JP2024123232A - 変更ＰＡＭ特異性を有する遺伝子操作ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼ - Google Patents

変更ＰＡＭ特異性を有する遺伝子操作ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼ Download PDF

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ジョン，ジェー．キース
クレインスティヴァー，ベンジャミン
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Abstract

【課題】変更および改善ＰＡＭ特異性を有する遺伝子操作ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼならびにゲノム遺伝子操作、エピゲノミック遺伝子操作、およびゲノム標的化におけるその使用を提供する。【解決手段】一般に使用される化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）を、構造情報、細菌選択ベース指向進化、およびコンビナトリアル設計を使用して新規ＰＡＭ配列を認識するように遺伝子操作した。これらの変更ＰＡＭ特異性バリアントは、野生型ＳｐＣａｓ９によってもＳａＣａｓ９によっても効率的に標的化することができないゼブラフィシュおよびヒト細胞中の内在性遺伝子部位のロバストな編集を可能とする。【選択図】なし

Description

優先権の主張
本出願は、２０１５年３月３日に出願された米国仮特許出願第６１／１２７，６３４号
明細書；２０１５年５月２２日に出願された同第６２／１６５，５１７号明細書；２０１
５年１０月９日に出願された同第６２／２３９，７３７号明細書；および２０１５年１１
月２０日に出願された同第６２／２５８，４０２号明細書の利益を主張する。上記の全体
の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府による資金提供を受けた研究または開発
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈにより授与
された助成金番号ＤＰ１ＧＭ１０５３７８、ＮＩＨＲ０１ＧＭ１０７４２７、およびＲ０
１ＧＭ０８８０４０のもとで政府支援により作製された。政府は、本発明における一定の
権利を有する。
本発明は、少なくとも部分的に、変更および改善されたプロトスペーサー隣接モチーフ
（ＰＡＭ）特異性を有する遺伝子操作クラスター化等間隔短鎖回文リピート（Ｃｌｕｓｔ
ｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒ
ｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ
９）ヌクレアーゼならびにゲノム遺伝子操作、エピゲノミック遺伝子操作、およびゲノム
標的化におけるその使用に関する。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、広範な生物および細胞タイプにおいて効率的
でカスタマイズ可能なゲノム編集を可能とする（Ｓａｎｄｅｒ＆Ｊｏｕｎｇ，Ｎａｔ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２，３４７－３５５（２０１４）；Ｈｓｕｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌ
ｌ １５７，１２６２－１２７８（２０１４）；Ｄｏｕｄｎａ＆Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ
，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４６，１２５８０９６（２０１４）；Ｂａｒｒａｎｇｏｕ＆Ｍａｙ
，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ １５，３１１－３１４（２０１５））
。Ｃａｓ９による標的部位認識は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｄｅｌｔｃｈｅ
ｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４７１，６０２－６０７（２０１１）；Ｊｉｎｅｋ
ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８１６－８２１（２０１２））として公知の
２つの短鎖ＲＮＡにより指向され、それらは、キメラ単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）に
融合させることができる（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８１６
－８２１（２０１２）；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ ２，ｅ００４７１（２
０１３）；Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９，８２３－８２６（２０１
３）；Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９，８１９－８２３（２０１３）
）。ｓｇＲＮＡの５’末端（ｃｒＲＮＡに由来）は、標的ＤＮＡ部位と塩基対合し得、そ
れによりＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体による部位特異的開裂の直接的な再プログラミング
を許容する（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８１６－８２１（２
０１２））。しかしながら、Ｃａｓ９は、ｓｇＲＮＡと塩基対合するＤＮＡに近接して存
在する特異的プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）も認識しなければならず（Ｍｏｊ
ｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １５５，７３３－７４０（２００９
）；Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌ １０，８９１－８９９（２０１３）；
Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８１６－８２１（２０１２）；Ｓ
ａｐｒａｎａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３９，９
２７５－９２８２（２０１１）；Ｈｏｒｖａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ １９０，１４０１－１４１２（２００８））、その要件は、配列特異的認識を開始す
るために必要とされるが（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５０７，
６２－６７（２０１４））、さらにゲノム編集のためのそれらのヌクレアーゼの標的化範
囲を拘束し得る。広く使用される化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏ
ｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）は、短鎖ＮＧＧ ＰＡＭを認識し（Ｊｉｎｅｋ
ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８１６－８２１（２０１２）；Ｊｉａｎｇ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，２３３－２３９（２０１３））、そ
れは、ランダムＤＮＡ配列の８ｂｐごとに１回生じる。対照的に、これまで特徴付けされ
ている他のＣａｓ９オルソログは、より長鎖のＰＡＭを認識し得る（Ｈｏｒｖａｔｈ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９０，１４０１－１４１２（２００８）；Ｆｏ
ｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２，２５７７－２
５９０（２０１４）；Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０，１
１１６－１１２１（２０１３）；Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５２０，１８６
－１９１（２０１５）；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ５０，４８８－
５０３（２０１３））。例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕ
ｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）は、ウイルス送達により良好に適するいくつかのよ
り小さいＣａｓ９オルソログの１つであり（Ｈｏｒｖａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ １９０，１４０１－１４１２（２００８）；Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａ
ｔｕｒｅ ５２０，１８６－１９１（２０１５）；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ
Ｃｅｌｌ ５０，４８８－５０３（２０１３））、ランダムＤＮＡの３２ｂｐごとに１回
生じることが予測される、より長鎖のＮＮＧＲＲＴ（配列番号４６）ＰＡＭを認識する。
Ｃａｓ９オルソログの標的化範囲の拡大は、種々の用途、例として、小さい遺伝子エレメ
ント（例えば、転写因子結合部位（Ｃａｎｖｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．；５２７
（７５７７）：１９２－７（２０１５）；Ｖｉｅｒｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ．１２（１０）：９２７－３０（２０１５））の改変、またはＰＡＭ内の配
列差異の位置決めによるアレル特異的変更（Ｃｏｕｒｔｎｅｙ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｇ
ｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２３（１）：１０８－１２（２０１５）の実施に重要である。
本明細書に記載のとおり、一般に使用される化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）を、構造情報、細菌選択
ベース指向進化、およびコンビナトリアル設計を使用して新規ＰＡＭ配列を認識するよう
に遺伝子操作した。これらの変更ＰＡＭ特異性バリアントは、野生型ＳｐＣａｓ９によっ
てもＳａＣａｓ９によっても効率的に標的化することができないゼブラフィッシュおよび
ヒト細胞中の内在性遺伝子部位のロバストな編集を可能とする。さらに、本発明者らは、
非カノニカルＮＡＧおよびＮＧＡ ＰＡＭを有する部位に対する低減した活性を保有する
、ヒト細胞中で改善されたＰＡＭ特異性を示す別のＳｐＣａｓ９バリアントを同定および
特徴付けした。さらに、本発明者らは、完全に異なるＰＡＭ特異性を有する２つのより小
サイズのＣａｓ９オルソログ、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９（Ｓｔ１Ｃａｓ９）および黄色ブドウ
球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）が、本
発明者らの細菌選択系およびヒト細胞中で効率的に機能することを見出し、それは、本発
明者らの遺伝子操作方針を他の種からのＣａｓ９に拡張し得ることを示唆した。本発明者
らの知見は、広く有用なＳｐＣａｓ９およびＳａＣａｓ９バリアントを提供し、本明細書
においてそれらをまとめて「バリアント（ｖａｒｉａｎｔｓ）」または「そのバリアント
（ｔｈｅ ｖａｒｉａｎｔｓ）」と称する。
第１の態様において、本発明は、例えば、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０
％同一である配列を含む、以下の位置：Ｇ１１０４、Ｓ１１０９、Ｌ１１１１、Ｄ１１３
５、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８、Ｎ１３１７、Ｒ１３３５、Ｔ１３３７の１つ以上における
突然変異を有する単離膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）
Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質を提供する。一部の実施形態において、バリアント
ＳｐＣａｓ９タンパク質は、以下の突然変異：Ｇ１１０４Ｋ；Ｓ１１０９Ｔ；Ｌ１１１１
Ｈ；Ｄ１１３５Ｖ；Ｄ１１３５Ｅ；Ｄ１１３５Ｎ；Ｄ１１３５Ｙ；Ｓ１１３６Ｎ；Ｇ１２
１８Ｒ；Ｎ１３１７Ｋ；Ｒ１３３５Ｅ；Ｒ１３３５Ｑ；およびＴ１３３７Ｒの１つ以上を
含む。一部の実施形態において、バリアントＳｐＣａｓ９タンパク質は、以下の突然変異
：Ｄ１１３５；Ｄ１１３５Ｖ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＱＲバリアント）；Ｄ１
１３５Ｅ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＥＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１
８／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｎ／Ｇ１２１８Ｒ
／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＮＲＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｙ／Ｇ１２１８Ｒ／
Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＹＲＱＲバリアント）；Ｇ１１０４Ｋ／Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ
１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＫＶＲＱＲバリアント）；Ｓ１１０９Ｔ／Ｄ
１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＴＶＲＱＲバリアント）；Ｌ
１１１１Ｈ／Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＨＶＲＱＲバ
リアント）；Ｄ１１３５Ｖ／Ｓ１１３６Ｎ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ
（ＶＮＲＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｎ１３１７Ｋ／Ｒ１３３５Ｑ
／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＫＱＲバリアント）；またはＤ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３
３５Ｅ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＥＲバリアント）を含む。
一部の実施形態において、バリアントＳｐＣａｓ９タンパク質は、Ｄ１０、Ｅ７６２、
Ｄ８３９、Ｈ９８３、またはＤ９８６；およびＨ８４０またはＮ８６３における突然変異
からなる群から選択される、ヌクレアーゼ活性を減少させる１つ以上の突然変異を含む。
一部の実施形態において、突然変異は、（ｉ）Ｄ１０ＡまたはＤ１０Ｎ、および（ｉｉ
）Ｈ８４０Ａ、Ｈ８４０Ｎ、またはＨ８４０Ｙである。
本明細書において、例えば、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である
配列を含む、以下の位置：Ｅ７８２、Ｎ９６８、および／またはＲ１０１５の１つ以上に
おける突然変異を有する単離黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅ
ｕｓ）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）タンパク質も提供される。本明細書において、以下の位
置：Ｅ７３５、Ｅ７８２、Ｋ９２９、Ｎ９６８、Ａ１０２１、Ｋ１０４４および／または
Ｒ１０１５の１つ、２つまたは３つ以上における突然変異を有する単離黄色ブドウ球菌（
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）タンパク質も
提供される。一部の実施形態において、バリアントＳａＣａｓ９タンパク質は、以下の突
然変異：Ｒ１０１５Ｑ、Ｒ１０１５Ｈ、Ｅ７８２Ｋ、Ｎ９６８Ｋ、Ｅ７３５Ｋ、Ｋ９２９
Ｒ、Ａ１０２１Ｔ、Ｋ１０４４Ｎの１つ以上を含む。一部の実施形態において、バリアン
トＳａＣａｓ９タンパク質は、Ｄ１０、Ｄ５５６、Ｈ５５７、および／またはＮ５８０に
おける突然変異からなる群から選択される、ヌクレアーゼ活性を減少させる１つ以上の突
然変異を含む。
一部の実施形態において、バリアントＳａＣａｓ９タンパク質は、Ｄ１０Ａ、Ｄ５５６
Ａ、Ｈ５５７Ａ、Ｎ５８０Ａ、例えば、Ｄ１０Ａ／Ｈ５５７Ａおよび／またはＤ１０Ａ／
Ｄ５５６Ａ／Ｈ５５７Ａ／Ｎ５８０Ａにおける突然変異を含む。
本明細書に記載のＳｐＣａｓ９バリアントは、以下の位置：Ｄ１１３５、Ｇ１２１８、
Ｒ１３３５、Ｔ１３３７の１つ以上における突然変異を有する配列番号１のアミノ酸配列
を含み得る。一部の実施形態において、ＳｐＣａｓ９バリアントは、以下の突然変異：Ｄ
１１３５Ｖ；Ｄ１１３５Ｅ；Ｇ１２１８Ｒ；Ｒ１３３５Ｅ；Ｒ１３３５Ｑ；およびＴ１３
３７Ｒの１つ以上を含み得る。一部の実施形態において、ＳｐＣａｓ９バリアントは、以
下の突然変異の組：Ｄ１１３５Ｖ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＱＲバリアント）；
Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ．Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＱＲバリアント）；Ｄ
１１３５Ｅ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＥＱＲバリアント）；またはＤ１１３５Ｖ／
Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｅ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＥＲバリアント）の１つを含み得る。
本明細書に記載のＳａＣａｓ９バリアントは、以下の位置：Ｅ７３５、Ｅ７８２、Ｋ９
２９、Ｎ９６８、Ｒ１０１５、Ａ１０２１、および／またはＫ１０４４の１つ以上におけ
る突然変異を有する配列番号２のアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態において、Ｓ
ａＣａｓ９バリアントは、以下の突然変異：Ｒ１０１５Ｑ、Ｒ１０１５Ｈ、Ｅ７８２Ｋ、
Ｎ９６８Ｋ、Ｅ７３５Ｋ、Ｋ９２９Ｒ、Ａ１０２１Ｔ、Ｋ１０４４Ｎの１つ以上を含み得
る。一部の実施形態において、ＳａＣａｓ９バリアントは、以下の突然変異の組：Ｅ７８
２Ｋ／Ｎ９６８Ｋ／Ｒ１０１５Ｈ（ＫＫＨバリアント）；Ｅ７８２Ｋ／Ｋ９２９Ｒ／Ｒ１
０１５Ｈ（ＫＲＨバリアント）；またはＥ７８２Ｋ／Ｋ９２９Ｒ／Ｎ９６８Ｋ／Ｒ１０１
５Ｈ（ＫＲＫＨバリアント）の１つを含み得る。
本明細書において、任意選択の介在リンカーにより異種機能ドメインに融合されている
本明細書に記載の単離バリアントＳａＣａｓ９またはＳｐＣａｓ９タンパク質を含む融合
タンパク質であって、リンカーが融合タンパク質の活性を妨害しない、融合タンパク質も
提供される。一部の実施形態において、異種機能ドメインは転写活性化ドメインである。
一部の実施形態において、転写活性化ドメインはＶＰ６４またはＮＦ－κＢ ｐ６５から
のものである。一部の実施形態において、異種機能ドメインは転写サイレンサーまたは転
写抑制ドメインである。一部の実施形態において、転写抑制ドメインは、クルッペル関連
ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）、またはｍＳｉ
ｎ３Ａ相互作用ドメイン（ＳＩＤ）である。一部の実施形態において、転写サイレンサー
はヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）、例えば、ＨＰ１αまたはＨＰ１βである。
一部の実施形態において、異種機能ドメインは、ＤＮＡのメチル化状態を改変する酵素で
ある。一部の実施形態において、ＤＮＡのメチル化状態を改変する酵素はＤＮＡメチルト
ランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）またはＴＥＴタンパク質である。一部の実施形態において
、ＴＥＴタンパク質はＴＥＴ１である。一部の実施形態において、異種機能ドメインは、
ヒストンサブユニットを改変する酵素である。一部の実施形態において、ヒストンサブユ
ニットを改変する酵素は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデ
アセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）、またはヒス
トンデメチラーゼである。一部の実施形態において、異種機能ドメインは生物学的係留物
である。一部の実施形態において、生物学的係留物はＭＳ２、Ｃｓｙ４またはラムダＮタ
ンパク質である。一部の実施形態において、異種機能ドメインはＦｏｋＩである。
本明細書において、任意選択的に、本明細書に記載のバリアントＳａＣａｓ９またはＳ
ｐＣａｓ９タンパク質の発現のための１つ以上の調節ドメインに作動可能に結合されてい
る、本明細書に記載のバリアントＳａＣａｓ９またはＳｐＣａｓ９タンパク質をコードす
る単離核酸、ならびに単離核酸を含むベクターも提供される。本明細書において、本明細
書に記載の核酸を含み、および任意選択的に本明細書に記載のバリアントＳａＣａｓ９ま
たはＳｐＣａｓ９タンパク質を発現する宿主細胞、例えば哺乳動物宿主細胞も提供される
。
本明細書において、細胞中で、本明細書に記載の単離バリアントＳａＣａｓ９またはＳ
ｐＣａｓ９タンパク質、および細胞のゲノムの選択部分に相補的な領域を有するガイドＲ
ＮＡを発現させることにより、細胞のゲノムを変更する方法も提供される。
本明細書において、細胞中で、バリアントタンパク質、および細胞のゲノムの選択部分
に相補的な領域を有するガイドＲＮＡを発現させることにより、細胞のゲノムを変更する
、例えば、選択的に変更する方法も提供される。
細胞を、本明細書に記載のタンパク質バリアント、および細胞のゲノムの選択部分に相
補的な領域を有するガイドＲＮＡと接触させることにより、細胞のゲノムを変更する、例
えば、選択的に変更する方法も提供される。
一部の実施形態において、単離タンパク質または融合タンパク質は、核局在化配列、細
胞浸透ペプチド配列、および／または親和性タグの１つ以上を含む。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態において、細胞は、幹細胞、例えば、胚性幹細
胞、間葉系幹細胞、もしくは誘導多能性幹細胞であるか、生存動物中に存在するか、また
は胚、例えば、哺乳動物、昆虫、もしくは魚類（例えば、ゼブラフィッシュ）胚もしくは
胚細胞中に存在する。
さらに、本明細書において、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子を変更する方法、例えば
、インビトロ方法が提供される。本方法は、ｄｓＤＮＡ分子を、本明細書に記載のバリア
ントタンパク質の１つ以上、およびｄｓ分子の選択部分に相補的な領域を有するガイドＲ
ＮＡと接触させることを含む。
特に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、本発
明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。方法お
よび材料は、本発明における使用のために本明細書に記載され、当技術分野において公知
の他の好適な方法および材料を使用することもできる。材料、方法、および実施例は、説
明のためのものにすぎず、限定するものではない。本明細書に挙げられる全ての刊行物、
特許出願、特許、配列、データベースエントリー、および他の参照文献は、参照により全
体として組み込まれる。矛盾する場合、本明細書が定義を含めて優先される。
本発明の他の特徴部および利点は、以下の詳細な説明および図面、ならびに特許請求の
範囲から明らかである。
特許または出願書類は、有色の少なくとも１つの図面を含有する。色付きの図面を有す
るこの特許または特許出願刊行物の複写物は、請求および必要な手数料の支払い時に省庁
により提供される。
図１Ａ－Ｊ：変更ＰＡＭ特異性を有するＳｐＣａｓ９バリアントの進化および特徴付け。ａ、ＰＡＭ塩基への塩基特異的接触を作製するＳｐＣａｓ９残基の合理的突然変異は、Ｕ２ＯＳヒト細胞ベース高感度緑色蛍光タンパク質（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＥＧＦＰ）崩壊アッセイにおいてＰＡＭ特異性を変更するには不十分である。崩壊頻度は、フローサイトメトリーにより定量し；バックグラウンド対照について観察された崩壊の平均レベルを、このおよび後続のパネル（ｃ、ｇ、ｈ、およびｊ）について赤色破線により表し；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝３を表す。ｂ、ＳｐＣａｓ９のＰＡＭ特異性を変更するために使用された２プラスミド陽性選択アッセイの概略図。機能的Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体による陽性選択プラスミド内の標的部位の開裂は、細菌を選択培地上でプレーティングする場合に生存に必要である（図１２Ａ～Ｂも参照）。ｃ、ＮＧＡ ＰＡＭを含有する標的部位を開裂し得るＳｐＣａｓ９バリアントについての陽性選択から得られた突然変異のコンビナトリアルアセンブリおよび試験。ＳｐＣａｓ９バリアントは、ＮＧＧまたはＮＧＡ ＰＡＭのいずれかを含有する部位を標的化するｓｇＲＮＡと対合させ、ＥＧＦＰ崩壊アッセイを使用して活性を評価した。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝３を表す。ｄ、細菌を選択培地上でプレーティングする場合、選択プラスミドの開裂が細胞死をもたらす陰性選択アッセイの概略図。この系は、プロトスペーサーの３’末端に隣接するランダム化配列を含有するプラスミドのライブラリーの生成によりＣａｓ９のＰＡＭ特異性をプロファイリングするように適合させた（図１３ｂも参照）。 図１Ａ－Ｊ：変更ＰＡＭ特異性を有するＳｐＣａｓ９バリアントの進化および特徴付け。ｅ、２つのランダム化ＰＡＭライブラリー（それぞれ異なるプロトスペーサーを有する）についての野生型ＳｐＣａｓ９の選択後ＰＡＭ枯渇値（ＰＰＤＶ）の分散プロット。ＰＡＭをそれらの２番目／３番目／４番目の位置ごとにグループ化およびプロットした。赤色破線は、統計的に有意な枯渇についてのカットオフ（ｄＣａｓ９対照実験から得られた、図１３ｃ参照）を示し、灰色破線は５倍枯渇（０．２のＰＰＤＶ）を表す。ｆ、野生型ＳｐＣａｓ９により認識されるものから区別されるＰＡＭを認識するＶＱＲおよびＥＱＲ ＳｐＣａｓ９バリアントについてのＰＰＤＶ分散プロット。 図１Ａ－Ｊ：変更ＰＡＭ特異性を有するＳｐＣａｓ９バリアントの進化および特徴付け。ｇ、ＮＧＡＮおよびＮＧＮＧ ＰＡＭを有する部位に対する野生型、ＶＱＲ、およびＥＱＲ ＳｐＣａｓ９についてのＥＧＦＰ崩壊頻度。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝３を表す。ｈ、ＮＧＣＧ ＰＡＭを含有する標的部位を開裂し得るＳｐＣａｓ９バリアントについての陽性選択から得られた突然変異のコンビナトリアルアセンブリおよび試験。ＮＧＧＧまたはＮＧＣＧ ＰＡＭのいずれかを含有する部位を標的するｓｇＲＮＡを、ＥＧＦＰ崩壊アッセイを使用してＣａｓ９標的化について評価した。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝３を表す。ｉ、ＶＲＥＲバリアントについてのＰＰＤＶ分散プロット。 図１Ａ－Ｊ：変更ＰＡＭ特異性を有するＳｐＣａｓ９バリアントの進化および特徴付け。ｊ、ＮＧＣＮおよびＮＧＮＧ ＰＡＭを有する部位に対する野生型およびＶＲＥＲ ＳｐＣａｓ９についてのＥＧＦＰ崩壊頻度。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝３を表す。 進化ＰＡＭ特異性を有するＳｐＣａｓ９バリアントは、ゼブラフィッシュ胚およびヒト細胞中の内在性部位をロバストに改変する。ａ、ＮＧＡＧ ＰＡＭを担持する内在性遺伝子部位に対する野生型またはＶＱＲ ＳｐＣａｓ９により誘導されたゼブラフィッシュ胚における突然変異誘発頻度の定量。突然変異頻度は、Ｔ７Ｅ１アッセイを使用して決定し；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝５から９つの個々の胚を表す。ｂ、ＮＧＡＧ、ＮＧＡＴ、およびＮＧＡＡ ＰＡＭを含有する部位に標的化されるｓｇＲＮＡについての４つの内在性ヒト遺伝子中の１６個の標的部位におけるＴ７Ｅ１アッセイにより定量されたＶＱＲバリアントの突然変異頻度。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝３を表す。 進化ＰＡＭ特異性を有するＳｐＣａｓ９バリアントは、ゼブラフィッシュ胚およびヒト細胞中の内在性部位をロバストに改変する。ｃ．ＮＧＡ ＰＡＭを有する内在性ヒト遺伝子標的部位に対する野生型ＳｐＣａｓ９の突然変異頻度。容易な比較のため、同一のｓｇＲＮＡを使用するＶＱＲバリアントについての突然変異頻度をここで再提示する（パネルｂに示される同一のデータ）。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝３を表し；ｎ．ｄ．は、Ｔ７Ｅ１により検出不能であることを表す。ｄ、Ｔ７Ｅ１アッセイにより定量された３つの内在性ヒト遺伝子中のＮＧＣＧ ＰＡＭを含有する９つの標的部位における野生型、ＶＲＥＲ、およびＶＱＲ ＳｐＣａｓ９の突然変異頻度。１９および２０ｎｔのｓｇＲＮＡ相補性長さを使用し；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝３を表す。 進化ＰＡＭ特異性を有するＳｐＣａｓ９バリアントは、ゼブラフィッシュ胚およびヒト細胞中の内在性部位をロバストに改変する。ｅ、野生型、ＶＱＲ、およびＶＲＥＲ ＳｐＣａｓ９により標的化可能な２０ｎｔのスペーサーを有するヒトゲノム中の部位数の表示。ｆ、パネルｂおよびｄからのｓｇＲＮＡを使用するＶＱＲおよびＶＲＥＲ ＳｐＣａｓ９バリアントについてのＧＵＩＤＥ－ｓｅｑにより同定されたオフターゲット開裂部位の数。 Ｄ１１３５Ｅ突然変異は、ＳｐＣａｓ９のＰＡＭ認識およびスペーサー特異性を改善する。ａ、２つのランダム化ＰＡＭライブラリーについての野生型およびＤ１１３５Ｅ ＳｐＣａｓ９（それぞれ左および右パネル）についてのＰＰＤＶ分散プロット。ＰＡＭをそれらの２番目／３番目／４番目の位置ごとにグループ化およびプロットした。野生型ＳｐＣａｓ９について示されるデータは、図１ｄからのプロットと同一であり、容易な比較のためここで再提示する。赤色破線は、統計的に有意に枯渇するＰＡＭを示し（図１３ｃ参照）、灰色破線は、５倍枯渇カットオフ（０．２のＰＰＤＶ）を示す。ｂ、ヒト細胞中のＮＧＧ、ＮＡＧ、およびＮＧＡ ＰＡＭを含有する部位に対する野生型およびＤ１１３５Ｅ ＳｐＣａｓ９のＥＧＦＰ崩壊活性。崩壊頻度は、フローサイトメトリーにより定量し；バックグラウンド対照について観察された崩壊の平均レベルを、このパネルおよび（ｄ）について赤色破線により表し；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝３を表し；活性の平均倍率変化を示す。ｃ、ヒト細胞中の６つの内在性部位における野生型およびＤ１１３５Ｅ ＳｐＣａｓ９についてのＴ７Ｅ１により検出された突然変異誘発頻度。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝３を表し；活性の平均変化倍率を示す。 Ｄ１１３５Ｅ突然変異は、ＳｐＣａｓ９のＰＡＭ認識およびスペーサー特異性を改善する。ｄ、ヒト細胞中のＥＧＦＰ崩壊実験についての形質移入野生型またはＤ１１３５Ｅ ＳｐＣａｓ９コードプラスミドの量のタイトレーション。これらの実験の全てに使用されたｓｇＲＮＡプラスミドの量は、２５０ｎｇに固定した。異なるＥＧＦＰ部位を標的化する２つのｓｇＲＮＡを使用し；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝３を表す。ｅ、野生型およびＤ１１３５Ｅ ＳｐＣａｓ９を使用する３つのｓｇＲＮＡについてのオンおよびオフターゲット部位の標的化ディープシーケンシング。オンターゲット部位を上段に示し、オフターゲット部位を下段に、オンターゲットに対するミスマッチを強調して列記する。オンターゲット部位における活性の変化よりも大きい、オフターゲット部位における野生型ＳｐＣａｓ９に対するＤ１１３５Ｅについての活性の倍率減少を緑色で強調し；それぞれのアンプリコンについての対照インデルレベルを報告する。ｆ、野生型ＳｐＣａｓ９について観察されたインデル頻度に対するＤ１１３５Ｅを使用するオンおよびオフターゲティング部位における活性の減少倍率としてプロットされた標的化ディープシーケンシングデータのまとめ。 Ｄ１１３５Ｅ突然変異は、ＳｐＣａｓ９のＰＡＭ認識およびスペーサー特異性を改善する。ｇ、野生型ＳｐＣａｓ９を使用するオフターゲット部位におけるリードカウントに対するＤ１１３５Ｅを使用する特異性の正規化変化倍率としてプロットされたそのオフターゲット部位における野生型およびＤ１１３５Ｅ間の特異性のＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ検出変化のまとめ（図１８ｃも参照）。Ｄ１１３５Ｅについてのリードカウントを有さない部位における特異性の推定増加倍率は、プロットしない（図１８ｃ参照）。 細菌およびヒト細胞中のＳｔ１Ｃａｓ９およびＳａＣａｓ９オルソログの特徴付け。ａ、２つのランダム化ＰＡＭライブラリーを使用するＳｔ１Ｃａｓ９についてのＰＰＤＶの分散プロット。ＰＡＭをそれらの３番目／４番目／５番目／６番目の位置ごとにグループ化およびプロットした。２０および２１ヌクレオチドのｓｇＲＮＡ相補性長さを使用して両方のライブラリーについてＳｔ１Ｃａｓ９をプログラミングした（それぞれ左および右パネル）。赤色破線は、統計的に有意に枯渇するＰＡＭを示し（図１３ｃ参照）、灰色破線は、５倍枯渇（０．２のＰＰＤＶ）を示し；αは、生物情報学的アプローチにより既に予測されたＰＡＭ２７であり；βは、ストリンジェントな実験条件下で既に同定されたＰＡＭ２０であり；＊は、本試験において発見された新規ＰＡＭであり；γは、モデレートな実験条件下で既に同定されたＰＡＭ２０である。ｂ、２つのランダム化ＰＡＭライブラリーを使用するＳａＣａｓ９についてのＰＰＤＶ分散プロット。ＰＡＭをそれらの３番目／４番目／５番目／６番目の位置ごとにグループ化およびプロットした。２１および２３ヌクレオチドのｓｇＲＮＡ相補性長さを使用して両方のライブラリーについてＳａＣａｓ９をプログラミングした（それぞれ左および右パネル）。ＳａＣａｓ９について同定されたＰＡＭを示し、ＰＡＭ１～３は、それらの実験において使用されたスペーサーおよびスペーサー長の全ての組合せにわたり一貫して枯渇した。 細菌およびヒト細胞中のＳｔ１Ｃａｓ９およびＳａＣａｓ９オルソログの特徴付け。ｃ、ｘ軸上に示される、異なる標的部位およびＰＡＭを保有する選択プラスミドをチャレンジした場合の細菌陽性選択におけるＳｔ１Ｃａｓ９およびＳａＣａｓ９の生存割合。Ｓｔ１Ｃａｓ９およびＳａＣａｓ９についてのパネル（ａ）および（ｂ）からの高度に枯渇したＰＡＭを陽性選択プラスミドにおける標的部位に使用した。ｄ、ｅ、ＮＮＡＧＡＡ（配列番号３）またはＮＮＧＧＧＴ（配列番号４）／ＮＮＧＡＧＴ（配列番号５）ＰＡＭをそれぞれ含有するＥＧＦＰ中の部位に対するＳｔ１Ｃａｓ９（パネルｄ）またはＳａＣａｓ９（パネルｅ）のＥＧＦＰ崩壊活性。同一部位についての異なる長さのマッチｓｇＲＮＡを示し；崩壊頻度をフローサイトメトリーにより定量し；陰性対照について得られたＥＧＦＰ崩壊の平均頻度を赤色破線により表し；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝３を表す。ｆ、ｇ、ＮＮＡＧＡＡ（配列番号３）またはＮＮＧＧＧＴ（配列番号４）／ＮＮＧＡＧＴ（配列番号５）／ＮＮＧＡＡＴ（配列番号６）ＰＡＭをそれぞれ含有する４つの内在性ヒト遺伝子中の部位におけるＴ７Ｅ１アッセイにより定量されたＳｔ１Ｃａｓ９（パネルｆ）およびＳａＣａｓ９（パネルｇ）の突然変異頻度。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝３を表し；ｎ．ｄ．は、Ｔ７Ｅ１により検出不能であることを表す。 図５Ａ－Ｊ：本試験において使用されたプラスミドの配列およびマップ。 図５Ａ－Ｊ：本試験において使用されたプラスミドの配列およびマップ。 図５Ａ－Ｊ：本試験において使用されたプラスミドの配列およびマップ。 図５Ａ－Ｊ：本試験において使用されたプラスミドの配列およびマップ。 図５Ａ－Ｊ：本試験において使用されたプラスミドの配列およびマップ。 ＳａＣａｓ９のＰＡＭ相互作用残基を予測するためのＣａｓ９オルソログのアラインメント。ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、および１１個の他のＣａｓ９オルソログのＰＡＭ相互作用ドメインをアラインし、ＳｐＣａｓ９について公知のものに基づきＳａＣａｓ９中のＰＡＭ接触残基を同定した。上段、上段、化膿性連鎖球菌（Ｓ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、配列番号１、次いでそれぞれ配列番号２９～４０のアミノ酸１２２９～１３６８。 細菌スクリーンにおける異なるＰＡＭに対する活性について評価されたＳａＣａｓ９中の置換。図６からのアラインメントに基づき、単一アミノ酸置換を細菌陽性選択において試験してカノニカルＮＮＧＡＧＴ（配列番号５）および非カノニカルＮＮＡＡＧＴ（配列番号４１）およびＮＮＡＧＧＴ（配列番号４２）ＰＡＭに対する活性に対する効果についてスクリーニングした。選択培地上の細菌コロニーは、ＳａＣａｓ９バリアントが示されるＰＡＭを含有する部位に対する活性を有することを示唆する。 図８Ａ－Ｂ：ＳａＣａｓ９バリアントがＮＮＡＲＲＴ（配列番号４３）ＰＡＭを標的化することを可能とするアミノ酸置換のまとめ。ＮＮＡＲＲＴ（配列番号４３）ＰＡＭを含有する部位に対する細菌中の生存を可能とした５２個の選択突然変異ＳａＣａｓ９クローンのＰＡＭ相互作用ドメインのアミノ酸配列；提示される配列は、表６に示される配列番号５３～１０４の部分配列である。 図８Ａ－Ｂ：ＳａＣａｓ９バリアントがＮＮＡＲＲＴ（配列番号４３）ＰＡＭを標的化することを可能とするアミノ酸置換のまとめ。ＮＮＡＲＲＴ（配列番号４３）ＰＡＭを含有する部位に対する細菌中の生存を可能とした５２個の選択突然変異ＳａＣａｓ９クローンのＰＡＭ相互作用ドメインのアミノ酸配列；提示される配列は、表６に示される配列番号５３～１０４の部分配列である。 野生型および遺伝子操作ＳａＣａｓ９バリアントのヒト細胞活性。野生型、ＫＫＱ、およびＫＫＨ ＳａＣａｓ９の活性を、ＮＮＲＲＲＴ（配列番号４５）ＰＡＭを含有する部位に対してヒト細胞ＥＧＦＰレポーターアッセイにおいて評価した。 細菌中の非カノニカルＰＡＭに対するＳａＣａｓ９活性、およびＲ１０１５における指向突然変異の、同一の非カノニカルＰＡＭに対する活性への影響の仕方。 遺伝子操作バリアントは、形態ＮＮＮＲＲＴのＰＡＭを認識し得る。 １２Ａ－Ｂ：ＳｐＣａｓ９の変更ＰＡＭ特異性バリアントを遺伝子操作するために使用された細菌ベース陽性選択。ａ、図１ｂからの陽性選択の拡大概略図（左パネル）、およびＳｐＣａｓ９が陽性選択において予測されるとおりに挙動するバリデーション（右パネル）。スペーサー１、配列番号１０５；スペーサー２、配列番号１０６。 １２Ａ－Ｂ：ＳｐＣａｓ９の変更ＰＡＭ特異性バリアントを遺伝子操作するために使用された細菌ベース陽性選択。ｂ、変更ＰＡＭ認識特異性を有するＳｐＣａｓ９バリアントを選択するように陽性選択を適合させた方法の概略図。ランダム化ＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメイン（残基１０９７～１３６８）を有するＳｐＣａｓ９クローンのライブラリーを、変更ＰＡＭを保有する選択プラスミドによりチャレンジする。陽性選択プラスミドを開裂することにより選択で生存するＳｐＣａｓ９バリアントをシーケンシングして変更ＰＡＭ特異性を可能とする突然変異を決定した。 図１３Ａ－Ｄ：Ｃａｓ９ヌクレアーゼの全体ＰＡＭ特異性をプロファイリングするための細菌細胞ベース部位枯渇アッセイ。ａ、図１ｄからの陰性選択を説明する拡大概略図（左パネル）、および野生型ＳｐＣａｓ９が、機能的（ＮＧＧ）および非機能的（ＮＧＡ）ＰＡＭを有する部位のスクリーンにおいて予測されるとおりに挙動するバリデーション（右パネル）。 図１３Ａ－Ｄ：Ｃａｓ９ヌクレアーゼの全体ＰＡＭ特異性をプロファイリングするための細菌細胞ベース部位枯渇アッセイ。ｂ、陰性選択を部位枯渇アッセイとして使用し、ＰＡＭに代えて６つのランダム化塩基対を含有する陰性選択プラスミドライブラリーを構築することにより機能的ＰＡＭについてスクリーニングした方法の概略図。目的のＣａｓ９／ｓｇＲＮＡにより開裂されるＰＡＭを含有する選択プラスミドは枯渇する一方、開裂されない（または不十分に開裂される）ＰＡＭは保持される。選択後のＰＡＭの頻度を出発ライブラリーにおけるそれらの選択前頻度と比較して選択後ＰＡＭ枯渇値（ＰＰＤＶ）を計算する。スペーサー１、配列番号１０５；スペーサー２、配列番号１０６。 図１３Ａ－Ｄ：Ｃａｓ９ヌクレアーゼの全体ＰＡＭ特異性をプロファイリングするための細菌細胞ベース部位枯渇アッセイ。ｃ、ｄ、統計的に有意なＰＰＤＶについてのカットオフは、２つのランダム化ＰＡＭライブラリーについて触媒的に不活性なＳｐＣａｓ９（ｄＣａｓ９）についてのＰＡＭのＰＰＤＶをプロットすることにより確立した（それらの２番目／３番目／４番目の位置ごとにグループ化およびプロットした（ｃ）。２つのライブラリーについての平均ＰＰＤＶから３．３６標準偏差の閾値が計算され（（ｄ）中の赤線）、０．８５未満の任意のＰＰＤＶ偏差が、ｄＣａｓ９処理（（ｃ）中の赤色破線）と比較して統計的に有意であることを確立した。（ｃ）中の灰色破線は、アッセイにおける５倍枯渇（０．２のＰＰＤＶ）を示す。 部位枯渇アッセイおよびＥＧＦＰ崩壊活性間の一致。データ点は、対応するＰＡＭについてライブラリー１および２について観察された平均ＰＰＤＶ（図１ｆ）に対してプロットされたＶＱＲおよびＥＱＲ ＳｐＣａｓ９バリアント（図１ｇ）についての２つのＮＧＡＮおよびＮＧＮＧ ＰＡＭ部位の平均ＥＧＦＰ崩壊を表す。赤色破線は、統計的に有意に枯渇するＰＡＭを示し（０．８５のＰＰＤＶ、図１３ｃ参照）、灰色破線は、５倍枯渇（０．２のＰＰＤＶ）を表す。平均値を９５％信頼区間でプロットする。 ＮＧＡＧ ＰＡＭを含有する内在性ゼブラフィッシュ部位におけるＶＱＲ ＳｐＣａｓ９バリアントにより誘導された挿入または欠失突然変異。それぞれの標的遺伝子座について、野生型配列を上段に示し、プロトスペーサーを黄色で強調し（相補鎖上に存在する場合、緑色で強調する）、ＰＡＭを赤色下線文字として標識する。欠失を灰色で強調された赤色破線として示し、挿入を青色で強調された小文字として示す。それぞれのインデル突然変異により引き起こされる長さの正味の変化を右側に示す（＋、挿入；－、欠失）。一部の変更が配列の両方の挿入および欠失を有し、それらの例において、変更を括弧内に列記することに留意されたい。それぞれの突然変異アレルが回復した回数の数（２回以上の場合）を括弧内に示す。 １６Ａ－Ｂ：野生型ＳｐＣａｓ９およびその進化バリアントにより標的化される内在性遺伝子。ａ、野生型、ＶＱＲ、およびＶＲＥＲ ＳｐＣａｓ９により標的化される配列をそれぞれ青色、赤色、および緑色で示す。Ｔ７Ｅ１のためのこれらの遺伝子座を増幅するために使用されたｓｇＲＮＡおよびプライマーの配列を以下の表１および２に提供する。 １６Ａ－Ｂ：野生型ＳｐＣａｓ９およびその進化バリアントにより標的化される内在性遺伝子。ｂ、４つの異なる内在性ヒト遺伝子（上段パネル中の注釈に対応）におけるＮＧＧ ＰＡＭを担持する８つの標的部位における野生型ＳｐＣａｓ９についてのＴ７Ｅ１により検出された平均突然変異誘発頻度。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝３を表す。 図１７Ａ－Ｂ：ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑを使用して決定されたＶＱＲおよびＶＲＥＲ ＳｐＣａｓ９バリアントの特異性プロファイル。設定オンターゲット部位を黒色四角により標識し、オフターゲット部位内のミスマッチ位置を強調する。ａ、ＶＱＲバリアントの特異性を、ヒト細胞においてＮＧＡ ＰＡＭを含有する内在性部位を標的化することにより評価した：ＥＭＸ１部位４（配列番号１４２）、ＦＡＮＣＦ部位１（配列番号１４３）、ＦＡＮＣＦ部位３（配列番号１４４）、ＦＡＮＣＦ部位４（配列番号１４５）、ＲＵＮＸ１部位１（配列番号１４６）、ＲＵＮＸ１部位３（配列番号１４７）、ＶＥＧＦＡ部位１（配列番号１４８）、およびＺＳＣＡＮ２（配列番号１４９）。 図１７Ａ－Ｂ：ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑを使用して決定されたＶＱＲおよびＶＲＥＲ ＳｐＣａｓ９バリアントの特異性プロファイル。設定オンターゲット部位を黒色四角により標識し、オフターゲット部位内のミスマッチ位置を強調する。ｂ、ＶＲＥＲバリアントの特異性を、ヒト細胞においてＮＧＣＧ ＰＡＭを含有する内在性部位を標的化することにより評価した：ＦＡＮＣＦ部位３（配列番号１５０）、ＦＡＮＣＦ部位４（配列番号１５１）、ＲＵＮＸ１部位１（配列番号１５２）、ＶＥＧＦＡ部位１（配列番号１５３）、およびＶＥＧＦＡ部位２（配列番号１５４）。 図１８Ａ－Ｃ：ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑにより検出されたオフターゲット部位におけるＤ１１３５Ｅおよび野生型ＳｐＣａｓ９間の活性差異。ａ、制限断片長多型分析により推定されたオンターゲット部位におけるオリゴタグインテグレーションの平均頻度。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝４を表す。ｂ、Ｔ７Ｅ１により検出されたオンターゲット部位における平均突然変異誘発頻度。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝４を表す。 図１８Ａ－Ｃ：ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑにより検出されたオフターゲット部位におけるＤ１１３５Ｅおよび野生型ＳｐＣａｓ９間の活性差異。ｃ、３つの内在性ヒト細胞部位（ＥＭＸ１部位３（配列番号１５５）；ＺＮＦ６２９部位（配列番号１５６）、ＶＥＧＦＡ部位３（配列番号１５７））における野生型ＳｐＣａｓ９およびＤ１１３５Ｅ間のＧＵＩＤＥ－ｓｅｑリードカウント差異。オンターゲット部位を上段に示し、オフターゲット部位を下段に列記し、ミスマッチを強調する。表中、オフターゲット活性とオンターゲット部位との比を野生型およびＤ１１３５Ｅ間で比較して特異性の正規化変化倍率を計算する（特異性の増加を緑色で強調する）。検出可能なＧＵＩＤＥ－ｓｅｑリードを有さない部位について、１の値を割り当てて推定特異性変化を計算した（橙色で示す）。図３ｅにおけるディープシーケンシングにより分析されたオフターゲット部位をＥＭＸ１部位３およびＶＥＧＦＡ部位３オフターゲット部位の左に番号付けした。 図１９Ａ－Ｆ：Ｓｔ１Ｃａｓ９およびＳａＣａｓ９についての追加のＰＡＭならびにヒト細胞中のスペーサー長さに基づく活性。ａ、スペーサー１（上段パネル）またはスペーサー２（下段パネル）についてのランダム化ＰＡＭライブラリーについて得られた２０および２１ヌクレオチドのｓｇＲＮＡ相補性長さを比較するＳｔ１Ｃａｓ９についてのＰＰＤＶ分散プロット。ＰＡＭをそれらの３番目／４番目／５番目／６番目の位置ごとにグループ化およびプロットした。赤色破線は、統計的に有意に枯渇するＰＡＭを示し（図１３ｃ参照）、灰色破線は、５倍枯渇（０．２のＰＰＤＶ）を表す。ｂ、４つのそれぞれの試験条件下でのＳｔ１Ｃａｓ９についての０．２未満のＰＰＤＶを有するＰＡＭの表。左に示されるＰＡＭ番号付けは、図４ａと同一である。ｃ、スペーサー１（上段パネル）またはスペーサー２（下段パネル）についてのランダム化ＰＡＭライブラリーについて得られた２１および２３ヌクレオチドのｓｇＲＮＡ相補性長さを比較するＳａＣａｓ９についてのＰＰＤＶ分散プロット。ＰＡＭをそれらの３番目／４番目／５番目／６番目の位置ごとにグループ化およびプロットした。赤色および灰色破線は、（ａ）のものと同一である。 図１９Ａ－Ｆ：Ｓｔ１Ｃａｓ９およびＳａＣａｓ９についての追加のＰＡＭならびにヒト細胞中のスペーサー長さに基づく活性。ｄ、４つのそれぞれの試験条件下でのＳａＣａｓ９についての０．２未満のＰＰＤＶを有するＰＡＭの表。ＰＡＭ番号付けは、図４ｂのものと同一である。 図１９Ａ－Ｆ：Ｓｔ１Ｃａｓ９およびＳａＣａｓ９についての追加のＰＡＭならびにヒト細胞中のスペーサー長さに基づく活性。ｅ、ｆ、ＥＧＦＰ崩壊を介する種々のスペーサー長さにわたるＳｔ１Ｃａｓ９およびＳａＣａｓ９のヒト細胞活性（パネルｅ、図４ｄ、４ｅからのデータ）ならびにＴ７Ｅ１により検出された内在性遺伝子突然変異誘発（パネルｆ、図４ｆ、４ｇからのデータ）。全てのレプリケートについての活性を示し（ｎ＝３または４）；バーは、平均および９５％信頼区間を説明し；スペーサー長さごとの部位の数を示す。 ２０Ａ－Ｂ：ＳｐＣａｓ９によるＰＡＭ認識におけるＤ１１３５、Ｇ１２１８、およびＴ１３３７の構造的および機能的役割。ａ、ＰＡＭ認識に関与する６つの残基の構造表示。左パネルは、ＰＡＭ１５の３番目の塩基位置への水媒介性副溝接触を作製する残基であるＳ１１３６へのＤ１１３５の近接性を説明する。右パネルはＰＡＭ１５の３番目の塩基位置への直接の塩基特異的な主溝接触を作製する残基であるＲ１３３５へのＧ１２１８、Ｅ１２１９、およびＴ１３３７の近接性を説明する。オングストローム距離を黄色破線により示し；ＰＡＭの非標的鎖グアニン塩基ｄＧ２およびｄＧ３を青色で示し；他のＤＮＡ塩基を橙色で示し；水分子を赤色で示し；ＰＤＢ：４ＵＮ３からＰｙＭＯＬを使用して画像を作成した。ｂ、ＰＡＭ認識に関与するＳｐＣａｓ９中の６つの残基の突然変異分析。それぞれの位置における３つのタイプの突然変異の１つを含有するクローンをＥＧＦＰ崩壊について試験し、ＮＧＧ ＰＡＭを保有する部位に２つのｓｇＲＮＡを標的化させた。それぞれの位置について、本発明者らは、１つのアラニン置換および２つの非保存的突然変異を作出した。Ｓ１１３６およびＲ１３３５は、ＰＡＭ１５の３番目のグアニンへの接触を媒介することが既に報告され、Ｄ１１３５、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、およびＴ１３３７は、本試験において報告される。ＥＧＦＰ崩壊活性をフローサイトメトリーにより定量し；バックグラウンド対照を赤色破線により表し；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝３を表す。 図２１Ａ－Ｆ：変更ＰＡＭ特異性を有するＳａＣａｓ９バリアントの選択およびアセンブリ。（ａ）ＳｐＣａｓ９およびＳａＣａｓ９を強調したＣａｓ９オルソログの系統樹。（ｂ）細菌陽性選択アッセイにおいて評価された単一アミノ酸置換を有するＳａＣａｓ９バリアントの活性（図３１ｂも参照）。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝３を表し；ＮＳ＝生存なし。（ｃ）野生型およびＲ１０１５Ｈ ＳａＣａｓ９のヒト細胞活性。ＥＧＦＰ崩壊活性をフローサイトメトリーにより定量し；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ、ｎ＝３を表し、バックグラウンドＥＧＦＰ損失の平均レベルを赤色破線により表す（このおよびパネルｅについて）。 図２１Ａ－Ｆ：変更ＰＡＭ特異性を有するＳａＣａｓ９バリアントの選択およびアセンブリ。（ｄ）変更ＰＡＭ特異性を有するＳａＣａｓ９バリアントについて選択した場合にそれぞれのアミノ酸位置において観察された置換の総数。Ｒ１０１５における出発突然変異は、カウントしない。（ｅ）変更ＰＡＭ特異性について選択した場合に観察された突然変異を含有するバリアントのヒト細胞ＥＧＦＰ崩壊活性。 図２１Ａ－Ｆ：変更ＰＡＭ特異性を有するＳａＣａｓ９バリアントの選択およびアセンブリ。（ｆ）野生型ＳａＣａｓ９対ＫＫＨバリアントの平均選択後ＰＡＭ枯渇値（ＰＰＤＶ）分散プロット（ｎ＝２、図３４ｃも参照）。ＰＡＭに代えて異なるプロトスペーサーおよび８つのランダム化塩基対を有する２つのライブラリーを使用して、いずれのＰＡＭがそれぞれのＣａｓ９により標的化可能であるかを決定した。統計的に有意な枯渇を赤色破線により示し（ｄＣａｓ９対照に対して、図３４ａおよび３４ｂ参照）、５倍枯渇を灰色破線により示す。 図２２Ａ－Ｆ：ヒト細胞中の内在性部位に標的化されるＳａＣａｓ９ ＫＫＨバリアントの活性。（ａ）Ｔ７Ｅ１アッセイにより決定された、ＫＫＨ ＳａＣａｓ９により誘導されたＮＮＮＲＲＴ ＰＡＭを担持する５５個の異なる部位にわたる突然変異誘発頻度。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝３を表し、ＮＤは、Ｔ７Ｅ１アッセイにより検出不能であることを表す。 図２２Ａ－Ｆ：ヒト細胞中の内在性部位に標的化されるＳａＣａｓ９ ＫＫＨバリアントの活性。（ｂ）ＰＡＭの３番目の位置についてのＫＫＨバリアント優先性。パネルａのデータからの平均活性を、このならびにパネルｂおよびｃについて示す。（ｃ）ＰＡＭの４番目および５番目の位置についてのＫＫＨバリアント優先性。（ｄ）ＫＫＨ ＳａＣａｓ９バリアントのスペーサー長さ優先性。（ｅ）ＮＮＮＲＲＴ ＰＡＭを含有する種々の部位に標的化される野生型およびＫＫＨ ＳａＣａｓ９のヒト細胞ＥＧＦＰ崩壊活性の比較。ＥＧＦＰ崩壊をフローサイトメトリーにより定量し；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ、ｎ＝３を表し、バックグラウンドＥＧＦＰ損失の平均レベルを赤色破線により表す。 図２２Ａ－Ｆ：ヒト細胞中の内在性部位に標的化されるＳａＣａｓ９ ＫＫＨバリアントの活性。（ｆ）パネルａからの１６個の考えられるＮＮＮＲＲＴ部位（最大ＫＫＨ活性を有する部位を選択した）のそれぞれについての１つの部位に対する野生型ＳａＣａｓ９の突然変異誘発頻度。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝３を表し、ＮＤは、Ｔ７Ｅ１アッセイにより検出不能であることを表す。 図２３Ａ－Ｅ：野生型およびＫＫＨ ＳａＣａｓ９のゲノムワイド特異性プロファイル。（ａ）ＥＭＸ部位１（配列番号１５８）およびＶＥＧＦ部位８（配列番号１５９）におけるオフターゲットの総数（パネルａ）およびそれぞれのオフターゲット部位において観察されたミスマッチ（パネルｂ）により表される、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号４６）ＰＡＭを含有する部位に標的化される野生型およびＫＫＨ ＳａＣａｓ９の直接比較。パネルｂおよびｅについて、それぞれの部位におけるＧＵＩＤＥ－ｓｅｑリードカウントを示し；オンターゲット配列を黒色の枠により標識し；オフターゲット部位内のミスマッチ位置を強調し；配列を細胞タイプ特異的ＳＮＰについて補正し；潜在的なｓｇＲＮＡまたはＤＮＡバルジヌクレオチドを有する部位を小さい赤色で縁取った塩基または破線によりそれぞれ示す。 図２３Ａ－Ｅ：野生型およびＫＫＨ ＳａＣａｓ９のゲノムワイド特異性プロファイル。（ｂ）ＥＭＸ部位１（配列番号１５８）およびＶＥＧＦ部位８（配列番号１５９）におけるオフターゲットの総数（パネルａ）およびそれぞれのオフターゲット部位において観察されたミスマッチ（パネルｂ）により表される、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号４６）ＰＡＭを含有する部位に標的化される野生型およびＫＫＨ ＳａＣａｓ９の直接比較。パネルｂおよびｅについて、それぞれの部位におけるＧＵＩＤＥ－ｓｅｑリードカウントを示し；オンターゲット配列を黒色の枠により標識し；オフターゲット部位内のミスマッチ位置を強調し；配列を細胞タイプ特異的ＳＮＰについて補正し；潜在的なｓｇＲＮＡまたはＤＮＡバルジヌクレオチドを有する部位を小さい赤色で縁取った塩基または破線によりそれぞれ示す。 図２３Ａ－Ｅ：野生型およびＫＫＨ ＳａＣａｓ９のゲノムワイド特異性プロファイル。（ｃ）ＶＥＧＦＡ部位８における野生型およびＫＫＨ ＳａＣａｓ９によるオフターゲット部位開裂における差異を強調するベン図。（ｄ）オフターゲットの総数（パネルｄ）およびそれぞれのオフターゲット部位において観察されたミスマッチ（パネルｅ）により表される、ＮＮＨＲＲＴ（配列番号４４）ＰＡＭを含有する部位、ＥＭＸ部位１（配列番号１６０）、ＥＭＸ部位４（配列番号１６１）、ＥＭＸ部位１０（配列番号１６２）、ＦＡＮＣＦ部位９（配列番号１６３）、およびＦＡＮＣＦ部位１６（配列番号１６４）に標的化されるＫＫＨバリアントの特異性プロファイル。 図２３Ａ－Ｅ：野生型およびＫＫＨ ＳａＣａｓ９のゲノムワイド特異性プロファイル。（ｅ）オフターゲットの総数（パネルｄ）およびそれぞれのオフターゲット部位において観察されたミスマッチ（パネルｅ）により表される、ＮＮＨＲＲＴ（配列番号４４）ＰＡＭを含有する部位、ＥＭＸ部位１（配列番号１６０）、ＥＭＸ部位４（配列番号１６１）、ＥＭＸ部位１０（配列番号１６２）、ＦＡＮＣＦ部位９（配列番号１６３）、およびＦＡＮＣＦ部位１６（配列番号１６４）に標的化されるＫＫＨバリアントの特異性プロファイル。 細菌２プラスミドスクリーンにおけるＶＱＲ誘導体クローンの活性。ＮＧＡＮ ＰＡＭを含有する細菌中の部位に対する２４個の異なるＶＱＲ誘導体バリアントの試験。非選択プレートに対する選択プレート上の生存率は、示されるＰＡＭに対する活性を示す。 ＳｐＣａｓ９－ＶＱＲ誘導体のヒト細胞ＥＧＦＰ崩壊活性。ＳｐＣａｓ９バリアントのＥＧＦＰ崩壊活性は、示されるＰＡＭを含有する部位に対する活性の尺度である。 ＳｐＣａｓ９－ＶＱＲおよび－ＶＲＱＲバリアントのヒト細胞ＥＧＦＰ崩壊活性。ＳｐＣａｓ９バリアントのＥＧＦＰ崩壊活性は、示されるＰＡＭを含有する部位に対する活性の尺度である。 細菌２プラスミドスクリーンにおけるＳｐＣａｓ９－ＶＲＱＲ誘導体バリアントの活性。ＶＱＲおよびＶＲＱＲバリアントと比較した、ＮＧＡＮ ＰＡＭを含有する細菌中の部位に対する１２個の異なるＶＱＲ誘導体バリアントの試験。非選択プレートに対する選択プレート上の生存率は、示されるＰＡＭに対する活性を示す。 ＳｐＣａｓ９－ＶＲＱＲバリアントのヒト細胞ＥＧＦＰ崩壊活性。ＳｐＣａｓ９バリアントのＥＧＦＰ崩壊活性は、示されるＰＡＭを含有する部位に対する活性の尺度である。 Ｃａｓ９オルソログ（図２１ａからのもの）のタンパク質ドメインアラインメント。ＳｐＣａｓ９のドメイン構造を上段に示し（ＰＤＢ：４ＵＮ３；Ａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４に基づく）；ＳｐＣａｓ９のＰＡＭ接触残基を強調し；変更ＰＡＭ特異性バリアントを選択するために突然変異させたＳａＣａｓ９の領域を示す。 ＰＡＭ相互作用残基の同定のためのＣａｓ９オルソログの一次配列アラインメント；それぞれ配列番号１６５～１７６。ＰＡＭへの接触に重要であることが既に同定されたＳｐＣａｓ９残基（Ａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４；実施例１～２）を青色で強調し、ＳａＣａｓ９のＰＡＭ特異性をモジュレートし得る残基（本試験において同定）を橙色で強調し、Ｒ１０１５に隣接する正荷電残基を黄色で強調する。構造予測されたＳｐＣａｓ９のＰＡＭ相互作用ドメインを青色破線により強調し（ＰＤＢに基づく：４ＵＮ３；Ａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、ＰＣＲ突然変異誘発についてのバウンダリーとして使用されるＳａＣａｓ９ ＰＡＭ相互作用ドメインの保守的推定を橙色破線により示す。 ＰＡＭ相互作用残基の同定のためのＣａｓ９オルソログの一次配列アラインメント；それぞれ配列番号１６５～１７６。ＰＡＭへの接触に重要であることが既に同定されたＳｐＣａｓ９残基（Ａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４；実施例１～２）を青色で強調し、ＳａＣａｓ９のＰＡＭ特異性をモジュレートし得る残基（本試験において同定）を橙色で強調し、Ｒ１０１５に隣接する正荷電残基を黄色で強調する。構造予測されたＳｐＣａｓ９のＰＡＭ相互作用ドメインを青色破線により強調し（ＰＤＢに基づく：４ＵＮ３；Ａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、ＰＣＲ突然変異誘発についてのバウンダリーとして使用されるＳａＣａｓ９ ＰＡＭ相互作用ドメインの保守的推定を橙色破線により示す。 図３１Ａ－Ｂ：細菌陽性選択アッセイの概略図。（ａ）選択プラスミドは、代替ＰＡＭ配列を認識し得るＣａｓ９バリアントについてスクリーニングするように改変することができる。（ｂ）陽性選択プラスミドの概略図（左パネル）、および陽性選択において機能的または非機能的Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡペアをスクリーニングする場合に予測される帰結（右パネル）。 ＫＮＨおよびＫＫＨバリアントへのＫ９２９Ｒ突然変異の追加。ＥＧＦＰ崩壊活性をフローサイトメトリーにより定量し；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ、ｎ＝３を表し、バックグラウンドＥＧＦＰ損失の平均レベルを赤色破線により表す。 細菌部位枯渇アッセイの概略図。野生型またはＫＫＨ ＳａＣａｓ９による開裂が生じないＰＡＭに代えて８つのランダム化ヌクレオチドを有する部位枯渇プラスミドをシーケンシングする。ライブラリー１スペーサー配列、配列番号１０５；ライブラリー２スペーサー配列、配列番号１０６。標的化可能なＰＡＭは、選択後ＰＡＭ枯渇値（ＰＰＤＶ）として計算されたインプットライブラリーに対するそれらの枯渇により推定する。 ３４Ａ－Ｅ：野生型およびＫＫＨ ＳａＣａｓ９についての部位枯渇アッセイ結果。（ａ）両方のライブラリーに対するｄＣａｓ９対照実験についてのＰＰＤＶ値。赤色破線は、統計的有意性を示し（ＰＰＤＶ＝０．７９４、パネルｂ参照）；灰色破線は、５倍枯渇を示し；ＰＡＭの３番目／４番目／５番目／６番目の位置を含むウインドウについてＰＰＤＶをプロットする（このおよびパネルｃについて）。（ｂ）統計的に有意な選択後ＰＡＭ枯渇値（ＰＰＤＶ）をパネルａにおけるｄＣａｓ９対照実験から決定した。統計的有意性は、標準偏差の３．３６倍において閾値を設定することにより決定した。 ３４Ａ－Ｅ：野生型およびＫＫＨ ＳａＣａｓ９についての部位枯渇アッセイ結果。（ｃ）ＰＡＭに代えて８つのランダム化ヌクレオチドを含有する２つのライブラリーのそれぞれについての野生型およびＫＫＨ ＳａＣａｓ９についてのＰＰＤＶの比較。 ３４Ａ－Ｅ：野生型およびＫＫＨ ＳａＣａｓ９についての部位枯渇アッセイ結果。（ｄ）ＰＡＭおよび全てのＰＡＭについての対応するＰＰＤＶ値は、野生型およびＫＫＨ ＳａＣａｓ９についてそれぞれ５倍超枯渇した。配列モチーフをＰＡＭについて２つのカテゴリーで示す：１）１０倍超または２）５～１０倍枯渇。（ｅ）ＰＡＭおよび全てのＰＡＭについての対応するＰＰＤＶ値は、野生型およびＫＫＨ ＳａＣａｓ９についてそれぞれ５倍超枯渇した。配列モチーフをＰＡＭについて２つのカテゴリーで示す：１）１０倍超または２）５～１０倍枯渇。 図３５Ａ－Ｄ：ＫＫＨ ＳａＣａｓ９により標的化される内在性部位の追加の特徴。（ａ）ＮＮＮＲＲＴ ＰＡＭの１６個の考えられるＮＲＲモチーフに基づきビン化された、５５個の内在性部位ｓｇＲＮＡのそれぞれについての活性。図２ａからの平均活性を、このならびにパネルｂおよびｃについて示す。（ｂ）スペーサーおよびＰＡＭのそれぞれの内在性遺伝子崩壊活性およびＧＣ含有率間の関係。 図３５Ａ－Ｄ：ＫＫＨ ＳａＣａｓ９により標的化される内在性部位の追加の特徴。（ｃ）スペーサーおよびＰＡＭのそれぞれの内在性遺伝子崩壊活性およびＧＣ含有率間の関係。（ｄ）活性に基づきビン化された標的部位のスペーサーおよびＰＡＭについての配列ロゴ。部位を平均突然変異頻度（図２ａからのもの）に基づき、低程度（０～１０％、１７個の部位）、中程度（１０～３０％、１７個の部位）、または高程度（＞３０％、２１個の部位）活性にグループ化した。 図３６Ａ－Ｂ：ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ実験についてのオンターゲットタグインテグレーションおよび突然変異誘発頻度。（ａ）平均ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑタグインテグレーション頻度を決定するための制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝３を表す（このおよびパネルｂについて）。 図３６Ａ－Ｂ：ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ実験についてのオンターゲットタグインテグレーションおよび突然変異誘発頻度。（ｂ）Ｔ７Ｅ１アッセイにより検出された平均突然変異誘発。 図３７Ａ－Ｂ：トランケートリピート：アンチリピートｓｇＲＮＡは、従来の結果（Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）と同様、全長ｓｇＲＮＡよりも優れている。（ａ）ＮＮＧＲＲＴ（配列番号４６）ＰＡＭを含有する４つの部位に対する野生型ＳａＣａｓ９についてのヒト細胞ＥＧＦＰ崩壊活性。ＥＧＦＰ崩壊活性をフローサイトメトリーにより定量し；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ、ｎ＝３を表し、バックグラウンドＥＧＦＰ損失の平均レベルを赤色破線により表す（このおよびパネルｂについて）。（ｂ）ＮＮＮＲＲＴ ＰＡＭを含有する８つの部位に対するＫＫＨ ＳａＣａｓ９についてのヒト細胞ＥＧＦＰ崩壊活性。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ゲノム編集に広く使用されるが１－４、Ｃａ
ｓ９が開裂し得る配列の範囲は、標的部位中の特異的プロトスペーサー隣接モチーフ（Ｐ
ＡＭ）についての必要性により拘束される５，６。例えば、最もロバストで、これまで広
く使用されるＣａｓ９のＳｐＣａｓ９は、主にＮＧＧ ＰＡＭを認識する。結果として、
種々のゲノム編集用途に必要な精度で二本鎖分解（ＤＳＢ）を標的化することが困難であ
り得ることが多い。さらに、Ｃａｓ９による不完全なＰＡＭ認識は、不所望なオフターゲ
ット突然変異の作出をもたらし得る７，８。意図的に変更または改善されたＰＡＭ特異性
を有するＣａｓ９誘導体を進化させる能力は、それらの制限に対処するが、本発明者らの
見識では、そのようなＣａｓ９バリアントは記載されていない。
伸長ＰＡＭを認識するオルソゴナルＣａｓ９の標的化範囲を改善するための潜在的方針
は、それらのＰＡＭ認識特異性を変更することである。本明細書に記載のとおり、ＳｐＣ
ａｓ９のＰＡＭ認識特異性は、構造ガイド設計および細菌細胞ベース選択系を用いて実施
される指向進化の組合せを使用して変更することができる；実施例１および２を参照され
たい。本明細書において、ＰＡＭ内のある位置についての緩和または部分的に緩和した特
異性を有するように進化させたバリアントも記載される；実施例３を参照されたい。これ
らのバリアントは、より長いＰＡＭ配列を規定するＣａｓ９オルソログの有用性を広げる
。
変更ＰＡＭ特異性を有する遺伝子操作Ｃａｓ９バリアント
本試験において遺伝子操作されたＳｐＣａｓ９バリアントは、野生型ＳｐＣａｓ９によ
りアクセス可能な部位を大幅に増加させ、これは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９プラットフォ
ームを使用して効率的なＨＤＲを実現する機会、ＮＨＥＪ媒介インデルを小さい遺伝子エ
レメントに標的化する機会、およびＰＡＭについての要求を活用して同一細胞中の２つの
異なるアレルを区別する機会をさらに向上させる。変更ＰＡＭ特異性のＳｐＣａｓ９バリ
アントは、現在、ゼブラフィッシュ胚およびヒト細胞中の両方でＳｐＣａｓ９により標的
化可能でない内在性遺伝子部位を効率的に崩壊させ得、それらは種々の異なる細胞タイプ
および生物中で機能することを示唆する。重要なことに、ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ実験は、Ｖ
ＱＲおよびＶＲＥＲ ＳｐＣａｓ９バリアントの全体プロファイルが、野生型ＳｐＣａｓ
９について観察されるものと類似し、またはそれよりも良好であることを示す。さらに、
本発明者らが同定および特徴付けした改善された特異性のＤ１１３５Ｅバリアントは、広
く使用される野生型ＳｐＣａｓ９の優れた代替物を提供する。Ｄ１１３５Ｅは、カノニカ
ルＮＧＧ ＰＡＭを有する部位に対して野生型ＳｐＣａｓ９と類似の活性を有するが、ミ
スマッチスペーサー配列およびカノニカルまたは非カノニカルＰＡＭのいずれかを担持す
るオフターゲット部位のゲノムワイド開裂を低減させる。
本明細書に記載のＳｐＣａｓ９およびＳａＣａｓ９バリアントの全ては、例えば、簡易
な部位特異的突然変異誘発により既存および広く使用されるベクター中に迅速に取り込む
ことでき、それらはＰＡＭ相互作用ドメイン内に含有される少数の突然変異のみを要求す
るため、バリアントはまた、ＳｐＣａｓ９プラットフォームの他の既に記載の改善ととも
に機能するはずである（例えば、トランケートｓｇＲＮＡ（Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎ
ａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３，１８７－１９７（２０１５）；Ｆｕ ｅｔ ａｌ．
，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２，２７９－２８４（２０１４））、ニッカーゼ突
然変異（Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，８３３－８３
８（２０１３）；Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５４，１３８０－１３８９（２０
１３））、二量体ＦｏｋＩ－ｄＣａｓ９融合物（Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎ
ａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２，５７７－５８２（２０１４）；Ｔｓａｉ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２，５６９－５７６（２０１４））。
本試験において進化させたＳｐＣａｓ９バリアントは、推定上、３番目のＰＡＭ塩基位
置に接触するＲ１３３５の突然変異を超え、ＳｐＣａｓ９－ＰＡＭ構造中の３番目のＰＡ
Ｍ位置への直接または間接的接触を作製するが、それら自体はＰＡＭ塩基との接触を媒介
しない残基付近またはそれに隣接して全てが局在するＤ１１３５、Ｇ１２１８、およびＴ
１３３７におけるアミノ酸置換を担持する（Ａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ
５１３，５６９－５７３（２０１４））（図２０ａ）。これと一致して、本発明者らは
、それらの位置における種々の突然変異が、ＮＧＧ ＰＡＭを担持する部位のＳｐＣａｓ
９媒介開裂に影響しないと考えられることを見出した（図２０ｂ）。これらの結果は、Ｖ
ＱＲおよびＶＲＥＲ ＳｐＣａｓ９バリアント中のＧ１２１８およびＴ１３３７における
アミノ酸置換の性質と一緒に、それらの２つの位置における変更が、機能獲得突然変異で
あり得ることを示唆する。例えば、Ｔ１３３７Ｒ突然変異が、特にＶＲＥＲバリアントの
場合、バックボーンまたはＰＡＭの４番目の位置付近もしくはそれへの塩基特異的接触を
形成していることが考えられる。Ｄ１１３５における突然変異の機序的役割は、不明確の
ままであるが、それらは、おそらく、ＰＡＭの３番目の位置のグアニンへの副溝を介する
水媒介接触の作製に関与する隣接Ｓ１１３６残基の活性に影響を及ぼし得る（Ａｎｄｅｒ
ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５１３，５６９－５７３（２０１４））。Ｄ１１３５
Ｅ突然変異は、このネットワークを崩壊させることにより特異性を改善し得、おそらく標
的部位とのＳｐＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の相互作用エネルギー全体を低減させ、本発明
者らが既に提案した機序は、エネルギー的に好ましくないそれらの不所望な配列の開裂を
作製することによりオフターゲット効果を低減させ得る（Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２，２７９－２８４（２０１４））。
本発明の結果は、変更ＰＡＭ特異性を有するＣａｓ９ヌクレアーゼの遺伝子操作の実行
可能性を明らかに確立する。既に記載されている追加のＣａｓ９オルソログの特徴付け（
Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０，１１１６－１１２１（２
０１３）；Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２
，２５７７－２５９０（２０１４））またはドメイン交換Ｃａｓ９キメラの生成（Ｎｉｓ
ｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１５６（５）：９３５－４９（２０１４））も
、異なるＰＡＭを標的化する潜在的な手法を提供する。本明細書に記載の遺伝子操作方針
は、そのようなオルソログまたは合成ハイブリッドＣａｓ９を用いて実施して標的化可能
なＰＡＭの範囲をさらに多様化させることもできる。Ｓｔ１Ｃａｓ９およびＳａＣａｓ９
は、ＳｐＣａｓ９に対するそれらの小さいサイズを考慮した将来の遺伝子操作の試行なら
びに本発明者らの細菌選択系およびヒト細胞中のそれらのロバストなゲノム編集活性の本
発明者らの実証のために特に魅力的なフレームワークをなす。
本発明者らの結果は、野生型ＳａＣａｓ９中のＲ１０１５が３番目のＰＡＭ位置のＧに
接触することを強く示唆した。理論により拘束されるものではないが、Ｒ１０１５Ｈ置換
は、この接触を除去し、３番目の位置における特異性を緩和させ得；しかしながら、Ｒ１
０１５のＧへの接触の損失はまた、標的部位結合に関連するエネルギーを認識可能に低減
させ得、それは、なぜＲ１０１５Ｈ突然変異単独が、ヒト細胞中のＮＮＮＲＲＴ部位にお
けるロバストな活性に十分でないかを説明し得る。Ｅ７８２ＫおよびＮ９６８Ｋ置換の両
方が陽性電荷を追加するため、それらは、ＤＮＡリン酸骨格との非特異的相互作用をなし
てＲ１０１５のグアニンへの接触の損失をエネルギー的に補い得ることが考えられる。
本明細書に記載の遺伝的アプローチは、構造情報を要求せず、したがって、多くの他の
Ｃａｓ９オルソログに適用可能であるはずである。拡大ＰＡＭ特異性を有するＣａｓ９ヌ
クレアーゼを進化させるための唯一の要求は、それらが細菌ベース選択において機能する
ことである。従来の研究が、高度に関連するＣａｓ９オルソログのＰＡＭ相互作用ドメイ
ンを交換することによりＰＡＭ認識を変更し得ることを実証した一方（Ｎｉｓｈｉｍａｓ
ｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１４））、依然として、この方針がより多様なオルソ
ログを使用する場合に一般化可能であり、または有効であるか否かを決定すべきである。
対照的に、本発明者らが本明細書に記載した進化方針は、天然Ｃａｓ９オルソログ内でコ
ードされるものを超えてＰＡＭ認識特異性を遺伝子操作するために使用することができる
。この全体方針は、天然に存在する多数のＣａｓ９オルソログの標的化範囲を広げ、その
有用性を拡張するために用いることができる。
変更特異性を有するＳｐＣａｓ９バリアント
したがって、本明細書において、ｓｐＣａｓ９バリアントが提供される。ＳｐＣａｓ９
野生型配列は、以下のとおりである。
Figure 2024123232000003
Figure 2024123232000004
本明細書に記載のＳｐＣａｓ９バリアントは、以下の位置：Ｄ１１３５、Ｇ１２１８、
Ｒ１３３５、Ｔ１３３７（またはそれらに相似する位置）の１つ以上における突然変異を
含み得る。一部の実施形態において、ＳｐＣａｓ９バリアントは、以下の突然変異：Ｄ１
１３５Ｖ；Ｄ１１３５Ｅ；Ｇ１２１８Ｒ；Ｒ１３３５Ｅ；Ｒ１３３５Ｑ；およびＴ１３３
７Ｒの１つ以上を含む。一部の実施形態において、ＳｐＣａｓ９は、配列番号１のアミノ
酸配列と少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、または９５％同一であ
り、例えば、保存的突然変異により置き換えられている、例えば、配列番号１の残基の最
大５％、１０％、１５％、または２０％における差異を有する。好ましい実施形態におい
て、バリアントは、親の所望の活性、例えば、ヌクレアーゼ活性（親がニッカーゼまたは
デッドＣａｓ９である場合を除外する）、ならびに／またはガイドＲＮＡおよび標的ＤＮ
Ａ）と相互作用する能力を保持する。
２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するため、最適な比較目的のために配列をア
ラインする（例えば、最適なアラインメントのため、ギャップを第１および第２のアミノ
酸または核酸配列の一方または両方の中に導入することができ、比較目的のために、非相
同配列を無視することができる）。比較目的のためにアラインされる参照配列の長さは、
参照配列の長さの少なくとも８０％であり、一部の実施形態において、少なくとも９０％
または１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置における
ヌクレオチドを比較する。第１の配列中のある位置が、第２の配列中の対応する位置と同
一のヌクレオチドにより占有される場合、その分子はその位置において同一である（本明
細書において使用される核酸「同一性」は、核酸「相同性」に相当する）。２つの配列間
の同一性パーセントは、それらの配列により共有される同一位置の数の関数であり、それ
ら２つの配列の最適なアラインメントのために導入が必要とされるギャップの数、および
それぞれのギャップの長さを考慮する。２つのポリペプチドまたは核酸配列間の同一性パ
ーセントは、当技術分野の技能の範囲内の種々の手段で、例えば、公的に入手可能なコン
ピュータソフトウェア、例えば、Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ（
Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．ａｎｄ Ｍ．Ｓ．Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉ
ｏｌ １４７：１９５－７）；ＧｅｎｅＭａｔｃｈｅｒ Ｐｌｕｓ（商標）に組み込まれ
た“ＢｅｓｔＦｉｔ”（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉ
ｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，４８２－４８９（１９８１））、Ｓｃｈ
ｗａｒｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆ（１９７９）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｏ．，Ｅｄ，ｐｐ ３
５３－３５８；ＢＬＡＳＴプログラム（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ
Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ；（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｗ．Ｇｉｓｈ，ｅｔ ａｌ．
（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３－１０）、ＢＬＡＳＴ－２、ＢＬＡ
ＳＴ－Ｐ、ＢＬＡＳＴ－Ｎ、ＢＬＡＳＴ－Ｘ、ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬ
ＩＧＮ－２、ＣＬＵＳＴＡＬ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア
を使用して決定する。さらに、当業者は、アラインメントを計測するための適切なパラメ
ータ、例として、比較される配列の長さにわたり最大アラインメントを達成するために必
要される任意のアルゴリズムを決定することができる。一般に、タンパク質または核酸に
ついて、比較の長さは、全長以下の任意の長さ（例えば、５％、１０％、２０％、３０％
、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％）であり
得る。本組成物および方法の目的のため、配列の全長の少なくとも８０％は、ＢＬＡＳＴ
アルゴリズムおよびデフォルトパラメータを使用してアラインする。
本発明の目的のため、２つの配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、Ｂ
ｌｏｓｓｕｍ ６２スコアリング行列をギャップペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルテ
ィ４、およびフレームシフトギャップペナルティ５で使用して達成することができる。
保存的置換としては、典型的には、以下の群：グリシン、アラニン；バリン、イソロイ
シン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、
トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン内の置換が挙げら
れる。
一部の実施形態において、ＳｐＣａｓ９バリアントは、以下の突然変異の組：Ｄ１１３
５Ｖ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ
／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｅ／Ｒ１３３５Ｑ／
Ｔ１３３７Ｒ（ＥＱＲバリアント）；またはＤ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｅ
／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＥＲバリアント）の１つを含む。
一部の実施形態において、ＳｐＣａｓ９バリアントは、タンパク質のヌクレアーゼ部分
を触媒的に不活性にするため、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を低減させ、または破壊する
以下の突然変異：Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｄ８３９、Ｈ９８３、またはＤ９８６およびＨ８４
０またはＮ８６３の１つ、例えば、Ｄ１０Ａ／Ｄ１０ＮおよびＨ８４０Ａ／Ｈ８４０Ｎ／
Ｈ８４０Ｙも含み；それらの位置における置換は、アラニン（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ａｌ
．，Ｃｅｌｌ １５６，９３５－９４９（２０１４）におけるとおり）、または他の残基
、例えば、グルタミン、アスパラギン、チロシン、セリン、またはアスパラギン酸、例え
ば、Ｅ７６２Ｑ、Ｈ９８３Ｎ、Ｈ９８３Ｙ、Ｄ９８６Ｎ、Ｎ８６３Ｄ、Ｎ８６３Ｓ、また
はＮ８６３Ｈであり得る（国際公開第２０１４／１５２４３２号パンフレット参照）。一
部の実施形態において、バリアントは、Ｄ１０ＡまたはＨ８４０Ａ（一本鎖ニッカーゼを
作出する）における突然変異、またはＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａ（ヌクレアーゼ活性を解
消する；この突然変異体は、デッドＣａｓ９またはｄＣａｓ９として公知である）におけ
る突然変異を含む。
本明細書において、ＳａＣａｓ９バリアントも提供される。ＳａＣａｓ９野生型配列は
、以下のとおりである。
Figure 2024123232000005
Figure 2024123232000006
本明細書に記載のＳａＣａｓ９バリアントは、以下の位置：Ｅ７８２、Ｎ９６８、およ
び／またはＲ１０１５（またはそれらに相似する位置）の１つ以上における突然変異を含
む。一部の実施形態において、バリアントは、以下の突然変異：Ｒ１０１５Ｑ、Ｒ１０１
５Ｈ、Ｅ７８２Ｋ、Ｎ９６８Ｋ、Ｅ７３５Ｋ、Ｋ９２９Ｒ、Ａ１０２１Ｔ、Ｋ１０４４Ｎ
の１つ以上を含む。一部の実施形態において、ＳａＣａｓ９バリアントは、突然変異Ｅ７
８２Ｋ、Ｋ９２９Ｒ、Ｎ９６８Ｋ、およびＲ１０１５Ｘ（Ｘは、Ｒ以外の任意のアミノ酸
である）を含む。一部の実施形態において、ＳａＣａｓ９バリアントは、配列番号２のア
ミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、または９５％同一
であり、例えば、保存的突然変異により置き換えられている、例えば、配列番号２の残基
の最大５％、１０％、１５％、または２０％における差異を有する。好ましい実施形態に
おいて、バリアントは、親の所望の活性、例えば、ヌクレアーゼ活性（親がニッカーゼま
たはデッドＣａｓ９である場合を除外する）、ならびに／またはガイドＲＮＡおよび標的
ＤＮＡ）と相互作用する能力を保持する。
一部の実施形態において、ＳａＣａｓ９バリアントは、タンパク質のヌクレアーゼ部分
を触媒的に不活性にするため、ＳａＣａｓ９のヌクレアーゼ活性を低減させ、または破壊
し得る以下の突然変異：Ｄ１０Ａ、Ｄ５５６Ａ、Ｈ５５７Ａ、Ｎ５８０Ａ、例えば、Ｄ１
０Ａ／Ｈ５５７Ａおよび／またはＤ１０Ａ／Ｄ５５６Ａ／Ｈ５５７Ａ／Ｎ５８０Ａも含み
；それらの位置における置換は、アラニン（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １
５６，９３５－９４９（２０１４）におけるとおり）、または他の残基、例えば、グルタ
ミン、アスパラギン、チロシン、セリン、またはアスパラギン酸であり得る。一部の実施
形態において、バリアントは、Ｄ１０Ａ、Ｄ５５６Ａ、Ｈ５５７Ａ、またはＮ５８０Ａ（
一本鎖ニッカーゼを作出し得る）における突然変異、またはＤ１０Ａ／Ｈ５５７Ａおよび
／もしくはＤ１０Ａ／Ｄ５５６Ａ／Ｈ５５７Ａ／Ｎ５８０Ａ（ＳｐＣａｓ９と同様にヌク
レアーゼ活性を解消し得；それらは、デッドＣａｓ９またはｄＣａｓ９と称される）にお
ける突然変異を含む。
本明細書において、任意選択的に、バリアントタンパク質の発現のための１つ以上の調
節ドメインに作動可能に結合されているＳｐＣａｓ９および／またはＳａＣａｓ９バリア
ントをコードする単離核酸、単離核酸を含むベクター、ならびにその核酸を含み、および
任意選択的にバリアントタンパク質を発現する宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞も提
供される。
本明細書に記載のバリアントは、細胞のゲノムを変更するために使用することができ；
本方法は、一般に、細胞中でバリアントタンパク質を、細胞のゲノムの選択部分に相補的
な領域を有するガイドＲＮＡとともに発現させることを含む。細胞のゲノムを選択的に変
更する方法は、当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第８，６９７，３５９
号明細書；米国特許出願公開第２０１０／００７６０５７号明細書；米国特許出願公開第
２０１１／０１８９７７６号明細書；米国特許出願公開第２０１１／０２２３６３８号明
細書；米国特許出願公開第２０１３／０１３０２４８号明細書；国際公開第２００８／１
０８９８９号パンフレット；国際公開第２０１０／０５４１０８号パンフレット；国際公
開第２０１２／１６４５６５号パンフレット；国際公開第２０１３／０９８２４４号パン
フレット；国際公開第２０１３／１７６７７２号パンフレット；；；米国特許出願公開第
２０１５００５０６９９号明細書；米国特許出願公開第２０１５００４５５４６号明細書
；米国特許出願公開第２０１５００３１１３４号明細書；米国特許出願公開第２０１５０
０２４５００号明細書；米国特許出願公開第２０１４０３７７８６８号明細書；米国特許
出願公開第２０１４０３５７５３０号明細書；米国特許出願公開第２０１４０３４９４０
０号明細書；米国特許出願公開第２０１４０３３５６２０号明細書；米国特許出願公開第
２０１４０３３５０６３号明細書；米国特許出願公開第２０１４０３１５９８５号明細書
；米国特許出願公開第２０１４０３１０８３０号明細書；米国特許出願公開第２０１４０
３１０８２８号明細書；米国特許出願公開第２０１４０３０９４８７号明細書；米国特許
出願公開第２０１４０３０４８５３号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２９８５４
７号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２９５５５６号明細書；米国特許出願公開第
２０１４０２９４７７３号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２８７９３８号明細書
；米国特許出願公開第２０１４０２７３２３４号明細書；米国特許出願公開第２０１４０
２７３２３２号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２７３２３１号明細書；米国特許
出願公開第２０１４０２７３２３０号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２７１９８
７号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２５６０４６号明細書；米国特許出願公開第
２０１４０２４８７０２号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２４２７０２号明細書
；米国特許出願公開第２０１４０２４２７００号明細書；米国特許出願公開第２０１４０
２４２６９９号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２４２６６４号明細書；米国特許
出願公開第２０１４０２３４９７２号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２２７７８
７号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２１２８６９号明細書；米国特許出願公開第
２０１４０２０１８５７号明細書；米国特許出願公開第２０１４０１９９７６７号明細書
；米国特許出願公開第２０１４０１８９８９６号明細書；米国特許出願公開第２０１４０
１８６９５８号明細書；米国特許出願公開第２０１４０１８６９１９号明細書；米国特許
出願公開第２０１４０１８６８４３号明細書；米国特許出願公開第２０１４０１７９７７
０号明細書；米国特許出願公開第２０１４０１７９００６号明細書；米国特許出願公開第
２０１４０１７０７５３号明細書；Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｖｏｌｕｔｉ
ｏｎ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ
ｓｙｓｔｅｍｓ”９（６）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
４６７－４７７（１－２３）（Ｊｕｎ．２０１１）；Ｗｉｅｄｅｎｈｅｆｔ ｅｔ ａｌ
．，“ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍｓ
ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ａｒｃｈａｅａ”４８２ Ｎａｔｕｒｅ ３３１－３
３８（Ｆｅｂ．１６，２０１２）；Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｃａｓ９－ｃｒ
ＲＮＡ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｓ
ｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ ｆｏｒ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉ
ｔｙ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ”１０９（３９）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ Ｅ２５７９－
Ｅ２５８６（Ｓｅｐ．４，２０１２）；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｐｒｏｇｒａ
ｍｍａｂｌｅ Ｄｕａｌ－ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ
ｉｎ Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ”３３７ Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ８１６－８２１（Ａｕｇ．１７，２０１２）；Ｃａｒｒｏｌｌ，“Ａ ＣＲＩＳＰ
Ｒ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ”２０（９）Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １６５８－１６６０（Ｓｅｐ．２０１２）；２０１２年５月２
５日に出願された米国特許出願第６１／６５２，０８６号明細書；Ａｌ－Ａｔｔａｒ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈ
ｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲｓ）：Ｔｈｅ Ｈａｌ
ｌｍａｒｋ ｏｆ ａｎ Ｉｎｇｅｎｉｏｕｓ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｄｅｆｅｎｓｅ
Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ，Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（２０１１
）ｖｏｌ．３９２，Ｉｓｓｕｅ ４，ｐｐ．２７７－２８９；Ｈａｌｅ ｅｔ ａｌ．，
Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｆｅａｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｒａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ｏ
ｆ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡｓ Ｔｈａｔ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｃａｓ
ＲＡＭＰ Ｍｏｄｕｌｅ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｔｏ Ｃｌｅａｖｅ ＲＮＡｓ，Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，（２０１２）ｖｏｌ．４５，Ｉｓｓｕｅ ３，２９２－３０２を
参照されたい。
本明細書に記載のバリアントタンパク質は、上記の参照文献に記載のＳｐＣａｓ９タン
パク質に代えて、以下の表４によるＰＡＭ配列を有する配列を標的化するガイドＲＮＡと
ともに使用することができる。
Figure 2024123232000007
さらに、本明細書に記載のバリアントは、当技術分野において公知の野生型Ｃａｓ９ま
たは他のＣａｓ９突然変異（例えば、上記のｄＣａｓ９またはＣａｓ９ニッカーゼ）に代
えて融合タンパク質、例えば、国際公開第２０１４／１２４２８４号パンフレットに記載
の異種機能ドメインを有する融合タンパク質中で使用することができる。例えば、バリア
ント、好ましくは、１つ以上のヌクレアーゼ低減または殺傷突然変異を含むバリアントを
Ｃａｓ９のＮまたはＣ末端上で、転写活性化ドメインまたは他の異種機能ドメイン（例え
ば、転写リプレッサー（例えば、ＫＲＡＢ、ＥＲＤ、ＳＩＤなど、例えば、ｅｔｓ２リプ
レッサー因子（ＥＲＦ）リプレッサードメイン（ＥＲＤ）のアミノ酸４７３～５３０、Ｋ
ＯＸ１のＫＲＡＢドメインのアミノ酸１～９７、またはＭａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメ
イン（ＳＩＤ）のアミノ酸１～３６；Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ
９５：１４６２８－１４６３３（１９９８）参照）またはサイレンサー、例えば、ヘテロ
クロマチンタンパク質１（ＨＰ１、ｓｗｉ６としても公知）、例えば、ＨＰ１αまたはＨ
Ｐ１β；固定ＲＮＡ結合配列に融合している長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）をリク
ルートし得るタンパク質またはペプチド、例えば、ＭＳ２コートタンパク質、エンドリボ
ヌクレアーゼＣｓｙ４、またはラムダＮタンパク質により結合されるものに融合させるこ
とができ；当技術分野において公知のＤＮＡのメチル化状態を改変する酵素（例えば、Ｄ
ＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）またはＴＥＴタンパク質）；またはヒストン
サブユニットを改変する酵素（例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）
、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（例えば、
リジンまたはアルギニン残基のメチル化のため）またはヒストンデメチラーゼ（例えば、
リジンまたはアルギニン残基の脱メチル化のため））を使用することもできる。多数のこ
のようなドメインの配列、例えば、ＤＮＡ中のメチル化シトシンのヒドロキシル化を触媒
するドメインが当技術分野において公知である。例示的なタンパク質としては、テンイレ
ブントランスロケーション（Ｔｅｎ－Ｅｌｅｖｅｎ－Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）（Ｔ
ＥＴ）１～３ファミリー、ＤＮＡ中の５－メチルシトシン（５－ｍＣ）を５－ヒドロキシ
メチルシトシン（５－ｈｍＣ）に変換する酵素が挙げられる。
ヒトＴＥＴ１～３配列は当技術分野において公知であり、それを以下の表に示す。
Figure 2024123232000008
一部の実施形態において、触媒ドメインの全長配列の全部または一部、例えば、システ
インリッチ伸長部および７つの高度に保存されるエキソンによりコードされる２ＯＧＦｅ
ＤＯドメイン、例えば、アミノ酸１５８０～２０５２を含むＴｅｔ１触媒ドメイン、アミ
ノ酸１２９０～１９０５を含むＴｅｔ２、およびアミノ酸９６６～１６７８を含むＴｅｔ
３を含む触媒モジュールを含めることができる。３つ全てのＴｅｔタンパク質中のキー触
媒残基を説明するアラインメント、および全長配列についてのその補助材料については、
例えば、Ｉｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ．２００９ Ｊｕｎ １；８（
１１）：１６９８－７１０．Ｅｐｕｂ ２００９ Ｊｕｎ ２７の図１を参照されたい（
例えば、ｓｅｑ ２ｃ参照）；一部の実施形態において、配列は、Ｔｅｔ１のアミノ酸１
４１８～２１３６またはＴｅｔ２／３中の対応領域を含む。
他の触媒モジュールは、Ｉｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９において同定されたタンパ
ク質からのものであり得る。
一部の実施形態において、異種機能ドメインは、生物学的係留物であり、ＭＳ２コート
タンパク質、エンドリボヌクレアーゼＣｓｙ４、またはラムダＮタンパク質の全部または
一部（例えば、それからのＤＮＡ結合ドメイン）を含む。これらのタンパク質は、特異的
ステム－ループ構造を含有するＲＮＡ分子をｄＣａｓ９ ｇＲＮＡ標的化配列により規定
される場所にリクルートするための使用することができる。例えば、ＭＳ２コートタンパ
ク質、エンドリボヌクレアーゼＣｓｙ４、またはラムダＮに融合しているｄＣａｓ９バリ
アントは、Ｃｓｙ４、ＭＳ２またはラムダＮ結合配列に結合している長鎖非コードＲＮＡ
（ｌｎｃＲＮＡ）、例えば、ＸＩＳＴまたはＨＯＴＡＩＲをリクルートするために使用す
ることができる；例えば、Ｋｅｒｙｅｒ－Ｂｉｂｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｅ
ｌｌ １００：１２５－１３８（２００８）を参照されたい。あるいは、Ｃｓｙ４、ＭＳ
２またはラムダＮタンパク質結合配列は、例えば、Ｋｅｒｙｅｒ－Ｂｉｂｅｎｓ ｅｔ
ａｌ．，前掲に記載のとおり、別のタンパク質に結合させることができ、本明細書に記載
の方法および組成物を使用してタンパク質をｄＣａｓ９バリアント結合部位に標的化させ
ることができる。一部の実施形態において、Ｃｓｙ４は、触媒的に不活性である。一部の
実施形態において、Ｃａｓ９バリアント、好ましくは、ｄＣａｓ９バリアントは、国際公
開第２０１４／２０４５７８号パンフレットに記載のとおり、ＦｏｋＩに融合している。
一部の実施形態において、融合タンパク質は、ｄＣａｓ９バリアントおよび異種機能ド
メイン間のリンカーを含む。これらの融合タンパク質中（または連結構造の融合タンパク
質間）で使用することができるリンカーは、融合タンパク質の機能を妨害しない任意の配
列を含み得る。好ましい実施形態において、リンカーは、短鎖であり、例えば、２～２０
アミノ酸であり、典型的には、フレキシブルである（すなわち、高い自由度を有するアミ
ノ酸、例えば、グリシン、アラニン、およびセリンを含む）。一部の実施形態において、
リンカーは、ＧＧＧＳ（配列番号１８８）またはＧＧＧＧＳ（配列番号１８９）からなる
１つ以上の単位、例えば、ＧＧＧＳ（配列番号１８８）またはＧＧＧＧＳ（配列番号１８
９）単位の２、３、４つ、またはそれより多いリピートを含む。他のリンカー配列を使用
することもできる。
発現系
本明細書に記載のＣａｓ９バリアントを使用するため、それらをコードする核酸からそ
れらを発現させることが望ましいことがある。これは、種々の手段で実施することができ
る。例えば、Ｃａｓ９バリアントをコードする核酸を、複製および／または発現のための
原核または真核細胞中への形質転換のための中間ベクター中にクローニングすることがで
きる。中間ベクターは、典型的には、Ｃａｓ９バリアントの産生のためのＣａｓ９バリア
ントをコードする核酸の貯蔵または操作のための原核生物ベクター、例えば、プラスミド
、もしくはシャトルベクター、または昆虫ベクターである。Ｃａｓ９バリアントをコード
する核酸は、植物細胞、動物細胞、好ましくは、哺乳動物細胞もしくはヒト細胞、真菌細
胞、細菌細胞、または原虫細胞への投与のための発現ベクター中にクローニングすること
もできる。
発現を得るため、Ｃａｓ９バリアントをコードする配列は、典型的には、転写を指向す
るためのプロモーターを含有する発現ベクター中にサブクローニングする。好適な細菌お
よび真核生物プロモーターは、当技術分野において周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ（３ｄ ｅｄ．２００１）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅ
ｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９
０）；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，２０１０）に記載されている。遺
伝子操作タンパク質を発現させるための細菌発現系は、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）
、バシラス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、およびサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ）において利用可能である（Ｐａｌｖａ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ ２２
：２２９－２３５）。このような発現系のためのキットは、市販されている。哺乳動物細
胞、酵母、および昆虫細胞のための真核生物発現系も、当技術分野において周知であり、
それらも市販されている。
核酸の発現を指向するために使用されるプロモーターは、特定の用途に依存する。例え
ば、強力な構成的プロモーターは、典型的には、融合タンパク質の発現および精製に使用
される。対照的に、Ｃａｓ９バリアントを遺伝子調節のためにインビボ投与すべき場合、
Ｃａｓ９バリアントの特定の使用に応じて構成的または誘導性プロモーターのいずれかを
使用することができる。さらに、Ｃａｓ９バリアントの投与に好ましいプロモーターは、
弱いプロモーター、例えば、ＨＳＶ ＴＫまたは類似の活性を有するプロモーターであり
得る。プロモーターは、トランス活性化に応答性であるエレメント、例えば、低酸素症応
答エレメント、Ｇａｌ４応答エレメント、ｌａｃリプレッサー応答エレメント、ならびに
小分子制御系、例えば、テトラサイクリン調節系およびＲＵ－４８６系も含み得る（例え
ば、Ｇｏｓｓｅｎ＆Ｂｕｊａｒｄ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，８９：５５４７；Ｏｌｉｇｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅ
ｒ．，５：４９１－４９６；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．
，４：４３２－４４１；Ｎｅｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｌｏｏｄ，８８：
１１４７－５５；およびＲｅｎｄａｈｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌ．，１６：７５７－７６１参照）。

プロモーターに加え、発現ベクターは、典型的には、原核生物または真核生物のいずれ
であれ、宿主細胞中の核酸の発現に要求される全ての追加のエレメントを含有する転写単
位または発現カセットを含有する。したがって、典型的な発現カセットは、例えば、Ｃａ
ｓ９バリアントをコードする核酸配列に作動可能に結合しているプロモーター、および例
えば、転写物の効率的なポリアデニル化、転写終結、リボソーム結合部位、または翻訳終
結に要求される任意のシグナルを含有する。カセットの追加のエレメントとしては、例え
ば、エンハンサー、および異種スプライシングイントロンシグナルを挙げることができる
。

遺伝子情報を細胞中に輸送するために使用される特定の発現ベクターは、Ｃａｓ９バリ
アントの目的の使用、例えば、植物、動物、細菌、真菌、原生動物中などでの発現に関し
て選択される。標準的な細菌発現ベクターとしては、ｐＢＲ３２２ベースのプラスミド、
ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄなどのプラスミド、ならびに市販のタグ融合発現系、例えば、Ｇ
ＳＴおよびＬａｃＺが挙げられる。

真核発現ベクターでは、真核生物ウイルスからの調節エレメントを含有する発現ベクタ
ー、例えば、ＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクター、およびエプスタイン・バ
ーウイルス由来のベクターを使用することが多い。他の例示的な真核生物ベクターとして
は、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ－５、バキュ
ロウイルスｐＤＳＶＥ、およびＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、
メタロチオネインプロモーター、ネズミ乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイ
ルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーターまたは真核細胞中での発現に有効であるこ
とが示されている他のプロモーターの指向下でタンパク質の発現を可能とする他の任意の
ベクターが挙げられる。

Ｃａｓ９バリアントを発現させるためのベクターは、ガイドＲＮＡの発現を駆動するＲ
ＮＡ ＰｏｌＩＩＩプロモーター、例えば、Ｈ１、Ｕ６または７ＳＫプロモーターを含み
得る。これらのヒトプロモーターは、プラスミド形質移入後に哺乳動物細胞中でのＣａｓ
９バリアントの発現を可能とする。

一部の発現系は、安定的に形質移入された細胞系を選択するためのマーカー、例えばチ
ミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、およびジヒドロ葉酸レ
ダクターゼを有する。高収率の発現系、例えば、バキュロウイルスベクターを昆虫細胞中
で、ポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイルスプロモーターの指向下
でｇＲＮＡコード配列とともに使用するものも好適である。

発現ベクター中に典型的に含まれるエレメントとしては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で
機能するレプリコン、組換えプラスミドを保有する細菌の選択を可能にする抗生物質耐性
をコードする遺伝子、および組換え配列の挿入を可能にするためのプラスミドの非必須領
域中のユニーク制限部位も挙げられる。

標準的な形質移入法を使用して大量のタンパク質を発現する細菌、哺乳動物、酵母また
は昆虫の細胞系を産生し、次いで標準的な技術を用いてそのタンパク質を精製する（例え
ば、Ｃｏｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１７
６１９－２２；Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｉｎ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８２（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，
ｅｄ．，１９９０）参照）。真核および原核細胞の形質転換は、標準的な技術に従って実
施する（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９７７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３２：３４
９－３５１；Ｃｌａｒｋ－Ｃｕｒｔｉｓｓ＆Ｃｕｒｔｉｓｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：３４７－３６２（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，１９８３
参照）。

宿主細胞内に外来ヌクレオチド配列を導入する公知の手順のいずれかを使用することが
できる。このような方法としては、リン酸カルシウム形質移入、ポリブレン、プロトプラ
スト融合、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リポソーム、マイクロイン
ジェクション、ネイキッドＤＮＡ、プラスミドベクター、ウイルスベクター（エピソーム
型および組込み型の両方）およびクローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮ
Ａまたは他の外来遺伝子材料を宿主細胞内に導入する他の周知の方法のいずれかの使用が
挙げられる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，前掲参照）。唯一必要なことは
、使用される特定の遺伝子操作手順が、Ｃａｓ９バリアントを発現し得る宿主細胞内に少
なくとも１つの遺伝子を良好に導入し得ることである。
本発明は、ベクターおよびベクターを含む細胞を含む。

本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、それらの実施例は特許請求の範囲に
記載の本発明の範囲を限定するものではない。
方法
実施例１および２では、以下の材料および方法を使用した。
プラスミドおよびオリゴヌクレオチド
本試験において使用される親構築物についての概略図およびＤＮＡ配列は、図５Ａ～Ｊ
および配列番号７～２０に見出すことができる。陽性選択プラスミド、陰性選択プラスミ
ド、および部位枯渇ライブラリーを生成するために使用されるオリゴヌクレオチドの配列
は、表１において入手可能である。本試験における全てのｇＲＮＡ標的の配列は、表２に
おいて入手可能である。Ｃａｓ９中の点突然変異は、ＰＣＲにより生成した。
Figure 2024123232000009
Figure 2024123232000010
Figure 2024123232000011
Figure 2024123232000012
Figure 2024123232000013
Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡを別個に発現させるための２つのＴ７プロモーターを有する
細菌Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ発現プラスミドを構築した。これらのプラスミドは、化膿性連
鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）についてのＣａｓ９（ＢＰＫ７６４、ＪＤＳ２４６から
サブクローニングされたＳｐＣａｓ９配列１７）、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座１からのＳ．サ
ーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９についてのＣａｓ９（ＭＳＰ１
６７３、既に公開された記載から改変されたＳｔ１Ｃａｓ９配列２０）、および黄色ブド
ウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）についてのＣａｓ９（ＢＰＫ２１０１、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｊ
７ＲＵＡ５からコドン最適化されたＳａＣａｓ９配列）のヒトコドン最適化バージョンを
コードする。ＳｐＣａｓ９３４，３５およびＳｔ１Ｃａｓ９２０については、既に記載さ
れているｓｇＲＮＡ配列を利用した一方、ＳａＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ配列は、ＣＲＩＳＰ
Ｒｆｉｎｄｅｒを使用するｃｒＲＮＡリピートについてのＥｕｒｏｐｅａｎ Ｎｕｃｌｅ
ｏｔｉｄｅ Ａｒｃｈｉｖｅ配列ＨＥ９８０４５０の検索、および既に記載されているも
のと同様の生物情報学的アプローチを使用するｔｒａｃｒＲＮＡの同定により決定した３
６。ｓｇＲＮＡのスペーサー相補性領域を完成させるためにアニールされるオリゴをＢｓ
ａＩ切断ＢＰＫ７６４およびＢＰＫ２１０１、またはＢｓｐＭＩ切断ＭＳＰ１６７３中に
ライゲートした（５’－ＡＴＡＧをスペーサーに付加してトップオリゴを生成し、５’－
ＡＡＡＣをスペーサー配列の逆相補鎖に付加してボトムオリゴを生成する）。
Ｍｕｔａｚｙｍｅ ＩＩ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＳ
ｐＣａｓ９の残基１０９７～１３６８を約５．２個の置換／キロベースの率においてラン
ダムに突然変異させて突然変異ＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインライブラリーを生成した
。それぞれのＰＩドメインライブラリーの理論複雑度は、得られた形質転換体の数に基づ
き１０７個超のクローンであると推定された。陽性および陰性選択プラスミドは、Ｘｂａ
Ｉ／ＳｐｈＩまたはＥｃｏＲＩ／ＳｐｈＩ切断ｐ１１－ｌａｃＹ－ｗｔｘ１１７中にアニ
ールされる標的部位オリゴをそれぞれライゲートすることにより生成した。
２つのランダム化ＰＡＭライブラリー（それぞれ異なるプロトスペーサー配列を有する
）は、クレノウ（－エキソ）を使用して構築し、プロトスペーサーの３’末端に直接隣接
する６つのランダム化ヌクレオチドを含有するオリゴのボトム鎖をフィルインした（表１
参照）。二本鎖産物をＥｃｏＲＩにより切断し、切断ｐ１１－ｌａｃＹ－ｗｔｘ１中への
ライゲーションのためのＥｃｏＲＩ／ＳｐｈＩ末端を残した。それぞれのランダム化ＰＡ
Ｍライブラリーの理論複雑度は、得られた形質転換体の数に基づき１０６個超であること
が推定された。
ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９バリアントは、ＪＤＳ２４６１６に由来するベクター
からヒト細胞中で発現させた。Ｓｔ１Ｃａｓ９およびＳａＣａｓ９について、ＭＳＰ１６
７３およびＢＰＫ２１０１からのＣａｓ９ ＯＲＦをＣＡＧプロモーターベクター中にサ
ブクローニングして、それぞれＭＳＰ１５９４およびＢＰＫ２１３９を生成した。ｓｇＲ
ＮＡのＵ６発現のためのプラスミド（その中に、所望のスペーサーオリゴをクローニング
することができる）は、ＳｐＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ（ＢＰＫ１５２０）、Ｓｔ１Ｃａｓ９
ｓｇＲＮＡ（ＢＰＫ２３０１）、およびＳａＣａｓ９ ｇＲＮＡ（ＶＶＴ１）について
上記のｓｇＲＮＡ配列を使用して生成した。ｓｇＲＮＡのスペーサー相補性領域を完成さ
せるためにアニールされるオリゴをそれらのベクターのＢｓｍＢＩオーバーハング中にラ
イゲートした（５’－ＣＡＣＣをスペーサーに付加してトップオリゴを生成し、５’－Ａ
ＡＡＣをスペーサー配列の逆相補鎖に付加してボトムオリゴを生成する）。
ＳｐＣａｓ９バリアントを進化させるための細菌ベース陽性選択アッセイ
陽性選択プラスミド（標的部位が埋め込まれた）を含有するコンピテント大腸菌（Ｅ．
ｃｏｌｉ）ＢＷ２５１４１（λＤＥ３）２３をＣａｓ９／ｓｇＲＮＡコードプラスミドに
より形質転換した。ＳＯＢ培地中の６０分間のリカバリー後、クロラムフェニコール（非
選択）またはクロラムフェニコール＋１０ｍＭのアラビノース（選択）のいずれかを含有
するＬＢ培地上で形質転換物をプレーティングした。陽性選択プラスミドの開裂は、生存
頻度：選択プレート上のコロニー／非選択プレート上のコロニーを計算することにより推
定した（図１２も参照）。
新規ＰＡＭを開裂し得るＳｐＣａｓ９バリアントについて選択するため、標的部位＋目
的のＰＡＭをコードする陽性選択プラスミドを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＷ２５
１４１（λＤＥ３）細胞中に、ＰＩドメイン突然変異Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡプラスミドラ
イブラリーをエレクトロポレートした。一般に、約５０，０００個のクローンをスクリー
ニングして５０～１００個の生存物を得た。生存クローンのＰＩドメインをフレッシュな
バックボーンプラスミド中にサブクローニングし、陽性選択において再試験した。活性に
ついてのこの第２のスクリーンにおいて１０％超の生存率を有したクローンをシーケンシ
ングした。シーケンシングされたクローン中で観察された突然変異を、生存クローン中の
それらの頻度、置換のタイプ、ＳｐＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ結晶構造（ＰＤＢ：４ＵＮ３）
１４中のＰＡＭ塩基への近接性、および（一部の場合）ヒト細胞ベースＥＧＦＰ崩壊アッ
セイにおける活性に基づきさらなる評価のために選択した。
Ｃａｓ９ＰＡＭ特異性をプロファイルするための細菌ベース部位枯渇アッセイ
Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ発現プラスミドを含有するコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）
ＢＷ２５１４１（λＤＥ３）を、開裂性または非開裂性標的部位を保有する陰性選択プラ
スミドにより形質転換した。ＳＯＢ培地中の６０分間のリカバリー後、クロラムフェニコ
ール＋カルベニシリンを含有するＬＢ培地上で形質転換物をプレーティングした。陰性選
択プラスミドの開裂は、形質転換されたＤＮＡ１μｇ当たりのコロニー形成単位を計算す
ることにより推定した（図１３も参照）。
陰性選択は、適切なＣａｓ９／ｓｇＲＮＡプラスミドを既に保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）ＢＷ２５１４１（λＤＥ３）細胞中にそれぞれのランダム化ＰＡＭライブラリーを
エレクトロポレートすることにより、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＰＡＭ特異性プロファイル
を決定するように適合させた。８０，０００～１００，０００個のコロニーをＬＢ＋クロ
ラムフェニコール＋カルベニシリンプレート上で低密度スプレッドにおいてプレーティン
グした。Ｃａｓ９による開裂が生じない陰性選択プラスミドを含有する生存コロニーをハ
ーベストし、プラスミドＤＮＡをマキシプレップ（Ｑｉａｇｅｎ）により単離した。得ら
れたプラスミドライブラリーは、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ－ｓｔａｒｔ Ｆｌｅｘ ＤＮ
Ａ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）使用するＰＣＲ
と、それに続くＡｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＸＰクリーンアップステップ（Ｂｅ
ｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）とにより増幅した。それぞれの部位枯
渇実験についての約５００ｎｇのクリーンＰＣＲ産物から、ＫＡＰＡ ＨＴＰライブラリ
ー調製キット（ＫＡＰＡ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を使用して二重インデックス化Ｔｒｕ
－Ｓｅｑ Ｉｌｌｕｍｉｎａディープシーケンシングライブラリーを調製した。Ｄａｎａ
－Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ Ｃｏｒｅにより、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ上で１５０
ｂｐペアドエンドシーケンシングが実施された。
それぞれのＭｉＳｅｑランについて出力された未処理ＦＡＳＴＱファイルをＰｙｔｈｏ
ｎプログラムにより分析して相対ＰＡＭ枯渇を決定した。プログラム（方法参照）は、以
下のとおり作動する：第１に、所与の実験についての全てのＦＡＳＴＱリードファイルを
選択することができるファイルダイアログを使用者に提示する。これらのファイルについ
て、それぞれのＦＡＳＴＱエントリーを両方の鎖上の固定スペーサー領域についてスキャ
ンする。スペーサー領域が見出される場合、スペーサー領域をフランキングする６つの変
動ヌクレオチドを捕捉し、カウンタに付加する。この検出された変動領域の組から、それ
ぞれの考えられる位置における長さ２～６ｎｔのそれぞれのウインドウのカウントおよび
頻度を一覧にした。両方のランダム化ＰＡＭライブラリーについての部位枯渇データは、
選択後ＰＡＭ枯渇値（ＰＰＤＶ）：選択集団におけるＰＡＭの選択後頻度を、そのＰＡＭ
の選択前ライブラリー頻度により除したものを計算することにより分析した。ＰＰＤＶ分
析は、６ｂｐランダム化領域中の全ての考えられる２～６長のウインドウにわたるそれぞ
れの実験について実施した。ＰＡＭ優先性を可視化するために本発明者らが使用したウイ
ンドウは、野生型およびバリアントＳｐＣａｓ９実験についての２番目、３番目、および
４番目のＰＡＭ位置を表す３ｎｔウインドウ、ならびにＳｔ１Ｃａｓ９およびＳａＣａｓ
９についての３番目、４番目、５番目、６番目のＰＡＭ位置を表す４ｎｔウインドウであ
った。
ＰＰＤＶについての２つの有意性閾値は、１）ｄＣａｓ９対選択前ライブラリー対数リ
ードカウント比の分布に基づく統計的有意性閾値（図１３ｃおよび１３ｄ参照）、ならび
に２）ヒト細胞における枯渇値および活性間の経験的相関に基づく生物学的活性閾値に基
づき決定した。統計的閾値は、ｄＣａｓ９についての平均ＰＰＤＶからの３．３６標準偏
差（０．８５の相対ＰＰＤＶに相当）において設定し、それは多重比較のための調整後の
０．０５の正規分布両側ｐ値に対応する（すなわち、ｐ＝０．０５／６４）。生物学的活
性閾値は、５倍枯渇（０．２のＰＰＤＶに相当）において設定した。なぜなら、この枯渇
のレベルがヒト細胞における活性の妥当な予測因子として機能するためである（図１４も
参照）。図１４の９５％信頼区間は、平均の標準偏差を、１．９６により乗じた試料サイ
ズの平方根により除することにより計算した。
ヒト細胞培養および形質移入
構成的に発現されるＥＧＦＰ－ＰＥＳＴレポーター遺伝子の単一インテグレートコピー
を保有するＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞１５を、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘ
（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ペニシリン／ストレプトマイシン、および４
００μｇ／ｍｌのＧ４１８が補給されたＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、３７℃において５％ＣＯ２を用いて培養した。Ｌｏｎｚ
ａ ４Ｄ－ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒのＤＮ－１００プログラムを製造業者のプロトコル
に従って使用して、７５０ｎｇのＣａｓ９プラスミドおよび２５０ｎｇのｓｇＲＮＡプラ
スミド（特に注釈のない限り）により、細胞を同時形質移入した。空のＵ６プロモーター
プラスミドと一緒に形質移入されるＣａｓ９プラスミドを全てのヒト細胞実験についての
陰性対照として使用した。内在性遺伝子実験についての標的部位を野生型ＳｐＣａｓ９に
より開裂可能なＮＧＧ部位の２００ｂｐ内で選択した（図１６ａおよび表２参照）。
ゼブラフィッシュケアおよび注射
ゼブラフィッシュケアおよび使用は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ
Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｉｍａｌ
Ｃａｒｅにより承認された。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは、既に記載のとおりｍＭＥＳＳＡＧ
Ｅ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ ＵＬＴＲＡ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ）を使用してＰｍｅＩ消化ＪＤＳ２４６（野生型ＳｐＣａｓ９）またはＭＳＰ４６９（
ＶＱＲバリアント）により転写させた２１。本試験の全てのｓｇＲＮＡは、クローニング
非依存的ｓｇＲＮＡ生成法に従って調製した２４。ｓｇＲＮＡは、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ
ＳＰ６ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
）により転写させ、ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５（Ｚｙｍｏ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ）により精製し、ＲＮアーゼ不含水により溶出させた。
ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９コードｍＲＮＡを一細胞期のゼブラフィッシュ胚中に同時注
射した。それぞれの胚に、３０ｎｇ／μＬのｇＲＮＡおよび３００ｎｇ／μＬのＣａｓ９
ｍＲＮＡを含有する約２～４．５ｎＬの溶液を注射した。翌日、注射された胚を立体鏡
下で正常な形態発生について精査し、ゲノムＤＮＡを５～９つの胚から抽出した。
ヒト細胞ＥＧＦＰ崩壊アッセイ
ＥＧＦＰ崩壊実験を既に記載のとおり実施した１６。ＥＧＦＰ発現について、形質移入
された細胞を形質移入の約５２時間後にＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。バックグラウンドＥＧＦＰ損失を全ての
実験について約２．５％においてゲーティングした（赤色破線としてグラフにより表示）
。
ヌクレアーゼ誘導突然変異率を定量するためのＴ７Ｅ１アッセイ、標的化ディープシーケ
ンシング、およびＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ
Ｔ７Ｅ１アッセイは、ヒト細胞１５およびゼブラフィッシュ２１について既に記載のと
おり実施した。Ｕ２ＯＳ．ＥＧＦＰヒト細胞について、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＤＮＡｄｖ
ａｎｃｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃ
ｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用してゲノムＤＮＡを形質移入細胞から形質移入
の約７２時間後に抽出した。表１に列記されるプライマーを使用してゼブラフィッシュま
たはヒト細胞ゲノムＤＮＡからの標的遺伝子座を増幅した。ほぼ２００ｎｇの精製ＰＣＲ
産物を変性し、アニールし、Ｔ７Ｅ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）によ
り消化した。突然変異誘発頻度は、ヒト細胞１５およびゼブラフィッシュ２１について既
に記載のとおりＱｉａｘｃｅｌキャピラリー電気泳動装置（ＱＩａｇｅｎ）を使用して定
量した。
標的化ディープシーケンシングについて、表１に列記されるプライマーを用いるＰｈｕ
ｓｉｏｎ Ｈｏｔ－ｓｔａｒｔ Ｆｌｅｘを使用して、既に特徴付けされたオンおよびオ
フターゲット部位（Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３，１
８７－１９７（２０１５）；Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１
，８２２－８２６（２０１３；Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３
２，２７９－２８４（２０１４））を増幅した。ゲノム遺伝子座は、対照条件（空のｓｇ
ＲＮＡ）、野生型、およびＤ１１３５Ｅ ＳｐＣａｓ９について増幅した。Ａｇｅｎｃｏ
ｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＸＰクリーンアップステップ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ
Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を実施してから、ライブラリー調製のためにそれぞれの条件から約
５００ｎｇのＤＮＡをプールした。ＫＡＰＡ ＨＴＰライブラリー調製キット（ＫＡＰＡ
ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を使用して二重インデックス化Ｔｒｕ－Ｓｅｑ Ｉｌｌｕｍｉ
ｎａディープシーケンシングライブラリーを生成した。Ｄａｎａ－Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｅにより、
Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ上で１５０ｂｐペアドエンドシーケ
ンシングが実施された。標的化ディープシーケンシングデータの突然変異分析は、既に記
載のとおり実施した（Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２，
５６９－５７６（２０１４））。簡潔に述べると、ｂｗａ（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ
ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２５，１７５４－１７６０（２００９））を使用してＩｌｌｕ
ｍｉｎａ ＭｉＳｅｑペアドエンドリードデータをヒトゲノム参照ＧＲＣｈｒ３７にマッ
ピングした。高品質リード（品質スコア＞＝３０）を標的またはオフターゲット部位に重
複するインデル突然変異について評価した。１ｂｐインデル突然変異は、それらが予測切
断点の１ｂｐ内で生じない限り、分析から除外した。Ｄ１１３５Ｅを野生型ＳｐＣａｓ９
に対して比較するオンおよびオフターゲット部位における活性の変化は、両方の条件から
のインデル頻度を比較することにより計算した（バックグラウンド対照アンプリコンイン
デルレベルを超える率について）。
ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ実験は、既に記載のとおり実施した（Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎ
ａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３，１８７－１９７（２０１５））。簡潔に述べると、
リン酸化ホスホロチオエート修飾二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）を上
記のとおりＣａｓ９およびｓｇＲＮＡ発現プラスミドとともにＣａｓ９ヌクレアーゼとと
もにＵ２ＯＳ細胞中に形質移入した。ｄｓＯＤＮ特異的増幅、ハイスループットシーケン
シング、およびマッピングを実施してＤＳＢ活性を含有するゲノム間隔を同定した。野生
型対Ｄ１１３５Ｅ実験のため、オフターゲットリードカウントをオンターゲットリードカ
ウントに正規化して、試料間のシーケンシング深度の差を補正した。次いで、野生型およ
びＤ１１３５Ｅ ＳｐＣａｓ９についての正規化比を比較してオフターゲット部位におけ
る活性の変化倍率を計算した。ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑについての野生型およびＤ１１３５Ｅ
試料が、設定標的部位における類似のオリゴタグインテグレーション率を有するか否かを
決定するため、表１に列記されるプライマーを使用して１００ｎｇのゲノムＤＮＡ（上記
のとおり単離）からＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ－Ｓｔａｒｔ Ｆｌｅｘにより設定標的遺伝
子座を増幅することにより制限断片長多型（ＲＦＬＰ）アッセイを実施した。ほぼ１５０
ｎｇのＰＣＲ産物を２０ＵのＮｄｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）によ
り３７℃において３時間消化してから、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＸＰキット
を使用してクリーンアップした。Ｑｉａｘｃｅｌキャピラリー電気泳動装置（ＱＩａｇｅ
ｎ）を使用してＲＦＬＰ結果を定量してオリゴタグインテグレーション率を推定した。Ｔ
７Ｅ１アッセイを上記のとおり同様の目的のために実施した。
Figure 2024123232000014
Figure 2024123232000015
Figure 2024123232000016
Figure 2024123232000017
Figure 2024123232000018
実施例１
標的化範囲の制限に対処する１つの潜在的な解決策は、新規ＰＡＭ特異性を有するＣａ
ｓ９バリアントを遺伝子操作することである。ＰＡＭ特異性を変更する従来の試行は、塩
基特異的ＳｐＣａｓ９－ＰＡＭ相互作用についての構造情報を利用し、２番目および３番
目のＰＡＭ位置におけるグアニンヌクレオチドに接触するアルギニン残基（Ｒ１３３３お
よびＲ１３３５）をそれぞれ突然変異させた（Ａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒ
ｅ ５１３，５６９－５７３（２０１４））。両方のアルギニンのグルタミンによる置換
（側鎖がアデニンと相互作用すると予測され得るもの）は、インビトロで予測ＮＡＡ Ｐ
ＡＭを保有する標的を開裂し得るＳｐＣａｓ９バリアントを生じさせ得なかった（Ａｎｄ
ｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５１３，５６９－５７３（２０１４））。ヌクレ
アーゼ誘導インデルが蛍光の損失をもたらすヒト細胞ベースＵ２ＯＳ ＥＧＦＰレポータ
ー遺伝子崩壊アッセイ（Ｒｅｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３
０，４６０－４６５（２０１２）；Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
３１，８２２－８２６（２０１３））を使用して、本発明者らは、Ｒ１３３３Ｑ／Ｒ１
３３５Ｑ ＳｐＣａｓ９バリアントがＮＡＡ ＰＡＭを有する標的部位を効率的に開裂し
得ないことを確認した（図１ａ）。さらに、本発明者らは、単一のＲ１３３３ＱおよびＲ
１３３５Ｑ ＳｐＣａｓ９バリアントが、それぞれ、それらの予測ＮＡＧおよびＮＧＡ部
位をそれぞれ有する標的部位を効率的に開裂し得ないことを見出した（図１ａ）。したが
って、本発明者らは、ＰＡＭ特異性の再遺伝子操作は、Ｒ１３３３およびＲ１３３５以外
の位置における追加の突然変異を要求し得ることを結論付けた。例えば、入手可能な構造
情報は、Ｋ１１０７およびＳ１１３６が、ＰＡＭ中の２番目および３番目の塩基への直接
および間接的な副溝の接触を作ることを示す（Ａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒ
ｅ ５１３，５６９－５７３（２０１４））。したがって、これらの位置におけるまたは
その付近の追加の変更は、ＰＡＭ特異性を変更することを必要とし得ることが妥当である
。
ＰＡＭ特異性の改変に重要であり得る追加の位置を同定するため、本発明者らは、既に
使用されている細菌選択系を、ホーミングエンドヌクレアーゼの特性を試験するように適
合させた（以下、陽性選択と称する）（Ｃｈｅｎ＆Ｚｈａｏ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ ３３，ｅ１５４（２００５）；Ｄｏｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈ
ｅｍ Ｓｏｃ １２８，２４７７－２４８４（２００６））。本発明者らのこの系の適合
において、誘導性毒性遺伝子をコードする陽性選択プラスミドのＣａｓ９媒介開裂により
、線形化プラスミドの後続の分解および損失に起因して細胞生存が可能となる（図１ｂお
よび図１２ａ）。ＳｐＣａｓ９が陽性選択系において機能し得ることを確立した後、本発
明者らは、野生型およびＲ１３３５Ｑバリアントの両方を、ＮＧＡ ＰＡＭを有する標的
部位を保有する選択プラスミドを開裂するそれらの能力について試験し、予測されるとお
り生存を観察し得なかった（図１２ａ）。機能獲得突然変異についてスクリーニングする
ため、本発明者らは、１キロベース当たり５．２個の突然変異の平均率でランダムに突然
変異したＰＡＭ相互作用ドメイン（アミノ酸位置１０９７～１３６８）を担持する野生型
およびＲ１３３５Ｑ ＳｐＣａｓ９ライブラリーを生成した（図１２ｂおよび方法）。Ｎ
ＧＡ ＰＡＭを有する標的部位を含有する陽性選択プラスミドを有する細菌中にこれらの
ライブラリーを導入し、選択培地上でプレーティングした。Ｒ１３３５Ｑベースライブラ
リーからの生存クローンの配列により、既存のＲ１３３５Ｑ突然変異に加わった最大頻度
の置換は、Ｄ１１３５Ｖ／Ｙ／Ｎ／ＥおよびＴ１３３７Ｒであることが明らかになった（
表３）。本発明者らは、野生型ＳｐＣａｓ９ベースライブラリー選択についてより少ない
生存物を得たが、それらのクローンの配列もＤ１１３５Ｖ／Ｙ／ＮおよびＲ１３３５Ｑ突
然変異を含んだ。次に、本発明者らは、ヒト細胞ベースＥＧＦＰ崩壊アッセイを使用して
Ｄ１１３５Ｖ／Ｙ／Ｎ／Ｅ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｒ突然変異の全ての考えら
れる単一、二重および三重の組合せを担持するＳｐＣａｓ９をアセンブルおよび試験した
。この分析は、３つ全ての位置における置換を有するＳｐＣａｓ９バリアントが、ＮＧＡ
ＰＡＭに対して最大活性を示すが、ＮＧＧ ＰＡＭに対して最小活性も示すことを示し
た（図１ｃ）。本発明者らは、２つのＳｐＣａｓ９バリアント、Ｄ１１３５Ｖ／Ｒ１３３
５Ｑ／Ｔ１３３７ＲおよびＤ１１３５Ｅ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（以下、それぞれ
ＶＱＲおよびＥＱＲ ＳｐＣａｓ９バリアントと称する）を選択した。なぜなら、それら
は、さらなる特徴付けのためのＮＧＡおよびＮＧＧ ＰＡＭ間の最大の差（図１ｃ）を有
したためである。
本発明者らの新規ＳｐＣａｓ９バリアントの全体ＰＡＭ特異性プロファイルを評価する
ため、本発明者らは、細菌ベース陰性選択系を使用した（図１ｄおよび図１３ａ）。従来
の研究は、類似タイプの選択系を使用してＣａｓ９ヌクレアーゼの開裂部位優先性を同定
した（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，２３３－２３
９（２０１３）；Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０，１１１
６－１１２１（２０１３））。このアッセイの本発明者らの変法（本発明者らは、部位枯
渇アッセイと称する）では、プロトスペーサーに隣接して配置されるランダム化６ｂｐ配
列を担持するプラスミドのライブラリーを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のＣａｓ９／ｓｇＲ
ＮＡ複合体による開裂について試験する（図１３ｂ）。Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体によ
る開裂に耐性であるプロトスペーサー隣接配列を有するプラスミドにより、抗生物質耐性
遺伝子の存在に起因して細胞生存が可能となる一方、開裂性配列を担持するプラスミドは
、分解され、したがって、ライブラリーから枯渇する（図１３ｂ）。約１００，０００個
の標的化可能でない配列のハイスループットシーケンシングにより、任意の所与のＰＡＭ
についての選択後ＰＡＭ枯渇値（ＰＰＤＶ）を計算することができた。ＰＡＭ（またはＰ
ＡＭの群）のＰＰＤＶは、選択後集団中のそのＰＡＭの頻度を選択前ライブラリー中のそ
の頻度により除したものと定義される。この定量値は、そのＰＡＭに対するＣａｓ９活性
の推定値を提供する。２つのランダム化ＰＡＭライブラリー（それぞれ異なるプロトスペ
ーサーを有する）に対して触媒的に不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）について得られたプ
ロファイルにより、任意の所与のＰＡＭまたはＰＡＭの群についてのＰＰＤＶの統計的に
有意な変化を表すものを定義することが可能となった（図１３ｃ）。次いで、本発明者ら
は、２つのランダム化ＰＡＭライブラリーについて得られた野生型ＳｐＣａｓ９について
のＰＰＤＶが、その既に記載された標的化可能なＰＡＭのプロファイル（Ｊｉａｎｇ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，２３３－２３９（２０１３））（図
１ｅ）を再現することを実証することにより本発明者らの部位枯渇アッセイをバリデート
した。
部位枯渇アッセイを使用して、本発明者らは、２つのランダム化ＰＡＭライブラリーを
使用してＶＱＲおよびＥＱＲ ＳｐＣａｓ９バリアントについてのＰＡＭ特異性プロファ
イルを得た。ＶＱＲバリアントは、ＮＧＡＮおよびＮＧＣＧ ＰＡＭを担持する部位を強
力に枯渇させ、ＮＧＧＧ、ＮＧＴＧ、およびＮＡＡＧ ＰＡＭを担持する部位をより弱く
枯渇させた（図１ｆ）。対照的に、ＥＱＲバリアントは、ＮＧＡＧ ＰＡＭを強力に、Ｎ
ＧＡＴ、ＮＧＡＡ、およびＮＧＣＧ ＰＡＭをより弱く枯渇させ（図１ｆ）、それは、Ｖ
ＱＲバリアントに対して潜在的により制限される標的化範囲を実証した。部位枯渇アッセ
イにより同定されたＰＡＭがヒト細胞中でも認識することができるか否かを試験するため
、本発明者らは、ＥＧＦＰ崩壊アッセイを使用して標的部位に対するＶＱＲおよびＥＱＲ
ＳｐＣａｓ９バリアントによる開裂を評価した。ＶＱＲバリアントは、ＮＧＡＮ ＰＡ
Ｍを担持するＥＧＦＰにおける部位をロバストに開裂し（相対効率は、ＮＧＡＧ＞ＮＧＡ
Ｔ＝ＮＧＡＡ＞ＮＧＡＣである）、およびさらにＮＧＣＧ、ＮＧＧＧ、およびＮＧＴＧ
ＰＡＭを担持する部位を一般により低い効率で開裂した（図１ｇ）。ＥＱＲバリアントは
、ヒト細胞において他のＮＧＡＮ ＰＡＭよりもＮＧＡＧおよびＮＧＮＧ ＰＡＭについ
てのその優先性も再現し、ここでも全てＶＱＲバリアントよりも低い活性であった（図１
ｇ）。まとめると、ヒト細胞におけるこれらの結果は、細菌部位枯渇アッセイについて観
察されたものを強力に反映し（図１４）、細菌アッセイにおける０．２のＰＰＤＶ（５倍
枯渇を表す）が、ヒト細胞における活性についての妥当な予測閾値を提供することを示唆
した（図１４）。
次に、本発明者らは、ＮＧＣ ＰＡＭを認識し得るＳｐＣａｓ９バリアントを同定する
試行により本発明者らの遺伝子操作方針の一般化可能性を拡張することを求めた。本発明
者らは、最初に、シトシンと相互作用することが予測することができるＲ１３３５のアミ
ノ酸置換（Ｄ、Ｅ、Ｓ、またはＴ）を担持するＣａｓ９突然変異体を設計し、陽性選択系
を使用してＮＧＣ ＰＡＭ部位に対する活性を見出さなかった。次いで、本発明者らは、
それらの単置換ＳｐＣａｓ９バリアントのそれぞれのＰＡＭ相互作用ドメインをランダム
に突然変異させたが、依然として陽性選択において生存コロニーを得ることができなかっ
た。Ｔ１３３７Ｒ突然変異は、本発明者らのＶＱＲおよびＥＱＲ ＳｐＣａｓ９バリアン
トの活性を増加させたため（図１ｃ）、本発明者らは、この突然変異と、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｓ
、Ｔ、またはＶのＲ１３３５置換と組み合わせ、ここでもそれらのＰＡＭ相互作用ドメイ
ンをランダムに突然変異させた。これら６つの突然変異ライブラリーの２つ（既存のＲ１
３３５Ｅ／Ｔ１３３７ＲおよびＲ１３３５Ｔ／Ｔ１３３７Ｒ置換を担持する）を使用する
選択により、種々の追加の突然変異を保有する生存コロニーが生じた（表３）。細菌およ
びヒト細胞ベースアッセイの両方を使用する種々の選択クローンの特徴付けは、特に４つ
の位置における置換（Ｄ１１３５Ｖ、Ｇ１２１８Ｒ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ
）が、ＮＧＣ ＰＡＭの開裂に重要であると考えられることを示唆した。ＥＧＦＰ崩壊ア
ッセイを使用するこれらの突然変異の全ての潜在的な単一、二重、三重、および四重の組
合せのアセンブリおよび試験は、四重ＶＲＥＲバリアントがＮＧＣＧ ＰＡＭに対する最
大活性およびＮＧＧＧ ＰＡＭに対する最小活性を示すことを確立した（図１ｈ）。部位
枯渇アッセイを使用するＶＲＥＲバリアントの分析により、それは、ＮＧＣＧ ＰＡＭに
高度に特異的であることが明らかになった（図１ｉ）。この結果と一致して、ＶＲＥＲバ
リアントを用いてヒト細胞において実施されたＥＧＦＰ崩壊アッセイにより、ＮＧＣＧ
ＰＡＭを有する部位の効率的な開裂、ＮＧＣＡ、ＮＧＣＣ、およびＮＧＣＴ ＰＡＭを有
する部位の大幅に減少した不一致の開裂、ならびにＮＧＡＧ、ＮＧＴＧ、およびＮＧＧＧ
ＰＡＭを有する部位に対する本質的な無活性が明らかになった（図１ｊ）。
本発明者らのＶＱＲおよびＶＲＥＲ ＳｐＣａｓ９バリアントが、野生型ＳｐＣａｓ９
により現在、改変可能でない部位を標的化し得ることを直接実証するため、本発明者らは
、ゼブラフィッシュ胚およびヒト細胞中の内在性遺伝子に対するそれらの活性を試験した
。単細胞ゼブラフィッシュ胚において、本発明者らは、ＶＱＲバリアントが、ＮＧＡＧ
ＰＡＭを担持する内在性遺伝子部位を２０～４３％の平均突然変異誘発頻度で効率的に改
変し得ること（図２ａ）、およびインデルが予測開裂部位において生じることを見出した
（図１５）。ヒト細胞において、本発明者らは、ＶＱＲバリアントが、ＮＧＡＧ、ＮＧＡ
Ｔ、およびＮＧＡＡ ＰＡＭを保有する４つの異なる内在性遺伝子にわたる１６個の部位
をロバストに改変することを見出した（６～５３％の範囲、平均３３％；図２ｂおよび図
１６ａ）。重要なことに、本発明者らは、野生型ＳｐＣａｓ９が、ゼブラフィッシュおよ
びヒト細胞中のＮＧＡＧおよびＮＧＡＴ ＰＡＭを有する同一部位のほとんどを効率的に
変更し得ないことを確認したが（図１６ｂ）、ＮＧＧ ＰＡＭを担持する隣接部位を効率
的に改変し得た（図１６ｂ）。同様に、３つの内在性ヒト遺伝子にわたるＮＧＣＧ ＰＡ
Ｍを有する９つの部位におけるＶＲＥＲバリアント活性を試験した場合、本発明者らはま
た、ロバストな平均崩壊頻度を観察した（５～３６％の範囲、平均２１％；図２ｄ）。本
発明者らの部位枯渇データ（図１ｅおよび１ｆ）と一致して、ＶＱＲバリアントは、ＶＲ
ＥＲバリアントについて観察されたものと同様にＮＧＣＧ ＰＡＭ部位の効率を変更した
一方、野生型ＳｐＣａｓ９は変更し得なかった（図２ｄ）。参照ヒトゲノム配列のコンピ
ュータ分析は、本発明者らのＶＱＲおよびＶＲＥＲ ＳｐＣａｓ９バリアントの追加が、
野生型ＳｐＣａｓ９単独について既に考えられたものと比較して潜在的な標的部位の範囲
を２倍にすることを示す（図２ｅ）。まとめると、これらの結果は、本発明者らの遺伝子
操作ＳｐＣａｓ９バリアントが、ゼブラフィッシュ胚およびヒト細胞中の従来アクセス不
可能な内在性部位を改変し得ることによりＳｐＣａｓ９の標的化範囲を広げることを実証
する。
本発明者らのＶＱＲおよびＶＲＥＲ ＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼのゲノムワイド特異性
を決定するため、本発明者らは、近年記載されたＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ（シーケンシングに
よる二本鎖分解のゲノムワイドな偏りのない識別）法１０を使用してヒト細胞におけるそ
れらのＳｐＣａｓ９バリアントのオフターゲット開裂イベントをプロファイリングした。
本発明者らは、設定オンターゲット部位における高い改変効率を誘導し得ること本発明者
らが示した合計１３個の異なるｓｇＲＮＡ（図２ｂおよび２ｄから、それぞれＶＱＲにつ
いて８つ、およびＶＲＥＲについて５つ）を使用してＶＱＲおよびＶＲＥＲ ＳｐＣａｓ
９バリアントのゲノムワイド活性をプロファイリングした。これらのＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ
実験について、多数の重要な観察が見られた：ヒト細胞中で本発明者らのＳｐＣａｓ９バ
リアントにより誘導されたオフターゲットＤＳＢの数は、野生型ＳｐＣａｓ９について既
に観察されたものと同等である（またはＶＲＥＲバリアントの場合、おそらくよりいっそ
う良好である）（図２ｆ）。本発明者らは、ＶＲＥＲについて観察された高いゲノムワイ
ド特異性が、ＮＧＣＧ ＰＡＭについてのその制限された特異性、およびおそらくヒトゲ
ノム中のＮＧＣＧ ＰＡＭを有する部位の相対枯渇の両方から生じ得たことを留意する（
図２ｅ）２１。さらに、観察されたオフターゲット部位は、一般に、１塩基だけ３’に「
シフトした」ＰＡＭ（図１ｆおよび１ｉからのＰＡＭを図１７の部位のものと比較する）
についていくらかの寛容を含む、本発明者らの部位枯渇実験により予測される予測ＰＡＭ
配列を有する。最後に、本発明者らのＶＱＲおよびＶＲＥＲ ＳｐＣａｓ９バリアントに
ついてのオフターゲット部位中に見出されたミスマッチの位置および数（図１７）は、そ
れらの分布において、非反復配列に標的化されるｓｇＲＮＡについて野生型ＳｐＣａｓ９
について本発明者らが既に観察したものと類似する１０。
従来の研究は、ＳｐＣａｓ９による不完全なＰＡＭ認識が、ヒト細胞中の非カノニカル
ＮＡＧ、ＮＧＡ、および他のＰＡＭを含有する不所望な部位の認識をもたらし得ることを
示している（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，８２７－８
３２（２０１３）；Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３，１
８７－１９７（２０１５）；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
３１，２３３－２３９（２０１３）；Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ ３１，８３３－８３８（２０１３）；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒ
ｅｐ ４，５４０５（２０１４））。したがって、本発明者らは、ＰＡＭ相互作用を媒介
する残基におけるまたはその付近の突然変異が、ＳｐＣａｓ９ＰＡＭ特異性を改善し得る
か否かの探索に関心を向けた。ＶＱＲバリアントの遺伝子操作の間、本発明者らは、Ｄ１
１３５Ｅ ＳｐＣａｓ９突然変異体が、野生型ＳｐＣａｓ９と比較してカノニカルＮＧＧ
ＰＡＭおよび非カノニカルＮＧＡ ＰＡＭ間を良好に区別することが考えられることに
留意した（図１ｃ）。この観察を考慮して、本発明者らは、本発明者らの部位枯渇アッセ
イを使用してＤ１１３５ＥバリアントのＰＡＭ認識プロファイルを包括的に評価した。こ
の実験により、野生型ＳｐＣａｓ９に対してＤ１１３５Ｅ ＳｐＣａｓ９について非カノ
ニカルＮＡＧ、ＮＧＡ、およびＮＮＧＧ ＰＡＭの枯渇の減少が明らかになった（図３ａ
）。興味深いことに、この効果は、本発明者らが使用した２つのプロトスペーサーの一方
について、より傑出しており、それは、非カノニカルＰＡＭ認識に対するＤ１１３５Ｅ置
換の影響がある程度プロトスペーサー依存的に変動し得ることを示唆した。重要なことに
、本発明者らは、いかなる新たな非カノニカルＰＡＭ特異性の出現も観察しなかった。
次に、本発明者らは、Ｄ１１３５Ｅ ＳｐＣａｓ９の改善されたＰＡＭ特異性がヒト細
胞中でも観察することができるか否かを試験した。非カノニカルＮＡＧまたはＮＧＡ Ｐ
ＡＭを有する８つの標的部位に対する野生型およびＤ１１３５Ｅ ＳｐＣａｓ９の直接比
較において、本発明者らは、それらの部位が、ＥＧＦＰ崩壊アッセイにおいて野生型Ｓｐ
Ｃａｓ９よりもＤ１１３５Ｅにより一貫して効率的に開裂されないことを観察した（図３
ｂ、１．９４の活性の平均減少倍率）。重要なことに、野生型およびＤ１１３５Ｅ Ｓｐ
Ｃａｓ９は、両方とも４つのＥＧＦＰレポーター遺伝子部位およびカノニカルＮＧＧ Ｐ
ＡＭを有する６つの内在性ヒト遺伝子部位に対する同等の活性を示し（それぞれ図３ｂお
よび３ｃ）、それは、Ｄ１１３５ＥバリアントがＮＧＧ ＰＡＭを有するオンターゲット
部位の開裂にそれほど影響しないことを実証した（１０個全ての部位にわたる１．０４の
活性の平均減少倍率）。本発明者らが、ヒト細胞中に形質移入されたＣａｓ９コードプラ
スミドの濃度を減少させたタイトレーション実験により、野生型およびＤ１１３５Ｅ Ｓ
ｐＣａｓ９の活性には、それらを同一部位に標的化した場合に実質的な差異がないことが
明らかになり（図３ｄ）、それは、Ｄ１１３５Ｅバリアントについて観察された増加した
特異性が、単にタンパク質の不安定化の結果でないことを意味した。
Ｄ１１３５Ｅの導入がＳｐＣａｓ９のオフターゲット開裂効果を低減させ得るか否かを
より直接的に評価するため、本発明者らは、ディープシーケンシングを使用して３つの異
なるｓｇＲＮＡの２５個の既に公知のオフターゲット部位（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａ
ｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，８２７－８３２（２０１３）；Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ
．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３，１８７－１９７（２０１５）；Ｆｕ ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，８２２－８２６（２０１３））に対して
野生型およびＤ１１３５Ｅ ＳｐＣａｓ９により誘導された突然変異率を比較した。これ
らの２５個の部位は、スペーサー配列ならびにカノニカルＮＧＧおよび非カノニカルＰＡ
Ｍ中の両方の種々のミスマッチを有するオフターゲット部位を含んだ（図３ｅ）。これら
のディープシーケンシング実験の結果により、Ｄ１１３５Ｅバリアントが、３つのオンタ
ーゲット部位において観察された突然変異頻度に対してバックグラウンドインデル率を超
える活性を有する２２個のオフターゲット部位の１９個における低減した突然変異頻度を
示すことが明らかになった（図３ｅおよび３ｆ）。興味深いことに、これらの低減したオ
フターゲット突然変異頻度は、カノニカルＰＡＭを有する多くの部位において観察され、
それは、Ｄ１１３５Ｅによる特異性の獲得が、非カノニカルＰＡＭを有する部位にのみ制
限されないことを示唆した。Ｄ１１３５Ｅに関連する特異性の改善をゲノムワイドスケー
ルで評価するため、本発明者らは、３つの異なるｓｇＲＮＡ（そのうちの２つは、カノニ
カルおよび非カノニカルＰＡＭを有するオフターゲット部位を有することが既に公知であ
った（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，８２７－８３２（
２０１３）；Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３，１８７－
１９７（２０１５）；Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，８２
２－８２６（２０１３））とともに野生型およびＤ１１３５Ｅ ＳｐＣａｓ９を使用する
ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ実験を実施した。本発明者らは、野生型ＳｐＣａｓ９と比較してＤ１
１３５Ｅ ＳｐＣａｓ９バリアントを使用した場合、ゲノムワイド特異性の一般化した改
善を観察した（図３ｇ）。本発明者らが試験した３つ全てのｓｇＲＮＡについて、カノニ
カルまたは非カノニカルＰＡＭを有するミスマッチスペーサーを含有するオフターゲット
部位において特異性のそれらの改善が観察された（図１８）。重要なことに、これらのＧ
ＵＩＤＥ－ｓｅｑ実験により、Ｄ１１３５Ｅ突然変異の導入が、ＳｐＣａｓ９により誘導
されるオフターゲット効果の数を増加させないことが実証された。まとめると、これらの
結果は、Ｄ１１３５Ｅ置換がＳｐＣａｓ９の全体特異性を増加させ得ることを示す。
上記の実験の全てはＳｐＣａｓ９を用いて実施したが、新規ＰＡＭ特異性を有するＣａ
ｓ９の特徴付けおよび遺伝子操作に魅力的な候補となり得る他の細菌からの多くのＣａｓ
９オルソログが存在する（Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ ４２，２５７７－２５９０（２０１４）；Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒ
ｅ ５２０，１８６－１９１（２０１５））。この実行可能性を探索するため、本発明者
らは、２つのより小さいサイズのオルソログ、ＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座からのストレプト
コッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）
Ｃａｓ９（Ｓｔ１Ｃａｓ９）（Ｄｅｖｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
１９０，１３９０－１４００（２００８）；Ｈｏｒｖａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ １９０，１４０１－１４１２（２００８））および黄色ブドウ球菌（Ｓｔ
ａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＳａＣａｓ９）（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，
Ｃｅｌｌ １５７，１２６２－１２７８（２０１４）；Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕ
ｒｅ ５２０，１８６－１９１（２０１５））が、本発明者らの細菌選択アッセイにおい
ても機能し得るか否かを決定した。Ｓｔ１Ｃａｓ９のＰＡＭは、ＮＮＡＧＡＡ（配列番号
３）として既に特徴付けされている一方（Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ １０，１１１６－１１２１（２０１３）；Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２，２５７７－２５９０（２０１４）；Ｄｅｖｅ
ａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９０，１３９０－１４００（２００８
）；Ｈｏｒｖａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９０，１４０１－１４
１２（２００８））、既に記載されているアプローチ（Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ．，
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２，２５７７－２５９０（２０１４））を使用
してＳａＣａｓ９ ＰＡＭを生物情報学的に導出する本発明者らの試行は、コンセンサス
配列を生じさせ得なかった（データ示さず）。したがって、本発明者らは、本発明者らの
部位枯渇アッセイを使用し、ＳａＣａｓ９についておよび陽性対照としてＳｔ１Ｃａｓ９
についてのＰＡＭを決定した。これらの実験は、２つの異なるプロトスペーサーおよびそ
れぞれプロトスペーサーについての２つの異なる相補性長さを有するｓｇＲＮＡを使用し
て実施し、それぞれのＣａｓ９について４つの選択をもたらした。Ｓｔ１Ｃａｓ９につい
て、本発明者らは、既に記載されている６つのＰＡＭ（Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎ
ａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０，１１１６－１１２１（２０１３）；Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ
ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２，２５７７－２５９０（２０１４
）；Ｈｏｒｖａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９０，１４０１－１４
１２（２００８））に加えて２つの新規ＰＡＭを同定した（図４ａならびに図１９ｃおよ
び１９ｄ、ＳａＣａｓ９ ＰＡＭ特異性の近年の定義（Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕ
ｒｅ ５２０，１８６－１９１（２０１５））と一致）。ＳａＣａｓ９について、主に、
１つのプロトスペーサーについて観察される制限されたＰＡＭ優先性に起因する４つの選
択間のＰＰＤＶ変動性が存在した。結果として、３つのＰＡＭのみが４つ全ての実験にお
いて５倍超で枯渇した：ＮＮＧＧＧＴ（配列番号４）、ＮＮＧＡＡＴ（配列番号６）、Ｎ
ＮＧＡＧＴ（配列番号５）（図４ｂ）。しかしながら、本発明者らは、第２のプロトスペ
ーサーライブラリーを有する多くのより標的化可能なＰＡＭを同定し、それは、ＳａＣａ
ｓ９が多数の追加のＰＡＭを認識し得ることを意味した（図１８ｃおよび１８ｄ）。本発
明者らの部位枯渇実験において同定されたＳｔ１Ｃａｓ９についてのＰＡＭ（ＮＮＡＧＡ
Ａ（配列番号３）およびＳａＣａｓ９についてのＮＮＧＡＧＴ（配列番号５））を使用し
て、本発明者らは、Ｓｔ１Ｃａｓ９およびＳａＣａｓ９の両方が細菌陽性選択系において
効率的に機能し得ることを見出し（図４ｃ）、それは、それらのＰＡＭ特異性を突然変異
誘発および選択により改変し得ることを示唆する。
全てのＣａｓ９オルソログがそれらの天然環境外で効率的に機能するわけではないため
（Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０，１１１６－１１２１（
２０１３））、本発明者らは、Ｓｔ１Ｃａｓ９およびＳａＣａｓ９が、ヒト細胞中の標的
部位をロバストに開裂し得るか否かを試験した。Ｓｔ１Ｃａｓ９は、ヒト細胞中でヌクレ
アーゼとして機能するが、数個の部位に対してのみ機能することが既に示されている（Ｅ
ｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３
９，８１９－８２３（２０１３））。本発明者らは、変動長さの相補性領域を有するｓｇ
ＲＮＡを使用してＮＮＡＧＡＡ（配列番号３）ＰＡＭを保有する部位に対するＳｔ１Ｃａ
ｓ９活性を評価し、５つの標的部位の３つにおいて高い活性を見出した（図４ｄ）。Ｓａ
Ｃａｓ９について、本発明者らは、ＮＮＧＧＧＴ（配列番号４）またはＮＮＧＡＧＴ（配
列番号５）ＰＡＭを保有する８つの部位において効率的な活性を観察した（図４ｅ）。Ｓ
ｔ１Ｃａｓ９およびＳａＣａｓ９の両方について、活性およびスペーサー相補性の長さ間
の明らかな相関は観察されなかった（図１９ｅ）。次に、本発明者らは、Ｓｔ１Ｃａｓ９
およびＳａＣａｓ９がヒト細胞中で内在性遺伝子座を効率的に改変し得るか否かを決定し
た。Ｓｔ１Ｃａｓ９について、４つの遺伝子にわたる１１個の部位のうちの７つが、Ｔ７
Ｅ１アッセイにより判断されるとおり効率的に崩壊された一方（１～２５％、平均１３％
；図４ｆ）、ＳａＣａｓ９は、４つの遺伝子にわたる１６個の試験部位においていくぶん
よりロバストな活性を示した（１％～３７％、平均１９％；図４ｇ）。ここでも、Ｓｔ１
Ｃａｓ９およびＳａＣａｓ９についてのｓｇＲＮＡスペーサー長さを考慮した場合に区別
の傾向は観察されなかった（図１９ｆ）。まとめると、本発明者らの結果は、Ｓｔ１Ｃａ
ｓ９およびＳａＣａｓ９が、本発明者らの細菌ベース選択およびヒト細胞の両方において
ロバストに機能することを示し、それらを、新規ＰＡＭ特異性を有する追加のＳｐＣａｓ
９バリアントの遺伝子操作のための魅力的な候補とする。
Figure 2024123232000019
Figure 2024123232000020
Figure 2024123232000021
Figure 2024123232000022
Figure 2024123232000023
Figure 2024123232000024
Figure 2024123232000025
実施例２．黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９の
ＰＡＭ特異性の遺伝子操作
本発明者らは、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃ
ａｓ９（ＳｐＣａｓ９）のいずれの残基がＰＡＭ認識に重要であるかに知得したため（Ｒ
１３３３およびＲ１３３５）、本発明者らは、Ｃａｓ９オルソログのアラインメントを生
成して黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（Ｓａ
Ｃａｓ９）のＰＡＭ相互作用ドメイン（ＰＩドメイン）中の相同性残基を探索した（図６
参照）。本発明者らは、ＳａＣａｓ９のＰＡＭがＮＮＧＲＲＴ（配列番号４６）（Ｎは、
任意のヌクレオチドであり、Ｒは、ＡまたはＧである）であることを既に示した。ＰＡＭ
の３番目の位置におけるＧについての優先性が本発明者らのデータに基づき最も厳密な要
求であると考えられるため、本発明者らは、正荷電残基、例えば、リジン（Ｋ）またはア
ルギニン（Ｒ）がその相互作用を媒介し得ることを仮定した。図６に示されるとおり、Ｓ
ｐＣａｓ９のＲ１３３３およびＲ１３３５との相同性領域中のＳａＣａｓ９中の多数の候
補残基、例として、Ｋ１１０１、Ｒ１０１２、Ｒ１０１５、Ｋ１０１８、およびＫ１０２
３が存在する。
本発明者らは、これら５つの位置におけるアラニン（Ａ）およびグルタミン（Ｑ）置換
を生成し、突然変異クローンが依然としてカノニカルＮＮＧＲＲＴ ＰＡＭ（配列番号４
６）を含有する部位を開裂し得るか否か、または場合により、従来、標的化可能でないＮ
ＮＡＲＲＴ（配列番号４３）のＰＡＭを開裂し得るか否かを決定した（図７）。本発明者
らは、選択条件下でプレーティングした場合の細菌コロニーの生存によりＣａｓ９の活性
を可視化することができる本発明者らの細菌アッセイ（先行特許出願に記載）を利用した
。Ｃａｓ９の相対活性は、非選択培地に対する選択培地上で増殖する細菌コロニーの比を
計算することにより定量することができる。図７において、本発明者らは、Ｒ１０１５Ａ
およびＲ１０１５Ｑ突然変異のみが、カノニカルＮＮＧＡＧＴ（配列番号５）ＰＡＭを認
識するＳａＣａｓ９の能力に影響する一方、ピーク、ＮＮＡＲＲＴ（配列番号４３）ＰＡ
Ｍ（ＮＮＡＡＧＴ（配列番号４１）またはＮＮＡＧＧＴ（配列番号４２））を標的化し得
る突然変異は見られないことを示す。これらの結果は、Ｒ１０１５がＳａＣａｓ９による
ＰＡＭ認識における役割を担うことを示唆した。
次いで、本発明者らは、野生型ＳａＣａｓ９、またはＲ１０１５Ｑバリアントのいずれ
かを選択し、ランダムに突然変異させ、ＮＮＡＡＧＴ（配列番号４１）またはＮＮＡＧＧ
Ｔ（配列番号４２）ＰＡＭを含有する部位に対する変更ＰＡＭ特異性クローンについて選
択した（ＳｐＣａｓ９について既に記載）。本発明者らは、図８（および表６）に示され
るアミノ酸配列を有する、それらのＰＡＭを標的化し得る多数の突然変異クローンを同定
し、再スクリーニングし、シーケンシングした。これらの配列のまとめにおいて、多数の
変化がＳａＣａｓ９の変更に極めて重要である一方（Ｒ１０１５Ｑ、Ｒ１０１５Ｈ、Ｅ７
８２Ｋ）、多くの他の突然変異も寄与し得ると考えられる（Ｎ９６８Ｋ、Ｅ７３５Ｋ、Ｋ
９２９Ｒ、Ａ１０２１Ｔ、Ｋ１０４４Ｎ）。
ＮＮＡＲＲＴ（配列番号４３）に対するＳａＣａｓ９のＰＡＭ特異性を変更するために
必須の位置および突然変異を同定した後、本発明者らは、単一、二重、および三重突然変
異体組合せを作製することにより特異性変化に対する最も豊富な突然変異の寄与を評価し
た（表５）。本発明者らの陽性選択（既に記載）における種々のＰＡＭに対するそれらの
突然変異を試験した場合、本発明者らは、多数の突然変異がカノニカルＮＮＧＡＧＴ（配
列番号５）および非カノニカルＮＮＡＡＧＴ（配列番号４１）またはＮＮＡＧＧＴ（配列
番号４２）ＰＡＭの両方に対する活性を可能とする一方、野生型ＳａＣａｓ９酵素が非カ
ノニカルＰＡＭに対する極めて低い活性を有することを観察した。具体的には、三重突然
変異がＰＡＭの３番目の位置における緩和した特異性を可能とすると考えられ（ＫＫＱ、
ＫＫＨ、ＧＫＱ、ＧＫＨ－Ｅ７８２／Ｎ９６８／Ｒ１０１５位の突然変異に基づき命名し
た）、それは、カノニカルＮＮＧＲＲＴ（配列番号４６）に対するＮＮＲＲＲＴ（配列番
号４５）のコンセンサスＰＡＭモチーフをもたらす。ＰＡＭ要求のこの緩和は、理論的に
は、ＳｐＣａｓ９の標的化範囲を２倍にする。以下、バリアントは、７８２、９６８、お
よび１０１５位におけるそれらのアイデンティティに基づき命名する。例えば、Ｅ７８２
Ｋ／Ｎ９６８Ｋ／Ｒ１０１５Ｈは、ＳａＣａｓ９ＫＫＨバリアントと命名する。
Figure 2024123232000026
次に、本発明者らは、ヒト細胞ＥＧＦＰ崩壊アッセイ（既に記載）において三重突然変
異体の２つを評価して遺伝子操作バリアントがヒト細胞環境中で非カノニカルＰＡＭを標
的化し得るか否かを決定した（図９）。非カノニカルＰＡＭを含有するＥＧＦＰ遺伝子内
の部位を標的化し得るバリアントは、ＥＧＦＰコードフレームを崩壊させ、シグナルの損
失をもたらす。この結果により、ＫＫＱおよびＫＫＨ突然変異体の両方がカノニカルＮＮ
ＧＲＲＴ（配列番号４６）ＰＡＭに対して野生型ＳａＣａｓ９と類似する活性を保持する
が、ＮＮＡＲＲＴ（配列番号４３）ＰＡＭに対してかなり高い活性を有することが明らか
になった。
全体として、本発明者らは、ＧからＲ（ＡまたはＧ）へのＰＡＭの３番目の位置におけ
る野生型酵素の優先性を緩和することが考えられるＳａＣａｓ９中の突然変異（ＫＫＱま
たはＫＫＨバリアント）を同定した。これは、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号４６）ＰＡＭ制約
からＮＮＲＲＲＴ（配列番号４５）ＰＡＭにＳａＣａｓ９の標的化を効率的に緩和する。
本発明者らは、ヒト細胞中でＮＮＡＲＲＴ（配列番号４３）ＰＡＭを標的化し得るバリ
アントを良好に誘導したため、次に、本発明者らは、ＮＮＣＲＲＴ（配列番号４７）また
はＮＮＴＲＲＴ（配列番号４８）についての特異性を有するバリアントを遺伝子操作する
ことができるか否かを追求した。これを行うため、本発明者らは、最初に、Ｒ１０１５を
Ｅに（ＰＡＭの３番目の位置におけるＣを規定する場合）、およびＬまたはＭに（ＰＡＭ
の３番目の位置におけるＴを規定する場合）突然変異させ、本発明者らの細菌陽性選択ア
ッセイ（既に記載）においてそれらの予測ＰＡＭに対してそれらを試験した（図１０）。
本発明者らは、野生型ＳａＣａｓ９がＮＮＣＡＧＴ（配列番号５１１）ＰＡＭを含有する
部位を非効率に開裂し得ること、Ｒ１０１５Ｅバリアントがその同一部位に対してわずか
に良好な活性を有すること、ならびに野生型または他の指向突然変異のいずれも他のＰＡ
Ｍに対する活性を与えないことを観察した（図１０）。これは、本発明者らがＲ１０１５
Ｑについて観察したとおり、ＮＮＣＲＲＴ（配列番号４７）およびＮＮＴＲＲＴ（配列番
号４８）ＰＡＭを標的化し得るＳａＣａｓ９バリアントを遺伝子操作するために他の突然
変異が必要であることを示唆した。
ＮＮＡＲＲＴ（配列番号４３）ＰＡＭに対するＳａＣａｓ９進化バリアントのため、Ｅ
Ｒ１０１５（Ｈ／Ｑ）とともに７８２ＫおよびＮ９６８Ｋ突然変異が必要および必須であ
った。これらの突然変異がそれらの予測ＰＡＭに対するＲ１０１５（Ｅ／Ｌ／Ｍ）バリア
ントの活性を増加させるか否かを試験するため、本発明者らは、ＫＫＥ、ＫＫＬ、および
ＫＫＭバリアントを生成した。図１１に示されるとおり、ＫＫＥ、ＫＫＬ、およびＫＫＭ
は全て、それらの予測ＰＡＭに対するロバストな活性を有した。
本発明者らは、ＫＫＱ、ＫＫＨ、ＫＫＥ、ＫＫＬ、またはＫＫＭバリアントが、ＰＡＭ
の３番目の位置における任意のヌクレオチドに対する緩和した特異性を有するか否かに関
しても関心があったため、ＮＮＮＲＲＴ ＰＡＭを含有する本発明者らの細菌陽性選択ア
ッセイにおける多数の部位を調査した。図１１に示されるとおり、若干の例外はあるもの
の、それらのバリアントのほぼ全てが、ＮＮＮＲＲＴ ＰＡＭを含有する全ての試験部位
を開裂し得る。これは、それらがＮＮＮＲＲＴ部位を効率的に標的化し得るため、それら
がＰＡＭの３番目の位置における緩和した特異性を有することを示した。これは、数個の
ＮＮＮＲＲＴ部位に対する極めて低い活性でＮＮＧＡＧＴ（配列番号５）部位のみを効率
的に標的化し得る野生型タンパク質（ＥＮＲ）とは対照的である。まとめると、ＫＫＨ（
および図１１に示される他の類似の誘導体）バリアントは、細菌中でＮＮＮＲＲＴ ＰＡ
Ｍを含有する部位を標的化し得、ＳａＣａｓ９の標的化範囲を効率的に４倍にする。
したがって、ＫＫＨバリアント（および図６の他のバリアントの一部）は、細菌中でＮ
ＮＮＲＲＴ ＰＡＭを標的化し得、ＳａＣａｓ９の標的化範囲を効率的に４倍にする。
Figure 2024123232000027
Figure 2024123232000028
Figure 2024123232000029
Figure 2024123232000030
Figure 2024123232000031
Figure 2024123232000032
Figure 2024123232000033
Figure 2024123232000034
Figure 2024123232000035
実施例３のための方法
以下の材料および方法を実施例３に使用した。
プラスミドおよびオリゴヌクレオチド
オリゴヌクレオチドを表１１に列記し、ｓｇＲＮＡ標的部位を表１２に列記し、本試験
において使用されるプラスミドを表１０に列記する。
細菌Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ発現プラスミドを使用し、それぞれ別個のＴ７プロモーター
下で発現されるＳａＣａｓ９のヒトコドン最適化バージョンおよびｓｇＲＮＡの両方を発
現させた。選択において使用される細菌発現プラスミドは、ＢＰＫ２１０１（実施例１～
２参照）に由来した一方、部位枯渇アッセイにおいて使用されるものを改変して短縮リピ
ート：アンチリピート配列を有するｓｇＲＮＡを発現させた（下記参照）。これらの細菌
発現プラスミド中の全てのｓｇＲＮＡは、Ｔ７プロモーターからの適切な発現のためのス
ペーサー配列の５’末端における２つのグアニンを含んだ。
ＳａＣａｓ９バリアントのライブラリーを生成するため、Ｍｕｔａｚｙｍｅ ＩＩ（Ａ
ｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＳａＣａｓ９のアミノ酸Ｍ６５７
～Ｇ１０５３を約５．５個の突然変異／キロベースの頻度においてランダムに突然変異さ
せた。野生型およびＲ１０１５Ｑ ＳａＣａｓ９の両方を突然変異誘発のための出発テン
プレートとして使用し、６×１０６個超のクローンの推定複雑度を有する２つのライブラ
リーをもたらした。
陽性選択プラスミドは、ＸｂａＩ／ＳｐｈＩ消化ｐ１１－ｌａｃＹ－ｗｔｘ１（Ｃｈｅ
ｎ，Ｚ．＆Ｚｈａｏ，Ｈ．Ａ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ
ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｍｉｎｇ
ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３，ｅ１５４
（２００５））中に、標的部位をコードするオリゴヌクレオチド二本鎖をライゲートする
ことによりアセンブルした。部位枯渇実験のため、異なるスペーサー配列を含有する２つ
の別個のライブラリーを生成した。それぞれのライブラリーのため、スペーサー配列に隣
接する８つのランダム化ヌクレオチド（ＰＡＭに代えて）を含有するオリゴヌクレオチド
をボトム鎖プライマーと複合体化させ、クレノウ（－エキソ）を使用してフィルインした
（表１１参照）。得られた産物をＥｃｏＲＩにより消化し、ＥｃｏＲＩ／ＳｐｈＩ消化ｐ
１１－ｌａｃＹ－ｗｔｘ１中にライゲートした。２つの部位枯渇ライブラリーの推定複雑
度は、４×１０６個超のクローンであった。
ヒト細胞実験のため、ＣＡＧプロモーターを含有するプラスミドからヒトコドン最適化
野生型およびバリアントＳａＣａｓ９を発現させた（表１２）。ＢｓｍＢＩ消化ＶＶＴ１
（実施例１～２参照またはＢＰＫ２６６０（全長１２０ｎｔのｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲ
ＮＡ ｓｇＲＮＡまたは８４ｎｔの短縮リピート：アンチリピートバージョンをそれぞれ
含有する）中に、スペーサー配列をコードするオリゴヌクレオチド二本鎖をライゲートす
ることにより、ｓｇＲＮＡ発現プラスミド（Ｕ６プロモーターを含有する）を生成した。
ヒト発現のために本試験において使用される全てのｓｇＲＮＡは、Ｕ６プロモーターから
の適切な発現を確保するためのスペーサーの５’末端における１つのグアニンを含み、既
に記載のもの（Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔ
ｉｎｇ ｕｓｉｎｇ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９．Ｎａｔ
ｕｒｅ ５２０，１８６－１９１（２０１５））と類似する短縮ｓｇＲＮＡ（図３７Ａ～
Ｂ）も使用した。
Ｃａｓ９オルソログ配列の生物情報学的分析
従来の研究（Ｆｏｎｆａｒａ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ ｏｆ Ｃａｓ９
ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｃｈａｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ ｏ
ｆ ｄｕａｌ－ＲＮＡ ａｎｄ Ｃａｓ９ ａｍｏｎｇ ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ ｔｙ
ｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ ４２，２５７７－２５９０（２０１４）；Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎ ｖ
ｉｖｏ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９．Ｎａｔｕｒｅ ５２０，１８６－１９１（２０１５）；Ａｎｄ
ｅｒｓ，Ｃ．，Ｎｉｅｗｏｅｈｎｅｒ，Ｏ．，Ｄｕｅｒｓｔ，Ａ．＆Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．Ｓ
ｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ＰＡＭ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔａｒｇｅｔ
ＤＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｃａｓ９ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ
．Ｎａｔｕｒｅ ５１３，５６９－５７３（２０１４））において実施されたアラインメ
ントと同様に、ＣｌｕｓｔａｌＷ２（ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕ
ｓｔａｌｗ２／）を使用してＳｐＣａｓ９およびＳａＣａｓ９の両方と類似するＣａｓ９
オルソログをアラインした。Ｇｅｎｅｉｏｕｓバージョン８．１．６およびＥＳＰｒｉｐ
ｔ（ｅｓｐｒｉｐｔ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ＥＳＰｒｉｐｔ／ＥＳＰｒｉｐｔ／）を使用して
、得られた系統樹およびタンパク質アラインメントを可視化した。
細菌ベース陽性選択アッセイ
細菌陽性選択アッセイは、既に記載のとおり実施した（実施例１～２参照）。簡潔に述
べると、陽性選択プラスミドを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＷ２５１４１（λＤＥ
３）（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
３８，２４１１－２４２７（２０１０））中に、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡプラスミドを形質
転換した。非選択（クロラムフェニコール）および選択（クロラムフェニコール＋１０ｍ
Ｍのアラビノース）条件上の両方で形質転換物をプレーティングした。生存率：（選択プ
レート上のコロニーの数／非選択プレート上のコロニーの数）×１００を計算することに
より、選択プラスミドのＣａｓ９開裂を推定した。代替ＰＡＭを認識し得るＳａＣａｓ９
バリアントについて選択するため、ＮＮＡＡＧＴ（配列番号４１）、ＮＮＡＧＧＴ（配列
番号４２）、ＮＮＣＡＧＴ（配列番号５１１）、ＮＮＣＧＧＴ（配列番号５１２）、ＮＮ
ＴＡＧＴ（配列番号５１３）、またはＮＮＴＧＧＴ（配列番号５１４）ＰＡＭを有する陽
性選択プラスミドを含有するコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＷ２５１４１（λＤ
Ｅ３）中に、突然変異ＰＩドメインを有する野生型およびＲ１０１５Ｑライブラリーを形
質転換した。選択条件上でプレーティングすることにより、約１×１０５個のクローンを
スクリーニングし、選択プラスミドを開裂することが想定されるＳａＣａｓ９バリアント
を含有する生存コロニーをミニプレップした（ＭＧＨ ＤＮＡ Ｃｏｒｅ）。全てのバリ
アントを陽性選択アッセイにおいて個々に再スクリーニングし、約２０％超の生存率を有
するものをシーケンシングして代替ＰＡＭの認識に要求される突然変異を決定した。
細菌ベース部位枯渇アッセイ
部位枯渇実験は、既に記載のとおり実施した（実施例１～２参照）。簡潔に述べると、
野生型、触媒的に不活性な（Ｄ１０Ａ／Ｈ５５７Ａ）、またはＫＫＨバリアントＳａＣａ
ｓ９／ｓｇＲＮＡプラスミドのいずれかを含有するコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）
ＢＷ２５１４１（λＤＥ３）中に、ランダム化ＰＡＭライブラリーをエレクトロポレート
した。１×１０５個超のコロニーをクロラムフェニコール／カルベニシリンプレート上で
プレーティングし、生存コロニー内に含有されるＣａｓ９標的化に耐性であるＰＡＭを有
する選択プラスミドをマキシプレップ（Ｑｉａｇｅｎ）により単離した。表１１に列記さ
れるプライマーを使用して、スペーサー配列およびＰＡＭを含有するプラスミドの領域を
ＰＣＲ増幅した。ＫＡＰＡ ＨＴＰライブラリー調製キット（ＫＡＰＡ ＢｉｏＳｙｓｔ
ｅｍｓ）を使用し、それぞれの部位枯渇条件からの約５００ｎｇの精製ＰＣＲ産物を使用
して二重インデックス化Ｔｒｕ－ｓｅｑ Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブラリー
を生成してから、Ｄａｎａ－Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＣｏｒｅにおいてＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑハイス
ループットシーケンシングランした。部位枯渇実験からのデータを既に記載のとおり分析
し（実施例１～２参照）、但し、スクリプトを改変して８つのランダム化ヌクレオチドを
分析した。任意の所与のＰＡＭの選択後ＰＡＭ枯渇値（ＰＰＤＶ）：そのＰＡＭの選択後
頻度と、選択前ライブラリー頻度との比を計算することにより、ＰＡＭを認識するＣａｓ
９の能力を決定した。触媒的に不活性なＳａＣａｓ９を使用する対照実験を使用して０．
７９４のＰＰＤＶが、インプットライブラリーに対する統計的に有意な枯渇を表すことを
確立した。
ヒト細胞培養および形質移入
本発明者らの協力者Ｔ．Ｃａｔｈｏｍｅｎ氏（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）から入手したＵ２Ｏ
Ｓ細胞、およびＥＧＦＰ－ＰＥＳＴレポーター遺伝子の単一インテグレートコピーを保有
するＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞（Ｒｅｙｏｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．ＦＬＡＳＨ ａｓｓｅｍｂ
ｌｙ ｏｆ ＴＡＬＥＮｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｏｍｅ
ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３０，４６０－４６５（２０１２））
を、１０％のＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、および２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡ
Ｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有するＡｄｖａｎｃｅｄＤＭＥＭ培地（Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地中で３７℃、５％のＣＯ２を用いて培養した。
細胞系アイデンティティは、ＳＴＲプロファイリング（ＡＴＣＣ）およびディープシーケ
ンシングによりバリデートし、細胞をマイコプラズマ汚染について週２回試験した。Ｕ２
ＯＳ．ＥＧＦＰ培養培地に、４００μｇ／ｍＬのＧ４１８をさらに補給した。Ｌｏｎｚａ
４Ｄ－ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒのＤＮ－１００プログラムを製造業者の説明書に従っ
て使用して、７５０ｎｇのＣａｓ９プラスミドおよび２５０ｎｇのｓｇＲＮＡプラスミド
により、細胞を同時形質移入した。
ヒト細胞ＥＧＦＰ崩壊アッセイ
ＥＧＦＰ崩壊実験は、既に記載のとおり実施した（Ｆｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ－
ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ
ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．
Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，８２２－８２６（２０１３）；Ｒｅｙｏｎ，Ｄ．
ｅｔ ａｌ．ＦＬＡＳＨ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＴＡＬＥＮｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－
ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
３０，４６０－４６５（２０１２））。形質移入の約５２時間後、Ｆｏｒｔｅｓｓａフ
ローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して形質移入Ｕ２ＯＳ．Ｅ
ＧＦＰ細胞中のＥＧＦＰ蛍光を計測した。Ｃａｓ９および空のＵ６プロモータープラスミ
ドの陰性対照形質移入を使用して全ての実験について約２．５％のバックグラウンドＥＧ
ＦＰ損失を確立した（図中に赤色破線として表す）。
Ｔ７Ｅ１アッセイ
Ｔ７Ｅ１アッセイは、既に記載のとおり実施して（Ｒｅｙｏｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．ＦＬ
ＡＳＨ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＴＡＬＥＮｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐ
ｕｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３０，４６０－
４６５（２０１２））ヒト細胞中の内在性遺伝子座におけるＣａｓ９誘導突然変異誘発を
定量した。形質移入の約７２時間後、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＤＮＡｄｖａｎｃｅ Ｇｅｎ
ｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇ
ｅｎｏｍｉｃｓ）を使用してゲノムＤＮＡを単離した。表１１に列記されるプライマーを
使用して約１００ｎｇのゲノムＤＮＡから、標的遺伝子座をＰＣＲ増幅した。Ａｇｅｎｃ
ｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＸＰクリーンアップステップ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅ
ｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）後、約２００ｎｇの精製ＰＣＲ産物を変性し、ハイブリダイズし
てからＴ７Ｅ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により消化した。２回目の
クリーンアップステップ後、Ｑｉａｘｃｅｌキャピラリー電気泳動装置（Ｑｉａｇｅｎ）
を使用して突然変異誘発頻度を定量した。
ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ実験
ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ実験は、既に記載のとおり実施および分析した（Ｔｓａｉ，Ｓ．Ｑ
．ｅｔ ａｌ．ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ ｅｎａｂｌｅｓ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｐｒｏ
ｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－
Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３，１８７－１９７（
２０１５））。簡潔に述べると、Ｕ２ＯＳ細胞を上記のとおり、Ｃａｓ９およびｓｇＲＮ
Ａプラスミド、ならびにＮｄｅＩ部位が埋め込まれた１００ｐｍｏｌのリン酸化ホスホロ
チオエート修飾二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）により形質移入した。
制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析を実施してｄｓＯＤＮタグインテグレーション頻度の頻
度を決定し（実施例１～２参照：Ｔｓａｉ，Ｓ．Ｑ．ｅｔ ａｌ．ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ
ｅｎａｂｌｅｓ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｏｆｆ－ｔａｒ
ｇｅｔ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３，１８７－１９７（２０１５））、Ｔ７Ｅ１アッセイを実
施してオンターゲットＣａｓ９突然変異誘発頻度を定量した。ｄｓＯＤＮタグ特異的増幅
およびライブラリー調製（Ｔｓａｉ，Ｓ．Ｑ．ｅｔ ａｌ．ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ ｅｎａ
ｂｌｅｓ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ
ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３，１８７－１９７（２０１５））を実施してから、Ｉｌｌｕｍｉ
ｎａ ＭｉＳｅｑ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを使用してハイスループットシーケンシングを行
った。潜在的なオフターゲット部位をマッピングした場合、オンターゲットスペーサー配
列に対するアラインメントについてのカットオフを２１ヌクレオチドスペーサーについて
８ミスマッチに、２２ヌクレオチドスペーサーについて９ミスマッチに、および２３ヌク
レオチドスペーサーについて１０ミスマッチに設定した。潜在的なＤＮＡまたはＲＮＡバ
ルジ（Ｌｉｎ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍｓ ｈａｖｅ
ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ ｏｒ ｄ
ｅｌｅｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ ａｎｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮ
Ａ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２，７４７３－７４
８５（２０１４））を有するオフターゲット部位をマニュアルアラインメントにより同定
した。
Figure 2024123232000036
Figure 2024123232000037
Figure 2024123232000038
Figure 2024123232000039
Figure 2024123232000040
実施例３．黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９の
ＰＡＭ特異性の遺伝子操作
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼによる部位特異的ＤＮＡ開裂は、主に、ＲＮＡ－
ＤＮＡ相互作用によりガイドされるが、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）のＣａ
ｓ９媒介認識も要求する。一般に使用される化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９は、そのＮＧＧ ＰＡＭ内の２つのヌクレオチドを規定
するが、望ましい特性を有する他のＣａｓ９オルソログは、より長鎖のＰＡＭを認識する
。伸長ＰＡＭ配列は、特異性の関連から潜在的に有利である一方、ゲノム編集用途のため
のＣａｓ９オルソログの標的化範囲を制限し得る。このようなＣａｓ９オルソログにより
標的化可能な配列の範囲を拡大する１つの考えられる方針は、ＰＡＭ内のある位置につい
ての緩和した特異性を有するバリアントを進化させることであり得る。ここで、本発明者
らは、分子進化を使用して黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕ
ｓ）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）（ウイルス送達を要求する用途に有用なより小さいサイズ
のオルソログ）のＮＮＧＲＲＴ（配列番号４６）ＰＡＭ特異性を改変した。本発明者らが
同定した１つのバリアントは、ＫＫＨ ＳａＣａｓ９と称され、ＮＮＮＲＲＴ ＰＡＭを
有する内在性ヒト標的部位におけるロバストなゲノム編集活性を示す。重要なことに、Ｇ
ＵＩＤＥ－ｓｅｑ法を使用して、本発明者らは、野生型およびＫＫＨ ＳａＣａｓ９の両
方がヒト細胞中で同等数のオフターゲット効果を誘導することを示した。ＫＫＨ ＳａＣ
ａｓ９は、ＳａＣａｓ９の標的化範囲をほぼ２～４倍だけ増加させ、それは、野生型ヌク
レアーゼにより変更することができない配列の標的化を可能とした。より一般に、これら
の結果は、Ｃａｓ９オルソログの標的化範囲を拡大するためのＰＡＭ特異性緩和の実行可
能性を実証する。本発明者らの分子進化方針は、ＰＡＭに接触する特異的残基の構造情報
も先験的知識も要求せず、したがって、広範なＣａｓ９オルソログに適用可能であるはず
である。
結果
本発明者らは、構造情報を要求しない、緩和したＰＡＭ認識特異性を有するＣａｓ９バ
リアントを遺伝子操作するための偏りのない遺伝的アプローチを考案した。本発明者らは
、本発明者らがそれらの試験を開始した時点で構造データが入手可能でないＳａＣａｓ９
を使用してこの方針を試験した。初期ステップにおいて、本発明者らは、構造的に十分に
特徴付けされたＳｐＣａｓ９（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４８，１
４７７－１４８１（２０１５）；Ａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５１３，
５６９－５７３（２０１４）；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１４）
；Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１４））との配列比較によりＳａ
Ｃａｓ９についてのＰＡＭ相互作用ドメインを保守的に推定することを求めた。ＳｐＣａ
ｓ９およびＳａＣａｓ９は、一次配列レベルにおいてかなり異なるが（図２１ａ、図２９
）、１０個の追加のオルソログとのその両方のアラインメントにより、ＳａＣａｓ９につ
いての予測ＰＡＭ相互作用ドメインを保守的に定義することが可能となった（実施例３の
ための方法；図２９および３０参照）。
ＳａＣａｓ９ ＰＡＭ中の３番目の位置におけるグアニンは最も厳密に規定された塩基
であるため（Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５２０，１８６－１９１（２０１５
））、本発明者らは、予測ＰＩドメインをランダムに突然変異させ、本発明者らの既に記
載された細菌細胞ベース法（実施例１～２参照）を使用し、３番目のＰＡＭ位置における
３つの他の考えられるヌクレオチドのそれぞれ（すなわち、ＮＮ［Ａ／Ｃ／Ｔ］ＲＲＴ
ＰＡＭ（ＮＮＨＲＲＴ（配列番号４４））；図３１ａ）を有する部位を開裂し得る突然変
異体について選択することを試行した。ＮＮＡＲＲＴ（配列番号４３）およびＮＮＣＲＲ
Ｔ（配列番号４７）ＰＡＭを含有する部位に対する選択からの生存バリアントの１つを除
き全てが、Ｒ１０１５Ｈ突然変異を保有した一方、本発明者らは、ＮＮＴＲＲＴ（配列番
号４８）ＰＡＭについての選択からいかなるバリアントも得なかった。これらの結果は、
Ｒ１０１５が、ＳｐＣａｓ９ ＰＡＭの３番目の位置におけるグアニンの認識に関与し得
ることを強力に示唆した。実際、本発明者らのアラインメントにおいて、ＳａＣａｓ９の
Ｒ１０１５は、ＰＡＭの３番目の塩基位置の認識に既に関与する残基のＳｐＣａｓ９ Ｒ
１３３５に近接することを見出した（図３０）（（実施例１～２参照；Ａｎｄｅｒｓ，Ｃ
．，Ｎｉｅｗｏｅｈｎｅｒ，Ｏ．，Ｄｕｅｒｓｔ，Ａ．＆Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．Ｓｔｒｕｃｔ
ｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ＰＡＭ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ ｒ
ｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｃａｓ９ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ．Ｎａｔｕ
ｒｅ ５１３，５６９－５７３（２０１４））。これと一致して、本発明者らは、Ｒ１０
１５のアラニンまたはグルタミンへの突然変異が、本発明者らの細菌選択系（図３１ｂ）
において試験した場合、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号４６）ＰＡＭを含有する標的部位に対す
るＳａＣａｓ９活性をかなり減少させることを見出した（図２１ｂ）。Ｒ１０１５に近接
する他の正荷電残基のアラニンまたはグルタミン置換は、ＳａＣａｓ９活性に対する強力
な効果を有さなかった（図２１ｂ、図３０）。
本発明者らの細菌ベース選択結果は、Ｒ１０１５Ｈ突然変異が、ＰＡＭの３番目の位置
におけるＳａＣａｓ９の特異性を少なくとも部分的に緩和し得ることも示唆した。しかし
ながら、本発明者らは、ＮＮＮＲＲＴ ＰＡＭの３番目の位置における任意のヌクレオチ
ドを有する部位に対して試験した場合、Ｒ１０１５Ｈ単一突然変異体が本発明者らの既に
記載されたヒト細胞ベースＥＧＦＰ崩壊アッセイ（Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌ ３１，８２２－８２６（２０１３）；Ｒｅｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａ
ｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３０，４６０－４６５（２０１２））において準最適活性を
有することを見出した（図２１ｃ）。これは、ヒト細胞中でＲ１０１５Ｈ突然変異体の活
性を増加または最適化させるために追加の突然変異が要求され得ることを示唆したため、
本発明者らは、Ｒ１０１５Ｑ突然変異も保有するＳａＣａｓ９の予測ＰＩドメインを包含
する領域をランダムに突然変異させた。次いで本発明者らは、本発明者らの細菌選択系を
使用して３つの異なるＮＮＨＲＲＴ（配列番号４４）ＰＡＭのそれぞれを有する標的部位
を開裂し得るこのライブラリーからのバリアントについて選択した。本発明者らは、Ｒ１
０１５Ｈではなく、Ｒ１０１５Ｑを使用した。なぜなら、この突然変異体が細菌中で活性
を示さなかったためである（図２１ｂ）。ＮＮＴＲＲＴ（配列番号４８）ＰＡＭに対して
選択した場合、生存クローンはここでも観察されなかったが、ＮＮＡＲＲＴ（配列番号４
３）またはＮＮＣＲＲＴ（配列番号４７）に対するＲ１０１５Ｑバリアントについての選
択は、Ｅ７８２、Ｋ９２９、Ｎ９６８における突然変異、および驚くべきことに、１０１
５におけるＱのＨへの突然変異を生じさせた。
野生型ＳａＣａｓ９からの選択結果と組み合わせると、全ての選択にわたり同定された
最も高頻度のミスセンス突然変異は、Ｅ７８２Ｋ、Ｋ９２９Ｒ、Ｎ９６８Ｋ、およびＲ１
０１５Ｈであり（図２１ｄ）、それらの突然変異の組合せが、ＳａＣａｓ９ ＰＡＭの３
番目の位置におけるＡまたはＣを含有する部位の効率的な開裂を許容し得ることを示唆し
た。したがって、本発明者らは、ＰＡＭ（すなわち、ＮＮＮＲＲＴ ＰＡＭ上）の３番目
の位置における４つの塩基のそれぞれを保有する部位に標的化されるｓｇＲＮＡを用いる
ヒト細胞ベースＥＧＦＰ崩壊アッセイを使用してそれらの突然変異の異なる組合せを含有
するＳａＣａｓ９バリアントを試験した（図２１ｅ、図３２）。本発明者らは、三重突然
変異体の組合せＥ７８２Ｋ／Ｎ９６８Ｋ／Ｒ１０１５ＨおよびＥ７８２Ｋ／Ｋ９２９Ｒ／
Ｒ１０１５Ｈを有するバリアントが、ＮＮＮＲＲＴ ＰＡＭを有する部位において高度に
活性である一方（図２１ｅ、図３２）、４つ全ての突然変異を含有する四重突然変異バリ
アント（Ｅ７８２Ｋ／Ｋ９２９Ｒ／Ｎ９６８Ｋ／Ｒ１０１５Ｈ）が、それらの部位に対す
る一般により低い活性を有することを見出した（図３２）。本発明者らは、さらなる特徴
付けのためにＥ７８２Ｋ／Ｎ９６８Ｋ／Ｒ１０１５Ｈ（以下、ＫＫＨバリアントと称する
）を選択し、本発明者らのヒト細胞ベースＥＧＦＰ崩壊アッセイを使用してＫＫＨバリア
ントを含む３つ全ての置換が活性に要求されることを確認した（図２１ｅ）。
ＫＫＨおよび野生型ＳａＣａｓ９のＰＡＭ特異性をより包括的に定義するため、本発明
者らは、本発明者らの既に記載された細菌細胞ベース部位枯渇アッセイ（実施例１～２参
照）を使用した（図３３）。この方法は、選択後ＰＡＭ枯渇値（ＰＰＤＶ）として定量さ
れる、ランダム化ＰＡＭ配列を担持するＤＮＡプラスミドの相対開裂（およびしたがって
細菌細胞中の枯渇）を同定することにより、Ｃａｓ９ＰＡＭ特異性プロファイルを生じさ
せる。本発明者らは、ＰＡＭに代えて８つのランダム化塩基をそれぞれ有する２つの異な
るスペーサー配列を有するライブラリーを使用して野生型およびＫＫＨ ＳａＣａｓ９の
両方を用いる部位枯渇実験を実施した（図３３）。触媒的に不活性なＳａＣａｓ９を使用
する対照実験は、任意のＰＡＭ配列の枯渇をほとんど示さず（図３４ａ）、それは、統計
的に有意な枯渇についての閾値を０．７９４のＰＰＤＶとして確立することを可能とした
（図３４ｂ）。先行実験は、本発明者らの細菌部位枯渇アッセイにおける＜０．２のＰＰ
ＤＶを有するＰＡＭを、本発明者らのヒト細胞ベースＥＧＦＰ崩壊アッセイにおいて効率
的に開裂し得ることを示した（実施例１～２参照）。野生型ＳａＣａｓ９について、最も
枯渇したＰＡＭ（２つのライブラリーから得られた平均ＰＰＤＶに基づく）は、予測され
るとおり、４つのＮＮＧＲＲＴ（配列番号４６）（ＰＡＭ（図２１ｆおよび図３４ｃ）で
あった。興味深いことに、＜０．１の平均ＰＰＤＶを有する他のＰＡＭは、形態ＮＮＧＲ
ＲＮ（配列番号４９）のものを含み（図３４ｄ）、それは、本発明者らの細菌ベースアッ
セイにおいて一部のスペーサー配列についてＰＡＭの最後の位置が、Ｔとして十分に規定
され得ないことを示唆した（しかし、従来の報告は、インビトロＰＡＭ枯渇アッセイ、Ｃ
ｈＩＰ－ｓｅｑ、および内在性ヒト部位の標的化によりＰＡＭの６番目の位置におけるチ
ミンが非常に好ましいことを実証した（Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎ ｖｉｖｏ
ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅ
ｕｓ Ｃａｓ９．Ｎａｔｕｒｅ ５２０，１８６－１９１（２０１５）））。対照的に、
ＫＫＨバリアントについて、＜０．２の平均ＰＰＤＶを有するＰＡＭは、ＮＮＧＲＲＴ（
配列番号４６）ＰＡＭだけでなく、４つ全てのＮＮＡＲＲＴ（配列番号４３）、４つ全て
のＮＮＣＲＲＴ（配列番号４７）、および４つのＮＮＴＲＲＴ（配列番号４８）ＰＡＭの
３つも含んだ（図２１ｆ、図３４ｃおよび３４ｅ）。これらの結果は、ＫＫＨ ＳａＣａ
ｓ９が、その野生型相当物に対して拡大したＰＡＭ標的化範囲を有すると考えられること
を示唆した。
ヒト細胞中でのＫＫＨ ＳａＣａｓ９バリアントのロバストネスを評価するため、本発
明者らは、種々のＮＮＮＲＲＴ ＰＡＭを含有する５５個の異なる内在性遺伝子標的部位
に対するその活性を試験した（図２２ａ）。ＫＫＨバリアントは、効率的な活性を示し、
平均突然変異誘発頻度は全ての部位にわたり２４．７％であり、部位の８０％（５５個の
部位の４４個）が、５％超の崩壊を示した。５５個全ての部位にわたるＫＫＨ ＳａＣａ
ｓ９活性の分析により、ＰＡＭの３番目の位置（ＮＮ［Ｇ＞Ａ＝Ｃ＞Ｔ］ＲＲＴ；図２２
ｂ）、およびＰＡＭの４番目／５番目の位置（ＮＮＮ［ＡＧ＞ＧＧ＞ＧＡ＞ＡＡ］Ｔ；図
２２ｃ）についての順序付けられた優先性が明らかになった。これと一致して、本発明者
らは、ＮＮＮＲＲＴ ＰＡＭの３番目／４番目／５番目の位置の１６個の考えられる組合
せ間の差異を観察した（図３５ａ）。ＫＫＨ ＳａＣａｓ９は、２１～２３ヌクレオチド
に及ぶスペーサー長さ（図２２ｄ）、変動ＧＣ含有率を有するスペーサー配列（図３５ｂ
）、および変動ＧＣ含有率を有するＰＡＭ（図３５ｃ）に対して効率的に機能した。低程
度、中程度、および高程度の効率（それぞれ０～１０％、１０～３０％、および＞３０％
の平均突然変異誘発頻度）で開裂された部位から導かれた配列ロゴにより、ＮＮＮＲＲＴ
ＰＡＭの４番目および５番目の位置以外の標的部位全体にわたる希少な配列優先性、お
よびおそらく高程度の効率で開裂された部位上の２番目のＰＡＭ位置におけるグアニンに
ついてのわずかな優先性が明らかになった（図３５ｄ）。
ＫＫＨバリアントが、野生型ＳａＣａｓ９により標的化することができないＰＡＭの改
変を可能とすることを実証するため、本発明者らは、種々のＮＮＮＲＲＴ ＰＡＭを担持
する部位に対するヒト細胞中のそれらのヌクレアーゼの直接比較を実施した。本発明者ら
のＥＧＦＰ崩壊アッセイおよび１６個の内在性ヒト遺伝子標的を使用する１６個の部位の
評価（それぞれ図２２ｅおよび２２ｆ）は、ＫＫＨ ＳａＣａｓ９がＮＮＮＲＲＴ ＰＡ
Ｍを担持する標的部位をロバストに改変する一方、野生型ＳａＣａｓ９はＮＮＧＲＲＴ（
配列番号４６）ＰＡＭを有する部位のみを効率的に標的化することを示した。ＮＮＨＲＲ
Ｔ（配列番号４４）ＰＡＭを有する２４個全ての部位について、ＫＫＨバリアントは、Ｎ
ＮＧＲＲＴ（配列番号４６）ＰＡＭを有する８つの部位に対して、野生型ＳａＣａｓ９よ
りもかなり高い率の突然変異誘発を誘導し、ＫＫＨ ＳａＣａｓ９は、野生型と比較して
同等またはわずかに低いレベルの突然変異誘発を誘導した（図２２ｅおよび２２ｆ）。こ
れらの結果は、まとめて、ＫＫＨバリアントがＮＮＮＲＲＴ ＰＡＭを有する部位を開裂
し得、それにより、現在、ヒト細胞中で野生型ＳａＣａｓ９により効率的に変更すること
ができないＮＮＨＲＲＴ（配列番号４４）ＰＡＭを有する部位の標的化が可能となること
を実証する。
ＳａＣａｓ９のゲノムワイド特異性に対するＫＫＨ突然変異の影響を評価するため、本
発明者らは、ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ（シーケンシングによるＤＳＢのゲノムワイドな偏りの
ない識別）法（Ｔｓａｉ，Ｓ．Ｑ．ｅｔ ａｌ．ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ ｅｎａｂｌｅｓ
ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｃｌｅａ
ｖａｇｅ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌ ３３，１８７－１９７（２０１５））を使用して野生型およびＫＫＨ ＳａＣａ
ｓ９のオフターゲットプロファイルを同一のｓｇＲＮＡと直接比較した。ＮＮＧＲＲＴ（
配列番号４６）ＰＡＭを含有する６つの内在性ヒト遺伝子部位に標的化されるｓｇＲＮＡ
について試験した場合、本発明者らは、野生型およびＫＫＨ ＳａＣａｓ９が６つ全ての
部位についてほぼ同一のＧＵＩＤＥ－ｓｅｑタグインテグレーション率およびオンターゲ
ット開裂頻度を誘導することを観察した（それぞれ図３６ａおよび３６ｂ）。さらに、野
生型およびＫＫＨ ＳａＣａｓ９は、６つのｓｇＲＮＡのそれぞれを有する類似数のオフ
ターゲット部位における突然変異を誘導する（図２３ａおよび２３ｂ）。ＫＫＨバリアン
トについてのオフターゲット部位は、一般に、ＮＮＮＲＲＴ ＰＡＭモチーフに付着し、
野生型ＳａＣａｓ９についてのオフターゲット部位は、ＮＮＧＲＲ［Ｔ＞Ｇ］モチーフに
付着した（図２２ｂ）。６つの試験ｓｇＲＮＡのうちの最大数のオフターゲット部位を誘
導したｓｇＲＮＡの１つについて、本発明者らは、野生型およびＫＫＨ ＳａＣａｓ９に
ついて類似数のオフターゲット部位を観察した。しかしながら、オフターゲット部位は、
野生型およびＫＫＨ ＳａＣａｓ９間で部分的にのみ重複し、それは、それらの異なるＰ
ＡＭ特異性を考慮して予測することができたとおりである（図２３ｂおよび２３ｃ）。本
発明者らは、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号４６）ＰＡＭを有する部位の標的化のためのＫＫＨ
バリアントの使用を提唱しないが（野生型ＳａＣａｓ９は、それらの部位についてＫＫＨ
よりも高いオンターゲット活性を示し得るため）、これらの結果は、ＫＫＨ ＳａＣａｓ
９が、予測ＰＡＭを有するオフターゲット部位のみを開裂し、一般に、野生型ＳａＣａｓ
９について観察されるものと同等数のオフターゲット部位を誘導することを示唆する。
ＫＫＨ ＳａＣａｓ９のゲノムワイド特異性をさらに試験するため、本発明者らは、Ｎ
ＮＨＲＲＴ（配列番号４４）ＰＡＭを含有する部位に標的化される５つの追加のｓｇＲＮ
Ａを試験した（図２３ｄおよび２３ｅ）。ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑにより検出されたオフター
ゲット部位は、一般に、（既に公開された実験において野生型ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣ
ａｓ９バリアントについて観察された数と同等に数が少なく（実施例１～２参照（Ｔｓａ
ｉ，Ｓ．Ｑ．ｅｔ ａｌ．ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ ｅｎａｂｌｅｓ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄ
ｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ＣＲ
ＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３，１８７
－１９７（２０１５））、潜在的なＤＮＡおよびＲＮＡバルジ型オフターゲットを示し（
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ｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ ａｎｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２，７４７３－７４８５（
２０１４））、予測ＰＡＭ配列を含有した。まとめると、本発明者らの実験は、野生型お
よびＫＫＨ ＳａＣａｓ９のゲノムワイド特異性が類似することを実証し、一般に、ＧＵ
ＩＤＥ－ｓｅｑにより判断されるとおりヒト細胞中の少ない数のオフターゲット突然変異
を示す。
野生型ＳａＣａｓ９はＮＮＧＲＲＴ（配列番号４６）ＰＡＭの標的化のための最適な選
択を保つが、本発明者らが本明細書に記載するＫＫＨ ＳａＣａｓ９バリアントは、ＮＮ
ＡＲＲＴ（配列番号４３）およびＮＮＣＲＲＴ（配列番号４７）ＰＡＭを有する部位をロ
バストに標的化し得、ＮＮＴＲＲＴ（配列番号４８）ＰＡＭを有する部位についての妥当
な良好な率を有する。したがって、本発明者らは、ＫＫＨバリアントがＳａＣａｓ９の標
的化範囲をランダムＤＮＡ配列中でほぼ２～４倍だけ増加させ、それにより、高精度の標
的化を要求する種々の異なる用途におけるＳａＣａｓ９のより広い利用の見込みを改善す
ることを保守的に推定する。ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑを使用して、本発明者らは、ＮＮＧＲＲ
Ｔ（配列番号４６）ＰＡＭを含有する同一部位に標的化される場合、ＫＫＨ ＳａＣａｓ
９が、野生型ＳａＣａｓ９と類似数のオフターゲット突然変異を誘導することを実証した
。さらに、ＫＫＨ ＳａＣａｓ９は、ＮＮＨＲＲＴ（配列番号４４）ＰＡＭを担持する部
位に標的化される場合、少数のみのオフターゲット突然変異を誘導する。ＫＫＨ ＳａＣ
ａｓ９は野生型ＳａＣａｓ９に対して改変ＰＡＭ配列を認識するが、本発明者らの知見は
、プロトスペーサーおよびＰＡＭの合計の組合せ長さがＫＫＨバリアントについてヒトゲ
ノムに妥当にオルソゴナルであるために依然として十分に長い（２４～２６ｂｐ）ことを
考慮すると完全に驚くべきことではない。さらに、ＰＡＭ認識の改変は、Ｃａｓ９／ｓｇ
ＲＮＡのその標的部位との相互作用のエネルギー論を変更することにより特異性を改善し
得ることが考えられる（トランケートｓｇＲＮＡ（Ｆｕ，Ｙ．，Ｓａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｄ．
，Ｒｅｙｏｎ，Ｄ．，Ｃａｓｃｉｏ，Ｖ．Ｍ．＆Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．Ｋ．Ｉｍｐｒｏｖｉｎ
ｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｕｓｉｎｇ
ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２，２
７９－２８４（２０１４））またはＤ１１３５Ｅ ＳｐＣａｓ９突然変異体（実施例１～
２参照）の改善された特異性について既に提案された機序と類似する）。
実施例４．ＳｐＣａｓ９－ＶＱＲバリアントの活性の改善
ＳｐＣａｓ９－ＶＱＲバリアントはＮＧＡＧ＞ＮＧＡＡ＝ＮＧＡＴ＞ＮＧＡＣのＮＧＡ
Ｎ ＰＡＭについての優先性を有するため、本発明者らは、ＮＧＡＨ ＰＡＭ（Ｈ＝Ａ、
Ｃ、またはＴ）に対する改善された活性を有する誘導体バリアントについて選択すること
を求めた。ＮＧＡＡ、ＮＧＡＴ、またはＮＧＡＣ ＰＡＭのいずれかを有する標的部位を
含有する細胞に対するＲ１３３５Ｑライブラリー（ランダムに突然変異誘発したＰＩドメ
インを有する）についての選択により、変更ＰＡＭ特異性を与える突然変異を含有する追
加のクローンをシーケンシングすることが可能となった。これらのクローンの配列により
、ＮＧＡＡ、ＮＧＡＴ、またはＮＧＡＣ ＰＡＭへのＰＡＭ特異性の変更に重要であり得
る追加の突然変異が明らかになった。
これらの選択の結果に基づき、ＶＱＲバリアントおよび２４個の他の誘導体バリアント
を細菌中のＮＧＡＧ、ＮＧＡＡ、ＮＧＡＴ、およびＮＧＡＣ ＰＡＭ部位に対して試験し
た。多数のこれらの誘導体バリアントは、ＮＧＡＨ ＰＡＭ部位に対してＶＱＲバリアン
トよりも良好に生存し、それらの多くはＧ１２１８Ｒ突然変異を含有した（表７および図
２４）。
Figure 2024123232000041
細菌スクリーンからの結果が、それらの追加の突然変異の一部がＮＧＡＨ ＰＡＭ部位
に対する活性を改善することを実証したことを考慮して、本発明者らは、ＥＧＦＰ崩壊ア
ッセイにおいてヒト細胞中で最良の候補の一部を試験した。本発明者らが観察したことは
、多数のそれらのバリアント、例として、ＶＲＱＲ、ＮＲＱＲ、およびＹＲＱＲバリアン
トがＶＱＲバリアントよりも、ＮＧＡＨ部位の標的化において優れていることである（表
８および図２５）。これらのクローンおよびＶＱＲバリアント間の主な差異は、それらが
Ｇ１２１８Ｒ突然変異を含むことである。
Figure 2024123232000042
ＶＲＱＲバリアントは試験したもののなかで最もロバストであると考えられるため、本
発明者らは、ヒト細胞中の９つの異なる内在性部位（ＮＧＡＡ、ＮＧＡＣ、ＮＧＡＴ、お
よびＮＧＡＧ ＰＡＭについて２つの部位、ならびにＮＧＣＧ ＰＡＭについて１つの部
位）に対するその活性をＶＱＲバリアントのものと比較した。このデータにより、ヒト細
胞中の全ての試験部位においてＶＲＱＲバリアントがＶＱＲバリアントよりも優れている
ことが明らかになる（図２６）。
ＶＲＱＲバリアントがＶＱＲバリアントに対して改善された活性を有することを実証し
た後、本発明者らは、追加の置換の追加が活性をさらに改善し得るか否かを決定すること
を求めた。本発明者らは、ＳｐＣａｓ９のＰＡＭ相互作用ポケットに近接する選択におけ
る追加の突然変異を観察したため、それらの突然変異のサブセットをＶＱＲおよびＶＲＱ
Ｒバリアントに追加し、ＮＧＡＧ、ＮＧＡＡ、ＮＧＡＴ、およびＮＧＡＣ ＰＡＭを含有
する部位に対して細菌中でスクリーニングした（表９および図２７）。多数の誘導体バリ
アントは、ＮＧＡＴおよびＮＧＡＣ ＰＡＭ部位に対するより高い活性を有することが考
えられるため、本発明者らは、ヒト細胞中のそれらのバリアントの試験を開始した。本発
明者らは、ヒト細胞ＥＧＦＰ崩壊アッセイにおいて、ＶＱＲまたはＶＲＱＲバックグラウ
ンドのいずれかへの追加の突然変異を含有する追加のバリアントを試験した。これらの実
験により、ここでも、ＶＲＱＲがＶＱＲバリアントよりも、ＮＧＡＨ ＰＡＭに対するよ
りロバストな活性を有すること、およびＶＲＱＲバックボーンへの追加の突然変異が有益
であることが明らかになった。
Figure 2024123232000043
まとめると、これらの結果は、ＳｐＣａｓ９－ＶＱＲバリアント中で追加の突然変異を
含めることは、ＮＧＡＮ ＰＡＭを含有する部位、具体的には、ＮＧＡＨ ＰＡＭを含有
する部位に対する活性を改善し得ることを示唆する。
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ｔａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｉｄｅｎ
ｔｉｆｉｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｏｆ
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Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３８，２４１１－２４２７（２０１０）．
２４．Ｇａｇｎｏｎ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉ
ｓ ｂｙ Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ａｎｄ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ
ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｇｕｉｄｅ ＲＮＡｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９，ｅ９８１８６（２
０１４）．
他の実施形態
本発明をその詳細な説明とともに記載した一方、上記の説明は、添付の特許請求の範囲
の範囲により定義される本発明の範囲を説明するものであり、限定するものではないこと
を理解すべきである。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内で
ある。
本発明は、以下の態様を含み得る。
［１］
以下の位置：Ｇ１１０４、Ｓ１１０９、Ｌ１１１１、Ｄ１１３５、Ｓ１１３６、Ｇ１２
１８、Ｎ１３１７、Ｒ１３３５、Ｔ１３３７の１つ以上における突然変異を有する単離膿
性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９
）タンパク質。
［２］
配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項１に記載
の単離タンパク質。
［３］
以下の突然変異：Ｇ１１０４Ｋ；Ｓ１１０９Ｔ；Ｌ１１１１Ｈ；Ｄ１１３５Ｖ；Ｄ１１
３５Ｅ；Ｄ１１３５Ｎ；Ｄ１３３５Ｙ；Ｓ１１３６Ｎ；Ｇ１２１８Ｒ；Ｎ１３１７Ｋ；Ｒ
１３３５Ｅ；Ｒ１３３５Ｑ；およびＴ１３３７Ｒの１つ以上を含む、請求項１に記載の単
離タンパク質。
［４］
以下の突然変異：Ｄ１１３５Ｅ（Ｄ１１３５Ｅバリアント）；Ｄ１１３５Ｖ／Ｒ１３３
５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ
／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｅ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（
ＥＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｎ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＮＲ
ＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｙ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＹＲＱ
Ｒバリアント）；Ｇ１１０４Ｋ／Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３
７Ｒ（ＫＶＲＱＲバリアント）；Ｓ１１０９Ｔ／Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３
５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＴＶＲＱＲバリアント）；Ｌ１１１１Ｈ／Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１
８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＨＶＲＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｖ／Ｓ１１３
６Ｎ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＮＲＱＲバリアント）；Ｄ１１３
５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｎ１３１７Ｋ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＫＱＲバリアン
ト）；またはＤ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｅ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＥＲバリ
アント）を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
［５］
Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｄ８３９、Ｈ９８３、またはＤ９８６；およびＨ８４０またはＮ８
６３における突然変異からなる群から選択される、ヌクレアーゼ活性を減少させる１つ以
上の突然変異をさらに含む、請求項１に記載の単離タンパク質。
［６］
前記突然変異が、
（ｉ）Ｄ１０ＡまたはＤ１０Ｎ、および
（ｉｉ）Ｈ８４０Ａ、Ｈ８４０Ｎ、またはＨ８４０Ｙ
である、請求項５に記載の単離タンパク質。
［７］
以下の位置：Ｅ７８２、Ｎ９６８、および／またはＲ１０１５の１つ以上における突然
変異を有する単離黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａ
ｓ９（ＳａＣａｓ９）タンパク質。
［８］
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項７に記載
の単離タンパク質。
［９］
以下の突然変異：Ｒ１０１５Ｑ、Ｒ１０１５Ｈ、Ｅ７８２Ｋ、Ｎ９６８Ｋ、Ｅ７３５Ｋ
、Ｋ９２９Ｒ、Ａ１０２１Ｔ、Ｋ１０４４Ｎ、Ｅ７８２Ｋ／Ｎ９６８Ｋ／Ｒ１０１５Ｈ（
ＫＫＨバリアント）；Ｅ７８２Ｋ／Ｋ９２９Ｒ／Ｒ１０１５Ｈ（ＫＲＨバリアント）；ま
たはＥ７８２Ｋ／Ｋ９２９Ｒ／Ｎ９６８Ｋ／Ｒ１０１５Ｈ（ＫＲＫＨバリアント）の１つ
以上を含む、請求項７に記載の単離タンパク質。
［１０］
Ｄ１０、Ｄ５５６、Ｈ５５７、および／またはＮ５８０における突然変異からなる群か
ら選択される、ヌクレアーゼ活性を減少させる１つ以上の突然変異をさらに含む、請求項
７に記載の単離タンパク質。
［１１］
前記突然変異が、Ｄ１０Ａ、Ｄ５５６Ａ、Ｈ５５７Ａ、Ｎ５８０Ａ、例えば、Ｄ１０Ａ
／Ｈ５５７Ａおよび／またはＤ１０Ａ／Ｄ５５６Ａ／Ｈ５５７Ａ／Ｎ５８０Ａである、請
求項７に記載の単離タンパク質。
［１２］
任意選択の介在リンカーにより異種機能ドメインに融合されている請求項１～１１のい
ずれか一項に記載の単離タンパク質を含む融合タンパク質であって、前記リンカーが前記
融合タンパク質の活性を妨害しない、融合タンパク質。
［１３］
前記異種機能ドメインが転写活性化ドメインである、請求項１２に記載の融合タンパク
質。
［１４］
前記転写活性化ドメインがＶＰ６４またはＮＦ－κＢ ｐ６５からのものである、請求
項１２に記載の融合タンパク質。
［１５］
前記異種機能ドメインが転写サイレンサーまたは転写抑制ドメインである、請求項１２
に記載の融合タンパク質。
［１６］
前記転写抑制ドメインが、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、ＥＲＦリプ
レッサードメイン（ＥＲＤ）、またはｍＳｉｎ３Ａ相互作用ドメイン（ＳＩＤ）である、
請求項１５に記載の融合タンパク質。
［１７］
前記転写サイレンサーがヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）である、請求項１５
に記載の融合タンパク質。
［１８］
前記異種機能ドメインが、ＤＮＡのメチル化状態を改変する酵素である、請求項１２に
記載の融合タンパク質。
［１９］
前記ＤＮＡのメチル化状態を改変する前記酵素がＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（Ｄ
ＮＭＴ）またはＴＥＴタンパク質である、請求項１８に記載の融合タンパク質。
［２０］
前記ＴＥＴタンパク質がＴＥＴ１である、請求項１９に記載の融合タンパク質。
［２１］
前記異種機能ドメインが、ヒストンサブユニットを改変する酵素である、請求項１２に
記載の融合タンパク質。
［２２］
ヒストンサブユニットを改変する前記酵素が、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（
ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（
ＨＭＴ）、またはヒストンデメチラーゼである、請求項１２に記載の融合タンパク質。
［２３］
前記異種機能ドメインが生物学的係留物である、請求項１２に記載の融合タンパク質。
［２４］
前記生物学的係留物がＭＳ２、Ｃｓｙ４またはラムダＮタンパク質である、請求項２３
に記載の融合タンパク質。
［２５］
前記異種機能ドメインがＦｏｋＩである、請求項１２に記載の融合タンパク質。
［２６］
請求項１～２５のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする単離核酸。
［２７］
請求項２６に記載の単離核酸を含むベクター。
［２８］
請求項２１に記載の単離核酸が、以下の位置：Ｇ１１０４、Ｓ１１０９、Ｌ１１１１、
Ｄ１１３５、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８、Ｎ１３１７、Ｒ１３３５、Ｔ１３３７の１つ以上
における突然変異を有する単離膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅ
ｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質を発現させるための１つ以上の調節ドメイ
ンに作動可能に結合されている、請求項２７に記載のベクター。
［２９］
請求項２１に記載の単離核酸が、以下の位置：Ｅ７８２、Ｎ９６８、および／またはＲ
１０１５の１つ以上における突然変異を有する単離黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）タンパク質を発現させるための１
つ以上の調節ドメインに作動可能に結合されている、請求項２７に記載のベクター。
［３０］
請求項２６に記載の核酸を含み、および任意選択的に請求項１～２５のいずれか一項に
記載のタンパク質を発現する宿主細胞、好ましくは哺乳動物宿主細胞。
［３１］
細胞のゲノムを変更する方法であって、前記細胞中で、請求項１～２５のいずれか一項
に記載の単離タンパク質または融合タンパク質、および前記細胞の前記ゲノムの選択部分
に相補的な領域を有するガイドＲＮＡを発現させるか、またはそれらと前記細胞を接触さ
せることを含む方法。
［３２］
前記単離タンパク質または融合タンパク質が、核局在化配列、細胞浸透ペプチド配列、
および／または親和性タグの１つ以上を含む、請求項３１に記載の方法。
［３３］
前記細胞が幹細胞である、請求項３１に記載の方法。
［３４］
前記細胞が胚性幹細胞、間葉系幹細胞、もしくは誘導多能性幹細胞であるか、生存動物
中に存在するか、または胚中に存在する、請求項３３に記載の方法。
［３５］
二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子を変更する方法であって、前記ｄｓＤＮＡ分子を、請
求項１～２５のいずれか一項に記載の単離タンパク質または融合タンパク質、および前記
ｄｓＤＮＡ分子の選択部分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡと接触させることを含む
方法。
［３６］
前記ｄｓＤＮＡ分子がインビトロで存在する、請求項３５に記載の方法。

Claims (36)

  1. 以下の位置：Ｇ１１０４、Ｓ１１０９、Ｌ１１１１、Ｄ１１３５、Ｓ１１３６、Ｇ１２
    １８、Ｎ１３１７、Ｒ１３３５、Ｔ１３３７の１つ以上における突然変異を有する単離膿
    性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９
    ）タンパク質。
  2. 配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項１に記載
    の単離タンパク質。
  3. 以下の突然変異：Ｇ１１０４Ｋ；Ｓ１１０９Ｔ；Ｌ１１１１Ｈ；Ｄ１１３５Ｖ；Ｄ１１
    ３５Ｅ；Ｄ１１３５Ｎ；Ｄ１３３５Ｙ；Ｓ１１３６Ｎ；Ｇ１２１８Ｒ；Ｎ１３１７Ｋ；Ｒ
    １３３５Ｅ；Ｒ１３３５Ｑ；およびＴ１３３７Ｒの１つ以上を含む、請求項１に記載の単
    離タンパク質。
  4. 以下の突然変異：Ｄ１１３５Ｅ（Ｄ１１３５Ｅバリアント）；Ｄ１１３５Ｖ／Ｒ１３３
    ５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ
    ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｅ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（
    ＥＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｎ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＮＲ
    ＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｙ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＹＲＱ
    Ｒバリアント）；Ｇ１１０４Ｋ／Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３
    ７Ｒ（ＫＶＲＱＲバリアント）；Ｓ１１０９Ｔ／Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３
    ５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＴＶＲＱＲバリアント）；Ｌ１１１１Ｈ／Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１
    ８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＨＶＲＱＲバリアント）；Ｄ１１３５Ｖ／Ｓ１１３
    ６Ｎ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＮＲＱＲバリアント）；Ｄ１１３
    ５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｎ１３１７Ｋ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＫＱＲバリアン
    ト）；またはＤ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｅ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＥＲバリ
    アント）を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  5. Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｄ８３９、Ｈ９８３、またはＤ９８６；およびＨ８４０またはＮ８
    ６３における突然変異からなる群から選択される、ヌクレアーゼ活性を減少させる１つ以
    上の突然変異をさらに含む、請求項１に記載の単離タンパク質。
  6. 前記突然変異が、
    （ｉ）Ｄ１０ＡまたはＤ１０Ｎ、および
    （ｉｉ）Ｈ８４０Ａ、Ｈ８４０Ｎ、またはＨ８４０Ｙ
    である、請求項５に記載の単離タンパク質。
  7. 以下の位置：Ｅ７８２、Ｎ９６８、および／またはＲ１０１５の１つ以上における突然
    変異を有する単離黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａ
    ｓ９（ＳａＣａｓ９）タンパク質。
  8. 配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項７に記載
    の単離タンパク質。
  9. 以下の突然変異：Ｒ１０１５Ｑ、Ｒ１０１５Ｈ、Ｅ７８２Ｋ、Ｎ９６８Ｋ、Ｅ７３５Ｋ
    、Ｋ９２９Ｒ、Ａ１０２１Ｔ、Ｋ１０４４Ｎ、Ｅ７８２Ｋ／Ｎ９６８Ｋ／Ｒ１０１５Ｈ（
    ＫＫＨバリアント）；Ｅ７８２Ｋ／Ｋ９２９Ｒ／Ｒ１０１５Ｈ（ＫＲＨバリアント）；ま
    たはＥ７８２Ｋ／Ｋ９２９Ｒ／Ｎ９６８Ｋ／Ｒ１０１５Ｈ（ＫＲＫＨバリアント）の１つ
    以上を含む、請求項７に記載の単離タンパク質。
  10. Ｄ１０、Ｄ５５６、Ｈ５５７、および／またはＮ５８０における突然変異からなる群か
    ら選択される、ヌクレアーゼ活性を減少させる１つ以上の突然変異をさらに含む、請求項
    ７に記載の単離タンパク質。
  11. 前記突然変異が、Ｄ１０Ａ、Ｄ５５６Ａ、Ｈ５５７Ａ、Ｎ５８０Ａ、例えば、Ｄ１０Ａ
    ／Ｈ５５７Ａおよび／またはＤ１０Ａ／Ｄ５５６Ａ／Ｈ５５７Ａ／Ｎ５８０Ａである、請
    求項７に記載の単離タンパク質。
  12. 任意選択の介在リンカーにより異種機能ドメインに融合されている請求項１～１１のい
    ずれか一項に記載の単離タンパク質を含む融合タンパク質であって、前記リンカーが前記
    融合タンパク質の活性を妨害しない、融合タンパク質。
  13. 前記異種機能ドメインが転写活性化ドメインである、請求項１２に記載の融合タンパク
    質。
  14. 前記転写活性化ドメインがＶＰ６４またはＮＦ－κＢ ｐ６５からのものである、請求
    項１２に記載の融合タンパク質。
  15. 前記異種機能ドメインが転写サイレンサーまたは転写抑制ドメインである、請求項１２
    に記載の融合タンパク質。
  16. 前記転写抑制ドメインが、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、ＥＲＦリプ
    レッサードメイン（ＥＲＤ）、またはｍＳｉｎ３Ａ相互作用ドメイン（ＳＩＤ）である、
    請求項１５に記載の融合タンパク質。
  17. 前記転写サイレンサーがヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）である、請求項１５
    に記載の融合タンパク質。
  18. 前記異種機能ドメインが、ＤＮＡのメチル化状態を改変する酵素である、請求項１２に
    記載の融合タンパク質。
  19. 前記ＤＮＡのメチル化状態を改変する前記酵素がＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（Ｄ
    ＮＭＴ）またはＴＥＴタンパク質である、請求項１８に記載の融合タンパク質。
  20. 前記ＴＥＴタンパク質がＴＥＴ１である、請求項１９に記載の融合タンパク質。
  21. 前記異種機能ドメインが、ヒストンサブユニットを改変する酵素である、請求項１２に
    記載の融合タンパク質。
  22. ヒストンサブユニットを改変する前記酵素が、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（
    ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（
    ＨＭＴ）、またはヒストンデメチラーゼである、請求項１２に記載の融合タンパク質。
  23. 前記異種機能ドメインが生物学的係留物である、請求項１２に記載の融合タンパク質。
  24. 前記生物学的係留物がＭＳ２、Ｃｓｙ４またはラムダＮタンパク質である、請求項２３
    に記載の融合タンパク質。
  25. 前記異種機能ドメインがＦｏｋＩである、請求項１２に記載の融合タンパク質。
  26. 請求項１～２５のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする単離核酸。
  27. 請求項２６に記載の単離核酸を含むベクター。
  28. 請求項２１に記載の単離核酸が、以下の位置：Ｇ１１０４、Ｓ１１０９、Ｌ１１１１、
    Ｄ１１３５、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８、Ｎ１３１７、Ｒ１３３５、Ｔ１３３７の１つ以上
    における突然変異を有する単離膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅ
    ｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質を発現させるための１つ以上の調節ドメイ
    ンに作動可能に結合されている、請求項２７に記載のベクター。
  29. 請求項２１に記載の単離核酸が、以下の位置：Ｅ７８２、Ｎ９６８、および／またはＲ
    １０１５の１つ以上における突然変異を有する単離黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃ
    ｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）タンパク質を発現させるための１
    つ以上の調節ドメインに作動可能に結合されている、請求項２７に記載のベクター。
  30. 請求項２６に記載の核酸を含み、および任意選択的に請求項１～２５のいずれか一項に
    記載のタンパク質を発現する宿主細胞、好ましくは哺乳動物宿主細胞。
  31. 細胞のゲノムを変更する方法であって、前記細胞中で、請求項１～２５のいずれか一項
    に記載の単離タンパク質または融合タンパク質、および前記細胞の前記ゲノムの選択部分
    に相補的な領域を有するガイドＲＮＡを発現させるか、またはそれらと前記細胞を接触さ
    せることを含む方法。
  32. 前記単離タンパク質または融合タンパク質が、核局在化配列、細胞浸透ペプチド配列、
    および／または親和性タグの１つ以上を含む、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記細胞が幹細胞である、請求項３１に記載の方法。
  34. 前記細胞が胚性幹細胞、間葉系幹細胞、もしくは誘導多能性幹細胞であるか、生存動物
    中に存在するか、または胚中に存在する、請求項３３に記載の方法。
  35. 二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子を変更する方法であって、前記ｄｓＤＮＡ分子を、請
    求項１～２５のいずれか一項に記載の単離タンパク質または融合タンパク質、および前記
    ｄｓＤＮＡ分子の選択部分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡと接触させることを含む
    方法。
  36. 前記ｄｓＤＮＡ分子がインビトロで存在する、請求項３５に記載の方法。
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