JP2023160981A - 膜タンパク質を使用する治療用エクソソームの調製 - Google Patents
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Abstract
【課題】膜タンパク質を使用する治療用エクソソームの調製の提供。【解決手段】本発明は、エクソソームの表面上で富化すると新しく同定されたタンパク質を使用して治療用エクソソームを調製する方法に関する。具体的には、本発明は、エクソソームのアフィニティー精製のために該タンパク質を使用する方法を提供する。該タンパク質を使用することにより、治療ペプチドをエクソソーム上に局在化させ、エクソソームを特定の器官、組織または細胞に標的化する方法に関する。該方法は、エクソソームタンパク質の1つまたは複数を高密度で、またはエクソソームタンパク質の変異体もしくは断片を含む表面操作エクソソームの生成を伴う。【選択図】図8
Description
配列表
本出願は、ASCII形式で電子提出された配列表を含有し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。前記ASCIIコピーは、2018年8月22日に作製され、名称は40714PCT_CRF_sequencelisting.txtであり、サイズは175,092バイトである。
本出願は、ASCII形式で電子提出された配列表を含有し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。前記ASCIIコピーは、2018年8月22日に作製され、名称は40714PCT_CRF_sequencelisting.txtであり、サイズは175,092バイトである。
エクソソームは、細胞間コミュニケーションの重要なメディエーターである。これらは、がんなどの多くの疾患の診断及び予後における重要なバイオマーカーでもある。薬物送達ビヒクルとして、エクソソームは、多くの治療分野における新しい処置モダリティとして、従来の薬物送達方法よりも多くの利点を提供する。
エクソソームを治療目的で使用するには、エクソソームが、夾雑タンパク質、DNA、炭水化物、及び脂質を含むがこれらに限定されない不純物を含まないまたはほとんど含まないことが求められる。現在の精製方法では、有意な量のこれらの不純物を除去するための十分な選択性が得られないため、純度を向上させるために追加のプロセスが望まれる。
さらに、エクソソームがヒト疾患の処置においてより頻繁に使用されるようになるにつれ、分子標的化、免疫回避、及び制御薬物放出を付与するそれらの物理化学的パラメータが不均一性であるがゆえに、臨床的期待を満たすのに苦心する可能性がある。これは主に、エクソソーム特性(例えば、組成、サイズ、形状、剛性、表面電荷、親水性、安定性、ならびにリガンドの種類及び密度)、ペイロード特性(例えば、薬物の種類、可溶性、負荷、効力、投薬、免疫応答、及び放出速度論)及びエクソソーム輸送に対するin vivoでの生理学的障壁(例えば、免疫監視、粒子血管外漏出、組織標的化、組織透過、及び細胞取り込み)の不均一性と複雑性によるものである。かなりの努力がなされてきたが、所望の特性を有する治療用エクソソーム、例えば、治療ペイロードを含有し、適切な標的化部分を有するエクソソームの個別の亜集団を得るための有効な方法は、まだ容易に利用できる状態ではない。
エクソソームに基づく技術の治療使用及び他の用途をより良く可能にするために、エクソソームの個別の亜集団を生成、単離及び精製するための好適な方法が必要とされている。
本発明の態様は、治療使用のためのエクソソームを調製する新しい方法に関する。具体的には、本方法は、エクソソームの表面上で富化すると新しく同定された表面マーカーを使用する。具体的には、タンパク質の群(例えば、プロスタグランジンF2受容体ネガティブレギュレーター(PTGFRN);ベイシジン(BSG);免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー2(IGSF2);免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー3(IGSF3);免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー8(IGSF8);インテグリンベータ-1(ITGB1);インテグリンアルファ-4(ITGA4);4F2細胞表面抗原重鎖(SLC3A2);及びATP輸送体タンパク質のクラス(ATP1A1、ATP1A2、ATP1A3、ATP1A4、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B2、ATP2B3、ATP2B4))を、エクソソームの表面上で高度に富化すると同定した。
新しく同定されたタンパク質を、本発明の様々な実施形態において使用することができる。本発明の一態様は、新しく同定されたエクソソームタンパク質及び治療タンパク質をコンジュゲートすることにより融合タンパク質を生成すること、ならびに表面上に融合タンパク質を含有する操作されたエクソソームを産生することに関する。治療タンパク質のネイティブ完全長または生物学的に活性な断片は、エクソソーム富化タンパク質にコンジュゲートすることによってエクソソームの表面へと輸送されることができる。本明細書に提供する新しく同定されたエクソソームタンパク質を使用する方法は、表面操作エクソソームを産生する点において、当該分野で公知のいくつかの他のエクソソーム足場タンパク質(例えば、Lamp2B、PDGFR、ラクトアドヘリンCD9、CD63及び/もしくはCD81、またはその断片)を使用する方法よりも、優れている。理論により束縛されることを望まないが、新しく同定されたタンパク質は、当該分野で公知のエクソソーム足場タンパク質のいくつか-すなわち、テトラスパニン(tetraspannin)タンパク質、例えばCD9、CD63及びCD81がそのC末端及びN末端の両方をエクソソーム内腔内に有するために、より優れていると考えられる。
本発明の別の態様は、全てのエクソソームに共通する、または単一細胞型に由来する全てのエクソソームに共通するエクソソームタンパク質を使用する、不均一溶液、例えば細胞培養培地または血漿からのアフィニティー精製によるエクソソームの精製に関する。いくつかの実施形態は、エクソソームの亜集団に特異的な表面マーカーを使用することによる総エクソソームからのエクソソームの亜集団の単離に関する。
本発明の別の態様は、エクソソームが夾雑産物であるときに、試料からエクソソームを除去する方法に関する。例えば、天然または操作されたウイルスは、夾雑エクソソームから精製され得る。ゆえに、本明細書に記載のエクソソームタンパク質を使用して、類似のサイズ、形状、及び/または電荷の他の粒子が望ましい産物である場合に、生物学的プロセスからエクソソームを選択的に除去することができる。
本発明の別の態様は、より効率的なアフィニティー精製のために、または標的化部分もしくは治療関連タンパク質の表面上への提示のために、設計された表面操作エクソソームの生成または使用に関する。例えば、エクソソーム表面を、ネイティブ完全長エクソソームタンパク質及び/またはネイティブエクソソームタンパク質の断片もしくは改変タンパク質を表面上に高密度にて含有するように改変することができる。
本発明は、このような表面操作エクソソームを産生するための、産生細胞または産生細胞を生成する方法にさらに関する。外因性ポリヌクレオチドを、産生細胞へと一過的にまたは安定的に導入して、表面操作エクソソームを生成するための産生細胞を作成することができる。
具体的には、本発明のある態様は、エクソソームを単離する方法であって、(1)エクソソームを含む試料を提供するステップ;(2)試料を、標的タンパク質に対する親和性を有する結合剤と接触させるステップ、ここで標的タンパク質は、PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP輸送体またはその断片もしくは変異体を含む;ならびに(3)標的タンパク質及び結合剤間の結合に基づいてエクソソームを単離するステップを含む、前記方法に関する。
いくつかの実施形態では、試料は、in vitroで増殖した細胞から得られ、任意選択で、細胞は、HEK293細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、または間葉系幹細胞(MSC)である。いくつかの実施形態では、試料は、対象の体液から得られる。
いくつかの実施形態では、細胞は、標的タンパク質を発現するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、細胞は、標的タンパク質をコードする発現プラスミドを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、結合剤に対する親和性を有するタグを発現する外因性配列を含むように遺伝子改変され、外因性配列は、細胞のゲノムへと挿入される。いくつかの実施形態では、外因性配列は、PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2またはATP輸送体をコードする内因性配列の3’または5’末端に位置するゲノム部位に挿入される。いくつかの実施形態では、内因性配列は、IGSF8をコードしない。いくつかの実施形態では、外因性配列は、PTGFRN、BSG、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2またはATP輸送体をコードする内因性配列内に位置するゲノム部位に挿入される。
いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、タグ、及びPTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP輸送体またはその断片もしくは変異体を含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、エクソソームは、標的タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、IGSF8またはその断片もしくは改変体ではない。いくつかの実施形態では、細胞は、ADAM10の発現が低下するように遺伝子改変される。
いくつかの実施形態では、エクソソームは、標的タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、ITGB1、ITGA4、SLC3A2及びATP輸送体から選択される。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2またはATP輸送体の断片もしくは変異体を含む。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、配列番号33のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP輸送体またはその断片もしくは変異体、及び親和性タグを含む融合タンパク質であり、親和性タグは、結合剤に対して親和性を有する。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、IGSF8またはその断片もしくは改変体を含まない。
いくつかの実施形態では、結合剤は、免疫グロブリン、タンパク質、ペプチド、または低分子を含む。いくつかの実施形態では、結合剤は、固体支持体に付着しており、任意選択で、固体支持体は、多孔質アガロースビーズ、マイクロタイタープレート、磁気ビーズ、または膜を含む。
いくつかの実施形態では、固体支持体は、クロマトグラフィーカラムを形成する。いくつかの実施形態では、試料を結合剤と接触させるステップは、試料をクロマトグラフィーカラムに接触させることにより行われる。
いくつかの実施形態では、本方法は、(1)試料のサブセットを、異なる標的タンパク質に対する親和性を有する異なる結合剤と接触させるステップ;ならびに(2)異なる標的タンパク質及び異なる結合剤間の結合に基づいてエクソソームを単離するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、異なる標的タンパク質は、PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ATP輸送体またはその断片もしくは変異体を含む。いくつかの実施形態では、異なる標的タンパク質は、配列番号33のポリペプチドを含む。
本発明の別の態様は、本明細書に提供する方法により産生されるエクソソームに関する。
なおも別の態様では、本発明は、本発明のエクソソーム及び賦形剤を含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、エクソソーム源を含む試料よりも低い濃度のマクロ分子を含み、マクロ分子は、核酸、夾雑タンパク質、脂質、炭水化物、代謝産物、またはその組み合わせである。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、マクロ分子を実質的に含まない。
本発明の別の態様は、標的タンパク質を含むエクソソームであって、標的タンパク質の少なくとも一部が外因性配列から発現され、標的タンパク質が、PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP輸送体またはその断片もしくは変異体を含む、前記エクソソームに関する。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、IGSF8またはその断片もしくは変異体を含まない。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、配列番号33のポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、エクソソームは、標的タンパク質及び結合剤間の結合に基づいて単離される。
いくつかの実施形態では、エクソソームは、外因性配列を含むように遺伝子改変された細胞から産生され、任意選択で、細胞は、HEK293細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、または間葉系幹細胞(MSC)である。いくつかの実施形態では、細胞は、ADAM10の発現が低下するように遺伝子改変される。
いくつかの実施形態では、細胞は、外因性配列を含むプラスミドを含む。
いくつかの実施形態では、細胞は、細胞のゲノムへと挿入された外因性配列を含む。いくつかの実施形態では、外因性配列は、PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2またはATP輸送体をコードするゲノム配列の3’または5’末端に位置するゲノム部位へと挿入される。いくつかの実施形態では、外因性配列は、PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2またはATP輸送体をコードするゲノム配列へと挿入される。いくつかの実施形態では、外因性配列は、IGSF8をコードしない。
いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP輸送体、またはその断片もしくは変異体、及び親和性タグを含む融合タンパク質であり、親和性タグは、結合剤に対する親和性を有する。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、IGSF8またはその断片を含まない。
いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP輸送体、またはその断片もしくは変異体、及び治療ペプチドを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、IGSF8またはその断片を含まない。
治療ペプチドは、天然ペプチド、組み換えペプチド、合成ペプチド、または治療化合物へのリンカーからなる群より選択されることができる。治療化合物は、ヌクレオチド、アミノ酸、脂質、炭水化物、及び低分子からなる群より選択されることができる。
治療ペプチドは、抗体またはその断片もしくは変異体であることができる。治療ペプチドは、酵素、リガンド、受容体、またはその断片もしくは変異体であることができる。治療ペプチドは、抗微生物ペプチドまたはその断片もしくは変異体であることができる。
いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP輸送体、またはその断片もしくは変異体、及び標的化部分を含む融合タンパク質である。標的化部分は、器官、組織、または細胞に特異的であることができる。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、IGSF8またはその断片を含まない。
いくつかの実施形態では、エクソソームは、第二の、異なる標的タンパク質をさらに含み、異なる標的タンパク質は、PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP輸送体、またはその断片もしくは変異体を含む。いくつかの実施形態では、エクソソームは、異なる標的タンパク質及び異なる結合剤間の結合に基づいて単離される。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、IGSF8またはその断片を含まない。
一態様では、本発明は、本発明のエクソソーム及び賦形剤を含む医薬組成物に関する。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、マクロ分子を実質的に含まず、マクロ分子は、核酸、夾雑タンパク質、脂質、炭水化物、代謝産物、及びその組み合わせから選択される。
一態様では、本発明は、本明細書に提示するエクソソームを産生するための細胞に関する。
具体的には、いくつかの実施形態は、エクソソームを産生するための細胞であって、PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、またはATP輸送体をコードするゲノム配列へと挿入された外因性配列を含み、外因性配列及びゲノム配列は、融合タンパク質をコードする、前記細胞に関連する。いくつかの実施形態では、ゲノム配列は、IGSF8をコードしない。
外因性配列は、親和性タグをコードすることができる。
外因性配列は、治療ペプチドをコードすることができる。治療ペプチドは、天然ペプチド、組み換えペプチド、合成ペプチド、または治療化合物へのリンカーからなる群より選択されることができる。治療化合物は、ヌクレオチド、アミノ酸、脂質、炭水化物、及び低分子からなる群より選択されることができる。治療ペプチドは、抗体またはその断片もしくは変異体であることができる。治療ペプチドは、酵素、リガンド、受容体、またはその断片もしくは変異体であることができる。治療ペプチドは、抗微生物ペプチドまたはその断片もしくは変異体であることができる。
外因性配列は、標的化部分をコードすることができる。標的化部分は、器官、組織、または細胞に特異的であることができる。
いくつかの実施形態では、細胞株は、ADAM10の発現が低下するように遺伝子改変される。
一態様では、本発明は、本発明の細胞株から産生されるエクソソームを提供する。いくつかの実施形態では、エクソソームは、異なるエクソソームの表面上の異なる融合タンパク質よりも高い密度で表面上に融合タンパク質を含み、異なるエクソソームは、従来のエクソソームタンパク質をコードする異なるゲノム配列へと挿入された外因性配列を含む異なる細胞株から産生され、外因性配列及び異なるゲノム配列は、異なる融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、従来のエクソソームタンパク質は、CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPIアンカータンパク質、LAMP2、LAMP2B、及びその断片からなる群より選択される。
別の態様では、本発明は、非エクソソーム物質を単離する方法であって、エクソソーム及び非エクソソーム物質を含む試料を提供するステップ;試料を、標的タンパク質に対する親和性を有する結合剤と接触させるステップ、ここで標的タンパク質は、PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP輸送体またはその断片もしくは変異体を含み、それによりエクソソームを結合剤に結合させる;及び非エクソソーム物質を単離するステップを含む、前記方法に関する。
いくつかの実施形態では、非エクソソーム物質は、ウイルスまたはタンパク質である。いくつかの実施形態では、非エクソソーム物質は、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、または他のエンベロープウイルスもしくは非エンベロープウイルスである。いくつかの実施形態では、非エクソソーム物質は、組み換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、単離された非エクソソーム物質は、実質的にエクソソームを含まない。
いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、親和性タグをさらに含み、親和性タグは、結合剤に対する親和性を有する。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、配列番号33のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、結合剤は、免疫グロブリン、タンパク質、ペプチド、または低分子を含む。いくつかの実施形態では、結合剤は、固体支持体に付着しており、任意選択で、固体支持体は、多孔質アガロースビーズ、マイクロタイタープレート、磁気ビーズ、または膜を含む。いくつかの実施形態では、固体支持体は、クロマトグラフィーカラムを形成する。いくつかの実施形態では、試料を結合剤と接触させるステップは、試料をクロマトグラフィーカラムに接触させることにより行われる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する精製の方法は、ナノ小胞の精製のために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、ナノ小胞に関する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
エクソソームを単離する方法であって、
前記エクソソームを含む試料を提供するステップ;
前記試料を、標的タンパク質に対する親和性を有する結合剤と接触させるステップ、ここで前記標的タンパク質は、PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP輸送体またはその断片もしくは変異体を含む;ならびに
前記標的タンパク質及び前記結合剤間の結合に基づいて前記エクソソームを単離するステップを含む、前記方法。
(項目2)
前記試料が、in vitroで増殖した細胞から得られ、任意選択で前記細胞がHEK293細胞である、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記試料が、対象の体液から得られる、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記細胞が、前記標的タンパク質を発現するように遺伝子改変される、項目2に記載の方法。
(項目5)
前記細胞が、前記標的タンパク質をコードする発現プラスミドを含む、項目2または4に記載の方法。
(項目6)
前記細胞が、前記結合剤に対する親和性を有するタグを発現する外因性配列を含むように遺伝子改変され、前記外因性配列が前記細胞のゲノムへと挿入される、項目4に記載の方法。
(項目7)
前記外因性配列が、PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、ITGB1、ITGA4、SLC3A2またはATP輸送体をコードする内因性配列の3’または5’末端に位置するゲノム部位に挿入される、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記外因性配列が、PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、ITGB1、ITGA4、SLC3A2またはATP輸送体をコードする内因性配列内に位置するゲノム部位に挿入される、項目6に記載の方法。
(項目9)
前記標的タンパク質が、前記タグ、及びPTGFRN、BSG、IGSF3、IGSF2、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP輸送体またはその断片もしくは変異体を含む融合タンパク質である、項目7~8のいずれかに記載の方法。
(項目10)
前記細胞が、ADAM10の発現が低下するように遺伝子改変される、項目1~9のいずれかに記載の方法。
(項目11)
前記エクソソームが、前記標的タンパク質を含む、項目1~10のいずれかに記載の方法。
(項目12)
前記標的タンパク質が、PTGFRN、BSG、IGSF3、ITGB1、ITGA4、SLC3A2及びATP輸送体から選択される、項目1~11のいずれかに記載の方法。
(項目13)
前記標的タンパク質が、PTGFRN、BSG、IGSF3、IGSF2、ITGB1、ITGA4、SLC3A2またはATP輸送体の断片または変異体を含む、項目1~11のいずれかに記載の方法。
(項目14)
前記標的タンパク質が、配列番号33のポリペプチドを含む、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記標的タンパク質が、PTGFRN、BSG、IGSF3、IGSF2、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP輸送体またはその断片もしくは変異体、及び親和性タグを含む融合タンパク質であり、前記親和性タグが、前記結合剤に対する親和性を有する、項目13~14のいずれかに記載の方法。
(項目16)
前記結合剤が、免疫グロブリン、タンパク質、ペプチド、または低分子を含む、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記結合剤が、固体支持体に付着しており、任意選択で、前記固体支持体が、多孔質アガロースビーズ、マイクロタイタープレート、磁気ビーズ、または膜を含む、項目1~16のいずれかに記載の方法。
(項目18)
前記固体支持体が、クロマトグラフィーカラムを形成する、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記試料を前記結合剤と接触させるステップが、前記試料を前記クロマトグラフィーカラムに接触させることにより行われる、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記試料のサブセットを、異なる標的タンパク質に対する親和性を有する異なる結合剤と接触させるステップ;ならびに
前記異なる標的タンパク質及び前記異なる結合剤間の結合に基づいて前記エクソソームを単離するステップをさらに含む、項目1~19のいずれかに記載の方法。
(項目21)
前記異なる標的タンパク質が、PTGFRN、BSG、IGSF3、IGSF2、ATP輸送体またはその断片もしくは変異体を含む、項目1~20のいずれかに記載の方法。
(項目22)
前記異なる標的タンパク質が、PTGFRNまたはその断片もしくは変異体を含む、項目1~21のいずれかに記載の方法。
(項目23)
前記異なる標的タンパク質が、配列番号33のポリペプチドを含む、項目22に記載の方法。
(項目24)
項目1~23のいずれかに記載の方法により産生される、エクソソーム。
(項目25)
項目24に記載のエクソソーム及び賦形剤を含む、医薬組成物。
(項目26)
前記医薬組成物が、前記試料よりも低い濃度のマクロ分子を含み、前記マクロ分子が、核酸、夾雑タンパク質、脂質、炭水化物、代謝産物、またはその組み合わせである、項目25に記載の医薬組成物。
(項目27)
前記医薬組成物が、前記マクロ分子を実質的に含まない、項目26に記載の医薬組成物。
(項目28)
標的タンパク質を含むエクソソームであって、前記標的タンパク質の少なくとも一部が外因性配列から発現され、前記標的タンパク質が、PTGFRN、BSG、IGSF3、IGSF8、IGSF2、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP輸送体またはその断片もしくは変異体を含む、前記エクソソーム。
(項目29)
前記標的タンパク質が、前記エクソソームの表面上に、異なるエクソソームの異なる標的タンパク質よりも高い密度で存在し、前記異なる標的タンパク質が、従来のエクソソームタンパク質またはその変異体を含む、項目28に記載のエクソソーム。
(項目30)
前記従来のエクソソームタンパク質が、CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPIアンカータンパク質、ラクトアドヘリン、LAMP2、LAMP2B、及びその断片からなる群より選択される、項目29に記載のエクソソーム。
(項目31)
前記標的タンパク質が、配列番号33のポリペプチドを含む、項目28~30のいずれかに記載のエクソソーム。
(項目32)
前記標的タンパク質及び結合剤間の結合に基づいて単離される、項目28~31のいずれかに記載のエクソソーム。
(項目33)
前記外因性配列を含むように遺伝子改変された細胞から産生され、任意選択で、前記細胞がHEK293細胞である、項目28~32のいずれかに記載のエクソソーム。
(項目34)
前記細胞が、ADAM10の発現が低下するように遺伝子改変される、項目33に記載のエクソソーム。
(項目35)
前記細胞が、前記外因性配列を含むプラスミドを含む、項目33~34のいずれかに記載のエクソソーム。
(項目36)
前記細胞が、前記細胞のゲノムへと挿入された前記外因性配列を含む、項目33~35のいずれかに記載のエクソソーム。
(項目37)
前記外因性配列が、PTGFRN、BSG、IGSF3、IGSF2、ITGB1、ITGA4、SLC3A2またはATP輸送体をコードするゲノム配列の3’または5’末端に位置するゲノム部位へと挿入される、項目36に記載のエクソソーム。
(項目38)
前記外因性配列が、PTGFRN、BSG、IGSF3、IGSF2、ITGB1、ITGA4、SLC3A2またはATP輸送体をコードするゲノム配列へと挿入される、項目36に記載のエクソソーム。
(項目39)
前記標的タンパク質が、PTGFRN、BSG、IGSF3、IGSF2、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP輸送体、またはその断片もしくは変異体、及び親和性タグを含む融合タンパク質であり、前記親和性タグが、前記結合剤に対する親和性を有する、項目28~38のいずれかに記載のエクソソーム。
(項目40)
前記標的タンパク質が、PTGFRN、BSG、IGSF3、IGSF2、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP輸送体、またはその断片もしくは変異体、及び治療ペプチドを含む融合タンパク質である、項目28~38のいずれかに記載のエクソソーム。
(項目41)
前記治療ペプチドが、天然ペプチド、組み換えペプチド、合成ペプチド、または治療化合物へのリンカーからなる群より選択される、項目40に記載のエクソソーム。
(項目42)
前記治療化合物が、ヌクレオチド、アミノ酸、脂質、炭水化物、及び低分子からなる群より選択される、項目40に記載のエクソソーム。
(項目43)
前記治療ペプチドが、抗体またはその断片もしくは変異体である、項目40に記載のエクソソーム。
(項目44)
前記治療ペプチドが、酵素、リガンド、受容体、またはその断片もしくは変異体である、項目40に記載のエクソソーム。
(項目45)
前記治療ペプチドが、抗微生物ペプチドまたはその断片もしくは変異体である、項目40に記載のエクソソーム。
(項目46)
前記標的タンパク質が、PTGFRN、BSG、IGSF3、IGSF2、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP輸送体、またはその断片もしくは変異体、及び標的化部分を含む融合タンパク質である、項目28~38のいずれかに記載のエクソソーム。
(項目47)
前記標的化部分が、器官、組織、または細胞に特異的である、項目46に記載のエクソソーム。
(項目48)
異なる標的タンパク質をさらに含み、前記異なる標的タンパク質が、PTGFRN、BSG、IGSF3、IGSF2、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP輸送体、またはその断片もしくは変異体を含む、項目28~47のいずれかに記載のエクソソーム。
(項目49)
前記異なる標的タンパク質及び異なる結合剤間の結合に基づいて単離される、項目48に記載のエクソソーム。
(項目50)
項目28~49のいずれかに記載のエクソソーム及び賦形剤を含む、医薬組成物。
(項目51)
マクロ分子を実質的に含まず、前記マクロ分子が、核酸、夾雑タンパク質、脂質、炭水化物、代謝産物、及びその組み合わせから選択される、項目50に記載の医薬組成物。
(項目52)
項目28~49のいずれかに記載のエクソソームを産生するための細胞株。
(項目53)
エクソソームを産生するための細胞株であって、PTGFRN、BSG、IGSF3、IGSF2、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、またはATP輸送体をコードするゲノム配列に挿入された外因性配列を含み、前記外因性配列及び前記ゲノム配列が、融合タンパク質をコードする、前記細胞株。
(項目54)
前記外因性配列が、親和性タグをコードする、項目53に記載の細胞株。
(項目55)
前記外因性配列が、治療ペプチドをコードする、項目53に記載の細胞株。
(項目56)
前記治療ペプチドが、天然ペプチド、組み換えペプチド、合成ペプチド、または治療化合物へのリンカーからなる群より選択される、項目55に記載の細胞株。
(項目57)
前記治療化合物が、ヌクレオチド、アミノ酸、脂質、炭水化物、及び低分子からなる群より選択される、項目55に記載の細胞株。
(項目58)
前記治療ペプチドが、抗体またはその断片もしくは変異体である、項目55に記載の細胞株。
(項目59)
前記治療ペプチドが、酵素、リガンド、受容体、またはその断片もしくは変異体である、項目55に記載の細胞株。
(項目60)
前記治療ペプチドが、抗微生物ペプチドまたはその断片もしくは変異体である、項目55に記載の細胞株。
(項目61)
前記外因性配列が、標的化部分をコードする、項目53に記載の細胞株。
(項目62)
前記標的化部分が、器官、組織、または細胞に特異的である、項目61に記載の細胞株。
(項目63)
前記細胞株が、ADAM10の発現が低下するように遺伝子改変される、項目53~62のいずれかに記載の細胞株。
(項目64)
項目53~63のいずれかに記載の細胞株から産生される、エクソソーム。
(項目65)
前記エクソソームが、前記融合タンパク質を表面上に、異なるエクソソームの表面上の異なる融合タンパク質よりも高い密度で含み、前記異なるエクソソームが、従来のエクソソームタンパク質をコードする異なるゲノム配列へと挿入された前記外因性配列を含む異なる細胞株から産生され、前記外因性配列及び前記異なるゲノム配列が、前記異なる融合タンパク質をコードする、項目64に記載のエクソソーム。
(項目66)
前記従来のエクソソームタンパク質が、CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPIアンカータンパク質、ラクトアドヘリン、LAMP2、LAMP2B、及びその断片からなる群より選択される、項目65に記載のエクソソーム。
(項目67)
非エクソソーム物質を単離する方法であって、
エクソソーム及び前記非エクソソーム物質を含む試料を提供するステップ;
前記試料を、標的タンパク質に対する親和性を有する結合剤と接触させるステップ、ここで前記標的タンパク質は、PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP輸送体またはその断片もしくは変異体を含み、それにより前記エクソソームを前記結合剤に結合させる;及び
前記非エクソソーム物質を単離するステップを含む、前記方法。
(項目68)
前記非エクソソーム物質が、ウイルスまたはタンパク質である、項目67に記載の方法。
(項目69)
前記非エクソソーム物質が、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、または他のエンベロープウイルスもしくは非エンベロープウイルスである、項目68に記載の方法。
(項目70)
前記非エクソソーム物質が、組み換えタンパク質である、項目68に記載の方法。
(項目71)
前記単離された非エクソソーム物質が、実質的にエクソソームを含まない、項目67~70のいずれかに記載の方法。
(項目72)
前記標的タンパク質が、親和性タグをさらに含み、前記親和性タグが、前記結合剤に対する親和性を有する、項目67~71のいずれかに記載の方法。
(項目73)
前記標的タンパク質が、配列番号33のポリペプチドを含む、項目67~72のいずれかに記載の方法。
(項目74)
前記結合剤が、免疫グロブリン、タンパク質、ペプチド、または低分子を含む、項目67~73のいずれかに記載の方法。
(項目75)
前記結合剤が、固体支持体に付着しており、任意選択で、前記固体支持体が、多孔質アガロースビーズ、マイクロタイタープレート、磁気ビーズ、または膜を含む、項目67~74のいずれかに記載の方法。
(項目76)
前記固体支持体が、クロマトグラフィーカラムを形成する、項目75に記載の方法。
(項目77)
前記試料を前記結合剤と接触させるステップが、前記試料を前記クロマトグラフィーカラムに接触させることにより行われる、項目76に記載の方法。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
エクソソームを単離する方法であって、
前記エクソソームを含む試料を提供するステップ;
前記試料を、標的タンパク質に対する親和性を有する結合剤と接触させるステップ、ここで前記標的タンパク質は、PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP輸送体またはその断片もしくは変異体を含む;ならびに
前記標的タンパク質及び前記結合剤間の結合に基づいて前記エクソソームを単離するステップを含む、前記方法。
(項目2)
前記試料が、in vitroで増殖した細胞から得られ、任意選択で前記細胞がHEK293細胞である、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記試料が、対象の体液から得られる、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記細胞が、前記標的タンパク質を発現するように遺伝子改変される、項目2に記載の方法。
(項目5)
前記細胞が、前記標的タンパク質をコードする発現プラスミドを含む、項目2または4に記載の方法。
(項目6)
前記細胞が、前記結合剤に対する親和性を有するタグを発現する外因性配列を含むように遺伝子改変され、前記外因性配列が前記細胞のゲノムへと挿入される、項目4に記載の方法。
(項目7)
前記外因性配列が、PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、ITGB1、ITGA4、SLC3A2またはATP輸送体をコードする内因性配列の3’または5’末端に位置するゲノム部位に挿入される、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記外因性配列が、PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、ITGB1、ITGA4、SLC3A2またはATP輸送体をコードする内因性配列内に位置するゲノム部位に挿入される、項目6に記載の方法。
(項目9)
前記標的タンパク質が、前記タグ、及びPTGFRN、BSG、IGSF3、IGSF2、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP輸送体またはその断片もしくは変異体を含む融合タンパク質である、項目7~8のいずれかに記載の方法。
(項目10)
前記細胞が、ADAM10の発現が低下するように遺伝子改変される、項目1~9のいずれかに記載の方法。
(項目11)
前記エクソソームが、前記標的タンパク質を含む、項目1~10のいずれかに記載の方法。
(項目12)
前記標的タンパク質が、PTGFRN、BSG、IGSF3、ITGB1、ITGA4、SLC3A2及びATP輸送体から選択される、項目1~11のいずれかに記載の方法。
(項目13)
前記標的タンパク質が、PTGFRN、BSG、IGSF3、IGSF2、ITGB1、ITGA4、SLC3A2またはATP輸送体の断片または変異体を含む、項目1~11のいずれかに記載の方法。
(項目14)
前記標的タンパク質が、配列番号33のポリペプチドを含む、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記標的タンパク質が、PTGFRN、BSG、IGSF3、IGSF2、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP輸送体またはその断片もしくは変異体、及び親和性タグを含む融合タンパク質であり、前記親和性タグが、前記結合剤に対する親和性を有する、項目13~14のいずれかに記載の方法。
(項目16)
前記結合剤が、免疫グロブリン、タンパク質、ペプチド、または低分子を含む、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記結合剤が、固体支持体に付着しており、任意選択で、前記固体支持体が、多孔質アガロースビーズ、マイクロタイタープレート、磁気ビーズ、または膜を含む、項目1~16のいずれかに記載の方法。
(項目18)
前記固体支持体が、クロマトグラフィーカラムを形成する、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記試料を前記結合剤と接触させるステップが、前記試料を前記クロマトグラフィーカラムに接触させることにより行われる、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記試料のサブセットを、異なる標的タンパク質に対する親和性を有する異なる結合剤と接触させるステップ;ならびに
前記異なる標的タンパク質及び前記異なる結合剤間の結合に基づいて前記エクソソームを単離するステップをさらに含む、項目1~19のいずれかに記載の方法。
(項目21)
前記異なる標的タンパク質が、PTGFRN、BSG、IGSF3、IGSF2、ATP輸送体またはその断片もしくは変異体を含む、項目1~20のいずれかに記載の方法。
(項目22)
前記異なる標的タンパク質が、PTGFRNまたはその断片もしくは変異体を含む、項目1~21のいずれかに記載の方法。
(項目23)
前記異なる標的タンパク質が、配列番号33のポリペプチドを含む、項目22に記載の方法。
(項目24)
項目1~23のいずれかに記載の方法により産生される、エクソソーム。
(項目25)
項目24に記載のエクソソーム及び賦形剤を含む、医薬組成物。
(項目26)
前記医薬組成物が、前記試料よりも低い濃度のマクロ分子を含み、前記マクロ分子が、核酸、夾雑タンパク質、脂質、炭水化物、代謝産物、またはその組み合わせである、項目25に記載の医薬組成物。
(項目27)
前記医薬組成物が、前記マクロ分子を実質的に含まない、項目26に記載の医薬組成物。
(項目28)
標的タンパク質を含むエクソソームであって、前記標的タンパク質の少なくとも一部が外因性配列から発現され、前記標的タンパク質が、PTGFRN、BSG、IGSF3、IGSF8、IGSF2、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP輸送体またはその断片もしくは変異体を含む、前記エクソソーム。
(項目29)
前記標的タンパク質が、前記エクソソームの表面上に、異なるエクソソームの異なる標的タンパク質よりも高い密度で存在し、前記異なる標的タンパク質が、従来のエクソソームタンパク質またはその変異体を含む、項目28に記載のエクソソーム。
(項目30)
前記従来のエクソソームタンパク質が、CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPIアンカータンパク質、ラクトアドヘリン、LAMP2、LAMP2B、及びその断片からなる群より選択される、項目29に記載のエクソソーム。
(項目31)
前記標的タンパク質が、配列番号33のポリペプチドを含む、項目28~30のいずれかに記載のエクソソーム。
(項目32)
前記標的タンパク質及び結合剤間の結合に基づいて単離される、項目28~31のいずれかに記載のエクソソーム。
(項目33)
前記外因性配列を含むように遺伝子改変された細胞から産生され、任意選択で、前記細胞がHEK293細胞である、項目28~32のいずれかに記載のエクソソーム。
(項目34)
前記細胞が、ADAM10の発現が低下するように遺伝子改変される、項目33に記載のエクソソーム。
(項目35)
前記細胞が、前記外因性配列を含むプラスミドを含む、項目33~34のいずれかに記載のエクソソーム。
(項目36)
前記細胞が、前記細胞のゲノムへと挿入された前記外因性配列を含む、項目33~35のいずれかに記載のエクソソーム。
(項目37)
前記外因性配列が、PTGFRN、BSG、IGSF3、IGSF2、ITGB1、ITGA4、SLC3A2またはATP輸送体をコードするゲノム配列の3’または5’末端に位置するゲノム部位へと挿入される、項目36に記載のエクソソーム。
(項目38)
前記外因性配列が、PTGFRN、BSG、IGSF3、IGSF2、ITGB1、ITGA4、SLC3A2またはATP輸送体をコードするゲノム配列へと挿入される、項目36に記載のエクソソーム。
(項目39)
前記標的タンパク質が、PTGFRN、BSG、IGSF3、IGSF2、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP輸送体、またはその断片もしくは変異体、及び親和性タグを含む融合タンパク質であり、前記親和性タグが、前記結合剤に対する親和性を有する、項目28~38のいずれかに記載のエクソソーム。
(項目40)
前記標的タンパク質が、PTGFRN、BSG、IGSF3、IGSF2、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP輸送体、またはその断片もしくは変異体、及び治療ペプチドを含む融合タンパク質である、項目28~38のいずれかに記載のエクソソーム。
(項目41)
前記治療ペプチドが、天然ペプチド、組み換えペプチド、合成ペプチド、または治療化合物へのリンカーからなる群より選択される、項目40に記載のエクソソーム。
(項目42)
前記治療化合物が、ヌクレオチド、アミノ酸、脂質、炭水化物、及び低分子からなる群より選択される、項目40に記載のエクソソーム。
(項目43)
前記治療ペプチドが、抗体またはその断片もしくは変異体である、項目40に記載のエクソソーム。
(項目44)
前記治療ペプチドが、酵素、リガンド、受容体、またはその断片もしくは変異体である、項目40に記載のエクソソーム。
(項目45)
前記治療ペプチドが、抗微生物ペプチドまたはその断片もしくは変異体である、項目40に記載のエクソソーム。
(項目46)
前記標的タンパク質が、PTGFRN、BSG、IGSF3、IGSF2、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP輸送体、またはその断片もしくは変異体、及び標的化部分を含む融合タンパク質である、項目28~38のいずれかに記載のエクソソーム。
(項目47)
前記標的化部分が、器官、組織、または細胞に特異的である、項目46に記載のエクソソーム。
(項目48)
異なる標的タンパク質をさらに含み、前記異なる標的タンパク質が、PTGFRN、BSG、IGSF3、IGSF2、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP輸送体、またはその断片もしくは変異体を含む、項目28~47のいずれかに記載のエクソソーム。
(項目49)
前記異なる標的タンパク質及び異なる結合剤間の結合に基づいて単離される、項目48に記載のエクソソーム。
(項目50)
項目28~49のいずれかに記載のエクソソーム及び賦形剤を含む、医薬組成物。
(項目51)
マクロ分子を実質的に含まず、前記マクロ分子が、核酸、夾雑タンパク質、脂質、炭水化物、代謝産物、及びその組み合わせから選択される、項目50に記載の医薬組成物。
(項目52)
項目28~49のいずれかに記載のエクソソームを産生するための細胞株。
(項目53)
エクソソームを産生するための細胞株であって、PTGFRN、BSG、IGSF3、IGSF2、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、またはATP輸送体をコードするゲノム配列に挿入された外因性配列を含み、前記外因性配列及び前記ゲノム配列が、融合タンパク質をコードする、前記細胞株。
(項目54)
前記外因性配列が、親和性タグをコードする、項目53に記載の細胞株。
(項目55)
前記外因性配列が、治療ペプチドをコードする、項目53に記載の細胞株。
(項目56)
前記治療ペプチドが、天然ペプチド、組み換えペプチド、合成ペプチド、または治療化合物へのリンカーからなる群より選択される、項目55に記載の細胞株。
(項目57)
前記治療化合物が、ヌクレオチド、アミノ酸、脂質、炭水化物、及び低分子からなる群より選択される、項目55に記載の細胞株。
(項目58)
前記治療ペプチドが、抗体またはその断片もしくは変異体である、項目55に記載の細胞株。
(項目59)
前記治療ペプチドが、酵素、リガンド、受容体、またはその断片もしくは変異体である、項目55に記載の細胞株。
(項目60)
前記治療ペプチドが、抗微生物ペプチドまたはその断片もしくは変異体である、項目55に記載の細胞株。
(項目61)
前記外因性配列が、標的化部分をコードする、項目53に記載の細胞株。
(項目62)
前記標的化部分が、器官、組織、または細胞に特異的である、項目61に記載の細胞株。
(項目63)
前記細胞株が、ADAM10の発現が低下するように遺伝子改変される、項目53~62のいずれかに記載の細胞株。
(項目64)
項目53~63のいずれかに記載の細胞株から産生される、エクソソーム。
(項目65)
前記エクソソームが、前記融合タンパク質を表面上に、異なるエクソソームの表面上の異なる融合タンパク質よりも高い密度で含み、前記異なるエクソソームが、従来のエクソソームタンパク質をコードする異なるゲノム配列へと挿入された前記外因性配列を含む異なる細胞株から産生され、前記外因性配列及び前記異なるゲノム配列が、前記異なる融合タンパク質をコードする、項目64に記載のエクソソーム。
(項目66)
前記従来のエクソソームタンパク質が、CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPIアンカータンパク質、ラクトアドヘリン、LAMP2、LAMP2B、及びその断片からなる群より選択される、項目65に記載のエクソソーム。
(項目67)
非エクソソーム物質を単離する方法であって、
エクソソーム及び前記非エクソソーム物質を含む試料を提供するステップ;
前記試料を、標的タンパク質に対する親和性を有する結合剤と接触させるステップ、ここで前記標的タンパク質は、PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP輸送体またはその断片もしくは変異体を含み、それにより前記エクソソームを前記結合剤に結合させる;及び
前記非エクソソーム物質を単離するステップを含む、前記方法。
(項目68)
前記非エクソソーム物質が、ウイルスまたはタンパク質である、項目67に記載の方法。
(項目69)
前記非エクソソーム物質が、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、または他のエンベロープウイルスもしくは非エンベロープウイルスである、項目68に記載の方法。
(項目70)
前記非エクソソーム物質が、組み換えタンパク質である、項目68に記載の方法。
(項目71)
前記単離された非エクソソーム物質が、実質的にエクソソームを含まない、項目67~70のいずれかに記載の方法。
(項目72)
前記標的タンパク質が、親和性タグをさらに含み、前記親和性タグが、前記結合剤に対する親和性を有する、項目67~71のいずれかに記載の方法。
(項目73)
前記標的タンパク質が、配列番号33のポリペプチドを含む、項目67~72のいずれかに記載の方法。
(項目74)
前記結合剤が、免疫グロブリン、タンパク質、ペプチド、または低分子を含む、項目67~73のいずれかに記載の方法。
(項目75)
前記結合剤が、固体支持体に付着しており、任意選択で、前記固体支持体が、多孔質アガロースビーズ、マイクロタイタープレート、磁気ビーズ、または膜を含む、項目67~74のいずれかに記載の方法。
(項目76)
前記固体支持体が、クロマトグラフィーカラムを形成する、項目75に記載の方法。
(項目77)
前記試料を前記結合剤と接触させるステップが、前記試料を前記クロマトグラフィーカラムに接触させることにより行われる、項目76に記載の方法。
図は、単に例示を目的として本発明の様々な実施形態を図示する。当業者は、本明細書に例示する構造及び方法の代替の実施形態が、本明細書に記載の本発明の原理から逸脱することなく採用され得ることを、以下の考察から容易に認識するだろう。
1.定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用する全ての技術及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解される意味を有する。本明細書で用いる場合、以下の用語は、下記のそれらに帰する意味を有する。
別段の定義がない限り、本明細書で使用する全ての技術及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解される意味を有する。本明細書で用いる場合、以下の用語は、下記のそれらに帰する意味を有する。
本明細書で用いる場合、「細胞外小胞」または「EV」という用語は、内部空間を囲む膜を含む細胞由来の小胞を指す。細胞外小胞は、それらが由来する細胞より小さな直径を有する全て膜に包まれた小胞を含む。一般に、細胞外小胞は、20nmから1000nmの範囲の直径を有し、内部空間内に、細胞外小胞の外表面上に表示される、及び/または膜に貫通する様々なマクロ分子カーゴを含むことができる。前記カーゴは、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、低分子、及び/またはそれらの組み合わせを含むことができる。例として、限定されないが、細胞外小胞には、アポトーシス小体、細胞の断片、直接的または間接的な操作により(例えば、連続的な押し出しまたはアルカリ溶液を用いる処理により)細胞から誘導される小胞、小胞化したオルガネラ、及び生細胞から(例えば、直接的な原形質膜の発芽または後期エンドソームの原形質膜との融合により)産生される小胞が含まれる。細胞外小胞は、生きているもしくは死んだ生物、外植した組織もしくは器官、及び/または培養した細胞から誘導することができる。
本明細書で用いる場合、「エクソソーム」という用語は、内部空間を囲む膜を含む細胞由来の小さな(20~300nmの直径、より好ましくは40~200nmの直径)小胞を指し、これは直接的な原形質膜出芽または後期エンドソームの原形質膜との融合によって前記細胞から生じる。エクソソームは、脂質または脂肪酸及びポリペプチドを含み、任意選択でペイロード(例えば、治療剤)、レシーバ(例えば、標的化部分)、ポリヌクレオチド(例えば、核酸、RNA、またはDNA)、糖(例えば、単糖、多糖、またはグリカン)または他の分子を含む。エクソソームは、産生細胞から誘導することができ、そのサイズ、密度、生化学的パラメータ、またはそれらの組み合わせに基づき、産生細胞から単離することができる。エクソソームは、細胞外小胞の一種である。一般に、エクソソーム産生/生合成は、産生細胞の破壊をもたらさない。
本明細書で用いる場合、「ナノ小胞」という用語は、内部空間を囲む膜を含む細胞由来の小さな(20~250nmの直径、より好ましくは30~150nmの直径)小胞を指し、これは直接的または間接的な操作によって前記細胞から生じ、前記ナノ小胞は前記操作無しには前記産生細胞から産生されない。前記産生細胞の適切な操作には、限定されないが、連続的な押し出し、アルカリ溶液を用いた処理、超音波処理、またはそれらの組み合わせが含まれる。ナノ小胞の産生は、いくつかの例では、前記産生細胞の破壊をもたらす可能性がある。好ましくは、ナノ小胞の集団は、原形質膜からの直接的出芽または後期エンドソームの原形質膜との融合の手段による産生細胞に由来する小胞を実質的に含まない。ナノ小胞は、脂質または脂肪酸及びポリペプチドを含み、任意選択でペイロード(例えば、治療剤)、レシーバ(例えば、標的化部分)、ポリヌクレオチド(例えば、核酸、RNA、またはDNA)、糖(例えば、単糖、多糖、またはグリカン)または他の分子を含む。ナノ小胞は、ひとたび前記操作に従って産生細胞から生じると、そのサイズ、密度、生化学的パラメータ、またはそれらの組み合わせに基づき、産生細胞から単離することができる。ナノ小胞は、細胞外小胞の一種である。
本明細書で用いる場合、「表面操作エクソソーム」という用語は、その組成が改変された膜を有するエクソソームを指す。例えば、膜は、タンパク質、脂質、低分子、炭水化物、等の組成が改変されている。組成は、化学的、物理的、もしくは生物学的方法により、または化学的、物理的、もしくは生物学的方法により以前にもしくは同時に改変された細胞から産生されることにより変えることができる。具体的には、組成は、遺伝子工学により、または遺伝子工学により以前に改変された細胞から産生されることにより、変えることができる。
本明細書で用いる場合、タンパク質の「改変」という用語は、タンパク質の非突然変異アミノ酸配列に対して、少なくとも15%同一性を有するタンパク質を指す。タンパク質の改変は、タンパク質の断片または変異体を含む。タンパク質の改変は、タンパク質の断片または変異体への化学的、または物理的改変も含むことができる。
本明細書で用いる場合、タンパク質の「断片」という用語は、天然に生じるタンパク質と比較して、N及び/またはC末端が欠失しているタンパク質を指す。好ましくは、PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、またはATP輸送体の断片は、エクソソームを特異的に標的とする能力を保持する。このような断片は、「機能性断片」とも称される。断片がその意味において機能性断片であるか否かは、エクソソームのタンパク質内容物を決定する任意の公知の方法により評価することができ、それには、ウェスタンブロット、FACS分析及び、断片の、例えば、GFPのような自家蛍光タンパク質との融合が含まれる。特定の実施形態では、PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP輸送体の断片は、天然に生じるPTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、またはATP輸送体の、エクソソームを特異的に標的とする能力の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%または100%を保持する。
本明細書で用いる場合、タンパク質の「変異体」という用語は、当該分野で公知の方法により整列させた際に、ある特定のアミノ酸配列同一性を別のタンパク質と共有するタンパク質を指す。タンパク質の変異体は、別のタンパク質における置換、挿入、欠失、フレームシフトまたは再編成を含むことができる。特定の実施形態では、変異体は、PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP輸送体またはPTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、もしくはATP輸送体の断片に対して少なくとも70%同一性を有する変異体である。いくつかの実施形態では、PTGFRNの変異体または断片の変異体は、少なくとも70%、80%、85%、90%、95%または99%配列同一性を、配列番号1に従うPTGFRNまたはその機能性断片と共有する。いくつかの実施形態では、BSGの変異体または断片の変異体は、少なくとも70%、80%、85%、90%、95%または99%配列同一性を、配列番号9に従うBSGまたはその機能性断片と共有する。いくつかの実施形態では、IGSF2の変異体または断片の変異体は、少なくとも70%、80%、85%、90%、95%または99%配列同一性を、配列番号34に従うIGSF2またはその機能性断片と共有する。いくつかの実施形態では、IGSF3の変異体または断片の変異体は、少なくとも70%、80%、85%、90%、95%または99%配列同一性を、配列番号20に従うIGSF3またはその機能性断片と共有する。いくつかの実施形態では、IGSF8の変異体または断片の変異体は、少なくとも70%、80%、85%、90%、95%または99%配列同一性を、配列番号14に従うIGSF8またはその機能性断片と共有する。いくつかの実施形態では、ITGB1の変異体または断片の変異体は、少なくとも70%、80%、85%、90%、95%または99%配列同一性を、配列番号21に従うITGB1またはその機能性断片と共有する。いくつかの実施形態では、ITGA4の変異体または断片の変異体は、少なくとも70%、80%、85%、90%、95%または99%配列同一性を、配列番号22に従うITGA4またはその機能性断片と共有する。いくつかの実施形態では、SLC3A2の変異体または断片の変異体は、少なくとも70%、80%、85%、90%、95%または99%配列同一性を、配列番号23に従うSLC3A2またはその機能性断片と共有する。いくつかの実施形態では、ATP1A1の変異体または断片の変異体は、少なくとも70%、80%、85%、90%、95%または99%配列同一性を、配列番号24に従うATP1A1またはその機能性断片と共有する。いくつかの実施形態では、ATP1A2の変異体または断片の変異体は、少なくとも70%、80%、85%、90%、95%または99%配列同一性を、配列番号25に従うATP1A2またはその機能性断片と共有する。いくつかの実施形態では、ATP1A3の変異体または断片の変異体は、少なくとも70%、80%、85%、90%、95%または99%配列同一性を、配列番号26に従うATP1A3またはその機能性断片と共有する。いくつかの実施形態では、ATP1A4の変異体または断片の変異体は、少なくとも70%、80%、85%、90%、95%または99%配列同一性を、配列番号27に従うATP1A4またはその機能性断片と共有する。いくつかの実施形態では、ATP1B3の変異体または断片の変異体は、少なくとも70%、80%、85%、90%、95%または99%配列同一性を、配列番号28に従うATP1B3またはその機能性断片と共有する。いくつかの実施形態では、ATP2B1の変異体または断片の変異体は、少なくとも70%、80%、85%、90%、95%または99%配列同一性を、配列番号29に従うATP2B1またはその機能性断片と共有する。いくつかの実施形態では、ATP2B2の変異体または断片の変異体は、少なくとも70%、80%、85%、90%、95%または99%配列同一性を、配列番号30に従うATP2B2またはその機能性断片と共有する。いくつかの実施形態では、ATP2B3の変異体または断片の変異体は、少なくとも70%、80%、85%、90%、95%または99%配列同一性を、配列番号31に従うATP2B3またはその機能性断片と共有する。いくつかの実施形態では、ATP2B4の変異体または断片の変異体は、少なくとも70%、80%、85%、90%、95%または99%配列同一性を、配列番号32に従うATP2B4またはその機能性断片と共有する。上記事例のそれぞれにおいて、変異体または断片の変異体が、エクソソームを特異的に標的とする能力を保持することが好ましい。
比較のための配列の整列方法は、当該分野で周知である。様々なプログラム及び整列アルゴリズムが、Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981);Needleman and Wunsch,J.Mol.Bio.48:443(1970);Pearson and Lipman,Methods in Mol.Biol.24:307-31(1988);Higgins and Sharp,Gene 73:15 237-44(1988);Higgins
and Sharp,CABIOS 5:151-3(1989)Corpet et
al.,Nuc.Acids Res.16:10881-90(1988);Huang et al.,Comp.Appl.BioSci.8:155-65(1992);及びPearson et al.,Meth.Mol.Biol.24:307-31(1994)に記載されている。NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)[Altschul 20 et al.,J.Mol.Biol.215:403-10(1990)Jは、National
Center for Biological Information(NBCl,Bethesda,Md.)を含む数箇所の供給源、ならびにインターネット上から入手可能であり、配列分析プログラムblastp、blasm、blastx、tblastn及びtblastxに関連して使用される。BLAST及び該プログラムを使用して配列同一性を決定する方法の説明は、NIH(National Institute of Health)下のNCBI(National Center for Biotechnology Information)の公式ウェブサイトにてアクセスできる。
and Sharp,CABIOS 5:151-3(1989)Corpet et
al.,Nuc.Acids Res.16:10881-90(1988);Huang et al.,Comp.Appl.BioSci.8:155-65(1992);及びPearson et al.,Meth.Mol.Biol.24:307-31(1994)に記載されている。NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)[Altschul 20 et al.,J.Mol.Biol.215:403-10(1990)Jは、National
Center for Biological Information(NBCl,Bethesda,Md.)を含む数箇所の供給源、ならびにインターネット上から入手可能であり、配列分析プログラムblastp、blasm、blastx、tblastn及びtblastxに関連して使用される。BLAST及び該プログラムを使用して配列同一性を決定する方法の説明は、NIH(National Institute of Health)下のNCBI(National Center for Biotechnology Information)の公式ウェブサイトにてアクセスできる。
本明細書に提供する任意のタンパク質の列挙は、タンパク質の機能性変異体を包含する。タンパク質の「機能性変異体」という用語は、エクソソームを特異的に標的とする能力を保持するタンパク質の変異体を指す。
本明細書で用いる場合、「産生細胞」という用語は、エクソソームを生成するために使用される細胞を指す。産生細胞は、in vitroで培養された細胞、またはin vivoの細胞であることができる。産生細胞には、限定されないが、エクソソームの生成に有効であると知られている細胞、例えば、HEK293細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、及び間葉系幹細胞(MSC)が含まれる。
本明細書で用いる場合、「標的タンパク質」という用語は、エクソソームの表面を標的とすることができるタンパク質を指す。標的タンパク質は、エクソソーム膜を天然に標的とする非突然変異タンパク質、または非突然変異タンパク質の断片もしくは変異体であることができる。標的タンパク質は、フラグタグ、治療ペプチド、標的化部分、あるいは、非突然変異タンパク質または非突然変異タンパク質の変異体もしくは断片に付着した他のペプチドを含有する融合タンパク質であることができる。標的タンパク質は、リンカーにより膜に付着した膜貫通型タンパク質、内在性タンパク質、周辺タンパク質、または可溶性タンパク質であることができる。
本明細書で用いる場合、「夾雑タンパク質」という用語は、エクソソームと関連しないタンパク質を指す。例えば、夾雑タンパク質には、エクソソームに囲まれておらず、エクソソームの膜に付着していない、または組み込まれていないタンパク質が含まれる。
本明細書で用いる場合、「単離する(isolate)」、「単離された」、及び「単離する(isolating)」または「精製する」、「精製された」、及び「精製する(purifying)」ならびに「抽出された」及び「抽出する」という用語は、互換可能に使用され、精製の1つまたは複数のプロセス、例えば、所望のエクソソーム調製の選択または富化を受けている、所望のEVの調製の状態(例えば、複数の公知または未知の量及び/または濃度)を指す。いくつかの実施形態では、単離するまたは精製するは、本明細書で用いる場合、産生細胞を含有する試料からエクソソーム(例えば、画分)を除去する、部分的に除去するプロセスである。いくつかの実施形態では、単離されたエクソソーム組成物は、検出可能な望ましくない活性を有さない、またあるいは、望ましくない活性のレベルもしくは量が許容可能なレベルもしくは量以下である。他の実施形態では、単離されたエクソソーム組成物は、許容可能な量及び/または濃度以上の所望のエクソソームの量及び/または濃度を有する。他の実施形態では、単離されたエクソソーム組成物は、その組成物を得た出発物質(例えば、産生細胞調製物)と比較して、富化されている。この富化は、出発物質と比較して、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、99.99%、99.999%、99.9999%、または99.9999%超であることができる。いくつかの実施形態では、単離されたエクソソーム調製物は、残留生物由来物質を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、単離されたエクソソーム調製物は、任意の夾雑生物質を、100%含まない、99%含まない、98%含まない、97%含まない、96%含まない、95%含まない、94%含まない、93%含まない、92%含まない、91%含まない、または90%含まない。残留生物由来物質は、非生物的物質(化学的な物質を含む)または不要な核酸、タンパク質、脂質、または代謝産物を含むことができる。残留生物由来物質を実質的に含まないということは、エクソソーム組成物が、検出可能な産生細胞を含有せず、エクソソームのみが検出可能であることも意味することができる。
「賦形剤」または「担体」という用語は、化合物の投与をさらに容易にするために医薬組成物に加えられる不活性物質を指す。「薬学的に許容され得る担体」または「薬学的に許容され得る賦形剤」という用語は、ヒトを含む動物における使用に関して米国連邦政府の規制当局によって承認されたまたは米国薬局方において列挙された任意の薬剤、ならびに著しい刺激を対象に引き起こさず、投与された化合物の生物学的活性及び特性を抑制しない、任意の担体または希釈剤を包含する。医薬組成物の調製において有用であり、一般に安全で、非毒性であり、望ましい賦形剤及び担体が含まれる。
本明細書で用いる場合、「ペイロード」という用語は、EVと接触している標的(例えば、標的細胞)に作用する治療剤を指す。エクソソーム及び/または産生細胞へと導入され得るペイロードには、治療剤、例えば、ヌクレオチド(例えば、検出可能部分もしくは毒素を含むまたは転写を妨害するヌクレオチド)、核酸(例えば、ポリペプチド、例えば酵素をコードするDNAまたはmRNA分子、または制御機能を有するRNA分子、例えばmiRNA、dsDNA、lncRNA、及びsiRNA)、アミノ酸(例えば、検出可能部分もしくは毒素を含むまたは翻訳を妨害するアミノ酸)、ポリペプチド(例えば、酵素)、脂質、炭水化物、及び低分子(例えば、低分子薬及び毒素)が含まれる。
本明細書で用いる場合、「哺乳動物対象」とは、ヒト、家畜(例えば、イヌ、ネコ等)、家畜(例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ等)及び実験動物(例えば、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモット等)を含むがこれらに限定されない全ての哺乳動物を含む。
「個体」、「対象」、「宿主」、及び「患者」という用語は、本明細書にて互換可能に使用され、診断、処置、または治療が望まれる、任意の哺乳動物対象、特にヒトを指す。本明細書に記載の方法は、ヒト治療及び獣医学の両方の用途に適用可能である。いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物であり、他の実施形態では、対象は、ヒトである。
本明細書で用いる場合、「実質的に含まない」という用語は、エクソソームを含む試料が、質量/体積(m/v)パーセント濃度で10%未満のマクロ分子を含むことを意味する。一部の画分は、0.001%未満、0.01%未満、0.05%未満、0.1%未満、0.2%未満、0.3%未満、0.4%未満、0.5%未満、0.6%未満、0.7%未満、0.8%未満、0.9%未満、1%未満、2%未満、3%未満、4%未満、5%未満、6%未満、7%未満、8%未満、9%未満、または10%未満(m/v)のマクロ分子を含有し得る。
本明細書で用いる場合、「マクロ分子」という用語は、核酸、夾雑タンパク質、脂質、炭水化物、代謝産物、またはその組み合わせを意味する。
本明細書で用いる場合、「従来のエクソソームタンパク質」という用語は、CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPIアンカータンパク質、ラクトアドヘリンLAMP2、及びLAMP2B、その断片、またはそれに結合するペプチドを含むがこれらに限定されない、エクソソームにおいて富化すると以前に知られているタンパク質を意味する。
2.他の解釈に関する規定
本明細書に列挙された範囲は、列挙された端点を含む、範囲内の全ての値の略記であると理解される。例えば、1~50の範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、及び50からなる群の任意の数、数の組み合わせ、または下位範囲を含むと理解される。
本明細書に列挙された範囲は、列挙された端点を含む、範囲内の全ての値の略記であると理解される。例えば、1~50の範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、及び50からなる群の任意の数、数の組み合わせ、または下位範囲を含むと理解される。
3.エクソソームタンパク質
本発明のある態様は、エクソソーム膜上で高度に富化する、エクソソームタンパク質の同定、使用及び改変に関する。このようなエクソソームタンパク質は、高度に精製されたエクソソームを、質量分析または当該分野で公知の他の方法を用いて、分析することにより同定することができる。
本発明のある態様は、エクソソーム膜上で高度に富化する、エクソソームタンパク質の同定、使用及び改変に関する。このようなエクソソームタンパク質は、高度に精製されたエクソソームを、質量分析または当該分野で公知の他の方法を用いて、分析することにより同定することができる。
エクソソームタンパク質には、エクソソーム膜上で富化された、様々な膜タンパク質、例えば膜貫通型タンパク質、内在性タンパク質及び周辺タンパク質が含まれる。それらには、様々なCDタンパク質、輸送体、インテグリン、レクチン及びカドヘリンが含まれる。具体的には、タンパク質には、限定されないが、(1)プロスタグランジンF2受容体ネガティブレギュレーター(PTGFRN)、(2)ベイシジン(BSG)、(3)免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー3(IGSF3)、(4)免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー8(IGSF8)、(5)インテグリンベータ-1(ITGB1)、(6)インテグリンアルファ-4(ITGA4)、(7)4F2細胞表面抗原重鎖(SLC3A2)、(8)ATP輸送体タンパク質のクラス(ATP1A1、ATP1A2、ATP1A3、ATP1A4、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B2、ATP2B3、ATP2B4)、及び(9)、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー2(IGSF2)が含まれる。
本明細書にて同定された1つまたは複数のエクソソームタンパク質は、エクソソームの産生細胞、産生条件、精製方法、または意図される用途に応じて選択的に使用することができる。例えば、エクソソームの特定の集団上で富化されたエクソソーム(exome)タンパク質を使用して、エクソソームの特定の集団を精製することができる。特定のサイズ範囲、標的化部分、電荷密度、ペイロード等を有する、ある特定のエクソソームの表面上で富化したエクソソームタンパク質を、本発明のいくつかの実施形態において同定及び使用することができる。いくつかの実施形態では、1つを超えるエクソソームタンパク質を、治療用エクソソームの生成、精製、及び単離のために、同時にまたは続けて使用することができる。
4.表面操作エクソソーム
本発明の別の態様は、表面操作エクソソームの生成及び使用に関する。表面操作エクソソームは、その組成が改変された膜を有する。例えば、それらの膜組成は、膜のタンパク質、脂質またはグリカン含量を変えることにより改変することができる。
本発明の別の態様は、表面操作エクソソームの生成及び使用に関する。表面操作エクソソームは、その組成が改変された膜を有する。例えば、それらの膜組成は、膜のタンパク質、脂質またはグリカン含量を変えることにより改変することができる。
いくつかの実施形態では、表面操作エクソソームは、化学的及び/または物理的方法、例えばPEG誘導性融合及び/または超音波融合により生成される。
他の実施形態では、表面操作エクソソームは、遺伝子操作により生成される。遺伝子改変された産生細胞または遺伝子改変された細胞の後代から産生されたエクソソームは、改変された膜組成を含有することができる。いくつかの実施形態では、表面操作エクソソームは、エクソソームタンパク質を高いもしくは低い密度にて有する、またはエクソソームタンパク質の変異体または断片を含む。
例えば、表面操作エクソソームは、エクソソームタンパク質またはエクソソームタンパク質の変異体もしくは断片をコードする外因性配列で形質転換された細胞から産生されることができる。外因性配列から発現されるタンパク質を含むエクソソームは、改変された膜タンパク質組成を含むことができる。
エクソソームタンパク質の様々な改変体または断片を、本発明の実施形態に使用することができる。例えば、結合剤に対する親和性が亢進するように改変されたタンパク質は、結合剤を使用して精製することができる表面操作エクソソームを生成するために使用することができる。エクソソーム及び/または膜をより効果的に標的とするように改変されたタンパク質を使用することができる。エクソソーム膜への特異的及び効果的な標的化に必要な最小限の断片を含むように改変されたタンパク質も使用することができる。
融合タンパク質も使用することができ、例えば、親和性タグ(例えば、Hisタグ、GSTタグ、グルタチオン-S-転移酵素、S-ペプチド、HA、Myc、FLAG(商標)(Sigma-Aldrich Co.)、MBP、SUMO、及びプロテインA)に融合したエクソソームタンパク質またはその断片を、親和性タグに特異的な結合剤を用いた表面操作エクソソームの精製または除去に使用することができる。
治療活性を有する融合タンパク質も、表面操作エクソソームを生成するために使用することができる。例えば、融合タンパク質は、PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP輸送体、またはその断片もしくは変異体、及び治療ペプチドを含むことができる。治療ペプチドは、天然ペプチド、組み換えペプチド、合成ペプチド、または治療化合物へのリンカーからなる群より選択される。治療化合物は、ヌクレオチド、アミノ酸、脂質、炭水化物、または低分子であることができる。治療ペプチドは、抗体、酵素、リガンド、受容体、抗微生物ペプチドまたはその断片もしくは変異体であることができる。いくつかの実施形態では、治療ペプチドは、核酸結合タンパク質である。核酸結合タンパク質は、ダイサー、アルゴノートタンパク質、TRBP、またはMS2バクテリオファージコートタンパク質であることができる。いくつかの実施形態では、核酸結合タンパク質は、追加で、1つまたは複数のRNAまたはDNA分子を含むことができる。1つまたは複数のRNAは、miRNA、siRNA、ガイドRNA、lincRNA、mRNA、アンチセンスRNA、dsRNA、またはそれらの組み合わせであることができる。
いくつかの実施形態では、治療ペプチドは、タンパク質-タンパク質相互作用系の一部である。いくつかの実施形態では、タンパク質-タンパク質相互作用系は、FRB-FKBP相互作用系、例えば、Banaszynski et al.,J Am Chem Soc.2005 Apr 6;127(13):4715-21に記載のようなFRB-FKBP相互作用系を含む。
融合タンパク質は、エクソソームの表面を標的とし、治療活性をエクソソームに提供することができる。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、IGSF8またはその断片もしくは改変体を含まない。
いくつかの実施形態では、標的化部分を有する融合タンパク質を使用する。例えば、融合タンパク質は、PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP輸送体、またはその断片もしくは変異体、及び標的化部分を含むことができる。標的化部分は、エクソソームを使用する処置のために、エクソソームを特定の器官、組織、または細胞に標的化するために使用することができる。いくつかの実施形態では、標的化部分は、抗体またはその抗原結合断片である。抗体及びその抗原結合断片には、全抗体、ポリクローナル、モノクローナル及び組み換え抗体、その断片が含まれ、一本鎖抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ、マウス-ヒト、マウス-霊長類、霊長類-ヒトモノクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、抗体断片、例えば、例としてscFv、(scFv)2、Fab、Fab’、及びF(ab’)2、F(ab1)2、Fv、dAb、及びFd断片、ダイアボディ、及び抗体関連ポリペプチドがさらに含まれる。抗体及びその抗原結合断片には、所望の生物学的活性または機能を呈する限りにおいて二重特異性抗体及び多特異性抗体も含まれる。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、IGSF8またはその断片もしくは改変体を含まない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の表面操作エクソソームは、当該分野で公知の表面操作エクソソームと比較して優れた特徴を実証する。例えば、本明細書で提供される新しく同定されたエクソソームタンパク質を使用することにより産生される表面操作エクソソームは、先行技術のエクソソーム、例えば、従来のエクソソームタンパク質を使用して産生されたものよりもその表面上で高度に富化された改変タンパク質を含有する。さらには、本発明の表面操作エクソソームは、当該分野で公知の表面操作エクソソームと比較して、より大きな、より特異的なまたはより制御された生物学的活性を有することができる。例えば、本明細書に記載のエクソソーム表面タンパク質またはその断片(例えば、PTGFRNまたはその断片)に融合した治療または生物学的に関連する外因性配列を含む表面操作エクソソームは、当該分野で公知の足場への融合よりも、望ましい操作された特徴を多く有することができる。当該分野で公知の足場タンパク質には、テトラスパニン分子(例えば、CD63、CD81、CD9及びその他)、リソソーム関連膜タンパク質2(LAMP2及びLAMP2B)、血小板由来成長因子受容体(PDGFR)、GPIアンカータンパク質、ラクトアドヘリン及びその断片、ならびにこれらのタンパク質またはその断片のいずれかに対して親和性を有するペプチドが含まれる。以前は、外因性タンパク質の過剰発現は、エクソソーム上への外因性タンパク質の確率的またはランダムな配置に依存して、表面操作されたエクソソームを産生していた。これは、エクソソーム上の外因性タンパク質の低レベルで予測不可能な密度をもたらした。ゆえに、本明細書に記載のエクソソーム表面タンパク質及びその断片は、新規エクソソーム組成物及びその作成方法における重要な進歩を提供する。
いくつかの実施形態では、外因性配列及び本明細書にて新しく同定されたエクソソーム表面タンパク質を含有する融合タンパク質を含む表面操作エクソソームは、当該分野で公知の従来のエクソソームタンパク質(例えば、CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPIアンカータンパク質、ラクトアドヘリンLAMP2、及びLAMP2B、その断片、またはそれに結合するペプチド)にコンジュゲートした外因性配列を含む同様に操作されたエクソソームよりも高密度の融合タンパク質を有する。いくつかの実施形態では、本明細書にて新しく同定されたエクソソームタンパク質を含有する前記融合タンパク質は、従来のエクソソームタンパク質を使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。いくつかの実施形態では、本明細書にて新しく同定されたエクソソームタンパク質を含有する前記融合タンパク質は、従来のエクソソームタンパク質を使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、2~4倍、4~8倍、8~16倍、16~32倍、32~64倍、64~100倍、100~200倍、200~400倍、400~800倍、800~1,000倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。
いくつかの実施形態では、PTGFRNの融合タンパク質、その変異体、断片、断片の変異体または改変体は、CD9を使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。いくつかの実施形態では、PTGFRNの融合タンパク質、その変異体、断片、断片の変異体または改変体は、CD63を使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。いくつかの実施形態では、PTGFRNの融合タンパク質、その変異体、断片、断片の変異体または改変体は、CD81を使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。いくつかの実施形態では、PTGFRNの融合タンパク質、その変異体、断片、断片の変異体または改変体は、PDGFRを使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。いくつかの実施形態では、PTGFRNの融合タンパク質、その変異体、断片、断片の変異体または改変体は、GPIアンカータンパク質を使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。いくつかの実施形態では、PTGFRNの融合タンパク質、その変異体、断片、断片の変異体または改変体は、ラクトアドヘリンを使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。いくつかの実施形態では、PTGFRNの融合タンパク質、その変異体、断片、断片の変異体または改変体は、LAMP2を使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。いくつかの実施形態では、PTGFRNの融合タンパク質、その変異体、断片、断片の変異体または改変体は、LAMP2Bを使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。いくつかの実施形態では、PTGFRNの融合タンパク質、その変異体、断片、断片の変異体または改変体は、従来のエクソソームタンパク質の断片を使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。いくつかの実施形態では、PTGFRNの融合タンパク質、その変異体、断片、断片の変異体または改変体は、従来のエクソソームタンパク質の変異体を使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。
特定の実施形態では、PTGFRNの融合タンパク質、その変異体、断片、断片の変異体または改変体は、従来のエクソソームタンパク質(例えば、CD63のような、テトラスパニン分子)を使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。特定の実施形態では、BSGの融合タンパク質、その変異体、断片、断片の変異体または改変体は、従来のエクソソームタンパク質(例えば、CD63のような、テトラスパニン分子)を使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。特定の実施形態では、IGSF2の融合タンパク質、その変異体、断片、断片の変異体または改変体は、従来のエクソソームタンパク質(例えば、CD63のような、テトラスパニン分子)を使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。特定の実施形態では、IGSF3の融合タンパク質、その変異体、断片、断片の変異体または改変体は、従来のエクソソームタンパク質(例えば、CD63のような、テトラスパニン分子)を使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。特定の実施形態では、IGSF8の融合タンパク質、その変異体、断片、断片の変異体または改変体は、従来のエクソソームタンパク質(例えば、CD63のような、テトラスパニン分子)を使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。特定の実施形態では、ITGB1の融合タンパク質、その変異体、断片、断片の変異体または改変体は、従来のエクソソームタンパク質(例えば、CD63のような、テトラスパニン分子)を使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。特定の実施形態では、ITGA4の融合タンパク質、その変異体、断片、断片の変異体または改変体は、従来のエクソソームタンパク質(例えば、CD63のような、テトラスパニン分子)を使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。特定の実施形態では、SLC3A2の融合タンパク質、その変異体、断片、断片の変異体または改変体は、従来のエクソソームタンパク質(例えば、CD63のような、テトラスパニン分子)を使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。特定の実施形態では、ATP輸送体の融合タンパク質、その変異体、断片、断片の変異体または改変体は、従来のエクソソームタンパク質(例えば、CD63のような、テトラスパニン分子)を使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。いくつかの実施形態では、本明細書にて新しく同定されたエクソソームタンパク質を含有する前記融合タンパク質は、従来のエクソソームタンパク質を使用して同様に改変された他のエクソソーム表面上の融合タンパク質よりも、2~4倍、4~8倍、8~16倍、16~32倍、32~64倍、64~100倍、100~200倍、200~400倍、400~800倍、800~1,000倍またはより高い密度にてエクソソーム表面上に存在する。
本明細書に提供する融合タンパク質は、PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP輸送体、またはその断片もしくは変異体、及び追加のペプチドを含むことができる。追加のペプチドは、エクソソームタンパク質またはその断片もしくは変異体のN末端またはC末端のいずれかに付着することができる。追加のペプチドは、エクソソームタンパク質に付着したエクソソームの内側(内腔側)または外側に位置することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供する融合タンパク質は、PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP輸送体、またはその断片もしくは変異体、及び2つの追加のペプチドを含む。2つの追加のペプチドは両方とも、エクソソームタンパク質またはその断片もしくは変異体のN末端またはC末端のいずれかに付着することができる。いくつかの実施形態では、2つの追加のペプチドのうちの一方がエクソソームタンパク質またはその断片もしくは変異体のN末端に付着し、2つの追加のペプチドのうちの他方がエクソソームタンパク質またはその断片もしくは変異体のC末端に付着する。追加のペプチドは、エクソソームタンパク質に付着したエクソソームの内側(内腔側)もしくは外側、または両側に位置することができる。
5.表面操作エクソソームの産生のための産生細胞
本発明のエクソソームは、in vitroで増殖させた細胞または対象の体液から産生することができる。エクソソームが、in vitro細胞培養物から産生される場合、様々な産生細胞、例えば、HEK293細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、または間葉系幹細胞(MSC)を、本発明のために使用することができる。
本発明のエクソソームは、in vitroで増殖させた細胞または対象の体液から産生することができる。エクソソームが、in vitro細胞培養物から産生される場合、様々な産生細胞、例えば、HEK293細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、または間葉系幹細胞(MSC)を、本発明のために使用することができる。
産生細胞を、1つまたは複数の外因性配列を含むように遺伝子改変して、表面操作エクソソームを産生することができる。遺伝子改変された産生細胞は、一過性または安定した形質転換により導入された外因性配列を含有することができる。外因性配列は、産生細胞に、プラスミドとして導入されることができる。外因性配列は、産生細胞のゲノム配列へと、標的部位にて、またはランダムな部位で、安定して統合されることができる。いくつかの実施形態では、安定した細胞株が、表面操作エクソソームの産生のために生成される。
外因性配列は、エクソソームタンパク質をコードする内因性配列の上流(5’末端)または下流(3’末端)内に位置する産生細胞のゲノム配列へと挿入されることができる。当該分野で公知の様々な方法を、産生細胞への外因性配列の導入に使用することができる。例えば、様々な遺伝子編集方法(例えば、相同組み換え、トランスポゾン媒介システム、loxP-Creシステム、CRISPR/Cas9またはTALENを使用する方法)を使用して改変された細胞は、本発明の範囲内である。
外因性配列は、エクソソームタンパク質またはエクソソームタンパク質の変異体もしくは断片をコードする配列を含むことができる。エクソソームタンパク質をコードする配列の余分なコピーを導入して、エクソソームタンパク質をより高い密度にて有する表面操作エクソソームを産生することができる。エクソソームタンパク質の変異体または断片をコードする外因性配列を導入して、エクソソームタンパク質の改変体または断片を含有する表面操作エクソソームを産生することができる。親和性タグをコードする外因性配列を導入して、エクソソームタンパク質に付着した親和性タグを含む融合タンパク質を含有する表面操作エクソソームを産生することができる。
いくつかの実施形態では、表面操作エクソソームは、同じまたは同様の産生細胞型から単離されたネイティブエクソソームよりも、高い密度のエクソソームタンパク質を有する。いくつかの実施形態では、前記エクソソームタンパク質は、前記ネイティブエクソソームよりも、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍またはより高い密度にて前記表面操作エクソソーム上に存在する。いくつかの実施形態では、前記エクソソームタンパク質は、前記ネイティブエクソソームよりも、2~4倍、4~8倍、8~16倍、16~32倍、32~64倍、64~100倍、100~200倍、200~400倍、400~800倍、800~1,000倍またはより高い密度にて前記表面操作エクソソーム上に存在する。いくつかの実施形態では、エクソソームタンパク質を含む融合タンパク質は、前記ネイティブエクソソーム上の改変されていないエクソソームタンパク質よりも、2~4倍、4~8倍、8~16倍、16~32倍、32~64倍、64~100倍、100~200倍、200~400倍、400~800倍、800~1,000倍またはより高い密度にて前記表面操作エクソソーム上に存在する。いくつかの実施形態では、エクソソームタンパク質の断片または変異体は、前記ネイティブエクソソーム上の改変されていないエクソソームタンパク質よりも、2~4倍、4~8倍、8~16倍、16~32倍、32~64倍、64~100倍、100~200倍、200~400倍、400~800倍、800~1,000倍またはより高い密度にて前記表面操作エクソソーム上に存在する。
特定の実施形態では、PTGFRN、PTGFRNの断片もしくは変異体、またはその改変体は、前記ネイティブエクソソーム上の改変されていないPTGFRNよりも、2~4倍、4~8倍、8~16倍、16~32倍、32~64倍、64~100倍、100~200倍、200~400倍、400~800倍、800~1,000倍またはより高い密度にて前記表面操作エクソソーム上に存在する。特定の実施形態では、BSG、BSGの断片もしくは変異体、またはその改変体は、前記ネイティブエクソソーム上の改変されていないBSGよりも、2~4倍、4~8倍、8~16倍、16~32倍、32~64倍、64~100倍、100~200倍、200~400倍、400~800倍、800~1,000倍またはより高い密度にて前記表面操作エクソソーム上に存在する。特定の実施形態では、IGSF2、IGSF2の断片もしくは変異体、またはその改変体は、前記ネイティブエクソソーム上の改変されていないIGSFよりも、2~4倍、4~8倍、8~16倍、16~32倍、32~64倍、64~100倍、100~200倍、200~400倍、400~800倍、800~1,000倍またはより高い密度にて前記表面操作エクソソーム上に存在する。特定の実施形態では、IGSF3、IGSF3の断片もしくは変異体、またはその改変体は、前記ネイティブエクソソーム上の改変されていないIGSF3よりも、2~4倍、4~8倍、8~16倍、16~32倍、32~64倍、64~100倍、100~200倍、200~400倍、400~800倍、800~1,000倍またはより高い密度にて前記表面操作エクソソーム上に存在する。特定の実施形態では、ITGB1、ITGB1の断片もしくは変異体、またはその改変体は、前記ネイティブエクソソーム上の改変されていないITGB1よりも、2~4倍、4~8倍、8~16倍、16~32倍、32~64倍、64~100倍、100~200倍、200~400倍、400~800倍、800~1,000倍またはより高い密度にて前記表面操作エクソソーム上に存在する。特定の実施形態では、ITGA4、ITGA4の断片もしくは変異体、またはその改変体は、前記ネイティブエクソソーム上の改変されていないITGA4よりも、2~4倍、4~8倍、8~16倍、16~32倍、32~64倍、64~100倍、100~200倍、200~400倍、400~800倍、800~1,000倍またはより高い密度にて前記表面操作エクソソーム上に存在する。特定の実施形態では、SLC3A2、SLC3A2の断片もしくは変異体、またはその改変体は、前記ネイティブエクソソーム上の改変されていないSLC3A2よりも、2~4倍、4~8倍、8~16倍、16~32倍、32~64倍、64~100倍、100~200倍、200~400倍、400~800倍、800~1,000倍またはより高い密度にて前記表面操作エクソソーム上に存在する。特定の実施形態では、ATP輸送体、ATP輸送体の断片もしくは変異体、またはその改変体は、前記ネイティブエクソソーム上の改変されていないATP輸送体よりも、2~4倍、4~8倍、8~16倍、16~32倍、32~64倍、64~100倍、100~200倍、200~400倍、400~800倍、800~1,000倍またはより高い密度にて前記表面操作エクソソーム上に存在する。
いくつかの実施形態では、産生細胞は、追加の外因性配列を含むようにさらに改変される。例えば、追加の外因性配列を導入して、内因性遺伝子発現を調節する、またはある特定のポリペプチドをペイロードとして含むエクソソームを産生することができる。いくつかの実施形態では、産生細胞は、2つの外因性配列を含むように改変され、一方は、エクソソームタンパク質またはエクソソームタンパク質の変異体もしくは断片をコードし、他方は、ペイロードをコードする。いくつかの実施形態では、産生細胞は、追加の機能性、例えば、特異的標的化能、送達機能、酵素機能、in vivo半減期の増加または低減、等をエクソソームに付与する追加の外因性配列を含むようにさらに改変されることができる。いくつかの実施形態では、産生細胞は、2つの外因性配列を含むように改変され、一方は、エクソソームタンパク質またはエクソソームタンパク質の変異体もしくは断片をコードし、他方は、追加の機能性をエクソソームに付与するタンパク質をコードする。
いくつかの実施形態では、産生細胞は、2つの外因性配列を含むように改変され、2つの外因性配列はそれぞれ、エクソソーム表面上の融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、産生細胞からの表面操作エクソソームは、同じまたは同様の細胞型の改変されていない細胞から単離されたネイティブエクソソームと比較して、より高い密度のエクソソームタンパク質を有する。いくつかの実施形態では、表面操作エクソソームは、エクソソームタンパク質を、同じまたは同様の細胞型の改変されていない細胞から単離されたネイティブエクソソームと比較して、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍またはより高い密度にて含有する。いくつかの実施形態では、産生細胞は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上の追加の外因性配列を含むようにさらに改変される。
より具体的には、表面操作エクソソームは、(1)プロスタグランジンF2受容体ネガティブレギュレーター(PTGFRN)、(2)ベイシジン(BSG)、(3)免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー3(IGSF3)、(4)免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー8(IGSF8)、(5)インテグリンベータ-1(ITGB1)、(6)インテグリンアルファ-4(ITGA4)、(7)4F2細胞表面抗原重鎖(SLC3A2)、(8)ATP輸送体タンパク質のクラス(ATP1A1、ATP1A2、ATP1A3、ATP1A4、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B2、ATP2B3、ATP2B4)、及び(9)免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー2(IGSF2)を含むがこれらに限定されない、1つまたは複数のエクソソーム表面タンパク質またはその変異体をコードする配列で形質転換された細胞から産生することができる。本明細書に記載する1つまたは複数のエクソソーム表面タンパク質はいずれも、プラスミド、ゲノムへと挿入された外因性配列または他の外因性核酸、例えば合成のメッセンジャーRNA(mRNA)から産生細胞にて発現することができる。
いくつかの実施形態では、1つまたは複数のエクソソーム表面タンパク質は、その完全長、内因性形態をコードする外因性配列で形質転換された細胞にて発現される。いくつかの実施形態では、このような外因性配列は、配列番号1のPTGFRNタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、このような外因性配列は、配列番号9のBSGタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、このような外因性配列は、配列番号14のIGSF8タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、このような外因性配列は、配列番号20のIGSF3タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、このような外因性配列は、配列番号21のITGB1タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、このような外因性配列は、配列番号22のITGA4タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、このような外因性配列は、配列番号23のSLC3A2タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、このような外因性配列は、配列番号24のATP1A1タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、このような外因性配列は、配列番号25のATP1A2タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、このような外因性配列は、配列番号26のATP1A3タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、このような外因性配列は、配列番号27のATP1A4タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、このような外因性配列は、配列番号28のATP1B3タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、このような外因性配列は、配列番号29のATP2B1タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、このような外因性配列は、配列番号30のATP2B2タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、このような外因性配列は、配列番号31のATP2B3タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、このような外因性配列は、配列番号32のATP2B4タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、このような外因性配列は、配列番号34のIGSF2タンパク質をコードする。
表面操作エクソソームは、(1)プロスタグランジンF2受容体ネガティブレギュレーター(PTGFRN)、(2)ベイシジン(BSG)、(3)免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー3(IGSF3)、(4)免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー8(IGSF8)、(5)インテグリンベータ-1(ITGB1)、(6)インテグリンアルファ-4(ITGA4)、(7)4F2細胞表面抗原重鎖(SLC3A2)、(8)ATP輸送体タンパク質のクラス(ATP1A1、ATP1A2、ATP1A3、ATP1A4、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B2、ATP2B3、ATP2B4)、及び(9)免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー2(IGSF2)を含むがこれらに限定されない、1つまたは複数のエクソソーム表面タンパク質の断片をコードする配列で形質転換された細胞から産生することができる。いくつかの実施形態では、配列は、ネイティブタンパク質のN末端から少なくとも5、10、50、100、200、300、400、500、600、700、または800個のアミノ酸を欠くエクソソーム表面タンパク質の断片をコードする。いくつかの実施形態では、配列は、ネイティブタンパク質のC末端から少なくとも5、10、50、100、200、300、400、500、600、700、または800個のアミノ酸を欠くエクソソーム表面タンパク質の断片をコードする。いくつかの実施形態では、配列は、ネイティブタンパク質のN末端及びC末端の両方から少なくとも5、10、50、100、200、300、400、500、600、700、または800個のアミノ酸を欠くエクソソーム表面タンパク質の断片をコードする。いくつかの実施形態では、配列は、ネイティブタンパク質の1つまたは複数の機能性または構造ドメインを欠くエクソソーム表面タンパク質の断片をコードする。
いくつかの実施形態では、エクソソーム表面タンパク質の断片は、1つまたは複数の異種タンパク質に融合している。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の異種タンパク質は、断片のN末端に融合している。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の異種タンパク質は、断片のC末端に融合している。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の異種タンパク質は、断片のN末端及びC末端に融合している。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の異種タンパク質は、哺乳動物タンパク質である。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の異種タンパク質は、ヒトタンパク質である。
表面操作エクソソームは、PTGFRNの断片をコードする配列で形質転換された細胞から産生することができる。いくつかの実施形態では、PTGFRNの断片は、1つまたは複数の機能性または構造ドメイン、例えばIgVを欠く。例えば、PTGFRNの断片は、配列番号2~7、または33のポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、PTGFRNの断片は、1つまたは複数の異種タンパク質に融合している。1つまたは複数の異種タンパク質は、前記PTGFRN断片のN末端に融合することができる。1つまたは複数の異種タンパク質は、前記PTGFRN断片のC末端に融合することができる。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の異種タンパク質は、前記PTGFRN断片のN末端及びC末端の両方に融合している。いくつかの実施形態では、異種タンパク質は、哺乳動物タンパク質である。いくつかの実施形態では、異種タンパク質は、ヒトタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記PTGFRN断片に融合した前記異種タンパク質は、シグナル配列ペプチドをさらに含有する。シグナル配列ペプチドは、配列番号8のポリペプチドであることができる。
表面操作エクソソームは、ベイシジンの断片をコードする配列で形質転換された細胞から産生することができる。いくつかの実施形態では、ベイシジンの断片は、1つまたは複数の機能性または構造ドメイン、例えばIgVを欠く。例えば、ベイシジンの断片は、配列番号10~12のポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、ベイシジンの断片は、1つまたは複数の異種タンパク質に融合している。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の異種タンパク質は、前記ベイシジン断片のN末端に融合している。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の異種タンパク質は、前記ベイシジン断片のC末端に融合している。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の異種タンパク質は、前記ベイシジン断片のN末端及びC末端の両方に融合している。いくつかの実施形態では、異種タンパク質は、哺乳動物タンパク質である。いくつかの実施形態では、異種タンパク質は、ヒトタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記ベイシジン断片に融合した前記異種タンパク質は、シグナル配列ペプチドをさらに含有する。シグナル配列ペプチドは、配列番号13のポリペプチドであることができる。
表面操作エクソソームは、IGSF8の断片をコードする配列で形質転換された細胞から産生することができる。いくつかの実施形態では、IGSF8の断片は、1つまたは複数の機能性または構造ドメイン、例えばIgVを欠く。例えば、IGSF8の断片は、配列番号15~18のポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、IGSF8の断片は、1つまたは複数の異種タンパク質に融合している。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の異種タンパク質は、前記IGSF8断片のN末端に融合している。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の異種タンパク質は、前記IGSF8断片のC末端に融合している。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の異種タンパク質は、前記IGSF8断片のN末端及びC末端の両方に融合している。いくつかの実施形態では、異種タンパク質は、哺乳動物タンパク質である。いくつかの実施形態では、異種タンパク質は、ヒトタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記IGSF8断片に融合した前記異種タンパク質は、シグナル配列ペプチドをさらに含有する。シグナル配列ペプチドは、配列番号19のポリペプチドであることができる。
表面操作エクソソームは、IGSF2の断片をコードする配列で形質転換された細胞から産生することができる。いくつかの実施形態では、IGSF2の断片は、1つまたは複数の機能性または構造ドメイン、例えばIgVを欠く。いくつかの実施形態では、IGSF2の断片は、1つまたは複数の異種タンパク質に融合している。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の異種タンパク質は、前記IGSF2断片のN末端に融合している。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の異種タンパク質は、前記IGSF2断片のC末端に融合している。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の異種タンパク質は、前記IGSF2断片のN末端及びC末端の両方に融合している。いくつかの実施形態では、異種タンパク質は、哺乳動物タンパク質である。いくつかの実施形態では、異種タンパク質は、ヒトタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記IGSF2断片に融合した前記異種タンパク質は、シグナル配列ペプチドをさらに含有する。シグナル配列ペプチドは、配列番号35のポリペプチドであることができる。
いくつかの実施形態では、表面操作エクソソームは、(1)プロスタグランジンF2受容体ネガティブレギュレーター(PTGFRN)、(2)ベイシジン(BSG)、(3)免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー3(IGSF3)、(4)免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー8(IGSF8)、(5)インテグリンベータ-1(ITGB1)、(6)インテグリンアルファ-4(ITGA4)、(7)4F2細胞表面抗原重鎖(SLC3A2)、(8)ATP輸送体タンパク質のクラス(ATP1A1、ATP1A2、ATP1A3、ATP1A4、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B2、ATP2B3、ATP2B4)、及び(9)免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー2(IGSF2)を含むが、これらに限定されない、ネイティブエクソソーム表面タンパク質の完全長または断片に同一であるまたは類似する配列のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、前記ペプチドは、ネイティブエクソソーム表面タンパク質の完全長または断片に50%同一である、例えば、配列番号1~34に50%同一である。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、ネイティブエクソソーム表面タンパク質の完全長または断片に60%同一である、例えば、配列番号1~34に60%同一である。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、ネイティブエクソソーム表面タンパク質の完全長または断片に70%同一である、例えば、配列番号1~34に70%同一である。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、ネイティブエクソソーム表面タンパク質の完全長または断片に80%同一である、例えば、配列番号1~34に80%同一である。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、ネイティブエクソソーム表面タンパク質の完全長または断片に90%同一である、例えば、配列番号1~34に90%同一である。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、ネイティブエクソソーム表面タンパク質の完全長または断片に95%同一である、例えば、配列番号1~34に95%同一である。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、ネイティブエクソソーム表面タンパク質の完全長または断片に99%同一である、例えば、配列番号1~34に99%同一である。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、ネイティブエクソソーム表面タンパク質の完全長または断片に99.9%同一である、例えば、配列番号1~34に99.9%同一である。
6.アフィニティー精製
本発明のいくつかの実施形態は、エクソソーム膜の上で富化したタンパク質及び固定された結合剤間の特異的結合相互作用を使用する、エクソソームの単離、精製、及び亜分画に関する。これらの方法は、一般に、(1)エクソソームを含む試料を供給または負荷するステップ、(2)エクソソームの標的タンパク質及び結合剤間の結合相互作用を維持する適切なバッファーを使用して結合しなかった試料成分を任意選択で洗い流すステップ、ならびに(3)結合相互作用がもう生じないようにバッファー条件を変化させることにより固定された結合剤からエクソソームを溶出(解離及び回収)するステップを含む。
本発明のいくつかの実施形態は、エクソソーム膜の上で富化したタンパク質及び固定された結合剤間の特異的結合相互作用を使用する、エクソソームの単離、精製、及び亜分画に関する。これらの方法は、一般に、(1)エクソソームを含む試料を供給または負荷するステップ、(2)エクソソームの標的タンパク質及び結合剤間の結合相互作用を維持する適切なバッファーを使用して結合しなかった試料成分を任意選択で洗い流すステップ、ならびに(3)結合相互作用がもう生じないようにバッファー条件を変化させることにより固定された結合剤からエクソソームを溶出(解離及び回収)するステップを含む。
いくつかの実施形態は、エクソソーム膜上で富化したタンパク質及び固定された結合剤間の特異的結合相互作用を使用して、試料からエクソソームを除去する方法に関する。この場合、結合剤に結合したエクソソームは、結合剤から溶出されず、結合剤に結合しない画分を収集することができる。この方法を使用して、エクソソーム及び非エクソソーム物質、例えばウイルス(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、または任意の他のエンベロープウイルスまたは非エンベロープウイルス)または組み換えタンパク質(例えば、抗体、酵素または他のポリペプチド)を含む試料を精製することができ、この場合エクソソームは、夾雑粒子である。結合したエクソソームは、結合剤に結合したまま保持されることができ、非エクソソーム物質が回収され、実質的にエクソソームが含まれない。
この単離、精製、亜分画または除去プロセスに使用される、標的タンパク質は、産生細胞のゲノムから産生された内因性タンパク質、遺伝子改変により産生細胞へと導入されたタンパク質、または化学的、物理的もしくは他の生物学的方法により改変されたタンパク質であることができる。いくつかの場合では、タンパク質は、非突然変異タンパク質または突然変異タンパク質、例えば、内因性タンパク質の変異体または断片である。いくつかの場合では、タンパク質は、融合タンパク質である。
標的タンパク質に対して親和性を有する様々な結合剤を、本発明の実施形態に使用することができる。例えば、標的タンパク質に対する特異的親和性を有するタンパク質、ペプチド、及び低分子を、結合剤として使用することができる。いくつかの実施形態では、結合剤は、有機または無機源から得られる。有機源からの結合剤の例としては、血清タンパク質、レクチンまたは抗体が挙げられる。無機源からの結合剤の例としては、ボロン酸、金属キレート、及びトリアジン染料が挙げられる。
結合剤を、結合剤に対して特異的な親和性を有するエクソソームが結合するように、固体支持体に化学的に固定化またはカップリングすることができる。様々な形態の固体支持体、例えば、多孔質アガロースビーズ、マイクロタイタープレート、磁気ビーズ、または膜を使用することができる。いくつかの実施形態では、固体支持体は、クロマトグラフィーカラムを形成し、エクソソームのアフィニティークロマトグラフィーに使用することができる。
いくつかの場合では、エクソソームの単離、精製、亜分画及び除去は、結合剤及び固体支持体が充填されているカラムを使用するカラムクロマトグラフィーにより行われる。いくつかの実施形態では、エクソソームを含有する試料を、カラムに通して固定を可能とし、洗浄バッファーをカラムに通し、続いて溶出バッファーをカラムに接触させて、収集する。これらのステップは、雰囲気圧または追加の圧力をかけて行うことができる。
いくつかの場合では、エクソソームの単離、精製、亜分画及び除去は、バッチ処理を使用して行われる。例えば、試料を、容器内の固体支持体に付着した結合剤に加え、混合し、固体支持体を分離し、液相を除去し、洗浄し、遠心分離し、溶出バッファーを加え、再び遠心分離し、溶出物を除去する。
いくつかの場合では、ハイブリッド方法を採用することができる。例えば、試料を、容器内の固体支持体に付着した結合剤に加え、エクソソームに結合した固体支持体を続いてカラムに充填し、カラム上で洗浄し、溶出する。
いくつかの場合では、エクソソームの単離、精製、亜分画及び除去は、マイクロタイタープレート、磁気ビーズ、または膜に付着した結合剤を使用して行われる。この場合、試料を、固体支持体に付着した結合剤に加え、その後、混合し、固体支持体を分離し、液相を除去し、洗浄し、洗浄バッファーを除去し、溶出バッファーを加え、溶出物を除去するステップが続く。
結合剤及びエクソソーム上の標的タンパク質間の結合は、結合剤及びエクソソーム上の標的タンパク質間の特異的相互作用に最適な様々な生理学的条件にて行われる。結合したエクソソームの溶出は、塩濃度、pH、pI、電荷及びイオン強度を、直接または勾配を通して、変化させることにより達成することができる。
いくつかの実施形態では、ある種の結合剤を用いて単離された、精製されたまたは亜分画された試料は、その後、異なる結合剤を用いて処理される。
いくつかの実施形態では、1つを超えるカラムが直列に使用され、複数のカラムのそれぞれが、異なる標的タンパク質に特異的な異なる結合剤を含有する。
いくつかの実施形態では、単一のカラムは、それぞれが異なる標的タンパク質に特異的な、複数の結合剤を含有する。
いくつかの場合では、結合剤及び固体支持体は、定期的な消毒ステップの導入により再使用される。例えば、それらは、プロピレングリコール、イソプロパノール、高イオン強度、及び/または水酸化ナトリウムの組み合わせを用いて消毒することができる。
6.1.試料調製
本明細書に記載の方法を使用して、エクソソームを含む様々な試料からエクソソームを、精製する、単離する、亜分画するまたは除去することができる。いくつかの実施形態では、試料は、エクソソームを含有する、清澄化された回収物質である。いくつかの場合では、試料は、当該分野で周知の精製方法により部分的に精製されたエクソソームを含む。例えば、限外ろ過/ダイアフィルトレーション、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、深層ろ過、またはイオン交換結合/溶出クロマトグラフィーを使用して、アフィニティー精製のために結合剤に接触させる前に、エクソソームを部分的に精製することができる。
本明細書に記載の方法を使用して、エクソソームを含む様々な試料からエクソソームを、精製する、単離する、亜分画するまたは除去することができる。いくつかの実施形態では、試料は、エクソソームを含有する、清澄化された回収物質である。いくつかの場合では、試料は、当該分野で周知の精製方法により部分的に精製されたエクソソームを含む。例えば、限外ろ過/ダイアフィルトレーション、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、深層ろ過、またはイオン交換結合/溶出クロマトグラフィーを使用して、アフィニティー精製のために結合剤に接触させる前に、エクソソームを部分的に精製することができる。
いくつかの場合では、部分的に精製された物質は、結合剤との所望の相互作用のために、ある特定の生理学的条件(例えば、pH、温度、塩濃度、塩タイプ、極性)を有するようにさらに処理される。試料は、希釈または濃縮して、ある特定のエクソソーム濃度を得ることにより、または賦形剤を加えて、エクソソームの構造を変化させることにより調製することができる。いくつかの場合では、部分的に精製された物質は、いずれの操作も伴わずに結合剤に接触される。
6.2.結合
本明細書に記載の方法は、エクソソームの標的タンパク質及び結合剤間の特異的相互作用を必要とする。有機修飾剤、エチレングリコール、プロピレングリコール、または尿素を用いて、塩濃度、pHを変える、及び/または極性を低減させることを通して、ハイスループットスクリーニングを実行して、特異的結合に理想的なバッファー条件を同定することができる。標的タンパク質及び結合剤間の相互作用は、試料条件(例えば、クロマトグラフィー樹脂の体積当たりの負荷される試料量、エクソソームの濃度、不純物の濃度)、ローディングバッファー(例えば、pH、塩濃度、塩タイプ、極性)、及び他の物理的条件(例えば、温度)に応じても変わり得る。さらに、エクソソームの構造を変える賦形剤を加えることも、それらの相互作用を変え得る。加えて、不純物及びエクソソーム間の吸着速度差異に基づいて滞留時間を調整することができる。ゆえに、本明細書に記載の様々な精製条件を試験して、本ステップに理想的な条件を同定することができる。
本明細書に記載の方法は、エクソソームの標的タンパク質及び結合剤間の特異的相互作用を必要とする。有機修飾剤、エチレングリコール、プロピレングリコール、または尿素を用いて、塩濃度、pHを変える、及び/または極性を低減させることを通して、ハイスループットスクリーニングを実行して、特異的結合に理想的なバッファー条件を同定することができる。標的タンパク質及び結合剤間の相互作用は、試料条件(例えば、クロマトグラフィー樹脂の体積当たりの負荷される試料量、エクソソームの濃度、不純物の濃度)、ローディングバッファー(例えば、pH、塩濃度、塩タイプ、極性)、及び他の物理的条件(例えば、温度)に応じても変わり得る。さらに、エクソソームの構造を変える賦形剤を加えることも、それらの相互作用を変え得る。加えて、不純物及びエクソソーム間の吸着速度差異に基づいて滞留時間を調整することができる。ゆえに、本明細書に記載の様々な精製条件を試験して、本ステップに理想的な条件を同定することができる。
同様の手法を使用して、純度及び収率を改善し、エクソソームの亜集団の、富化、枯渇または単離を助けることができる。これらの特性は、負荷チャレンジを最大化し、よりストリンジェントな溶出条件を適用するとともに、エクソソームの濃度をさらに高めるために採用され得る。
6.2.1.溶出
エクソソームの溶出は、塩濃度、pH、及び/または極性を、有機修飾剤、エチレングリコール、プロピレングリコール、または尿素を用いて変えることを通して、達成することができる。
エクソソームの溶出は、塩濃度、pH、及び/または極性を、有機修飾剤、エチレングリコール、プロピレングリコール、または尿素を用いて変えることを通して、達成することができる。
エクソソームの選択的溶出は、一価カチオン性ハロゲン化塩(例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、塩化リチウム、ヨウ化ナトリウム、臭化カリウム、臭化リチウム、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、フッ化リチウム、ヨウ化リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸リチウム、ヨウ化カリウム)、二価または三価塩(例えば、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸カルシウム、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、三塩化クロム、硫酸クロム、クエン酸ナトリウム、塩化鉄(III)、塩化イットリウム(III)、リン酸カリウム、硫酸カリウム、リン酸ナトリウム、塩化第一鉄、クエン酸カルシウム、リン酸マグネシウム、塩化第二鉄)、またはその組み合わせの、溶出バッファー中の濃度を、漸増勾配(段階的または線形)の、一価カチオン性ハロゲン化塩(例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、塩化リチウム、ヨウ化ナトリウム、臭化カリウム、臭化リチウム、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、フッ化リチウム、ヨウ化リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸リチウム、ヨウ化カリウム)、二価または三価塩(例えば、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸カルシウム、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、三塩化クロム、硫酸クロム、クエン酸ナトリウム、塩化鉄(III)、塩化イットリウム(III)、リン酸カリウム、硫酸カリウム、リン酸ナトリウム、塩化第一鉄、クエン酸カルシウム、リン酸マグネシウム、塩化第二鉄)、またはその組み合わせを、固定したpHにて、使用することで、増加させることにより達成することができる。
実質的なエクソソーム純度は、カラム負荷段階中に不純物を流し、選択的賦形剤洗浄中に不純物を溶出し、溶出中に生成物を選択的に溶出する一方でカラムに結合した追加の不純物を残すことにより、達成することができる。カラム溶出液から測定される吸光度は、この方法により得られたエクソソームの精製を示すことができる。
溶出は、pH範囲、塩、有機溶媒、低分子、洗浄剤、両性イオン、アミノ酸、ポリマー、温度、及び上記の任意の組み合わせを調節することによっても達成することができる。類似の溶出剤を使用して、純度を改善する、収率を改善する、及びエクソソームの亜集団を単離することができる。
溶出は、異なる特性、例えばpH、塩、有機溶媒、低分子、洗浄剤、両性イオン、アミノ酸、ポリマー、温度、及び上記の任意の組み合わせを有する、複数の溶出バッファーを用いて行うこともできる。複数の溶出画分を収集することができ、各画分で収集されたエクソソームは、異なる特性を有する。例えば、ある画分で収集されたエクソソームは、他の画分のエクソソームよりも、高い純度、小さいまたは大きい平均サイズ、好ましい組成等を有する。
複数の溶出画分を収集する一方で、異なる特性を有する溶出バッファーを連続流として供給することができる。溶出画分は、イソクラティック溶出または勾配溶出中に収集することができる。少なくとも1つの溶出画分が収集されたら、溶出画分の組成を分析することができる。例えば、エクソソームの濃度、宿主細胞タンパク質、夾雑タンパク質、DNA、炭水化物、または脂質を、各溶出画分において測定することができる。各溶出画分におけるエクソソームの他の特性も測定することが出る。特性には、平均サイズ、平均電荷密度、及び生体内分布、細胞取り込み、半減期、薬力学、効力、投与量、免疫応答、負荷効率、安定性、または他の化合物に対する反応性に関する他の生理学的な特性が含まれる。
6.2.2.洗浄
任意選択で、エクソソームの純度は、溶出の前に試料を洗浄することにより、さらに改善することができる。いくつかの実施形態では、賦形剤は、洗浄バッファーであることができる。賦形剤は、特定のpH範囲、塩、有機溶媒、低分子、洗浄剤、両性イオン、アミノ酸、ポリマー、及び上記の任意の組み合わせを有する溶液であることができる。
任意選択で、エクソソームの純度は、溶出の前に試料を洗浄することにより、さらに改善することができる。いくつかの実施形態では、賦形剤は、洗浄バッファーであることができる。賦形剤は、特定のpH範囲、塩、有機溶媒、低分子、洗浄剤、両性イオン、アミノ酸、ポリマー、及び上記の任意の組み合わせを有する溶液であることができる。
より具体的には、賦形剤は、アルギニン、リジン、グリシン、ヒスチジン、カルシウム、ナトリウム、リチウム、カリウム、ヨウ化物、マグネシウム、鉄、亜鉛、マンガン、尿素、プロピレングリコール、アルミニウム、アンモニウム、グアニジニウムポリエチレングリコール、EDTA、EGTA、洗浄剤、塩化物、硫酸塩、カルボン酸、シアル酸、リン酸塩、酢酸塩、グリシン、ホウ酸塩、ギ酸塩、過塩素酸塩、臭素、硝酸塩、ジチオトレイトール、ベータメルカプトエタノール、またはリン酸トリ-n-ブチルを含むことができる。
賦形剤は、Sigma-Aldrichから入手可能な、セチルトリメチルアンモニウムクロリド、オクトキシノール-9、TRITON(商標)X-100(すなわち、ポリエチレングリコールp-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)-フェニルエーテル)及びTRITON(商標)CG-110;ドデシル硫酸ナトリウム;ラウリル硫酸ナトリウム;デオキシコール酸;ポリソルベート80(すなわち、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエート);ポリソルベート20(すなわち、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート);アルコールエトキシレート;アルキルポリエチレングリコールエーテル;デシルグルコシド;オクトグルコシド;SafeCare;DOW Chemicalから入手可能な、ECOSURF(商標)EH9、ECOSURF(商標)EH6、ECOSURF(商標)EH3、ECOSURF(商標)SA7、及びECOSURF(商標)SA9;BASFから入手可能な、LUTENSOL(商標)M5、LUTENSOL(商標)XL、LUTENSOL(商標)XP及びAPG(商標)325N;AIR PRODUCTSから入手可能な、TOMADOL(商標)900;CRODAから入手可能な、NATSURF(商標)265;Bestchemから入手可能な、SAFECARE(商標)1000、DOWから入手可能な、TERGITOL(商標)L64;カプリル酸;Lubrizolから入手可能な、CHEMBETAINE(商標)LEC;及びMackol DGからなる群より選択される、洗浄剤も含むことができる。
6.3.結果を改善するための他の方法
クロマトグラフィー樹脂の体積当たりに負荷することができるエクソソームの量は、供給物質を調節する、例えば、エクソソームの濃度を増加させる、不純物の濃度を低減させる、pHを変える、塩濃度を低減させる、イオン強度を低減させる、またはエクソソームの特定の亜集団を変えることにより、改善することができる。物質移動の制約及び樹脂へのエクソソームの吸着と脱着の遅さにより、クロマトグラフィー樹脂の体積当たりに負荷することができるエクソソームの量は、カラム負荷中の流速を遅くし、より長いカラムを採用して、滞留時間を長くすることにより増加させることができる。
クロマトグラフィー樹脂の体積当たりに負荷することができるエクソソームの量は、供給物質を調節する、例えば、エクソソームの濃度を増加させる、不純物の濃度を低減させる、pHを変える、塩濃度を低減させる、イオン強度を低減させる、またはエクソソームの特定の亜集団を変えることにより、改善することができる。物質移動の制約及び樹脂へのエクソソームの吸着と脱着の遅さにより、クロマトグラフィー樹脂の体積当たりに負荷することができるエクソソームの量は、カラム負荷中の流速を遅くし、より長いカラムを採用して、滞留時間を長くすることにより増加させることができる。
7.用途
7.1.エクソソームの精製
エクソソームを医療目的で使用するには、エクソソームが、マクロ分子、例えば核酸、夾雑タンパク質、脂質、炭水化物、代謝産物、低分子、金属、またはその組み合わせを含むがこれらに限定されない不純物を含まないまたはほとんど含まないことが求められる。本発明は、夾雑マクロ分子からエクソソームを精製する方法を提供する。いくつかの実施形態では、精製エクソソームは、夾雑マクロ分子を実質的に含まない。
7.1.エクソソームの精製
エクソソームを医療目的で使用するには、エクソソームが、マクロ分子、例えば核酸、夾雑タンパク質、脂質、炭水化物、代謝産物、低分子、金属、またはその組み合わせを含むがこれらに限定されない不純物を含まないまたはほとんど含まないことが求められる。本発明は、夾雑マクロ分子からエクソソームを精製する方法を提供する。いくつかの実施形態では、精製エクソソームは、夾雑マクロ分子を実質的に含まない。
7.2.エクソソームの亜分画
本発明の実施形態は、その膜タンパク質、サイズ、電荷密度、リガンドタイプ(例えば、テトラスパニン)及びヘパリンまたは他の硫酸化炭水化物結合部位に基づいて、エクソソームの集団を亜分画するための方法をさらに提供する。親和性タグ、ローディング及び溶出バッファー組成及びプロトコルの選択は、エクソソームの異なる亜集団の溶出をもたらすことができる。
本発明の実施形態は、その膜タンパク質、サイズ、電荷密度、リガンドタイプ(例えば、テトラスパニン)及びヘパリンまたは他の硫酸化炭水化物結合部位に基づいて、エクソソームの集団を亜分画するための方法をさらに提供する。親和性タグ、ローディング及び溶出バッファー組成及びプロトコルの選択は、エクソソームの異なる亜集団の溶出をもたらすことができる。
例えば、本発明の実施形態は、小さいまたは大きいサイズのエクソソームの集団を精製する方法を提供する。エクソソームのサイズは、当該分野で利用可能な方法により決定することができる。例えば、サイズは、ナノ粒子トラッキング解析、多角度光散乱、単一角度光散乱、サイズ排除クロマトグラフィー、超遠心分析、流動場分離法、レーザー回析、可変抵抗パルスセンシング、または動的光散乱法により測定することができる。
本発明の実施形態は、その電荷密度に基づいてエクソソームを亜分画する方法にさらに関する。エクソソームの電荷密度は、電位差滴定、陰イオン交換、陽イオン交換、等電点電気泳動、ゼータ電位、キャピラリー電気泳動、キャピラリーゾーン電気泳動、ゲル電気泳動により決定することができる。
本発明の実施形態は、他の生理学的な特性、例えば生体内分布、細胞取り込み、半減期、薬力学、効力、投与量、免疫応答、負荷効率、安定性、または他の化合物に対する反応性に基づいて、エクソソームを亜分画する方法にも関する。この方法は、特定の用途に適切であるエクソソームの集団の単離を可能とする。
8.エクソソームの特徴決定
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、各収集画分に含有されるエクソソームを特徴決定するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、エクソソームの内容物を、研究及び特徴決定のために抽出することができる。いくつかの実施形態では、エクソソームは、サイズ、形状、形態、または分子組成、例えば核酸、タンパク質、代謝産物、及び脂質を含むがこれらに限定されないメトリックによって単離及び特徴決定される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、各収集画分に含有されるエクソソームを特徴決定するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、エクソソームの内容物を、研究及び特徴決定のために抽出することができる。いくつかの実施形態では、エクソソームは、サイズ、形状、形態、または分子組成、例えば核酸、タンパク質、代謝産物、及び脂質を含むがこれらに限定されないメトリックによって単離及び特徴決定される。
8.1.エクソソームの内容物の測定
エクソソームは、タンパク質、ペプチド、RNA、DNA、及び脂質を含むことができる。総RNAは、酸性フェノール:クロロホルム抽出を使用して抽出することができる。次いで、RNAを、ガラス繊維フィルターを、低分子RNAを含有する総RNAを回収する、またはmRNAなどのより長いRNA種から200ヌクレオチド長未満の低分子RNA種を分離するという条件下で使用して、精製することができる。RNAが少量で溶出されるため、アルコール沈殿ステップはRNAの単離に必要ないだろう。
エクソソームは、タンパク質、ペプチド、RNA、DNA、及び脂質を含むことができる。総RNAは、酸性フェノール:クロロホルム抽出を使用して抽出することができる。次いで、RNAを、ガラス繊維フィルターを、低分子RNAを含有する総RNAを回収する、またはmRNAなどのより長いRNA種から200ヌクレオチド長未満の低分子RNA種を分離するという条件下で使用して、精製することができる。RNAが少量で溶出されるため、アルコール沈殿ステップはRNAの単離に必要ないだろう。
エクソーム組成物は、トランスクリプトミックス、配列決定、プロテオミックス、質量分析、またはHP-LCを含むが、これらに限定されない当該分野で公知の方法により評価され得る。
(RNA及びDNAを含む)単離されたエクソソームに関連するヌクレオチドの組成は、当業者に周知の様々な技術(例えば、定量的または半定量的RT-PCR、ノーザンブロット分析、溶液ハイブリダイゼーション検出)を使用して測定することができる。特定の実施形態では、少なくとも1種のRNAのレベルは、エクソソーム組成からRNAを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを提供し、この標的オリゴデオキシヌクレオチドを1つまたは複数のRNA特異的プローブオリゴヌクレオチド(例えば、RNA特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイ)にハイブリダイズさせて、エクソソーム組成のハイブリダイゼーションプロファイルを提供し、エクソソーム組成ハイブリダイゼーションプロファイルを、対照試料から生成されたハイブリダイゼーションプロファイルと比較することにより、測定される。対照試料と対比した検査試料中の少なくとも1種のRNAのシグナルの変化は、RNA組成を示す。
また、マイクロアレイは、公知のRNA配列から生成された遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブから調製することができる。このアレイは、2つの異なるオリゴヌクレオチドプローブを各RNAに関して含有することができ、一方は活性な成熟配列を含有し、他方はRNAの前駆体(例えばmiRNA及び初期miRNA)に特異的である。アレイは、数塩基のみがヒトオルソログと異なる1つまたは複数のマウス配列などの対照も含有することができ、これはハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件の対照として機能できる。両種からのtRNA及び他のRNA(例えば、rRNA、mRNA)を、マイクロチップ上にプリントすることもでき、これが特異的ハイブリダイゼーションのための、内部の比較的安定した陽性対照となる。非特異的ハイブリダイゼーションのための1つまたは複数の適切な対照も、マイクロチップ上に含めることができる。この目的のためには、どのような公知のRNAとも全く相同性が存在しないことを基準に配列が選択される。
マイクロアレイは、当該分野で公知の方法を使用して製作することが出来る。例えば、適当な長さ、例えば40ヌクレオチドのプローブオリゴヌクレオチドをC6位で5’-アミン修飾し、市販のマイクロアレイシステム、例えば、GeneMachine OmniGrid(商標)100 Microarrayer及びAmersham CodeLink(商標)を使用して活性化スライド上にプリントする。標的RNAに対応する標識cDNAオリゴマーを、標識プライマーを用いて標的RNAを逆転写することにより調製する。第一の鎖合成の後、RNA/DNAハイブリッドを変性させ、RNA鋳型を分解する。次いで、このように調製された標識された標的cDNAを、例えば6×SSPE/30%フォルムアミド、25℃にて18時間というハイブリダイゼーション条件下でマイクロアレイチップにハイブリダイズさせ、0.75×TNT中で37℃にて40分間洗浄する。固定されたプローブDNAが試料中の相補的な標的cDNAを認識するアレイ上の位置で、ハイブリダイゼーションが生じる。この標識された標的cDNAは、結合が生じたアレイ上の正確な位置の印となり、自動検出及び定量が可能となる。アウトプットは、エクソソーム調製物中の特定のcDNA配列の相対存在量、従って対応する相補的RNAの相対存在量を示す、ハイブリダイゼーション事象のリストからなる。一実施形態に従い、標識cDNAオリゴマーはビオチン標識cDNAであり、ビオチン標識プライマーから調製される。マイクロアレイは次いで、例えば、ストレプトアビジン-Alexa647コンジュゲートを用いたビオチン含有転写産物の直接的検出によって処理され、通常のスキャニング法を利用してスキャンされる。アレイ上の各スポットの画像強度は、エクソソーム中の対応するRNAの存在量に比例する。
データマイニング作業は、チップの走査、信号収集、画像処理、正規化、統計学的処理及びデータ比較ならびに経路分析を含む生物情報学により達成される。このように、マイクロアレイは、高いスループット能で、数百、数千のポリヌクレオチドを同時にプロファイリングできる。mRNA発現のマイクロアレイプロファイリング分析は、基礎研究において遺伝子発現研究に有益なデータを提供することに成功している。そして、この技術は、製薬産業及び臨床診断において実践されてきた。利用可能になるmiRNAデータの量の増大及び遺伝子制御におけるmiRNAの重要性についての証拠の蓄積に伴い、マイクロアレイは高スループットmiRNA研究に有用な技術となっている。ポリヌクレオチドプローブを利用するmiRNAレベルの分析は、様々な物理的フォーマットにおいても実施することができる。例えば、マイクロタイタープレートの使用または自動操作を使用して、多数の検査試料のプロセシングを容易にすることができる。
8.2.エクソソームのサイズの測定
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、精製された画分に含まれるエクソソーム及び/またはエクソソームの集団のサイズを測定することを含む。いくつかの実施形態では、エクソソームサイズは、最長の測定可能な寸法として測定される。一般に、エクソソームの最長の全体寸法は、その直径とも称される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、精製された画分に含まれるエクソソーム及び/またはエクソソームの集団のサイズを測定することを含む。いくつかの実施形態では、エクソソームサイズは、最長の測定可能な寸法として測定される。一般に、エクソソームの最長の全体寸法は、その直径とも称される。
エクソソームサイズは、当該分野で公知の様々な方法、例えば、ナノ粒子トラッキング解析、多角度光散乱、単一角度光散乱、サイズ排除クロマトグラフィー、超遠心分析、流動場分離法、レーザー回析、可変抵抗パルスセンシング、または動的光散乱法を使用して測定することができる。
エクソソームサイズは、動的光散乱法(DLS)及び/または多角度光散乱検出器(MALS)を使用して測定することができる。エクソソームのサイズを測定するためにDLS及び/またはMALSを使用する方法は、当業者に公知であり、ナノ粒子トラッキングアッセイ(NTA、例えば、Malvern Nanosight NS300ナノ粒子トラッキングデバイスを使用する)が含まれる。特定の実施形態では、エクソソームサイズは、Malvern NanoSight NS300を使用して決定される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のエクソソームは、NTA(例えば、Malvern
NanosightNS300を使用する)により測定して約20~1000nmの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソームは、NTA(例えば、Malvern NanosightNS300を使用する)により測定して約40~1000nmの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの90%が、NTA(例えば、Malvern Nanosight NS300を使用する)により測定して約20~1000nmの最長寸法を有する、集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの95%が、NTA(例えば、Malvern Nanosight NS300を使用する)により測定して約20~1000nmの最長寸法を有する、集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの99%が、NTA(例えば、Malvern Nanosight NS300を使用する)により測定して約20~1000nmの最長寸法を有する、集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの90%が、NTA(例えば、Malvern Nanosight NS300を使用する)により測定して約40~1000nmの最長寸法を有する、集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの95%が、NTA(例えば、Malvern Nanosight NS300を使用する)により測定して約40~1000nmの最長寸法を有する、集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの99%が、NTA(例えば、Malvern Nanosight NS300を使用する)により測定して約40~1000nmの最長寸法を有する、集団を含む。
NanosightNS300を使用する)により測定して約20~1000nmの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソームは、NTA(例えば、Malvern NanosightNS300を使用する)により測定して約40~1000nmの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの90%が、NTA(例えば、Malvern Nanosight NS300を使用する)により測定して約20~1000nmの最長寸法を有する、集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの95%が、NTA(例えば、Malvern Nanosight NS300を使用する)により測定して約20~1000nmの最長寸法を有する、集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの99%が、NTA(例えば、Malvern Nanosight NS300を使用する)により測定して約20~1000nmの最長寸法を有する、集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの90%が、NTA(例えば、Malvern Nanosight NS300を使用する)により測定して約40~1000nmの最長寸法を有する、集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの95%が、NTA(例えば、Malvern Nanosight NS300を使用する)により測定して約40~1000nmの最長寸法を有する、集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの99%が、NTA(例えば、Malvern Nanosight NS300を使用する)により測定して約40~1000nmの最長寸法を有する、集団を含む。
エクソソームサイズは、可変抵抗パルスセンシング(TRPS)を使用して測定することができる。特定の実施形態では、TRPSにより測定されるエクソソームサイズは、iZON qNANO Goldを使用して決定される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のエクソソームは、TRPS(例えば、iZON qNano Goldを使用する)により測定して約20~1000nmの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソームは、TRPS(例えば、iZON qNano Goldを使用する)により測定して約40~1000nmの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの90%が、TRPS(例えば、iZON qNano Goldを使用する)により測定して約20~1000nmの最長寸法を有する、集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの95%が、TRPS(例えば、iZON qNano Goldを使用する)により測定して約20~1000nmの最長寸法を有する、集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの99%が、TRPS(例えば、iZON qNano Goldを使用する)により測定して約20~1000nmの最長寸法を有する、集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの90%が、TRPS(例えば、iZON qNano Goldを使用する)により測定して約40~1000nmの最長寸法を有する、集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの95%が、TRPS(例えば、iZON qNano Goldを使用する)により測定して約40~1000nmの最長寸法を有する、集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの99%が、TRPS(例えば、iZON qNano Goldを使用する)により測定して約40~1000nmの最長寸法を有する、集団を含む。
エクソソームサイズは、電子顕微鏡を使用して測定することができる。いくつかの実施形態では、エクソソームサイズを測定するために使用される電子顕微鏡法は、透過型電子顕微鏡法である。特定の実施形態では、エクソソームサイズを測定するために使用される透過型電子顕微鏡は、Tecnai(商標)G2 Spirit BioTWINである。電子顕微鏡を使用してエクソソームサイズを測定する方法は、当業者に周知であり、任意のかかる方法は、エクソソームサイズを測定するのに適切であることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のエクソソームは、走査電子顕微鏡(例えば、Tecnai(商標)G2 Spirit BioTWIN走査電子顕微鏡)により測定して約20~1000nmの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソームは、走査電子顕微鏡(例えば、Tecnai(商標)G2 Spirit BioTWIN走査電子顕微鏡)により測定して約40~1000nmの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの90%が、走査電子顕微鏡(例えば、Tecnai(商標)G2 Spirit BioTWIN走査電子顕微鏡)により測定して約20~1000nmの最長寸法を有する、集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの95%が、走査電子顕微鏡(例えば、Tecnai(商標)G2 Spirit BioTWIN走査電子顕微鏡)により測定して約20~1000nmの最長寸法を有する、集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの99%が、走査電子顕微鏡(例えば、Tecnai(商標)G2 Spirit BioTWIN走査電子顕微鏡)により測定して約20~1000nmの最長寸法を有する、集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの90%が、走査電子顕微鏡(例えば、Tecnai(商標)G2 Spirit BioTWIN走査電子顕微鏡)により測定して約40~1000nmの最長寸法を有する、集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの95%が、走査電子顕微鏡(例えば、Tecnai(商標)G2 Spirit BioTWIN走査電子顕微鏡)により測定して約40~1000nmの最長寸法を有する、集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、前記エクソソームの99%が、走査電子顕微鏡(例えば、Tecnai(商標)G2 Spirit BioTWIN走査電子顕微鏡)により測定して約40~1000nmの最長寸法を有する、集団を含む。
8.3.エクソソームの電荷密度の測定
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、精製された画分に含まれるエクソソーム及び/またはエクソソームの集団の電荷密度を測定することを含む。いくつかの実施形態では、電荷密度は、電位差滴定、陰イオン交換、陽イオン交換、等電点電気泳動、ゼータ電位、キャピラリー電気泳動、キャピラリーゾーン電気泳動、またはゲル電気泳動により測定される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、精製された画分に含まれるエクソソーム及び/またはエクソソームの集団の電荷密度を測定することを含む。いくつかの実施形態では、電荷密度は、電位差滴定、陰イオン交換、陽イオン交換、等電点電気泳動、ゼータ電位、キャピラリー電気泳動、キャピラリーゾーン電気泳動、またはゲル電気泳動により測定される。
8.4.エクソソームタンパク質の密度の測定
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、エクソソーム表面上のエクソソームタンパク質の密度を測定することを含む。表面密度は、単位面積質量、面積当たりのタンパク質の数、エクソソーム当たりの分子の数または分子の強度、タンパク質のモル量、等として計算または提示することができる。表面密度は、当該分野で公知の方法により、例えば、バイオレイヤー干渉法(BLI)、FACS、ウェスタンブロッティング、蛍光(例えば、GFP融合タンパク質)検出、ナノ-フローサイトメトリー、ELISA、alphaLISA、及び/またはタンパク質ゲル上のバンドを測定することによるデンシトメトリーを使用することにより、実験的に測定することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、エクソソーム表面上のエクソソームタンパク質の密度を測定することを含む。表面密度は、単位面積質量、面積当たりのタンパク質の数、エクソソーム当たりの分子の数または分子の強度、タンパク質のモル量、等として計算または提示することができる。表面密度は、当該分野で公知の方法により、例えば、バイオレイヤー干渉法(BLI)、FACS、ウェスタンブロッティング、蛍光(例えば、GFP融合タンパク質)検出、ナノ-フローサイトメトリー、ELISA、alphaLISA、及び/またはタンパク質ゲル上のバンドを測定することによるデンシトメトリーを使用することにより、実験的に測定することができる。
以下の実施例は、本発明をどのように実施し用いるのかを当業者に完全に開示し記載するためのものであって、本発明者らが彼らの発明であるとみなすものの範囲を限定することを意図するものではなく、以下の実験が全てであるまたはこれらのみが行われたと示すことを意図するものでもない。用いられる数値(例えば量、温度等)に関し、正確性を確保するよう努力が払われているが、実験的誤差及び偏差を考慮に入れなければならない。別段の指定がない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子重量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。標準的な略語を使用することができる、例えば、bp、塩基対(複数可);kb、キロ塩基(複数可);pl、ピコリットル(複数可);sまたはsec、秒(複数可);min、分(複数可);hまたはhr、時間(複数可);aa、アミノ酸(複数可);nt、ヌクレオチド(複数可);等である。
本発明の実践には、別段の指示がない限り、当該分野の技術範囲内で、タンパク質化学、生化学、組み換えDNA技術及び薬理学の従来の方法を採用するだろう。このような技術は、文献において十分に説明される。例えば、T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman and Company,1993);AL.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,current addition);Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd Edition,1989);Methods In Enzymology(S.Colowick and N.Kaplan eds.,Academic Press,Inc.);Remington’s Pharmaceutical Sciences,21th Edition(Easton,Pennsylvania:Mack Publishing Company,2005);Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed.(Plenum
Press)Vols A and B(l992)を参照されたい。
Press)Vols A and B(l992)を参照されたい。
実施例1:エクソソームタンパク質の同定
1.エクソソームの収集
エクソソームを、9日後にHEK293 SF細胞の高密度懸濁培養物の上清から収集した。上清を濾過し、陰イオン交換クロマトグラフィーにより分画し、塩化ナトリウムの段階勾配にて溶出した。タンパク質濃度が最も高いピーク画分は、エクソソーム及び夾雑細胞成分を含有した。ピーク画分を単離し、超遠心分離によりOptiprep(商標)(60%イオジキサノールw/v)密度勾配でさらに分画した。
1.エクソソームの収集
エクソソームを、9日後にHEK293 SF細胞の高密度懸濁培養物の上清から収集した。上清を濾過し、陰イオン交換クロマトグラフィーにより分画し、塩化ナトリウムの段階勾配にて溶出した。タンパク質濃度が最も高いピーク画分は、エクソソーム及び夾雑細胞成分を含有した。ピーク画分を単離し、超遠心分離によりOptiprep(商標)(60%イオジキサノールw/v)密度勾配でさらに分画した。
エクソソーム画分を、38.5mLウルトラクリア(344058)チューブ内、SW
32 Tiローターを133,900×gで3時間4℃にて超遠心分離することより、濃縮した。ペレット化した物質を、1mL PBS及び3mLのOptiprep(商標)に再懸濁し、最終イオジキサノール濃度を45%とした。Optiprep(商標)勾配に関しては、4段滅菌勾配を、SW 41 Tiローター用に、12mLウルトラクリア(344059)チューブ中に、再懸濁物質を含有する4mLの45%イオジキサノール、3mLの30%イオジキサノール、2mLの22.5%イオジキサノール、2mLの17.5%イオジキサノール、及び1mL PBSを用いて調製した。Optiprep(商標)勾配を、150,000×gで16時間4℃にて超遠心分離して、エクソソーム画分を分離した。超遠心分離により、エクソソームを含有すると知られている上部画分、中密度の細胞デブリを含有する中間画分、及び高密度凝集体及び細胞デブリを含有する下部画分がもたらされた(図1)。エクソソーム層を、次いで、チューブの上部約3mLから穏やかに収集した。
32 Tiローターを133,900×gで3時間4℃にて超遠心分離することより、濃縮した。ペレット化した物質を、1mL PBS及び3mLのOptiprep(商標)に再懸濁し、最終イオジキサノール濃度を45%とした。Optiprep(商標)勾配に関しては、4段滅菌勾配を、SW 41 Tiローター用に、12mLウルトラクリア(344059)チューブ中に、再懸濁物質を含有する4mLの45%イオジキサノール、3mLの30%イオジキサノール、2mLの22.5%イオジキサノール、2mLの17.5%イオジキサノール、及び1mL PBSを用いて調製した。Optiprep(商標)勾配を、150,000×gで16時間4℃にて超遠心分離して、エクソソーム画分を分離した。超遠心分離により、エクソソームを含有すると知られている上部画分、中密度の細胞デブリを含有する中間画分、及び高密度凝集体及び細胞デブリを含有する下部画分がもたらされた(図1)。エクソソーム層を、次いで、チューブの上部約3mLから穏やかに収集した。
エクソソーム画分を、38.5mLウルトラクリア(344058)チューブ内で約32mL PBSに希釈し、133,900×gで3時間4℃にて超遠心分離して、精製エクソソームをペレット化した。ペレット化エクソソームを、次いで、最小容量のPBS(約200μL)に再懸濁し、4℃にて保管した。
2.LC-MS/MS分析のための試料調製
エクソソームに特異的なタンパク質を決定するために、Optiprep(商標)勾配の上部画分及び下部画分を、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析により分析した。全ての試料は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)バッファーまたはPBS及び5%スクロースのいずれかにて受け取った。分析の前に、各試料の総タンパク質濃度を、ビシンコニン酸(BCA)アッセイにより決定し、その後、各試料を、PBSバッファー中125μg/mLに適切に希釈した。次に、50.0μLの各試料を、等量のエクソソーム溶解バッファー(60mMトリス、400mM GdmCl、100mM EDTA、20mM TCEP、1.0%トリトンX-100)を含有する別々の1.5mL微量遠心チューブに加えて、その後2.0μLの1.0%トリトンX-100溶液を移した。次いで、全ての試料を55℃にて60分間インキュベートした。
エクソソームに特異的なタンパク質を決定するために、Optiprep(商標)勾配の上部画分及び下部画分を、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析により分析した。全ての試料は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)バッファーまたはPBS及び5%スクロースのいずれかにて受け取った。分析の前に、各試料の総タンパク質濃度を、ビシンコニン酸(BCA)アッセイにより決定し、その後、各試料を、PBSバッファー中125μg/mLに適切に希釈した。次に、50.0μLの各試料を、等量のエクソソーム溶解バッファー(60mMトリス、400mM GdmCl、100mM EDTA、20mM TCEP、1.0%トリトンX-100)を含有する別々の1.5mL微量遠心チューブに加えて、その後2.0μLの1.0%トリトンX-100溶液を移した。次いで、全ての試料を55℃にて60分間インキュベートした。
タンパク質の沈殿は、1250μLのエタノールを-20℃にて加えることによって行った。効率を改善するために、試料を、おおよそ10分間激しくボルテックスし、次いで、-20℃にて60分間インキュベートした。インキュベーション後、試料を、ウォーターバスで5分間超音波処理した。沈殿した物質を、5分間、15,000gで4℃にて遠心分離することによりペレット化した。上清をデカントし、ペレット化物質を、窒素ガスを使用して完全に乾燥させた。ペレットを、30.0μL消化バッファー(30mMトリス、1.0M GdmCl、100mM EDTA、50mM TCEP、pH8.5)に再懸濁し、またこれはジスルフィド結合を還元した。遊離システイン残基を、5.0μLアルキル化溶液(375mMヨードアセトアミド、50mMトリス、pH8.5)を加え、得られた溶液を室温にて暗所で少なくとも30分間インキュベートすることによりアルキル化した。
インキュベーション後、各試料を、30.0μLの50mMトリスpH8.5を使用して希釈し、タンパク質分解性消化を、2.0μgトリプシンを加えることにより開始した。全ての試料を混合し、次いで、一晩37℃にてインキュベートした。インキュベーション後、トリプシン活性を、5.0μLの10%ギ酸を加えることにより停止させた。LC-MS/MSによる分析の前に、各試料を、Pierce C18スピンカラムを使用して脱塩した。このプロセスの最後に、各試料を乾燥させ、0.1%ギ酸を含む50.0μLの水にて再構成し、HPLCバイアルに移して、分析した。
3.LC-MS/MS分析
試料を、UltiMate 3000 RSCLnano(Thermo Fisher Scientific)低流量クロマトグラフィーシステムへと注入し、トリプシンペプチドを、ローディング移動相(MPL:水、0.1%ギ酸)を1.000μL/分の流量にて使用して、Acclaim PepMap 100 C18トラッピングカラム(75μm×2cm、3μm粒子サイズ、100Å孔サイズ、Thermo Fisher Scientific)へと負荷した。ペプチドを溶出し、移動相A(MPA:水、0.1%ギ酸)及び移動相B(MPB:アセトニトリル、0.1%ギ酸)の勾配を、300nL/分の流量にて、EASY-Spray C18分析用カラム(75μm×25cm、2μm粒子サイズ、100Å孔サイズ、Thermo Fisher Scientific)にわたって用いて、分離した。溶出に使用した段階的な勾配は、2%MPBで開始し、これを負荷中8分間保持した。パーセンテージMPBを、次いで2~17%に35分間かけて、再度17~25%に45分間かけて、そして最後に25~40%に10分間かけて増加させた。最も疎水性の高い種は、98%MPBに5分間かけて増加し、そこに10分間保持することにより除去した。本方法の合計実行時間は135分で、カラムの再平衡化に十分な時間であった。洗浄サイクルを、同一でない分析用注入の間に行って、キャリーオーバーを最小限に抑えた。
試料を、UltiMate 3000 RSCLnano(Thermo Fisher Scientific)低流量クロマトグラフィーシステムへと注入し、トリプシンペプチドを、ローディング移動相(MPL:水、0.1%ギ酸)を1.000μL/分の流量にて使用して、Acclaim PepMap 100 C18トラッピングカラム(75μm×2cm、3μm粒子サイズ、100Å孔サイズ、Thermo Fisher Scientific)へと負荷した。ペプチドを溶出し、移動相A(MPA:水、0.1%ギ酸)及び移動相B(MPB:アセトニトリル、0.1%ギ酸)の勾配を、300nL/分の流量にて、EASY-Spray C18分析用カラム(75μm×25cm、2μm粒子サイズ、100Å孔サイズ、Thermo Fisher Scientific)にわたって用いて、分離した。溶出に使用した段階的な勾配は、2%MPBで開始し、これを負荷中8分間保持した。パーセンテージMPBを、次いで2~17%に35分間かけて、再度17~25%に45分間かけて、そして最後に25~40%に10分間かけて増加させた。最も疎水性の高い種は、98%MPBに5分間かけて増加し、そこに10分間保持することにより除去した。本方法の合計実行時間は135分で、カラムの再平衡化に十分な時間であった。洗浄サイクルを、同一でない分析用注入の間に行って、キャリーオーバーを最小限に抑えた。
質量分析は、Q Exactive Basic(Thermo Fisher Scientific)質量分析計を用いて行った。前駆体イオン質量スペクトルを、400~1600Daのm/z範囲にわたって、70,000の分解能にて測定した。最も強力な10の前駆体イオンを選択し、27の衝突エネルギーを使用して、HCD細胞内で断片化し、MS/MSスペクトルを、200~2000Daのm/z範囲にわたって、35,000の分解能にて測定した。2~4の電荷状態を有するイオンを、断片化のために選択し、動的排除時間を30秒に設定した。14の一般的なポリシロキサンを含有する排除リストを使用して、既知の夾雑物質の誤同定を最小限に抑えた。
4.データ処理
タンパク質を、Proteome Discovererソフトウェア(バージョン2.1.1.21、Thermo Fisher Scientific)及び標的デコイPSMバリデーターと組み合わせたSequest HTアルゴリズムを使用して、まず同定し、定量化(標識不含)した。検索は、完全Swiss-Protホモサピエンス(分類9606バージョン2017-05-10:42、153エントリ)参照データベース、ならびにE1aタンパク質(7エントリー)を含有するカスタムUniprotデータベースに対して行った。以下の検索パラメータを使用した:酵素、トリプシン;最大2か所の未切断サイト;最小ペプチド長は6残基;10ppmの前駆体質量許容値;及び0.02Da断片質量許容値。検索は、特異動的修飾(Mの酸化;NまたはQの脱アミド化;S、T、またはYのリン酸化;ペプチド末端Eのピログルタミル化;及びタンパク質N末端のアセチル化)及び静的修飾(Cのカルバミドメチル化)も含んだ。
タンパク質を、Proteome Discovererソフトウェア(バージョン2.1.1.21、Thermo Fisher Scientific)及び標的デコイPSMバリデーターと組み合わせたSequest HTアルゴリズムを使用して、まず同定し、定量化(標識不含)した。検索は、完全Swiss-Protホモサピエンス(分類9606バージョン2017-05-10:42、153エントリ)参照データベース、ならびにE1aタンパク質(7エントリー)を含有するカスタムUniprotデータベースに対して行った。以下の検索パラメータを使用した:酵素、トリプシン;最大2か所の未切断サイト;最小ペプチド長は6残基;10ppmの前駆体質量許容値;及び0.02Da断片質量許容値。検索は、特異動的修飾(Mの酸化;NまたはQの脱アミド化;S、T、またはYのリン酸化;ペプチド末端Eのピログルタミル化;及びタンパク質N末端のアセチル化)及び静的修飾(Cのカルバミドメチル化)も含んだ。
標的デコイPSMバリデーターでは、Scaffoldソフトウェア(バージョン4.8.2、Proteome Software Inc.)を使用してデータが再度検索されるため、最大デルタCn及び厳密及び緩和の両方の標的偽発見率(FDR)を1に設定した。Scaffoldでは、データを、さらにX!タンデムオープンソースアルゴリズムを使用して検索して、99.0%のタンパク質閾値、最小2つのペプチド、及び95%のペプチド閾値を使用してタンパク質を同定した。
新規エクソソーム特異的タンパク質の同一性を決定するために、総ペプチドスペクトル一致(PSM)を、Optiprep(商標)勾配の上部エクソソーム画分において見いだされるタンパク質を低画分のものに対して比較した。図2に示すように、上部画分タンパク質(Y軸)及び下部画分タンパク質(X軸)の間には弱い相関があった。点線より上にプロットしたタンパク質は、エクソソーム富化タンパク質を表し、一方で点線より下のものは、夾雑物富化タンパク質を表す。重要なことに、(1)プロスタグランジンF2受容体ネガティブレギュレーター(PTGFRN)、(2)ベイシジン(BSG)、(3)免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー3(IGSF3)、(4)免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー8(IGSF8)、(5)インテグリンベータ-1(ITGB1)、(6)インテグリンアルファ-4(ITGA4)、(7)4F2細胞表面抗原重鎖(SLC3A2)、及び(8)ATP輸送体タンパク質のクラス(ATP1A1、ATP1A2、ATP1A3、ATP1A4、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B2、ATP2B3、ATP2B4)を含む、エクソソーム画分において高度に富化したと同定された膜関連タンパク質がいくつかあった。図3~5のトリプシンペプチドカバレッジマップに示すように、質量分析試験は、PTGFRN(図3)、IGSF8(図4)、及びベイシジン(図5)の広範なカバレッジをもたらした。併せて、これらの結果は、不均一集団からエクソソームを精製するまたは操作エクソソームの生成における足場として使用するのに有用であり得る精製エクソソーム集団において多くの膜貫通型タンパク質が富化したことを実証する。
実施例2:表面タンパク質発現の検証
質量分析試験において同定されたエクソソーム特異的タンパク質が、エクソソームの表面上で高度に富化されたことを確認するために、タンパク質ブロッティングを、総細胞ライセート及びHEK293細胞からの精製されたエクソソーム集団に実行した。図6Aに示すように、総タンパク質パターンは、総細胞ライセート(左)及びエクソソームライセート(右)の間で実質的に異なった。具体的には、約110kDaにて強いバンドが、エクソソームライセートでは見られたが、総細胞ライセートには存在しなかった。PTGFRNのウェスタンブロッティングにより、約110kDaの予想されるサイズでのバンドが、エクソソームライセートにはあるが、細胞ライセートにはないことが明らかとなり(図6B)、このことは、PTGFRNがエクソソームにおいて高度に富化され、総エクソソームライセートにおいて視覚的に検出可能であり得ることを示す。
質量分析試験において同定されたエクソソーム特異的タンパク質が、エクソソームの表面上で高度に富化されたことを確認するために、タンパク質ブロッティングを、総細胞ライセート及びHEK293細胞からの精製されたエクソソーム集団に実行した。図6Aに示すように、総タンパク質パターンは、総細胞ライセート(左)及びエクソソームライセート(右)の間で実質的に異なった。具体的には、約110kDaにて強いバンドが、エクソソームライセートでは見られたが、総細胞ライセートには存在しなかった。PTGFRNのウェスタンブロッティングにより、約110kDaの予想されるサイズでのバンドが、エクソソームライセートにはあるが、細胞ライセートにはないことが明らかとなり(図6B)、このことは、PTGFRNがエクソソームにおいて高度に富化され、総エクソソームライセートにおいて視覚的に検出可能であり得ることを示す。
質量分析試験は、いくつかの新規エクソソーム関連膜タンパク質の存在を示した。この関連をさらに確認するために、エクソソーム画分を、自動的に形成されるOptiprep(商標)勾配で精製し、ウェスタンブロッティングにより分析した。図7Aに示すように、総タンパク質は、勾配の全ての画分において検出され、エクソソームマーカータンパク質アリックス及びシンテニンは、画分2~6において富化される。重要なことに、分析された新規表面マーカータンパク質はそれぞれ、これらの同じ画分において富化しており、このことは、エクソソームとの強く特異的な関連を示している(図7B)。これらの膜貫通型タンパク質が、エクソソーム上で高度に発現され、富化されているという実証は、これらのタンパク質のいずれかを対象とする結合剤を使用することによりエクソソームを精製する、ならびにこれらの新規タンパク質のいずれかに融合した異種タンパク質を含有する高発現表面改変エクソソームを生成する機会を提供する(図8)。
実施例3:PTGFRNのドメイン特徴決定
PTGFRN、BSG、IGSF3、及びIGSF8は全て、図8に図示するように、N末端が細胞外/小胞外環境に面し、C末端が細胞質/エクソソーム内腔に位置し、少なくとも2つの免疫グロブリンV(IgV)反復を含有するI型1回膜貫通型タンパク質である。PTGFRNは、図2に示す質量分析において検出された最も高度に富化した表面タンパク質であった。図9A及びBに記載するGFP及び完全長PTGFRNまたはPTGFRNの様々なIgV短縮化突然変異体間の融合タンパク質をコードする発現構築物は、HEK293細胞において安定して発現した。エクソソームを、HEK293細胞培養物から、実施例1に記載の方法を使用して単離し、抗GFP抗体を使用して、ウェスタンブロッティングにより分析した。図9Bに示すように、GFP及び完全長または短縮PTGFRN間の融合タンパク質の発現が、精製エクソソームにおいて検出された。興味深いことに、第一のIgVドメインの欠失は、低い分子量バンド(「切断産物」としてマークした)をもたらし、これは、完全長タンパク質の過剰発現では検出できなかった。この小さな産物は、全ての短縮化突然変異体において一貫して検出され、それがプロテアーゼ切断の結果として生成されたことが示された。様々なGFP-PTGFRN融合タンパク質を含有するエクソソームを、SDS-PAGE mini-PROTEAN(登録商標)TGXステインフリーゲル(Bio-Rad,Inc.)で分析して、総エクソソームタンパク質を測定した。結果を、図10に提供する。GFP及び完全長PTGFRNの融合タンパク質の発現は、精製エクソソームにおいて総タンパク質の約50%という高さのレベルにて、容易に検出可能であり、非常に豊富であった(レーン2)。低い分子量切断産物(「切断産物」としてマークした)は、はっきりと見えないため、ネイティブエクソソームまたはエクソソーム過剰発現完全長PTGFRNでは存在せず(レーン1及び2)、このことは、タンパク質のN末端にある第一のIgVドメイン(IgV1)が、PTGFRNの切断を防ぎ得ることを示す。
PTGFRN、BSG、IGSF3、及びIGSF8は全て、図8に図示するように、N末端が細胞外/小胞外環境に面し、C末端が細胞質/エクソソーム内腔に位置し、少なくとも2つの免疫グロブリンV(IgV)反復を含有するI型1回膜貫通型タンパク質である。PTGFRNは、図2に示す質量分析において検出された最も高度に富化した表面タンパク質であった。図9A及びBに記載するGFP及び完全長PTGFRNまたはPTGFRNの様々なIgV短縮化突然変異体間の融合タンパク質をコードする発現構築物は、HEK293細胞において安定して発現した。エクソソームを、HEK293細胞培養物から、実施例1に記載の方法を使用して単離し、抗GFP抗体を使用して、ウェスタンブロッティングにより分析した。図9Bに示すように、GFP及び完全長または短縮PTGFRN間の融合タンパク質の発現が、精製エクソソームにおいて検出された。興味深いことに、第一のIgVドメインの欠失は、低い分子量バンド(「切断産物」としてマークした)をもたらし、これは、完全長タンパク質の過剰発現では検出できなかった。この小さな産物は、全ての短縮化突然変異体において一貫して検出され、それがプロテアーゼ切断の結果として生成されたことが示された。様々なGFP-PTGFRN融合タンパク質を含有するエクソソームを、SDS-PAGE mini-PROTEAN(登録商標)TGXステインフリーゲル(Bio-Rad,Inc.)で分析して、総エクソソームタンパク質を測定した。結果を、図10に提供する。GFP及び完全長PTGFRNの融合タンパク質の発現は、精製エクソソームにおいて総タンパク質の約50%という高さのレベルにて、容易に検出可能であり、非常に豊富であった(レーン2)。低い分子量切断産物(「切断産物」としてマークした)は、はっきりと見えないため、ネイティブエクソソームまたはエクソソーム過剰発現完全長PTGFRNでは存在せず(レーン1及び2)、このことは、タンパク質のN末端にある第一のIgVドメイン(IgV1)が、PTGFRNの切断を防ぎ得ることを示す。
完全長PTGFRN及び様々な短縮PTGFRN突然変異体を、次いで、N末端FLAGタグを用いてHEK293細胞において安定的に発現させた(図11A)。細胞培養物からのエクソソームを収集し、抗FLAG抗体を用いてウェスタンブロッティングにより分析した。結果を、図11Bに提供する。そのC末端にGFPを有する融合タンパク質(図9及び10)とは対照的に、N末端にFLAGタグを含有する融合タンパク質は、低分子量バンドを示さず(図11Bで「切断産物無し」とマークした)、より短い短縮化が低レベルにて検出された。この結果は、切断事象が、ウェスタンブロッティングに使用されるFLAGエピトープに連結したタンパク質のN末端を除去する可能性が高いことを示す(図11B)。
PTGFRNは、細胞ライセートにおいてほとんど検出されず、インタクト及び切断PTGFRNの混合物が、精製エクソソームにおいて検出され、これは、図6A及びBにおいて提供したウェスタンブロット結果によって示される通りである。これは、PTGFRNが、エクソソーム膜に局在化し統合されている間、またはエクソソームの形成中に切断されていることを示す。ADAM10(ディスインテグリン及びメタロプロテアーゼドメイン10)は、従来のエクソソームタンパク質及び膜関連メタロプロテアーゼである。HEK293細胞を、Cas9及びADAM10遺伝子座を標的とする4つのガイドRNA(CRISPR32174_SG、CRISPR726928_SG、CRISPR726931_SG、及びCRISPR726933_SG、Thermo Fisher Scientific)でトランスフェクトして、ADAM10ノックアウト細胞を生成した。ADAM10ノックアウト細胞(ADAM10-)または野生型細胞(ADAM10+)を次いで、GFPに融合した完全長PTGFRNを含有する融合タンパク質をコードする構築物またはGFPに融合した最初の3つのIgVドメインを欠く短縮PTGFRN(PTGFRN_IgV3-GFP)を含有する異なる融合タンパク質のいずれかを用いて安定的にトランスフェクトした。エクソソームを、これらの細胞から単離し、融合タンパク質の発現を、総タンパク質PAGE及びウェスタンブロッティングにより抗GFP抗体を使用して測定した。図12Aは、各レーンに同等量の総タンパク質が負荷されたことを示す。抗ADAM10抗体(ab124695;Abcam)を使用するウェスタンブロッティングは、ノックアウト細胞におけるADAM10の有効な欠失を示した(図12B)。抗GFP抗体を使用するウェスタンブロッティングは、図12Cに提供するように、野生型(ADAM10+)及びADAM10ノックアウト細胞(ADAM10-)の両方において完全長PTGFRN及びGFPを含有する融合タンパク質の高レベル発現を示した(レーン1及び2)。この結果は、完全長PTGFRNを含有する融合タンパク質の切断が検出されなかった図9Bの結果と一致する。興味深いことに、PTGFRN_IgV3-GFPに関して以前に検出された切断産物は、野生型細胞では検出されたが、ADAM10ノックアウト細胞には存在しなかった(図12C、レーン3及び4)。このことは、ADAM10が、エクソソームのPTGFRN断片の切断を媒介することを示す。この結果は、短縮PTGFRN断片を含有する融合タンパク質が、ADAM10を欠く(ADAM10-)細胞からのエクソソームでよりうまく発現され得ることも示す。
PTGFRNは、高密度エクソソーム装飾/負荷のための魅力的な融合パートナーとして使用することができるが、そのサイズ(約100kDa)のために、より小さな短縮バージョンが、大きな生物学的に活性な分子の共発現を可能にするために好ましいだろう。IgV短縮化突然変異体のそれぞれにおいて検出されたADAM10依存性切断は、ある特定の割合(%)の任意の融合タンパク質がエクソソーム表面から切断され、負荷/表示の程度を低下し得るため、高密度負荷に関して問題を有する。プロテアーゼ切断を被らずに高密度エクソソーム表面表示を促進する最小PTGFRN断片を同定するために、6つのIgVドメインのうちの5つを欠くPTGFRN(PTGFRN_IgV6)を、FLAGタグ及び融合パートナータンパク質への融合体として発現させた(図13)。PTGFRN_IgV6を含有する融合タンパク質の発現により、以前に同定された予測切断産物が得られた(図14B、番号451)。同時に4個の追加のアミノ酸を欠くPTGFRN_IgV6の連続短縮化突然変異体も検査し、12個のアミノ酸の除去により、PTGFRNの切断を受けなかったエクソソームが得られた(図14A、図14B、番号454)。PTGFRN番号454は、配列番号33のポリペプチドである。加えて、FLAGタグが、切断部位のN末端にあるため、PTGFRN_IgV6のより短い短縮化は、融合タンパク質のより高い発現をもたらし、このことは、切断はこれらの短縮化では生じないことを示す(図14C)。
図15に提供する結果は、完全長PTGFRN(FL)及びPTGFRN_454(sIgV)が、エクソソーム上及び/または内の内腔(C末端融合)または表面(N末端)タンパク質の高密度発現に関して理想的な融合パートナーであり得ることをさらに示す。この仮説を検証するために、数種の足場タンパク質を、高密度表示エクソソームを産生する能力に関して検査した。足場タンパク質及びGFPを含有する融合タンパク質を、具体的には、しばしば使用されるpDisplay足場(PDGF受容体)、PalmPalm(パルミトイル化配列)、CD81、または完全長PTGFRN(FL)もしくはPTGFRN_454(sIgV)のいずれかの内腔側に融合したGFPを含有する融合タンパク質を、細胞培養物において発現させた。各融合タンパク質を安定的に発現する細胞から精製されたエクソソームの用量滴定により、PTGFRN融合タンパク質が、周知のエクソソームタンパク質CD81を含むいずれの他の足場よりも大きなGFP蛍光をもたらしたことが実証された。pDisplay足場と比較して、完全長PTGFRN及びsIgVは、負荷効率において25倍を超える亢進をもたらした(図15)。これらの結果は、完全長PTGFRNまたは切断部位を除去するのに十分に短い短縮PTGFRN(sIgV)の、融合パートナーとしての使用は、高密度表示またはエクソソーム負荷を可能にすることを示す。
実施例4:IGSF8過剰発現は、高密度エクソソーム表示をもたらさない
PTGFRNの発現レベルは、それが操作エクソソームの産生に理想的な融合パートナーであり得ることを示す。免疫グロブリン含有タンパク質ファミリーの他のメンバーがエクソソーム操作に好適であり得るか否かを決定するために、HEK293細胞を、IGFS8-GFP融合タンパク質で安定的にトランスフェクトし、結果得られたエクソソームを精製した(図16A)。ネイティブエクソソーム及びIGSF8-GFPエクソソームを、SDS-PAGE mini-PROTEAN(登録商標)TGXステインフリーゲル(Bio-Rad,Inc.)で分析し、これにはトリプトファン結合染料を使用してタンパク質を検出した。これは図16Bに提供する通りである。IGSF8は、10のトリプトファン残基を含有し、その検出を容易にした。抗GFP抗体を使用するウェスタンブロッティングにより、過剰発現エクソソーム上のIGSF8-GFPの発現が確認された(図16B、下部)。興味深いことに、IGSF8-GFPエクソソームを、pDisplay足場(PDGF受容体)、CD81、または完全長PTGFRN(FL)もしくはPTGFRN_454(sIgV)のいずれかへのGFP融合体と比較して、GFP蛍光に関して検査したとき、IGSF8(FL IGSF8)は、pDisplayで観察された低レベルの確率的表示を超えるGFP富化を示せなかった(図17)。この結果は、全てのIgVファミリーメンバーを高密度エクソソーム表面表示/内腔負荷を操作するための融合タンパク質として使用することができるわけではないこと、及びPTGFRN及び他のファミリーメンバーが、この点でIGSF8より優れていることが示される。IGSF8発現は、しかしながら、改変されていないエクソソームの表面上では高レベルで検出されたため、IGSF8をエクソソームアフィニティー精製の標的として使用することは許容されるだろう。
PTGFRNの発現レベルは、それが操作エクソソームの産生に理想的な融合パートナーであり得ることを示す。免疫グロブリン含有タンパク質ファミリーの他のメンバーがエクソソーム操作に好適であり得るか否かを決定するために、HEK293細胞を、IGFS8-GFP融合タンパク質で安定的にトランスフェクトし、結果得られたエクソソームを精製した(図16A)。ネイティブエクソソーム及びIGSF8-GFPエクソソームを、SDS-PAGE mini-PROTEAN(登録商標)TGXステインフリーゲル(Bio-Rad,Inc.)で分析し、これにはトリプトファン結合染料を使用してタンパク質を検出した。これは図16Bに提供する通りである。IGSF8は、10のトリプトファン残基を含有し、その検出を容易にした。抗GFP抗体を使用するウェスタンブロッティングにより、過剰発現エクソソーム上のIGSF8-GFPの発現が確認された(図16B、下部)。興味深いことに、IGSF8-GFPエクソソームを、pDisplay足場(PDGF受容体)、CD81、または完全長PTGFRN(FL)もしくはPTGFRN_454(sIgV)のいずれかへのGFP融合体と比較して、GFP蛍光に関して検査したとき、IGSF8(FL IGSF8)は、pDisplayで観察された低レベルの確率的表示を超えるGFP富化を示せなかった(図17)。この結果は、全てのIgVファミリーメンバーを高密度エクソソーム表面表示/内腔負荷を操作するための融合タンパク質として使用することができるわけではないこと、及びPTGFRN及び他のファミリーメンバーが、この点でIGSF8より優れていることが示される。IGSF8発現は、しかしながら、改変されていないエクソソームの表面上では高レベルで検出されたため、IGSF8をエクソソームアフィニティー精製の標的として使用することは許容されるだろう。
実施例5:哺乳動物細胞におけるPTGFRNの細胞外ドメインの発現及び特徴決定
PTGFRNの細胞外ドメイン(ECD)は、98kDaであり、6つのタンデムIgVリピートを含有する。PTGFRNのECDは、そのサイズ及び高発現レベルのために、エクソソームアフィニティー精製試薬の望ましい標的であり得る。PTGFRNのこのセグメントを特徴決定するために、PTGFRN ECDを、内因性シグナルペプチドをN末端(SP)に、PAR1切断部位及びFcドメインをC末端に伴う融合タンパク質として発現させた(図18)。PAR1は、トロンビンの基質であり、プロテインA樹脂を使用してFc融合タンパク質を溶出するために使用することができる。PTGFRNは、9つの予測されるN結合型グリコシル化部位及び6つの予測されるジスルフィド結合を有し、これは内因性糖タンパク質の産生のための細菌発現系の使用を排除する。PTGFRN ECDを、Expi293発現系(Thermo Fisher Scientific)を使用して過剰発現させた。これは、高収率の哺乳動物組み換えタンパク質を産生するために使用される。トランスフェクトされたExpi293細胞からの条件細胞培養液を、0.2μmろ過し、プロテインAで精製した後、低pHグリシン溶出を行い、すぐに中和した。Fcタグを、トロンビン処理で除去し、切断したタンパク質プールを、プロテインAに再度流した。フロースルーを収集し、濃縮し、分取SECで仕上げを実施(polish)した。精製されたPTGFRN ECDを、ゲルろ過クロマトグラフィーによりPBS pH7.4中、Superdex 200カラム(GE Healthcare)を使用して分析し、280nm UV蛍光にて検出した。変性SDS-PAGE mini-PROTEAN(登録商標)TGXステインフリーゲル(Bio-Rad,Inc.)で、溶出液ピークを分析したとき、図19Aは、単一溶出ピークを約55mLで示し、図19Bは、PTGFRN ECDの予測されたサイズでの単一タンパク質産物を示し、このことは、PTGFRN ECDを哺乳動物細胞から精製できることを示す。
PTGFRNの細胞外ドメイン(ECD)は、98kDaであり、6つのタンデムIgVリピートを含有する。PTGFRNのECDは、そのサイズ及び高発現レベルのために、エクソソームアフィニティー精製試薬の望ましい標的であり得る。PTGFRNのこのセグメントを特徴決定するために、PTGFRN ECDを、内因性シグナルペプチドをN末端(SP)に、PAR1切断部位及びFcドメインをC末端に伴う融合タンパク質として発現させた(図18)。PAR1は、トロンビンの基質であり、プロテインA樹脂を使用してFc融合タンパク質を溶出するために使用することができる。PTGFRNは、9つの予測されるN結合型グリコシル化部位及び6つの予測されるジスルフィド結合を有し、これは内因性糖タンパク質の産生のための細菌発現系の使用を排除する。PTGFRN ECDを、Expi293発現系(Thermo Fisher Scientific)を使用して過剰発現させた。これは、高収率の哺乳動物組み換えタンパク質を産生するために使用される。トランスフェクトされたExpi293細胞からの条件細胞培養液を、0.2μmろ過し、プロテインAで精製した後、低pHグリシン溶出を行い、すぐに中和した。Fcタグを、トロンビン処理で除去し、切断したタンパク質プールを、プロテインAに再度流した。フロースルーを収集し、濃縮し、分取SECで仕上げを実施(polish)した。精製されたPTGFRN ECDを、ゲルろ過クロマトグラフィーによりPBS pH7.4中、Superdex 200カラム(GE Healthcare)を使用して分析し、280nm UV蛍光にて検出した。変性SDS-PAGE mini-PROTEAN(登録商標)TGXステインフリーゲル(Bio-Rad,Inc.)で、溶出液ピークを分析したとき、図19Aは、単一溶出ピークを約55mLで示し、図19Bは、PTGFRN ECDの予測されたサイズでの単一タンパク質産物を示し、このことは、PTGFRN ECDを哺乳動物細胞から精製できることを示す。
PTGFRN ECDの適切な発現を確認するため、精製されたタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィー/多角度光散乱検出器(SEC-MALS)により、BSA及び抗VLA4抗体を、比較のための標準として使用して、分析した。組み換えPTGFRN
ECDを、その予測分子量の約2倍にて溶出した(予測分子量、98kDaに対して198kDa;図20A)。PTGFRN ECDが溶液中でホモ二量体を形成するか否かを決定するために、組み換えPTGFRN ECDを、分析SECカラム(Tosoh、7.8×30cm、G3000SW xl)上、PBS中、塩化グアニジウム(GuHCl)の不在下または1Mもしくは2M塩化グアニジニウム(GuHCl)の存在下で、泳動させた。図20Bは、漸増GuHCl(GuHCl無し(「PTGFRN」とラベル付けされた曲線)、1M GuHCl(「PTGFRN+1M GuHCl」とラベル付けされた曲線)、または2M GuHCl(「PTGFRN+2M GuHCl」とラベル付けされた曲線))下でのPTGFRN ECDの溶出プロファイル、及び予測二量体ピークの単量体ピークへの変換を示す。これらの結果は、PTGFRN ECDがホモ二量体を形成し、PTGFRN 二量体化がエクソソーム表面上で天然に生じ得ることを示す。
ECDを、その予測分子量の約2倍にて溶出した(予測分子量、98kDaに対して198kDa;図20A)。PTGFRN ECDが溶液中でホモ二量体を形成するか否かを決定するために、組み換えPTGFRN ECDを、分析SECカラム(Tosoh、7.8×30cm、G3000SW xl)上、PBS中、塩化グアニジウム(GuHCl)の不在下または1Mもしくは2M塩化グアニジニウム(GuHCl)の存在下で、泳動させた。図20Bは、漸増GuHCl(GuHCl無し(「PTGFRN」とラベル付けされた曲線)、1M GuHCl(「PTGFRN+1M GuHCl」とラベル付けされた曲線)、または2M GuHCl(「PTGFRN+2M GuHCl」とラベル付けされた曲線))下でのPTGFRN ECDの溶出プロファイル、及び予測二量体ピークの単量体ピークへの変換を示す。これらの結果は、PTGFRN ECDがホモ二量体を形成し、PTGFRN 二量体化がエクソソーム表面上で天然に生じ得ることを示す。
実施例6:PTGFRNプロテインアレイ
PTGFRNは、文献においてあまり特徴決定されておらず、エクソソームタンパク質としてのその役割は、大部分が未解明である。PTGFRNは、同じくエクソソームの表面上で見いだされる、CD9とのその相互作用のために、CD9パートナー1(CD9P-1)としても知られる。PTGFRNがどのタンパク質に結合するのかをさらに理解するため、組み換えモノ-ビオチン化ヒトPTGFRN ECDを生成し、ヒトプロテオームの81%を包含する20,000超のタンパク質を含有するタンパク質マイクロアレイ上にプローブした(CDI Laboratories)。結合分析を、それぞれ、pH5.6及び7.4にて行って、酸性化エンドソーム及びサイトゾルのpHを表した。9つの陽性ヒットがpH7.4にて同定され、16がpH5.6にて同定された。3つのタンパク質(LGALS1、ガレクチン-1;FCN1、フィコリン-1;MGAT4B、アルファ-1,3-マンノシル-糖タンパク質4-ベータ-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼB)が、pH5.6及びpH7.4の両方にて同定された(図21)。LGALS1は、単量体の炭水化物及び複合グリカンに結合すると知られているが、PTGFRN結合パートナーとしては関係付けられてない。PTGFRN及びLGALS1間の相互作用を確認するために、ビオチン化組み換えPTGFRN ECDを、ストレプトアビジン光学プローブに結合させ、Octet(登録商標)RED96(Pall)を使用してバイオレイヤー干渉法(BLI)により分析した。ガレクチン-1のPTGFRNへの用量依存性結合がBLIにより確認された(図22)。LGALS1及びPTGFRN間の相互作用は、可逆的であり、用量依存的様式でラクトースと競合し(図23)、この相互作用の特異性を実証する。これらの結果はまた、エクソソームが、PTGFRN結合パートナーを親和性試薬として使用することにより精製され得ることを示す。
PTGFRNは、文献においてあまり特徴決定されておらず、エクソソームタンパク質としてのその役割は、大部分が未解明である。PTGFRNは、同じくエクソソームの表面上で見いだされる、CD9とのその相互作用のために、CD9パートナー1(CD9P-1)としても知られる。PTGFRNがどのタンパク質に結合するのかをさらに理解するため、組み換えモノ-ビオチン化ヒトPTGFRN ECDを生成し、ヒトプロテオームの81%を包含する20,000超のタンパク質を含有するタンパク質マイクロアレイ上にプローブした(CDI Laboratories)。結合分析を、それぞれ、pH5.6及び7.4にて行って、酸性化エンドソーム及びサイトゾルのpHを表した。9つの陽性ヒットがpH7.4にて同定され、16がpH5.6にて同定された。3つのタンパク質(LGALS1、ガレクチン-1;FCN1、フィコリン-1;MGAT4B、アルファ-1,3-マンノシル-糖タンパク質4-ベータ-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼB)が、pH5.6及びpH7.4の両方にて同定された(図21)。LGALS1は、単量体の炭水化物及び複合グリカンに結合すると知られているが、PTGFRN結合パートナーとしては関係付けられてない。PTGFRN及びLGALS1間の相互作用を確認するために、ビオチン化組み換えPTGFRN ECDを、ストレプトアビジン光学プローブに結合させ、Octet(登録商標)RED96(Pall)を使用してバイオレイヤー干渉法(BLI)により分析した。ガレクチン-1のPTGFRNへの用量依存性結合がBLIにより確認された(図22)。LGALS1及びPTGFRN間の相互作用は、可逆的であり、用量依存的様式でラクトースと競合し(図23)、この相互作用の特異性を実証する。これらの結果はまた、エクソソームが、PTGFRN結合パートナーを親和性試薬として使用することにより精製され得ることを示す。
実施例7:PTGFRNまたはエクソソームへの抗PTGFRN抗体の結合
ビオチン化PTGFRNを、Octet(登録商標)RED96(Pall)のストレプトアビジンプローブに結合させ、PBS+0.1%Tween20中で、漸増濃度の、PTGFRN(MABT883,Millipore Sigma)の別名であるCD315に対するモノクローナルラット抗体とインキュベートした。用量依存性結合が検出され、抗体によるPTGFRNの特異的認識が示された(図24)。抗CD315抗体がエクソソームに結合できたか否かを決定するため、抗CD315抗体を、プロテインLプローブに結合させ、漸増量のOptiprep(商標)精製HEK293エクソソームとインキュベートした(図25)。図25に示すように、精製エクソソームとのインキュベーション後の用量依存性の偏向は、抗CD315抗体がエクソソーム表面上の内因性PTGFRNを認識できることを示す。同様の実験を、PTGFRN過剰発現エクソソーム(PTGFRN++エクソソーム)を生成するように完全長PTGFRNで安定的にトランスフェクトされたHEK293細胞を用いて行った。過剰発現エクソソームを、固定化抗CD315抗体とインキュベートし、用量依存性偏向がもたらされ、これにより抗体及びエクソソーム間の特異的結合が示された(図26)。ネイティブまたはPTGFRN過剰発現エクソソームに対する抗体結合の程度を比較するために、各種の1.1E11エクソソームを、抗CD315抗体の存在下でインキュベートし、BLIにより測定した。図27に示すように、PTGFRN過剰発現エクソソームは、ネイティブエクソソームよりも遥かに大きい偏向を引き起こし、このことは、PTGFRNのレベルの増加がより高い結合をもたらし、それゆえPTGFRN結合をエクソソーム精製に使用できることを示す。
ビオチン化PTGFRNを、Octet(登録商標)RED96(Pall)のストレプトアビジンプローブに結合させ、PBS+0.1%Tween20中で、漸増濃度の、PTGFRN(MABT883,Millipore Sigma)の別名であるCD315に対するモノクローナルラット抗体とインキュベートした。用量依存性結合が検出され、抗体によるPTGFRNの特異的認識が示された(図24)。抗CD315抗体がエクソソームに結合できたか否かを決定するため、抗CD315抗体を、プロテインLプローブに結合させ、漸増量のOptiprep(商標)精製HEK293エクソソームとインキュベートした(図25)。図25に示すように、精製エクソソームとのインキュベーション後の用量依存性の偏向は、抗CD315抗体がエクソソーム表面上の内因性PTGFRNを認識できることを示す。同様の実験を、PTGFRN過剰発現エクソソーム(PTGFRN++エクソソーム)を生成するように完全長PTGFRNで安定的にトランスフェクトされたHEK293細胞を用いて行った。過剰発現エクソソームを、固定化抗CD315抗体とインキュベートし、用量依存性偏向がもたらされ、これにより抗体及びエクソソーム間の特異的結合が示された(図26)。ネイティブまたはPTGFRN過剰発現エクソソームに対する抗体結合の程度を比較するために、各種の1.1E11エクソソームを、抗CD315抗体の存在下でインキュベートし、BLIにより測定した。図27に示すように、PTGFRN過剰発現エクソソームは、ネイティブエクソソームよりも遥かに大きい偏向を引き起こし、このことは、PTGFRNのレベルの増加がより高い結合をもたらし、それゆえPTGFRN結合をエクソソーム精製に使用できることを示す。
実施例8:抗PTGFRN抗体によるドメイン認識
実施例6及び7の結果は、エクソソームが、PTGFRNとの親和性相互作用に基づいて精製され得ることを示す。完全長PTGFRN及び一連の短縮化突然変異体を、上記のExpi293系を使用してモノ-ビオチン化組み換えタンパク質として発現させた(図28、左)。短縮化物をそれぞれ、抗CD315抗体とインキュベートし、結合をBLIにより測定した。完全長PTGFRNのみが抗CD315抗体に結合し、このことは、エピトープが、第一のIgVドメインのタンパク質のN末端にあることを示す。
実施例6及び7の結果は、エクソソームが、PTGFRNとの親和性相互作用に基づいて精製され得ることを示す。完全長PTGFRN及び一連の短縮化突然変異体を、上記のExpi293系を使用してモノ-ビオチン化組み換えタンパク質として発現させた(図28、左)。短縮化物をそれぞれ、抗CD315抗体とインキュベートし、結合をBLIにより測定した。完全長PTGFRNのみが抗CD315抗体に結合し、このことは、エピトープが、第一のIgVドメインのタンパク質のN末端にあることを示す。
ポリクローナル抗体プールを、ウサギに、図28の構築物1に類似するがビオチン化配列を欠くPTGFRNの組み換え完全長エクトドメインを注射することにより生成した。ポリクローナル抗体プールを、終末出血からプロテインAにより精製し、PTGFRN短縮化断片に対する活性に関して検査した。断片をそれぞれ、変性SDS-PAGE mini-PROTEAN(登録商標)TGXステインフリーゲル(Bio-Rad,Inc.)で分析し、正しい長さのタンパク質の発現を確認した(図29A)。次いで、ウェスタンブロッティングを、試料に、プールしたポリクローナルウサギ抗体を使用して行い、正しいサイズのバンドを対照ネイティブエクソソームと同じく各レーンにおいて検出し、ポリクローナルPTGFRN抗体との特異的反応を確認した(図29B)。この結果を確認するために、ビオチン化PTGFRN断片をそれぞれ、BLIにより分析し、結果を図30に提供する。ポリクローナル抗体プールとのインキュベーションは、全ての条件で結合を示し、PTGFRNのIgVドメインのそれぞれに関する抗体との広範な反応性を実証した。
実施例9:多様な細胞株からのエクソソームは、IgVファミリーメンバー及び他の新規表面タンパク質を発現する
起源の異なる組織の細胞株(HEK293SF、腎臓;HT1080、結合組織;K562、骨髄;MDA-MB-231、乳房;Raji、リンパ芽球)を、対数期まで増殖させ、エクソソームを枯渇させた血清を補充した培地に約6日間移した。骨髄由来間葉系幹細胞(MSC)を3Dマイクロキャリア上で5日間増殖させ、無血清培地に3日間補充した。上清を単離し、エクソソームを、上記のOptiprep(商標)密度-勾配超遠心分離法を使用して精製した。精製エクソソームをそれぞれ、上記のようにLC-MS/MSにより分析し、数種のエクソソーム表面タンパク質のペプチドスペクトルマッチ(PSM)の数を定量化し(PTGFRN、IGSF8、IGSF3、BSG、SLC3A2、ITGB1、CD81、及びCD9)、結果を図31に提供する。テトラスパニンCD81及びCD9は、大半の精製エクソソーム集団において検出可能であったが、いくつかの場合では、他の表面マーカー以下であった(例えば、全ての細胞株においてCD9を、PTGFRN、BSG、及びSLC3A2と比較する)。この知見は、IgVタンパク質ファミリーメンバーを含む、新しく同定された表面マーカーが、異なる組織に由来する数種の無関係な細胞株のエクソソームアフィニティー精製方法を開発するための好適な標的であることを示す。
起源の異なる組織の細胞株(HEK293SF、腎臓;HT1080、結合組織;K562、骨髄;MDA-MB-231、乳房;Raji、リンパ芽球)を、対数期まで増殖させ、エクソソームを枯渇させた血清を補充した培地に約6日間移した。骨髄由来間葉系幹細胞(MSC)を3Dマイクロキャリア上で5日間増殖させ、無血清培地に3日間補充した。上清を単離し、エクソソームを、上記のOptiprep(商標)密度-勾配超遠心分離法を使用して精製した。精製エクソソームをそれぞれ、上記のようにLC-MS/MSにより分析し、数種のエクソソーム表面タンパク質のペプチドスペクトルマッチ(PSM)の数を定量化し(PTGFRN、IGSF8、IGSF3、BSG、SLC3A2、ITGB1、CD81、及びCD9)、結果を図31に提供する。テトラスパニンCD81及びCD9は、大半の精製エクソソーム集団において検出可能であったが、いくつかの場合では、他の表面マーカー以下であった(例えば、全ての細胞株においてCD9を、PTGFRN、BSG、及びSLC3A2と比較する)。この知見は、IgVタンパク質ファミリーメンバーを含む、新しく同定された表面マーカーが、異なる組織に由来する数種の無関係な細胞株のエクソソームアフィニティー精製方法を開発するための好適な標的であることを示す。
実施例10:PTGFRNノックアウト細胞及びエクソソームの生成
PTGFRNノックアウト細胞を生成するために、HEK293SF細胞を、組み換えCas9ならびにPTGFRNのエクソン2及び膜貫通領域を標的とするガイドRNAを用いてトランスフェクトした。ThermoFisherにより生成されたエクソン2を標的とするガイドRNAには、(1)CGTTGGCAGTCCGCCTTAAC、CRISPR926045_CR(配列番号36);(2)CATAGTCACTGACGTTGCAG、CRISPR926054_CR(配列番号37);(3)TTGTGGAGCTTGCAAGCACC、CRISPR926055_CR(配列番号38);及び(4)GTTCTTTATGTGGAGCTCCA、CRISPR926071_CR(配列番号39)が含まれる。ThermoFisherにより生成された膜貫通領域を標的とするガイドRNAには、(1)TATCCCTTGCTGATCGGCGT、TMgRNA5.1.97(配列番号40);(2)GCTGCAGTACCCGATGAGAC、TMgRNA3.7.87(配列番号41)が含まれる。
PTGFRNノックアウト細胞を生成するために、HEK293SF細胞を、組み換えCas9ならびにPTGFRNのエクソン2及び膜貫通領域を標的とするガイドRNAを用いてトランスフェクトした。ThermoFisherにより生成されたエクソン2を標的とするガイドRNAには、(1)CGTTGGCAGTCCGCCTTAAC、CRISPR926045_CR(配列番号36);(2)CATAGTCACTGACGTTGCAG、CRISPR926054_CR(配列番号37);(3)TTGTGGAGCTTGCAAGCACC、CRISPR926055_CR(配列番号38);及び(4)GTTCTTTATGTGGAGCTCCA、CRISPR926071_CR(配列番号39)が含まれる。ThermoFisherにより生成された膜貫通領域を標的とするガイドRNAには、(1)TATCCCTTGCTGATCGGCGT、TMgRNA5.1.97(配列番号40);(2)GCTGCAGTACCCGATGAGAC、TMgRNA3.7.87(配列番号41)が含まれる。
PTGFRNのエクソン2及び膜貫通領域の標的とする遺伝子の編集及び欠失を、PCR及び配列決定により確認した。5つのクローンPTGFRNノックアウト(PTGFRN KO)細胞株からのエクソソームを、上記のように精製し、PAGE及びウェスタンブロッティングにより実施例8に記載のポリクローナルウサギ抗体プールを使用して分析した。図32Bに示すように、PTGFRNに対応するバンドは、5つのノックアウトクローンのいずれにおいても検出されなかった。このことは、産生細胞及び精製エクソソームにおけるPTGFRNの標的欠失を実証する。重要なことに、エクソソーム産生収率及び全体のタンパク質バンドパターン(図32A)は、PTGFRN欠失の影響を受けず、PTGFRN KOエクソソームを実験目的に使用できることが示される。
PTGFRN欠失が精製エクソソームのプロテオミクスプロファイルを変化させるか否かを決定するために、ネイティブエクソソーム及びPTGFRN KOエクソソームを、比較質量分析により分析した。図33に示すように、ネイティブ及びPTGFRN KOエクソソームのタンパク質内容物は、PTGFRN KOエクソソームにおいて検出できなかったPTGFRNのみを除いて、非常に類似していた。エクソソームマーカーアリックス、CD81、TSG101、及びCD9は、群間で有意な差はなかった。これらのデータは、エクソソームのプロテオミクスプロファイルを変化させることなく、PTGFRNをエクソソームから除去できることを示す。
PTGFRN欠失が、PTGFRNの完全な機能性除去をもたらすことを検証し、実施例7に記載の抗PTGFRN(抗CD315)抗体がPTGFRNに特異的であることを実証するため、BLIを使用するエクソソーム結合実験を、ネイティブエクソソーム、PTGFRN過剰発現エクソソーム(PTGFRN++)及びPTGFRN KOエクソソームを用いて実行した。図27及び実施例7に記載の実験結果と同様、PTGFRN++エクソソームは、固定化抗CD315抗体に、ネイティブエクソソームよりも大きな親和性で結合した(図34)。対照的に、同数のPTGFRN KOエクソソームは、固定化抗体に結合できず(図34)、PTGFRN欠失が、PTGFRN KOエクソソームと抗PTGFRN親和性試薬との相互作用を除くことを実証する。
実施例11:エクソソームを、PTGFRNを認識する親和性試薬を用いて精製することができる
PTGFRNに対するカスタムモノクローナル抗体を、実施例8に記載のように免疫化したウサギから生成した。エクソソームを、PTGFRNを引き抜くことにより単離できるか否かを決定するために、5×1010個のネイティブまたはPTGFRN KOエクソソームを、磁気プロテインAビーズ(カタログ番号10001D;Invitrogen)または10μgのカスタム抗PTGFRNモノクローナル抗体を用いて機能化されたプロテインAビーズのいずれかに加えた。各エクソソーム-ビーズ混合物を、30分間室温にてインキュベートし、PBS+0.1%v/v TWEEN(登録商標)20を用いて3回洗浄した。洗浄したビーズを、溶出バッファー(20mMグリシンpH3.6、2×Laemmliサンプルバッファー(カタログ番号1610737,Bio-Rad,Inc.)、10%β-メルカプトエタノール)中、95℃にて10分間インキュベートすることにより溶出し、煮沸した上清を、PAGE及び抗PTGFRNウェスタンブロッティングにより、異なるカスタム抗PTGFRNモノクローナル抗体を使用して分析した。PAGEにより分析した総タンパク質は、PTGFRNの分子量に対応するバンドをネイティブエクソソーム条件においてのみ抗PTGFRN抗体の存在下で示した(図35A)。このバンドは、PTGFRNとして、ウェスタンブロッティングにより確認された(図35B)。抗PTGFRN抗体の、それぞれ重鎖及び軽鎖に対応するHC及びLCを精製に使用した。これらのデータは、PTGFRN含有エクソソームを、エクソソーム表面上のPTGFRNを引き抜くことにより、溶液から精製することができることを実証する。
PTGFRNに対するカスタムモノクローナル抗体を、実施例8に記載のように免疫化したウサギから生成した。エクソソームを、PTGFRNを引き抜くことにより単離できるか否かを決定するために、5×1010個のネイティブまたはPTGFRN KOエクソソームを、磁気プロテインAビーズ(カタログ番号10001D;Invitrogen)または10μgのカスタム抗PTGFRNモノクローナル抗体を用いて機能化されたプロテインAビーズのいずれかに加えた。各エクソソーム-ビーズ混合物を、30分間室温にてインキュベートし、PBS+0.1%v/v TWEEN(登録商標)20を用いて3回洗浄した。洗浄したビーズを、溶出バッファー(20mMグリシンpH3.6、2×Laemmliサンプルバッファー(カタログ番号1610737,Bio-Rad,Inc.)、10%β-メルカプトエタノール)中、95℃にて10分間インキュベートすることにより溶出し、煮沸した上清を、PAGE及び抗PTGFRNウェスタンブロッティングにより、異なるカスタム抗PTGFRNモノクローナル抗体を使用して分析した。PAGEにより分析した総タンパク質は、PTGFRNの分子量に対応するバンドをネイティブエクソソーム条件においてのみ抗PTGFRN抗体の存在下で示した(図35A)。このバンドは、PTGFRNとして、ウェスタンブロッティングにより確認された(図35B)。抗PTGFRN抗体の、それぞれ重鎖及び軽鎖に対応するHC及びLCを精製に使用した。これらのデータは、PTGFRN含有エクソソームを、エクソソーム表面上のPTGFRNを引き抜くことにより、溶液から精製することができることを実証する。
実施例12:多様な異種タンパク質を、PTGFRNに融合させて、エクソソーム上での過剰発現を促進することができる
図11、13、14及び15に提供する実験データは、数種のタンパク質が、PTGFRNを過剰発現足場として使用することにより劇的に過剰発現できることを実証する。PTGFRNを使用する過剰発現は、他のエクソソーム過剰発現足場を使用する発現よりも有意に優れていた。PTGFRNに融合することで過剰発現に成功することができるタンパク質の幅を決定するために、数種の操作エクソソームを生成した。第VIII因子(FVIII)は、凝固カスケードに関与する大きな酵素である。Bドメインを欠くFVIIIの断片(BDDFVIII)をPTGFRNのN末端(外側に面する側)に融合させ、HEK293SF細胞において発現させた。精製エクソソームを、PAGE(図36A)及びウェスタンブロット(図36B)により分析した。細胞培養において完全長FVIIIのプロセシングによって生成したFVIIIの軽鎖は、FVIIIに対する抗体(図36B;カタログ番号GMA-8025、Green Mountain Antibodies)を使用して、操作エクソソームにおいては容易に検出されたが、ネイティブエクソソームでは検出されなかった。完全長FVIIIは、165kDaの分子量を有し、これはPTGFRNの分子量(約120kDa)より有意に大きく、酵素を含む非常に大きなタンパク質が、エクソソームの表面上でPTGFRN融合体として発現に成功できることを実証する。
図11、13、14及び15に提供する実験データは、数種のタンパク質が、PTGFRNを過剰発現足場として使用することにより劇的に過剰発現できることを実証する。PTGFRNを使用する過剰発現は、他のエクソソーム過剰発現足場を使用する発現よりも有意に優れていた。PTGFRNに融合することで過剰発現に成功することができるタンパク質の幅を決定するために、数種の操作エクソソームを生成した。第VIII因子(FVIII)は、凝固カスケードに関与する大きな酵素である。Bドメインを欠くFVIIIの断片(BDDFVIII)をPTGFRNのN末端(外側に面する側)に融合させ、HEK293SF細胞において発現させた。精製エクソソームを、PAGE(図36A)及びウェスタンブロット(図36B)により分析した。細胞培養において完全長FVIIIのプロセシングによって生成したFVIIIの軽鎖は、FVIIIに対する抗体(図36B;カタログ番号GMA-8025、Green Mountain Antibodies)を使用して、操作エクソソームにおいては容易に検出されたが、ネイティブエクソソームでは検出されなかった。完全長FVIIIは、165kDaの分子量を有し、これはPTGFRNの分子量(約120kDa)より有意に大きく、酵素を含む非常に大きなタンパク質が、エクソソームの表面上でPTGFRN融合体として発現に成功できることを実証する。
上記のPTGFRN融合パートナーは、全て規則正しい三次元構造を有するタンパク質である。XTEN(登録商標)ペプチド(Amunix;Mountain View,CA)は、長く、不規則な反復配列を有し、その一次配列と比較して劇的に増加した見かけの分子質量を有する。XTEN(8%Ala、12%Glu、18%Gly、17%Pro、28%Ser及び17%Thrを含むランダム化された288個のアミノ酸を含むタンパク質)、PTGFRNの断片(配列番号33)及びGFPをコードする融合構築物を、HEK293SF細胞において安定的に発現させた。精製エクソソームを単離し、PAGE(図37A)及びウェスタンブロッティング(図37B)により分析した。図37Bに示すように、融合タンパク質のC末端GFPは、ウェスタンブロッティングにより検出され、精製エクソソーム上の融合タンパク質のインフレーム翻訳を実証する。これらの結果は、構造不定のタンパク質もPTGFRNとの融合体として安定して発現できることを実証する。さらには、これらの結果は、異種タンパク質がPTGFRNのN末端及びC末端と同時に融合することができ、それぞれエクソソーム表面及び内腔にインタクトなタンパク質を表示することを示す。ゆえに、PTGFRNは、N末端またはC末端の一方または両方上の様々な構築物及びクラスの数個のアミノ酸(例えば、FLAGタグ)から150kDa(BDDFVIII)超の範囲のサイズのタンパク質融合体に適した強力な足場である。
実施例13:PTGFRN配列は、他のエクソソーム過剰発現系よりもエクソソーム上での異種タンパク質の発現に優れている
実施例3及び図15のデータは、PTGFRNが、エクソソームのバルク集団における異種タンパク質の発現において他のエクソソーム足場よりも優れていることを実証する。これらの結果は、しかしながら、エクソソームのサブセットでの発現の増加と、精製された集団の全てのエクソソームにわたって均一に増加した発現を区別することができない。均一なエクソソーム治療薬を開発する目的のためには、高度に過剰発現するエクソソーム及び改変されていないエクソソームを含む不均一なエクソソーム集団よりも、発現が均一に増加した同種エクソソーム集団を有する方が、好ましい。この問題に取り組むために、本発明者らは、Flow NanoAnalyzer(NanoFCM,Inc.;Xiamen,China)を使用してナノフローサイトメトリーにより粒子毎にエクソソーム集団における個々のエクソソームを特徴決定した。Flow NanoAnalyzerは、直径10nmという小さな個々のナノ粒子の光散乱及び蛍光発光を測定することができる。ネイティブエクソソーム及びCD9、CD81、またはPTGFRNへの内腔GFP融合をコードする改変エクソソームを、安定的にトランスフェクトされたHEK293SF細胞から単離し、上記のようにOptiprep(登録商標)密度勾配超遠心分離により精製した。励起488/発光509に設定したFlow NanoAnalyzerによる分析は、粒子毎の分析においてGFP発現に関して、CD9-GFPエクソソームが約48%陽性、CD81-GFPエクソソームが約80%陽性、及びPTGFRN-GFPエクソソームが約97%陽性であったことを実証した(図38、左)。さらに、平均蛍光強度(MFI)も同様の傾向をたどり、PTGFRN-GFPエクソソームは、CD81-GFPエクソソームよりも全体的に約2倍明るかった(図38、右)。これらのデータは、PTGFRN-GFP融合タンパク質を発現するように改変されたエクソソームが、融合タンパク質を高度に発現する同種のエクソソーム集団であり、全体の発現レベルが、ネイティブまたは他のエクソソーム足場に融合したGFPを発現する他の改変エクソソームよりも遥かに高かったことを実証する。
実施例3及び図15のデータは、PTGFRNが、エクソソームのバルク集団における異種タンパク質の発現において他のエクソソーム足場よりも優れていることを実証する。これらの結果は、しかしながら、エクソソームのサブセットでの発現の増加と、精製された集団の全てのエクソソームにわたって均一に増加した発現を区別することができない。均一なエクソソーム治療薬を開発する目的のためには、高度に過剰発現するエクソソーム及び改変されていないエクソソームを含む不均一なエクソソーム集団よりも、発現が均一に増加した同種エクソソーム集団を有する方が、好ましい。この問題に取り組むために、本発明者らは、Flow NanoAnalyzer(NanoFCM,Inc.;Xiamen,China)を使用してナノフローサイトメトリーにより粒子毎にエクソソーム集団における個々のエクソソームを特徴決定した。Flow NanoAnalyzerは、直径10nmという小さな個々のナノ粒子の光散乱及び蛍光発光を測定することができる。ネイティブエクソソーム及びCD9、CD81、またはPTGFRNへの内腔GFP融合をコードする改変エクソソームを、安定的にトランスフェクトされたHEK293SF細胞から単離し、上記のようにOptiprep(登録商標)密度勾配超遠心分離により精製した。励起488/発光509に設定したFlow NanoAnalyzerによる分析は、粒子毎の分析においてGFP発現に関して、CD9-GFPエクソソームが約48%陽性、CD81-GFPエクソソームが約80%陽性、及びPTGFRN-GFPエクソソームが約97%陽性であったことを実証した(図38、左)。さらに、平均蛍光強度(MFI)も同様の傾向をたどり、PTGFRN-GFPエクソソームは、CD81-GFPエクソソームよりも全体的に約2倍明るかった(図38、右)。これらのデータは、PTGFRN-GFP融合タンパク質を発現するように改変されたエクソソームが、融合タンパク質を高度に発現する同種のエクソソーム集団であり、全体の発現レベルが、ネイティブまたは他のエクソソーム足場に融合したGFPを発現する他の改変エクソソームよりも遥かに高かったことを実証する。
PTGFRNのN末端は、予測されるシグナルペプチド配列(アミノ酸1~21;配列番号8)からなる。この配列が、精製エクソソーム上で導入遺伝子の発現を亢進できるか否かを決定するために、PTGFRNシグナルペプチドを、異種タンパク質DsbA11のシグナルペプチドと比較した。HEK293SF細胞を、(i)GFPに融合した完全長野生型PTGFRN;(ii)GFPに融合した内因性PTGFRNシグナルペプチドを含有するPTGFRNの短い断片(454-PTGFRN;配列番号33);または(iii)GFPに融合した、内因性PTGFRNシグナルペプチドを細菌遺伝子DsbA11からのシグナルペプチド(Koerber et al.,Journal of molecular biology,427.2(2015):576-586)で置換したPTGFRNの短い断片(454-PTGFRN;配列番号33)をコードする発現構築物で安定的にトランスフェクトした。図39に示すように、内因性PTGFRNシグナルペプチドを含有する完全長または短縮PTGFRN-GFPを含有するGFP融合タンパク質を発現する細胞は、GFPを含むエクソソームを同様に高いレベルにて産生した。DsbA11シグナルペプチドを伴う短縮PTGFRNを含有するGFP融合タンパク質を発現する細胞は、しかしながら、遥かに低いレベルにてGFPを発現するエクソソームを産生した。これらの結果は、PTGFRNシグナルペプチドが、操作エクソソームの高密度装飾を促進することを実証する。
実施例14:抗体断片は、PTGFRNを足場として使用して、エクソソーム表面上で、機能的に発現することができる
上記の実験データは、PTGFRNが、多くのクラスのタンパク質の過剰発現に適した強力な足場であることを実証する。抗体及び抗体の抗原結合断片は、多くの疾患の多くの処置において多様な用途を有する治療ペプチドの重要なクラスである。機能性抗原結合断片が、PTGFRNを足場として使用して、エクソソーム上で発現することができるか否かを決定するために、HEK29SF細胞を安定的にトランスフェクトして、レクチンCLEC9A(クローン10B4、Millipore Sigma、カタログ番号04-148;及びCaminschi et al.,Blood,112:8(2008)に記載)、完全長PTGFRN、GFP、及びFLAGタグを認識する一本鎖Fabからなる融合タンパク質を過剰発現させた(図40A)。Optiprep(商標)精製エクソソームを、ステインフリータンパク質ゲル上で泳動させ、FLAGタグに対する抗体を用いてブロットし、これは完全長融合タンパク質の有意な過剰発現を示す(図40B)。
上記の実験データは、PTGFRNが、多くのクラスのタンパク質の過剰発現に適した強力な足場であることを実証する。抗体及び抗体の抗原結合断片は、多くの疾患の多くの処置において多様な用途を有する治療ペプチドの重要なクラスである。機能性抗原結合断片が、PTGFRNを足場として使用して、エクソソーム上で発現することができるか否かを決定するために、HEK29SF細胞を安定的にトランスフェクトして、レクチンCLEC9A(クローン10B4、Millipore Sigma、カタログ番号04-148;及びCaminschi et al.,Blood,112:8(2008)に記載)、完全長PTGFRN、GFP、及びFLAGタグを認識する一本鎖Fabからなる融合タンパク質を過剰発現させた(図40A)。Optiprep(商標)精製エクソソームを、ステインフリータンパク質ゲル上で泳動させ、FLAGタグに対する抗体を用いてブロットし、これは完全長融合タンパク質の有意な過剰発現を示す(図40B)。
精製された抗CLEC9Aエクソソームを、BLIにより、固定化CLEC9A-Fc(R&D Systems、カタログ番号6049-CL-050;及びUto et al.,Nature Communications 7:11273(2016)に記載)に対する結合に関して検査した。CLEC9A-Fcを、プロテインAプローブにPBS+0.1%(v/v)Tween20中0.5μg/mlの最終濃度にて結合させ、1×1011個の改変されていないエクソソームまたは図40Aに示すレクチンCLEC9A、完全長PTGFRN、GFP、及びFLAGタグを認識する一本鎖Fab(「αCLEC9A-PTGFRN」)からなる融合タンパク質を発現するように改変されたエクソソームとインキュベートした。図41に示すように、抗CLEC9A-PTGFRNエクソソームのみがCLEC9A-Fcプローブに結合し、細胞表面マーカー及び抗原結合断片を過剰発現するように操作されたエクソソーム間の機能性認識を実証した。
実施例15:間葉系幹細胞は、PTGFRNを発現する
いくつかの細胞型からの治療用エクソソームは、研究及び臨床目的のために使用されている。神経前駆幹細胞及び間葉系幹細胞を含む数種類の幹細胞には、治療効果があることが示されているが、これらの細胞を使用する大半の試験は、天然の、改変されていないエクソソームに依存する。それゆえ、特定のリガンドまたは他の標的タンパク質を過剰発現するようにこれらの細胞株を操作することが望ましいだろう。骨髄由来の間葉系幹細胞を、1.1Lマイクロキャリアベースの3Dバイオリアクターシステムにおいて増殖させた。5日間の細胞増殖後、増殖培地を廃棄し、細胞を、無血清培地にてさらに3日間培養した。無血清培地を、100μmフィルターを通してろ過して、マイクロキャリアを除去し、低速で遠心分離して、細胞デブリ及び夾雑物を除去した。清澄化した培地を、次いで、実施例1に記載のようにOptiprep(商標)密度-勾配超遠心分離により精製した。HEK293SF細胞及びMSCからの精製エクソソームを、PTGFRN、及び確立されたエクソソームタンパク質アリックス、TSG101、CD63、CD9、及びCD81についてウェスタンブロッティングにより分析した。図42に示すように、これらのタンパク質は全て、HEK293SF細胞及びMSCの両方において発現し、このことは、エクソソームタンパク質、例えば、PTGFRNを、表面操作MSCエクソソームを生成するための足場として使用することができることを示す。
いくつかの細胞型からの治療用エクソソームは、研究及び臨床目的のために使用されている。神経前駆幹細胞及び間葉系幹細胞を含む数種類の幹細胞には、治療効果があることが示されているが、これらの細胞を使用する大半の試験は、天然の、改変されていないエクソソームに依存する。それゆえ、特定のリガンドまたは他の標的タンパク質を過剰発現するようにこれらの細胞株を操作することが望ましいだろう。骨髄由来の間葉系幹細胞を、1.1Lマイクロキャリアベースの3Dバイオリアクターシステムにおいて増殖させた。5日間の細胞増殖後、増殖培地を廃棄し、細胞を、無血清培地にてさらに3日間培養した。無血清培地を、100μmフィルターを通してろ過して、マイクロキャリアを除去し、低速で遠心分離して、細胞デブリ及び夾雑物を除去した。清澄化した培地を、次いで、実施例1に記載のようにOptiprep(商標)密度-勾配超遠心分離により精製した。HEK293SF細胞及びMSCからの精製エクソソームを、PTGFRN、及び確立されたエクソソームタンパク質アリックス、TSG101、CD63、CD9、及びCD81についてウェスタンブロッティングにより分析した。図42に示すように、これらのタンパク質は全て、HEK293SF細胞及びMSCの両方において発現し、このことは、エクソソームタンパク質、例えば、PTGFRNを、表面操作MSCエクソソームを生成するための足場として使用することができることを示す。
実施例16:PTGFRNは、非ヒト細胞からのエクソソーム上で過剰発現することができる
実施例9及び15の結果は、多くのヒト由来細胞が、天然にPTGFRN及び実施例1にて同定された他の新規エクソソームタンパク質を発現することを実証する。PTGFRNをユニバーサルなエクソソーム足場タンパク質として使用することができるか否かを決定するために、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を、FLAGタグに融合した完全長PTGFRNを発現するプラスミド(「PTGFRN-FLAGプラスミド」)で安定的にトランスフェクトした。エクソソームを、野生型HEK293SF細胞、PTGFRN-FLAGプラスミドでトランスフェクトしたHEK293SF細胞、CHO細胞、及びPTGFRN-FLAGプラスミドでトランスフェクトしたCHO細胞から、実施例1に記載の方法を使用して、精製した。図43A~Cに示すように、PTGFRN-FLAGを、ステインフリーPAGE(図43A)及びPTGFRN(図43B)及びFLAG(図43C)に対する抗体を用いたウェスタンブロッティングにより検出して、HEK293SF細胞及びCHO細胞の両方において過剰発現させることに成功した。この結果は、非ヒト細胞(例えば、CHO細胞)ならびにヒト細胞(例えば、HEK細胞)が、ヒトPTGFRNを過剰発現するエクソソームを産生できることを実証する。この結果は、PTGFRNが、操作エクソソームを多くの異なる細胞型及び種から生成するための、ユニバーサルな足場タンパク質であることを示す。
実施例9及び15の結果は、多くのヒト由来細胞が、天然にPTGFRN及び実施例1にて同定された他の新規エクソソームタンパク質を発現することを実証する。PTGFRNをユニバーサルなエクソソーム足場タンパク質として使用することができるか否かを決定するために、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を、FLAGタグに融合した完全長PTGFRNを発現するプラスミド(「PTGFRN-FLAGプラスミド」)で安定的にトランスフェクトした。エクソソームを、野生型HEK293SF細胞、PTGFRN-FLAGプラスミドでトランスフェクトしたHEK293SF細胞、CHO細胞、及びPTGFRN-FLAGプラスミドでトランスフェクトしたCHO細胞から、実施例1に記載の方法を使用して、精製した。図43A~Cに示すように、PTGFRN-FLAGを、ステインフリーPAGE(図43A)及びPTGFRN(図43B)及びFLAG(図43C)に対する抗体を用いたウェスタンブロッティングにより検出して、HEK293SF細胞及びCHO細胞の両方において過剰発現させることに成功した。この結果は、非ヒト細胞(例えば、CHO細胞)ならびにヒト細胞(例えば、HEK細胞)が、ヒトPTGFRNを過剰発現するエクソソームを産生できることを実証する。この結果は、PTGFRNが、操作エクソソームを多くの異なる細胞型及び種から生成するための、ユニバーサルな足場タンパク質であることを示す。
実施例17:PTGFRNは、従来のエクソソームタンパク質と比較して改善された内腔カーゴの搭載を提供する
以前の実施例は、PTGFRN過剰発現が、従来のエクソソームタンパク質と比較して、より多くのタンパク質数及び/または活性を有するエクソソームをもたらすことを実証した(例えば、実施例13;図15)。PTGFRNが膜貫通型タンパク質であり、そのN末端を小胞外面に、そのC末端をエクソソーム内腔に有するため、PTGFRNは、エクソソームの内腔にカーゴタンパク質を搭載するのに好適な足場タンパク質であり得る。この可能性を調査するために、HEK293SF細胞を操作して、低分子ラパマイシンを使用してタンパク質-タンパク質相互作用を促進する二分レポーターシステムを安定的に発現させた。CD9(図44A)またはPTGFRN(図44B)のいずれかをGFP、FLAGタグ、及びFKBPに融合させた。細胞を、V5タグ及びFRBに融合したmCherryを安定的に発現するようにも操作した。低分子ラパマイシンの存在下で、タンパク質FRB及びFKBPは二量体化して、安定した複合体を形成する。ラパマイシンの存在下で細胞を培養することは、それゆえ、エクソソーム生合成中のmCherryカーゴタンパク質及びCD9またはPTGFRNのいずれかの間の会合を可能とし得る。これらの細胞から精製されたエクソソームを、洗浄してラパマイシンを除去し、エクソソーム内腔への可溶性カーゴとしてのmCherryの放出が可能となるだろう。(図44A~B)。
以前の実施例は、PTGFRN過剰発現が、従来のエクソソームタンパク質と比較して、より多くのタンパク質数及び/または活性を有するエクソソームをもたらすことを実証した(例えば、実施例13;図15)。PTGFRNが膜貫通型タンパク質であり、そのN末端を小胞外面に、そのC末端をエクソソーム内腔に有するため、PTGFRNは、エクソソームの内腔にカーゴタンパク質を搭載するのに好適な足場タンパク質であり得る。この可能性を調査するために、HEK293SF細胞を操作して、低分子ラパマイシンを使用してタンパク質-タンパク質相互作用を促進する二分レポーターシステムを安定的に発現させた。CD9(図44A)またはPTGFRN(図44B)のいずれかをGFP、FLAGタグ、及びFKBPに融合させた。細胞を、V5タグ及びFRBに融合したmCherryを安定的に発現するようにも操作した。低分子ラパマイシンの存在下で、タンパク質FRB及びFKBPは二量体化して、安定した複合体を形成する。ラパマイシンの存在下で細胞を培養することは、それゆえ、エクソソーム生合成中のmCherryカーゴタンパク質及びCD9またはPTGFRNのいずれかの間の会合を可能とし得る。これらの細胞から精製されたエクソソームを、洗浄してラパマイシンを除去し、エクソソーム内腔への可溶性カーゴとしてのmCherryの放出が可能となるだろう。(図44A~B)。
CD9負荷レポーター細胞を、ラパマイシンの存在下で0、1、または2日間にわたって増殖させた。PTGFRN負荷レポーター細胞を、ラパマイシンの存在下で5日間にわたって増殖させた。エクソソームを、ラパマイシンの不在下で細胞培養物から精製し、エクソソーム内腔におけるカーゴ放出を可能とした。精製されたエクソソーム試料を、変性ポリアクリルアミドゲルで泳動させ、総タンパク質の存在について分析し、足場タンパク質(抗FLAG)またはmCherryカーゴ(抗V5)に対してウェスタンブロットした。PTGFRN試料を、CD9試料と比較して遥かに少ない物質を伴ってポリアクリルアミドゲルに負荷したが、PTGFRNは、FLAGウェスタンブロッティングにより容易に検出可能であった。カーゴmCherryも、PTGFRN及びCD9足場試料間で同等のレベルにて検出された(図45A)。足場及びカーゴタンパク質バンドをデンシトメトリーにより測定し、収集したエクソソームの量に対して正規化したとき、PTGFRN足場は、より高いレベルで発現され、CD9足場タンパク質に含有されたものより遥かに多くのmCherryカーゴを搭載できた(図45B)。これらのデータは、PTGFRNが、従来のエクソソームタンパク質CD9より大きな程度までペプチドを搭載する内腔への融合タンパク質として発現できること、及びPTGFRNの使用が、従来のエクソソームタンパク質と比較して、より多くの指向性カーゴ搭載をもたらすことを示す。これらのデータは、複雑な、複数部分操作システムを、PTGFRN足場の状況において使用することができ、エクソソーム内腔における強いカーゴ搭載をもたらすことを示す。
実施例18:改変エクソソームタンパク質の生成
改変エクソソームタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、全エクソソームタンパク質または短縮エクソソームタンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して生成する。特定の短縮エクソソームタンパク質を、様々な短縮エクソソームタンパク質をスクリーニングし、エクソソーム膜に組み込み、結合剤と相互作用する最適な能力を有する短縮タンパク質を選択することにより、選択する。エクソソーム膜への短縮タンパク質の標的化は、ナノフローサイトメトリーにより検査する。
改変エクソソームタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、全エクソソームタンパク質または短縮エクソソームタンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して生成する。特定の短縮エクソソームタンパク質を、様々な短縮エクソソームタンパク質をスクリーニングし、エクソソーム膜に組み込み、結合剤と相互作用する最適な能力を有する短縮タンパク質を選択することにより、選択する。エクソソーム膜への短縮タンパク質の標的化は、ナノフローサイトメトリーにより検査する。
改変エクソソームタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、親和性タグ(グルタチオン-S-転移酵素、S-ペプチド、FLAGタグ、GFP、等)をコードするポリヌクレオチドを、全または短縮エクソソームタンパク質(例えば、PTGFRN、BSG、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、及びATP輸送体)をコードするポリヌクレオチドに加えることにより生成される。改変されたポリヌクレオチドは、融合タンパク質を発現する。ポリヌクレオチドを、さらに改変して、エクソソーム膜へのそれらの標的化及び/または結合剤に対するそれらの親和性を改善する。
改変エクソソームタンパク質をコードする異なるタイプのポリヌクレオチドは、治療ペプチド(例えば、抗体、酵素、リガンド、受容体、抗微生物ペプチド、変異体またはその断片)をコードするポリヌクレオチドを、全または短縮エクソソームタンパク質(例えば、PTGFRN、BSG、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、及びATP輸送体)をコードするポリヌクレオチドに加えることにより生成される。改変されたポリヌクレオチドは、エクソソームの表面上に提示される融合タンパク質を発現する。融合タンパク質は、治療ペプチドの治療活性を維持する。
改変エクソソームタンパク質をコードする異なるタイプのポリヌクレオチドは、標的化部分(例えば、特定の器官、組織または細胞に特異的な標的化部分)をコードするポリヌクレオチドを、全または短縮エクソソームタンパク質(例えば、PTGFRN、BSG、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、及びATP輸送体)をコードするポリヌクレオチドに加えることにより生成される。改変されたポリヌクレオチドは、エクソソームの表面上に提示される融合タンパク質を発現する。融合タンパク質により、エクソソームは、特定の器官、組織または細胞を標的とすることができる。
エクソソーム表面上の改変エクソソームタンパク質の局在化も、ナノフローサイトメトリーにより検査される。
実施例19:表面操作エクソソームの生成
表面操作エクソソームを生成する産生細胞は、エクソソームタンパク質またはエクソソームタンパク質の変異体もしくは断片をコードする外因性配列を導入することにより作成される。エクソソームタンパク質をコードするプラスミドを、一過的にトランスフェクトして、エクソソーム表面上でエクソソームタンパク質の高レベル発現を誘導する。改変エクソソームタンパク質をコードするプラスミドを、一過的にトランスフェクトして、改変エクソソームタンパク質を表面上に有するエクソソームを産生する。
表面操作エクソソームを生成する産生細胞は、エクソソームタンパク質またはエクソソームタンパク質の変異体もしくは断片をコードする外因性配列を導入することにより作成される。エクソソームタンパク質をコードするプラスミドを、一過的にトランスフェクトして、エクソソーム表面上でエクソソームタンパク質の高レベル発現を誘導する。改変エクソソームタンパク質をコードするプラスミドを、一過的にトランスフェクトして、改変エクソソームタンパク質を表面上に有するエクソソームを産生する。
エクソソームタンパク質、エクソソームタンパク質の変異体もしくは断片をコードするポリヌクレオチド、または親和性タグ、治療ペプチドもしくは標的化部分をコードする外因性配列を、産生細胞へと安定的に形質転換して、表面操作エクソソームを産生する。親和性タグ、治療ペプチドまたは標的化部分をコードする外因性配列を、エクソソームタンパク質をコードするゲノム部位へと挿入して、エクソソームタンパク質に付着した親和性タグを含む融合タンパク質を生成する。改変エクソソームタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、エクソソームタンパク質をコードするゲノム部位にノックインする。
産生細胞株は、それぞれエクソソームタンパク質、エクソソームタンパク質の変異体もしくは断片をコードする、少なくとも2つのポリヌクレオチドまたは外因性ペプチド(例えば、親和性タグ、標的化部分、治療ペプチド)を安定的にトランスフェクトすることにより生成される。異なる産生細胞株はまた、2つ以上の外因性配列(例えば、親和性タグ、マーカー、標的化ペプチド、治療ペプチド等をコードする外因性配列)を、エクソソームタンパク質をコードするゲノム配列内またはそれに近接する複数のゲノム部位へと挿入することによって生成して、複数の改変エクソソームタンパク質を含む表面操作エクソソームを生成する。複数の改変エクソソームタンパク質はそれぞれ、エクソソームの表面を標的とする。エクソソームは、2つの異なる結合剤に対して親和性を有し、いずれかまたは両方の結合剤により精製される。
実施例20:アフィニティー精製によるエクソソームの単離、精製及び亜分画
エクソソームのアフィニティー精製のための結合剤を、穏和な条件下で溶出するバイオパニング/定向進化により開発した。
エクソソームのアフィニティー精製のための結合剤を、穏和な条件下で溶出するバイオパニング/定向進化により開発した。
結合剤を、固体支持体(例えば、多孔質アガロースビーズ)に付着させ、従来のクロマトグラフィー系(例えば、GE AKTA)を形成した。エクソソームを含有する試料を、アフィニティー精製のためにそのカラムに接触させる。
参照による組み込み
本出願において引用される、全ての出版物、特許、特許出願及び他の文書は、それぞれ個々の出版物、特許、特許出願または他の文書が、あらゆる目的のために参照により組み込まれると個別に示されるのと同程度に、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願において引用される、全ての出版物、特許、特許出願及び他の文書は、それぞれ個々の出版物、特許、特許出願または他の文書が、あらゆる目的のために参照により組み込まれると個別に示されるのと同程度に、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
等価物
本開示は、とりわけ、カンナビノイドの組成物及び取り巻き組成物を提供する。本開示はまた、カンナビノイド及び取り巻き組成物を投与することにより神経変性疾患を処置する方法を提供する。様々な特定の実施形態を例示し説明してきたが、上記の明細書は制限的ではない。本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができることが理解されるだろう。本明細書を参照すると、多くの変形が当業者に明らかになるであろう。
本開示は、とりわけ、カンナビノイドの組成物及び取り巻き組成物を提供する。本開示はまた、カンナビノイド及び取り巻き組成物を投与することにより神経変性疾患を処置する方法を提供する。様々な特定の実施形態を例示し説明してきたが、上記の明細書は制限的ではない。本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができることが理解されるだろう。本明細書を参照すると、多くの変形が当業者に明らかになるであろう。
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