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TECHNISCHER
BEREICH
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Diese
Erfindung bezieht sich auf die Verwendung neuartiger Peptide und
Nucleinsäuren,
die dieselben kodieren, um CRF2R-modulierte
Störungen
zu behandeln.
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HINTERGRUND
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CRFR und Liganden
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Es
gibt mindestens zwei Rezeptoren von Corticotropin Releasing Factor
(CRF), die bisher identifiziert wurden (CRF1R
und CRF2R), die zu der Klasse der G-Protein-gekoppelten
Rezeptoren (GPCR) gehören.
Agonistenaktivierung von CRF1R oder CRF2R führt
zu Gαs-Aktivierung
von Adenylatcyclase. Adenylatcyclase katalysiert die Bildung von
cAMP, was wiederum zahlreiche Auswirkungen hat, einschließlich der
Aktivierung von Proteinkinase A, intrazellulärer Calciumfreisetzung und
Aktivierung von Mitogen-aktivierter Proteinkinase (MAP-Kinase).
In anderen Studien weist die Verstärkung der intrazellulären Inositoltriphosphatsynthese,
nach Agonistenaktivierung der CRF-Rezeptoren, darauf hin, dass CRFRs
sich auch mit Gαq verbinden.
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CRF1R und CRF2R wurden
von Menschen, Ratte, Maus, Huhn, Kuh, Wels, Frosch und Schaf geklont. CRF1R und CRF2R haben
jeweils ein einzigartiges Verteilungsmuster. In Menschen wurden
drei Isoformen, Alpha, Beta und Gamma, des CRF2R-Rezeptors
geklont. Homologe für
Alpha- und Beta-CRF2R wurden in Ratten identifiziert.
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Mehrere
Liganden/Agonisten der CRFRs sind bekannt und schließen Corticotropin
Releasing Factor (oder Hormon, CRF, CRH), Urocortin I, Urocortin
II (oder Stresscopin-verwandtes Peptid), Urocortin III (oder Stresscopin),
Urotensin I, Sauvagin und andere verbundene Peptide ein. Corticotropin
Releasing Factor bindet sich an und aktiviert CRF1R
und CRF2R. CRF ist ein wichtiger Modulator der
Körperreaktionen
auf Stress. Dieses 41-Aminosäurenpeptid
kontrolliert eine Vielzahl von neuronalen, Endokrin- und Immunprozessen
als der primäre
Regulator der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Hormonachse (HPA-Achse). Zusätzlich besteht
bedeutende Sequenzhomalogie zwischen allen bekannten Liganden von
CRFR. Ferner wurden zwei CRF2R-selektive
Liganden identifiziert, Urocortin II (oder Stresscopin-verwandtes
Peptid) und Urocortin III (Stresscopin). Diese Peptiden wurden von
mehreren Säugetier-
und Fischspezies identifiziert. Beispielsweise offenbaren Mso et
al., in Nature Medicine, VSI. 7, Nr. 5, Mai 2001 S. 605–611, menschliches
Stresscopin, Analoge davon vom Kugelfisch und Meirselektivität für CRF2R.
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Die
CRF-Rezeptoren können
pharmakologisch von Nicht-CRFRs durch die Verwendung Rezeptor-selektiver
Agonisten und Antagonisten unterschieden werden. Diese selektiven
Agonisten und Antagonisten, zusammen mit den CRFR-Knockout-Mäusen, waren
nützlich
bei der Bestimmung, welcher CRF-Rezeptor eine bestimmte biologische
Reaktion vermittelt.
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Die
Rolle von CRF1R ist relativ gut erwiesen.
Mäuse,
bei denen das CRF1R-Gen entfernt wurde (CRF1R-Knockout), zeigen eine beeinträchtigte
Stressreaktion und vermindertes angstähnliches Verhalten. CRF1R ist ein wichtiger Mediator der HPA-Achse.
Besonders CRF, das vom Hypothalamus freigesetzt wird und über das
Hypothalamus-Hypophysen-Portalsystem zur vorderen Hypophyse transportiert
wird, interagiert mit dem CRF1R, das auf
Zellen vorliegt, die sich in der vorderen Hypophyse befinden. Agonistenaktivierung
des CRF1R führt zu der Freisetzung von
ACTH von den Zellen der vorderen Hypophyse in die systemische Zirkulation.
Das freigesetzte ACTH bindet den ACTH-Rezeptor, der sich auf Zellen
im Nebennierenkortex befindet, was zu der Freisetzung von Nebennierenhormonen
einschließlich
Corticosteroiden führt.
Corticosteroide vermitteln zahlreiche Wirkungen, einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf, Immunsystemunterdrückung über einen
Mechanismus, der Thymus- und Milzatrophie zur Folge hat. Daher resultiert
die Aktivierung von CRF1R indirekt in der
Herunterregulierung des Immunsystems über Aktivierung der HPA-Achse.
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Die
Rolle von CRF2R ist weniger klar erwiesen.
Mäuse,
bei denen das CRF2R-Gen entfernt wurde (CRF2R-Knockout), zeigen eine beeinträchtigte
oder verminderte Nahrungsaufnahme nach Stimulierung mit Urocortin,
mangelnde Vasodilatation, aber eine normale Stressreaktion. Experimente
mit CRF2R haben gezeigt, dass CRF2R für
die hypotensiven/Gefäß erweiternden
Wirkungen der CRFR-Agonisten und für die beobachtete Verminderung
bei der Nahrungsaufnahme nach Behandlung von Mäusen mit CRFR-Agonisten verantwortlich
ist.
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Skelettmuskelatrophie
und -hypertrophie
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Zusätzlich ist
CRF2R an der Modulation von Skelettmuskelatrophie
und die Induktion von Hypertrophie beteiligt. Skelettmuskel ist
ein formbares Gewebe, das sich leicht an Änderungen in physiologischen
Anforderungen für
die Arbeit oder den Stoffwechselbedarf anpasst. Hypertrophie bezieht
sich auf eine Erhöhung
der Skelettmuskelmasse, während
Skelettmuskelatrophie sich auf eine Verringerung der Skelettmuskelmasse
bezieht. Akute Skelettmuskelatrophie ist zu einer Vielzahl von Ursachen
zurückverfolgbar,
einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf: Nichtgebrauch aufgrund eines chirurgischen Eingriffs, Bettruhe
oder gebrochener Knochen; Denervierung/Nervenschaden aufgrund von
Rückenmarksverletzung,
Autoimmunkrankheit oder Infektionskrankheit; Glucocorticoidverwendung
für nicht
verwandte Zustände;
Sepsis aufgrund von Infektion oder anderer Ursachen; Nährstoffbeschränkung aufgrund
von Krankheit oder Mangelernährung
und Raumfahrt. Skelettmuskelatrophie tritt durch normale biologische
Prozesse auf, in bestimmten medizinischen Situationen führt dieser
normale biologische Prozess jedoch zu einem schwächenden Grad der Skelettmuskelatrophie.
Akute Skelettmuskelatrophie stellt beispielsweise eine bedeutende
Begrenzung bei der Rehabilitation von Patienten von Immobilisierungen
dar, einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf diejenigen, die eine orthopädische
Prozedur begleiten. In solchen Fällen
ist die Rehabilitationsperiode, die erforderlich ist, um die Skelettmuskelatrophie rückgän gig zu
machen, oft wesentlich länger
als die Zeitperiode, die erforderlich ist, um die ursprüngliche
Verletzung zu heilen. Solche akute Atrophie durch Nichtgebrauch
ist ein besonderes Problem bei alten Menschen, die bereits unter
bedeutenden altersverbundenen Defiziten bei der Muskelfunktion und
-masse leiden, da solche Atrophie zu permanenter Behinderung und
vorzeitigem Tod führen
kann.
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Skelettmuskelatrophie
kann auch durch chronische Bedingungen hervorgerufen sein, wie Krebskachexie,
chronische Entzündung,
AIDS-Kachexie, chronisch-obstruktive Lungenerkrankung (COPD), kongestive Herzinsuffizienz,
genetische Störungen,
z. B. Muskeldystrophien, neurodegenerative Krankheiten und Sarcopenie
(altersbedingter Muskelschwund). In diesen chronischen Bedingungen
kann Skelettmuskelatrophie zu einem vorzeitigen Verlust der Mobilität führen und
dadurch zu der krankheitsbedingten Morbidität beitragen.
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Wenig
ist hinsichtlich der molekularen Prozesse bekannt, die Atrophie
oder Hypertrophie von Skelettmuskel steuern. Während der initiierende Auslöser der
Skelettmuskelatrophie für
die verschiedenen Atrophie einleitenden Ereignisse unterschiedlich
ist, treten mehrere gemeinsame biochemische Veränderungen in der betroffenen
Skelettmuskelfaser auf, einschließlich einer Verminderung bei
der Proteinsynthese und eine Erhöhung
in der Proteindegradation und Änderungen
sowohl in der kontraktilen als auch der metabolischen Enzymprotein-Isozymeigenschaften
eines langsam (hoch oxidativer Stoffwechsel/langsame kontraktile
Proteinisoformen) zu schnell (hoch glycolytischer Stoffwechsel/schnell
kontraktile Proteinisoformen) Faserschalters. Zusätzliche
Veränderungen
im Skelettmuskel, die auftreten, schließen den Verlust der Vaskulatur
und Umformung der extrazellulären
Matrix ein. Sowohl der schnelle als auch der langsame Schaltmuskel
zeigen Atrophie unter den entsprechenden Bedingungen, wobei der
relative Muskelschwund von den spezifischen Atrophiestimuli oder
der spezifischen Atrophiebedingung abhängt. Alle diese Änderungen
sind wesentlicherweise koordiniert reguliert und werden je nach Änderungen
im physiologischen und metabolischen Bedarf ein- oder ausgeschaltet.
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Die
Prozesse, durch die Atrophie und Hypertrophie auftreten, sind über die
Säugetierspezies
hinweg beibehalten. Mehrere Studien haben gezeigt, dass dieselben
grundlegenden molekularen, zellulären und physiologischen Prozesse
während
Atrophie sowohl in Nagetieren als auch in Menschen auftreten. Daher
wurden Nagetiermodelle der Skelettmuskelatrophie erfolgreich eingesetzt,
um menschliche Atrophiereaktionen zu verstehen und vorauszusagen.
Beispielsweise führt
Atrophie, die durch eine Vielzahl von Methoden in Nagetieren und
Menschen eingeleitet wurde, zu ähnlichen
Veränderungen
bei der Muskelanatomie, dem Querschnittsbereich, der Funktion, dem
Faserschalten, der kontraktilen Proteinexpression und der Histologie.
Zudem wurde gezeigt, dass mehrere Mittel Skelettmuskelatrophie in
Nagetieren und Menschen regulieren. Diese Mittel schließen anabole
Steroide, Wachstumshormone, insulinähnlicher Wachstumsfaktor I,
beta-adrenerge Agonisten und CRF2R-Agonisten
ein. Zusammen zeigen diese Daten, dass Skelettmuskelatrophie sowohl
in Nagetieren als auch in Menschen durch gemeinsame Mechanismen
hervorgerufen wird.
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Während gezeigt
wurde, dass einige Mittel Skelettmuskelatrophie regulieren, und
sie für
diese Indikation zum Gebrauch bei Menschen freigegeben sind, haben
diese Mittel ungewünschte
Nebeneffekte wie Hypertrophie des Herzmuskels, Neoplasie, Hirsutismus,
Andregonisierung von Frauen, erhöhte
Morbidität
und Sterberate, Leberschaden, Hypoglykämie, Muskelskelettschmerz,
erhöhte
Gewebeschwellung, Tachycardie und Ödeme. Derzeit gibt es keine
hoch wirksamen und selektiven Behandlungen für akute oder chronische Skelettmuskelatrophie.
Daher besteht ein fortgesetzter Bedarf, andere therapeutische Mittel
zu identifizieren, die Skelettmuskelatrophie behandeln.
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Muskeldystrophien
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Muskeldystrophien
umfassen eine Gruppe vererbter, progressiver Muskelstörungen,
die klinisch durch die selektive Verteilung von Skelettmuskelschwäche unterschieden
werden. Die beiden üblichsten
Formen der Muskeldystrophie sind Duchenne- und Becker-Dystrophien,
die jeweils die Folge der Vererbung einer Mutation im Dystrophingen
sind, das sich am Genort Xp21 befindet. Andere Distrophien schließen ein,
sind aber nicht beschränkt
auf, Gliedergürtelmuskeldystrophie,
die die Folge von Mutation mehrerer Genorte ist, einschließlich den
Genorten p94 Calpain, Adhalin, γ-Sarcoglycan
und β-Sarcoglycan; fascioscapulohumerale
(Landouzy-Dejerine) Muskeldystrophie, myotonische Dystrophie und
Emery-Dreifuss-Muskeldystrophie. Die Symptome der Duchenne-Muskeldystrophie,
die fast ausschließlich
bei Männern
auftritt, schließen
Watschelgang, Zehengang, Lordose, häufiges Fallen und Schwierigkeiten
beim Aufstehen und Treppengehen ein. Symptome beginnen im Alter
von etwa 3–7
Jahren, wobei die meisten Patienten mit 10–12 Jahren an den Rollstuhl
gebunden sind und viele im Alter von etwa 20 Jahren aufgrund von
Atemkomplikationen sterben. Derzeitige Behandlung für Duchenne-Muskeldystrophie
schließt
die Verabreichung von Prednison (einer Corticosteroid-Arznei) ein, die,
während
sie nicht heilend ist, den Niedergang der Muskelstärke verlangsamt
und Behinderung verzögert. Es
wird angenommen, dass Corticosteroide, wie Prednisone, durch Blockieren
der Immunzellenaktivierung und -infiltration agieren, was durch
Muskelfaserschaden durch die Krankheit ausgelöst wird. Leider führt die Corticosteroidbehandlung
auch zu Skelettmuskelatrophie, was einen Teil des potenziellen Nutzens
der Blockierung der Immunreaktion bei diesen Patienten aufhebt.
Daher besteht ein fortgesetzter Bedarf, therapeutische Mittel zu
identifizieren, die den Muskelfaserschaden verlangsamen und das
Einsetzen von Behinderung bei Patienten mit Muskeldystrophien verzögern, aber
ein geringeres Maß von
Skelettmuskelatrophie verursachen als derzeitige Therapien.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung bietet isolierte Peptide nach Anspruch 1,
die CRF2R-Agonisten sind. Spezifisch bietet
die Erfindung ein isoliertes Peptid, nach Anspruch 1, oder Nucleinsäure, die
selbige codiert, die CRF, Urocortin I, Urocortin II, Urocortin III,
Sauvagin, Urotensin I oder verwandte Peptidderivate sind. Die Erfindung
bietet auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine sichere
und wirksame Menge eines isolierten Peptids der vorliegenden Erfindung
und einen pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoff umfasst. Die Erfindung
bietet ferner einen Set, der ein isoliertes Peptid in Einheitsdosisform
und Gebrauchsanweisungen umfasst.
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Die
Verabreichung eines Peptids oder einer Nucleinsäure, die selbiges codiert,
einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder eines Sets der vorliegenden
Erfindung an eine Person, die dieser bedarf, ist wirksam für die Behandlung
von CRF2R-modulierten Störungen wie Skelettmuskelatrophie
oder -schwund. Die Erfindung bietet außerdem einen Antikörper, der
spezifisch für
die Peptide der vorliegenden Erfindung ist. Schließlich bietet
die Erfindung den Gebrauch eines Peptids der vorliegenden Erfindung
oder einer Nucleinsäure,
die selbiges codiert, in der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung
einer CRF2R-modulierten Störung bei einer Person, die
dieser bedarf.
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SEQUENZLISTENBESCHREIBUNG:
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Tabelle
1 beschreibt verschiedene Proteine und Proteinfragmentsequenzen,
die sich an CRF-Rezeptoren binden. Diese ausgewählten Sequenzen sind mit der/den
zugehörigen
Genbank- oder Derwent-Annahmezahl(en) und den Tierspezies, von denen
sie berichtet werden, sowie Annahmezahlen für verwandte Nucleotid-Sequenzen
enthalten, die identische oder fast identische Aminosäure-Sequenzen codieren.
Diese bekannten und neuartigen Sequenzen der Erfindung werden ferner
in der Sequenzliste aufgeführt.
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BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Glossar der Begriffe
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Das
Folgende ist eine Liste der Definitionen für hier verwendete Begriffe:
„Agonist" bedeutet eine beliebige
Verbindung, einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf, Antikörper,
die einen Rezeptor aktivieren. CRFR-Agonisten schließen beispielsweise
ein, sind aber nicht beschränkt
auf CRF, Urocortin, Urocortin II, Urocortin III, Urotensin I, Sauvagin
und verwandte Analoge.
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„Antikörper", in seinen verschiedenen
grammatikalischen Formen, bedeutet Immunoglobulin-Moleküle und immunologisch
wirksame Teile der Immunoglobulin-Moleküle, d. h. Moleküle, die
einen Antigen bindenden Ort enthalten, der spezifisch ein Antigen
bindet. Wie hier verwendet, bezeichnet „isolierter Antikörper" einen Antikörper, der
teilweise oder vollständig
von den Proteinen und natürlich
vorkommenden organischen Molekülen
getrennt wurde, mit denen er natürlicherweise
verbunden ist.
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„Bindungsaffinität" bedeutet die Neigung
eines Liganden, mit einem Rezeptor zu interagieren, und steht in
umgekehrtem Verhältnis
zu der Dissoziationskonstante für
eine spezifische CRF-Ligand-CRFR-Interaktion. Die Dissoziationskonstante
kann direkt über
standardmäßige Sättigung,
Konkurrenz oder kinetische Bindungstechniken oder indirekt über pharmakologische
Techniken gemessen werden, die funktionale Proben und Endpunkte
betreffen.
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„Heterozygoter
Antikörper" bezeichnet einen
Antikörper,
der strukturelle Elemente von zwei oder mehr verschiedenen Antikörpermolekülen enthält, z. B.
von verschiedenen Tierspezies. Heterozygote Antikörper schließen ein,
sind aber nicht beschränkt
auf, Antikörper,
die als „humanisierte
Antikörper" bekannt sind, die einschließen, aber
nicht beschränkt
sind auf, heterozygote Antikörper,
die durch die Technik erzeugt werden, die als Pfropfen der hypervariablen
Region bekannt ist.
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„CRF" bedeutet Corticotropin
Releasing Factor, was dasselbe wie Corticotropin Releasing Hormone (CRH)
ist. Beispielhafte CRF-Peptide schließen Ratten-/Menschen-CRF und
Schafs-CRF (siehe U.S.-Pat. Nr. 4,415,558) und dergleichen ein.
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„CRF-Analog" bezeichnet Substanzen,
die als Liganden von CRFRs fungieren. Geeignete CRF-Analoge können von
einer Vielzahl von Wirbeltierspezies erlangt werden und schließen ein,
sind aber nicht beschränkt
auf, Substanzen wie Sauvagin (siehe, z. B., U.S.-Pat. Nr. 4,605,642),
Urotensin (siehe, z. B., U.S.-Pat. Nr. 4,908,352 und 4,533,654),
Mausurocortin II, menschliches Urocortinverwandtes Peptid (Reyes, T.M.
et al., Proc. Nat'l
Acad Sci 98:2843–2848
(2001)), Urocortin (siehe, z. B., WO 97/00063), menschliches Urocortin
II (Stresscopin-verwandtes Peptid), menschliches Urocortin III (Stresscopin),
Kugelfisch-URP 1, Kugelfisch-URP II, Urotensin I und die CRF-Analoge,
beschrieben in U.S.-Pat. Nr.: 4,415,558; 4,489,163; 4,594,329; 4,605,642;
5,109,111; 5,235,036; 5,278,146; 5,439,885; 5,493,006; 5663292;
5,824,771; 5,844,074 und 5,869,450. Spezifische CRF-Analoge schließen hUcnI
(menschliches Urocortin I, AF038633 (GB)); hUroII (menschliches
Urocortin II oder Stresscopin-verwandtes Peptid) (AF320560); hUroIII
(menschliches Urocortin III oder Stresscopin, AF361943); hCRF (menschlicher
Corticotropin Releasing Factor)(V00571(GB)); oCRF (Corticotropin
Releasing Factor vom Schaf E00212 (GB)); Svg (Sauvagin, P01144 (SP))
ein.
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„CRFR-Agonist" bezeichnet eine
Verbindung oder ein Molekül,
die bzw. das die Fähigkeit
hat, CRF1R, CRF2R
oder beide zu aktivieren.
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„CRFR" bedeutet CRF1R oder CRF2R. Der
Ausdruck „CRFR" schließt auch
gestutzte und/oder mutierte Proteine ein, wobei Regionen des Rezeptormoleküls, die
nicht zur Bindung des Liganden oder zum Signalisieren benötigt werden,
gelöscht
oder modifiziert wurden.
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„CRF1R" bezeichnet
beliebige Isoformen von CRF1R von einer
beliebigen Tierspezies. Der CRF1R wurde
zuvor als CRF-RA, PC-CRF, CRF, (Perrin, M.H., et al. Endocrinology
133:3058–3061
(1993), Chen, R., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8967–8971 (1993),
Chang, C-P. et al., Neuron 11:1187–1195 (1993), Kishimoto, T.,
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:1108–1112 (1995) und Vita, N. et
al., FEBS Lett. 335: 1–5 (1993))
oder der CRH-Rezeptor bezeichnet.
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Die
Definition von CRF1R schließt ein,
ist aber nicht beschränkt
auf, die Rezeptoren, für
die die cDNA- oder Genomsequenz, die den Rezeptor codiert, in einer
Sequenzdatenbank hinterlegt ist. Diese Sequenzen schließen die
folgenden An nahmezahlen ein: X72304, E11431, L23332, I92584, T37068,
T28968, Q81952, L23333, NM_004382, AF180301, T28970, L25438, L24096,
I92586, Q81954, AH006791, NM_007762, X72305, AF054582, Y14036, AF229359,
AF229361, AB055434 und L41563. Die Nucleotid- und Proteinsequenzen
dieser Rezeptoren sind von GenBank oder Derwent erhältlich.
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„CRF2R" bezeichnet
eine beliebige Isoform von CRF2R von einer
beliebigen Tierspezies. CRF2R wurde auch
als HM-CRF, CRF-RB, (Kishimoto, T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 92:1108–1112
(1995) und Perrin, M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:2969–2973 (1995))
bezeichnet.
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Die
Definition des CRF2R-Rezeptors schließt ein,
ist aber nicht beschränkt
auf, die Rezeptoren, für
die die DNA-Sequenz, die den Rezeptor codiert, in einer Sequenzdatenbank
hinterlegt ist. Diese Sequenzen schließen die folgenden Annahmezahlen
ein: U34587, E12752, NM_001883, T12247, T66508, AF011406, AF019381,
U16253, T12244, T28972, U17858, NM_009953, Y14037 und AF229360.
Die Nucleotid- und Proteinsequenzen dieser Rezeptoren sind von GenBank
oder Derwent erhältlich.
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„Hemmen" bedeutet teilweises
oder vollständiges
Blockieren eines bestimmten Vorgangs oder einer bestimmten Aktivität. Eine
Verbindung hemmt beispielsweise Skelettmuskelatrophie, wenn sie
Muskelatrophie vollständig
oder teilweise verhindert.
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„Isoliertes
Peptid" bedeutet,
dass ein Peptidmolekül
als „isoliert" bezeichnet wird,
wenn physikalische, mechanische oder chemische Methoden angewendet
werden, um das Peptid von zellulären
Bestandteilen zu entfernen, die normalerweise mit dem Protein verbunden
sind. Eine Person mit einschlägiger
fachlicher Ausbildung kann einfach standardmäßige Reinigungsmethoden einsetzen,
um ein isoliertes Peptid zu erhalten.
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„Isolierte
Nucleinsäure" bedeutet, dass ein
Nucleinsäuremolekül im Wesentlichen
von kontaminierenden Nucleinsäuremolekülen getrennt
ist, die andere Polypeptide codieren. Reinigungs- und Sequenzidentifikationstechniken
entsprechen dem Stand der Technik.
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Wie
hier verwendet, werden zwei DNA-Sequenzen als „funktionsmäßig assoziiert" bezeichnet, wenn die
Eigenschaft der Verbindung zwischen den beiden DNA-Sequenzen nicht
(1) zu der Einführung
einer Rasterverschiebungsmutation führt, (2) die Fähigkeit
einer Promoterregion stört,
die Transkription der Kodierungssequenzen zu steuern, oder (3) die
Fähigkeit
des entsprechenden RNA-Transkripts
stört,
in ein Protein translatiert zu werden. Eine Kodierungssequenz und
Regulierungssequenzen sind funktionsmäßig assoziiert, wenn sie kovalent
auf eine solche Weise verbunden sind, dass sie die Transkription
der Kodierungssequenz unter den Einfluss oder die Kontrolle der
Regulierungssequenzen stellen. Eine Promotorregion ist daher funktionsmäßig mit
einer Kodierungssequenz assoziiert, wenn die Promotorregion in der
Lage ist, Transkription dieser DNA-Sequenz so zu bewirken, dass
das resultierende Transkript in das gewünschte Peptid translatiert
werden kann.
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„Selektiver
Agonist" bedeutet,
dass der Agonist im Allgemeinen eine größere, vorzugsweise bedeutend
größere, Aktivität gegenüber einem
bestimmten Rezeptoren) im Vergleich mit anderen Rezeptoren hat, nicht,
dass er vollständig
inaktiv hinsichtlich anderer Rezeptoren ist.
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„Sequenzidentität" oder „Homologie" auf dem Niveau der
Aminosäure-
oder Nucleotid-Sequenz wird durch BLAST-Analyse (Basic Local Alignment
Search Tool) bestimmt, wobei der Algorithmus verwendet wird, der
von den Programmen blastp, blastn, blastx, tblastn und tblastx eingesetzt
wird (Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389–3402 und
Karlin et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2264–2268),
die für
die Suche von Sequenzähnlichkeiten
ausgelegt sind. Die vom BLAST-Programm verwendete Herangehensweise ist,
zunächst ähnliche
Segmente, mit Unterbrechungen (nicht unmittelbar benachbart) und
ohne Unterbrechungen (unmittelbar benachbart), zwischen einer Abfragesequenz
und einer Datenbanksequenz zu betrachten, dann die statistische
Signifi kanz aller Übereinstimmungen
zu bewerten, die identifiziert wurden, und schließlich nur
die Übereinstimmungen
zusammenzufassen, die einen zuvor ausgewählten Grenzwert der Signifikanz
erfüllen.
Für eine
Diskussion von grundlegenden Fragen bei der Ähnlichkeitssuche von Sequenzdatenbanken siehe
Altschul et al. (1994) Nature Genetics 6, 119–129. Die Suchparameter für Histogramm,
Beschreibungen, Ausrichtungen, Erwartung (d. h. der statistische
Signifikanzgrenzwert für
die Meldung von Übereinstimmungen gegenüber Datenbanksequenzen),
Obergrenze, Matrix und Filter (niedrige Komplexität) sind
die standardmäßigen Einstellungen.
Die standardmäßige Bewertungsmatrix,
die von blastp, blastx, tblastn und tblastx verwendet wird, ist
die BLOSUM62-Matrix
(Henikoff et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915–10919),
empfohlen für
Abfragesequenzen mit einer Länge über 85 Nucleotiden
oder Aminosäuren.
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Für blastn
ist die Bewertungsmatrix durch die Verhältnisse von M (d. h. die Belohnungspunktzahl
für ein
Paar übereinstimmender
Reste) zu N (d. h. die Strafpunktzahl für nicht übereinstimmende Reste) festgelegt,
wobei die Standardwerte für
M und N +5 bzw. –4
sind. Vier blastn-Parameter wurden wie folgt angepasst: Q = 10 (GAP
Creation Penalty); R = 10 (GAP Extension Penalty); wink = 1 (erzeugt
Worttreffer in jeder wink-Position in der Abfrage) und gapw = 16
(stellt die Fensterbreite ein, in der Ausrichtungen mit Unterbrechungen erzeugt
werden). Die gleichwertigen Blastp-Parametereinstellungen waren
Q = 9; R = 2; wink = 1 und gapw = 32. Ein Bestfit-Vergleich zwischen
Sequenzen, verfügbar
im GCG-Paket Version 10.0, verwendet DNA-Parameter GAP = 50 (GAP
Creation Penalty) und LEN = 3 (GAP Extension Penalty) und die gleichwertigen
Einstellungen in Proteinvergleichen sind GAP = 8 und LEN = 2.
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„Skelettmuskelhypertrophie" bezeichnet eine
Zunahme der Skelettmuskelmasse oder Skelettmuskelfunktion oder beidem.
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„Skelettmuskelatrophie" bezeichnet dasselbe
wie „Muskelschwund" und bedeutet eine
Verminderung der Skelettmuskelmasse oder Skelettmuskelfunktion oder
beidem.
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Beim
Beschreiben einer Proteinstruktur und -funktion wird auf Aminosäuren verwiesen,
die das Protein umfassen. Auf die Aminosäuren kann auch mit ihren herkömmlichen
Abkürzungen
verwiesen werden, wie gezeigt: A = Ala = Alanin; T = Thr = Threonin;
V = Val = Valin; C = Cys = Cystein; L = Leu = Leucin; Y = Tyr = Tyrosin;
I = Ile = Isoleucin; N = Asn = Asparagin; P = Pro = Prolin; Q =
Gln Glutamin; F = Phe = Phenylalanin; D = Asp = Asparaginsäure; W =
Trp = Tryptophan; E = Glu = Glutaminsäure; M = Met = Methionin; K
= Lys = Lysin; G = Gly = Glycin; R = Arg = Arginin; S = Ser = Serin;
H = His = Histidin. Der Buchstabe Z = Glx = Pyrrolidoncarbonsäure, wird
verwendet, um Glutaminsäure
oder Glutamin mit N-Endstelle anzuzeigen, die bzw. das ein internes
cyclisches Lactam gebildet hat. Dies wurde in der Sequenzliste unter
dem Merkmal „MODIFIED_RES" beschrieben, wo
angemessen. Der Buchstabe B wird in der Spezifikation verwendet,
um Naphthylalanin anzuzeigen, eine Modifikation von Alanin in bestimmten
Peptiden, und wurde in der Sequenzliste unter „sonstiges Merkmal" in der Sequenzliste
in der Peptid-Sequenz angezeigt, wo es auftritt. Die Abkürzung „Ac" wurde benutzt, um
eine modifizierte acetylierte NH2-Endstelle
in der Spezifikation anzuzeigen, und wurde unter dem Merkmal „MODIFIED_RES" beschrieben, wo
angemessen. Die Peptide der Erfindung sind auch modifiziert, um
eine Amidgruppe an der Carboxy-Endstelle zu haben. Dies wird in
der Sequenzliste unter dem Merkmal „MODIFIED_RES" angezeigt. Um eine
Löschung
oder eine Abwesenheit einer Aminosäure im Zusammenhang des natürlichen
Homologs anzuzeigen, wird ein „–" oder „nil" in der Anwendung
verwendet.
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Sofern
nicht anders definiert, haben alle hier verwendeten technischen
und wissenschaftlichen Ausdrücke
dieselbe Bedeutung, wie gemeinhin von einem Fachmann der Proteinchemie,
Pharmakologie oder Molekularbiologie verstanden. Die Methoden, Materialien
und Beispiele, die hier beschrieben sind, sollen nicht beschränkend sein.
Andere Methoden und Materialien, ähnlich oder gleichwertig zu
den hier beschriebenen, können
in der Praxis oder dem Prüfen
der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
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Peptide
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Die
vorliegende Erfindung umfasst isolierte, nicht native Peptide, wie
in Anspruch 1 angeführt.
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Varianten
der offenbarten Peptide sind auch von der vorliegenden Erfindung
umfasst. Wie hier verwendet, bezeichnet „Varianten" die Peptide, die mindestens 97%, vorzugsweise
98% und am meisten bevorzugt 99% Sequenzidentität gegenüber ihrer jeweiligen nativen
Aminosäure-Sequenz
haben. Fusionsproteine oder N-Endstellen-, C-Endstellen oder interne
Erweiterungen, Löschungen
oder Einfügungen
in der Peptid-Sequenz sollen nicht als die Homologie beeinflussend
gedeutet werden.
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Verwendung der Peptide
der Erfindung als CRF2R-Agonisten
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Die
Peptide der Erfindung sind nützlich
für die
Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten, Störungen und Leiden, die durch
CRF2R- oder CRF2R-Aktivität moduliert
sind. Wie hier verwendet, werden die Begriffe „Krankheit", „Störung" und „Leiden" austauschbar verwendet.
Wie hier verwendet, bezieht sich eine Störung, die durch die Begriffe „moduliert
von CRF2R" oder „moduliert von CRF2R-Aktivität" beschrieben wird, auf eine Störung, ein
Leiden oder eine Krankheit, wo CRF2R-Aktivität ein wirksames
Mittel zur Linderung der Störung oder
einer oder mehrerer biologischer Manifestationen der Krankheit oder
Störung
ist oder eine oder Punkte in der biologischen Kaskade stört, die
entweder zu der Störung
führt oder
für die
zugrunde liegende Störung verantwortlich
ist, oder eines oder mehrere Symptome der Störung mildert. Daher schließen von „Modulation" abhängige Störungen diejenigen
ein, bei denen: (1) Der Mangel an CRF2R-Aktivität eine „Ursache" dieser Störung oder
eine oder mehrerer biologischer Manifestationen ist, unabhängig davon,
ob die Aktivität
genetisch, durch Infektion, durch Reizung, durch internen Stimulus
oder durch eine andere Ursache geändert wurde; (2) Die Krankheit
oder Störung
oder die beobachtbare Manifestation oder Manifestationen der Krankheit
oder Störung
durch CRF2R-Aktivität gemildert werden (der Mangel
an CRF2R-Aktivität braucht nicht kausal mit
der Krankheit oder Störung
oder der beobachtbaren Manifestationen davon verbunden zu sein);
(3) CRF2R-Aktivität Teil der biochemischen oder
zellulären
Kaskade stört,
die zu der Krankheit oder Störung
führt oder
mit dieser verbunden ist. In dieser Hinsicht ändert die CRF2R-Aktivität die Kaskade
und kontrolliert so die Krankheit, das Leiden oder die Störung.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung haben die Peptide der vorliegenden Erfindung keine
oder nur schwache Aktivität
des CRF1R-Agonisten. Daher sind die Peptide
der vorliegenden Erfindung besonders nützlich für die Behandlung von CRF2R-modulierten Störungen. Eine solche von CRF2R modulierte Störung ist Skelettmuskelatrophie.
Skelettmuskelatrophie kann durch Nichtgebrauch aufgrund eines chirurgischen
Eingriffs, Bettruhe, gebrochener Knochen; Denervation/Nervenschaden
aufgrund von Rückenmarksverletzung; Autoimmunkrankheit;
Infektionskrankheit; Glucocorticoid-Verwendung für nicht verwandte Leiden; Sepsis
aufgrund von Infektion oder anderen Ursachen; Nährstoffbegrenzung aufgrund
von Krankheit oder Mangelernährung;
Krebskachexie; chronische Entzündung;
erworbenes Immunschwäche-Syndrom
(AIDS); Kachexie; chronisch-obstruktive Lungenkrankheit (COPD);
kongestive Herzinsuffizienz, Sarcopenie und genetische Störungen;
z. B. Muskeldystrophien, neurodegenerative Krankheiten hervorgerufen
werden.
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In
einer anderen Ausführungsform
führt die
Behandlung einer CRF2R-modulierten Störung zu
einer Erhöhung
der Skelettmasse und -funktion. Krankheiten und Leiden, die die
Skelettmuskelmasse und -funktion beeinflussen, schließen ein,
sind aber nicht beschränkt
auf, Skelettmuskelatrophie oder -schwund, einschließlich akuter
Atrophie/Schwund als Folge von Nichtgebrauch durch Krankheit, chirurgischen
Eingriff, Bettruhe oder Unfall; Nervenschaden aufgrund von Rückenmarksverletzung,
Autoimmunkrankheit oder Infektionskrankheit, Glucocorticoid-Ver wendung
für nicht
verwandte Zustände;
Sepsis aufgrund von Infektion oder anderen Ursachen; Nährstoffbeschränkung aufgrund
von Krankheit oder Mangelernährung
und Raumfahrt: und chronische Atrophie/Schwund einschließlich Krebskachexie,
chronischer Entzündung,
AIDS-Kachexie, COPD, kongestive Herzinsuffizienz, genetische Störungen,
z. B. Muskeldystrophien, neurodegenerative Krankheiten und Sarcopenie
(altersbedingter Muskelschwund).
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In
noch einer anderen Ausführungsform
schließt
die Behandlung von einer CRF2R-modulierten
Störung
Störungen
ein, die sich auf den Knochen auswirken. Krankheiten und Leiden,
die sich auf den Knochen auswirken, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf,
Knochenschwund durch Nichtgebrauch aufgrund von Krankheit, chirurgischem
Eingriff, Bettruhe oder Unfall; Nervenschaden aufgrund von Rückenmarksverletzung, Autoimmunkrankheit
oder Infektionskrankheit; Glucocorticoid-Anwendung für nicht
verwandte Leiden; Sepsis aufgrund von Infektion oder anderen Ursachen;
Nährstoffbeschränkung aufgrund
von Krankheit oder Mangelernährung
und Raumfahrt. Alters- und hormonbedingter Knochenschwund (Osteoporose)
sind auch eingeschlossen.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
schließt
die Behandlung einer CRF2R-modulierten Störung Störungen ein,
die sich auf das Herz und den Kreislauf auswirken, einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf, Hypertonie, kongestive Herzinsuffizienz, Herzschaden aufgrund
eines Herzinfarkts, Ischämiereperfusionsverletzung,
Schlaganfall, Migräne,
Gedächtnisverlust,
Alzheimersche Krankheit, Demenz und dergleichen.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
schließt
die Behandlung einer CRF2R-modulierten Störung Störungen ein,
die sich auf die Gelenke auswirken, einschließlich, aber nicht beschränkt auf,
Arthritis, insbesondere Osteoarthritis und rheumatoide Arthritis.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
schließt
die Behandlung einer CRF2R-modulierten Störung metabolische
Krankheiten ein, einschließlich
Fettleibigkeit und Diabetes.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
schließt
die Behandlung einer CRF2R-modulierten
Störung Folgendes
ein: Schmerzlinderung; Schwellungsminderung; Allergiereaktionen,
Allergie; Senken der Körpertemperatur;
Appetitunterdrückung;
kongestive Herzinsuffizienz; Stress und Angst; Änderung von unerwünscht niedrigen
Konzentrationen der adrenocorticotropischen Hormonausscheidung („ACTH"); Kontrolle von
Appetit, sexueller Erregung und kognitiven Funktionen und Verhindern
langfristiger Wirkungen von Stress, wie Angststörungen, Anorexia nervosa und
melancholische Depression.
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Der
Ausdruck „Behandlung" soll hier zumindest
die Verabreichung eines Peptids der vorliegenden Erfindung meinen,
das eine CRF2R-modulierte Störung in
einem Säugetierpatienten,
vorzugsweise in Menschen, mildert. Somit umfasst der Begriff „Behandlung": Verhindern des
Auftretens einer CRF2R-modulierten Störung bei
einem Säugetier,
insbesondere, wenn das Säugetier
dazu neigt, die CRF2R-modulierte Störung zu
bekommen, aber noch nicht mit der Krankheit diagnostiziert wurde;
Hemmen der CRF2R-modulierten Störung und/oder
Mildern oder Umkehren der CRF2R-modulierten
Störung.
Insofern, als die Methoden der vorliegenden Erfindung darauf gerichtet
sind, die CRF2R-modulierte Störung zu
verhindern, ist klar, dass der Ausdruck „verhindern" nicht erfordert,
dass die CRF2R-modulierte Störung vollständig vereitelt
wird (siehe Webster's Ninth
Collegiate Dictionary). Stattdessen bezieht sich der Ausdruck „verhindern" wie hier verwendet,
auf die Fähigkeit
der Person mit einschlägiger
fachlicher Ausbildung, eine Population zu identifizieren, die für CRF2R-modulierte Störungen anfällig ist, so dass die Verabreichung
von den Peptiden und Sets der vorliegenden Erfindung vor dem Einsetzen
der Symptome der CRF2R-modulierten Störung stattfinden
kann. Die Population, die für
eine bestimmte CRF2R-modulierte Störung gefährdet ist,
ist einfach zu identifizieren. Die Population, die für die Entwicklung
von Muskeldystrophie gefährdet
ist, kann zum Beispiel durch Identifizieren von Mutationen in Genen
bestimmt werden, die für
die Störung
charakteristisch sind. Zum Beispiel, und zuvor diskutiert, resultieren
Duchenne- und Becker-Dystrophien
von dem Ererben einer Mutation im Dystrophiegen, das sich am Genort
Xp21 befindet. Diese Personen einer Population, die diese Mutationen
haben, sind gefährdet, Muskeldystrophie
zu entwickeln. Daher ist die Patientenpopulation identifizierbar
und könnte
die Verabreichung einer Zusammensetzung oder Einheitsdosisform eines
Sets der vorliegenden Erfindung vor dem Fortschreiten der Krankheit
erhalten. Daher würde
das Fortschreiten von Skelettmuskelatrophie oder -schwund in solchen
Personen „verhindert".
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Nucleinsäuremoleküle
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Die
vorliegende Erfindung bietet ferner Nucleinsäuremoleküle, die die Peptide der vorliegenden
Erfindung codieren, vorzugsweise in isolierter Form. Wie hier verwendet,
ist „Nucleinsäure" als RNA oder DNA
definiert, die ein Peptid der vorliegenden Erfindung wie oben definiert
codiert oder zu einer Nucleinsäure-Sequenz komplementär ist, die
solche Peptide codiert. Besonders betrachtet werden genomische DNA-,
cDNA-, mRNA- und Antisense-Moleküle
sowie Nucleinsäuren,
die auf alternativen Grundgerüsten
basieren oder alternative Grundlagen einschließen, unabhängig davon, ob sie aus natürlichen
Quellen abgeleitet oder synthetisiert sind.
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Die
vorliegende Erfindung bietet ferner ein Fragment eines Codierungs-Nucleinsäuremoleküls. Wie hier
verwendet, bezieht sich ein Fragment des Kodierungs-Nucleinsäuremoleküls auf einen
kleinen Teil der gesamten Proteinkodierungssequenz. Die Größe des Fragments
wird durch die beabsichtigte Verwendung bestimmt. Wenn das Fragment
beispielsweise so gewählt
wird, dass es einen aktiven Abschnitt eines Peptids der vorliegenden
Erfindung kodiert, muss das Fragment groß genug sein, um die funktionalen
Bereiche des Peptids zu kodieren.
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Fragmente
der Kodierungs-Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden
Erfindung (d. h. synthetische Oligonucleotide), die als Proben oder
spezifische Primer für
die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder zum Synthetisieren von
Gensequenzen zur Kodierung von Peptiden der Erfindung verwendet
werden, können
leicht durch chemische Techniken synthetisiert werden, beispielse
die Phosphotriester-Methode von Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc.,
103:3185–3191
(1981) oder durch Verwenden automatisierter Synthesemethoden. Zusätzlich können größere DNA-Segmente
einfach durch bekannte Methoden hergestellt werden, wie die Synthese einer
Gruppe von Oligonucleotiden, die verschiedene modulare Segmente
des Gens definieren, gefolgt von der Ligation der Oligonucleotide,
um das vollständige
modifizierte Gen zu bauen.
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Die
Kodierungs-Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden
Erfindung können
ferner so modifiziert werden, dass sie eine erkennbare Markierung
für Diagnose- und Untersuchungszwecke
enthalten. Eine Vielzahl solcher Markierungen entsprechen dem Stand
der Technik und können
problemlos mit den hier beschriebenen Kodierungsmolekülen eingesetzt
werden. Geeignete Markierungen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf,
Biotin, radiomarkierte Nucleotide und dergleichen. Eine Person mit
einschlägiger
fachlicher Ausbildung kann eine beliebige solche Markierung problemlos
einsetzen, um markierte Varianten der Nucleinsäuremoleküle der Erfindung zu erhalten.
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Herstellung von Peptiden
oder Zellreihen, die Peptide exprimieren
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Die
Peptide der vorliegenden Erfindung können für eine Vielzahl von Verwendungen
hergestellt werden, einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf, Verwendung als pharmazeutische Reagenzien für die Behandlung von CRF2R-modulierten
Störungen.
Dem Fachmann wird klar sein, dass für einige Ausführungsformen der
Erfindung gereinigte Peptide am nützlichsten sind, während für andere
Ausführungsformen
Zellreihen, die die Peptide exprimieren, am nützlichsten sind.
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Da
die Peptide der Erfindung kurze Polypeptide sind, erkennt die Person
mit einschlägiger
fachlicher Ausbildung, dass Peptide der vorliegenden Erfindung durch
direkte Synthese, statt durch rekombinierte Mittel, unter Verwendung
von dem Stand der Technik entsprechenden Techniken synthetisiert
werden können.
Siehe Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag,
Heidelberg (1984); und über
Festphasensynthese, siehe, z. B., Merrifield, J. Am. Chem. Soc.,
85:2149–54
(1963); Barany et al., Int. J. Peptide Protein Res., 30:705–739 (1987);
und U.S.-Pat. Nr. 5,424,398.
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Die
Peptide können
zum Beispiel entweder mit einem automatisierten Synthetisiergerät Applied
Biosystem, Inc. (ABI) Modell 433 oder einem Multireaktor-Synthetisiergerät (Modell
SymphonyTM) von Protein Technology, Inc
(PTI) synthetisiert werden. Hinsichtlich der Peptide, die mit dem
ABI-Synthetisiergerät
synthetisiert werden, werden alle Reagenzien von ABI gekauft (ausschließlich Piperidin,
das von Aldrich gekauft wird). FMOC-Aminosäuren werden von ABI gekauft
(außer
FMOC-L-Pyr, das von Chem-Impek gekauft wird). Rink-Amidharze werden
von Nova Chemicals gekauft. Standardmäßige 0,1 mMol FastMoc-Chemie mit einfacher
Kopplung wird angewendet. Das allgemeine FMOC-Chemieprotokoll für SPPS (Festphasen-Peptidsynthese)
schließt
Folgendes ein: 1) Spaltung der FMOC-Schutzgruppen mit Piperidin;
2) Aktivierung der Carboxylgruppe der Aminosäuren und 3) Kopplung der aktivierten
Aminosäuren
an die Amino-Endstelle der harzgebundenen Peptidkette, um Peptidbindungen
zu bilden. Aminosäuren
werden mit 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-Hexafluorphosphat
(HBTU) aktiviert. Eine trockene geschützte Aminosäure in einer Patrone (1,0 mMol)
wird in einer Lösung
aus HBTU, N,N-Diisopropylethylamin (DIEA) und 1-Hydroxybenzotriazol
(HOBt) in N,N-Dimethylformamid (DMF) mit hinzugefügtem zusätzlichem
N-Methylpyrrolidon (NMP) gelöst.
Die aktivierte FMOC-Aminosäure
wird fast unmittelbar gebildet und die Lösung wird direkt in das Umsetzungsgefäß übertragen.
Der Schritt der FMOC-Entschützung wird
durch Leitfähigkeitsmessung beobachtet
und gesteuert. Die Peptidkette ist auf einem Rink-Amidharz gebaut,
da das Amid der C-Endstelle erforderlich ist. Das Endprodukt wird
ausgiebig mit NMP und Dichlormethan (DCM) gewaschen.
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Hinsichtlich
der Peptide, die mit dem PTI-Multi-Synthetisiergerät synthetisiert
werden, werden alle FMOC-Aminosäuren
von NovaBiochem gekauft (außer
FMOC-Pyr, das von Chem-Impex gekauft wird). Standardmäßige 0,05
mMol-FMOC-Syntheseprotokolle
werden für
Synthesen verwendet. FMOC-Aminosäuren (0,4
mMol) werden in einer Lösung
aus HBTU (200 mM), N-Methylmorpholin (NMM, 0,4 M) und N,N-Dimethylformamid
(DMF) mit hinzugefügtem
zusätzlichem
N-Methylpyrrolidon (NMP) gelöst.
Die aktivierte FMOC-Aminosäure
wird fast umgehend gebildet und die Lösung wird direkt in das Umsetzungsgefäß übertragen.
Der Schritt der FMOC-Entschützung
wird zweimal durchgeführt.
Die Peptidkette ist auf einem Rink-Amidharz gebaut, da das Amid
der C-Endstelle erforderlich ist. Das Syntheseendprodukt wird ausgiebig
mit NMP und Dichlormethan (DCM) gewaschen.
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Die
neu synthetisierten Peptide sind entschützt. Die Harze, die synthetisierte
Peptide enthalten, werden vom Synthetisiergerät entladen und kurz luftgetrocknet.
Unter Verwendung von 1,5–2,0
ml des Spaltungscocktails (umfassend 95% Trifluoressigsäure (TFA),
2,5% Ethanodithiol, 2,5% Thioanisol, 2,5% Phenol (WN) in Wasser)
für 4 Stunden
bei Raumtemperatur werden die Peptide vom Harz gespalten und gleichzeitig
werden die Seitenketten-Schutzgruppen [O-t-Butyl(OtBu) für Asp, Glu,
Tyr, Thr und Ser; Pentamethylchroman-6-sulfonyl (Pmc) für Arg, t-Butoxycarbonyl
(Boc) für
Trp und Lys; Trityl (Trt) für
His, Asn und Gln] unter Entschützungsbedingung
entfernt. Die Spaltlösung
wird durch Filtration vom Harz getrennt. Das Filtrat wird dann mit
15 ml Wasser verdünnt.
Sechs Runden der Etherextraktion werden durchgeführt, um das Peptidprodukt zu
reinigen. Das Peptid wird lyophilisiert und bei –20°C vor der Reinigung aufbewahrt.
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Die
entschützten
Peptide werden gereinigt und charakterisiert. Das Peptidpulver wird
in 50% Essigsäurelösung gelöst und auf
ein Vydac 1,0 cm Innendurchmesser 25 cm Länge C-8 Säule mit 5 μm Partikelgröße und 300 Å Porengröße zur Reinigung gespritzt.
Ein hochleistungsfähiges
Beckman System Gold Flüssigchromatographiesystem
(HPLC) mit Ultraviolettdetektor mit dualer Wellenlänge (220
nm und 280 nm) wird verwendet. Ein linear Gradient von Acetonitril
wird programmiert und in die Säule
eingeleitet, um das Peptidprodukt von anderen Substanzen zu trennen.
Das Eluat wird von einem Pharmacia Fraktionssammler gesammelt und
die individuellen Abscheidefraktionen wurden sowohl analytischer
HPLC als auch (matrixunterstützter
Laser-Desorptions-Ionisation in Verbindung mit Flugzeitmassenspektrometrie)
MALDI-TOF MS für
die Charakterisierung unterzogen, um die Identität und Reinheit sicherzustellen.
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Die
Verwendung der rekombinierten DNA-Technologie in der Herstellung
der Peptiden oder der Zellreihen, die diese Peptide exprimieren,
wird auch betrachtet. Solche rekombinierten Methoden entsprechen dem
Stand der Technik. Methoden für
das Erzeugen von rDNA-Molekülen
entsprechen dem Stand der Technik, siehe beispielsweise Sambrook
et al., Molecular Cloning – A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Um
rekombinierte Peptide der vorliegenden Erfindung zu exprimieren,
wird ein Expressionsvektor hergestellt, der eine Nucleinsäure umfasst,
die das jeweilige Polypeptid unter der Kontrolle von einem oder
mehreren regulierenden Elementen kodiert. Die Sequenz der Nucleinsäuren, die
die Peptide der vorliegenden Erfindung kodieren, können von
den Peptid-Sequenzen
abgeleitet werden, die hier diskutiert oder beansprucht werden.
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Durch
dem Stand der Technik entsprechende Methoden kann das isolierte
Nucleinsäuremolekül, das das
jeweilige Peptid kodiert, in einen geeigneten Expressionsvektor
gebunden werden. Die Wirts-Expressionsvektorsysteme, die für Zwecke
der Erfindung verwendet werden können,
schließen
ein, sind aber nicht beschränkt
auf: Mikroorganismen wie Bakterien (z. B. E. coli, B. subtilis),
umgeformt mit rekombinierten Bacteriophage-DNA-, Plasmid-DNA- oder
Cosmid- DNA-Expressionsvektoren,
die Nucleotid-Sequenzen enthalten, die die Peptide der vorliegenden
Erfindung kodieren; Hefe (z. B. Saccharomyces, Pichia), umgeformt
mit rekombinierten Hefe-Expressionsvektoren, die Nucleotid-Sequenzen
enthalten, die die Peptide der vorliegenden Erfindung kodieren;
Insektenzellsysteme, die mit rekombinierten Virusexpressionsvektoren
(z. B. Baculovirus) infiziert sind, die Nucleotid-Sequenzen enthalten,
die die Peptide der vorliegenden Erfindung kodieren; Pflanzenzellsysteme,
die mit rekombinierten Virusexpressionsvektoren (z. B. Blumenkohl-Mosaikvirus,
Tabak-Mosaikvirus) infiziert oder mit rekombinierten Plasmidexpressionsvektoren
(z. B. Ti-Plasmid) umgewandelt sind, die Nucleotid-Sequenzen erhalten,
die die Peptide der vorliegenden Erfindung kodieren, oder Säugetierzellsysteme
(z. B. COS, CHO, HEK293, NIH3T3), die rekombinierte Expressionskonstrukte
beherbergen, die Promotoren enthalten, die von dem Genom von Säugetierzellen
(z. B. Metallothionein-Promotor) oder von Säugetierviren (z. B. Retrovirus
LTR) abgeleitet sind und auch Nucleotid-Sequenzen enthalten, die die Peptide
der vorliegenden Erfindung kodieren.
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In
Bakteriensystemen kann eine Reihe von Expressionsvektoren vorteilhaft
je nach der beabsichtigten Verwendung für das exprimierte Peptid ausgewählt werden.
Wenn beispielsweise eine große
Menge eines solchen Proteins erforderlich ist, sind Vektoren wünschenswert,
die die Expression hoher Konzentrationen von Proteinprodukten steuern.
Ein Fachmann kann solche Vektorkonstrukte erzeugen und die Proteine
durch eine Vielzahl von Methodologien reinigen, einschließlich selektiver
Reinigungstechnologien wie selektive Fusion-Protein-Säulen und
Antikörpersäulen und
nicht selektive Reinigungstechnologien.
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In
einem Insektenprotein-Expressionssystem wird der Baculovirus A.
californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) als ein Vektor verwendet,
um fremde Gene in S. frugiperda-Zellen zu exprimieren. In diesem Fall
werden Nucleotid-Sequenzen, die die Peptide der vorliegenden Erfindung
kodieren, in nicht wesentliche Bereiche des Virus geklont und unter
die Kontrolle eines AcNPV-Promotors gestellt. Die rekombinierten
Viren werden dann verwendet, um Zellen zu infizieren, in denen das
eingefügte
Gen exprimiert ist, und das Protein wird durch eine der vielen Techniken
gereinigt, die dem Fachmann bekannt sind.
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In
Säugetierwirtszellen
kann eine Reihe von Expressionssystemen auf Virenbasis verwendet
werden. Nutzung dieser Expressionssysteme erfordert oft die Erstellung
spezifischer Initiationssignale in den Vektoren für effiziente
Translation der eingefügten
Nucleotid-Sequenzen. Dies ist besonders wichtig, wenn ein Teil der verwendeten
Nucleotid-Sequenz das endogene Initiationssignal nicht enthält. Die
Platzierung dieses Initiationssignals, im Rahmen mit der Kodierungsregion
der eingefügten
Nucleotid-Sequenz, sowie das Hinzufügen von Transkription und Translation
fördernden
Elementen und die Reinigung des rekombinierten Proteins werden durch
eine der vielen Methodologien erreicht, die dem Fachmann bekannt
sind. Auch wichtig in Säugetierwirtszellen
ist die Auswahl eines geeigneten Zelltyps, der zu den erforderlichen
Modifikationen des rekombinierten Proteins nach der Translation
in der Lage ist. Solche Änderungen,
beispielsweise Spaltung, Phosphorylierung, Glycosylierung, Acetylierung
usw., erfordern die Auswahl der geeigneten Wirtszelle, die die modifizierenden
Enzyme enthält.
Solche Wirtszellen schließen
ein, sind aber nicht beschränkt
auf, CHO, HEK293, NIH3T3, COS usw. und sind Fachleuten bekannt.
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Für langfristige
rekombinierte Proteine mit hoher Expression ist eine stabile Expression
bevorzugt. Zum Beispiel können
Zellreihen erstellt werden, die Peptide der vorliegenden Erfindung
stabil exprimieren. Ein Fachmann kann, die bekannten Methoden wie
Elektroporation, Calciumphosphat-Transfektion oder Liposom-katalysierte
Transfektion befolgend, eine Zellreihe erzeugen, die die Peptide
der vorliegenden Erfindung stabil exprimiert. Dies wird normalerweise
durch Transfektieren von Zellen unter Verwendung von Expressionsvektoren
erreicht, die entsprechende Expressionskontrollelemente (z. B. Promotorsequenzen,
Enhancersequenzen, transkriptionale Terminationssequenzen, Polyadenylierungsorte,
translationale Startorte usw.), eine auswählbare Markierung und das jeweilige
Gen enthalten. Die auswählbare
Markierung kann entweder in demselben Vektor wie das jeweilige Gen
oder auf einem separaten Vektor enthalten sein, der mit dem die Peptid-Kodierungssequenz
enthaltenden Vektor kotransfektiert ist. Die auswählbare Markierung
in dem Expressionsvektor kann Widerstand auf die Auswahl übertragen
und es den Zellen ermöglichen,
den Vektor stabil in ihre Chromosomen zu integrieren und zu wachsen,
um Foki zu bilden, die wiederum geklont und in Zellreihen erweitert
werden können.
Als Alternative kann der Expressionsvektor die Wahl der Zelle ermöglichen,
die die auswählbare
Markierung exprimiert, ein physikalisches Attribut der Markierung
verwendend, d. h. Expression des Green Fluorescent Protein (GFP)
ermöglicht
die Auswahl von Zellen, die die Markierung mithilfe der fluoreszenzaktivierten
Zellsortierungsanalyse (FACS) exprimieren.
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Ein
Fachmann kann einen geeigneten Zelltyp für die Transfektion auswählen, um
die Auswahl von Zellen zu ermöglichen,
in die die jeweilige Sequenz erfolgreich integriert wurde. Wo beispielsweise
die auswählbare
Markierung Herpes Simplex Virus-Thymidinkinase, Hypoxanthin-guaninphosphoribosyltransferase
oder Adeninphosphoribosyltransferase ist, wäre der entsprechende Zelltyp
tk-, hgprt- bzw. aprt-Zellen. Oder normale Zellen können verwendet
werden, bei denen die auswählbare
Markierung dhfr, gpt, neo oder hygro ist, was Widerstand auf Methotrexat,
Mycophenolsäure,
G-418 bzw. Hygromycin überträgt.
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Herstellung
von Antikörpern
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Antikörper, die
selektiv ein oder mehrere Epitope der Peptide der vorliegenden Erfindung
erkennen, sind ebenfalls von der Erfindung umfasst. Solche Antikörper schließen beispielsweise
polyklonale Antikörper, monoklonale
Antikörper,
heterozygote Antikörper,
menschliche Antikörper,
einkettige Antikörper,
Fab-Fragmente, F(ab')2-Fragmente,
mithilfe einer Fab-Expressionsbibliothek produzierte Moleküle, menschliche
Antikörper
(polyklonal oder monoklonal), die in transgenen Mäusen produziert
wurden, und Epitop-bindende Fragmente der oben stehenden ein.
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Die
Antikörper
können
zusammen mit Gentherapietechniken eingesetzt werden, um beispielsweise die
Expression der Peptide der vorliegenden Erfindung entweder in Zellen
oder direkt in Patientengeweben, in die diese Gene eingeführt wurden,
zu bewerten.
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Für die Produktion
von Antikörpern
kann eine Vielzahl von Wirtstieren durch Injektion mit Peptiden
der vorliegenden Erfindung, Antipeptid-Antikörpern, Antipeptid-Analogantikörpern oder
immunogenen Fragmenten davon durch dem Stand der Technik entsprechende
Methoden immunisiert werden. Zur Herstellung eines Anti-Idiotyp-Antikörpers ist
das Immunogen ein Anti-Peptid-Antikörper oder ein Anti-Peptid-Analogantikörper. Produktion
von Anti-Idiotyp-Antikörpern
ist beispielsweise in U.S.-Patent Nr. 4,699,880 beschrieben. Geeignete
Wirtstiere schließen
ein, sind aber nicht beschränkt
auf, Hasen, Mäuse,
Ziegen, Schafe und Pferde. Immunisierungstechniken entsprechen dem
Stand der Technik. Polyklonale Antikörper können vom Serum des immunisierten
Tiers gereinigt werden oder monoklonale Antikörper können durch dem Stand der Technik
entsprechende Methoden erzeugt werden. Diese Techniken schließen ein,
sind aber nicht beschränkt
auf, die gut bekannten Hybridom-Techniken von Kohler und Milstein,
menschliche B-Zellen-Hybridom-Techniken und die EBV-Hybridom-Technologie. Monoklonale
Antikörper
können
einer beliebigen Immunoglobulin-Klasse
entstammen, einschließlich
IgG, IgE, IgM, IgA und IgD, die entweder leichte Kappa- oder Lambda-Ketten
enthalten. Techniken der Herstellung und Verwendung heterozygoter
Antikörper
entsprechen dem Stand der Technik und sind beispielsweise in U.S.-Pat.
Nr. 5,807,715; 4,816,397; 4,816,567; 5,530,101; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762;
6,180,370 und 5,824,307 beschrieben.
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CRF2R-Selektivität bestimmende
Proben
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Die
pharmakologische Aktivität
und Selektivität
der Peptide der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung veröffentlichter
Testverfahren bestimmt werden. Siehe z. B. WO 02/069908. Da CRF2R und CRF1R homologe
Proteine sind, wird erwartet, dass ein gewisser Anteil der Agonisten
für CRF2R auch als Ago nisten für CRF1R
funktioniert. Wie oben stehend besprochen, ruft die Aktivierung
von CRF1R die Aktivierung der HPA-Achse
hervor, da erhöhte
Corticosteroid-Produktion zu Skelettmuskelatrophie führt. In
den meisten Fällen,
in denen eine Erhöhung
der Muskelmasse oder -funktion gewünscht ist, ist es nicht wünschenswert, die
HPA-Achse zu aktivieren. Bei der Auswahl eines Peptids, das für die Behandlung
einer CRF2R-modulierten Störung nützlich ist,
die nicht mit einer Muskeldystrophie verbunden ist, ist es vorzuziehen,
dass das Peptid selektiv für
CRF2R ist. Vorzugsweise zeigt das Peptid
10-fache Selektivität
für CRF2R gegenüber
CRF1R (d. h. 10-mal aktiver gegenüber CRF2R als gegenüber CRF1R),
mehr bevorzugt 100-fache Selektivität und am meisten bevorzugt
1000-fache oder
größere Selektivität. Da veröffentlichte
Studien einen Nutzen einer Corticosteroid-Therapie bei der Behandlung
von Muskeldystrophien gezeigt haben, kann es nützlich sein, dass ein CRF2R-Agonist ein gewisses Niveau des CRF1R-Agonismus beibehält, wenn er zur Behandlung
von Muskeldystrophien verwendet wird. Daher wird für die Behandlung
von Muskeldystrophien ein Peptid niedrigerer Selektivität, das das
CRF2R sowie das CRF1R
in einem ähnlichen
Konzentrationsbereich aktiviert, bevorzugt. Vorzugsweise ist das
Peptid 100-fach für
CRF2R gegenüber CRF1R
selektiv, mehr bevorzugt 10-fach selektiv und am meisten bevorzugt
nicht selektiv für
CRF2R gegenüber CRF1R
(d. h. die Aktivität
der Kandidatverbindung ist im Wesentlichen ähnlich für CRF2R
und CRF1R). In diesem Fall kann es auch
mehr bevorzugt sein, dass das Peptid ein Vollagonist für CRF2R ist, während
es ein Partialagonist für
CRF1R ist. Ein solches Peptid hätte daher
eine eingebaute Grenze für
den maximalen Grad der Cortisolerhöhung und des Potenzials für Skelettmuskelatrophie,
während
die Antiatrophie-Wirkung, die durch das CRF2R
moduliert wird, durch Erhöhen
der Dosis gesteigert werden könnte.
Ein Fachmann wäre
in der Lage, unter Verwendung von dem Stand der Technik entsprechenden
Methoden einfach zu bestimmen, ob ein Peptid ein Voll- oder Partialagonist
des CRF1R oder CRF2R
ist.
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Da
es wünschenswert
ist, Bindungen zwischen CRF2R im Vergleich
mit CRF1R zu benachteiligen, können die
oben beschriebenen Prüfungen
mithilfe einer Zelle, oder einer Membran von einer Zelle, durchgeführt werden,
die nur CRF2R exprimiert, oder die Prüfungen können mit
einer rekombinierten Quelle von CRF2R durchgeführt werden.
Zellen, die beide Formen von CRFR exprimieren, können mithilfe von homologer
Rekombination modifiziert werden, um das CRF1R-Gen
zu deaktivieren oder auf andere Weise zu sperren. Als Alternative,
wenn die Quelle von CRFR mehr als einen CRFR-Typ enthält, muss
das Hintergrundsignal, das vom Rezeptor erzeugt wird, der nicht
von Interesse ist, von dem in der Prüfung erhaltenen Signal abgezogen werden.
Die Hintergrundreaktion kann durch eine Reihe von Methoden bestimmt
werden, einschließlich
der Eliminierung des Signals vom CRFR, das nicht von Interesse ist,
durch die Verwendung von Antisense, Antikörpern oder selektiven Antagonisten.
Bekannte Antagonisten von CRFRs schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf,
Antalarmin (CRF1R-selektiv), Antisauvagin-30
(CRF2R-selektiv) und Astressin (nichtselektiv
für CRF1R/CRF2R).
-
Um
zu bestimmen, ob ein Peptid CRF2R und/oder
CRF1R aktiviert, sind die Prüfungen üblicherweise auf
Zellbasis; jedoch sind zellfreie Prüfungen bekannt, die Agonisten-
und Antagonisten-Bindung wie oben beschrieben unterscheiden können. Prüfungen auf
Zellbasis schließen
die Schritte des Berührens
von Zellen, die CRF1R oder CRF2R
exprimieren, mit einem Peptid der vorliegenden Erfindung oder einer
Kontrolle und des Messens der Aktivierung des CRFR durch Messen
der Expression oder Aktivität
der Bestandteile der CRFR-Signaltransduktionspfade ein.
-
Wie
im obigen Abschnitt über
den Hintergrund beschrieben, scheinen CRFRs sich über mehrere
verschiedene Pfade zu koppeln, einschließlich Gαs,
Gαq,
oder Gαi,
je nach dem Zelltyp. Es wird angenommen, dass Agonistenaktivierung
des CRFR es dem Rezeptor ermöglicht, über einen
dieser Pfade zu signalisieren, sofern die erforderlichen Pfadkomponenten
in dem spezifischen Zelltyp vorhanden sind. Um daher ein bestimmtes Peptid
der vorliegenden Erfindung auf CRFR-Aktivierung zu prüfen, kann
eine Prüfung
einen beliebigen Signaltransduktionspfad als den Ablesewert verwenden,
selbst wenn der relevante Zellentyp für die Behandlung, in vivo,
CRFR über
einen anderen Pfad an Skelettmuskelatrophie bindet. Ein Fachmann
würde erkennen,
dass eine Prüfung
für die
Identifizierung nützlicher
Peptidagonisten unabhängig
von dem Pfad, durch den die Rezeptoraktivierung gemessen wurde,
effektiv wäre.
Prüfungen
für die
Messung der Aktivierung dieser Signalisierungspfade entsprechen
dem Stand der Technik.
-
Nach
dem Berühren
mit einem Peptid der vorliegenden Erfindung können beispielsweise Lysate
der Zellen hergestellt und auf die Induktion von cAMP geprüft werden.
cAMP wird als Reaktion auf Gαs-Aktivierung induziert.
Da Gαs von
anderen Rezeptoren als CRFR aktiviert wird und da ein Testpeptid
seine Wirkung durch CRFR oder durch andere Mechanismen ausüben kann,
sind zwei Kontrollvergleiche für
die Bestimmung relevant, ob das Peptid die Konzentrationen von cAMP über Aktivierung
eines CRFRs erhöht.
Eine Kontrolle vergleicht die cAMP-Konzentration von Zellen, die
mit dem Peptid in Kontakt gebracht wurden, und die cAMP-Konzentration
von Zellen, die mit einer Kontrollverbindung in Kontakt gebracht
wurden (d. h. die Trägersubstanz,
in der das Peptid gelöst
ist). Wenn das Peptid die cAMP-Konzentrationen im Vergleich zu der
Kontrollverbindung erhöht,
zeigt dies an, dass das Peptid cAMP durch einen Mechanismus erhöht. Die
andere Kontrolle vergleicht die cAMP-Konzentrationen einer CRFR exprimierenden
Zellreihe und einer Zellreihe, die im Wesentlichen gleich ist außer, dass
sie nicht das CRFR exprimiert, wobei beide Zellreihen mit dem Peptid behandelt
wurden. Wenn das Peptid cAMP-Konzentrationen
in der CRFR exprimierenden Zellreihe im Verhältnis zur Zellreihe erhöht, die
CRFRs nicht exprimiert, ist dies ein Anzeichen, dass das Peptid
cAMP über
Aktivierung der CRFRs erhöht.
-
In
einem Beispiel wird die cAMP-Induktion mit der Verwendung von DNA-Konstruktionen
gemessen, die das cAMP-responsive Element verbunden mit einem einer
Vielzahl von Reportergenen enthält,
können
in Zellen eingeleitet werden, die CRFRs exprimieren. Solche Reportergene
schließen
ein, sind aber nicht beschränkt
auf Chloramphenicolacetyltransferase (CAT), Luciferase, Glucuronidsynthetase,
Wachstumshormon, fluoreszierende Proteine (z. B. Green Fluorescent
Protein) oder alkalische Phosphatase. Nach Kontakt der Zellen mit
dem Peptid kann die Konzentration der Reportergenexpression quantitativ
bestimmt werden, um die Fähigkeit
des Peptids zu bestimmen, cAMP-Konzentrationen
zu erhöhen,
und so die Fähigkeit
des Peptids zu bestimmen, das CRFR zu aktivieren.
-
Die
in dieser Prüfung
nützlichen
Zellen sind dieselben wie für
die oben beschriebene CRFR-Bindungsprüfung, außer dass in den Aktivierungsprüfungen verwendete
Zellen vorzugsweise einen funktionalen Rezeptor exprimieren, der
eine statistisch signifikante Reaktion auf CRF oder einen oder mehrere
CRF-Analoge zeigt.
Zusätzlich
zur Verwendung von Zellen, die CRFRs voller Länge exprimieren, können Zellen
hergestellt werden, die CRFRs exprimieren, die die Liganden bindende
Domäne
des Rezeptors enthalten, der verbunden ist mit oder physikalisch
modifiziert wurde, um Reporterelemente zu enthalten oder um mit
signalisierenden Proteinen zu interagieren. Ein Wildtyp-CRFR oder
CRFR-Fragment kann
beispielsweise mit einem G-Protein kondensiert werden, was zu der
Aktivierung des kondensierten G-Proteins bei Bindung des Agonisten
an den CRFR-Teil des Fusionsproteins führt. Siefert, R. et al., Trends
Pharmacol. Sci., 20:383–389
(1999). Die Zellen sollten außerdem
vorzugsweise eine Reihe von Eigenschaften, je nach dem Ablesewert,
besitzen, um die induktive Reaktion durch CRF oder das CRF-Analog
beispielsweise für
die Erkennung einer starken Induktion eines CRE-Reportergens zu
maximieren; (a) eine niedrige natürliche Konzentration von cAMP;
(b) G-Proteine, die in der Lage sind, mit CRFRs zu interagieren;
(c) eine hohe Konzentration von Adenylylcyclase; (d) eine hohe Konzentration
von Proteinkinase A; (e) eine niedrige Konzentration von Phosphodiesterasen
und (f) eine hohe Konzentration des das cAMP-Reaktionselement bindenden Proteins
wären vorteilhaft.
Um die Reaktion auf CRF oder ein CRF-Analog zu erhöhen, könnten Wirtszellen
hergestellt werden, um eine größere Menge vorteilhafter
Faktoren oder eine niedrigere Menge nachteiliger Faktoren zu exprimieren.
Zusätzlich
könnten
alternative Pfade für
die Induktion des CRE-Reporters beseitigt werden, um Basiskonzentrationen
zu senken.
-
Prüfungen zur
Bestimmung von pharmakologischer Aktivität
-
Die
pharmakologische Aktivität
von den Peptiden der vorliegenden Erfindung kann durch Verwendung veröffentlichter
Testverfahren bestimmt werden. Beispielsweise schließen Modelle
von Skelettmuskelatrophie oder -hypertrophie sowohl in vitro-Zellkulturmodelle
als auch in vivo-Tiermodelle von Skelettmuskelatrophie ein.
-
In
vitro-Modelle der Skelettmuskelatrophie entsprechen dem Stand der
Technik. Solche Modelle sind beispielsweise in Vandenburgh, H.H.,
In Vitro, 24:609–619
(1988), Vandenburgh, H.H. et al., J. Biomechanics, 24 Suppl 1:91–99 (1991),
Vandenburgh, H.H et al., In Vitro Cell. abw. Biol., 24(3):166–174 (1988),
Chromiak, J.A., et al., In Vitro Cell. abw. Biol. Anim., 34(9):694–703 (1998),
Shansky, J., et al., In Vitro Cell. abw. Biol. Anim., 33(9):659-661
(1997), Perrone, C.E. et al., J. Biol. Chem., 270(5):2099–2106 (1995),
Chromiac, J.A. und Vandenburgh, H.H., J. Cell. Physiol., 159(3):407–414 (1994)
und Vandenburgh, H.H. und Karlisch, P., In Vitro Cell. abw. Biol.,
25(7):607–616
(1989) beschrieben.
-
Eine
Vielzahl von Tiermodellen für
Skelettmuskelatrophie entspricht dem Stand der Technik, wie die
in den folgenden Verweisen beschriebenen: Herbison, G.J., et al.
Arch. Phys. Med. Rehabil., 60:401–404 (1979), Appell, H-J. Sports
Medicine 10:42–58
(1990), Hasselgren, P-O. und Fischer, J.E. World J. Surg., 22:203–208 (1998),
Agbenyega, E.T. und Wareham, A.C. Comp. Biochem. Physiol., 102A:141–145 (1992),
Thomason, D.B. und Booth, F.W. J. Appl. Physiol., 68:1–12 (1990),
Fitts, R.H., et al. J. Appl. Physiol., 60:1946–1953 (1986), Bramanti, P.,
et al. Int. J. Anat. Embryol. 103:45–64 (1998), Cartee, G.D. J.
Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci., 50:137–141 (1995), Cork, L.C., et
al. Prog. Clin. Biol. Res., 229:241–269 (1987), Booth, F.W. und
Gollnick, P.D. Med. Sci. Sports Exerc., 15:415–420 (1983), Bloomfield, S.A.
Med. Sci. Sports Exerc., 29:197–206
(1997). Bevorzugte Tiere für
diese Modelle sind Mäuse
und Ratten. Diese Modelle schließen beispielsweise Modelle von
durch Nichtgebrauch induzierter Atrophie wie Eingipsen oder auf
andere Weise Ruhigstellen von Gliedmaßen, Aufhängung hinterer Gliedmaßen, vollständige Immobilisierung
des Tiers und Situationen mit verminderter Schwerkraft ein. Modelle
von durch Nervenschaden induzierter Atrophie schließen beispielsweise
Nervenquetschung, Entfernung von Nervenabschnitten, die bestimmte
Muskeln innervieren, Toxinanwendung auf Nerven und Infektion von
Nerven mit viralen, bakteriellen oder eukaryoten Infektionsmitteln.
Modelle von Glucocorticoid-induzierter Atrophie schließen Anwendung
von Atrophie induzierenden Dosen von exogenem Glucocorticoid in
Tieren und Stimulierung endogener Corticosteroid-Produktion, zum
Beispiel durch Anwendung von Hormonen ein, die die Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse (HPA) aktivieren.
Modelle von durch Sepsis induzierter Atrophie schließen beispielsweise
Impfung mit Sepsis induzierenden Organismen wie Bakterien, Behandlung
des Tiers mit immunaktivierenden Verbindungen wie bakteriellem Zellwandextrakt
oder Endotoxin und Punktur der Darmwände ein. Modelle von durch
Kachexie induzierter Atrophie schließen beispielsweise Impfung
eines Tiers mit karzinogenen Zellen mit Kachexiebildungspotenzial,
Infektion eines Tiers mit Infektionsmitteln (wie Viren, die AIDS
verursachen), was zu Kachexie führt,
und Behandlung eines Tiers mit Hormonen oder Cytokinen wie CNTF,
TNF, IL-6, IL-1
usw. ein, die Kachexie induzieren. Modelle von durch Herzversagen
induzierter Atrophie schließen
die Behandlung eines Tiers ein, so dass Herzversagen mit einhergehender
Skelettmuskelatrophie auftritt. Durch neurodegenerative Krankheit
induzierte Atrophiemodelle schließen Autoimmun-Tiermodelle ein
wie diejenigen, die durch die Immunisierung eines Tiers mit neuronalen Komponenten
resultieren. Durch Muskeldystrophie induzierte Modelle von Atrophie
schließen
natürliche
oder künstliche
genetisch induzierte Modelle der Muskeldystrophie ein wie die Mutation
des Dystrophingens, das in der Mdx-Maus auftritt.
-
Tiermodelle
für Skelettmuskelhypertrophie
schließen
beispielsweise Modelle von erhöhtem
Gliedmaßenmuskelgebrauch
aufgrund der Inaktivierung der gegenüber liegenden Gliedmaße, Nachwiegen
nach einem Nichtgebrauch-Atrophie induzierenden Ereignis, erneute
Nutzung eines Muskels, der aufgrund vorübergehenden Nervenschadens
atrophierte, erhöhte
Nutzung ausgewählter
Muskeln aufgrund von Inaktivierung eines synergistischen Muskels
(z. B. kompensierende Hypertrophie), erhöhte Muskelnutzung aufgrund
erhöhter
Belastung des Muskels und Hypertrophie als Folge der Entfernung
des Glucocorticoids nach Glucocorticoid-induzierter Atrophie ein.
Bevorzugte Tier-Atrophiemodelle schließen das Ischiasnerv-Denervierungs-Atrophiemodell,
Glucocorticoid-induziertes Atrophiemodell und das Nichtgebrauch-Atrophiemodell
durch Eingipsen des Beins ein, die unten stehend genauer beschrieben
sind.
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Das
Ischiasnerv-Denervierungs-Atrophiemodell betrifft das Narkotisieren
des Tiers gefolgt von der chirurgischen Entfernung eines kurzen
Segments entweder des rechten oder linken Ischiasnervs, z. B. wird
der Ischiasnerv in Mäusen
etwa in der Mitte des Femurs isoliert und ein 3–5 mm Segment wird entfernt.
Dies denerviert die Muskulatur des unteren hinteren Glieds, was
zu Atrophie dieser Muskeln führt. Üblicherweise
wird die Innervierung des Bizeps femoris intakt gelassen, um zufrieden
stellende Bewegung des Knies für
nahezu normalen Gang bereitzustellen. Üblicherweise ist die Muskelmasse
der denervierten Muskeln, bei unbehandelten Tieren, zehn Tage nach
der Denervierung um 30–50%
vermindert. Nach der Denervierung werden Testpeptide verabreicht,
z. B. durch Injektion oder kontinuierliche Infusion, z. B. über Implantation
einer osmotischen Minipumpe (z. B. Alzet, Palo Alto, CA), um ihre
Wirkung auf von Denervierung induzierte Skelettmuskelatrophie zu
bestimmen. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Denervierung werden
die Tiere eingeschläfert
und die unteren Beinmuskeln werden schnell von den denervierten
und nicht denervierten Beinen seziert, die Muskeln, von Sehnen und
Bindegewebe befreit, werden gewogen. Das Ausmaß der Atrophie in den betroffenen
Muskeln wird analysiert, beispielsweise durch Messen der Muskelmasse,
des Querschnittbereichs der Muskeln, des Myofaser-Querschnittsbereichs
oder des Gehalts des kontraktilen Proteins.
-
Das
Glucocorticoid-induzierte Atrophiemodell betrifft das Verabreichen
eines Glucocorticoids an das Versuchstier, z. B. 1,2 mg/kg/Tag Dexamethason
im Trinkwasser. Üblicherweise
ist die Skelettmuskelmasse, in unbehandelten Tieren, zehn Tage nach
der Dexamethason-Verabreichung um 30–50% reduziert. Begleitend mit
oder nach Glucocorticoid-Verabreichung werden Testpeptide verabreicht,
z. B. durch Injektion oder kontinuierliche Infusion, um ihre Wirkung
auf Glucocorticoid-induzierte Skelettmuskelatrophie zu bestimmen.
Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Glucocorticoid-Verabreichung
wird das Ausmaß der
Atrophie in den betroffenen Muskeln analysiert, wie oben stehend
für das
Denervierungsmodell beschrieben.
-
Das
Nichtgebrauch-Atrophiemodell durch Eingipsen eines Beins betrifft
das Eingipsen eines Hinterbeins eines Tiers vom Knie bis zum Fuß. Üblicherweise
ist die Muskelmasse nach zehn Tagen nach dem Eingipsen um 20–40% reduziert.
Nach dem Eingipsen werden Testpeptide durch Injektion oder kontinuierliche
Infusion durch Implantation einer osmotischen Minipumpe (z. B. Alzet,
Palo Alto, CA) verabreicht, um ihre Wirkung auf die durch Eingipsen
des Beins induzierte Skelettmuskelatrophie zu bestimmen. Zu verschiedenen Zeitpunkten
nach Eingipsen des Beins wird das Ausmaß der Atrophie in den betroffenen
Muskeln analysiert, wie oben stehend für das Denervierungsmodell beschrieben.
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Knochenaktivität der betroffenen
Peptide kann praktisch unter Verwendung einer Prüfung gezeigt werden, die dafür ausgelegt
ist, die Fähigkeit
der betroffenen Verbindungen zu prüfen, Knochenvolumen, -masse oder
-dichte zu erhöhen.
Ein Beispiel solcher Prüfungen
ist die Prüfung
ovarektomierter Ratten.
-
In
der Prüfung
ovarektomierter Ratten werden sechs Monate alte Ratten ovarektomiert,
im Alter von 2 Monaten, und dann einmal täglich subkutan mit einer Testverbindung
dosiert. Bei Abschluss der Studie kann die Knochenmasse und/ oder
-dichte durch Dualenenergie-Röntgenabsorptiometrie
(DXA) oder periphere quantitative Computer-Tomographie (pQCT) oder
mikroberechnete Tomographie (mCT) gemessen werden. Als Alternative
können
statische und dynamische Histomorphometrie verwendet werden, um
die Erhöhung
bei Knochenvolumen oder -bildung zu messen.
-
Zusammensetzungen
-
Ein
weiterer Aspekt dieser Erfindung sind Zusammensetzungen, die umfassen:
(a) eine sichere und wirksame Menge eines Peptids der vorliegenden
Erfindung und (b) einen pharmazeutisch unbedenklichen Träger. Standardmäßige pharmazeutische
Formulierungstechniken werden verwendet, wie diejenigen, die in
Remington's Pharmaceutical
Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., neueste Ausgabe,
offenbart sind.
-
Eine „sichere
und wirksame Menge" bedeutet
eine Menge des Peptids der Erfindung, die ausreicht, um eine positive
Modifikation in dem zu behandelnden Leiden signifikant zu induzieren,
aber niedrig genug ist, um ernsthafte Nebenwirkungen (wie Toxizität, Reizung
oder allergische Reaktion) in einem Tier, vorzugsweise einem Säugetier,
mehr bevorzugt einer menschlichen Testperson, die dessen bedarf,
zu vermeiden, entsprechend einem angemessenen Nutzen-/Risikoverhältnis bei
der Anwendung auf Art und Weise dieser Erfindung. Die spezifische „sichere
und wirksame Menge" variiert
offensichtlich mit solchen Faktoren wie dem bestimmten zu behandelnden
Leiden, der körperlichen
Verfassung des Patienten, der Behandlungsdauer, der Art der Begleittherapie
(falls vorhanden), der spezifischen zu verwendenden Dosierungsform,
dem eingesetzten Träger, der
Löslichkeit
des Peptids darin und dem Dosierungsplan, der für die Zusammensetzung erwünscht ist.
Ein Fachmann kann die folgenden Belehrungen verwenden, um eine „sichere
und wirksame Menge" gemäß der vorliegenden
Erfindung zu bestimmen. Spilker B., Guide to Clinical Studies and
Developing Protocols, Raven Press Books, Ltd., New York, 1984, S.
7–13,
54–60;
Spilker B., Guide to Clinical Trials, Raven Press, Ltd., New York,
1991, S. 93–101;
Craig C. und R. Stitzel, Hrsg., Modern Pharmacology, 2. Auflage,
Little, Brown and Co., Boston, 1986, S. 127–33; T. Speight, Hrsg., Avery's Drug Treatment:
Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics,
3. Auflage, Williams and Wilkins, Baltimore, 1987, S. 50–56; R.
Tallarida, R. Raffa und P. McGonigle, Principles in General Pharmacology,
Springer-Verlag, New York, 1988, S. 18–20.
-
Zusätzlich zu
dem betreffenden Peptid enthalten die Zusammensetzungen des Erfindungsgegenstands
einen pharmazeutisch unbedenklichen Träger. Der Ausdruck „pharmazeutisch
unbedenklicher Träger", wie hier verwendet,
bedeutet einen oder mehrere verträgliche feste oder flüssige Füllstoffverdünnungsmittel oder
Verkapselungssubstanzen, die für
die Verabreichung an ein Tier, vorzugsweise ein Säugetier,
mehr bevorzugt einen Menschen geeignet sind. Der Begriff „verträglich", wie hier verwendet,
bedeutet, dass sich die Bestandteile der Zusammensetzungen mit dem
betroffenen Peptid und miteinander in einer Weise vermischen lassen,
dass keine Wechselwirkungen auftreten, die die pharmazeutische Wirksamkeit
der Zusammensetzung unter normalen Anwendungsbedingungen wesentlich
reduzieren würden.
Pharmazeutisch unbedenkliche Träger
müssen
natürlich
von einer ausreichend hohen Reinheit und ausreichend niedrigen Toxizität sein,
um sie für
die Verabreichung an das behandelte Tier, vorzugsweise ein Säugetier,
mehr bevorzugt einen Menschen geeignet zu machen.
-
Einige
Beispiele für
Substanzen, die als pharmazeutisch unbedenkliche Träger oder
Bestandteile davon dienen können,
sind: Zucker, wie Lactose, Glucose und Saccharose; Stärken, wie
Maisstärke
und Kartoffelstärke;
Cellulose und seine Derivate, wie Natriumcarboxymethylcellulose,
Ethylcellulose und Methylcellulose; pulverförmiges Tragant; Malz, Gelatine;
Talk; feste Schmiermittel, wie Stearinsäure und Magnesiumstearat; Calciumsulfat;
pflanzliche Öle,
wie Erdnussöl,
Baumwollsamenöl,
Sesamöl,
Olivenöl,
Maisöl
und Öl
des Theobroma; Polyole wie Propylenglycol, Glycerin, Sorbitol, Mannitol
und Polyethylenglycol; Alginsäure;
Emulgatoren wie Tweens®; Benetzungsmittel wie
Natriumlaurylsulfat; Färbemittel;
Geschmacksstoffe; Tablettiermittel, Stabilisatoren; Antioxidations mittel;
Konservierungsstoffe; pyrogenfreies Wasser; isotone Salzlösung und Phosphatpufferlösungen.
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Die
Wahl eines pharmazeutisch unbedenklichen Trägers, der zusammen mit der
betroffenen Verbindung zu verwenden ist, ist grundlegend durch die
Art bestimmt, wie das Peptid zu verabreichen ist.
-
Wenn
das betroffene Peptid zu injizieren ist, ist der bevorzugte pharmazeutisch
unbedenkliche Träger sterile,
physiologische Salzlösung
mit einem mit Blut verträglichen
kolloidalen Suspendiermittel, dessen pH-Wert auf etwa 7,4 eingestellt
wurde.
-
Insbesondere
umfassen pharmazeutisch unbedenkliche Träger zur systemischen Verabreichung
Zucker, Stärken,
Cellulose und ihre Derivate, Malz, Gelatine, Talk, Calciumsulfat,
pflanzliche Öle,
synthetische Öle,
Polyole, Alginsäure,
Phosphatpufferlösungen,
Emulgatoren, isotone Salzlösung
und pyrogenfreies Wasser. Bevorzugte Träger zur parenteralen Verabreichung
umfassen Propylenglycol, Ethyloleat, Pyrrolidon, Ethanol und Sesamöl. Vorzugsweise
umfasst der pharmazeutisch unbedenkliche Träger in Zusammensetzungen zur
parenteralen Verabreichung mindestens ungefähr 90 Gew.-% der Gesamtzusammensetzung.
-
Die
Zusammensetzungen dieser Erfindung werden vorzugsweise in Einheitsdosierungsform
bereitgestellt. Wie hier verwendet, ist eine „Einheitsdosierungsform" eine Zusammensetzung
dieser Erfindung, die eine Menge eines Formel (I)-Peptids enthält, die
gemäß guter
medizinischer Praxis für
die Verabreichung an ein Tier, vorzugsweise ein Säugetier,
mehr bevorzugt einen menschlichen Patienten in einer Einzeldosis
geeignet ist. Diese Zusammensetzungen enthalten vorzugsweise von
etwa 0,1 mg (Milligramm) bis etwa 1000 mg, mehr bevorzugt von etwa
0,5 mg bis etwa 500 mg, mehr bevorzugt von etwa 1 mg bis etwa 30
mg ein Peptid der Formel (I).
-
Die
Zusammensetzungen dieser Erfindung können in jeder beliebigen einer
Reihe von Formen vorliegen, die zum Beispiel für orale, rektale, örtliche,
nasale, okulare oder parenterale Verabreichung geeignet sind. Abhängig von
der speziellen gewünschten
Art der Verabreichung kann eine Vielzahl von pharmazeutisch unbedenklichen
Trägern,
die dem Stand der Technik entsprechen, verwendet werden. Diese umfassen
feste oder flüssige
Füllmittel,
Verdünnungsmittel,
hydrotrope Stoffe, oberflächenaktive
Mittel und Verkapselungssubstanzen. Optionale pharmazeutisch aktive
Substanzen können
enthalten sein, die im Wesentlichen nicht die CRF2R-Agonistenaktivität der Peptide
der Formel (I) stören.
Die Menge an Träger,
der zusammen mit dem Peptid der Formel (I) eingesetzt wird, reicht
aus, um eine praktische Menge an Substanz zur Verabreichung pro
Einheitsdosis des Peptids der Formel (I) bereitzustellen. Techniken
und Zusammensetzungen zur Herstellung von Dosierungsformen, die
in den Verfahren dieser Erfindung nützlich sind, sind in den folgenden
Referenzen beschrieben: Modern Pharmaceutics, Kapitel 9 und 10 (Banker & Rhodes, Herausgeber,
1979); Lieberman et al., Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets (1981);
und Ansel, Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms 2. Ausgabe
(1976).
-
Es
können
verschiedene orale Dosierungsformen verwendet werden, einschließlich solcher
fester Formen wie Tabletten, Kapseln, Granalien und Schüttgut. Diese
oralen Formen umfassen eine sichere und wirksame Menge, in der Regel
mindestens ungefähr
5% und vorzugsweise von ungefähr
25% bis ungefähr
50% Peptid. Tabletten können
komprimiert, Tablettenpulver, säureresistent überzogen,
mit Zuckerguss überzogen, mit
einer Schicht überzogen
oder mehrfachkomprimiert sein und geeignete Bindemittel, Schmiermittel,
Verdünnungsmittel,
Aufschlussmittel, Farbstoffe, Geschmackszusätze, Verlaufmittel und Schmelzmittel
enthalten. Flüssige
orale Dosierungsformen umfassen wässrige Lösungen, Emulsionen, Suspensionen,
Lösungen und/oder
Suspensionen, die von nicht sprudelnden Granalien zur ursprünglichen
Konzentration gelöst
wurden, und sprudelnde Zubereitungen, die von Sprudelgranalien zur
ursprünglichen
Konzentration gelöst
wurden, die geeignete Lösungsmittel,
Konservierungsstoffe, Emulgatoren, Suspendiermittel, Verdünnungsmittel,
Süßstoffe,
Schmelzmittel, Farbstoffe und Geschmackszusätze enthalten.
-
Der
pharmazeutisch unbedenkliche Träger,
der für
die Herstellung der Einheitsdosierungsform für perorale Verabreichung geeignet
ist, entspricht dem Stand der Technik. Tabletten umfassen üblicherweise
herkömmliche
pharmazeutisch verträgliche
Adjuvantien wie inerte Verdünnungsmittel,
wie Calciumcarbonat, Natriumcarbonat, Mannitol, Lactose und Cellulose;
Bindemittel wie Stärke,
Gelatine und Saccharose; zersetzende Wirkstoffe wie Stärke, Alginsäure und
Croscarmelose; Schmiermittel wie Magnesiumstearat, Stearinsäure und
Talk. Fließregulierungsmittel
wie Siliziumdioxid können
verwendet werden, um die Fließeigenschaften
der Pulvermischung zu verbessern. Farbstoffe, wie die FD&C-Farbstoffe,
können
für das
Aussehen hinzugefügt werden.
Süßstoffe
und Geschmackszusätze,
wie Aspartam, Saccharin, Menthol, Pfefferminz und Fruchtgeschmacksstoffe
sind nützliche
Adjuvantien für
Kautabletten. Kapseln umfassen üblicherweise
ein oder mehrere feste, oben stehend offenbarte Verdünnungsmittel.
Die Auswahl von Trägerkomponenten
hängt von
sekundären Überlegungen
wie Geschmack, Kosten und Lagerstabilität ab, die für die Zwecke des Erfindungsgegenstands
nicht von wesentlicher Bedeutung sind, und kann problemlos von einem
Fachmann getroffen werden. Im Allgemeinen schließt die Formulierung das Peptid
und inerte Bestandteile ein, die einen Schutz gegen die Magenumgebung
und die Freisetzung der biologisch aktiven Substanzen im Darm ermöglichen.
-
Das
Peptid der Formel (I) kann chemisch so modifiziert sein, dass orale
Abgabe des Derivats wirksam ist. Im Allgemeinen ist die betrachtete
chemische Modifizierung das Anfügen
von mindestens einer Einheit an das Proteinmolekül selbst, wobei die Einheit
(a) Hemmung der Proteolyse und (b) Aufnahme in den Blutkreislauf
vom Magen oder Darm ermöglicht.
Auch gewünscht
ist die Erhöhung
der allgemeinen Stabilität
des Proteins und Erhöhung
der Zirkulationszeit im Körper.
Beispiele solcher Einheiten sind unter anderem: Polyethylenglycol,
Copolymere von Ethylenglycol und Propylenglycol, Carboxymethylcellulose,
Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon und Polyprolin. Newmark
et al., J. Appl. Biochem., 4:185–189 (1982). Andere Polymere,
die verwendet werden könnten,
sind Poly-1,3-dioxolan und Poly-1,3,6-tioxocan. Bevorzugt für die pharmazeutische
Verwendung sind, wie oben stehend angegeben, Polyethylenglycol-Einheiten.
-
Der
Ort der Freisetzung kann der Magen, der Dünndarm (der Zwölffingerdarm,
der Jejunum oder der Ileum) oder der Dickdarm sein. Einem Fachmann
stehen Formulierungen zur Verfügung,
die sich nicht im Magen lösen,
jedoch das Material im Zwölffingerdarm
oder anderswo im Darm freisetzen. Vorzugsweise vermeidet die Freisetzung
schädliche
Wirkungen der Magenumgebung, entweder durch Schutz des Peptids (oder
der Variante) oder durch Freisetzung der biologisch aktiven Substanz
außerhalb
der Magenumgebung, wie im Darm.
-
Um
vollständigen
gastrischen Widerstand zu gewährleisten,
wird eine Beschichtung bevorzugt, die bis mindestens pH 5,0 undurchlässig ist.
Beispiele der üblicheren
inerten Bestandteile, die als enterale Beschichtungen verwendet
werden, sind Celluloseacetattrimellitat (CAT), Hydroxypropylmethylcellulosephthalat
(HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, Polyvinylacetatphthalat (PVAP), Eudragit
L30D, Aquateric, Celluloseacetatphthalat (CAP), Eudragit L, Eudragit
S und Schellack. Diese Beschichtungen können als gemischte Schichten verwendet
werden.
-
Perorale
Zusammensetzungen schließen
außerdem
flüssige
Lösungen,
Emulsionen, Suspensionen und dergleichen ein. Die pharmazeutisch
unbedenklichen Träger,
die für
die Herstellung solcher Zusammensetzungen geeignet sind, entsprechen
dem Stand der Technik. Typische Bestandteile von Trägern für Sirupe, Elixiere,
Emulsionen und Suspensionen schließen Ethanol, Glycerol, Propylenglycol,
Polyethylenglycol, flüssige
Saccharose, Sorbit und Wasser ein. Für eine Suspension schließen typische
Suspendiermittel Methylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose,
Avicel® RC-591,
Tragant und Natriumalginat ein; typische Benetzungsmittel schließen Lecithin
und Polysorbat 80 ein und typische Konservierungsstoffe schließen Methylparaben und
Natriumbenzoat ein. Perorale flüssige
Zusammensetzungen können
auch einen oder mehrere Bestandteile wie Süßstoffe, Geschmackszusätze und
Farbstoffe, die oben stehend offenbart sind, enthalten.
-
Zusammensetzungen
des Erfindungsgegenstands können
wahlweise andere Wirkstoffe einschließen. Nicht beschränkende Beispiele
von Wirkstoffen sind in WO 99/15210 aufgeführt.
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Andere
Zusammensetzungen, die nützlich
für das
Erreichen systemischer Abgabe der betreffenden Verbindungen sind,
schließen
sublinguale, bukkale, Suppositorium-, nasale und pulmonale Dosierungsformen ein.
Solche Zusammensetzungen schließen üblicherweise
eine oder mehrere lösliche
Füllsubstanzen
wie Saccharose, Sorbit und Mannitol ein und Bindemittel wie Akaziengummi,
mikrokristalline Cellulose, Carboxymethylcellulose und Hydroxypropylmethylcellulose.
Fließregulierungsmittel,
Schmiermittel, Süßstoffe,
Farbstoffe, Antioxidationsmittel und Geschmackszusätze, die
oben stehend offenbart sind, können
auch enthalten sein.
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Die
Zusammensetzungen dieser Erfindung können auch topisch einem Patienten
verabreicht werden, z. B. durch direktes Auflegen oder Verteilen
der Zusammensetzung auf das epiderme oder Epithelgewebe des Patienten
oder über
die Haut durch ein „Pflaster". Ein Beispiel eines
geeigneten Pflasterapplikators ist in WO 02/47593 beschrieben. Solche
Zusammensetzungen umfassen zum Beispiel Lotionen, Cremes, Lösungen, Gele
und Feststoffe. Diese örtlichen
Verbindungen umfassen vorzugsweise eine sichere und wirksame Menge, in
der Regel mindestens ungefähr
0,1% und vorzugsweise von ungefähr
1% bis ungefähr
5% Peptid. Geeignete Träger
zur örtlichen
Verabreichung bleiben vorzugsweise als durchgehender Film an Ort
und Stelle auf der Haut und sind gegen die Entfernung durch Transpiration
oder Eintauchen in Wasser beständig.
Generell ist der Träger
organischer Natur und kann das Peptid darin dispergiert oder gelöst ha ben.
Der Träger
kann pharmazeutisch unbedenkliche Weichmacher, Emulgatoren, Verdickungsmittel,
Lösungsmittel
und dergleichen enthalten.
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Methoden der
Verabreichung
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Diese
Erfindung befasst sich auch mit der Verwendung eines erfindungsgemäßen Peptids
in der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von CRF2R-modulierten
Störungen
in menschlichen oder anderen tierischen Patienten durch Verabreichen
einer sicheren und wirksamen Menge eines Peptids an den Patienten.
Solche Störungen
sind oben stehend beschrieben.
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Zusammensetzungen
dieser Erfindung können örtlich oder
systemisch verabreicht werden. Systemische Anwendung schließt eine
beliebige Methode der Einführung
eines Peptids der Formel (I) in die Gewebe des Körpers ein, z. B. intraartikuläre (besonders
bei Behandlung von rheumatoider Arthritis), intrathekale, epidurale,
intramuskuläre,
transdermale, intravenöse,
intraperitoneale, subkutane, nasale, pulmonale, sublinguale, rektale
und orale Verabreichung.
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Die
spezifische Dosierung des zu verabreichenden Peptids sowie die Dauer
der Behandlung und ob die Behandlung topisch oder systemisch ist,
sind voneinander abhängig.
Die Dosierung und der Behandlungsplan hängen außerdem von solchen Faktoren
wie dem spezifischen verwendeten Peptid, der Behandlungsindikation,
der Fähigkeit
des Peptids, minimale Hemmkonzentrationen am Ort des der Behandlung
bedürftigen Gewebes
zu erreichen, den persönlichen
Attributen des Patienten (wie Gewicht), Einhaltung des Behandlungsplans
und das Vorliegen und der Stärke
von Nebenwirkungen der Behandlung ab.
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Örtliche
Verabreichung kann verwendet werden, um das Peptid systemisch bereitzustellen
oder um einen Patienten lokal zu behandeln. Die örtlich zu verabreichende Peptidmenge
hängt von
solchen Faktoren wie Hautempfindlichkeit, Art und Lage des zu behandelnden
Gewebes, der Zusammensetzung und dem Träger (falls vorhanden), die
verabreicht werden sollen, dem spezifischen zu verabreichenden Peptid
sowie der spezifischen zu behandelnden Störung und dem Aus maß, zu dem
systemische (im Gegensatz zu örtlichen) Wirkungen
erwünscht
sind, ab.
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Die
Peptide der vorliegenden Erfindungen können durch die Verwendung von
Zielliganden auf spezifische Orte ausgerichtet werden, wo die Behandlung
benötigt
wird. Um zum Beispiel ein Peptid zu fokussieren, um Muskeldystrophie
zu behandeln, wird das Peptid an einen Antikörper oder ein Fragment davon
gebunden, der mit einer Skelettmuskelmarkierung immunoreaktiv ist,
wie allgemein dem Stand der Technik nach bekannt ist. Der auf eine
Zielstruktur gerichtete Ligand kann auch ein Ligand sein, der für einen
Rezeptor geeignet ist, der auf Skelettmuskeln vorliegt. Jeder auf
eine Zielstruktur gerichtete Ligand, der spezifisch mit einer Markierung
für das
beabsichtigte Zielgewebe reagiert, kann verwendet werden. Methoden
für die
Kopplung der Erfindungsverbindung an den Zielliganden sind gut bekannt
und ähneln
den unten beschriebenen für
die Kopplung an einen Träger.
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Ein
Peptid der Formel (I) kann über
eine gesteuerte Freisetzung verabreicht werden. Das Peptid kann beispielsweise
mithilfe intravenöser
Infusion, einer implantierbaren osmotischen Pumpe, einem transdermalen Pflaster,
Liposomen, subkutaner Depotinjektion, die ein biologisch abbaubares
Material enthält,
oder andere Modi der Verabreichung verabreicht werden. In einer
Ausführungsform
kann eine Pumpe verwendet werden, Langer et al., eds., Medical Applications
of Controlled Release, CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Sefton, CRC
Crit. Ref. Biomed. Eng., 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery,
88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med., 321:574 (1989).
In einer anderen Ausführungsform
können
Polymermaterialien verwendet werden. Langer, 1974, supra; Sefton,
1987, supra; Smolen et al., Hrsg., Controlled Drug Bioavailability,
Drug Product Design and Performance, Wiley, N.Y. (1984); Ranger
et al., J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem., 23:61 (1983); siehe
auch Levy et al., Science, 228:190 (1985); During et al., Ann. Neurol.,
25:351 (1989); Howard et al., J. Neurosurg., 71:105 (1989). In noch
einer anderen Ausführungsform
kann ein gesteuertes Freisetzungssystem in der Nähe des therapeutischen Ziels
positioniert werden, wodurch es nur eine Fraktion der systemischen
Dosis benötigt.
Siehe z. B. Goodson, in Medical Applications of Controlled Release,
Band 2, S. 115–138 (1984).
In noch einer anderen Ausführungsform
ein Arzneibereitstellungssystem auf Polymerbasis, wobei Medikamente
von Polymer- oder Lipidsystemen geliefert werden. Diese Systeme
liefern ein Medikament durch drei allgemeine Mechanismen: (1) Diffusion
der Arzneispezies von oder durch das System; (2) eine chemische oder
enzymatische Reaktion, die zur Degradation des Systems oder Spaltung
des Medikaments vom System führt,
und (3) Lösungsmittelaktivierung,
entweder durch Osmose oder Anschwellen des Systems. Geeignete Systeme
sind in den folgenden Überblickartikeln
beschrieben: Langer, Robert, „Drug
delivery and targeting", Nature:
392 (Supp):5–10
(1996); Kumar, Majeti N. V., „Nano
and Microparticles as Controlled Drug Delivery Devices", J Pharm Pharmaceut
Sci, 3(2):234–258
(2000); Brannon-Peppas, „Polymers
in Controlled Drug Delivery",
Medical Plastics and Biomaterials, (Nov. 1997). Siehe auch Langer,
1990, supra; Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious
Disease and Cancer, Lopez-Berestein und Fidler (Hrsg.), Liss, New
York, S. 353–365
(1989); Langer, Science, 249:1527–1533 (1990). Geeignete Systeme
können
einschließen:
AtrigelTM Arzneibereitstellungssystem von
Atrix Labs; DepoFoamTM von SkyPharma; Hydrogele
auf Polyethylenglycolbasis von Infimed Therapeutics, Inc.; ReGelTM, orales SQZGeITM,
HySolvTM und ReSolvTM lösungsvermittelnde
Arzneibereitstellungssysteme von MacroMed; ProGelzTM von
ProGelz' Products
und einspritzbares ProLeaseTM von Alkermes.
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In
allen oben genannten Fällen
können
die Peptide der Erfindung natürlich
alleine oder als Mischungen verabreicht werden und die Zusammensetzungen
können
ferner zusätzliche
Medikamente oder Arzneimittelträger
einschließen,
wie für
die Indikation angemessen.
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Gentherapie
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Expressionsvektoren
können
verwendet werden, um die Nucleinsäuren der Erfindung in eine
Zelle als Teil der Gentherapie einzuleiten. Solche Vektoren haben im
Allgemeinen geeignete Restriktionsorte, die sich in der Nähe der Promotorsequenz
befinden, um das Einfügen
von Nucleinsäuresequenzen
zu ermöglichen. Transkriptionskassetten
können
hergestellt werden, die eine Transkriptions-Initiierungsregion,
das Zielgen oder ein Fragment davon und eine Transkriptions-Terminierungsregion
umfassen. Die Transkriptionskassetten können in eine Vielzahl von Vektoren
eingeleitet werden, z. B. Plasmid, Retrovirus, Lentivirus, Adenovirus
und dergleichen, wobei die Vektoren in den Zellen vorübergehend
oder stabil erhalten werden können,
normalerweise für
eine Dauer von mindestens einem Tag, üblicher für eine Dauer von mindestens
etwa mehreren Tagen bis mehreren Wochen.
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Die
Proteine und Nucleinsäuren
der Erfindung können
in Gewebe oder Wirtszellen durch eine beliebige Zahl von Routen
eingeleitet werden, einschließlich
viraler Infektion, Mikroinjektion oder Fusion von Blasen. Strahlinjektion
kann auch für
intramuskuläre
Verabreichung verwendet werden, wie beschrieben von Furth et al.,
Anal. Biochem., 205:365–368
(1992). Die DNA kann auf Goldmikropartikel geschichtet und intradermal durch
eine Partikelbeschussvorrichtung oder „Genpistole" geliefert werden,
wie in der Literatur beschrieben. Siehe z. B. Tang et al., Nature
356:152–154
(1992), wo Goldmikroprojektile mit DNA überzogen und dann in Hautzellen
bombardiert werden.
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Sets
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Die
Peptide der vorliegenden Erfindung können in einem Set zur Verhinderung
oder Behandlung einer CRF2R-modulierten
Störung
aufgenommen sein, umfassend: (a) ein Peptid der Formel (I) in einer
Einheitsdosisform und (b) Gebrauchsanweisungen. Solch ein Set schließt vorzugsweise
eine Reihe von Einheitsdosen ein. Solche Sets können eine Karte mit Dosen enthalten,
die in der Reihenfolge ihrer beabsichtigten Verwendung angeordnet
sind. Ein Beispiel eines solchen Sets ist eine „Blisterpackung". Blisterpackungen
sind in der Verpackungsindustrie gut bekannt und werden vielfach
für die
Verpackung von pharmazeutischen Einheitsdosisformen verwendet. Wenn
gewünscht,
kann eine Gedächtnisstütze bereitgestellt
werden, beispielsweise in der Form von Zahlen, Buchstaben oder anderen
Markierungen oder mit einer Kalendereinlage, die die Tage im Behandlungsplan
zeigt, an denen die Dosen verabreicht werden können. Ein Beispiel eines Sets
ist in WO 01/45636 beschrieben. Behandlungspläne liegen innerhalb des Aufgabenbereichs
von medizinischen Fachleuten. Nicht beschränkende Beispiele schließen einmal
täglich,
wöchentlich,
zweiwöchentlich,
monatlich oder zweimonatlich ein.
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BEISPIELE
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Beispiel 1
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Savagin
und andere nichtselektive CRFR-Agonisten sind im Allgemeinen nicht
effektiv bei der Behandlung von CRF2R-modulierten
Störungen,
da diese Agonisten auch CRF1R aktivieren
und dadurch zu ungewünschten
Nebenwirkungen führen.
Tabelle 2 zeigt komparative CRF-Bindung für native Sequenzfragmente von
menschlichem Urocortin I (hUcnI), menschlichem Urocortin II (hUroII),
menschlichem Urocortin III (hUroIII), menschlichem Corticotropin
Releasing Factor (hCRF), Schaf-Corticotropin (oCRF) und Savagin
(Svg), bezeichnet als SEQ-ID Nr.: 2, 4, 6, 8, 10 bzw. 11.
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Beispiel 2
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Tabelle
3 zeigt komparative CRF-Bindung von verschiedenen Ausführungsformen
der Erfindung.
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Beispiel 3
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Erhöhte In Vivo-Wirksamkeit
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Die
Peptide der vorliegenden Erfindung zeigen erweiterte biologische
Verfügbarkeit,
insbesondere unter Bedingungen niedriger Dosierung, im Vergleich
zu bekannten nativen Sequenzen, z. B. UroII-Peptidfragment (SEQ-ID
Nr.: 4).
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Die
Halbwertzeit eines Peptids in einem Patienten kann beispielsweise
durch hochleistungsfähige Flüssigchromatographie
(HPLC) von Serumproben bestimmt werden, die vom Patienten zu verschiedenen Zeitpunkten
nach Verabreichung des Peptids abgenommen wurden. Ein Fachmann würde wissen,
wie geeignete Elutionspuffer für
HPLC auf Grundlage der physicochemischen Eigenschaften eines bestimmten
Peptids auszuwählen
sind.
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Ein
nicht beschränkendes
Beispiel einer in vivo-Untersuchung zur Bestimmung der Wirksamkeit
ist hier beschrieben. Mäuse
werden durch intravenöse
(IV) (1000 μg/kg)
und subkutane (SC) (1000 μg/kg)
Routen mit einem Peptid der Formel (I) dosiert. Blutproben werden
zu verschiedenen Zeitpunkten (IV = 0, 2, 10, 30 min und 1, 2, 4
und 6 Std. und SC = 0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4 und 6 Std.) nach Dosierung
in Mikrozentrifugenröhrchen abgenommen,
die Natriumheparin ent halten. Die Blutproben werden weiter verarbeitet,
um Plasma zu erhalten, das bis zur Analyse bei –70°C gelagert wird.
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Plasmastandards
werden hergestellt. Aufstocklösung
eines Peptids der Formel (I), die einen Konzentrationsbereich von
50 ng/ml bis 100 μg/ml
abdeckt, wird am Analysetag in Methanol durch serielle Verdünnung einer
zuvor hergestellten methanolischen Aufstocklösung von 1 mg/ml Peptid der
Formel (I) hergestellt. Auf ähnliche
Weise wird die Aufstocklösung
des internen Standards (ISTD), stabiles Isotop mit der Markierung h-Unc-II,
durch serielle Verdünnung
einer gelagerten 1 mg/ml ISTD-Aufstocklösung hergestellt, um eine abschließende Konzentration
von 5 μg/ml
am Tag der Analyse zu erhalten. Arbeitsplasmastandards, die einen Massebereich
von 0,5 bis 100 ng abdecken, werden durch Zugeben von 10 μL der entsprechenden
Aufstocklösung
des Peptids der Formel (I) in Röhrchen
erreicht, die bereits 10 μL
einer 5 μg/mL
ISTD-Lösung,
100 μL dd-Wasser
und 100 μl
Rattenplasma-Blindprobe enthalten. Die Arbeitsstandards werden für die Analyse
wie unten stehend beschrieben hergestellt.
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Qualitätskontrollproben
(QC) werden hergestellt. Eine QC-Stammlösung wird mit der 50 ng/ml
Konzentration durch Zugeben von 25 μl einer 1 μg/ml Aufstocklösung des
Peptids der Formel (I) in eine 475 μl Blindprobe aus heparinisertem
Rattenplasma hergestellt, das in einem Plastikfläschen enthalten ist. QC-Arbeitsproben
werden durch Hinzufügen
von 100 μl
der QC-Stammlösung
(50 ng/ml) in Röhrchen
hergestellt, die bereits 10 μl
einer 5 μg/ml
ISTD-Lösung
und 100 μl
dd-Wasser enthalten. Die QC-Arbeitsprobe wurde für die Analyse wie unten stehend
beschrieben hergestellt.
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Untersuchungsproben
werden hergestellt. Am Tag der Analyse werden die Proben bei Raumtemperatur
aufgetaut und ein Aliquot der Probe wurde zu einem Röhrchen gegeben,
das bereits 10 μl
einer 5 μg/ml ISTD-Lösung, 100 μl dd-Wasser und ein Aliquot
einer heparinisierten Rattenplasma-Blindprobe enthält. Das Volumen
der Probe und der Rattenplasma-Blindprobe sind so, dass das Gesamtvolumen
des Plasmas gleich 100 μl
ist.
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Die
Arbeitsstandards, QC-Arbeitsproben und Untersuchungsproben werden
für die
Analyse durch Hinzufügen
von 400 μl
Acetonitril zu Röhrchen,
die diese jeweils enthalten, Verkappen, Verwirbeln, Zentrifugieren und
Isolieren des Überstands
hergestellt. Ein Aliquot (300 μl)
des Überstands
wird unter N2 getrocknet und in 50 μL Methanol/Wasser
(50/50) rekonstituiert.
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Die
hergestellten Arbeitsstandards, QC-Arbeitsproben und Untersuchungsproben
werden durch Separation mit hochleistungsfähiger Gradienten-Umkehrphasen-Flüssigchromatographie
(RP-HPLC) gefolgt von Probeneinleitung durch Elektron-Sprühionisierung
(ESI) mit Massenspektroskopie/Massenspektroskopie-(MS/MS-) Erkennung
unter Verwendung von Selected Reaction Monitoring (SRM) im positiven
Ionenmodus analysiert. Ein SRM-Kanal wird für h-Unc-II und den ISTD beobachtet.
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Die
Dosislösungen
von der pharmakokinetischen Studie werden mit Methanol verdünnt und
durch RP-HPLC mit Ultravioletterkennung analysiert. Die Konzentrationen
des Peptids der Formel (I) in den Dosislösungen werden durch Interpolation
von einer linearen Regressionskurve errechnet, die nach bekannten Standards
erstellt wird.
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