JP4628999B2

JP4628999B2 - α−アミラーゼの活性化方法

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Publication number: JP4628999B2
Application number: JP2006160195A
Authority: JP
Inventors: 昌史野村; 陽子石井; 資通四方
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2006-06-08
Filing date: 2006-06-08
Publication date: 2011-02-09
Anticipated expiration: 2026-06-08
Also published as: JP2007325554A

Description

本発明は、α−アミラーゼの活性化方法及び該方法により活性化されたα−アミラーゼに関する。

α−アミラーゼ（１，４−α−Ｄ−ｇｌｕｃａｎｇｌｕｃａｎｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ［ＥＣ３．２．１．１］）はデンプン、グリコーゲンなどのα−１，４グルコシド結合をランダムに切断するエンド型の酵素である。工業的には、デンプン加工、食品加工、繊維加工、醸造、医薬、臨床検査、洗剤などに広く利用されており、その起源も微生物、植物、動物と多岐にわたる。

この工業的に極めて重要な酵素に関しては、従来からその活性や価格において必ずしも、満足できるものではなく、これを解決するための手段として、遺伝子組換えや蛋白工学技術による酵素の高生産化や酵素触媒能の強化、また酵素反応系において酵素の反応速度を向上させる方法、すなわち酵素反応の活性化方法について検討されてきた。

酵素の活性化方法としては、酵素反応系に特定のポリマーを添加することによって得られるもの（特許文献１）、特定のアミラーゼに対して塩素イオンを加えることで得られるもの（非特許文献１）、ｎ−ヘキサンにＴｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）を添加して得られる逆相ミセル系を利用して酵素活性を高めるもの（非特許文献２）、酵素反応系に特定のアルキル鎖長を有するアルキル硫酸塩及び／又はアルキルスルホン酸塩を添加して酵素活性を高めること（特許文献２）などが報告されている。また、予め酵素を電解生成水に溶解させることにより、酵素反応の前段階で酵素を活性化させる方法（特許文献３）、酵素を発熱性無機塩に溶解することにより酵素を活性化する方法（特許文献４）が報告されている。

また、酵素を含有する洗浄剤組成物の製造方法としては、各種造粒操作により得られた洗剤ベースに対して、酵素や漂白剤などを別個にアフターブレンドすることが多数の文献に報告されている。
特表平５−５０７６１５号特開平８−２５６７６８号特開２０００−２４５４５３号特開２０００−３７１８６号Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６，２２４−２２８（１９８３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２９，９０１−９０２（１９８７）

しかしながら、これらの活性化方法は酵素の反応速度をある程度高めることはできるものの、未だその活性化力が十分とは言えなかった。また、これらの活性化方法では必然的に酵素以外の成分（活性化剤）を添加しなければならず、これらの活性化剤が最終製品に混入してその製品価値を下げるなどの課題があった。更には活性化に特別な装置を必要とするために経費が高騰し、本来の目的であった酵素を活性化してその使用量を削減し、経済効果を生み出すことが困難になるなどの課題があり、汎用技術として広く使用する上で問題があった。

本発明の課題は、簡易な操作でα−アミラーゼの酵素活性を顕著に高める活性化方法、および該活性化方法により得られたα−アミラーゼを提供し、これを使用することである。

そこで本発明者らは、α−アミラーゼの活性化方法について鋭意検討を続けてきた結果、α−アミラーゼを、酸素濃度が所定以上の雰囲気中に曝すことによって酵素活性が著しく活性化されることを見出し、本発明を完成させるに至った。

本発明は、α−アミラーゼを酸素濃度が２５％以上の雰囲気中に３０秒以上暴露する工程を有する、α−アミラーゼの活性化方法に関する。

また、本発明は、α−アミラーゼを酸素濃度が２５％以上の雰囲気中に３０秒以上暴露する工程を有する、活性化されたα−アミラーゼの製造方法に関する。

また、本発明は、上記本発明の方法に従って得られるα−アミラーゼに関する。

以下において、α−アミラーゼという場合には、α−アミラーゼを含む粒子、α−アミラーゼを含む液状物を包含する場合もある。

本発明によれば、簡単にα−アミラーゼを活性化できる。更に他の成分と混合する工程を含まないため、不純物を全く含まない活性化されたα−アミラーゼを各種産業プロセスや洗剤等の成分として広く使用することができる。本発明により活性化されたα−アミラーゼは、酵素使用量の低減、あるいは反応時間の短縮に功を奏する。従って、本発明は、α−アミラーゼを用いた酵素反応やその応用技術において、経済的な面でも有利な効果をもたらす。

本発明の対象とするα−アミラーゼとしては、バチルスズブチリスマーバーグ（ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＭａｒｂｕｒｇ）、バチルスズブチリスナットウ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｎａｔｔｏ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスリケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスセレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）、バチルスマセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍａｃｅｒａｎｓ）、シュードモナスシュツッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｔｕｔｚｅｒｉ）、クレブシェラアエリゲネス（Ｋｌｅｂｕｓｉｅｌｌａａｅｒｏｇｅｎｅｓ）などの細菌、ストレプトマイセスグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓ）等の放線菌、アスペルギウスオリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）などのカビ類、イネ科及びマメ科植物の種子、ヒト及びブタなどの動物の消化腺など多くの生物から得られているものを使用することができる。

本発明に用いるα−アミラーゼは、前記微生物又は、それらの変異株、あるいはこれらの酵素若しくはその変異体をコードするＤＮＡ配列を有する組換えベクターで形質転換された宿主細胞等を、同化性の炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従い培養し、一般の酵素の採取及び精製方法に準じて得ることができる。このようにして得られる酵素液はそのまま用いることもできるが、さらに公知の方法により精製、結晶化、粉末化又は造粒化（例えば特公昭５８−２６３１５号、特表平７−５０００１３号、特開昭６２−２５５９９０号、特開平９−４８９９６号）したものを用いることができる。

本発明に用いるα−アミラーゼの形態は特に限定されず、酵素蛋白質の乾燥物、酵素蛋白質を含む粒子、及び）酵素蛋白質を含む液体を用いることができる。

本発明に用いる酸素の純度は特に限定されない。

ここで、α−アミラーゼの活性は、後述の実施例で示したファデバス（ｐｈａｄｅｂａｓ）法により測定される。

本発明では、α−アミラーゼを、酸素濃度が２５％（体積比）以上の雰囲気（以下、高濃度酸素雰囲気という）中に３０秒以上暴露する。高濃度酸素雰囲気中の酸素濃度は３５〜９５％、更に４５〜９０％が好ましい。この濃度以上の場合、十分な効果を得ることができ、またこの濃度以下の場合、酸素濃度に設定するために特に純度の高い濃縮酸素を必要としないため、経済効果の点で望ましい。

このような高濃度酸素雰囲気を達成する方法として、閉鎖空間に酸素ガスを導入する方法が挙げられる。特に、本発明では、α−アミラーゼと、酸素濃度が２５％以上の気体とを接触させることが好ましい。また、該酸素濃度の雰囲気、特に気体は流動するものであってもよく、定常的に該酸素濃度の雰囲気、特に気体がα−アミラーゼと接触するような状態であればよい。

また、α−アミラーゼを高濃度酸素雰囲気中に暴露する時間は、３０秒以上、更に５分〜２カ月が好ましい。

また、α−アミラーゼを高濃度酸素雰囲気中に暴露する際の温度は、５℃〜８０℃、更に２０℃〜５０℃が好ましい。この温度は、α−アミラーゼの周囲温度であり、実質的には、高濃度酸素雰囲気の温度である。

また、α−アミラーゼを高濃度酸素雰囲気中に暴露する際の絶対湿度は、０．５ｇ／ｍ³〜１０００ｇ／ｍ³、更に１．５ｇ／ｍ³〜２００ｇ／ｍ³が好ましい。この湿度は、α−アミラーゼの周囲湿度であり、実質的には、高濃度酸素雰囲気の湿度である。

上述の活性化方法に従って得られたα−アミラーゼは、未処理のα−アミラーゼに比べ、織物または硬質表面の清浄化等において優れた性能を有するものである。従って本発明により得られたα−アミラーゼを含有する繊維用洗剤組成物、または硬質表面用洗剤組成物が提供される。またデンプンを液化するための酵素としても、本発明により得られたα−アミラーゼは好適である。

以下に、実施例で用いたα−アミラーゼ活性の測定法〔ファデバス（ｐｈａｄｅｂａｓ）法〕を示す。

＜α−アミラーゼ活性測定法＞
（１）サンプルの吸光度の測定
５ｍＬの緩衝液（Ｂｒｉｔｔｏｎ−ＲｏｂｉｎｓｏｎＢｕｆｆｅｒ、ｐＨ８．５、５０ｍＭ（阿南功一ら著．基礎生化学実験法６．Ｐ２７７．丸善株式会社））にネオ．アミラーゼテスト「第一」〔第一化学薬品（株）より入手、製品番号７０１５０１−００５〕を１錠添加し、約１０秒間攪拌した後、２ｍＭ塩化カルシウム水溶液で希釈した１ｍＬの酵素溶液を添加して、５０℃にて１５分間反応させた。１ｍＬの０．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加、攪拌することで反応を停止させた後、遠心分離（４００×ｇ、５分間）にて不溶成分を沈殿させ、得られた遠心上澄の６２０ｎｍにおける吸光度を測定した。

（２）ブランクの吸光度の測定
５ｍＬの緩衝液（Ｂｒｉｔｔｏｎ−ＲｏｂｉｎｓｏｎＢｕｆｆｅｒ、ｐＨ８．５、５０ｍＭ（阿南功一ら著．基礎生化学実験法６．Ｐ２７７．丸善株式会社））にネオ．アミラーゼテスト「第一」を１錠添加し、約１０秒間攪拌した。これに１ｍｌの０．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加、攪拌した後、１ｍＬの酵素溶液を添加し、５０℃にて１５分間インキュベートした後遠心分離（４００×ｇ、５分間）を行った。得られた遠心上澄みの６２０ｎｍにおける吸光度を測定した。

（３）酵素活性の算出
ネオ．アミラーゼテスト「第一」同封の国際単位の検量線を基準とし、これに（１）と（２）の吸光度の差をあてはめることでアミラーゼの活性を算出した。

実施例１
α−アミラーゼを含む粒子として、ノボザイムズ社より市販されているＤｕｒａｍｙｌ６０Ｔを用い、その５００ｍｇをペトリ皿（旭テクノガラス、身外径３０ｍｍ×高さ１５ｍｍ）に入れ、これをデシケーターに入れ、酸素を注入した後、コックを閉め、表１の酸素濃度の雰囲気を作製し、表１の所定時間後に前述した方法により酵素活性を測定した。高濃度酸素雰囲気に曝した酵素は、曝していない酵素（大気中の酸素濃度約２２％のままの雰囲気中に曝した酵素、以下同様）に比べ高い活性を有していた（表１）。なお、この時の周辺湿度は８ｇ／ｍ³であった。

＊相対活性：高濃度酸素雰囲気に曝していない酵素（対照品）の酵素活性を１００％とした時の酵素活性（以下同様）

実施例２
α−アミラーゼを含む粒子として、ノボザイムズ社より市販されているＴｅｒｍａｍｙｌ６０Ｔ、またはＳｔａｉｎｚｙｍｅ１２Ｔ、ジェネンコア社より市販されているＰｕｒａｓｔａｒＯｘＡｍ４０００Ｅ５００ｍｇをペトリ皿（旭テクノガラス、身外径３０ｍｍ×高さ１５ｍｍ）に入れ、これをデシケーターに入れ、酸素を注入した後、コックを閉め、表２の酸素濃度の雰囲気を作製し、表２の所定時間後に前述した方法により酵素活性を測定した。高濃度酸素雰囲気に曝した酵素は、曝していない酵素に比べ高い活性を有していた（表２）。なお、この時の周辺湿度は８ｇ／ｍ³であった。

実施例３
特開２００１−１５２１９９号公報の表１中の実施例２に記載の洗剤ベース９９重量％に、実施例２で７０％の酸素濃度雰囲気に曝したＳｔａｉｎｚｙｍｅ１２Ｔ０．５重量％、及び香料０．５重量％を配合して洗剤組成物を調製した。この洗剤組成物を３０℃に調整した１Ｌの水道水に０．０７質量％となる濃度で溶解し、ターゴトメーター（上島製作所（株）製）用ステンレスビーカーに移した。スターチ／色素汚染布（ＥＭＰＡ１６２）５枚（６ｃｍ四方）を洗剤溶液中に入れ、８０ｒｐｍで１０分間攪拌洗浄した。流水下で濯いだ後、アイロンプレスして反射率測定に供した。汚染布の原布、及び洗浄前後の人工汚染布の反射率を、４６０ｎｍにて自記色差計（島津製作所（株））にて測定し洗浄率（％）を測定した。その結果、高濃度酸素雰囲気に曝したＳｔａｉｎｚｙｍｅ１２Ｔでは高い洗浄効果が確認された。

Claims

α−アミラーゼを酸素濃度が２５％以上の雰囲気中に３０秒以上暴露する工程を有する、α−アミラーゼの活性化方法。
α−アミラーゼを酸素濃度が２５％以上の雰囲気中に３０秒以上暴露する工程を有する、活性化されたα−アミラーゼの製造方法。
α−アミラーゼが、織物または硬質表面を清浄化するための酵素として用いられるα−アミラーゼである、請求項１又は２記載の方法。
α−アミラーゼが、デンプンを液化するための酵素として用いられるα−アミラーゼである、請求項１又は２記載の方法。