 및 CRFR 신호 전달 경로의 구성 요소의 발현 또는 활성을 측정함으로써 CRFR의 활성화를 측정하는 단계를 포함한다.

상기 배경 기술 부분에서 기술되어 있는 바와 같이, CRFR은 세포형에 따라 G_αs, G_αq 또는 G_αi를 비롯한 여러 상이한 경로를 통하여 커플링되는 것으로 나타났다. 필요한 경로의 구성 요소가 특정 세포형에 존재한다면 CRFR의 작용제 활성화에 의해 이 수용체가 상기 경로 중 임의의 경로를 통하여 신호를 보내게 된다고 생각된다. 따라서, CRFR 활성화에 있어서 본 발명의 특정 펩티드를 분석하기 위해서는 심지어 생체내 처리에 있어서 관련 세포형이 상이한 경로를 통하여 CRFR을 골격근 위축에 커플링시킨다 해도 해독 정보(readout)로서 신호 변환 경로 중 임의의 경로가 분석에서 이용될 수 있다. 당 업계의 숙련자라면 수용체 활성화가 측정된 경로와는 상관없는 분석이 유용한 펩티드 작용제를 동정하는 데에 효과적이라는 것을 인식할 것이다. 이러한 신호 전송 경로의 활성화를 측정하는 분석법은 당 업계에 공지되어 있다.

예를 들어, 본 발명의 펩티드와의 접촉 후, 세포의 용해물(lysate)을 제조하고 cAMP의 유도에 대하여 분석할 수 있다. cAMP는 G_αs 활성화에 응답하여 유도된다. G_αs는 CRFR 이외의 수용체에 의해 활성화되기 때문에, 그리고 시험 펩티드는 CRFR을 통하여, 또는 다른 메커니즘에 의해 그의 영향을 발휘할 수 있기 때문에, 이 펩티드가 CRFR의 활성화를 통하여 cAMP의 수준을 증가시키는지를 측정하는 데에 두가지 대조 비교가 관련된다. 하나의 대조에서는 펩티드와 접촉된 세포의 cAMP 수준과 대조 화합물(즉, 펩티드가 용해되는 비히클(vehicle))과 접촉된 세포의 cAMP 수준이 비교된다. 펩티드가 대조 화합물에 비하여 cAMP 수준을 증가시킨다면 이는 펩티드가 몇몇 메커니즘에 의해 cAMP를 증가시키고 있음을 나타낸다. 다른 대조에서는 CRFR 발현 세포주와 CRFR을 발현하지 않는다는 것을 제외하고는 본질적으로 동일한 세포주의 cAMP 수준이 비교되는데, 여기서 둘 모두의 세포주를 본 펩티드로 처리하였다. 펩티드가 CRFR을 발현하지 않는 세포주에 비하여 CRFR 발현 세포주에서 cAMP 수준을 상승시킨다면 이는 펩티드가 CRFR의 활성화를 통하여 cAMP를 상승시킨다는 것을 나타내는 것이다.

하나의 실시예에 있어서, cAMP 유도는 CRFR을 발현하는 세포 내로 도입될 수 있는 다양한 리포터 유전자 중 임의의 유전자에 결합된 cAMP 응답성 요소를 포함하 는 DNA 제작물을 사용하여 측정한다. 이러한 리포터 유전자는, 그에 한정되는 것은 아니지만, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(chloramphenicol acetyltransferase, CAT), 루시퍼라제, 글루큐로나이드 신테타제, 성장 호르몬, 형광 단백질(예를 들어 녹색 형광 단백질), 또는 알칼라인 포스파타제를 포함한다. 세포를 펩티드에 노출시킨 후, 리포터 유전자의 발현 수준을 정량화하여 펩티드가 cAMP 수준을 증가시키는 능력을 측정함으로써 펩티드의 CRFR 활성화 능력을 측정할 수 있다.

이러한 분석에 유용한 세포는, 활성화 분석에 이용되는 세포가 바람직하게는 CRF 또는 하나 이상의 CRF 유사체에 대하여 통계적으로 유의하게 응답하는 작용성 수용체를 발현한다는 것을 제외하고는, 상기 CRFR 결합 분석에서의 것과 동일하다. 전장(full length) CRFR을 발현하는 세포의 사용에 더하여, 리포터 요소에 커플링되거나, 리포터 요소를 포함하거나 신호 전송 단백질과 상호작용하도록 물리적으로 변형된 수용체의 리간드 결합 도메인을 포함하는 CRFR을 발현하는 세포가 조작될 수 있다. 예를 들어, 야생형 CRFR 또는 CRFR 단편을 G-단백질에 융합시켜 융합 단백질의 CRFR 부분에의 작용제의 결합시 융합 G-단백질을 활성화시킬 수 있다. 문헌[Siefert, R. et al., Trends Pharmacol. Sci., 20: 383-389 (1999)]. 또한 세포는 바람직하게는 해독 정보에 따라 CRF 또는 CRF 유사체에 의한 유도성 응답을 최대화하기 위한 다수의 특성을 보유하여야 하는데, 예를 들어 CRE 리포터 유전자의 강력한 유도성 탐지를 위해서는 (a) 본래의 낮은 수준의 cAMP; (b) CRFR과 상호 작용할 수 있는 G 단백질; (c) 높은 수준의 아데닐릴 사이클라제; (d) 높은 수준의 단백질 키나제 A; (e) 낮은 수준의 포스포다이에스터레이즈; 및 (f) 높은 수준의 cAMP 응답 요소 결합 단백질이 유리하다. CRF 또는 CRF 유사체에 대한 응답을 증가시키기 위하여, 더욱 많은 양의 유리한 인자 또는 더욱 적은 양의 불리한 인자를 발현하도록 숙주 세포가 조작될 수 있다. 또한, CRE 리포터의 다른 유도 경로를 제거하여 기초 수준을 감소시킬 수 있다.

약리학적 활성의 측정 분석법

본 발명의 펩티드의 약리학적 활성은 공개된 시험 절차를 사용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 골격근 위축 또는 비대 모델은 골격근 위축의 시험관내 세포 배양 모델 및 생체내 동물 모델 둘 모두를 포함한다.

골격근 위축의 시험관내 모델은 당 업계에 공지되어 있다. 이러한 모델은 예를 들어 문헌[Vandenburgh, H.H., In Vitro, 24:609-619 (1988)], 문헌[Vandenburgh, H.H. et al., J. Biomechanics, 24 Suppl 1:91-99 (1991)], 문헌[Vandenburgh, H.H et al., In Vitro Cell. Dev. Biol., 24(3):166-174 (1988)], 문헌[Chromiak, J.A., et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim., 34(9):694-703 (1998)], 문헌[Shansky, J., et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim., 33(9):659-661 (1997)], 문헌[Perrone, C.E. et al., J. Biol. Chem., 270(5):2099-2106 (1995)], 문헌[Chromiac, J.A. and Vandenburgh, H.H., J. Cell. Physiol., 159(3):407-414 (1994)], 및 문헌[Vandenburgh, H.H. and Karlisch, P., In Vitro Cell. Dev. Biol., 25(7):607-616 (1989)]에 기술되어 있다.

하기의 참고 문헌에 기술되어 있는 것과 같은 다양한 골격근 위축의 동물 모 델이 당 업계에 공지되어 있다: 문헌[Herbison, G.J., et al. Arch. Phys. Med. Rehabil., 60:401-404 (1979)], 문헌[Appell, H-J. Sports Medicine 10:42-58 (1990)], 문헌[Hasselgren, P-O. and Fischer, J.E. World J. Surg., 22:203-208 (1998)], 문헌[Agbenyega, E.T. and Wareham, A.C. Comp. Biochem. Physiol., 102A:141-145 (1992)], 문헌[Thomason, D.B. and Booth, F.W. J. Appl. Physiol., 68:1-12 (1990)], 문헌[Fitts, R.H., et al. J. Appl. Physiol., 60:1946-1953 (1986)], 문헌[Bramanti, P., et al. Int. J. Anat. Embryol. 103:45-64 (1998)], 문헌[Cartee, G.D. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci., 50:137-141 (1995)], 문헌[Cork, L.C., et al. Prog. Clin. Biol. Res., 229:241-269 (1987)], 문헌[Booth, F.W. and Gollnick, P.D. Med. Sci. Sports Exerc., 15:415-420 (1983)], 문헌[Bloomfield, S.A. Med. Sci. Sports Exerc., 29:197-206 (1997)]. 이러한 모델에 있어서의 바람직한 동물은 생쥐 및 쥐이다. 상기 모델은 예를 들어 깁스(casting) 또는 그렇지 않을 경우 사지의 고정, 뒷다리 현수, 완전한 동물 고정화, 및 무게 감소 상태와 같은 불용 유도성 위축 모델을 포함한다. 신경 손상 유도성 위축 모델은 예를 들어 신경 압박(crush), 특정 근육에 분포하는 신경 절편의 제거, 신경에 대한 독소 적용과, 바이러스, 박테리아 또는 진핵생물 감염 제제(agent)에 의한 신경 감염을 포함한다. 글루코코르티코이드 유도성 위축 모델은, 예를 들어 시상하부-뇌하수체-부신(HPA) 축을 활성화하는 호르몬의 적용에 의한 내인성 코르티코스테로이드 생성의 촉진과, 위축 유도 투여량의 외인성 글루코코르티코이드의 동물에의 적용을 포함한다. 패혈증 유도성 위축 모델은 예를 들어 박테 리아와 같은 패혈증 유도 유기체를 이용한 접종, 박테리아 세포벽 추출물 또는 내독소와 같은 면역 활성화 화합물을 이용한 동물의 처치, 및 장 벽의 천자(puncture)를 포함한다. 악액질 유도성 위축 모델은 예를 들어 악액질 형성 잠재력을 가지는 종양 형성성(tumorigenic) 세포의 동물에의 접종, 악액질로 이어지는 감염성 제제(예를 들어 에이즈를 야기하는 바이러스)의 동물에의 접종 및 악액질을 유도하는 호르몬 또는 사이토카인, 예를 들어 CNTF, TNF, IL-6, IL-1 등을 이용한 동물의 처치를 포함한다. 심부전 유도성 위축 모델은 심부전이 골격근 위축과 동시에 발병하도록 동물을 조작하는 것을 포함한다. 퇴행성 신경 질환 유도성 위축 모델은 동물을 뉴런 구성 요소로 면역화하는 것으로부터 생기는 것과 같은 자가면역 동물 모델을 포함한다. 근이영양증 유도성 위축 모델은 Mdx 생쥐에서 나타나는 디스트로핀 유전자의 돌연변이와 같은 유전적으로 유도된 근이영양증의 천연 또는 인공 모델을 포함한다.

골격근 비대의 동물 모델은 예를 들어 반대되는 사지의 불활성화로 인한 사지 근육 사용 증가 모델, 불용 위축 유도 사건에 이은 재계량 모델, 일시적 신경 손상 때문에 위축된 근육의 재이용 모델, 주동근(synergistic muscle)의 불활성화로 인한 선택적 근육 사용의 증가 모델(예를 들어 보상성 비대), 근육에 가해지는 하중 증가로 인한 근육 이용 증가 모델 및 글루코코르티코이드 유도성 위축 후 글루코코르티코이드의 제거에 의해 생기는 비대 모델을 포함한다. 바람직한 동물 위축 모델은 이하에서 더욱 상세하게 기술되는 좌골 신경 탈신경 위축 모델, 글루코코르티코이드 유도성 위축 모델, 및 다리 깁스에 의한 불용 위축 모델을 포함한다.

좌골 신경 탈신경 위축 모델은 동물을 마취시키고 이어서 우측 또는 좌측 좌골 신경의 짧은 절편을 수술로 제거하는 것을 포함하는데, 예를 들어 생쥐에 있어서 좌골 신경은 대략 대퇴부의 중앙에서 단리하며 3-5 mm 절편을 제거한다. 이는 뒷다리 하부의 근육 조직의 신경을 제거하여 상기 근육에서 위축을 일으킨다. 일반적으로, 대퇴이두근으로의 신경 분포는 온전하게 남아 있어 사실상 정상적인 보행을 위한 만족스러운 무릎 운동을 제공한다. 일반적으로, 미처리 동물에 있어서는 탈신경화 근육의 근육 질량이 탈신경화한지 10일 후에 30-50% 감소한다. 탈신경화 후, 시험 펩티드를 예를 들어 삼투 미니펌프(예를 들어, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 알제트(Alzet)사제)의 이식을 통하여 예를 들어 연속 주입으로 또는 주사에 의해 투여하여 시험 화합물의 탈신경화 유도성 골격근 위축에 대한 영향을 측정한다. 탈신경화 이후의 다양한 시간대에서 동물을 안락사시키고 하부 다리 근육을 탈신경화 및 비탈신경화 다리 둘 모두로부터 신속하게 절개하고, 힘줄과 결합 조직을 제거한 근육의 중량을 잰다. 영향을 받은 근육에서의 위축 정도를 예를 들어 근육 질량, 근육 단면적, 근육섬유 단면적 또는 수축성 단백질 함량의 측정에 의해 분석한다.

글루코코르티코이드 유도성 위축 모델은 글루코코르티코이드, 예를 들어 일일 1.2 mg/kg의 음용수 중 덱사메타손을 시험 동물에 투여하는 것을 포함한다. 일반적으로, 미처리 동물에 있어서, 골격근 질량은 덱사메타손 투여 10일 후에 30-50% 감소된다. 글루코코르티코이드 투여와 동시에, 또는 글루코코르티코이드 투여 이후, 시험 펩티드를 예를 들어 주사 또는 연속 주입에 의해 투여하여 그의 글루코 코르티코이드 유도성 골격근 위축에 대한 영향을 측정한다. 글루코코르티코이드 투여 이후의 다양한 시간대에서 영향을 받은 근육에서의 위축 정도를 상기 탈신경 모델에 대하여 기술한 바와 같이 분석한다.

다리 깁스에 의한 불용 위축 모델은 무릎에서 아래로 발까지 동물의 뒷다리 하나를 깁스하는 것을 포함한다. 일반적으로 근육 질량은 깁스 10일 후에 20-40% 감소한다. 깁스 후, 시험 펩티드를 예를 들어 삼투 미니펌프(예를 들어, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 알제트사제)의 이식을 통하여 예를 들어 연속 주입으로 또는 주사에 의해 투여하여 시험 펩티드의 다리 깁스 유도성 골격근 위축에 대한 영향을 측정한다. 다리 깁스 이후의 다양한 시간대에서 영향을 받은 근육에서의 위축 정도를 상기 탈신경 모델에 대하여 기술한 바와 같이 분석한다.

본 펩티드의 골 활성화는 본 화합물이 뼈의 부피, 질량 또는 밀도를 증가시키는 능력을 시험하도록 고안된 분석법을 이용하여 편리하게 증명할 수 있다. 이러한 분석법의 예로는 난소 적출 쥐 분석법이 있다.

난소 적출 쥐 분석법에 있어서, 6개월령의 쥐에서 난소를 적출하고, 2개월 둔 후, 시험 화합물을 일일 1회 피하 투여한다. 연구의 완료시, 뼈 질량 및/또는 밀도를 이중 에너지 x-선 흡수계측법(dual energy x-ray absorptometry, DXA) 또는 말단부 정량적 전산화 단층촬영술(peripheral quantitative computed tomography, pQCT), 또는 미세 전산화 단층촬영술(mCT)로 측정할 수 있다. 이와는 달리, 뼈 부피 또는 형성 증가의 측정에 정적 또는 동적 조직형태 계측법을 이용할 수 있다.

조성물

본 발명의 다른 실시예는, (a) 안전한 유효량의 본 발명의 펩티드; 및 (b) 제약적으로 허용가능한 담체를 함유하는 조성물이다. 표준 제약 제형 기술, 예를 들어 문헌[Remington s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., latest edition]에 개시된 것이 사용된다.

"안전한 유효량"은, 본 발명의 방식으로 이용될 때, 본 발명 펩티드를 필요로 하는 동물, 바람직하게는 포유류, 더욱 바람직하게는 사람인 대상에서 치료할 상태를 상당히 긍정적으로 변화시키기에 충분하지만 심각한 부작용(예, 독성, 자극, 또는 알레르기 반응)을 피하기에 충분히 낮으며 합리적인 이익/위험 비율에 해당하는 본 발명 펩티드의 양을 의미한다. 구체적인 "안전한 유효량"은 명백히 치료될 구체적 상태, 대상의 신체 조건, 치료의 기간, (만일 있다면) 수반되는 치료의 특성, 이용되는 구체적인 투여 형태, 이용되는 담체, 담체에 대한 펩티드의 용해도, 및 그 조성물에 바람직한 투여 요법과 같은 인자들에 따라 다를 것이다. 당업자는 하기의 개시를 따라 본 발명에 따른 "안전한 유효량"을 결정할 수도 있다. 문헌[Spilker B., Guide to Clinical Studies and Developing Protocols, Raven Press Books, Ltd., New York, 1984, pp. 7-13, 54-60]; 문헌[Spilker B., Guide to Clinical Trials, Raven Press, Ltd., New York, 1991, pp. 93-101]; 문헌[Craig C., and R. Stitzel, eds., Modern Pharmacology, 2d ed., Little, Brown and Co., Boston, 1986, pp. 127-33]; 문헌[T. Speight, ed., Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 3d ed., Williams and Wilkins, Baltimore, 1987, pp. 50-56]; 문헌[R. Tallarida, R. Raffa and P. McGonigle, Principles in General Pharmacology, Springer-Verlag, New York, 1988, pp. 18-20].

본 발명의 조성물은, 본 발명의 펩티드외에도 제약상 허용되는 담체를 함유한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "제약상 허용되는 담체"는 동물, 바람직하게는 포유류, 더욱 바람직하게는 사람에게 투여하기에 적합한 하나 이상의 상용성(compatible) 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "상용성"은 그 조성물의 성분들이, 통상의 사용 상황에서 조성물의 약학적 효능을 실질적으로 감소시키는 상호작용없이 본 발명의 펩티드와, 그리고 서로, 혼합될 수 있음을 의미한다. 물론 제약상 허용되는 담체는 충분히 순도가 높고 독성이 낮아 치료되는 동물, 바람직하게는 포유류, 더욱 바람직하게는 사람에게 투여하기에 적합해야 한다.

제약적으로 허용가능한 담체 또는 그의 성분으로 기능할 수 있는 몇몇 물질의 예로는, 당, 예를 들어 락토스, 글루코스 및 수크로스; 전분, 예를 들어 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로오스 및 그의 유도체, 예를 들어 소듐 카복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 메틸 셀룰로오스; 분말화 트래거캔스; 맥아; 젤라틴; 활석; 고체 윤활제, 예를 들어 스테아르산 및 스테아르산마그네슘; 황산칼슘; 식물유, 예를 들어 땅콩유, 면실유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 테오브로마유; 폴리올, 예를 들어 프로필렌 글리콜, 글리세린, 소르비톨, 만니톨, 및 폴리에틸렌 글리콜; 알긴산; 유화제, 예를 들어 트윈스(Tweens(등록상표)); 습윤제, 예를 들어 소듐 라우릴 설페이트; 착색제; 착향제; 정제화제, 안정제; 산화방지제; 방부제; 무발열원성 물; 등장 염수; 및 포스페이트 완충액이 있다.

본 발명의 화합물과 함께 사용할 제약적으로 허용가능한 담체의 선택은 기본적으로는 본 펩티드가 투여되는 방식에 의해 결정된다.

본 발명의 펩티드를 주사할 경우, 바람직한 제약적으로 허용가능한 담체는 혈액 상용성의 콜로이드성 현탁제를 포함하며 pH가 약 7.4로 조정된 살균 생리 염수이다.

구체적으로, 전신 투여를 위한 제약상 허용되는 담체는 당, 전분, 셀룰로오스 및 그 유도체, 맥아, 젤라틴, 활석, 칼슘 설페이트, 식물성유, 합성유, 폴리올, 알긴산, 인산염 완충용액, 유화제, 등장식염수, 및 무발열원성 물을 포함한다. 비경구 투여에 바람직한 담체는 프로필렌 글리콜, 에틸 올레에이트, 피롤리돈, 에탄올 및 참기름을 포함한다. 바람직하게는, 비경구 투여를 위한 조성물에서 제약상 허용되는 담체는 총 조성물의 적어도 약 90중량%를 구성한다.

본 발명의 조성물은 바람직하게는 단위 제형(unit dosage form)으로 제공된다. 본 명세서에서 사용되는 "단위 제형"은 알맞은 의료 업무에 따라 동물, 바람직하게는 포유류, 더욱 바람직하게는 인간 대상에게 단일 투여량으로 투여하기에 적합한 양의 화학식 I의 펩티드를 함유하는 본 발명의 조성물이다. 이러한 조성물은 바람직하게는 약 0.1 mg(밀리그램) 내지 약 1000 mg, 더욱 바람직하게는 약 0.5 mg 내지 약 500 mg, 더욱 바람직하게는 약 1 mg 내지 약 30 mg의 화학식 I의 펩티드를 함유한다.

본 발명의 조성물은 예를 들어 경구 투여, 직장 투여, 국소 투여, 비강 투 여, 안구 투여 또는 비경구 투여에 적합한 임의의 다양한 형태일 수 있다. 원하는 특정 투여 경로에 따라 당 업계에 잘 알려진 다양한 제약적으로 허용가능한 담체가 사용될 수 있다. 이들은 고체 또는 액체 충전제, 희석제, 친수성 부여 물질, 계면활성제 및 캡슐화 물질을 포함한다. 화학식 I의 펩티드의 CRF₂R 작용제 활성을 실질적으로 간섭하지 않는 선택적인 제약적 활성 물질이 포함될 수 있다. 화학식 I의 펩티드와 함께 이용되는 담체의 양은 화학식 I의 펩티드의 단위 투여량 당 투여용 물질의 실제 양을 제공하기에 충분해야 한다. 본 발명의 방법에서 유용한 제형의 제조를 위한 기술 및 조성물이 참고 문헌[Modern Pharmaceutics, Chapters 9 and 10 (Banker & Rhodes, editors, 1979)]; 문헌[Lieberman et al., Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets (1981)]; 및 문헌[Ansel, Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms 2d Edition (1976)]에 기술되어 있다.

정제, 캡슐제, 과립제 및 벌크 분말과 같은 고체 형태를 비롯한 다양한 경구용 제형이 사용될 수 있다. 이러한 경구형은 안전한 유효량, 일반적으로 약 5% 이상, 바람직하게는 약 25% 내지 약 50%의 펩티드를 포함한다. 적합한 결합제, 윤활제, 희석제, 붕해제, 착색제, 착향제, 유동 유도제 및 용융제를 포함하는 정제는 압축되거나, 정제 미분화되거나, 장용으로 코팅되거나, 당으로 코팅되거나, 필름 코팅되거나, 다중 압축될 수 있다. 경구용 액체 제형은 수성 용액, 에멀젼, 현탁액, 비발포성 과립으로부터 재구성된 용액 및/또는 현탁액과, 발포성 과립으로부터 재구성되며 적합한 용제, 방부제, 유화제, 현탁제, 희석제, 감미제, 용융제, 착색 제 및 착향제를 포함하는 발포성 제제를 포함한다.

경구 투여용의 단위 제형의 제조에 적합한 제약적으로 허용가능한 담체는 당 업계에 잘 알려져 있다. 정제는 일반적으로 통상의 제약적으로 상용성인 불활성 희석제로서의 보조제, 예를 들어 탄산칼슘, 탄산나트륨, 만니톨, 락토스 및 셀룰로오스; 결합제, 예를 들어 전분, 젤라틴 및 수크로스; 붕해제, 예를 들어 전분, 알긴산 및 크로스카르멜로스(croscarmelose); 윤활제, 예를 들어 스테아르산마그네슘, 스테아르산 및 활석을 포함한다. 글리단트, 예를 들어 이산화규소가 분말 혼합물의 유동 특성의 개선을 위하여 사용될 수 있다. 착색제, 예를 들어 FD&C 염료가 외관을 위하여 첨가될 수 있다. 감미제 및 착향제, 예를 들어 아스파탐, 사카린, 멘톨, 박하 및 과일향이 츄잉성 정제에 유용한 보조제이다. 캡슐제는 일반적으로 상기에 개시된 하나 이상의 고체 희석제를 포함한다. 담체 성분의 선택은 본 발명의 목적에는 결정적이지 않은 기호, 비용 및 저장 안정성과 같은 부차적인 고려 사항에 따라 달라지며, 당 업계의 숙련자에 의해 손쉽게 이루어질 수 있다. 일반적으로, 본 조성물은 본 펩티드와, 위 환경에 대한 보호 및 장에서의 생물학적 활성 물질의 방출을 고려한 불활성 성분을 함유한다.

화학식 I의 펩티드는 유도체의 경구 전달이 효능을 가지도록 화학적으로 변형될 수 있다. 일반적으로, 고려되는 화학적 변형은 단백질 분자 그 자체에 하나 이상의 부분을 부착하는 것인데, 여기서 상기 부분은 (a) 단백질 분해의 억제; 및 (b) 위 또는 장으로부터의 혈류 내로의 섭취를 허용한다. 또한 요망되는 것은 단백질의 전체 안정성의 증가 및 체내에서의 순환 시간 증가이다. 이러한 부분의 예는, 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸 셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈 및 폴리프롤린을 포함한다. 문헌[Newmark et al., J. Appl. Biochem., 4:185-189 (1982)]. 사용될 수 있는 다른 중합체로는 폴리-1,3-다이옥솔란 및 폴리-1,3,6-트리옥소칸이 있다. 상기에서 나타낸 바와 같이 제약적 용도에 바람직한 것은 폴리에틸렌 글리콜 부분이다.

방출 위치는 위, 소장(십이지장, 공장(jejunum), 또는 회장(ileum)), 또는 대장(large intestine)일 수 있다. 당 업계의 숙련자라면 위에서는 용해되지 않지만 십이지장 또는 장의 다른 곳에서 물질을 방출하는 이용가능한 제형을 가질 수 있다. 바람직하게는, 이 방출은 펩티드(또는 변이체)의 보호에 의해, 또는 위 환경 이외의 환경, 예를 들어 장에서의 생물학적 활성 물질의 방출에 의해 위 환경의 해로운 영향을 회피한다.

완전한 위 내성을 보증하기 위하여 적어도 pH 5.0에 대하여 불투과성인 코팅이 바람직하다. 장용 코팅으로 사용되는 더욱 일반적인 불활성 성분의 예로는 셀룰로오스 아세테이트 트라이멜리테이트(CAT), 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 프탈레이트(HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트(PVAP), 유드라기트(Eudragit) L30D, 아쿠아테릭(Aquateric), 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트(CAP), 유드라기트 L, 유드라기트 S, 및 셸락(Shellac)이 있다. 이러한 코팅은 혼합 필름으로 사용될 수 있다.

경구용 조성물은 액체 용액, 에멀젼, 현탁액 등을 또한 포함한다. 이러한 조성물의 제조에 적합한 제약적으로 허용가능한 담체는 당 업계에 잘 알려져 있다. 시럽, 엘릭서, 에멀젼 및 현탁액의 전형적인 담체 성분은 에탄올, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 액체 수크로스, 소르비톨 및 물을 포함한다. 현탁액에 있어서, 전형적인 현탁제는 메틸 셀룰로오스, 소듐 카복시메틸 셀룰로오스, 아비셀(Avicel(등록상표)) RC-591, 트래거캔스 및 알긴산나트륨을 포함하며; 전형적인 습윤제는 레시틴 및 폴리소르베이트 80을 포함하며; 전형적인 방부제는 메틸 파라벤 및 벤조산나트륨을 포함한다. 경구용 액체 조성물은 상기에 개시된 감미제, 착향제 및 착색제와 같은 하나 이상의 성분을 또한 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 선택적으로 다른 활성제를 함유할 수 있다. 활성제의 비제한적 예는 WO 99/15210호에 열거되어 있다.

본 화합물의 전신 전달의 달성에 유용한 다른 조성물은 설하 제형, 구강 제형, 좌제 제형, 비강 제형 및 폐 제형을 포함한다. 이러한 조성물은 일반적으로 하나 이상의 가용성 충전제 물질, 예를 들어 수크로스, 소르비톨 및 만니톨과; 결합제, 예를 들어 아라비아 고무, 미정질 셀룰로오스, 카복시메틸 셀룰로오스 및 하이드록시프로필 메틸 셀룰로오스를 함유한다. 상기에 개시된 글라이던트(glidant), 윤활제, 감미제, 착색제, 산화방지제 및 착향제도 함유될 수 있다.

또한 본 발명의 조성물은 대상에게 국소적으로, 예를 들어 대상의 표피 또는 상피 조직에 본 조성물을 직접 놓거나 바름으로써 투여하거나, "패치"를 통하여 경피적으로 투여할 수 있다. 적합한 패치 적용기의 예는 미국 특허 출원 제10/054113호에 기술되어 있다. 이러한 조성물은 예를 들어 로션, 크림, 용액, 겔 및 고체를 포함한다. 이러한 국소 조성물은 바람직하게는 안전한 유효량, 일반적 으로 약 0.1% 이상, 바람직하게는 약 1% 내지 약 5%의 펩티드를 함유한다. 국소 투여에 적합한 담체는 바람직하게는 연속성 필름으로 피부 상에서 적소에 잔존하며 땀 또는 물에의 침지에 의한 제거를 견디어낸다. 일반적으로 담체는 사실상 유기물이며 담체에 본 펩티드가 분산 또는 용해될 수 있다. 담체는 제약적으로 허용가능한 연화제, 유화제, 증점제, 용제 등을 포함할 수 있다.

투여 방법

본 발명은 또한 안전한 유효량의 펩티드를 인간 또는 기타 동물 대상에게 투여함으로써 인간 또는 기타 동물 대상에 있어서 CRF₂R에 의해 조절되는 장애를 치료하는 방법도 제공한다. 본 발명의 방법은 상기 장애의 예방 또는 치료에 유용하다.

본 발명의 조성물은 국소적으로 또는 전신적으로 투여될 수 있다. 전신 적용법은 화학식 I의 펩티드를 신체 조직 내로 도입하는 임의의 방법, 예를 들어 관절내(특히 류머티즘성 관절염의 치료에서), 경막내, 경막외, 근육내, 경피, 정맥내, 복강내, 피하, 비강, 폐, 설하, 직장, 및 경구 투여법을 포함한다.

투여할 펩티드의 구체적인 투여량과, 치료 기간과, 치료가 국소적인지 또는 전신적인지는 상호 의존적이다. 투여량 및 치료 요법은 사용되는 특정 펩티드, 치료 징후, 치료가 필요한 조직 부위에서 펩티드가 최소 억제 농도에 도달하는 능력, 대상의 개인적인 속성(예를 들어, 체중), 치료 요법에 대한 순응성, 및 임의의 치료 부작용의 존재 및 격심함과 같은 인자에 또한 의존적이다.

국소 투여법이 펩티드를 전신적으로 전달하거나 대상을 국부적으로 치료하는 데에 사용될 수 있다. 국소적으로 투여할 펩티드의 양은 피부 민감성, 치료할 조직의 유형 및 위치, 투여할 조성물 및 담체(존재하는 경우), 투여할 특정 펩티드와, 치료할 특정 장애 및 (국부적인 것과 구별되는) 전신 효과가 요망되는 정도와 같은 인자에 의존적이다.

본 발명의 펩티드는 표적화 리간드를 사용하여 치료가 필요한 특정 위치에 표적화할 수 있다. 예를 들어 근이영양증을 치료하기 위한 펩티드에 초점을 맞추면, 펩티드는 당 업계에서 일반적으로 이해되는 골격근 마커와의 면역반응성을 가지는 항체 또는 그의 단편에 콘쥬게이션된다. 표적화 리간드는 골격근 상에 존재하는 수용체에 적합한 리간드일 수도 있다. 의도되는 표적 조직에 있어서의 마커와 특이적으로 반응하는 임의의 표적화 리간드가 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물을 표적화 리간드에 커플링시키는 방법은 잘 알려져 있으며 담체에의 커플링을 위한 하기의 것과 유사하다.

화학식 I의 펩티드는 제어된 방출을 통하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 펩티드는 정맥내 주입, 이식성 삼투 펌프, 경피 패치, 리포좀, 생분해성 물질을 포함하는 피하 저장(depot) 주사, 또는 기타 투여 양식을 이용하여 투여될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 펌프가 사용될 수 있다(문헌[Langer et al., eds., Medical Applications of Controlled Release, CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974)]; 문헌[Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng., 14:201 (1987)]; 문헌[Buchwald et al., Surgery, 88:507 (1980)]; 문헌[Saudek et al., N. Engl. J. Med., 321:574 (1989)]). 다른 실시 형태에 있어서, 중합체 물질이 사용될 수 있다. 상기 문헌[Langer, 1974]; 상기 문헌[Sefton, 1987]; 문헌[Smolen et al., eds., Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Wiley, N.Y. (1984)]; 문헌[Ranger et al., J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem., 23:61 (1983)]; 또한 문헌[Levy et al., Science, 228:190 (1985)]; 문헌[During et al., Ann. Neurol., 25:351 (1989)]; 문헌[Howard et al., J. Neurosurg., 71:105 (1989)] 참조. 또 다른 실시 형태에 있어서, 방출이 제어된 시스템은 치료 표적에 근접하여 두어질 수 있어서, 전신 투여량의 일부분만이 요구된다. 예를 들어, 문헌[Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, pp. 115-138 (1984)] 참조. 또 다른 실시 형태에 있어서 중합체 기재의 약물 전달 시스템이 있는데 여기서 약물은 중합체 또는 지질 시스템으로부터 전달된다. 이러한 시스템은 하기의 세가지 일반 메커니즘에 의해 약물을 전달한다: (1) 이 시스템으로부터의, 또는 이 시스템을 통한 약물종의 확산; (2) 이 시스템의 분해, 또는 이 시스템으로부터의 약물의 절단으로 이어지는 화학 또는 효소 반응; 및 (3) 이 시스템의 팽창 또는 삼투를 통한 용제 활성화. 적합한 시스템은 하기의 해설 논문에 기술되어 있다: 문헌[Langer, Robert, Drug delivery and targeting, Nature: 392 (Supp):5-10 (1996)]; 문헌[Kumar, Majeti N. V., Nano and Microparticles as Controlled Drug Delivery Devices, J Pharm Pharmaceut Sci, 3(2):234-258 (2000)]; 문헌[Brannon-Peppas, Polymers in Controlled Drug Delivery, Medical Plastics and Biomaterials, (Nov. 1997)] 참조. 또한, 상기 문헌[Langer, 1990]; 문헌[Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989)]; 문헌[Langer, Science, 249:1527-1533 (1990)] 참조. 적합한 시스템은, 아트릭스 랩스(Atrix Labs)사제의 아트리겔(Atrigel(상표명)) 약물 전달 시스템; 스카이파마(SkyPharma)사제의 데포폼(DepoFoam(상표명)); 인핌드 써라퓨틱스, 인크.(Infimed Therapeutics, Inc.)사제의 폴리에틸렌 글리콜 기재의 하이드로겔; 마크로메드(MacroMed)사제의 리겔(ReGel(상표명)), 경구용 에스큐지겔(SQZGel(상표명) oral), 하이솔브(HySolv(상표명)) 및 리솔브(ReSolv(상표명)) 가용화 약물 전달 시스템; 프로겔즈' 프로덕츠(ProGelz Products)사제의 프로겔즈(ProGelz(상표명)); 및 알케르메스(Alkermes)사제의 주사가능한 프로레아제(ProLease(상표명))를 포함할 수 있다.

물론, 상기의 모든 것에 있어서, 본 발명의 펩티드는 단독으로 또는 혼합물로 투여될 수 있으며, 본 조성물은 징후에 적절한 부가적인 약물 또는 부형제를 더 함유할 수 있다.

유전자 요법

유전자 요법의 일부로서 발현 벡터를 사용하여 본 발명의 핵산을 세포 내로 도입할 수 있다. 이러한 벡터는 일반적으로 핵산 서열의 삽입을 제공하기 위한 프로모터 서열 근처에 위치하는 편리한 제한 효소 부위를 가진다. 전사 개시 부위, 표적 유전자 또는 그의 단편, 및 전사 종결 부위를 포함하는 전사 카세트가 제조될 수 있다. 전사 카세트는 다양한 벡터, 예를 들어, 플라스미드, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스 등에 도입될 수 있는데, 여기서 상기 벡터는 일반적으로 약 1일 이상의 기간 동안, 더욱 일반적으로는 적어도 약 수일 내지 수주의 기간 동안 일시적으로 또는 안정하게 세포에서 유지될 수 있다.

본 발명의 단백질 및 핵산은 바이러스 감염, 미세주입, 또는 소낭의 융합을 비롯한 임의의 다수의 경로에 의해 조직 또는 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 문헌[Furth et al., Anal. Biochem., 205:365-368 (1992)]에 기술되어 있는 바와 같이 제트(Jet) 주입법이 근육내 투여에 또한 사용될 수 있다. DNA는 상기 문헌에 기술되어 있는 바와 같이 금 미립자 상에 코팅되어 입자 충돌(bombardment) 장치 또는 "유전자 총"에 의해 피내 전달될 수 있다. 예를 들어 문헌[Tang et al., Nature 356:152-154 (1992)]을 참조하기 바라며, 여기서 금 마이크로프로젝타일(microprojectile)은 DNA로 코팅되며, 이어서 피부 세포 내로 충돌된다.

키트

본 발명은, (a) 단위 제형의 화학식 I의 펩티드; 및 (b) 사용 설명서를 포함하며 CRF₂R에 의해 조절되는 장애를 예방하거나 치료하기 위한 키트를 포함한다. 이러한 키트는 바람직하게는 다수의 단위 제형을 포함한다. 이러한 키트는 사용 의도 순서대로 배향된 제형을 가지는 카드를 포함할 수 있다. 이러한 키트의 예로는 "발포제 팩"이 있다. 발포제 팩은 포장 업계에서 잘 알려져 있으며 제약적 단위 제형의 포장에 광범위하게 사용된다. 필요할 경우, 기억 보조물은 예를 들어 숫자, 문자 또는 기타 표식(marking)의 형태로, 또는 제형이 투여될 수 있는 치료 스케줄에서 날짜를 나타내는 달력 인서트와 함께 제공될 수 있다. 키트의 예가 WO 01/45636호에 기술되어 있다. 치료 스케줄은 의약 업계의 숙련자의 범위 내에 있다. 비제한적 예는 일일, 매주, 2주마다, 매월 또는 2개월마다 1회를 포함한다.

실시예 1

사바긴 및 기타 비선택성 CRFR 작용제는 일반적으로 CRF₂R에 의해 조절되는 장애의 치료에는 효과적이지 않은데, 이는 상기 작용제가 CRF₁R도 활성화시킴으로써 바람직하지 못한 부작용을 일으키기 때문이다.

표 2는 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10 및 11로 각각 나타내어진 인간 유로코르틴 I(hUcnI), 인간 유로코르틴 II(hUroII), 인간 유로코르틴 III(hUroIII), 인간 코르티코트로핀 방출 인자(hCRF), 양 코르티코트로핀(oCRF), 및 사바긴(Svg)의 천연 서열 단편에 대한 상대적인CRF 결합력을 반영한다.

실시예 2

표 3a 내지 표 3j는 본 발명의 다양한 실시 형태의 상대적인 CRF 결합력을 반영한다.

실시예 3

생체내 효능 증가

본 발명의 펩티드에서는, 특히 낮은 투여량의 조건 하에서, 공지된 천연 서열, 예를 들어 UroII 펩티드 단편(서열 번호: 4)과 비교하여 생물학적 이용성이 확장되어 있다.

대상에 있어서의 펩티드의 반감기는, 예를 들어 본 펩티드의 투여 이후에 다양한 시간대에서 대상으로부터 수집한 혈청 시료의 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 측정할 수 있다. 당 업계의 숙련자라면 특정 펩티드의 물리화학적 특성에 기초하여 적절한 HPLC의 용출 완충제를 어떻게 선택하는지를 알 것이다.

효능을 측정하기 위한 생체내 연구의 비제한적 예가 본 명세서에 기술되어 있다. 정맥내(IV) (1000 ㎍/kg) 및 피하(SC) (1000 ㎍/kg) 경로로 화학식 I의 펩티드를 생쥐에 투여한다. 투여 후 다양한 시간 지점(IV = 0, 2, 10, 30 분 및 1, 2, 4 및 6 시간; 및 SC = 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 및 6 시간)에서 소듐 헤파린을 포함하는 마이크로원심분리 튜브 중 혈액 시료를 얻는다. 혈액 시료를 더 가공하여 혈장을 얻고 이를 분석할 때까지 -70℃에서 보관한다.

혈장 표준물을 제조한다. 50 ng/mL 내지 100 μg/mL의 농도 범위를 포함하는, 메탄올 중의 화학식 I의 펩티드의 스파이킹(spiking) 용액을, 이전에 제조한 1 mg/mL의 화학식 I의 펩티드의 메탄올 원액의 연속적인 희석에 의해 분석일에 제조한다. 이와 유사하게, 분석일에 내부 표준(ISTD)인 안정한 동위 원소 표지 h-Unc-II의 스파이킹 용액을 보관된 1 mg/mL ISTD 원액의 연속적인 희석으로 제조하여 최종 농도가 5 μg/mL이 되게 한다. 0.5 내지 100 ng의 질량 범위를 포함하는 실시용 혈장 표준물은, 10 μL의 적절한 화학식 I의 펩티드의 스파이킹 용액을 이미 10 μL의 5 μg/mL ISTD 용액, 100 μL의 dd-물 및 100 μL의 블랭크 쥐 혈장을 포함하는 튜브 내로 첨가함으로써 제조한다. 실시용 표준물을 이하에 기술하는 분석을 위하여 제조한다.

품질 제어(QC) 시료를 제어한다. QC 원액은 1 μg/mL의 화학식 I의 펩티드의 스파이킹 용액 25 μL를 블랭크인 플라스틱 바이알에 담긴 헤파린 처리 쥐 혈장 475 μL에 첨가함으로써 50 ng/mL의 수준으로 제조한다. 실시용 QC 시료는 100 μL의 QC 원액(50 ng/mL)을 이미 10 μL의 5 μg/mL ISTD 용액 및 100 μL의 dd-물을 포함하는 튜브 내에 첨가함으로써 제조한다. 실시용 QC 시료를 이하에 기술하는 분석을 위하여 제조하였다.

연구용 시료를 제조한다. 분석일에 이 시료를 실온에서 해동시키고 분취량의 시료를 이미 10 μL의 5 μg/mL ISTD 용액, 100 μL의 dd-물 및 분취량의 블랭크, 헤파린 처리 쥐 혈장을 포함하는 튜브에 첨가하였다. 시료 및 블랭크 쥐 혈장의 부피는 총 혈장 부피가 100 μL이 되게 하는 것이다.

분석에 있어서 실시용 표준물, 실시용 QC 시료 및 연구용 시료를 이들 각각을 포함하는 튜브에 400 μL의 아세토니트릴을 첨가함으로써 제조하고, 뚜껑을 덮고, 와동시키고, 원심분리하고 상청액을 단리한다. 분취량(300 μL)의 상청액을 N₂ 하에 건조시키고 50 μL의 메탄올/물(50/50)에서 재구성한다.

제조한 실시용 표준물, 실시용 QC 시료 및 연구용 시료를 구배 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 분리로 분석하고 이어서 양이온 모드에서 선택된 반 응 모니터링(selected reaction monitoring, SRM)을 이용하여 질량 분광기(mass spectroscopy)/질량 분광기(MS/MS) 검출로 전자 분무 이온화(electron spray ionization, ESI)를 통해 시료를 도입한다. SRM 채널을 h-Unc-II 및 ISTD에 대하여 모니터링한다.

약물동력학 연구로부터의 투여 용액을 메탄올로 희석시키고 자외선 검출로 RP-HPLC에 의해 분석한다. 투여 용액 중 화학식 I의 펩티드의 농도는 공지된 표준물로부터 작성된 선형 회귀 곡선으로부터의 내삽으로 계산한다.

본 발명의 특정 실시예들이 예시되고 기술되었지만, 당해 기술 분야의 숙련자에게는 본 발명의 사상 및 범주로부터 벗어남이 없이 각종 수정 및 변경이 이루어질 수 있음이 자명할 것이다. 따라서, 본 발명의 범주 내에 속하는 그러한 모든 변경 및 수정을 첨부된 청구의 범위에 포함시키고자 한다.

서열목록 전자파일 첨부

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하기 식에 따른 서열을 포함하는 비천연 펩티드:

IVLSLDVPIGLLQILLEQX₂₂KX₂₄X₂₅X₂₆X₂₇X₂₈X₂₉QATTNARILARV

여기서,

(a) X₂₂는 D 및 E 로 이루어진 군으로부터 선택되며;

(b) X₂₄는 A 및 Q 로 이루어진 군으로부터 선택되고;

(c) X₂₅는 R, E 및 K 로 이루어진 군으로부터 선택되며;

(d) X₂₆은 A, K 및 N 으로 이루어진 군으로부터 선택되고;

(e) X₂₇은 A, E 및 L 로 이루어진 군으로부터 선택되며;

(f) X₂₈은 R 및 K 로 이루어진 군으로부터 선택되고;

(g) X₂₉는 E 및 Q 로 이루어진 군으로부터 선택됨.
제 53 항에서, X₂₂가 D 인 펩티드.
제 53 항에서, X₂₄가 A 인 펩티드.
제 53 항에서, X₂₅가 R 인 펩티드.
제 53 항에서, X₂₅가 E 인 펩티드.
제 53 항에서, X₂₆이 A 인 펩티드.
제 53 항에서, X₂₆이 K 인 펩티드.
제 53 항에서, X₂₇이 A 인 펩티드.
제 53 항에서, X₂₇이 E 인 펩티드.
제 53 항에서, X₂₈이 R 인 펩티드.
제 53 항에서, X₂₉가 E 인 펩티드.
서열 번호 : 121 의 아미노산 서열을 갖는 펩티드.
하기를 함유하는, 골격근 위축 또는 근이영양증을 예방 또는 치료하기 위한 제약 조성물:

(a) 안전 유효량의 제 53 항 내지 제 64 항 중 어느 한 항의 펩티드; 및

(b) 제약적으로 허용가능한 담체.
하기를 함유하는, 골격근 위축 또는 근이영양증을 예방 또는 치료하기 위한 제약 조성물:

(a) 안전 유효량의 제 64 항의 펩티드; 및

(b) 제약적으로 허용가능한 담체.
안전 유효량의 제 53 항 내지 제 64 항 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 포함시킴으로써, 코르티코트로핀 방출 인자 2 수용체 (CRF₂R)의 조절이 요구되는 숙주에서의 골격근 위축 또는 근이영양증을 예방 또는 치료하기 위한 약제를 제조하는 방법.
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제 53 항 내지 제 64 항 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 코딩하는 단리된 핵산.
제 53 항 내지 제 64 항 중 어느 한 항에 따른 펩티드에 특이적인 단리된 항체.
골격근 위축 또는 근이영양증의 치료가 요구되는 동물에서, 사용 설명서와 함께, 골격근 위축 또는 근이영양증을 예방 또는 치료하기 위한, 제 53 항 내지 제 64 항 중 어느 한 항에 따른 펩티드의 사용 방법.