JP3746195B2 - マルチバンド蛍光顕微鏡 - Google Patents

Description

【０００１】
本発明は、請求項１の上位概念の構成に対応するマルチバンド蛍光顕微鏡に関するものである。
【０００２】
マルチバンド蛍光顕微鏡の場合、使用者は、顕微鏡像内の種々の蛍光バンドが異なる強度を有し、一様に視認できないという問題に直面することがある。その原因は、照明光路内の励起強度が異なっていることがほとんどで、或いは、結像光路内にある遮断フィルタによる蛍光強度の遮断状態が異なっていることにも原因がある。すでに被観察対象物を着色する際に、種々の励起バンドのための蛍光色素の濃度が異なっていても、或いは色素が漸次退色しても（いわゆるフェーディング）、顕微鏡像内の蛍光バンドの強度が異なる原因になる。蛍光バンドの異なる強度は、顕微鏡の像を写真で記録する必要がある場合に特に問題である。この場合、蛍光光線の強度が弱い部分は写真ではかなり薄く再生され、或いは全く視認できない。蛍光バンドの強度が可能な限り均一である場合にだけ顕微鏡の像の申し分のない写真を得ることができる。
【０００３】
米国特許第５３７１６２４号公報には、２つの励起バンドのみを備えた蛍光顕微鏡が記載されており、この顕微鏡では、両励起バンドの強度を交互に制御することができる。照明光路は光源と励起フィルタとを有し、励起フィルタは、光源の光から、波長が異なる複数の励起バンドを生じさせる。さらにこの顕微鏡は、ビームスプリッターと、蛍光光線用の出口フィルタ（遮断フィルタ或いは放射フィルタともいう）と、励起バンドの強度を制御するフィルタ要素を有している。
【０００４】
前記フィルタ要素は、光軸に対し傾動させることにより、一方の励起バンドまたは他方の励起バンドの透過度の２つの所定固定値をもった２つの設定状態の間で無段階に切換えることができる。一方の設定状態では第１の励起バンドのみが減衰し、他方の励起バンドでは第２の励起バンドのみが減衰し、両設定状態の間では両励起バンドのいずれも減衰されない。それぞれの励起バンドの透過度の低下は、前記所定固定値以下でしか可能でない。また、最大透過度とゼロ値の間での変化、すなわち両励起バンドの一方が完全に抑制されるまでの変化は不可能である。さらに、２つの励起バンドしか制御できない。
【０００５】
本発明の課題は、マルチバンド蛍光顕微鏡において、複数の励起バンドの１つまたはいくつかを選択的に、部分的にまたは完全に濾波することができるようにすることである。また、各励起バンドに対する透過度を簡単な手段で無段階に調整可能であるようにすることである。
【０００６】
この課題は、本発明によれば、独立請求項の特徴部分により解決される。有利な構成は従属項の構成から明らかである。
本発明によるマルチバンド蛍光顕微鏡は、照明光路内で光源の光から励起フィルタを用いて光の波長が異なる複数の励起バンドを発生させる公知のマルチバンド蛍光顕微鏡を前提としている。励起バンドは、蛍光色素によってプレパラート化された蛍光対象物を照射し、蛍光対象物により、周波数がシフトした蛍光バンドへ置換される。
【０００７】
本発明によれば、まず、顕微鏡像における個々の蛍光バンドの蛍光強度を測定し、前もって設定していたゼロに設定可能な強度基準値またはゼロよりも大きな値に設定可能な強度基準値と比較する。蛍光強度の測定はたとえばビジュアルで、或いは強度計を用いて行なうことができる。強度計はたとえば、画像分析システムを下流側に配置したビデオカメラまたはCCDカメラからなる。
【０００８】
この場合、各蛍光バンドに対して異なる強度基準値を設定してもよい。しかし、実際には、基準値は顕微鏡の具体的に使用目的に依存している。たとえば顕微鏡の像を写真またはビデオカメラで記録し、その際各蛍光バンドを写真またはビデオ画像で同じ明るさで再生しようとする場合は、基準値の高さはフィルムまたはカメラのスペクトル感度に依存している。したがって、種々の励起バンドに対する基準値を設定する際には、フィルムまたはカメラのスペクトル感度を考慮する必要がある。
【０００９】
すなわち、フィルムまたはカメラがすべてのスペクトル色を同じ強度で再生するには、所望の基準値はすべて同じでなければならず、より厳密には、最低蛍光強度に等しくなければならない。しかし、フィルムまたはカメラのスペクトル感度が一定でないと、これに対応して、異なる蛍光バンドに対し異なる基準値を設定しなければ、個々の蛍光バンドを同じ明るさで再生することはできない。
【００１０】
他方、特定の蛍光バンドが写真またはビデオ画像に現れないようにするには、すなわちこの蛍光バンドを絞る必要がある場合は、この蛍光バンドに対して基準値をゼロに設定する必要がある。この場合、絞るべきでない蛍光バンドに対しては、その基準値がその強度の最低値に等しければ好都合である。このときこれらの蛍光バンドはすべて同じ明るさで現れる。
【００１１】
基準値からずれた蛍光強度に割り当てられている各蛍光バンドに対しては、本発明によれば、該当する蛍光バンドに同調したセレクティブフィルタが照明光路内へもたらされる。そのスペクトル透過度の推移は、該当する励起バンドだけを減衰させ、残余のスペクトル範囲は支障なく透過させるように構成されている。
【００１２】
本発明によるマルチバンド蛍光顕微鏡では、フィルタスライダセットは個別にスライド可能な複数個のフィルタスライダからなり、開口絞りの横に密接して照明光路内に垂直に挿入されている。
【００１３】
フィルタスライダの構成は、マルチバンド蛍光顕微鏡の種々の励起バンドの数量に依存している。ｎ個の励起バンドがある場合、各フィルタスライダは励起バンドに同調したｎ個のセレクティブフィルタを有し、これらのセレクティブフィルタは高透過度と低透過度とを有している。
【００１４】
異なる透過度を得るため、放射横断面の特定の面部分だけが別個のフィルタ面要素で覆われる。この場合、放射横断面をできるだけ一様に面要素で覆うことが考慮されるので、放射横断面の片側が陰になることはなく、よって瞳の片側が照射されることもない。これにより傾斜照明が回避され、よってフォーカシング時の像点の横方向への変位が回避される。
【００１５】
フィルタは、互いに独立に個別に、または所望の面領域或いは所望の透過度を持ったものと組み合わせて、照明光路内へ挿入可能でなければならない。この場合、n個の励起バンドがあれば、最大で（n−１）個のフィルタを互いに組み合わせ可能でなければならず、すなわちこれらを同時に照明光路内へ挿入可能でなければならない。通常は、１つの励起バンドが強度基準値を提供し、しかも不変であるため、すべての励起バンドを同時に減衰させる必要はないので、これで十分である。同様にすべての励起バンドを同時に解消させる必要はない。これは照明を切ることと同義であるからである。
【００１６】
（n−１）個のフィルタの必要な組み合わせを得るため、（n−１）個のスライド面上にn個の励起バンドを備えた本発明によるマルチバンド蛍光顕微鏡の有利な実施形態では、（n−１）個の個別にスライド可能なフィルタスライダが配置される。これらのフィルタスライダは、開口絞りの横に平行に密接して且つ互いに小さな間隔で配置され、組み合わせて有効となる。それぞれのフィルタスライダによりそれぞれ１つの励起バンドに対する１つのフィルタを適宜設定することができるので、総じて（n−１）個の励起バンド（最大数よりも少ない）を合目的に減衰させ、或いは消去することができる。
【００１７】
２つの励起バンドに対しては、必要な２つのフィルタが１つのスライド面（n−１＝１）内に配置されていれば十分である。というのは、一方のフィルタまたは他方のフィルタのみを照明光路内へ挿入すればよいからである。それゆえ、１つのフィルタスライダセットが２つの励起バンドを制御するために一体に構成されているのが有利であり、すなわちただ１つのフィルタスライダで構成されているのが有利である。しかしながら、２つ以上の励起バンドに対しては、対応的に多分割された、（n−１）個の個々にスライド可能なフィルタスライダを備えたフィルタスライダセットを設ける必要がある。
【００１８】
各フィルタスライダは、異なる励起バンドに対するセレクティブフィルタ以外に、照明光路の放射径に対応する径を持った自由開口部を有している。この場合、それぞれのフィルタの横に自由開口部が配置される。実施形態に応じては、フィルタをただ１つの自由開口部のまわりにグループ化して配置してもよい。フィルタの透過度は、スライド方向において、自由開口部からの距離に伴って減少している。各フィルタは、最低透過度を持ち且つ放射径xに等しい最小径を持った面領域を有している。この面領域が照明光路内に挿入されていると、付属の励起バンドは最大に減衰され、すなわち値ゼロに減衰される。
【００１９】
個々のフィルタをそれぞれ照明光路内に正確に位置決めすることにより、照明光路に作用する透過度を個々に正確に設定して、それから得られる蛍光強度を、フィルタに割り当てられている励起バンドを減衰させることによりその強度基準値と一致させる。このため、各フィルタスライダには別個の位置調整手段が付設されている。位置調整手段は、フィルタスライダをスライドおよび（または）回転させることにより、照明光路をフィルタスライダの適当な面領域で完全にまたは部分的に覆う。したがって、自由開口部、またはフィルタの１つ或いはいくつか、またはフィルタ面と自由開口部の組み合わせを選択的に照明光路内へ挿入することができる。この最後のステップをすべてのフィルタに対し、よってすべての励起バンドに対し行うと、すべての蛍光強度はその基準値と一致する。
【００２０】
上記マルチバンド蛍光顕微鏡において蛍光強度を最適に設定した後も、数時間後には再び蛍光強度は基準値からずれる。これは、異なる励起バンドに対する種々の蛍光色素が退色するスピードが異なるためで、すなわち個々の蛍光色素が特有のフェーディングを示すからである。
【００２１】
このため、本発明によるマルチバンド蛍光顕微鏡の有利な実施形態では、蛍光強度の時間的変化を連続的に測定する。この場合、フィルタの、照明光路内での有効な透過度は、特定の時間間隔で反復的に調整されて、蛍光強度が常にその基準値と再び一致するようにする。
【００２２】
本発明の特に有利な構成により、自動的なフェーディング補正が行なわれる。このため、蛍光強度の時間的変化が自動的に連続してビデオカメラで撮影され、その中に含まれている蛍光強度は画像分析システムにより測定され、所定の基準値と比較される。
【００２３】
その後、フィルタの透過度を自動的に連続的に変化させ、整合せしめることにより、蛍光強度は常に強度基準値に保持される。このため、たとえば電動で作動する位置調整手段が使用される。モータの制御および蛍光強度の基準値への調整は、電子系と、ビデオカメラまたは画像分析システムの信号が供給されるコンピュータにより行なうことができる。
【００２４】
図面には本発明の実施形態が図示されており、以下にこれを詳細に説明する。
図１は、本発明によるマルチバンド蛍光顕微鏡の光路を示している。光源１からは、光軸２を備えた照明光路が出ている。照明光路内には、順次、集光器３と、第１のレンズ要素４と、開口絞り５と、第２のレンズ要素６と、照明フィールド絞り７と、第３のレンズ要素８と、励起バンドを生じさせるための励起フィルタ９とが配置されている。照明光路は、ビームスプリッター１０において対物レンズ１１のほうへ転向せしめられる。照明光路は対物レンズ１１を通過して、載物テーブル１３上に載置されている蛍光対象物１２に達する。
【００２５】
照明光路内において励起フィルタ９によって生じた励起バンドは、蛍光対象物１２に挿入された蛍光色素によって蛍光バンドに置換され、この蛍光バンドは周波数をシフトして蛍光対象物１２から放出される。この蛍光光線は対物レンズ１１と、ビームスプリッター１０と、出口フィルタ１４と、鏡筒レンズ１５を通過して、中間像面１６に達する。ここで生じた中間像を、顕微鏡利用者は接眼レンズ１７を用いて観察することができる。TV出力を介して中間像は補助的に、画像分析システム１９を下流側に設けたビデオカメラ１８に結像される。この構成により、接眼レンズ１７を介して、或いは画像分析システム１９を用いて、顕微鏡画像内の個々の蛍光バンドの蛍光強度を測定し、強度基準値と比較してより大きいか、或いはゼロに等しいかを確定することができる。
【００２６】
励起バンドを減衰するため、本発明によればフィルタスライダセット２０が設けられている。本実施形態では、このフィルタスライダセット２０は２つのフィルタスライダ２１aと２１bからなり、これらフィルタスライダは照明光路の光軸２に対し垂直に密接して並設されており、すなわち開口絞り面２４の後方または前方に位置するように照明光路内に挿入されている。それぞれのフィルタスライダ２１a,２１bには、自由開口部２２と、その横に位置するように、励起バンドに整合した複数個のセレクティブフィルタ２３とが配置されている。フィルタスライダ２１a,２１bを可能な限り密接して配置することにより、フィルタ２３を開口絞り面２４の横に可能な限り密接して位置させることができる。これにより、押し込まれたフィルタスライダ２１a,２１bが画像内で見えなくなるよう保証される。他の利点は、ここでは光線の拡がりが最も狭くなるので、フィルタ２３の面積を可能な限り小さくできることである。
【００２７】
本発明によれば、それぞれのフィルタスライダには位置調整手段が付設されている。この場合、より低コストの実施形態では、手動で調整できる位置調整手段も使用してよい。
【００２８】
ここに図示した実施形態では、フィルタスライダ２１ａ,２１ｂの位置調整手段として２つのモータ２５ａ,２５ｂが配置されている。これらのモータは、フィルタスライダ２１a,２１bを開口絞り面２４に対し平行に移動および（または）回動させる。モータ２５a,２５bにより、それぞれ付設されているフィルタスライダ２１aまたは２１bによって自由開口部２２またはセレクティブフィルタ２３、或いは両者の組み合わせを照明光路内に挿入させることができる。モータ２５a,２５bは電子制御器２６によって制御される。電子制御器２６は画像分析システム１９から入力信号を受け取る。
【００２９】
画像分析システム１９は、カメラ信号から、蛍光強度の基準値からのずれを求める。このとき、基準値からのずれを生じさせる蛍光バンドが特定され、これら蛍光バンドのそれぞれには、減衰のため、フィルタスライダ２１a,２１bの一方が割り当てられる。したがって、図示した実施形態では、２つの励起バンドが完全に減衰され、すなわちゼロの値に減衰され、或いは部分的に減衰される。それぞれのフィルタスライダ２１a,２１bに対しては、付属のモータ２５a,２５bに対し制御信号を発生させる。それぞれのフィルタスライダ２１a,２１bは付属のモータ２５a,２５bにより無段階に移動せしめられて、割り当てられた励起バンドに対し選択的に作用するフィルタ２３が照明光路内へもたらされる。次にフィルタスライダ２１aまたは２１bを再び移動させて、挿入したフィルタ２３の面領域が、割り当てられた励起バンドを強度基準値へ減衰させるような透過率を持って照明光路内に位置するようにする。このようにして、すべての励起バンドがその強度基準値へ設定される。
【００３０】
次に、フィルタスライダセット２０またはフィルタスライダ２１の種々の構成と、その上に配置されるフィルタのスペクトル透過過程とを説明する。
図２aには、２つの励起バンドＡとＤを備えた本発明によるマルチバンド蛍光顕微鏡のためのフィルタスライダ２１が図示されている。長方形のガラス板２７上には、短波長の励起バンドＡを強度抑制するためのロングパスフィルタ２９と、長波長の励起バンドＤを強度抑制するためのショートパスフィルタ２８とが異なる蒸着層として取り付けられている。これらのフィルタはガラス板２７の端部にあり、その間には、フィルタスライダ２１の中央部に自由開口部２２が設けられている。自由開口部２２の横断面は、照明光路の開口絞り５の放射径ｘに等しい。ここには図示していない位置調整手段により、フィルタスライダ２１は長手方向において両方向に、開口絞り面２４に平行に無段階に移動することができる。この運動を二重矢印で示した。
【００３１】
この実施形態では、ショートパスフィルタ２８とロングパスフィルタ２９とは、それぞれ関連した蒸着層として取り付けられている。両フィルタ２８,２９の透過は、自由開口部２２のすぐ横で最大であり、自由開口部２２からの間隔に伴って減少する。このため、自由開口部２２の横では、フィルタスライダ２１は全面をフィルタ２８,２９で覆われているのではなく、フィルタ面の割り当ては自由開口部２２からフィルタスライダ２１の端部のほうへ増大している。
【００３２】
このように、蒸着層はフィルタスライダ２１の端部に矩形を形成し、その最小エッジ長さは放射径ｘに等しい。この蒸着された矩形面が照明光路の全面を覆うと、これによって最小パーセント透過率が設定され、付属の励起バンドは完全に減衰され、すなわちゼロに減衰される。蒸着した矩形面には、蒸着した三角形面の底辺が境を接しており、その対向隅角部は自由開口部２２のほうへ指向している。
【００３３】
放射径を常に部分的にしか覆わない、蒸着された三角形面により、ショートパスフィルタ２８とロングパスフィルタ２９の透過率はそれぞれスライド方向に自由開口部２２からフィルタスライダ２１の端部のほうへ減少する。ショートパスフィルタ２８またはロングパスフィルタ２９の任意の面部分を差し込むことにより、照明光路内のフィルタ２８,２９のそれぞれの所望の透過率を実現することができ、よって一方の励起バンド或いは他方の励起バンドを任意に弱めることができ、或いは絞ることができる。
【００３４】
図２bも同様に、２つの励起バンドAとDを備えた本発明によるマルチバンド蛍光顕微鏡のためのフィルタスライダ２１を図示したものである。長方形のガラス板２７上には、長波長励起バンドAを濾波するためのショートパスフィルタ２８と、短波長の励起バンドDを濾波するためのロングパスフィルタ２９とが異なる蒸着層として被着されている。
【００３５】
図２ａの場合と同様に、この実施形態でも、蒸着層は自由開口部２２の方向へ三角形の輪郭を有している。しかしこの実施形態では、三角形はそれぞれ繋がった面としてではなく、同じ大きさの小さな面要素３０として蒸着されている。これにより、両フィルタ２８,２９に対しては、より高い透過度を持った、より長い調整範囲が得られる。蒸着層は、フィルタスライダ２１の端部において、放射径xに等しい最小エッジ長さを持った長方形を形成しており、したがって、割り当てられた励起バンドをゼロに減衰させることができるような、最小透過度の領域を形成している。
【００３６】
図２cは、２つの励起バンドAとDを備えた本発明によるマルチバンド蛍光顕微鏡のための他のフィルタスライダ２１を示している。長方形のガラス板２７には、長波長の励起バンドAを濾波するためのショートパスフィルタ２８と、短波長の励起バンドDを濾波するためのショートパスフィルタ２９とが異なる蒸着層として被着されている。その間に自由開口部２２がある。
【００３７】
フィルタスライダ２１のこの実施形態では、フィルタ２８,２９は自由開口部２２の横に、任意の形状の（ここでは円形）別個の面要素３０として蒸着されている。この場合、面要素３０の大きさは、したがってフィルタスライダ２１の蒸着面の割り当ては、自由開口部２２からフィルタスライダ２１の端部のほうへ増大している。自由開口部２２の横でフィルタ２８,２９の透過度は最大であり、スライド方向においてフィルタスライダ２１の端部のほうへ減少している。両フィルタ２８,２９は、フィルタスライダ２１の端部にそれぞれ、最小透過度を備えた全面蒸着面を有しており、この全面蒸着面は少なくとも光路の径xを有している。
【００３８】
図２ｄも同様に、２つの励起バンドAとDを備えた本発明によるマルチバンド蛍光顕微鏡のためのフィルタスライダ２１を図示したものである。長方形のガラス板２７には、長波長の励起バンドAを濾波するためのショートパスフィルタ２８と、短波長の励起バンドDを濾波するためのロングパスフィルタ２９とが異なる蒸着層として被着されている。その間に自由開口部２２がある。
【００３９】
この実施形態では、蒸着層はストライプ状の面要素３０として被着されており、ストライプの幅はフィルタスライダ２１の中央部から端部のほうへ増大している。これにより、透過度はスライド方向において自由開口部２２からフィルタスライダ２１の端部のほうへ減少する。この実施形態でも、両フィルタ２８,２９は、フィルタスライダ２１の端部にそれぞれ、最小透過度を備えた全面蒸着面を有しており、この全面蒸着面は少なくとも光路の径xを有している。
【００４０】
図２eは、光の波長λと、短波長励起バンドＡと長波長励起バンドDのスペクトル透過曲線、および付属のセレクティブフィルタ、すなわち短波長の励起バンドAを濾波するためのロングパスフィルタ２８と、長波長の励起バンドDを濾波するためのショートパスフィルタ２９の透過曲線Ｔ_Ａ，Ｔ_Ｄとの関係を示したものである。フィルタAとBは、選択的にそれぞれに付属の励起バンドを濾波するように、しかし残余の波長領域を支障なく通過させるように選定されている。
【００４１】
図３ａは、３つの励起バンドＡ,Ｂ,Dを備えた本発明によるマルチバンド蛍光顕微鏡のための２分割のフィルタスライダセット２０の長方形のフィルタスライダ２１を示している。この実施形態では、フィルタスライダセット２０は、同一の２つの長方形のフィルタスライダ２１からなっており、これらフィルタスライダ２１は、開口絞り面２４の横に互いに密接して直列に位置するように照明光路内へ挿入される。
【００４２】
フィルタスライダ２１の中央部には、照明光路２の径ｘを持った自由開口部２２が設けられている。フィルタスライダ２１の両端部には、励起バンドＡ,Ｂ,Ｄのための３つのセレクティブフィルタ２８,２９,３１のそれぞれ２つからなっている２つの異なる組み合わせ体が蒸着層として被着されている。一端に設けられている両フィルタ２８,３１または２９,３１は、これら両フィルタが互いに境を接するように、且つ自由開口部２２に境を接するようにそれぞれ並設されている。各フィルタ２８,２９,３１は少なくとも照明光路２の径ｘを持った最小透過度の領域を有している。これにより、フィルタスライダ２１はその短い端部において少なくとも２ｘの幅を有する。
【００４３】
フィルタ２８,２９,３１の透過度は、フィルタスライダ２１の長手方向において、すなわちスライド方向において、自由開口部２２から端部のほうへ減少している。これを実現するため、ここに図示した実施形態では、それぞれのフィルタ２８,２９,３１の蒸着面はそれぞれ自由開口部２２からフィルタスライダ２１の端部へ増大している。
【００４４】
フィルタスライダセットの同一の２つのフィルタスライダ２１のそれぞれに対しては、フィルタスライダ２１を開口絞り面２４に対し平行に長手方向にも横方向にもスライドさせるための別個の位置調整手段２５が設けられている。これにより、フィルタ２８,２９,３１を個別に或いは一緒に、それらの面の全体を、または面の一部分を照明光路に挿入することが可能である。
【００４５】
図３ｂは、３つの励起バンドＡ,Ｂ,Dを備えた本発明によるマルチバンド蛍光顕微鏡のための２分割のフィルタスライダセット２０の円形のフィルタスライダ２１を示している。本発明によるマルチバンド蛍光顕微鏡のこの有利な実施形態では、フィルタスライダセット２０は同一の円形のフィルタスライダ２１からなり、これらフィルタスライダは開口絞り２４の横に互いに密接するように直列に照明光路に挿入される。それぞれのフィルタスライダ２１上には自由開口部２２が中央部に設けられている。自由開口部２２に境を接するように、互いに境を接するように蒸着された円環セクターとして、励起バンドＡ,Ｂ,Ｄのための３つのセレクティブフィルタ２８,２９,３１が配置されている。
【００４６】
フィルタ２８,２９,３１の透過度はそれぞれ半径方向に減少しており、透過度は自由開口部２２の横で最大となっている。これを実現するため、たとえば、フィルタ２８,２９,３１は全面に蒸着されているのではなく、自由開口部２２の横で、半径方向に幅を持って延在するように蒸着された面要素３０が被着されており、これら面要素３０の間には非蒸着面領域があるので、それぞれのフィルタ２８,２９,３０の蒸着面は半径方向に増大している。
【００４７】
別個の位置調整手段（ここには図示せず）を用いて、フィルタスライダセット２０の同一の２つのフィルタスライダ２１のそれぞれは個別に開口絞り面２４に対し平行に移動させることができる。各フィルタスライダ２１は横方向において一方向に移動させることができ、補助的に回転させることもでき（図３ｂを参照）、或いは、１つの面内を２方向に移動させることができる。これにより、フィルタスライダ２１のそれぞれ任意の面部分、すなわちたとえば自由開口部２２または所望の透過度を持ったフィルタ２８,２９,３１の１つを照明光路内へ挿入させることができる。照明光路内に２つの同じフィルタスライダ２１を配置することにより、３つのフィルタ２８,２９,３１のうち任意の２つのフィルタを同時に照明光路内へ挿入できるので、３つの励起バンドのうち２つの励起バンドを同時に所定の基準値に弱化させることができ、或いは完全に絞ることができる。
【００４８】
図３ｃは、３つの励起バンドＡ,Ｂ,Dを備えた本発明によるマルチバンド蛍光顕微鏡の２分割のフィルタスライダセット２０のためのフィルタスライダ２１の特に有利な実施形態を示している。本発明によるマルチバンド蛍光顕微鏡のこの実施形態では、フィルタスライダセット２０は２つの同一の円形のフィルタスライダ２１からなっており、これらフィルタスライダ２１は開口絞り面２４の横に互いに密接して直列に位置するように照明光路に挿入される。
【００４９】
励起バンドＡ,Ｂ,Ｄのためのフィルタ２８,２９,３１は、回転だけを行なえばよく、スライドさせる必要がない（図中に回転運動が示唆されている）ように配置されているので有利である。このため、両フィルタスライダ２１のそれぞれに付設されている機械的または電動式の位置調整手段（ここには図示せず）の構成が簡潔になる。
【００５０】
これを達成するため、各フィルタスライダ２１は円形に構成されており、６つのセクターに分割され、その中央部が回転可能に支持されている。円の中心は照明光路の外側にある。各セクターはフィルタスライダ２１を回転させることにより照明光路内へ回動して照明光路を完全に覆う。ｘは、放射横断面の径である。
【００５１】
それぞれ第２のセクターが自由開口部２２である。その間には、３つの励起バンドＡ,Ｂ,Ｄのための３つのフィルタ２８,２９,３１のそれぞれ１つが被着され、たとえば接着或いは蒸着されている。各フィルタ２８,２９,３１は、その円セクター内側において、且つ両回転方向の１つにおいて、透過度が増大しており、これはたとえば面要素を蒸着した異なる面敷設により実現される。これにより各フィルタ２８,２９,３１は隣接している一方の自由開口部２２の横で最大透過度を有しており、隣接する他方の自由開口部２２の横では最小透過度を有している。フィルタスライダ２１を回転させることにより、自由開口部２２の１つまたは所望の透過度を持ったフィルタ２８,２９,３１の１つ、或いは両者の組み合わせを照明光路内へ挿入することができる。フィルタスライダとして２つの同一のフィルタスライダ２１を使用することにより、３つの励起バンドＡ,B,Ｄのうち２つまでを同時に且つ互いに独立に所望の基準値へ減衰させることが可能になる。
【００５２】
図３ｄは、光の波長λと、短波長の励起バンドＡ,長波長の励起バンドD、およびその間にある励起バンドＢのスペクトル透過曲線との関係を示したものである。さらに、付属のセレクティブフィルタの透過曲線、すなわち短波長の励起バンドAのためのロングパスフィルタと、長波長の励起バンドDのためのショートパスフィルタと、励起バンドＢのためのセレクティブフィルタの透過曲線Ｔ_Ａ，Ｔ_Ｂ，Ｔ_Ｄも図示されている。これらフィルタは、選択的に付属の励起バンドを濾波するが、残余の波長範囲を支障なく通過するように選定されている。
【００５３】
図４ａは、４つの励起バンドＡ,Ｂ,Ｃ，Dを備えた本発明によるマルチバンド蛍光顕微鏡のための３分割のフィルタスライダセット２０のための円形のフィルタスライダ２１を示している。本発明によるマルチバンド蛍光顕微鏡のこの有利な実施形態では、フィルタスライダセット２０は３つの同一の円形のフィルタスライダ２１からなり、これらフィルタスライダは開口絞り２４の横に互いに密接するように直列に照明光路に挿入される。各フィルタスライダ２１は中央部に自由開口部２１を有している。その横には、境を接する円環セクターとして、励起バンドＡ,B,Ｃ,Ｄのための４つのセレクティブフィルタ２８,２９,３１,３２が蒸着されている。
【００５４】
フィルタ２８,２９,３１,３２の透過度は半径方向に減少しており、自由開口部２２の横で最大になっている。これを実現するため、たとえば、フィルタ２８,２９,３１,３２は全面が蒸着されるのではなく、非蒸着面を備えたリング状の面要素３０として蒸着され、これによりそれぞれのフィルタ２８,２９,３１,３２の蒸着面の部分は半径方向に増大している。
【００５５】
フィルタスライダセット２０の３つのフィルタスライダ２１のそれぞれには別個の位置調整手段（ここには図示せず）が付設されている。この位置調整手段を用いてそれぞれのフィルタスライダ２１を個別に開口絞り面２４に対し平行にスライドさせることができる。この場合フィルタスライダは横方向において一方向にスライドさせ、補助的に回転させることができ（図４ａに示唆されている）、或いは、これに代えて１つの面内で２方向にスライドさせることができる。
【００５６】
これにより、フィルタスライダ２１のそれぞれ任意の面部分を、すなわちたとえば自由開口部２２またはフィルタ２８,２９,３１,３２の任意の１つの面部分を照明光路内へ挿入することができる。照明光路内に３つの同じフィルタスライダ２１を配置することにより、４個のフィルタ２８,２９,３１,３２のうち任意の３個のフィルタを同時に照明光路内に挿入できる。したがって、４つの励起バンドＡ,B,Ｃ,Ｄのうち３つまでを同時に所定の基準値に減衰させることができ、または完全に絞ることができる。
【００５７】
図４ｂは、４つの励起バンドＡ,Ｂ,Ｃ，Dを備えた本発明によるマルチバンド蛍光顕微鏡のための３分割のフィルタスライダセット２０のためのフィルタスライダ２１の特に有利な実施形態を示している。本発明によるマルチバンド蛍光顕微鏡のこの有利な実施形態では、フィルタスライダセット２０は３つの同一の円形のフィルタスライダ２１からなり、これらフィルタスライダは開口絞り面２４の横に互いに密接するように直列に照明光路に挿入される。
【００５８】
励起バンドＡ,Ｂ,Ｃ，Dのためのフィルタ２８,２９,３１,３２は、回転させるだけでよく、スライドさせる必要がない（図に回転運動が示唆されている）ように配置されているので有利である。これにより、３個のフィルタスライダ２１のそれぞれに別個に付設されている機械的または電動式の位置調整手段（ここには図示せず）の構成が簡潔になる。
【００５９】
これを実現するため、各フィルタスライダ２１は円形に構成され、８個のセクターに分割されており、その中心の周りで回転可能に支持されている。円の中心は照明光路の外側にある。フィルタスライダ２１を回転させることにより、各セクターは全体がまたは部分的に照明光路によって覆われる。ｘは、放射横断面の径である。
【００６０】
それぞれ第２のセクターが自由開口部２２である。その間にそれぞれ、励起バンドＡ,Ｂ,Ｃ，Dのための４個のフィルタ２８,２９,３１,３２のそれぞれ１個が被着され、たとえば接着または蒸着されている。各フィルタ２８,２９,３１,３２はその円セクターの内側において、両回転方向のうち１つの回転方向に透過度が増大しており、これはたとえば異なる面敷設により実現される。これにより、各フィルタ２８,２９,３１,３２は隣接している一方の自由開口部２２の横で透過度が最大であり、隣接している他方の自由開口部２２の横で透過度が最小になっている。
【００６１】
フィルタスライダ２１を回転させることにより、自由開口部２２の１つまたは所望の透過度を持ったフィルタ２８,２９,３１，３２の１つ、或いは両者の組み合わせを照明光路内へ挿入することができる。３つのフィルタスライダ２１を使用することにより、４つの励起バンドＡ,B,Ｃ，Ｄのうち３つまでを同時に且つ互いに独立に所望の基準値へ減衰させることができる。
【００６２】
図４ｃは、光の波長λと、短波長の励起バンドＡ,長波長の励起バンドD、およびその間にある励起バンドＢとＣのスペクトル透過曲線との関係を示したものである。さらに、付属のセレクティブフィルタの透過曲線、すなわち短波長の励起バンドAのためのロングパスフィルタと、長波長の励起バンドDのためのショートパスフィルタと、励起バンドＢのためのセレクティブフィルタと、励起バンドＣのためのセレクティブフィルタの透過曲線Ｔ_Ａ，Ｔ_Ｂ，Ｔ_Ｃ、Ｔ_Ｄも図示されている。フィルタＡ,Ｂ,Ｃ,Ｄは、選択的に付属の励起バンドを濾波するが、残余の波長範囲を支障なく通過するように選定されている。
【００６３】
４つ以上の励起バンドに対しては、フィルタスライダセット２０を対応的に拡張せねばならない。もちろん、個々のフィルタを開口絞り５の横に十分近接して収納する困難さが増す。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明によるマルチバンド蛍光顕微鏡の光路を示す図である。
【図２ａ−ｄ】２バンド傾向顕微鏡用のフィルタスライダの種々の実施形態を示す図である。
【図２ｅ】励起バンドと２バンド蛍光顕微鏡用のフィルタスライダのフィルタとのスペクトル透過変化を示す図である。
【図３ａ−ｃ】本発明による３バンド蛍光顕微鏡の２分割のフィルタスライダセット用のフィルタスライダの種々の実施形態を示す図である。
【図３ｄ】励起バンドと３バンド蛍光顕微鏡用のフィルタスライダのフィルタとのスペクトル透過変化を示す図である。
【図４ａ−ｂ】本発明による４バンド蛍光顕微鏡の３分割のフィルタスライダセット用のフィルタスライダの種々の実施形態を示す図である。
【図４ｃ】励起バンドと４バンド蛍光顕微鏡用のフィルタスライダのフィルタとのスペクトル透過変化を示す図である。
【符号の説明】
１ 光源
２ 照明光路の光軸
３ 集光器
４ 第１のレンズ要素
５ 開口絞り
６ 第２のレンズ要素
７ 照明フィールド絞り
８ 第３のレンズ要素
９ 励起フィルタ
１０ ビームスプリッター
１１ 対物レンズ
１２ 蛍光対象物
１３ 載物テーブル
１４ 出口フィルタ
１５ 鏡筒レンズ
１６ 中間像面
１７ 接眼レンズ
１８ ビデオカメラ
１９ 画像分析システム
２０ フィルタスライダセット
２１ フィルタスライダ（２１ａ，２１ｂも）
２２ 自由開口部
２３ セレクティブフィルタ
２４ 開口絞り面
２５ 位置調整手段（２５ａ,２５ｂ モータ）
２６ 電子制御器
２７ ガラス板
２８ 長波長励起バンドＤ（λ_４）用のショートパスフィルタ
２９ 短波長励起バンドＡ（λ_１）用のロングパスフィルタ
３０ 面要素
３１ 励起バンドＢ（λ_２）用の減色フィルタ
３２ 励起バンドＢ（λ_３）用の減色フィルタ
ｘ 開口絞り面２４の放射径

Claims (12)

1. 照明光路が、光源（１）と、集光器（３）と、複数のレンズ要素（４,６,８）と、開口絞り（５）と、照明フィールド絞り（７）と、波長が異なる複数の励起バンドを同時に生じさせるための励起フィルタ（９）とを含み、ビームスプリッター（１０）と対物レンズ（１１）が設けられ、対物レンズ（１１）が、照明光線を載物テーブル（１３）上にある蛍光対象物（１２）へ指向させ、蛍光対象物（１２）が、ビームスプリッター（１０）と出口フィルタ（１４）と鏡筒レンズ（１５）を介して中間像面（１６）に結像せしめられるマルチバンド蛍光顕微鏡において、
   ａ）フィルタ要素として、個別に位置調整可能で、間隔をもって密に配置されるフィルタスライダ（２１；２１ａ,２１ｂ）からなるフィルタスライダセット（２０）が設けられ、該フィルタスライダセット（２０）は、開口絞り（５）の横に密接して照明光路内に垂直に挿入されていること、
   ｂ）各励起バンドのための各フィルタスライダ（２１）に対しセレクティブフィルタ（２３；２８,２９,３１,３２）が設けられ、セレクティブフィルタ（２３；２８,２９,３１,３２）が、高い透過度と低い透過度を持った面領域を有していること、
   ｃ）励起バンドを完全に消すため、最低透過度を持った面領域が、放射径（ｘ）に等しい最小径を有していること、
   ｄ）各フィルタ（２３；２８,２９,３１,３２）の横に、放射径（ｘ）を持った自由開口部（２２）が配置されていること、
   ｅ）各フィルタ（２３；２８,２９,３１,３２）の透過度が、スライド方向において自由開口部（２２）からの距離とともに減少していること、
   ｆ）各フィルタスライダ（２１）に対し別個の位置調整手段（２５）が付設され、これらの位置調整手段（２５）を用いてフィルタスライダ（２１）の任意の面領域を照明光路内へ挿入可能であること、
   を特徴とするマルチバンド蛍光顕微鏡。
2. ｎ個の励起バンドを制御するため、
   ａ）フィルタスライダセット（２０）が（ｎ−１）個のフィルタスライダ（２１）からなり、これらフィルタスライダ（２１）が、開口絞り面（２４）に対し平行に密に間隔を持って配置される（ｎ−１）個の別個のスライド面上にあること、
   ｂ）各フィルタスライダ（２１）が、少なくとも１つの自由開口部（２２）と、ｎ個の励起バンドのためのセレクティブフィルタ（２３；２８,２９,３１,３２）とを有していること、
   を特徴とする、請求項１に記載のマルチバンド蛍光顕微鏡。
3. ２つの励起バンド（Ａ,Ｄ）を制御するため１つのフィルタスライダ（２１）が設けられ、このフィルタスライダ（２１）が、
   ａ）その一端に、短波長の励起バンド（Ａ）の強度を弱化させるためのロングパスフィルタ（２９）を有し、
   ｂ）その他端に、長波長の励起バンド（Ｄ）の強度を弱化させるためのショートパスフィルタ（２８）を有し、
   ｃ）その間に自由開口部（２２）を有し、
   ｄ）フィルタスライダ（２１）を連続的にスライドさせるための位置調整手段（２５）が開口絞り面（２４）に対し平行に取り付けられていること、
   を特徴とする、請求項１に記載のマルチバンド蛍光顕微鏡。
4. ａ）フィルタスライダ（２１）が、光を透過させる長方形のガラス板（２７）を有し、ガラス板（２７）の端部に、ショートパスフィルタ（２８）とロングパスフィルタ（２９）が蒸着層として被着されていること、
   ｂ）ショートパスフィルタ（２８）とロングパスフィルタ（２９）が、それぞれ自由開口部（２２）からフィルタスライダ（２１）の端部のほうへ蒸着ガラス面の割り当てが増大して、透過度が減少していること、
   を特徴とする、請求項２に記載のマルチバンド蛍光顕微鏡。
5. フィルタスライダ（２１）の端部に設けた両蒸着層の面が、それぞれ放射径（ｘ）に等しい最小エッジ長さを持った長方形の形状を有し、この長方形に、自由開口部（２２）の方向において、蒸着された二等辺三角形面の底辺が境を接していることを特徴とする、請求項３に記載のマルチバンド蛍光顕微鏡。
6. 蒸着層が全体的にまたは部分的に繋がった面としてではなく面要素（３０）として被着され、その大きさまたは間隔がスライド方向において自由開口部（２２）から端部のほうへ種々選定されていることを特徴とする、請求項３に記載のマルチバンド蛍光顕微鏡。
7. ３つの励起バンド（Ａ,Ｂ,Ｄ）を制御するため、２つの円形のフィルタスライダ（２１）からなる２分割のフィルタスライダセット（２０）が設けられ、
   ａ）各フィルタスライダ（２１）が中央部に円形の自由開口部（２２）を有し、
   ｂ）そのまわりに３つの円環セクターとして、透過度が半径方向に減少している励起バンド（Ａ,Ｂ,Ｄ）用のセレクティブフィルタ（２８,２９,３１）が配置されていること、
   ｃ）各フィルタスライダ（２１）に別個の位置調整手段（２５）が付設され、これらの位置調整手段（２５）によりフィルタスライダ（２１）を互いに独立に開口絞り面（２４）に対し平行にスライドおよび（または）回転可能であること、
   ことを特徴とする、請求項１に記載のマルチバンド蛍光顕微鏡。
8. 透過度を半径方向に減少させるため、フィルタ（２８,２９,３１）の蒸着面の割り当てが半径方向に増大していることを特徴とする、請求項７に記載のマルチバンド蛍光顕微鏡。
9. ３つの励起バンド（Ａ,Ｂ,Ｄ）を制御するため、２つの円形のフィルタスライダ（２１）からなる２分割のフィルタスライダセット（２０）が設けられ、
   ａ）各フィルタスライダ（２１）が、照明光路を覆っている６個の円形セクターに分割され、光路外にあるその中心の周りに回転可能に支持されていること、
   ｂ）それぞれ第２の円形セクターが自由開口部（２２）であり、その間に励起バンド（Ａ,Ｂ,Ｄ）用の３つのセレクティブフィルタ（２８,２９,３１）の１つがあること、
   ｃ）各フィルタ（２８,２９,３１）が、両回転方向の一方において透過度が増大していること、
   ｄ）各フィルタスライダ（２１）をその中心の周りに且つ開口絞り面（２４）に対し平行に回転させるための別個の位置調整手段（２５）が設けられていること、
   を特徴とする、請求項１に記載のマルチバンド蛍光顕微鏡。
10. ３つの励起バンド（Ａ,Ｂ,Ｄ）を制御するため、２つの長方形のフィルタスライダ（２１）からなる２分割のフィルタスライダセット（２０）が設けられ、
    ａ）各フィルタスライダ（２１）が中央部に自由開口部（２２）を有し、その両端部に、励起バンドのための３つのセレクティブフィルタ（２８,２９,３１）のうちそれぞれ２つのセレクティブフィルタからなる２つの異なる組み合わせを有していること、
    ｂ）フィルタ（２８,２９,３１）の透過率が、フィルタスライダ（２１）の長手方向において自由開口部（２２）から端部のほうへ減少していること、
    ｃ）フィルタスライダ（２１）を長手方向に且つ開口絞り（２４）に対し平行にスライドさせるための別個の位置調整手段（２５）が配置されていること、
    を特徴とする、請求項１に記載のマルチバンド蛍光顕微鏡。
11. ４つの励起バンド（Ａ,Ｂ,Ｃ,Ｄ）を制御するため、３つの円形のフィルタスライダ（２１）からなる３分割のフィルタスライダセット（２０）が設けられ、ａ）各フィルタスライダ（２１）が中央部に自由開口部（２２）を有し、そのまわりに励起バンドのための４つのフィルタ（２８,２９,３１,３２）を有し、これらフィルタ（２８,２９,３１,３２）は、互いに境を接するように蒸着され、半径方向に透過度が減少している円環セクターとして構成されていること、
    ｂ）各フィルタスライダ（２１）を開口絞り面（２４）に対し平行にスライドおよび（または）回転させるための別個の位置調整手段（２５）が設けられていること、
    を特徴とする、請求項１に記載のマルチバンド蛍光顕微鏡。
12. ４つの励起バンド（Ａ,Ｂ,Ｃ,Ｄ）を制御するため、３つの円形のフィルタスライダ（２１）からなる３分割のフィルタスライダセット（２０）が設けられ、ａ）各フィルタスライダ（２１）が、照明光路を覆う８個の円形セクターに分割され、光路外にあるその中心の周りに回転可能に支持されていること、
    ｂ）それぞれ第２の円形セクターが自由開口部（２２）であり、その間にそれぞれ励起バンドのための４つのセレクティブフィルタ（２８,２９,３１,３２）の１つがあること、ｃ）それぞれのフィルタ（２８,２９,３１,３２）が、両回転方向の一方において透過度が増大していること、
    ｄ）各フィルタスライダ（２１）を開口絞り（２４）に対し平行に自らの中心の周りに回転させるための別個の位置調整手段（２５）が設けられていること、
    を特徴とする、請求項１に記載のマルチバンド蛍光顕微鏡。

Images