JP4347940B2 - 酵素の活性化方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素反応に使用される酵素であるα−アミラーゼ、酸性プロテアーゼ、リパーゼを活性化する方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
食品素材の調理、加工等、食品加工における酵素反応に関与する酵素には多くの種類があり、その主要な酵素としては、α−アミラーゼ、酸性プロテアーゼ、リパーゼ等が知られている。α−アミラーゼは、澱粉を分解してデキストリン、異性化糖、ブドウ糖、水飴、マルトース、マルトオリゴ糖、シクロデキストリン、カップリングシュガー等の製造に使用され、酸性プロテアーゼは、醤油、味噌、麺つゆ、焼き肉のたれ、ドレッシング等の製造に使用され、リパーゼは、脂肪酸、石鹸、糖脂肪酸エステル等の界面活性剤、香料、メントール等の製造に使用される。これらの酵素の使用に際しては、酵素反応の前段階において、酵素の活性を高めておくことが有利である。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
従来、酵素の使用に際しては、酵素反応の前段階で、酵素を蒸留水、または反応液のpHに合わせた緩衝液に溶解して酵素溶液にする手段が採られている。これは、通常、酵素反応が最適な範囲のpHで行われるため、酵素溶液を添加した際に反応液が最適なpHの範囲から外れないようにするためである。換言すれば、かかる手段は、酵素の活性を予め高めるものではない。
【0004】
従って、本発明の目的は、酵素反応に使用される主要な酵素であるα−アミラーゼ、酸性プロテアーゼ、リパーゼを酵素反応に使用する場合、酵素反応の前段階において、酵素の活性を高める方法を提供することにある。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明は、酵素反応に使用される主要な酵素であるα−アミラーゼ、酸性プロテアーゼ、リパーゼを酵素を活性化する方法であって、これらの酵素を、塩化ナトリウムの希釈水溶液を被電解水とする有隔膜電解にて生成される電解生成水に溶解して活性化するものである。
【0006】
しかして、本発明に係る酵素の活性化方法においては、前記酵素としてα−アミラーゼを採用する場合には前記電解生成水として電解生成アルカリ性水を採用すること、前記酵素として酸性プロテアーゼを採用する場合には前記電解生成水として電解生成酸性水を採用すること、前記酵素としてリパーゼを採用する場合には前記電解生成水として電解生成酸性水を採用することを特徴とするものである。
【0007】
【発明の作用・効果】
本発明に係る酵素の活性化方法によれば、図2、図4、図6に示すグラフを参照すれば明らかなように、酵素を水道水等通常の水(pH約7)に溶解する場合に比較して、酵素の活性が高くなっている。特に、酵素としてα−アミラーゼを採用する場合には、電解生成水として電解生成アルカリ性水を採用することにより、酵素として酸性プロテアーゼを採用する場合には、電解生成水として電解生成酸性水を採用することにより、また、酵素としてリパーゼを採用する場合には、電解生成水として電解生成酸性水を採用することにより、酵素の活性を高めることができる。
【0008】
これらの結果は、酵素を酵素反応に使用するに際して電解生成水に溶解することにより酵素の活性化を図ることができること、個々の酵素については、電解生成水を使用する酵素に対応して適宜選択することによりその活性化を図ることを教示している。
【0009】
電解生成水が酵素の活性を高める理由は定かではないが、非電解生成水でpHのみを変化させた水を溶解液として採用した比較例(図2、図4、図6に示す1点鎖線グラフ)を参照すれば、電解生成水を溶解液として採用した場合には、比較例に比して酵素の活性を一層高めている。酵素の活性が溶解液のpHに依存することは知られているが、電解生成水の場合には、pH以外の機能が大きく寄与していることが認められる。
【0010】
【発明の実施の形態】
本発明に係る酵素の活性化方法についての具体的例を、α−アミラーゼ(実験例1)、酸性プロテアーゼ(実験例2)、リパーゼ(実験例3)について説明する。
【0011】
(実験例1)
α−アミラーゼとしてアミラーゼVIII−A(シグマ株式会社社製:大麦麦芽起源)を採用するとともに、酵素を活性化するための供試水として下記に示す電解モデル水(電解生成水)およびpHモデル水を採用して、図1のフローチャートに示す方法で酵素の活性化実験を下記の条件で行った。
【0012】
電解モデル水:蒸留水に塩化ナトリウムを溶解して100mg/lの濃度の塩化ナトリウム水溶液を調製して、この水溶液を原水として有隔膜電解して得た電解生成水(pH3,pH4,pH10,pH11)。pHモデル水:蒸留水に水酸化ナトリウムまたは塩酸を添加して各種のpHの水溶液(pH3,pH4,pH10,pH11)を調製し、この水溶液に塩化ナトリウムを添加してNaイオン濃度を電解モデル水の原水と一致させた水溶液(Naイオン濃度39.3mg/l)。
【0013】
酵素活性測定キット:アミラーゼB−テストワコー(和光純薬工業株式会社製、発色酵素液キット、基質液キット、反応停止液キット)。活性測定:試験管に酵素溶液0.01mlと発色酵素液キット1mlを入れて反応開始液としてこれを37℃で5分間加温し、次いでこれに基質液キット1mlを入れて37℃で10分間反応させ、最後にこれに反応停止液キット2mlを入れて反応を停止する。この反応液を分光光度計で620nmの吸光度を測定し、この吸光度に基づいて酵素量を算出する。
【0014】
実験方法:図1のフローチャートに示す方法にて実施する。先ず、α−アミラーゼ85mgに供試水を加えて100mlの定容とした酵素溶液を調製し、この酵素溶液0.01ml中に発色酵素液キット1mlを添加して37℃で5分間加温し、次いで基質液キット1mlを添加して反応開始液として酵素反応を開始する。酵素反応においては、37℃で10分間正確に加温して行い、その後反応停止液キット2mlを添加して反応を停止する。この反応液を分光光度計で620nmの吸光度を測定する。
【0015】
本実験における各供試水、酵素溶液、反応開始液の性質変化の状態を表1および表2に示すとともに、各供試水に基づく酵素の活性状態を表3および表4に示す。また、各供試水に基づくpHと酵素活性比との関係を図2に示す。但し、図2に示す酵素活性比は、pH7の原水における酵素活性を1とする各酵素活性の比率を意味する。但し、酵素活性の値は5回測定した場合の平均値である。
【0016】
【表1】
【0017】
【表2】
【0018】
【表3】
【0019】
【表4】
【0020】
酵素活性については、供試水がアルカリ性域では酵素活性が上昇して、かつ酸性域では酵素活性が低下している。この傾向は電解モデル水、pHモデル水ともに共通しているが、アルカリ性域での酵素活性の上昇率および酸性域では酵素活性の低下率は、pHモデル水に比較して電解モデル水が大きい。特に、両モデル水がpH11である場合の酵素活性に着目すると、酵素活性は、電解モデル水においては20%上昇しているのに対して、pHモデル水においては7%であって、電解モデル水とpHモデル水との間では酵素に対する活性化の作用に大きな差があることが認められる。
【0021】
以上のことから、酵素の活性化を図るには電解生成水が有効であること、酵素としてα−アミラーゼを採用する場合には、電解生成アルカリ性水が極めて有効であることが判明した。電解生成アルカリ性水のこのような効果は、pHモデル水とを比較すればpHのみに起因するものではなく、また、表1および表2に示すpHおよび酸化還元電位(ORP)の値が電解生成アルカリ性水とpHモデル水との間で差がないことから、pHおよび酸化還元電位にのみに起因するものでないものと認められる。従って、電解生成水の酵素の活性化に及ぼす作用は、pH、酸化還元電位、および、その他の潜在する機能の総合によるものと判断される。
【0022】
(実験例2)
酸性プロテアーゼとしてプロテアーゼXXIII(シグマ株式会社社製:Aspergillus oryuse起源)を採用するとともに、酵素を活性化するための供試水としては実験例1で使用した電解モデル水(電解生成水)およびpHモデル水を採用して、図3のフローチャートに示す方法で酵素の活性化実験を下記の条件で行った。
【0023】
酸性プロテアーゼ:プロテアーゼXXIII。緩衝液:マッキルベイン緩衝液pH3(燐酸二ナトリウム、クエン酸)。カゼイン溶液:カゼイン(発色用)2gに10倍に薄めた乳酸5mlを加え、さらに蒸留水を加えて完全に白濁状に溶解するまで掻き混ぜる。この白濁液を一度沸騰させてから冷却し、これにpH3のマッキルベイン緩衝液20mlを加え、さらに蒸留水を加えて100mlに定容。チロシン標準溶液:L−チロシン10.0mgに1N塩酸1mlを加えて全容を100mlとして、これを原液(100mg/l)とする。検量線は原液を使用し、標準液として0mg/l,25mg/l,75mg/l,100mg/lのものを使用。
【0024】
酵素溶液の調製:酸性プロテアーゼ25mgに供試水を加えて25mlに定容し、室温(25℃)で5分間放置したもの。酵素活性の表示:酸性プロテアーゼの活性は、40℃で60分間に1μgのチロシン相当量の呈色を示す活性を1単位(1U)とする。酵素活性(1U/ml)=生成チロシン量×6/1(反応液量)×1/0.5(酵素液量)。
【0025】
実験方法:図3のフローチャートに示す方法にて実施する。先ず、カゼイン溶液1.5mlに緩衝液1.0mlを加えて40℃で5分間加温し、このカゼイン溶液に予め調製した酵素溶液0.5mlを加えて反応開始液として酵素反応を開始する。酵素反応においては、40℃で60分間反応させた後、0.4Mトリクロール酢酸溶液(TCA)3mlを加えて反応を停止し、反応停止液中の沈殿を濾別する。得られた濾液1mlを分取し、この濾液に0.4M炭酸ナトリウム溶液5mlと0.4Nフェノール試薬1mlを加えて40℃で30分間発色を行い、660nmの吸光度を測定する。
【0026】
本実験における電解モデル水を使用した供試水、酵素溶液、反応開始液の性質変化の状態を表5に示すとともに、同供試水に基づく酵素の活性状態を表6に示す。また、電解モデル水およびpHモデル水を供試水とするpHと酵素活性比との関係を図4のグラフに示す。但し、図4に示す酵素活性比は、pH7の原水における酵素活性を1とする各酵素活性の比率を意味する。
【0027】
【表5】
【0028】
【表6】
【0029】
酵素活性については、供試水が酸性域では酵素活性が上昇し、かつアルカリ性域では酵素活性が低下している。この傾向は電解モデル水、pHモデル水ともに共通しているが、酸性性域での酵素活性の上昇率およびアルカリ性域では酵素活性の低下率は、pHモデル水に比較して電解モデル水が大きい。電解モデル水がpH3である場合には酵素活性が42%上昇し、電解モデル水がpH4である場合には酵素活性が38%上昇していて、pHモデル水に比較して酵素活性化が高い。
【0030】
以上のことから、酵素の活性化を図るには電解生成水が有効であること、酵素として酸性プロテアーゼを採用する場合には、電解生成酸性水が極めて有効であることが判明した。電解生成酸性水のこのような効果は、pHモデル水とを比較すればpHのみに起因するものではなく、電解生成酸性水の電解機能の総合によるものと認められる。
【0031】
(実験例3)
リパーゼとして生化学工業株式会社製リパーゼ(Rhizopus delemar起源)を採用するとともに、酵素を活性化するための供試水としては実験例1で使用した電解モデル水(電解生成水)およびpHモデル水を採用して、図5のフローチャートに示す方法で酵素の活性化実験を下記の条件で行った。
【0032】
基質:トリオレン。緩衝液:0.05MでpHが5.6の酢酸緩衝液。賦活剤:0.1MCaCl2溶液。反応停止剤:エタノール。酵素溶液の調製:リパーゼ10mgに供試水を加えて10mlに定容し、室温(25℃)で5分間放置したもの。
【0033】
実験方法:図5のフローチャートに示す方法にて実施する。先ず、トリオレン0.48mlに酢酸緩衝液1.8mlおよび賦活剤であるCaCl2溶液0.2mlを加えて30℃で10分間加温し、これに酵素溶液0.2mlを加えて反応開始液として酵素反応を開始する。酵素反応においては、30℃で30分間振とうしつつ反応させた後、反応液にエタノール8mlを加えて反応を停止し、反応停止させた反応液を酵素活性測定に供する。
【0034】
酵素活性測定:反応液にエタノール8mlおよび蒸留水2.68mlを加えて、撹拌しつつ0.01N水酸化ナトリウムでpH9まで滴定し、下式により酵素活性を算出する(0.01N水酸化ナトリウム1mlに相当するオレイン酸量を1単位(U)とする。但し、ブランクテストには、酵素溶液に代えて蒸留水を使用)。
【0035】
リパーゼ活性(unit)=5×(T−Tb)×n T:試料の水酸化ナトリウム滴下量、Tb:ブランクテストでの水酸化ナトリウム滴下量、n:希釈率。
【0036】
本実験における電解モデル水を使用した供試水、酵素溶液、反応開始液の性質変化の状態を表7に示すとともに、同供試水に基づく酵素の活性状態を表8に示す。また、電解モデル水およびpHモデル水を供試水とするpHと酵素活性比の関係を図6のグラフに示す。但し、図6に示す酵素活性比は、pH7の原水における酵素活性を1とする各酵素活性の比率を意味する。
【0037】
【表7】
【0038】
【表8】
【0039】
酵素活性については、供試水が酸性域では酵素活性が上昇し、かつアルカリ性域では酵素活性が低下している。この傾向は電解モデル水、pHモデル水ともに共通しているが、酸性域での酵素活性の上昇率は電解モデル水が大きく、アルカリ性域での低下率はpHモデル水が大きい。電解モデル水がpH3である場合には酵素活性が18%上昇し、電解モデル水がpH4である場合には酵素活性が16%上昇していて、pHモデル水に比較して酵素活性化が高い。
【0040】
以上のことから、酵素の活性化を図るには電解生成水が有効であること、酵素としてリパーゼを採用する場合には、電解生成酸性水が極めて有効であることが判明した。電解生成酸性水のこのような効果は、pHモデル水とを比較すればpHのみに起因するものでないものではなく、電解生成酸性水の電解機能の総合によるものと認められる。
【図面の簡単な説明】
【図1】α−アミラーゼの活性化実験を実施するためのフローチャートである。
【図2】α−アミラーゼの活性化実験における供試水のpHと酵素活性比との関係を示すグラフである。
【図3】酸性プロテアーゼの活性化実験を実施するためのフローチャートである。
【図4】酸性プロテアーゼの活性化実験における供試水のpHと酵素活性比との関係を示すグラフである。
【図5】リパーゼの活性化実験を実施するためのフローチャートである。
【図6】リパーゼの活性化実験における供試水のpHと酵素活性比との関係を示すグラフである。
Claims (3)
- 酵素反応に使用される酵素であるα−アミラーゼを活性化する方法であり、α−アミラーゼを、塩化ナトリウムの希釈水溶液を被電解水とする有隔膜電解にて生成される電解生成アルカリ性水に溶解して活性化することを特徴とする酵素の活性化方法。
- 酵素反応に使用される酵素である酸性プロテアーゼを活性化する方法であり、酸性プロテアーゼを、塩化ナトリウムの希釈水溶液を被電解水とする有隔膜電解にて生成される電解生成酸性水に溶解して活性化することを特徴とする酵素の活性化方法。
- 酵素反応に使用される酵素であるリパーゼを活性化する方法であり、リパーゼを、塩化ナトリウムの希釈水溶液を被電解水とする有隔膜電解にて生成される電解生成酸性水に溶解して活性化することを特徴とする酵素の活性化方法。
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