JP2022543851A

JP2022543851A - 治療用細胞外小胞

Info

Publication number: JP2022543851A
Application number: JP2022507658A
Authority: JP
Inventors: ジェイムズリー，エル; シ，ジュンフォン; ヤオ，ジャオガン
Original assignee: オハイオ・ステイト・イノベーション・ファウンデーション
Priority date: 2019-08-06
Filing date: 2020-08-06
Publication date: 2022-10-14
Also published as: WO2021026353A3; US20210093567A1; WO2021026353A2; EP4009989A4; EP4009989A2; CN116171163A

Abstract

本明細書では、治療用細胞外小胞組成物、ならびに治療用細胞外小胞を産生する方法及びシステムが記載される。また、本明細書では、治療用細胞外小胞を用いて疾患を治療する方法も記載される。【選択図】なし

Description

相互参照
本出願は、２０１９年８月６日に出願された米国仮出願第６２／８８３，３１９号及び２０１９年１２月１２日に出願された米国仮出願第６２／９４７，２２８号の利益を主張するものであり、それによって、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

参照による組み込み
本明細書で言及される全ての公開物、特許、及び特許出願は、あたかも個々の公開物、特許、または特許出願のそれぞれが、参照により組み込まれるように、明確に、かつ個々に示されているかのごとく、同等の程度までそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

細胞外小胞は、多種多様な細胞型によって分泌される。一般に、エクソソーム、マイクロベシクル、及びアポトーシス小体等の細胞外小胞は、膜結合性であり、治療用カーゴを積載し得る。エクソソームは、大多数の真核細胞から分泌される、細胞外小胞の１つのタイプである。エクソソームの生合成は、エンドソームの陥入部がつまみ離されて多胞体になり、腔内膜小胞が形成される際に始まる可能性がある。多胞体が細胞の原形質膜と融合する場合、腔内膜小胞はエクソソームとして放出されることがある。マイクロベシクルは、細胞表面の膜から外に向かって出芽する、細胞外小胞の別のタイプである。一方、アポトーシス小体は、死細胞片から形成される細胞外小胞である。エクソソーム、マイクロベシクル、及びアポトーシス小体は、ｉｎｖｉｖｏまたは細胞培養液内等のｉｎｖｉｔｒｏで放出され得る。

治療用遺伝物質の送達は、疾患を治療するのに有用であり得る。細胞外小胞は、治療用核酸のキャリアとして検討されてきた。しかし、細胞外小胞を産生し、細胞外小胞内に治療用核酸をカプセル化する現行の方法の大多数には、いくつかの欠点がある。まず、治療用核酸を組み込んでいる細胞外小胞の産生量が一般的に低く、このことは多くの場合、産生される細胞外小胞の数が少ないか、または細胞外小胞にカプセル化される治療用核酸のコピーの数が少ないことによる。例えば、あるトランスフェクション方式を利用した場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は一般的に、細胞外小胞によって有効にカプセル化されるには大きすぎる。現在利用可能な方法から生じる他の問題点としては、細胞外小胞によってカプセル化された核酸の断片化及び分解が挙げられる。最後に、循環における細胞外小胞の大部分は、肝臓、脾臓、及び腎臓に集積し、代謝されるため、細胞外小胞をｉｎｖｉｖｏ標的に指向させるという課題が残っている。

したがって、十分な量の治療用核酸を、標的とする細胞、組織または器官に、有効に送達することができる細胞外小胞、を含む医薬組成物が必要とされている。また、十分な量の高品質の治療用核酸を標的に送達して対象の疾患を治療するために、細胞外小胞を含む医薬組成物を産生する方法及びシステムも必要とされている。

本明細書では、いくつかの態様において、細胞外小胞を産生する方法が記載されており、前記方法は、少なくとも１つのポリヌクレオチドを細胞外小胞ドナー細胞にナノエレクトロポレーションすることであって、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドは、（ｉ）膜貫通ドメイン及び細胞外ドメインを含むアダプターポリペプチド、ならびに（ｉｉ）前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインに共有結合にて連結される異種ターゲティングドメインを含む、ターゲティングポリペプチドをコードする、前記ナノエレクトロポレーションすることと、（ｉ）前記ターゲティングポリペプチドが、前記細胞外小胞ドナー細胞内で発現され、かつ（ｉｉ）前記ターゲティングポリペプチドが、前記細胞外小胞ドナー細胞から放出される細胞外小胞内に組み込まれるような条件下で、前記細胞外小胞ドナー細胞をインキュベーションすることと、前記細胞外小胞ドナー細胞から放出される前記少なくとも１つの細胞外小胞を収集することであって、前記少なくとも１つの細胞外小胞は前記ターゲティングポリペプチドを含む、前記細胞外小胞を収集することと、を含む。いくつかの実施形態では、前記異種ターゲティングドメインは、前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインのＮ末端に共有結合にて連結される。いくつかの実施形態では、前記異種ターゲティングドメインは、前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインのＣ末端に共有結合にて連結される。いくつかの実施形態では、前記アダプターポリペプチドの前記膜貫通ドメインは、ＣＤ４７ポリペプチドの膜貫通ドメインと少なくとも７０％同一であるか、または前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインは、ＣＤ４７ポリペプチドの細胞外ドメインと少なくとも７０％同一である。いくつかの実施形態では、前記アダプターポリペプチドの前記膜貫通ドメインは、ＣＤ４７ポリペプチドの膜貫通ドメインと少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるか、または前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインは、ＣＤ４７ポリペプチドの細胞外ドメインと少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一である。いくつかの実施形態では、前記アダプターポリペプチドは、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ４７、ＣＤ３１５、ヘテロ三量体Ｇタンパク質、ＭＨＣクラスＩ、インテグリン、トランスフェリン受容体（ＴＦＲ２）、ＬＡＭＰ１／２、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＡＤＡＭ１０、ＧＰＩアンカー型５’ヌクレオチダーゼ、ＣＤ７３、補体－結合タンパク質ＣＤ５５及びＣＤ５９、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ＴＳＰＡＮ８、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ９、ＰＥＣＡＭ１、ＥＲＢＢ２、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ９０、ＣＤ４５、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、グリコフォリンＡ、ＣＤ１４、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３、アセチルコリンエステラーゼ／ＡＣｈＥ－Ｓ、ＡＣｈＥ－Ｅ、アミロイドベータＡ４／ＡＰＰ、ＰＴＧＦＲＮ、ならびに多剤耐性関連タンパク質からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記アダプターポリペプチドは、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ４７、ＣＤ３１５、ヘテロ三量体Ｇタンパク質、ＭＨＣクラスＩ、インテグリン、トランスフェリン受容体（ＴＦＲ２）、ＬＡＭＰ１／２、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＡＤＡＭ１０、ＧＰＩアンカー型５’ヌクレオチダーゼ、ＣＤ７３、補体－結合タンパク質ＣＤ５５及びＣＤ５９、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ＴＳＰＡＮ８、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ９、ＰＥＣＡＭ１、ＥＲＢＢ２、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ９０、ＣＤ４５、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、グリコフォリンＡ、ＣＤ１４、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３、アセチルコリンエステラーゼ／ＡＣｈＥ－Ｓ、ＡＣｈＥ－Ｅ、アミロイドベータＡ４／ＡＰＰ、ＰＴＧＦＲＮ、ならびに多剤耐性関連タンパク質からなる群から選択されるポリペプチドと、少なくとも７０％同一である。いくつかの実施形態では、前記アダプターポリペプチドは、ＣＤ４７と少なくとも７０％同一である。いくつかの実施形態では、前記アダプターポリペプチドは、ＣＤ４７と少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一である。いくつかの実施形態では、前記異種ターゲティングドメインは、腫瘍ターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記腫瘍ターゲティングドメインは、ＣＤＸペプチドである。いくつかの実施形態では、前記腫瘍ターゲティングドメインは、ＣＲＥＫＡペプチドである。いくつかの実施形態では、前記方法は、ポリヌクレオチドを前記細胞外小胞ドナー細胞内にナノエレクトロポレーションすることであって、前記ポリヌクレオチドはリボ核酸（ＲＮＡ）治療薬をコードする、前記ナノエレクトロポレーションすること、をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記リボ核酸（ＲＮＡ）治療薬は、前記細胞外小胞ドナー細胞から放出される細胞外小胞内に組み込まれ、前記方法は、前記細胞外小胞ドナー細胞から放出された前記細胞外小胞を収集することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記リボ核酸（ＲＮＡ）治療薬は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）治療薬である。いくつかの実施形態では、前記リボ核酸（ＲＮＡ）治療薬は、非翻訳ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、前記ＲＮＡ治療薬は、がん治療薬である。いくつかの実施形態では、前記細胞外小胞は、完全にインタクトまたは実質的にインタクトな形態にある前記ＲＮＡ治療薬を含む。いくつかの実施形態では、前記ＲＮＡ治療薬は、完全にインタクトまたは実質的にインタクトなメッセンジャーＲＮＡである。いくつかの実施形態では、前記ＲＮＡ治療薬は、少なくとも５つの完全にインタクトなメッセンジャーＲＮＡのコピーを構成する。いくつかの実施形態では、前記ナノエレクトロポレーション後、平均すると、前記細胞外小胞ドナー細胞によって放出された各細胞外小胞は、少なくとも１つの前記ＲＮＡ治療薬のコピーを含む。いくつかの実施形態では、前記ナノエレクトロポレーション後、平均すると、前記細胞外小胞ドナー細胞によって放出された各細胞外小胞は、少なくとも１つの完全にインタクトまたは実質的にインタクトな前記ＲＮＡ治療薬のコピーを含む。いくつかの実施形態では、前記ナノエレクトロポレーション以前において、前記細胞外小胞ドナー細胞は、初代細胞または遺伝子改変されていない細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞外小胞ドナー細胞は、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）、ヒト胚線維芽細胞（ＨＥＦ）、樹状細胞、間葉系幹細胞、骨髄由来樹状細胞、骨髄由来間質細胞、脂肪間質細胞、内皮細胞、及び免疫細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記細胞外小胞ドナー細胞は、好中球ではない。いくつかの実施形態では、前記細胞外小胞は、エクソソーム、マイクロベシクル、またはアポトーシス小体である。いくつかの実施形態では、前記細胞外小胞はエクソソームである。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、バイオチップ上に位置するナノチャネルを介して、前記細胞外小胞ドナー細胞内にナノエレクトロポレーションされる。いくつかの実施形態では、前記ナノチャネルは、１ナノメートル～１０００ナノメートルの直径で構成される。いくつかの実施形態では、前記ナノチャネルは、２００ナノメートル～８００ナノメートルの直径で構成される。いくつかの実施形態では、前記ナノチャネルは、約５００ナノメートルの直径で構成される。いくつかの実施形態では、前記バイオチップは、１マイクロメートル～１００マイクロメートルのナノチャネル間の間隔を構成するナノチャネルアレイを含む。いくつかの実施形態では、前記ナノエレクトロポレーションは電界を構成する。いくつかの実施形態では、前記電界は、１ボルト／ｍｍ～１０００ボルト／ｍｍの電界強度を有する。いくつかの実施形態では、前記電界は、０．１ミリ秒／パルス～１００ミリ秒／パルスのパルス持続時間を有する複数のパルスを構成する。いくつかの実施形態では、腫瘍ターゲティングドメインは、腫瘍ターゲティングポリペプチドのＮ末端上にある。いくつかの実施形態では、腫瘍ターゲティングドメインは、腫瘍ターゲティングポリペプチドのＣ末端上にある。

本明細書では、いくつかの態様において、細胞外小胞を産生する方法が記載されており、前記方法は、初代細胞に少なくとも１つの異種デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ポリヌクレオチドをナノエレクトロポレーションし、それによって、前記異種ＤＮＡポリヌクレオチドを含む初代細胞を得ることであって、前記異種ＤＮＡポリヌクレオチドは、治療用リボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドをコードする、前記初代細胞を得ることと、前記異種ＤＮＡポリヌクレオチドを含む前記初代細胞を、前記異種ＤＮＡポリヌクレオチドの転写を可能にする条件下でインキュベーションし、それによって、前記治療用リボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを産生することであって、前記治療用リボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドは、前記初代細胞から放出される細胞外小胞内に組み込まれる、前記治療用リボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを産生することと、前記初代細胞から放出された前記細胞外小胞を収集することであって、前記初代細胞から放出された前記細胞外小胞は、平均すると、少なくとも１つの前記治療用リボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドのコピーを含む、前記細胞外小胞を収集することと、を含む。場合によっては、前記初代細胞から放出された前記細胞外小胞は、平均すると、前記初代細胞から放出された、５、１０、２０、５０、１００、５００または１０００個の細胞外小胞ごとに、少なくとも１つの前記治療用リボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドのコピーを含む。場合によっては、前記初代細胞から放出された前記細胞外小胞は、平均すると、前記治療用リボ核酸（ＲＮＡ）のコピーを少なくとも２、５、１０、２５または５０コピー含む。いくつかの実施形態では、前記ナノエレクトロポレーション以前において、前記初代細胞は、遺伝子改変されていない初代細胞である。いくつかの実施形態では、前記初代細胞は、間葉系幹細胞、骨髄由来樹状細胞、骨髄由来間質細胞、脂肪間質細胞、内皮細胞、及び免疫細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記初代細胞は、好中球ではない。いくつかの実施形態では、前記細胞外小胞は、エクソソーム、マイクロベシクル、またはアポトーシス小体である。いくつかの実施形態では、前記細胞外小胞はエクソソームである。

本明細書では、いくつかの態様において、細胞外小胞を含む組成物が記載されており、前記細胞外小胞は、以下：アダプターポリペプチドであって、前記アダプターポリペプチドは細胞外ドメインを含み、前記アダプターポリペプチドは、以下のポリペプチド：ＣＤ４７細胞外ドメイン、ＣＤ４７膜貫通ドメイン、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ４７、ＣＤ３１５、ヘテロ三量体Ｇタンパク質、ＭＨＣクラスＩ、インテグリン、トランスフェリン受容体（ＴＦＲ２）、ＬＡＭＰ１／２、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＡＤＡＭ１０、ＧＰＩアンカー型５’ヌクレオチダーゼ、ＣＤ７３、補体－結合タンパク質ＣＤ５５及びＣＤ５９、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ＴＳＰＡＮ８、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ９、ＰＥＣＡＭ１、ＥＲＢＢ２、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ９０、ＣＤ４５、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、グリコフォリンＡ、ＣＤ１４、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３、アセチルコリンエステラーゼ／ＡＣｈＥ－Ｓ、ＡＣｈＥ－Ｅ、アミロイドベータＡ４／ＡＰＰ、ＰＴＧＦＲＮ、ならびに多剤耐性関連タンパク質、のうちの１つと少なくとも７０％同一であるポリペプチド配列を含む、前記アダプターポリペプチドと；前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインに共有結合にて付着される異種ターゲティングポリペプチドであって、前記ターゲティングポリペプチドは、標的細胞に特異的に結合する、前記異種ターゲティングポリペプチドと、を含む。いくつかの実施形態では、前記アダプターポリペプチドは、ＣＤ４７ポリペプチドの膜貫通ドメインと少なくとも７０％同一である膜貫通ドメイン、またはＣＤ４７ポリペプチドの細胞外ドメインと少なくとも７０％同一である細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記異種ターゲティングポリペプチドは、前記アダプターポリペプチドの細胞外ドメインのＮ末端に共有結合にて連結される。いくつかの実施形態では、前記異種ターゲティングポリペプチドは、前記アダプターポリペプチドの細胞外ドメインのＣ末端に共有結合にて連結される。いくつかの実施形態では、前記アダプターポリペプチドはＣＤ４７を含む。いくつかの実施形態では、前記異種ターゲティングポリペプチドは、疾患細胞に関連する細胞表面マーカーに結合するターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記ターゲティングドメインは、腫瘍ターゲティングドメインである。いくつかの実施形態では、前記腫瘍ターゲティングドメインは、ＣＤＸペプチドである。いくつかの実施形態では、前記腫瘍ターゲティングドメインは、ＣＲＥＫＡペプチドである。いくつかの実施形態では、前記細胞外小胞は、少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）治療薬のコピーを含む。いくつかの実施形態では、前記リボ核酸（ＲＮＡ）治療薬は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）治療薬である。いくつかの実施形態では、前記リボ核酸（ＲＮＡ）治療薬は、非翻訳ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、前記ＲＮＡ治療薬は、がん治療薬である。いくつかの実施形態では、前記ＲＮＡ治療薬は、完全にインタクトまたは実質的にインタクトな形態である。いくつかの実施形態では、前記ＲＮＡ治療薬は、完全にインタクトまたは実質的にインタクトなメッセンジャーＲＮＡである。いくつかの実施形態では、前記ＲＮＡ治療薬は、少なくとも５つの完全にインタクトまたは実質的にインタクトなメッセンジャーＲＮＡのコピーを構成する。いくつかの実施形態では、前記細胞外小胞は、エクソソーム、マイクロベシクル、またはアポトーシス小体である。いくつかの実施形態では、前記細胞外小胞はエクソソームである。いくつかの実施形態では、腫瘍ターゲティングドメインは、腫瘍ターゲティングポリペプチドのＮ末端上にある。いくつかの実施形態では、腫瘍ターゲティングドメインは、腫瘍ターゲティングポリペプチドのＣ末端上にある。

本明細書では、いくつかの態様において、対象の腫瘍を治療する方法が記載されており、前記方法は、治療薬を含む少なくとも１つの細胞外小胞を対象に全身投与することであって、前記治療薬を含む前記少なくとも１つの細胞外小胞は、以下：少なくとも１つのポリヌクレオチドを細胞外小胞ドナー細胞にナノエレクトロポレーションすることであって、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドは、（ｉ）膜貫通ドメイン及び細胞外ドメインを含むアダプターポリペプチド、ならびに（ｉｉ）前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインに共有結合にて連結される異種ターゲティングドメインを含む、ターゲティングポリペプチドをコードし、かつ、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドは、リボ核酸（ＲＮＡ）治療薬をコードする、前記ナノエレクトロポレーションすることと；（ｉ）前記ターゲティングポリペプチドが、前記細胞外小胞ドナー細胞内で発現され、かつ（ｉｉ）前記ターゲティングポリペプチドが、前記細胞外小胞ドナー細胞から放出される細胞外小胞内に組み込まれるような条件下で、前記細胞外小胞ドナー細胞をインキュベーションすることと；前記細胞外小胞ドナー細胞から放出される前記少なくとも１つの細胞外小胞を収集することであって、前記少なくとも１つの細胞外小胞は前記ターゲティングポリペプチドを含む、前記細胞外小胞を収集することと、により得られる、前記全身投与すること、を含み、腫瘍における少なくとも１つの細胞外小胞の集積率が、異種ターゲティングドメインを欠く細胞外小胞の集積率と比較して高い。いくつかの実施形態では、前記異種ターゲティングドメインは、前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインのＮ末端に共有結合にて連結される。いくつかの実施形態では、前記異種ターゲティングドメインは、前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインのＣ末端に共有結合にて連結される。いくつかの実施形態では、前記アダプターポリペプチドの前記膜貫通ドメインは、ＣＤ４７ポリペプチドの膜貫通ドメインと少なくとも７０％同一であるか、または前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインは、ＣＤ４７ポリペプチドの細胞外ドメインと少なくとも７０％同一である。いくつかの実施形態では、前記アダプターポリペプチドは、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ４７、ＣＤ３１５、ヘテロ三量体Ｇタンパク質、ＭＨＣクラスＩ、インテグリン、トランスフェリン受容体（ＴＦＲ２）、ＬＡＭＰ１／２、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＡＤＡＭ１０、ＧＰＩアンカー型５’ヌクレオチダーゼ、ＣＤ７３、補体－結合タンパク質ＣＤ５５及びＣＤ５９、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ＴＳＰＡＮ８、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ９、ＰＥＣＡＭ１、ＥＲＢＢ２、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ９０、ＣＤ４５、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、グリコフォリンＡ、ＣＤ１４、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３、アセチルコリンエステラーゼ／ＡＣｈＥ－Ｓ、ＡＣｈＥ－Ｅ、アミロイドベータＡ４／ＡＰＰ、ＰＴＧＦＲＮ、ならびに多剤耐性関連タンパク質からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記アダプターポリペプチドは、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ４７、ＣＤ３１５、ヘテロ三量体Ｇタンパク質、ＭＨＣクラスＩ、インテグリン、トランスフェリン受容体（ＴＦＲ２）、ＬＡＭＰ１／２、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＡＤＡＭ１０、ＧＰＩアンカー型５’ヌクレオチダーゼ、ＣＤ７３、補体－結合タンパク質ＣＤ５５及びＣＤ５９、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ＴＳＰＡＮ８、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ９、ＰＥＣＡＭ１、ＥＲＢＢ２、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ９０、ＣＤ４５、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、グリコフォリンＡ、ＣＤ１４、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３、アセチルコリンエステラーゼ／ＡＣｈＥ－Ｓ、ＡＣｈＥ－Ｅ、アミロイドベータＡ４／ＡＰＰ、ＰＴＧＦＲＮ、ならびに多剤耐性関連タンパク質からなる群から選択されるポリペプチドと、少なくとも７０％同一である。いくつかの実施形態では、前記アダプターポリペプチドは、ＣＤ４７と少なくとも７０％同一である。いくつかの実施形態では、前記異種ターゲティングドメインは、腫瘍ターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記腫瘍ターゲティングドメインは、ＣＤＸペプチドである。いくつかの実施形態では、前記腫瘍ターゲティングドメインは、ＣＲＥＫＡペプチドである。いくつかの実施形態では、前記リボ核酸（ＲＮＡ）治療薬は、前記細胞外小胞ドナー細胞から放出される細胞外小胞内に組み込まれ、前記方法は、前記細胞外小胞ドナー細胞から放出された前記細胞外小胞を収集することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記リボ核酸（ＲＮＡ）治療薬は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）治療薬である。いくつかの実施形態では、前記リボ核酸（ＲＮＡ）治療薬は、非翻訳ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、前記ＲＮＡ治療薬は、がん治療薬である。いくつかの実施形態では、前記細胞外小胞は、完全にインタクトまたは実質的にインタクトな形態にある前記ＲＮＡ治療薬を含む。いくつかの実施形態では、前記ＲＮＡ治療薬は、完全にインタクトまたは実質的にインタクトなメッセンジャーＲＮＡである。いくつかの実施形態では、前記ＲＮＡ治療薬は、少なくとも５つの完全にインタクトなメッセンジャーＲＮＡのコピーを構成する。いくつかの実施形態では、前記ナノエレクトロポレーション後、平均すると、前記細胞外小胞ドナー細胞によって放出された各細胞外小胞は、少なくとも１つの前記ＲＮＡ治療薬のコピーを含む。いくつかの実施形態では、前記ナノエレクトロポレーション後、平均すると、前記細胞外小胞ドナー細胞によって放出された各細胞外小胞は、少なくとも１つの完全にインタクトまたは実質的にインタクトな前記ＲＮＡ治療薬のコピーを含む。いくつかの実施形態では、前記ナノエレクトロポレーション以前において、前記細胞外小胞ドナー細胞は、初代細胞または遺伝子改変されていない細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞外小胞ドナー細胞は、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）、ヒト胚線維芽細胞（ＨＥＦ）、樹状細胞、間葉系幹細胞、骨髄由来樹状細胞、骨髄由来間質細胞、脂肪間質細胞、内皮細胞、及び免疫細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記細胞外小胞ドナー細胞は、好中球ではない。いくつかの実施形態では、前記細胞外小胞は、エクソソーム、マイクロベシクル、またはアポトーシス小体である。いくつかの実施形態では、前記細胞外小胞はエクソソームである。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、バイオチップ上に位置するナノチャネルを介して、前記細胞外小胞ドナー細胞内にナノエレクトロポレーションされる。いくつかの実施形態では、前記ナノチャネルは、１ナノメートル～１０００ナノメートルの直径で構成される。いくつかの実施形態では、前記ナノチャネルは、２００ナノメートル～８００ナノメートルの直径で構成される。いくつかの実施形態では、前記ナノチャネルは、約５００ナノメートルの直径で構成される。いくつかの実施形態では、前記バイオチップは、１マイクロメートル～１００マイクロメートルのナノチャネル間の間隔を構成するナノチャネルアレイを含む。いくつかの実施形態では、前記ナノエレクトロポレーションは電界を構成する。いくつかの実施形態では、前記電界は、１ボルト／ｍｍ～１０００ボルト／ｍｍの電界強度を有する。いくつかの実施形態では、前記電界は、０．１ミリ秒／パルス～１００ミリ秒／パルスのパルス持続時間を有する複数のパルスを構成する。いくつかの実施形態では、腫瘍ターゲティングドメインは、腫瘍ターゲティングポリペプチドのＮ末端上にある。いくつかの実施形態では、腫瘍ターゲティングドメインは、腫瘍ターゲティングポリペプチドのＣ末端上にある。いくつかの実施形態では、前記腫瘍は、がんである。いくつかの実施形態では、前記がんは神経膠腫である。

本明細書では、いくつかの態様において、対象の筋ジストロフィーを治療する方法が記載されており、前記方法は、治療薬を含む少なくとも１つの細胞外小胞を対象に全身投与することであって、前記治療薬を含む前記少なくとも１つの細胞外小胞は、以下：少なくとも１つのポリヌクレオチドを細胞外小胞ドナー細胞にナノエレクトロポレーションすることであって、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドは、（ｉ）膜貫通ドメイン及び細胞外ドメインを含むアダプターポリペプチド、ならびに（ｉｉ）前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインに共有結合にて連結される異種ターゲティングドメインを含む、ターゲティングポリペプチドをコードし、かつ、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドは、リボ核酸（ＲＮＡ）治療薬をコードする、前記ナノエレクトロポレーションすることと；（ｉ）前記ターゲティングポリペプチドが、前記細胞外小胞ドナー細胞内で発現され、かつ（ｉｉ）前記ターゲティングポリペプチドが、前記細胞外小胞ドナー細胞から放出される細胞外小胞内に組み込まれるような条件下で、前記細胞外小胞ドナー細胞をインキュベーションすることと；前記細胞外小胞ドナー細胞から放出される前記少なくとも１つの細胞外小胞を収集することであって、前記少なくとも１つの細胞外小胞は前記ターゲティングポリペプチドを含む、前記細胞外小胞を収集することと、により得られる、前記全身投与すること、を含み、腫瘍における少なくとも１つの細胞外小胞の集積率が、異種ターゲティングドメインを欠く細胞外小胞の集積率と比較して高い。いくつかの実施形態では、前記異種ターゲティングドメインは、前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインのＮ末端に共有結合にて連結される。いくつかの実施形態では、前記異種ターゲティングドメインは、前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインのＣ末端に共有結合にて連結される。いくつかの実施形態では、前記アダプターポリペプチドの前記膜貫通ドメインは、ＣＤ４７ポリペプチドの膜貫通ドメインと少なくとも７０％同一であるか、または前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインは、ＣＤ４７ポリペプチドの細胞外ドメインと少なくとも７０％同一である。いくつかの実施形態では、前記アダプターポリペプチドは、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ４７、ＣＤ３１５、ヘテロ三量体Ｇタンパク質、ＭＨＣクラスＩ、インテグリン、トランスフェリン受容体（ＴＦＲ２）、ＬＡＭＰ１／２、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＡＤＡＭ１０、ＧＰＩアンカー型５’ヌクレオチダーゼ、ＣＤ７３、補体－結合タンパク質ＣＤ５５及びＣＤ５９、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ＴＳＰＡＮ８、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ９、ＰＥＣＡＭ１、ＥＲＢＢ２、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ９０、ＣＤ４５、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、グリコフォリンＡ、ＣＤ１４、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３、アセチルコリンエステラーゼ／ＡＣｈＥ－Ｓ、ＡＣｈＥ－Ｅ、アミロイドベータＡ４／ＡＰＰ、ＰＴＧＦＲＮ、ならびに多剤耐性関連タンパク質からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記アダプターポリペプチドは、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ４７、ＣＤ３１５、ヘテロ三量体Ｇタンパク質、ＭＨＣクラスＩ、インテグリン、トランスフェリン受容体（ＴＦＲ２）、ＬＡＭＰ１／２、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＡＤＡＭ１０、ＧＰＩアンカー型５’ヌクレオチダーゼ、ＣＤ７３、補体－結合タンパク質ＣＤ５５及びＣＤ５９、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ＴＳＰＡＮ８、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ９、ＰＥＣＡＭ１、ＥＲＢＢ２、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ９０、ＣＤ４５、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、グリコフォリンＡ、ＣＤ１４、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３、アセチルコリンエステラーゼ／ＡＣｈＥ－Ｓ、ＡＣｈＥ－Ｅ、アミロイドベータＡ４／ＡＰＰ、ＰＴＧＦＲＮ、ならびに多剤耐性関連タンパク質からなる群から選択されるポリペプチドと、少なくとも７０％同一である。いくつかの実施形態では、前記アダプターポリペプチドは、ＣＤ４７と少なくとも７０％同一である。いくつかの実施形態では、前記異種ターゲティングドメインは、腫瘍ターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記腫瘍ターゲティングドメインは、ＣＤＸペプチドである。いくつかの実施形態では、前記腫瘍ターゲティングドメインは、ＣＲＥＫＡペプチドである。いくつかの実施形態では、前記リボ核酸（ＲＮＡ）治療薬は、前記細胞外小胞ドナー細胞から放出される細胞外小胞内に組み込まれ、前記方法は、前記細胞外小胞ドナー細胞から放出された前記細胞外小胞を収集することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記リボ核酸（ＲＮＡ）治療薬は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）治療薬である。いくつかの実施形態では、前記リボ核酸（ＲＮＡ）治療薬は、非翻訳ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、前記細胞外小胞は、完全にインタクトまたは実質的にインタクトな形態にある前記ＲＮＡ治療薬を含む。いくつかの実施形態では、前記ＲＮＡ治療薬は、完全にインタクトまたは実質的にインタクトなメッセンジャーＲＮＡである。いくつかの実施形態では、前記ＲＮＡ治療薬は、少なくとも５つの完全にインタクトなメッセンジャーＲＮＡのコピーを構成する。いくつかの実施形態では、前記ナノエレクトロポレーション後、平均すると、前記細胞外小胞ドナー細胞によって放出された各細胞外小胞は、少なくとも１つの前記ＲＮＡ治療薬のコピーを含む。いくつかの実施形態では、前記ナノエレクトロポレーション後、平均すると、前記細胞外小胞ドナー細胞によって放出された各細胞外小胞は、少なくとも１つの完全にインタクトまたは実質的にインタクトな前記ＲＮＡ治療薬のコピーを含む。いくつかの実施形態では、前記ナノエレクトロポレーション以前において、前記細胞外小胞ドナー細胞は、初代細胞または遺伝子改変されていない細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞外小胞ドナー細胞は、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）、ヒト胚線維芽細胞（ＨＥＦ）、樹状細胞、間葉系幹細胞、骨髄由来樹状細胞、骨髄由来間質細胞、脂肪間質細胞、内皮細胞、及び免疫細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記細胞外小胞ドナー細胞は、好中球ではない。いくつかの実施形態では、前記細胞外小胞は、エクソソーム、マイクロベシクル、またはアポトーシス小体である。いくつかの実施形態では、前記細胞外小胞はエクソソームである。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、バイオチップ上に位置するナノチャネルを介して、前記細胞外小胞ドナー細胞内にナノエレクトロポレーションされる。いくつかの実施形態では、前記ナノチャネルは、１ナノメートル～１０００ナノメートルの直径で構成される。いくつかの実施形態では、前記バイオチップは、１マイクロメートル～１００マイクロメートルのナノチャネル間の間隔を構成するナノチャネルアレイを含む。いくつかの実施形態では、前記ナノエレクトロポレーションは電界を構成する。いくつかの実施形態では、前記電界は、１ボルト／ｍｍ～１０００ボルト／ｍｍの電界強度を有する。いくつかの実施形態では、前記電界は、０．１ミリ秒／パルス～１００ミリ秒／パルスのパルス持続時間を有する複数のパルスを構成する。いくつかの実施形態では、腫瘍ターゲティングドメインは、腫瘍ターゲティングポリペプチドのＮ末端上にある。いくつかの実施形態では、腫瘍ターゲティングドメインは、腫瘍ターゲティングポリペプチドのＣ末端上にある。いくつかの実施形態では、前記筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、及び筋強直性ジストロフィーからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーである。

本明細書では、いくつかの態様において、対象の網膜疾患を治療する方法が記載されており、前記方法は、治療薬を含む少なくとも１つの細胞外小胞を対象に全身投与することであって、前記治療薬を含む前記少なくとも１つの細胞外小胞は、以下：少なくとも１つのポリヌクレオチドを細胞外小胞ドナー細胞にナノエレクトロポレーションすることであって、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドは、（ｉ）膜貫通ドメイン及び細胞外ドメインを含むアダプターポリペプチド、ならびに（ｉｉ）前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインに共有結合にて連結される異種ターゲティングドメインを含む、ターゲティングポリペプチドをコードし、かつ、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドは、リボ核酸（ＲＮＡ）治療薬をコードする、前記ナノエレクトロポレーションすることと；（ｉ）前記ターゲティングポリペプチドが、前記細胞外小胞ドナー細胞内で発現され、かつ（ｉｉ）前記ターゲティングポリペプチドが、前記細胞外小胞ドナー細胞から放出される細胞外小胞内に組み込まれるような条件下で、前記細胞外小胞ドナー細胞をインキュベーションすることと；前記細胞外小胞ドナー細胞から放出される前記少なくとも１つの細胞外小胞を収集することであって、前記少なくとも１つの細胞外小胞は前記ターゲティングポリペプチドを含む、前記細胞外小胞を収集することと、により得られる、前記全身投与すること、を含み、腫瘍における少なくとも１つの細胞外小胞の集積率が、異種ターゲティングドメインを欠く細胞外小胞の集積率と比較して高い。いくつかの実施形態では、前記異種ターゲティングドメインは、前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインのＮ末端に共有結合にて連結される。いくつかの実施形態では、前記異種ターゲティングドメインは、前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインのＣ末端に共有結合にて連結される。いくつかの実施形態では、前記アダプターポリペプチドの前記膜貫通ドメインは、ＣＤ４７ポリペプチドの膜貫通ドメインと少なくとも７０％同一であるか、または前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインは、ＣＤ４７ポリペプチドの細胞外ドメインと少なくとも７０％同一である。いくつかの実施形態では、前記アダプターポリペプチドは、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ４７、ＣＤ３１５、ヘテロ三量体Ｇタンパク質、ＭＨＣクラスＩ、インテグリン、トランスフェリン受容体（ＴＦＲ２）、ＬＡＭＰ１／２、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＡＤＡＭ１０、ＧＰＩアンカー型５’ヌクレオチダーゼ、ＣＤ７３、補体－結合タンパク質ＣＤ５５及びＣＤ５９、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ＴＳＰＡＮ８、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ９、ＰＥＣＡＭ１、ＥＲＢＢ２、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ９０、ＣＤ４５、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、グリコフォリンＡ、ＣＤ１４、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３、アセチルコリンエステラーゼ／ＡＣｈＥ－Ｓ、ＡＣｈＥ－Ｅ、アミロイドベータＡ４／ＡＰＰ、ＰＴＧＦＲＮ、ならびに多剤耐性関連タンパク質からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記アダプターポリペプチドは、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ４７、ＣＤ３１５、ヘテロ三量体Ｇタンパク質、ＭＨＣクラスＩ、インテグリン、トランスフェリン受容体（ＴＦＲ２）、ＬＡＭＰ１／２、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＡＤＡＭ１０、ＧＰＩアンカー型５’ヌクレオチダーゼ、ＣＤ７３、補体－結合タンパク質ＣＤ５５及びＣＤ５９、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ＴＳＰＡＮ８、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ９、ＰＥＣＡＭ１、ＥＲＢＢ２、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ９０、ＣＤ４５、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、グリコフォリンＡ、ＣＤ１４、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３、アセチルコリンエステラーゼ／ＡＣｈＥ－Ｓ、ＡＣｈＥ－Ｅ、アミロイドベータＡ４／ＡＰＰ、ＰＴＧＦＲＮ、ならびに多剤耐性関連タンパク質からなる群から選択されるポリペプチドと、少なくとも７０％同一である。いくつかの実施形態では、前記アダプターポリペプチドは、ＣＤ４７と少なくとも７０％同一である。いくつかの実施形態では、前記異種ターゲティングドメインは、腫瘍ターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記腫瘍ターゲティングドメインは、ＣＤＸペプチドである。いくつかの実施形態では、前記腫瘍ターゲティングドメインは、ＣＲＥＫＡペプチドである。いくつかの実施形態では、前記リボ核酸（ＲＮＡ）治療薬は、前記細胞外小胞ドナー細胞から放出される細胞外小胞内に組み込まれ、前記方法は、前記細胞外小胞ドナー細胞から放出された前記細胞外小胞を収集することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記リボ核酸（ＲＮＡ）治療薬は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）治療薬である。いくつかの実施形態では、前記リボ核酸（ＲＮＡ）治療薬は、非翻訳ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、前記細胞外小胞は、完全にインタクトまたは実質的にインタクトな形態にある前記ＲＮＡ治療薬を含む。いくつかの実施形態では、前記ＲＮＡ治療薬は、完全にインタクトまたは実質的にインタクトなメッセンジャーＲＮＡである。いくつかの実施形態では、前記ＲＮＡ治療薬は、少なくとも５つの完全にインタクトなメッセンジャーＲＮＡのコピーを構成する。いくつかの実施形態では、前記ナノエレクトロポレーション後、平均すると、前記細胞外小胞ドナー細胞によって放出された各細胞外小胞は、少なくとも１つの前記ＲＮＡ治療薬のコピーを含む。いくつかの実施形態では、前記ナノエレクトロポレーション後、平均すると、前記細胞外小胞ドナー細胞によって放出された各細胞外小胞は、少なくとも１つの完全にインタクトまたは実質的にインタクトな前記ＲＮＡ治療薬のコピーを含む。いくつかの実施形態では、前記ナノエレクトロポレーション以前において、前記細胞外小胞ドナー細胞は、初代細胞または遺伝子改変されていない細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞外小胞ドナー細胞は、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）、ヒト胚線維芽細胞（ＨＥＦ）、樹状細胞、間葉系幹細胞、骨髄由来樹状細胞、骨髄由来間質細胞、脂肪間質細胞、内皮細胞、及び免疫細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記細胞外小胞ドナー細胞は、好中球ではない。いくつかの実施形態では、前記細胞外小胞は、エクソソーム、マイクロベシクル、またはアポトーシス小体である。

いくつかの実施形態では、前記細胞外小胞はエクソソームである。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、バイオチップ上に位置するナノチャネルを介して、前記細胞外小胞ドナー細胞内にナノエレクトロポレーションされる。いくつかの実施形態では、前記ナノチャネルは、１ナノメートル～１０００ナノメートルの直径で構成される。いくつかの実施形態では、前記バイオチップは、１マイクロメートル～１００マイクロメートルのナノチャネル間の間隔を構成するナノチャネルアレイを含む。いくつかの実施形態では、前記ナノエレクトロポレーションは電界を構成する。いくつかの実施形態では、前記電界は、１ボルト／ｍｍ～１０００ボルト／ｍｍの電界強度を有する。いくつかの実施形態では、前記電界は、０．１ミリ秒／パルス～１００ミリ秒／パルスのパルス持続時間を有する複数のパルスを構成する。いくつかの実施形態では、腫瘍ターゲティングドメインは、腫瘍ターゲティングポリペプチドのＮ末端上にある。いくつかの実施形態では、腫瘍ターゲティングドメインは、腫瘍ターゲティングポリペプチドのＣ末端上にある。いくつかの実施形態では、前記網膜疾患は網膜色素変性症である。いくつかの実施形態では、前記網膜疾患は、レーバー先天黒内障である。

本明細書では、いくつかの態様において、対象の腫瘍を治療する方法が記載されており、前記方法は、治療用ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞外小胞を対象に全身投与することであって、治療用ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞外小胞は、以下：細胞外小胞ドナー細胞に、少なくとも第１のベクター（例えば、プラスミド）及び少なくとも第２のベクター（例えば、プラスミド）をナノエレクトロポレーションすることであって、第１のベクター（例えば、プラスミド）は、腫瘍または組織ターゲティングドメインに共有結合にて結合された細胞外小胞表面タンパク質を含む腫瘍または組織ターゲティングポリペプチドをコードし、第２のベクターは、治療用ポリヌクレオチドをコードする、前記ナノエレクトロポレーションすることと；腫瘍または組織ターゲティングポリペプチドを得るために、細胞外小胞ドナー細胞内で第１のベクター（例えば、プラスミド）を発現させることと；治療用ポリヌクレオチドを得るために、細胞外小胞ドナー細胞内で第２のベクター（例えば、プラスミド）を転写することと；細胞外小胞ドナー細胞から放出される少なくとも１つの細胞外小胞を収集することと、により得られる、前記全身投与すること、を含み、目的の腫瘍または組織における少なくとも１つの細胞外小胞の集積率が、腫瘍または組織ターゲティングポリペプチドを欠く細胞外小胞の集積率と比較して高い。いくつかの実施形態では、細胞外小胞はエクソソームである。いくつかの実施形態では、腫瘍または組織における、腫瘍または組織ターゲティングポリペプチドを含む少なくとも１つの細胞外小胞の集積率は、腫瘍ターゲティングポリペプチドを欠く細胞外小胞の集積率と比較して、少なくとも１００倍高い。いくつかの実施形態では、細胞外小胞ドナー細胞は、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）、ヒト胚線維芽細胞（ＨＥＦ）、樹状細胞、間葉系幹細胞、骨髄由来樹状細胞、骨髄由来間質細胞、脂肪間質細胞、内皮細胞、及び免疫細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、複数の第１及び第２のプラスミドは、バイオチップ上に位置するナノチャネルを介して細胞外小胞ドナー細胞内にナノエレクトロポレーションされる。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、１ナノメートル～１０００ナノメートルの直径で構成される。いくつかの実施形態では、バイオチップは、１マイクロメートル～１００マイクロメートルのナノチャネル間の間隔を構成するナノチャネルアレイを含む。いくつかの実施形態では、ナノエレクトロポレーションは電界を構成する。いくつかの実施形態では、電界は、１ボルト／ｍｍ～１０００ボルト／ｍｍの電界強度を有する。いくつかの実施形態では、電界は、０．１ミリ秒／パルス～１００ミリ秒／パルスのパルス持続時間を有する複数のパルスを構成する。いくつかの実施形態では、細胞外小胞ドメインの腫瘍または組織ターゲティングドメインは、腫瘍または組織ターゲティングポリペプチドのＮ末端上にある。いくつかの実施形態では、腫瘍または組織ターゲティングドメインは、腫瘍ターゲティングポリペプチドのＣ末端上にある。いくつかの実施形態では、腫瘍または組織ターゲティングドメインは、ＣＤＸペプチドを含む。いくつかの実施形態では、腫瘍または組織ターゲティングドメインは、ＣＲＥＫＡペプチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞外小胞表面タンパク質は、天然に存在する細胞外小胞表面タンパク質のペプチド配列と少なくとも７０％同一であるペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、天然に存在する細胞外小胞表面タンパク質は、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ４７、ＣＤ３１５、ヘテロ三量体Ｇタンパク質、ＭＨＣクラスＩ、インテグリン、トランスフェリン受容体（ＴＦＲ２）、ＬＡＭＰ１／２、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＡＤＡＭ１０、ＧＰＩアンカー型５’ヌクレオチダーゼ、ＣＤ７３、補体－結合タンパク質ＣＤ５５及びＣＤ５９、ならびにソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、天然に存在する細胞外小胞表面タンパク質は、ＴＳＰＡＮ８、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ９、ＰＥＣＡＭ１、ＥＲＢＢ２、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ９０、ＣＤ４５、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、グリコフォリンＡ、ＣＤ１４、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３、アセチルコリンエステラーゼ／ＡＣｈＥ－Ｓ、ＡＣｈＥ－Ｅ、アミロイドベータＡ４／ＡＰＰ、ＰＴＧＦＲＮ、及び多剤耐性関連タンパク質からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、天然に存在する細胞外小胞表面タンパク質はＣＤ４７を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの細胞外小胞は、少なくとも１つの治療用ポリヌクレオチドのコピーを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの細胞外小胞は、治療用ポリヌクレオチドのコピーを、少なくとも２コピー、少なくとも５コピー、少なくとも１０コピー、または少なくとも５０コピー含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの細胞外小胞は、治療用ポリヌクレオチドのコピーを少なくとも１００コピー含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの細胞外小胞は、治療用ポリヌクレオチドのコピーを少なくとも１０００コピー含む。いくつかの実施形態では、治療用ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＳＲＰＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｔｍＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ａＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及びｓｈＲＮＡからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、治療用ポリヌクレオチドはｍＲＮＡを構成する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも１００個のＲＮＡヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、治療用ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、治療用ポリヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、記載される方法は、細胞外小胞で腫瘍を治療することを含む。いくつかの実施形態では、腫瘍は、がんである。いくつかの実施形態では、がんは神経膠腫である。

本明細書では、いくつかの態様において、対象の筋ジストロフィーを治療する方法が記載されており、前記方法は、治療用ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞外小胞を対象に全身投与することであって、治療用ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞外小胞は、以下：細胞外小胞ドナー細胞に、少なくとも第１のベクター（例えば、プラスミド）及び少なくとも第２のベクター（例えば、プラスミド）をナノエレクトロポレーションすることであって、第１のベクター（例えば、プラスミド）は、筋細胞ターゲティングドメインに共有結合にて結合された細胞外小胞表面タンパク質を含む筋細胞ターゲティングポリペプチドをコードし、第２のベクターは、治療用ポリヌクレオチドをコードする、前記ナノエレクトロポレーションすることと；筋細胞ターゲティングポリペプチドを得るために、細胞外小胞ドナー細胞内で第１のベクターを発現させることと；治療用ポリヌクレオチドを得るために、細胞外小胞ドナー細胞内で第２のベクターを転写することと；細胞外小胞ドナー細胞から放出される少なくとも１つの細胞外小胞を収集することと、により得られる、前記全身投与すること、を含む。いくつかの実施形態では、筋ジストロフィーを治療するための細胞外小胞はエクソソームである。いくつかの実施形態では、筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、及び筋強直性ジストロフィーからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーである。いくつかの実施形態では、筋ジストロフィーを治療するための治療用ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡを構成する。いくつかの実施形態では、筋ジストロフィーを治療するための治療用ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、筋ジストロフィーを治療するための治療用ポリヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドを含む。

本明細書では、いくつかの態様において、対象の網膜疾患を治療する方法が記載されており、前記方法は、治療用ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞外小胞を対象に全身投与することであって、治療用ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞外小胞は、以下：細胞外小胞ドナー細胞に、少なくとも第１のベクター及び少なくとも第２のベクターをナノエレクトロポレーションすることであって、第１のベクターは、網膜細胞ターゲティングドメインに共有結合にて結合された細胞外小胞表面タンパク質を含む網膜細胞ターゲティングポリペプチドをコードし、第２のベクターは、治療用ポリヌクレオチドをコードする、前記ナノエレクトロポレーションすることと；網膜細胞ターゲティングポリペプチドを得るために、細胞外小胞ドナー細胞内で第１のベクターを発現させることと；治療用ポリヌクレオチドを得るために、細胞外小胞ドナー細胞内で第２のベクターを転写することと；細胞外小胞ドナー細胞から放出される少なくとも１つの細胞外小胞を収集することと、により得られる、前記全身投与すること、を含む。いくつかの実施形態では、網膜疾患を治療するための細胞外小胞はエクソソームである。いくつかの実施形態では、網膜疾患は網膜色素変性症である。いくつかの実施形態では、網膜疾患は、レーバー先天黒内障である。

本明細書では、いくつかの態様において、少なくとも１つの細胞外小胞を含む医薬組成物であって、少なくとも１つの細胞外小胞は、以下：ターゲティングドメインに共有結合にて結合された細胞外小胞表面タンパク質を含む少なくとも１つのターゲティングポリペプチドと；少なくとも１つの治療用ポリヌクレオチドと、を含む、前記医薬組成物が記載される。いくつかの実施形態では、医薬組成物の細胞外小胞はエクソソームである。いくつかの実施形態では、細胞外小胞表面タンパク質は、細胞外小胞膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外小胞膜貫通ドメインは、ＣＤ４７ペプチド配列と少なくとも７０％同一である。いくつかの実施形態では、医薬組成物の細胞外小胞は、少なくとも２つのターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのターゲティングドメインは相異なる。いくつかの実施形態では、医薬組成物の治療用ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＳＲＰＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｔｍＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ａＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及びｓｈＲＮＡからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、治療用ポリヌクレオチドはｍＲＮＡを構成する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、髄腔内、眼窩内、硝子体内、網膜、静脈内、筋肉内、脳室内、大脳内、小脳内、側脳室内、実質内、皮下、またはそれらの組み合わせで対象に投与される。

本特許出願は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含有している。カラー図面（複数可）による本特許または特許出願の写しは、請求に応じて、必要な手数料が支払われた場合に、米国特許商標庁により提供される。

本開示の新規性は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載される。本開示の特徴及び利点のより良い理解は、例示的な実施形態を説明する後述の発明を実施するための形態を参照することによって得られるであろう。

転写されたｍＲＮＡを積載した細胞外小胞（ＥＶ）が、細胞ナノポレーション（ＣＮＰ）によって大量に生成することを示している。標的化核酸を送達するためのＥＶを生成したＣＮＰの略図である。左：模範的なＣＮＰシステムは、各チャネルの直径が約５００ｎｍ程度のナノチャネルアレイからなる（挿入図上部）。緩衝液中に添加されたＤＮＡベクターは、一過性の電気パルスの下で、付着した細胞にナノチャネルを通じて侵入する。続いて、付着した細胞は、転写されたｍＲＮＡを含有するエクソソームを大量に放出し、それらのエクソソームは、血液脳関門（ＢＢＢ）及び血液脳腫瘍関門（ＢＢＴＢ）を介した腫瘍標的化送達のために収集され得る（右）。転写されたｍＲＮＡを積載した細胞外小胞（ＥＶ）が、細胞ナノポレーション（ＣＮＰ）によって大量に生成することを示している。ＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳ）中の未処理ＭＥＦ、リポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏ）、バルクエレクトロポレーション（ＢＥＰ）、及び細胞ナノエレクトロポレーション（ＣＮＰ）でトランスフェクションされるＡｓｃｌ１／Ｂｒｎ２／Ｍｙｔ１ｌ（Ａ／Ｂ／Ｍ）ベクターを用いて処理した後のＭＥＦ、ならびにＰＢＳ緩衝液のみを用いたＣＮＰ（ＣＮＰ／ＰＢＳ）によって産生された、細胞当たりのＥＶ数。全てのデータは独立した３回の実験に由来するものであり、平均値±ＳＥＭとして提示した。^＊Ｐ＜０．０５（ｖｓＢＥＰ）、スチューデントｔ検定（図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、及び図１Ｈ）。転写されたｍＲＮＡを積載した細胞外小胞（ＥＶ）が、細胞ナノポレーション（ＣＮＰ）によって大量に生成することを示している。ＣＮＰ法によるＥＶ放出と、飢餓、低酸素、及び熱処理を含む、これまでの他のストレス誘導ＥＶ放出法との比較。飢餓：ＭＥＦ細胞をＦＢＳなしのＤＭＥＭで培養；低酸素：ＭＥＦ細胞を１％Ｏ_２及び５％ＣＯ_２の低酸素チャンバ内で３７℃の加湿環境にて培養；熱：ＭＥＦ細胞を４２℃で２時間培養し、次いで３７℃の通常の細胞培養条件に移した。全てのデータは独立した３回の実験に由来するものであり、平均値±ＳＥＭとして提示した。^＊Ｐ＜０．０５（ｖｓＢＥＰ）、スチューデントｔ検定（図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、及び図１Ｈ）。転写されたｍＲＮＡを積載した細胞外小胞（ＥＶ）が、細胞ナノポレーション（ＣＮＰ）によって大量に生成することを示している。ＰＢＳ、Ｌｉｐｏ、ＢＥＰ、ＣＮＰ、及びＣＮＰ／ＰＢＳ群を含む異なる処理群において、マウス骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）により産生された細胞当たりのＥＶ数。全てのデータは独立した３回の実験に由来するものであり、平均値±ＳＥＭとして提示した。^＊Ｐ＜０．０５（ｖｓＢＥＰ）、スチューデントｔ検定（図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、及び図１Ｈ）。転写されたｍＲＮＡを積載した細胞外小胞（ＥＶ）が、細胞ナノポレーション（ＣＮＰ）によって大量に生成することを示している。ＣＮＰでトランスフェクションされたＭＥＦからのエクソソーム放出は、ＣＮＰ後８時間前後の時点でピークに達する。転写されたｍＲＮＡを積載した細胞外小胞（ＥＶ）が、細胞ナノポレーション（ＣＮＰ）によって大量に生成することを示している。様々な電圧でのＣＮＰによるＭＥＦエクソソーム濃度の動的光散乱法（ＤＬＳ）測定。結果から、電圧を２００Ｖから２２０Ｖに上げてもエクソソーム数は増加しないことが明らかになった。^＊＊Ｐ＜０．０１（ｖｓ電圧０Ｖ）、＃Ｐ＜０．０５（ｖｓ電圧１５０Ｖ）、スチューデントｔ検定。転写されたｍＲＮＡを積載した細胞外小胞（ＥＶ）が、細胞ナノポレーション（ＣＮＰ）によって大量に生成することを示している。ＣＮＰ後のＥＶから収集したＥＶ－ｍＲＮＡのアガロースゲル分析。ＣＮＰ／ＰＢＳ：ＰＢＳ緩衝液のみでＣＮＰを行った後、１０^７ＭＥＦから回収した全ＲＮＡ；ＰＴＥＮｍＲＮＡ：２００ｎｇの合成ＰＴＥＮｍＲＮＡ；ＣＮＰ／ＰＴＥＮ：ＰＴＥＮベクターを用いてＣＮＰを行った後、１０^７ＭＥＦから回収した全ＲＮＡ（約１．０μｇ）。転写されたｍＲＮＡを積載した細胞外小胞（ＥＶ）が、細胞ナノポレーション（ＣＮＰ）によって大量に生成することを示している。Ａ、Ｂ、及びＭのｍＲＮＡをｑＰＣＲしたところ、ＣＮＰによって産生されたエクソソームは、他の方法と比較してはるかに多くの量で転写されたｍＲＮＡを含んでいたことが明らかとなった。全てのデータは独立した３回の実験に由来するものであり、平均値±ＳＥＭとして提示した。^＊Ｐ＜０．０５（ｖｓＢＥＰ）、スチューデントｔ検定（図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、及び図１Ｈ）。転写されたｍＲＮＡを積載した細胞外小胞（ＥＶ）が、細胞ナノポレーション（ＣＮＰ）によって大量に生成することを示している。ＣＮＰでトランスフェクションされたＭＥＦに由来するＥＶＡ、Ｂ、及びＭのｍＲＮＡをｑＰＣＲ（４時間ごとに培養液を交換して２４時間）したところ、最大の転写物では、ピーク濃度に達するまでに最も長い時間を要したことが示された。ＣＮＰから生成したエクソソームの特性を示している。ＣＮＰにより産生された小胞の粒度分布ＤＬＳ測定。ＣＮＰ群では７０～１１０ｎｍ付近にピークが認められ、ＣＮＰにより大量のエクソソームが産生されることが示された。上段：ＰＢＳ群、下段：ＣＮＰ群。ＣＮＰから生成したエクソソームの特性を示している。様々な圧力での遺伝子銃による、ＭＥＦ細胞当たりのエクソソーム数のＤＬＳ測定。結果から、遺伝子銃で使用される圧力の増加に伴い、ＥＶ数はわずかに増加することが明らかになった。データは独立した３回の実験に由来するものであり、平均値±ＳＥＭである。^＊Ｐ＜０．０５（ｖｓＰＢＳ）、スチューデントｔ検定。ＣＮＰから生成したエクソソームの特性を示している。ＰＢＳ、Ｌｉｐｏ、ＢＥＰ、ＣＮＰ、及びＣＮＰ／ＰＢＳ群を含む異なる処理群において、マウス間葉系幹細胞（ＭＳＣ）により産生される細胞当たりのＥＶ数。ＣＮＰから生成したエクソソームの特性を示している。ＰＢＳ、Ｌｉｐｏ、ＢＥＰ、ＣＮＰ、及びＣＮＰ／ＰＢＳ群を含む異なる処理群において、ヒト胚性腎臓２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）により産生される細胞当たりのＥＶ数。ＣＮＰから生成したエクソソームの特性を示している。異なるＣＮＰ実施温度でのＣＮＰ群における、ＭＥＦにより産生される細胞当たりのＥＶ数。ＣＮＰから生成したエクソソームの特性を示している。ＰＴＥＮベクターを用いた様々なトランスフェクション方法で産生されたＥＶ中のＰＴＥＮｍＲＮＡを、ｑＰＣＲで測定したところ、ＭＥＦにおいて、ＣＮＰにより産生されたＥＶは、他の方法よりもはるかに多くの量で転写されたＰＴＥＮｍＲＮＡを含んでいたことが示された。ＣＮＰから生成したエクソソームの特性を示している。ＰＴＥＮベクターを用いた様々なトランスフェクション方法で産生されたＥＶ中のＰＴＥＮｍＲＮＡを、ｑＰＣＲで測定したところ、ＢＭＤＣにおいて、ＣＮＰにより産生されたＥＶは、他の方法よりもはるかに多くの量で転写されたＰＴＥＮｍＲＮＡを含んでいたことが示された。ＣＮＰから生成したエクソソームの特性を示している。ｍｉＲ－１２８ベクターを用いた様々なトランスフェクション方法で産生されたＥＶ中のｍｉＲ－１２８レベルを、ｑＰＣＲで測定したところ、ＭＥＦにおいて、ＣＮＰにより産生されたＥＶは、他の方法よりもはるかに多くの量で転写されたｍｉＲ－１２８を含んでいたことが示された。ＣＮＰから生成したエクソソームの特性を示している。異なるトランスフェクション方法でＭＥＦから分泌された全小胞における、ｉｎｖｉｔｒｏタンパク質翻訳物のウェスタンブロットは、全小胞が、機能タンパク質へと翻訳されることができる転写されたｍＲＮＡを含有していたことを指し示している。エクソソームへのｍｉＲＮＡ積載効率についてのＣＮＰとＢＥＰとの比較を示す。超遠心分離法で収集したエクソソーム分画における、ＣＮＰにより産生された小胞粒度分布のＤＬＳ測定。エクソソームへのｍｉＲＮＡ積載効率についてのＣＮＰとＢＥＰとの比較を示す。超遠心分離法で収集したマイクロベシクル（ＭＶ）分画における、ＣＮＰにより産生された小胞粒度分布のＤＬＳ測定。エクソソームへのｍｉＲＮＡ積載効率についてのＣＮＰとＢＥＰとの比較を示す。ＣＮＰ及びＢＥＰ後のエクソソーム（ＣＤ６３－ＧＦＰ）において共存しているｍｉＲ－１２８のＴＬＮアッセイから得た代表的なＴＩＲＦ画像によって、ＣＮＰでは、ＢＥＰと比較してエクソソームへのｍｉＲＮＡ－１２８積載効率がより優れていたことが示された。エクソソームへのｍｉＲＮＡ積載効率についてのＣＮＰとＢＥＰとの比較を示す。ＣＮＰ及びＢＥＰ後のエクソソームにおけるｍｉＲ－１２８の共存百分率。１００枚の画像を統計解析に用いた。特に指示しない限り、データは独立した３回の実験に由来するものであり、平均値±ＳＥＭとして提示した。^＊Ｐ＜０．０５（ｖｓＣＮＰ）、スチューデントｔ検定（図３Ｄ、図３Ｅ、及び図３Ｆ）。エクソソームへのｍｉＲＮＡ積載効率についてのＣＮＰとＢＥＰとの比較を示す。ＣＮＰ群及びＢＥＰ群においてＴＬＮで測定したエクソソーム内のｍｉＲ－１２８蛍光強度。１００枚の画像を統計解析に用いた。特に指示しない限り、データは独立した３回の実験に由来するものであり、平均値±ＳＥＭとして提示した。^＊Ｐ＜０．０５（ｖｓＣＮＰ）、スチューデントｔ検定（図３Ｄ、図３Ｅ、及び図３Ｆ）。エクソソームへのｍｉＲＮＡ積載効率についてのＣＮＰとＢＥＰとの比較を示す。ＢＥＰの前後で相対的なエクソソーム数をＤＬＳ測定したところ、ＢＥＰにより５０％前後のエクソソームが破壊されたことが示された。特に指示しない限り、データは独立した３回の実験に由来するものであり、平均値±ＳＥＭとして提示した。^＊Ｐ＜０．０５（ｖｓＣＮＰ）、スチューデントｔ検定（図３Ｄ、図３Ｅ、及び図３Ｆ）。マイクロベシクル（ＭＶ）以外にエクソソームが、ＣＮＰ後に機能的な転写ｍＲＮＡを含有することを示す。同量（２０μｇタンパク質）のエクソソーム及びＭＶにおける、ウェスタンブロットによるエクソソームマーカー（ＣＤ９、ＣＤ６３、及びＴｓｇ１０１）ならびにＭＶマーカー（Ａｒｆ６）の検出。マイクロベシクル（ＭＶ）以外にエクソソームが、ＣＮＰ後に機能的な転写ｍＲＮＡを含有することを示す。ＣＮＰでトランスフェクションされた１０^８ＭＥＦに由来するエクソソーム内のＲＮＡ量対ＭＶ内のＲＮＡ量をＮａｎｏｄｒｏｐにより測定したところ、ＲＮＡの大部分はＭＶ内よりもエクソソーム内にあることが指し示された。^＊＊Ｐ＜０．０１（ｖｓエクソソーム）、スチューデントｔ検定（図４Ｂ及び図４Ｄ）。マイクロベシクル（ＭＶ）以外にエクソソームが、ＣＮＰ後に機能的な転写ｍＲＮＡを含有することを示す。ＰＢＳ群（ＰＢＳ）及びＣＮＰ群（ＣＮＰ）由来のエクソソームのクライオＴＥＭ画像では、これら２群から得られたエクソソームの外観に違いは見られなかったが、エクソソームの内部により多くのＲＮＡが含有されていた。マイクロベシクル（ＭＶ）以外にエクソソームが、ＣＮＰ後に機能的な転写ｍＲＮＡを含有することを示す。エクソソーム及びＭＶ由来のＡｓｃｌ１（Ａ）、Ｂｒｎ２（Ｂ）及びＭｙｔ１ｌ（Ｍ）のｍＲＮＡをｑＰＣＲしたところ、転写されたｍＲＮＡの大部分がエクソソームにあったことが示された。^＊＊Ｐ＜０．０１（ｖｓエクソソーム）、スチューデントｔ検定（図４Ｂ及び図４Ｄ）。マイクロベシクル（ＭＶ）以外にエクソソームが、ＣＮＰ後に機能的な転写ｍＲＮＡを含有することを示す。ＣＮＰでトランスフェクションされたＭＥＦにより分泌されたエクソソーム及びＭＶから抽出したｍＲＮＡに由来するｉｎｖｉｔｒｏタンパク質翻訳物。マイクロベシクル（ＭＶ）以外にエクソソームが、ＣＮＰ後に機能的な転写ｍＲＮＡを含有することを示す。テザードリポプレックスナノ粒子（ＴＬＮ）アッセイの方法を示す概略図。特定のモレキュラービーコン（ＭＢ）を含有するナノ粒子をカバーガラス上に固定し、エクソソームをナノ粒子で捕捉した。エクソソーム内のｍＲＮＡとナノ粒子内のＭＢとのハイブリダイゼーションにより蛍光が生じ、それを全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡で検出した。マイクロベシクル（ＭＶ）以外にエクソソームが、ＣＮＰ後に機能的な転写ｍＲＮＡを含有することを示す。ＣＮＰ群及びＳ－ＣＮＰ群におけるＴＬＮアッセイの代表的なＴＩＲＦ画像から、Ｓ－ＣＮＰにより、個々のエクソソームへの異なるｍＲＮＡの積載が最適化されたことが示された。ミディアムグレー（グリーン）ドット：Ａｓｃｌ１ｍＲＮＡ、ダークグレー（レッド）ドット：Ｂｒｎ２ｍＲＮＡ、ライトグレー（パープル）ドット：Ｍｙｔ１ｌｍＲＮＡ、ダークグレー（ピンク）矢印：１種のｍＲＮＡを有するエクソソーム、ライトグレー（ターコイズ）矢印：２種のｍＲＮＡを有するエクソソーム、ミディアムグレー（イエロー）矢印：３種のｍＲＮＡを有するエクソソーム。マイクロベシクル（ＭＶ）以外にエクソソームが、ＣＮＰ後に機能的な転写ｍＲＮＡを含有することを示す。ＣＮＰ群及びＳ－ＣＮＰ群における、異なるＲＮＡを有するエクソソームの百分率。各群において１００枚の画像を統計解析用に選択した。エクソソームへのｍＲＮＡ積載効率についてのＣＮＰとＢＥＰとの比較を示す。ＣＮＰ及びＢＥＰ後のエクソソーム（ＣＤ６３－ＧＦＰ）において共存しているＢｒｎ２ｍＲＮＡのＴＬＮアッセイから得た代表的なＴＩＲＦ画像により、ＣＮＰではＢＥＰよりもエクソソームへのｍＲＮＡ積載効率がはるかに高かったことが示された。エクソソームへのｍＲＮＡ積載効率についてのＣＮＰとＢＥＰとの比較を示す。ＣＮＰ及びＢＥＰ後のエクソソームにおけるＢｒｎ２ｍＲＮＡの共存百分率。１００枚の画像を統計解析に用いた。全てのデータは独立した３回の実験に由来するものであり、平均値±ＳＥＭとして提示した。^＊＊Ｐ＜０．０１（ｖｓＣＮＰ）、＃＃Ｐ＜０．０１（ｖｓＲＮａｓｅなしのＢＥＰ）、スチューデントｔ検定（図５Ｂ、図５Ｃ、及び図５Ｄ）。エクソソームへのｍＲＮＡ積載効率についてのＣＮＰとＢＥＰとの比較を示す。ＣＮＰ群及びＢＥＰ群においてＴＬＮで測定した際のＥＶ内のＢｒｎ２ｍＲＮＡ蛍光強度。１００枚の画像を統計解析に用いた。全てのデータは独立した３回の実験に由来するものであり、平均値±ＳＥＭとして提示した。^＊＊Ｐ＜０．０１（ｖｓＣＮＰ）、＃＃Ｐ＜０．０１（ｖｓＲＮａｓｅなしのＢＥＰ）、スチューデントｔ検定（図５Ｂ、図５Ｃ、及び図５Ｄ）。エクソソームへのｍＲＮＡ積載効率についてのＣＮＰとＢＥＰとの比較を示す。ＣＮＰでトランスフェクションされた１０^７ＭＥＦから分泌されたエクソソーム（ＣＮＰ）、ＣＮＰ／ＰＢＳでトランスフェクションされた１０^７ＭＥＦ由来のエクソソームを、ＣＮＰでトランスフェクションされた１０^７ＭＥＦ由来の遊離ＲＮＡと混合したもの（混合物）、バルクエレクトロポレーションに基づくＲＮＡ挿入後の混合物由来エクソソーム（ＲＮａｓｅなしのＢＥＰ）、及びエクソソームの外側表面に付着したＲＮＡ分子を除去するためにＲＮａｓｅ処理したＢＥＰ後の混合物由来エクソソーム（ＲＮａｓｅありのＢＥＰ）についてのｍｉＲ－１２８及びＢｒｎ２ｍＲＮＡ発現量ｑＰＣＲ（ＣＴ値）。全てのデータは独立した３回の実験に由来するものであり、平均値±ＳＥＭとして提示した。^＊＊Ｐ＜０．０１（ｖｓＣＮＰ）、＃＃Ｐ＜０．０１（ｖｓＲＮａｓｅなしのＢＥＰ）、スチューデントｔ検定（図５Ｂ、図５Ｃ、及び図５Ｄ）。ＣＮＰ誘導性エクソソーム分泌が、ＣＮＰ後のＣａ^２＋イオンの流入と関連していたことを示している。ＰＫＨ２６色素の赤色蛍光スポットで測定した際の、ＣＮＰ／ＰＢＳ刺激によるＭＥＦの細胞内小胞形成の増加を示す落射蛍光画像。ＣＮＰ誘導性エクソソーム分泌が、ＣＮＰ後のＣａ^２＋イオンの流入と関連していたことを示している。ＣＮＰ／ＰＢＳで穿孔されたＭＥＦ（ＣＮＰ）では、ＢＥＰと比較して、ＣＤ６３－ＧＦＰを含有する多胞体（ＭＶＢ）の形成が増加した。挿入画像：画像内でピークが明るいスポットを表し、ＭＶＢ形成が活発であったことを指し示す、３Ｄ強度プロファイル。ＣＮＰ誘導性エクソソーム分泌が、ＣＮＰ後のＣａ^２＋イオンの流入と関連していたことを示している。ＣＮＰ／ＰＢＳ刺激の有無により、異なる量のＭＶＢ及び腔内膜小胞（ＩＬＶ）を含有したＭＥＦの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像。ＣＮＰ誘導性エクソソーム分泌が、ＣＮＰ後のＣａ^２＋イオンの流入と関連していたことを示している。ＣＮＰ／ＰＢＳ刺激ありのＭＥＦまたは刺激なしのＭＥＦにおけるＭＶＢの定量化。ｎ＝２０のＴＥＭ画像。ＣＮＰ誘導性エクソソーム分泌が、ＣＮＰ後のＣａ^２＋イオンの流入と関連していたことを示している。ＣＮＰ／ＰＢＳ刺激ありのＭＥＦまたは刺激なしのＭＥＦにおけるＩＬＶの定量化。ｎ＝２０のＴＥＭ画像。ＣＮＰ誘導性エクソソーム分泌が、ＣＮＰ後のＣａ^２＋イオンの流入と関連していたことを示している。ウェスタンブロットにより、エクソソームの生合成に関係するタンパク質が、ＣＮＰ後に増加したことが示されている。ＣＮＰ誘導性エクソソーム分泌が、ＣＮＰ後のＣａ^２＋イオンの流入と関連していたことを示している。ＰＢＳ緩衝液中のＢＥＰ及びＣＮＰで穿孔されたＭＥＦにおける、膜孔を越えて拡散するヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の縦方向蛍光強度測定。細胞付着面でのＰＩ強度の急激な増加（挿入上部）は、一連の大型細孔の形成を指し示しているが、対向する細胞表面では、ＰＩの増加がはるかに遅かった（挿入下部）ことから、より小さい細孔が形成されたことが指し示された。ＢＥＰで穿孔されたＭＥＦでは、ＰＩ強度の中間的な増加が示された。ＣＮＰ誘導性エクソソーム分泌が、ＣＮＰ後のＣａ^２＋イオンの流入と関連していたことを示している。ＣＮＰ後の細胞の蛍光画像により、ＣＮＰ中に形成された膜孔がトランスフェクション後１～２分の間で閉じたことが指し示された。ＰＩはＣＮＰ後の必要とされる時点で細胞に適用した。ＣＮＰ誘導性エクソソーム分泌が、ＣＮＰ後のＣａ^２＋イオンの流入と関連していたことを示している。さらに、細胞の蛍光強度測定により、ＣＮＰ後２分以内に膜孔が閉じることを確認した。各群ともｎ＝２０の細胞。ＣＮＰ誘導性エクソソーム分泌が、ＣＮＰ後のＣａ^２＋イオンの流入と関連していたことを示している。ＣＮＰ後に様々なカルシウムイオン濃度でＭＥＦにより産生される、細胞当たりのエクソソーム数。ＣＮＰ誘導性エクソソーム分泌が、ＣＮＰ後のＣａ^２＋イオンの流入と関連していたことを示している。緩衝液中の様々なカルシウムイオン濃度における、ＣＮＰ後の細胞内カルシウムイオン濃度。ＣＮＰ誘導性エクソソーム分泌が、ＣＮＰ後のＣａ^２＋イオンの流入と関連していたことを示している。ＣＮＰ後の細胞内カルシウムイオン濃度とエクソソーム放出との相関性。ＣＮＰ誘導性エクソソーム分泌が、ＣＮＰ後のＣａ^２＋イオンの流入と関連していたことを示している。カルシウムキレート剤であるＥＧＴＡの存在下において、ＣＮＰ後に様々なカルシウムイオン濃度でＭＥＦにより産生される、細胞当たりのエクソソーム数。ＣＮＰ誘導性エクソソーム分泌が、ＣＮＰ後のＣａ^２＋イオンの流入と関連していたことを示している。ＥＧＴＡの存在下、緩衝液中の様々なカルシウムイオン濃度における、ＣＮＰ後の細胞内カルシウムイオン濃度。ＣＮＰ誘導性エクソソーム分泌が、ＣＮＰ後のＣａ^２＋イオンの流入と関連していたことを示している。ＥＧＴＡの存在下における、ＣＮＰ後の細胞内カルシウムイオン濃度とエクソソーム放出との相関性。ＣＮＰの熱効果により、ＨＳＰ－Ｐ５３－ＴＡＳＰ６シグナル伝達経路を通じてエクソソーム放出量が増加した。単一のナノチャネルにおける温度上昇シミュレーションの概略図。データは独立した３回の実験に由来するものであり、平均値±ＳＥＭとして提示した。ＣＮＰの熱効果により、ＨＳＰ－Ｐ５３－ＴＡＳＰ６シグナル伝達経路を通じてエクソソーム放出量が増加した。ナノチャネル内／近傍の５つの異なる位置を選択した。データは独立した３回の実験に由来するものであり、平均値±ＳＥＭとして提示した。ＣＮＰの熱効果により、ＨＳＰ－Ｐ５３－ＴＡＳＰ６シグナル伝達経路を通じてエクソソーム放出量が増加した。選択した５つの位置での温度変化をシミュレーションした。２００Ｖ及び１０ｍｓパルスにより、ナノチャネル出口に限局性の「ホットスポット」が作り出され、周囲温度から最大６０℃までのピーク温度が生じた。パルスがなくなるとすぐに、「ホットスポット」は急速に消滅することになる。データは独立した３回の実験に由来するものであり、平均値±ＳＥＭとして提示した。ＣＮＰの熱効果により、ＨＳＰ－Ｐ５３－ＴＡＳＰ６シグナル伝達経路を通じてエクソソーム放出量が増加した。ＣＮＰデバイス表面に付着しているＭＥＦのトップダウン画像。ＣＮＰ前（０ｓ）、ドットはナノチャネルの位置と室温を指し示している。ＣＮＰ電気パルス（ＣＮＰ）により、ナノチャネル／細胞表面の界面で温度が急激に上昇した。データは独立した３回の実験に由来するものであり、平均値±ＳＥＭとして提示した。ＣＮＰの熱効果により、ＨＳＰ－Ｐ５３－ＴＡＳＰ６シグナル伝達経路を通じてエクソソーム放出量が増加した。ナノチャネル断面図は、ＣＮＰパルス前（０ｓ）、ＣＮＰパルス中及びＣＮＰパルス後（１ｓ）のナノチャネル内の温度変化を示している。データは独立した３回の実験に由来するものであり、平均値±ＳＥＭとして提示した。ＣＮＰの熱効果により、ＨＳＰ－Ｐ５３－ＴＡＳＰ６シグナル伝達経路を通じてエクソソーム放出量が増加した。細胞－ナノチャネル界面で測定された温度は、一時的に（＜１ｓ）約６０℃まで上昇する。データは独立した３回の実験に由来するものであり、平均値±ＳＥＭとして提示した。ＣＮＰの熱効果により、ＨＳＰ－Ｐ５３－ＴＡＳＰ６シグナル伝達経路を通じてエクソソーム放出量が増加した。未処理（ＰＢＳ）及びＣＮＰ／ＰＢＳ刺激（ＣＮＰ）ＭＥＦに由来するＨＳＰ９０及びＨＳＰ７０のウェスタンブロット。データは独立した３回の実験に由来するものであり、平均値±ＳＥＭとして提示した。ＣＮＰの熱効果により、ＨＳＰ－Ｐ５３－ＴＡＳＰ６シグナル伝達経路を通じてエクソソーム放出量が増加した。ＨＳＰ阻害剤がある状態またはない状態でＣＮＰ刺激された１０^８ＭＥＦのエクソソーム濃度のＤＬＳ測定から、ＨＳＰ７０及びＨＳＰ９０が、エクソソームの産生に重大な意味を持つことが示されている。ＮＶＰ－ＨＳＰ９９０：ＨＳＰ９０阻害剤、ＶＥＲ１５５００８：ＨＳＰ７０阻害剤。^＊＊Ｐ＜０．０１（ｖｓＣＮＰ）、＃＃Ｐ＜０．０１（ｖｓ単一阻害剤群）、スチューデントｔ検定。データは独立した３回の実験に由来するものであり、平均値±ＳＥＭとして提示した。ＣＮＰの熱効果により、ＨＳＰ－Ｐ５３－ＴＡＳＰ６シグナル伝達経路を通じてエクソソーム放出量が増加した。ウェスタンブロットの結果、ＣＮＰにより、Ｐ５３ＷＴＭＥＦにおけるＰ５３及びＴＳＡＰ６タンパク質の発現は増加したが、ｐ５３－／－ＭＥＦにおけるＰ５３及びＴＳＡＰ６タンパク質の発現は影響されなかったことが示された。データは独立した３回の実験に由来するものであり、平均値±ＳＥＭとして提示した。ＣＮＰの熱効果により、ＨＳＰ－Ｐ５３－ＴＡＳＰ６シグナル伝達経路を通じてエクソソーム放出量が増加した。エクソソーム濃度のＤＬＳ測定からは、Ｐ５３ノックダウンにより、ＣＮＰ後のエクソソーム放出は、ある程度遮断され得ることが示された。＃＃Ｐ＜０．０１（ｖｓＣＮＰ－Ｐ５３＋／＋群）、スチューデントｔ検定。データは独立した３回の実験に由来するものであり、平均値±ＳＥＭとして提示した。ＣＮＰの熱効果により、ＨＳＰ－Ｐ５３－ＴＡＳＰ６シグナル伝達経路を通じてエクソソーム放出量が増加した。ＣＮＰでトランスフェクションされた細胞において、ＣＮＰがどのようにエクソソームの放出を引き起こすかについて提唱した機序を示す概略図。データは独立した３回の実験に由来するものであり、平均値±ＳＥＭとして提示した。遺伝子治療用のＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｔｒｏ試験及びマウスにおける免疫原性評価を示している。ＣＤ４７膜貫通タンパク質のＮ末端にクローニングされた神経膠芽腫（ＧＢＭ）ターゲティングペプチドの概略図。遺伝子治療用のＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｔｒｏ試験及びマウスにおける免疫原性評価を示している。エクソソームプルダウンアッセイのウェスタンブロットにより、ＦＬＡＧビーズがＮ末端にクローニングされたＦＬＡＧ－ＣＤ４７をプルダウンできたことが示され、ＣＤ４７のＮ末端はエクソソームの外側にあることが指し示された。遺伝子治療用のＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｔｒｏ試験及びマウスにおける免疫原性評価を示している。神経膠腫（ＧＬ２６１）細胞による、ＣＤ４７に連結された脳腫瘍ターゲティングペプチドで被覆されたＣＮＰ生成エクソソームの取り込みの増加。エクソソーム：被覆されていないエクソソーム。Ｅｘｏ－Ｔ：ＣＲＥＫＡ－ＣＤ４７ベクターでトランスフェクションされたＣＮＰ刺激ＢＭＤＣから生成されたエクソソーム。遺伝子治療用のＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｔｒｏ試験及びマウスにおける免疫原性評価を示している。ＧＬ２６１に取り込まれたＰＫＨ２６標識Ｅｘｏ－Ｔの蛍光強度は、フローサイトメトリーで評価し、Ｅｘｏ－ＴがＧＬ２６１細胞により良く取り込まれたことが指し示された。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１（ｖｓＰＢＳ）、＃＃Ｐ＜０．０１（ｖｓエクソソーム）。スチューデントｔ検定（図８Ｄ、図８Ｆ、及び図８Ｈ）。遺伝子治療用のＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｔｒｏ試験及びマウスにおける免疫原性評価を示している。ＰＢＳ、エクソソームまたはＥｘｏ－Ｔ処理の２４時間後のＧＬ２６１細胞におけるＰＴＥＮ染色の代表的な共焦点顕微鏡画像。遺伝子治療用のＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｔｒｏ試験及びマウスにおける免疫原性評価を示している。ＧＬ２６１をエクソソームと共にインキュベーションした２４時間後のＰＴＥＮ染色の蛍光強度をフローサイトメトリーで測定したところ、Ｅｘｏ－Ｔ群ではＰＴＥＮタンパク質の発現がより強力であったことが示された。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１（ｖｓＰＢＳ）、＃＃Ｐ＜０．０１（ｖｓエクソソーム）。スチューデントｔ検定（図８Ｄ、図８Ｆ、及び図８Ｈ）。遺伝子治療用のＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｔｒｏ試験及びマウスにおける免疫原性評価を示している。ＰＫＨ２６標識Ｅｘｏ－Ｔ小胞（レッド）と、異なるエンドサイトーシスマーカー（グリーン）との共局在を示す代表的な免疫染色画像。その結果、大部分のＥｘｏ－ＴはＡ４８８－Ｔｆと共局在しており、Ｅｘｏ－Ｔは主にクラスリン依存性エンドサイトーシスを通じて取り込まれたことが指し示された。Ａ４８８－Ｔｆ：クラスリン依存性エンドサイトーシスマーカー、Ａ４８８－ＣＴ－Ｂ：カベオラ依存性エンドサイトーシスマーカー、及びＦＩＴＣ－デキストラン：マクロピノサイトーシスマーカー。遺伝子治療用のＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｔｒｏ試験及びマウスにおける免疫原性評価を示している。異なる阻害条件下でのＧＬ２６１によるＰＫＨ２６標識Ｅｘｏ－Ｔの取り込みについてのフローサイトメトリーによる蛍光強度から、Ｅｘｏ－Ｔが主としてクラスリン依存性エンドサイトーシスを通じて取り込まれたことがさらに示された。スクロース：クラスリン依存性エンドサイトーシス阻害剤、フィリピン：カベオラ依存性エンドサイトーシス阻害剤、及びウォルチニン（Ｗｏｒｔｉｎｉｎ）：マクロピノサイトーシス阻害剤。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１（ｖｓＰＢＳ）、＃＃Ｐ＜０．０１（ｖｓエクソソーム）。スチューデントｔ検定（図８Ｄ、図８Ｆ、及び図８Ｈ）。遺伝子治療用のＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｔｒｏ試験及びマウスにおける免疫原性評価を示している。空のリポフェクタミン（Ｅ－Ｌｉｐｏ）、エクソソーム及びＥｘｏ－Ｔで処理したＧＬ２６１細胞の生存率により、Ｅｘｏ－Ｔの良好な生体適合性が指し示された。遺伝子治療用のＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｔｒｏ試験及びマウスにおける免疫原性評価を示している。ＰＴＥＮｍＲＮＡを含有するリポフェクタミン、エクソソーム及びＥｘｏ－Ｔで処理したＧＬ２６１細胞の生存率。遺伝子治療用のＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｔｒｏ試験及びマウスにおける免疫原性評価を示している。マウスに全身投与したＰＫＨ２６標識エクソソームの循環半減期。ＣＤ４７タンパク質の過剰発現により、エクソソームの循環半減期が大幅に延長され、ＣＲＥＫＡペプチドを挿入してもそれに影響しなかった。Ｅｘｏ－Ｃ：ＣＮＰ／ＣＤ４７ベクターでトランスフェクションしたＢＭＤＣ由来のエクソソーム。Ｅｘｏ－Ｔ：ＣＮＰ／ＣＲＥＫＡ－ＣＤ４７ベクターでトランスフェクションしたＢＭＤＣ由来のエクソソーム。挿入画像：ＣＲＥＫＡ－ＣＤ４７ベクターでトランスフェクションしたＢＭＤＣ由来のエクソソームにおけるＣＤ４７タンパク質の発現確認。遺伝子治療用のＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｔｒｏ試験及びマウスにおける免疫原性評価を示している。異なる用量のＣＲＥＫＡ－ＣＤ４７標的化エクソソーム（Ｅｘｏ－Ｔ）を投与してＥＬＩＳＡで測定したＡＳＴ、ＡＬＴ、クレアチニン、ＢＵＮ、ＩＬ６及びＴＮＦレベル。エクソソームをターゲットとするフローサイトメトリー解析のための例示的なゲーティングストラテジーを示している。Ｕ８７細胞における遺伝子治療用のＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｔｒｏ試験を示している。神経膠腫（Ｕ８７）細胞による、ＣＤ４７に連結された脳腫瘍ターゲティングペプチド（ＣＤＸ）で被覆されたＣＮＰ生成エクソソームの取り込みの増加。エクソソーム：被覆されていないエクソソーム。Ｅｘｏ－Ｔ：ＣＤＸ－ＣＤ４７ベクターでトランスフェクションされたＣＮＰ刺激ＭＥＦから生成されたエクソソーム。Ｕ８７細胞における遺伝子治療用のＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｔｒｏ試験を示している。Ｕ８７に取り込まれたＰＫＨ２６標識Ｅｘｏ－Ｔのフローサイトメトリーによる蛍光強度から、Ｅｘｏ－ＴがＵ８７細胞により良く取り込まれたことがさらに確認された。Ｕ８７細胞における遺伝子治療用のＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｔｒｏ試験を示している。ＰＢＳ、エクソソームまたはＥｘｏ－Ｔ処理の２４時間後のＵ８７細胞におけるＰＴＥＮ染色の代表的な共焦点顕微鏡画像。Ｕ８７細胞における遺伝子治療用のＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｔｒｏ試験を示している。Ｕ８７をエクソソームと共にインキュベーションした２４時間後のＰＴＥＮ染色のフローサイトメトリーによる蛍光強度から、Ｅｘｏ－Ｔ群ではＰＴＥＮタンパク質の発現がより強力であったことが示された。Ｕ８７細胞における遺伝子治療用のＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｔｒｏ試験を示している。ＰＫＨ２６標識Ｅｘｏ－Ｔ小胞（レッド）と、異なるエンドサイトーシスマーカー（グリーン）との共局在を示す代表的な免疫染色画像。その結果、大部分のＥｘｏ－ＴはＡ４８８－Ｔｆと共局在しており、Ｅｘｏ－Ｔは主にクラスリン依存性エンドサイトーシスを通じて取り込まれたことが指し示された。Ａ４８８－Ｔｆ：クラスリン依存性エンドサイトーシスマーカー、Ａ４８８－ＣＴ－Ｂ：カベオラ依存性エンドサイトーシスマーカー、及びＦＩＴＣ－デキストラン：マクロピノサイトーシスマーカー。Ｕ８７細胞における遺伝子治療用のＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｔｒｏ試験を示している。異なる阻害条件下でのＵ８７によるＰＫＨ２６標識Ｅｘｏ－Ｔの取り込みについてのフローサイトメトリーによる蛍光強度から、Ｅｘｏ－Ｔが主にクラスリン依存性エンドサイトーシスを通じて取り込まれたことがさらに確認された。スクロース：クラスリン依存性エンドサイトーシス阻害剤、フィリピン：カベオラ依存性エンドサイトーシス阻害剤、及びウォルチニン：マクロピノサイトーシス阻害剤。Ｕ８７細胞における遺伝子治療用のＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｔｒｏ試験を示している。空のリポフェクタミン（Ｅ－Ｌｉｐｏ）、エクソソーム及びＥｘｏ－Ｔで処理したＵ８７細胞の生存率により、Ｅｘｏ－Ｔの良好な生体適合性が指し示された。Ｕ８７細胞における遺伝子治療用のＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｔｒｏ試験を示している。ＰＴＥＮｍＲＮＡを含有するリポフェクタミン、エクソソーム及びＥｘｏ－Ｔで処理したＵ８７細胞の生存率。Ｕ８７細胞における遺伝子治療用のＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｔｒｏ試験を示している。異なるタイプのエクソソームを用いた、マウスにおける異なる時点でのＥＬＩＳＡで測定したＡＳＴ、ＡＬＴ、クレアチニン、ＢＵＮ、ＩＬ６及びＴＮＦレベル。その結果、マウスにおいて、Ｅｘｏ－Ｔには明らかなｉｎｖｉｖｏ毒性及び免疫原性がなかったことが示された。Ｕ８７同所性神経膠腫モデルにおけるＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｖｏ治療有効性を示している。特に指示しない限り、データは独立した３回の実験に由来するものであり、平均値±ＳＥＭとして提示した。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１（ｖｓＰＢＳ）、＃＃Ｐ＜０．０１（ｖｓエクソソーム群）、スチューデントｔ検定（図１１Ｃ、図１１Ｅ、図１１Ｇ、図１１Ｈ、図１１Ｊ、図１１Ｌ、及び図１１Ｍ）。Ｕ８７同所性神経膠腫モデルにおけるＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｖｏ治療有効性を示している。ヌードマウスに同所移植したＵ８７腫瘍内でのＰＫＨ－２６標識Ｅｘｏ－Ｔの選択的集積を示しているｉｎｖｉｖｏイメージング。Ｕ８７同所性神経膠腫モデルにおけるＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｖｏ治療有効性を示している。ヌードマウスに同所移植したＵ８７腫瘍内でのＰＫＨ－２６標識Ｅｘｏ－Ｔの選択的集積を示しているｉｎｖｉｖｏイメージング。生体蛍光顕微鏡によって、脳腫瘍へのＥｘｏ－Ｔの標的化送達も確認され、それによると、被覆されていないエクソソーム（エクソソーム）またはＴｕｒｂｏＦｅｃｔナノ粒子（Ｔｕｒｂｏ）と比較して、腫瘍間質内でのＥｘｏ－Ｔの集積が有意に増加したことが示された。Ｕ８７同所性神経膠腫モデルにおけるＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｖｏ治療有効性を示している。様々な時点での腫瘍部位におけるエクソソーム強度の定量化。１群当たりマウス３匹で、１匹当たり１０枚の画像。特に指示しない限り、データは独立した３回の実験に由来するものであり、平均値±ＳＥＭとして提示した。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１（ｖｓＰＢＳ）、＃＃Ｐ＜０．０１（ｖｓエクソソーム群）、スチューデントｔ検定（図１１Ｃ、図１１Ｅ、図１１Ｇ、図１１Ｈ、図１１Ｊ、図１１Ｌ、及び図１１Ｍ）。Ｕ８７同所性神経膠腫モデルにおけるＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｖｏ治療有効性を示している。組織分布分析により、Ｅｘｏ－Ｔは肝臓及び脾臓への集積が少なく、脳へのターゲティングが向上したことが示された。Ｕ８７同所性神経膠腫モデルにおけるＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｖｏ治療有効性を示している。組織分布分析により、Ｅｘｏ－Ｔは肝臓及び脾臓への集積が少なく、脳へのターゲティングが向上したことが示された。特に指示しない限り、データは独立した３回の実験に由来するものであり、平均値±ＳＥＭとして提示した。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１（ｖｓＰＢＳ）、＃＃Ｐ＜０．０１（ｖｓエクソソーム群）、スチューデントｔ検定（図１１Ｃ、図１１Ｅ、図１１Ｇ、図１１Ｈ、図１１Ｊ、図１１Ｌ、及び図１１Ｍ）。Ｕ８７同所性神経膠腫モデルにおけるＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｖｏ治療有効性を示している。尾静脈注射を介したＰＢＳ、ＰＴＥＮｍＲＮＡ含有エクソソーム（エクソソーム）、Ｅｘｏ－Ｔ、空のＥｘｏ－Ｔ（Ｅ－Ｅｘｏ－Ｔ）、またはＴｕｒｂｏＦｅｃｔナノ粒子（Ｔｕｒｂｏ）処理による腫瘍成長阻害。群当たりｎ＝３のマウス。Ｕ８７同所性神経膠腫モデルにおけるＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｖｏ治療有効性を示している。尾静脈注射を介したＰＢＳ、ＰＴＥＮｍＲＮＡ含有エクソソーム（エクソソーム）、Ｅｘｏ－Ｔ、空のＥｘｏ－Ｔ（Ｅ－Ｅｘｏ－Ｔ）、またはＴｕｒｂｏＦｅｃｔナノ粒子（Ｔｕｒｂｏ）処理による腫瘍成長阻害。群当たりｎ＝３のマウス。特に指示しない限り、データは独立した３回の実験に由来するものであり、平均値±ＳＥＭとして提示した。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１（ｖｓＰＢＳ）、＃＃Ｐ＜０．０１（ｖｓエクソソーム群）、スチューデントｔ検定（図１１Ｃ、図１１Ｅ、図１１Ｇ、図１１Ｈ、図１１Ｊ、図１１Ｌ、及び図１１Ｍ）。Ｕ８７同所性神経膠腫モデルにおけるＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｖｏ治療有効性を示している。ＰＴＥＮｍＲＮＡＥｘｏ－Ｔでは、Ｕ８７神経膠腫を有するマウスの生存時間が延長した（ｐ＜０．００１、ボンフェローニ補正後のログランク検定）。群当たりｎ＝８マウス。特に指示しない限り、データは独立した３回の実験に由来するものであり、平均値±ＳＥＭとして提示した。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１（ｖｓＰＢＳ）、＃＃Ｐ＜０．０１（ｖｓエクソソーム群）、スチューデントｔ検定（図１１Ｃ、図１１Ｅ、図１１Ｇ、図１１Ｈ、図１１Ｊ、図１１Ｌ、及び図１１Ｍ）。Ｕ８７同所性神経膠腫モデルにおけるＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｖｏ治療有効性を示している。ＧＢＭ腫瘍における、ＰＴＥＮタンパク質レベルについてのウェスタンブロットにより、ＰＴＥＮ欠損Ｕ８７ＧＢＭ腫瘍において、ＰＴＥＮタンパク質発現の回復が指し示された。群当たりｎ＝３マウス。Ｕ８７同所性神経膠腫モデルにおけるＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｖｏ治療有効性を示している。ＧＢＭ腫瘍における、ｍＲＮＡレベルについてのｑＰＣＲにより、ＰＴＥＮ欠損Ｕ８７ＧＢＭ腫瘍において、ｍＲＮＡ発現の回復が指し示された。群当たりｎ＝３マウス。特に指示しない限り、データは独立した３回の実験に由来するものであり、平均値±ＳＥＭとして提示した。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１（ｖｓＰＢＳ）、＃＃Ｐ＜０．０１（ｖｓエクソソーム群）、スチューデントｔ検定（図１１Ｃ、図１１Ｅ、図１１Ｇ、図１１Ｈ、図１１Ｊ、図１１Ｌ、及び図１１Ｍ）。Ｕ８７同所性神経膠腫モデルにおけるＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｖｏ治療有効性を示している。異なる処理をした残存ＧＢＭ腫瘍組織のＰＴＥＮ、Ｋｉ６７及びＨ＆Ｅ染色により、Ｅｘｏ－ＴがＰＴＥＮ発現を回復させ、腫瘍組織の細胞増殖を阻害したことが示された。Ｕ８７同所性神経膠腫モデルにおけるＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｖｏ治療有効性を示している。ＩｍａｇｅＪソフトウェアによるＩＨＣ画像のＫｉ６７強度測定。特に指示しない限り、データは独立した３回の実験に由来するものであり、平均値±ＳＥＭとして提示した。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１（ｖｓＰＢＳ）、＃＃Ｐ＜０．０１（ｖｓエクソソーム群）、スチューデントｔ検定（図１１Ｃ、図１１Ｅ、図１１Ｇ、図１１Ｈ、図１１Ｊ、図１１Ｌ、及び図１１Ｍ）。Ｕ８７同所性神経膠腫モデルにおけるＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｖｏ治療有効性を示している。ＩｍａｇｅＪソフトウェアによるＩＨＣ画像のＰＴＥＮ強度測定。特に指示しない限り、データは独立した３回の実験に由来するものであり、平均値±ＳＥＭとして提示した。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１（ｖｓＰＢＳ）、＃＃Ｐ＜０．０１（ｖｓエクソソーム群）、スチューデントｔ検定（図１１Ｃ、図１１Ｅ、図１１Ｇ、図１１Ｈ、図１１Ｊ、図１１Ｌ、及び図１１Ｍ）。腫瘍間質内でのＥｘｏ－Ｔのｉｎｖｉｖｏ生体内分布を示している。ＰＫＨ２６で標識された異なるナノキャリアを投与した後の様々な時点でのマウスＧＢＭ腫瘍間質における代表的な生体蛍光画像により、Ｅｘｏ－ＴのＧＢＭ腫瘍への集積は、他の処理と比較して、より優れていたことが示された。各群ともｎ＝３のマウス。腫瘍間質内でのＥｘｏ－Ｔのｉｎｖｉｖｏ生体内分布を示している。全体画像からセグメンテーションしたＰＫＨ２６結合エクソソーム。Ｕ８７同所性神経膠腫モデルにおける異なる組織の免疫組織化学染色を示している。Ｕ８７同所性神経膠腫モデルにおける異なる組織の免疫組織化学染色を示している。異なる処理をした正常な脳組織のＰＴＥＮ、Ｋｉ６７及びＨ＆Ｅ染色では、正常な脳組織に対して直接的な効果を及ぼさなかったことが示された。Ｕ８７同所性神経膠腫モデルにおける異なる組織の免疫組織化学染色を示している。異なる処理をした心臓組織のＰＴＥＮ及びＨ＆Ｅ染色により、Ｅｘｏ－Ｔは、調査した組織に対して効果を及ぼさなかったことが示された。倍率：×４００。Ｕ８７同所性神経膠腫モデルにおける異なる組織の免疫組織化学染色を示している。異なる処理をした肝臓組織のＰＴＥＮ及びＨ＆Ｅ染色により、Ｅｘｏ－Ｔは、調査した組織に対して効果を及ぼさなかったことが示された。倍率：×４００。Ｕ８７同所性神経膠腫モデルにおける異なる組織の免疫組織化学染色を示している。異なる処理をした脾臓組織のＰＴＥＮ及びＨ＆Ｅ染色により、Ｅｘｏ－Ｔは、調査した組織に対して効果を及ぼさなかったことが示された。倍率：×４００。Ｕ８７同所性神経膠腫モデルにおける異なる組織の免疫組織化学染色を示している。異なる処理をした肺組織のＰＴＥＮ及びＨ＆Ｅ染色により、Ｅｘｏ－Ｔは、調査した組織に対して効果を及ぼさなかったことが示された。倍率：×４００。Ｕ８７同所性神経膠腫モデルにおける異なる組織の免疫組織化学染色を示している。異なる処理をした腎臓組織のＰＴＥＮ及びＨ＆Ｅ染色により、Ｅｘｏ－Ｔは、調査した組織に対して効果を及ぼさなかったことが示された。倍率：×４００。Ｕ８７同所性神経膠腫モデルにおける異なる組織の免疫組織化学染色を示している。ＩｍａｇｅＪソフトウェアによるＩＨＣ画像のＫｉ６７強度測定。Ｕ８７同所性神経膠腫モデルにおける異なる組織の免疫組織化学染色を示している。ＩｍａｇｅＪソフトウェアによるＩＨＣ画像のＰＴＥＮ強度測定。Ｕ８７同所性神経膠腫モデルにおける異なる組織の免疫組織化学染色を示している。ＩｍａｇｅＪソフトウェアによるＩＨＣ画像のＰＴＥＮ強度測定。Ｕ８７同所性神経膠腫モデルにおける異なる組織の免疫組織化学染色を示している。ＩｍａｇｅＪソフトウェアによるＩＨＣ画像のＰＴＥＮ強度測定。Ｕ８７同所性神経膠腫モデルにおける異なる組織の免疫組織化学染色を示している。ＩｍａｇｅＪソフトウェアによるＩＨＣ画像のＰＴＥＮ強度測定。Ｕ８７同所性神経膠腫モデルにおける異なる組織の免疫組織化学染色を示している。ＩｍａｇｅＪソフトウェアによるＩＨＣ画像のＰＴＥＮ強度測定。Ｕ８７同所性神経膠腫モデルにおける異なる組織の免疫組織化学染色を示している。ＩｍａｇｅＪソフトウェアによるＩＨＣ画像のＰＴＥＮ強度測定。ＧＬ２６１同所性神経膠腫モデルにおけるＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｖｏ治療有効性を示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに同所移植したＧＬ２６１腫瘍内でのＰＫＨ－２６標識Ｅｘｏ－Ｔの選択的集積を示しているｉｎｖｉｖｏイメージング。ＧＬ２６１同所性神経膠腫モデルにおけるＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｖｏ治療有効性を示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに同所移植したＧＬ２６１腫瘍内でのＰＫＨ－２６標識Ｅｘｏ－Ｔの選択的集積を示しているｉｎｖｉｖｏイメージング。生体蛍光顕微鏡によって、脳腫瘍へのＥｘｏ－Ｔの標的化送達も確認され、それによると、被覆されていないエクソソーム（エクソソーム）またはＰＥＧ－リポソームナノ粒子（リポソーム）と比較して、腫瘍間質内でのＥｘｏ－Ｔの集積が有意に増加したことが示された。ＧＬ２６１同所性神経膠腫モデルにおけるＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｖｏ治療有効性を示している。様々な時点での腫瘍部位におけるエクソソーム強度の定量化。特に指示しない限り、データは独立した３回の実験に由来するものであり、平均値±ＳＥＭとして提示した。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１（ｖｓＰＢＳ）、＃＃Ｐ＜０．０１（ｖｓエクソソーム群）、スチューデントｔ検定（図１４Ｃ、図１４Ｆ、図１４Ｈ、図１４Ｉ、図１４Ｋ、図１４Ｍ、及び図１４Ｎ）。ＧＬ２６１同所性神経膠腫モデルにおけるＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｖｏ治療有効性を示している。正常組織領域及び腫瘍領域におけるＰＢＳ（上段）及びＰＫＨ２６結合Ｅｘｏ－Ｔ（下段）の分布、スケールバー：５００μｍ。ＧＬ２６１同所性神経膠腫モデルにおけるＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｖｏ治療有効性を示している。組織分布分析により、Ｅｘｏ－Ｔは肝臓及び脾臓への集積が少なく、脳へのターゲティングが向上したことが示された。ＧＬ２６１同所性神経膠腫モデルにおけるＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｖｏ治療有効性を示している。組織分布分析により、Ｅｘｏ－Ｔは肝臓及び脾臓への集積が少なく、脳へのターゲティングが向上したことが示された。特に指示しない限り、データは独立した３回の実験に由来するものであり、平均値±ＳＥＭとして提示した。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１（ｖｓＰＢＳ）、＃＃Ｐ＜０．０１（ｖｓエクソソーム群）、スチューデントｔ検定（図１４Ｃ、図１４Ｆ、図１４Ｈ、図１４Ｉ、図１４Ｋ、図１４Ｍ、及び図１４Ｎ）。ＧＬ２６１同所性神経膠腫モデルにおけるＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｖｏ治療有効性を示している。尾静脈注射を介したＰＢＳ、ＰＴＥＮｍＲＮＡ含有エクソソーム（エクソソーム）、Ｅｘｏ－Ｔ、空のＥｘｏ－Ｔ（Ｅ－Ｅｘｏ－Ｔ）、またはＰＥＧ－リポソームナノ粒子（リポソーム）処理による腫瘍成長阻害。群当たりｎ＝３のマウス。ＧＬ２６１同所性神経膠腫モデルにおけるＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｖｏ治療有効性を示している。尾静脈注射を介したＰＢＳ、ＰＴＥＮｍＲＮＡ含有エクソソーム（エクソソーム）、Ｅｘｏ－Ｔ、空のＥｘｏ－Ｔ（Ｅ－Ｅｘｏ－Ｔ）、またはＰＥＧ－リポソームナノ粒子（リポソーム）処理による腫瘍成長阻害。群当たりｎ＝３のマウス。特に指示しない限り、データは独立した３回の実験に由来するものであり、平均値±ＳＥＭとして提示した。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１（ｖｓＰＢＳ）、＃＃Ｐ＜０．０１（ｖｓエクソソーム群）、スチューデントｔ検定（図１４Ｃ、図１４Ｆ、図１４Ｈ、図１４Ｉ、図１４Ｋ、図１４Ｍ、及び図１４Ｎ）。ＧＬ２６１同所性神経膠腫モデルにおけるＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｖｏ治療有効性を示している。ＰＴＥＮｍＲＮＡＥｘｏ－Ｔでは、ＧＬ２６１神経膠腫を有するマウスの生存時間が延長した（ｐ＜０．００１、ボンフェローニ補正後のログランク検定）。特に指示しない限り、データは独立した３回の実験に由来するものであり、平均値±ＳＥＭとして提示した。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１（ｖｓＰＢＳ）、＃＃Ｐ＜０．０１（ｖｓエクソソーム群）、スチューデントｔ検定（図１４Ｃ、図１４Ｆ、図１４Ｈ、図１４Ｉ、図１４Ｋ、図１４Ｍ、及び図１４Ｎ）。ＧＬ２６１同所性神経膠腫モデルにおけるＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｖｏ治療有効性を示している。ＧＢＭ腫瘍における、ＰＴＥＮタンパク質レベルについてのウェスタンブロットにより、ＰＴＥＮ欠損ＧＬ２６１ＧＢＭ腫瘍において、ＰＴＥＮタンパク質発現が回復していることが示された。群当たりｎ＝３のマウス。ＧＬ２６１同所性神経膠腫モデルにおけるＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｖｏ治療有効性を示している。ＧＢＭ腫瘍における、ｍＲＮＡレベルについてのｑＰＣＲにより、ＰＴＥＮ欠損ＧＬ２６１ＧＢＭ腫瘍において、ｍＲＮＡ発現が回復していることが示された。群当たりｎ＝３のマウス。特に指示しない限り、データは独立した３回の実験に由来するものであり、平均値±ＳＥＭとして提示した。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１（ｖｓＰＢＳ）、＃＃Ｐ＜０．０１（ｖｓエクソソーム群）、スチューデントｔ検定（図１４Ｃ、図１４Ｆ、図１４Ｈ、図１４Ｉ、図１４Ｋ、図１４Ｍ、及び図１４Ｎ）。ＧＬ２６１同所性神経膠腫モデルにおけるＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｖｏ治療有効性を示している。異なる処理をした残存ＧＢＭ腫瘍組織のＰＴＥＮ、Ｋｉ６７及びＨ＆Ｅ染色により、Ｅｘｏ－ＴがＰＴＥＮ発現を回復させ、腫瘍組織の細胞増殖を阻害したことが示された。ＧＬ２６１同所性神経膠腫モデルにおけるＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｖｏ治療有効性を示している。ＩｍａｇｅＪソフトウェアによるＩＨＣ画像のＫｉ６７強度測定。特に指示しない限り、データは独立した３回の実験に由来するものであり、平均値±ＳＥＭとして提示した。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１（ｖｓＰＢＳ）、＃＃Ｐ＜０．０１（ｖｓエクソソーム群）、スチューデントｔ検定（図１４Ｃ、図１４Ｆ、図１４Ｈ、図１４Ｉ、図１４Ｋ、図１４Ｍ、及び図１４Ｎ）。ＧＬ２６１同所性神経膠腫モデルにおけるＣＮＰ生成エクソソームのｉｎｖｉｖｏ治療有効性を示している。ＩｍａｇｅＪソフトウェアによるＩＨＣ画像のＰＴＥＮ強度測定。特に指示しない限り、データは独立した３回の実験に由来するものであり、平均値±ＳＥＭとして提示した。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１（ｖｓＰＢＳ）、＃＃Ｐ＜０．０１（ｖｓエクソソーム群）、スチューデントｔ検定（図１４Ｃ、図１４Ｆ、図１４Ｈ、図１４Ｉ、図１４Ｋ、図１４Ｍ、及び図１４Ｎ）。ＧＬ２６１同所性神経膠腫モデルにおける異なる組織の免疫組織化学染色を示している。ＧＬ２６１同所性神経膠腫モデルにおける異なる組織の免疫組織化学染色を示している。異なる処理をした正常な脳組織のＰＴＥＮ、Ｋｉ６７及びＨ＆Ｅ染色では、正常な脳組織に対して直接的な効果を及ぼさなかったことが示された。ＧＬ２６１同所性神経膠腫モデルにおける異なる組織の免疫組織化学染色を示している。異なる処理をした心臓組織のＰＴＥＮ及びＨ＆Ｅ染色により、Ｅｘｏ－Ｔは、調査した組織に対して効果を及ぼさなかったことが示された。倍率：×４００。ＧＬ２６１同所性神経膠腫モデルにおける異なる組織の免疫組織化学染色を示している。異なる処理をした肝臓組織のＰＴＥＮ及びＨ＆Ｅ染色により、Ｅｘｏ－Ｔは、調査した組織に対して効果を及ぼさなかったことが示された。倍率：×４００。ＧＬ２６１同所性神経膠腫モデルにおける異なる組織の免疫組織化学染色を示している。異なる処理をした脾臓組織のＰＴＥＮ及びＨ＆Ｅ染色により、Ｅｘｏ－Ｔは、調査した組織に対して効果を及ぼさなかったことが示された。倍率：×１００。ＧＬ２６１同所性神経膠腫モデルにおける異なる組織の免疫組織化学染色を示している。異なる処理をした肺組織のＰＴＥＮ及びＨ＆Ｅ染色により、Ｅｘｏ－Ｔは、調査した組織に対して効果を及ぼさなかったことが示された。倍率：×４００。ＧＬ２６１同所性神経膠腫モデルにおける異なる組織の免疫組織化学染色を示している。異なる処理をした腎臓組織のＰＴＥＮ及びＨ＆Ｅ染色により、Ｅｘｏ－Ｔは、調査した組織に対して効果を及ぼさなかったことが示された。倍率：×４００。ＧＬ２６１同所性神経膠腫モデルにおける異なる組織の免疫組織化学染色を示している。ＩｍａｇｅＪソフトウェアによるＩＨＣ画像のＫｉ６７強度測定。ＧＬ２６１同所性神経膠腫モデルにおける異なる組織の免疫組織化学染色を示している。ＩｍａｇｅＪソフトウェアによるＩＨＣ画像のＰＴＥＮ強度測定。ＧＬ２６１同所性神経膠腫モデルにおける異なる組織の免疫組織化学染色を示している。ＩｍａｇｅＪソフトウェアによるＩＨＣ画像のＰＴＥＮ強度測定。ＧＬ２６１同所性神経膠腫モデルにおける異なる組織の免疫組織化学染色を示している。ＩｍａｇｅＪソフトウェアによるＩＨＣ画像のＰＴＥＮ強度測定。ＧＬ２６１同所性神経膠腫モデルにおける異なる組織の免疫組織化学染色を示している。ＩｍａｇｅＪソフトウェアによるＩＨＣ画像のＰＴＥＮ強度測定。ＧＬ２６１同所性神経膠腫モデルにおける異なる組織の免疫組織化学染色を示している。ＩｍａｇｅＪソフトウェアによるＩＨＣ画像のＰＴＥＮ強度測定。ＧＬ２６１同所性神経膠腫モデルにおける異なる組織の免疫組織化学染色を示している。ＩｍａｇｅＪソフトウェアによるＩＨＣ画像のＰＴＥＮ強度測定。

本開示の好ましい実施形態が、本明細書に示され、記載されているが、このような実施形態がほんの一例として提供されるものであることは当業者には明らかであろう。多数の変形、変更、及び置換が、本開示から逸脱することなく、当業者によって想到されることとなる。本明細書に記載される本開示の実施形態の様々な代案が、本開示の実施において利用され得ることを理解されたい。特許請求の範囲は本開示の範囲を定義するものであり、この特許請求の範囲内の方法及び構造ならびにそれらの均等物は、それによって網羅されることが意図される。

絶対的または経時的な用語、例えば、「するであろう（ｗｉｌｌ）」、「しないであろう（ｗｉｌｌｎｏｔ）」、「するものとする（ｓｈａｌｌ）」、「してはならない（ｓｈａｌｌｎｏｔ）」、「しなければならない（ｍｕｓｔ）」、「してはいけない（ｍｕｓｔｎｏｔ）」、「第一に（ｆｉｒｓｔ）」、「最初に（ｉｎｉｔｉａｌｌｙ）」、「次に（ｎｅｘｔ）」、「続いて（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ）」、「前に（ｂｅｆｏｒｅ）」、「後に（ａｆｔｅｒ）」、「最後に（ｌａｓｔｌｙ）」、及び「最終的に（ｆｉｎａｌｌｙ）」の使用は、本明細書に開示される本実施形態の範囲の限定を意味するものではなく、模範的なものである。

本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないと明確に指し示さない限り、複数形を同様に含むように意図される。さらに、用語「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「伴う（ｗｉｔｈ）」またはそれらの変形は、発明を実施するための形態及び／または特許請求の範囲のいずれかで使用される限りにおいて、このような用語は、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同様の様式で包括的であるように意図される。

本明細書で使用される場合、語句「少なくとも１つ」、「１つまたは複数」、及び「及び／または」は、使用中、接続的かつ離接的である非制限的表現である。例えば、「Ａ、Ｂ及びＣのうちの少なくとも１つ」、「Ａ、ＢまたはＣのうちの少なくとも１つ」、「Ａ、Ｂ及びＣのうちの１つまたは複数」、「Ａ、ＢまたはＣのうちの１つまたは複数」及び「Ａ、Ｂ及び／またはＣ」という表現の各々は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢともに、ＡとＣともに、ＢとＣともに、または、ＡとＢとＣともに、を意味する。

本明細書で使用される場合、「または」は、「及び」、「または」、または「及び／または」を指し得、排他的かつ包括的に使用され得る。例えば、用語「ＡまたはＢ」は、「ＡまたはＢ」、「ＢではなくＡ」、「ＡではなくＢ」、及び「Ａ及びＢ」を指し得る。場合によっては、文脈により特定の意味が定まり得る。

本明細書に記載されるいかなるシステム、方法、ソフトウェア、及びプラットフォームも、モジュール方式であり、順次工程に限定されない。したがって、「第１」及び「第２」等の用語は、必ずしも優先順位、重要性の順序、または行為の順序を含意するものではない。

本明細書で使用される場合、用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、数値または数値範囲に言及する際、言及される数値または数値範囲が、実験的な変動の範囲内（または統計的実験誤差以内）の近似であり、その数値または数値範囲が、記載の数値または数値範囲の例えば１％～１５％で変動し得ることを意味する。文脈により特に指示がない限り、用語「約」は、記載の数値または値の±１０％を指す。

用語「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、当業者によって決定されるような特定の値の許容可能な誤差範囲内であることを意味し、このことは、その値がどのように測定または決定されるかに、例えば、測定システムの制限に部分的に依存している。例えば、「およそ」とは、所与の値において、慣行に従って１以内または１より大きい標準偏差を意味することがある。特定の値が本出願及び特許請求の範囲に記載されている場合、特に指示しない限り、用語「およそ」は、特定の値の許容可能な誤差範囲を意味すると仮定されるものとする。

本明細書において、用語「増加した」、「増加する」または「増加」は、統計学的に有意な量の増加を一般的に意味するように使用される。場合によっては、用語「増加した」、または「増加」は、基準レベルと比較して少なくとも１０％の増加、例えば、基準レベル、標準、または対照と比較して少なくとも約１０％、もしくは少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％の増加、もしくは１００％を含む最大の増加、または１０～１００％の間の任意の増加を意味する。「増加」の他の例としては、基準レベルと比較して少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍またはそれ以上の増加が挙げられる。

本明細書において、用語「減少した」、「減少する」、または「減少」は、統計学的に有意な量の減少を一般的に意味するように使用される。場合によっては、用語「減少した」、または「減少」は、基準レベルと比較して少なくとも１０％の低下、例えば、基準レベルと比較して少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％の減少、もしくは１００％を含む最大の減少（例えば、基準レベルと比較してレベルが非存在または検出不可能）、または１０～１００％の間の任意の減少を意味する。マーカーまたは症状に関して、これらの用語が意味するのは、かかるレベルの統計学的に有意な減少である。例えば、減少は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％またはそれ以上であり得、好ましくは、所与の疾患を有しない個人にとって正常範囲内として受容されるレベルまで下がる。

用語「患者」または「対象」は、本明細書において互換的に使用され、哺乳類を包含する。哺乳類の非限定的な例としては、哺乳類クラスのいずれかのメンバー：ヒト、チンパンジー等の非ヒト霊長類、ならびに他の類人猿及びサル種；ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の家畜；ウサギ、イヌ、及びネコ等の飼育動物；ラット、マウス及びモルモット等のげっ歯類を含む実験動物、などが挙げられる。

本明細書で使用される場合、「細胞」は一般に、生物学的細胞を指す。細胞は、生体の基本構造的、機能的及び／または生物学的な単位である。細胞は、１つまたは複数の細胞を有する任意の生命体を起源とし得る。いくつかの非限定的な例としては、原核細胞、真核細胞、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、原虫細胞、植物由来の細胞、真菌細胞（例えば、酵母細胞、キノコ由来の細胞）、動物細胞、無脊椎動物（例えば、ミバエ、刺胞動物、棘皮動物、線虫など）由来の細胞、脊椎動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類）由来の細胞、または哺乳類（例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯類、ラット、マウス、非ヒト霊長類、ヒトなど）由来の細胞が挙げられる。時には、細胞は天然の生命体を起源としない（例えば、細胞は、合成して作製され、人工細胞と呼ばれることがある）。場合によっては、細胞は初代細胞である。場合によっては、細胞は細胞株に由来する細胞である。

本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド」は、一般に塩基－糖－リン酸の組み合わせを指す。ヌクレオチドは、合成ヌクレオチドを含む。ヌクレオチドは、合成ヌクレオチドアナログを含む。ヌクレオチドは、核酸配列（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ））のモノマー単位である。用語ヌクレオチドには、リボヌクレオシド三リン酸のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シトシン三リン酸（ＣＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、及びデオキシリボヌクレオシド三リン酸のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、またはそれらの誘導体等が含まれ得る。このような誘導体としては、例えば、［αＳ］ｄＡＴＰ、７－デアザ－ｄＧＴＰ及び７－デアザ－ｄＡＴＰ、ならびにそれらを含有する核酸分子にヌクレアーゼ耐性を付与するヌクレオチド誘導体を挙げることができる。本明細書で使用される場合、用語ヌクレオチドは、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）及びその誘導体を指し得る。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の実例としては、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、及びｄｄＴＴＰを挙げることができるが、これらに限定されない。

用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、及び「核酸」は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらのアナログのいずれかであり、一本鎖、二本鎖、または多重鎖形態のいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指すために、互換的に使用される。場合によっては、ポリヌクレオチドは外因性である（例えば、異種ポリヌクレオチド）。場合によっては、ポリヌクレオチドは細胞内因性である。場合によっては、ポリヌクレオチドはセルフリー環境で存在し得る。場合によっては、ポリヌクレオチドは遺伝子またはその断片である。場合によっては、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。場合によっては、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、公知または未知の任意の機能を果たし得る。場合によっては、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のアナログ（例えば、変更されたバックボーン、糖、または核酸塩基）を含む。ヌクレオチド構造を修飾する場合、ポリマー構築の前後において施してもよい。アナログのいくつかの非限定的な例としては、５－ブロモウラシル、ペプチド核酸、異種核酸、モルフォリノ、固定化核酸、グリコール核酸、トレオース核酸、ジデオキシヌクレオチド、コルジセピン７－デアザ－ＧＴＰ、フルオロフォア（例えば、糖に連結されるローダミンまたはフルオレセイン）、チオール含有ヌクレオチド、ビオチン連結ヌクレオチド、蛍光塩基アナログ、ＣｐＧアイランド、メチル－７－グアノシン、メチル化ヌクレオチド、イノシン、チオウリジン、シュードウリジン、ジヒドロウリジン、キューオシン、及びワイオシンが挙げられる。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子または遺伝子断片の翻訳領域または非翻訳領域、連鎖解析から明らかにされる遺伝子座（複数可）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、非翻訳ＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）及びセルフリーＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）を含むセルフリーポリヌクレオチド、核酸プローブ、ならびにプライマーが挙げられる。場合によっては、ヌクレオチド配列は、非ヌクレオチド構成要素によって割り込まれる。

「完全にインタクト」及び「実質的にインタクト」とは、転写され得る、及び／または本明細書に記載される治療用ポリペプチドへと翻訳され得る核酸配列を有する、本明細書に記載される核酸を指す。完全にインタクトな核酸とは、部分的に分解または断片化されていない、完全長の核酸配列を指す。例えば、完全にインタクトな核酸は、本明細書に記載される治療用ポリペプチドのうちのいずれか１つのような完全長タンパク質へと翻訳され得るメッセンジャーＲＮＡであり得る。一般に、完全にインタクトまたは実質的にインタクトなメッセンジャーＲＮＡは、ポリペプチドへと翻訳されることができる。概して、メッセンジャーＲＮＡは、リボソームへの結合を補助し得る５’キャップ、及び翻訳に有用であり得るポリ（Ａ）鎖を含む。用語「実質的にインタクト」とは、部分的に分解または断片化されていることがあっても、依然として転写され得る、及び／または本明細書に記載される治療用ポリペプチドのうちのいずれか１つへと翻訳され得る核酸配列を指す。例えば、実質的にインタクトな核酸は、本明細書に記載される治療用ポリペプチドのうちのいずれか１つへと翻訳され得る、部分的に分解または断片化されたメッセンジャーＲＮＡであり得る。

本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーに関して本明細書で互換的に使用され得る。ポリペプチドとは、コーディング領域オープンリーディングフレームから翻訳されるもののような、またはその成熟型へのプロセッシングによるもののような完全長ポリペプチドを指し得る。ポリペプチドとは、それでもなお特定のタンパク質に一意的または識別可能に位置する、タンパク質の分解断片またはプロセッシング断片を指し得る。ポリペプチドは、隣接するアミノ酸残基のカルボキシル基とアミノ基との間のペプチド結合によって互いに結合された、アミノ酸の単一直鎖状ポリマーであり得る。ポリペプチドは、例えば、炭水化物の添加、リン酸化などによって修飾され得る。ポリペプチドは異種ポリペプチドであり得る。

本明細書で使用される場合、用語「断片」または同義語は、完全長タンパク質のものよりも短く、所望によりタンパク質機能を維持する、タンパク質の遺伝子座を指し得る。「同一性の割合」及び「同一性％」は、２つの配列（ヌクレオチドまたはアミノ酸）が、アライメントにおいて同一の位置に同一の残基を有する程度を指す。例えば、「アミノ酸配列は配列番号ＹとＸ％同一である」は、配列番号Ｙに対するアミノ酸配列の同一性％を指し、アミノ酸配列中のＸ％の残基が配列番号Ｙに開示されている配列の残基と同一である、と詳述するものである。概して、このような計算にはコンピュータプログラムが利用される。配列ペアを比較及び整列させる模範的なプログラムとしては、ＡＬＩＧＮ、ＦＡＳＴＡ、ｇａｐｐｅｄＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、またはＧＣＧが挙げられる。

本明細書で使用される場合、用語「ｉｎｖｉｖｏ」は、対象の体内で起こる事象を説明するために使用される。

本明細書で使用される場合、用語「ｅｘｖｉｖｏ」は、対象の体外で起こる事象を説明するために使用される。「ｅｘｖｉｖｏ」アッセイは、対象に対して直接実施され得ない。むしろ、対象から得られた生体サンプル等、対象から分離されたサンプルがあれば実施される。ｅｘｖｉｖｏは、対象の体外にあるインタクトな細胞内または他のタイプの生体サンプル内で生じる事象を説明するために使用される。

本明細書で使用される場合、用語「ｉｎｖｉｔｒｏ」は、生物由来の生体から得られる物質を、その生体から分離するように、実験室用試薬を入れる容器に収めた際、その容器内で起こる事象を説明するために使用される。ｉｎｖｉｔｒｏアッセイには、生細胞もしくは死細胞、または他の生物学的物質が用いられる、細胞ベースのアッセイが包含され得る。ｉｎｖｉｔｒｏアッセイには、インタクトな細胞が用いられない、セルフリーアッセイも包含され得る。

「治療する」または「治療」は、治療処置及び予防または防止措置の両方を指し、その目的は、標的とされる病的状態または障害を、予防するかまたは遅くする（和らげる）ことである。治療を必要とするものとしては、既に罹患しているもの、ならびに罹患しやすいもの、または罹患を予防すべきものが挙げられる。治療効果は、治療される症状または根本的な障害の根絶または寛解を指し得る。また、治療効果は、対象が依然として根本的な障害に悩まされ得るにもかかわらず、対象に改善が認められるように、根本的な障害に関連した１つまたは複数の生理学的症状の根絶または寛解があって達成される。予防効果としては、疾患または病状の出現を遅延、予防、または排除すること、疾患または病状の発症を遅延または排除すること、疾患または病状の進行を遅くする、止める、または逆転させること、あるいはそれらの任意の組み合わせを挙げることができる。予防効果に関して、特定の疾患を進行させる危険のある対象、または、１つまたは複数の疾患の生理学的症状を報告する対象は、たとえこの疾患の診断が行われていなかったとしても、治療を受けることがある。

本明細書で互換的に使用される用語「有効量」及び「治療有効量」は、一般に、医薬組成物、例えば本明細書に記載される組成物を含む医薬組成物、を必要とする対象に投与した際に、望ましい活性が生じるのに十分な量を指す。本開示の文脈において、用語「治療上有効な」は、本開示の方法によって治療される障害の少なくとも１つの症状に対して、発現を遅らせ、進行を押さえ、緩和または軽減するのに十分であり得る医薬組成物の量のことを指す。

用語「医薬として許容できる担体」、「医薬として許容できる賦形剤」、「生理学的に許容できる担体」、または「生理学的に許容できる賦形剤」は、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶剤、もしくはカプセル化材料等の医薬として許容できる材料、組成物、またはビヒクルを指す。構成成分は、医薬製剤の他の成分と適合性があるという意味で「医薬として許容できる」。また、構成成分は、合理的な利点／リスク比に対応し、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、ヒト及び非ヒト哺乳類の組織または器官と接触させて使用するのにも適し得る。

用語「医薬組成物」は、希釈剤または担体等の他の化学成分を有する、系もしくは系の混合物または本明細書に開示される系の各構成成分を含む組成物を指す。医薬組成物は、対象への系または系の構成成分の投与を容易にし得る。当該技術分野には化合物を投与する複数の技術があり、経口、注射、噴霧、非経口、及び局所投与が挙げられるが、これらに限定されない。

用語「トランスフェクション」または「トランスフェクションした」は、一般に、非ウイルスまたはウイルスベースの方法によって核酸コンストラクトを細胞内に導入することを指す。場合によっては、核酸分子は、完全なタンパク質またはその機能的部分をコードする遺伝子配列である。場合によっては、核酸分子は非翻訳配列である。場合によっては、トランスフェクション法は、遺伝子導入動物を生成するために、核酸分子を細胞内に導入することに利用される。このような技術としては、前核マイクロインジェクション、生殖系細胞内へのレトロウイルス介在性遺伝子移入、胚性幹細胞内への遺伝子ターゲティング、胚エレクトロポレーション、精子介在性遺伝子移入、及び卵丘もしくは乳腺細胞等の体細胞、または成体、胎生、もしくは胚性幹細胞の核移植前ｉｎｖｉｔｒｏ形質転換を挙げることができる。

「ナノエレクトロポレーション」または「ナノチャネルエレクトロポレーション」は、電界を発生させて、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドをナノチャネル内に負荷し、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドが細胞内に入るのを促進することにより、ベクター等の少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを細胞にトランスフェクションすることを指す。トランスフェクションされる細胞は、ナノチャネルの開口部に位置づけられ、そこでナノエレクトロポレーションの電界により細胞膜に細孔が形成され、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドが細胞内に導入される。

本明細書で使用される場合、「プラスミド」は、一般に、非ウイルス発現ベクター、例えば、遺伝子及び／または遺伝子の発現に必要な調節エレメントをコードする核酸分子を指す。本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、一般に、ペイロード核酸分子を移送または運搬することができる核酸分子を指す。ペイロード核酸分子は、一般に、ベクター核酸分子に連結（例えば、挿入）され得る。ベクターは、細胞内での自律増殖を指示する配列を含み得るか、または宿主細胞遺伝子（例えば、宿主細胞ＤＮＡ）内に統合されるのに十分な配列を含み得る。ベクターの例としては、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、細菌人工染色体、及びウイルスベクターを挙げることができるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「ウイルスベクター」は、一般に、別の核酸を細胞内に運搬することができるウイルス由来の核酸を指す。ウイルスベクターは、適切な環境に存在する場合に、ベクターによって輸送される１つまたは複数の遺伝子によりコードされるタンパク質（複数可）の発現を指示することができる。ウイルスベクターの例としては、ガンマレトロウイルス、アルファレトロウイルス、フォーミーウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。本開示における任意の態様のベクターは、プロモーター及び／またはエンハンサー等の外因性、内因性、または異種制御配列を含み得る。

概観
本開示は、少なくとも１つのターゲティングポリペプチドを発現し、及び／または治療用カーゴ（例えば、ｍＲＮＡ）を輸送する、１つまたは複数の細胞外小胞（例えば、エクソソーム）の設計及び産生に関する。いくつかの例では、ターゲティングポリペプチドは、疾患細胞、がん細胞、腫瘍細胞、非がん病変細胞、損傷組織の細胞、または健康な組織の細胞等の標的細胞に対する細胞外小胞のターゲティング及び集積を向上し得る。場合によっては、ターゲティングポリペプチドは、腫瘍ターゲティングポリペプチドである。ターゲティングポリペプチドは、膜貫通ドメイン及び細胞外ドメインを含むアダプターポリペプチドを含み得る。また、ターゲティングポリペプチドは、アダプターポリペプチドの細胞外ドメインに連結された異種ターゲティングドメインも含み得る。細胞外小胞は、標的細胞に送達されるべき治療薬等のペイロードを輸送するように設計され得る。場合によっては、細胞外小胞により送達される治療薬としては、治療用化合物（例えば、治療用ポリヌクレオチド、治療用ＤＮＡ、治療用ＲＮＡ、治療用ｍＲＮＡ、治療用ｍｉＲＮＡ、治療用ｔＲＮＡ、治療用ｒＲＮＡ、治療用ｓｉＲＮＡ、治療用ｓｈＲＮＡ、治療用ＳＲＰＲＮＡ、治療用ｔｍＲＮＡ、治療用ｇＲＮＡ、または治療用ｃｒＲＮＡ）を挙げることができる。場合によっては、細胞外小胞により送達される治療薬としては、治療用非翻訳ポリヌクレオチド（例えば、非翻訳ＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、またはｓｃａＲＮＡ）、治療用ポリペプチド、治療用化合物、またはがん治療薬を挙げることができる。場合によっては、細胞外小胞は、非治療用化合物（例えば、非治療用ポリヌクレオチド）を輸送してもよい。

本開示は、エクソソームの基礎分泌量が少ない細胞からでさえ、大量のｍＲＮＡ転写物を含有する多数のエクソソームを産生する方法を提供する。本明細書で提供される１つのアプローチは、ベクター（例えば、プラスミド）等の少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを細胞外小胞ドナー細胞内にナノエレクトロポレーションすることに関与し、ここで、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドは、ターゲティングポリペプチドをコードする。当該ターゲティングポリペプチドは、標的とされるがん細胞、腫瘍、非がん病変細胞、損傷組織、または健康な組織への細胞外小胞のターゲティング及び集積を向上し得る。場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞は、初代細胞（例えば、初代付着細胞）である。場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞は細胞株である。場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞は、ナノエレクトロポレーション以前に遺伝子改変されていない。

対象におけるがんまたは腫瘍（例えば、悪性腫瘍、良性腫瘍）等の疾患または障害を治療する方法であって、対象に少なくとも１つの細胞外小胞を全身投与することを含む前記方法が本明細書に記載される。場合によっては、細胞外小胞は、少なくとも１つの治療用ポリヌクレオチド（例えば、治療用ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）を含む。場合によっては、治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞は、少なくとも１つの細胞外小胞ドナー細胞に、少なくとも第１のベクター及び少なくとも第２のベクター（例えば、プラスミド）をナノエレクトロポレーションすることによって得ることができ、第１のベクターは、腫瘍ターゲティングドメインに共有結合にて結合された細胞外小胞表面タンパク質を含む腫瘍ターゲティングポリペプチドをコードし、第２のベクターは、治療用ポリヌクレオチドをコードする。いくつかの実施形態では、細胞外小胞表面タンパク質はＣＤ４７である。場合によっては、細胞外表面タンパク質（例えば、ＣＤ４７）は、腫瘍ターゲティングドメインに共有結合にて連結される。場合によっては、第１のベクターを細胞外小胞ドナー細胞内で発現させて、腫瘍ターゲティングポリペプチドを得ることができる。いくつかの例では、第２のベクターを細胞外小胞ドナー細胞内で発現させて、治療用ポリヌクレオチドを得ることができる。いくつかの実施態様では、細胞外小胞ドナー細胞から放出される細胞外小胞は、腫瘍ターゲティングポリペプチド及び治療用ポリヌクレオチドの両方を含む。場合によっては、細胞外小胞は収集され、対象に全身投与される。場合によっては、標的腫瘍における腫瘍ターゲティングポリペプチドを有する細胞外小胞の集積率は、標的腫瘍における腫瘍ターゲティングポリペプチドを欠く細胞外小胞の集積率と比較して高い。

細胞外小胞ドナー細胞
場合によっては、本明細書に記載される細胞外小胞ドナー細胞は、本明細書に記載される細胞外小胞を産生する。細胞外小胞ドナー細胞は、その細胞における細胞外小胞の基礎分泌レベルよりも高いレベルで細胞外小胞を分泌するように遺伝子改変または操作され得る任意の細胞であり得る。そのため、細胞外小胞の基礎分泌レベルが低いまたはごくわずかな細胞であっても、細胞外小胞ドナー細胞となり得る。場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞は、有核細胞であり得る。場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞は、自家細胞であり得る。このような場合、細胞外小胞ドナー細胞は対象から得ることができ、それに続いて、細胞外小胞ドナー細胞を改変（例えば、ベクターを導入）し、分泌された細胞外小胞を収集し、次いで、同一の対象に投与する。場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞は同種細胞である。このような場合、細胞外小胞ドナー細胞は、細胞外小胞ドナー細胞によって分泌された細胞外小胞を後で受け取る対象と遺伝的に異なる供給源から得られる細胞である。同種細胞外小胞ドナー細胞の場合の多くにおいて、細胞外小胞ドナー細胞は同一種のものであるが、細胞外小胞ドナー細胞によって産生及び分泌された細胞外小胞を後で受け取る対象と遺伝的に異なるものである。

細胞外小胞ドナー細胞は、任意の細胞型であり得る。場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞は、真核細胞（例えば、哺乳類細胞、ヒト細胞、非ヒト哺乳類細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞など）である。いくつかの例では、細胞外小胞ドナー細胞は、細胞株からの細胞、幹細胞、初代細胞、または分化細胞である。いくつかの実施形態では、細胞外小胞ドナー細胞は初代細胞である。いくつかの例では、細胞外小胞ドナー細胞は、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）、ヒト胚線維芽細胞（ＨＥＦ）、樹状細胞、間葉系幹細胞、骨髄由来樹状細胞、骨髄由来間質細胞、脂肪間質細胞、除核細胞、神経幹細胞、未熟樹状細胞、または免疫細胞である。細胞外小胞ドナー細胞は、付着細胞であってもよい。場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞は、付着細胞である。場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞は、浮遊細胞である。

場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞は、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む。場合によっては、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドは、トランスフェクションによって細胞外小胞ドナー細胞内に導入される。少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される生物学的、化学的、もしくは物理的方法のいずれか、または任意の他の生物学的、化学的、もしくは物理的方法によって、細胞外小胞ドナー細胞内にトランスフェクションされ得る。いくつかの例では、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドは、エレクトロポレーション（例えば、ナノエレクトロポレーション）によって細胞外小胞ドナー細胞内にトランスフェクションされる。場合によっては、エレクトロポレーションは、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションである。いくつかの例では、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドは、ナノチャネルエレクトロポレーションによって細胞外小胞ドナー細胞内にトランスフェクションされる。場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞は、遺伝子改変細胞を含む。遺伝子改変細胞の例としては、誘導多能性幹細胞または核酸誘導型ヌクレアーゼ（例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）によって遺伝子改変された細胞を挙げることができる。場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞は、遺伝子改変されていない。例えば、場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞は、エレクトロポレーション（例えば、ナノポレーション）以前に遺伝子改変されていない。

いくつかの例では、細胞外小胞ドナー細胞内にトランスフェクションされた異種ポリヌクレオチドは、細胞外小胞ドナー細胞の染色体内に統合される。場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞内にトランスフェクションされた異種ポリヌクレオチドは、細胞外小胞ドナー細胞の染色体内に統合されない。場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞は、異種ポリヌクレオチドで安定的にトランスフェクションされる。場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞は、異種ポリヌクレオチドで一過性にトランスフェクションされる。場合によっては、トランスフェクションされる細胞外小胞ドナー細胞は、細胞株に由来する細胞である。いくつかの例では、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドはベクター（例えば、プラスミド）である。

場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞は、複数のベクターによってエレクトロポレーションされて、細胞外小胞を産生及び分泌し得る。場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞は、複数のベクターによってナノエレクトロポレーションされて、細胞外小胞を産生及び分泌し得る。場合によっては、複数のベクターは、少なくとも第１のベクター、少なくとも第２のベクター、または任意の追加のベクターを含む。場合によっては、第１のベクター及び第２のベクターは、細胞外小胞ドナー細胞内に同時にナノエレクトロポレーションされ得る。場合によっては、第１のベクター及び第２のベクターは、細胞外小胞ドナー細胞内に異なる時間でナノエレクトロポレーションされ得る。場合によっては、第１のベクターと第２のベクターとをナノエレクトロポレーションする間の時間差は、少なくとも１分、５分、１０分、３０分、１時間、５時間、１２時間、１日、２日、５日、１０日、３０日、またはそれ以上であり得る。

場合によっては、第１のベクターは、腫瘍ターゲティングポリペプチドをコードし得る。いくつかの例では、細胞外小胞ドナー細胞に第１のベクターをナノエレクトロポレーションした場合、第１のベクターが翻訳されて腫瘍ターゲティングポリペプチドが得られる。場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞は、腫瘍ターゲティングポリペプチドを含む細胞外小胞またはエクソソームを産生し得る。場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞は、産生された腫瘍ターゲティングポリペプチドを含む細胞外小胞またはエクソソームを分泌し得る。

場合によっては、第２のベクターは、少なくとも１つの治療用ポリヌクレオチドをコードし得る。場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞に第２のベクターをナノエレクトロポレーションした場合、第２のベクターが転写されて治療用ポリヌクレオチドが得られる。場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞は、第２のベクターによってコードされた治療用ポリヌクレオチドをカプセル化した細胞外小胞またはエクソソームを産生及び分泌する。場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞は、腫瘍ターゲティングペプチド及び第２のベクターによってコードされた治療用ポリヌクレオチドを含む、細胞外小胞またはエクソソームを産生及び分泌し得る。

場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞に第２のベクターをナノエレクトロポレーションした場合、第２のベクターが転写または翻訳されて、治療用ポリヌクレオチドまたは治療用ポリペプチドが得られる。場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞は、第２のベクターによってコードされた治療用ポリヌクレオチドまたは治療用ポリペプチドを含む、細胞外小胞またはエクソソームを産生及び分泌し得る。場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞は、腫瘍ターゲティングペプチド及び第２のベクターによってコードされた治療用ポリヌクレオチドまたは治療用ポリペプチドを含む細胞外小胞を産生及び分泌し得る。いくつかの例では、治療用ポリヌクレオチド及び治療用ポリペプチドは、同一の細胞外小胞またはエクソソームにカプセル化され得る。いくつかの例では、治療用ポリヌクレオチド及び治療用ポリペプチドは、異なる細胞外小胞またはエクソソームにカプセル化され得る。

場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞は、細胞外小胞を定常または基底の速度で連続的に産生及び分泌する。細胞外小胞ドナー細胞は、細胞外小胞の産生及び分泌の基底速度が小さいまたはごくわずかな速度である細胞を含む、任意の細胞型であり得る。例えば、細胞外小胞ドナー細胞は、一般的に細胞外小胞を分泌しないか、または少数を分泌する、初代細胞または非がん性細胞であり得る。

場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞は、基底速度で細胞外小胞を産生及び分泌する。場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞は、基底速度よりも大きい速度で細胞外小胞を産生及び分泌するように刺激され得る。例えば、細胞外小胞ドナー細胞に熱ショック処置を行うか、または細胞外小胞ドナー細胞をＣａ^２＋と接触させることによって、細胞外小胞ドナー細胞は、基底速度よりも大きい速度で細胞外小胞を産生及び分泌するように刺激され得る。場合によっては、ｐ５３－ＴＳＡＰ６シグナル伝達経路等のストレス応答シグナル伝達経路を活性化することによって、細胞外小胞ドナー細胞は、基底速度よりも大きい速度で細胞外小胞を産生及び分泌するように刺激され得る。場合によっては、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを細胞外小胞ドナー細胞内にエレクトロポレーションすることによって、細胞外小胞ドナー細胞は、基底速度よりも大きい速度で細胞外小胞を産生及び分泌するように刺激され得る。場合によっては、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを細胞外小胞ドナー細胞内にマイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションすることによって、細胞外小胞ドナー細胞は、基底速度よりも大きい速度で細胞外小胞を産生及び分泌するように刺激され得る。場合によっては、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを細胞外小胞ドナー細胞内にナノチャネルエレクトロポレーションすることによって、細胞外小胞ドナー細胞は、基底速度よりも大きい速度で細胞外小胞を産生及び分泌するように刺激され得る。いくつかの例では、ナノチャネルエレクトロポレーションによって刺激された細胞外小胞ドナー細胞は、細胞外小胞ドナー細胞が細胞外小胞を産生及び分泌する基底速度よりも、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．３倍、０．４倍、０．５倍、０．６倍、０．７倍、０．８倍、０．９倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、またはそれ以上大きい速度で細胞外小胞を産生及び分泌し得る。場合によっては、ナノチャネルエレクトロポレーションによって刺激された細胞外小胞ドナー細胞は、ナノエレクトロポレーション以外の方法で刺激された細胞外小胞ドナー細胞が細胞外小胞を産生及び分泌する速度よりも、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．３倍、０．４倍、０．５倍、０．６倍、０．７倍、０．８倍、０．９倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、またはそれ以上大きい速度で細胞外小胞を産生及び分泌し得る。

場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞内にトランスフェクションされる異種ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの本明細書に記載されるターゲティングポリペプチドをコードする。場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞内にトランスフェクションされる異種ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの本明細書に記載されるアダプターポリペプチドを含むターゲティングポリペプチドをコードする。いくつかの例では、アダプターポリペプチドは細胞外ドメインを含む。いくつかの例では、アダプターポリペプチドは膜貫通ドメインを含む。場合によっては、少なくとも１つのターゲティングポリペプチドは、アダプターポリペプチドの細胞外ドメインに複合化される異種ターゲティングドメインのペプチド配列を含む。場合によっては、異種ターゲティングドメインは、アダプターポリペプチドの細胞外ドメインに共有結合にて複合化（例えば、融合）される。

場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞内にトランスフェクションされる異種ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの本明細書に記載される治療薬をコードする。場合によっては、治療薬は治療用ポリヌクレオチドである。いくつかの例では、治療薬は治療用ポリペプチドである。いくつかの例では、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドでトランスフェクションされた細胞外小胞ドナー細胞は、少なくとも１つのターゲティングポリペプチドを含む細胞外小胞を産生及び分泌する。いくつかの例では、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドでトランスフェクションされた細胞外小胞ドナー細胞は、少なくとも１つの治療薬を含む細胞外小胞を産生及び分泌する。いくつかの例では、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドでトランスフェクションされた細胞外小胞ドナー細胞は、アダプターポリペプチド（例えば、ＣＤ４７または遺伝子改変ＣＤ４７）及び前記アダプターポリペプチドに連結される異種ターゲティングドメインを含む、少なくとも１つのターゲティングポリペプチドを含む、細胞外小胞を産生及び分泌する。いくつかの例では、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドでトランスフェクションされた細胞外小胞ドナー細胞は、アダプターポリペプチド（例えば、ＣＤ４７または遺伝子改変ＣＤ４７）及び前記アダプターポリペプチドに連結される異種ターゲティングドメインを含む、少なくとも１つのターゲティングポリペプチドならびに少なくとも１つの治療薬（例えば、ｍＲＮＡ）を含む、細胞外小胞を産生及び分泌する。

細胞外小胞
場合によっては、本明細書では、細胞外小胞を含む組成物及び細胞外小胞を産生する方法が提供される。場合によっては、細胞外小胞は、任意の膜結合粒子（例えば、脂質二重層を有する小胞）である。多くの場合、本明細書で提供される細胞外小胞は、細胞によって分泌される。いくつかの例では、細胞外小胞は、ｉｎｖｉｔｒｏで産生される膜結合粒子である。場合によっては、細胞外小胞は、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドでトランスフェクションされた細胞外小胞ドナー細胞によって産生及び分泌される。いくつかの例では、細胞外小胞は、エクソソーム、マイクロベシクル、レトロウイルス様粒子、アポトーシス小体、アポプトソーム、オンコソーム、エクソファー、エンベロープウイルス、エクソメア、または大型オンコソーム等の他の極めて大きな細胞外小胞である。場合によっては、細胞外小胞はエクソソームである。

場合によっては、細胞外小胞は、約１０ｎｍ～約５０，０００ｎｍの直径を有し得る。場合によっては、細胞外小胞は、約１０ｎｍ～約２０ｎｍ、約１０ｎｍ～約３０ｎｍ、約１０ｎｍ～約５０ｎｍ、約１０ｎｍ～約１００ｎｍ、約１０ｎｍ～約２００ｎｍ、約１０ｎｍ～約５００ｎｍ、約１０ｎｍ～約１，０００ｎｍ、約１０ｎｍ～約２，０００ｎｍ、約１０ｎｍ～約５，０００ｎｍ、約１０ｎｍ～約１０，０００ｎｍ、約１０ｎｍ～約５０，０００ｎｍ、約２０ｎｍ～約３０ｎｍ、約２０ｎｍ～約５０ｎｍ、約２０ｎｍ～約１００ｎｍ、約２０ｎｍ～約２００ｎｍ、約２０ｎｍ～約５００ｎｍ、約２０ｎｍ～約１，０００ｎｍ、約２０ｎｍ～約２，０００ｎｍ、約２０ｎｍ～約５，０００ｎｍ、約２０ｎｍ～約１０，０００ｎｍ、約２０ｎｍ～約５０，０００ｎｍ、約３０ｎｍ～約５０ｎｍ、約３０ｎｍ～約１００ｎｍ、約３０ｎｍ～約２００ｎｍ、約３０ｎｍ～約５００ｎｍ、約３０ｎｍ～約１，０００ｎｍ、約３０ｎｍ～約２，０００ｎｍ、約３０ｎｍ～約５，０００ｎｍ、約３０ｎｍ～約１０，０００ｎｍ、約３０ｎｍ～約５０，０００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約５０ｎｍ～約２００ｎｍ、約５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１，０００ｎｍ、約５０ｎｍ～約２，０００ｎｍ、約５０ｎｍ～約５，０００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１０，０００ｎｍ、約５０ｎｍ～約５０，０００ｎｍ、約１００ｎｍ～約２００ｎｍ、約１００ｎｍ～約５００ｎｍ、約１００ｎｍ～約１，０００ｎｍ、約１００ｎｍ～約２，０００ｎｍ、約１００ｎｍ～約５，０００ｎｍ、約１００ｎｍ～約１０，０００ｎｍ、約１００ｎｍ～約５０，０００ｎｍ、約２００ｎｍ～約５００ｎｍ、約２００ｎｍ～約１，０００ｎｍ、約２００ｎｍ～約２，０００ｎｍ、約２００ｎｍ～約５，０００ｎｍ、約２００ｎｍ～約１０，０００ｎｍ、約２００ｎｍ～約５０，０００ｎｍ、約５００ｎｍ～約１，０００ｎｍ、約５００ｎｍ～約２，０００ｎｍ、約５００ｎｍ～約５，０００ｎｍ、約５００ｎｍ～約１０，０００ｎｍ、約５００ｎｍ～約５０，０００ｎｍ、約１，０００ｎｍ～約２，０００ｎｍ、約１，０００ｎｍ～約５，０００ｎｍ、約１，０００ｎｍ～約１０，０００ｎｍ、約１，０００ｎｍ～約５０，０００ｎｍ、約２，０００ｎｍ～約５，０００ｎｍ、約２，０００ｎｍ～約１０，０００ｎｍ、約２，０００ｎｍ～約５０，０００ｎｍ、約５，０００ｎｍ～約１０，０００ｎｍ、約５，０００ｎｍ～約５０，０００ｎｍ、または約１０，０００ｎｍ～約５０，０００ｎｍの直径を有し得る。場合によっては、細胞外小胞は、約１０ｎｍ、約２０ｎｍ、約３０ｎｍ、約５０ｎｍ、約１００ｎｍ、約２００ｎｍ、約５００ｎｍ、約１，０００ｎｍ、約２，０００ｎｍ、約５，０００ｎｍ、約１０，０００ｎｍ、または約５０，０００ｎｍの直径を有する。場合によっては、細胞外小胞は、少なくとも約１０ｎｍ、約２０ｎｍ、約３０ｎｍ、約５０ｎｍ、約１００ｎｍ、約２００ｎｍ、約５００ｎｍ、約１，０００ｎｍ、約２，０００ｎｍ、約５，０００ｎｍ、または約１０，０００ｎｍの直径を有し得る。場合によっては、細胞外小胞は、最大で約２０ｎｍ、約３０ｎｍ、約５０ｎｍ、約１００ｎｍ、約２００ｎｍ、約５００ｎｍ、約１，０００ｎｍ、約２，０００ｎｍ、約５，０００ｎｍ、約１０，０００ｎｍ、または約５０，０００ｎｍの直径を有し得る。

場合によっては、細胞外小胞は、少なくとも１つのターゲティングポリペプチドを含む。場合によっては、細胞外小胞は、少なくとも１つのターゲティングポリペプチド及び少なくとも１つの治療薬を含む。場合によっては、少なくとも１つのターゲティングポリペプチドは、膜貫通ドメイン及び細胞外ドメインを含む、アダプターポリペプチドを含む。場合によっては、ターゲティングポリペプチドは、アダプターポリペプチドの細胞外ドメインに連結された異種ターゲティングドメインを含む。場合によっては、アダプターポリペプチドは、細胞外小胞表面タンパク質のペプチド配列と少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一であるペプチド配列を含む。場合によっては、アダプターポリペプチドは、本明細書に記載される細胞外小胞表面タンパク質またはその断片のいずれか１つの膜貫通ドメインを含む。場合によっては、少なくとも１つのアダプターポリペプチドは、本明細書に記載される細胞外小胞表面タンパク質のいずれか１つのペプチド配列と少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一であるペプチド配列を含む、膜貫通ドメインを含む。場合によっては、少なくとも１つのアダプターポリペプチドは、本明細書に記載される細胞外小胞表面タンパク質のいずれか１つのペプチド配列と少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一であるペプチド配列を含む、細胞外ドメインを含む。場合によっては、ターゲティングポリペプチドは、細胞外小胞表面タンパク質のペプチド配列と少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一であるペプチド配列を含む、腫瘍ターゲティングポリペプチドである。場合によっては、ターゲティングポリペプチドまたは腫瘍ターゲティングポリペプチドは、本明細書に記載されるターゲティングドメインまたは腫瘍ターゲティングドメインのうちの少なくとも１つに共有結合にて結合され得る。

細胞外小胞表面タンパク質は、一般に、細胞外小胞と関連するタンパク質である。場合によっては、細胞外小胞表面タンパク質は、細胞外小胞ドナー細胞によって発現され、細胞外小胞ドナー細胞によって産生及び分泌される細胞外小胞の一部として統合及び分泌され得る。いくつかの例では、細胞外小胞表面タンパク質は、細胞外小胞表面タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方を含み得る、少なくとも１つの細胞外ドメインを含む。場合によっては、細胞外小胞表面タンパク質は、本明細書に記載される少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドまたはベクターによってコードされ得る。場合によっては、細胞外小胞表面タンパク質は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり得る。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーとしては、抗原受容体、抗原提示分子、共受容体、抗原受容体アクセサリー分子、共刺激性もしくは抑制性分子、ナチュラルキラー細胞上の受容体、白血球上の受容体、免疫グロブリン様細胞接着分子、サイトカイン受容体、増殖因子受容体、受容体型チロシンキナーゼ、受容体型チロシンホスファターゼ、免疫グロブリン結合受容体、細胞骨格、または他のメンバーを挙げることができる。場合によっては、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーを含む細胞外小胞表面タンパク質は、免疫グロブリン可変ドメイン（ＩｇＶ）または免疫グロブリン定常ドメイン（ＩｇＣ）を含む。場合によっては、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーを含む細胞外小胞表面タンパク質は、ＩｇＶドメインを含む。ＩｇＶを含む免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーの例としては、分化抗原群タンパク質（例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ４７、ＣＤ８０、またはＣＤ８６）、ミエリン膜接着分子、ＪＡＭ（ｊｕｎｃｔｉｏｎａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、チロシン－プロテインキナーゼ受容体、プログラム細胞死１タンパク質（ＰＤ１）、またはＴ細胞抗原受容体を挙げることができる。

場合によっては、細胞外小胞表面タンパク質は、本明細書に記載されるターゲティングドメインを含むように、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方で改変され得る。一般に、細胞外小胞タンパク質は、（ａ）細胞外ドメイン、（ｂ）膜通過ドメイン（例えば、膜貫通ドメイン）、及び／または（ｃ）細胞内ドメインを有する膜貫通タンパク質（例えば、細胞外小胞の膜を貫通するタンパク質）である。模範的な細胞外小胞表面タンパク質としては、１４－３－３イプシロンタンパク質、７８ｋＤａグルコース制御タンパク質、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ－Ｓ）、アクチン、ＡＤＡＭ１０、アルカリ性ホスファターゼ、アルファ－エノラーゼ、アルファ－シヌクレイン、アミノペプチダーゼＮ、アミロイドＡ４（ＡＰＰ）、アネキシン５Ａ、アネキシンＡ２、ＡＰ－１、ＡＴＦ３、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、ＡＴＰアーゼ、βアクチン（ＡＣＴＢ）、ベータ－アミロイド４２、カベオリン－１、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１４２、ＣＤ１４６、ＣＤ１６３、ＣＤ２４、ＣＤ２６／ＤＰＰ４、ＣＤ２９／ＩＴＧＢ１、ＣＤ３、ＣＤ３７、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４７、ＣＤ４９、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６９、ＣＤ７３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ９、ＣＤ９０、ＣＤ３１５、ＰＴＧＦＲＮ、クローディン、コフィリン－１、補体－結合タンパク質ＣＤ５５及びＣＤ５９、細胞質１（ＡＣＴＡ）、細胞質熱ショックタンパク質９０アルファ、細胞質熱ショックタンパク質９０ベータ、ＥＢＶＬＭＰ１、ＥＢＶＬＭＰ２Ａ、ＥＦ－１アルファ－１、ＥＦ２、ＥＦＧＲＥＧＦＲＶＩＩＩ、ＥＭＭＰＲＩＮ、ｅｍｍｐｒｉｎ／ＣＤ１４７、エノラーゼ１アルファ（ＥＮＯ１）、ＥＰＣＡＭ、ＥＲＢＢ２、脂肪酸合成酵素、フェチュイン－Ａ、フロチリン－１、フロチリン－２、フルクトース二リン酸アルドラーゼＡ、グリセルアルデヒド３―リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、グリコフォリンＡ、ＧＰＣ１、ＧＰＩアンカー型５’ヌクレオチダーゼ、ＧＴＰアーゼ、熱ショックタンパク質８（ＨＳＰＡ８）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ７０及びＨＳＰ９０）、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ヘパリナーゼ、ヘテロ三量体Ｇタンパク質、ＨＩＶＧａｇ、ＨＩＶＮｅｆ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＳＶｇＢ、ＨＴＬＶ－１Ｔａｘ、ハンチンチン、ＩＣＡＭ１、インテグリン、ＬＡＭＰ１／２、ロイシンリッチ受容体型キナーゼ２、Ｌ－乳酸脱水素酵素Ａ鎖、リソソーム膜糖タンパク質１、リソソーム膜糖タンパク質２、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＭＵＣ１、多剤耐性関連タンパク質、筋ピルビン酸キナーゼ（ＰＫＭ２）、Ｎ－カドヘリン、ＮＫＣＣ２、ＰＤＣＤ６ＩＰ／Ａｌｉｘ、ＰＥＣＡＭ１、ホスホグリセレートキナーゼ、胎盤プリオンタンパク質、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫＭ）、Ｒａｂ－１４、Ｒａｂ－５ａ、Ｒａｂ－５ｂ、Ｒａｂ－５ｃ、Ｒａｂ－７、Ｒａｐ１Ｂ、レジスチン、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、残存、シンデカン－１、シンデカン－４、シンテニン－１、テトラスパニン（ＣＤ９、トランスフェリン受容体（ＴＦＲ２））、ＴＳＧ１０１、ＴＳＰＡＮ８、腫瘍関連糖タンパク質テトラスパニン－８、チロシン３モノオキシゲナーゼ／トリプトファン５－モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質、ＴＹＲＰ－２、液胞局在タンパク質３５、ゼータポリペプチド（ＹＷＨＡＺ）、または１４－３－３ゼータ／デルタタンパク質が挙げられる。場合によっては、天然に存在する細胞外小胞表面タンパク質は、非組織特異的または組織もしくは細胞特異的であり得る。場合によっては、天然に存在する細胞外小胞表面タンパク質は、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ４７、ＣＤ３１５、ヘテロ三量体Ｇタンパク質、ＭＨＣクラスＩ、インテグリン、トランスフェリン受容体（ＴＦＲ２）、ＬＡＭＰ１／２、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＡＤＡＭ１０、ＧＰＩアンカー型５’ヌクレオチダーゼ、ＣＤ７３、補体－結合タンパク質ＣＤ５５及びＣＤ５９、ならびにソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）からなる群から選択される。場合によっては、天然に存在する細胞外小胞表面タンパク質は、ＴＳＰＡＮ８、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ９、ＰＥＣＡＭ１、ＥＲＢＢ２、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ９０、ＣＤ４５、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、グリコフォリンＡ、ＣＤ１４、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３、アセチルコリンエステラーゼ／ＡＣｈＥ－Ｓ、ＡＣｈＥ－Ｅ、アミロイドベータＡ４／ＡＰＰ、ＰＴＧＦＲＮ、及び多剤耐性関連タンパク質からなる群から選択される。

場合によっては、少なくとも１つのターゲティングポリペプチドは、ＣＤ４７のペプチド配列と少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一であるペプチド配列を含む、アダプターポリペプチドを含む。場合によっては、ＣＤ４７は、配列番号１の配列またはその断片を含む。場合によっては、ＣＤ４７は、配列番号１の１４２～１６２、１７７～１９７、２０８～２２８、２３６～２５６、または２６９～２８９位のアミノ酸と一致する膜貫通ドメインを含む。場合によっては、ＣＤ４７は、１９～１４１、１９８～２０７、または２５７～２６８位のアミノ酸と一致する細胞外ドメインを含む。場合によっては、ＣＤ４７は、１９～１４１位のアミノ酸と一致する細胞外ドメインを含む。場合によっては、ＣＤ４７は、マクロファージ等の骨髄細胞によって発現されるシグナル制御タンパク質（ＳＩＲＰ）と相互作用し得る、ＩｇＶドメインを含む。このようなＣＤ４７とＳＩＲＰとの間の相互作用は、骨髄細胞の貪食作用を阻害し得る。場合によっては、ＩｇＶドメインは、ＣＤ４７の細胞外ドメインの一部であり得る。場合によっては本明細書に記載されるアダプターポリペプチドは、細胞外ドメインの一部としてＩｇＶドメインを含むＣＤ４７のペプチド配列を含む。

場合によっては、アダプターポリペプチドは、ＣＤ４７のペプチド配列と少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一であるペプチド配列を含む、細胞外ドメインを含む。いくつかの例では、アダプターポリペプチドは、ＣＤ４７のペプチド配列と少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一であるペプチド配列を含む、膜貫通ドメインを含む。場合によっては、異種ターゲティングドメインは、ＣＤ４７のペプチド配列を含むアダプターポリペプチドの細胞外ドメインに連結される。場合によっては、異種ターゲティングドメインは、ＣＤ４７のペプチド配列を含むアダプターポリペプチドの細胞外ドメインのＮ末端に連結される。場合によっては、異種ターゲティングドメインは、ＣＤ４７のペプチド配列を含むアダプターポリペプチドの細胞外ドメインのＣ末端に連結される。場合によっては、異種ターゲティングドメインは、ＣＤ４７のペプチド配列を含むアダプターポリペプチドの細胞外ドメインのＮ末端に共有結合にて連結される。場合によっては、異種ターゲティングドメインは、ＣＤ４７のペプチド配列を含むアダプターポリペプチドの細胞外ドメインのＣ末端に共有結合にて連結される。

いくつかの例では、本明細書に記載される細胞外小胞は、複数のアダプターポリペプチドを含む複数のターゲティングポリペプチドを含み、各アダプターポリペプチドは、本明細書に記載される細胞外小胞表面ポリペプチドのいずれか１つのペプチド配列と少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一であるペプチド配列を含み得る。場合によっては、細胞外小胞は、複数のアダプターポリペプチドが同一のものである、複数のターゲティングポリペプチドを含む。場合によっては、細胞外小胞は、複数のアダプターポリペプチドが異なるものである、複数のターゲティングポリペプチドを含む。場合によっては、細胞外小胞は、複数のアダプターポリペプチドのうちの少なくとも１つがＣＤ４７を含む、複数のターゲティングポリペプチドを含む。

場合によっては、少なくとも１つのターゲティングポリペプチド（またはアダプターポリペプチド）を含む細胞外小胞は、ターゲティングまたはアダプターポリペプチドを有しない細胞外小胞の半減期と比較して、長い循環半減期を示す。場合によっては、ＣＤ４７またはその断片を含むターゲティングポリペプチド（またはアダプターポリペプチド）を少なくとも１つ含む細胞外小胞は、ＣＤ４７またはその断片を含むターゲティングポリペプチドを有しない細胞外小胞の半減期と比較して、長い循環半減期を示す。場合によっては、ＣＤ４７またはその断片を含むターゲティングポリペプチドを少なくとも１つ含む細胞外小胞の半減期は、ＣＤ４７またはその断片を含むターゲティングポリペプチドを有しない細胞外小胞の半減期と比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、またはそれ以上長くなる。場合によっては、ＣＤ４７またはその断片を含むターゲティングポリペプチドを少なくとも１つ含む細胞外小胞の半減期は、ＣＤ４７またはその断片を含むターゲティングポリペプチドを有しない細胞外小胞の半減期と比較して、少なくとも１分、２分、３分、４分、５分、１０分、１５分、３０分、６０分、９０分、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、４８時間、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１２日、１４日、２１日、２８日、３０日、またはそれ以上長くなる。

場合によっては、少なくとも１つのターゲティングポリペプチド（及び／またはアダプターポリペプチド）を含む細胞外小胞は、哺乳類（例えば、ヒト、げっ歯類、マウス）における循環半減期が、少なくとも３０秒、少なくとも１分、少なくとも２分、少なくとも３分、少なくとも５分、または少なくとも１０分であることを示す。場合によっては、ＣＤ４７またはその断片を含むターゲティングポリペプチド（及び／またはアダプターポリペプチド）を少なくとも１つ含む細胞外小胞は、哺乳類（例えば、ヒト、げっ歯類、マウス）における循環半減期が、少なくとも３０秒、少なくとも１分、少なくとも２分、少なくとも３分、少なくとも５分、または少なくとも１０分であることを示す。場合によっては、ターゲティング及び／またはアダプターポリペプチドを含む細胞外小胞は、哺乳類における循環半減期が５時間未満、２時間未満、１時間未満、または３０分未満であることを示す。

場合によっては、細胞外小胞は、改変ＣＤ４７を含むアダプターポリペプチドを含み、ここで、異種ターゲティングドメインは、アダプターポリペプチドの細胞外ドメインに付着または複合化される。場合によっては、改変ＣＤ４７を含むアダプターポリペプチドを含む細胞外小胞は、ＣＤ４７を含むアダプターポリペプチドを有しない細胞外小胞の半減期と比較して、長い循環半減期を示す。場合によっては、改変ＣＤ４７を含むアダプターポリペプチドを含む細胞外小胞の半減期は、ＣＤ４７を含むアダプターポリペプチドを有しない細胞外小胞の半減期と比較して、０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、またはそれ以上長くなる。場合によっては、改変ＣＤ４７を含むアダプターポリペプチドを含む細胞外小胞の半減期は、ＣＤ４７を含むアダプターポリペプチドを有しない細胞外小胞の半減期と比較して、少なくとも１分、２分、３分、４分、５分、１０分、１５分、３０分、６０分、９０分、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、４８時間、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１２日、１４日、２１日、２８日、３０日、またはそれ以上長くなる。場合によっては、改変ＣＤ４７を含むアダプターポリペプチドを含む細胞外小胞数の循環中の減少速度は、ＣＤ４７を含むアダプターポリペプチドを有しない細胞外小胞数の循環中の減少速度と比較して、０．１倍、０．２倍、０．５倍、１倍、２倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、またはそれ以上減少し、その際、ＣＤ４７を有する細胞外小胞とＣＤ４７を有しない細胞外小胞との間の比較は、１分、２分、３分、４分、５分、１０分、１５分、３０分、６０分、９０分、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、４８時間、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１２日、１４日、２１日、２８日、３０日、またはそれ以上の時間間隔でなされる。

いくつかの例では、改変ＣＤ４７を含むアダプターポリペプチドを含む細胞外小胞は、非改変ＣＤ４７を含むアダプターポリペプチドを含む細胞外小胞の半減期と比較して、短い循環半減期を示さない。いくつかの例では、改変ＣＤ４７を含むアダプターポリペプチドを含む細胞外小胞は、非改変ＣＤ４７を含むアダプターポリペプチドを含む細胞外小胞の半減期と比較して、短い循環半減期を示さない。

場合によっては、ターゲティングポリペプチドは、異種ターゲティングドメインを含む。場合によっては、異種ターゲティングドメインは、アダプターポリペプチドの細胞外ドメインに付着または複合化される。場合によっては、異種ターゲティングドメインは、アダプターポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方に複合化される。いくつかの例では、異種ターゲティングドメインは、アダプターポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方に共有結合にて融合される。図８Ａは、ＣＤＸまたはＣＲＥＫＡのいずれかを含む異種ターゲティングドメインが、ＣＤ４７を含むアダプターポリペプチドの細胞外ドメインＮ末端に融合された例を示している。場合によっては、異種ターゲティングドメインは、融合ポリペプチドの一部としてアダプターポリペプチドに融合される。場合によっては、アダプターポリペプチドに融合された異種ターゲティングドメインを含む融合ポリペプチドは、本明細書に記載される少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドまたはベクターによってコードされる。

いくつかの例では、異種ターゲティングドメインは、腫瘍ターゲティングドメイン、組織ターゲティングドメイン、細胞膜透過性ペプチド、ウイルス膜タンパク質、またはそれらの組み合わせである。異種ターゲティングドメインは、標的細胞の表面に発現される細胞表面マーカーを標的とし得る。細胞表面マーカーは、標的細胞の表面に発現される任意の高分子またはタンパク質であり得る。細胞表面マーカーの非限定的な例としては、血管受容体、フィブロネクチン受容体、Ａ２Ｂ５、ＣＤ４４、ＣＤ２４、ＥＳＡ、ＳＳＥＡ１、ＣＤ１３３、ＣＤ３４、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＣＤ２６、ＣＤ１６６、またはＣＤ９０が挙げられる。

いくつかの例では、細胞表面マーカーを発現している標的細胞における、少なくとも１つのターゲティングポリペプチドを含む細胞外小胞の集積率は、同一の細胞表面マーカーを発現している同一の標的細胞における、少なくとも１つのターゲティングポリペプチドを有しない細胞外小胞の集積率よりも高い。いくつかの例では、細胞表面マーカーを発現している標的細胞における、少なくとも１つのターゲティングポリペプチドを含む細胞外小胞の集積率は、同一の細胞表面マーカーを発現している同一の標的細胞における、ターゲティングポリペプチドを有しない細胞外小胞の集積率と比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれ以上高い。

いくつかの例では、細胞表面マーカーを発現している標的細胞に向かう、少なくとも１つのターゲティングポリペプチドを含む細胞外小胞の肝臓及び脾臓集積率、例えば非標的細胞における細胞外小胞の集積率は、同一の標的細胞に向かう、少なくとも１つのターゲティングポリペプチドを有しない細胞外小胞の肝臓及び脾臓集積率と比較して減少する。いくつかの例では、少なくとも１つのターゲティングポリペプチドを含む細胞外小胞の肝臓及び脾臓集積率は、ターゲティングポリペプチドを有しない細胞外小胞の肝臓及び脾臓集積率と比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍、または１０，０００倍減少する。

いくつかの例では、ターゲティングポリペプチドは、アダプターポリペプチドの細胞外ドメインに付着または複合化された少なくとも１つの異種ターゲティングドメインを含む。場合によっては、少なくとも１つの異種ターゲティングドメインは、腫瘍ターゲティングドメイン、組織ターゲティングドメイン、細胞膜透過性ペプチド、ウイルス膜タンパク質、またはそれらの組み合わせである。いくつかの例では、少なくとも１つの異種ターゲティングドメインは、腫瘍ターゲティングドメインであり、当該腫瘍ターゲティングドメインは、がん性細胞を標的とする。いくつかの例では、少なくとも１つの異種ターゲティングドメインは、腫瘍ターゲティングドメインであり、当該腫瘍ターゲティングドメインは、非がん性病変細胞を標的とする。

場合によっては、ターゲティングポリペプチドは、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の異種ターゲティングドメインを含む。いくつかの例では、少なくとも２つの異種ターゲティングドメインは同一であり得る。場合によっては、少なくとも２つの異種ターゲティングドメインは異なり得る。異種ターゲティングドメインは、アダプターポリペプチドのＮ末端に複合化され得る。代案では、異種ターゲティングドメインは、アダプターポリペプチドのＣ末端に複合化され得る。場合によっては、異種ターゲティングドメインとアダプターポリペプチドとの間の複合化は、共有結合性の複合化であり得る。例えば、異種ターゲティングドメインは、アダプターポリペプチドに共有結合にて融合され得る。いくつかの例では、異種ターゲティングドメインは、アダプターポリペプチド内に統合され得る。場合によっては、異種ターゲティングドメインは、ペプチドリンカーを介してアダプターポリペプチドに複合化される。場合によっては、ペプチドリンカーは、５～２００個のアミノ酸を含む。他の場合には、ペプチドリンカーは、５～２５個のアミノ酸を含む。

場合によっては、ターゲティングポリペプチドは、少なくとも１つの腫瘍ターゲティングドメインを含む。場合によっては、ターゲティングポリペプチドは、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の腫瘍ターゲティングドメインを含む。いくつかの例では、少なくとも２つの腫瘍ターゲティングドメインは同一である。場合によっては、少なくとも２つの腫瘍ターゲティングドメインは相異なる。場合によっては、腫瘍ターゲティングドメインは、アダプターポリペプチドのＮ末端に融合される。場合によっては、腫瘍ターゲティングドメインは、アダプターポリペプチドのＣ末端に融合される。場合によっては、腫瘍ターゲティングドメインは、アダプターポリペプチドの任意のペプチドの位置で統合され得る。いくつかの例では、腫瘍ターゲティングドメインは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、または１００個のアミノ酸を含む。場合によっては、腫瘍ターゲティングドメインは、ＣＤＸ（ＦＫＥＳＷＲＥＡＲＧＴＲＩＥＲＧ（配列番号２））ペプチドである。場合によっては、腫瘍ターゲティングドメインは、ＣＲＥＫＡ（配列番号３）ペプチドである。場合によっては、腫瘍ターゲティングドメインは、ＣＫＡＡＫＮ（配列番号４）ペプチドである。場合によっては、腫瘍ターゲティングドメインは、ＡＲＲＰＫＬＤ（配列番号５）ペプチドである。他の模範的な腫瘍ターゲティングドメインが含まれ得る。

場合によっては、ターゲティングポリペプチドは、少なくとも１つの組織ターゲティングドメインを含み、当該組織ターゲティングドメインは、ターゲティングポリペプチドを含む細胞外小胞が、特定の組織の細胞を標的とし、指向するようにさせる。場合によっては、ターゲティングポリペプチドは、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の組織ターゲティングペプチドを含む。いくつかの例では、少なくとも２つの組織ターゲティングペプチドは同一である。場合によっては、少なくとも２つの組織ターゲティングペプチドは相異なる。場合によっては、組織ターゲティングペプチドは、アダプターポリペプチドのＮ末端に融合される。場合によっては、組織ターゲティングペプチドは、アダプターポリペプチドのＣ末端に融合される。場合によっては、組織ターゲティングペプチドは、アダプターポリペプチドの任意のペプチドの位置で統合され得る。いくつかの例では、組織ターゲティングペプチドは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、または１００個のアミノ酸を含む。内皮または心臓組織を標的とする模範的な組織ターゲティングドメインとしては、ＳＩＧＹＰＬＰ（配列番号６）、ＬＳＩＰＰＫＡ（配列番号７）、ＦＱＴＰＰＱＬ（配列番号８）、ＬＴＰＡＴＡＩ（配列番号９）、ＣＮＩＷＧＶＶＬＳＷＩＧＶＦＰＥＣ（配列番号１０）、ＮＴＴＴＨ（配列番号１１）、ＶＨＰＫＱＨＲ（四量体）（配列番号１２）、ＣＲＫＲＬＤＲＮＣＣＲＴＬＴＶＲＫＣ（配列番号１３）、ＣＬＷＴＶＧＧＧＣ（配列番号１４）、ＱＰＷＬＥＱＡＹＹＳＴＦ（配列番号１５）、ＹＰＨＩＤＳＬＧＨＷＲＲ（配列番号１６）、ＬＬＡＤＴＴＨＨＲＰＷＴ（配列番号１７）、ＳＡＨＧＴＳＴＧＶＰＷＰ（配列番号１８）、ＶＰＷＭＥＰＡＹＱＲＦＬ（配列番号１９）、ＴＬＰＷＬＥＥＳＹＷＲＰ（配列番号２０）、ＨＷＲＲ（配列番号２１）、ＣＳＴＳＭＬＫＡＣ（配列番号２２）、ＤＤＴＲＨＷＧ（配列番号２３）、ＣＡＲＰＡＲ（配列番号２４）、ＣＫＲＡＶＲ（配列番号２５）、ＣＲＳＴＲＡＮＰＣ（配列番号２６）、ＣＰＫＴＲＲＶＰＣ（配列番号２７）、ＣＳＧＭＡＲＴＫＣ（配列番号２８）、またはＣＲＰＰＲ（配列番号２９）が挙げられる。膵臓組織を標的とする模範的な組織ターゲティングドメインとしては、ＣＲＶＡＳＶＬＰＣ（配列番号３０）、ＳＷＣＥＰＧＷＣＲ（配列番号３１）、ＬＳＧＴＰＥＲＳＧＱＡＶＫＶＫＬＫＡＩＰ（配列番号３２）、ＣＨＶＬＷＳＴＲＣＣＶＳＮＰＲＷＫＣ（配列番号３３）、またはＬＳＡＬＰＲＴ（配列番号３４）が挙げられる。腎臓組織を標的とする模範的な組織ターゲティングドメインとしては、ＣＬＰＶＡＳＣ（配列番号３５）、ＥＬＲＧＤ（Ｒ／Ｍ）ＡＸ（Ｗ／Ｌ）（配列番号３６）、ＧＶ（Ｋ／Ｒ）ＧＸ３（Ｔ／Ｓ）ＲＤＸＲ（配列番号３７）、ＨＩＴＳＬＬＳＨＴＴＨＲＥＰ（配列番号３８）、またはＡＮＴＰＣＧＰＹＴＨＤＣＰＶＫＲ（配列番号３９）が挙げられる。肺組織を標的とする模範的な組織ターゲティングドメインとしては、ＣＧＦＥＬＥＴＣＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号４０）、ＱＰＦＭＱＣＬＣＬＩＹＤＡＳＣＲＮＶＰＰＩＦＮＤＶＹＷＩＡＦ（配列番号４１）、ＶＮＴＡＮＳＴ（配列番号４２）、ＣＴＳＧＴＨＰＲＣ（配列番号４３）、またはＳＧＥＷＶＩＫＥＡＲＧＷＫＨＷ－ＶＦＹＳＣＣＰＴＴＰＹＬＤＩＴＹＨ（配列番号４４）が挙げられる。腸組織を標的とする模範的な組織ターゲティングドメインとしては、ＹＳＧＫＷＧＷ（配列番号４５）、ＬＥＴＴＣＡＳＬＣＹＰＳＹＱＣＳＹＴＭＰＨＰＰＶＶＰＰＨＰＭＴＹＳＣＱＹ（配列番号４６）、ＹＰＲＬＬＴＰ（配列番号４７）、ＣＳＱＳＨＰＲＨＣ（配列番号４８）、ＣＳＫＳＳＤＹＱＣ（配列番号４９）、ＣＫＳＴＨＰＬＳＣ（配列番号５０）、ＣＴＧＫＳＣＬＲＶＧ（配列番号５１）、ＳＦＫＰＳＧＬＰＡＱＳＬ（配列番号５２）、またはＣＴＡＮＳＳＡＱＣ（配列番号５３）が挙げられる。脳組織を標的とする模範的な組織ターゲティングドメインとしては、ＣＬＳＳＲＬＤＡＣ（配列番号５４）、ＧＨＫＡＫＧＰＲＫ（配列番号５５）、ＨＡＩＹＰＲＨ（配列番号５６）、ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ（配列番号５７）、ＨＬＮＩＬＳＴＬＷＫＹＲＣ（配列番号５８）、ＣＡＧＡＬＣＹ（配列番号５９）、ＣＬＥＶＳＲＫＮＣ（配列番号６０）、ＲＰＲＴＲＬＨＴＨＲＮＲ（Ｄ－ａａ）（配列番号６１）、ＡＣＴＴＰＨＡＷＬＣＧ（配列番号６２）、ＧＬＡＨＳＦＳＤＦＡＲＤＦＶ（配列番号６３）、ＧＹＲＰＶＨＮＩＲＧＨＷＡＰＧ（配列番号６４）、ＴＧＮＹＫＡＬＨＰＨＮＧ（配列番号６５）、ＣＲＴＩＧＰＳＶＣ（配列番号６６）、ＣＴＳＴＳＡＰＹＣ（配列番号６７）、ＣＳＹＴＳＳＴＭＣ（配列番号６８）、ＣＭＰＲＬＲＧＣ（配列番号６９）、ＴＰＳＹＤＴＹＡＡＥＬＲ（配列番号７０）、ＲＬＳＳＶＤＳＤＬＳＧＣ（配列番号７１）、ＣＡＱＫ（配列番号７２）、またはＳＧＶＹＫＶＡＹＤＷＱＨ（配列番号７３）を挙げることができる。種々の組織を標的とする追加の模範的な組織ターゲティングドメインとしては、ＬＭＬＰＲＡＤ（配列番号７４）（副腎を標的とする）、ＣＳＣＦＲＤＶＣＣ（配列番号７５）（網膜を標的とする）、ＣＲＤＶＶＳＶＩＣ（配列番号７６）（網膜を標的とする）、ＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（配列番号７７）（皮膚皮下組織脈管系を標的とする）、ＧＬＳＧＧＲＳ（配列番号７８）（子宮を標的とする）、ＷＹＲＧＲＬ（配列番号７９）（軟骨を標的とする）、ＣＰＧＰＥＧＡＧＣ（配列番号８０）（胸の脈管系を標的とする）、ＳＭＳＩＡＲＬＶＳＦＬＥＹＲ（配列番号８１）（前立腺を標的とする）、ＧＰＥＤＴＳＲＡＰＥＮＱＱＫＴＧＣ（配列番号８２）（皮膚ランゲルハンスを標的とする）、ＣＫＧＧＲＡＫＤＣ（配列番号８３）（脈管系白色脂肪を標的とする）、ＣＡＲＳＫＮＫＤＣ（配列番号８４）（創傷または損傷組織を標的とする）、ＣＨＡＱＧＳＡＥＣ（配列番号８５）（胸腺を標的とする）、ＬＥＰＲＷＧＦＧＷＷＬＫＬＳＴＨＴＴＥＳＲＳＭＶ（配列番号８６）（耳または蝸牛組織を標的とする）、ＡＣＳＴＥＡＬＲＨＣＧＧＧＳ（配列番号８７）（網膜血管を標的とする）またはＡＳＳＬＮＩＡ（配列番号８８）（筋組織を標的とする）が挙げられる。

場合によっては、ターゲティングポリペプチドは、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の細胞膜透過性ペプチドを含む。場合によっては、細胞膜透過性ペプチドを含むターゲティングポリペプチドは、細胞外小胞が標的細胞によって融合またはエンドサイトーシスされる割合を増加させる。いくつかの例では、少なくとも２つの細胞膜透過性ペプチドは同一である。場合によっては、少なくとも２つの細胞膜透過性ペプチドは相異なる。場合によっては、細胞膜透過性ペプチドは、アダプターポリペプチドのＮ末端に融合される。場合によっては、細胞膜透過性ペプチドは、アダプターポリペプチドのＣ末端に融合される。場合によっては、細胞膜透過性ペプチドは、アダプターポリペプチドの任意のペプチドの位置で統合され得る。いくつかの例では、細胞膜透過性ペプチドは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、または１００個のアミノ酸を含む。細胞膜透過性ペプチドの非限定的な例としては、ＤＳＬＫＳＹＷＹＬＱＫＦＳＷＲ（配列番号８９）、ＤＷＬＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＬＫＥＡＦ（配列番号９０）、ＫＳＫＴＥＹＹＮＡＷＡＶＷＥＲＮＡＰ（配列番号９１）、ＧＮＧＥＱＲＥＭＡＶＳＲＬＲＤＣＬＤＲＱＡ（配列番号９２）、ＨＴＰＧＮＳＮＫＷＫＨＬＱＥＮＫＫＧＲＰＲＲ（配列番号９３）、ＤＷＬＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＬＫＥＡＦ（配列番号９４）、Ｒ９ＧＰＬＧＬＡＧＥ８（配列番号９５）、Ａｃ－ＧＡＦＳＷＧＳＬＷＳＧＩＫＮＦＧＳＴＶＫＮＹＧ（配列番号９６）、ＲＬＲＷＲ（配列番号９７）、ＬＧＱＱＱＰＦＰＰＱＱＰＹ（配列番号９８）、ＩＬＧＫＬＬＳＴＡＡＧＬＬＳＮＬ（配列番号９９）、ＴＦＦＹＧＧＳＲＧＫＲＮＮＦＫＴＥＥＹ（配列番号１００）、Ａｃ－ＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲＸ－Ｂｐｇ－Ｇ（配列番号１０１）、Ａｃ－ＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲ（配列番号１０２）、またはＭＶＲＲＦＬＶＴＬＲＩＲＲＡＣＧＰＰＲＶＲＶ（配列番号１０３）が挙げられる。

場合によっては、ターゲティングポリペプチドは、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のウイルス膜タンパク質またはその断片を含む。場合によっては、ウイルス膜タンパク質を含むターゲティングポリペプチドは、細胞外小胞が標的細胞によって融合またはエンドサイトーシスされる割合を増加させる。いくつかの例では、少なくとも２つのウイルス膜タンパク質は同一である。場合によっては、少なくとも２つのウイルス膜タンパク質は相異なる。場合によっては、ウイルス膜タンパク質は、アダプターポリペプチドのＮ末端に融合される。場合によっては、ウイルス膜タンパク質は、アダプターポリペプチドのＣ末端に融合される。場合によっては、ウイルス膜タンパク質は、アダプターポリペプチドの任意のペプチドの位置で統合され得る。いくつかの例では、ウイルス膜タンパク質は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、または１００個のアミノ酸を含む。ウイルス膜タンパク質の非限定的な例としては、赤血球凝集素、糖タンパク質４１、エンベロープタンパク質、ＶＳＶＧ、ＨＳＶ０１ｇＢ、エボラウイルス糖タンパク質、または融合関連小型膜貫通型（ＦＡＳＴ）タンパク質が挙げられる。

場合によっては、本明細書に記載される細胞外小胞は、少なくとも１つの治療薬を含む。場合によっては、少なくとも１つの治療薬は、細胞外小胞内にある（例えば、カプセル化されている）。場合によっては、治療薬は治療用ポリヌクレオチドである。場合によっては、治療薬は治療用ポリペプチドである。いくつかの例では、治療薬は治療用化合物である。場合によっては、治療薬は、治療用ポリヌクレオチド、治療用ポリペプチド、治療用化合物、またはそれらの組み合わせを含むがん治療薬である。いくつかの例では、細胞外小胞は複数の治療薬を含み、当該複数の治療薬は、治療用ポリヌクレオチド、治療用ポリペプチド、治療用化合物、またはそれらの組み合わせを含む。

場合によっては、本明細書に記載される細胞外小胞は、少なくとも１つのターゲティングポリペプチドを含む。場合によっては、ターゲティングポリペプチドは、腫瘍ターゲティングドメインを含む腫瘍ターゲティングポリペプチドである。場合によっては、腫瘍における、腫瘍ターゲティングドメインを含む腫瘍ターゲティングポリペプチドを含む細胞外小胞の集積率は、腫瘍ターゲティングポリペプチドを有しない細胞外小胞の集積率と比較して高い。いくつかの例では、腫瘍における、腫瘍ターゲティングポリペプチドを含む細胞外小胞の集積率は、腫瘍ターゲティングポリペプチドを欠く細胞外小胞の集積率と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍、または１０，０００倍高い。いくつかの例では、腫瘍における、腫瘍ターゲティングポリペプチドを含む細胞外小胞の集積率は、腫瘍ターゲティングポリペプチドを欠く細胞外小胞の集積率と比較して、少なくとも１００倍高い。

場合によっては、腫瘍ターゲティングポリペプチドは、少なくとも１つの腫瘍ターゲティングドメインを含む。場合によっては、腫瘍ターゲティングドメインは、腫瘍ターゲティングポリペプチドのＮ末端上にあり得る。場合によっては、腫瘍ターゲティングドメインは、腫瘍ターゲティングポリペプチドのＣ末端上にあり得る。場合によっては、腫瘍ターゲティングドメインは、腫瘍ターゲティングポリペプチドにおける任意のペプチドの位置にあり得る。場合によっては、少なくとも２つのターゲティングドメインが、同一の腫瘍ターゲティングポリペプチド上にあり得る。場合によっては、同一の腫瘍ターゲティングポリペプチド上にある少なくとも２つのターゲティングドメインは、同一であり得る。場合によっては、同一の腫瘍ターゲティングポリペプチド上にある少なくとも２つのターゲティングドメインは、異なり得る。いくつかの例では、ターゲティングドメインは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、または１００個のアミノ酸を含む。場合によっては、腫瘍ターゲティングドメインは、ＣＤＸペプチドであり得る。場合によっては、腫瘍ターゲティングドメインは、ＣＲＥＫＡペプチドであり得る。

場合によっては、細胞外小胞表面タンパク質を含む細胞外小胞は、細胞外小胞表面タンパク質を有しない細胞外小胞の半減期と比較して、循環半減期が長い。場合によっては、細胞外小胞表面タンパク質によって延長された細胞外小胞の半減期は、細胞外小胞表面タンパク質を欠く細胞外小胞の半減期よりも、少なくとも９０分、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、４８時間、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１２日、１４日、２１日、２８日、３０日、またはそれ以上長い。

場合によっては、細胞外小胞表面タンパク質を含む細胞外小胞は、細胞外小胞表面タンパク質を欠く細胞外小胞と比較して、毒性が低下している。このような場合、細胞外小胞表面タンパク質は、標的に特異的に結合することが多く、有意なオフターゲット結合がない。場合によっては、毒性とは、腫瘍ターゲティングポリペプチドによって標的とされない細胞に対する毒性を含む。場合によっては、細胞外小胞表面タンパク質を含む細胞外小胞は、細胞外小胞表面タンパク質を欠く細胞外小胞と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上の低下で毒性が低下している。場合によっては、細胞外小胞表面タンパク質を含む細胞外小胞の毒性低下は、細胞外小胞表面タンパク質を欠く細胞外小胞と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上低下する。

場合によっては、細胞外小胞（例えば、エクソソーム）は、細胞外小胞の投与後に対象によって忍容される。例えば、場合によっては、細胞外小胞は免疫応答を誘導しないか、または免疫原性がない。

治療用ポリヌクレオチド
場合によっては、本明細書では、少なくとも１つの治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞が記載される。いくつかの例では、少なくとも１つの治療用ポリヌクレオチドは、細胞外小胞ドナー細胞内にトランスフェクションされる少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドまたはベクターによってコードされる。場合によっては、少なくとも１つの治療用ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるターゲティングポリペプチドにより標的化され、結合された細胞によって、治療用ポリペプチドへと翻訳され得るペプチド配列を含む。

場合によっては、細胞外小胞は、少なくとも１つの治療用ポリヌクレオチドを含む。場合によっては、各細胞外小胞は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、５００、１，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００またはそれ以上の治療用ポリヌクレオチドのコピーを含む。場合によっては、各細胞外小胞は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、５００、１，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００またはそれ以上の本明細書に記載される治療用ｍＲＮＡのコピーを含む。いくつかの例では、細胞外小胞は、少なくとも２つの治療用ポリヌクレオチドを含む。いくつかの例では、細胞外小胞は、少なくとも２つの治療用ポリヌクレオチドを含み、当該少なくとも２つの治療用ポリヌクレオチドは相異なる。場合によっては、細胞外小胞によってカプセル化された少なくとも２つの異なる治療用ポリヌクレオチドは、異なる比率を構成する。例えば、２つの異なる治療用ポリヌクレオチドの第１のものと第２のものとの間の比率は、１：１，０００，０００、１：５００，０００、１：１００，０００、１：５０，０００、１：１０，０００、１：５，０００、１：１，０００、１：５００、１：１００、１：５０、１：１０、１：５、１：４、１：３、１：２、または１：１であり得る。いくつかの例では、細胞外小胞は、同一の細胞外小胞にカプセル化された少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の治療用ポリヌクレオチドを含む。場合によっては、細胞外小胞はエクソソームであり得る。

場合によっては、治療用ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＳＲＰＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｔｍＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ａＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及びｓｈＲＮＡを構成する。場合によっては、治療用ポリヌクレオチドはｍＲＮＡを構成する。場合によっては、ｍＲＮＡは完全にインタクトであるか、または実質的にインタクトである。場合によっては、ｍＲＮＡは、タンパク質の一部をコードする。場合によっては、ｍＲＮＡは、少なくとも５０、１００、２００、５００、１，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、または１，０００，０００個のＲＮＡヌクレオチドを含む。いくつかの例では、治療用ポリヌクレオチドはＤＮＡを構成する。いくつかの例では、治療用ポリヌクレオチドは、治療用ポリペプチドまたはＲＮＡ治療薬をコードするベクター等のＤＮＡを構成する。治療用ポリヌクレオチドは、治療用ポリペプチド（腫瘍抑制タンパク質、ペプチド、変異タンパク質の野生型タンパク質カウンターパート、ＤＮＡ修復タンパク質、タンパク質分解酵素、タンパク質性毒素、細胞内タンパク質の活性を阻害し得るタンパク質、細胞内タンパク質の活性を活性化し得るタンパク質、または損失機能が再構成される必要がある任意のタンパク質、が挙げられるがこれらに限定されない）をコードし得る。治療用ポリヌクレオチド（例えば、メッセンジャーＲＮＡ治療薬）によってコードされ得る治療用ポリペプチドの例としては、１２３Ｆ２、Ａｂｃｂ４、Ａｂｃｃ１、Ａｂｃｇ２、Ａｃｔｂ、Ａｄａ、Ａｈｒ、Ａｋｔ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、Ａｋｔ３、Ａｍｈｒ２、Ａｎｘａ７、Ａｐｃ、Ａｒ、Ａｔｍ、Ａｘｉｎ２、Ｂ２ｍ、Ｂａｒｄ１、Ｂｃ１２１１、Ｂｅｃｎ１、Ｂｈｌｈａｌ５、Ｂｉｎ１、Ｂｌｍ、Ｂｒａｆ、Ｂｒｃａ１、Ｂｒｃａ２、Ｂｒｃａ３、Ｂｒａｆ、Ｂｒｃａｔａ、Ｂｒｉｎｐ３、Ｂｒｉｐ１、Ｂｕｂ１ｂ、Ｂｗｓｃｒ１ａ、Ｃａｄｍ３、Ｃａｓｃ１、Ｃａｓｐ３、Ｃａｓｐ７、Ｃａｓｐ８、Ｃａｖ１、Ｃｃａｍ、Ｃｃｎｄ１、Ｃｃｒ４、Ｃｃｓ１、Ｃｄ２８、Ｃｄｃ２５ａ、Ｃｄ９５、Ｃｄｈ１、Ｃｄｋｎ１ａ、Ｃｄｋｎ１ｂ、Ｃｄｋｎ２ａ、Ｃｄｋｎ２ｂ、Ｃｄｋｎ２ｃ、Ｃｆｔｒ、Ｃｈｅｋ１、Ｃｈｅｋ２、Ｃｒｃｓ１、Ｃｒｃｓ１０、Ｃｒｃｓ１１、Ｃｒｃｓ２、Ｃｒｃｓ３、Ｃｒｃｓ４、Ｃｒｃｓ５、Ｃｒｃｓ６、Ｃｒｃｓ７、Ｃｒｃｓ８、Ｃｒｃｓ９、Ｃｔｎｎｂ１、Ｃｔｓ１、Ｃｙｐｌａ１、Ｃｙｐ２ａ６、Ｃｙｐ２ｂ２、Ｃｙ１ｄ、Ｄｃｃ、Ｄｋｃ１、Ｄｉｃｅｒ１、Ｄｍｔｆ１、Ｄｎｍｔ１、Ｄｐｃ４、Ｅ２ｆ１、Ｅａｆ２、Ｅｅｆ１ａ１、Ｅｇｆｒ、Ｅｇｆｒ４、Ｅｒｂｂ２、Ｅｒｂｂ４、Ｅｒｃｃ２、Ｅｒｃｃ６、Ｅｒｃｃ８、Ｅｒｒｆｉ１、Ｅｓｒ１、Ｅｔｖ４、Ｆａｓ１ｇ、Ｆｂｘｏ１０、Ｆｃｃ、Ｆｇｆｒ３、Ｆｎｔｂ、Ｆｏｘｍ１、Ｆｏｘｎ１、Ｆｕｓ１、Ｆｚｄ６、Ｆｚｄ７、Ｆｚｒ１、Ｇａｄｄ４５ａ、Ｇａｓｔ、Ｇｎａｉ２、Ｇｐｃ１、Ｇｐｒ１２４、Ｇｐｒ８７、Ｇｐｒｃ５ａ、Ｇｐｒｃ５ｄ、Ｇｒｂ２、Ｇｓｔｍ１、Ｇｓｔｍ５、Ｇｓｔｐ１、Ｇｓｔｔ１、Ｈ１９、Ｈ２ａｆｘ、Ｈｃｋ、Ｌｉｍｓ１、Ｈｄａｃ、Ｈｅｘａ、Ｈｉｃ１、Ｈｉｎ１、Ｈｍｍｒ、Ｈｎｐｃｃ８、Ｈｐｒｔ、Ｈｒａｓ、Ｈｔａｔｉｐ２、Ｉ１１ｂ、Ｉ１１１０、Ｉ１２、Ｉ１６、Ｉ１８ｒｂＩｎｈａ、Ｉｔｇａｖ、Ｊｕｎ、Ｊａｋ３、Ｋｉｔ、Ｋｌｆ４、Ｋｒａｓ、Ｋｒａｓ２、Ｋｒａｓ２ｂ、Ｌｉｇ１、Ｌｉｇ４、Ｌｋｂ１、Ｌｍｏ７、Ｌｎｃｒ１、Ｌｎｃｒ２、Ｌｎｃｒ３、Ｌｎｃｒ４、Ｌｔｂｐ４、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、Ｌｙｚ２、Ｌｚｔｓ１、Ｍａｄ１１１、Ｍａｄ２１１、Ｍａｄｒ２／Ｊｖ１８、Ｍａｐｋ１４、Ｍｃｃ、Ｍｃｍ４、Ｍｅｎ１、Ｍｅｎ２、Ｍｅｔ、Ｍｇａｔ５、Ｍｉｆ、Ｍ１ｈ１、Ｍ１ｈ３、Ｍｍａｃ１、Ｍｍｐ８、Ｍｎｔ、Ｍｐｏ、Ｍｓｈ２、Ｍｓｈ３、Ｍｓｈ６、Ｍｓｍｂ、Ｍｔｈｆｒ、Ｍｔｓ１、Ｍｕｔｙｈ、Ｍｙｈ１１、Ｎａｔ２、Ｎｂｎ、Ｎｃｏａ３、Ｎｅｉｌ１、Ｎｆ１、Ｎｆ２、Ｎｆｅ２１１、Ｎｈｅｊ１、Ｎｋｘ２－１、Ｎｋｘ２－９、Ｎｋｘ３－１、Ｎｐｒ１２、Ｎｑｏ１、Ｎｒａｓ、Ｎｕｄｔ１、Ｏｇｇ１、Ｏｘｇｒ１、ｐ１６、ｐ１９、ｐ２１、ｐ２７、ｐ２７ｍｔ、ｐ５７、ｐ１４ＡＲＦ、Ｐａ１ｂ２、Ｐａｒｋ２、Ｐｇｇｔ１ｂ、Ｐｇｒ、Ｐｉ３ｋ、Ｐｉｋ３ｃａ、Ｐｉｗｉｌ２、Ｐ１６、Ｐｌａ２ｇ２ａ、Ｐｌｇ、Ｐ１ｋ３、Ｐｍｓ１、Ｐｍｓ２、Ｐｏｌｄ１、Ｐｏｌｅ、Ｐｐａｒｄ、Ｐｐａｒｇ、Ｐｐｆｉａ２、Ｐｐｍ１ｄ、Ｐｒｄｍ２、Ｐｒｄｘ１、Ｐｒｋａｒ１ａ、Ｐｔｃｈ、ＰＴＥＮ、Ｐｒｏｍ１、Ｐｓｃａ、Ｐｔｃｈｌ、Ｐｔｆ１ａ、Ｐｔｇｅｒ２、Ｐｔｐｎ１３、Ｐｔｐｒｊ、Ｒａｒａ、Ｒａｄ５１、Ｒａｓｓｆ１、Ｒｂ、Ｒｂ１、Ｒｂ１ｃｃ１、Ｒｂ１２、Ｒｅｃｇ１４、Ｒｅｔ、Ｒｇｓ５、Ｒｈｏｃ、Ｒｉｎｔ１、Ｒｏｂｏ１、Ｒｐ１３８、Ｓ１００ａ４、ＳＣＧＢ１Ａ１、Ｓｋｐ２、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ４、Ｓｍａｒｃｂ１、Ｓｍｏ、Ｓｎｘ２５、Ｓｐａｔａ１３、Ｓｒｐｘ、Ｓｓｉｃ１、Ｓｓｔｒ２、Ｓｓｔｒ５、Ｓｔａｔ３、Ｓｔ５、Ｓｔ７、Ｓｔ１４、Ｓｔｋ１１、Ｓｕｄｓ３、Ｔａｐ１、Ｔｂｘ２１、Ｔｅｒｃ、Ｔｎｆ、Ｔｐ５３、Ｔｐ７３、Ｔｒｐｍ５、Ｔｓｃ２、Ｔｓｃ１、Ｖｈ１、Ｗｒｎ、Ｗｔ１、Ｗｔ２、Ｘｒｃｃｌ、Ｘｒｃｃ５、Ｘｒｃｃ６、またはＺａｃ１が挙げられる。場合によっては、本明細書に記載される治療用ポリヌクレオチドは、ＰＴＥＮをコードし得る。場合によっては、本明細書に記載される治療用ポリヌクレオチドからコードされる治療用ポリペプチドは、ＰＴＥＮであり得る。

いくつかの例では、細胞外小胞にカプセル化された治療用ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ治療薬、ｍＲＮＡ治療薬）のコピー数は、細胞外小胞当たり、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１００，０００、またはそれ以上である。いくつかの例では、本明細書に記載される各細胞外小胞またはエクソソームにカプセル化された治療用ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ治療薬、ｍＲＮＡ治療薬）のコピー数は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１００，０００、またはそれ以上である。

いくつかの例では、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションによってトランスフェクションされた細胞外小胞ドナー細胞から産生された細胞外小胞にカプセル化された治療用ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ治療薬またはメッセンジャーＲＮＡ治療薬）のコピー数は、他のトランスフェクション方法（例えば、従来のバルクエレクトロポレーション、遺伝子銃、リポフェクタミントランスフェクションなど）によってトランスフェクションされた細胞外小胞ドナー細胞から産生された細胞外小胞にカプセル化された治療用ポリヌクレオチドのコピー数と比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれ以上増加する。いくつかの例では、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞から産生された細胞外小胞にカプセル化された治療用ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ治療薬またはメッセンジャーＲＮＡ治療薬）のコピー数は、治療用ポリヌクレオチドを細胞外小胞内に直接導入する（例えば、治療用ポリヌクレオチドを細胞外小胞内に直接トランスフェクションする）ことによって産生された細胞外小胞にカプセル化された治療用ポリヌクレオチドのコピー数と比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれ以上増加する。

いくつかの例では、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションによってトランスフェクションされた細胞外小胞ドナー細胞から産生された細胞外小胞にカプセル化された治療用ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ治療薬またはメッセンジャーＲＮＡ治療薬）は、完全にまたは実質的にインタクトであり、当該カプセル化された治療用ポリヌクレオチドのコピーのうちの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上は、完全にインタクトまたは実質的にインタクトである。場合によっては、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションによってトランスフェクションされた細胞外小胞ドナー細胞から産生された細胞外小胞にカプセル化された、完全にインタクトまたは実質的にインタクトな治療用ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ治療薬またはメッセンジャーＲＮＡ治療薬）の百分率は、他のトランスフェクション方法（例えば、従来のバルクエレクトロポレーション、遺伝子銃、リポフェクタミントランスフェクションなど）によってトランスフェクションされた細胞外小胞ドナー細胞から産生された細胞外小胞にカプセル化された、完全にインタクトまたは実質的にインタクトな治療用ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ治療薬またはメッセンジャーＲＮＡ治療薬）の百分率と比較して、増加する。場合によっては、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションによってトランスフェクションされた細胞外小胞ドナー細胞から産生された細胞外小胞にカプセル化された、完全にインタクトまたは実質的にインタクトな治療用ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ治療薬またはメッセンジャーＲＮＡ治療薬）の数は、他のトランスフェクション方法（例えば、従来のバルクエレクトロポレーション、遺伝子銃、リポフェクタミントランスフェクションなど）によってトランスフェクションされた細胞外小胞ドナー細胞から産生された細胞外小胞にカプセル化された、完全にインタクトまたは実質的にインタクトな治療用ポリヌクレオチドの数と比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれ以上増加する。場合によっては、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションによってトランスフェクションされた細胞外小胞ドナー細胞から産生された細胞外小胞にカプセル化された、完全にインタクトまたは実質的にインタクトな治療用ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ治療薬またはメッセンジャーＲＮＡ治療薬）の数は、治療用ポリヌクレオチドを細胞外小胞内に直接導入する（例えば、治療用ポリヌクレオチドを細胞外小胞内に直接トランスフェクションする）ことによって産生された細胞外小胞にカプセル化された、完全にインタクトまたは実質的にインタクトな治療用ポリヌクレオチドの数と比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれ以上増加する。

場合によっては、治療用ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾核酸または核酸アナログを構成する。模範的な修飾核酸としては、ウラシル－５－イル、ヒポキサンチン－９－イル（Ｉ）、２－アミノアデニン－９－イル、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンとグアニンの６－メチル及び他のアルキル誘導体、アデニンとグアニンの２－プロピル及び他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン及び２－チオシトシン、５－ハロウラシル及びシトシン、５－プロピニルウラシル及びシトシン、６－アゾウラシル、シトシン及びチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル及び他の８置換アデニンとグアニン、５－ハロ特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル及び他の５－置換ウラシルとシトシン、７－メチルグアニン及び７－メチルアデニン、８－アザグアニン及び８－アザアデニン、７－デアザグアニン及び７－デアザアデニンならびに３－デアザグアニン及び３－デアザアデニンが挙げられるが、これらに限定されない。ある種の修飾核酸は、５置換ピリミジン、６－アザピリミジンならびにＮ－２置換プリン、Ｎ－６置換プリン、Ｏ－６置換プリン、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル、５－プロピニルシトシン、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、二本鎖形成の安定性を高めるもの、ユニバーサル核酸、疎水性核酸、乱交雑核酸、サイズ拡張核酸、フッ素化核酸、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンとグアニンの６－メチル及び他のアルキル誘導体、アデニンとグアニンの２－プロピル及び他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン及び２－チオシトシン、５－ハロウラシル、５－ハロシトシン、５－プロピニル（－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ_３）ウラシル、５－プロピニルシトシン、ピリミジン核酸の他のアルキニル誘導体、６－アゾウラシル、６－アゾシトシン、６－アゾチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル及び他の８置換アデニンとグアニン、５－ハロ特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル及び他の５置換ウラシルとシトシン、７－メチルグアニン、７－メチルアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノ－アデニン、８－アザグアニン、８－アザアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザアデニン、３－デアザグアニン、３－デアザアデニン、三環式ピリミジン、フェノキサジンシチジン（［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）、Ｇ－クランプ、フェノキサジンシチジン（例えば、９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－２－オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ－ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－２－オン）、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環で置き換えられているもの、７－デアザ－アデニン、７－デアザグアノシン、２－アミノピリジン、２－ピリドン、アザシトシン、５－ブロモシトシン、ブロモウラシル、５－クロロシトシン、塩素化シトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５－フルオロシトシン、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、５，６－ジヒドロシトシン、５－ヨードシトシン、ヒドロキシ尿素、ヨードウラシル、５－ニトロシトシン、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－フルオロウラシル、５－ヨードウラシル、２－アミノ－アデニン、６－チオ－グアニン、２－チオ－チミン、４－チオ－チミン、５－プロピニル－ウラシル、４－チオ－ウラシル、Ｎ４－エチルシトシン、７－デアザグアニン、７－デアザ－８―アザグアニン、５－ヒドロキシシトシン、２’－デオキシウリジン、２－アミノ－２’－デオキシアデノシン等である。当該技術分野においては、様々な複素環塩基ならびに様々な糖部（及び糖アナログ）を含む修飾核酸が利用可能であり、場合によっては、核酸は、天然に存在する核酸の主要な５つの塩基構成要素以外の１つまたはいくつかの複素環塩基を含む。例えば、場合によっては複素環塩基としては、ウラシル－５－イル、シトシン－５－イル、アデニン－７－イル、アデニン－８－イル、グアニン－７－イル、グアニン－８－イル、４－アミノピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－５－イル、２－アミノ－４－オキソピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－５－イル、２－アミノ－４－オキソピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－３－イル基が挙げられ、プリンは９位を介して、ピリミジンは１位を介して、ピロロピリミジンは７位を介して、及びピラゾロピリミジンは１位を介して核酸の糖部に付着される。

場合によっては、ヌクレオチドアナログはリン酸部でも修飾される。リン酸部修飾としては、限定されないが、２つのヌクレオチド間の連結において修飾を有するものが挙げられ、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び、３’－アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィナート、３’－アミノホスホロアミダート及びアミノアルキルホスホロアミダートを含むホスホロアミダート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびにボラノホスフェートを含有する。２つのヌクレオチド間のこれらのリン酸エステルまたは修飾リン酸エステル結合は、３’－５’連結または２’－５’連結を経由し、連結は、３’－５’から５’－３’、または２’－５’から５’－２’等の反転した方向性を含有することが理解されている。また、様々な塩、混合塩、及び遊離酸形態も含まれる。

場合によっては、修飾核酸は、２’，３’－ジデオキシ－２’，３’－ジデヒドロ－ヌクレオシド５’－置換ＤＮＡ及びＲＮＡ誘導体または修飾塩基を有するモノホスフェートとして作製された５’－置換モノマーを含む。

場合によっては、修飾核酸は、５’－ＣＨ_２－置換２’－Ｏ－保護ヌクレオシド等、糖環の５’位及び２’位での修飾を含む。場合によっては、修飾核酸は、オリゴヌクレオチドへの組み込みのために調製されているアミド連結ヌクレオシドダイマーを含み、ダイマーの３’連結ヌクレオシド（５’から３’）は、２’－ＯＣＨ_３及び５’－（Ｓ）－ＣＨ_３を含む。修飾核酸は、２’－置換５’－ＣＨ_２（またはＯ）修飾ヌクレオシドを含み得る。修飾核酸は、５’－メチレンホスホネートＤＮＡ及びＲＮＡモノマー、ならびにダイマーを含み得る。修飾核酸は、２’－置換を有する５’－ホスホネートモノマー及び他の修飾５’－ホスホネートモノマーを含み得る。修飾核酸は、５’－修飾メチレンホスホネートモノマーを含み得る。修飾核酸は、５’及び／または６’位にヒドロキシル基を含む、５’または６’－ホスホネートリボヌクレオシドアナログを含み得る。修飾核酸は、５’－ホスホネートデオキシリボヌクレオシドモノマー及び５’－リン酸基を有するダイマーを含み得る。修飾核酸は、６’－ホスホネート基を有するヌクレオシドを含み得、５’または／及び６’位は、非置換か、またはチオ－ｔｅｒｔ－ブチル基（ＳＣ（ＣＨ_３）_３）（及びそのアナログ）、メチレンアミノ基（ＣＨ_２ＮＨ_２）（及びそのアナログ）もしくはシアノ基（ＣＮ）（及びそのアナログ）で置換されている。

場合によっては、修飾核酸は、糖部修飾も含む。場合によっては、核酸は、糖基が修飾されている１つまたは複数のヌクレオシドを含有する。このような糖修飾ヌクレオシドは、ヌクレアーゼ安定性の増強、結合親和性の向上、またはいくつかの他の有益な生物学的特性を付与することがある。特定の場合では、核酸は、化学修飾リボフラノース環部を含む。化学修飾リボフラノース環の例としては、限定されないが、置換基（５’及び／または２’置換基を含む）の付加；二環式核酸（ＢＮＡ）を形成するための２つの環原子の架橋；リボシル環酸素原子のＳ、Ｎ（Ｒ）、またはＣ（Ｒ_１）（Ｒ_２）（Ｒ＝Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキルまたは保護基）での置換；及びそれらの組み合わせが挙げられる。

いくつかの例では、修飾核酸は、修飾された糖または糖アナログを含む。したがって、リボース及びデオキシリボースに加えて、糖部は、ペントース、デオキシペントース、ヘキソース、デオキシヘキソース、グルコース、アラビノース、キシロース、リキソース、または糖「アナログ」シクロペンチル基であり得る。糖は、ピラノシルまたはフラノシル形態であり得る。糖部は、リボース、デオキシリボース、アラビノースまたは２’－Ｏ－アルキルリボースのフラノシドであってもよく、糖は、［アルファ］または［ベータ］アノマー立体配置のいずれかで、それぞれの複素環塩基に付着され得る。糖修飾としては、限定されないが、２’－アルコキシ－ＲＮＡアナログ、２’－アミノ－ＲＮＡアナログ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、及び２’－アルコキシ－またはアミノ－ＲＮＡ／ＤＮＡキメラが挙げられる。例えば、糖修飾は、２’－Ｏ－メチル－ウリジンまたは２’－Ｏ－メチル－シチジンを含んでもよい。糖修飾は、２’－Ｏ－アルキル－置換デオキシリボヌクレオシド及び２’－Ｏ－エチレングリコール様リボヌクレオシドを含む。これらの糖または糖アナログ、及びこのような糖またはアナログが複素環塩基（核酸塩基）に付着されているそれぞれの「ヌクレオシド」の調製は公知である。糖修飾は他の修飾でなされてもよいし、他の修飾と組み合わされてもよい。

糖部修飾は、改変修飾のみならず、リボース及びデオキシリボースの天然修飾も含む。糖修飾としては、限定されないが、２’位における以下の修飾：ＯＨ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルキニル；またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキルが挙げられ、アルキル、アルケニル、及びアルキニルは、置換または非置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキル、もしくはＣ_２～Ｃ_１０アルケニル及びアルキニルであってもよい。２’糖修飾としては、限定されないが、－Ｏ［（ＣＨ_２）_ｎＯ］_ｍＣＨ_３、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＣＨ_３、－Ｏ（ＣＨ_２）ｎＮＨ_２、－Ｏ（ＣＨ_２）ｎＣＨ_３、－Ｏ（ＣＨ_２）ｎＯＮＨ_２、及び－Ｏ（ＣＨ_２）ｎＯＮ［（ＣＨ_２）ｎＣＨ_３］_２も挙げられ、ｎ及びｍは１～約１０である。

２’位における他の修飾としては、限定されないが、Ｃ_１～Ｃ_１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリル、Ｏ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ_３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、及び同様の特性を有する他の置換基が挙げられる。同様の修飾もまた、糖上の他の位置、特に３’末端ヌクレオチドまたは２’－５’連結オリゴヌクレオチドにおける糖の３’位、及び５’末端ヌクレオチドの５’位になされてもよい。修飾された糖としては、ＣＨ_２及びＳ等、架橋環酸素に修飾を含有するものも挙げられる。ヌクレオチド糖アナログはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部等の糖模倣物を有してもよい。このような修飾された糖構造の調製を教示し、一連の塩基修飾を詳述及び説明する、多数の米国特許が存在する。

糖部修飾を有する核酸の例としては、限定されないが、５’－ビニル、５’－メチル（ＲまたはＳ）、４’－Ｓ、２’－Ｆ、２’－ＯＣＨ_３、及び２’－Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＣＨ_３置換基を含む核酸が挙げられる。２’位における置換基はまた、アリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ－アリル、Ｏ－（Ｃ_１～Ｃ_１０アルキル）、ＯＣＦ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_２ＳＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_２－Ｏ－Ｎ（Ｒ_ｍ）（Ｒ_ｎ）、及びＯ－ＣＨ_２－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｒ_ｍ）（Ｒ_ｎ）から選択され得、各Ｒ_ｍ及びＲ_ｎは、独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキルである。

特定の場合では、本明細書に記載される核酸は１つまたは複数の二環性核酸を含む。このような特定の場合では、二環性核酸は、４’リボシル環原子と２’リボシル環原子との間の架橋を含む。特定の場合では、本明細書で提供される核酸は、１つまたは複数の二環性核酸を含み、架橋により４’から２’の二環性核酸が構成される。このような４’から２’の二環性核酸の例としては、限定されないが、以下の式：４’－（ＣＨ_２）－Ｏ－２’（ＬＮＡ）；４’－（ＣＨ_２）－Ｓ－２’；４’－（ＣＨ_２）_２－Ｏ－２’（ＥＮＡ）；４’－ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｏ－２’及び４’－ＣＨ（ＣＨ_２ＯＣＨ_３）－Ｏ－２’、ならびにそれらのアナログ；４’－Ｃ（ＣＨ_３）（ＣＨ_３）－Ｏ－２’及びそのアナログ、のうちの１つが挙げられる。

特定の場合では、核酸は連結核酸を含む。核酸は、任意の核酸間連結を使用して互いに連結され得る。核酸間連結基の２つの主なクラスは、リン原子の有無によって定められる。代表的なリン含有核酸間連結基としては、限定されないが、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホロアミダート、及びホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）が挙げられる。代表的な非リン含有核酸間連結基としては、限定されないが、メチレンメチルイミノ（－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_３）－Ｏ－ＣＨ_２－）、チオジエステル（－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｓ－）、チオノカルバミン酸（－Ｏ－Ｃ（Ｏ）（ＮＨ）－Ｓ－）；シロキサン（－Ｏ－Ｓｉ（Ｈ）_２－Ｏ－）；及びＮ，Ｎ^＊－ジメチルヒドラジン（－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_３）－Ｎ（ＣＨ_３））が挙げられる。特定の態様において、キラル原子を有する核酸間連結基、例えばアルキルホスホネート及びホスホロチオエートは、ラセミ混合物として、別々のエナンチオマーとして調製され得る。修飾核酸は単一の修飾を含有し得る。修飾核酸は、１つの部分内または異なる部分間に複数の修飾を含有し得る。

核酸に対するリン酸バックボーン修飾としては、限定されないが、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロアミダート（架橋または非架橋）、ホスホトリエステル、ホスホロジチオエート、ホスホジチオエート、及びボラノホスフェートが挙げられ、任意の組み合わせで使用されてもよい。他の非リン酸連結も使用されてもよい。

場合によっては、バックボーン修飾（例えばメチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロアミダート及びホスホロジチオエートのヌクレオチド間連結）は、修飾核酸に免疫調節活性を付与し得、及び／またはｉｎｖｉｖｏでのそれらの安定性を高め得る。

いくつかの例では、リン誘導体（または修飾されたリン酸基）は、糖または糖アナログ部内に付着され、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミダートなどであり得る。

場合によっては、バックボーン修飾は、ホスホジエステル結合を、アニオン、中性またはカチオン基等の代替部分と置き換えることを含む。このような修飾の例としては、アニオン性ヌクレオシド間連結；Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミダート修飾；ボラノホスフェートＤＮＡ；プロオリゴヌクレオチド；メチルホスホネート等の中性ヌクレオシド間連結；アミド連結ＤＮＡ；メチレン（メチルイミノ）連結；ホルムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）及びチオホルムアセタール（ｔｈｉｏｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）連結；スルホニル基含有バックボーン；モルフォリノオリゴ；ペプチド核酸（ＰＮＡ）；及び正に帯電したデオキシリボ核酸グアニジン（ＤＮＧ：ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃｇｕａｎｉｄｉｎｅ）オリゴ（Ｍｉｃｋｌｅｆｉｅｌｄ，２００１，ＣｕｒｒｅｎｔＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ８：１１５７－１１７９）が挙げられる。修飾核酸は、１つまたは複数の修飾、例えば、ホスホジエステル結合とホスホロチオエート結合との組み合わせ等のリン酸連結の組み合わせを含む、キメラまたは混合バックボーンを含んでもよい。

リン酸置換基としては、例えば、短鎖アルキルまたはシクロアルキルのヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子及びアルキルまたはシクロアルキルのヌクレオシド間連結、あるいは１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式のヌクレオシド間連結が挙げられる。これらは、モルフォリノ連結（ヌクレオシドの糖部から部分的に形成される）を有するもの；シロキサンバックボーン；スルフィド、スルホキシド、及びスルホンバックボーン；ホルムアセチル（ｆｏｒｍａｃｅｔｙｌ）及びチオホルムアセチル（ｔｈｉｏｆｏｒｍａｃｅｔｙｌ）バックボーン；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチルバックボーン；アルケン含有バックボーン；スルファミン酸バックボーン；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノバックボーン；スルホナート及びスルホンアミドバックボーン；アミドバックボーン；ならびに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ_２構成要素部位を有する他のものを含む。ヌクレオチドの糖及びリン酸部の両方が、例えばアミド型連結（アミノエチルグリシン）（ＰＮＡ）により置き換えられ得ることも、ヌクレオチド置換基において理解されている。米国特許第５，５３９，０８２号；５，７１４，３３１号；及び５，７１９，２６２号は、ＰＮＡ分子の作製及び使用方法を教示しており、それらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。Ｎｉｅｌｓｅｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７－１５００も参照されたい。また、他のタイプの分子（コンジュゲート）をヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに連結させて、例えば、細胞の取り込みを増大させることも可能である。コンジュゲートは、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに化学的に連結され得る。このようなコンジュゲートとしては、限定されないが、脂質部（コレステロール部、コール酸、チオエテール（例えばヘキシル－Ｓ－トリチルチオール）、チオコレステロール、脂肪族鎖（例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基）、リン脂質（例えばジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチルアンモニウムｌ－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－Ｓ－Ｈ－ホスホナート）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖等）、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部、あるいはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステリン部が挙げられる。

場合によっては、本明細書に記載される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、天然の核酸分子と比較した場合、例えばＲＮａｓｅＨ等のリボヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅ等のデオキシリボヌクレアーゼ、または５’－３’エキソヌクレアーゼ及び３’－５’エキソヌクレアーゼ等のエキソヌクレアーゼ、等のヌクレアーゼに対する耐性があり得る。いくつかの例では、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、もしくは２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾物、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、モルフォリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイト、またはそれらの組み合わせを含み、例えばＲＮａｓｅＨ等のリボヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅ等のデオキシリボヌクレアーゼ、または５’－３’エキソヌクレアーゼ及び３’－５’エキソヌクレアーゼ等のエキソヌクレアーゼ、等のヌクレアーゼに対して耐性がある。いくつかの例では、２’－Ｏ－メチル修飾核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼまたは３’－５’エキソヌクレアーゼ耐性）がある。いくつかの例では、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）修飾核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼまたは３’－５’エキソヌクレアーゼ耐性）がある。いくつかの例では、２’－Ｏ－アミノプロピル修飾核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼまたは３’－５’エキソヌクレアーゼ耐性）がある。いくつかの例では、２’－デオキシ修飾核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼまたは３’－５’エキソヌクレアーゼ耐性）がある。いくつかの例では、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ修飾核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼまたは３’－５’エキソヌクレアーゼ耐性）がある。いくつかの例では、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）修飾核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼまたは３’－５’エキソヌクレアーゼ耐性）がある。いくつかの例では、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）修飾核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼまたは３’－５’エキソヌクレアーゼ耐性）がある。いくつかの例では、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）修飾核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼまたは３’－５’エキソヌクレアーゼ耐性）がある。いくつかの例では、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）修飾核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼまたは３’－５’エキソヌクレアーゼ耐性）がある。いくつかの例では、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼまたは３’－５’エキソヌクレアーゼ耐性）がある。いくつかの例では、ＬＮＡ修飾核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼまたは３’－５’エキソヌクレアーゼ耐性）がある。いくつかの例では、ＥＮＡ修飾核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼまたは３’－５’エキソヌクレアーゼ耐性）がある。いくつかの例では、ＨＮＡ修飾核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼまたは３’－５’エキソヌクレアーゼ耐性）がある。いくつかの例では、モルフォリノは、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼまたは３’－５’エキソヌクレアーゼ耐性）がある。いくつかの例では、ＰＮＡ修飾核酸分子は、ヌクレアーゼに対する耐性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼまたは３’－５’エキソヌクレアーゼ耐性）がある。いくつかの例では、メチルホスホネートヌクレオチド修飾核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼまたは３’－５’エキソヌクレアーゼ耐性）がある。いくつかの例では、チオールホスホネートヌクレオチド修飾核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼまたは３’－５’エキソヌクレアーゼ耐性）がある。いくつかの例では、２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイトを含む核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼまたは３’－５’エキソヌクレアーゼ耐性）がある。いくつかの例では、本明細書に記載される５’コンジュゲートは、５’－３’エキソヌクレアーゼ切断を阻害する。いくつかの例では、本明細書に記載される３’コンジュゲートは、３’－５’エキソヌクレアーゼ切断を阻害する。

さらなる場合では、本明細書に記載される修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、その安定性を高めるために修飾される。いくつかの実施形態では、核酸分子はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である。いくつかの例では、ｍＲＮＡは、その安定性を高めるために、１つまたは複数の修飾によって修飾され得る。場合によっては、ｍＲＮＡは、２’ヒドロキシル位における、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、もしくは２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾等により、または固定化もしくは架橋リボースコンフォメーション（例えば、ＬＮＡまたはＥＮＡ）により、修飾され得る。場合によっては、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、２’－Ｏ－メチル及び／または２’－Ｏ－メトキシエチルリボースによって修飾される。場合によっては、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、その安定性を高めるために、モルフォリノ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、及び／または２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイトも含む。いくつかの例では、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、キラルに純粋な（または立体的に純粋な）核酸分子である。いくつかの例では、キラルに純粋な（または立体的に純粋な）核酸分子は、その安定性を高めるために修飾される。

いくつかの例では、本明細書に記載される細胞外小胞は、本明細書に記載される治療用ポリペプチドのいずれか少なくとも１つを含む。場合によっては、少なくとも１つの治療用ポリペプチドは、細胞外小胞ドナー細胞内にトランスフェクションされる少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドまたはベクターによってコードされる。

場合によっては、治療用ポリヌクレオチドは、細胞外小胞ドナー細胞によって翻訳されて、少なくとも１つの治療用ポリペプチドが得られる。場合によっては、治療用ポリヌクレオチドによってコードされる治療用ポリペプチドは、細胞外小胞ドナー細胞によって産生及び分泌される細胞外小胞によってカプセル化され得る。場合によっては、細胞外小胞は、ナノエレクトロポレーションされるベクターによってコードされた治療用ポリヌクレオチド及び治療用ポリペプチドの両方をカプセル化し得る。場合によっては、細胞外小胞はエクソソームであり得る。

いくつかの例では、本明細書に記載される細胞外小胞は、少なくとも１つの治療用化合物を含み得る。場合によっては、少なくとも１つの治療用化合物は、本明細書に記載される細胞外小胞表面タンパク質のいずれか１つによって複合化または繋留される。場合によっては、少なくとも１つの治療用化合物は、細胞外小胞内にある。本明細書に記載される組成物及び方法で使用するための模範的な治療用化合物としては、乳癌、卵巣癌、肺癌（非小細胞肺癌及び小細胞肺癌を含む）、膵癌、脳癌（多形神経膠芽腫及び未分化星状細胞腫等の脳腫瘍を含む）、膀胱癌、カポジ肉腫、リンパ腫、急性リンパ性白血病、及び子宮頸癌を治療する治療用化合物が挙げられる。本明細書に記載される組成物及び方法で使用するための模範的な治療用化合物としては、ヌクレオシドアナログ、アルキル化剤、挿入剤、及びチューブリン標的薬である治療用化合物が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物及び方法で使用するための治療用化合物は、ゲムシタビン塩酸塩、テモゾロミド、ドキソルビシン、及びパクリタキセルからなる群から選択される。

細胞外小胞を用いた治療
本明細書に記載される細胞外小胞を含む組成物または医薬組成物を治療有効量で投与することにより、対象の疾患を治療する方法が本明細書に記載される。場合によっては、細胞外小胞は、本明細書に記載される少なくとも１つのターゲティングポリペプチド及び少なくとも１つの治療薬を含む。場合によっては、ターゲティングポリペプチドは、腫瘍ターゲティングドメイン、組織ターゲティングドメイン、細胞膜透過性ペプチド、ウイルス膜タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせもしくは断片を含む異種ターゲティングドメインを含む。いくつかの例では、ターゲティングドメインはそれぞれ、疾患細胞に関連する細胞表面マーカーに結合し、その際、細胞外小胞は疾患細胞に結合すると同時に、少なくとも１つの治療薬を疾患細胞に送達する。場合によっては、疾患細胞はがん細胞である。場合によっては、疾患細胞は非がん性病変細胞である。いくつかの例では、疾患細胞は腫瘍細胞である。いくつかの例では、少なくとも１つの治療薬は、治療用ポリヌクレオチド、治療用ポリペプチド、治療用化合物、がん治療薬、またはそれらの組み合わせを含む。

場合によっては、少なくとも１つのターゲティングポリペプチドを含む細胞外小胞によって送達された治療薬の標的細胞による取り込みは、ターゲティングポリペプチドを有しない細胞外小胞によって送達された治療薬の標的細胞による取り込みと比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれ以上多く増加する。いくつかの例では、少なくとも１つのターゲティングポリペプチドを含む細胞外小胞によって送達された治療薬の取り込みが増加した標的細胞は、がん性細胞、非がん性病変細胞、腫瘍の一部としての細胞、または組織の一部としての細胞である。

場合によっては、本開示に記載されるターゲティングポリペプチド及び治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞を用いて疾患を治療する方法が本明細書に記載される。場合によっては、ターゲティングポリペプチド及び治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞を用いて腫瘍を治療する方法が本明細書に記載される。場合によっては、本明細書に記載される細胞外小胞を用いて腫瘍を治療する方法により、腫瘍成長が阻害される。例えば、場合によっては、腫瘍成長は、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％またはそれ以上阻害されることがある。場合によっては、本明細書に記載される細胞外小胞を用いて腫瘍を治療する方法により、腫瘍成長が抑えられる（例えば、腫瘍細胞の死による腫瘍のサイズ減少または排除）。場合によっては、腫瘍を治療する方法は、治療用ポリヌクレオチド、治療用ポリペプチド、治療用化合物、がん治療薬、またはそれらの組み合わせを、細胞外小胞によって腫瘍細胞に送達することを含む。細胞外小胞によって送達される治療用ポリヌクレオチド、治療用ポリペプチド、治療用化合物、がん治療薬、またはそれらの組み合わせによって治療され得る腫瘍細胞の非限定的な例としては、棘細胞腫、腺房細胞癌、聴神経腫、末端部黒子黒色腫、先端汗腺腫、急性好酸球性白血病、急性リンパ性白血病、急性巨核芽球性白血病、急性単球性白血病、急性分化型骨髄性白血病、急性ミエロイド系樹状細胞白血病、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、アダマンチノーマ、腺癌、腺様嚢胞癌、アデノーマ、腺様歯原性腫瘍、副腎皮質癌、成人Ｔ細胞白血病、悪性ＮＫ細胞性白血病、エイズ関連癌、エイズ関連リンパ腫、胞状軟部肉腫、エナメル上皮線維腫、肛門癌、未分化大細胞性リンパ腫、組織非形成性甲状腺癌、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、血管筋脂肪腫、血管肉腫、虫垂癌、星細胞腫、非定型奇形腫様ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、基底様癌、Ｂ細胞白血病、Ｂ細胞リンパ腫、ベリニ管癌、胆道癌、膀胱癌、芽細胞腫、骨癌、骨腫瘍、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、ブレンネル腫瘍、気管支腫瘍、細気管支肺胞上皮癌、褐色腫、バーキットリンパ腫、原発部位不明の癌、カルチノイド腫瘍、癌腫、上皮内癌、陰茎癌、原発部位不明の癌腫、癌肉腫、キャッスルマン病、中枢神経系胚芽腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、子宮頸癌、肝内胆管癌、軟骨腫、軟骨肉腫、脊索腫、絨毛癌、脈絡叢乳頭腫瘍、慢性リンパ性白血病、慢性単球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、慢性好中球白血病、明細胞腫、大腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、デゴス病、隆起性皮膚線維肉腫、類皮嚢胞腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、胚芽異形成性神経上皮腫瘍、胎児性癌、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜癌、子宮内膜子宮癌、類内膜腫瘍、腸疾患関連Ｔ細胞リンパ腫、脳室上衣芽細胞腫、脳室上衣細胞腫、類上皮肉腫、赤白血病、食道癌、鼻腔神経芽細胞腫、ユーイングファミリー腫瘍、ユーイングファミリー肉腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、乳腺外ページェット病、卵管癌、胎児内胎児、線維腫、線維肉腫、濾胞性リンパ腫、濾胞性甲状腺癌、胆嚢癌、神経節膠腫、神経節神経細胞腫、胃癌、胃リンパ腫、胃腸癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質性腫瘍、胚細胞性腫瘍、胚細胞腫、妊娠性絨毛癌、妊娠性絨毛性腫瘍、骨巨細胞腫瘍、多形性グリア芽細胞腫、グリオーマ、大脳神経膠腫症、グロムス腫瘍、グルカゴノーマ、性腺芽細胞腫、顆粒膜細胞腫、毛髪様細胞白血病、頭頸部癌、心臓癌、血管芽細胞腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫、血液悪性腫瘍、原発性肝細胞癌、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、遺伝性乳癌卵巣癌症候群、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部神経膠腫、炎症性乳癌、眼内黒色腫、島細胞癌、島細胞腫瘍、若年性骨髄単球性白血病、カポジ肉腫、腎臓癌、クラツキン腫瘍、クルーケンベルグ癌、喉頭癌、悪性黒子型黒色腫、白血病、口唇及び口腔癌、脂肪肉腫、肺癌、黄体腫、リンパ管腫、リンパ管肉腫、リンパ上皮腫、リンパ性白血病、リンパ腫、マクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫、骨の悪性線維性組織球腫、悪性神経膠腫、悪性中皮腫、悪性神経鞘腫、悪性ラブドイド腫瘍、悪性トリトン腫瘍、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、肥満細胞性白血病、縦隔胚細胞性腫瘍、縦隔腫瘍、甲状腺髄様癌、髄芽腫、髄芽腫、髄様上皮腫、黒色腫、髄膜腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発性潜在性の転移性頸部扁平上皮癌、転移性尿路上皮癌、ミュラー管混合腫瘍、単球性白血病、口腔癌、粘液性腫瘍、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、菌状息肉症、骨髄異形成疾患、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、骨髄様肉腫、骨髄増殖性疾患、粘液腫、鼻腔癌、鼻咽腔癌、新生物、神経鞘腫、神経芽細胞腫、神経芽細胞腫、神経線維腫、神経腫、結節性黒色腫、非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚癌、非小細胞肺癌、眼腫瘍、乏突起星状細胞腫、乏突起神経膠腫、膨大細胞腫、視神経鞘髄膜腫、口腔癌、口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、低悪性度卵巣腫瘍、乳房ページェット病、パンコースト腫瘍、膵癌、乳頭状甲状腺癌、乳頭腫症、傍神経節腫、副鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、血管周囲類上皮細胞腫瘍、咽頭癌、クロム親和性細胞腫、中間型松果体実質腫瘍、松果体芽細胞腫、下垂体細胞腫、下垂体腺腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍、胸膜肺芽腫、多胚腫、前駆Ｔ－リンパ芽球性リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、原発性肝細胞癌、原発性肝癌、原発性腹膜癌、胎生型神経外胚芽性腫瘍、前立腺癌、腹膜偽粘液腫、直腸癌、腎細胞癌、１５番染色体上のＮＵＴ遺伝子に関与する呼吸器癌、網膜芽細胞腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、リヒター形質転換、仙尾部奇形腫、唾液腺癌、肉腫、神経鞘腫症、皮脂腺癌、続発性新生物、セミノーマ、漿液性腫瘍、セルトリ・ライディッヒ細胞腫、性索間質性腫瘍、セザリー症候群、印環細胞癌、皮膚癌、青色小円形細胞腫瘍、小細胞癌、小細胞肺癌、小細胞型リンパ腫、小腸癌、軟部組織肉腫、ソマトスタチン産生腫瘍、煤煙性いぼ、脊髄腫瘍、脊椎腫瘍、脾臓周辺帯リンパ腫、扁平上皮癌、胃癌、表在性黒色腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、表層上皮性・間質性腫瘍、滑膜肉腫、Ｔ細胞性急性リンパ性白血病、Ｔ細胞性大顆粒リンパ球性白血病、Ｔ細胞性白血病、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞性前リンパ性白血病、奇形腫、末期リンパ腫、精巣癌、卵巣卵胞膜細胞腫、喉頭癌、胸腺癌、胸腺腫、甲状腺癌、腎盂及び尿管の移行上皮癌、移行上皮癌、尿膜管癌、尿道癌、尿生殖器新生物、子宮肉腫、ブドウ膜黒色腫、腟癌、ヴェルナー・モリソン症候群、いぼ状癌、視経路膠腫、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウォーシン腫瘍、ウィルムス腫瘍、ならびにそれらの組み合わせの細胞が挙げられる。場合によっては、細胞外小胞により標的とされるがん細胞は、がん幹細胞等、がん細胞集団内の亜集団を表す。

場合によっては、筋疾患を有する対象に、本開示に記載されるターゲティングポリペプチド及び治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞を投与することによって、筋疾患を治療する方法が本明細書に記載される。場合によっては、筋細胞ターゲティングポリペプチド及び治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞を用いて、対象の筋ジストロフィーを治療する方法が本明細書に記載される。場合によっては、筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、及び筋強直性ジストロフィーからなる群から選択される。場合によっては、筋細胞に送達される治療用ポリヌクレオチドは、完全長または切断型タンパク質をコードするｍＲＮＡを構成する。場合によっては、筋細胞に送達される治療用ポリヌクレオチドは、タンパク質エクソンスキップを誘導するアンチセンスオリゴヌクレオチドを構成する。

場合によっては、対象に、本開示に記載されるターゲティングポリペプチド及び治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞を投与することによって、眼疾患を治療する方法が本明細書に記載される。場合によっては、眼細胞ターゲティングポリペプチド及び治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞を用いて、対象の眼疾患を治療する方法が本明細書に記載される。いくつかの例では、眼疾患は網膜疾患である。場合によっては、網膜疾患は網膜色素変性症である。いくつかの例では、網膜疾患は、レーバー先天黒内障である。いくつかの例では、本開示に記載される細胞外小胞によって網膜細胞に送達される治療用ポリヌクレオチドを用いて網膜疾患を治療する方法が本明細書に記載される。

場合によっては、ターゲティングポリペプチド及び治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞を、それを必要とする対象に投与することによって、疾患を治療する方法が本明細書に記載される。場合によっては、ターゲティングポリペプチド及び治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞は、日ごとに、毎日、隔日、週５日、週１回、隔週、月に２週間、月に３週間、月１回、月２回、月３回、またはそれ以上で投与される。ターゲティングポリペプチド及び治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞は、少なくとも１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間、１８ヶ月間、２年間、３年間、またはそれ以上投与され得る。

対象の状態が改善される場合においては、投与しているターゲティングポリペプチド及び治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞の用量を、一定の長さの期間（「休薬期間」）、一時的に減少させるか、または一時的に中止することができる。いくつかの例では、休薬期間の長さは、２日～１年の間で変動し、例を挙げるに過ぎないが、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１２日、１５日、２０日、２８日、３５日、５０日、７０日、１００日、１２０日、１５０日、１８０日、２００日、２５０日、２８０日、３００日、３２０日、３５０日、または３６５日である。休薬期間中の用量の減量率は、１０％～１００％であり得、例を挙げるに過ぎないが、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％である。

場合によっては、ターゲティングポリペプチド及び治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞の有効量は、それを必要とする対象に、週に１回、２週に１回、３週に１回、４週に１回、５週に１回、６週に１回、７週に１回、８週に１回、９週に１回、１０週に１回、１１週に１回、１２週に１回、１３週に１回、１４週に１回、１５週に１回、１６週に１回、１７週に１回、１８週に１回、１９週に１回、２０週に１回、２１週に１回、２２週に１回、２３週に１回、２４週に１回、２５週に１回、２６週に１回、２７週に１回、または２８週に１回投与され得る。

対象の疾患または疾患に関連する病状が改善されたならば、必要に応じて細胞外小胞の維持用量が投与される。その後、投与量もしくは投与頻度、または両方が、症候に応じて、疾患、障害または病状の改善が維持されるレベルにまで減少され得る。

場合によっては、このような量に相当するターゲティングポリペプチド及び治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞の量は、疾患の重症度、治療を必要とする対象または宿主の素性（例えば、体重）等の要因に応じて変動するが、それにもかかわらず、例えば、投与されている特定の細胞外小胞、投与経路、及び治療されている対象または宿主を含む、症例を取り巻く個々の状況に従って、当該技術分野で公知の方法で日常的に決定される。いくつかの例では、所望の用量は、単回投与で、または同時（もしくは短期間にわたって）もしくは適切な間隔での分割投与として、例えば１日当たり２回、３回、４回またはそれ以上の分割用量として、適宜提供される。

場合によっては、投与量は、対象におけるグレード３またはグレード４の有害事象の発生または重症度によって少なくとも部分的に決定され得る。有害事象の非限定的な例としては、低体温、ショック、徐脈、心室性期外収縮、心筋虚血、失神、出血、心房性不整脈、静脈炎、第２度房室（ＡＶ）ブロック、心内膜炎、心膜滲出液、末梢性壊疽、血栓症、冠動脈疾患、口内炎、悪心嘔吐、肝機能検査異常、胃腸出血、吐血症、血性下痢、胃腸障害、腸穿孔、膵臓炎、貧血、白血球減少症、白血球増加症、低カルシウム血症、アルカリ性ホスファターゼ増加、血中尿素窒素（ＢＵＮ）増加、高尿酸血症、非タンパク性窒素（ＮＰＮ）増加、呼吸性アシドーシス、嗜眠、興奮、末梢神経障害、妄想反応、痙攣、大発作痙攣、せん妄、喘息、肺水腫、呼吸亢進、低酸素症、喀血、呼吸低下、気胸、散瞳症、瞳孔障害、腎機能異常、腎不全、急性尿細管壊死、十二指腸潰瘍、腸壊死、心筋炎、上室性頻脈、視神経炎に続発する永続的または一過性の失明、一過性脳虚血発作、髄膜炎、脳浮腫、心膜炎、アレルギー性間質性腎炎、気管食道瘻、悪性高熱症、心停止、心筋梗塞、肺塞栓、脳卒中、肝不全または腎不全、自殺に通じる重度抑うつ、肺水腫、呼吸停止、呼吸不全、白血球減少症、血小板減少症、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）増加、摂食障害、関節痛、背部痛、悪寒、下痢、異常脂血症、疲労、熱、インフルエンザ様症状、低アルブミン血症、リパーゼ増加、注射部位反応、筋肉痛、悪心、盗汗、そう痒症、発疹、紅斑性皮疹、斑状丘疹状皮疹、高トランスアミナーゼ血症、嘔吐、及び脱力が挙げられる。

個々の治療レジメンに関する変数の数は多く、これらの推奨値からの相当な逸脱は珍しいことではないため、上記範囲は単なる提示に過ぎない。このような投与量は、多くの変数（限定されないが、使用される化合物の活性、治療される疾患または病状、投与方法、個々の対象の要件、治療される疾患または病状の重症度、及び医師の判断）に応じて変わる。

場合によっては、このような治療レジメンの毒性及び治療効果は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手法（ＬＤ５０（母集団の５０％が死に至る用量）及びＥＤ５０（母集団の５０％に治療効果がある用量）が挙げられるが、これらに限定されない）によって決定される。毒性と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０とＥＤ５０との間の比として表現される。高い治療指数を示す化合物が好ましい。細胞培養アッセイ及び動物試験から得られるデータは、ヒトに用いる投与量の範囲を策定するのに使用される。このような化合物の投与量は、毒性が最小のＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあるのが好ましい。投与量は、用いられる剤形及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動する。

細胞外小胞の産生
場合によっては、ターゲティングポリペプチド、治療用ポリペプチド、治療用化合物、がん治療薬、またはそれらの組み合わせを含む細胞外小胞を産生する方法及びシステムが本明細書に記載される。

場合によっては、本方法は、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを細胞外小胞ドナー細胞内に導入することを含む。場合によっては、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドはベクターである。いくつかの例では、細胞外小胞ドナー細胞内に導入される少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される少なくとも１つのターゲティングポリペプチドをコードする。場合によっては、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの異種ターゲティングドメインをコードする。いくつかの例では、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される少なくとも１つの治療用ポリヌクレオチドを構成する。いくつかの例では、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される少なくとも１つの治療用ポリヌクレオチドをコードする。いくつかの例では、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される少なくとも１つの治療用ポリペプチドをコードする。

いくつかの例では、少なくとも２つの異種ポリヌクレオチドが細胞外小胞ドナー細胞内に導入され、その際、第１の異種ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのターゲティングポリペプチドまたは腫瘍ターゲティングポリペプチドをコードする第１のベクターを構成する。場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞内に導入される第２の異種ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの治療用ポリヌクレオチドまたは少なくとも１つの治療用ポリペプチドをコードする第２のベクターを構成する。

場合によっては、異種ポリヌクレオチドは、発現ベクターの使用を介して細胞内に導入され得る。発現ベクターに関して、ベクターは、当該技術分野における任意の方法によって、本明細書に記載される細胞内に容易に導入され得る。例えば、発現ベクターは、生物学的、化学的、または物理的な方法によって細胞内に移され得る。場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞は、本明細書に記載される任意の細胞型であり得る。場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞は有核細胞であり得る。

目的の異種ポリヌクレオチドを細胞内に導入する生物学的方法としては、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターの使用を挙げることができる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、非ヒト哺乳類細胞内に遺伝子を挿入するために最も広く使用される方法となっている。場合によっては、他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスなどに由来する。模範的なウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、ポックスベクター、パルボウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスベクター（ＨＳＶ）が挙げられる。いくつかの例では、レトロウイルスベクターとしては、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ、ＭＭＬＶ、ＭｕＬＶ、もしくはＭＬＶ）またはマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）ゲノムに由来するベクター等のガンマレトロウイルスベクターが挙げられる。いくつかの例では、レトロウイルスベクターとしては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ゲノムに由来するもの等のレンチウイルスベクターも挙げられる。いくつかの例では、ＡＡＶベクターとしては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９血清型が挙げられる。いくつかの例では、ウイルスベクターは、２つ以上のウイルスに由来するウイルスの一部を含む、キメラウイルスベクターである。さらなる例では、ウイルスベクターは、組み換えウイルスベクターである。

異種ポリヌクレオチドを細胞内に導入する化学的方法としては、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質ベース系等のコロイド分散系を挙げることができる。ｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏで送達媒体として使用するための模範的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。標的化ナノ粒子または他の適切なサブミクロンサイズの送達系を用いたポリヌクレオチドの送達等、核酸を標的に送達する他の最先端の方法が利用できる。

非ウイルス送達系が利用される場合、模範的な送達媒体はリポソームである。脂質製剤の使用が、宿主細胞内への核酸の導入（ｉｎｖｉｔｒｏ、ｅｘｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｖｏ）のために企図される。別の態様では、核酸は脂質と関連する。場合によっては、脂質と関連する核酸は、リポソームの水性内部にカプセル化される、リポソームの脂質二重層内で散在する、リポソーム及びオリゴヌクレオチドの両方に結合される連結分子を介してリポソームに付着される、リポソーム内に封入される、リポソームと複合化される、脂質含有溶液中で分散する、脂質と混合される、脂質と組み合わされる、懸濁液として脂質中に含有される、ミセル中に含有されるかもしくはミセルと複合化される、または他の方法で脂質と関連する。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクター関連組成物は、溶液中のいかなる特定の構造にも限定されない。例えば、場合によっては、それらは二重層構造で、ミセルとして、または「崩壊」構造を伴って存在する。あるいは、それらは単に溶液中で散在し、サイズまたは形状が均一でない凝集物を形成することもあり得る。脂質とは脂肪性物質のことであり、場合によっては、天然に存在する脂質または合成脂質である。例えば、脂質としては、細胞質中に天然に存在する脂肪滴、ならびに長鎖脂肪族炭化水素及びその誘導体を含有する化合物類（脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール及びアルデヒド等）が挙げられる。

使用に適した脂質は、商業的供給源から得られる。例えば、場合によっては、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）はＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得られ；場合によっては、ジセチルホスフェート（「ＤＣＰ」）はＫ＆ＫＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）から得られ；コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）は、場合によってはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｂｅｈｒｉｎｇから得られ；ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）及び他の脂質は、多くの場合、ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ）から得られる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質原液は、多くの場合、約－２０℃で保存される。クロロホルムはメタノールよりも容易に蒸発するので、最適な溶媒として用いられる。「リポソーム」とは、閉じた脂質二重層または凝集物の生成によって形成される、種々の単層及び多重層の脂質媒体を包含する総称である。リポソームは、多くの場合、リン脂質二重層膜及び内部水性媒質を伴う小胞構造を有するものとして特徴づけられる。多重層リポソームは、水性媒質によって分離された複数の脂質層を有する。それらはリン脂質を過剰量の水溶液中に懸濁させると自発的に形成される。脂質成分は、閉鎖構造形成前に自己再編成を起こし、水及び溶解された溶質を脂質二重層の間に封入する。しかし、通常の小胞構造とは異なる溶液中の構造を有する組成物も包含される。例えば、場合によっては、脂質はミセル構造を装うか、または単に脂質分子の不均一性凝集物として存在する。また、リポフェクタミン－核酸複合体も企図される。

異種ポリヌクレオチドを細胞内に導入する物理的方法としては、リン酸カルシウム沈澱、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、遺伝子銃、エレクトロポレーション、マイクロニードルアレイ、ナノニードルアレイ、超音波処理または化学的透過を挙げることができる。エレクトロポレーションとしては、マイクロ流体エレクトロポレーション、マイクロチャネルエレクトロポレーション、またはナノチャネルエレクトロポレーションが挙げられる。特定の場合では、細胞外小胞ドナー細胞は、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションによって、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドでトランスフェクションされる。いくつかの例では、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションは、ミクロ孔パターンシリコンウエハ、ナノ孔パターンシリコンウエハ、トラックエッチドメンブレン、セラミックミクロ孔メンブレン、セラミックナノ孔メンブレン、他の多孔質材料、またはそれらの組み合わせの使用を含む。いくつかの例では、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドまたは少なくとも１つのベクターは、バイオチップ上に位置するナノチャネルを介して細胞外小胞ドナー細胞内にナノエレクトロポレーションされる。

場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞は、基板表面上で増殖され、付着され得る。場合によっては、基板はバイオチップを含む。場合によっては、基板表面は金属物質を含む。場合によっては、基板は金属物質を含む。金属物質の非限定的な例としては、アルミニウム（Ａｌ）、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ、Ｉｎ_２Ｏ_３：ＳｎＯ_２）、クロム（Ｃｒ）、ヒ化ガリウム（ＧａＡｓ）、金（Ａｕ）、モリブデン（Ｍｏ）、有機残渣及びフォトレジスト、白金（Ｐｔ）、ケイ素（Ｓｉ）、二酸化ケイ素（ＳｉＯ_２）、ＳＯＩ（ｓｉｌｉｃｏｎｏｎｉｎｓｕｌａｔｏｒ）、窒化ケイ素（Ｓｉ_３Ｎ_４）、タンタル（Ｔａ）、チタン（Ｔｉ）、窒化チタン（ＴｉＮ）、タングステン（Ｗ）が挙げられる。場合によっては、金属物質が処理またはエッチングされて、アレイまたはチャネルが作り出され得る。場合によっては、金属表面は、リン酸（Ｈ_３ＰＯ_４）、酢酸、硝酸（ＨＮＯ_３）、水（Ｈ_２Ｏ）、塩酸（ＨＣｌ）、硝酸セリウムアンモニウム（ＮＨ_４）_２Ｃｅ（ＮＯ_３）_６、クエン酸（Ｃ_６Ｈ_８Ｏ_７）、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）、王水、ヨウ素溶液、硫酸（Ｈ_２ＳＯ_４）、フッ化水素酸（ＨＦ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、エチレンジアミンピロカテコール（ＥＤＰ）、水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＨ）、バッファード酸化物、フッ化アンモニウム（ＮＨ_４Ｆ）、ＳＣｌ、Ｃｌ_２、ＣＣｌ_４、ＳｉＣｌ_４、ＢＣｌ_３、ＣＣｌ_２Ｆ_２、ＣＦ_４、Ｏ_２、ＳＦ_６、ＮＦ_３、ＣＨＦ_３、またはそれらの組み合わせで処理またはエッチングされ得る。

場合によっては、金属表面は、親水性を高めるために、ガスまたはプラズマで処理され得る。場合によっては、金属表面は、疎水性を高めるために、ガスまたはプラズマで処理され得る。金属表面の親水性または疎水性を高めるための模範的なガスまたはプラズマとしては、酸素、窒素、アンモニア、アルゴン、塩素、フッ素、臭素、ヨウ素、アスタチン、水素、またはそれらの組み合わせが挙げられる。

場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞は、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、ＡＢＳ、ポリアミド、共重合ポリエチレン、エポキシ、ポリエステル、ポリ塩化ビニル、フェノール、ポリテトラフルオロエチレン、共重合ポリエチレン、フッ素化エチレンプロピレン、重合ビニリデン、シリコーン、天然ゴム、ラテックス、ポリウレタン、スチレン‐ブタジエンゴム、フルオロカーボンエラストマー共重合体、ポリエチレンテレフタラート、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリアラミド、ポリアリールエーテルケトン、ポリアセタール、ポリフェニレンオキシド、ＰＢＴ、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアリールスルホン、ポリフェニレンスルフィド、ポリテトラフルオロエチレン、酸化ベリリウムなどのポリマーで作製された基板表面で増殖され、付着され得る。場合によっては、ポリマーで作製された表面は、半透過性であり得る。いくつかの実施形態では、半透過性ポリマー表面の孔径は、約０．０１μｍ～約１０μｍの間であり得る。いくつかの実施形態では、半透過性ポリマー表面の孔径は、約０．０１μｍ～約０．０３μｍ、約０．０１μｍ～約０．０５μｍ、約０．０１μｍ～約０．１μｍ、約０．０１μｍ～約０．２μｍ、約０．０１μｍ～約０．３μｍ、約０．０１μｍ～約０．４μｍ、約０．０１μｍ～約０．５μｍ、約０．０１μｍ～約１μｍ、約０．０１μｍ～約３μｍ、約０．０１μｍ～約５μｍ、約０．０１μｍ～約１０μｍ、約０．０３μｍ～約０．０５μｍ、約０．０３μｍ～約０．１μｍ、約０．０３μｍ～約０．２μｍ、約０．０３μｍ～約０．３μｍ、約０．０３μｍ～約０．４μｍ、約０．０３μｍ～約０．５μｍ、約０．０３μｍ～約１μｍ、約０．０３μｍ～約３μｍ、約０．０３μｍ～約５μｍ、約０．０３μｍ～約１０μｍ、約０．０５μｍ～約０．１μｍ、約０．０５μｍ～約０．２μｍ、約０．０５μｍ～約０．３μｍ、約０．０５μｍ～約０．４μｍ、約０．０５μｍ～約０．５μｍ、約０．０５μｍ～約１μｍ、約０．０５μｍ～約３μｍ、約０．０５μｍ～約５μｍ、約０．０５μｍ～約１０μｍ、約０．１μｍ～約０．２μｍ、約０．１μｍ～約０．３μｍ、約０．１μｍ～約０．４μｍ、約０．１μｍ～約０．５μｍ、約０．１μｍ～約１μｍ、約０．１μｍ～約３μｍ、約０．１μｍ～約５μｍ、約０．１μｍ～約１０μｍ、約０．２μｍ～約０．３μｍ、約０．２μｍ～約０．４μｍ、約０．２μｍ～約０．５μｍ、約０．２μｍ～約１μｍ、約０．２μｍ～約３μｍ、約０．２μｍ～約５μｍ、約０．２μｍ～約１０μｍ、約０．３μｍ～約０．４μｍ、約０．３μｍ～約０．５μｍ、約０．３μｍ～約１μｍ、約０．３μｍ～約３μｍ、約０．３μｍ～約５μｍ、約０．３μｍ～約１０μｍ、約０．４μｍ～約０．５μｍ、約０．４μｍ～約１μｍ、約０．４μｍ～約３μｍ、約０．４μｍ～約５μｍ、約０．４μｍ～約１０μｍ、約０．５μｍ～約１μｍ、約０．５μｍ～約３μｍ、約０．５μｍ～約５μｍ、約０．５μｍ～約１０μｍ、約１μｍ～約３μｍ、約１μｍ～約５μｍ、約１μｍ～約１０μｍ、約３μｍ～約５μｍ、約３μｍ～約１０μｍ、または約５μｍ～約１０μｍの間であり得る。いくつかの実施形態では、半透過性ポリマー表面の孔径は、約０．０１μｍ、約０．０３μｍ、約０．０５μｍ、約０．１μｍ、約０．２μｍ、約０．３μｍ、約０．４μｍ、約０．５μｍ、約１μｍ、約３μｍ、約５μｍ、または約１０μｍのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、半透過性ポリマー表面の孔径は、少なくとも０．０１μｍ、約０．０３μｍ、約０．０５μｍ、約０．１μｍ、約０．２μｍ、約０．３μｍ、約０．４μｍ、約０．５μｍ、約１μｍ、約３μｍ、または約５μｍのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、半透過性ポリマー表面の孔径は、最大で約０．０３μｍ、約０．０５μｍ、約０．１μｍ、約０．２μｍ、約０．３μｍ、約０．４μｍ、約０．５μｍ、約１μｍ、約３μｍ、約５μｍ、または約１０μｍのいずれかであり得る。

場合によっては、ポリマー表面は、親水性を高めるために、ガスまたはプラズマで処理され得る。場合によっては、ポリマー表面は、疎水性を高めるために、ガスまたはプラズマで処理され得る。金属表面の親水性または疎水性を高めるための模範的なガスまたはプラズマとしては、酸素、窒素、アンモニア、アルゴン、塩素、フッ素、臭素、ヨウ素、アスタチン、水素、またはそれらの組み合わせが挙げられる。

ナノエレクトロポレーション
場合によっては、金属またはポリマー表面で増殖されるか、または付着される細胞外小胞ドナー細胞は、本明細書に記載されるようなナノエレクトロポレーションシステムによってナノエレクトロポレーションされ得る。場合によっては、本明細書に記載されるナノエレクトロポレーションシステムによってナノエレクトロポレーションされる細胞外小胞ドナー細胞は、本明細書に記載されるバイオチップ等の金属またはポリマー表面で増殖されるか、または付着され得る。場合によっては、本明細書に記載されるナノエレクトロポレーションシステムによってナノエレクトロポレーションされる細胞外小胞ドナー細胞は、本明細書に記載されるバイオチップ等の金属またはポリマー表面に単一層で増殖されるか、または付着され得る。場合によっては、システムは、上部境界及び下部境界がある流体チャンバを含む。細胞外小胞ドナー細胞を伴う基板を流体チャンバ内に配置することで、上部チャンバ及び下部チャンバが作り出される。場合によっては、システムは少なくとも１つのナノチャネルをさらに含む。場合によっては、ナノチャネルは、基板内に埋め込まれ得る。

場合によっては、金属またはポリマー表面で増殖されるか、または付着され、本明細書に記載される異種ポリヌクレオチドをナノエレクトロポレーションされる細胞外小胞ドナー細胞は、細胞外小胞（例えば、エクソソーム）をハイスループットで産生し得る。場合によっては、このようなエクソソームのハイスループット産生は、複数（例えば、１超、２超、３超、５超、１０超、またはさらなる数）のバイオチップ（例えば、ＣＮＰバイオチップ）の使用に関与し得る。場合によっては、ＣＮＰバイオチップは、少なくとも１ｃｍ、２ｃｍ、３ｃｍ、４ｃｍ、５ｃｍ、６ｃｍ、７ｃｍ、８ｃｍ、９ｃｍ、１０ｃｍ、１５ｃｍ、２０ｃｍ、２５ｃｍ、３０ｃｍ、３５ｃｍ、４０ｃｍ、４５ｃｍ、５０ｃｍ、１００ｃｍ、またはそれ以上の幅を構成する。場合によっては、ＣＮＰバイオチップは、少なくとも１ｃｍ、２ｃｍ、３ｃｍ、４ｃｍ、５ｃｍ、６ｃｍ、７ｃｍ、８ｃｍ、９ｃｍ、１０ｃｍ、１５ｃｍ、２０ｃｍ、２５ｃｍ、３０ｃｍ、３５ｃｍ、４０ｃｍ、４５ｃｍ、５０ｃｍ、１００ｃｍ、またはそれ以上の長さを構成する。場合によっては、バイオチップは１ｃｍ×１ｃｍの寸法を構成する。場合によっては、バイオチップは、１ｃｍ×２ｃｍ、１ｃｍ×３ｃｍ、１ｃｍ×５ｃｍ、１ｃｍ×１０ｃｍ、２ｃｍ×１ｃｍ、２ｃｍ×２ｃｍ、２ｃｍ×３ｃｍ、２ｃｍ×５ｃｍ、２ｃｍ×１０ｃｍ、３ｃｍ×１ｃｍ、３ｃｍ×２ｃｍ、３ｃｍ×３ｃｍ、３ｃｍ×５ｃｍ、３ｃｍ×１０ｃｍ、５ｃｍ×１ｃｍ、５ｃｍ×２ｃｍ、５ｃｍ×３ｃｍ、５ｃｍ×５ｃｍ、５ｃｍ×１０ｃｍ、１０ｃｍ×１ｃｍ、１０ｃｍ×２ｃｍ、１０ｃｍ×３ｃｍ、１０ｃｍ×５ｃｍ、または１０ｃｍ×１０ｃｍの模範的な寸法を構成し得る。

場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞のナノエレクトロポレーションは、ナノチャネルエレクトロポレーション（ＣＮＰ）に続いて、ナノエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞によって産生及び分泌される細胞外小胞を、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、またはそれ以上の期間で収集することを含むサイクルを構成し得る。場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞は、１サイクル、２サイクル、３サイクル、４サイクル、５サイクル、６サイクル、７サイクル、８サイクル、９サイクル、１０サイクル、またはそれ以上のＣＮＰサイクルにわたって、細胞外小胞を産生及び分泌し得る。

場合によっては、分泌される細胞外小胞は、生体適合性があり、直径４０～１５０ｎｍ程度であり、膜貫通及び膜繋留タンパク質を内因的に発現する可能性がある。これらのタンパク質の存在により、血液循環が延長され得、組織指向性送達が促進され得、カプセル化されたエクソソーム内容物の細胞による取り込みが容易になり得る。場合によっては、本明細書で提供される方法は、有意な凝集体の形成を伴わない、ナノエレクトロポレーションの使用に関与する可能性がある。いくつかの例では、細胞外小胞ドナー細胞内に導入される異種ポリヌクレオチドまたはベクターは、細胞外小胞内に組み込まれるペプチド配列をコードせず、標的ｍＲＮＡに結合する。

場合によっては、ナノチャネルは、半透過性ポリマー基板の細孔を構成する。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、約０．０１μｍ～約５００μｍの高さで構成される。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、約０．０１μｍ～約０．０５μｍ、約０．０１μｍ～約０．１μｍ、約０．０１μｍ～約０．５μｍ、約０．０１μｍ～約１μｍ、約０．０１μｍ～約２μｍ、約０．０１μｍ～約５μｍ、約０．０１μｍ～約１０μｍ、約０．０１μｍ～約２０μｍ、約０．０１μｍ～約５０μｍ、約０．０１μｍ～約１００μｍ、約０．０１μｍ～約５００μｍ、約０．０５μｍ～約０．１μｍ、約０．０５μｍ～約０．５μｍ、約０．０５μｍ～約１μｍ、約０．０５μｍ～約２μｍ、約０．０５μｍ～約５μｍ、約０．０５μｍ～約１０μｍ、約０．０５μｍ～約２０μｍ、約０．０５μｍ～約５０μｍ、約０．０５μｍ～約１００μｍ、約０．０５μｍ～約５００μｍ、約０．１μｍ～約０．５μｍ、約０．１μｍ～約１μｍ、約０．１μｍ～約２μｍ、約０．１μｍ～約５μｍ、約０．１μｍ～約１０μｍ、約０．１μｍ～約２０μｍ、約０．１μｍ～約５０μｍ、約０．１μｍ～約１００μｍ、約０．１μｍ～約５００μｍ、約０．５μｍ～約１μｍ、約０．５μｍ～約２μｍ、約０．５μｍ～約５μｍ、約０．５μｍ～約１０μｍ、約０．５μｍ～約２０μｍ、約０．５μｍ～約５０μｍ、約０．５μｍ～約１００μｍ、約０．５μｍ～約５００μｍ、約１μｍ～約２μｍ、約１μｍ～約５μｍ、約１μｍ～約１０μｍ、約１μｍ～約２０μｍ、約１μｍ～約５０μｍ、約１μｍ～約１００μｍ、約１μｍ～約５００μｍ、約２μｍ～約５μｍ、約２μｍ～約１０μｍ、約２μｍ～約２０μｍ、約２μｍ～約５０μｍ、約２μｍ～約１００μｍ、約２μｍ～約５００μｍ、約５μｍ～約１０μｍ、約５μｍ～約２０μｍ、約５μｍ～約５０μｍ、約５μｍ～約１００μｍ、約５μｍ～約５００μｍ、約１０μｍ～約２０μｍ、約１０μｍ～約５０μｍ、約１０μｍ～約１００μｍ、約１０μｍ～約５００μｍ、約２０μｍ～約５０μｍ、約２０μｍ～約１００μｍ、約２０μｍ～約５００μｍ、約５０μｍ～約１００μｍ、約５０μｍ～約５００μｍ、または約１００μｍ～約５００μｍの高さで構成される。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、約０．０１μｍ、約０．０５μｍ、約０．１μｍ、約０．５μｍ、約１μｍ、約２μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、約２０μｍ、約５０μｍ、約１００μｍ、または約５００μｍの高さで構成される。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、少なくとも約０．０１μｍ、約０．０５μｍ、約０．１μｍ、約０．５μｍ、約１μｍ、約２μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、約２０μｍ、約５０μｍ、または約１００μｍの高さで構成される。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、最大で約０．０５μｍ、約０．１μｍ、約０．５μｍ、約１μｍ、約２μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、約２０μｍ、約５０μｍ、約１００μｍ、または約５００μｍの高さで構成される。場合によっては、各ナノチャネルの高さは同一であり得る。場合によっては、各ナノチャネルの高さは異なり得る。場合によっては、ナノチャネルの高さは、高電界領域（例えば、ナノチャネルの内側）で分子がナノエレクトロポレーションされるのを促進するのに十分な高さでありながら、短時間電気パルスでナノエレクトロポレーションされている大型分子がなんとか通り抜けられるほどの低さでなければならない。

いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、約０．０１ｎｍ～約１０，０００ｎｍの直径で構成される。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、約０．０１ｎｍ～約０．１ｎｍ、約０．０１ｎｍ～約０．５ｎｍ、約０．０１ｎｍ～約１ｎｍ、約０．０１ｎｍ～約５ｎｍ、約０．０１ｎｍ～約１０ｎｍ、約０．０１ｎｍ～約５０ｎｍ、約０．０１ｎｍ～約１００ｎｍ、約０．０１ｎｍ～約５００ｎｍ、約０．０１ｎｍ～約１，０００ｎｍ、約０．０１ｎｍ～約５，０００ｎｍ、約０．０１ｎｍ～約１０，０００ｎｍ、約０．１ｎｍ～約０．５ｎｍ、約０．１ｎｍ～約１ｎｍ、約０．１ｎｍ～約５ｎｍ、約０．１ｎｍ～約１０ｎｍ、約０．１ｎｍ～約５０ｎｍ、約０．１ｎｍ～約１００ｎｍ、約０．１ｎｍ～約５００ｎｍ、約０．１ｎｍ～約１，０００ｎｍ、約０．１ｎｍ～約５，０００ｎｍ、約０．１ｎｍ～約１０，０００ｎｍ、約０．５ｎｍ～約１ｎｍ、約０．５ｎｍ～約５ｎｍ、約０．５ｎｍ～約１０ｎｍ、約０．５ｎｍ～約５０ｎｍ、約０．５ｎｍ～約１００ｎｍ、約０．５ｎｍ～約５００ｎｍ、約０．５ｎｍ～約１，０００ｎｍ、約０．５ｎｍ～約５，０００ｎｍ、約０．５ｎｍ～約１０，０００ｎｍ、約１ｎｍ～約５ｎｍ、約１ｎｍ～約１０ｎｍ、約１ｎｍ～約５０ｎｍ、約１ｎｍ～約１００ｎｍ、約１ｎｍ～約５００ｎｍ、約１ｎｍ～約１，０００ｎｍ、約１ｎｍ～約５，０００ｎｍ、約１ｎｍ～約１０，０００ｎｍ、約５ｎｍ～約１０ｎｍ、約５ｎｍ～約５０ｎｍ、約５ｎｍ～約１００ｎｍ、約５ｎｍ～約５００ｎｍ、約５ｎｍ～約１，０００ｎｍ、約５ｎｍ～約５，０００ｎｍ、約５ｎｍ～約１０，０００ｎｍ、約１０ｎｍ～約５０ｎｍ、約１０ｎｍ～約１００ｎｍ、約１０ｎｍ～約５００ｎｍ、約１０ｎｍ～約１，０００ｎｍ、約１０ｎｍ～約５，０００ｎｍ、約１０ｎｍ～約１０，０００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１，０００ｎｍ、約５０ｎｍ～約５，０００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１０，０００ｎｍ、約１００ｎｍ～約５００ｎｍ、約１００ｎｍ～約１，０００ｎｍ、約１００ｎｍ～約５，０００ｎｍ、約１００ｎｍ～約１０，０００ｎｍ、約５００ｎｍ～約１，０００ｎｍ、約５００ｎｍ～約５，０００ｎｍ、約５００ｎｍ～約１０，０００ｎｍ、約１，０００ｎｍ～約５，０００ｎｍ、約１，０００ｎｍ～約１０，０００ｎｍ、または約５，０００ｎｍ～約１０，０００ｎｍの直径で構成される。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、約０．０１ｎｍ、約０．１ｎｍ、約０．５ｎｍ、約１ｎｍ、約５ｎｍ、約１０ｎｍ、約５０ｎｍ、約１００ｎｍ、約５００ｎｍ、約１，０００ｎｍ、約５，０００ｎｍ、または約１０，０００ｎｍの直径で構成される。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、少なくとも約０．０１ｎｍ、約０．１ｎｍ、約０．５ｎｍ、約１ｎｍ、約５ｎｍ、約１０ｎｍ、約５０ｎｍ、約１００ｎｍ、約５００ｎｍ、約１，０００ｎｍ、または約５，０００ｎｍの直径で構成される。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、最大で約０．１ｎｍ、約０．５ｎｍ、約１ｎｍ、約５ｎｍ、約１０ｎｍ、約５０ｎｍ、約１００ｎｍ、約５００ｎｍ、約１，０００ｎｍ、約５，０００ｎｍ、または約１０，０００ｎｍの直径で構成される。場合によっては、各ナノチャネルの直径は同一であり得る。場合によっては、各ナノチャネルの直径は異なり得る。

場合によっては、ナノチャネルは、ナノチャネルアレイ中に配置され得る。場合によっては、ナノチャネルは、ナノチャネル間に間隔をあけて、ナノチャネルアレイ中に配置され得る。いくつかの例では、ナノチャネル間の間隔は、約０．０１μｍ～約５，０００μｍであり得る。いくつかの例では、ナノチャネル間の間隔は、約０．０１μｍ～約０．０５μｍ、約０．０１μｍ～約０．１μｍ、約０．０１μｍ～約０．５μｍ、約０．０１μｍ～約１μｍ、約０．０１μｍ～約５μｍ、約０．０１μｍ～約１０μｍ、約０．０１μｍ～約５０μｍ、約０．０１μｍ～約１００μｍ、約０．０１μｍ～約５００μｍ、約０．０１μｍ～約１，０００μｍ、約０．０１μｍ～約５，０００μｍ、約０．０５μｍ～約０．１μｍ、約０．０５μｍ～約０．５μｍ、約０．０５μｍ～約１μｍ、約０．０５μｍ～約５μｍ、約０．０５μｍ～約１０μｍ、約０．０５μｍ～約５０μｍ、約０．０５μｍ～約１００μｍ、約０．０５μｍ～約５００μｍ、約０．０５μｍ～約１，０００μｍ、約０．０５μｍ～約５，０００μｍ、約０．１μｍ～約０．５μｍ、約０．１μｍ～約１μｍ、約０．１μｍ～約５μｍ、約０．１μｍ～約１０μｍ、約０．１μｍ～約５０μｍ、約０．１μｍ～約１００μｍ、約０．１μｍ～約５００μｍ、約０．１μｍ～約１，０００μｍ、約０．１μｍ～約５，０００μｍ、約０．５μｍ～約１μｍ、約０．５μｍ～約５μｍ、約０．５μｍ～約１０μｍ、約０．５μｍ～約５０μｍ、約０．５μｍ～約１００μｍ、約０．５μｍ～約５００μｍ、約０．５μｍ～約１，０００μｍ、約０．５μｍ～約５，０００μｍ、約１μｍ～約５μｍ、約１μｍ～約１０μｍ、約１μｍ～約５０μｍ、約１μｍ～約１００μｍ、約１μｍ～約５００μｍ、約１μｍ～約１，０００μｍ、約１μｍ～約５，０００μｍ、約５μｍ～約１０μｍ、約５μｍ～約５０μｍ、約５μｍ～約１００μｍ、約５μｍ～約５００μｍ、約５μｍ～約１，０００μｍ、約５μｍ～約５，０００μｍ、約１０μｍ～約５０μｍ、約１０μｍ～約１００μｍ、約１０μｍ～約５００μｍ、約１０μｍ～約１，０００μｍ、約１０μｍ～約５，０００μｍ、約５０μｍ～約１００μｍ、約５０μｍ～約５００μｍ、約５０μｍ～約１，０００μｍ、約５０μｍ～約５，０００μｍ、約１００μｍ～約５００μｍ、約１００μｍ～約１，０００μｍ、約１００μｍ～約５，０００μｍ、約５００μｍ～約１，０００μｍ、約５００μｍ～約５，０００μｍ、または約１，０００μｍ～約５，０００μｍであり得る。いくつかの例では、ナノチャネル間の間隔は、約０．０１μｍ、約０．０５μｍ、約０．１μｍ、約０．５μｍ、約１μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、約５０μｍ、約１００μｍ、約５００μｍ、約１，０００μｍ、または約５，０００μｍであり得る。いくつかの例では、ナノチャネル間の間隔は、少なくとも約０．０１μｍ、約０．０５μｍ、約０．１μｍ、約０．５μｍ、約１μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、約５０μｍ、約１００μｍ、約５００μｍ、または約１，０００μｍであり得る。いくつかの例では、ナノチャネル間の間隔は、最大で約０．０５μｍ、約０．１μｍ、約０．５μｍ、約１μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、約５０μｍ、約１００μｍ、約５００μｍ、約１，０００μｍ、または約５，０００μｍであり得る。

場合によっては、ナノエレクトロポレーションシステムは、流体チャンバ内に電界を発生させるための上部及び下部電極層を含む。場合によっては、電極によって発生したナノエレクトロポレーションのための電界は、約１０Ｖ～約５００Ｖの間の電圧で構成される。場合によっては、電極によって発生したナノエレクトロポレーションのための電界は、約１０Ｖ～約２５Ｖ、約１０Ｖ～約５０Ｖ、約１０Ｖ～約１００Ｖ、約１０Ｖ～約１２５Ｖ、約１０Ｖ～約１５０Ｖ、約１０Ｖ～約１７５Ｖ、約１０Ｖ～約２００Ｖ、約１０Ｖ～約２２５Ｖ、約１０Ｖ～約２５０Ｖ、約１０Ｖ～約３００Ｖ、約１０Ｖ～約５００Ｖ、約２５Ｖ～約５０Ｖ、約２５Ｖ～約１００Ｖ、約２５Ｖ～約１２５Ｖ、約２５Ｖ～約１５０Ｖ、約２５Ｖ～約１７５Ｖ、約２５Ｖ～約２００Ｖ、約２５Ｖ～約２２５Ｖ、約２５Ｖ～約２５０Ｖ、約２５Ｖ～約３００Ｖ、約２５Ｖ～約５００Ｖ、約５０Ｖ～約１００Ｖ、約５０Ｖ～約１２５Ｖ、約５０Ｖ～約１５０Ｖ、約５０Ｖ～約１７５Ｖ、約５０Ｖ～約２００Ｖ、約５０Ｖ～約２２５Ｖ、約５０Ｖ～約２５０Ｖ、約５０Ｖ～約３００Ｖ、約５０Ｖ～約５００Ｖ、約１００Ｖ～約１２５Ｖ、約１００Ｖ～約１５０Ｖ、約１００Ｖ～約１７５Ｖ、約１００Ｖ～約２００Ｖ、約１００Ｖ～約２２５Ｖ、約１００Ｖ～約２５０Ｖ、約１００Ｖ～約３００Ｖ、約１００Ｖ～約５００Ｖ、約１２５Ｖ～約１５０Ｖ、約１２５Ｖ～約１７５Ｖ、約１２５Ｖ～約２００Ｖ、約１２５Ｖ～約２２５Ｖ、約１２５Ｖ～約２５０Ｖ、約１２５Ｖ～約３００Ｖ、約１２５Ｖ～約５００Ｖ、約１５０Ｖ～約１７５Ｖ、約１５０Ｖ～約２００Ｖ、約１５０Ｖ～約２２５Ｖ、約１５０Ｖ～約２５０Ｖ、約１５０Ｖ～約３００Ｖ、約１５０Ｖ～約５００Ｖ、約１７５Ｖ～約２００Ｖ、約１７５Ｖ～約２２５Ｖ、約１７５Ｖ～約２５０Ｖ、約１７５Ｖ～約３００Ｖ、約１７５Ｖ～約５００Ｖ、約２００Ｖ～約２２５Ｖ、約２００Ｖ～約２５０Ｖ、約２００Ｖ～約３００Ｖ、約２００Ｖ～約５００Ｖ、約２２５Ｖ～約２５０Ｖ、約２２５Ｖ～約３００Ｖ、約２２５Ｖ～約５００Ｖ、約２５０Ｖ～約３００Ｖ、約２５０Ｖ～約５００Ｖ、または約３００Ｖ～約５００Ｖの間の電圧で構成される。場合によっては、電極によって発生したナノエレクトロポレーションのための電界は、約１０Ｖ、約２５Ｖ、約５０Ｖ、約１００Ｖ、約１２５Ｖ、約１５０Ｖ、約１７５Ｖ、約２００Ｖ、約２２５Ｖ、約２５０Ｖ、約３００Ｖ、または約５００Ｖのいずれかの電圧で構成される。場合によっては、電極によって発生したナノエレクトロポレーションのための電界は、少なくとも約１０Ｖ、約２５Ｖ、約５０Ｖ、約１００Ｖ、約１２５Ｖ、約１５０Ｖ、約１７５Ｖ、約２００Ｖ、約２２５Ｖ、約２５０Ｖ、または約３００Ｖのいずれかの電圧で構成される。場合によっては、電極によって発生したナノエレクトロポレーションのための電界は、最大で約２５Ｖ、約５０Ｖ、約１００Ｖ、約１２５Ｖ、約１５０Ｖ、約１７５Ｖ、約２００Ｖ、約２２５Ｖ、約２５０Ｖ、約３００Ｖ、または約５００Ｖのいずれかの電圧で構成される。

場合によっては、電極によって発生したナノエレクトロポレーションのための電界は、約０．１ボルト／ｍｍ～約５０，０００ボルト／ｍｍの電界強度を構成する。場合によっては、電極によって発生したナノエレクトロポレーションのための電界は、約０．１ボルト／ｍｍ～約０．５ボルト／ｍｍ、約０．１ボルト／ｍｍ～約１ボルト／ｍｍ、約０．１ボルト／ｍｍ～約５ボルト／ｍｍ、約０．１ボルト／ｍｍ～約１０ボルト／ｍｍ、約０．１ボルト／ｍｍ～約５０ボルト／ｍｍ、約０．１ボルト／ｍｍ～約１００ボルト／ｍｍ、約０．１ボルト／ｍｍ～約５００ボルト／ｍｍ、約０．１ボルト／ｍｍ～約１，０００ボルト／ｍｍ、約０．１ボルト／ｍｍ～約５，０００ボルト／ｍｍ、約０．１ボルト／ｍｍ～約１０，０００ボルト／ｍｍ、約０．１ボルト／ｍｍ～約５０，０００ボルト／ｍｍ、約０．５ボルト／ｍｍ～約１ボルト／ｍｍ、約０．５ボルト／ｍｍ～約５ボルト／ｍｍ、約０．５ボルト／ｍｍ～約１０ボルト／ｍｍ、約０．５ボルト／ｍｍ～約５０ボルト／ｍｍ、約０．５ボルト／ｍｍ～約１００ボルト／ｍｍ、約０．５ボルト／ｍｍ～約５００ボルト／ｍｍ、約０．５ボルト／ｍｍ～約１，０００ボルト／ｍｍ、約０．５ボルト／ｍｍ～約５，０００ボルト／ｍｍ、約０．５ボルト／ｍｍ～約１０，０００ボルト／ｍｍ、約０．５ボルト／ｍｍ～約５０，０００ボルト／ｍｍ、約１ボルト／ｍｍ～約５ボルト／ｍｍ、約１ボルト／ｍｍ～約１０ボルト／ｍｍ、約１ボルト／ｍｍ～約５０ボルト／ｍｍ、約１ボルト／ｍｍ～約１００ボルト／ｍｍ、約１ボルト／ｍｍ～約５００ボルト／ｍｍ、約１ボルト／ｍｍ～約１，０００ボルト／ｍｍ、約１ボルト／ｍｍ～約５，０００ボルト／ｍｍ、約１ボルト／ｍｍ～約１０，０００ボルト／ｍｍ、約１ボルト／ｍｍ～約５０，０００ボルト／ｍｍ、約５ボルト／ｍｍ～約１０ボルト／ｍｍ、約５ボルト／ｍｍ～約５０ボルト／ｍｍ、約５ボルト／ｍｍ～約１００ボルト／ｍｍ、約５ボルト／ｍｍ～約５００ボルト／ｍｍ、約５ボルト／ｍｍ～約１，０００ボルト／ｍｍ、約５ボルト／ｍｍ～約５，０００ボルト／ｍｍ、約５ボルト／ｍｍ～約１０，０００ボルト／ｍｍ、約５ボルト／ｍｍ～約５０，０００ボルト／ｍｍ、約１０ボルト／ｍｍ～約５０ボルト／ｍｍ、約１０ボルト／ｍｍ～約１００ボルト／ｍｍ、約１０ボルト／ｍｍ～約５００ボルト／ｍｍ、約１０ボルト／ｍｍ～約１，０００ボルト／ｍｍ、約１０ボルト／ｍｍ～約５，０００ボルト／ｍｍ、約１０ボルト／ｍｍ～約１０，０００ボルト／ｍｍ、約１０ボルト／ｍｍ～約５０，０００ボルト／ｍｍ、約５０ボルト／ｍｍ～約１００ボルト／ｍｍ、約５０ボルト／ｍｍ～約５００ボルト／ｍｍ、約５０ボルト／ｍｍ～約１，０００ボルト／ｍｍ、約５０ボルト／ｍｍ～約５，０００ボルト／ｍｍ、約５０ボルト／ｍｍ～約１０，０００ボルト／ｍｍ、約５０ボルト／ｍｍ～約５０，０００ボルト／ｍｍ、約１００ボルト／ｍｍ～約５００ボルト／ｍｍ、約１００ボルト／ｍｍ～約１，０００ボルト／ｍｍ、約１００ボルト／ｍｍ～約５，０００ボルト／ｍｍ、約１００ボルト／ｍｍ～約１０，０００ボルト／ｍｍ、約１００ボルト／ｍｍ～約５０，０００ボルト／ｍｍ、約５００ボルト／ｍｍ～約１，０００ボルト／ｍｍ、約５００ボルト／ｍｍ～約５，０００ボルト／ｍｍ、約５００ボルト／ｍｍ～約１０，０００ボルト／ｍｍ、約５００ボルト／ｍｍ～約５０，０００ボルト／ｍｍ、約１，０００ボルト／ｍｍ～約５，０００ボルト／ｍｍ、約１，０００ボルト／ｍｍ～約１０，０００ボルト／ｍｍ、約１，０００ボルト／ｍｍ～約５０，０００ボルト／ｍｍ、約５，０００ボルト／ｍｍ～約１０，０００ボルト／ｍｍ、約５，０００ボルト／ｍｍ～約５０，０００ボルト／ｍｍ、または約１０，０００ボルト／ｍｍ～約５０，０００ボルト／ｍｍの電界強度を構成する。場合によっては、電極によって発生したナノエレクトロポレーションのための電界は、約０．１ボルト／ｍｍ、約０．５ボルト／ｍｍ、約１ボルト／ｍｍ、約５ボルト／ｍｍ、約１０ボルト／ｍｍ、約５０ボルト／ｍｍ、約１００ボルト／ｍｍ、約５００ボルト／ｍｍ、約１，０００ボルト／ｍｍ、約５，０００ボルト／ｍｍ、約１０，０００ボルト／ｍｍ、または約５０，０００ボルト／ｍｍの電界強度を構成する。場合によっては、電極によって発生したナノエレクトロポレーションのための電界は、少なくとも約０．１ボルト／ｍｍ、約０．５ボルト／ｍｍ、約１ボルト／ｍｍ、約５ボルト／ｍｍ、約１０ボルト／ｍｍ、約５０ボルト／ｍｍ、約１００ボルト／ｍｍ、約５００ボルト／ｍｍ、約１，０００ボルト／ｍｍ、約５，０００ボルト／ｍｍ、または約１０，０００ボルト／ｍｍの電界強度を構成する。場合によっては、電極によって発生したナノエレクトロポレーションのための電界は、最大で約０．５ボルト／ｍｍ、約１ボルト／ｍｍ、約５ボルト／ｍｍ、約１０ボルト／ｍｍ、約５０ボルト／ｍｍ、約１００ボルト／ｍｍ、約５００ボルト／ｍｍ、約１，０００ボルト／ｍｍ、約５，０００ボルト／ｍｍ、約１０，０００ボルト／ｍｍ、または約５０，０００ボルト／ｍｍの電界強度を構成する。

いくつかの例では、電極によって発生したナノエレクトロポレーションのための電界は、約０．０１ミリ秒／パルス～約５，０００ミリ秒／パルスのパルス持続時間を有する複数のパルスを構成する。いくつかの例では、電極によって発生したナノエレクトロポレーションのための電界は、約０．０１ミリ秒／パルス～約０．０５ミリ秒／パルス、約０．０１ミリ秒／パルス～約０．１ミリ秒／パルス、約０．０１ミリ秒／パルス～約０．５ミリ秒／パルス、約０．０１ミリ秒／パルス～約１ミリ秒／パルス、約０．０１ミリ秒／パルス～約５ミリ秒／パルス、約０．０１ミリ秒／パルス～約１０ミリ秒／パルス、約０．０１ミリ秒／パルス～約５０ミリ秒／パルス、約０．０１ミリ秒／パルス～約１００ミリ秒／パルス、約０．０１ミリ秒／パルス～約５００ミリ秒／パルス、約０．０１ミリ秒／パルス～約１，０００ミリ秒／パルス、約０．０１ミリ秒／パルス～約５，０００ミリ秒／パルス、約０．０５ミリ秒／パルス～約０．１ミリ秒／パルス、約０．０５ミリ秒／パルス～約０．５ミリ秒／パルス、約０．０５ミリ秒／パルス～約１ミリ秒／パルス、約０．０５ミリ秒／パルス～約５ミリ秒／パルス、約０．０５ミリ秒／パルス～約１０ミリ秒／パルス、約０．０５ミリ秒／パルス～約５０ミリ秒／パルス、約０．０５ミリ秒／パルス～約１００ミリ秒／パルス、約０．０５ミリ秒／パルス～約５００ミリ秒／パルス、約０．０５ミリ秒／パルス～約１，０００ミリ秒／パルス、約０．０５ミリ秒／パルス～約５，０００ミリ秒／パルス、約０．１ミリ秒／パルス～約０．５ミリ秒／パルス、約０．１ミリ秒／パルス～約１ミリ秒／パルス、約０．１ミリ秒／パルス～約５ミリ秒／パルス、約０．１ミリ秒／パルス～約１０ミリ秒／パルス、約０．１ミリ秒／パルス～約５０ミリ秒／パルス、約０．１ミリ秒／パルス～約１００ミリ秒／パルス、約０．１ミリ秒／パルス～約５００ミリ秒／パルス、約０．１ミリ秒／パルス～約１，０００ミリ秒／パルス、約０．１ミリ秒／パルス～約５，０００ミリ秒／パルス、約０．５ミリ秒／パルス～約１ミリ秒／パルス、約０．５ミリ秒／パルス～約５ミリ秒／パルス、約０．５ミリ秒／パルス～約１０ミリ秒／パルス、約０．５ミリ秒／パルス～約５０ミリ秒／パルス、約０．５ミリ秒／パルス～約１００ミリ秒／パルス、約０．５ミリ秒／パルス～約５００ミリ秒／パルス、約０．５ミリ秒／パルス～約１，０００ミリ秒／パルス、約０．５ミリ秒／パルス～約５，０００ミリ秒／パルス、約１ミリ秒／パルス～約５ミリ秒／パルス、約１ミリ秒／パルス～約１０ミリ秒／パルス、約１ミリ秒／パルス～約５０ミリ秒／パルス、約１ミリ秒／パルス～約１００ミリ秒／パルス、約１ミリ秒／パルス～約５００ミリ秒／パルス、約１ミリ秒／パルス～約１，０００ミリ秒／パルス、約１ミリ秒／パルス～約５，０００ミリ秒／パルス、約５ミリ秒／パルス～約１０ミリ秒／パルス、約５ミリ秒／パルス～約５０ミリ秒／パルス、約５ミリ秒／パルス～約１００ミリ秒／パルス、約５ミリ秒／パルス～約５００ミリ秒／パルス、約５ミリ秒／パルス～約１，０００ミリ秒／パルス、約５ミリ秒／パルス～約５，０００ミリ秒／パルス、約１０ミリ秒／パルス～約５０ミリ秒／パルス、約１０ミリ秒／パルス～約１００ミリ秒／パルス、約１０ミリ秒／パルス～約５００ミリ秒／パルス、約１０ミリ秒／パルス～約１，０００ミリ秒／パルス、約１０ミリ秒／パルス～約５，０００ミリ秒／パルス、約５０ミリ秒／パルス～約１００ミリ秒／パルス、約５０ミリ秒／パルス～約５００ミリ秒／パルス、約５０ミリ秒／パルス～約１，０００ミリ秒／パルス、約５０ミリ秒／パルス～約５，０００ミリ秒／パルス、約１００ミリ秒／パルス～約５００ミリ秒／パルス、約１００ミリ秒／パルス～約１，０００ミリ秒／パルス、約１００ミリ秒／パルス～約５，０００ミリ秒／パルス、約５００ミリ秒／パルス～約１，０００ミリ秒／パルス、約５００ミリ秒／パルス～約５，０００ミリ秒／パルス、または約１，０００ミリ秒／パルス～約５，０００ミリ秒／パルスのパルス持続時間を有する複数のパルスを構成する。いくつかの例では、電極によって発生したナノエレクトロポレーションのための電界は、約０．０１ミリ秒／パルス、約０．０５ミリ秒／パルス、約０．１ミリ秒／パルス、約０．５ミリ秒／パルス、約１ミリ秒／パルス、約５ミリ秒／パルス、約１０ミリ秒／パルス、約５０ミリ秒／パルス、約１００ミリ秒／パルス、約５００ミリ秒／パルス、約１，０００ミリ秒／パルス、または約５，０００ミリ秒／パルスのパルス持続時間を有する複数のパルスを構成する。いくつかの例では、電極によって発生したナノエレクトロポレーションのための電界は、少なくとも約０．０１ミリ秒／パルス、約０．０５ミリ秒／パルス、約０．１ミリ秒／パルス、約０．５ミリ秒／パルス、約１ミリ秒／パルス、約５ミリ秒／パルス、約１０ミリ秒／パルス、約５０ミリ秒／パルス、約１００ミリ秒／パルス、約５００ミリ秒／パルス、または約１，０００ミリ秒／パルスのパルス持続時間を有する複数のパルスを構成する。いくつかの例では、電極によって発生したナノエレクトロポレーションのための電界は、最大で約０．０５ミリ秒／パルス、約０．１ミリ秒／パルス、約０．５ミリ秒／パルス、約１ミリ秒／パルス、約５ミリ秒／パルス、約１０ミリ秒／パルス、約５０ミリ秒／パルス、約１００ミリ秒／パルス、約５００ミリ秒／パルス、約１，０００ミリ秒／パルス、または約５，０００ミリ秒／パルスのパルス持続時間を有する複数のパルスを構成する。場合によっては、ナノエレクトロポレーションは、１パルス、２パルス、３パルス、４パルス、５パルス、６パルス、７パルス、８パルス、９パルス、１０パルス、１１パルス、１２パルス、１３パルス、１４パルス、１５パルス、１６パルス、１７パルス、１８パルス、１９パルス、２０パルス、またはそれ以上のパルスを構成する。

場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞によって産生及び分泌された細胞外小胞は、細胞外小胞の密度に基づいて他の細胞片または分子から細胞外小胞を精製し得る遠心分離法または超遠心分離法によって、細胞培養液から収集及び精製される。

場合によっては、ターゲティングポリペプチド及び／または治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞を産生する方法及びシステムは、細胞内にナノエレクトロポレーションされる複数のベクターをナノチャネルに負荷することを含む。場合によっては、ベクター以外の分子（例えば、タンパク質、生体分子、化合物など）がナノチャネル内に負荷されて、細胞内にナノエレクトロポレーションされ得る。場合によっては、上部及び下部電極によって発生した電界は、ベクターが細胞内に入るのを促進する。場合によっては、ナノエレクトロポレーションのために発生した電界により、細胞膜に細孔が作り出されて、ベクターのナノエレクトロポレーションが可能になる。場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞膜の細孔は、局所、例えば、電界が細胞膜に直接接触するナノチャネル出口で形成され得る。

場合によっては、ナノエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞は、非ナノエレクトロポレーション（例えば、従来のバルクエレクトロポレーション、遺伝子銃、リポフェクタミントランスフェクションなど）によってトランスフェクションされた細胞外小胞ドナー細胞よりも、少なくとも１０％、５０％、１倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５０００倍、またはそれ以上多い細胞外小胞を産生及び分泌し得る。場合によっては、ナノエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞は、非ナノエレクトロポレーション（例えば、従来のバルクエレクトロポレーション、遺伝子銃、リポフェクタミントランスフェクション、細胞ストレス応答全般、飢餓、低酸素、及び熱処理など）で刺激された細胞外小胞ドナー細胞によって産生及び分泌された細胞外小胞の数と比較して、少なくとも１０％、５０％、１倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５０００倍、またはそれ以上増加した数の細胞外小胞を産生及び分泌し得る。

場合によっては、温度を上げて細胞外小胞ドナー細胞を培養及びナノエレクトロポレーションすると、細胞外小胞ドナー細胞は、より多くの細胞外小胞を産生及び分泌し得る。例えば、細胞外小胞ドナー細胞を３７℃で培養及びナノエレクトロポレーションすると、４℃で培養及びナノエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞よりも多くの細胞外小胞が産生及び分泌される。場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞は、細胞外小胞ドナー細胞の培養及びナノエレクトロポレーションの間、４℃を超えて１℃上昇するごとに、少なくとも１０％、５０％、１倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、またはそれ以上の細胞外小胞を産生及び分泌する。

場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞を、Ｃａ^２＋を含む緩衝液中で培養すると、より多くの細胞外小胞が産生及び分泌され得る。例えば、ナノエレクトロポレーション後に５００ｎＭＣａ^２＋を含む緩衝液中で培養された細胞外小胞ドナー細胞は、ナノエレクトロポレーション後にＣａ^２＋を含まない緩衝液中で培養される細胞外小胞ドナー細胞の場合と比較して、より多くの細胞外小胞を産生及び分泌する。場合によっては、細胞外小胞ドナー細胞は、ナノエレクトロポレーション後にＣａ^２＋の濃度を増加させた緩衝液中で培養された場合、ナノエレクトロポレーション後にＣａ^２＋を含まない緩衝液中で培養される細胞外小胞ドナー細胞の場合と比較して、少なくとも１０％、５０％、１倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、またはそれ以上の細胞外小胞を産生及び分泌する。緩衝液中の増加したＣａ^２＋濃度の例としては、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、２５０ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、１０００ｎＭ、１１００ｎＭ、１２００ｎＭ、１３００ｎＭ、１４００ｎＭ、１５００ｎＭ、２０００ｎＭ、２５００ｎＭ、３０００ｎＭ、５０００ｎＭ、１００００ｎＭ、またはそれ以上高いＣａ^２＋濃度が挙げられる。

場合によっては、６ｋｂｐＡｓｃｌ１（Ａｃｈａｅｔｅ－ＳｃｕｔｅＣｏｍｐｌｅｘＬｉｋｅ－１）、７ｋｂｐＰｏｕ３ｆ２（ＰｏｕＤｏｍａｉｎＣｌａｓｓ３Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ２）またはＢｒｎ２、及び９ｋｂｐＭｙｔ１ｌ（ＭｙｅｌｉｎＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＦａｃｔｏｒ１Ｌｉｋｅ）をコードするベクターを含む、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを細胞外小胞ドナー細胞にトランスフェクションすると、細胞外小胞ドナー細胞は、より多くの細胞外小胞を産生及び分泌し得る。６ｋｂｐＡｓｃｌ１（Ａｃｈａｅｔｅ－ＳｃｕｔｅＣｏｍｐｌｅｘＬｉｋｅ－１）、７ｋｂｐＰｏｕ３ｆ２（ＰｏｕＤｏｍａｉｎＣｌａｓｓ３Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ２）またはＢｒｎ２、及び９ｋｂｐＭｙｔ１ｌ（ＭｙｅｌｉｎＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＦａｃｔｏｒ１Ｌｉｋｅ）を細胞外小胞ドナー細胞にトランスフェクションすることにより、ナノエレクトロポレーションで刺激された細胞外小胞ドナー細胞によって産生及び分泌される細胞外小胞の数は、６ｋｂｐＡｓｃｌ１（Ａｃｈａｅｔｅ－ＳｃｕｔｅＣｏｍｐｌｅｘＬｉｋｅ－１）、７ｋｂｐＰｏｕ３ｆ２（ＰｏｕＤｏｍａｉｎＣｌａｓｓ３Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ２）またはＢｒｎ２、及び９ｋｂｐＭｙｔ１ｌ（ＭｙｅｌｉｎＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＦａｃｔｏｒ１Ｌｉｋｅ）でトランスフェクションされていない細胞外小胞ドナー細胞をナノエレクトロポレーションすることによって産生及び分泌される細胞外小胞の数と比較して、少なくとも１０％、５０％、１倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、またはそれ以上で増加し得る。

いくつかの例では、ナノエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞によって産生及び分泌される細胞外小胞は、非ナノエレクトロポレーションでトランスフェクションされた細胞外小胞ドナー細胞によって産生及び分泌される細胞外小胞と比較して、少なくとも５０％、１倍、２倍、５倍、１００倍、５００倍、１０００倍、またはそれ以上の治療用ポリヌクレオチドを含む。場合によっては、ナノエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞によって産生及び分泌された細胞外小胞によりカプセル化される治療用ポリヌクレオチドでは、非ナノエレクトロポレーションでトランスフェクションされた細胞外小胞ドナー細胞によって産生及び分泌された細胞外小胞によりカプセル化される治療用ポリヌクレオチドよりも、コードしている治療用ポリペプチドがインタクトである可能性が、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上高い。

場合によっては、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞では、少なくとも１つの治療用ポリヌクレオチドのコピーを含む細胞外小胞を産生及び分泌する百分率が、他のトランスフェクション方法（例えば、従来のバルクエレクトロポレーション、遺伝子銃、リポフェクタミントランスフェクションなど）でトランスフェクションされた細胞外小胞ドナー細胞によって産生及び分泌された、少なくとも１つの治療用ポリヌクレオチドのコピーを含む細胞外小胞の百分率と比較して、増加する。場合によっては、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞によって産生及び分泌された、少なくとも１つの治療用ポリヌクレオチドのコピーを含む細胞外小胞の百分率は、他のトランスフェクション方法でトランスフェクションされた細胞外小胞ドナー細胞によって産生及び分泌された、少なくとも１つの治療用ポリヌクレオチドのコピーを含む細胞外小胞の百分率と比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれ以上増加する。場合によっては、少なくとも１つの治療用ポリヌクレオチドのコピーを含む細胞外小胞の百分率は、細胞外小胞ドナー細胞によって産生及び分泌された、少なくとも１つの治療用ポリヌクレオチドのコピーを含む細胞外小胞の数を、１分、１０分、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、１ヶ月間、２ヶ月間、またはそれ以上長い期間にわたって測定することによって求められ得る。場合によっては、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞では、少なくとも１つの治療用ポリヌクレオチド（例えば、治療用ｍＲＮＡ、治療用ｍｉＲＮＡ）のコピーを含む細胞外小胞を産生及び分泌する数が、他のトランスフェクション方法（例えば、従来のバルクエレクトロポレーション、遺伝子銃、リポフェクタミントランスフェクションなど）でトランスフェクションされた細胞外小胞ドナー細胞によって産生及び分泌された、少なくとも１つの治療用ポリヌクレオチドのコピーを含む細胞外小胞の数と比較して、増加する。場合によっては、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞では、少なくとも１つの治療用ポリヌクレオチドのコピーを含む細胞外小胞を産生及び分泌する数が、他のトランスフェクション方法（例えば、従来のバルクエレクトロポレーション、遺伝子銃、リポフェクタミントランスフェクションなど）でトランスフェクションされた細胞外小胞ドナー細胞によって産生及び分泌された細胞外小胞と比較して、少なくとも０．１倍、０．２倍、０．５倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれ以上増加する。場合によっては、マイクロチャネルエレクトロポレーションまたはナノチャネルエレクトロポレーションされた細胞外小胞ドナー細胞では、細胞外小胞を産生及び分泌する数が増加し、その際、５００個の細胞外小胞のうちの少なくとも１つ、２００個の細胞外小胞のうちの少なくとも１つ、１００個の細胞外小胞のうち少なくとも１つ、５０個の細胞外小胞のうち少なくとも１つ、２５個の細胞外小胞のうち少なくとも１つ、または１０個の細胞外小胞のうち少なくとも１つが、治療用ポリヌクレオチド（例えば、治療用ｍＲＮＡ、治療用ｍｉＲＮＡ）のコピーを少なくとも１つ含む。

医薬組成物
場合によっては、細胞外小胞は医薬組成物へと製剤化され得る。場合によっては、細胞外小胞またはエクソソームを含む医薬組成物は、複数の投与経路（非経口、経口、バッカル、直腸、舌下、または経皮投与経路が挙げられるがこれらに限定されない）によって対象に投与され得る。場合によっては、非経口投与は、静脈内、皮下、筋肉内、脳内、鼻腔内、動脈内、関節内、皮内、硝子体内、骨内注入、腹腔内、または髄腔内投与を含む。いくつかの例では、医薬組成物は局所投与のために製剤化される。他の例では、医薬組成物は全身投与のために製剤化される。場合によっては、本明細書に記載される医薬組成物及び製剤は、静脈内、皮下、及び筋肉内投与によって対象に投与される。場合によっては、本明細書に記載される医薬組成物及び製剤は、静脈内投与によって対象に投与される。場合によっては、本明細書に記載される医薬組成物及び製剤は、皮下投与によって対象に投与される。場合によっては、本明細書に記載される医薬組成物及び製剤は、筋肉内投与によって対象に投与される。

キット／製造品
特定の態様において、本明細書に記載される１つまたは複数の方法及び組成物と共に使用するためのキット及び製造品が本明細書に開示される。また、細胞外小胞またはエクソソームを製造するシステムも本明細書に記載される。場合によっては、システムは、細胞外小胞ドナー細胞をナノエレクトロポレーションして、ターゲティングポリペプチド及び治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞またはエクソソームの産生を刺激する方法を含む。

場合によっては、キットは、バイアル、チューブなどのような容器を１つまたは複数受け入れるように区分されているキャリア、パッケージ、またはコンテナを含み得、容器（複数可）の各々は、本明細書に記載される方法で使用される個別の要素のうちの１つを含む。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、及び試験管が挙げられる。場合によっては、容器は、ガラスまたはプラスチック等の様々な材料から形成され得る。キットは、通常、内容物及び／または取扱説明を記載したラベル、ならびに取扱説明を伴う添付文書を含む。通常は説明書一式も含まれる。

一実施形態では、ラベルは容器上にあるか、または容器に付随する。一実施形態では、ラベルを形成する文字、数字、または他の記号が、容器自体に書き添えられているか、成型されているかまたはエッチングされている場合、ラベルは容器上にあり、ラベルが容器も支える入れ物またはキャリア内に存在している場合、ラベルは、例えば添付文書として、容器に付随する。一実施形態では、ラベルは、内容物が特定の治療用途に使用されることを指し示すために用いられる。ラベルはまた、本明細書に記載される方法等における内容物の使用法も指し示す。

特定の場合では、ターゲティングポリペプチド及び治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞は、本明細書で提供される化合物を含有する１つまたは複数の投与剤形を含有するパックまたはディスペンサーデバイス中に存在し得る。パックは、例えば、ブリスターパック等の金属ホイルまたはプラスチックホイルを含有する。一実施形態では、パックまたはディスペンサーデバイスには、投与説明書が付随する。一実施形態では、パックまたはディスペンサーには、医薬品の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって規定された形態の容器に関連する通知も添えられており、当該通知は、ヒトまたは動物への投与に向けた薬剤の形態についての政府機関による承認を反映するものである。このような通知は、例えば、米国食品医薬品局が薬剤に対して承認したラベルであるか、または承認された製品添付文書である。一実施形態では、適合性のある医薬担体中に配合され、本明細書で提供される化合物を含有する、腫瘍ターゲティングポリペプチド及び治療用ポリヌクレオチドを含む細胞外小胞はまた、調製され、適切な容器に入れられ、適応症治療用とラベル表示される。

場合によっては、キットは、本明細書に記載される養子療法及び治療方法を展開するのに有用な製造品を含む。場合によっては、キットは、ターゲティングポリペプチド及び治療用ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞外小胞、または腫瘍ターゲティングポリペプチド及び治療用ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞外小胞を製造するための構成要素を含む。場合によっては、キットは、ターゲティングポリペプチド及び治療用ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのエクソソーム、またはターゲティングポリペプチド及び治療用ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのエクソソームを製造するための構成要素を含む。

以下の例示的な実施例は、本明細書に記載される組成物、システム、及び方法の実施形態を代表するものであり、任意の手段に限定することを意味するものではない。

実施例１．細胞ナノポレーション（ＣＮＰ）で生成した細胞外小胞の定量化
ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ及びｓｈＲＮＡを含む、目的のヌクレオチド配列を含有するエクソソームを産生及び放出するように細胞を刺激するための細胞ナノポレーション（ＣＮＰ）バイオチップ、ＣＮＰシステム、及びＣＮＰ法を開発し、本明細書に記載する。本システム及び方法により、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）及び樹状細胞（ＤＣ）等の供給源細胞の単層を、ナノチャネルアレイを含有するチップ表面上で培養することが可能になった（図１Ａ）。ナノチャネル（直径約５００ｎｍ）により、一過性の電気パルスが通過可能となり、ＤＮＡプラスミドが、緩衝液から付着した細胞内へと往復輸送された（図１Ａ）。６ｋｂｐＡｓｃｌ１（Ａｃｈａｅｔｅ－ＳｃｕｔｅＣｏｍｐｌｅｘＬｉｋｅ－１、本明細書では時として「Ａ」と呼ぶ）、７ｋｂｐＰｏｕ３ｆ２（ＰｏｕＤｏｍａｉｎＣｌａｓｓ３Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ２）またはＢｒｎ２（本明細書では時として「Ｂ」と呼ぶ）、及び９ｋｂｐＭｙｔ１ｌ（ＭｙｅｌｉｎＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＦａｃｔｏｒ１Ｌｉｋｅ、本明細書では時として「Ｍ」と呼ぶ）プラスミドを緩衝液中に添加すると、ＣＮＰでは、同様の小胞粒度分布を有する、分泌された細胞外小胞（ＥＶ）の収率が、他の従来技術と比較して＞５０倍増加した（図１Ｂ及び図２Ａ～Ｂ）。同様に、飢餓、低酸素、及び熱処理等の全般的な細胞ストレス応答に依存したＥＶ産生法では、ＥＶ放出は中程度でしかなかった（図１Ｃ）。それに比べ、ＣＮＰ誘導性ＥＶ分泌は非常に強力であり、異なる細胞型の供給源及びトランスフェクションベクターに適用することができた（図１Ｄ及び図２Ｃ～Ｄ）。動態解析により、ＥＶ放出は、ＣＮＰ誘導後８時間の時点でピークに達し、２４時間にわたる継続的な分泌が認められることがさらに示された（図１Ｅ）。ＥＶ分泌の程度は、ナノチャネルにかかる電圧を調整することで制御でき、１００Ｖから１５０Ｖに電圧を上げると、放出されるＥＶの数は、プラトーが２００Ｖに達するまで増えることが観察された（図１Ｆ）。３７℃で調製した細胞が、４℃のものと比較してより多くのＥＶを放出したように、周囲温度は、ＣＮＰにより誘発されるＥＶ分泌に影響を及ぼし得る別の変数であった（図２Ｅ）。放出されたＥＶの内部核酸含有量を評価するために、供給源細胞にＰＴＥＮプラスミドを用いたＣＮＰを行った後、ＥＶから収集したＲＮＡを用いてアガロースゲル分析を実施した。ＣＮＰ／ＰＢＳ群と比較した際、より多くの数のインタクトなＰＴＥＮｍＲＮＡがＥＶ内に包まれており（図１Ｇ）、ＣＮＰ／ＰＴＥＮプラスミドで誘導されたＥＶでは、インタクトなＰＴＥＮｍＲＮＡが、全大型ＲＮＡの５５．５±９．２重量％を構成した。定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑｔｒ．－ＰＣＲ）により、ＣＮＰを用いた場合、プラスミドＤＮＡに相補的なＥＶ内のｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡにおいて、ＢＥＰまたはＬｉｐｏ法と比較して１０^３倍の増加が認められたことをさらに確認した（図１Ｈ及び図２Ｆ～Ｈ）。加えて、ＣＮＰで生成したＥＶから抽出した相補的ｍＲＮＡは、タンパク質合成のためのポリペプチドをコードするｍＲＮＡの能力を維持していた（図２Ｉ）。複数のプラスミドＤＮＡをＣＮＰに使用した場合、相補的ｍＲＮＡのレベルは段階的な増加を示し、最大の転写物であるＭｙｔ１ｌは、ピーク濃度に達するまでに最も長い時間（１６時間）を要した（図１Ｉ）。このことは、長い核酸配列の転写には、より多くの時間が必要であるためだと考えられる。

実施例２．細胞外小胞のｍＲＮＡ積載
異なるＥＶ亜群における転写されたｍＲＮＡの分布をより良く理解するために、まず、標準的な多段階超遠心分離法により、エクソソームをマイクロベシクル（ＭＶ）から分離した（図３Ａ～Ｂ）。エクソソーム及びＭＶにおいて、ウェスタンブロットにより、エクソソームマーカー（ＣＤ９、ＣＤ６３、及びＴｓｇ１０１）ならびにＭＶマーカー（Ａｒｆ６）を検出した（図４Ａ）。ＣＮＰでトランスフェクションされた１０^８ＭＥＦに由来する全ＥＶＲＮＡの大部分（＞７５％）は、ＭＶではなくエクソソーム内にあり（図４Ｂ）、エクソソームでの平均重量比、大型ＲＮＡ／タンパク質、は１μｇ／２０μｇであった。このことは、ＣＮＰなしのＭＥＦ細胞に由来する大型ＲＮＡが、同数のエクソソームから検出されなかったことと対照的であった。図４ＣのクライオＴＥＭ画像から、プラスミドＤＮＡを用いたＣＮＰによって生成したエクソソームは多くの核酸を含有した一方、未処理のＭＥＦに由来するエクソソームは空であったことがさらに明らかになった。さらにｑＲＴ－ＰＣＲ測定により、転写されたｍＲＮＡの大部分も、ＭＶ内ではなくエクソソーム内にあり（図４Ｄ）、ｍＲＮＡはタンパク質合成のためのポリペプチドをコードする能力を維持していたことが確認された（図４Ｅ）。

個々のエクソソーム内に積載されているｍＲＮＡに関して、潜在的な多様性をさらに定量化するために、テザードリポプレックスナノ粒子（ＴＬＮ）アッセイを用いた（図４Ｆ）。その際、特定のモレキュラービーコン（ＭＢ）を含有するカチオン性リポプレックスナノ粒子をカバーガラス上に固定し、静電相互作用を利用して、負に帯電したエクソソームをナノ粒子で個別に捕捉した。エクソソーム内のｍＲＮＡとナノ粒子内のＭＢとのハイブリダイゼーションにより、蛍光シグナルが生じ、それを全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡で捉えて、ｍＲＮＡ含有量を定量化した。３種の異なるＤＮＡプラスミド（Ａ、Ｂ及びＭ）を用いたＣＮＰの後、エクソソームのおよそ５０％が１種の転写物のみを含有し、２５％が２種のｍＲＮＡを含有し、残りの２５％のエクソソームが３種のｍＲＮＡ配列全てを含んだことを発見した（図４Ｇ～Ｈ）。この多重積載は、異なるプラスミドをそれらのピークタイム（図１Ｉ）に応じて別々に送達する、順次ＣＮＰ（Ｓ－ＣＮＰ）技術を用いることで改善した（図４Ｇ～Ｈ）。したがって、Ｓ－ＣＮＰにより、個々のエクソソーム内への複数のｍＲＮＡ積載率が５０％超となって大幅に改善された。

実施例３．治療用エクソソームについてのＣＮＰとＢＥＰとの比較
ＣＮＰと既存のＢＥＰ技術との主要な違いは、ＣＮＰでは内因性に転写されたＲＮＡをエクソソーム内にカプセル化するのに対し、ＢＥＰでは外因性のヌクレオチドを事前に単離したエクソソーム内に送達することにある。２つのアプローチ間での効率を比較するために、まず、ｍｉＲ－１２８及びＣＤ６３－ＧＦＰプラスミドの両方を、ＣＮＰを用いてＭＥＦ内に送達して、ｍｉＲ－１２８を含有するＧＦＰ標識エクソソームを生成した。一方、ＢＥＰ挿入のために、遊離ｍｉＲ－１２８を、事前に単離した空のエクソソームと混合した。ＢＥＰでは小型の核酸配列しかエクソソーム内に挿入し得ないため、核酸カーゴとしてマイクロＲＮＡを使用した。小型の核酸配列しかカプセル化できないＢＥＰの機能は、ｍＲＮＡベースのエクソソーム生成においてＢＥＰを使用する際の主な制限となっている。ＣＮＰ及びＢＥＰの両方で調製したエクソソーム内のｍｉＲ－１２８の量を比較するために、Ｃｙ５－ｍｉＲ１２８モレキュラービーコンを含有するテザードリポプレックスナノ粒子（ＴＬＮ）バイオチップを設計して、負に帯電したエクソソームを捕捉し、２種の小胞が融合できるようにした。その後、ｍｉＲ－１２８分子とＣｙ５－ｍｉＲ１２８モレキュラービーコンがハイブリダイゼーションすることにより、ＴＩＲＦ顕微鏡で捉え得る赤色蛍光が放出された（図３Ｃ）。ＣＮＰ及びＢＥＰの両方でｍｉＲ－１２８を含有するエクソソームが約８０％産生されたが、ＣＮＰエクソソーム内のｍｉＲ－１２８の方がはるかに濃度は高かった（図３Ｄ～Ｆ）。その上、ＢＥＰとは異なり、ＣＮＰでは大型ｍＲＮＡを含有するエクソソームが効率的に産生され（図５Ａ～Ｃ）、ＣＮＰで分泌されたエクソソームは、ＢＥＰ挿入によるエクソソームよりも、＞１００倍多くＢｒｎ２ｍＲＮＡを含有していた（図１Ｈ及び図５Ｄ）。

実施例４．ＣＮＰ誘導性エクソソーム分泌の機序
ＣＮＰ誘発性エクソソーム放出の根底にある細胞機序を調べるために、まずＣＮＰ曝露後の細胞内の構造変化を調べた。ＣＮＰは、ＭＥＦ内の多胞体（ＭＶＢ）の形成を有意に増加させたことが示された（図６Ａ）。ＣＤ６３－ＧＦＰプラスミドをＣＮＰでＭＥＦに送達すると、誘導後４時間以内にＧＦＰ陽性ＭＶＢが多数形成された（図６Ｂ）。さらに、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により、ＣＮＰ処理後のＭＥＦでは、ＭＶＢが約２倍、腔内膜小胞（ＩＬＶ）が約８倍増加したことが明らかになった（図６Ｃ～Ｅ）。このことに対応して、エクソソームの生合成に関与するタンパク質の発現増加が認められた（図６Ｆ）。ＣＮＰは、供給源細胞の原形質膜を越えて局所性電界を送達することに依存しているため、接触点で損傷が生じる可能性がある。まず、基底面に面した原形質膜に多数の細孔が形成され、その後、細胞尖端側の表面を越えて蛍光が段階的に増加（ＢＥＰに供した細胞よりも遅い）したことが示されており、このことは、ＣＮＰにより、小型の細孔がナノチャネルとの接触点を越えて形成されたことを示唆している（図６Ｇ）。興味深いことに、細胞膜のナノ孔は、エレクトロポレーション後２分以内に閉じることがわかり、膜損傷を修復するために回復プロセスが生じた可能性が指し示された（図６Ｈ～Ｉ）。細胞内のカルシウムイオンレベルが高くなると、エクソソームの放出が促進されることが報告されているため、ＣＮＰによってエクソソームの分泌レベルが上昇した後に、これらのナノ孔を通じてカルシウムイオンが流入することが果たす役割を調べた。実際、ＣＮＰ後のエクソソーム放出量は、細胞外空間におけるＣａ^２＋の増加と共に上昇し、それに伴って細胞内のＣａ^２＋が増加したことがわかった（図６Ｊ～Ｌ）。カルシウムキレート剤であるＥＧＴＡを添加すると、細胞内部のカルシウムイオンの上昇が大方遮られ、ＣＮＰにより生じるエクソソーム放出が抑制された（図６Ｍ～Ｎ）。このことは、細胞内のＣａ^２＋の上昇が、ＣＮＰによるエクソソーム分泌の誘導を惹起する要因であり得たことを示唆している（図６Ｏ）。

次に、ＣＮＰ処理後のエクソソーム形成の増加に寄与する、供給源細胞内のストレス応答を評価した。熱ショックにより、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）の産生増加を通じて、エクソソームの生合成が刺激されることが示されている。数値的シミュレーションから、ＣＮＰ中、ナノチャネル出口付近で６０℃に迫る温度の増加が、一時的に（＜１ｓ）生じ得たことが示された（図７Ａ～Ｃ）。この温度上昇は、ナノチャネル出口付近の細胞表面に集中していた（図７Ｄ～Ｆ）。予想通り、ＣＮＰは細胞のＨＳＰ発現を大幅に増加させ、ＨＳＰ阻害剤を加えるとエクソソーム分泌が著しく抑制されることがわかった（図７Ｇ～Ｈ）。このことから、ＣＮＰ介在性エクソソーム産生には、熱ショック応答が重大な意味を持ったことが示唆される。ＨＳＰはＰ５３活性を制御し得、そして次にＰ５３は、ＴＳＡＰ６を通じてエクソソーム産生を制御することから、ＣＮＰを介したＨＳＰ量の増加が、Ｐ５３－ＴＳＡＰ６シグナル経路を通じてエクソソーム産生を促進したかどうかを調べた。それに合うように、ＣＮＰ後にＰ５３及びＴＳＡＰ６の発現レベルが上方制御され（図７Ｉ）、Ｐ５３を安定的にノックダウンしたＭＥＦ細胞株（ＭＥＦＰ５３－／－）では、ＴＳＡＰ６の発現量が変化しなかったことがわかった（図７Ｉ）。さらに、Ｐ５３－／－ＭＥＦ細胞では、ＣＮＰ後のエクソソーム放出量は増加しなかった（図７Ｊ）。これらの結果から、ＣＮＰ誘導性の局所的熱ストレスがある状況で、熱ショック応答がＰ５３－ＴＳＡＰ６シグナルの活性化を促し、細胞の回復プロセスの一部としてエクソソーム産生が増加することが示唆された（図７Ｋ）。

実施例５．ＣＮＰ生成エクソソームの機能的及び薬物動態評価
ＰＴＥＮ欠損ヒトＵ８７及びマウスＧＬ２６１神経膠腫モデルにおいて一般に変異している腫瘍抑制遺伝子ＰＴＥＮを、ｍＲＮＡ－エクソソームの臨床的有用性のために評価した。神経膠腫ターゲティング機能を実現するために、エクソソーム表面上に大量に存在する膜貫通タンパク質であるＣＤ４７のＮ末端に、神経膠腫ターゲティングペプチドをクローニングした（図８Ａ）。２種類のペプチド、Ｕ８７ターゲティング用のＣＤＸペプチド（ＦＫＥＳＷＲＥＡＲＧＴＲＩＥＲＧ（配列番号１０４））及びＧＬ２６１ターゲティング用のＣＲＥＫＡ、とＦＬＡＧエピトープを、別々にＣＤ４７のＮ末端に挿入した。エクソソーム上のＣＤ４７のトポロジーが不明であったため、抗ＦＬＡＧビーズを用いてプルダウンアッセイを実施して、ＣＤ４７のＮ末端がエクソソームの外側表面に局在していることを確認した（図８Ｂ）。ターゲティングペプチドを追加することにより、Ｕ８７及びＧＬ２６１細胞におけるＣＤ４７－エクソソーム（Ｅｘｏ－Ｔ）の取り込みが劇的に増加しただけでなく、ＰＴＥＮタンパク質の翻訳量も増加した（図８Ｃ～Ｆ、図９、図１０Ａ～Ｄ）。エンドサイトーシスマーカーを染色したところ、Ｅｘｏ－Ｔはトランスフェリンと強く共局在したことが明らかになった（図８Ｇ及び図１０Ｅ）。クラスリン介在性エンドサイトーシスを阻害すると、エクソソームの細胞内への取り込みが有意に減少した（図８Ｈ及び図１０Ｆ）ことから、Ｅｘｏ－Ｔの標的細胞への侵入は、クラスリン介在性エンドサイトーシスによって介在され得ることが示唆される。Ｅｘｏ－Ｔは、腫瘍細胞の増殖を阻害することができ、最小限の細胞毒性を示した（図８Ｉ～Ｊ及び図１０Ｇ～Ｈ）。

ｉｎｖｉｖｏ適用に向けてＥｘｏ－Ｔの潜在的な役割を調べるために、Ｅｘｏ－Ｔの薬物動態特性を評価した。ＣＤ４７プラスミドを細胞にトランスフェクションした後、ＣＤ４７がエクソソーム表面上に強力に発現した（図８Ｋ、上部パネル）。ＣＤ４７をエクソソーム表面上に過剰発現させると、Ｅｘｏ－Ｔのｉｎｖｉｖｏ循環半減期が３倍延長することがわかり、ターゲティングペプチドを加えてもＣＤ４７の機能に明らかな影響はなかった（図８Ｋ）。免疫原性についての結果により、異なる投与量及び異なる時点（２時間、８時間、及び２４時間）でテストしたマウスにおいて、Ｅｘｏ－Ｔには明らかなｉｎｖｉｖｏ毒性及び免疫原性がなかったことが示された（図８Ｌ及び図１０Ｉ）。

実施例６．神経膠腫の前臨床モデルにおけるＥｘｏ－Ｔのｉｎｖｉｖｏ治療有効性
ＰＴＥＮ欠損神経膠腫モデルにおけるＥｘｏ－Ｔの治療的可能性を評価するために、ヒトＵ８７を同所性移植した担神経膠腫免疫不全マウスにＥｘｏ－Ｔを静脈内注射した。Ｅｘｏ－Ｔでは、非標的化エクソソーム（エクソソーム）またはＴｕｒｂｏＦｅｃｔ（Ｔｕｒｂｏ）ナノ粒子と比較して、腫瘍への集積が著しく向上したことが示された（図１１Ａ）。腫瘍間質内でのＥｘｏ－Ｔのｉｎｖｉｖｏ生体内分布をさらに評価するために、ＰＫＨ２６で標識した、Ｅｘｏ－Ｔ、エクソソーム、及びＴｕｒｂｏを担腫瘍マウスに全身投与し、生体蛍光顕微鏡で画像化した。Ｅｘｏ－Ｔ投与４時間後に腫瘍間質内で強いＰＫＨ蛍光が観察されたが、エクソソームまたはＴｕｒｂＦｅｃｔナノ粒子では観察されなかった（図１１Ｂ～Ｃ及び図１２Ａ～Ｂ）。さらに、全身分布を評価したところ、Ｅｘｏ－Ｔの肝臓及び脾臓への集積においては、標識数が減少していたことが明らかになった（図１１Ｄ～Ｅ）。

Ｅｘｏ－Ｔで処理したＵ８７マウスでは、腫瘍成長は有意に阻害されたことが実証され（図１１Ｆ～Ｇ）、生存時間の中央値は４９日となり、非標的化エクソソームでの３７日と比較して生存時間の延長が示された（図１１Ｈ）。両群の残存腫瘍組織を評価したところ、ＰＴＥＮｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの両方が、Ｅｘｏ－Ｔ処理後に上方制御されたことが明らかになった（図１１Ｉ～Ｊ）。免疫組織化学染色の結果から、Ｅｘｏ－Ｔ処理によってＰＴＥＮ発現が回復し、腫瘍細胞の増殖が阻害され、調査した他の組織に対しても直接的な効果を及ぼさなかったことをさらに確認した（図１１Ｋ～Ｍ及び図１３）。

次に、免疫能力を有するＰＴＥＮ欠損ＧＬ２６１神経膠腫モデルにおける、Ｅｘｏ－Ｔの治療有効性を調べた。Ｅｘｏ－Ｔでは、非標的化エクソソーム（エクソソーム）またはＰＥＧ－リポソーム（リポソーム）と比較して、腫瘍への集積が有意に向上したことが示された（図１４Ａ）。腫瘍間質内でのＥｘｏ－Ｔのｉｎｖｉｖｏ生体内分布をさらに評価するために、ＰＫＨ２６で標識した、Ｅｘｏ－Ｔ、エクソソーム、及びＰＥＧ－リポソームを担腫瘍マウスに全身投与し、生体蛍光顕微鏡で画像化した。Ｅｘｏ－Ｔ投与４時間後に腫瘍間質内で強いＰＫＨ蛍光が観察されたが、エクソソームコホートまたはリポソームナノ粒子コホートでは観察されなかった（図１４Ｂ～Ｃ）。ｅｘｖｉｖｏの結果、エクソソームの大部分は脳腫瘍細胞に取り込まれたが、正常な脳細胞では、投与後のエクソソームの取り込みは最小限であったことが示された（図１４Ｄ）。さらに、全身分布を評価したところ、Ｅｘｏ－Ｔの肝臓及び脾臓への集積においては、標識数が減少していたことが明らかになった（図１４Ｅ～Ｆ）。Ｅｘｏ－Ｔで処理したＧＬ２６１マウスでは、腫瘍成長は有意に阻害されたことが実証され（図１４Ｇ～Ｈ）、生存時間の中央値は４５日となり、非標的化エクソソームでの３１日に対して生存時間の延長があった（図１４Ｉ）。両群の残存腫瘍組織を評価したところ、ＰＴＥＮｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの両方が、Ｅｘｏ－Ｔ処理後に上方制御されたことが明らかになった（図１４Ｊ～Ｋ）。免疫組織化学染色の結果から、Ｅｘｏ－Ｔ処理によってＰＴＥＮ発現が回復し、腫瘍細胞の増殖が阻害され、調査した他の組織に対しても直接的な効果を及ぼさなかったことをさらに確認した（図７Ｌ～Ｎ及び図１５）。

実施例７．治療用細胞外小胞を合成する方法及びシステム
治療用ポリヌクレオチドをカプセル化するための細胞外小胞またはエクソソームを産生するための模範的な方法及びシステムが本明細書に記載される。本方法及びシステムによって産生される細胞外小胞及びエクソソームは、治療に使用するための医薬組成物へと製剤化するのに適し得る。

細胞培養
マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を、１０％熱失活したウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。１０ｍｍｏｌ／ＬＨＥＰＥＳ、１０％ＦＢＳ、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを追加したＤＭＥＭにおいて、ヒト神経膠腫Ｕ８７－ＭＧ及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を、５％ＣＯ_２で平衡化した加湿条件下、３７℃にて培養した。

プラスミド調製
Ａｓｃｌ１（Ａｃｈａｅｔｅ－ＳｃｕｔｅＣｏｍｐｌｅｘＬｉｋｅ－１）、Ｐｏｕ３ｆ２（ＰｏｕＤｏｍａｉｎＣｌａｓｓ３Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ２）またはＢｒｎ２、及びＭｙｔ１ｌ（ＭｙｅｌｉｎＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＦａｃｔｏｒ１Ｌｉｋｅ）を合成した。ＰＴＥＮ、ＣＤ４７、ＣＤ６３－ＧＦＰ及びｍｉＲ－１２８プラスミドは購入可能であった。ＣＤＸ（ＦＫＥＳＷＲＥＡＲＧＴＲＩＥＲＧ（配列番号１０５））、ＣＲＥＫＡ、及びＦＬＡＧタグをコードするように設計されたプライマーを用いて、ＣＤ４７のＮ末端にリガンドを導入した。マウス骨髄からの単核球の単離。４～１２週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを頸椎脱臼で安楽死させ、７０％エタノールで５分間殺菌した。大腿骨及び脛骨を取り出し、無菌条件下で精製した。次いで、インタクトな骨をＰＢＳで洗浄し、両端をハサミで切断した。骨髄は、０．４５ｍｍ径の針を用いてＲＰＭＩ－１６４０培地ですすいだ。５分間１，０００ｒｐｍで遠心分離することにより、細胞を収集した。細胞ペレットにトリス－ＮＨ_４Ｃｌ赤血球溶血緩衝液を加えて赤血球を除去した。細胞懸濁液をさらに５分間１，０００ｒｐｍで遠心分離して、単核球を収集した。骨髄由来ＤＣ（ＢＭＤＣ）の誘導培養。単離した単核球を、１０％ＦＢＳを追加したＲＰＭＩ－１６４０培地で、５％ＣＯ_２を含有するインキュベーター内で３７℃にて培養した。培養液に２０ｎｇ／ｍｌＧＭ－ＣＳＦ及び１０ｎｇ／ｍｌＩＬ－４を追加した。培養１２時間後、付着していない細胞を除去し、ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４を含有する新鮮な完全培地に交換した。７日目に、フラスコに対して培地を穏やかにピペッティングすることで、緩やかに付着した細胞を回収した。細胞をＣＮＰチップに蒔き、リポ多糖と共にさらに２４時間インキュベーションした。

細胞トランスフェクション
ＣＮＰのために、１ｃｍ×１ｃｍの３ＤＣＮＰシリコンチップ表面上に、ＭＥＦ、ＭＳＣ、ＤＣ、またはＨＥＫ－２９３Ｔ細胞（－２００，０００細胞）を単層で広げ、一晩細胞をインキュベーションした。ＰＢＳ緩衝液にあらかじめ入れておいたプラスミドは、２００Ｖの電界で１０ｍｓ／パルスの５パルスを０．１秒間隔で作用させて、ナノチャネル（－直径５００ｎｍ及び間隔５μｍ）を介して個々の細胞内に注入した。最良の選択のために、様々なエレクトロポレーション条件をテストした。バルクエレクトロポレーション（ＢＥＰ）、遺伝子銃、及びリポフェクタミン２０００トランスフェクションを実施した。トランスフェクションのために、Ａｓｃｌ１／Ｂｒｎ２／Ｍｙｔ１ｌプラスミドを２／１／１の重量比及びＰＢＳ緩衝液中１００ｎｇ／ｍＬの濃度でプレミックスした。ＰＴＥＮ、ｍｉＲ－１２８、ＣＤ４７、ＣＤＸ－ＣＤ４７、ＣＲＥＫＡ－ＣＤ４７及びＣＤ６３－ＧＦＰプラスミドの細胞トランスフェクションも同一の手順に従った。

ドナー細胞により分泌されたＥＶの収集及び精製
細胞は、血清を含有する培養液で培養した。トランスフェクションの前に、血清を含有する細胞培養液を除去した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、無血清細胞培養液で培養した。ｑＲＴ－ＰＣＲのために、１０分間１５００ｇで遠心分離することによって、細胞培養上清からＥＶを収集した。動的光散乱角度測定（ＤＬＳ）ならびにＮａｎｏＳｉｇｈｔ（商標）ｉｎｖｉｔｒｏ細胞トランスフェクション及びｉｎｖｉｖｏ動物実験によるＥＶ粒子測定のために、一連の遠心分離及び超遠心分離工程によって、細胞培養上清からＥＶを収集した。

ＣＮＰバイオチップ製造
両面研磨された４インチ（１００ｍｍ）ウエハをベースとして、ナノチャネルアレイデバイスを製造した。要約すると、まず、ＨＭＤＳプライム処理後、Ｓｈｉｐｌｅｙ１８１３フォトレジスト薄膜をシリコンウエハ上に３，０００ＲＰＭでスピンコートした。フォトレジスト上のナノ孔開口部は、投影リソグラフィを用いてパターン化した。高アスペクト比（＞２０：１）のナノチャネルアレイ（深さ１０μｍ）をエッチングするために、深掘り反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）技術である「ボッシュプロセス」を利用した。最適化されたパラメータを用いて、エッチングガスＳＦ_６及び側壁パッシベーションガスＣ_４Ｆ_８が交互に繰り返されるように設定した。ウエハ反対側のマイクロチャネルリザーバーは、フォトリソグラフィとＤＲＩＥとを組み合わせた同様のプロセスで生成した。処理したウエハをピラニア洗浄（１２０℃、１０分）した後、１ｃｍ×１ｃｍの片へと切断した。ＰＤＭＳスペーサーは、プレポリマー／硬化剤混合物（重量比１０：１）を室温で３日間硬化させて作られたものとした。ＰＤＭＳとシリコンの表面を酸素プラズマで前処理して、強固な結合を確実にした。下部電極として、スライドガラス上に金の薄膜を堆積させた。上部電極としては金の棒材を用いた。

全ＥＶからのエクソソーム及びマイクロベシクルの選別
収集した全ＥＶについて、３０分間１０，０００ｇで遠心分離することにより、マイクロベシクルを選別した。上清をさらに２時間１００，０００ｇで遠心分離して、より小さいエクソソームを収集した。

ＤＬＳ及びＮａｎｏＳｉｇｈｔ（商標）によるＥＶサイズ測定
ＥＶの粒度分布は、ＤＬＳ測角器を用いて測定した。細胞当たりの分泌されたエクソソーム及びマイクロベシクルの絶対数は、比較のために、トランスフェクション後、同数の生ドナー細胞を用いて、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（商標）により定量した。

アガロースゲルアッセイ
０．５％μｇ／ｍｌエチジウムブロマイドを含有する１％（ｗ／ｖ）アガロースゲルにサンプルをロードした。３０分間１００Ｖで電気泳動を実施した。紫外光の下、ゲルを撮影した。

ＥＶが含有しているＲＮＡの発現レベルについてのｑＲＴ－ＰＣＲ
ＥＶ内のＡｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１ｌ及びＰＴＥＮｍＲＮＡならびにｍｉＲ－１２８の発現量は、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いて測定した。要約すると、ＴＲＩｚｏｌ試薬を用いて全ＲＮＡを得た。プライマーとしてランダムヘキサマーを用いた第一鎖ｃＤＮＡ合成キットを用いて、等量のＲＮＡの逆転写を行った。遺伝子発現量は、ＳＹＢＲｇｒｅｅｎを用いて測定した。全ての実験は３回実施した。使用したプライマー配列は以下の通りにした。Ａｓｃｌ１（マウス）、フォワード：５’－ＴＧＧＴＧＴＣＴＧＡＡＣＣＴＡＡＧＣＣＣ－３’（配列番号１０６）、及びリバース：５’－ＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＴＧＡＣＧＴＴＧＣＴ－３’（配列番号１０７）；Ｍｙｔ１ｌ（マウス）、フォワード：５’－ＣＣＴＡＴＧＡＧＧＡＣＣＡＧＴＣＴＣＣ－３’（配列番号１０８）、及びリバース：５’－ＧＡＣＡＴＧＧＣＴＧＴＣＡＣＴＧＧＡＴ－３’（配列番号１０９）；Ｂｒｎ２（マウス）、フォワード：５’－ＧＡＣＡＣＧＣＣＧＡＣＣＴＣＡＧＡＣ－３’（配列番号１１０）、及びリバース：５’－ＧＡＴＣＣＧＣＣＴＣＴＧＣＴＴＧＡＡＴ－３’（配列番号１１１）；ＧＡＰＤＨ（マウス）、フォワード：５’－ＧＧＧＡＡＡＴＴＣＡＡＣＧＧＣＡＣＡＧＴ－３’（配列番号１１２）及びリバース：５’－ＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＣＴＴＣＣＣ－３’（配列番号１１３）；ＰＴＥＮ、フォワード：５’－ＣＡＡＧＡＴＧＡＴＧＴＴＴＧＡＡＡＣＴＡＴＴＣＣＡＡＴＧ－３’（配列番号１１４）、及びリバース：５’－ＣＣＴＴＴＡＧＣＴＧＧＣＡＧＡＣＣＡＣＡＡ－３’（配列番号１１５）；ならびにＧＡＰＤＨ、フォワード：５’－ＧＡＣＡＧＴＣＡＧＣＣＧＣＡＴＣＴＴＣＴ－３’（配列番号１１６）、及びリバース：５’－ＴＴＡＡＡＡＧＣＡＧＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣ－３’（配列番号１１７）。

ｉｎｖｉｔｒｏタンパク質翻訳
各トランスフェクション方法由来の同量の全ＲＮＡ（１μｇ）を、ｉｎｖｉｔｒｏタンパク質翻訳に適用した。翻訳操作を済ませた後、サンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、ウェスタンブロットのプロットで示したように、タンパク質を種々の抗体で検出した。

透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）
ＴＥＭ分析用の細胞は、ＣＮＰトランスフェクションから４時間後に収集し、ＰＢＳ中の２０％ＢＳＡに再懸濁させ、次いで、凍結深度２００μｍハット内に入れ、高圧で凍結させた。次いで、凍結サンプルを、氷ブロック中で１％四酸化オスミウム及び０．１％酢酸ウラニルで凍結置換し、発泡スチロールブロック内で３時間、０℃まで温めておき、３０分間フードに移動させ、１２時間保持してから、５℃／ｈで５時間、２５℃まで昇温し、１２時間前後保持した。サンプルをアセトンで２回、酸化プロピレン（ＰＯ）で１回、それぞれ１５分間洗浄した。ＰＯと１：２、１：１、及び２：１で混合した樹脂を、それぞれ２時間サンプルに浸透させ、ヒュームフード内で室温にて循環させながら、２：１の樹脂ＰＯ中にサンプルを一晩漬けたままにした。次いで、サンプルを包埋し、キャリア／細胞（まだハット内にある場合）試料を上向きにして、６５℃のオーブン内に一晩置いた。７５～９０ｎｍの間で切片を採取し、フォルムバール／カーボン膜１００メッシュＣｕグリッド上に載せ、次いで、５０％アセトン中の３．５％酢酸ウラニルで３０秒間コントラスト染色し、その後０．２％クエン酸鉛で３～４分間染色した。サンプルを観察し、２ｋ×４ｋデジタルカメラを用いて撮影した。

クライオＴＥＭ
クライオ電子顕微鏡法のために、３μｌのＥＶサンプルを、グロー放電処理した３００メッシュＲ２．０／２．０Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌグリッド上に滴下した。ＶｉｔｒｏｂｏｔＩＶプランジャー（ＦＥＩ）を用いて、グリッドをＷｈａｔｍａｎ＃１濾紙で吸い取り、液体エタン中で急速凍結した。顕微鏡写真は、３００ｋＶで作用するＦＥＩＴｅｃｎａｉＦ３０電子顕微鏡内の４ｋ×４ｋＣＣＤカメラで、倍率５９，０００×、線量２０電子／Å^２、デフォーカス５μｍにて記録した。

細胞のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）取り込みによる細胞膜損傷の評価
ＣＮＰ誘導性の一過性細胞膜損傷は、細胞の取り込みによるＰＩ（ＰｒｏｐｉｄｉｕｍＩｏｄｉｄｅ）の拡散に基づいて生じる蛍光シグナルによって定量化した。ＭＥＦは、２００Ｖ、１０ｍｓの電気パルスによるＣＮＰでトランスフェクションした。ＰＩを直ちにリザーバーの上部（細胞側）または下部のいずれかに添加した。ＥＭＣＣＤカメラを搭載した倒立顕微鏡システムを用いて、オンチップタイムラプス落射蛍光生細胞イメージングを実施した。コントロールとして、ＭＥＦのＢＥＰを電界条件に従って行った。模範的なＢＥＰのプロトコル及び条件としては、ＢＥＰ装置であるＮｅｏｎＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍのマニュアルを挙げることができる。

細胞内カルシウム濃度測定
細胞を１０μＭＦｕｒａ２－Ａｍと共に３７℃にて１時間インキュベーションした。細胞外色素はＰＢＳで洗い流し、細胞を完全ＲＰＭＩ培地に再懸濁させた。７μＭＭＯＮを添加した後、蛍光変化を蛍光分光光度計で記録した。全ての実験は光から保護され、２時間以内に完了した。

ＣＮＰ中の温度測定
ＣＮＰ中のジュール熱による温度上昇を、温度感受性の蛍光色素であるローダミンＢを用いて測定した。蛍光色素の拡散を防ぐために、塩化カルシウム粉末にアルギン酸ナトリウム溶液を加えてアルギン酸カルシウムゲルを形成し、ＣＮＰ中の色素拡散を抑制した。

ＣＮＰ中のＦＥＭ熱伝導シミュレーション
ナノチャネル近傍の温度場は、ＣＯＭＳＯＬ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｐｈｙｓｉｃｓ５．０．（ＣＯＭＳＯＬＩｎｃ．）「流体における熱伝導」モジュールを用いて、支配方程式：

式中、ρ：密度ｃ_ｐ：熱容量ｕ：流量ｋ：熱伝導率、初期温度＝２２℃、を解くことによりシミュレーションした。ナノチャネルは、出力密度Ｑ_ｎｃ＝Ｐ／Ｖ≒１０^１４Ｗ／ｍ^３のパルス熱源とみなした。シミュレーションしたデータはＭＡＴＬＡＢ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ）にエクスポートして解析した。

ＥＶプルダウンアッセイ
プロテイン－Ａセファロースビーズを２ｍｇ／ｍｌＢＳＡ／ＰＢＳ溶液と共に４℃にて一晩インキュベーションした。続いて、ビーズを冷ＰＢＳで３回洗浄した。ウサギ抗ＦＬＡＧ抗体をビーズと共に４℃にて４時間インキュベーションし、次いで、冷ＰＢＳで３回洗浄した。精製したＥＶをビーズと共に一晩インキュベーションした。洗浄後、ビーズを０．１％ＳＤＳ中で溶出させ、上清２０μｌをポリアクリルアミドゲル用に使用した。

細胞内取り込みについてのフローサイトメトリー
ＥＶをＰＨＫ６７で標識し、処理前に、２４ウェルプレート内の６０，０００Ｕ８７－ＭＧ細胞と共に３７℃にて４時間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞を冷ＰＢＳで３回すすぎ、４％パラホルムアルデヒド溶液で固定した。細胞の蛍光強度は、ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒＥＰＩＣＳＸＬフローサイトメーターを用いて分析した。各細胞サンプルについて、リストモードで最低１０，０００イベントを収集した。

共焦点顕微鏡法
ＰＫＨ２６染色ＥＶと共に４時間インキュベーションした後、細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、ホルムアルデヒド（４％）／ＰＢＳで３０分間固定した。細胞核を金コーティング溶液と共にＤＡＰＩで染色し、蛍光をレーザー走査型共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７１０、ＣａｒｌＺｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で可視化し、記録した。全ての画像を、オフラインでバックグラウンド減算法を用いて解析した。

テザードリポプレックスナノ粒子（ＴＬＮ）バイオチップアッセイ及び全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）イメージング
全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡（ＮｉｋｏｎＥｃｌｉｐｓｅＴｉ倒立顕微鏡システム）上で、テザードリポプレックスナノ粒子（ＴＬＮ）を用いてＥＶを試験した。要約すると、ＲＮＡを標的とするモレキュラービーコン（ＭＢ）をカチオン性リポソームナノ粒子内にカプセル化した。これらのカチオン性リポプレックスナノ粒子をスライドガラス上に固定すると、負に帯電したＥＶが静電相互作用によって捕捉されて、より大きなナノスケール複合体が形成された。このリポプレックスとＥＶの融合により、バイオチップ界面近傍のナノスケールの制限空間内で、ＲＮＡとＭＢとが混合された。ＴＩＲＦ顕微鏡を用いて、固定されたリポソームナノ粒子が位置する場である界面（焦点面）から３００ｎｍの範囲内で蛍光シグナルを測定した。

ＭＴＳアッセイ
トランスフェクションの２４時間前に、Ｕ８７－ＭＧ細胞を９６ウェルプレートに５０００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を無血清培地で３回洗浄し、ＥＶとインキュベーションした。トランスフェクション後４８時間の時点で、培地を新鮮な細胞培養液に交換した。次いで、製造者の指示に従ってＭＴＳアッセイにより細胞生存率を解析した。要約すると、ＭＴＳ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）２０μｌを各ウェルに加えた。マイクロプレートを加湿雰囲気（５％ＣＯ_２、３７℃）で２時間インキュベーションした後、マイクロプレートリーダーを用いて分光光度的に吸光度を測定した。測定波長は４９０ｎｍに設定した。細胞生存率は、未処理コントロールに対する百分率として提示した。

動物試験
６～８週齢のＢＡＬＢ／Ｃ－ｎｕ及びＣ５７ＢＬ／６マウスを、病原体フリーの施設において隔離ケージ内で飼育した。マウス実験プロトコルは、ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎＢｏａｒｄｏｆＳｃｉｅｎｃｅ＆ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＪｉｌｉｎＰｒｏｖｉｎｃｅまたはＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅにより承認され、ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＨｅａｌｔｈＧｕｉｄｅｆｏｒｔｈｅＣａｒｅａｎｄＵｓｅｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌｓに準拠して実施した。

ｉｎｖｉｖｏ毒性及び免疫原性アッセイ
ＥＶを全身送達した後に、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血清中ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＢＵＮ、及びクレアチニンを測定することによるｉｎｖｉｖｏ毒性アッセイを実施した。ＥＶ注入後のマウス血清ＩＬ－６及びＴＮＦレベルは、ＩＬ－６及びＴＮＦアルファＥＬＩＳＡキットで測定した。

動物手術及び腫瘍移植
１０％抱水クロラールの腹腔内注射により、マウス（６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕまたはＣ５７ＢＬ／６、雄）に麻酔をかけ、定位装置に固定した。麻酔後、炎症及び疼痛を軽減するために、デキサメサゾン（２ｍｇ／ｋｇ）とブプレノルフィン（０．２ｍｇ／ｋｇ）を皮下投与した。頭部を剃毛し、頭蓋骨を露出させた。外科用ドリルを用いて体性感覚皮質上に円形の開頭術（直径：３～４ｍｍ）を実施した。腫瘍細胞（１×１０^８、ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕマウスにはＵ８７－Ｌｕｃ腫瘍細胞、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにはＧＬ２６１－Ｌｕｃ腫瘍細胞）は、マイクロマニピュレーターを用いて３２ゲージの針で、表面からおよそ８００μｍ下の皮質内に、以下の座標（注入位置は尾状核）：ブレグマに対して前方０．５ｍｍ、側方１．５ｍｍ、脳表面から３．０ｍｍの深さで、０．１μｌ／分の速度にて圧力をかけて注入した。移植後、円形カバーガラス（直径：５ｍｍ）を、頭蓋骨切除部位を覆うように接着し、次いで歯科用セメントでさらに固定した。体温は直腸プローブでモニターし、加温ブランケットによって３７℃に維持した。術後の炎症及び疼痛を軽減するために、デキサメサゾン（皮下、２ｍｇ／ｋｇ）及びブプレノルフィン（皮下、０．２ｍｇ／ｋｇ）を、毎日１回で１週間投与した。腫瘍移植後１４日目に初めて動物を撮影し、実験は生理学的変数が正常範囲内のままである場合にのみ実施した。

ＩＶＩＳイメージング
ＢＡＬＢ／Ｃ－ｎｕまたはＣ５７ＢＬ／６マウスを用いて、エクソソームのｉｎｖｉｖｏターゲティング及び体内分布を別々に検討した。腫瘍移植（１×１０^８、ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕマウスにはＵ８７－Ｌｕｃ腫瘍細胞、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにはＧＬ２６１－Ｌｕｃ腫瘍細胞）後１４日目に、蛍光顕微鏡で腫瘍を確認した。ＰＫＨ２６標識Ｅｘｏ、Ｅｘｏ－Ｔ及びＴｕｒｂｏＦｅｃｔｉｎｖｉｖｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎまたはＰＥＧ－リポソームは、尾静脈を通じて静脈注入した。注入後１時間及び４時間後に、１０％抱水クロラールでマウスに麻酔をかけ、ＩＶＩＳＳｐｅｃｔｒｕｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ａｍｅｒｉｃａ）で記録した。４時間後、マウスを安楽死させ、脳、肝臓、肺、脾臓、心臓及び腎臓を含む主要器官を収集した。ＰＫＨ２６の蛍光シグナルを捉えて解析した。

二光子イメージング
３％抱水クロラールの腹腔内注射により、マウス（６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕまたはＣ５７ＢＬ／６、雄）に麻酔をかけ、カスタムメイドの定位装置に対物レンズ下で固定した。生理食塩水、ナノ粒子（ＮＰ）及びＥＶを、それぞれ１：１の比率でＰＫＨ２６リンカーキットと混合し、混合物を直ちに４つの異なる群：ＰＢＳ、ＮＰ（ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕマウスにはＴｕｒｂｏ、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにはリポソーム）、エクソソーム、及びＥｘｏ－Ｔ（各群ｎ＝３）に静脈注入した。Ｔｉ：サファイアパルスレーザーシステム（繰り返し率８０ＭＨｚ、パルス幅＜１００ｆｓ、ＳｐｅｃｔｒａＰｈｙｓｉｃｓ）及びソフトウェアを搭載した正立レーザー走査型顕微鏡を用いて、注入後の異なる時間（１時間、４時間、８時間、及び２４時間）における腫瘍領域内の生理食塩水、ＮＰ及びＥＶの分布を追跡し、測定した。ｉｎｖｉｖｏ蛍光イメージングのために、２０×水浸対物レンズ（ＮＡ：１．００、ＷＤ：２ｍｍ、Ｏｌｙｍｐｕｓ）及び４０×水浸対物レンズ（ＮＡ：０．８０、ＷＤ：３．３ｍｍ、Ｏｌｙｍｐｕｓ）を個別に選択し、照射波長８９０ｎｍを用いてＵ８７－Ｌｕｃ（またはＧｌ２６１－Ｌｕｃ）及びＰＫＨ２６赤色蛍光を励起させ、放出光はそれぞれ５２５／５０及び５９５／５００フィルターで区別し収集した。イメージングのための平均レーザー出力は５０ｍＷ未満であった。

抗神経膠腫活性
腫瘍細胞移植後１０日目に、蛍光顕微鏡で腫瘍を確認した。マウスを無作為に５群に分け、それぞれ生理食塩水、Ｅｘｏ、Ｅｘｏ－Ｔ、ＥＥｘｏ－Ｔ、Ｔｕｒｂｏ（またはリポソーム）で処理した。配合物は３日ごとに１回、尾静脈を介して投与し、用量はマウス１匹当たり１０^１２エクソソームとした。Ｕ８７動物モデルにはＭＥＦ由来のエクソソームを、ＧＬ２６１動物モデルにはＢＭＤＣ由来のエクソソームを使用した。ルシフェラーゼの蛍光シグナルを捉え、３日、６日、９日、及び１２日目に別々に解析した。

組織学及び免疫組織化学（ＩＨＣ）解析
全てのスライドをキシレンで１０分間、３回脱パラフィン処理し、エタノールで段階的に再水和した。抗原賦活化及び免疫染色は、従来説明されてきた通りに実施し、ＶｅｃｔｏｒＭ．Ｏ．Ｍ．ＢａｓｉｃＫｉｔを使用した。要約すると、抗原賦活化は１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ＝６．０）を用いて行った。スライドを０．３％過酸化水素中で３０分間インキュベーションして、内因性西洋ワサビペルオキシダーゼ活性を不活化し、次いで、ＴＢＳＴ／５％正常ヤギ血清でブロッキングした。ＰＴＥＮまたはＫｉ－６７に対する一次抗体は、１：１０００で希釈して使用した。肝臓、肺、心臓、脾臓、及び腎臓を含む、他の正常器官に対する組織学的解析は、Ｈ＆Ｅ染色を用いて実施した。種々の群のＰＴＥＮ及びＫｉ６７強度を、画像処理ソフトウェアを用いて分析した。

統計解析
特に指示がない限り、データは３回分の平均値±ＳＥＭで示した。統計解析は、適宜、スチューデントｔ検定（両側）または事後検定を伴うｏｎｅ－ｗａｙＡＮＯＶＡを用いて実施した。０．０５未満のＰ値を統計的に有意と指定した。

実施例８．細胞ナノエレクトロポレーションによるｍＲＮＡカプセル化エクソソームの生成
本明細書に記載されるエクソソームは、その好ましい薬物動態及び免疫学的特性、ならびに合成薬物送達媒体には許されない、生理学的障壁を突破するその能力のために、魅力的な核酸キャリアである。これまで、細胞から分泌されるエクソソーム内に外因性の核酸、特に大型のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を挿入することは困難であり、収率が低くなることがあった。したがって、内因性に転写されたｍＲＮＡを豊富に含有するエクソソームを大量に産生する能力が主な課題となっている。治療用ｍＲＮＡ及びターゲティングペプチドを含有するエクソソームを大量に産生するための細胞ナノポレーション法が本明細書に記載される。種々の供給源細胞にプラスミドＤＮＡをトランスフェクションし、転写されたｍＲＮＡ及びターゲティングペプチドを輸送するエクソソームの放出を促進する、局所的かつ一過性の電気刺激で細胞を刺激した。細胞ナノポレーションでは、バルクエレクトロポレーション及び他のエクソソーム産生ストラテジーと比較して、エクソソームの基礎分泌レベルが低い細胞からでさえ、最大５０倍多いエクソソームが産生され、エクソソーム内のｍＲＮＡ転写物は１０^３倍超増加した。ＰＴＥＮ欠損同所性神経膠腫マウスモデルにおいては、ｍＲＮＡ含有エクソソームにより、腫瘍抑制機能が回復し、腫瘍成長阻害が亢進され、動物生存時間が増加した。細胞ナノポレーションにより、エクソソームを一般的な核酸キャリアとして、転写操作を必要とする用途に使用することが可能になり得る。

本明細書では、標的化転写操作及び治療のために、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を高存在量でエクソソーム内に効率的に組み込むための非遺伝子的ストラテジーについて記載した。本明細書に記載される研究は、種々の供給源細胞から内因性に転写されたｍＲＮＡを含有するエクソソームの大規模産生が、細胞ナノポレーション技術の使用を通じて実現できたことを示すものである。他の細胞エレクトロポレーション及びストレス誘導ストラテジーとは異なり、ナノチャネルを用いて一過性の膜孔を局所的に制御して生成することにより、成長因子またはサイトカインを単に投与することでは成し得ないであろう、供給源細胞内へのプラスミドＤＮＡの同時送達が可能になる。

ナノチャネルにより膜孔を誘導すると、細胞のエクソソーム放出を刺激するのに役立つことが多いので、１００～１０００ｎｍの範囲の異なるナノチャネルサイズを検討した。直径がおよそ１０～２０μｍの細胞については、このサイズの範囲内にあるナノチャネルであればプラスミドの送達に十分であることが見出された。チャネル径が１μｍより大きい場合、過度の細胞死を避けるために、はるかに低い電圧（＜５０Ｖ）が必要となるので、細胞トランスフェクションの機序が変わる。しかし、低電圧により、プラスミドの送達がさらに非効率になる可能性がある。今回の研究では、全体的なエレクトロポレーションの有効性を低下させる細胞傷害を誘導することなく、プラスミドＤＮＡを細胞内に十分に送達可能であることに依拠して、直径５００ｎｍのナノチャネルを選択した。

結果は、細胞の内在的プロセスによる機序によって、エクソソーム生成とそれに続く分泌が、外部ストレスに反応して促進され得ることも示唆している。ＣＮＰによる局所的な細胞膜損傷及び限局性の加熱によって、ＨＳＰが上方制御され、細胞内カルシウム［Ｃａ^２＋］が増加し、それによって細胞内小胞が大量に形成されたことが見出された。これらの小胞は、プラスミドＤＮＡの送達後に、治療用ＲＮＡを含有するように誘導され得る分泌エクソソームとして放出される。機序には、おそらく、ＨＳＰ応答の一部としてのＰ５３－ＴＳＡＰ６の活性化に加えて、［Ｃａ^２＋］の流入が関与している可能性があり、それによってエクソソーム産生とその後の分泌の向上が促進される。本明細書で提示した結果が示唆していることは、適切に制御されたＣＮＰアプローチは、細胞内への核酸送達に効果的であるだけでなく、より重要なことに、そのアプローチによって細胞の内在的適応プロセスが刺激されて、治療用エクソソームが産生されることである。また、Ｐ５３の発現増加にもかかわらず、ＣＮＰによる細胞死またはアポトーシス経路の活性化がほとんど認められなかったことも注目に値する。このことは、ＣＮＰトランスフェクション中にナノ孔部位で生じた、一過性かつ限局的な熱ショック応答によるものと説明され得る。

供給源細胞を利用して、転写されたｍＲＮＡを分泌エクソソーム内に内在的にカプセル化することに関する１つの懸念は、ｍＲＮＡの積載効率である。本明細書で提示した実験からは、正常な生理学的条件下でＭＥＦから単離されたエクソソームが、インタクトなｍＲＮＡコピーを最小限でしか含有しておらず、エクソソーム内ＲＮＡの＞９９％は５００ＫＤ未満のサイズであったことが示されている。平均すると、インタクトなｍＲＮＡは、外部からの刺激なしで内因性に産生される１０^３エクソソームごとに１つ認められ得ると推定された。ＣＮＰで処理した場合、同一の供給源細胞は、１つのエクソソーム当たり２～１０のインタクトなｍＲＮＡを産生したが、これは２，０００～１０，０００倍の積載効率の向上に相当する。また、培養液からエクソソームを精製するために、段階的超遠心分離法及びＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）密度勾配精製法の両方を試した。Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（商標）密度勾配精製法では、エクソソーム分画（分画５～７）において、より高い濃度のＲＮＡ収集物が認められたものの、ｍＲＮＡ回収率が段階的超遠心分離法の約１０～２０％のみであった。さらに、分離プロセスに関与する化学物質が残留することもある。したがって、類似したｍＲＮＡ率を考慮して、本明細書に記載される治療モデルでは、段階的超遠心分離法を選択した。

比較すると、本研究で実証されたように、ＣＮＰ法は、後挿入のエレクトロポレーションと比べて、一般に、供給源細胞または標的化ｍＲＮＡ／タンパク質配列を改変する必要が一切なく、収集したＥＶの分泌後処理が最小限で済む。

前述の開示は、明確性及び理解という目的で若干詳しく記載されているが、この開示を読むことによって、形態及び細部における様々な変更が、本開示の真の範囲から逸脱することなくなされ得ることが当業者には明らかとなるであろう。例えば、上記の全ての技術及び装置は、様々な組み合わせで使用され得る。本出願で引用される全ての公開物、特許、特許出願、及び／または他の文献は、あたかも個々の公開物、特許、特許出願、及び／または他の文献のそれぞれが、あらゆる目的のために参照により組み込まれるように、個々に、かつ別々に示されているかのごとく、あらゆる目的のために同等の程度まで、それらの全体が参照により組み込まれる。

Claims

細胞外小胞を産生する方法であって、
ａ．少なくとも１つのポリヌクレオチドを細胞外小胞ドナー細胞にナノエレクトロポレーションすることであって、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドは、（ｉ）膜貫通ドメイン及び細胞外ドメインを含むアダプターポリペプチド、ならびに（ｉｉ）前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインに共有結合にて連結される異種ターゲティングドメインを含む、ターゲティングポリペプチドをコードする、前記ナノエレクトロポレーションすることと、
ｂ．（ｉ）前記ターゲティングポリペプチドが、前記細胞外小胞ドナー細胞内で発現され、かつ（ｉｉ）前記ターゲティングポリペプチドが、前記細胞外小胞ドナー細胞から放出される細胞外小胞内に組み込まれるような条件下で、前記細胞外小胞ドナー細胞をインキュベーションすることと、
ｃ．前記細胞外小胞ドナー細胞から放出される前記少なくとも１つの細胞外小胞を収集することであって、前記少なくとも１つの細胞外小胞は前記ターゲティングポリペプチドを含む、前記細胞外小胞を収集することと、
を含む、前記方法。
前記異種ターゲティングドメインは、前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインのＮ末端に共有結合にて連結される、請求項１に記載の方法。
前記異種ターゲティングドメインは、前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインのＣ末端に共有結合にて連結される、請求項１に記載の方法。
前記アダプターポリペプチドの前記膜貫通ドメインは、ＣＤ４７ポリペプチドの膜貫通ドメインと少なくとも７０％同一であるか、または前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインは、ＣＤ４７ポリペプチドの細胞外ドメインと少なくとも７０％同一である、請求項１に記載の方法。
前記アダプターポリペプチドは、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ４７、ＣＤ３１５、ヘテロ三量体Ｇタンパク質、ＭＨＣクラスＩ、インテグリン、トランスフェリン受容体（ＴＦＲ２）、ＬＡＭＰ１／２、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＡＤＡＭ１０、ＧＰＩアンカー型５’ヌクレオチダーゼ、ＣＤ７３、補体－結合タンパク質ＣＤ５５及びＣＤ５９、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ＴＳＰＡＮ８、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ９、ＰＥＣＡＭ１、ＥＲＢＢ２、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ９０、ＣＤ４５、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、グリコフォリンＡ、ＣＤ１４、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３、アセチルコリンエステラーゼ／ＡＣｈＥ－Ｓ、ＡＣｈＥ－Ｅ、アミロイドベータＡ４／ＡＰＰ、ＰＴＧＦＲＮ、ならびに多剤耐性関連タンパク質からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
前記アダプターポリペプチドは、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ４７、ＣＤ３１５、ヘテロ三量体Ｇタンパク質、ＭＨＣクラスＩ、インテグリン、トランスフェリン受容体（ＴＦＲ２）、ＬＡＭＰ１／２、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＡＤＡＭ１０、ＧＰＩアンカー型５’ヌクレオチダーゼ、ＣＤ７３、補体－結合タンパク質ＣＤ５５及びＣＤ５９、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ＴＳＰＡＮ８、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ９、ＰＥＣＡＭ１、ＥＲＢＢ２、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ９０、ＣＤ４５、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、グリコフォリンＡ、ＣＤ１４、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３、アセチルコリンエステラーゼ／ＡＣｈＥ－Ｓ、ＡＣｈＥ－Ｅ、アミロイドベータＡ４／ＡＰＰ、ＰＴＧＦＲＮ、ならびに多剤耐性関連タンパク質からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも７０％同一である、請求項１に記載の方法。
前記アダプターポリペプチドは、ＣＤ４７と少なくとも７０％同一である、請求項１に記載の方法。
前記異種ターゲティングドメインは、腫瘍ターゲティングドメインを含む、請求項１に記載の方法。
前記腫瘍ターゲティングドメインはＣＤＸペプチドである、請求項８に記載の方法。
前記腫瘍ターゲティングドメインはＣＲＥＫＡペプチドである、請求項８に記載の方法。
前記方法は、ポリヌクレオチドを前記細胞外小胞ドナー細胞内にナノエレクトロポレーションすることであって、前記ポリヌクレオチドはリボ核酸（ＲＮＡ）治療薬をコードする、前記ナノエレクトロポレーションすること、をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
前記リボ核酸（ＲＮＡ）治療薬は、前記細胞外小胞ドナー細胞から放出される細胞外小胞内に組み込まれ、前記方法は、前記細胞外小胞ドナー細胞から放出された前記細胞外小胞を収集することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
前記リボ核酸（ＲＮＡ）治療薬は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）治療薬である、請求項１１または１２に記載の方法。
前記リボ核酸（ＲＮＡ）治療薬は、非翻訳ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはそれらの組み合わせである、請求項１１または１２に記載の方法。
前記ＲＮＡ治療薬は、がん治療薬である、請求項１１または１２に記載の方法。
前記細胞外小胞は、完全にインタクトまたは実質的にインタクトな形態にある前記ＲＮＡ治療薬を含む、請求項１１または１２に記載の方法。
前記ＲＮＡ治療薬は、完全にインタクトまたは実質的にインタクトなメッセンジャーＲＮＡである、請求項１６に記載の方法。
前記ＲＮＡ治療薬は、少なくとも５つの完全にインタクトなメッセンジャーＲＮＡのコピーを構成する、請求項１７に記載の方法。
前記ナノエレクトロポレーション後、平均すると、前記細胞外小胞ドナー細胞によって放出された各細胞外小胞は、少なくとも１つの前記ＲＮＡ治療薬のコピーを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
前記ナノエレクトロポレーション後、平均すると、前記細胞外小胞ドナー細胞によって放出された各細胞外小胞は、少なくとも１つの完全にインタクトまたは実質的にインタクトな前記ＲＮＡ治療薬のコピーを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
前記ナノエレクトロポレーション以前において、前記細胞外小胞ドナー細胞は、初代細胞または遺伝子改変されていない細胞である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞外小胞ドナー細胞は、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）、ヒト胚線維芽細胞（ＨＥＦ）、樹状細胞、間葉系幹細胞、骨髄由来樹状細胞、骨髄由来間質細胞、脂肪間質細胞、内皮細胞、及び免疫細胞からなる群から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞外小胞ドナー細胞は、好中球ではない、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞外小胞は、エクソソーム、マイクロベシクル、またはアポトーシス小体である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞外小胞はエクソソームである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
前記ポリヌクレオチドは、バイオチップ上に位置するナノチャネルを介して、前記細胞外小胞ドナー細胞内にナノエレクトロポレーションされる、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
前記ナノチャネルは、１ナノメートル～１０００ナノメートルの直径で構成される、請求項２６に記載の方法。
前記バイオチップは、１マイクロメートル～１００マイクロメートルのナノチャネル間の間隔を構成するナノチャネルアレイを含む、請求項２６に記載の方法。
前記ナノエレクトロポレーションは電界を構成する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
前記電界は、１ボルト／ｍｍ～１０００ボルト／ｍｍの電界強度を有する、請求項２９に記載の方法。
前記電界は、０．１ミリ秒／パルス～１００ミリ秒／パルスのパルス持続時間を有する複数のパルスを構成する、請求項２９に記載の方法。
前記腫瘍ターゲティングドメインは、腫瘍ターゲティングポリペプチドのＮ末端上にある、請求項８に記載の方法。
前記腫瘍ターゲティングドメインは、前記腫瘍ターゲティングポリペプチドのＣ末端上にある、請求項８に記載の方法。
細胞外小胞を産生する方法であって、
ａ．初代細胞に少なくとも１つの異種デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ポリヌクレオチドをナノエレクトロポレーションし、それによって、前記異種ＤＮＡポリヌクレオチドを含む初代細胞を得ることであって、前記異種ＤＮＡポリヌクレオチドは、治療用リボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドをコードする、前記初代細胞を得ることと、
ｂ．前記異種ＤＮＡポリヌクレオチドを含む前記初代細胞を、前記異種ＤＮＡポリヌクレオチドの転写を可能にする条件下でインキュベーションし、それによって、前記治療用リボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを産生することであって、前記治療用リボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドは、前記初代細胞から放出される細胞外小胞内に組み込まれる、前記治療用リボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを産生することと、
ｃ．前記初代細胞から放出された前記細胞外小胞を収集することであって、前記初代細胞から放出された前記細胞外小胞は、平均すると、少なくとも１つの前記治療用リボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドのコピーを含む、前記細胞外小胞を収集することと、を含む、前記方法。
前記ナノエレクトロポレーション以前において、前記初代細胞は、遺伝子改変されていない初代細胞である、請求項３４に記載の方法。
前記初代細胞は、間葉系幹細胞、骨髄由来樹状細胞、骨髄由来間質細胞、脂肪間質細胞、内皮細胞、及び免疫細胞からなる群から選択される、先行請求項３４～３５のいずれか１項に記載の方法。
前記初代細胞は、好中球ではない、先行請求項３４～３６のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞外小胞は、エクソソーム、マイクロベシクル、またはアポトーシス小体である、先行請求項１～３７のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞外小胞はエクソソームである、請求項３８に記載の方法。
細胞外小胞を含む組成物であって、前記細胞外小胞は、
ａ．アダプターポリペプチドであって、前記アダプターポリペプチドは細胞外ドメインを含み、前記アダプターポリペプチドは、以下のポリペプチド：ＣＤ４７細胞外ドメイン、ＣＤ４７膜貫通ドメイン、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ４７、ＣＤ３１５、ヘテロ三量体Ｇタンパク質、ＭＨＣクラスＩ、インテグリン、トランスフェリン受容体（ＴＦＲ２）、ＬＡＭＰ１／２、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＡＤＡＭ１０、ＧＰＩアンカー型５’ヌクレオチダーゼ、ＣＤ７３、補体－結合タンパク質ＣＤ５５及びＣＤ５９、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ＴＳＰＡＮ８、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ９、ＰＥＣＡＭ１、ＥＲＢＢ２、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ９０、ＣＤ４５、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、グリコフォリンＡ、ＣＤ１４、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３、アセチルコリンエステラーゼ／ＡＣｈＥ－Ｓ、ＡＣｈＥ－Ｅ、アミロイドベータＡ４／ＡＰＰ、ＰＴＧＦＲＮ、ならびに多剤耐性関連タンパク質、のうちの１つと少なくとも７０％同一であるポリペプチド配列を含む、前記アダプターポリペプチドと、
ｂ．前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインに共有結合にて付着される異種ターゲティングポリペプチドであって、前記ターゲティングポリペプチドは、標的細胞に特異的に結合する、前記異種ターゲティングポリペプチドと、
を含む、前記組成物。
前記アダプターポリペプチドは、ＣＤ４７ポリペプチドの膜貫通ドメインと少なくとも７０％同一である膜貫通ドメイン、またはＣＤ４７ポリペプチドの細胞外ドメインと少なくとも７０％同一である細胞外ドメインを含む、請求項４０に記載の組成物。
前記異種ターゲティングポリペプチドは、前記アダプターポリペプチドの細胞外ドメインのＮ末端に共有結合にて連結される、請求項４０に記載の組成物。
前記異種ターゲティングポリペプチドは、前記アダプターポリペプチドの細胞外ドメインのＣ末端に共有結合にて連結される、請求項４０に記載の組成物。
前記アダプターポリペプチドはＣＤ４７を含む、請求項４０に記載の組成物。
前記異種ターゲティングポリペプチドは、疾患細胞に関連する細胞表面マーカーに結合するターゲティングドメインを含む、請求項４０に記載の組成物。
前記ターゲティングドメインは、腫瘍ターゲティングドメインである、請求項４５に記載の組成物。
前記腫瘍ターゲティングドメインはＣＤＸペプチドである、請求項４６に記載の組成物。
前記腫瘍ターゲティングドメインはＣＲＥＫＡペプチドである、請求項４６に記載の組成物。
前記細胞外小胞は、少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）治療薬のコピーを含む、請求項４０に記載の組成物。
前記リボ核酸（ＲＮＡ）治療薬は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）治療薬である、請求項４９に記載の組成物。
前記リボ核酸（ＲＮＡ）治療薬は、非翻訳ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはそれらの組み合わせである、請求項４９に記載の組成物。
前記ＲＮＡ治療薬は、がん治療薬である、請求項４９に記載の組成物。
前記ＲＮＡ治療薬は、完全にインタクトまたは実質的にインタクトな形態である、請求項４９に記載の組成物。
前記ＲＮＡ治療薬は、完全にインタクトまたは実質的にインタクトなメッセンジャーＲＮＡである、請求項５３に記載の組成物。
前記ＲＮＡ治療薬は、少なくとも５つの完全にインタクトまたは実質的にインタクトなメッセンジャーＲＮＡのコピーを構成する、請求項５４に記載の組成物。
前記細胞外小胞は、エクソソーム、マイクロベシクル、またはアポトーシス小体である、請求項４０～５５のいずれか１項に記載の組成物。
前記細胞外小胞はエクソソームである、請求項５６に記載の組成物。
前記腫瘍ターゲティングドメインは、腫瘍ターゲティングポリペプチドのＮ末端上にある、請求項４６に記載の組成物。
前記腫瘍ターゲティングドメインは、前記腫瘍ターゲティングポリペプチドのＣ末端上にある、請求項４６に記載の組成物。
対象の腫瘍を治療する方法であって、前記方法は、治療薬を含む少なくとも１つの細胞外小胞を対象に全身投与することであって、前記治療薬を含む前記少なくとも１つの細胞外小胞は、以下：
ａ．少なくとも１つのポリヌクレオチドを細胞外小胞ドナー細胞にナノエレクトロポレーションすることであって、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドは、（ｉ）膜貫通ドメイン及び細胞外ドメインを含むアダプターポリペプチド、ならびに（ｉｉ）前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインに共有結合にて連結される異種ターゲティングドメインを含む、ターゲティングポリペプチドをコードし、かつ、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドは、リボ核酸（ＲＮＡ）治療薬をコードする、前記ナノエレクトロポレーションすることと；
ｂ．（ｉ）前記ターゲティングポリペプチドが、前記細胞外小胞ドナー細胞内で発現され、かつ（ｉｉ）前記ターゲティングポリペプチドが、前記細胞外小胞ドナー細胞から放出される細胞外小胞内に組み込まれるような条件下で、前記細胞外小胞ドナー細胞をインキュベーションすることと、
ｃ．前記細胞外小胞ドナー細胞から放出される前記少なくとも１つの細胞外小胞を収集することであって、前記少なくとも１つの細胞外小胞は前記ターゲティングポリペプチドを含む、前記細胞外小胞を収集することと、
により得られる、前記全身投与すること、を含み、前記腫瘍における前記少なくとも１つの細胞外小胞の集積率が、前記異種ターゲティングドメインを欠く細胞外小胞の集積率と比較して高い、前記方法。
前記異種ターゲティングドメインは、前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインのＮ末端に共有結合にて連結される、請求項６０に記載の方法。
前記異種ターゲティングドメインは、前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインのＣ末端に共有結合にて連結される、請求項６０に記載の方法。
前記アダプターポリペプチドの前記膜貫通ドメインは、ＣＤ４７ポリペプチドの膜貫通ドメインと少なくとも７０％同一であるか、または前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインは、ＣＤ４７ポリペプチドの細胞外ドメインと少なくとも７０％同一である、請求項６０に記載の方法。
前記アダプターポリペプチドは、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ４７、ＣＤ３１５、ヘテロ三量体Ｇタンパク質、ＭＨＣクラスＩ、インテグリン、トランスフェリン受容体（ＴＦＲ２）、ＬＡＭＰ１／２、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＡＤＡＭ１０、ＧＰＩアンカー型５’ヌクレオチダーゼ、ＣＤ７３、補体－結合タンパク質ＣＤ５５及びＣＤ５９、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ＴＳＰＡＮ８、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ９、ＰＥＣＡＭ１、ＥＲＢＢ２、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ９０、ＣＤ４５、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、グリコフォリンＡ、ＣＤ１４、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３、アセチルコリンエステラーゼ／ＡＣｈＥ－Ｓ、ＡＣｈＥ－Ｅ、アミロイドベータＡ４／ＡＰＰ、ＰＴＧＦＲＮ、ならびに多剤耐性関連タンパク質からなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
前記アダプターポリペプチドは、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ４７、ＣＤ３１５、ヘテロ三量体Ｇタンパク質、ＭＨＣクラスＩ、インテグリン、トランスフェリン受容体（ＴＦＲ２）、ＬＡＭＰ１／２、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＡＤＡＭ１０、ＧＰＩアンカー型５’ヌクレオチダーゼ、ＣＤ７３、補体－結合タンパク質ＣＤ５５及びＣＤ５９、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ＴＳＰＡＮ８、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ９、ＰＥＣＡＭ１、ＥＲＢＢ２、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ９０、ＣＤ４５、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、グリコフォリンＡ、ＣＤ１４、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３、アセチルコリンエステラーゼ／ＡＣｈＥ－Ｓ、ＡＣｈＥ－Ｅ、アミロイドベータＡ４／ＡＰＰ、ＰＴＧＦＲＮ、ならびに多剤耐性関連タンパク質からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも７０％同一である、請求項６０に記載の方法。
前記アダプターポリペプチドは、ＣＤ４７と少なくとも７０％同一である、請求項６０に記載の方法。
前記異種ターゲティングドメインは、腫瘍ターゲティングドメインを含む、請求項６０に記載の方法。
前記腫瘍ターゲティングドメインはＣＤＸペプチドである、請求項６７に記載の方法。
前記腫瘍ターゲティングドメインはＣＲＥＫＡペプチドである、請求項６７に記載の方法。
前記リボ核酸（ＲＮＡ）治療薬は、前記細胞外小胞ドナー細胞から放出される細胞外小胞内に組み込まれ、前記方法は、前記細胞外小胞ドナー細胞から放出された前記細胞外小胞を収集することをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
前記リボ核酸（ＲＮＡ）治療薬は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）治療薬である、請求項６０に記載の方法。
前記リボ核酸（ＲＮＡ）治療薬は、非翻訳ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはそれらの組み合わせである、請求項６０に記載の方法。
前記ＲＮＡ治療薬は、がん治療薬である、請求項６０に記載の方法。
前記細胞外小胞は、完全にインタクトまたは実質的にインタクトな形態にある前記ＲＮＡ治療薬を含む、請求項６０に記載の方法。
前記ＲＮＡ治療薬は、完全にインタクトまたは実質的にインタクトなメッセンジャーＲＮＡである、請求項７４に記載の方法。
前記ＲＮＡ治療薬は、少なくとも５つの完全にインタクトなメッセンジャーＲＮＡのコピーを構成する、請求項７５に記載の方法。
前記ナノエレクトロポレーション後、平均すると、前記細胞外小胞ドナー細胞によって放出された各細胞外小胞は、少なくとも１つの前記ＲＮＡ治療薬のコピーを含む、請求項６０～７６のいずれか１項に記載の方法。
前記ナノエレクトロポレーション後、平均すると、前記細胞外小胞ドナー細胞によって放出された各細胞外小胞は、少なくとも１つの完全にインタクトまたは実質的にインタクトな前記ＲＮＡ治療薬のコピーを含む、請求項６０～７７のいずれか１項に記載の方法。
前記ナノエレクトロポレーション以前において、前記細胞外小胞ドナー細胞は、初代細胞または遺伝子改変されていない細胞である、請求項６０～７８のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞外小胞ドナー細胞は、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）、ヒト胚線維芽細胞（ＨＥＦ）、樹状細胞、間葉系幹細胞、骨髄由来樹状細胞、骨髄由来間質細胞、脂肪間質細胞、内皮細胞、及び免疫細胞からなる群から選択される、請求項６０～７９のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞外小胞ドナー細胞は、好中球ではない、先行請求項６０～８０のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞外小胞は、エクソソーム、マイクロベシクル、またはアポトーシス小体である、請求項６０～８１のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞外小胞はエクソソームである、請求項８２に記載の方法。
前記ポリヌクレオチドは、バイオチップ上に位置するナノチャネルを介して、前記細胞外小胞ドナー細胞内にナノエレクトロポレーションされる、請求項６０～８２のいずれか１項に記載の方法。
前記ナノチャネルは、１ナノメートル～１０００ナノメートルの直径で構成される、請求項８４に記載の方法。
前記バイオチップは、１マイクロメートル～１００マイクロメートルのナノチャネル間の間隔を構成するナノチャネルアレイを含む、請求項８４に記載の方法。
前記ナノエレクトロポレーションは電界を構成する、請求項６０～８６のいずれか１項に記載の方法。
前記電界は、１ボルト／ｍｍ～１０００ボルト／ｍｍの電界強度を有する、請求項８７に記載の方法。
前記電界は、０．１ミリ秒／パルス～１００ミリ秒／パルスのパルス持続時間を有する複数のパルスを構成する、請求項８７に記載の方法。
前記腫瘍ターゲティングドメインは、腫瘍ターゲティングポリペプチドのＮ末端上にある、請求項６７に記載の方法。
前記腫瘍ターゲティングドメインは、前記腫瘍ターゲティングポリペプチドのＣ末端上にある、請求項６７に記載の方法。
前記腫瘍は、がんである、請求項６０～９１のいずれか１項に記載の方法。
前記がんは神経膠腫である、請求項９２に記載の方法。
対象の筋ジストロフィーを治療する方法であって、前記方法は、治療薬を含む少なくとも１つの細胞外小胞を対象に全身投与することであって、前記治療薬を含む前記少なくとも１つの細胞外小胞は、以下：
ａ．少なくとも１つのポリヌクレオチドを細胞外小胞ドナー細胞にナノエレクトロポレーションすることであって、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドは、（ｉ）膜貫通ドメイン及び細胞外ドメインを含むアダプターポリペプチド、ならびに（ｉｉ）前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインに共有結合にて連結される異種ターゲティングドメインを含む、ターゲティングポリペプチドをコードし、かつ、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドは、リボ核酸（ＲＮＡ）治療薬をコードする、前記ナノエレクトロポレーションすることと；
ｂ．（ｉ）前記ターゲティングポリペプチドが、前記細胞外小胞ドナー細胞内で発現され、かつ（ｉｉ）前記ターゲティングポリペプチドが、前記細胞外小胞ドナー細胞から放出される細胞外小胞内に組み込まれるような条件下で、前記細胞外小胞ドナー細胞をインキュベーションすることと、
ｃ．前記細胞外小胞ドナー細胞から放出される前記少なくとも１つの細胞外小胞を収集することであって、前記少なくとも１つの細胞外小胞は前記ターゲティングポリペプチドを含む、前記細胞外小胞を収集することと、
により得られる、前記全身投与すること、を含み、腫瘍における前記少なくとも１つの細胞外小胞の集積率が、前記異種ターゲティングドメインを欠く細胞外小胞の集積率と比較して高い、前記方法。
前記異種ターゲティングドメインは、前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインのＮ末端に共有結合にて連結される、請求項９４に記載の方法。
前記異種ターゲティングドメインは、前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインのＣ末端に共有結合にて連結される、請求項９４に記載の方法。
前記アダプターポリペプチドの前記膜貫通ドメインは、ＣＤ４７ポリペプチドの膜貫通ドメインと少なくとも７０％同一であるか、または前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインは、ＣＤ４７ポリペプチドの細胞外ドメインと少なくとも７０％同一である、請求項９４に記載の方法。
前記アダプターポリペプチドは、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ４７、ＣＤ３１５、ヘテロ三量体Ｇタンパク質、ＭＨＣクラスＩ、インテグリン、トランスフェリン受容体（ＴＦＲ２）、ＬＡＭＰ１／２、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＡＤＡＭ１０、ＧＰＩアンカー型５’ヌクレオチダーゼ、ＣＤ７３、補体－結合タンパク質ＣＤ５５及びＣＤ５９、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ＴＳＰＡＮ８、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ９、ＰＥＣＡＭ１、ＥＲＢＢ２、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ９０、ＣＤ４５、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、グリコフォリンＡ、ＣＤ１４、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３、アセチルコリンエステラーゼ／ＡＣｈＥ－Ｓ、ＡＣｈＥ－Ｅ、アミロイドベータＡ４／ＡＰＰ、ＰＴＧＦＲＮ、ならびに多剤耐性関連タンパク質からなる群から選択される、請求項９４に記載の方法。
前記アダプターポリペプチドは、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ４７、ＣＤ３１５、ヘテロ三量体Ｇタンパク質、ＭＨＣクラスＩ、インテグリン、トランスフェリン受容体（ＴＦＲ２）、ＬＡＭＰ１／２、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＡＤＡＭ１０、ＧＰＩアンカー型５’ヌクレオチダーゼ、ＣＤ７３、補体－結合タンパク質ＣＤ５５及びＣＤ５９、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ＴＳＰＡＮ８、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ９、ＰＥＣＡＭ１、ＥＲＢＢ２、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ９０、ＣＤ４５、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、グリコフォリンＡ、ＣＤ１４、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３、アセチルコリンエステラーゼ／ＡＣｈＥ－Ｓ、ＡＣｈＥ－Ｅ、アミロイドベータＡ４／ＡＰＰ、ＰＴＧＦＲＮ、ならびに多剤耐性関連タンパク質からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも７０％同一である、請求項９４に記載の方法。
前記アダプターポリペプチドは、ＣＤ４７と少なくとも７０％同一である、請求項９４に記載の方法。
前記異種ターゲティングドメインは、腫瘍ターゲティングドメインを含む、請求項９４に記載の方法。
前記腫瘍ターゲティングドメインはＣＤＸペプチドである、請求項１０１に記載の方法。
前記腫瘍ターゲティングドメインはＣＲＥＫＡペプチドである、請求項１０１に記載の方法。
前記リボ核酸（ＲＮＡ）治療薬は、前記細胞外小胞ドナー細胞から放出される細胞外小胞内に組み込まれ、前記方法は、前記細胞外小胞ドナー細胞から放出された前記細胞外小胞を収集することをさらに含む、請求項９４に記載の方法。
前記リボ核酸（ＲＮＡ）治療薬は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）治療薬である、請求項９４に記載の方法。
前記リボ核酸（ＲＮＡ）治療薬は、非翻訳ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはそれらの組み合わせである、請求項９４に記載の方法。
前記細胞外小胞は、完全にインタクトまたは実質的にインタクトな形態にある前記ＲＮＡ治療薬を含む、請求項９４に記載の方法。
前記ＲＮＡ治療薬は、完全にインタクトまたは実質的にインタクトなメッセンジャーＲＮＡである、請求項１０７に記載の方法。
前記ＲＮＡ治療薬は、少なくとも５つの完全にインタクトなメッセンジャーＲＮＡのコピーを構成する、請求項１０８に記載の方法。
前記ナノエレクトロポレーション後、平均すると、前記細胞外小胞ドナー細胞によって放出された各細胞外小胞は、少なくとも１つの前記ＲＮＡ治療薬のコピーを含む、請求項９４～１０９のいずれか１項に記載の方法。
前記ナノエレクトロポレーション後、平均すると、前記細胞外小胞ドナー細胞によって放出された各細胞外小胞は、少なくとも１つの完全にインタクトまたは実質的にインタクトな前記ＲＮＡ治療薬のコピーを含む、請求項９４～１１０のいずれか１項に記載の方法。
前記ナノエレクトロポレーション以前において、前記細胞外小胞ドナー細胞は、初代細胞または遺伝子改変されていない細胞である、請求項９４～１１１のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞外小胞ドナー細胞は、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）、ヒト胚線維芽細胞（ＨＥＦ）、樹状細胞、間葉系幹細胞、骨髄由来樹状細胞、骨髄由来間質細胞、脂肪間質細胞、内皮細胞、及び免疫細胞からなる群から選択される、請求項９４～１１２のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞外小胞ドナー細胞は、好中球ではない、先行請求項９４～１１３のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞外小胞は、エクソソーム、マイクロベシクル、またはアポトーシス小体である、請求項９４～１１４のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞外小胞はエクソソームである、請求項１１５に記載の方法。
前記ポリヌクレオチドは、バイオチップ上に位置するナノチャネルを介して、前記細胞外小胞ドナー細胞内にナノエレクトロポレーションされる、請求項９４～１１６のいずれか１項に記載の方法。
前記ナノチャネルは、１ナノメートル～１０００ナノメートルの直径で構成される、請求項１１７に記載の方法。
前記バイオチップは、１マイクロメートル～１００マイクロメートルのナノチャネル間の間隔を構成するナノチャネルアレイを含む、請求項１１７に記載の方法。
前記ナノエレクトロポレーションは電界を構成する、請求項９４～１１９のいずれか１項に記載の方法。
前記電界は、１ボルト／ｍｍ～１０００ボルト／ｍｍの電界強度を有する、請求項１２０に記載の方法。
前記電界は、０．１ミリ秒／パルス～１００ミリ秒／パルスのパルス持続時間を有する複数のパルスを構成する、請求項１２０に記載の方法。
前記腫瘍ターゲティングドメインは、腫瘍ターゲティングポリペプチドのＮ末端上にある、請求項１０１に記載の方法。
前記腫瘍ターゲティングドメインは、前記腫瘍ターゲティングポリペプチドのＣ末端上にある、請求項１０１に記載の方法。
前記筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、及び筋強直性ジストロフィーからなる群から選択される、請求項９４～１２４のいずれか１項に記載の方法。
前記筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項１２５に記載の方法。
対象の網膜疾患を治療する方法であって、前記方法は、治療薬を含む少なくとも１つの細胞外小胞を対象に全身投与することであって、前記治療薬を含む前記少なくとも１つの細胞外小胞は、以下：
ａ．少なくとも１つのポリヌクレオチドを細胞外小胞ドナー細胞にナノエレクトロポレーションすることであって、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドは、（ｉ）膜貫通ドメイン及び細胞外ドメインを含むアダプターポリペプチド、ならびに（ｉｉ）前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインに共有結合にて連結される異種ターゲティングドメインを含む、ターゲティングポリペプチドをコードし、かつ、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドは、リボ核酸（ＲＮＡ）治療薬をコードする、前記ナノエレクトロポレーションすることと；
ｂ．（ｉ）前記ターゲティングポリペプチドが、前記細胞外小胞ドナー細胞内で発現され、かつ（ｉｉ）前記ターゲティングポリペプチドが、前記細胞外小胞ドナー細胞から放出される細胞外小胞内に組み込まれるような条件下で、前記細胞外小胞ドナー細胞をインキュベーションすることと、
ｃ．前記細胞外小胞ドナー細胞から放出される前記少なくとも１つの細胞外小胞を収集することであって、前記少なくとも１つの細胞外小胞は前記ターゲティングポリペプチドを含む、前記細胞外小胞を収集することと、
により得られる、前記全身投与すること、を含み、腫瘍における前記少なくとも１つの細胞外小胞の集積率が、前記異種ターゲティングドメインを欠く細胞外小胞の集積率と比較して高い、前記方法。
前記異種ターゲティングドメインは、前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインのＮ末端に共有結合にて連結される、請求項１２７に記載の方法。
前記異種ターゲティングドメインは、前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインのＣ末端に共有結合にて連結される、請求項１２７に記載の方法。
前記アダプターポリペプチドの前記膜貫通ドメインは、ＣＤ４７ポリペプチドの膜貫通ドメインと少なくとも７０％同一であるか、または前記アダプターポリペプチドの前記細胞外ドメインは、ＣＤ４７ポリペプチドの細胞外ドメインと少なくとも７０％同一である、請求項１２７に記載の方法。
前記アダプターポリペプチドは、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ４７、ＣＤ３１５、ヘテロ三量体Ｇタンパク質、ＭＨＣクラスＩ、インテグリン、トランスフェリン受容体（ＴＦＲ２）、ＬＡＭＰ１／２、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＡＤＡＭ１０、ＧＰＩアンカー型５’ヌクレオチダーゼ、ＣＤ７３、補体－結合タンパク質ＣＤ５５及びＣＤ５９、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ＴＳＰＡＮ８、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ９、ＰＥＣＡＭ１、ＥＲＢＢ２、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ９０、ＣＤ４５、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、グリコフォリンＡ、ＣＤ１４、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３、アセチルコリンエステラーゼ／ＡＣｈＥ－Ｓ、ＡＣｈＥ－Ｅ、アミロイドベータＡ４／ＡＰＰ、ＰＴＧＦＲＮ、ならびに多剤耐性関連タンパク質からなる群から選択される、請求項１２７に記載の方法。
前記アダプターポリペプチドは、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ４７、ＣＤ３１５、ヘテロ三量体Ｇタンパク質、ＭＨＣクラスＩ、インテグリン、トランスフェリン受容体（ＴＦＲ２）、ＬＡＭＰ１／２、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＡＤＡＭ１０、ＧＰＩアンカー型５’ヌクレオチダーゼ、ＣＤ７３、補体－結合タンパク質ＣＤ５５及びＣＤ５９、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ＴＳＰＡＮ８、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ９、ＰＥＣＡＭ１、ＥＲＢＢ２、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ９０、ＣＤ４５、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、グリコフォリンＡ、ＣＤ１４、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３、アセチルコリンエステラーゼ／ＡＣｈＥ－Ｓ、ＡＣｈＥ－Ｅ、アミロイドベータＡ４／ＡＰＰ、ＰＴＧＦＲＮ、ならびに多剤耐性関連タンパク質からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも７０％同一である、請求項１２７に記載の方法。
前記アダプターポリペプチドは、ＣＤ４７と少なくとも７０％同一である、請求項１２７に記載の方法。
前記異種ターゲティングドメインは、腫瘍ターゲティングドメインを含む、請求項１２７に記載の方法。
前記腫瘍ターゲティングドメインはＣＤＸペプチドである、請求項１３４に記載の方法。
前記腫瘍ターゲティングドメインはＣＲＥＫＡペプチドである、請求項１３４に記載の方法。
前記リボ核酸（ＲＮＡ）治療薬は、前記細胞外小胞ドナー細胞から放出される細胞外小胞内に組み込まれ、前記方法は、前記細胞外小胞ドナー細胞から放出された前記細胞外小胞を収集することをさらに含む、請求項１２７に記載の方法。
前記リボ核酸（ＲＮＡ）治療薬は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）治療薬である、請求項１２７に記載の方法。
前記リボ核酸（ＲＮＡ）治療薬は、非翻訳ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはそれらの組み合わせである、請求項１２７に記載の方法。
前記細胞外小胞は、完全にインタクトまたは実質的にインタクトな形態にある前記ＲＮＡ治療薬を含む、請求項１２７に記載の方法。
前記ＲＮＡ治療薬は、完全にインタクトまたは実質的にインタクトなメッセンジャーＲＮＡである、請求項１４０に記載の方法。
前記ＲＮＡ治療薬は、少なくとも５つの完全にインタクトなメッセンジャーＲＮＡのコピーを構成する、請求項１４１に記載の方法。
前記ナノエレクトロポレーション後、平均すると、前記細胞外小胞ドナー細胞によって放出された各細胞外小胞は、少なくとも１つの前記ＲＮＡ治療薬のコピーを含む、請求項１２７～１４２のいずれか１項に記載の方法。
前記ナノエレクトロポレーション後、平均すると、前記細胞外小胞ドナー細胞によって放出された各細胞外小胞は、少なくとも１つの完全にインタクトまたは実質的にインタクトな前記ＲＮＡ治療薬のコピーを含む、請求項１２７～１４３のいずれか１項に記載の方法。
前記ナノエレクトロポレーション以前において、前記細胞外小胞ドナー細胞は、初代細胞または遺伝子改変されていない細胞である、請求項１２７～１４４のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞外小胞ドナー細胞は、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）、ヒト胚線維芽細胞（ＨＥＦ）、樹状細胞、間葉系幹細胞、骨髄由来樹状細胞、骨髄由来間質細胞、脂肪間質細胞、内皮細胞、及び免疫細胞からなる群から選択される、請求項１２７～１４５のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞外小胞ドナー細胞は、好中球ではない、先行請求項１２７～１４６のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞外小胞は、エクソソーム、マイクロベシクル、またはアポトーシス小体である、請求項１２７～１４７のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞外小胞はエクソソームである、請求項１４８に記載の方法。
前記ポリヌクレオチドは、バイオチップ上に位置するナノチャネルを介して、前記細胞外小胞ドナー細胞内にナノエレクトロポレーションされる、請求項１２７～１４９のいずれか１項に記載の方法。
前記ナノチャネルは、１ナノメートル～１０００ナノメートルの直径で構成される、請求項１５０に記載の方法。
前記バイオチップは、１マイクロメートル～１００マイクロメートルのナノチャネル間の間隔を構成するナノチャネルアレイを含む、請求項１５０に記載の方法。
前記ナノエレクトロポレーションは電界を構成する、請求項１２７～１５２のいずれか１項に記載の方法。
前記電界は、１ボルト／ｍｍ～１０００ボルト／ｍｍの電界強度を有する、請求項１５３に記載の方法。
前記電界は、０．１ミリ秒／パルス～１００ミリ秒／パルスのパルス持続時間を有する複数のパルスを構成する、請求項１５３に記載の方法。
前記腫瘍ターゲティングドメインは、腫瘍ターゲティングポリペプチドのＮ末端上にある、請求項１３４に記載の方法。
前記腫瘍ターゲティングドメインは、前記腫瘍ターゲティングポリペプチドのＣ末端上にある、請求項１３４に記載の方法。
前記網膜疾患は網膜色素変性症である、請求項１２７～１５７のいずれか１項に記載の方法。
前記網膜疾患は、レーバー先天黒内障である、請求項１２７～１５７のいずれか１項に記載の方法。