ES2287484T3 - Agonistas del receptor del factor liberador 2 de la corticotropina. - Google Patents

Abstract

Un péptido no natural que comprende la secuencia -ZGPPISIDLPX12X13LLRKX18IEIEKQEKEKQQAX32X33NAX36X37LX39X40X41 en donde: a) X12 se selecciona de F, Y, L, I y T; b) X13 se selecciona de Q, W e Y; c) X18 se selecciona de V y M; d) X32 se selecciona de T y A; e) X33 se selecciona de N y T; f) X36 se selecciona de R y L; g) X37 se selecciona de L e I; h) X39 se selecciona de D y A; i) X40 se selecciona de T y R; y j) X41 se selecciona de I y V; o variantes del mismo que tienen al menos 95% de identidad con la secuencia, siendo dichas variantes agonistas de CRF2R.

Description

Agonistas del receptor del factor liberador 2 de la corticotropina.

Campo de la invención

Esta invención se refiere al uso de nuevos péptidos y ácidos nucleicos que codifican los mismos, para tratar trastornos modulados por CRF_{2}R.

Antecedentes de la invención Receptores del factor liberador de la corticotropina (CRFR) y ligandos

Existen al menos dos receptores del CRF (factor liberador de la corticotropina) identificados hasta la fecha (CRF_{1}R y CRF_{2}R) que pertenecen a la clase de los receptores acoplados a la proteína G (GPCR). La activación agonista de los CRF_{1}R o CRF_{2}R conduce a la activación de la adenilatociclasa por G_{\alpha s}. La adenilatociclasa cataliza la formación de AMPc que, a su vez, tiene múltiples efectos incluyendo la activación de la proteína cinasa A, la liberación de calcio intracelular y la activación de la proteína cinasa activada por mitógenos (MAP cinasa). En otros estudios, la mejora de la síntesis intracelular de inositol trifosfato, tras la activación agonista de los receptores del CRF, sugiere que los CRFR también se acoplan a la proteína G_{\alpha q}.

Se han clonado CRF_{1}R y CRF_{2}R de humanos, ratas, ratones, pollos, vacas, bagres, ranas y ovejas. Cada CRF_{1}R y CRF_{2}R tiene un único patrón de distribución. En humanos se han clonado tres isoformas, alfa, beta y gamma, del receptor CRF_{2}R. Se han identificado homólogos de CRF_{2}R alfa y beta en ratas.

Se conocen diversos ligandos/agonistas de los CRFR e incluyen factor liberador de corticotropina (u hormona, CRF, CRH), urocortina I, urocortina II (o péptido relacionado con stresscopina), urocortina III (o stresscopina), urotensina I, sauvagina y otros péptidos relacionados. El factor liberador de corticotropina se une y activa los CRF_{1}R y CRF_{2}R. El CRF es un modulador principal de las respuestas corporales frente al estrés. Este péptido de 41 aminoácidos preside una colección de procesos neuronales, endocrinos e inmunológicos como regulador principal del eje hormonal hipotálamo-pituitario-suprarrenal (eje HPA). Además, existe una considerable homología secuencial entre todos los ligandos conocidos del CRFR. Además, se han identificado dos ligandos selectivos del CRF_{2}R, la urocortina II (o péptido relacionado con la stresscopina) y la urocortina III (stresscopina). Se han identificado estos péptidos en numerosas especies de mamíferos y peces.

Farmacológicamente, los receptores del CRF se pueden distinguir de los no receptores del CRF a través del uso de agonistas y antagonistas selectivos del receptor. Estos agonistas y antagonistas selectivos, junto con los ratones con el CRFR anulado, han sido útiles para determinar el receptor del CRF que media en una respuesta biológica particular.

El papel del CRF_{1}R ha sido bastante bien establecido. Los ratones con ablación del gen CRF_{1}R (CRF_{1}R desactivado) demuestran una respuesta al estrés disminuida y un reducido comportamiento ansiogénico. El CRF_{1}R es un mediador principal del eje HPA. Específicamente, el CRF que se libera del hipotálamo y se transporta a la pituitaria anterior a través del sistema portal hipotalámico-hipofisiario interactúa con el CRF_{1}R presente en las células localizadas en la pituitaria anterior. La activación agonista del CRF_{1}R da lugar a la liberación de ACTH de las células de la pituitaria anterior a la circulación sistémica. La ACTH liberada se une al receptor de la ACTH presente en las células localizadas en la corteza suprarrenal, ocasionando la liberación de hormonas suprarrenales incluyendo corticosteroides. Los corticosteroides median en numerosos efectos incluyendo, aunque no de forma limitativa, la supresión del sistema inmune a través de un mecanismo que implica atrofia tímica y esplénica. Así, la activación del CRF_{1}R da lugar indirectamente a la regulación negativa del sistema inmunológico a través de la activación del eje HPA.

El papel del CRF_{2}R no está tan bien establecido. Los ratones con ablación del gen CRF_{2}R (CRF_{2}R desactivado) demuestran una menor o reducida ingesta de alimentos después de la estimulación con urocortina, falta de vasodilatación, pero una respuesta al estrés normal. Los experimentos con CRF_{2}R demuestran que el CRF_{2}R es responsable de los efectos hipotensores/vasodilatadores de los agonistas del CRFR y de la reducción de la ingesta de alimentos observada tras el tratamiento de ratones con agonistas del CRFR.

Atrofia e hipertrofia del músculo esquelético

Asimismo, el CRF_{2}R está relacionado con la modulación de la atrofia del músculo esquelético y la inducción de la hipertrofia. El músculo esquelético es un tejido plástico que se adapta fácilmente a los cambios de cada demanda fisiológica por necesidades de trabajo o metabólicas. La hipertrofia se refiere a un incremento de la masa del músculo esquelético mientras que la atrofia del músculo esquelético se refiere a una disminución de la masa de músculo esquelético. La atrofia del músculo esquelético aguda se puede deber a diversas causas incluyendo, aunque no de forma limitativa: desuso debido a cirugía, reposo en cama o rotura de huesos; denervación/daño nervioso debido a lesión de la médula espinal, enfermedad autoinmune o enfermedad infecciosa; uso de glucocorticoides para condiciones no relacionadas; septicemia debida a infecciones u otras causas; limitación de nutrientes debido a enfermedad o inanición; y viaje espacial. La atrofia del músculo esquelético se produce durante procesos biológicos normales aunque, en ciertas situaciones médicas, este proceso biológico normal da lugar a un nivel debilitante de atrofia muscular. Por ejemplo, la atrofia del músculo esquelético aguda presenta una limitación significativa para la rehabilitación de pacientes de inmovilizaciones incluyendo, aunque no de forma limitativa, los inmovilizadores que acompañan un procedimiento ortopédico. En tales casos, el período de rehabilitación necesario para corregir la atrofia del músculo esquelético es a menudo mayor que el período de tiempo necesario para reparar la lesión original. Dicha atrofia de desuso aguda es un problema particular en las personas mayores que pueden sufrir ya de déficits básicos relacionados con la edad en la función y masa muscular, porque dicha atrofia puede conducir a incapacidad permanente y mortalidad
prematura.

La atrofia del músculo esquelético también puede dar lugar a condiciones crónicas como caquexia por cáncer, inflamación crónica, caquexia por SIDA, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), insuficiencia cardíaca congestiva, trastornos genéticos, p. ej., distrofias musculares, enfermedades neurodegenerativas y sarcopenia (pérdida muscular asociada con la edad). En estas condiciones crónicas, la atrofia del músculo esquelético puede conducir a una pérdida prematura de movilidad, añadiéndose por tanto a la morbilidad relacionada con enfermedades.

Se sabe poco con respecto a los procesos moleculares que controlan la atrofia o hipertrofia del músculo esquelético Aunque el disparador inicial de la atrofia del músculo esquelético es diferente para los diversos eventos iniciadores de atrofia, ocurren varios cambios bioquímicos comunes en la fibra de músculo esquelético afectada, incluyendo un descenso de la síntesis de proteínas y un aumento de la degradación de proteínas, y cambios en las isoenzimas de proteínas enzimas contráctiles y metabólicas característicos de un intercambio muscular lento (metabolismo muy oxidante/isoformas de proteínas contráctiles lentas) a rápido (metabolismo muy glicolítico/isoformas de proteínas contráctiles rápidas). Los cambios del músculo esquelético adicionales que ocurrirán incluyen la pérdida de vasculatura y el remodelado de la matriz extracelular. Tanto el intercambio lento como el intercambio rápido muscular muestran atrofia en condiciones apropiadas, con la correspondiente pérdida muscular dependiendo de los estímulos o condiciones de atrofia específicos. En gran medida, todos estos cambios se regulan coordenadamente y se activan o desactivan en función de los cambios en las necesidades fisiológicas y metabólicas.

Los procesos por los que ocurre atrofia o hipertrofia se conservan a través de las especies de mamíferos. Muchos estudios han demostrado que los mismos procesos moleculares, celulares y fisiológicos se producen durante la atrofia tanto en roedores como en humanos. Así, los modelos de atrofia del músculo esquelético en roedores se han utilizado con éxito para comprender y predecir respuestas de atrofia en humanos. Por ejemplo, la atrofia inducida por diversos medios tanto en roedores como en humanos da lugar a cambios similares en la anatomía muscular, el área de sección transversal, la función, el tipo de fibra de intercambio, la expresión de las proteínas contráctiles y la histología. Además, se ha demostrado que diversos agentes regulan la atrofia del músculo esquelético en roedores y humanos. Estos agentes incluyen esteroides anabólicos, hormona del crecimiento, factor de crecimiento I de tipo insulina, agonistas beta adrenérgicos y agonistas del CRF_{2}R. En su conjunto, estos datos demuestran que la atrofia del músculo esquelético resulta de mecanismos comunes tanto en roedores como en humanos.

Aunque se ha mostrado que algunos agentes regulan la atrofia del músculo esquelético y han sido aprobados para usar en humanos con esta indicación, estos agentes tienen efectos adversos no deseables tales como hipertrofia del músculo cardíaco, neoplasia, hirsutismo, androgenización femenina, morbilidad y mortalidad aumentada, daños hepáticos, hipoglicemia, dolor musculoesquelético, aumento del turgor de los tejidos, taquicardia y edema. Actualmente, no existen tratamientos muy eficaces y selectivos para la atrofia del músculo esquelético aguda o crónica. Por lo tanto, sigue siendo necesario identificar otros agentes terapéuticos para tratar la atrofia del músculo esquelético.

Distrofias musculares

Las distrofias musculares abarcan un grupo de trastornos musculares hereditarios y progresivos que se distinguen clínicamente por la distribución selectiva de la debilidad del músculo esquelético. Las dos formas más comunes de distrofia muscular son las distrofias de Duchenne y de Becker, que resultan de la herencia de una mutación del gen de la distrofina, que está situado en el locus Xp21. Otras distrofias incluyen, aunque no de forma limitativa, distrofia muscular de Limb-girdle (distrofia de cinturas), debida a la mutación de múltiples loci génicos que incluye los loci de la calpaína p94, adhalina, \gamma-sarcoglucano y \beta-sarcoglucano; distrofia muscular fascioescapulohumeral (Landouzy-Dejerine), distrofia miotónica y distrofia muscular de Emery-Dreifuss. Los síntomas de la distrofia muscular de Duchenne que ocurre casi exclusivamente en hombres, incluyen marcha de pato, caminar en puntillas, lordosis, caídas frecuentes y dificultad para subir escaleras. Los síntomas comienzan a la edad de 3 a 7 años con la mayoría de los pacientes confinados a una silla de ruedas al cabo de 10-12 años y muchos mueren a la edad de aproximadamente 20 años debido a complicaciones respiratorias. El tratamiento actual de la distrofia muscular de Duchenne incluye la administración de prednisona (un fármaco corticosteroide) que, aunque no cura, ralentiza la disminución de fuerza muscular y retrasa la incapacidad. Se cree que los corticosteroides, tales como la prednisona, actúan bloqueando la activación e infiltración celular inmune que son precipitados por daños en las fibras musculares resultantes de la enfermedad. Desgraciadamente, el tratamiento con corticosteroides también da lugar a atrofia del músculo esquelético que niega algunas de las ventajas potenciales del bloqueo de la respuesta inmune de estos pacientes. Por tanto, sigue siendo necesario identificar agentes terapéuticos que ralenticen el daño a las fibras musculares y retrasen la presentación de incapacidad en pacientes con distrofias musculares, pero que causen daños menores de atrofia del músculo esquelético que las terapias actuales.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona péptidos aislados, según la reivindicación 1, que son agonistas del CRF_{2}R. Específicamente, la invención proporciona un péptido aislado, según la reivindicación 1, o ácido nucleico que codifica dicho péptido, que son de tipo CRF, urocortina I, urocortina II, urocortina III, sauvagina, urotensina I o derivados de péptidos relacionados. La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz y segura de un péptido aislado de la presente invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

La administración de un péptido, o ácido nucleico que codifica dicho péptido, composición farmacéutica o kit de la presente invención a un sujeto en necesidad del mismo es eficaz para el tratamiento de trastornos modulados por CRF_{2}R, tales como atrofia o desgaste muscular. La invención también proporciona un anticuerpo específico para los péptidos de la presente invención. Finalmente, la invención proporciona el uso de un péptido de la presente invención, o ácido nucleico que codifica dicho péptido, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno modulado por CRF_{2}R en un sujeto en necesidad del mismo.

Descripción de la lista de secuencias

La Tabla 1 describe diversas proteínas y secuencias de fragmentos de proteínas que se unen con receptores del CRF. Estas secuencias seleccionadas se incluyen con su(s) correspondiente(s) número(s) de acceso Genbank o Derwent y la especie animal considerada, así como los números de acceso de las secuencias de nucleótidos relacionadas que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o casi idénticas. Estas secuencias conocidas y nuevas de la invención se presentan detalladamente en la lista de secuencias

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TABLA 1

1

2

Descripción de la invención Glosario de términos

La siguiente es una lista de definiciones de términos usados en la presente memoria.

"Agonista" es cualquier compuesto, incluyendo, aunque no de forma limitativa, anticuerpos, que activa un receptor. Por ejemplo, los agonistas del CRFR incluyen, aunque no de forma limitativa, CRF, urocortina, urocortina II, urocortina III, urotensina I, sauvagina y análogos relacionados.

"Anticuerpo", en sus diversas formas gramaticales, significa moléculas de inmunoglobulina y partes inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión de antígenos que une específicamente un antígeno. En la presente memoria, "anticuerpo aislado" significa un anticuerpo que ha sido parcial o completamente separado de proteínas y moléculas orgánicas naturales con las que está asociado de forma natural.

"Afinidad de unión" significa la tendencia de un ligando a interactuar con un receptor y está relacionada inversamente con la constante de disociación de una interacción específica de ligando del CRF-CRFR. La constante de disociación se puede medir directamente mediante técnicas estándares de unión por saturación, competencia o cinética o indirectamente mediante técnicas farmacológicas que implican ensayos funcionales y puntos finales.

"Anticuerpo quimérico" significa un anticuerpo que contiene elementos estructurales de dos o más moléculas de anticuerpos diferentes, es decir, de especies animales diferentes. Los anticuerpos quiméricos incluyen, aunque no de forma limitativa, los anticuerpos conocidos como "anticuerpos humanizados" que incluyen, aunque no de forma limitativa, anticuerpos quiméricos generados mediante la técnica conocida como injerto de regiones determinantes de la complementariedad.

"CRF" significa factor liberador de la corticotropina que es igual que hormona liberadora de la corticotropina (CRH). Péptidos CRF ilustrativos incluyen CRF r/h y CRF ovino (véase US-4.415.558) y similares.

"Análogo del CRF" significa sustancias que actúan como ligandos de los CRFR. Se pueden obtener análogos del CRF adecuados de diversas especies de vertebrados e incluyen, aunque no de forma limitativa, sustancias tales como sauvagina (véase, p. ej., US-4.605.642), urotensina (véase, p. ej., US-4.908.352 y US-4.533.654), urocortina II de ratón, péptido relacionado con la urocortina humana (Reyes, T.M. y col., Proc. Nat'l Acad Sci 98:2843-2848 [2001]), urocortina (véase, p. ej., WO 97/00063), urocortina II humana (péptido relacionado con la stresscopina), urocortina III humana (stresscopina), URP I de pez globo, URP II de pez globo, urotensina I y los análogos de CRF descritos en US-4.415.558; US-4.489.163; US-4.594.329; US-4.605.642; US-5.109.111; US-5.235.036; US-5.278.146; US-5.439.885; US-5.493.006; US-5663292; US-5.824.771; US-5.844.074 y US-5.869.450. El último documento describe péptidos del tipo CRF, los cuales al sustituir con prolina en la posición 4 ó 5 se seleccionan para CRF_{2}R. Análogos de CRF específicos incluyen hUcnI (urocortina I humana, AF038633 (GB)); hUroII (urocortina II humana o péptido relacionado con stresscopina)(AF320560); hUroIII (urocortina III humana o stresscopina, AF361943); hCRF (factor liberador de la corticotropina humana)(V00571(GB)) o CRF (factor liberador de la corticotropina de oveja E00212 (GB)); Svg (sauvagina, P01144 (SP)).

"Agonista del CRFR" significa un compuesto o molécula que tiene la capacidad de activar los CRF_{1}R_{,} CRF_{2}R o ambos.

"CRFR" significa los CRF_{1}R o CRF_{2}R. El término "CRFR" también incluye proteínas truncadas y/o mutadas en donde se han eliminado o modificado regiones de la molécula receptora que no son necesarias para la unión o señalización del ligando.

"CRF_{1}R" significa cualquier isoforma del CRF_{1}R de cualquier especie animal. El CRF_{1}R_{ }ha sido denominado anteriormente como CRF-RA, PC-CRF, CRF, (Perrin, M.H., y col. Endocrinology 133:3058-3061 (1993), Chen, R., y col. Proc. Natl. Acad. Sci.USA 90:8967-8971 [1993], Chang, C-P. y col., Neuron 11:1187-1195 [1993], Kishimoto, T., y col., Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 92:1108-1112 [1995] y Vita, N. y col., FEBS Lett. 335: 1-5 [1993]) o receptor de la CRH.

La definición del CRF_{1}R incluye, aunque no de forma limitativa, aquellos receptores para los que la secuencia del ADNc o genómica que codifica el receptor ha sido depositada en una base de datos de secuencias. Estas secuencias incluyen los N.º de acceso X72304, E11431, L23332, I92584, T37068, T28968, Q81952, L23333, NM004382, AF180301, T28970, L25438, L24096, I92586, Q81954, AH006791, NM007762, X72305, AF054582, Y14036, AF229359, AF229361, AB055434 y L41563. Las secuencias de nucleótidos y proteínas de estos receptores están comercializadas por GenBank o Derwent.

"CRF_{2}R" significa cualquier isoforma del CRF_{2}R de cualquier especie animal. El CRF_{2}R ha sido también denominado HM-CRF, CRF-RB, (Kishimoto, T., y col., Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 92:1108-1112 [1995] y Perrin, M. y col. Proc. Natl. Acad. Sci.USA 92:2969-2973 [1995]).

La definición del CRF_{2}R incluye, aunque no de forma limitativa, aquellos receptores para los que la secuencia del ADN que codifica el receptor ha sido depositada en una base de datos de secuencias. Estas secuencias incluyen los N.º de acceso: U34587, E12752, NM001883, T12247, T66508, AF011406, AF019381, U16253, T12244, T28972, U17858, NM009953, Y14037 y AF229360. Las secuencias de nucleótidos y proteínas de estos receptores son comercializadas por GenBank o Derwent.

"Inhibe" se refiere al bloqueo parcial o completo de un proceso o actividad particular. Por ejemplo, un compuesto inhibe la atrofia del músculo esquelético si evita completamente o parcialmente la atrofia muscular.

"Péptido aislado" significa una molécula de péptido que se "aísla" cuando se emplean métodos físicos, mecánicos o químicos para eliminar el péptido de los constituyentes celulares que están normalmente asociados a la proteína. Un experto en la materia puede emplear fácilmente métodos de purificación estándar para obtener un péptido aislado.

"Ácido nucleico aislado" significa una molécula de ácido nucleico que es prácticamente separada de las moléculas de ácido nucleico contaminantes que codifican otros polipéptidos. Las técnicas de purificación e identificación de la secuencia son bien conocidas en la técnica.

En la presente memoria, se dice que dos secuencias de ADN están "operativamente asociadas" si la naturaleza de la unión entre las dos secuencias de ADN no (1) tiene como consecuencia la introducción de una mutación de desplazamiento del marco de lectura, no (2) interfiere con la capacidad de una región promotora para dirigir la transcripción de las secuencias codificantes o no (3) interfiere con la capacidad del correspondiente transcrito de ARN en ser traducido en una proteína. Por ejemplo, una secuencia codificante y las secuencias reguladoras están operativamente asociadas cuando están covalentemente unidas de modo que tiene lugar la transcripción de la secuencia codificante bajo la influencia o control de las secuencias reguladoras. Por lo tanto, una región promotora está operativamente asociada a una secuencia codificante cuando la región promotora es capaz de realizar la transcripción de esa secuencia de ADN de modo que el transcrito resultante es capaz de ser traducido en el péptido deseado.

"Agonista selectivo" significa que el agonista generalmente tiene una actividad mayor, preferiblemente significativamente mayor, frente a un determinado receptor(es) comparado con otros receptores, no siendo completamente inactivo respecto a otros receptores.

La "identidad de la secuencia" u "homología" a nivel de la secuencia de aminoácidos o nucleótidos se determina mediante el análisis BLAST (Herramienta de búsqueda de alineamiento local básica) utilizando el algoritmo empleado con los programas blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx (Altschul y col. (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402 y Karlin y col. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2264-2268) los cuales están diseñados para la búsqueda de similitud de las secuencias. El método utilizado por el programa BLAST consiste en considerar en primer lugar segmentos similares, con huecos (no contiguos) y sin huecos (contiguos), entre una secuencia desconocida y una secuencia de una base de datos, evaluar a continuación la significación estadística de todas las coincidencias que se identifiquen y finalmente resumir sólo aquellas coincidencias que satisfagan un umbral preseleccionado de significación. Para una discusión de los aspectos básicos sobre la búsqueda de similitud en bases de datos de secuencias, véase Altschul y col. (1994) Nature Genetics 6, 119-129. Los parámetros de búsqueda del histograma, las descripciones, las alineaciones, el valor esperado (es decir, el umbral de significación estadística de notificación de coincidencias frente a secuencias de bases de datos), el valor de corte, la matriz y el filtro (baja complejidad) son los parámetros por defecto. La matriz de puntuación por defecto utilizada por blastp, blastx, tblastn y tblastx es la matriz BLOSUM62 (Henikoff y col. [1992] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915-10919), recomendada para secuencias desconocidas con una longitud de más de 85 nucleótidos o aminoácidos.

Para blastn, la matriz de puntuación se establece mediante los cocientes entre M (es decir, la puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes) y N (es decir, la puntuación de penalización para residuos no coincidentes), en donde los valores por defecto para M y N son +5 y -4, respectivamente. Se ajustaron cuatro parámetros blastn de la siguiente manera: Q=10 (penalización por introducción de hueco); R=10 (penalización por extensión de hueco); wink=1 (genera coincidencias de palabras en cada posición wink a lo largo de la secuencia desconocida) y gapw=16 (fija la anchura de la ventana dentro la cual se generan los alineamientos con hueco). Los ajustes del parámetro Blastp equivalente fueron Q=9; R=2; wink=1 y gapw=32. Una comparación Bestfit entre las secuencias, disponible en el paquete GCG versión 10.0, utiliza los parámetros de ADN GAP=50 (penalización por introducción de hueco) y LEN=3 (penalización por extensión de hueco) y los ajustes equivalentes en las comparaciones de proteínas son GAP=8 y LEN=2.

"Hipertrofia del músculo esquelético" significa un aumento de la masa del músculo esquelético o de la función del músculo esquelético o ambas.

"Atrofia del músculo esquelético" significa lo mismo que "desgaste muscular" y significa una reducción de la masa del músculo esquelético o de la función del músculo esquelético o ambos.

Al describir la estructura y función de las proteínas se hace referencia a los aminoácidos que comprenden la proteína. Los aminoácidos también se pueden designar por sus abreviaturas convencionales, como son: A = Ala = Alanina; T = Thr = Treonina; V = Val = Valina; C = Cys = Cisteína; L = Leu = Leucina; Y = Tyr = Tirosina;
I = Ile = Isoleucina; N = Asn = Asparagina; P = Pro = Prolina; Q = Gln Glutamina; F = Phe = Fenilalanina; D =
Asp = Ácido aspártico; W = Trp = Triptófano; E = Glu = Ácido glutámico; M = Met = Metionina; K = Lys = Lisina; G = Gly = Glicina; R = Arg = Arginina; S = Ser = Serina; H = His = Histidina. La letra Z = Glx = Ácido pirrolidona carboxílico se usa para indicar el ácido glutámico o glutamina N-terminal que ha formado una lactama cíclica interna. Éste se describe en la lista de la secuencia como "MODIFIED_RES" cuando así corresponda. La letra B se utiliza en la memoria descriptiva para designar naftilalanina, una modificación de alanina en determinados péptidos y cuando aparece se ha indicado en la lista de secuencia como "elemento misceláneo" en las secuencias de péptidos. La abreviatura "Ac" se ha usado en la memoria descriptiva para indicar NH_{2}-terminal acetilado modificado y se describe como "MODIFIED_RES" cuando así corresponda. Los péptidos de la invención también están modificados para tener el grupo amida en el carboxi terminal. Esto está indicado en la lista de secuencia como "MODIFIED_RES". Con el fin de designar una deleción o una ausencia de un aminoácido en el contexto de un homólogo natural, se utiliza un "-" o "nada" a lo largo de toda la solicitud.

Salvo que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados tienen el mismo significado que el habitualmente entendido por un experto en la técnica de la química de proteínas, farmacología o biología molecular. Los métodos, materiales y ejemplos descritos en la presente memoria no está previsto que sean limitativos. Otros métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria se pueden usar en la práctica o como ensayo de la presente invención.

Péptidos

La presente invención abarca péptidos no naturales aislados como los descritos en la reivindicación 1.

La presente invención también abarca las variantes de los péptidos descritos. En la presente memoria, "variantes" se refiere a aquellos péptidos que tienen al menos 95%, preferiblemente 97%, más preferiblemente 98% y con máxima preferencia 99% de identidad de secuencia con su secuencia de aminoácidos natural. Las proteínas de fusión o extensiones N-terminal, C-terminal o internas, deleciones o inserciones en la secuencia del péptido no deben ser considerados como que afectan a la homología.

Uso de los péptidos de la invención como agonistas del CRF_{2}R

Los péptidos de la invención son útiles para el tratamiento de diversas enfermedades, trastornos y afecciones que son moduladas por el CRF_{2}R o por la actividad del CRF_{2}R. En la presente memoria, los términos "enfermedad", "trastorno" y "afección" se usan indistintamente. En la presente memoria, un trastorno descrito por los términos "modulado por el CRF_{2}R," o "modulado por la actividad del CRF_{2}R" se refiere a un trastorno, afección o enfermedad donde la actividad del CRF_{2}R es un medio eficaz de aliviar el trastorno o una o más de las manifestaciones biológicas de la enfermedad o trastorno o interfiere con uno o más puntos de la cascada biológica que conduce al trastorno o que es responsable del trastorno subyacente o alivia uno o más síntomas del trastorno. Por lo tanto, los trastornos sujetos a "modulación" incluyen aquellos para los cuales: (1) la ausencia de actividad del CRF_{2}R es una "causa" de este trastorno o de una o más de las manifestaciones biológicas, independientemente de que la actividad se haya alterado genéticamente, por infección, por irritación, por un estímulo interno o por cualquier otra causa; (2) la enfermedad o trastorno o la manifestación o manifestaciones observables de la enfermedad o trastorno son aliviadas por la actividad del CRF_{2}R (la ausencia de actividad del CRF_{2}R no tiene que estar casualmente relacionada con la enfermedad o trastorno o las manifestaciones del mismo); (3) la actividad del CRF_{2}R interfiere con parte de la cascada bioquímica o molecular que produce o se relaciona con la enfermedad o trastorno. A este respecto, la actividad del CRF_{2}R altera la cascada y, por tanto, controla la enfermedad, afección o trastorno.

En una realización de la invención, los péptidos de la presente invención no tienen ninguna o sólo una débil actividad agonista frente al CRF_{1}R. Por lo tanto, los péptidos de la presente invención son especialmente útiles para el tratamiento de los trastornos modulados por el CRF_{2}R. Uno de estos trastornos modulados por el CRF_{2}R es la atrofia del músculo esquelético. La atrofia del músculo esquelético se puede inducir por el desuso debido a cirugía, reposo en cama, fractura de huesos; denervación/daño nervioso debido a lesión de la médula espinal; enfermedad autoinmune; enfermedad infecciosa; uso de glucocorticoides para afecciones no relacionadas; septicemia debida a infección o a otras causas; limitación de nutrientes debido a enfermedad o inanición; caquexia por cáncer; inflamación crónica; síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA); caquexia; enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC); insuficiencia cardíaca congestiva; sarcopenia y trastornos genéticos; p. ej., distrofias musculares, enfermedades neurodegenerativas.

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En otra realización, el tratamiento de un trastorno modulado por el CRF_{2}R tiene como resultado un aumento de la masa y de la función del músculo esquelético. Las enfermedades y afecciones que afectan a la masa y función del músculo esquelético incluyen, aunque no de forma limitativa, atrofia o desgaste del músculo esquelético incluyendo atrofia/desgaste agudos resultante del desuso debido a dolencia, cirugía, reposo en cama o accidente; daño nervioso debido a lesión de la médula espinal, enfermedad autoinmune o enfermedad infecciosa; uso de glucocorticoides para afecciones no relacionadas; septicemia debido a infección o a otras causas; limitación de nutrientes debido a dolencia o inanición y viaje espacial: y atrofia/desgaste crónico que incluye caquexia por cáncer, inflamación crónica, caquexia por SIDA, EPOC, insuficiencia cardíaca congestiva, trastornos genéticos, p. ej., distrofias musculares, enfermedades neurodegenerativas y sarcopenia (edad asociada a pérdida de músculo).

En otra realización más, el tratamiento de un trastorno modulado por el CRF_{2}R incluye trastornos que afectan a los huesos. Las enfermedades y afecciones que afectan a los huesos incluyen, aunque no de forma limitativa, pérdida de hueso por desuso debido a enfermedad, cirugía, reposo en cama o accidente; daño nervioso debido a lesión de la médula espinal, enfermedad autoinmune o enfermedad infecciosa; uso de glucocorticoides para afecciones no relacionadas; septicemia debida a infección o a otras causas; limitación de nutrientes debido a enfermedad o inanición y viaje espacial. También se incluye la pérdida ósea (osteoporosis) relacionada con la edad y el estatus hormonal.

En otra realización más, el tratamiento de un trastorno modulado por el CRF_{2}R incluye trastornos que afectan al corazón y al sistema circulatorio incluyendo de forma no excluyente hipertensión, insuficiencia cardíaca congestiva, daño cardíaco resultante de infarto de miocardio, lesión por isquemia y reperfusión, ictus, migraña, pérdida de memoria, enfermedad de Alzheimer, demencia y similares.

En otra realización más, el tratamiento de un trastorno modulado por el CRF_{2}R incluye trastornos que afectan a las articulaciones incluyendo de forma no excluyente artritis en particular osteoartritis y artritis reumatoide.

En otra realización más, el tratamiento de un trastorno modulado por el CRF_{2}R incluye enfermedades metabólicas incluyendo obesidad y diabetes.

En otra realización más, el tratamiento de un trastorno modulado por el CRF2R incluye: reducción del dolor; reducción de la inflamación; reacciones alérgicas, alergia; reducción de la temperatura corporal; inhibición del apetito; insuficiencia cardíaca congestiva; estrés y ansiedad; alteración de los bajos niveles no deseables de secreción de la hormona adrenocorticotropa ("ACTH"); control del apetito, excitación sexual y funciones cognitivas y evitación de los efectos del estrés a largo plazo, como los trastornos de ansiedad, anorexia nerviosa y depresión melancólica.

El término "tratamiento" en la presente memoria significa que, como mínimo, la administración de un péptido de la presente invención alivia un trastorno modulado por el CRF_{2}R en un sujeto de mamífero, preferiblemente en humanos. Por tanto, el término "tratamiento" incluye: evitar que se produzca un trastorno modulado por el CRF_{2}R en un mamífero, especialmente cuando el mamífero está predispuesto a padecer el trastorno modulado por el CRF_{2}R, pero al que todavía no se le ha diagnosticado la enfermedad; inhibir el trastorno modulado por el CRF_{2}R y/o aliviar o revertir el trastorno modulado por el CRF_{2}R. En la medida en que los métodos de la presente invención están dirigidos a prevenir el trastorno modulado por el CRF_{2}R, se entiende que el término "previene" no requiere que el trastorno modulado por el CRF_{2}R sea completamente evitado (véase el Webster's Ninth Collegiate Dictionary). Más concretamente, en la presente memoria, el término "previene" se refiere a la capacidad del experto en la materia para identificar una población que sea susceptible al trastorno modulado por el CRF_{2}R, de modo que esa administración de los péptidos y kits de la presente invención puede ocurrir antes de la presentación de los síntomas del trastorno modulado por el CRF_{2}R. La población con riesgo de padecer un trastorno modulado por el CRF_{2}R es fácilmente identificable. Por ejemplo, la población que está en riesgo de desarrollar distrofia muscular se puede determinar identificando mutaciones en los genes característicos del trastorno. Por ejemplo, y tal como se ha descrito anteriormente, las distrofias de Duchenne y Becker son debidas a la herencia de una mutación en el gen de la distrofia, el cual está localizado en el locus Xp21. Aquellos individuos de una población que poseen estas mutaciones tienen riesgo de desarrollar distrofia muscular. Por lo tanto, la población de pacientes es identificable y podría recibir la administración de una composición o dosis unitaria de un kit de la presente invención antes de la progresión de la enfermedad. Por lo tanto, en dichos individuos sería "prevenida" la progresión de la atrofia o desgaste muscular.

Moléculas de ácido nucleico

La presente invención proporciona además moléculas de ácido nucleico que codifican los péptidos de la presente invención, preferiblemente en forma aislada. En la presente memoria, "ácido nucleico" se define como ARN o ADN que codifica un péptido de la presente invención como se ha definido anteriormente o es complementario a una secuencia de ácido nucleico que codifica dichos péptidos. Específicamente, se trata de moléculas de ADN, ADNc y ARNm genómicas y moléculas antisentido, así como ácidos nucleicos que tienen cadenas principales alternativas o que incluyen bases alternativas independientemente de si derivan o se sintetizan de fuentes naturales.

La presente invención proporciona además un fragmento de una molécula de ácido nucleico codificante. En la presente memoria, un fragmento de una molécula de ácido nucleico codificante se refiere a una pequeña parte de toda la secuencia codificante de una proteína. El tamaño del fragmento se determinará dependiendo del uso previsto. Por ejemplo, si el fragmento se elige de tal forma que codifique una parte activa de un péptido de la presente invención, el fragmento tendrá que ser lo suficientemente grande para codificar las regiones funcionales del péptido.

Los fragmentos de las moléculas de ácido nucleico codificante de la presente invención (es decir, oligonucléotidos sintéticos) que se usan como sondas o cebadores específicos para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o para sintetizar secuencias de genes que codifican péptidos de la invención, pueden sintetizarse fácilmente mediante técnicas químicas, por ejemplo, el método del fosfotriéster de Matteucci y col., J. Am. Chem. Soc., 103:3185-3191 (1981) o utilizando métodos de síntesis automatizada. Además, se pueden preparar fácilmente segmentos de ADN más grandes mediante métodos bien conocidos, como la síntesis de un grupo de oligonucleótidos que definen diversos segmentos modulares del gen, seguido por el ligamiento de oligonucleótidos para constituir el gen modificado completo.

Las moléculas de ácido nucleico codificantes de la presente invención pueden además ser modificadas de forma que contengan un marcador detectable con fines diagnósticos y como sonda. En la técnica se conocen diversos de estos marcadores y se pueden utilizar fácilmente con las moléculas codificantes descritas en la presente memoria. Marcadores adecuados incluyen, aunque no de forma limitativa, biotina, nucleótidos marcados radiactivamente y similares. Un experto en la materia puede utilizar fácilmente cualquiera de estos marcadores para obtener variantes marcadas de las moléculas de ácido nucleico de la invención.

Preparación de los péptidos o líneas celulares que expresan péptidos

Los péptidos de la presente invención se pueden preparar para una variedad de usos, incluyendo, aunque no de forma limitativa, el uso como reactivos farmacéuticos para el tratamiento de trastornos modulados por el CRF_{2}R. Será evidente para el experto en la técnica que, para determinadas realizaciones de la invención, los péptidos purificados serán los más útiles, mientras que para otras realizaciones, las líneas celulares que expresan los péptidos serán las más útiles.

Debido a que los péptidos de la presente invención son polipéptidos cortos, el experto en la materia reconocerá que los péptidos de la presente invención pueden sintetizarse mediante síntesis directa mejor que mediante medios recombinantes, utilizando técnicas bien conocidas en la técnica. Véase Bodanszky, Principles Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg (1984) y como tal mediante síntesis de fase sólida, véase p. ej., Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-54 (1963); Barany y col., Int. J. Peptide Protein Res., 30:705-739 (1987) y US-5.424.398.

Por ejemplo, los péptidos se pueden sintetizar con un sintetizador automático de Applied Biosystem, Inc. (ABI) Modelo 433 o en un sintetizador de tipo multi-reactor (modelo Symphony^{TM}) de Protein Technology, Inc (PTI). Al igual que para los péptidos sintetizados con el sintetizador ABI, todos los reactivos son adquiridos en ABI (salvo la piperidina que es adquirida en Aldrich). Los aminoácidos Fmoc son adquiridos en ABI (salvo Fmoc-L-Pyr que es adquirida en Chem-Impek). Las resinas de tipo Rink amida son adquiridas en Nova Chemicals. Se utiliza la FastMoc estándar de 0,1 mmol con acoplamiento simple. El protocolo de química Fmoc general para SPPS (síntesis de péptido en fase sólida) incluye: 1) escisión de los grupos de protección Fmoc con piperidina; 2) activación del grupo carboxilo de los aminoácidos y 3) acoplamiento de los aminoácidos activados al amino terminal de la cadena peptídica unida a la resina para formar enlaces peptídicos. Los aminoácidos se activan con hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HBTU). Se disuelve un aminoácido protegido en seco en un cartucho (1,0 mmol) en una solución de HBTU, N,N-diisopropiletilamina (DIEA) y 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) en N,N-dimetilformamida (DMF) añadiéndose adicionalmente N-metilpirrolidona (NMP). El aminoácido Fmoc activado se forma casi instantáneamente y la solución se transfiere directamente al vaso de reacción. La etapa de desprotección del Fmoc se monitoriza y se controla mediante las mediciones de la conductividad. La cadena peptídica se construye sobre una resina de tipo Rink amida ya que se necesita una amida C-terminal. El producto final se lava exhaustivamente con NMP y diclorometano (DCM).

Al igual que con los péptidos sintetizados con el sintetizador múltiple PTI, todos los aminoácidos Fmoc son adquiridos en NovaBiochem (salvo la Fmoc-Pyr que es adquirida en Chem-Impex). Para las síntesis se utilizan protocolos de síntesis Fmoc estándar de 0,05 mmol. Los aminoácidos Fmoc (0,4 mmol) se disuelven en una solución de HBTU (200 mm), N-metilmorfolina (NMM, 0,4 M) y N,N-dimetilformamida (DMF) añadiéndose adicionalmente N-metilpirrolidona (NMP). El aminoácido Fmoc activado se forma casi instantáneamente y la solución se transfiere directamente al vaso de reacción. La etapa de la desprotección del Fmoc se realiza dos veces. La cadena peptídica se construye sobre una resina de tipo Rink amida ya que se necesita una amida C-terminal. El producto de síntesis final se lava exhaustivamente con NMP y diclorometano (DCM).

Los péptidos recién sintetizados se desprotegen. Las resinas que contienen péptidos sintetizados se descargan del sintetizador y se secan al aire brevemente. Mediante la utilización de 1,5-2,0 ml del cóctel de escisión (que comprende ácido trifluoroacético (TFA) al 95%, etanoditiol al 2,5%, tioanisol al 2,5%, fenol al 2,5% (P/V) en agua) durante 4 horas a temperatura ambiente, los péptidos se escinden de la resina y al mismo tiempo, los grupos protectores de las cadenas laterales [O-t-butilo (OtBu) para Asp, Glu, Tyr, Thr y Ser; pentametilcroman-6-sulfonilo (Pmc) para Arg, t-butoxicarbonil (Boc) para Trp y Lys; tritilo (Trt) para His, Asn y Gln] se eliminan en las condiciones de desprotección. La solución de escisión se separa de la resina mediante filtración. El filtrado se diluye a continuación con 15 ml de agua. Se realizan seis ciclos de extracción en éter para purificar el producto peptídico. El péptido se liofiliza y se conserva a -20ºC antes de la purificación.

Los péptidos desprotegidos se purifican y se caracterizan. El polvo de péptido se disuelve en una solución de ácido acético al 50% y se inyecta en una columna Vydac de 1,0 cm de D.I., 25 cm de longitud con tamaño de partículas de C-8 y tamaño de poro de 300 \ring{A} para la purificación. Se utiliza un sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) Beckman System Gold con detector ultravioleta de longitud de onda doble (220 nm y 280 nm). Se programa un gradiente lineal de acetonitrilo y se introduce en la columna para separar el producto peptídico de otras sustancias. El eluato se recoge mediante un colector de fracciones de Pharmacia y las fracciones de la separación individual se someten tanto a HPLC analítico como a MALDI-TOF MS (espectrometría de masas mediante desorción-ionización por láser, asistida por una matriz y analizador por tiempos de vuelo) para garantizar la identidad y la pureza.

También se contempla el uso de la tecnología del ADN recombinante en la preparación de los péptidos, o de las líneas celulares que expresan estos péptidos. Dichos métodos recombinantes son bien conocidos en la técnica. Los métodos para generar moléculas de ADNr son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, véase Sambrook y col., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Para expresar los péptidos recombinantes de la presente invención, se prepara un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés bajo el control de uno o más elementos de regulación. La secuencia de ácidos nucleicos que codifica los péptidos de la presente invención se puede deducir de las secuencias del péptido descritas o reivindicadas en la presente invención.

Mediante métodos bien conocidos en la técnica, se puede introducir la molécula de ácido nucleico aislado que codifica el péptido de interés en un vector de expresión adecuado. Los sistemas huésped-vector de expresión que se pueden usar para fines de la invención incluyen, aunque no de forma limitativa: microorganismos como bacterias (p. ej., E. coli, B. subtilis) transformadas con ADN de bacteriófago recombinante, ADN plasmídico, o vectores de expresión de ADN cosmídico que contienen secuencias de nucleótidos que codifican los péptidos de la presente invención; levaduras (p. ej., Saccharomyces, Pichia) transformadas con vectores de expresión en levadura que contienen secuencias de nucleótidos que codifican los péptidos de la presente invención; sistemas de células de insectos infectadas con vectores de expresión en virus recombinantes (p. ej., baculovirus) que contienen secuencias de nucleótidos que codifican los péptidos de la presente invención; sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión en virus recombinantes (p. ej., virus del mosaico de la coliflor, virus del mosaico del tabaco) o vectores de expresión en plásmidos recombinantes (p. ej., plásmido Ti) que contiene secuencias de nucleótidos que codifican los péptidos de la presente invención; o sistemas de células de mamífero (p. ej., COS, CHO, HEK293, NIH3T3) que albergan construcciones de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (p. ej., promotor de la metalotioneína) o de virus de mamíferos (p. ej., LTR de retrovirus) y también que contienen secuencias de nucleótidos que codifican los péptidos de la presente invención.

En sistemas bacterianos, se pueden seleccionar de forma ventajosa varios vectores de expresión dependiendo del uso previsto para el péptido que se va a expresar. Por ejemplo, cuando se necesita una gran cantidad de dicha proteína, son deseables los vectores que dirigen la expresión de altos niveles de productos de proteína. El experto en la técnica es capaz de generar dichas construcciones de vectores y purificar las proteínas mediante diversas metodologías incluyendo las tecnologías de purificación selectiva como las columnas selectivas de proteína de fusión y las tecnologías de purificación no selectiva.

En un sistema de expresión de proteínas en insectos, se usan baculovirus como el virus de la polihedrosis nuclear de A. californica (AcNPV) como vector para expresar genes extraños en células de S. frugiperda. En este caso, las secuencias de nucleótidos que codifican los péptidos de la presente invención se clonan en regiones no esenciales del virus y se colocan bajo el control del promotor del AcNPV. Los virus recombinantes se utilizan a continuación para infectar células en las cuales el gen insertado se expresa y la proteína se purifica mediante una de muchas técnicas conocidas por el experto en la técnica.

En células huésped de mamífero se pueden utilizar varios sistemas de expresión basados en virus. La utilización de estos sistemas de expresión frecuentemente requiere la creación de señales de iniciación específicas en los vectores para la traducción eficaz de las secuencias de nucleótidos insertadas. Esto es especialmente importante si una parte de la secuencia de nucleótidos utilizada no contiene la señal de iniciación endógena. La situación de esta señal de inicio, dentro del marco de la región de codificación de la secuencia de nucleótidos insertada, así como la adición de elementos potenciadores de la transcripción y la traducción y la purificación de la proteína recombinante, se consigue mediante una de las muchas metodologías conocidas por el experto en la técnica. Igualmente importante en las células huésped de mamífero es la selección de un tipo celular adecuado que sea capaz de realizar las modificaciones postraducción de la proteína recombinante. Dichas modificaciones, por ejemplo, escisión, fosforilación, glucosilación, acetilación, etc., requieren la selección de la célula huésped adecuada que contiene las enzimas modificadoras. Dichas células huésped incluyen, aunque no de forma limitativa, CHO, HEK293, NIH3T3, COS, etc. y son conocidas por los expertos en la técnica.

Para una elevada y prolongada expresión de proteínas recombinantes se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, se pueden diseñar líneas celulares que expresan establemente los péptidos de la presente invención. El experto en la técnica, aplicando los métodos conocidos como electroporación, transfección con fosfato cálcico o la transfección mediada por liposomas, puede generar una línea celular que exprese de modo estable los péptidos de la presente invención. Esto se lleva a cabo habitualmente mediante la transfección de las células usando vectores de expresión que contienen elementos de control de la expresión adecuados (p. ej., secuencias del promotor, secuencias del potenciador, secuencias de terminación de la transcripción, sitios de poliadenilación, sitios de inicio de la traducción etc.), un marcador seleccionable y el gen de interés. El marcador seleccionable puede estar contenido dentro del mismo vector, como el gen de interés, o en un vector independiente, que se cotransfecta con el vector que contiene la secuencia que codifica el péptido. El marcador seleccionable en el vector de expresión puede conferir resistencia a la selección y permitir a las células integrar establemente el vector en sus cromosomas y crecer para formar focos que a su vez se pueden clonar y expandir en líneas celulares. De forma alternativa, el vector de expresión puede permitir seleccionar la célula que expresa el marcador seleccionable utilizando un atributo físico del marcador, por ejemplo, la expresión de la Proteína Fluorescente Verde (GFP) permite la selección de células que expresan el marcador utilizando el análisis de separación celular por fluorescencia (FACS).

El experto en la técnica es capaz de seleccionar un tipo celular adecuado para la transfección con el fin de permitir la selección de las células en las cuales la secuencia de interés se ha integrado con éxito. Por ejemplo, cuando el marcador seleccionable es la timidina quinasa, la hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa o la adenina fosforibosiltransferasa, el tipo celular adecuado sería las células tk-, hgprt- o aprt-, respectivamente. O bien, se pueden usar células normales cuando el marcador seleccionable es dhfr, gpt, neo o hygro, los cuales confieren resistencia a metotrexato, ácido micofenólico, G-418 o higromicina, respectivamente.

Preparación de anticuerpos

Los anticuerpos que reconocen selectivamente a uno o más epítopos de los péptidos de la presente invención están también abarcados por la invención. Dichos anticuerpos incluyen, p. ej., anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanos, anticuerpos de cadena simple, fragmentos Fab, fragmentos
F(ab')_{2}, moléculas producidas usando una genoteca de expresión de Fab, anticuerpos humanos (policlonales o monoclonales) producidos en ratones transgénicos y fragmentos de unión a epítopos de cualquiera de los anteriores.

Los anticuerpos se pueden utilizar conjuntamente con las técnicas de terapia génica para evaluar, por ejemplo, la expresión de los péptidos de la presente invención o bien en células o directamente en tejidos de pacientes en los cuales estos genes se han introducido.

Para la producción de anticuerpos, se pueden inmunizar a diversos animales huésped mediante la inyección con péptidos de la presente invención, anticuerpos anti-péptido, anticuerpos de análogos anti-péptido o fragmentos inmunogénicos de los mismos mediante métodos bien conocidos en la técnica. Para la preparación de un anticuerpo anti-idiotipo, el inmunogen es un anticuerpo anti-péptido o un anticuerpo análogo de anti-péptido. La producción de anticuerpos anti-idiotipo se describe, por ejemplo, en US-4.699.880. Animales huésped adecuados incluyen, aunque no de forma limitativa, conejos, ratones, cabras, ovejas y caballos. Las técnicas de inmunización son bien conocidas en la técnica. Los anticuerpos policlonales se pueden purificar a partir del suero de los animales inmunizados o los anticuerpos monoclonales se pueden generar mediante métodos que son bien conocidos en la técnica. Estas técnicas incluyen, aunque no de forma limitativa, las bien conocidas técnicas de hibridoma de Kohler y Milstein, las técnicas de hibridoma de linfocitos B humanos y la tecnología del hibridoma del EBV. Los anticuerpos monoclonales pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulinas, como IgG, IgE, IgM, IgA e IgD que contienen cadenas ligeras kappa o lambda. Las técnicas de producción y utilización de anticuerpos quiméricos son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en US-5.807.715; US-4.816.397; US-4.816.567; US-5.530.101; US-5.585.089; US-5.693.761; US-5.693.762; US-6.180.370 y US-5.824.307.

Ensayos de determinación de la selectividad del CRF_{2}R

La actividad farmacológica y la selectividad de los péptidos de la presente invención se puede determinar utilizando procedimientos de ensayo publicados. Véase, p. ej., WO 02/69908. Dado que CRF_{2}R y CRF_{1}R son proteínas homólogas, se espera que una determinada proporción de los agonistas de CRF_{2}R también funcionen como agonistas de CRF_{1}R. Como se ha descrito más arriba, la activación de CRF_{1}R induce la activación del eje HPA ya que el aumento de la producción de corticosteroides conduce a la atrofia del músculo esquelético. En la mayoría de los casos en los cuales se desea un aumento de la masa o de la función muscular, no es deseable activar el eje HPA. Cuando se selecciona un péptido útil para el tratamiento de un trastorno modulado por el CRF_{2}R, que no está relacionado con la distrofia muscular, es preferible que el péptido sea selectivo para CRF_{2}R. Preferiblemente el péptido presenta una selectividad por CRF_{2}R 10 veces superior a la que presenta por CRF_{1}R (es decir, es 10 veces más activo frente al CRF_{2}R que frente al CRF_{1}R), más preferiblemente 100 veces superior y con máxima preferencia 1000 veces superior o una selectividad aún mayor. Dado que los estudios publicados han demostrado un beneficio del tratamiento con corticosteroides en el tratamiento de las distrofias musculares, sería beneficioso que un agonista del CRF_{2}R conservase cierto nivel de agonismo por el CRF_{1}R cuando se usa para tratar distrofias musculares. Por lo tanto, para el tratamiento de las distrofias musculares, se prefiere un péptido de menor selectividad que active el CRF_{2}R así como el CRF_{1}R, en un intervalo de concentración similar. Preferiblemente, el péptido es 100 veces más selectivo para CRF_{2}R que para CRF_{1}R, más preferiblemente 10 veces más selectivo y con máxima preferencia no es selectivo para CRF_{2}R frente a CRF_{1}R (es decir, la actividad del compuesto candidato es prácticamente similar para CRF_{2}R que para CRF_{1}R). También, en este caso, podría ser más preferible que el péptido sea totalmente agonista de CRF_{2}R aunque también un agonista parcial de CRF_{1}R. Por lo tanto, un péptido de este tipo tendría un límite integrado hasta el máximo grado de aumento de cortisol y potencial de desarrollo de atrofia muscular, aunque el efecto anti-atrofia modulado mediante el CRF_{2}R podría reforzarse aumentando la dosis. Un experto en la técnica sería capaz de determinar fácilmente si un péptido es un agonista total o parcial del CRF_{1}R o CRF_{2}R utilizando métodos conocidos en la técnica.

Dado que es deseable discriminar entre CRF_{2}R, comparado con CRF_{1}R, los ensayos descritos anteriormente se pueden realizar usando una célula, o membrana de una célula, que expresa sólo CRF_{2}R o los ensayos se pueden realizar con una fuente recombinante de CRF_{2}R. Las células que expresan ambas formas de CRFR se pueden modificar utilizando la recombinación homóloga para inactivar o de otra manera inhabilitar el gen del CRF_{1}R. De forma alternativa, si la fuente de CRFR contiene más de un tipo de CRFR, la señal de fondo producida por el receptor que no es de interés deberá restarse de la señal obtenida en el ensayo. La respuesta de fondo se puede determinar mediante diversos métodos, incluyendo la eliminación de la señal de CRFR que no es de interés mediante el uso de moléculas antisentido, anticuerpos o antagonistas selectivos. Antagonistas conocidos de los CRFR incluyen, aunque no de forma limitativa, antalarmina (selectivo para CRF_{1}R), antisauvagina-30 (selectivo para CRF_{2}R) y astresina (no selectivo para CRF_{1}R / CRF_{2}R).

Para determinar si un péptido activa CRF_{2}R y/o CRF_{1}R, los ensayos se basan de forma típica en células; sin embargo, los ensayos sin células son conocidos y son capaces de diferenciar la unión a agonistas y antagonistas como se ha descrito anteriormente. Los ensayos basados en células incluyen las etapas de poner en contacto células que expresan CRF_{1}R o CRF_{2}R con un péptido de la presente invención o controlar y medir la activación del CRFR mediante la medición de la expresión o actividad de los componentes de las vías de transducción de la señal del CRFR.

Como se describe en la sección Antecedentes de la invención anterior, los CRFR parecen acoplarse mediante diferentes vías incluyendo G_{\alpha s}, G_{\alpha q} o G_{\alpha i}, dependiendo del tipo celular. Se cree que la activación agonista del CRFR permite al receptor enviar una señal a través de cualquiera de estas vías, siempre y cuando los componentes necesarios de la vía estén presentes en el tipo de célula particular. Por lo tanto, para ensayar un péptido particular de la presente invención en cuanto a la activación del CRFR, el ensayo puede usar cualquiera de las vías de transducción de la señal como la lectura incluso si el tipo de célula relevante para el tratamiento in vivo se une al CRFR para producir la atrofia del músculo esquelético a través de una vía diferente. Una persona con conocimientos ordinarios en la técnica reconocería que el ensayo sería eficaz en identificar agonistas de péptidos útiles independientemente de la vía mediante la cual se midió la activación del receptor. Los ensayos para medir la activación de estas vías de señalización son conocidos en la técnica.

Por ejemplo, tras el contacto con un péptido de la presente invención, los lisados de las células se pueden preparar y ensayar para la inducción del AMPc. El AMPc se induce en respuesta a la activación de G_{\alpha s}. Dado que G_{\alpha s} es activado por receptores distintos al CRFR y dado que un péptido de ensayo podría ejercer su efecto a través de los CRFR o mediante otro mecanismo, se necesitan dos comparaciones control para determinar si el péptido aumenta los niveles de AMPc mediante la activación de un CRFR. Un control compara el nivel de AMPc de las células que entraron en contacto con el péptido y el nivel de AMPc de las células que entraron en contacto con un compuesto control (es decir, el vehículo en el cual se disuelve el péptido). Si el péptido aumenta los niveles de AMPc respecto al compuesto control, esto indica que el péptido está aumentando el AMPc mediante algún mecanismo. El otro control compara los niveles de AMPc de una línea celular que expresa CRFR y una línea celular que es prácticamente la misma, salvo que no expresa el CRFR, habiendo sido tratadas ambas líneas celulares con el péptido. Si el péptido aumenta los niveles de AMPc en la línea celular que expresa el CRFR respecto a la línea celular que no expresa los CRFR, esto es una indicación de que el péptido aumenta el AMPc mediante la activación de los CRFR.

En un ejemplo, la inducción de AMPc se mide con el uso de construcciones de ADN que contienen el elemento que responde al AMPc unido a cualquiera de una variedad de genes indicadores que se pueden introducir en las células que expresan los CRFR. Dichos genes indicadores incluyen, aunque no de forma limitativa, cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), luciferasa, glucurónido sintetasa, hormona del crecimiento, proteínas fluorescentes (p. ej., Proteína Fluorescente Verde) o fosfatasa alcalina. Tras la exposición de las células al péptido, el nivel de expresión del gen indicador se puede cuantificar para determinar la capacidad del péptido para aumentar los niveles de AMPc y así determinar la capacidad del péptido para activar el CRFR.

Las células útiles en este ensayo son las mismas que las del ensayo de unión a CRFR descritas anteriormente, salvo que las células utilizadas en los ensayos de activación expresan preferiblemente un receptor funcional que da una respuesta estadísticamente significativa al CRF o a uno o más análogos del CRF. Además de la utilización de células que expresan los CRFR de longitud total, las células se pueden diseñar de modo que expresen CRFR que contengan el dominio de unión al ligando del receptor acoplado a, o modificado físicamente para que contenga, elementos indicadores o para que interactuén con proteínas de señalización. Por ejemplo, un CRFR natural o un fragmento de CRFR se puede fusionar a una proteína G teniendo como resultado la activación de la proteína G fusionada la unión del agonista a la parte CRFR de la proteína de fusión. Siefert, R. y col., Trends Pharmacol. Sci., 20: 383-389 (1999). Las células deberían también poseer preferiblemente varias características, dependiendo de la lectura, para maximizar la respuesta inductiva por el CRF o el análogo del CRF, por ejemplo, para detectar una inducción fuerte de un gen indicador CRE sería ventajoso (a) un nivel bajo natural de AMPc; (b) proteínas G capaces de interaccionar con los CRFR; (c) un elevado nivel de adenil ciclasa; (d) un elevado nivel de proteína quinasa A; (e) un bajo nivel de fosfodiesterasas y (f) un alto nivel de proteína de unión al elemento de respuesta a AMPc. Para aumentar la respuesta al CRF o a un análogo del CRF, se podrían diseñar células huésped que expresasen una cantidad mayor de factores favorables o una cantidad menor de factores desfavorables. Además, se podrían eliminar vías alternativas para la inducción del receptor CRE para reducir los niveles basales.

Ensayos para determinar la actividad farmacológica

La actividad farmacológica de los péptidos de la presente invención se puede determinar utilizando los procedimientos de ensayo publicados. Por ejemplo, los modelos de atrofia o hipertrofia del músculo esquelético incluyen tanto los modelos de cultivo celular in vitro como los modelos en animales in vivo de atrofia del músculo esquelético.

Los modelos de atrofia del músculo esquelético in vitro son conocidos en la técnica. Dichos modelos se describen, por ejemplo, en Vandenburgh, H.H., In Vitro, 24:609-619 (1988), Vandenburgh, H.H. y col., J. Biomechanics, 24 Suppl 1:91-99 (1991), Vandenburgh, H.H y col., In Vitro Cell. est. Biol., 24(3):166-174 (1988), Chromiak, J.A., y col., In Vitro Cell. est. Biol. Anim., 34(9):694-703 (1998), Shansky, J., y col., In Vitro Cell. est. Biol. Anim., 33(9):659-661 (1997), Perrone, C.E. y col., J. Biol. Chem., 270(5):2099-2106 (1995), Chromiac, J.A. y Vandenburgh, H.H., J. Cell. Physiol., 159(3):407-414 (1994) y Vandenburgh, H.H. y Karlisch, P., In Vitro Cell. est. Biol., 25(7):607-616 (1989).

En la técnica se conocen diversos modelos en animales de atrofia del músculo esquelético, como los descritos en las siguientes referencias: Herbison, G.J., y col. Arch. Phys. Med. Rehabil., 60:401-404 (1979), Appell, H-J. Sports Medicine 10:42-58 (1990), Hasselgren, P-O. y Fischer, J.E. World J. Surg., 22:203-208 (1998), Agbenyega, E.T. y Wareham, A.C. Comp. Biochem. Physiol., 102A:141-145 (1992), Thomason, D.B. y Booth, F.W. J. - Physiol., 68:1-12 (1990), Fitts, R.H., y col. J. Appl. Physiol., 60:1946-1953 (1986), Bramanti, P., y col. Int. J. Anat. Embryol. 103:45-64 (1998), Cartee, G.D. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci., 50:137-141 (1995), Cork, L.C., y col. Prog. Clin. Biol. Res., 229:241-269 (1987), Booth, F.W. y Gollnick, P.D. Med. Sci. Sports Exerc., 15:415-420 (1983), Bloomfield, S.A. Med. Sci. Sports Exerc., 29:197-206 (1997). Los animales preferidos para estos modelos son ratones y ratas. Estos modelos incluyen, por ejemplo, modelos de atrofia inducida por el desuso, como inmovilización de extremidades por escayolado o por otros medios, suspensión de la extremidad posterior, inmovilización completa del animal y situaciones de gravedad reducida. Los modelos de atrofia inducida por daño nervioso incluyen, por ejemplo, compresión nerviosa, extirpación de secciones nervios que inervan músculos específicos, administración de toxina a los nervios e infección de nervios con agentes infecciosos víricos, bacterianos o eucarióticas. Los modelos de atrofia inducida por glucocorticoides incluyen la administración de dosis inductoras de atrofia de glucocorticoides exógenos a animales y la estimulación de la producción endógena de corticosteroides, por ejemplo, mediante la administración de hormonas que activan el eje hipotálamo-pituitario-suprarrenal (HPA). Los modelos de atrofia inducida por septicemia incluyen, por ejemplo, la inoculación con organismos inductores de septicemia, como bacterias, el tratamiento del animal con compuestos inmunoactivadores, como extracto de la pared celular bacteriana o endotoxina y punción de la pared intestinal. Los modelos de atrofia inducida por caquexia incluyen, por ejemplo, la inoculación de un animal con células tumorigénicas con potencial de inducción de caquexia, infección de un animal con agentes infecciosos (como los virus que causan SIDA) que tiene como resultado caquexia y tratamiento de un animal con hormonas o citocinas, tales como CNTF, TNF, IL-6, IL-1, etc. que inducen caquexia. Los modelos de atrofia inducida por insuficiencia cardíaca incluyen la manipulación de un animal de modo que la insuficiencia cardíaca se produce con atrofia del músculo esquelético concomitante. Los modelos de atrofia inducida por enfermedad neurodegenerativa incluyen modelos en animales autoinmunes como los resultantes de la inmunización de un animal con componentes neuronales. Los modelos de atrofia inducida por distrofia muscular incluyen los modelos naturales o los artificiales inducidos genéticamente de distrofia muscular como la mutación del gen de la distrofina que se produce en el ratón Mdx.

Los modelos en animales de hipertrofia del músculo esquelético incluyen, por ejemplo, los modelos de aumento del uso del músculo de la extremidad debido a inactivación de la extremidad opuesta, redistribución del peso tras un acontecimiento inductor de atrofia por desuso, reutilización de un músculo atrofiado debido a un daño nervioso transitorio, aumento del uso de músculos selectivos debido a inactivación de un músculo sinérgico (p. ej., hipertrofia compensatoria), aumento de la utilización del músculo debido a un aumento de la carga colocada sobre el músculo e hipertrofia resultante de la retirada del glucocorticoides tras la atrofia inducida por glucocorticoides. Los modelos de atrofia animal incluyen el modelo de atrofia por denervación del nervio ciático, el modelo de atrofia inducida por glucocorticoides y el modelo de atrofia por desuso debido a escayolado de la pata que se describirán a continuación más detalladamente.

El modelo de atrofia por denervación del nervio ciático implica anestesiar al animal y posteriormente la extirpación quirúrgica de un segmento corto del nervio ciático derecho o izquierdo, p. ej., en ratones el nervio ciático se aísla aproximadamente en el punto medio del fémur y se extrae un segmento de 3 a 5 mm. Esto produce la denervación de la extremidad posterior izquierda y que tiene como resultado la atrofia de estos músculos. De forma típica, la inervación del bíceps femoral se deja intacta para permitir un movimiento satisfactorio de la rodilla para que la ambulación sea prácticamente normal. De forma típica, en los animales no tratados, a los 10 días de la denervación la masa muscular de los músculos denervados se reduce del 30 al 50%. Tras la denervación, se administran los péptidos de ensayo, p. ej., mediante inyección o mediante infusión continua, p. ej., mediante la implantación de una minibomba osmóstica (p. ej., Alzet, Palo Alto, CA), para determinar su efecto sobre la atrofia del músculo esquelético inducida por denervación. En diversos tiempos tras la denervación, los animales son eutanizados y los músculos inferiores de las patas son diseccionados rápidamente, tanto de las patas denervadas como de las no denervadas, y los músculos, limpios de tendones y de tejido conjuntivo, se pesan. Se analiza el grado de atrofia en los músculos afectados, por ejemplo, midiendo la masa muscular, el área de sección transversal del músculo, el área de sección transversal de la miofibra o el contenido de proteína contráctil.

El modelo de atrofia inducido por glucocorticoides implica la administración de un glucocorticoide al animal de ensayo, p. ej., 1,2 mg/kg/día de dexametasona en el agua de bebida. De forma típica, en los animales no tratados, a los 10 días de la administración de dexametasona la masa de músculo esquelético se reduce del 30 al 50%. Concomitantemente con, o tras la administración del glucocorticoide, se administran los péptidos de ensayo, p. ej. mediante inyección o mediante infusión continua, para determinar su efecto sobre la atrofia del músculo esquelético inducida por glucocorticoides. En diversos tiempos tras la administración de glucocorticoides, se analiza el grado de atrofia en los músculos afectados tal como se ha descrito anteriormente para el modelo de denervación.

El modelo de atrofia por desuso debido al escayolado de la pata implica el escayolado de una pata trasera de un animal desde la rodilla hasta el pie. De forma típica, a los 10 días del escayolado la masa muscular se reduce del 20 al 40%. Tras el escayolado, los péptidos de ensayo se administran mediante inyección o mediante infusión continua, p. ej., mediante la implantación de una minibomba osmóstica (p. ej., Alzet, Palo Alto, CA), para determinar su efecto sobre la atrofia del músculo esquelético inducida por el escayolado de la pata. En diversos tiempos tras el escayolado de la pata, se analiza el grado de atrofia en los músculos afectados tal como se ha descrito anteriormente para el modelo de denervación.

La actividad ósea de los péptidos de la invención se puede demostrar convenientemente utilizando un ensayo diseñado para analizar la capacidad de los compuestos de la invención para aumentar el volumen, la masa o la densidad ósea. Un ejemplo de dichos ensayos es el ensayo en rata ovariectomizada.

En el ensayo en rata ovariectomizada, se ovariectomizan ratas de seis meses, y al cabo de 2 meses se les aplica subcutáneamente una dosis diaria de un compuesto de ensayo. Al finalizar el estudio, se puede medir la masa y/o la densidad ósea mediante absorciometría de rayos x de doble energía (DXA) o tomografía computerizada cuantitativa periférica (pQCT) o microtomografía computerizada (mCT). De forma alternativa, se puede usar la histomorfometría estática y dinámica para medir el aumento del volumen o formación ósea.

Composiciones

Otro aspecto de esta invención son las composiciones que comprenden: (a) una cantidad segura y eficaz de un a péptido de la presente invención y (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se usan técnicas de formulación farmacéutica estándar, como las descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., última edición.

Una "cantidad segura y eficaz" significa una cantidad del péptido de la invención suficiente para inducir significativamente una modificación positiva de la afección a tratar, pero lo suficientemente baja como para evitar efectos adversos graves (como toxicidad, irritación o respuesta alérgica) en un animal, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un sujeto humano en necesidad del mismo, de acuerdo con una relación ventaja/riesgo razonable cuando se usa siguiendo el método de esta invención. La "cantidad segura y eficaz" específica variará obviamente dependiendo de factores tales como la afección particular a tratar, el estado físico del sujeto, la duración del tratamiento, la naturaleza del tratamiento concomitante (si procede), la forma farmacéutica específica que se usa, el vehículo utilizado, la solubilidad del péptido en la misma y la pauta posológica deseada para la composición. El experto en la técnica podrá usar las siguientes descripciones para determinar una "cantidad segura y eficaz" de acuerdo con la presente invención. Spilker B., Guide to Clinical Studies and Developing Protocols, Raven Press Books, Ltd., New York, 1984, págs. 7-13, 54-60; Spilker B., Guide to Clinical Trials, Raven Press, Ltd., New York, 1991, págs. 93-101; Craig C. y R. Stitzel, eds., Modern Pharmacology, 2ª ed., Little, Brown and Co., Boston, 1986, págs. 127-33; T. Speight, ed., Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 3ª ed., Williams and Wilkins, Baltimore, 1987, págs. 50-56; R. Tallarida, R. Raffa y P. McGonigle, Principles in General Pharmacology, Springer-Verlag, New York, 1988, págs. 18-20.

Además del péptido de la invención, las composiciones de la presente invención contienen un vehículo farmacéuticamente aceptable. La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable", en la presente memoria, significa una o más cargas sólidas o líquidas, diluyentes o sustancias encapsulantes compatibles que son adecuadas para la administración a un animal, preferiblemente a un mamífero, más preferiblemente a un humano. La expresión "compatible", en la presente memoria, significa que los componentes de la composición son capaces de ser combinados con el péptido de la invención, y entre sí, de manera que no se produce ninguna interacción que reduzca sustancialmente la eficacia farmacéutica de la composición en situaciones de uso ordinarias. Los vehículos farmacéuticamente aceptables deben, lógicamente, presentar una pureza suficientemente alta y una toxicidad suficientemente baja como para resultar adecuados para ser administrados al animal, preferiblemente al mamífero y más preferiblemente al humano que deba ser tratado.

Algunos ejemplos de sustancias que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables o componentes de los mismos son: azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidón y almidón de patata; celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa, y metilcelulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; lubricantes sólidos, tales como ácido esteárico y estearato de magnesio; sulfato cálcico; aceites vegetales, tales como aceite de cacahuete, aceite de algodón, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de teobroma; polioles, tales como propilenglicol, glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ácido algínico; emulsionantes, tales como los Tweens®; agentes humectantes, tales como laurilsulfato sódico; agentes colorantes; agentes aromatizantes; agentes para compresión, estabilizantes; antioxidantes; conservantes; agua apirógena; solución salina isotónica y soluciones de tampón fosfato.

La elección de un vehículo farmacéuticamente aceptable para usarse conjuntamente con el compuesto de la invención está básicamente determinada por el modo de administración del péptido.

Si el péptido de la invención va a ser inyectable, el vehículo farmacéuticamente aceptable preferido es solución salina fisiológica estéril, con un agente de suspensión hemocompatible, cuyo pH se ha ajustado a aproximadamente 7,4.

En particular, los vehículos farmacéuticamente aceptables para la administración sistémica incluyen azúcares, almidones, celulosa y sus derivados, malta, gelatina, talco, sulfato cálcico, aceites vegetales, aceites sintéticos, polioles, ácido algínico, soluciones tampón fosfato, emulsionantes, solución salina isotónica y agua exenta de pirógenos. Los vehículos preferidos para administración parenteral incluyen propilenglicol, etil oleato, pirrolidona, etanol y aceite de sésamo. Preferiblemente, el vehículo farmacéuticamente aceptable para composiciones de administración parenteral comprende al menos aproximadamente un 90% en peso de la composición total.

Las composiciones de la presente invención se proporcionan preferiblemente en forma farmacéutica unitaria. En la presente memoria, una "forma farmacéutica unitaria" es una composición de esta invención que contiene una cantidad del péptido que es adecuada para la administración a un animal, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un sujeto humano, en una dosis única, según la buena práctica médica. Estas composiciones preferiblemente contienen de aproximadamente 0,1 mg (miligramos) a aproximadamente 1000 mg, más preferiblemente de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 500 mg, más preferiblemente de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 30 mg, de péptido.

Las composiciones de esta invención pueden estar en diversas formas adecuadas, por ejemplo, para la administración oral, rectal, tópica, nasal, ocular o parenteral. Dependiendo de la vía de administración deseada, puede elegirse entre los diferentes vehículos farmacéuticamente aceptables conocidos en la técnica. Estos incluyen cargas, diluyentes, hidrótropos, tensioactivos y sustancias encapsulantes sólidas o líquidas. Pueden incluirse materiales farmacéuticamente activos opcionales que no interfieran prácticamente con la actividad agonista del CRF_{2}R de los péptidos. La cantidad del vehículo utilizado conjuntamente con el péptido es suficiente para proporcionar una cantidad práctica del material para administración por dosis unitaria del péptido. Las técnicas y composiciones para preparar las formas farmacéuticas útiles en los métodos de esta invención se describen en las siguientes referencias: Modern Pharmaceutics, Capítulos 9 y 10 (Banker & Rhodes, editores, 1979); Lieberman y col., Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets (1981); y Ansel, Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms 2ª Edición (1976).

Pueden utilizarse diferentes formas farmacéuticas orales, incluidas formas sólidas tales como comprimidos, cápsulas, gránulos o polvos a granel. Estas formas orales comprenden una cantidad segura y eficaz, habitualmente de al menos aproximadamente 5% y preferiblemente de aproximadamente 25% a aproximadamente 50%, del péptido. Los comprimidos pueden tratarse mediante compresión, trituración, recubrimiento entérico, recubrimiento de azúcar, recubrimiento pelicular o mediante compresión múltiple, y pueden contener aglutinantes, lubricantes, diluyentes, disgregantes, colorantes, aromatizantes, fluidificantes y agentes fusionantes adecuados. Las formas farmacéuticas orales líquidas incluyen soluciones acuosas, emulsiones, suspensiones, soluciones y/o suspensiones reconstituidas a partir de gránulos no efervescentes y preparaciones efervescentes reconstituidas a partir de gránulos efervescentes y que contienen disolventes adecuados, conservantes, emulsionantes, agentes de suspensión, diluyentes, edulcorantes, agentes fusionantes, colorantes y aromatizantes.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados para preparar formas farmacéuticas unitarias para administración oral son bien conocidos en la técnica. Los comprimidos comprenden de forma típica adyuvantes farmacéuticamente compatibles convencionales tales como diluyentes inertes como el carbonato cálcico, el carbonato sódico, el manitol, la lactosa y la celulosa; aglutinantes tales como el almidón, la gelatina y la sacarosa; disgregantes tales como el almidón, el ácido algínico y la croscarmelosa; lubricantes tales como el estearato de magnesio, el ácido esteárico y el talco. Pueden utilizarse agentes deslizantes tales como dióxido de silicio para mejorar las características de flujo de la mezcla en polvo. Pueden añadirse agentes colorantes, tales como los colorantes FD&C, para mejorar el aspecto. Los edulcorantes y los agentes aromatizantes, tales como el aspartamo, la sacarina, el mentol, el peppermint y los aromas de fruta son adyuvantes útiles para comprimidos masticables. Las cápsulas comprenden de forma típica uno o más de los diluyentes sólidos descritos anteriormente. La selección de los componentes vehículos depende de consideraciones secundarias tales como el sabor, el coste y la estabilidad durante el almacenamiento, que no son críticas para los fines de la presente invención y pueden ser fácilmente realizadas por el experto en la técnica. En general, la formulación incluirá el péptido y los ingredientes inertes que permitan la protección frente al medio del estómago y la liberación del material biológicamente activo en el intestino.

El péptido de la invención puede modificarse químicamente de modo que la liberación oral del derivado sea eficaz. Generalmente, la modificación contemplada es la unión de al menos un resto a la propia molécula de la proteína, donde dicho resto permite (a) inhibición de la proteolisis y (b) la absorción en el torrente circulatorio desde estómago o el intestino. También se desea el aumento en la estabilidad global de la proteína y el aumento en el tiempo de la circulación en el cuerpo. Ejemplos de dichos restos incluyen: polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona y poliprolina. Newmark y col., J. Appl. Biochem., 4:185-189 (1982). Otros polímeros que se podrían usar son el poli-1,3-dioxolano y el poli-1,3,6-tioxocano. Se prefieren para el uso farmacéutico, como se ha indicado más arriba, los restos polietilen-
glicol.

El sitio de liberación puede ser el estómago, el intestino delgado (el duodeno, el yeyuno o el íleo) o el intestino grueso. El experto en la técnica tiene formulaciones disponibles que no se disuelven en el estómago pero que permiten que el material se libere en el duodeno o en otro lugar del intestino. Preferiblemente, la liberación evitará los efectos deletéreos del ambiente del estómago, mediante protección del péptido (o variante) o mediante la liberación del material biológicamente activo más allá de este entorno, como es en el intestino.

Para garantizar la resistencia gástrica total se prefiere un recubrimiento impermeable hasta un pH de al menos 5,0. Los ejemplos de los ingredientes inertes más comunes que se utilizan como recubrimientos entéricos son acetato-trimetilato de celulosa (CAT), ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, acetato-ftalato de polivinilo (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, acetato-ftalato de celulosa (CAP), Eudragit L, Eudragit S y goma laca. Estos recubrimientos se pueden usar como películas mezcladas.

Las composiciones orales también incluyen soluciones líquidas, emulsiones, suspensiones y similares. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados para preparar estas composiciones son bien conocidas en la técnica. Los componentes de vehículos típicos para jarabes, elixires, emulsiones y suspensiones incluyen etanol, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, sacarosa líquida, sorbitol y agua. Para una suspensión, los agentes de suspensión típicos incluyen metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, Avicel® RC-591, tragacanto y alginato sódico; agentes humectantes típicos incluyen lecitina y polisorbato 80 y conservantes típicos incluyen metilparabeno y benzoato sódico. Las composiciones líquidas orales también pueden contener uno o más componentes tales como los edulcorantes, agentes aromatizantes y colorantes descritos anteriormente.

Las composiciones de la presente invención pueden incluir opcionalmente otros agentes activos. Ejemplos no limitativos de agentes activos se citan en WO 99/15210.

Otras composiciones útiles para conseguir la liberación sistémica de los compuestos de la invención incluyen las formas farmacéuticas sublinguales, bucales, supositorios, nasales y pulmonares. Estas composiciones comprenden de forma típica una o más sustancias de carga solubles tales como sacarosa, sorbitol y manitol; y aglutinantes tales como goma arábiga, celulosa microcristalina, carboximetilcelulosa y hidroxipropil metilcelulosa. También pueden incluir los agentes deslizantes, lubricantes, edulcorantes, colorantes, antioxidantes y aromatizantes descritos anteriormente.

Las composiciones de esta invención se pueden administrar también por vía tópica a un sujeto, p. ej., mediante la deposición directa o la dispersión de la composición sobre el tejido epidérmino o epitelial del sujeto o por vía transdérmica a través de un "parche". Un ejemplo de un aplicador de parche adecuado se describe en WO 02/47593. Estas composiciones incluyen, p. ej., lociones, cremas, soluciones, geles y sólidos. Estas composiciones tópicas preferiblemente comprenden una cantidad segura y eficaz, habitualmente al menos aproximadamente 0,1% y preferiblemente de aproximadamente 1% a aproximadamente 5%, de péptido. Los vehículos adecuados para la administración tópica preferiblemente permanecen sobre la piel en forma de película continua y no se despegan de allí ni por el efecto de la transpiración ni de la inmersión en agua. Generalmente, el vehículo es de naturaleza orgánica y es capaz de dispersarse o disolverse en el péptido. El vehículo puede incluir emolientes, emulsionantes, espesantes, disolventes farmacéuticamente aceptables y similares.

Métodos de administración

Esta invención también proporciona el uso de un péptido según la invención en la fabricación de un medicamento para prevenir o tratar los trastornos modulados por el CRF_{2}R en un humano u otro sujeto animal, mediante la administración de una cantidad segura y eficaz de un péptido a dicho sujeto. Dichos trastornos se han descrito anteriormente.

Las composiciones de la presente invención pueden ser administradas de forma tópica o sistémica. La administración sistémica incluye cualquier método de introducción de un péptido de Fórmula (I) en los tejidos del organismo, p. ej., la administración intra-articular (especialmente en el tratamiento de la artritis reumatoide), intratecal, epidural, intramuscular, transdérmica, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, nasal, pulmonar, sublingual, rectal y oral.

La dosificación específica del péptido que se va a administrar, así como la duración del tratamiento y si el tratamiento es tópico o sistémico son interdependientes. El régimen de dosificación y tratamiento dependerá también de factores como el péptido específico utilizado, la indicación de tratamiento, la capacidad del péptido en alcanzar las concentraciones inhibitorias mínimas en el sitio del tejido que necesita tratamiento, los atributos personales del sujeto (como peso), cumplimiento con el régimen de tratamiento y la presencia y gravedad de cualquiera de los efectos adversos del tratamiento.

Se puede usar la administración tópica para liberar el péptido sistémicamente o para tratar a un sujeto localmente. Las cantidades del péptido que se va a administrar por vía tópica dependerán de dichos factores, tales como sensibilidad cutánea, tipo y localización del tejido que se va a tratar, la composición y el vehículo (si procede) que se va a administrar, el péptido particular que se va a administrar, así como el trastorno particular que se va a tratar y el grado hasta el cual se desean los efectos sistémicos (a diferencia de los locales).

Los péptidos de la presente invención se pueden dirigir a localizaciones específicas donde se necesite el tratamiento utilizando ligandos redireccionados. Por ejemplo, para dirigir un péptido para tratar la distrofia muscular, el péptido se conjuga con un anticuerpo o con un fragmento del mismo que es inmunorreactivo con un marcador del músculo esquelético tal cual se entiende generalmente en la técnica. El ligando redireccionado también puede ser un ligando adecuado para un receptor que esté presente en el músculo esquelético. Puede utilizarse cualquier ligando redireccionado que reaccione de forma específica con un marcador para el tejido objetivo previsto. Los métodos para unir el compuesto de la invención al ligando redireccionado son bien conocidos y similares a los que se describen más adelante para la unión al vehículo.

Un péptido de la invención se puede administrar mediante liberación controlada. Por ejemplo, el péptido se puede administrar usando infusión intravenosa, una bomba osmótica implantable, un parche transdérmico, liposomas, inyección depot subcutánea que contiene un material biodegradable u otros modos de administración. En una realización, se puede usar una bomba, Langer y col., eds., Medical Applications of Controlled Release, CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng., 14:201 (1987); Buchwald y col., Surgery, 88:507 (1980); Saudek y col., N. Engl. J. Med., 321:574 (1989). En otra realización, se pueden usar materiales poliméricos. Langer, 1974, supra; Sefton, 1987, supra; Smolen y col., eds., Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Wiley, N.Y. (1984); Ranger y col., J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem., 23:61 (1983); véase también Levy y col., Science, 228:190 (1985); During y col., Ann. Neurol., 25:351 (1989); Howard y col., J. Neurosurg., 71:105 (1989). En otra realización más, se puede colocar un sistema de liberación controlada en las proximidades de la diana terapéutica, requiriendo así sólo una fracción de la dosis sistémica. Véase p. ej., Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, págs. 115-138 (1984). En otra realización más, un sistema de suministro del fármaco a base de polímero en donde los fármacos se liberan de los sistemas polimérico o lipídico. Estos sistemas suministran un fármaco mediante tres mecanismos generales: (1) difusión de la especie farmacéutica desde o a través del sistema; (2) una reacción química o enzimática que produce la degradación del sistema o escisión del fármaco del sistema y (3) activación del disolvente, o por ósmosis o hinchamiento del sistema. Los sistemas adecuados se describen en artículos de revisión: Langer, Robert, "Drug delivery and targeting", Nature: 392 (Supp):5-10 (1996); Kumar, Majeti N. V., "Nano and Microparticles as Controlled Drug Delivery Devices", J Pharm Pharmaceut Sci, 3(2):234-258 (2000); Brannon-Peppas, "Polymers in Controlled Drug Delivery", Medical Plastics and Biomaterials, (Nov. 1997). Véase también, Langer, 1990, supra; Treat y col., en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, págs. 353-365 (1989); Langer, Science, 249:1527-1533 (1990). Los sistemas adecuados pueden incluir: Atrigel^{TM} sistema de suministro de fármacos de Atrix Labs; DepoFoam^{TM} de SkyPharma; hidrogeles a base de polietilenglicol de Infimed Therapeutics, Inc.; ReGel^{TM}, SQZGel^{TM} oral, HySolv^{TM} y ReSolv^{TM} sistemas de suministro de fármacos para disolución de MacroMed; ProGelz^{TM} de ProGelz' Products y ProLease^{TM} inyectable de Alkermes.

Evidentemente, en todos los anteriores, los péptidos de la invención se pueden administrar solos o como mezclas y las composiciones pueden incluir además otros fármacos o excipientes según sea adecuado para la indicación.

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Terapia génica

Se pueden utilizar vectores de expresión para introducir los ácidos nucleicos de la invención en una célula como parte de la terapia génica. Dichos vectores generalmente tienen sitios de restricción convenientes localizados cerca de la secuencia del promotor para proporcionar la inserción de las secuencias de ácidos nucleicos. Se pueden preparar cassettes de transcripción que comprenden una región de iniciación de la transcripción, el gen diana o fragmento del mismo y una región de terminación de la transcripción. Los cassettes de transcripción se pueden introducir mediante diversos vectores, p. ej., plásmidos, retrovirus, lentivirus, adenovirus y similares, donde los vectores son capaces de mantenerse transitoriamente o establemente en las células, habitualmente durante un período de al menos aproximadamente un día, más habitualmente durante un período de al menos aproximadamente varios días hasta varias semanas.

Las proteínas y los ácidos nucleicos de la invención se pueden introducir en tejidos o células huésped mediante cualquier ruta, incluyendo infección vírica, microinyección o fusión de vesículas. Para la administración intramuscular también se puede utilizar la inyección de chorro, como se describe por Furth y col., Anal. Biochem., 205:365-368 (1992). Se pueden recubrir micropartículas de oro con el ADN y administrarlas por vía intradérmica mediante un dispositivo de bombardeo de partículas o "cañón génico" como se describe en la literatura. Véase, p. ej., Tang y col., Nature 356:152-154 (1992), donde los microproyectiles de oro se recubren con ADN y a continuación se bombardean en las células cutáneas.

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Kits

Los péptidos de la presente invención pueden estar embebidos en un kit para prevenir o tratar un trastorno modulado por el CRF_{2}R que comprende: (a) el péptido en una forma de dosis unitaria e (b) instrucciones de uso. Un kit de este tipo preferiblemente incluye varias dosificaciones unitarias. Dichos kits pueden incluir una lámina que tiene dosificaciones orientadas en el orden de uso previsto. Un ejemplo de un kit de este tipo es un "envase de burbuja o blíster". Los envases de burbuja o blíster son bien conocidos en la industria del envasado y son ampliamente utilizados para el envasado de las formas de dosificación unitarias farmacéuticas. Si se desea, se puede proporcionar un recordatorio, por ejemplo, en la forma de números, letras u otros marcadores o un calendario que indique los días de la pauta posológica en los cuales se deben administrar las dosificaciones. Un ejemplo de un kit se describe en WO 01/45636. Las pautas posológicas están dentro del ámbito de los expertos en la técnica médica. Ejemplos no limitativos incluyen la administración una vez al día, semanalmente, bisemanalmente, mensualmente o bimensual-
mente.

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Ejemplos Ejemplo 1

La sauvagina y otros agonistas no selectivos del CRFR generalmente no son eficaces para tratar los trastornos modulados por el CRF_{2}R porque estos agonistas también activan el CRF_{1}R resultando de este modo en efectos adversos no deseables.

La Tabla 2 refleja la unión a CRF comparativa para los fragmentos de secuencia natural de la urocortina I humana (hUcnI), urocortina II humana (hUroII), urocortina III humana (hUroIII), factor de liberación de la corticotropina humana (hCRF), corticotropina ovina (oCRF) y sauvagina (Svg) designadas como SEC. N.º: 1-6 respectiva-
mente.

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TABLA 2

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3

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Ejemplo 2

La Tabla 3 refleja la unión a CRF comparativa de diversas realizaciones de la invención.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3

4

5

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Ejemplo 3 Aumento de la eficacia in Vivo

Los péptidos de la presente invención presentan una mayor disponibilidad biológica, especialmente en condiciones de dosificación baja, comparado con las secuencias naturales, p. ej., el fragmento del péptido UroII (SEC. N.º: 4).

La semivida de un péptido en un sujeto se puede determinar, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) de las muestras séricas recogidas del sujeto en diversos tiempos tras la administración del péptido. El experto en la técnica sabrá cómo seleccionar los tampones de elución apropiados para la HPLC basándose en las propiedades fisicoquímicas de un péptido particular.

Un ejemplo no limitativo de un estudio in vivo para determinar la eficacia se ha descrito en la presente memoria. Se administra a ratones por vía intravenosa (IV) (1000 \mug/kg) y por vía subcutánea (SC) (1000 \mug/kg) un péptido de Fórmula (I). Se obtienen muestras de sangre en diversos puntos temporales (IV = 0, 2, 10, 30 min y 1, 2, 4 y 6 h y SC = 0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4 y 6 h) después de la administración de la dosis y se añaden a tubos que contienen heparina sódica. Las muestras de sangre se procesan a continuación para obtener plasma que se conserva a -70ºC hasta que se analizan.

Se preparan las muestras patrón de plasma. El día del análisis se prepara una solución de enriquecimiento de un péptido de Fórmula (I) en metanol que cubre un intervalo de concentración desde 50 ng/ml hasta 100 \mug/ml mediante dilución seriada de una solución madre metanólica del péptido de Fórmula (I) 1 mg/ml previamente preparada. De modo similar, el día del análisis se prepara el patrón interno (ISTD), solución de enriquecimiento de h-Unc-II marcada con un isótopo estable mediante dilución seriada de una solución madre de ISTD 1 mg/ml para obtener una concentración final de 5 \mug/ml. Los patrones de plasma de trabajo que cubren un intervalo de masa desde 0,5 hasta 100 ng se preparan añadiendo 10 \mul de la correspondiente solución de enriquecimiento del péptido de Fórmula (I) en tubos que contienen 10 \mul de una solución de ISTD 5 \mug/ml, 100 \mul de agua desionizada y agua dd y 100 \mul de plasma de rata como blanco. Los patrones de trabajo se preparan para el análisis como se describe a continuación.

Se preparan muestras de control de calidad (CC). Se prepara una solución madre de CC a una concentración de 50 ng/ml añadiendo 25 \mul de una solución de enriquecimiento de un péptido de Fórmula (I) 1 \mug/ml a 475 \mul de plasma de rata heparinizado como blanco contenido en un vial de plástico. Las muestras de CC de trabajo se preparan añadiendo 100 \mul de la solución madre de CC (50 ng/ml) a tubos que contienen 10 \mul de una solución de ISTD 5 \mug/ml y 100 \mul de agua dd. La muestra de CC de trabajo se preparó para el análisis como se describe a continuación.

Se preparan muestras de estudio. El día del análisis, las muestras se descongelan a temperatura ambiente y se añade una alícuota de la muestra a un tubo que contiene 10 \mul de una solución de ISTD 5 \mug/ml, 100 \mul de agua dd y una alícuota de plasma de rata heparinizado como blanco. El volumen de la muestra y el plasma de rata como blanco son tal que el volumen total de plasma es igual a 100 \mul.

Los patrones de trabajo, las muestras de CC de trabajo y las muestras de estudio se preparan para el análisis añadiendo 400 \mul de acetonitrilo a tubos que contienen cada uno éstos, se cierran, se agitan en Vórtex, se centrifugan y se aísla el sobrenadante. Se seca una alícuota (300 \mul) del sobrenadante en N_{2} y se reconstituye en 50 \mul de metanol/agua (50/50).

Los patrones de trabajo preparados, las muestras de CC de trabajo y las muestras de estudio se analizan mediante separación por cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa (RP-HPLC) en gradiente seguido de la introducción de la muestra mediante ionización por electronebulización (ESI) con detección de espectroscopía de masas /
espectroscopía de masas (MS/MS) utilizando monitorización de la reacción seleccionada (SRM) en el modo de ion positivo. Se monitoriza un canal SRM para h-Unc-II e ISTD.

Las soluciones de la dosis del estudio farmacocinético se diluyen con metanol y se analizan mediante RP-HPLC con detección ultravioleta. Las concentraciones del péptido de Fórmula (I) en las soluciones de la dosis se calculan por interpolación de una curva de regresión lineal construida a partir de patrones conocidos.

<110> The Procter & Gamble Company

\hskip1cm Isfort, Robert J

\hskip1cm Mazur, Wieslaw A

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<120> Agonistas del receptor del factor liberador 2 de la corticotropina

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<130> 8847M2/CA

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<140> EP 03731965.4

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<141> 2003-01-16

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<150> US 60/349,117

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<151> 2002-01-16

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/376,337

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2002-04-29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/388,895

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2002-06-14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/411,988

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2002-09-19

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<160> 45

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<170> PatentIn versión 3,1

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<210> 1

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<211> 40

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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6

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<210> 2

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<211> 38

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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7

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<210> 3

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<211> 40

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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8

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<210> 4

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<211> 41

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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9

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<210> 5

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<211> 41

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<212> PRT

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<213> Ovis sp.

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<400> 5

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10

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<210> 6

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<211> 40

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<212> PRT

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<213> Phyllomedusa sauvagei

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (1)..(1)

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<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (40)..(40)

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<223> AMIDACIÓN

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<400> 6

11

12

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<210> 7

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<211> 40

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<212> PRT

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (40)..(40)

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<223> AMIDACIÓN

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (1)..(1)

<223) ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

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<400> 7

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13

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<210> 8

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<211> 40

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Artificial

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (40)..(40)

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<223> AMIDACIÓN

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (1)..(1)

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<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

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<400> 8

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15

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<210> 9

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<211> 40

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Artificial

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (40)..(40)

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<223> AMIDACIÓN

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (1)..(1)

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<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

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<400> 9

17

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<210> 10

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<211> 40

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Artificial

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (40)..(40)

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<223> AMIDACIÓN

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (1)..(1)

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<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

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<400> 10

18

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<210> 11

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<211> 40

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<212> PRT

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (1)..(1)

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<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (40)..(40)

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<223> AMIDACIÓN

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<400> 11

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19

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

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<211> 40

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Artificial

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (1)..(1)

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<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (40)..(40)

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<223> AMIDACIÓN

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<400> 12

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<210> 13

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<211> 40

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Artificial

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (1)..(1)

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<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (40)..(40)

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<223> AMIDACIÓN

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\vskip0.400000\baselineskip

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<210> 14

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<211> 40

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Artificial

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (1)..(1)

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<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (40)..(40)

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<223> AMIDACIÓN

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<400> 14

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22

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<210> 15

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<211> 40

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Artificial

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<221> MOD_RES

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<222> (40)..(40)

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<223> AMIDACIÓN

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (1)..(1)

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<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

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<400> 15

23

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<210> 16

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<211> 40

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Artificial

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (1)..(1)

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<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (40)..(40)

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<223> AMIDACIÓN

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<400> 16

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<210> 17

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<211> 40

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Artificial

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (1)..(1)

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<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (40)..(40)

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<223> AMIDACIÓN

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<400> 17

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25

26

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<210> 18

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<211> 40

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (40)..(40)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AMIDACIÓN

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

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27

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\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

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<212> PRT

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (40)..(40)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AMIDACIÓN

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<400> 19

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<212> PRT

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<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (40)..(40)

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<223> AMIDACIÓN

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30

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<212> PRT

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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\vskip0.400000\baselineskip

<223> AMIDACIÓN

\newpage

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (1)..(40)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AMIDACIÓN

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<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (40)..(40)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AMIDACIÓN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip1.000000\baselineskip

33

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\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

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<212> PRT

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<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (1)..(1)

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<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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\vskip0.400000\baselineskip

<223> AMIDACIÓN

\newpage

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34

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<212> PRT

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<223> AMIDACIÓN

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\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 40

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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\vskip0.400000\baselineskip

<223> AMIDACIÓN

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<212> PRT

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<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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\vskip0.400000\baselineskip

<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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\vskip0.400000\baselineskip

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\newpage

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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\vskip0.400000\baselineskip

<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<223> AMIDACIÓN

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\vskip0.400000\baselineskip

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<212> PRT

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<223> AMIDACIÓN

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\vskip0.400000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (40)..(40)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AMIDACIÓN

\newpage

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<212> PRT

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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\vskip0.400000\baselineskip

<223> AMIDACIÓN

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<223> AMIDACIÓN

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<212> PRT

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (40)..(40)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AMIDACIÓN

\newpage

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<212> PRT

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<220>

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (40)..(40)

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<223> AMIDACIÓN

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<212> PRT

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<220>

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<223> Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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\vskip0.400000\baselineskip

<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<223> AMIDACIÓN

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<212> PRT

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (40)..(40)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AMIDACIÓN

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

48

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (40)..(40)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AMIDACIÓN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

49

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (40)..(40)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AMIDACIÓN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

50

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (40)..(40)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AMIDACIÓN

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (40)..(40)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AMIDACIÓN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (40)..(40)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AMIDACIÓN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (40)..(40)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AMIDACIÓN

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

57

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (40)..(40)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AMIDACIÓN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

58

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (40)..(40)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AMIDACIÓN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (40)..(40)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AMIDACIÓN

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

60

Claims (14)

1. Un péptido no natural que comprende la secuencia

\quad

-ZGPPISIDLPX_{12}X_{13}LLRKX_{18}IEIEKQEKEKQQAX_{32}X_{33}NAX_{36}X_{37}LX_{39}X_{40}X_{41}

en donde:

a)

X_{12} se selecciona de F, Y, L, I y T;

b)

X_{13} se selecciona de Q, W e Y;

c)

X_{18} se selecciona de V y M;

d)

X_{32} se selecciona de T y A;

e)

X_{33} se selecciona de N y T;

f)

X_{36} se selecciona de R y L;

g)

X_{37} se selecciona de L e I;

h)

X_{39} se selecciona de D y A;

i)

X_{40} se selecciona de T y R; y

j)

X_{41} se selecciona de I y V;

o variantes del mismo que tienen al menos 95% de identidad con la secuencia, siendo dichas variantes agonistas de CRF_{2}R.

2. El péptido según la reivindicación 1, en el que X_{12} se selecciona de F, L, T e Y.

3. El péptido según la reivindicación 1, en el que la secuencia X_{12}X_{13} se selecciona de FQ, YQ, YW, LQ, LY, IY y TY.

4. El péptido según la reivindicación 1, en el que la secuencia X_{32}X_{33} se selecciona de AN y TT.

5. El péptido según la reivindicación 1, en el que la secuencia X_{36}X_{37} se selecciona de RL, LL y RI.

6. El péptido según la reivindicación 3, en el que la secuencia X_{32}X_{33} se selecciona de AN y TT.

7. El péptido según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en el que la secuencia X_{36}X_{37} se selecciona de RL, LL y RI.

8. El péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 4, 5, 6 ó 7, en el que la secuencia X_{39}X_{40}X_{41} se selecciona de DTI, ARI, ATI, DRV y ARV.

9. El péptido según la reivindicación 1, seleccionado de la SEC. N.º: 9, 11, 13, 14, 16, 32, 33, 34, 39, 41, 42, 43, 44 y 45.

10. Un péptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para prevenir o tratar un trastorno modulado por el CRF_{2}R.

11. El péptido de la reivindicación 10, en el que el trastorno es atrofia del músculo esquelético.

12. Un ácido nucleico aislado que codifica un péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

13. Un anticuerpo aislado específico para un péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

14. Una composición farmacéutica que comprende:

\quad

a) una cantidad segura y eficaz de un péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9; y

\quad

b) un vehículo farmacéuticamente aceptable.