CN1162728C

CN1162728C - 用于在多波段荧光显微镜中单独匹配激发强度的方法以及用于实施该方法的多波段荧光显微镜

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Publication number: CN1162728C
Application number: CNB998146560A
Authority: CN
Inventors: A��ά; A·维斯
Original assignee: Leica Mikroskopie und Systems GmbH
Current assignee: Lycra Microsystems And Microscopes Co ltd; Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 1998-12-17
Filing date: 1999-11-27
Publication date: 2004-08-18
Anticipated expiration: 2019-11-27
Also published as: US6747280B1; JP2002532748A; CN1330775A; DE59904198D1; JP3746195B2; DE19858206A1; ATE231984T1; WO2000036451A1; EP1141764B1; DE19858206C2; EP1141764A1

Abstract

本发明涉及用多个光谱的不同激发带和所属的荧光谱带在多波段荧光显微镜中单独匹配激发强度的方法。在显微镜图像中确定单个荧光谱带的强度，并且将其与大于或等于零的强度标准值进行比较。对于各个属于偏离强度标准值的荧光强度的激发带，在照明光路中为其装设一种选择滤光镜(23；28、29、31、32)，并且其透射比如此无级地来调节，使得通过激发带的衰减，所属荧光强度被调节到其强度标准值。用于实施该方法的多波段荧光显微镜在紧靠孔径光阑(5)处具有一个由具有选择滤光镜(23；28、29、31、32)的可单独移动的、并且间隔紧密的滤光镜闸门(21；21a、21b)组成的滤光镜闸门组(20)，其中的滤光镜对于各激发带具有连续可调的透射比，且具有至少一个敞露开口(22)。本发明还给出了滤光镜组(20)不同的有利布置。

Description

用于在多波段荧光显微镜中单独匹配激发强度的方法以及用于实施该方法的多波段荧光显微镜

技术领域

本发明涉及一种对应于独立权利要求的前序部分所述特征的、用于在多波段荧光显微镜中单独匹配激发强度的方法和实施该方法的多波段荧光显微镜。

背景技术

在多波段荧光显微镜中，用户经常会遇到这种问题，即在显微镜图像中不同的荧光谱带具有不同的强度并且可视程度不同。原因常常是在于照明光路中的不同激发强度或者也在于成像光路中带阻滤光镜对荧光强度的阻挡不同。也由于在待观察物体的着色中荧光色素的浓度对于不同的激发带是不同的，或者由于色素的逐渐褪色、即所谓的脱色，从而导致显微镜图像中荧光谱带的强度不同。当显微镜图像需要被拍摄下来时，不同的荧光谱带强度被证明是尤其有问题的。于是，照片上荧光的强弱部分再现得很差或者根本看不出来。只有荧光谱带的强度尽可能地相等，才能得到显微镜图像的完好照片。

美国专利US 5,371,624提供了一种只具有两个激发带的荧光显微镜，其中两个激发带的强度可以交替进行作用。该显微镜含有具有一个光源和一个激发滤光镜的照明光路，该激发滤光镜从光源的光线中产生不同光波波长的多个激发带。另外该显微镜还具有一个分光镜、一个用于荧光的输出滤光镜(也称为带阻滤光镜或发射滤光镜)以及用于影响激发带强度的滤光镜单元。

所述滤光镜单元可以相对于光轴翻转而无级地在两个末端位置之间进行转换，该两末端位置相对于一个或另一个激发带具有两个固定的透射比值，在一末端位置只有第一激发带被衰减，在另一末端位置只有第二激发带被衰减，而在两个末端位置之间两个激发带都不衰减。各激发带的透射比只可能下降至固定值。然而在最大透射与零值之间变化、也即直至完全抑制两个激发带也是不可能的。另外，只能作用于两个激发带。

发明内容

本发明的任务在于，提供一种用于在多波段荧光显微镜中单独匹配激发强度的方法以及一种用于实施该方法的多波段荧光显微镜，其中，可以有选择地部分或完全滤除激发带中的一个或多个。为此，各激发带的透射比能够用简单的方法来无级调节。

本发明的该任务通过以下的方法和多波段荧光显微镜而得到解决。

根据本发明的在具有多个光谱不同的激发带的多波段荧光显微镜中单独匹配激发强度的方法，其中这些激发带由荧光体同时变换成具有荧光强度的荧光谱带，其特征在于：(a)在显微镜图像中确定单个荧光谱带的荧光强度，并将其与被设为大于或等于零的强度标准值进行比较，(b)对于属于偏离强度标准值的荧光强度的激发带，为其在照明光路中设置一种波长选择滤光镜，(c)而且，如此无级地调节在照明光路中起作用的单个的所述波长选择滤光镜的透射比，使得通过衰减所属的激发带来把所有荧光强度调节到其强度标准值。

根据本发明的多波段荧光显微镜，包含有照明光路，其中该照明光路具有光源、聚光镜、多个透镜、孔径光阑、明场光阑、用于同时生成不同光波波长的多个激发带的激发滤光镜、以及用于影响激发带的滤光镜单元，所述的显微镜另外还包含有分光镜和把照明光线对准到放在载物台上的荧光体的物镜，其中该荧光体通过分光镜、输出滤光镜和筒状透镜在中间像平面中成像，其特征在于：a)由可单独移动的、间隔紧密的滤光镜闸门组成的滤光镜闸门组作为滤光镜单元并紧挨着孔径光阑而被垂直插入到照明光路中，b)在每个滤光镜闸门上为每个激发带设置了一个波长选择滤光镜，其中波长选择滤光镜具有大和小透射比的平面区域，c)为了完全遮蔽激发带，具有最小透射比的平面区域具有一个等于透射孔径的最小孔径，d)在每个波长选择滤光镜旁设置有一个具有透射孔径的敞露开口，e)各波长选择滤光镜的透射比在移动方向上随着与敞露开口的间隔的增加而减小，f)而且，每个滤光镜闸门分配有单独的调整装置，借助该调整装置，滤光镜闸门的任意平面区域都可以插入到照明光路中。

本发明的方法是以已公开的多波段荧光显微镜为出发点，其中在照明光路中借助激发滤光镜从光源的光线中生成不同光波波长的多个激发带。激发带照亮一种用荧光色素制做的荧光体，并且由该荧光体变换成频率被偏离的荧光谱带。

本发明中，在显微镜图像中首先确定单个荧光谱带的荧光强度，并且将其与预定强度标准值相比较。荧光强度的确定比如可以通过视觉或借助强度测定器来实施。该强度测定器比如可以由后面连接了图像分析系统的电视摄像机或CCD摄像机组成。

在此，对于各荧光谱带可以确定不同的强度标准值。在实际中，该标准值还可以取决于显微镜用户的具体出发点。如果比如需要把显微镜图像用照片或视频摄像机记录下来，并且照片或视频图像中的各荧光谱带需同样明亮地再现，那么该标准值的大小便依赖于胶片以及摄像机的光谱灵敏度。因此，在确定不同激发带的标准值时必须考虑其光谱灵敏度。

倘若胶片或摄像机用相同强度再现全部光谱颜色，则期望的标准值必须全部相等-而且甚至于最低荧光强度也相等。然而，如果视频摄像机或胶片的光谱灵敏度不为恒量，那么对于不同的荧光谱带必须确定相应不同的标准值，以便能够同样明亮地再现该荧光谱带。

另一方面，如果想在照片或视频图像上不显现某些荧光谱带，即想遮蔽它们，则用于该荧光谱带的标准值必须等于零。对此，如下做法被证明是有利的，即没被遮蔽的荧光谱带的标准值也与其强度的最小值相等。于是，这些荧光谱带全部同样明亮地显现。

对于属于偏离标准值的荧光强度的各激发带，在本发明中，它被送到照明光路中被调整到相关激发带的波长选择滤光镜上。其光谱传输过程如此来设置，使得只有相关激发带的强度被减弱，而剩下的光谱区域则无阻碍地透过。

在本发明的一种用来实施本发明方法的多波段荧光显微镜中，一种由多个可单独移动的滤光镜闸门组成的滤光镜闸门组紧挨着孔径光阑而垂直插入在照明光路中。

滤光镜闸门的构造与多波段荧光显微镜的不同激发带的数量有关。在数量为n的激发带的情况下，每个滤光镜闸门具有n个调谐到该激发带的波长选择滤光镜，其中，该波长选择滤光镜具有高和低透射比的平面区域。

通过只给幅射截面的某些平面部分覆盖不同的滤光镜平面单元来获得不同的透射比。在此要注意辐射截面的平面覆盖应尽可能均匀，使得辐射截面没有单侧的阴影，从而使得也没有单侧的光瞳照射。从而避免了不正确的照明，并由此避免了在聚焦时像点的水平偏移。

滤光镜必须能够单独地或者联系所需的平面区域及期望的透射而被插到照明光路中。在此，在n个激发带的情况下，最多n-1个滤光镜可以相互组合在一起，也即可以同时插入到照明光路中。这已经足够了，原因是无须把全部激发带同时衰减，因为通常是由一个激发带提供强度标准值并且保持不变。同样，无须将全部激发带同时去除，原因是这等于是关掉照明。

为了得到所要求的n-1个滤光镜组合，在本发明具有n个激发带的多波段荧光显微镜的一个有利的实施方案中，在n-1个移动面上设置有n-1个可单独移动的滤光镜闸门，其中这些滤光镜闸门以微小的间距相互平行地紧挨着孔径光阑放置，并且可以组合使用。用每个滤光镜闸门均可以调节滤光镜使一种激发带透过，使得能够衰减或去除最多全部n-1个激发带(或小于该最大数量)。

对于两个激发带，把两个所要求的滤光镜设置在一个单独的移动面上(n-1＝1)就已足够了，原因是只须在照明光路中移动一个或另一个滤光镜。因此，用于影响两个激发带的滤光镜组被有利地构造成单部分的，也即只具有一个滤光镜闸门。然而对于多于两个激发带的情况，必须设置相应具有n-1个可单独移动滤光镜闸门的多部分滤光镜闸门组。

除了用于不同激发带的波长选择滤光镜之外，每个滤光镜闸门还具有至少一个带有照明光路透射孔径的敞露开口。在此，在每个滤光镜旁设置有一个敞露开口。这些滤光镜也可以按实施方案直接地围着一个单独的敞露开口而组合起来。滤光镜的透射比在移动方向上随着与敞露开口的距离的增加而减小。这里每个滤光镜都具有一个带有最小透射比以及带有等于透射孔径x的最小孔径的平面区域。如果将该平面区域插入照明光路中，则所属激发带的衰减最大，也即达到零值。

通过在照明光路中正确放置单个的滤光镜来如此精确地单独调节照明光路上的有效透射比，使得通过对滤光镜所属的激发带进行衰减来使由此产生的荧光强度与强度标准值相一致。为了实施这种方法步骤，每个滤光镜闸门都分配了单独的调整装置，其中该调整装置通过移动和/或旋转滤光镜闸门来用滤光镜闸门的合适平面区域全部或部分地遮蔽照明光路。这样，敞露开口或者滤光镜中的一个或多个、或者滤光镜平面和敞露开口的组合可以有选择地插入到照明光路中。如果对所有滤光镜并由此对所有激发带实施该最后的方法步骤，那么所有的荧光强度便与其标准值相一致。

在借助所提供的多波段荧光显微镜、并应用本发明的方法最佳地调节荧光强度之后，一段时间之后也会出现荧光强度与标准值的偏离。其原因在于，不同的荧光色素对于不同的激发带褪色快慢不同，也即它们表现出特有的脱色。

因此在本方法的一个有利的实施方案中确定了随时间不断地改变荧光强度的方法。于是，照明光路中有效的滤光镜透射比在确定的时间间隔内如此重复地进行调节，使得荧光强度不断地再次与其标准值相一致。

本方法的一个尤其有利的扩展方案可以进行自动脱色补偿。为此，不断地自动确定随时间改变的荧光强度。因此，可以自动且不断地比如用视频摄像机来拍摄显微镜图像，并且其中所含的荧光强度用图像分析系统来确定，并将其与预定的标准值进行比较。

于是，滤光镜的透射比可自动且不断地改变和匹配，使得荧光强度不断地保持在强度标准值。因此比如可以采用电机驱动的调整装置。电机的控制以及把荧光强度调节到标准值可通过电子装置和计算机来实现，其中把视频摄像机或图像分析系统的信号传输给该计算机。

附图说明

下文借助附图对本发明进行详细解释。其中，

图1示出了本发明的多波段荧光显微镜的光路；

图2a-d示出了两波段荧光显微镜的滤光镜闸门的不同布置；

图2e示出了两波段荧光显微镜激发带以及滤光镜闸门的所属滤光镜的光谱透射曲线；

图3a-c示出了本发明三波段荧光显微镜的两部分滤光镜闸门组的滤光镜闸门的不同布置；

图3d示出了三波段荧光显微镜激发带以及滤光镜闸门的所属滤光镜的光谱透射曲线；

图4a-b示出了本发明四波段荧光显微镜的四部分滤光镜闸门组的滤光镜闸门的不同布置；

图4c示出了四波段荧光显微镜激发带以及滤光镜闸门组的所属滤光镜的光谱透射曲线。

具体实施方式

图1示出了一种用于实施本发明方法的本发明多波段荧光显微镜的光路。照明光路从光源1顺着光轴2出发，在照明光路中依次设置有聚光镜3、第一透镜4、孔径光阑5、第二透镜6、明场光阑7、第三透镜8和用于生成激发带的激发滤光镜9。照明光路在分光镜10上偏转到物镜11。光路穿过物镜11到达放置在载物台13上的荧光体12。

由激发滤光镜9生成的激发带在照明光路中通过放置在荧光体12中的荧光色素变换为荧光谱带，并且该荧光谱带由荧光体12频率偏移地发射。该荧光穿过物镜11、分光镜10、输出滤光镜14、筒状透镜15并到达中间像平面16。这里生成的中间图像可以由显微镜使用者用目镜17来观察。中间图像另外通过TV输出在后面联接有图像分析系统19的视频摄像机18上成像。利用这种构造，不但可以通过目镜17在视觉上、而且可以借助图像分析系统19来确定显微镜图像中单个荧光谱带的荧光强度，并且将其与大于或等于零的强度标准值进行比较。

为了衰减激发带，本发明的滤光镜闸门组20(在本例中由两个滤光镜闸门21a和21b组成)垂直于照明光路的光轴2，并紧挨着孔径光阑平面24(即在其之前以及之后)而被插到照明光路中。在每个滤光镜闸门21a、21b上设置有一个敞露开口22和多个与之相邻的、并被调谐到激发带的波长选择滤光镜23。通过尽可能紧密地设置滤光镜闸门21a、21b，能够实现滤光镜23尽可能紧密地与孔径光阑平面24相邻。因而保证了移动的滤光镜闸门21a、21b不能在图像中看到。另一优点在于，这里出现了极少的散光，使得滤光镜23的平面能够保持尽可能的小。

在本发明中，每个滤光镜闸门都设置了调整装置。在经济型实施方案中，这里也可以采用可手动调整的调整装置。电机调整装置虽然比较昂贵，然而可以自动实施本发明的方法。

在此处所描绘的实施例中，为滤光镜闸门21a、21b设置了两个电机25a、25b来用作调整装置，其中该电机可以使滤光镜闸门21a、21b平行于孔径光阑平面24移动和/或旋转。借助电机25a、25b，由所属的各滤光镜闸门21a及21b将敞露开口22或选择滤光镜23插入到照明光路中，或者将两者的组合插入到照明光路中。电机25a、25b由控制电子装置26来控制，其中该电子装置从图像分析系统19获取其输入信号。

图像分析系统19从摄像机信号中获得荧光强度与其标准值的偏差。引起标准值偏差的那些激发带则被确定下来，并且滤光镜闸门21a、21b之一被分配给这些激发带中的任一个以用来进行衰减。因此在所描绘的例子中可以把两个激发带全部衰减，即衰减到零值，或者也可以部分地衰减。为每个滤光镜闸门21a、21b都生成用于所属电机25a、25b的控制信号。每个滤光镜闸门21a、21b借助所属的电机25a、25b来如此无级地移动，使得对所分配的激发带有选择地起作用的滤光镜23被插入到照明光路中。滤光镜闸门21a及21b则继续移动，直到所插入的滤光镜23的平面区域在照明光路中具有这样的透射比，使得所分配的激发带被衰减到强度标准值。通过这种方式，所有的激发带被调节到其强度标准值。

下文对滤光镜闸门组20及滤光镜闸门21的不同布置以及其上所设置的滤光镜的所属光谱透射过程进行解释。

图2a中描绘了用于本发明多波段荧光显微镜的、并且具有两个激发带A和D的滤光镜闸门21。在矩形玻璃板27上以不同的蒸镀层形式沉积了用于衰减短波激发带A强度的长通滤光镜29和用于衰减长波激发带D强度的短通滤光镜28。它们位于玻璃板27的端头，其间在滤光镜闸门21的中间有敞露开口22。其截面与照明光路的孔径光阑5中的透射孔径x相同。通过此处未描绘的调整装置，滤光镜闸门21可以在长度方向的两个方向上平行于孔径光阑平面24而无级地移动。这种运动在图中是通过双箭头来标示的。

在该实施例中，短通滤光镜28和长通滤光镜29是作为连贯的蒸镀层来沉积的。两个滤光镜28、29的透射在直接相邻于敞露开口22处达到最大，并随着与敞露开口22的间隔而减小。因此在敞露开口22旁边，滤光镜闸门21并没有全部地用滤光镜28、29覆盖，而是滤光镜平面部分从敞露开口22向滤光镜闸门21的端头增加。

这样，蒸镀层在滤光镜闸门21的端头构成了最小边长等于透射孔径x的矩形。当衰减矩形平面完全遮蔽照明光路时，从而调节到最小百分比的透射比，并且所属激发带被完全衰减，也即达到零值。

在所述沉积矩形平面处紧接着沉积三角形平面的底边，其相对角具有敞露开口22。

利用一直只按比例地遮蔽透射孔径的沉积三角平面，短通滤光镜28和长通滤光镜29的透射比均在移动方向上从敞露开口22向滤光镜闸门21的端头减少。通过插入短通滤光镜28或长通滤光镜29的任意平面部分，可以在照明光路中实现滤光镜28、29的每个期望的透射比，并从而可以任意减弱或遮蔽一个或另一个激发带。

在图2b中描绘了用于本发明多波段荧光显微镜的、并且具有两个激发带A和D的滤光镜闸门21。在矩形玻璃板27上以不同的蒸镀层而沉积了用来对长波激发带A进行滤光的短通滤光镜28和用来对短波激发带D进行滤光的长通滤光镜29。

如同在图2a中一样，这里的蒸镀层也在敞露开口22的方向上具有一个三角形轮廓。当然这里的三角均不是作为连贯平面，而是作为小的、相同尺寸的平面单元30来沉积的。因而对于两个滤光镜28、29就获得了具有较高透射的较长调整范围。蒸镀层在滤光镜闸门21的端头上形成了最小边长等于透射孔径x的矩形，并从而形成最小透射的区域，其中所属激发带可以利用该区域衰减到零。

在图2c中描绘了用于本发明多波段荧光显微镜的、并具有两个激发带A和D的另一种滤光镜闸门21。在矩形玻璃板27上以不同的蒸镀层而沉积了用来对长波激发带A进行滤光的短通滤光镜28和用来对短波激发带D进行滤光的长能滤光镜29。其间具有敞露开口22。

在滤光镜闸门21的实施中，滤光镜28、29靠近敞露开口22处是作为分开的、任意形状(这里为圆形)的平面单元30来沉积的。因此，平面单元30的大小以及因而滤光镜闸门21的衰减平面部分从敞露开口22向滤光镜闸门21的端头增加。在敞露开口22旁，滤光镜28、29的透射比最大，并在朝着滤光镜闸门21端头的移动方向上减小。在滤光镜闸门21的两个端头上，两个滤光镜28、29均带有具备最小透射比的完全衰减平面，其中该平面至少具有光路的孔径x。

在图2d中同样也描绘了用于本发明多波段荧光显微镜的、并具有两个激发带A和D的一种光镜闸门21。在矩形玻璃板27上以不同的蒸镀层而沉积了用来对长波激发带A进行滤光的短通滤光镜28和用来对短波激发带D进行滤光的长通滤光镜29。其间具有敞露开口22。

在该实施方案中，蒸镀层沉积成条状平面单元30，其中条纹的宽度从滤光镜闸门21的中间向端头增加。从而透射在从敞露开口22向滤光镜闸门21的端头的移动方向上减小。在滤光镜闸门21的两个端头上，两个滤光镜28、29在这里也均带有具备最小透射比的完全衰减平面，其中该平面至少具有光路的孔径x。

在图2e中以光波波长λ的函数形式描绘了短波激发带A和长波激发带D的光谱透射曲线，以及所属选择滤光镜、即用于短波激发带A的长通滤光镜和用于长波激发带D的短通滤光镜的透射曲线。如此来选择滤光镜A和B，使得它们只是有选择地滤除各个所属的激发带，而其余的波长区域无阻碍地透过。

图3a示出了用于本发明具有三个激发带A、B、D的多波段荧光显微镜的一种两部分的滤光镜闸门组20的矩形滤光镜闸门21。在该实施例中，滤光镜闸门组20由两个等同的矩形滤光镜闸门21组成，其中该滤光镜闸门紧挨着孔径光阑平面24依次插入到照明光路中。

在滤光镜闸门21的中间设置有具有照明光路2的孔径x的敞露开口22。在滤光镜闸门21的两个端头上以蒸镀层的形式沉积了用于激发带A、B、D的三个选择滤光镜28、29、31中的两个所组成的两种不同组合。两个滤光镜28、31以及29、31在端头上均如此并列设置，使得两个滤光镜彼此紧靠并以敞露开口为界。每个滤光镜28、29、31在此具有一个最小为照明光路2的孔径x的最小透射区域。因而滤光镜闸门21在其短边上具有2x的宽度。

滤光镜28、29、31的透射比在滤光镜闸门21的长度方向上、也即在移动方向上从敞露开口22向端头减小。这在此处所描绘的例子中是按如下方式实现的，各滤光镜28、29、31的沉积平面均从敞露开口22向滤光镜闸门21的端头增加。

对于滤光镜闸门组的两个等同滤光镜闸门21中的任一个，均设置有单独的调整装置25，以便在长度方向和横向上平行于孔径光阑平面24来移动滤光镜闸门21。因而能够单个或组合地把滤光镜28、29、31整个平面或仅其平面的一部分插入到照明光路中。

图3b示出了本发明具有三个激发带A、B、D的多波段荧光显微镜的两部分滤光镜闸门组20的一种圆形滤光镜闸门21。在本发明多波段荧光显微镜的这种有利实施方案中，滤光镜闸门组20由两个等同的这种圆形滤光镜闸门21组成，其中这两个滤光镜闸门依次紧挨着孔径光阑平面24而被插入到照明光路中。在每个滤光镜闸门21上在中间设置有敞露开口22。与之相邻地设有作为毗邻的沉积圆环扇形的、用于激发带A、B、D的三个选择滤光镜28、29、31。

滤光镜28、29、31各具有径向减小的透射比，其中透射比在敞露开口22旁达到最大。其实现方法比如为：滤光镜28、29、31没有全面积沉积。或者，挨着敞露开口22沉积一些其间具有未蒸镀平面区域的、径向逐渐变宽的沉积平面单元30，使得各滤光镜28、29、31的蒸镀平面部分径向地增加。

借助单独地调整装置(这里未描绘出)，滤光镜闸门组20的两个等同的滤光镜闸门21中的每一个可以单独地并平行于孔径光阑平面24来移动。在此它可以要么在一个方向上横向移动和附助以旋转(如图3b所示)，要么在一个平面内两个方向上交替移动。因而滤光镜闸门21的每一个任意平面部分、也即诸如敞露开口22或具有期望透射比的滤光镜28、29、31之一可以插入到照明光路中。通过在照明光路中设置两个相同的滤光镜闸门21，可以把三个滤光镜28、29、31的任两个插入到照明光路中，使得三个激发带中的两个可以同时衰减到预定的标准值或者甚至完全被遮蔽。

图3c示出了本发明具有三个激发带A、B、D的多波段荧光显微镜的两部分滤光镜闸门组20的滤光镜闸门21的一种尤其有利的实施方案。在本发明多波段荧光显微镜的这种实施方案中，滤光镜闸门组20由两个等同的这种圆形滤光镜闸门21组成，其中，这两个滤光镜闸门紧挨着孔径光阑平面24被依次插入到照明光路中。

用于激发带A、B、D的滤光镜28、29、31如此有利地设置在滤光镜闸门21上，使得它只可旋转，而不可移动(已标明转动)。这简化了机械或电机调整装置的构造，其中该调整装置被单独分配给两个滤光镜闸门21的每个调整装置(此处未描绘)。

为了达到这个目的，每个滤光镜闸门21呈环形构造，分成六个扇形并围绕其中心旋转放置。圆环中心位于照明光路之外。每个扇形都可以通过旋转滤光镜闸门21而旋转到照明光路中并把照明光路完全遮蔽。在透射截面上绘入了孔径x。

每第二个扇形为一个敞露开口22。其间各插入了用于三个激发带A、B、D的三个滤光镜28、29、31中的一个，比如用粘接或沉积的方法。在其扇形中，每个滤光镜28、29、31在两种旋转方向之一上具有上升的透射比，这比如通过利用沉积平面单元进行不同的平面铺设来实现。从而每个滤光镜28、29、31在一个相邻敞露开口22附近具有最大透射比，并且在另一个相邻敞露开口22附近具有最小透射比。通过旋转滤光镜闸门21可以把敞露开口22之一或具有期望透射比的滤光镜28、29、31之一或二者的组合插入到照明光路中。通过采用两个等同的滤光镜闸门21来作为滤光镜闸门组，能够使直至三个激发带A、B、D中的两个同时并相互独立地衰减到期望的标准值。

图3d以光波波长λ的函数形式示出了短波激发带A、长波激发带D和中间激发带B的光谱透射曲线。另外还描绘了所属的选择滤光镜，也即用于短波激发带A的长通滤光镜、用于长波激发带D的短通滤光镜和用于激发带B的选择滤光镜的透射曲线T_A、T_B、T_D。滤光镜如此来选择，使得它们仅是有选择地滤除所属的激发带，而其它波长范围可以无阻碍地透过。

图4a示出了本发明具有四个激发带A、B、C、D的多波段荧光显微镜的三部分滤光镜闸门组20的圆形滤光镜闸门21。在本发明多波段荧光显微镜的这种实施方案中，滤光镜闸门组20由等同的圆形滤光镜闸门21组成，其中这些滤光镜闸门依次紧挨着孔径光阑平面24而被插入到照明光路中。每个滤光镜闸门21在中间具有敞露开口22。旁边沉积了作为相邻环形扇区的用于激发带A、B、C、D的四个选择滤光镜28、29、31、32。

滤光镜28、29、31、32的透射比径向减小，并在敞露开口22旁达到最大。其实现方式比如为：滤光镜28、29、31、32不是完全地，而是作为其间有未蒸镀平面的环形平面单元30来沉积，从而各滤光镜28、29、31、32的蒸镀平面部分径向地增加。

滤光镜闸门组20的三个滤光镜闸门21中的每一个都分配有单独的调整装置(这里未描绘)。借且该调整装置，每个滤光镜闸门21都可以单独地并平行于孔径光阑平面24移动。在此它可以要么在一个方向上横向移动并附加以旋转(如图4a中所示)，要么交替地在一个平面的两个方向上移动。

因而滤光镜闸门21的每个任意平面部分，比如敞露开口22或滤光镜28、29、31、32的任意平面部分都可以插入到照明光路中。通过在照明光路中设置三个相同的滤光镜闸门21，可以把四个滤光镜28、29、31、32中的任三个同时插入到照明光路中。从而可以把四个激发带A、B、C、D中的直至三个同时衰减到预定标准值或者甚至完全遮蔽。

图4b示出了本发明具有四个激发带A、B、C、D的多波段荧光显微镜的三部分滤光镜闸门组20的滤光镜闸门21的一种尤其有利的实施方案。在本发明多波段荧光显微镜的该实施方案中，滤光镜闸门组20由三个等同的这种圆形滤光镜闸门21组成，其中这些滤光镜闸门依次紧挨着孔径光阑平面24而被插入到照明光路中。

用于激发带A、B、C、D的滤光镜28、29、31、32如此有利地设置在滤光镜闸门21上，使得它只可旋转而不可移动(已标明转动)。这简化了机械或电机调整装置的构造，其中这些调整装置被单独配置给三个滤光镜闸门21的每一个(此处未描绘)。

实现这些目的的方式为：每个滤光镜闸门21呈圆形构造，且分成八个扇形并围绕其中心旋转放置。圆心位于照明光路之外。通过旋转滤光镜闸门21，每个扇区都可以完全或部分地遮蔽照明光路。在透射截面上绘入了孔径x。

每第二个扇形为一个敞露开口22。其间各插入了用于三个激发带A、B、C、D的四个滤光镜28、29、31、32中的一个，比如用粘接或沉积的方法。在其圆形扇区中，每个滤光镜28、29、31、32在两种旋转方向之一上具有上升的透射比，比如通过不同的平面铺设来实现。从而每个滤光镜28、29、31、32在一个相邻敞露开口22附近具有最大透射比，并在另一个相邻敞露开口22附近具有最小透射比。通过旋转滤光镜闸门21可以把敞露开口22之一或具有期望透射的滤光镜28、29、31、32之一或二者的组合插入到照明光路中。采用三个滤光镜闸门21可以使直至四个激发带A、B、C、D中的三个同时并相互独立地衰减到期望的标准值。

图4c以光波波长λ的函数形式示出了短波激发带A、长波激发带D和两个中间激发带B和C的光谱透射曲线。另外还描绘了所属的选择滤光镜，也即用于短波激发带A的长通滤光镜、用于长波激发带D的短通滤光镜、用于激发带B的选择滤光镜和用于激发带C的选择滤光镜的透射曲线T_A、T_B、T_C、T_D。滤光镜A、B、C、D如此来选择，使得它们仅是有选择地滤除各个所属的激发带，而其它波长范围可以无阻碍地透过。

对于多于四个激发带的情况，滤光镜闸门组20必须进行相应扩展。然而把各个滤光镜尽量紧挨着孔径光阑5放置会由此变得越加困难。

符号清单

1.光源

2.照明光路的光轴

3.聚光镜

4.第一透镜

5.孔径光阑

6.第二透镜

7.明场光阑

8.第三透镜

9.激发滤光镜

10.分光镜

11.物镜

12.荧光体

13.载物台

14.输出滤光镜

15.筒状透镜

16.中间像平面

17.筒镜(17’)上的目镜

18.视频摄像机

19.图像分析系统

20.滤光镜闸门组

21.滤光镜闸门(21a、21b)

22.敞露开口

23.选择滤光镜

24.孔径光阑平面

25.调整装置(25a、25b电机)

26.控制电子装置

27.玻璃板

28.用于长波激发带D(λ₄)的短通滤光镜

29.用于短波激发带A(λ₁)的长通滤光镜

30.平面单元

31.针对激发带B(λ₂)的衰减滤光镜

32.针对激发带C(λ₃)的衰减滤光镜

x 孔径光阑平面24中的透射孔径

Claims

1.在具有多个光谱不同的激发带的多波段荧光显微镜中单独匹配激发强度的方法，其中这些激发带由荧光体(12)同时变换成具有荧光强度的荧光谱带，

其特征在于：

(a)在显微镜图像中确定单个荧光谱带的荧光强度，并将其与被设为大于或等于零的强度标准值进行比较，

(b)对于属于偏离强度标准值的荧光强度的激发带，为其在照明光路中设置一种波长选择滤光镜(23；28、29、31、32)，

(c)而且，如此无级地调节在照明光路中起作用的单个的所述波长选择滤光镜(23；28、29、31、32)的透射比，使得通过衰减所属的激发带来把所有荧光强度调节到其强度标准值。

2.如权利要求1所述的方法，

其特征在于：

不同荧光强度的标准值全部与最低荧光强度相同。

3.如权利要求1所述的方法，

其特征在于：

不同荧光强度的标准值中至少有一个等于零。

4.如权利要求1所述的方法，

其特征在于：

几个荧光强度的标准值等于零，而其它的标准值则等于最小荧光强度。

5.如权利要求1所述的方法，

其特征在于：

不同的荧光强度通过视觉来确定。

6.如权利要求1所述的方法，

其特征在于：

不同的荧光强度借助一种强度测定器来确定。

7.如权利要求6所述的方法，

其特征在于：

不同的荧光强度借助一种后接有图像分析系统(19)的CCD摄像机或视频摄像机(18)来确定。

8.如权利要求1所述的方法，

其特征在于：

a)荧光强度的变化被连续地确定，

b)通过重复匹配在照明光路中起作用的所述波长选择滤光镜(23；28、29、31、32)透射比来连续地再次把荧光强度调到其标准值。

9.如权利要求2所述的方法，

其特征在于：

a)荧光强度的变化被自动连续地确定，

b)通过自动连续地匹配在照明光路中起作用的所述波长选择滤光镜(23；28、29、31、32)透射比来把荧光强度连续地保持到其标准值。

10.用于实施如权利要求1所述的方法的多波段荧光显微镜，包含有照明光路，其中该照明光路具有光源(1)、聚光镜(3)、多个透镜(4、6、8)、孔径光阑(5)、明场光阑(7)、用于同时生成不同光波波长的多个激发带的激发滤光镜(9)、以及用于影响激发带的滤光镜单元，所述的显微镜另外还包含有分光镜(10)和把照明光线对准到放在载物台(13)上的荧光体(12)的物镜(11)，其中该荧光体通过分光镜(10)、输出滤光镜(14)和筒状透镜(15)在中间像平面(16)中成像，

其特征在于：

a)由可单独移动的、间隔紧密的滤光镜闸门(21；21a、21b)组成的滤光镜闸门组(20)作为滤光镜单元并紧挨着孔径光阑(5)而被垂直插入到照明光路中，

b)在每个滤光镜闸门(21)上为每个激发带设置了一个波长选择滤光镜(23；28、29、31、32)，其中波长选择滤光镜具有大和小透射比的平面区域，

c)为了完全遮蔽激发带，具有最小透射比的平面区域具有一个等于透射孔径(x)的最小孔径，

d)在每个波长选择滤光镜(23；28、29、31、32)旁设置有一个具有透射孔径(x)的敞露开口(22)，

e)各波长选择滤光镜(23；28、29、31、32)的透射比在移动方向上随着与敞露开口(22)的间隔的增加而减小，

f)而且，每个滤光镜闸门(21)分配有单独的调整装置(25)，借助该调整装置，滤光镜闸门(21)的任意平面区域都可以插入到照明光路中。

11.如权利要求10所述的荧光显微镜，

其特征在于：

为了影响数量为n的激发带，

a)滤光镜闸门组(20)由位于平行于孔径光阑平面(24)的、间隔紧密的n-1个单独闸门平面上的n-1个滤光镜闸门(21)组成，

b)每个滤光镜闸门(21)具有至少一个敞露开口(22)和用于n个激发带的n个波长选择滤光镜(23；28、29、31、32)。

12.如权利要求10所述的荧光显微镜，

其特征在于：

为了影响两个激发带A、D而设置有一个单独的滤光镜闸门(21)，其中该滤光镜闸门具有

a)用于对短波激发带A进行强度衰减的、位于该滤光镜闸门一端的长通滤光镜(29)，

b)用于对长波激发带D进行强度衰减的、位于该滤光镜闸门另一端的短通滤光镜(28)，

c)和位于所述长通滤光镜与短通滤光镜之间的敞露开口(22)，

d)而且，该显微镜设置有用于平行于孔径光阑平面(24)来连续移动滤光镜闸门(21)的调整装置(25)。

13.如权利要求12所述的荧光显微镜，

其特征在于：

a)滤光镜闸门(21)具有透光的矩形玻璃板(27)，在该矩形玻璃板端头上相对地设有作为蒸镀层的短通滤光镜(28)和长通滤光镜(29)，

b)而且，短通滤光镜(28)和长通滤光镜(29)均在从敞露开口(22)到滤光镜闸门(21)端头的移动方向上具有增加的沉积玻璃表面部分，并从而具有减少的透射。

14.如权利要求13所述的荧光显微镜，

其特征在于：

两个所述蒸镀层的平面在滤光镜闸门(21)的端头均具有最小边长等于透射孔径(x)的矩形，在敞露开口(22)的方向上，沉积的等边三角平面的底边与该矩形相毗邻。

15.如权利要求13所述的荧光显微镜，

其特征在于：

蒸镀层完全或部分地不是作为连贯平面，而是作为平面单元(30)来沉积的，该平面单元的大小和间距在从敞露开口(22)到端头的方向上作不同的选择。

16.如权利要求10所述的荧光显微镜，

其特征在于：

为了影响三个激发带A、B、D而设置了由两个圆形滤光镜闸门(21)组成的、两部分的滤光镜闸门组(20)，其中

a)每个滤光镜闸门(21)在中央具有圆形敞露开口(22)，

b)在该圆形敞露开口的周围作为三个圆环扇形而环绕地设置有透射比径向减小的、用于激发带A、B、D的三个波长选择滤光镜(28、29、31)，

c)每个滤光镜闸门(21)都分配有单独的调整装置(25)，借助该装置，滤光镜闸门可以平行于孔径光阑平面(24)相互独立地移动和/或旋转。

17.如权利要求16所述的荧光显微镜，

其特征在于：

为了获得径向减小的透射比，滤光镜(28、29、31)的蒸镀平面部分径向增加。

18.如权利要求10所述的荧光显微镜，

其特征在于：

为了影响三个激发带A、B、D而设置有由两个圆形滤光镜闸门(21)组成的、两部分的滤光镜闸门组(20)，其中，

a)每个滤光镜闸门(21)都分成6个衰减照明光路的扇形，并且在放置时可围绕其位于光路之外的中心旋转，

b)每第二个扇形为一个敞露开口(22)，其间分别有用于激发带A、B、D的三个波长选择滤光镜(28、29、31)之一，

c)每个滤光镜(28、29、31)在其扇形中的两个旋转方向之一上具有增加的透射比，

d)而且，设置有单独的调整装置(25)来使各滤光镜闸门(21)围绕其中心并平行于孔径光阑平面(24)旋转。

19.如权利要求10所述的荧光显微镜，

其特征在于：

为了影响三个激发带A、B、D而设置有由两个矩形滤光镜闸门(21)组成的、两部分的滤光镜闸门组(20)，其中，

a)每个滤光镜闸门(21)在中心具有敞露开口(22)，并在其两个端头具有由用于激发带A、B、D的三个波长选择滤光镜(28、29、31)中的各两个组成的两种不同组合，其中两个波长选择滤光镜分别被并排地布置在一个端头上，使得该两个波长选择滤光镜彼此靠近并与所述的敞露开口(22)相邻接，

b)滤光镜(28、29、31)的透射比在滤光镜闸门(21)的长度方向上从敞露开口(22)向端头减小，

c)而且，设置有单独的调整装置(25)，用于在长度方向和横向上并平行于孔径光阑平面(24)移动滤光镜闸门(21)。

20.如权利要求10所述的荧光显微镜，

其特征在于：

为了影响四个激发带A、B、C、D而设置有由三个圆形滤光镜闸门(21)组成的、三部分的滤光镜闸门组(20)，其中，

a)每个滤光镜闸门(21)在中心具有敞露开口(22)，并在该开口周围具有用于激发带的、作为透射比径向减小并互相毗邻的沉积圆环扇形的四个波长选择滤光镜(28、29、31、32)，

b)而且，设置有单独的调整装置(25)来平行于孔径光阑平面(24)移动和/或旋转各滤光镜闸门(21)。

21.如权利要求10所述的荧光显微镜，

其特征在于：

a)每个滤光镜闸门(21)分成八个衰减照明光路的扇形，并且在放置时可围绕其位于光路之外的中心旋转，

b)每第二个扇形有一个敞露开口(22)，并且其间各有用于激发带的四个波长选择滤光镜(28、29、31、32)中的一个，

c)每个滤光镜(28、29、31、32)在其扇形中的两个旋转方向之一上具有增加的透射比，

d)而且，设置有单独的调整装置(25)来围绕其中心并平行于孔径光阑平面(24)旋转各滤光镜闸门(21)。