JP4336673B2 - 生物組織中のカロテノイドと関連する化学物質との非侵襲的測定方法および装置 - Google Patents
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Description
人間の皮膚中のカロテノイドのラマン測定に好適な実験装置40を図2に概略的に示したように組み立てた。装置40は、光ビーム送出収集部品を含有する光モジュール42、および分光計コンポーネントを含有するラマンモジュール44を含む。光モジュール42は、手持型ビーム送出収集装置として作られており、散乱サンプル(例えば人の皮膚)が光収集部品から約5cm以内となるようにサンプルに接近させて設置することができる。これにより装置のfナンバーが大きくなり、したがって光の透過量が大きくなる。
実施例1の装置を用いて健康な人間の志願者の皮膚から得た典型的ラマンカロテノイドスペクトルを図3のグラフに示す。約2mmの大きさの皮膚を出力10mWのレーザー光を488nmで照射した。光子計数(強度)対波数シフトの標準形式でデータをプロットした。共鳴ラマン法を用い内在的微弱ラマン信号をさらに増幅して、スペクトルを測定した。カロテノイド分子のラマンピーク特性は図3のグラフに表れている。このピークは広範な蛍光背景上に重なっている。それにもかかわらず、ラマンピークを明確に分離することができ、かつCCD検出器の高動作感度領域を用いてラマンピークを優れた感度分解能および高い信号対ノイズ比で表示することができる。これを例えば図4に示す。図中、蛍光背景を高次多項式に当てはめ、スペクトルから除去している。背景蛍光スペクトルを市販のスペクトル取得ソフトウエア(例えば、Rhea Corpより入手可能なKestrel Spec)により除去することができる。1159および1524cm−1の2つのピークはそれぞれカロテノイド分子の炭素−炭素単結合および二重結合伸縮振動に対応し、ピーク高は皮膚中の励起したカロテノイド濃度に相関する。
蛍光背景および人間の皮膚のラマン測定に対するその影響をさらに特徴付けるため、人間の皮膚の蛍光放射スペクトルを励起波長458nm、488nm、514.5nmおよび532nmの青/緑レーザーに対してインビボ測定した。レーザーの出力密度は0.2W/cm2であり、波長1nm毎のサンプリング時間は1秒であった。結果を図5のグラフに示す。このグラフより、放射は少なくとも2つの広範かつ重なった帯域からなり、一方は600nm付近を中心とし、他方は750nm付近を中心とすることが分かる。励起波長が増えるにつれて、放射中心極大はより長い波長に若干シフトし、全体の強度は減少し、かつ532nm励起では放射の短波長成分のみが残る。この、いわゆる皮膚「自己蛍光」の起源は、内在的蛍光色素、すなわちコラーゲン細胞、ポルフィリン分子等によるものであって、カロテノイドの発光によるものではない。この結論は、蛍光の減衰速度によりさらに裏付けられており、これを図6のグラフに示す。このグラフは600nm付近での蛍光強度を、532nmのモードロックレーザーから短い(100ps)パルスで励起した後の時間に関してプロットしたものである。片対数目盛上にプロットすると、強度は6nsの寿命時間でほぼ指数関数的に減衰することが分かる。これは皮膚に存在する天然蛍光色素の自発発光寿命時間に典型的な値であり、カロテノイドに対して報告されている寿命時間(約200fs)よりも大きい。
ラマン散乱強度は励起波長の4乗に反比例する。これは実際には励起波長が短くなるにつれてラマン散乱強度が大幅に増加することを意味する。一方、ラマン信号をマスクする重複蛍光も波長が短くなるにつれて増加する。共鳴ラマン散乱の場合、光散乱光効率はさらに散乱種の電子吸収作用の影響を受け、一般に電子吸収遷移のスペクトル依存性に従う。したがって、ラマンピークと蛍光背景との間の対比を最大にするための最適励起条件を見出すために、5つの異なるアルゴンレーザー光線およびNd:YAGレーザー波長の2倍の周波数を用いて励起条件を変えた。励起出力密度は0.2W/cm2であり、サンプリング時間は10秒であった。結果を図7のグラフに示す。このグラフは、1520cm−1での最強ラマンカロテノイドピーク強度(白抜きの三角)と皮膚の背景蛍光(白抜きの丸)の両方に対するスペクトル依存性を示している。図7中点線で示した蛍光強度に対するラマンの比から、最適励起波長は500nm波長領域に存在することが分かる。4880および5145Åの利用可能な最強のアルゴンイオンレーザー波長がこの最適波長に近く、小型で比較的安価な空冷レーザーを用いて必要な出力レベルを容易に達成することができる。
ラマン測定の実施中に、人間の皮膚の蛍光背景が数分間に渡って部分的にブリーチングされることが分かった。この効果を図8のグラフに示す。図中、曲線(a)は「新鮮な」皮膚を露光した直後の蛍光背景に対応し、曲線(b)は200mW/cm2の(安全)出力密度を用いて488nmアルゴンレーザー光を7分間照射した後の蛍光背景に対応する。蛍光スペクトルの形状は変化していないが、強度は初期値の約70%にまで下がった。この値はさらに光を照射しても安定である。
実施例1の装置を用いて、健康な人間の志願者の体の種々の皮膚領域に含まれるカロテノイド含量を測定した。図10のグラフは、志願者の指(曲線a)および額(曲線b)の測定から得られた、蛍光を除去したラマンスペクトル結果を示す。指からのラマン反応および、それに対応してカロテノイド濃度は、額からの反応の約2倍であることが分かった。これは体の種々の皮膚領域にカロテノイドが異なるレベルで存在することを示している。
実施例1の装置を用いて、扁平上皮ガンを患っている人間の志願者の体の皮膚領域中のカロテノイド含量を測定した。図11のグラフはガン近傍の健康な皮膚領域の測定から得られた、蛍光を排除したラマンスペクトル結果(曲線a)およびガンの中心領域の測定から得られら結果(曲線b)を示す。カロテノイドに関係するピークは1015cm−1、1159cm−1および1524cm−1で測定された。曲線(a)のピークは、光子計数(強度)が高いことに表されるように、健康な皮膚におけるカロテノイドのレベルが比較的高いことに対応する。曲線(b)のピークは光子計数が非常に少なく、ガンの皮膚中のカロテノイドのレベルが低いことを示している。したがって、ガン領域ではカロテノイド含量が減少し、両方の領域のカロテノイド濃度の間に顕著な差が現れる。
12 干渉性光源
14 光線送出収集システム
16 ニュートラルフィルター
17 回折格子
18 スリット
20 ビームスプリッター
22 第1レンズ
24 第2レンズ
26 スペクトル選択システム
28 光検出システム
30 定量システム
32 レーザービーム
34 測定する組織
36 生体皮膚組織
40 実験装置
42 光モジュール
44 ラマンモジュール
46 アルゴンレーザー
48 第1レンズ
50 第1狭周波数帯フィルター
52、54 ダイクロイックビームスプリッター
56 第2レンズ
58 第2狭周波数帯フィルター
60 第3レンズ
62 CCDカメラ
64 反射格子
66 第1ミラー
68 第2ミラー
70 パーソナルコンピュータ
Claims (25)
- 皮膚組織(生きた人間の一部をなす組織を除く)の抗酸化状態を非侵襲的に測定する方法であって、該方法が、
検出するカロテノイドに対する波長シフトを有するラマン反応を起こす波長の光を発生する光源を準備する工程、
光源からカロテノイドレベルを測定する皮膚組織に、最大で約200mW/cm2の強度の光を当てる工程、
組織から散乱した光であって、弾性散乱光と非弾性散乱光とを含み、非弾性散乱光が組織内のカロテノイドに対応するラマン信号を発する光を収集する工程、
弾性散乱光をフィルター除去する工程、
蛍光背景に対して、カロテノイドの周波数特性でラマンシフトした光をスキャンすることのできる高動作感度領域を有する検出手段を用い、ラマン信号強度を定量する工程、および
ラマン信号から皮膚組織の背景蛍光信号を取り除く工程を含み、
ラマン信号強度と正常組織からのラマン散乱の強度との間の実質的な差を用いて組織の抗酸化状態を評価することを特徴とする方法。 - 前記光源が検出するカロテノイドの吸収帯と重なる波長の光を発生することを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 前記光源が約450nm〜約520nmの波長域のレーザー光を発生することを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 前記皮膚組織が人間から採取された体液であることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 前記皮膚組織が人間から採取された皮膚であることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 皮膚中のカロテノイドの周波数特性で前記散乱光を測定することを特徴とする、請求項5載の方法。
- 皮膚中の実際のカロテノイドレベルで校正した信号強度を介して前記ラマン信号を定量することを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 皮膚組織(生きた人間の一部をなす組織を除く)中のカロテノイドを非侵襲的に測定する方法であって、該方法が、
検出するカロテノイドに対する波長シフトを有するラマン反応を起こす波長の光を発生する光源を準備する工程、
光源からカロテノイドレベルを測定する皮膚組織に、最大で約200mW/cm2の強度の光を当てる工程、
皮膚組織から散乱した光であって、弾性散乱光と非弾性散乱光とを含み、非弾性散乱光が皮膚組織内のカロテノイドに対応するラマン信号を発する光を収集する工程、
弾性散乱光をフィルター除去する工程、
蛍光背景に対して、カロテノイドの周波数特性でラマンシフトした光をスキャンすることのできる高動作感度領域を有する検出手段を用い、ラマン信号強度を定量する工程、および
検出されたカロテノイドのラマン信号から皮膚組織の背景蛍光信号を取り除く工程、を含み、
ラマン信号強度と正常組織からのラマン散乱の強度との間の実質的な差が組織異常の存在を示すことを特徴とする方法。 - 前記光源が検出するカロテノイドの吸収帯と重なる波長の光を発生することを特徴とする、請求項8記載の方法。
- 前記光源が約450nm〜約520nmの波長域のレーザー光を発生することを特徴とする、請求項8記載の方法。
- 皮膚中のカロテノイドの周波数特性で前記散乱光を測定することを特徴とする、請求項8載の方法。
- 皮膚中の実際のカロテノイドレベルで校正した信号強度を介して前記ラマン信号を定量することを特徴とする、請求項8記載の方法。
- 皮膚組織中の異常の存在を非侵襲的に検出する装置であって、該装置が、
検出したカロテノイドに対する波長シフトを有するラマン反応を起こす波長の光を発生するレーザー光源、
最大で約200mW/cm2の強度の光を皮膚組織に当て、組織からの散乱光を収集するための光送出収集モジュールであって、該モジュールが、
レーザー光を平行にする第1レンズ、
第1レンズと光学的に連通した第1狭周波数帯フィルター、
第1狭周波数帯フィルターと光学的に連通した第1および第2ダイクロイックビームスプリッター、
レーザー光のビームを第2ダイクロイックビームスプリッターから組織に向け、組織からの散乱光を収集するように取り付けられた第2レンズ、
第2レンズと光学的に連通した第2狭周波数帯フィルター、および
第2狭周波数帯フィルターと光学的に連通した第3レンズ、を含むモジュール、
収集した散乱光からラマンシフトした光を選択するためのスペクトル選択システム、
蛍光背景に対して、カロテノイドの周波数特性でラマンシフトした光をスキャンすることのできる高動作感度領域を有する検出手段、および
検出したカロテノイドに対するラマン信号強度を測定し、検出されたカロテノイドのラマン信号から皮膚組織の背景蛍光信号を取り除き、ラマン信号強度と正常組織からのラマン散乱の強度との間の実質的な差から組織異常の存在を検出するよう構成された定量手段、とを含む装置。 - 前記光源が約450nm〜約520nmの波長領域でレーザー光を発生することを特徴とする、請求項13記載の装置。
- 前記スペクトル選択システムが格子分光計であることを特徴とする、請求項13記載の装置。
- 前記スペクトル選択システムが格子モノクロメーターを含むことを特徴とする、請求項13記載の装置。
- 前記スペクトル選択システムがホログラフィックフィルターを含むことを特徴とする、請求項13記載の装置。
- 前記スペクトル選択システムが誘電フィルターを含むことを特徴とする、請求項13記載の装置。
- 前記スペクトル選択システムが音響光学フィルターを含むことを特徴とする、請求項13記載の装置。
- 前記検出手段がCCD検出器列を含むことを特徴とする、請求項13記載の装置。
- 前記検出手段が増感CCD検出器列を含むことを特徴とする、請求項13記載の装置。
- 前記定量手段がパーソナルコンピュータを含むことを特徴とする、請求項13記載の装置。
- 前記定量手段がCCD画像ディスプレーまたはモニターを含むことを特徴とする、請求項13記載の装置。
- 前記レーザー光源及び光送出収集モジュールは、組織に当たるレーザー光の出力密度が約200mW/cm2以下となるように構成されていることを特徴とする、請求項13記載の装置。
- 組織異常が悪性腫瘍を含む、請求項13に記載の装置。
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