JP2022551420A - 腫瘍を治療するためのｉｌ－１２提示エクソソームとｓｔｉｎｇアゴニスト含有エクソソームとの併用 - Google Patents

腫瘍を治療するためのｉｌ－１２提示エクソソームとｓｔｉｎｇアゴニスト含有エクソソームとの併用 Download PDF

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ヌルディーン ルイス，
スリラム サティヤナラヤナン，
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コディアック バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド
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Abstract

本明細書は、（ｉ）細胞外小胞及びＳＴＩＮＧアゴニストを含む組成物、例えば、ＳＴＩＮＧアゴニストを封入したエクソソームと、（ｉｉ）ＩＬ－１２部分と、を併用して投与することを含む、腫瘍を治療する方法を提供する。本開示の特定の態様は、腫瘍の治療を必要とする対象の腫瘍を治療する方法であって、（ｉ）細胞外小胞（ＥＶ）とインターフェロン遺伝子タンパク質の刺激因子（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇｅｎｅｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＳＴＩＮＧ）アゴニストとを含む組成物と、（ｉｉ）インターロイキン１２（ＩＬ－１２）部分と、を併用して投与することを含む、方法に関する。いくつかの態様では、ＩＬ－１２部分は、第２のＥＶに結合されている。いくつかの態様では、ＩＬ－１２部分は、ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶに関連付けられる。【選択図】なし

Description

ＥＦＳ－ＷＥＢを介して電子的に提出された配列表の参照
本出願と共にＡＳＣＩＩテキストファイル（名称４０００＿０７２ＰＣ０３＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５；サイズ：１０１，６４７バイト；作成日：２０２０年９月２４日）の形で提出される、電子的に提出される配列表の内容の全体を、参照により本明細書に援用する。
関連出願の相互参照
本ＰＣＴ出願は、２０１９年９月２５日に出願された米国特許仮出願同６２／９０６，０１６号、２０２０年８月１７日に出願された同第６３／０６６，６０５号、及び２０２０年８月２５日に出願された米国特許仮出願第６３／０７０，１４９号の優先権の利益を主張するものであり、それぞれの全内容を参照によって本明細書に援用する。
インターフェロン遺伝子の刺激因子（Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｇｅｎｅｓ）（ＳＴＩＮＧ）は、一般的に細菌によって産生される環状ジヌクレオチドのサイトゾルセンサーである。ＳＴＩＮＧは活性化されるとI型インターフェロンの産生をもたらし、免疫応答を開始する。ＳＴＩＮＧのアゴニズムは、前臨床的に腫瘍に対する免疫応答を誘導するための有望なアプローチであることが示されている。残念なことに、ＳＴＩＮＧの幅広い発現プロファイルを考慮すると、ＳＴＩＮＧアゴニストの全身送達は全身性の炎症を引き起こす。これは投与可能な用量を制限し、それによって治療効果も制限される。全身送達の代替的なアプローチとして、ＳＴＩＮＧアゴニストを腫瘍に直接注射することがある。腫瘍内注射は極めて効果的であるが、針で到達して組織を傷害することができる固形腫瘍に限定される。したがって、ＳＴＩＮＧアゴニストを送達する改善された方法が求められている。
本開示の特定の態様は、腫瘍の治療を必要とする対象の腫瘍を治療する方法であって、（ｉ）細胞外小胞（ＥＶ）とインターフェロン遺伝子タンパク質の刺激因子（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇｅｎｅｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＳＴＩＮＧ）アゴニストとを含む組成物と、（ｉｉ）インターロイキン１２（ＩＬ－１２）部分と、を併用して投与することを含む、方法に関する。いくつかの態様では、ＩＬ－１２部分は、第２のＥＶに結合されている。いくつかの態様では、ＩＬ－１２部分は、ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶに関連付けられる。
いくつかの態様では、腫瘍は、原発腫瘍、二次腫瘍、または原発腫瘍及び二次腫瘍の両方である。
いくつかの態様では、投与することは、腫瘍の体積を減少させる。
いくつかの態様では、投与することは、ＳＴＩＮＧアゴニストまたはＩＬ－１２部分を含む細胞外小胞のいずれかを投与した（「単剤療法」）後の腫瘍体積と比較して、腫瘍の体積を、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍、減少させる。
いくつかの態様では、投与することは、原発腫瘍の体積を減少させる。いくつかの態様では、投与することは、投与することの１４日目後に単剤療法と比較して、原発腫瘍の体積を、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍、減少させることができる。
いくつかの態様では、投与することは、二次腫瘍の体積を減少させる。いくつかの態様では、投与することは、投与することの１４日目後に、単剤療法と比較して、二次腫瘍の体積を、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、または少なくとも約２倍、減少させることができる。いくつかの態様では、投与することは、腫瘍の増殖を減少させる。
いくつかの態様では、投与することは、ＳＴＩＮＧアゴニストまたはＩＬ－１２部分を含む細胞外小胞のいずれかを投与した（「単剤療法」）後の腫瘍体積と比較して、腫瘍の増殖を、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍、減少させる。いくつかの態様では、投与することは、原発腫瘍及び／または二次腫瘍の増殖を減少させる。
いくつかの態様では、方法は、抗がん剤を投与することをさらに含む。いくつかの態様では、抗がん剤は、チェックポイント阻害剤を含む。いくつかの態様では、チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－１抗体である。
本開示の特定の態様は、ＳＴＩＮＧアゴニスト及びＩＬ－１２部分を含む細胞外小胞に関する。
本開示の特定の態様は、ＳＴＩＮＧアゴニストを含む細胞外小胞と、ＩＬ－１２部分を含む第２のＥＶとを含む組成物に関する。
特定の態様では、ＩＬ－１２部分は、ＩＬ－１２タンパク質、ＩＬ－１２タンパク質をコードする核酸、またはＩＬ－１２活性を有する分子である。特定の態様では、ＩＬ－１２部分は、ＩＬ－１２タンパク質である。
特定の態様では、細胞外小胞は、エクソソーム、ナノ小胞、アポトーシス小体、マイクロベシクル、リソソーム、エンドソーム、リポソーム、脂質ナノ粒子、ミセル、多層構造、再小胞化された小胞、または押し出された細胞である。いくつかの態様では、ＥＶは、エクソソームである。
いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ＥＶに関連付けられる。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ＥＶに封入される。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、場合によりリンカーによってＥＶの脂質二重層に連結される。いくつかの態様では、ＥＶは、プロスタグランジンＦ２受容体ネガティブレギュレーター（ＰＴＧＦＲＮ）タンパク質を過剰発現する。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ＰＴＧＦＲＮタンパク質に連結されていない。いくつかの態様では、細胞外小胞は、ＰＴＧＦＲＮタンパク質を過剰発現する細胞によって生成される。
いくつかの態様では、細胞外小胞は、リガンド、サイトカイン、または抗体をさらに含む。いくつかの態様では、抗体は、アンタゴニスト抗体及び／またはアゴニスト抗体を含む。
いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、環状ジヌクレオチドである。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、非環状ジヌクレオチドである。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、脂質結合タグを含む。
いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストが、物理的及び／または化学的に改変される。いくつかの態様では、改変されたＳＴＩＮＧアゴニストは、対応する未改変のＳＴＩＮＧアゴニストとは異なる極性及び／または電荷を有する。
いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストの濃度は、約０．０１μＭ～１００μＭである。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストの濃度は、約０．０１μＭ～０．１μＭ、０．１μＭ～１μＭ、１μＭ～１０μＭ、１０μＭ～５０μＭ、または５０μＭ～１００μＭである。いくつかの態様では、ＥＶ内のＳＴＩＮＧアゴニストの濃度は、約１μＭ～１０μＭである。
いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、
Figure 2022551420000001
 ［式中、
Ｘ１は、Ｈ、ＯＨ、またはＦであり、
Ｘ２は、Ｈ、ＯＨ、またはＦであり、
Ｚは、ＯＨ、ＯＲ１、ＳＨまたはＳＲ１であり、式中、
ｉ）Ｒ１は、ＮａまたはＮＨ４であるか、または
ｉｉ）Ｒ１は、ピバロイルオキシメチルなどのインビボでＯＨまたはＳＨを与える酵素不安定基であり、
Ｂｉ及びＢ２は、以下から選択される塩基であり、
Figure 2022551420000002
ただし、
－式（Ｉ）において：Ｘ１及びＸ２はＯＨではなく、
－式（ＩＩ）において：Ｘ１及びＸ２がＯＨである場合、Ｂ１はアデニンではなく、Ｂ２はグアニンではなく、かつ、
－式（ＩＩＩ）において：Ｘ１及びＸ２がＯＨである場合、Ｂ１はアデニンではなく、Ｂ２はグアニンではなく、ＺはＯＨではない。］、またはその薬学的に許容される塩を含む。
いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、


Figure 2022551420000003
Figure 2022551420000004
Figure 2022551420000005
 及びその薬学的に許容される塩からなる群から選択される。
いくつかの態様では、ＩＬ－１２部分は、足場部分に連結される。いくつかの態様では、第２のＥＶは、足場部分を含む。いくつかの態様では、ＩＬ－１２部分は、足場部分に連結される。いくつかの態様では、足場部分は、ＰＴＧＦＲＮタンパク質を含む。いくつかの態様では、ＰＴＧＦＲＮタンパク質は、配列番号３３を含む。いくつかの態様では、ＰＴＧＦＲＮタンパク質が、配列番号１と少なくとも約７０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一である。いくつかの態様では、ＰＴＧＦＲＮタンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、投与は、非経口、経口、静脈内、筋肉内、腫瘍内、腹腔内、または他の任意の適切な投与経路による。いくつかの態様では、投与は、腫瘍内である。
本開示の特定の態様は、本明細書に開示されるＥＶまたは本明細書に開示される組成物と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
本開示の特定の態様は、本明細書に開示される組成物及び使用説明書を含むキットに関する。
態様
エクソソームにＳＴＩＮＧアゴニストをロードする方法の図を示す。 ＰＢＳコントロール（四角形）、表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソーム（「ｅｘｏＩＬ－１２」）（逆三角形）、エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニスト（「ｅｘｏＳＴＩＮＧ」）（三角形）、または表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソームとエクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニストとの併用療法（丸）の施行後の一次部位（原発腫瘍）に接種されたＢ１６Ｆ１０マウスにおける平均腫瘍体積（ｍｍ３）のグラフである。エラーバーは平均の標準誤差を示す。 ＰＢＳコントロール（四角形）、表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソーム（「ｅｘｏＩＬ－１２」）（逆三角形）、エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニスト（「ｅｘｏＳＴＩＮＧ」）（三角形）、または表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソームとエクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニストとの併用療法（丸）の施行後の二次部位（二次腫瘍）に接種されたＢ１６Ｆ１０マウスにおける平均腫瘍体積（ｍｍ３）のグラフである。エラーバーは平均の標準誤差を示す。 ＰＢＳコントロール（四角形）、表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソーム（逆三角形）、エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニスト（三角形）、または表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソームとエクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニストとの併用療法（丸）の施行後のＢ１６Ｆ１０マウスにおける原発腫瘍及び二次腫瘍の増殖速度を示す箱ひげ図である。統計的有意性は、Ｔｕｋｅｙ事後検定を用いた一元配置分散分析により判定した。＊ｐ＜０．０５ ｖｓ ＰＢＳ；＊＊＊ｐ＜０．００１ ｖｓ ＰＢＳ；＃ｐ＜０．０５ ｖｓ ｅｘｏＩＬ－１２；⊥ ｐ＜０．０５ ｖｓ ｅｘｏＳＴＩＮＧ；⊥⊥⊥ ｐ＜０．００１ ｖｓ ｅｘｏＳＴＩＮＧ。 ＰＢＳ＋ＩｇＧコントロール（四角形）、エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニスト＋ＩｇＧ（三角形）、エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニスト＋ＰＤ－１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ１）に結合する抗体（抗ＰＤ－１抗体、逆三角形）、表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソーム＋ＩｇＧ（白抜き三角形）、表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソーム＋抗ＰＤ－１抗体（白抜き逆三角形）、表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソーム、エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニスト、及びＩｇＧの３剤併用療法（丸）、または表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソーム、エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニスト、及び抗ＰＤ－１抗体の３剤併用療法（アスタリスク）の施行後のＢ１６Ｆ１０マウスにおける二次腫瘍（Ａ）及び原発腫瘍（Ｂ）の腫瘍体積のグラフである。 ＰＢＳ＋ＩｇＧコントロール、エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニスト＋ＩｇＧ、エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニスト＋抗ＰＤ－１抗体、表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソーム＋ＩｇＧ、表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソーム＋抗ＰＤ－１抗体、表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソーム、エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニスト、及びＩｇＧの３剤併用療法、または表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソーム、エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニスト、及び抗ＰＤ－１抗体の３剤併用療法（示されるように）の施行後のＢ１６Ｆ１０マウスにおける原発腫瘍（図４Ａ）及び二次腫瘍（図４Ｂ）の増殖速度のグラフである。統計的有意性は、Ｔｕｋｅｙ事後検定を用いた一元配置分散分析によって判定した（図４Ａ－４Ｂ）。各データセットの上の小文字は、統計群を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 ＰＢＳ＋ＩｇＧコントロール、エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニスト＋ＩｇＧ、エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニスト＋抗ＰＤ－１抗体、表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソーム＋ＩｇＧ、表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソーム＋抗ＰＤ－１抗体、表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソーム、エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニスト、及びＩｇＧの３剤併用療法、または表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソーム、エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニスト、及び抗ＰＤ－１抗体の３剤併用療法（示されるように）の施行後のＢ１６Ｆ１０マウスにおける原発腫瘍（図４Ａ）及び二次腫瘍（図４Ｂ）の増殖速度のグラフである。統計的有意性は、Ｔｕｋｅｙ事後検定を用いた一元配置分散分析によって判定した（図４Ａ－４Ｂ）。各データセットの上の小文字は、統計群を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 各群で処置した５匹のマウスのそれぞれについて腫瘍体積を表す線グラフである。ＰＢＳ＋ＩｇＧコントロールで処置した原発腫瘍。 各群で処置した５匹のマウスのそれぞれについて腫瘍体積を表す線グラフである。エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニスト＋ＩｇＧで処置した原発腫瘍。 各群で処置した５匹のマウスのそれぞれについて腫瘍体積を表す線グラフである。エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニスト＋抗ＰＤ－１抗体で処置した原発腫瘍。 各群で処置した５匹のマウスのそれぞれについて腫瘍体積を表す線グラフである。表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソーム＋ＩｇＧで処置した原発腫瘍。 各群で処置した５匹のマウスのそれぞれについて腫瘍体積を表す線グラフである。表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソーム＋抗ＰＤ－１抗体で処置した原発腫瘍。 各群で処置した５匹のマウスのそれぞれについて腫瘍体積を表す線グラフである。表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソーム、エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニスト、及びＩｇＧの３剤併用療法で処置した原発腫瘍。 各群で処置した５匹のマウスのそれぞれについて腫瘍体積を表す線グラフである。表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソーム、エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニスト、及び抗ＰＤ－１抗体の３剤併用療法で処置した原発腫瘍。 各群で処置した５匹のマウスのそれぞれについて腫瘍体積を表す線グラフである。ＰＢＳ＋ＩｇＧコントロールによる処置後の二次腫瘍。 各群で処置した５匹のマウスのそれぞれについて腫瘍体積を表す線グラフである。エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニスト＋ＩｇＧによる処置後の二次腫瘍。 各群で処置した５匹のマウスのそれぞれについて腫瘍体積を表す線グラフである。エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニスト＋抗ＰＤ－１抗体による処置後の二次腫瘍。 各群で処置した５匹のマウスのそれぞれについて腫瘍体積を表す線グラフである。表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソーム＋ＩｇＧによる処置後の二次腫瘍。 各群で処置した５匹のマウスのそれぞれについて腫瘍体積を表す線グラフである。表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソーム＋抗ＰＤ－１抗体による処置後の二次腫瘍。 各群で処置した５匹のマウスのそれぞれについて腫瘍体積を表す線グラフである。表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソーム、エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニスト、及びＩｇＧの３剤併用療法による処置後の二次腫瘍。 各群で処置した５匹のマウスのそれぞれについて腫瘍体積を表す線グラフである。表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソーム、エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニスト、及び抗ＰＤ－１抗体の３剤併用療法による処置後の二次腫瘍。 表面に提示されたＩＬ－１２を有する操作されたエクソソーム（「ｅｘｏＩＬ－１２」）の図である。 非処理マウス及び図示されるように遊離組換えＩＬ－１２またはｅｘｏＩＬ－１２で処理したマウスにおける腫瘍保持量を示す散布図である。 非処理マウス及び図示されるように遊離組換えＩＬ－１２またはｅｘｏＩＬ－１２で処理したマウスにおけるＩＦＮ－γのＡＵＣを示す散布図である。 非処理マウス及び図示されるように遊離組換えＩＬ－１２またはｅｘｏＩＬ－１２で処理したマウスにおける腫瘍増殖を示す散布図である。 非処理マウス及び図示されるように遊離組換えＩＬ－１２またはｅｘｏＩＬ－１２で処理したマウスにおける再チャレンジ後の腫瘍増殖を示す散布図である。 コントロール及びｅｘｏＩＬ－１２で処理したマウスにおける抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合（％）を示す箱ひげ図である。 皮膚及び血漿中で測定したｅｘｏＩＬ－１２によって測定された薬物動態のグラフである。 ０．３μｇ、１．０μｇ、または３．０μｇのｅｘｏＩＬ－１２の投与後の経時的な皮膚中のＩＰ－１０のビヒクルに対する倍率変化によって測定された組織薬力学のグラフである。 ０．３μｇ、１．０μｇ、または３．０μｇのｅｘｏＩＬ－１２の投与後の経時的な血漿中のＩＰ－１０のビヒクルに対する倍率変化によって測定された組織薬力学のグラフである。 健康なボランティア（Ａ）及びがん患者（Ｂ）におけるｅｘｏＩＬ－１２治療の安全性及び有効性を評価する臨床試験の概略図である。 示されるように、ｉ）エクソソームとＩｇＧコントロールとの併用、（ｉｉ）エクソソームと抗ＰＤ－１抗体との併用、（ｉｉｉ）エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニストとＩｇＧコントロールとの併用、（ｉｖ）エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニストと抗ＰＤ－１抗体との併用、（ｖ）ｅｘｏＩＬ－１２と抗ＰＤ－１抗体との併用、（ｖｉ）エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニストとｅｘｏＩＬ－１２との併用、及び（ｖｉｉ）エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニスト（１０ｎｇ）とｅｘｏＩＬ－１２（１０ｎｇ）との併用の施行後の最大２０日間にわたる二次腫瘍体積（ｍｍ３）のグラフである。 図示されるように、ｉ）エクソソームとＩｇＧコントロールとの併用、（ｉｉ）エクソソームと抗ＰＤ－１抗体との併用、（ｉｉｉ）エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニストとＩｇＧコントロールとの併用、（ｉｖ）エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニストと抗ＰＤ－１抗体との併用、（ｖ）ｅｘｏＩＬ－１２と抗ＰＤ－１抗体との併用、（ｖｉ）エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニストとｅｘｏＩＬ－１２との併用、及び（ｖｉｉ）エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニスト（１０ｎｇ）とｅｘｏＩＬ－１２（１０ｎｇ）との併用の施行後の最大２０日間にわたる原発腫瘍体積（ｍｍ３）のグラフである。 図示されるように、ｉ）エクソソームとＩｇＧコントロールとの併用、（ｉｉ）エクソソームと抗ＰＤ－１抗体との併用、（ｉｉｉ）エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニストとＩｇＧコントロールとの併用、（ｉｖ）エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニストと抗ＰＤ－１抗体との併用、（ｖ）ｅｘｏＩＬ－１２と抗ＰＤ－１抗体との併用、（ｖｉ）エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニストとｅｘｏＩＬ－１２との併用、及び（ｖｉｉ）エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニスト（１０ｎｇ）とｅｘｏＩＬ－１２（１０ｎｇ）との併用の施行後の１ｍｍ２当たりのＣＤ８＋細胞の数のグラフである。
本発明をより詳細に説明するのに先立って、本発明は記載される特定の態様に限定されるものではなく、言うまでもなく変化し得る点は理解されるべきである。本発明の範囲は付属の特許請求の範囲によってのみ限定されるものであるため、本明細書で使用される用語は、あくまで特定の態様を説明するためのものであって、限定することを目的としたものではない点も理解されるべきである。
別段の定義がなされない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有するものとする。本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法及び材料も、本発明の実施または試験において使用することができるが、代表的な例示的方法及び材料について以下に記載する。
本明細書に引用されるすべての刊行物及び特許は、あたかもそれぞれの刊行物または特許が参照によって援用されるものとして具体的かつ個々に示されているのと同様に本明細書に参照によって援用されるものであり、引用される刊行物と関連する方法及び／または材料を開示及び記載するために参照によって本明細書に援用されるものである。
本開示を読むことで当業者には明らかとなるように、本明細書に記載及び例示される個々の態様のそれぞれは、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく他のいくつかの態様のいずれかの特徴から容易に分離するか、またはそれと組み合わせることができる別個の構成要素及び特徴を有する。記載されるいずれの方法も、記載される事象の順序で、または論理的に可能な他の任意の順序で実施することが可能である。
Ｉ.定義
本明細書において、また付属の特許請求の範囲において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈によってそうでない旨が明確に示されない限り、複数の指示対象が含まれる点に留意されたい。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、ならびに「１つ以上の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、及び「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」は、本開示では互換可能に用いられる場合がある。各請求項は、あらゆる任意選択的な要素を除外するように起草される場合もある点にも留意されたい。したがって、この記載は、請求項の要素の記載との関連において「～だけの」、「～のみ」などといった除外的な語の使用に対する、または否定による限定の使用に対する先行詞としての役割を有するものとする。
さらに、本明細書で使用するところの「及び／または」とは、他方を伴うかまたは伴わない、２つの特定の特性または要素のそれぞれの具体的な開示として理解されるべきである。したがって、本明細書において「Ａ及び／またはＢ」といった語句で用いられる「及び／または」なる用語は、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（のみ）、及び「Ｂ」（のみ）を含むものとする。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」といった語句で使用される「及び／または」なる用語は、以下の態様、すなわち、Ａ、Ｂ、及びＣ、Ａ、Ｂ、またはＣ、ＡまたはＣ、ＡまたはＢ、ＢまたはＣ、Ａ及びＣ、Ａ及びＢ、Ｂ及びＣ、Ａ（のみ）、Ｂ（のみ）、ならびにＣ（のみ）のそれぞれを包含するものとする。
各態様が「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」なる文言によって記述される場合、さもなければ「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び／または「～から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」によって記述される同様の態様も提供されるものと理解される。
別段の定義がなされない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有するものとする。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、及びＯｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、当業者に、本開示で使用される用語の多くについての一般的な辞書を与えるものである。
単位、接頭語、及び記号は、国際単位系（ＳＩ）で認められた形式で記載する。数値範囲は、その範囲を規定する数を含むものとする。値の範囲が記載されている場合、その範囲の記載された上限と下限との間にあるそれぞれの介在する整数値、及びそのそれぞれの分数もまた、そのような値の間のそれぞれの部分範囲とともに具体的に開示される点は理解されるべきである。任意の範囲の上限値及び下限値は独立してその範囲に含まれる場合も、その範囲から除外される場合もあるが、どちらかの限界値が含まれるか、どちらの限界値も含まれないか、または両方の限界値が含まれるそれぞれの範囲もまた、本開示に包含される。したがって、本明細書に記載される範囲は、記載される端点を含む、その範囲内のすべての値の簡略的な表記であるものとして理解される。例えば、１～１０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、または部分範囲を含むものとして理解される。
値が明示的に記載されている場合、記載されている値とほぼ同じ数または量である値もまた、本開示の範囲内に含まれる点を理解されたい。ある組み合わせが開示される場合、その組み合わせの要素の部分的な組み合わせのそれぞれも具体的に開示され、本開示の範囲内に含まれる。逆に、異なる要素または要素群が個別に開示される場合、それらの組み合わせも開示される。ある開示の任意の要素が複数の選択肢を有するものとして開示される場合、各選択肢が単独で、または他の選択肢との任意の組み合わせとして除外されるその開示の例もまた、本明細書に開示される。つまり、ある開示の複数の要素がそのような除外を有することができ、そのような除外を有する要素のすべての組み合わせが本明細書に開示される。
ヌクレオチドは、それらの広く認められている１文字の略号で呼称する。特に示されない限り、ヌクレオチド配列は５’から３’の方向に左から右に記載する。本明細書では、ヌクレオチドは、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名法委員会（ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）により推奨されるそれらの一般的に知られる１文字記号で呼称する。したがって、Ａはアデニンを表し、Ｃはシトシンを表し、Ｇはグアニンを表し、Ｔはチミンを表し、Ｕはウラシルを表す。
アミノ酸配列はアミノ末端からカルボキシ末端の方向に左から右に記載する。本明細書では、アミノ酸は、それらの一般的に知られる３文字記号、またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名法委員会により推奨される１文字記号で呼称する。
「約」または「およそ」なる用語は、本明細書では概ね大体、おおよそ、またはその周辺であることを意味するために使用される。「約」なる用語が数値範囲とともに使用される場合、記載される数値よりも上及び下の境界値を広げることによって、その範囲を修飾する。本明細書で使用されるこの用語は、参照される量の５％以内を意味し、例えば、約５０％とは、４７．５％～５２．５％の値の範囲を包含するものとして理解される。
本明細書で使用するところの「細胞外小胞」または「ＥＶ」なる用語は、内部空間を封入する膜を含む細胞由来の小胞を指す。細胞外小胞は、それらが由来する細胞よりも小さい直径を有するすべての膜結合小胞（例えば、エクソソーム、ナノ小胞）を含む。一般的に、細胞外小胞は直径が２０ｎｍ～１０００ｎｍの範囲であり、内部空間（すなわち、内腔）内にある場合、細胞外小胞の外表面に提示される場合、及び／または膜を貫通している場合のいずれかの形で、さまざまなマクロ分子ペイロードを含むことができる。前記ペイロードは、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、小分子、及び／またはそれらの組み合わせを含むことができる。いくつかの態様では、細胞外小胞は足場部分を含む。例として、また、これらに限定されるものではないが、細胞外小胞は、アポトーシス小体、細胞の断片、直接的操作または間接的操作（例えば、連続押出またはアルカリ溶液での処理によるもの）によって細胞から誘導される小胞、小胞化オルガネラ、及び生細胞により産生される小胞（例えば、直接の原形質膜出芽または後期エンドソームの原形質膜との融合によるもの）を含む。細胞外小胞は、生きているもしくは死んだ生物、外植された組織もしくは臓器、原核または真核細胞、及び／または培養された細胞に由来するものであってよい。いくつかの態様では、細胞外小胞は、１つまたは複数の導入遺伝子産物を発現する細胞によって生成される。
本明細書で使用するところの「エクソソーム」なる用語は、内部空間（すなわち、内腔）を封入する膜を含み、直接の原形質膜出芽によるか、または後期エンドソームの原形質膜との融合により細胞から生成される、前記細胞由来の小さい（直径２０～３００ｎｍ、例えば直径４０～２００ｎｍ）小胞を指す。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは、約２０ｎｍ～約３００ｎｍである。エクソソームは、細胞外小胞の一種である。エクソソームは、脂質または脂肪酸及びポリペプチドを含み、場合により、ペイロード（例えば、治療薬）、レシーバー（例えば、標的化部分）、ポリヌクレオチド（例えば、核酸、ＲＮＡ、またはＤＮＡ）、糖（例えば、単糖、多糖類、もしくはグリカン）または他の分子を含む。いくつかの態様では、エクソソームは足場部分を含む。エクソソームは、プロデューサー細胞に由来するものであってよく、そのサイズ、密度、生化学的パラメータ、またはそれらの組み合わせに基づいてプロデューサー細胞から単離することができる。いくつかの態様では、本開示のエクソソームは、１つ以上の導入遺伝子産物を発現する細胞によって生成される。
本明細書で使用するところの「ナノ小胞」なる用語は、内部空間を封入する膜を含む、細胞由来の小さい（直径２０～２５０ｎｍ、より好ましくは直径３０～１５０ｎｍ）小胞であって、ナノ小胞が操作なしではプロデューサー細胞によって産生されないように直接的操作または間接的操作によって細胞から生成されるものを指す。前記プロデューサー細胞の適切な操作としては、これらに限定されるものではないが、連続押出、アルカリ溶液による処理、超音波処理、またはそれらの組み合わせが挙げられる。ナノ小胞の産生は、場合により、前記プロデューサー細胞の破壊につながり得る。ナノ小胞の集団は、原形質膜からの直接出芽または後期エンドソームの原形質膜との融合によってプロデューサー細胞から誘導される小胞を実質的に含まないことが好ましい。ナノ小胞は、脂質または脂肪酸及びポリペプチドを含み、場合により、ペイロード（例えば、治療薬）、レシーバー（例えば、標的化部分）、ポリヌクレオチド（例えば、核酸、ＲＮＡ、またはＤＮＡ）、糖（例えば、単糖、多糖類、もしくはグリカン）または他の分子を含む。いくつかの態様では、ナノ小胞は足場部分を含む。ナノ小胞は、上記の操作によってプロデューサー細胞から誘導されると、そのサイズ、密度、生化学的パラメータ、またはそれらの組み合わせに基づいてプロデューサー細胞から単離することができる。
「改変された」なる用語は、本明細書に記載のエクソソームとの関連で使用される場合、改変されたＥＶが天然に存在するＥＶとは異なるような、ＥＶの改変または操作を指す。いくつかの態様では、本明細書に記載の改変ＥＶは、天然に存在するＥＶの膜と比較して、タンパク質、脂質、小分子、炭水化物などの組成が異なる膜を含む（例えば、膜がより高い密度または多くの数の天然ＥＶタンパク質を含む、及び／または膜がＥＶには天然にみられないタンパク質を含む）。特定の態様では、膜に対するそのような改変は、ＥＶの外表面を変化させる。特定の態様では、膜に対するそのような改変は、ＥＶの内腔を変化させる。
本明細書で使用するところの「足場部分」なる用語は、本明細書で開示されるＳＴＩＮＧアゴニスト、ＩＬ－１２部分、及び／または他の任意の目的の化合物（例えば、ペイロード）をＥＶに、ＥＶの内腔表面または外表面のいずれかに固定するために使用できる分子を指す。特定の態様では、足場部分は合成分子を含む。いくつかの態様では、足場部分は、非ポリペプチド部分を含む。他の態様では、足場部分は、ＥＶに天然に存在する脂質、炭水化物、またはタンパク質を含む。いくつかの態様では、足場部分は、エクソソーム中に天然に存在しない脂質、炭水化物、またはタンパク質を含む。特定の態様では、足場部分はＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘである。いくつかの態様では、足場部分はＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙである。さらなる態様では、足場部分は、Ｓｃａｆｆｏｌｄ ＸとＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙの両方を含む。特定の態様では、足場部分は、Ｌａｍｐ－１、Ｌａｍｐ－２、ＣＤ１３、ＣＤ８６、フロチリン、シンタキシン－３、ＣＤ２、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１ａ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＩＣＡＭ－１、インテグリンα４、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ－１α及びβ、Ｖｔｉ－１Ａ及びＢ、ＣＤ３ε及びζ、ＣＤ９、ＣＤ１８、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＸＣＲ４、ＦｃＲ、ＧｌｕＲ２／３、ＨＬＡ－ＤＭ（ＭＨＣ ＩＩ）、免疫グロブリン、ＭＨＣ－ＩもしくはＭＨＣ－ＩＩ成分、ＴＣＲβ、テトラスパニン、またはそれらの組み合わせを含む。
本明細書で使用するところの「Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ」なる用語は、エクソソームの表面で最近同定されたエクソソームタンパク質を指す。例えば、参照によって本明細書にその全体を援用する米国特許１０，１９５，２９０号を参照。Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘタンパク質の非限定的な例としては、プロスタグランジンＦ２受容体ネガティブレギュレーター（「ＰＴＧＦＲＮタンパク質」）、ベイシジン（「ＢＳＧタンパク質」）、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（「ＩＧＳＦ２タンパク質」）、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（「ＩＧＳＦ３タンパク質」）、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（「ＩＧＳＦ８タンパク質」）、インテグリンβ１（「ＩＴＧＢ１タンパク質」）、インテグリンα４（「ＩＴＧＡ４タンパク質」）、４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（「ＳＬＣ３Ａ２タンパク質」）、及びＡＴＰトランスポータータンパク質のクラス（「ＡＴＰ１Ａ１タンパク質」、「ＡＴＰ１Ａ２タンパク質」、「ＡＴＰ１Ａ３タンパク質」、「ＡＴＰ１Ａ４タンパク質」、「ＡＴＰ１Ｂ３タンパク質」、「ＡＴＰ２Ｂ１タンパク質」、「ＡＴＰ２Ｂ２タンパク質」、「ＡＴＰ２Ｂ３タンパク質」、「ＡＴＰ２Ｂタンパク質」）が挙げられる。いくつかの態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘタンパク質は、タンパク質全体またはそのフラグメント（例えば、機能的フラグメント、例えば、ＥＶ、例えば、エクソソームの外表面または内腔表面上に別の部分を固定することができる最小フラグメント）とすることができる。いくつかの態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、部分（例えば、ＳＴＩＮＧアゴニスト及び／またはＩＬ－１２部分）をＥＶ、例えば、エクソソームの外表面または内腔表面に固定することができる。
本明細書で使用するところの「Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｙ」なる用語は、エクソソームの内腔表面で新たに同定されたエクソソームタンパク質を指す。参照によって本明細書にその全体を援用する国際公開第ＷＯ／２０１９／０９９９４２号を参照。Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｙタンパク質の非限定的な例としては、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質（「ＭＡＲＣＫＳタンパク質」）、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質様１（「ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質」）、及び脳の酸可溶性タンパク質１（「ＢＡＳＰ１タンパク質」）が挙げられる。いくつかの態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｙタンパク質は、タンパク質全体またはそのフラグメント（例えば、機能的フラグメント、例えば、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面上に部分を固定することができる最小フラグメント）とすることができる。いくつかの態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｙは、部分（例えば、ＳＴＩＮＧアゴニスト及び／またはＩＬ－１２部分）をＥＶ、例えば、エクソソームの内腔に固定することができる。
本明細書で使用するところのタンパク質（例えば、治療用タンパク質、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ、またはＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙ）の「フラグメント」なる用語は、天然に存在する配列よりも短いタンパク質のアミノ酸配列、天然に存在するタンパク質と比較してタンパク質のＮ末端及び／またはＣ末端または任意の部分が欠失されたタンパク質を指す。本明細書で使用するところの「機能的フラグメント」なる用語は、タンパク質機能を保持したタンパク質フラグメントを指す。したがって、いくつかの態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘタンパク質の機能的フラグメントは、部分をＥＶの内腔表面及び／または外表面に固定する能力を保持している。同様に、特定の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｙタンパク質の機能的フラグメントは、部分をＥＶの内腔表面に固定する能力を保持している。フラグメントが機能的フラグメントであるかどうかは、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ分析、及びフラグメントと例えばＧＦＰなどの自家蛍光タンパク質との融合を含む、ＥＶのタンパク質含有量を決定するための任意の周知の方法によって評価することができる。特定の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘタンパク質の機能的フラグメントは、天然に存在するＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘタンパク質の能力、例えば、部分を固定する能力の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約１００％を保持する。いくつかの態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｙタンパク質の機能的フラグメントは、天然に存在するＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙタンパク質の能力、例えば、別の分子を固定する能力の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約１００％を保持する。
本明細書で使用される場合、分子（例えば、機能性分子、抗原、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ及び／またはＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙ）の「変異体」なる用語は、当該技術分野では周知の方法により比較した場合に、別の分子と特定の構造的及び機能的同一性を共有する分子を指す。例えば、あるタンパク質の変異体は、別のタンパク質における置換、挿入、欠失、フレームシフトまたは再構成を含み得る。
いくつかの態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘの変異体は、完全長の成熟したＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、もしくはＡＴＰトランスポータータンパク質、またＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、もしくはＡＴＰトランスポータータンパク質のフラグメント（例えば、機能的フラグメント）と少なくとも約７０％の同一性を有する変異体を含む。いくつかの態様では、ＰＴＧＦＲＮの変異体またはそのフラグメントの変異体は、配列番号１によるＰＴＧＦＲＮまたはその機能的フラグメントと少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。
いくつかの態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｙの変異体は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、またはＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、もしくはＢＡＳＰ１のフラグメントに対して少なくとも７０％の同一性を有する変異体を含む。いくつかの態様では、ＭＡＲＣＫＳの変異体またはそのフラグメントの変異体は、配列番号４０１によるＭＡＲＣＫＳまたはその機能的フラグメントと少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または、少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの態様では、ＭＡＲＣＫＳＬ１の変異体またはそのフラグメントの変異体は、配列番号４０２によるＭＡＲＣＫＳＬ１またはその機能的フラグメントと少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または、少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの態様では、ＢＡＳＰ１の変異体またはそのフラグメントの変異体は、配列番号４０３によるＢＡＳＰ１またはその機能的フラグメントと少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｙタンパク質の変異体またはそのフラグメントの変異体は、ＥＶの内腔に特異的に標的化される能力を保持している。いくつかの態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｙは、１つ以上の変異、例えば、保存的アミノ酸置換を含む。
「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、ポリペプチド中のアミノ酸が同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸で置換されている場合、その置換は保存的であるとみなされる。別の態様では、アミノ酸のストリングは、側鎖ファミリーメンバーの順序及び／または組成が異なる構造的に類似したストリングで保存的に置換することができる。
２個のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の「配列同一率（％）」または「同一率（％）」なる用語は、比較ウインドウにわたって各配列によって共有される同一の一致位置の数を指し、２個の配列の最適なアラインメントを得るために導入する必要のある付加または欠失（すなわちギャップ）を考慮したものである。一致位置は、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸が、標的配列と参照配列の両方に示される任意の位置である。標的配列内に示されるギャップは、ヌクレオチドまたはアミノ酸ではないため、カウントされない。同様に、標的配列のヌクレオチドまたはアミノ酸はカウントされるが、参照配列のヌクレオチドまたはアミノ酸はカウントされないため、参照配列内に示されるギャップはカウントされない。
配列同一性の比率（％）は、同一のアミノ酸残基または核酸塩基が両方の配列に存在する位置の数を求めて一致位置の数を得て、一致位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数で割り、その結果を１００倍して配列同一性の比率（％）を得ることによって計算される。配列同士の比較及び２個の配列間の配列同一率（％）の決定は、オンラインでの使用またはダウンロード用の容易に入手可能なソフトウェアを使用して行うことができる。適当なソフトウェアプログラムは、さまざまな販売元から入手可能であり、タンパク質及びヌクレオチド配列の両方のアライメント用のものがある。配列同一率（％）を決定するための適当なプログラムの１つに、米国政府のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＢＬＡＳＴウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手可能なＢＬＡＳＴパッケージプログラムの一部であるｂｌ２ｓｅｑがある。Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して、２個の配列間の比較を行う。ＢＬＡＳＴＮが核酸配列を比較するために使用されるのに対して、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列を比較するために使用される。他の適当なプログラムとしては、例えば、バイオインフォマティクスプログラムパッケージＥＭＢＯＳＳの一部であり、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）よりｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａにおいてやはり入手可能なＮｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、またはＭａｔｃｈｅｒがある。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド参照配列と整列する単一のポリヌクレオチドまたはポリペプチド標的配列内の異なる領域は、それぞれ、それら自体の配列同一率（％）を有することができる。配列同一率の値（％）は、１０分の１の位に四捨五入される点に留意されたい。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３、及び８０．１４は、８０．１に切り捨てられ、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８、及び８０．１９は８０．２に切り上げられる。また、長さの値は常に整数である点に留意されたい。
当業者であれば、配列同一率（％）を計算するための配列アラインメントの生成が、一次配列データによってのみ行われるバイナリー配列間比較に限定されない点は理解されよう。配列アラインメントは、複数の配列アラインメントから導出することができる。複数の配列アラインメントを生成するための適切なプログラムの１つに、ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇから入手できるＣｌｕｓｔａｌＷ２がある。別の適当なプログラムとして、ｗｗｗ．ｄｒｉｖｅ５．ｃｏｍ／ｍｕｓｃｌｅ／から入手できるＭＵＳＣＬＥがある。あるいはＣｌｕｓｔａｌＷ２及びＭＵＳＣＬＥは、例えば、ＥＢＩから入手することもできる。
配列アラインメントは、配列データを、構造データ（例えば、結晶学的タンパク質構造）、機能的データ（例えば、突然変異の位置）、または系統発生データなどの異種ソースからのデータと統合することによって生成できる点も理解されよう。異種データを統合してマルチプル配列アラインメントを生成する適当なプログラムとしてｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇで入手できるか、あるいは例えばＥＢＩからも入手できるＴ－Ｃｏｆｆｅｅがある。配列同一率（％）を計算するために使用される最終的なアラインメントは、自動または手動のいずれかで精選することができる点も理解されよう。
ポリヌクレオチド変異体は、コーディング領域、非コーディング領域、またはその両方に改変を含むことができる。一態様では、ポリヌクレオチド変異体は、サイレント置換、付加、または欠失を生じるが、コードされるポリペプチドの性質または活性を変化させない改変を含む。別の態様では、ヌクレオチド変異体は、遺伝コードの縮重に起因するサイレント置換によって作製される。他の態様では、５～１０個、１～５個、または１～２個のアミノ酸が任意の組み合わせで置換、削除、または付加されている変異体。ポリヌクレオチド変異体は、例えば、特定の宿主のコドン発現を最適化するため（ヒトｍＲＮＡのコドンを他のもの、例えばＥ．ｃｏｌｉなどの細菌宿主に変更する）など、さまざまな理由で作製することができる。
天然に存在する変異体は「対立遺伝子変異体」と呼ばれ、生物の染色体上の特定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代替形態の１つを指す（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））。これらの対立遺伝子変異体は、ポリヌクレオチド及び／またはポリペプチドレベルのいずれかで異なり得るものであり、本開示に含まれる。あるいは、天然に存在しない変異体は、突然変異誘発技術または直接合成によって生成することもできる。
タンパク質工学及び組換えＤＮＡ技術の既知の方法を使用して、ポリペプチドの特性を改善または改変するための変異体を作製することができる。例えば、生物学的機能を実質的に失うことなく、分泌されたタンパク質のＮ末端またはＣ末端から１つ以上のアミノ酸を欠失させることができる。本明細書に参照によりその全体を援用するＲｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４－２９８８（１９９３）は、３、８、または２７個のアミノ末端のアミノ酸残基を欠失させた後でもヘパリン結合活性を有する変異体ＫＧＦタンパク質を報告している。同様に、インターフェロンγは、このタンパク質のカルボキシ末端から８～１０個のアミノ酸残基を欠失させた後に最大１０倍高い活性を示した。（参照によりその全体を本明細書に援用するＤｏｂｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９－２１６（１９８８））。
さらに、変異体がしばしば天然に存在するタンパク質と同様の生物学的活性を保持していることを示す十分な証拠がある。例えば、Ｇａｙｌｅと共同研究者（本明細書に参照によりその全体を援用するＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６８：２２１０５－２２１１１（１９９３））は、ヒトサイトカインＩＬ－１ａの広範な突然変異分析を行っている。彼らはランダム突然変異誘発を用いて、分子の全長にわたって変異体当たり平均２．５個のアミノ酸の変化を有する３５００種を超える個々のＩＬ－１ａ変異体を作製した。すべての可能なアミノ酸位置で複数の変異を調べた。これらの研究者は、「これら分子のほとんどは、[結合または生物活性]のいずれにもほとんど影響することなく改変できる」ことを発見した。（抄録を参照。）実際、調べた３５００種を超えるヌクレオチド配列のうち、２３種の固有のアミノ酸配列のみが、野生型とは活性が大きく異なるタンパク質を生じた。
上記のように、ポリペプチド変異体には、例えば、修飾ポリペプチドが含まれる。修飾としては、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ－リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミル化、γ－カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカーの形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ＰＥＧ化（本明細書に参照によりその全体を援用するＭｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１６：２７０－７９（２０１０））、タンパク分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、及び、アルギニル化などのタンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡの媒介による付加、及びユビキチン化が挙げられる。いくつかの態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ及び／またはＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙは、任意の便宜の良い位置で改変される。
本明細書で使用するところの「プロデューサー細胞」なる用語は、ＥＶを生成するために使用される細胞を指す。プロデューサー細胞は、インビトロで培養された細胞、またはインビボの細胞であってよい。プロデューサー細胞としては、これらに限定されるものではないが、例えば、ＥＶ、例えば、エクソソーム、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、ＢＪヒト包皮線維芽細胞、ｓ９ｆ細胞、ｆＨＤＦ線維芽細胞、ＡＧＥ．ＨＮ（登録商標）神経前駆細胞、ＣＡＰ（登録商標）羊膜細胞、脂肪組織由来の間葉系幹細胞、及びＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１細胞の生成に有効であることが知られている細胞が挙げられる。特定の態様では、プロデューサー細胞は、抗原提示細胞である。いくつかの態様では、プロデューサー細胞は、細菌細胞である。いくつかの態様では、プロデューサー細胞は、樹状細胞、Ｂ細胞、マスト細胞、マクロファージ、好中球、クッパー・ブロウィッツ細胞、またはこれらの細胞のいずれかに由来する細胞、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの態様では、プロデューサー細胞は、細菌細胞はない。他の態様では、プロデューサー細胞は、抗原提示細胞ではない。
本明細書で使用するところの「関連付けられた」なる用語は、それぞれ、第１の部分、例えばＳＴＩＮＧアゴニスト及び／またはＩＬ－１２部分の、第２の部分、例えば細胞外小胞への封入、または第１の部分、例えばＳＴＩＮＧアゴニスト（及び／またはＩＬ－１２部分）と第２の部分、例えば細胞外小胞との間に形成される共有結合または非共有結合を指す。例えば、いくつかの態様では、足場部分、例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ（例えば、ＰＴＧＦＲＮタンパク質）が、細胞外小胞内または細胞外小胞上に発現され、ＳＴＩＮＧアゴニストが、細胞外小胞の内腔内または外表面上にロードされる。例えば、いくつかの態様では、足場部分、例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ（例えば、ＰＴＧＦＲＮタンパク質）が、細胞外小胞内または細胞外小胞上に発現され、ＩＬ－１２部分が、細胞外小胞の外表面上にロードされる。一態様では、「関連付けられた」なる用語は、共有の非ペプチド結合または非共有結合を意味する。例えば、アミノ酸システインは、第２のシステイン残基上のチオール基とジスルフィド結合を形成するか、または架橋することができるチオール基を含む。共有結合の例としては、これらに限定されるものではないが、ペプチド結合、金属結合、水素結合、ジスルフィド結合、シグマ結合、パイ結合、デルタ結合、グリコシド結合、アグノスティック結合（ａｇｎｏｓｔｉｃ ｂｏｎｄ）、曲がった結合（ｂｅｎｔ ｂｏｎｄ）、双極子結合、パイバックボンド（Ｐｉ ｂａｃｋｂｏｎｄ）、二重結合、三重結合、四重結合、五重結合、六重結合、共役、超共役、芳香族性、ハプト数、または反結合が挙げられる。非共有結合の非限定的な例としては、イオン結合（例えば、カチオン－パイ結合または塩結合）、金属結合、水素結合（例えば、二水素結合、二水素錯体、低バリア水素結合、または対称水素結合）、ファンデルワールス力（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａｌｌｓ ｆｏｒｃｅ）、ロンドン分散力、機械的結合、ハロゲン結合、オーロフィリシティー（ａｕｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ）、インターカレーション、スタッキング、エントロピー力、または化学的極性が挙げられる。他の態様では、「関連付けられた」なる用語は、第１の部分、例えば、細胞外小胞が、第２の部分、例えば、ＳＴＩＮＧアゴニスト及び／またはＩＬ－１２部分を封入することを意味する。いくつかの態様では、第１の部分と第２の部分とは互いに連結することができる。他の態様では、第１の部分と第２の部分とは、互いに物理的及び／または化学的に連結されない。
本明細書で使用される場合、「～に連結される」または「～と結合される」なる用語は、互換的に使用され、第１の部分と第２の部分、例えばそれぞれ、ＳＴＩＮＧアゴニストと細胞外小胞、及び／またはＩＬ－１２部分と細胞外小胞との間に形成される共有または非共有結合を指す。いくつかの態様では、足場部分は、細胞外小胞内または細胞外小胞上で発現され（例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ（例えば、ＰＴＧＦＲＮタンパク質））、ＩＬ－１２部分は、細胞外小胞の表面に露出されたＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘタンパク質（例えば、ＰＴＧＦＲＮタンパク質）の部分に連結または結合される（例えば、「表面に提示されたＩＬ－１２」）。いくつかの態様では、足場部分は、細胞外小胞内または細胞外小胞上で発現され（例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ（例えば、ＰＴＧＦＲＮタンパク質））、ＳＴＩＮＧアゴニスト及び／またはＩＬ－１２部分は、細胞外小胞の内腔に露出されたＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘタンパク質（例えば、ＰＴＧＦＲＮタンパク質）の部分に連結または結合される。
本明細書で使用するところの「ロードされた」なる用語、またはこの用語の文法的に異なる語形（例えば、ロード（ｌｏａｄ）またはロードされる（ｌｏａｄｅｄ））は、第１の部分（例えば、ＳＴＩＮＧアゴニスト及び／またはＩＬ－１２部分）が第２の部分（例えば、ＥＶ、例えば、エクソソーム）に関連付けられた状態またはプロセスを指す。いくつかの態様では、第１の部分は、第２の部分と化学的または物理的に連結される。いくつかの態様では、第１の部分は、第２の部分と化学的または物理的に連結されない。いくつかの態様では、第１の部分は、第２の部分内、例えばＥＶ（例えば、エクソソーム）の内腔内に存在し、例えば、「封入される」。いくつかの態様では、第１の部分は、第２の部分の外表面に関連付けられ、例えば、ＥＶ（例えば、エクソソーム）の表面に連結または結合され、例えば、第２の部分の「表面に提示される」。
「封入された」なる用語、またはこの用語の文法的に異なる語形（例えば、封入、または封入すること）は、第１の部分（例えば、ＳＴＩＮＧアゴニスト及び／またはＩＬ－１２部分）が第２の部分（例えば、ＥＶ、例えば、エクソソーム）の内部にあり、２つの部分が化学的または物理的に連結されていない状態またはプロセスを指す。いくつかの態様では、「封入された」なる用語は、「の内腔内」と互換的に使用される場合がある。第１の部分（例えば、ＳＴＩＮＧアゴニスト及び／またはＩＬ－１２部分）を第２の部分（例えば、ＥＶ、例えば、エクソソーム）内に封入する非限定的な例は、本明細書の他の箇所で開示されている。
本明細書で使用するところの「単離する」、「単離された」、及び「単離すること」または「精製する」、「精製された」、及び「精製すること」、ならびに「抽出された」及び「抽出すること」なる用語は互換的に使用され、１つ以上の精製プロセス、例えば、所望のＥＶ調製物の選択または濃縮が行われた、所望のＥＶの調製（例えば、複数の既知または未知量及び／または濃度）の状態を指す。いくつかの態様では、本明細書で使用するところの、単離することまたは精製すること、とは、プロデューサー細胞を含有する試料からＥＶを除去、部分的に除去する（例えば、画分）プロセスである。いくつかの態様では、単離されたＥＶ組成物は検出可能な望ましくない活性を有さないか、あるいは、望ましくない活性のレベルまたは量が、許容されるレベルまたは量以下である。他の態様では、単離されたＥＶ組成物は、許容される量及び／または濃度以上の所望のＥＶの量及び／または濃度を有する。他の態様では、単離されたＥＶ組成物は、組成物が得られる出発材料（例えば、プロデューサー細胞調製物）と比較して濃縮されている。この濃縮は、出発材料と比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％、９９．９９９９％、または９９．９９９９％超であってよい。いくつかの態様では、単離されたＥＶ調製物は、残留する生物学的産物を実質的に含まない。いくつかの態様では、単離されたＥＶ調製物は、いかなる夾雑する生物物質も１００％含まないか、９９％含まないか、９８％含まないか、９７％含まないか、９６％含まないか、９５％含まないか、９４％含まないか、９３％含まないか、９２％含まないか、９１％含まないか、または９０％含まない。残留する生物学的産物は、非生物物質（化学物質を含む）もしくは不要な核酸、タンパク質、脂質、または代謝産物を含み得る。残留する生物学的産物を実質的に含まない、とは、ＥＶ組成物が検出可能なプロデューサー細胞を含有せず、ＥＶのみが検出可能であることを意味する場合もある。
本明細書で使用するところの「アゴニスト」なる用語は、受容体に結合し、受容体を活性化して生物学的応答を生じる分子を指す。受容体は、内因性アゴニストまたは外因性アゴニストのいずれかによって活性化され得る。内因性アゴニストの非限定的な例としては、ホルモン、神経伝達物質、及び環状ジヌクレオチドが挙げられる。外因性アゴニストの非限定的な例としては、薬物、小分子、及び環状ジヌクレオチドが挙げられる。アゴニストは、完全、部分、またはインバースアゴニストであってよい。
本明細書で使用するところの「アンタゴニスト」なる用語は、受容体に結合すると、それ自体が生物学的応答を誘発するのではなく、アゴニスト媒介性応答を遮断または抑制する分子を指す。多くのアンタゴニストは、受容体上の構造的に規定された結合部位において内因性リガンドまたは基質と競合することによってその効力を示す。アンタゴニストの非限定的な例としては、アルファ遮断薬、ベータ遮断薬、及びカルシウムチャネル遮断薬が含まれる。アンタゴニストは、競合的、非競合的、または不競合的アンタゴニストであってよい。
本明細書で使用するところの「遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト」または「遊離ＩＬ－１２部分」なる用語は、細胞外小胞に関連付けられていないＳＴＩＮＧアゴニストまたはＩＬ－１２部分を意味するが、それ以外の点では細胞外小胞に関連付けられたＳＴＩＮＧアゴニストまたはＩＬ－１２部分と同じである。特に、ＳＴＩＮＧアゴニストまたはＩＬ－１２部分に関連付けられた細胞外小胞と比較した場合、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストまたは遊離ＩＬ－１２部分は、細胞外小胞と関連付けられた同じＳＴＩＮＧアゴニストまたはＩＬ－１２部分である。いくつかの態様では、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストをその有効性、毒性、及び／または他の任意の特性についてＳＴＩＮＧアゴニストを含む細胞外小胞と比較した場合、細胞外小胞に関連付けられたＳＴＩＮＧアゴニストと比較した遊離ＳＴＩＮＧアゴニストの量は、ＥＶに関連付けられたＳＴＩＮＧアゴニストの量と同じである。いくつかの態様では、遊離ＩＬ－１２部分をその有効性、毒性、及び／または他の任意の特性についてＩＬ－１２部分を含む細胞外小胞と比較した場合、細胞外小胞に関連付けられたＩＬ－１２部分と比較した遊離ＩＬ－１２部分の量は、ＥＶに関連付けられたＩＬ－１２部分の量と同じである。
本明細書で使用するところの「ｅｘｏＳＴＩＮＧ」なる用語は、ＳＴＩＮＧアゴニストがロードされたエクソソームを指す。いくつかの態様では、エクソソームは、エクソソームの内腔内にＳＴＩＮＧアゴニストを含む。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、エクソソームの内腔表面、例えば、足場タンパク質、例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ、例えば、ＰＴＧＦＲＮと関連付けられる。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、エクソソームの内腔内に封入され、足場タンパク質には関連付けられない。いくつかの態様では、エクソソームは、エクソソームの表面上にＳＴＩＮＧアゴニストを含む。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、エクソソームの外表面に関連付けられる。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、エクソソームの外表面に連結または結合される。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、表面に露出された足場タンパク質、例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘタンパク質、例えば、ＰＴＧＦＲＮタンパク質に連結または結合される。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、エクソソームの脂質二重層に連結または結合される。
本明細書で使用するところの「ｅｘｏＩＬ－１２」なる用語は、ＩＬ－１２部分、例えば、ＩＬ－１２タンパク質またはそのフラグメントがロードされたエクソソームを指す。いくつかの態様では、ＩＬ－１２部分は、エクソソームの外表面に関連付けられる（例えば、ＩＬ－１２部分の表面提示）。ＩＬ－１２部分を含むエクソソームの非限定的な例は、例えば、本明細書に参照によりその全体をそれぞれ援用するところの米国特許第１０，７２３，７８２号及び国際公開第ＷＯ２０１９／１３３９３４Ａ２号にみることができる。いくつかの態様では、ＩＬ－１２部分は、エクソソームの外表面に連結または結合される。いくつかの態様では、ＩＬ－１２部分は、表面に露出された足場タンパク質、例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘタンパク質、例えば、ＰＴＧＦＲＮタンパク質に連結または結合される。いくつかの態様では、ＩＬ－１２部分は、エクソソームの脂質二重層に連結または結合される。いくつかの態様では、エクソソームは、エクソソームの内腔内にＩＬ－１２部分を含む。いくつかの態様では、ＩＬ－１２部分は、エクソソームの内腔表面、例えば、足場タンパク質、例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ、例えば、ＰＴＧＦＲＮと関連付けられる。いくつかの態様では、ＩＬ－１２部分は、エクソソームの内腔内に封入され、足場タンパク質には関連付けられない。
本明細書で使用するところの「リガンド」なる用語は、受容体に結合し、受容体を調節して生物学的応答を生じる分子を指す。調節は、受容体によって媒介される生物学的応答の活性化、非活性化、遮断、または減衰であり得る。受容体は、内因性または外因リガンドのいずれかによって調節され得る。内因性リガンドの非限定的な例としては、抗体及びペプチドが挙げられる。外因性アゴニストの非限定的な例としては、薬物、小分子、及び環状ジヌクレオチドが挙げられる。リガンドは、完全、部分、またはインバースリガンドであってよい。
本明細書で使用するところの「抗体」なる用語は、天然であるかまたは部分的もしくは全体的に合成されたものであるかによらず免疫グロブリン、及びそのフラグメントを包含する。この用語はまた、免疫グロブリン結合ドメインに相同である結合ドメインを有するあらゆるタンパク質を網羅する。「抗体」は、抗原に特異的に結合して認識する免疫グロブリン遺伝子またはそのフラグメントからのフレームワーク領域を含むポリペプチドをさらに含む。抗体なる用語の使用は、全抗体、ポリクローナル、モノクローナル及び組換え抗体、それらのフラグメントを含むことを意図し、一本鎖抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ、マウス－ヒト、マウス－霊長類、霊長類－ヒトモノクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、及びＦｄフラグメントのような抗体フラグメント、ダイアボディ、及び抗体関連ポリペプチドをさらに含む。抗体は、所望の生物学的活性または機能を有するものである限り、二重特異性抗体及び多重特異性抗体を含む。
本明細書で使用するところの「治療有効量」なる用語は、所望の治療効果、薬理学的及び／または生理学的効果をそれを必要とする対象に対して生じるうえで十分な試薬または医薬化合物の量である。予防は治療とみなすことができるため、治療有効量とは「予防有効量」でもあり得る。
本明細書で使用するところの「医薬組成物」なる用語は、例えば、薬学的に許容される担体及び賦形剤のような１つ以上の他の化学成分と混合もしくは混ぜ合わされるかまたはそれに懸濁されたＥＶなどの、本明細書に記載される１つ以上の化合物を指す。医薬組成物の目的の１つは、ＥＶの調製物の対象への投与を促進することである。「賦形剤」または「担体」なる用語は、化合物の投与をさらに促進するために医薬組成物に添加される不活性物質のことを指す。「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容される賦形剤」なる用語及びそれらの文法的な変化形は、ヒトを含む動物での使用について米国連邦政府の規制機関によって承認されているかまたは米国薬局方に記載されている薬剤のいずれか、ならびに、対象への組成物の投与が禁止される程の望ましくない生理学的作用の発生を引き起こさず、また、投与された化合物の生物学的活性及び特性を無効化しない任意の担体または希釈剤を包含する。医薬組成物を調製するのに有用であり、一般に安全で、非毒性であり、望ましい賦形剤及び担体が含まれる。
本明細書で使用するところの「ペイロード」なる用語は、ＥＶと接触される標的（例えば、標的細胞）に作用する治療剤を指す。エクソソーム及び／またはプロデューサー細胞に導入することができるペイロードには、ヌクレオチド（例えば、検出可能な部分もしくは毒素を含む、または転写を妨げるヌクレオチド）、核酸（例えば、酵素などのポリペプチドをコードするＤＮＡもしくはｍＲＮＡ分子、またはｍｉＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、及びｓｉＲＮＡのような制御機能を有するＲＮＡ分子）、アミノ酸（例えば、検出可能な部分もしくは毒素を含む、または翻訳を妨げるアミノ酸）、ポリペプチド（例えば、酵素）、脂質、炭水化物、及び小分子（例えば、小分子薬及び毒素）などの治療剤が含まれる。
「投与」、「投与すること」なる用語、及びそれらの変化形は、ＥＶなどの組成物または薬剤を対象に導入することを指し、組成物または薬剤の同時及び順次の導入を含む。対象への組成物または薬剤の導入は、腫瘍内、経口、肺内、鼻腔内、非経口的（静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下）、直腸内、リンパ管内、くも膜下腔内、眼周囲、または局所的を含む任意の適当な経路による。投与は、自己投与及び他者による投与を含む。適当な投与経路によって、組成物または薬剤はその目的とする機能を実行することができる。例えば、適当な経路が静脈内である場合、組成物は、組成物または薬剤を対象の静脈内に導入することによって投与される。
本明細書で使用するところの「治療する」、「治療」または「治療すること」なる用語は、例えば、疾患または状態の重症度の減少、疾患経過の期間の短縮、疾患または状態に関連する１つ以上の症状の改善または消失、疾患または状態を必ずしも治癒しなくとも疾患または状態を有する対象に有益な効果をもたらすことを指す。この用語には、疾患もしくは状態またはその症状の予防または防止も含まれる。一態様では、「治療する」または「治療」なる用語は、対象において抗原に対する免疫応答を誘導することを意味する。
本明細書で使用するところの「防止する」または「防止すること」なる用語は、特定の転帰の発生または重症度を減少または低減することを指す。いくつかの態様では、転帰の予防は、予防的治療によって実現される。
本明細書で使用される場合、「調節する」、「調節すること」、「改変する」及び／または「調節因子」なる用語は、一般に、例えば、アンタゴニストまたはアゴニストとして作用するために、特定の濃度、レベル、発現、機能または挙動を増加または減少させる、例えば、直接的または間接的に促進／刺激／アップレギュレートまたは干渉／阻害／ダウンレギュレートすることによって変化させる能力を指す。いくつかの例では、調節因子は、コントロールに対して、または一般に予想される活性の平均的レベルに対して、または活性のコントロールレベルに対して、特定の濃度、レベル、活性または機能を増加及び／または減少させることができる。
本明細書で使用するところの「哺乳動物対象」には、これらに限定されるものではないが、ヒト、家庭用動物（例えば、イヌ、ネコなど）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）及び実験動物（例えば、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモットなど）を含むすべての哺乳動物が含まれる。
「個体」「対象」「宿主」及び「患者」なる用語は、本明細書では互換的に使用され、診断、処置または治療が望ましいあらゆる哺乳動物対象、特にヒトを指す。本明細書に記載される方法は、ヒトの治療及び獣医学的用途の両方に適用可能である。いくつかの態様では、対象は哺乳動物であり、他の態様では、対象はヒトである。
本明細書で使用するところの「実質的に含まない」なる用語は、ＥＶを含む試料が、質量／体積（ｍ／ｖ）濃度比率で１０％未満のマクロ分子しか含まないことを意味する。一部の画分は、０．００１（ｍ／ｖ）％未満、０．０１（ｍ／ｖ）％未満、０．０５（ｍ／ｖ）％未満、０．１（ｍ／ｖ）％未満、０．２％未満、０．３未満（ｍ／ｖ）％未満、０．４（ｍ／ｖ）％未満、０．５（ｍ／ｖ）％未満、０．６（ｍ／ｖ）％未満、０．７（ｍ／ｖ）％未満、０．８（ｍ／ｖ）％未満、０．９（ｍ／ｖ）％未満、１（ｍ／ｖ）％未満、２（ｍ／ｖ）％未満、３（ｍ／ｖ）％未満、４（ｍ／ｖ）％未満、５（ｍ／ｖ）％未満、６（ｍ／ｖ）％未満、７（ｍ／ｖ）％未満、８（ｍ／ｖ）％未満、９（ｍ／ｖ）％未満、または１０（ｍ／ｖ）％未満のマクロ分子を含有してもよい。
本明細書で使用するところの「マクロ分子」なる用語は、核酸、外因性タンパク質、脂質、炭水化物、代謝産物、またはそれらの組み合わせを意味する。
本明細書で使用するところの「わずかな」、「低下した」、または「無視できる」なる用語は、対象のベースライン炎症応答と比較した、または遊離ＳＴＩＮＧアゴニストの投与に対する対象の炎症応答と比較した、ＳＴＩＮＧアゴニストを封入したＥＶを含む試料の投与後の対象における炎症応答の存在、レベル、または量を指す。例えば、全身性炎症の無視できるまたはわずかな存在、レベルまたは量とは、対象のベースライン炎症と比較して、または遊離ＳＴＩＮＧアゴニストの投与に対する対象の免疫応答と比較して、０．００１％未満、０．０１％未満、０．１％未満、０．２％未満、０．３％未満、０．４％未満、０．５％未満、０．６％未満、０．７％未満、０．８％未満、０．９％未満、１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、６％未満、７％未満、８％未満、９％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、１７％未満、２０％未満、または２５％未満の全身性炎症であり得る。全身性炎症のレベルまたは量は、ベースラインと比較して、または遊離ＳＴＩＮＧアゴニストの投与に対する炎症応答と比較して、０．１倍未満、０．５倍未満、０．５倍未満、１倍未満、１．５倍未満、２倍未満であり得る。
本明細書で使用するところの「原発腫瘍」とは、腫瘍が増殖を開始した対象内の場所の元の、または最初の腫瘍を指す。原発腫瘍は、例えば原発腫瘍内の細胞の転移による原発腫瘍の場所以外の場所での原発腫瘍の増殖の開始後に発生する腫瘍を指す「二次腫瘍」とは対照的に使用される。
本明細書に記載される範囲は、記載される端点を含むその範囲内のすべての値の簡略的な表記であるものとして理解される。例えば、１～５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、及び５０からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、または部分範囲を含むものとして理解される。
特に明記しない限り、１つ以上の立体中心を有する化合物について言及する場合、そのそれぞれの立体異性体及びその立体異性体のすべての組み合わせを意味する。
ＩＩ．治療方法
本開示の特定の態様は、疾患または状態、例えば腫瘍の治療を必要とする対象の疾患または状態、例えば腫瘍を治療する方法であって、（ｉ）細胞外小胞（ＥＶ）とインターフェロン遺伝子タンパク質の刺激因子（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇｅｎｅｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＳＴＩＮＧ）アゴニストとを含む組成物と、（ｉｉ）インターロイキン１２（ＩＬ－１２）部分と、を併用して投与することを含む、方法に関する。いくつかの態様では、ＩＬ－１２部分は、ＥＶに関連付けられる。いくつかの態様では、ＩＬ－１２部分は、第２のＥＶに関連付けられる。いくつかの態様では、本方法は、（ｉ）第１のＥＶとＳＴＩＮＧアゴニストとを含む組成物と、（ｉｉ）ＩＬ－１２部分に関連付けられた第２のＥＶと、を投与することを含む。いくつかの態様では、ＩＬ－１２部分は、ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶに関連付けられる（例えば、ＩＬ－１２及びＳＴＩＮＧアゴニストがＥＶに関連付けられる）。いくつかの態様では、本方法は、（ｉ）ＥＶとＳＴＩＮＧアゴニストとを含む組成物を投与することを含み、ＥＶはＩＬ－１２部分に関連付けられる。いくつかの態様では、ＥＶは、ＳＴＩＮＧアゴニストに関連付けられる。
いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ＥＶに関連付けられる。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ＥＶの内腔内にロードされる。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ＥＶに関連付けられない。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ナノ粒子内にロードされる。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、脂質ナノ粒子、リポソーム、高分子ミセル、デンドリマー、キトサンナノ粒子、アルギン酸塩ナノ粒子、キサンタンガムベースのナノ粒子、セルロースナノ結晶、無機ナノ粒子（例えば、銀、金、酸化鉄、及びシリカナノ粒子）、ナノ結晶、金属ナノ粒子、量子ドット、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるナノ粒子にロードされる。
いくつかの態様では、本方法によって治療可能な腫瘍は、原発腫瘍、二次腫瘍、または原発腫瘍及び二次腫瘍の両方である。いくつかの態様では、投与することは、腫瘍の体積を減少させる。いくつかの態様では、投与することは、ＳＴＩＮＧアゴニストまたはＩＬ－１２部分を含む細胞外小胞のいずれかを投与した（「単剤療法」）後の腫瘍体積と比較して、腫瘍の体積を、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍、減少させる。
いくつかの態様では、投与することは、原発腫瘍の体積を減少させる。いくつかの態様では、投与することは、投与することの１４日目後に、単剤療法と比較して、原発腫瘍の体積を、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍、減少させることができる。
いくつかの態様では、投与することは、原発腫瘍の腫瘍増殖速度を減少させる。いくつかの態様では、投与することは、投与することの１４日目後に、単剤療法と比較して、原発腫瘍の増殖速度を、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍、減少させることができる。いくつかの態様では、投与することは、原発腫瘍の増殖を低下または停止させることができる。
前記投与することが、二次腫瘍の体積を減少させる、請求項４～８のいずれか１項に記載の方法。いくつかの態様では、投与することは、投与することの１４日目後に、単剤療法と比較して、二次腫瘍の体積を、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍、減少させることができる。
いくつかの態様では、投与することは、二次腫瘍の腫瘍増殖速度を減少させる。いくつかの態様では、投与することは、投与することの１４日目後に、単剤療法と比較して、二次腫瘍の増殖速度を、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍、減少させることができる。いくつかの態様では、投与することは、二次腫瘍の増殖を低下または停止させることができる。
本開示の他の態様は、疾患または状態、例えば腫瘍の治療を必要とする対象の疾患または状態、例えば腫瘍を治療する方法であって、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）部分を含む細胞外小胞（ＥＶ）を投与することを含み、ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶを投与することを含まない、方法に関する。
いくつかの態様では、方法は、抗がん剤をさらに含む。いくつかの態様では、抗がん剤は、チェックポイント阻害剤を含む。いくつかの態様では、チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、またはそれらの任意の組み合わせを含む。特定の態様では、チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－１抗体である。
ＩＩＩ．組成物（細胞外小胞）
本開示の特定の態様は、ＳＴＩＮＧアゴニスト及び／またはＩＬ－１２部分を含む細胞外小胞（ＥＶ）に関する。特定の態様では、ＥＶは、ＳＴＩＮＧアゴニストを含む。いくつかの態様では、ＥＶは、ＩＬ－１２部分を含む。特定の態様では、ＥＶは、ＳＴＩＮＧアゴニスト及びＩＬ－１２部分を含む。
本開示のいくつかの態様は、第１のＥＶ（例えば、エクソソーム）及び第２のＥＶ（例えば、エクソソーム）を含む組成物であって、第１のＥＶ（例えば、エクソソーム）がＳＴＩＮＧアゴニストを含み（例えば、ＳＴＩＮＧアゴニストがロードされる）、第２のＥＶ（例えば、エクソソーム）がＩＬ－１２部分を含む（例えば、ＩＬ－１２部分がロードされる）、組成物に関する。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、第１のＥＶ（例えば、エクソソーム）によって封入される。いくつかの態様では、ＩＬ－１２部分は、第２のＥＶ（例えば、エクソソーム）の外表面に関連付けられる。いくつかの態様では、第２のＥＶ（例えば、エクソソーム）は、表面に露出されたＩＬ－１２を含む。
いくつかの態様では、ＥＶは、エクソソーム、ナノ小胞、アポトーシス小体、マイクロベシクル、リソソーム、エンドソーム、リポソーム、脂質ナノ粒子、ミセル、多層構造、再小胞化された小胞、または押し出された細胞である。特定の態様では、ＥＶはエクソソームである。
ＩＩＩ．Ａ．ＳＴＩＮＧアゴニスト
自然免疫システムは、免疫応答を誘発するパターン認識受容体（ＰＲＲ）を介して病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を認識する。ＰＲＲは、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡならびにＤＮＡをはじめとするさまざまな病原体分子を認識する。レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）様受容体（ＲＬＲ）及び一部のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）などのＰＲＲは、ＲＮＡリガンドを認識する。ＤＮＡリガンドは、サイクリックＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）、ＡＩＭ２、及びその他のＴＬＲによって認識される。ＴＬＲ、ＲＬＲ、及びＡＩＭ２が他のシグナルカスケードアダプタータンパク質と直接相互作用して転写因子を活性化するのに対して、ｃＧＡＳは、インターフェロン遺伝子（ＳＴＩＮＧ）受容体の刺激物質を活性化する環状ジヌクレオチド分子であるｃＧＡＭＰを生成する。ＳＴＩＮＧとＲＬＲはどちらも、転写因子ＩＲＦ３とＮＦ－κＢの活性化を誘導するアダプターキナーゼＴＢＫ１を活性化し、Ｉ型ＩＦＮ及び炎症性サイトカインの産生をもたらす。
環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）は、分子ｃ－ｄｉ－ＧＭＰにおけるような２個の３’，５’ホスホジエステル結合を特徴とする細菌のシグナル伝達分子として最初に同定された。ＳＴＩＮＧは細菌のＣＤＮによって活性化され得るが、哺乳動物細胞における自然免疫応答は、ｃＧＡＳによって生成されるＣＤＮシグナル伝達分子ｃＧＡＭＰによっても媒介される。ｃＧＡＭＰは、混合型の２’，５’及び３’，５’ホスホジエステル結合を特徴としている。細菌及び哺乳動物ＣＤＮはいずれも、直接ＳＴＩＮＧと相互作用して、ＩＦＮα及びＩＦＮ－βなどのＩ型ＩＦＮの産生をもたらす炎症促進性シグナル伝達カスケードを誘導する。
本開示で使用されるＳＴＩＮＧアゴニストは、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）または非環状ジヌクレオチドアゴニストとすることができる。これらに限定されるものではないが、ｃＧＭＰ、環状ｄｉ－ＧＭＰ（ｃ－ｄｉ－ＧＭＰ）、ｃＡＭＰ、環状ｄｉ－ＡＭＰ（ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ）、環状－ＧＭＰ－ＡＭＰ（ｃＧＡＭＰ）、環状ｄｉ－ＩＭＰ（ｃ－ｄｉ－ＩＭＰ）、環状ＡＭＰ－ＩＭＰ（ｃＡＩＭＰ）などの環状プリンジヌクレオチド、及びそれらの任意の類似体は、患者の免疫または炎症反応を刺激または増強することが知られている。ＣＤＮは、環状ジヌクレオチド同士を結合する２’２’、２’３’、２’５’、３’３’、もしくは３’５’結合、またはそれらの任意の組み合わせを有する場合がある。
環状プリンジヌクレオチドは、標準的な有機化学技術によって修飾することでプリンジヌクレオチドの類似体を生成することができる。適当なプリンジヌクレオチドとしては、これらに限定されるものではないが、アデニン、グアニン、イノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、イソグアニン、または当該技術分野では周知の他の任意の適切なプリンジヌクレオチドが挙げられる。環状ジヌクレオチドは修飾された類似体であってもよい。これらに限定されるものではないが、ホスホロチオエート、ビホスホロチオエート、フルオリネート、及びジフルオリネート修飾を含む、当該技術分野では周知の任意の適切な修飾を使用することができる。
５，６－ジメチルキサンテノン－４－酢酸（ＤＭＸＡＡ）、または当該技術分野では周知の他の任意の非環状ジヌクレオチドアゴニストなどの非環状ジヌクレオチドアゴニストも使用することができる。
任意のＳＴＩＮＧアゴニストを使用することができることが企図される。ＳＴＩＮＧアゴニストには、ＤＭＸＡＡ、ＳＴＩＮＧアゴニスト－１、ＭＬ ＲＲ－Ｓ２ ＣＤＡ、ＭＬ ＲＲ－Ｓ２ｃ－ｄｉ－ＧＭＰ、ＭＬ－ＲＲ－Ｓ２ ｃＧＡＭＰ、２’３’－ｃ－ｄｉ－ＡＭ（ＰＳ）２、２’３’－ｃＧＡＭＰ、２’３’－ｃＧＡＭＰｄＦＨＳ、３’３’－ｃＧＡＭＰ、３’３’－ｃＧＡＭＰｄＦＳＨ、ｃＡＩＭＰ、ｃＡＩＭ（ＰＳ）２、３’３’－ｃＡＩＭＰ、３’３’－ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、２’２’－ｃＧＡＭＰ、２’３’－ｃＧＡＭ（ＰＳ）２、３’３’－ｃＧＡＭＰ、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ、２’３’－ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ、２’３’－ｃ－ｄｉ－ＡＭ（ＰＳ）２、ｃ－ｄｉ－ＧＭＰ、２’３’－ｃ－ｄｉ－ＧＭＰ、ｃ－ｄｉ－ＩＭＰ、ｃ－ｄｉ－ＵＭＰ、またはそれらの任意の組み合わせがある。好ましい態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、３’３’－ｃＡＩＭＰｄＦＳＨであり、代替的に３～３ｃＡＩＭＰｄＦＳＨとも呼ばれる。当該技術分野では周知のさらなるＳＴＩＮＧアゴニストも使用することが可能である。
他の態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、下式を有する化合物を含む。
Figure 2022551420000006
 式中、
Ｘ１は、Ｈ、ＯＨ、またはＦであり、
Ｘ２は、Ｈ、ＯＨ、またはＦであり、
Ｚは、ＯＨ、ＯＲ１、ＳＨまたはＳＲ１であり、式中、
ｉ）Ｒ１は、ＮａまたはＮＨ４であるか、または
ｉｉ）Ｒ１は、ピバロイルオキシメチルなどのインビボでＯＨまたはＳＨを与える酵素不安定基であり、
Ｂｉ及びＢ２は、以下から選択される塩基であり、
Figure 2022551420000007
 ただし、
－式（Ｉ）において：Ｘ１及びＸ２はＯＨではなく、
－式（ＩＩ）において：Ｘ１及びＸ２がＯＨである場合、Ｂ１はアデニンではなく、Ｂ２はグアニンではなく、かつ、
－式（ＩＩＩ）において：Ｘ１及びＸ２がＯＨである場合、Ｂ１はアデニンではなく、Ｂ２はグアニンではなく、ＺはＯＨではない。本明細書に参照によりその内容の全体を援用するＷＯ２０１６／０９６１７４号を参照されたい。
いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、以下、
Figure 2022551420000008
Figure 2022551420000009
 その薬学的に許容される塩を含む。ＷＯ２０１６／０９６１７４Ａ１を参照。
いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、下式を有する化合物を含む。


Figure 2022551420000010
Figure 2022551420000011
 または任意のその薬学的に許容される塩。
いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、下式を有する化合物を含む。
Figure 2022551420000012
 式中、各記号は、本明細書に参照によりその全内容を援用するＷＯ２０１４／０９３９３６に定義されている。
いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、下式を有する化合物を含む。
Figure 2022551420000013
 式中、各記号は、本明細書に参照によりその全内容を援用するＷＯ２０１４／１８９８０５に定義されている。
いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、下式を有する化合物を含む。
Figure 2022551420000014
 式中、各記号は、本明細書に参照によりその全内容を援用するＷＯ２０１５／０７７３５４に定義されている。Ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ １１，１０１８－１０３０（２０１５）も参照されたい。
いくつかの態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、本明細書に参照によりそれらの全体を援用するＷＯ２０１３／１８５０５２及びＳｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２８３，２８３ｒａ５２（２０１５）に記載される、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ、ｃ－ｄｉ－ＧＭＰ、ｃ－ｄｉ－ＩＭＰ、ｃ－ＡＭＰ－ＧＭＰ、ｃ－ＡＭＰ－ＩＭＰ、及びｃ－ＧＭＰ－ＩＭＰを含む。
いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、下式を有する化合物を含む。
Figure 2022551420000015
 式中、各記号は、本明細書に参照によりその全内容を援用するＷＯ２０１４／１８９８０６に定義されている。
いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、下式を有する化合物を含む。
Figure 2022551420000016
 式中、各記号は、本明細書に参照によりその全内容を援用するＷＯ２０１５／１８５５６５に定義されている。
いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、下式を有する化合物を含む。
Figure 2022551420000017
 式中、各記号は、本明細書に参照によりその全内容を援用するＷＯ２０１４／１７９７６０に定義されている。
いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、下式を有する化合物を含む。
Figure 2022551420000018
 式中、各記号は、本明細書に参照によりその全内容を援用するＷＯ２０１４／１７９３３５に定義されている。
いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、下式を有する化合物を含む。
Figure 2022551420000019
 これは、本明細書に参照によりその全内容を援用するＷＯ２０１５／０１７６５２に定義されている。
いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、下式を有する化合物を含む。
Figure 2022551420000020
 これは、本明細書に参照によりその全内容を援用するＷＯ２０１６／０９６５７７に定義されている。
いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、下式を有する化合物を含む。

Figure 2022551420000021
 式中、各記号は、本明細書に参照によりその全内容を援用するＷＯ２０１６／１２０３０５に定義されている。
いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、下式を有する化合物を含む。
Figure 2022551420000022
 式中、各記号は、本明細書に参照によりその全内容を援用するＷＯ２０１６／１４５１０２に定義されている。
いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、下式を有する化合物を含む。
Figure 2022551420000023
 式中、各記号は、本明細書に参照によりその全内容を援用するＷＯ２０１７／０２７６４６に定義されている。
いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、下式を有する化合物を含む。
Figure 2022551420000024
 式中、各記号は、本明細書に参照によりその全内容を援用するＷＯ２０１７／０７５４７７に定義されている。
いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、下式を有する化合物を含む。
Figure 2022551420000025
 式中、各記号は、本明細書に参照によりその全内容を援用するＷＯ２０１７／０２７６４５に定義されている。
いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、下式を有する化合物を含む。
Figure 2022551420000026
 式中、各記号は、本明細書に参照によりその全内容を援用するＷＯ２０１８／１００５５８に定義されている。
いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、下式を有する化合物を含む。


Figure 2022551420000027
 式中、各記号は、本明細書に参照によりその全内容を援用するＷＯ２０１７／１７５１４７に定義されている。
いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、下式を有する化合物を含む。
Figure 2022551420000028
 式中、各記号は、本明細書に参照によりその全内容を援用するＷＯ２０１７／１７５１５６に定義されている。
いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６０６、ＣＬ６１１、ＣＬ６０２、ＣＬ６５５、ＣＬ６０４、ＣＬ６０９、ＣＬ６１４、ＣＬ６５６、ＣＬ６４７、ＣＬ６２６、ＣＬ６２９、ＣＬ６０３、ＣＬ６３２、ＣＬ６３３、ＣＬ６５９、またはその薬学的に許容される塩である。いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６０６またはその薬学的に許容される塩である。いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６１１またはその薬学的に許容される塩である。いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６０２またはその薬学的に許容される塩である。いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６５５またはその薬学的に許容される塩である。いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６０４またはその薬学的に許容される塩である。いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６０９またはその薬学的に許容される塩である。いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６１４またはその薬学的に許容される塩である。いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６５６またはその薬学的に許容される塩である。いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６４７またはその薬学的に許容される塩である。いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６２６またはその薬学的に許容される塩である。いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６２９またはその薬学的に許容される塩である。いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６０３またはその薬学的に許容される塩である。いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６３２またはその薬学的に許容される塩である。いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６３３またはその薬学的に許容される塩である。いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６５９またはその薬学的に許容される塩である。
いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは、環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニスト及び／または非環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストを含む。いくつかの態様では、いくつかの環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストが、本明細書に開示されるＥＶ、例えば、エクソソーム上に存在する場合、かかるＳＴＩＮＧアゴニストは同じであってもよく、または異なってもよい。いくつかの態様では、いくつかの非環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストが存在する場合、かかるＳＴＩＮＧアゴニストは同じであってもよく、または異なってもよい。いくつかの態様では、本開示のＥＶ、例えば、エクソソーム、組成物は、ＥＶ、例えば、エクソソームの２つ以上の集団を含むことができ、ＥＶ、例えば、エクソソームの各集団は、異なるＳＴＩＮＧアゴニストまたはそれらの組み合わせを含む。
ＳＴＩＮＧアゴニストはまた、細胞外小胞またはＥＶ（例えば、内腔内に結合していない）中へアゴニストの封入を増加させるように修飾することができる。いくつかの態様において、ＳＴＩＮＧアゴニストは、足場部分、例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｙに連結される。特定の態様では、修飾は、ＥＶ、例えば、エクソソームの外表面のＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、本明細書に開示される足場部分、例えばＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘに連結された）のより良好な発現を可能とする。この修飾には、アゴニストを化学物質もしくは酵素で処理することによる、またはＳＴＩＮＧアゴニストの極性もしくは電荷を物理的もしくは化学的に変化させることによる脂質結合タグの付加が含まれ得る。ＳＴＩＮＧアゴニストは、単一の処理によって、または処理の組み合わせ、例えば、脂質結合タグのみを付加すること、または脂質結合タグを付加し、かつ極性を変化させることによって修飾することができる。上記の例は、非限定的な例示的な例として意図されている。任意の修飾の組み合わせを実施することができることが企図される。
ＩＩＩ．Ｂ．インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）
本開示の特定の態様は、ＩＬ－１２部分を含む細胞外小胞を、それを必要とする対象に投与する方法に関する。いくつかの態様では、方法は、ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶを投与することをさらに含む。いくつかの態様では、方法は、ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶを投与することを含まない。インターロイキン１２（ＩＬ－１２）は、樹状細胞、マクロファージ、好中球によって産生されるヘテロ二量体サイトカインである。例えば、ｒｅａｃｔｏｍｅ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｄｅｔａｉｌ／Ｒ－ＨＳＡ－９０２０５９１で入手可能なＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１２ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｒｅａｃｔｏｍｅ、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２９４５９（ＩＬ－１２Ａサブユニット）Ｐ２９４６０（ＩＬ－１２Ｂサブユニット）を参照されたい。ＩＬ－１２は、それぞれ３５ｋＤａの軽鎖（ｐ３５）及び４０ｋＤａの重鎖（ｐ４０）をコードするインターロイキン－１２サブユニットα（ＩＬ１２Ａ）及びインターロイキン－１２サブユニットβ（ＩＬ１２Ｂ）の遺伝子によってコードされている。活性なＩＬ－１２ヘテロ二量体はｐ７０と呼ばれる場合もある。ｐ３５成分が一本鎖サイトカインと相同性を有するのに対して、ｐ４０は造血サイトカイン受容体ファミリーメンバーの細胞外ドメインと相同性を有する。したがって、ＩＬ－１２ヘテロ二量体は可溶性受容体に連結されたサイトカインに似ている。ＩＬ－１２は、ナイーブＴ細胞のＴｈ１細胞への分化に関与しており、しばしばＴ細胞刺激因子としても知られている場合もある。ＩＬ－１２は、ナチュラルキラー細胞及びＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞傷害性活性を増加させる。ＩＬ－１２はまた、インターフェロンγを介したＣＸＣＬ１０の産生の増加によって媒介される抗血管新生活性も有している。本開示で使用可能なＩＬ－１２部分の非限定的な例は、例えば、それぞれ本明細書に参照によりその全体を援用する米国特許第１０，７２３，７８２号、国際公開第ＷＯ２０１９／１３３９３４Ａ２号、及び国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２８７７８号にみることができる。
ＩＬ－１２受容体は、インターロイキン－１２受容体サブユニットβ－１（ＩＬ１２ＲＢ１）とインターロイキン－１２受容体サブユニットβ－２（ＩＬ１２ＲＢ２）とによって形成されるヘテロ二量体であり、どちらも、ＩＬ６様サイトカインスーパーファミリーのシグナル伝達受容体サブユニットであるＩＬ６ＳＴ（ｇｐ１３０）と高い相同性を有している。ＩＬ－１２ＲＢ２は、ＩＬ－１２機能に重要な役割を果たしていると考えられているが、これは１つには、活性化Ｔ細胞でのその発現が、Ｔｈ１細胞の発生を促進するサイトカインによって刺激され、Ｔｈ２細胞の発生を促進するサイトカインによって阻害されるためである。さらに、ＩＬ－１２の結合はＩＬ１２ＲＢ２チロシンのリン酸化を引き起こし、キナーゼである非受容体チロシンプロテインキナーゼＴＹＫ２及びチロシンプロテインキナーゼＪＡＫ２の結合部位を与える。これらは、シグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ）ファミリー、特に骨髄性及び他の細胞型によって産生されるサイトカインであるＳＴＡＴ４の転写因子タンパク質を活性化する。
ＩＬ－１２Ａ及びＢサブユニットのアミノ酸配列を表１Ａに示す。
Figure 2022551420000029
いくつかの態様では、ＩＬ－１２部分はＩＬ－１２タンパク質を含む。いくつかの態様では、ＩＬ－１２タンパク質は、完全長のヒトＩＬ－１２、例えば、ＩＬ－１２ヘテロ二量体を含む。いくつかの態様では、ＩＬ－１２ヘテロ二量体は、ＩＬ－１２αサブユニットがＩＬ－１２βサブユニットに共有結合した融合タンパク質を含む（配列番号１３；表１Ｂ）。いくつかの態様では、ＩＬ－１２部分は、ＩＬ－１２αサブユニットを含む。いくつかの態様では、ＩＬ－１２部分はＩＬ－１２βサブユニットを含む。
Figure 2022551420000030
いくつかの態様では、ＩＬ－１２ヘテロ二量体は、リンカーによってＩＬ－１２βサブユニットに共有結合されたＩＬ－１２αサブユニットを含む。いくつかの態様では、リンカーは、１つ以上のアミノ酸を含む。いくつかの態様では、リンカーは、本明細書に開示されるリンカーである。いくつかの態様では、リンカーは、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーを含む。いくつかの態様では、リンカーは、切断可能なリンカーである。いくつかの態様では、リンカーは、ジスルフィド結合を含む。
いくつかの態様では、ＩＬ－１２部分は、ＩＬ－１２活性を有する分子を含む。いくつかの態様では、ＩＬ－１２活性を有する分子は、ＩＬ－１２類似体である。いくつかの態様では、ＩＬ－１２活性を有する分子は、ＩＬ－１２受容体を活性化する分子を含む。
いくつかの態様では、ＩＬ－１２部分は、ＩＬ－１２タンパク質、例えば、ＩＬ－１２αサブユニット、ＩＬ－１２βサブユニット、及び／またはＩＬ－１２ヘテロ二量体をコードする核酸分子を含む。いくつかの態様では、核酸分子は、ＩＬ－１２αサブユニットをコードする。いくつかの態様では、核酸分子は、ＩＬ－１２βサブユニットをコードする。いくつかの態様では、核酸分子は、ＩＬ－１２αサブユニット及びＩＬ－１２βサブユニットをコードする。いくつかの態様では、核酸分子は、ＩＬ－１２βサブユニットに共有結合したＩＬ－１２αサブユニットをコードする。いくつかの態様では、核酸分子は、ＩＬ－１２ヘテロ二量体をコードする。
いくつかの態様では、ＩＬ－１２部分は核酸分子を含み、核酸分子はベクターに組み込まれる。いくつかの態様では、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの態様では、ベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）及びヘルペスウイルスのようなＤＮＡウイルスに基づいたベクター、ならびにレトロウイルスに基づくベクターである。いくつかの態様では、ベクターは、レンチウイルスである。いくつかの態様では、ウイルスはＡＡＶである。
ＩＩＩ．Ｃ．足場操作されたＥＶ、例えば、エクソソーム
いくつかの態様では、本開示のＥＶは、その組成が改変された膜を含む。例えば、それらの膜組成は、膜のタンパク質、脂質、またはグリカン含量を変更することによって改変することができる。
いくつかの態様では、表面操作されたＥＶは、ＰＥＧ誘導融合及び／または超音波融合などの化学的及び／または物理的方法により生成される。他の態様では、表面操作されたＥＶ、例えば、エクソソームは、遺伝子操作によって生成される。遺伝子改変されたプロデューサー細胞または遺伝子改変された細胞の子孫から生成されるＥＶは、改変された膜組成を含み得る。いくつかの態様では、表面操作されたＥＶ、例えば、エクソソームは、より高いまたはより低い密度（例えば、より多い数）の足場部分（例えば、エクソソームタンパク質、例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ）を有するか、または足場部分の変異体またはフラグメントを含む。
例えば、表面操作されたＥＶ（例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘで操作された、またはＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙで操作されたＥＶ）は、足場部分（例えば、エクソソームタンパク質、例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ及び／またはＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙ）をコードする外因性配列またはその変異体もしくはフラグメントで形質転換された細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）から生成され得る。外因性配列から発現される足場部分を含むＥＶは、改変された膜組成を有し得る。
足場部分のさまざまな改変またはフラグメントを、本開示の態様で使用することができる。例えば、結合剤への親和性が高められるように修飾された足場部分は、結合剤を使用して精製することができる表面操作されたＥＶを生成するために使用することができる。ＥＶ、例えば、エクソソーム及び／または膜により効果的に標的化するように改変された足場部分を使用することができる。ＥＶ、例えば、エクソソーム、膜への特異的かつ効果的な標的化に必要な最小限のフラグメントを含むように改変された足場部分も使用することができる。
いくつかの態様において、本明細書に開示されるＳＴＩＮＧアゴニストは、ＥＶ、例えば、エクソソームの表面上で、融合タンパク質、例えば、ＳＴＩＮＧアゴニストとＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘ及び／またはＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙとの融合タンパク質として発現される。例えば、融合タンパク質は、足場部分（例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ ＸまたはＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙ）に連結された本明細書に開示されるＳＴＩＮＧアゴニストを含むことができる。
ＩＩＩ．Ｃ．１．Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘタンパク質
特定の態様において、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、ＰＴＧＦＲＮタンパク質、ＢＳＧタンパク質、ＩＧＳＦ２タンパク質、ＩＧＳＦ３タンパク質、ＩＧＳＦ８タンパク質、ＩＴＧＢ１タンパク質、ＩＴＧＡ４タンパク質、ＳＬＣ３Ａ２タンパク質、ＡＴＰトランスポータータンパク質、Ｌａｍｐ－１タンパク質、Ｌａｍｐ－２タンパク質、ＣＤ１３タンパク質、ＣＤ８６タンパク質、フロチリンタンパク質、シンタキシン－３タンパク質、ＣＤ２タンパク質、ＣＤ３６タンパク質、ＣＤ４０タンパク質、ＣＤ４０Ｌタンパク質、ＣＤ４１ａタンパク質、ＣＤ４４タンパク質、ＣＤ４５タンパク質、ＩＣＡＭ－１タンパク質、インテグリンα４タンパク質、Ｌ１ＣＡＭタンパク質、ＬＦＡ－１タンパク質、Ｍａｃ－１α及びβタンパク質、Ｖｔｉ－１Ａ及びＢタンパク質、ＣＤ３ε及びζタンパク質、ＣＤ９タンパク質、ＣＤ１８タンパク質、ＣＤ３７タンパク質、ＣＤ５３タンパク質、ＣＤ６３タンパク質、ＣＤ８１タンパク質、ＣＤ８２タンパク質、ＣＸＣＲ４タンパク質、ＦｃＲタンパク質、ＧｌｕＲ２／３タンパク質、ＨＬＡ－ＤＭ（ＭＨＣ ＩＩ）タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、ＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩ成分タンパク質、ＴＣＲβタンパク質、テトラスパニンタンパク質、またはそれらのフラグメントもしくは変異体を含む。
いくつかの態様では、本明細書に記載の表面操作されたＥＶ、例えば、エクソソーム（例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘで操作されたＥＶ、例えば、エクソソーム）は、当該技術分野では周知のＥＶ、例えば、エクソソームと比較して優れた特性を示す。例えば、表面（例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘ）操作されたものは、天然に存在するＥＶ、例えば、エクソソーム、または従来のエクソソームタンパク質を使用して作製されたＥＶ、例えば、エクソソームと比較して、その表面上により高度に濃縮された修飾タンパク質を含む。さらに、本発明の表面操作されたＥＶ、例えば、エクソソーム（例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘで操作されたＥＶ、例えば、エクソソーム）は、天然に存在するＥＶ、例えば、エクソソーム、または従来のエクソソームタンパク質を使用して作製されたＥＶ、例えば、エクソソームと比較して、より高い、より特異的な、またはより制御された生物活性を有し得る。
他の態様では、本開示のＥＶ、例えば、エクソソームは、ＳＴＩＮＧアゴニスト及びＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘを含み、ＳＴＩＮＧアゴニストはＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘに連結される。いくつかの態様では、本開示のＥＶ、例えば、エクソソームは、ＳＴＩＮＧアゴニスト及びＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘを含み、ＳＴＩＮＧアゴニストはＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘに連結されていない。
いくつかの態様では、本開示に有用なＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、プロスタグランジンＦ２受容体ネガティブレギュレーター（ＰＴＧＦＲＮポリペプチド）を含む。ＰＴＧＦＲＮタンパク質は、ＣＤ９パートナー１（ＣＤ９Ｐ－１）、Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｉｌｅ ＥＷＩモチーフ含有タンパク質Ｆ（ＥＷＩ－Ｆ）、プロスタグランジンＦ２α受容体調節タンパク質、プロスタグランジンＦ２α受容体関連タンパク質、またはＣＤ３１５と称される場合もある。ヒトＰＴＧＦＲＮタンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ９Ｐ２Ｂ２）の完全長アミノ酸配列は、表２に配列番号１として示されている。ＰＴＧＦＲＮポリペプチドは、シグナルペプチド（配列番号１のアミノ酸１～２５）、細胞外ドメイン（配列番号１のアミノ酸２６～８３２）、膜貫通ドメイン（配列番号１のアミノ酸８３３～８５３）、及び細胞質ドメイン（配列番号１のアミノ酸８５４～８７９）を含む。成熟ＰＴＧＦＲＮポリペプチドは、シグナルペプチドを含まない配列番号１（すなわち、配列番号１のアミノ酸２６～８７９）からなる。いくつかの態様では、本開示で有用なＰＴＧＦＲＮポリペプチドフラグメントは、ＰＴＧＦＲＮポリペプチドの膜貫通ドメインを含む。他の態様では、本開示で有用なＰＴＧＦＲＮポリペプチドフラグメントは、ＰＴＧＦＲＮポリペプチドの膜貫通ドメイン、及び（ｉ）膜貫通ドメインのＮ末端の少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも１１０個、少なくとも１２０個、少なくとも１３０個、少なくとも１４０個、少なくとも１５０個のアミノ酸、（ｉｉ）膜貫通ドメインのＣ末端の少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、または少なくとも２５個のアミノ酸、または（ｉ）と（ｉｉ）の両方を含む。
いくつかの態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、配列番号３３と少なくとも約少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。


Figure 2022551420000031
他の態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、配列番号２、３、４、５、６、７、または８と少なくとも約少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
ＳＴＩＮＧアゴニストをＥＶ、例えば、エクソソームの表面に連結するために使用することができる他のＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘタンパク質の非限定的な例は、本明細書に参照によりその全体をそれぞれ援用する米国特許第１０，１９５，２９０Ｂ１号及び同第１０，５６１，７４０Ｂ２号にみることができる。
いくつかの態様では、本明細書に記載されるＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘを使用して、ＳＴＩＮＧアゴニスト及び／またはＩＬ－１２部分をＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面及び／または外表面に同時に連結することもできる。例えば、ＰＴＧＦＲＮポリペプチドは、ＳＴＩＮＧアゴニスト及び／またはＩＬ－１２部分を、ＥＶ、例えば、エクソソームの表面に加えて、内腔内に連結するために使用することができる。いくつかの態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘを使用して、ＳＴＩＮＧアゴニスト及びさらなる治療剤（例えば、ＩＬ－１２部分）をＥＶ、例えば、エクソソーム（例えば、ペイロード）に連結することができる。したがって、特定の態様では、本明細書に開示されるＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘは、二重の目的で使用することができる。
いくつかの態様では、本開示のＥＶ、例えば、エクソソームは、天然に存在するＥＶ、例えば、エクソソームのものとは異なる内部空間（すなわち、内腔）を含む。例えば、ＥＶ、例えば、エクソソームは、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔側の組成が、天然に存在するＥＶ、例えば、エクソソームのものとは異なるタンパク質、脂質、またはグリカン含量を有するように改変することができる。
いくつかの態様では、操作されたＥＶ、例えば、エクソソームは、足場部分（例えば、エクソソームタンパク質、例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｙ）をコードする外因性配列、またはＥＶ、例えば、エクソソームの内腔側の組成もしくは内容を変化させる足場部分の改変もしくはフラグメントで形質転換された細胞から生成することができる。ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔側で発現させることができるエクソソームタンパク質のさまざまな改変またはフラグメントを、本開示の態様で使用することができる。
いくつかの態様では、本明細書で開示されるＳＴＩＮＧアゴニスト及び／またはＩＬ－１２部分は、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔内にある（すなわち、封入されている）。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニスト及び／またはＩＬ－１２部分は、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面に連結される。本明細書で使用される場合、ある分子（例えば、ＳＴＩＮＧアゴニスト及び／またはＩＬ－１２部分）がＥＶ、例えば、エクソソームの「内腔内にある」ものとして記載される場合、その分子はＥＶ、例えば、エクソソーム内に位置している（例えば、関連付けられる）が、ＥＶの内腔表面のいずれの分子にも連結されていないことを意味する。他の態様では、ＳＴＩＮＧアゴニスト及び／またはＩＬ－１２部分は、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面に、融合分子、例えば、ＳＴＩＮＧアゴニストと足場部分（例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ ＸまたはＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙ）との融合分子として発現される。
いくつかの態様では、本開示の併用療法は、内腔内にＳＴＩＮＧアゴニストを含む第１のＥＶと、ＰＴＧＦＲＮタンパク質を介してＥＶの外表面上にＩＬ－１２を含む第２のＥＶとを投与することを含む。
ＩＩＩ．Ｃ．２．Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｙタンパク質
いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニスト及び／またはＩＬ－１２部分は、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面に、融合分子、例えば、ＳＴＩＮＧアゴニストとＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙ部分との融合分子として発現される。いくつかの態様では、操作されたＥＶ、例えば、エクソソームは、足場部分（例えば、エクソソームタンパク質、例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｙ）をコードする外因性配列、またはＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面の組成もしくは内容を変化させる足場部分の改変もしくはフラグメントで形質転換された細胞から生成することができる。ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面上で発現させることができるエクソソームタンパク質のさまざまな改変またはフラグメントを、本開示の態様で使用することができる。
いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面を変化させることができるエクソソームタンパク質としては、これらに限定されるものではないが、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質（ＭＡＲＣＫＳ）タンパク質、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質様１（ＭＡＲＣＫＳＬ１）タンパク質、脳の酸可溶性タンパク質１（ＢＡＳＰ１）タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
本開示で有用なＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙタンパク質の非限定的な例は、本明細書に開示されている。いくつかの態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｙタンパク質は、配列番号４１１、４３８、４４６、及び４５５～５６７から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｙタンパク質は、配列番号４１１、４３８、４４６、及び４５５～５６７から選択されるアミノ酸配列からなる。いくつかの態様では、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｙタンパク質は、本明細書に参照によってその全体をそれぞれ援用するところの国際公開第ＷＯ／２０１９／０９９９４２号または同ＷＯ２０２０／１０１７４０号に開示される任意のＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙタンパク質を含むか、またはそれからなる。
いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストはＥＶ内のＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘに関連付けられ、ＩＬ－１２部分はＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘ部分に関連付けられる。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストはＥＶ内の第１のＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘに関連付けられ、ＩＬ－１２部分は第２のＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘ部分に関連付けられる。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストはＥＶ内のＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘに関連付けられ、ＩＬ－１２部分はＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙ部分に関連付けられる。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストはＥＶ内の第１のＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙに関連付けられ、ＩＬ－１２部分は第２のＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙ部分に関連付けられる。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストはＥＶ内の足場タンパク質に関連付けられておらず、ＩＬ－１２部分はＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙ部分に関連付けられる。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストはＥＶ内の足場タンパク質に関連付けられておらず、ＩＬ－１２部分はＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘ部分に関連付けられる。いくつかの態様では、ＩＬ－１２部分はＥＶ内の足場タンパク質に関連付けられておらず、ＳＴＩＮＧアゴニストはＳｃａｆｆｏｌｄ Ｙ部分に関連付けられる。いくつかの態様では、ＩＬ－１２部分はＥＶ内の足場タンパク質に関連付けられておらず、ＳＴＩＮＧアゴニストはＳｃａｆｆｏｌｄ Ｘ部分に関連付けられる。
ＩＩＩ．Ｄ．リンカー
本開示のＥＶは、ＳＴＩＮＧアゴニスト及び／またはＩＬ－１２部分をＥＶまたはＥＶの外表面上の足場部分、例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｘに連結する１つ以上のリンカーを含むことができる。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニスト及び／またはＩＬ－１２部分は、ＥＶに直接、またはリンカーによってＥＶ上の足場部分に連結される。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニスト及び／またはＩＬ－１２は、例えば、リンカーによって、ＥＶの脂質二重層に連結される。リンカーは、当該技術分野では周知の任意の化学部分であってよい。
いくつかの態様では、「リンカー」なる用語は、ペプチドまたはポリペプチド配列（例えば、合成ペプチドまたはポリペプチド配列）または非ポリペプチドを指す。いくつかの態様では、２つ以上のリンカーを直列に連結することができる。一般に、リンカーは柔軟性を与えるか、または立体障害を防止／改善する。リンカーは通常は切断されないが、特定の態様では、そのような切断が望ましい場合もある。したがって、いくつかの態様では、リンカーは、リンカーの配列内に位置するかまたはリンカー配列のいずれかの末端でリンカーに隣接させることができる１つ以上のプロテアーゼ切断部位を含むことができる。
いくつかの態様において、リンカーは、ペプチドリンカーである。いくつかの態様では、ペプチドリンカーは、少なくとも約２個、少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約３５個、少なくとも約４０個、少なくとも約４５個、少なくとも約５０個、少なくとも約５５個、少なくとも約６０個、少なくとも約６５個、少なくとも約７０個、少なくとも約７５個、少なくとも約８０個、少なくとも約８５個、少なくとも約９０個、少なくとも約９５個、または少なくとも約１００個のアミノ酸を含むことができる。
いくつかの態様では、ペプチドリンカーは合成、すなわち非天然である。一態様では、ペプチドリンカーは、アミノ酸の第１の直線配列を、第１の直線配列が自然には連結されていない、または遺伝子的に自然に融合されていないアミノ酸の第２の直線配列に連結または遺伝子的に融合するアミノ酸配列を含むペプチド（またはポリペプチド）（例えば、天然または非天然ペプチド）を含む。例えば、一態様では、ペプチドリンカーは、天然に存在するポリペプチドの改変された形態（例えば、付加、置換または欠失などの変異を含む）である非天然のポリペプチドを含むことができる。
リンカーは切断されやすい（「切断性リンカー」）ものとしてもよく、それにより、ＳＴＩＮＧアゴニストまたは他のペイロードの放出を容易にする。いくつかの態様では、リンカーは、「還元感受性リンカー」である。いくつかの態様では、還元感受性リンカーは、ジスルフィド結合を含む。いくつかの態様では、リンカーは「酸不安定性リンカー」である。いくつかの態様では、酸不安定性リンカーは、ヒドラゾンを含む。適当な酸不安定性リンカーには、例えば、ｃｉｓ－アコニットリンカー、ヒドラジドリンカー、チオカルバモイルリンカー、またはそれらの任意の組み合わせも含まれる。いくつかの態様では、リンカーは、非切断性リンカーを含む、
ＩＩＩ．Ｅ．プロデューサー細胞及び改変
ＥＶ、例えば、エクソソームは、インビトロで増殖させた細胞または対象の体液から生成することができる。ＥＶ、例えば、エクソソームがインビトロの細胞培養から生成される場合、さまざまなプロデューサー細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞を使用することができる。本明細書に記載される内腔が操作されたＥＶ、例えば、エクソソームの生成に使用できるさらなる細胞タイプとしては、限定されるものではないが、間葉系幹細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、及びがん細胞株が挙げられる。さらなる例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、ＢＪヒト包皮由来繊維芽細胞、ｆＨＤＦ繊維芽細胞、ＡＧＥ．ＨＮ（登録商標）神経前駆細胞、ＣＡＰ（登録商標）羊膜細胞、脂肪組織由来の間葉系幹細胞、及びＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１細胞が挙げられる。特定の態様では、プロデューサー細胞は、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、マスト細胞、好中球、クッパー・ブロウィッツ細胞、これらの細胞のいずれかに由来する細胞、またはそれらの任意の組み合わせではない。
いくつかの態様はまた、小胞表面上に外因性タンパク質を発現する改変されたＥＶを生成するように１つ以上の外因性配列、例えば、ＩＬ－１２に連結されたＰＴＧＦＲＮを含むようにＥＶ、例えば、エクソソームを遺伝子改変することを含んでもよい。
より具体的には、本ＥＶ、例えば、エクソソームは、リガンド、サイトカイン、もしくは抗体、またはそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない１つ以上の追加の外因性タンパク質をコードする配列で形質転換された細胞から生成させることができる。これらのさらなる外因性タンパク質は、ＳＴＩＮＧアゴニストと組み合わせてさらなる免疫刺激シグナルの活性化または調節を可能にすることができる。使用が企図される例示的なさらなる外因性タンパク質としては、本明細書に参照によりその全体をそれぞれ援用する米国特許出願第６２／６１１，１４０号、国際公開第ＷＯ／２０１９／１３３９３４号、ならびに米国特許第１０，１９５，２９０Ｂ１号及び同第１０，５６１，７４０Ｂ２号に詳細に記載されているタンパク質、リガンド、及び他の分子が挙げられる。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、またはＣＤ２７Ｌを含むリガンドでさらに改変される。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、またはＩＬ－１５を含むサイトカインでさらに改変される。本明細書に記載の１つ以上のエクソソームタンパク質のいずれも、プラスミド、ゲノムに挿入された外因性配列、または合成メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などの他の外因性核酸から発現させることができる。
いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームをさらに改変して、ＥＶ、例えば、エクソソームの表面上にアンタゴニスト抗体もしくはアゴニスト抗体またはそのフラグメントを提示させることで、ＥＶ取り込みを誘導し、細胞経路を活性化、または遮断して、ＳＴＩＮＧアゴニストのコンビナトリアル効果を高める。いくつかの具体的な態様では、抗体またはそのフラグメントは、ＤＥＣ２０５、ＣＬＥＣ９Ａ、ＣＬＥＣ６、ＤＣＩＲ、ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＬＯＸ－１、またはランゲリンに対する抗体である。プロデューサー細胞は、アンタゴニスト抗体またはアゴニスト抗体をコードするさらなる外因性配列を含むように改変することができる。あるいは、アンタゴニスト抗体またはアゴニスト抗体は、当該技術分野では周知の任意の適切な連結化学によってＥＶ、例えば、エクソソームに共有結合によって連結または結合させることもできる。適切な連結化学の非限定的な例としては、アミン反応性基、カルボキシル反応性基、スルフヒドリル反応性基、アルデヒド反応性基、光反応性基、ＣｌｉｃｋＩＴ化学、ビオチン－ストレプトアビジンまたは他のアビジン結合、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
ＩＶ．ＳＴＩＮＧアゴニストを有するＥＶを製造する方法
ＩＶ．Ａ．ＥＶ中にＳＴＩＮＧアゴニストを封入するための方法
ＳＴＩＮＧアゴニストは、当該技術分野では周知の任意の適切な技術によってＥＶ、例えば、エクソソーム中に封入することができる。生体分子をＥＶ、例えば、エクソソームにロードするすべての既知の方法は、本明細書での使用に適しているとみなされると考えられる。かかる技術としては、受動拡散、エレクトロポレーション、化学的もしくはポリマートランスフェクション、ウイルス形質導入、機械的膜破壊もしくは機械的剪断、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。ＳＴＩＮＧアゴニストとＥＶ、例えば、エクソソームとを、封入時に適切な緩衝液中でインキュベートすることができる。
一態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、受動拡散によってＥＶ、例えば、エクソソームに封入される。ＳＴＩＮＧアゴニストとＥＶ、例えば、エクソソームとを一緒に混合し、ＳＴＩＮＧアゴニストが小胞の脂質二重層を通して拡散するのに十分な時間インキュベートすることにより、ＥＶ、例えば、エクソソーム中に封入することができる。ＳＴＩＮＧアゴニストとＥＶ、例えば、エクソソームとは、約１～３０時間、２～２４時間、４～１８時間、６～１６時間、８～１４時間、１０～１２時間、６～１２時間、１２～２０時間、１４～１８時間、または２０～３０時間、一緒にインキュベートすることができる。ＳＴＩＮＧアゴニストとＥＶ、例えば、エクソソームとは、約２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、２４時間、２６時間、または３０時間、一緒にインキュベートすることができる。
ＥＶ、例えば、エクソソームの溶液の緩衝条件を、ＳＴＩＮＧアゴニストの封入を最適化するために変更することもできる。一態様では、緩衝液は、スクロースを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）とすることができる。ＰＢＳは当業者には周知の緩衝液である。せん断保護剤、粘度調整剤、及び／または小胞の構造特性に影響を与える溶質などのさらなる緩衝液の改変を用いることもできる。膜軟化材料及び分子密集剤などのＳＴＩＮＧアゴニスト封入の効率を改善するための賦形剤を添加することもできる。緩衝液の他の改変としては、特定のｐＨ範囲及び／または塩濃度、有機溶媒、小分子、洗剤、両性イオン、アミノ酸、ポリマー、及び／または複数の濃度を含む上記の任意の組み合わせを挙げることができる。
インキュベーション中のＥＶ、例えば、エクソソームとＳＴＩＮＧアゴニストの溶液の温度を、ＳＴＩＮＧアゴニストの封入を最適化するために変更することができる。温度は室温でよい。温度は約１５℃～９０℃、１５～３０℃、３０～５０℃、５０～９０℃とすることができる。温度は約１５℃、２０℃、３５℃、３０℃、３５℃、３７℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、または９０℃とすることができる。
アゴニストとＥＶ、例えば、エクソソームとのインキュベーション中のＳＴＩＮＧアゴニストの濃度を、ＳＴＩＮＧアゴニストの封入を最適化するために変更することもできる。アゴニストの濃度は、少なくとも０．０１ｍＭ～１００ｍＭのＳＴＩＮＧアゴニストとすることができる。アゴニストの濃度は、少なくとも０．０１～１ｍＭ、１～１０ｍＭ、１０～５０ｍＭ、または５０～１００ｍＭとすることができる。アゴニストの濃度は、少なくとも０．０１ｍＭ、０．０２ｍＭ、０．０３ｍＭ、０．０４ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．０６ｍＭ、０．０７ｍＭ、０．０８ｍＭ、０．０９ｍＭ、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．３ｍＭ、０．４ｍＭ、０．５ｍＭ、０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ ３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭ、または１００ｍＭとすることができる。
ＳＴＩＮＧアゴニストとインキュベートされる細胞外粒子の数を、ＳＴＩＮＧアゴニストの封入を最適化するために変更することもできる。精製されたＥＶ、例えば、エクソソームの粒子の数は、少なくとも約１０６個～少なくとも約１０２０個の精製された小胞の全粒子であってよい。精製された粒子の数は、約１０８～１０１８個、１０１０～１０１６個、１０８～１０１４個、または１０１０～１０１２個の精製された小胞の全粒子であってよい。精製された粒子の数は、少なくとも約１０６個、１０８個、１０１０個、１０１２個、１０１４個、１０１６個、１０１８個、または１０２０個の精製された小胞の全粒子であってよい。
いくつかの態様では、カチオン性脂質及びポリマーのような合成マクロ分子を使用して１つ以上の部分を適当なプロデューサー細胞に導入することができる（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １２：Ｓ１１８－Ｓ１３０（２００５））。いくつかの態様では、カチオン性脂質は、電荷相互作用によって１つ以上の部分と複合体を形成する。これらの態様のいくつかでは、正に荷電した複合体は、負に荷電した細胞表面に結合し、エンドサイトーシスによって細胞に取り込まれる。いくつかの他の態様では、カチオン性ポリマーを使用してプロデューサー細胞をトランスフェクトすることができる。これらの態様のいくつかでは、カチオン性ポリマーは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。特定の態様では、リン酸カルシウム、シクロデキストリン、またはポリブレンのような化学物質を使用して１つ以上の部分をプロデューサー細胞に導入することができる。１つ以上の部分はまた、粒子介在型トランスフェクション、「遺伝子銃」、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）、またはパーティクルボンバードメント法などの物理的方法を使用してプロデューサー細胞中に導入することができる（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ１２：Ｓ１１８－Ｓ１３０（２００５））。例えば、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、または緑色蛍光タンパク質のようなレポーター遺伝子を使用してプロデューサー細胞のトランスフェクション効率を評価することができる。
いくつかの態様では、１つ以上の部分は、ウイルス形質導入によってプロデューサー細胞に導入される。モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、レンチウイルス、及びスプマウイルスをはじめとする多くのウイルスを遺伝子導入ビヒクルとして使用することができる。ウイルス媒介型の遺伝子導入ビヒクルは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス及びヘルペスウイルスのようなＤＮＡウイルスに基づくベクター、ならびにレトロウイルスに基づくベクターを含む。
いくつかの態様では、１つ以上の部分は、エレクトロポレーションによってプロデューサー細胞に導入される。エレクトロポレーションは、細胞膜に一時的な孔を形成し、細胞内へのさまざまな分子の導入を可能とする。いくつかの態様では、ＤＮＡ及びＲＮＡ、ならびにポリペプチド及び非ポリペプチド治療薬を、エレクトロポレーションによってプロデューサー細胞に導入することができる。
いくつかの態様では、１つ以上の部分は、マイクロインジェクションによってプロデューサー細胞に導入される。いくつかの態様では、ガラス製マイクロピペットを使用して、１つ以上の部分を顕微鏡レベルでプロデューサー細胞に注入することができる。
いくつかの態様では、１つ以上の部分は、押し出しによってプロデューサー細胞に導入される。
いくつかの態様では、１つ以上の部分は、超音波処理によってプロデューサー細胞に導入される。いくつかの態様では、プロデューサー細胞を高強度の音波に曝露して細胞膜の一時的な破壊を引き起こすことで１つ以上の部分のローディングが可能となる。
いくつかの態様では、１つ以上の部分は、細胞融合によってプロデューサー細胞に導入される。いくつかの態様では、１つ以上の部分は、電気的細胞融合によって導入される。他の態様では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用してプロデューサー細胞を融合する。さらなる態様では、センダイウイルスを使用してプロデューサー細胞を融合する。
いくつかの態様では、１つ以上の部分は、低張溶解によってプロデューサー細胞に導入される。かかる態様では、プロデューサー細胞を低イオン強度緩衝液に曝露することで破裂させて１つ以上の部分のローディングを可能とする。他の態様では、低張溶液に対する制御された透析を用いてプロデューサー細胞を膨潤させ、プロデューサー細胞の膜に孔を形成することができる。その後、プロデューサー細胞を、膜の再封止を可能とする条件に曝露する。
いくつかの態様では、１つ以上の部分は、洗剤処理によってプロデューサー細胞に導入される。特定の態様では、プロデューサー細胞を弱い洗剤で処理することで、１つ以上の部分のローディングを可能とする孔を形成することによってプロデューサー細胞の膜を一時的に破壊する。プロデューサー細胞がローディングされた後、洗剤を洗い流すことによって膜を再封止する。
いくつかの態様では、１つ以上の部分は、受容体介在型エンドサイトーシスによってプロデューサー細胞に導入される。特定の態様では、プロデューサー細胞は、１つ以上の部分の結合時に受容体及び関連する部分の内部移行を誘導する表面受容体を有する。
いくつかの態様では、１つ以上の部分は、濾過によってプロデューサー細胞に導入される。特定の態様では、プロデューサー細胞及び１つ以上の部分をプロデューサー細胞より小さい孔径のフィルターに強制的に通すことで、プロデューサー細胞の膜の一時的な破壊を引き起こし、１つ以上の部分をプロデューサー細胞に入れることができる。
いくつかの態様では、プロデューサー細胞に数回の凍結融解サイクルを行うことで細胞膜の破壊を生じ、１つ以上の部分のローディングを可能とする。
Ｖ．ＥＶの精製
本開示で調製されたＥＶ、例えば、エクソソームは、プロデューサー細胞から単離することができる。ＥＶ、例えば、エクソソームのすべての既知の単離の方法も、本明細書での使用に適しているとみなされると企図される。例えば、電荷（例えば、電気泳動による分離）、サイズ（例えば、濾過、分子ふるいなど）、密度（例えば、通常の遠心分離または勾配遠心分離）、スヴェドベリ定数（例えば、外力による、またはよらない沈降など）に基づく分離をはじめとするＥＶ、例えば、エクソソームの物理的性質を利用して、培地または他のソース材料からそれらを分離することができる。上記に代えて、または上記に加えて、単離は、１つ以上の生物学的特性に基づいたものとすることができ、表面マーカーを利用できるような方法が含まれ得る（例えば、沈降では、固相への可逆的結合、ＦＡＣＳ分離、特異的リガンド結合、非特異的リガンド結合など）。いっそうさらに企図される方法では、ＥＶ、例えば、エクソソームは、ＰＥＧ誘導融合及び／または超音波融合をはじめとする化学的及び／または物理的方法を使用して融合することができる。
ＥＶ、例えば、エクソソームは、ＳＴＩＮＧアゴニストとのインキュベーション後に精製を行って、組成物から未封入の遊離ＳＴＩＮＧアゴニストを除去することもできる。ＥＶ、例えば、エクソソームの物理的または生物学的特性に基づく分離を含む、以前に開示されているすべての方法も、本明細書での使用に適しているものとみなされる。
単離、精製、及び濃縮は、一般的かつ非選択的な形（通常は連続遠心分離を含む）で行うことができる。あるいは、単離、精製、及び濃縮は、より特異的かつ選択的な形（例えば、プロデューサー細胞に特異的な表面マーカーを用いる）で行うこともできる。例えば、特異的表面マーカーは、免疫沈降、ＦＡＣＳソーティング、アフィニティ精製、及び磁気分離におけるビーズ結合リガンドなどで使用することができる。
いくつかの態様では、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、ＥＶ、例えば、エクソソームを単離または精製することができる。サイズ排除クロマトグラフィー法は、当該技術分野では周知のものである。例示的かつ非限定的な方法を本明細書に示す。いくつかの態様では、ボイド容積画分が単離され、これは目的のＥＶ、例えば、エクソソームを含む。いくつかの態様では、例えば、密度勾配遠心分離を利用して、ＥＶ、例えば、エクソソームをさらに単離することができる。さらにまた、いくつかの態様では、プロデューサー細胞由来のＥＶ、例えば、エクソソームを他の由来のＥＶからさらに分離することが望ましい場合がある。例えば、プロデューサー細胞由来のＥＶ、例えば、エクソソームは、プロデューサー細胞に特異的な抗原抗体を使用する免疫吸着剤捕捉により、非プロデューサー細胞由来のＥＶ、例えば、エクソソームから分離することができる。
いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームの単離では、サイズ排除クロマトグラフィーまたは、陰イオン交換、陽イオン交換、もしくは混合モードクロマトグラフィーなどのイオンクロマトグラフィーを行うことができる。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームの単離では、脱塩、透析、接線流濾過、限外濾過、もしくは透析濾過、またはそれらの任意の組み合わせを行うことができる。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームの単離において、これらに限定されるものではないが、示差遠心分離、サイズに基づく膜濾過、濃度及び／または速度ゾーン遠心分離を含む方法の組み合わせを行うことができる。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームの単離において、１つ以上の遠心分離工程を行うことができる。遠心分離は、約５０，０００～１５０，０００×ｇで行うことができる。遠心分離は、約５０，０００×ｇ、７５，０００×ｇ、１００，０００×ｇ、１２５，０００×ｇ、または１５０，０００×ｇで行うことができる。
ＶＩ．治療的投与
ＶＩ．Ａ．免疫調節及び用量
本明細書では、ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えば、エクソソームの薬学的有効量を投与することにより、対象の免疫または炎症反応を誘導及び／または調節する方法を提供する。
樹状細胞（ＤＣ）は、自然免疫系と獲得免疫系を結びつける造血細胞系統に由来する抗原提示細胞の集団である。ＤＣは、単球及びマクロファージと共通の骨髄前駆細胞を共有し、一般に形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）と、標準型ＤＣ（ｃＤＣ）としても知られる骨髄系ＤＣ（ｍＤＣ）の２つの主要な群に分類される。ｍＤＣは、骨髄またはリンパ系前駆細胞からの発生とＣＤ８α、ＣＤ４、及びＣ１１ｂの発現レベルに基づいてさらに分類される。ＤＣの３つめの集団は、ｐＤＣ及びｃＤＣのようなＤＣ前駆細胞ではなく、単球前駆細胞から生じる単球由来ＤＣ（ｍｏＤＣ）である。ｍｏＤＣは、炎症性キューを受けた後に発生する。未成熟ＤＣは成熟前には末梢組織に存在している。パターン認識受容体（ＰＲＲ）によって誘導されるシグナル伝達カスケードを含むいくつかのシグナル伝達経路が、ＤＣ成熟を引き起こす。未成熟ＤＣの各サブセットはＰＲＲのタンパク質発現パターンが異なり、これにより未成熟ＤＣ集団は同じＰＲＲの活性化時に異なる応答をすることができる。これは、ＤＣによって媒介される免疫応答の調節をもたらす。ＤＣに存在するＰＲＲとしては、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、Ｃタイプレクチン受容体、レチノイン酸誘導遺伝子（ＲＩＧ）－Ｉ様受容体（ＲＬＲ）、ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）、及びＳＴＩＮＧが挙げられる。
ＳＴＩＮＧ経路は、ｍＤＣ及びｐＤＣの両方で主要なＤＮＡセンシング経路である。ＤＣにおけるＳＴＩＮＧ経路の活性化は、ＴＢＫ１、ＩＲＦ３、及びＮＦ－κＢシグナル伝達を介して、Ｉ型ＩＦＮ及び炎症性サイトカインの産生をもたらす。細胞上の受容体へのＩＦＮの結合は、ＩＦＮ刺激応答要素の活性化と、免疫及び炎症反応を引き起こすＩＦＮ感受性遺伝子の転写をもたらす。ＩＦＮシグナル伝達はまた、ＤＣをクロスプライミングして抗原持続性を促進し、ＭＨＣＩ提示に利用できる抗原レパートリーを変化させ、抗原のＭＨＣＩ提示を強化し、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、ならびに共刺激分子ＣＤ４０、ＣＤ８０、及びＣＤ８６の全体的な表面発現を増加させる。これらの作用により、腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングが増加し、獲得免疫反応が開始される。
いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストを封入する及び／または表面にＳＴＩＮＧアゴニストを発現するＥＶ、例えば、エクソソームをそれを必要とする対象に投与する方法は、樹状細胞を活性化または誘導し、それにより対象の免疫または炎症反応を誘導または調節する。いくつかの態様では、活性化される樹状細胞は骨髄系樹状細胞である。いくつかの態様では、樹状細胞は、形質細胞様樹状細胞である。
いくつかの態様では、方法は、インターフェロン（ＩＦＮ）－β産生を誘導する。ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含むＥＶ、例えば、エクソソームの投与は、ＳＴＩＮＧアゴニスト単独の投与と比較して、２倍～１０，０００倍高いＩＦＮ－β誘導をもたらし得る。ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、封入されるか表面に発現される）を含むＥＶ、例えば、エクソソームの投与は、ＳＴＩＮＧアゴニスト単独の投与と比較して、約２～５倍、５～１０倍、１０～２０倍、２０～３０倍、３０～４０倍、４０～５０倍、５０～６０倍、６０～７０倍、７０～８０倍、８０～９０倍、９０～１００倍、１００～２００倍、２００～３００倍、３００～４００倍、４００～５００倍、５００～６００倍、６００～７００倍、７００～８００倍、８００～９００倍、９００～１０００倍、１０００～２０００倍、２０００～３０００倍、３０００～４０００倍、４０００～５０００倍、５０００～６０００倍、６０００～７０００倍、７０００～８０００倍、８０００～９０００倍、または９０００～１０，０００倍高いＩＦＮ－β誘導をもたらし得る。ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含むＥＶ、例えば、エクソソームの投与は、ＳＴＩＮＧアゴニスト単独の投与と比較して、約２倍超、＞５倍、＞１０倍、＞２０倍、＞３０倍、＞４０倍、＞５０倍、＞６０倍、＞７０倍、＞８０倍、＞９０倍、＞１００倍、＞２００倍、＞３００倍、＞４００倍、＞５００倍、＞６００倍、＞７００倍、＞８００倍、＞９００倍、＞１０００倍、＞２０００倍、＞３０００倍、＞４０００倍、＞５０００倍、＞６０００倍、＞７０００倍、＞８０００倍、＞９０００倍、または＞１０，０００倍のＩＦＮ－β誘導をもたらし得る。ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含むＥＶ、例えば、エクソソームの投与は、対象のベースラインＩＦＮ－β産生量と比較して、２倍～１０，０００倍高いＩＦＮ－β誘導をもたらし得る。ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含むＥＶ、例えば、エクソソームの投与は、対象のベースラインＩＦＮ－β産生量と比較して、約２～５倍、５～１０倍、１０～２０倍、２０～３０倍、３０～４０倍、４０～５０倍、５０～６０倍、６０～７０倍、７０～８０倍、８０～９０倍、９０～１００倍、１００～２００倍、２００～３００倍、３００～４００倍、４００～５００倍、５００～６００倍、６００～７００倍、７００～８００倍、８００～９００倍、９００～１０００倍、１０００～２０００倍、２０００～３０００倍、３０００～４０００倍、４０００～５０００倍、５０００～６０００倍、６０００～７０００倍、７０００～８０００倍、８０００～９０００倍、または９０００～１０，０００倍高いＩＦＮ－β誘導をもたらし得る。ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えば、エクソソームの投与は、対象のベースラインＩＦＮ－β産生量と比較して、約２倍超、＞５倍、＞１０倍、＞２０倍、＞３０倍、＞４０倍、＞５０倍、＞６０倍、＞７０倍、＞８０倍、＞９０倍、＞１００倍、＞２００倍、＞３００倍、＞４００倍、＞５００倍、＞６００倍、＞７００倍、＞８００倍、＞９００倍、＞１０００倍、＞２０００倍、＞３０００倍、＞４０００倍、＞５０００倍、＞６０００倍、＞７０００倍、＞８０００倍、＞９０００倍、または＞１０，０００倍のＩＦＮ－β誘導をもたらし得る。
いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶ、例えば、エクソソームを対象に投与することにより、他の免疫モジュレーター（例えば、サイトカインまたはケモカイン）のレベルを調節することもできる。特定の態様では、本明細書に開示される方法は、ＩＦＮ－γ、ＣＸＣＬ９、及び／またはＣＸＣＬ１０のレベルを増加させることができる。いくつかの態様では、本明細書に記載されるＥＶ、例えば、エクソソームの投与は、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストと比較して、約２～５倍、５～１０倍、１０～２０倍、２０～３０倍、３０～４０倍、４０～５０倍、５０～６０倍、６０～７０倍、７０～８０倍、８０～９０倍、９０～１００倍、１００～２００倍、２００～３００倍、３００～４００倍、４００～５００倍、５００～６００倍、６００～７００倍、７００～８００倍、８００～９００倍、９００～１０００倍、１０００～２０００倍、２０００～３０００倍、３０００～４０００倍、４０００～５０００倍、５０００～６０００倍、６０００～７０００倍、７０００～８０００倍、８０００～９０００倍、または９０００～１０，０００倍高いＩＦＮ－γ、ＣＸＣＬ９、及び／またはＣＸＣＬ１０の量をもたらし得る。
いくつかの態様では、方法は、骨髄系樹状細胞（ｍＤＣ）の活性化を誘導する。ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含むＥＶ、例えば、エクソソームの投与は、ＳＴＩＮＧアゴニスト単独の投与と比較して、２倍～５０，０００倍高いｍＤＣの活性化をもたらし得る。ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含むＥＶ、例えば、エクソソームの投与は、ＳＴＩＮＧアゴニスト単独の投与と比較して、約２～５倍、５～１０倍、１０～２０倍、２０～３０倍、３０～４０倍、４０～５０倍、５０～６０倍、６０～７０倍、７０～８０倍、８０～９０倍、９０～１００倍、１００～２００倍、２００～３００倍、３００～４００倍、４００～５００倍、５００～６００倍、６００～７００倍、７００～８００倍、８００～９００倍、９００～１０００倍、１０００～２０００倍、２０００～３０００倍、３０００～４０００倍、４０００～５０００倍、５０００～６０００倍、６０００～７０００倍、７０００～８０００倍、８０００～９０００倍、９０００～１０，０００倍、１０，０００～１５，０００倍、１５，０００～２０，０００倍、２０，０００～２５，０００倍、２５，０００～３０，０００倍、３０，０００～３５，０００倍、３５，０００～４０，０００倍、４０，０００～４５，０００倍、または４５，０００～５０，０００倍高いｍＤＣの活性化をもたらし得る。ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含むＥＶ、例えば、エクソソームの投与は、ＳＴＩＮＧアゴニスト単独の投与と比較して、約２倍超、＞５倍、＞１０倍、＞２０倍、＞３０倍、＞４０倍、＞５０倍、＞６０倍、＞７０倍、＞８０倍、＞９０倍、＞１００倍、＞２００倍、＞３００倍、＞４００倍、＞５００倍、＞６００倍、＞７００倍、＞８００倍、＞９００倍、＞１０００倍、＞２０００倍、＞３０００倍、＞４０００倍、＞５０００倍、＞６０００倍、＞７０００倍、＞８０００倍、＞９０００倍、＞１０，０００倍、＞１５，０００倍、＞２０，０００倍、＞２５，０００倍、＞３０，０００倍、＞３５，０００倍、＞４０，０００倍、＞４５，０００倍、または＞５０，０００倍のｍＤＣの活性化をもたらし得る。
ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含むＥＶ、例えば、エクソソームの投与は、対象のベースラインｍＤＣ活性化と比較して、２倍～１０，０００倍高いｍＤＣの活性化をもたらし得る。ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含むＥＶ、例えば、エクソソームの投与は、対象のベースラインｍＤＣ活性化と比較して、約２～５倍、５～１０倍、１０～２０倍、２０～３０倍、３０～４０倍、４０～５０倍、５０～６０倍、６０～７０倍、７０～８０倍、８０～９０倍、９０～１００倍、１００～２００倍、２００～３００倍、３００～４００倍、４００～５００倍、５００～６００倍、６００～７００倍、７００～８００倍、８００～９００倍、９００～１０００倍、１０００～２０００倍、２０００～３０００倍、３０００～４０００倍、４０００～５０００倍、５０００～６０００倍、６０００～７０００倍、７０００～８０００倍、８０００～９０００倍、９０００～１０，０００倍、１０，０００～１５，０００倍、１５，０００～２０，０００倍、２０，０００～２５，０００倍、２５，０００～３０，０００倍、３０，０００～３５，０００倍、３５，０００～４０，０００倍、４０，０００～４５，０００倍、または４５，０００～５０，０００倍高いｍＤＣの活性化をもたらし得る。ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含むＥＶ、例えば、エクソソームの投与は、対象のベースラインｍＤＣ活性化と比較して、約２倍超、＞５倍、＞１０倍、＞２０倍、＞３０倍、＞４０倍、＞５０倍、＞６０倍、＞７０倍、＞８０倍、＞９０倍、＞１００倍、＞２００倍、＞３００倍、＞４００倍、＞５００倍、＞６００倍、＞７００倍、＞８００倍、＞９００倍、＞１０００倍、＞２０００倍、＞３０００倍、＞４０００倍、＞５０００倍、＞６０００倍、＞７０００倍、＞８０００倍、＞９０００倍、＞１０，０００倍、＞１５，０００倍、＞２０，０００倍、＞２５，０００倍、＞３０，０００倍、＞３５，０００倍、＞４０，０００倍、＞４５，０００倍、または＞５０，０００倍のｍＤＣの活性化をもたらし得る。
いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含むＥＶ、例えば、エクソソームを投与する方法は、対象のベースライン単球活性化と比較して単球の活性化を誘導しない。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含むＥＶ、例えば、エクソソームの投与は、対象のベースライン単球活性化と比較して、約２倍未満、＜５倍、＜１０倍、＜２０倍、＜３０倍、＜４０倍、＜５０倍、＜６０倍、＜７０倍、＜８０倍、＜９０倍、＜１００倍、＜２００倍、＜３００倍、＜４００倍、＜５００倍、＜６００倍、＜７００倍、＜８００倍、＜９００倍、＜１０００倍、＜２０００倍、＜３０００倍、＜４０００倍、＜５０００倍、＜６０００倍、＜７０００倍、＜８０００倍、＜９０００倍、＜１０，０００倍、＜１５，０００倍、＜２０，０００倍、＜２５，０００倍、＜３０，０００倍、＜３５，０００倍、＜４０，０００倍、＜４５，０００倍、＜５０，０００倍、＜５５，０００倍、＜６０，０００倍、＜６５，０００倍、＜７０，０００倍、＜７５，０００倍、＜８０，０００倍、＜８５，０００倍、＜９０，０００倍、＜９５，０００倍、＜１００，０００倍、＜２００，０００倍、＜３００，０００倍、＜４００，０００倍、＜５００，０００倍、＜６００，０００倍、＜７００，０００倍、＜８００，０００倍、＜９００，０００倍、または＜１，０００，０００倍の単球活性化の誘導をもたらす。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含むＥＶ、例えば、エクソソームの対象への投与は、対象のベースライン単球活性化と比較して、約２～５倍、５～１０倍、１０～２０倍、２０～３０倍、３０～４０倍、４０～５０倍、５０～６０倍、６０～７０倍、７０～８０倍、８０～９０倍、９０～１００倍、１００～２００倍、２００～３００倍、３００～４００倍、４００～５００倍、５００～６００倍、６００～７００倍、７００～８００倍、８００～９００倍、９００～１０００倍、１０００～２０００倍、２０００～３０００倍、３０００～４０００倍、４０００～５０００倍、５０００～６０００倍、６０００～７０００倍、７０００～８０００倍、８０００～９０００倍、９０００～１０，０００倍、１０，０００～１５，０００倍、１５，０００～２０，０００倍、２０，０００～２５，０００倍、２５，０００～３０，０００倍、３０，０００～３５，０００倍、３５，０００～４０，０００倍、４０，０００～４５，０００倍、４５，０００～５０，０００倍、５５，０００～６０，０００倍、６０，０００～６５，０００倍、６５，０００～７０，０００倍、７０，０００～７５，０００倍、７５，０００～８０，０００倍、８０，０００～８５，０００倍、８５，０００～９０，０００倍、９０，０００～９５，０００倍、９５，０００～１００，０００倍、１００，０００～２００，０００倍、２００，０００～３００，０００倍、３００，０００～４００，０００倍、４００，０００～５００，０００倍、５００，０００～６００，０００倍、６００，０００～７００，０００倍、７００，０００～８００，０００倍、８００，０００～９００，０００倍、または９００，０００～１，０００，０００倍未満の単球活性化の誘導をもたらす。
いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含むＥＶ、例えば、エクソソームを対象に投与する方法は、ＳＴＩＮＧアゴニスト単独の投与と比較して単球の活性化を誘導しない。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含むＥＶ、例えば、エクソソームの投与は、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストの投与後の単球活性化の量と比較して、約２倍未満、＜５倍、＜１０倍、＜２０倍、＜３０倍、＜４０倍、＜５０倍、＜６０倍、＜７０倍、＜８０倍、＜９０倍、＜１００倍、＜２００倍、＜３００倍、＜４００倍、＜５００倍、＜６００倍、＜７００倍、＜８００倍、＜９００倍、＜１０００倍、＜２０００倍、＜３０００倍、＜４０００倍、＜５０００倍、＜６０００倍、＜７０００倍、＜８０００倍、＜９０００倍、＜１０，０００倍、＜１５，０００倍、＜２０，０００倍、＜２５，０００倍、＜３０，０００倍、＜３５，０００倍、＜４０，０００倍、＜４５，０００倍、または＜５０，０００倍の単球活性化の誘導をもたらす。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含むＥＶ、例えば、エクソソームの対象への投与は、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストの投与後の単球活性化の量と比較して、約２～５倍、５～１０倍、１０～２０倍、２０～３０倍、３０～４０倍、４０～５０倍、５０～６０倍、６０～７０倍、７０～８０倍、８０～９０倍、９０～１００倍、１００～２００倍、２００～３００倍、３００～４００倍、４００～５００倍、５００～６００倍、６００～７００倍、７００～８００倍、８００～９００倍、９００～１０００倍、１０００～２０００倍、２０００～３０００倍、３０００～４０００倍、４０００～５０００倍、５０００～６０００倍、６０００～７０００倍、７０００～８０００倍、８０００～９０００倍、９０００～１０，０００倍、１０，０００～１５，０００倍、１５，０００～２０，０００倍、２０，０００～２５，０００倍、２５，０００～３０，０００倍、３０，０００～３５，０００倍、３５，０００～４０，０００倍、４０，０００～４５，０００倍、または４５，０００～５０，０００倍未満の単球活性化の誘導をもたらす。単球の活性化は、単球上のＣＤ８６の表面発現によって、または当該技術分野では周知の他の任意の適切な単球活性化マーカーによって測定することができる。
本明細書に記載されるＥＶ、例えば、エクソソームに関連する改善された治療効果のため、いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含むＥＶ、例えば、エクソソームの、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストと比較してより低い投与量を投与することができる。さらに、高用量のＳＴＩＮＧアゴニストの非選択的送達は、望ましい免疫刺激応答を減弱させる可能性がある。したがって、本明細書に記載されるＥＶ、例えば、エクソソームは、より低い用量で投与することができるため、いくつかの態様では、それらより広い治療濃度域で作用し、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストに認められる傾向（例えば、全身毒性、免疫細胞殺傷、細胞選択性の欠如）を低減することができる。
本明細書に記載の組成物は、それを必要とする対象の疾患、障害、状態、または症状を改善するのに十分な投与量で投与することができる。いくつかの態様では、必要とする対象に投与されるＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えば、エクソソームの投与量は、約０．０１～０．１μＭ、０．１～１μＭ、１～１０μＭ、１０～１００μＭ、または１００～１０００μＭである。特定の態様では、必要とする対象に投与されるＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えば、エクソソームの投与量は、約０．０１μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．８μＭ、０．９μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１７μＭ、１８μＭ、１９μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、４０μＭ、５５μＭ、６０μＭ、６５μＭ、７０μＭ、７５μＭ、８０μＭ、８５μＭ、９０μＭ、９５μＭ、１００μＭ、１５０μＭ、２００μＭ、２５０μＭ、３００μＭ、３５０μＭ、４００μＭ、４５０μＭ、５００μＭ、５５０μＭ、６００μＭ、６５０μＭ、７００μＭ、７５０μＭ、８００μＭ、８５０μＭ、９００μＭ、９５０μＭ、または１０００μＭである。
いくつかの態様では、必要とする対象に投与されるＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含むＥＶ、例えば、エクソソームの量は、必要とする対象で同じ改善結果をもたらすのに必要な遊離ＳＴＩＮＧアゴニストの量と比較して、２倍未満、＜５倍、＜１０倍、＜２０倍、＜３０倍、＜４０倍、＜５０倍、＜６０倍、＜７０倍、＜８０倍、＜９０倍、＜１００倍、＜２００倍、＜３００倍、＜４００倍、＜５００倍、＜６００倍、＜７００倍、＜８００倍、＜９００倍、＜１０００倍、＜２０００倍、＜３０００倍、＜４０００倍、＜５０００倍、＜６０００倍、＜７０００倍、＜８０００倍、＜９０００倍、＜１０，０００倍、＜１５，０００倍、＜２０，０００倍、＜２５，０００倍、＜３０，０００倍、＜３５，０００倍、＜４０，０００倍、＜４５，０００倍、または＜５０，０００倍である。いくつかの態様では、必要とする対象に投与されるＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含むＥＶ、例えば、エクソソームの量は、必要とする対象で同じ改善結果をもたらすのに必要な遊離ＳＴＩＮＧアゴニストの量と比較して、約２～５倍、５～１０倍、１０～２０倍、２０～３０倍、３０～４０倍、４０～５０倍、５０～６０倍、６０～７０倍、７０～８０倍、８０～９０倍、９０～１００倍、１００～２００倍、２００～３００倍、３００～４００倍、４００～５００倍、５００～６００倍、６００～７００倍、７００～８００倍、８００～９００倍、９００～１０００倍、１０００～２０００倍、２０００～３０００倍、３０００～４０００倍、４０００～５０００倍、５０００～６０００倍、６０００～７０００倍、７０００～８０００倍、８０００～９０００倍、９０００～１０，０００倍、１０，０００～１５，０００倍、１５，０００～２０，０００倍、２０，０００～２５，０００倍、２５，０００～３０，０００倍、３０，０００～３５，０００倍、３５，０００～４０，０００倍、４０，０００～４５，０００倍、または４５，０００～５０，０００倍未満である。
いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えば、エクソソームを投与する方法は、対象のベースラインの全身性炎症と比較して、全身性炎症を誘導しない。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えば、エクソソームの投与は、対象のベースラインの全身性炎症と比較して、約２倍未満、＜５倍、＜１０倍、＜２０倍、＜３０倍、＜４０倍、＜５０倍、＜６０倍、＜７０倍、＜８０倍、＜９０倍、＜１００倍、＜２００倍、＜３００倍、＜４００倍、＜５００倍、＜６００倍、＜７００倍、＜８００倍、＜９００倍、＜１０００倍、＜２０００倍、＜３０００倍、＜４０００倍、＜５０００倍、＜６０００倍、＜７０００倍、＜８０００倍、＜９０００倍、＜１０，０００倍、＜１５，０００倍、＜２０，０００倍、＜２５，０００倍、＜３０，０００倍、＜３５，０００倍、＜４０，０００倍、＜４５，０００倍、または＜５０，０００倍の全身性炎症の誘導をもたらす。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ、例えば、エクソソームの投与は、対象のベースラインの全身性炎症と比較して、約２～５倍、５～１０倍、１０～２０倍、２０～３０倍、３０～４０倍、４０～５０倍、５０～６０倍、６０～７０倍、７０～８０倍、８０～９０倍、９０～１００倍、１００～２００倍、２００～３００倍、３００～４００倍、４００～５００倍、５００～６００倍、６００～７００倍、７００～８００倍、８００～９００倍、９００～１０００倍、１０００～２０００倍、２０００～３０００倍、３０００～４０００倍、４０００～５０００倍、５０００～６０００倍、６０００～７０００倍、７０００～８０００倍、８０００～９０００倍、９０００～１０，０００倍、１０，０００～１５，０００倍、１５，０００～２０，０００倍、２０，０００～２５，０００倍、２５，０００～３０，０００倍、３０，０００～３５，０００倍、３５，０００～４０，０００倍、４０，０００～４５，０００倍、または４５，０００～５０，０００倍未満の全身性炎症の誘導をもたらす。
いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含むＥＶ、例えば、エクソソームを対象に投与する方法は、ＳＴＩＮＧアゴニスト単独の投与と比較して全身性炎症を誘導しない。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含むＥＶ、例えば、エクソソームの投与は、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストの投与後の全身性炎症の量と比較して、約２倍未満、＜５倍、＜１０倍、＜２０倍、＜３０倍、＜４０倍、＜５０倍、＜６０倍、＜７０倍、＜８０倍、＜９０倍、＜１００倍、＜２００倍、＜３００倍、＜４００倍、＜５００倍、＜６００倍、＜７００倍、＜８００倍、＜９００倍、＜１０００倍、＜２０００倍、＜３０００倍、＜４０００倍、＜５０００倍、＜６０００倍、＜７０００倍、＜８０００倍、＜９０００倍、＜１０，０００倍、＜１５，０００倍、＜２０，０００倍、＜２５，０００倍、＜３０，０００倍、＜３５，０００倍、＜４０，０００倍、＜４５，０００倍、または＜５０，０００倍の全身性炎症の誘導をもたらす。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含むＥＶ、例えば、エクソソームの対象への投与は、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストの投与後の全身性炎症の量と比較して、約２～５倍、５～１０倍、１０～２０倍、２０～３０倍、３０～４０倍、４０～５０倍、５０～６０倍、６０～７０倍、７０～８０倍、８０～９０倍、９０～１００倍、１００～２００倍、２００～３００倍、３００～４００倍、４００～５００倍、５００～６００倍、６００～７００倍、７００～８００倍、８００～９００倍、９００～１０００倍、１０００～２０００倍、２０００～３０００倍、３０００～４０００倍、４０００～５０００倍、５０００～６０００倍、６０００～７０００倍、７０００～８０００倍、８０００～９０００倍、９０００～１０，０００倍、１０，０００～１５，０００倍、１５，０００～２０，０００倍、２０，０００～２５，０００倍、２５，０００～３０，０００倍、３０，０００～３５，０００倍、３５，０００～４０，０００倍、４０，０００～４５，０００倍、または４５，０００～５０，０００倍未満の全身性炎症の誘導をもたらす。全身性炎症は、当該技術分野では周知の任意の適切な方法によって定量または測定することができる。
いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含むＥＶ、例えば、エクソソームを対象に投与する方法は、さらなる治療薬を投与することをさらに含む。いくつかの態様では、ＥＶはさらなる治療薬をさらに含む。いくつかの態様では、さらなる治療薬は、リガンド、サイトカイン、または抗体を含む。いくつかの態様では、さらなる治療薬は、免疫調節剤である。いくつかの態様では、免疫調節成分は、ネガティブチェックポイント調節因子の阻害剤、またはネガティブチェックポイント調節因子の結合パートナーの阻害剤である。これらの態様のいくつかでは、ネガティブチェックポイント調節因子は、細胞毒性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン含有タンパク質３（ＴＩＭ－３）、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、ＣＤ２０、ＣＤ３９、及びＣＤ７３からなる群から選択される。さまざまな態様において、さらなる治療薬は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。いくつかの態様では、抗体及びその抗原結合フラグメントは、１つ以上の全抗体、ポリクローナル、モノクローナル及び組換え抗体、それらのフラグメントであり、一本鎖抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ、マウス－ヒト、マウス－霊長類、霊長類－ヒトモノクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、及びＦｄフラグメントのような抗体フラグメント、ダイアボディ、ならびに抗体関連ポリペプチドをさらに含む。抗体なる用語は、所望の生物学的活性または機能を呈する限り、二重特異性抗体及び多重特異性抗体を含む。いくつかの態様では、さらなる治療剤は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＴＩＭ－３、またはＬＡＧ３の阻害剤である治療用抗体またはその抗原結合フラグメントである。
いくつかの態様では、さらなる治療剤は、Ｔ細胞の疲弊を防止または治療する薬剤である。このような薬剤は、Ｐｒｄｍ１、Ｂｈｌｈｅ４０、Ｉｒｆ４、Ｉｋｚｆ２、Ｚｅｂ２、Ｌａｓｓ６、Ｅｇｒ２、Ｔｏｘ、Ｅｏｍｅｓ、Ｎｆａｔｃ１、Ｎｆａｔｃ２、Ｚｂｔｂ３２、Ｒｂｐｊ、Ｈｉｆ１ａ、Ｌａｇ３、Ｔｎｆｒｓｆ９、Ｐｔｇｅｒ２、Ｈａｖｃｒ２、Ａｌｃａｍ、Ｔｉｇｉｔ、Ｃｔｌａ４、Ｐｔｇｅｒ４、Ｔｎｆｒｓｆ１ｂ、Ｃｃｌ４、ＣＤ１０９、ＣＤ２００、Ｔｎｆｓｆ９、Ｎｒｐ１、Ｓｅｍａ４ｃ、Ｐｔｐｒｊ、Ｉｌ２１、Ｔｓｐａｎ２、Ｒｇｓ１６、Ｓｈ２ｄ２ａ、Ｎｕｃｂ１、Ｐｌｓｃｒ１、Ｐｔｐｎ１１、Ｐｒｋｃａ、Ｐｌｓｃｒ４、Ｃａｓｐ３、Ｇｐｄ２、Ｇａｓ２、Ｓｈ３ｒｆ１、Ｎｈｅｄｃ２、Ｐｌｅｋ、Ｔｎｆａｉｐ２、及びＣｔｓｂ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、Ｔ細胞の疲弊に関連する遺伝子の発現を増加、減少、または調節することができる。治療剤は、ＮＦＡＴ－１またはＮＦＡＴ－２を含むＴ細胞の疲弊に関連するタンパク質を増加、減少、または調節する場合もある。
ＶＩ．Ｂ．がんを治療する方法
本明細書では、対象のがんを治療する方法を提供する。この方法は、対象に治療有効量の本明細書に開示される組成物を投与することを含み、組成物は対象におけるＳＴＩＮＧ介在型免疫応答を増加させ、それにより対象の免疫系の腫瘍標的化を高めることができる。いくつかの態様では、組成物は、対象に腫瘍内投与される。いくつかの態様では、組成物は、非経口的、経口的、静脈内、筋肉内、腹腔内、または他の任意の適切な投与経路を介して投与される。
本明細書では、対象のがんの転移を防止する方法が提供される。方法は、対象に治療有効量の本明細書に開示される組成物を投与することを含み、組成物は、対象のある位置の１つ以上の腫瘍が対象の別の位置の１つ以上の腫瘍の成長を促進することを防止することができる。いくつかの態様では、組成物は、ある位置の第１の腫瘍に腫瘍内投与され、第１の腫瘍に投与された組成物は、第２の位置の１つ以上の腫瘍の転移を防止する。
いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶ、例えば、エクソソームを投与することは、対象の腫瘍の増殖を阻害及び／または減少させる。いくつかの態様では、腫瘍増殖（例えば、腫瘍の体積または重量）は、基準（例えば、遊離ＳＴＩＮＧアゴニストまたはＳＴＩＮＧアゴニストを含まないＥＶ、例えば、エクソソームの投与後の対応する対象における腫瘍体積）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％減少する。
いくつかの態様では、治療されるがんは、白血球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球）の腫瘍微小環境への浸潤、またはいわゆる「熱い腫瘍（ｈｏｔ ｔｕｍｏｒ）」もしくは「炎症性腫瘍」により特徴付けられる。いくつかの態様では、治療されるがんは、腫瘍微小環境への低レベルもしくは検出不可能なレベルの白血球浸潤、またはいわゆる「冷たい腫瘍（ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒ）」もしくは「非炎症性腫瘍」により特徴付けられる。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは、「冷たい腫瘍」を「熱い腫瘍」に変換するのに十分な量及び時間で投与され、すなわち、前記投与することは、白血球（Ｔ細胞のような）の腫瘍微小環境への浸潤を引き起こす。特定の態様では、がんは、膀胱癌、子宮頸癌、腎細胞癌、精巣癌、結腸直腸癌、肺癌、頭頸部癌、及び卵巣癌、リンパ腫、肝臓癌、神経膠芽腫、黒色腫、骨髄腫、白血病、膵臓癌、またはそれらの組み合わせを含む。本明細書で使用するところの「遠位腫瘍」、「遠隔腫瘍」、または「二次腫瘍」なる用語は、元の（または原発性）腫瘍から遠隔臓器または遠隔組織、例えばリンパ節に拡散した腫瘍を指す。いくつかの態様では、本開示のＥＶ、例えば、エクソソームは、転移性拡散後の腫瘍を治療する。
本明細書に開示される方法によって治療することが可能ながん（または腫瘍）の非限定的な例としては、扁平上皮癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌、扁平上皮非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、非扁平上皮ＮＳＣＬＣ、消化器癌、腎癌（例えば、腎淡明細胞癌）、卵巣癌、肝癌（例えば、肝細胞癌）、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎癌（例えば、腎細胞癌（ＲＣＣ））、前立腺癌（例えば、ホルモン抵抗性前立腺癌）、甲状腺癌、膵癌、子宮頸癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、及び頭頸部癌（または癌腫）、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胚細胞腫瘍、小児肉腫、鼻腔ナチュラルキラー、黒色腫（例えば、皮膚または眼内悪性黒色腫のような転移性悪性黒色腫）、骨癌、皮膚癌、子宮癌、肛門部癌、精巣癌（例えば、絨毛癌及び非セミノーマ）、卵管癌、子宮内膜癌、頸癌、膣癌、外陰癌、食道癌（例えば、食道胃接合部癌）、小腸癌、内分泌系癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児の固形腫瘍、尿管癌、腎盂癌腫、腫瘍血管新生、下垂体腺腫、カポジ肉腫、表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストによって誘発されるものを含む環境誘発癌、ウイルス関連癌またはウイルス起源癌（例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ関連または起源腫瘍））、及び２つの主要血球系統、すなわち骨髄細胞系（顆粒球、赤血球、血小板、マクロファージ及びマスト細胞を生成する）またはリンパ細胞系（Ｂ、Ｔ、ＮＫ及び形質細胞を生成する）のいずれかに由来する血液学的悪性腫瘍、例えばすべての種類の白血病、リンパ腫、及び骨髄種、例えば急性、慢性、リンパ球性及び／または骨髄性白血病、例えば急性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、未分化ＡＭＬ（ＭＯ）、骨髄芽球性白血病（Ｍ１）、骨髄芽球性白血病（Ｍ２；細胞成熟を伴う）、前骨髄球性白血病（Ｍ３またはＭ３変異型［Ｍ３Ｖ］）、骨髄単球性白血病（Ｍ４または好酸球増加症を伴うＭ４変異型［Ｍ４Ｅ］）、単球性白血病（Ｍ５）、赤白血病（Ｍ６）、巨核芽球性白血病（Ｍ７）、単離顆粒球性肉腫、及び緑色腫；リンパ腫、例えばホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、Ｂ細胞血液学的悪性腫瘍、例えばＢ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、単球性Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ組職（ＭＡＬＴ）リンパ腫、未分化（例えば、Ｋｉ１＋）大細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病、マントル細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫、腸Ｔ細胞リンパ腫、縦隔原発細胞型Ｂ細胞リンパ腫、前駆体Ｔリンパ芽球性リンパ腫、Ｔリンパ芽球性；及びリンパ腫／白血病（Ｔ－Ｌｂｌｙ／Ｔ－ＡＬＬ）、末梢Ｔ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、移植後リンパ増殖性疾患、組織球性リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫（ＬＢＬ）、リンパ系の造血性腫瘍、急性リンパ芽球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性組織球性リンパ腫（ＤＨＬ）、免疫芽細胞性リンパ腫、前駆体Ｂリンパ芽球性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫（ＣＴＬＣ）（菌状息肉腫またはセザリー症候群とも呼ばれる）、及びヴァルデンストレームマクログロブリン血症を伴うリンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＰＬ）；骨髄腫、例えばＩｇＧ骨髄腫、軽鎖骨髄腫、非分泌性骨髄腫、くすぶり型骨髄腫（無痛性骨髄種とも呼ばれる）、孤立性形質細胞腫、及び多発性骨髄種、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、毛状細胞リンパ腫；骨髄細胞系の造血性腫瘍、線維肉腫及び横紋筋肉腫を含む間葉由来の腫瘍；セミノーマ、奇形癌腫；線維肉腫、横紋筋肉腫及び骨肉腫を含む間葉起源の腫瘍；ならびに黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、セミノーマ、甲状腺濾胞性癌及び奇形癌腫を含むその他の腫瘍、リンパ系の造血性腫瘍、例えば、これらに限定されるものではないが、小細胞及び脳回状細胞タイプを含む、Ｔ前リンパ球性白血病（Ｔ－ＰＬＬ）のようなＴ細胞疾患を含むＴ細胞及びＢ細胞腫瘍；Ｔ細胞タイプの大型顆粒リンパ球白血病（ＬＧＬ）；ａ／ｄ Ｔ－ＮＨＬ肝脾リンパ腫；末梢／胸腺後Ｔ細胞リンパ腫（多形成及び免疫芽球性サブタイブ）；血管中心性（鼻）Ｔ細胞リンパ腫；頭頸部癌、腎癌、直腸癌、甲状腺癌；急性骨髄性リンパ腫、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
いくつかの態様では、治療することができるがん（または腫瘍）は、乳癌、頭頸部癌、子宮癌、脳腫瘍、皮膚癌、腎癌、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、肝臓癌、膀胱癌、腎臓癌、腹膜癌、膵臓癌、甲状腺癌、食道癌、眼癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）（胃（ｇａｓｔｒｉｃ））癌、消化管癌、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、またはそれらの組み合わせを含む。特定の態様では、本開示で治療することが可能ながんは、膵臓癌及び／または腹膜癌である。
いくつかの態様では、本明細書に記載の方法は、転移性癌、切除不能な難治性癌（例えば、以前の癌治療に不応性の癌）、及び／または再発癌の治療に使用することもできる。
いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶ、例えば、エクソソームは、１つ以上のさらなる抗癌剤及び／または免疫調節剤と併用することができる。かかる薬剤としては、例えば、化学療法薬、小分子薬、または所定のがんに対する免疫応答を刺激する抗体が挙げられ得る。いくつかの態様では、本明細書に記載の方法は、標準治療（例えば、外科手術、放射線、及び化学療法）と併用される。
いくつかの態様では、本明細書に開示されるがんを治療するための方法は、（ｉ）ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含むＥＶ、例えば、エクソソームを、（ｉｉ）ＩＬ－１２部分と併用して、抗がん剤、例えば、１つ以上のがん免疫療法剤、例えば、チェックポイント阻害剤とともに投与することを含むことができ、それにより、免疫経路の複数の要素を標的化することができる。いくつかの態様では、本明細書に開示されるがんを治療するための方法は、（ｉ）ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含む第１のＥＶ、例えば、エクソソームと、（ｉｉ）ＩＬ－１２部分（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含む第２のＥＶ、例えば、エクソソームと、（ｉｉｉ）抗がん剤、例えば、１つ以上のがん免疫療法剤、例えば、チェックポイント阻害剤と、を投与することを含み、それにより、免疫経路の複数の要素を標的化することができる。いくつかの態様では、本明細書に開示されるがんを治療するための方法は、（ｉ）ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含む第１のＥＶ、例えば、エクソソームと、（ｉｉ）ＩＬ－１２部分と、（ｉｉｉ）抗がん剤、例えば、１つ以上のがん免疫療法剤、例えば、チェックポイント阻害剤を含む第２のＥＶ、例えば、エクソソームと、を投与することを含み、抗がん剤は、封入されるか、第２のＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面または外表面に発現される。いくつかの態様では、本明細書に開示されるがんを治療するための方法は、（ｉ）ＳＴＩＮＧアゴニストと、（ｉｉ）ＩＬ－１２部分（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含む第１のＥＶ、例えば、エクソソームと、（ｉｉｉ）抗がん剤、例えば、１つ以上のがん免疫療法剤、例えば、チェックポイント阻害剤を含む第２のＥＶ、例えば、エクソソームと、を投与することを含み、抗がん剤は、封入されるか、第２のＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面または外表面に発現される。いくつかの態様では、本明細書に開示されるがんを治療するための方法は、（ｉ）ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含む第１のＥＶ、例えば、エクソソームと、（ｉｉ）ＩＬ－１２部分（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含む第２のＥＶ、例えば、エクソソームと、（ｉｉｉ）抗がん剤（例えば、１つ以上のがん免疫療法剤、例えば、チェックポイント阻害剤）を含む第３のＥＶ、例えば、エクソソームと、を投与することを含み、抗がん剤は、封入されるか、第３のＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面または外表面に発現される。
いくつかの態様では、本明細書に開示されるがんを治療するための方法は、（ｉ）（ａ）ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）及び（ｂ）ＩＬ－１２部分（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含むＥＶ、例えば、エクソソームと、（ｉｉ）抗がん剤、例えば、１つ以上のがん免疫療法剤、例えば、チェックポイント阻害剤と、を投与することを含み、それにより、免疫経路の複数の要素を標的化することができる。いくつかの態様では、本明細書に開示されるがんを治療するための方法は、（ｉ）（ａ）ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）及び（ｂ）抗がん剤、例えば、１つ以上のがん免疫療法剤、例えば、チェックポイント阻害剤（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含むＥＶ、例えば、エクソソームと、（ｉｉ）ＩＬ－１２部分と、を投与することを含む。いくつかの態様では、本明細書に開示されるがんを治療するための方法は、（ｉ）（ａ）ＩＬ－１２部分（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）及び（ｂ）抗がん剤、例えば、１つ以上のがん免疫療法剤、例えば、チェックポイント阻害剤（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含むＥＶ、例えば、エクソソームと、（ｉｉ）ＳＴＩＮＧアゴニストと、を投与することを含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されるがんを治療するための方法は、（ｉ）ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含むＥＶ、例えば、エクソソームと、（ｉｉ）ＩＬ－１２部分と、（ｉｉｉ）抗がん剤、例えば、１つ以上のがん免疫療法剤、例えば、チェックポイント阻害剤と、を投与することを含み、それにより、免疫経路の複数の要素を標的化することができる。いくつかの態様では、本明細書に開示されるがんを治療するための方法は、（ｉ）ＩＬ－１２部分（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含むＥＶ、例えば、エクソソームと、（ｉｉ）ＳＴＩＮＧアゴニストと、（ｉｉｉ）抗がん剤、例えば、１つ以上のがん免疫療法剤、例えば、チェックポイント阻害剤と、を投与することを含む。いくつかの態様では、本明細書に開示されるがんを治療するための方法は、（ｉ）抗がん剤、例えば、１つ以上のがん免疫療法剤、例えば、チェックポイント阻害剤（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含むＥＶ、例えば、エクソソームと、（ｉｉ）ＳＴＩＮＧアゴニストと、（ｉｉｉ）ＩＬ－１２部分と、を投与することを含む。
いくつかの態様では、方法は、（ｉ）ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、ＥＶ（例えば、エクソソーム）に関連付けられたものか、または遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト）を、（ｉｉ）ＩＬ－１２部分（例えば、ＥＶ（例えば、エクソソーム）に関連付けられたものか、または遊離ＩＬ－１２部分）を投与するよりも前に投与することを含む。いくつかの態様では、方法は、（ｉ）ＩＬ－１２部分（例えば、ＥＶ（例えば、エクソソーム）に関連付けられたものか、または遊離ＩＬ－１２部分）を、（ｉｉ）ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、ＥＶ（例えば、エクソソーム）に関連付けられたものか、または遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト）を投与するよりも前に投与することを含む。いくつかの態様では、（ｉ）は、（ｉｉ）の少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約６時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約７２時間、または少なくとも約９６時間前に投与される。いくつかの態様では、（ｉ）は（ｉｉ）の少なくとも約２４時間前に投与される。いくつかの態様では、（ｉ）は（ｉｉ）の少なくとも約４８時間前に投与される。
いくつかの態様では、方法は、（ｉ）ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、ＥＶ（例えば、エクソソーム）に関連付けられたものか、または遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト）と、（ｉｉ）ＩＬ－１２部分（例えば、ＥＶ（例えば、エクソソーム）に関連付けられたものか、または遊離ＩＬ－１２部分）と、（ｉｉｉ）さらなる抗がん剤（例えば、ＥＶ（例えば、エクソソーム）に関連付けられたものか、またはＥＶ（例えば、エクソソーム）に関連付けられていないもの）と、を投与することを含み、（ａ）（ｉ）が（ｉｉ）よりも前に投与され、かつ（ｉｉ）が（ｉｉｉ）よりも前に投与されるか、（ｂ）（ｉｉ）が（ｉ）よりも前に投与され、かつ（ｉ）が（ｉｉｉ）よりも前に投与されるか、（ｃ）（ｉｉｉ）が（ｉ）よりも前に投与され、かつ（ｉ）が（ｉｉ）よりも前に投与されるか、（ｄ）（ｉｉｉ）が（ｉｉ）よりも前に投与され、かつ（ｉｉ）が（ｉｉ）よりも前に投与されるか、（ｅ）（ｉ）と（ｉｉ）が同時に、かつ（ｉｉｉ）よりも前に投与されるか、（ｆ）（ｉ）と（ｉｉ）が同時に、かつ（ｉｉｉ）よりも後に投与されるか、（ｇ）（ｉ）と（ｉｉｉ）が同時に、かつ（ｉｉ）よりも前に投与されるか、（ｈ）（ｉ）と（ｉｉｉ）が同時に、かつ（ｉｉ）よりも後に投与されるか、（ｊ）（ｉｉ）と（ｉｉｉ）が同時に、かつ（ｉ）よりも前に投与されるか、（ｋ）（ｉｉ）と（ｉｉｉ）が同時に、かつ（ｉ）よりも後に投与されるか、または（ｌ）（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）が同時に投与される。いくつかの態様では、投与は、（ｉｉ）の前に少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約６時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約７２時間、または少なくとも約９６時間の間隔を置く。
かかる併用の非限定的な例としては、腫瘍抗原提示を促進する療法（例えば、樹状細胞ワクチン、ＧＭ－ＣＳＦ分泌細胞ワクチン、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、及びイミキモドなど）；例えば、ＣＴＬＡ－４及び／またはＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を阻害することにより、及び／またはＴｒｅｇもしくは他の免疫抑制細胞（例えば、骨髄由来抑制細胞）を枯渇もしくはブロックすることにより負の免疫制御を阻害する療法；例えば、ＣＤ－１３７、ＯＸ－４０、及び／またはＣＤ４０またはＧＩＴＲ経路を刺激するか及び／またはＴ細胞エフェクター機能を刺激するアゴニストを用いて、正の免疫制御を刺激する療法；抗腫瘍Ｔ細胞の頻度を全身的に増大させる療法；例えば、ＣＤ２５のアンタゴニスト（例えばガクリズマブ）を用いるかまたはエクスビボの抗ＣＤ２５ビーズ枯渇により、腫瘍内のＴｒｅｇなどのＴｒｅｇを枯渇または阻害する療法；腫瘍内の抑制性骨髄細胞の機能に影響を与える療法；腫瘍細胞の免疫原性を高める療法（例えば、アントラサイクリン）；例えばキメラ抗原受容体により改変された細胞などの遺伝子改変細胞を含む、養子Ｔ細胞またはＮＫ細胞移植（ＣＡＲ－Ｔ療法）；インドールアミンジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、ジオキシゲナーゼ、アルギナーゼ、または一酸化窒素合成酵素などの代謝酵素を阻害する療法；Ｔ細胞のアナジーまたは疲弊を逆転／防止する療法；腫瘍部位における自然免疫活性化及び／または炎症を誘発する療法；免疫刺激性サイトカインの投与；または免疫抑制性サイトカインのブロッキングが挙げられる。
いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶ、例えば、エクソソーム及びＩＬ－１２部分と併用することができるがん免疫療法剤は、免疫チェックポイント阻害剤（すなわち、特定の免疫チェックポイント経路を介したシグナル伝達を遮断する）をさらに含む。本方法で使用できる免疫チェックポイント阻害剤の非限定的な例は、ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト（例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体）、ＰＤ－１アンタゴニスト（例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体）、ＴＩＭ－３アンタゴニスト（例えば、抗ＴＩＭ－３抗体）、またはそれらの組み合わせを含む。
いくつかの態様では、がん免疫療法剤は免疫チェックポイント活性化剤（すなわち、特定の免疫チェックポイント経路を介したシグナル伝達を促進する）を含む。特定の態様では、免疫チェックポイント活性化剤は、ＯＸ４０アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０抗体）、ＬＡＧ－３アゴニスト（例えば、抗ＬＡＧ－３抗体）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト（例えば、抗ＣＤ１３７抗体）、ＧＩＴＲアゴニスト（例えば、抗ＧＩＴＲ抗体）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶ、例えば、エクソソームと本明細書に記載される第２の薬剤（例えば、免疫チェックポイント阻害剤）との組み合わせは、薬学的に許容される担体中の単一組成物として同時に投与することができる。他の態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームと本明細書に記載される第２の薬剤（例えば、免疫チェックポイント阻害剤）との組み合わせは、別々の組成物として同時に投与することができる。さらなる態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームと本明細書に記載される第２の薬剤（例えば、免疫チェックポイント阻害剤）との組み合わせは、順次投与することができる。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは、第２の薬剤（例えば、免疫チェックポイント阻害剤）の投与前に投与される。
ＶＩ．Ｃ．医薬組成物
本明細書では、対象への投与に適したＥＶ、例えば、エクソソームを含む医薬組成物が提供される。医薬組成物は、一般に、ＳＴＩＮＧアゴニスト及び／またはＩＬ－１２部分（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含む複数のＥＶ、例えば、エクソソームと、対象への投与に適した形態の薬学的に許容される賦形剤または担体と、を含む。いくつかの態様では、医薬組成物は、（ｉ）ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含む複数のＥＶ、例えば、エクソソームと、（ｉｉ）ＩＬ－１２部分と、（ｉｉｉ）対象への投与に適した形態の薬学的に許容される賦形剤または担体と、を含む。いくつかの態様では、医薬組成物は、（ｉ）ＩＬ－１２部分（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含む複数のＥＶ、例えば、エクソソームと、（ｉｉ）ＳＴＩＮＧアゴニストと、（ｉｉｉ）対象への投与に適した形態の薬学的に許容される賦形剤または担体と、を含む。いくつかの態様では、医薬組成物は、（ｉ）ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面に発現される）を含む複数のＥＶ、例えば、エクソソームと、（ｉｉ）ＩＬ－１２部分（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含む複数のＥＶ、例えば、エクソソームと、（ｉｉｉ）対象への投与に適した形態の薬学的に許容される賦形剤または担体と、を含む。いくつかの態様では、医薬組成物は、（ｉ）ＳＴＩＮＧアゴニスト及びＩＬ－１２部分（例えば、封入されるか、内腔表面または外表面上で発現される）を含む複数のＥＶ、例えば、エクソソームと、（ｉｉ）対象への投与に適した形態の薬学的に許容される賦形剤または担体と、を含む。
薬学的に許容される賦形剤または担体は、一部には、投与される特定の組成物によって、また、組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。したがって、複数のＥＶ、例えば、エクソソームを含む医薬組成物の多種多様な適当な製剤がある（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．１８ｔｈ ｅｄ．（１９９０）を参照）。医薬組成物は一般に、無菌状態で、米国食品医薬品局の適正製造基準（ＧＭＰ）規制のすべてに完全に準拠したものとして製剤化される。
いくつかの態様では、医薬組成物は、本明細書に記載される１つ以上のＳＴＩＮＧアゴニストと、ＥＶ、例えば、エクソソームとを含む。本開示のＥＶ、例えば、ＳＴＩＮＧアゴニストを含むＥＶ及びＩＬ－１２部分を含む第２のＥＶは、一緒にまたは別々に配合することができる。
薬学的に許容される賦形剤は、一般に安全と認められ（ＧＲＡＳ）、非毒性で、望ましい賦形剤を含み、ヒトの医薬としての使用だけでなく、獣医学的使用においても許容される賦形剤が含まれる。
担体または希釈剤の例としては、これらに限定されるものではないが、水、生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。薬学的活性物質のためのかかる媒体及び化合物の使用は当該技術分野では周知のものである。任意の従来の培地または化合物が本明細書に記載されるＥＶ、例えば、エクソソームと不適合でない限り、組成物におけるそれらの使用が企図される。補助治療剤を組成物に添加することもできる。一般的に、医薬組成物は、その意図される投与経路に適合するように配合される。ＥＶ、例えば、エクソソームは、腫瘍内、非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、皮内、経皮、直腸内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、筋肉内経路または吸入剤によって投与することができる。一態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームを含む医薬組成物は、例えば、注射によって静脈内投与される。ＥＶ、例えば、エクソソームは、場合により、ＥＶ、例えば、エクソソームが意図される疾患、障害または状態の治療に少なくとも部分的に有効である他の治療薬と組み合わせて投与することができる。
溶液または懸濁液は、以下の成分、すなわち、水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような滅菌希釈剤、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗微生物化合物、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のようなキレート化合物、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩のような緩衝液、及び塩化ナトリウムまたはデキストロースのような浸透圧を調節するための化合物を含むことができる。ｐＨは、塩酸や水酸化ナトリウムなどの酸または塩基によって調整することができる。製剤は、ガラスもしくはプラスチックで形成されたアンプル、使い捨て注射器、または複数用量バイアルに封入することができる。
注射可能な使用に適した医薬組成物としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液及び滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与の場合、適当な担体として、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。組成物は一般的に無菌であり、容易に注射器で使用できる程度の流動性を有する。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適当な混合物を含有する溶媒または分散媒とすることができる。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の活動の防止は、さまざまな抗菌化合物及び抗真菌化合物、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって実現することができる。必要に応じて、等張化合物、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコール、塩化ナトリウムを、組成物に添加することができる。例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンなどの吸収を遅延させる化合物を組成物に含めることによって注射用組成物の長期的吸収をもたらすことができる。
ＥＶ、例えば、エクソソームを、有効量で、適切な溶媒中に、必要に応じて本明細書に列挙した成分のうちの１つまたは組み合わせとともに加えることによって滅菌注射液を調製することができる。一般的に、分散液は、ＥＶ、例えば、エクソソームを、塩基性分散媒及び任意の所望の他の成分を含む無菌溶媒に添加することによって調製される。滅菌注射液の調製用の滅菌粉末の場合、調製方法は、真空乾燥及びフリーズドライであり、予め滅菌濾過したその溶液から有効成分及び任意の追加的な所望の成分の粉末が得られる。ＥＶ、例えば、エクソソームは、ＥＶ、例えば、エクソソームの持続的またはパルス放出を可能とする形で製剤化することができるデポー注射またはインプラント製剤の形態で投与することができる。
ＥＶ、例えば、エクソソームを含む組成物の全身投与は、経粘膜的または経皮的な手段によって行うこともできる。経粘膜または経皮投与を行うには、浸透させるバリアに対して適当な浸透剤が製剤中に用いられる。かかる浸透剤は一般に、当該技術分野では周知のものであり、例えば、経粘膜投与の場合では、洗剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、点鼻薬または坐剤を使用して行うことができる。経皮投与の場合、改変されたＥＶ、例えば、エクソソームを、当該技術分野では周知のように、軟膏、膏薬、ゲル、またはクリーム中に配合する。
実施例
以下の実施例はあくまで例示の目的で示されるものにすぎず、本発明の範囲または内容をいかなる意味においても限定するものとして解釈されてはならない。本発明の実施では、特に示されない限り、当該技術分野の技術の範囲内で、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術、及び薬理学の従来の方法を用いている。かかる技術は文献内で十分に説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）、Ｇｒｅｅｎ ＆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２０１２）、Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ＆ Ｋａｐｌａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，２０１２）、Ｓｕｎｄｂｅｒｇ ＆ Ｃａｒｅｙ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｐａｒｔｓ Ａ ａｎｄ Ｂ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２００７）を参照されたい。
方法
エクソソーム精製：
ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞を合成培地中で７日間、高密度に増殖させた。馴化した細胞培地を回収し、３００～８００×ｇで５分間、室温で遠心分離して、細胞と大きな破片を除去した。次に、培地上清に１０００Ｕ／ＬのＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）を添加し、３７℃の水浴中で１時間インキュベートした。上清を回収し、１６，０００×ｇで３０分間、４℃で遠心分離して残留する細胞片及びその他の大きな夾雑物を除去した。次に、上清を１３３，９００×ｇで３時間、４℃で超遠心分離して、エクソソームをペレット化した。上清を廃棄し、任意の残留培地をチューブの底から吸引した。ペレットを２００～１０００μＬのＰＢＳ（－Ｃａ－Ｍｇ）中に再懸濁した。
エクソソーム集団をさらに濃縮するため、ペレットを密度勾配精製（スクロースまたはＯＰＴＩＰＲＥＰ（商標））により処理した。スクロース勾配精製を行うため、エクソソームペレットを、下記表５に定義されるようなスクロース勾配の上に層状に重ねた。


Figure 2022551420000032
この勾配を、ＳＷ４１ Ｔｉローターに入れた１２ｍＬのＵｌｔｒａ－Ｃｌｅａｒ（３４４０５９）チューブ中、２００，０００×ｇで１６時間、４℃でスピンしてエクソソーム画分を分離した。
このエクソソーム層を上層から静かに取り除き、３８．５ｍＬのＵｌｔｒａ－Ｃｌｅａｒ（３４４０５８）チューブ中、約３２．５ｍＬのＰＢＳに希釈し、１３３，９００×ｇで３時間、４℃で超遠心分離を行って、精製されたエクソソームをペレット化した。次に、得られたペレットを最小量のＰＢＳ（約２００μＬ）に再懸濁し、４℃で保存した。
ＯＰＴＩＰＲＥＰ（商標）勾配では、ＳＷ４１ Ｔｉローター用の１２ｍＬのＵｌｔｒａ－Ｃｌｅａｒ（３４４０５９）チューブ中、等量の１０％、３０％、及び４５％ＯＰＴＩＰＲＥＰ（商標）を用いて３段階の無菌勾配を調製した。ペレットをＯＰＴＩＰＲＥＰ（商標）勾配に加え、２００，０００×ｇで１６時間、４℃で超遠心分離を行ってエクソソーム画分を分離した。次に、エクソソーム層を、チューブの約３ｍＬの上部から静かに回収した。
このエクソソーム画分を、３８．５ｍＬのＵｌｔｒａ－Ｃｌｅａｒ（３４４０５８）チューブ中、約３２ｍＬのＰＢＳに希釈し、１３３，９００×ｇで３時間、４℃で超遠心分離を行って精製されたエクソソームをペレット化した。次に、ペレット化したエクソソームを、最小量のＰＢＳ（約２００μＬ）に再懸濁し、４℃で保存した。
ＣＩＶＯ（登録商標）を用いたインビボ腫瘍内マイクロインジェクション試験
腫瘍細胞培養
Ａ２０細胞（ＡＴＣＣロット番号７０００６０８２）を、Ｌ－グルタミン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１０％ウシ胎児血清（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）及び５０ナノモルのＢＭＥを含むＲＰＭＩ１６４０中、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。ＩＭＰＡＣＴ ＩＩＩ試験（ＩＤＥＸＸ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を行ってマイコプラズマ及び病原菌を含まない状態であることを確認した。細胞を販売元から入手した後、２～３代継代した後に拡大及び凍結保存した。解凍後、細胞を週に３回継代培養し、その後、新鮮な凍結ストックから補充することで最大８週間にわたって維持した。
インビボ腫瘍研究
マウス実験はすべて、ＩＡＣＵＣ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐｒｅｓａｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ（プロトコル番号ＰＲ－００１）によって承認され、関連するガイドラインと規制に従ってＰｒｅｓａｇｅで実施した。関連するすべての手順は麻酔下で行い、痛み及び苦痛を最小限に抑えるようできる限りの努力を払った。平均体重１８ｇｍの雌ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＨｓｄ系マウス（Ｅｎｖｉｇｏ）を５～７週齢で実験に使用した。Ａ２０同種移植片を作製するために、１００万個のＡ２０細胞を１００μｌの接種量でマウスに接種した。
ＣＩＶＯ（登録商標）腫瘍内マイクロインジェクション
ＣＩＶＯ腫瘍内マイクロインジェクションを、Ｋｌｉｎｇｈｏｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅに記載されるとおりに実施した。簡単に述べると、マウス（各時点につきｎ＝６、４及び２４時間）を、移植された腫瘍が以下のおよその寸法、すなわち、１４ｍｍ（長さ）、１０ｍｍ（幅）及び７ｍｍ（深さ）に達した時点でマイクロインジェクション試験に登録した。ＣＩＶＯデバイスは、６本の３０ゲージの注射針で構成されており、総送達量は２．０μｌである。空間的定位を行うため、Ｐｒｅｓａｇｅの蛍光追跡マーカー（ＦＴＭ、５体積％）を注射内容物に加えた。マイクロインジェクションした物質は次のとおりである。すなわち、コントロールＰＴＧＦＲＮ＋＋ＧＦＰエクソソーム、ＭＬ ＲＲ－Ｓ２ ＣＤＡをロードしたＰＴＧＦＲＮ＋＋ＧＦＰエクソソーム、ＭＬ ＲＲ－Ｓ２ ＣＤＡをロードしたＰＴＧＦＲＮ＋＋ＧＦＰ脱シアリル化エクソソーム、ＭＬ ＲＲ－Ｓ２ ＣＤＡをロードした天然エクソソームを、送達される総量が２０ｎｇとなるようにいずれも１０ｎｇ／μｌのＭＬ ＲＲ－Ｓ２ ＣＤＡとした。遊離ＭＬ ＲＲ－Ｓ２ ＣＤＡを、２０ｎｇと２μｇの両方でマイクロインジェクションした。ＣＩＶＯマイクロインジェクションの４時間後及び２４時間後に、バイオマーカー分析のためにＣＯ２吸入によりマウスを安楽死させた。
組織学、免疫組織化学、インサイチューハイブリダイゼーション
切除した腫瘍を注入カラムに垂直に厚さ２ｍｍの切片に切断し、１０％緩衝ホルマリン中で４８時間固定した。ＵＶイメージングを用いて各ＣＩＶＯ部位に注入されたＦＴＭからのシグナルに基づいてＣＩＶＯマイクロインジェクションを確認した。次に、厚さ２ｍｍの組織切片を標準パラフィン包埋用に処理した。下記に述べるように、すべての組織学的アッセイで厚さ４μｍの切片を使用した。ヘマトキシリン－エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を標準的な方法を用いて行った。
免疫組織化学
ホルマリン固定し、パラフィンに包埋した腫瘍を厚さ４μｍでスライド上に切り落とした。スライドを６０℃で１時間ベイクし、キシレンで脱パラフィンし、段階的にアルコールで再水和した。
スライドを１００℃の標的回収溶液中で２０分間インキュベーションした後、２０分間で室温にまで冷却した。血清ブロック（ＴＢＳＴ中、５％正常ヤギ血清）を室温で１時間行った。５％ＮＧＳ ＴＢＳ希釈液中、適切な一次抗体を用いて室温で一晩、一次抗体染色を行った。対応するアイソタイプコントロールを各バッチに含めた。５％ＮＧＳ ＴＢＳ希釈液中、適切な二次抗体を用いて室温で一晩、二次抗体染色を行った。各スライドをＤＡＰＩで１０分間対比染色し、Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄマウンティング培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともにカバースリップをかけた。染色したスライドを、デジタル自動化高解像度スキャナーを使用して画像化した。
ＲＮＡｓｃｏｐｅマルチプレックス蛍光試薬キットｖ２（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して、インサイチューハイブリダイゼーションを完了した。ホルマリン固定し、パラフィンに包埋した腫瘍を厚さ４μｍでスライド上に切り落とした。スライドを６０℃で１時間ベイクし、キシレンで脱パラフィンし、段階的にアルコールで再水和した。過酸化水素を１０分間加えて、内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチした。スライドを１００℃の標的回収溶液中で１５分間インキュベーションした後、４０℃で１５分間、プロテアーゼ消化した。マウスＩｆｎｂ１プローブ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）及びＴＳＡ Ｐｌｕｓ Ｃｙａｎｉｎｅ５検出（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いてＲＮＡｓｃｏｐｅ ＩＳＨアッセイを完了した。各スライドをＤＡＰＩで１０分間対比染色し、Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄマウンティング培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともにカバースリップをかけた。染色したスライドを、デジタル自動化高解像度スキャナーを使用して画像化した。
全スライドスキャニングと画像分析
染色した各組織切片からのすべての細胞の画像を、デジタル化自動化高解像度全組織スキャニング（３Ｄ Ｈｉｓｔｅｃｈ Ｐａｎｏｒａｍｉｃ ２５０ Ｆｌａｓｈ）によってキャプチャーした。ＰｒｅｓａｇｅのカスタムＣＩＶＯ Ａｎａｌｙｚｅｒ画像分析プラットフォームを使用して、各組織切片の画像ファイルからの腫瘍反応を定量化した。スライドスキャナーによってキャプチャーされた組織全体の断面画像を、ＣＩＶＯ Ａｎａｌｙｚｅｒによって自動処理した。各組織切片からの各細胞を、核（ＤＡＰＩ）シグナルに基づいてセグメント化し、Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用してバイオマーカー陰性または陽性として分類した。細胞のセグメント化及び分類に続いて、円形の関心領域（ＲＯＩ）を、各画像内の各マイクロインジェクション部位の周囲で、各位置のＦＴＭの周囲にローカライズして、最大ＲＯＩを半径２０００μｍ以下とした。バイオマーカー測定値に対する既存の壊死の影響を軽減するため、定量分析に先立って、大部分が無細胞腫瘍領域内にある注射部位は除外する。
実施例１：エクソソームに封入されたＳＴＩＮＧアゴニスト
ＳＴＩＮＧアゴニストの封入
ＭＬ ＲＲ－Ｓ２ ＣＤＡアンモニウム塩（ＭｅｄＣｈｅｍ Ｅｘｐｒｅｓｓ、カタログ番号ＨＹ－１２８８５Ｂ）及び（３－３ ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カタログ番号ｔｌｒｌ－ｎａｃａｉｒｓ）を含む１ｍＭのＳＴＩＮＧアゴニストを、精製したエクソソーム（総粒子数１Ｅ１２個）と３００ｕｌのＰＢＳ中、３７℃で一晩インキュベートした。次に、混合物をＰＢＳで２回洗浄し、１００，０００×ｇの超遠心分離により精製した（図１）。
環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストの定量化
ＬＣ－ＭＳ分析用の試料調製
すべての試料を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）バッファーまたはＰＢＳ及び５％スクロースのいずれかに加えた。分析に先立ち、粒子濃度（Ｐ／ｍＬ）をＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＮＳ３００でＮａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｔｒａｃｋｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＮＴＡ）により測定した。すべての標準及び試料は、各注入液にほぼ同数の粒子が含まれるように調製した。これは、各試料の初期粒子濃度に応じて、最終濃度が１．０～４．０Ｅ＋１１Ｐ／ｍＬに達するように試料を希釈することと、エクソソームを標準にスパイクすることとを組み合わせることで行った。
標準曲線は、既知の濃度のＳＴＩＮＧアゴニストをＰＢＳバッファーにスパイクし、その後、段階希釈により追加の標準を調製することで調製した。一般的に、最終濃度（すべての試料調製工程後）が２５、５０、２５０、５００、１２５０、２５００、及び５０００ｎＭのＳＴＩＮＧアゴニストとなるように、個別の標準液を調製した。最初に、７５．０μＬの適切に希釈された各試料と各マトリックス一致標準液を、別々の１．５ｍＬマイクロ遠心チューブ中で調製した。次に、２５．０μＬのエクソソーム溶解バッファー（６０ｍＭ Ｔｒｉｓ、４００ｍＭ ＧｄｍＣｌ、１００ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ ＴＣＥＰ、１．０％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）を各チューブに加えてから、すべてのチューブをボルテックスして混合し、短時間遠心分離して沈殿させた。最後に、１．０μＬの濃縮Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ酵素溶液（Ｄａｋｏ、参照番号Ｓ３００４）を各チューブに加え、再びすべてのチューブをボルテックスしてから短時間遠心分離した後、５５℃で６０分間インキュベートした。ＬＣ－ＭＳに注入する前に、各試料を室温まで冷却してからＨＰＬＣバイアルに移した。
ＬＣ－ＭＳ分析
２０．０μＬの標準液と試料を、クリーンアップなしでＵｌｔｉＭａｔｅ３０００ ＲＳＣＬｎａｎｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）低流量クロマトグラフィーシステムに未希釈で注入した。分析物の分離は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘ ＥＶＯ Ｃ１８コアシェル分析カラム（５０×２．１ｍｍ、粒径２．６μｍ、孔径１００Å）と、移動相Ａ（ＭＰＡ：水、０．１％ギ酸）及び移動相Ｂ（ＭＰＢ：アセトニトリル、０．１％ギ酸）の勾配を流量５００μＬ／分で供給するローディングポンプを使用して行った。勾配は２％ＭＰＢで開始し、これを２分間維持してＳＴＩＮＧアゴニスト分析物をロードして脱塩した。次いで、ＭＰＢの割合を３分間かけて２～３０％まで増加させてＳＴＩＮＧアゴニスト分析物を溶出させた。次いで、ＭＰＢの割合を１分間かけて３０～９５％まで増加させ、３分間９５％に保持し、１分間かけて９５～２％まで減少させ、その後、さらに３分間２％に保持してカラムを再平衡化させた。本方法の合計実行時間は１３分であり、ＬＣのフローは２．５～４．５分の間にのみＭＳに直接送られた。通常のキャリーオーバーは、前の注入のピーク面積の０．０５％未満であったため、各分析注入間でブランク注入は行わなかった。
質量分析は、Ｉｏｎ Ｍａｘソース及び陰イオンモードで動作するＨＥＳＩ－ＩＩプローブを備えたＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｂａｓｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）質量分析計を使用して行い、５００～８００ＤａをスキャンするフルＭＳ－ＳＩＭモードを、ＡＧＣターゲット１Ｅ＋６イオン、最大注入時間２００ミリ秒、及び分解能３５，０００で使用して質量スペクトルを収集した。ＳＴＩＮＧアゴニストの定量は、モノアイソトピック－１のＳＴＩＮＧアゴニストのピークを用い、ｍ／ｚが６８８．９７～６８９．１３Ｄａの範囲内のすべてのイオンを選択的に抽出した後、３．８０～３．９０分の保持時間で得られたピークを積分することによって行った。特定の試料中のＳＴＩＮＧアゴニストの濃度は、相対定量化では一般的である、その試料中のＳＴＩＮＧアゴニストのピーク面積と、標準液によって生成されたＳＴＩＮＧアゴニストのピーク面積との比較によって求めた。
実施例２：エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニストと併用した、表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソームのインビボ投与
表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソームとエクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニストとの相乗効果があるかどうかを判定するために、Ｂ１６Ｆ１０マウスの２つの異なる部位（「原発」及び「二次」）に腫瘍細胞を皮下接種した。マウスが約５０ｍｍ３の原発腫瘍及び二次腫瘍を発症した接種後４日目に、マウスを７つの処置群に分けた（表６）。群１のマウスには、接種後４、６、７、８、及び１０日目に（原発腫瘍の）腫瘍内（ＩＴ）注射によりＰＢＳを投与し、接種後４、７、１１、及び１４日目に腹腔内（ＩＰ）注射により１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプコントロールを投与した。群２のマウスには、接種後４、７、及び１０日目に（原発腫瘍の）ＩＴ注射により、ＳＴＩＮＧアゴニストをロードした１０ｎｇのエクソソームを投与し、接種後４、７、１１、及び１４日目に腹腔内（ＩＰ）注射により１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプコントロールを投与した。群３のマウスには、接種後４、７、及び１０日目に（原発腫瘍の）ＩＴ注射により、ＳＴＩＮＧアゴニストをロードした１０ｎｇのエクソソームを投与し、接種後４、７、１１、及び１４日目にＩＰ注射により１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ－１抗体（ａＰＤ－１）を投与した。群４のマウスには、接種後４、６、及び８日目に（原発腫瘍の）ＩＴ注射により、ＩＬ－１２をロードした１００ｎｇのエクソソームを投与し、接種後４、７、１１、及び１４日目にＩＰ注射により１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプコントロールを投与した。群５のマウスには、接種後４、６、及び８日目に（原発腫瘍の）ＩＴ注射により、ＩＬ－１２をロードした１００ｎｇのエクソソームを投与し、接種後４、７、１１、及び１４日目にＩＰ注射により１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ－１抗体（ａＰＤ－１）を投与した。群６のマウスには、接種後４、７、及び１０日目に（原発腫瘍の）ＩＴ注射により、ＳＴＩＮＧアゴニストをロードした１０ｎｇのエクソソームを、接種後６、８、及び１０日目に（原発腫瘍の）ＩＴ注射により、ＩＬ－１２をロードした１００ｎｇのエクソソームを、接種後４、７、１１、及び１４日目にＩＰ注射により、１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプコントロールを投与した。群７のマウスには、接種後４、７、及び１０日目に（原発腫瘍の）ＩＴ注射により、ＳＴＩＮＧアゴニストをロードした１０ｎｇのエクソソームを、接種後６、８、及び１０日目に（原発腫瘍の）ＩＴ注射により、ＩＬ－１２をロードした１００ｎｇのエクソソームを、接種後４、７、１１、及び１４日目にＩＰ注射により、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ－１抗体（ａＰＤ－１）を投与した。
Figure 2022551420000033
表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソーム及び／またはエクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニストの投与は、持続的な完全奏功及び再チャレンジ後の腫瘍増殖の防止をもたらしている（図２Ａ～２Ｃ）。腫瘍増殖は、原発腫瘍（図２Ａ）及び二次腫瘍（図２Ｂ）の両方で、表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソーム、エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニスト、及び表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソームとエクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニストの併用療法の投与後に阻害された。腫瘍増殖速度は、表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソームまたはエクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニストのいずれか単独の投与と比較して、併用療法の投与後により大きな減少を示した（図２Ｃ）。これらの効果は原発腫瘍でより顕著であったが、各処置群で、二次（注射されていない）腫瘍の腫瘍増殖速度は少なくともわずかに減少し、併用療法後の腫瘍増殖速度は有意に減少した（図２Ｃ）。１４日目の腫瘍サイズは、表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソーム、エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニスト、及び抗ＰＤ－１抗体の３剤療法で処置したマウスで、原発腫瘍及び二次腫瘍の両方でさらに減少した（図３Ａ～３Ｂ）。しかしながら、３剤併用療法の施行後の原発腫瘍及び二次腫瘍の両方における腫瘍増殖速度は、表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソームとエクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニストとの併用療法後の増殖速度と統計的な差はなかった（図４Ａ～４Ｂ）。個々の処置の結果を図５Ａ～図５Ｎに示す。
実施例３：マウスがんモデルにおける表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソームの投与
表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソームを、ＰＴＧＦＲＮに連結された単一のペプチドＩＬ－１２（ペプチドリンカーｐ４０によって連結されたｐ２９）を含む融合コンストラクトをエクソソーム産生細胞で発現させることによって調製した（図６）。効力を、ヒトＰＢＭＣまたはマウス脾細胞を使用してインビトロで、また、マウス皮下腫瘍モデルを使用してインビボで評価した。局所と全身の薬理学的動態を、マウスの腫瘍内注射及びサルの皮下注射で測定した。すべての試験は、組換えＩＬ－１２（ｒＩＬ－１２）を基準として評価した。
ＭＣ３８マウス腫瘍モデルでは、表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソーム（ｅｘｏＩＬ－１２）の腫瘍内投与によって、遊離組換えＩＬ－１２及び非処理のコントロールと比較してＰＫの増強とＰＤの持続が示された。ｅｘｏＩＬ－１２を投与したマウスは、遊離組換えＩＬ－１２と比較して、投与の３、１２、２４、及び４８時間後に腫瘍当たりのＩＬ－１２ｐ７０濃度によって測定した場合に腫瘍保持量の増加（約１５倍）を示した（図７Ａ）。さらに、ｅｘｏＩＬ－１２投与は、組換えＩＬ－１２と比較して腫瘍内ＩＦＮ－γＡＵＣの約４倍の増強をもたらした（図７Ｂ）。さらに、ｅｘｏＩＬ－１２の腫瘍内投与は、マウスのＭＣ３８腫瘍増殖の用量依存的な減少をもたらした。ＥｘｏＩＬ－１２は、腫瘍増殖阻害においてｒＩＬ－１２よりも１００倍強力であり、１００ｎｇのｅｘｏＩＬ－１２を投与されたマウスでは、腫瘍増殖をほとんどまたはまったく示さなかった（図７Ｃ）。ＭＣ３８腫瘍モデルでは、ｅｘｏＩＬ－１２で処置したマウスの６３％で完全奏功が観察されたのに対して、ｒＩＬ－１２では同等のＩＬ－１２の用量で完全奏功は０％であった。これは、ｅｘｏＩＬ－１２処置マウスにおいてほぼ４倍増加した、腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の用量依存的な増加と相関していた（図７Ｅ）。
ＭＣ３８再チャレンジ後には、腫瘍増殖の抑制が再び観察された（図７Ｄ）。ｅｘｏＩＬ－１２完全奏功マウスの再チャレンジ試験では、腫瘍の再増殖は示されず、ＣＤ８＋Ｔ細胞の欠乏によってｅｘｏＩＬ－１２の抗腫瘍活性は完全に消失した。腫瘍内投与後、ｅｘｏＩＬ－１２はｒＩＬ－１２よりも１０倍高い腫瘍内曝露及び最大４８時間のＩＦＮγ産生の延長を示した。ｅｘｏＩＬ－１２の保持された局所的な薬理動態を、非ヒト霊長類での皮下注射を用いてさらに確認した。
毒物学的分析によって、試験した最高用量である３μｇのｅｘｏＩＬ－１２はＮＯＡＥＬ（無有害作用量）であることが明らかにされ、限定的な血漿レベル及び用量依存的組織レベルを示した（図８Ａ）。ＣＸＣＬ１０／ＩＰ－１０の発現は、単回投与後に皮膚で持続することが観察されたが、血漿では検出できなかった（図８Ｂ～８Ｃ）。
ｅｘｏＩＬ－１２の腫瘍に制限された薬理動態は、全身のＩＬ－１２曝露及び関連する毒性を伴わずに優れたインビボ有効性及び免疫記憶をもたらす。このように、ｅｘｏＩＬ－１２はｒＩＬ－１２の主要な制約を克服するものである。
実施例４：表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソームの投与の安全性及び有効性を試験する臨床試験
表面に提示されたＩＬ－１２を有する操作されたエクソソームを投与することによってヒト対象のがんを治療することの安全性及び有効性を試験するための臨床研究を実施する（図９Ａ～９Ｂ）。パートＡでは、健康なボランティアにさまざまな用量のｅｘｏＩＬ－１２を投与し、有害事象及びバイオマーカーを監視する（図９Ａ）。パートＢでは、ＣＴＣＬ（ステージＩＡ－ＩＩＢ）と診断された対象にさまざまな用量のｅｘｏＩＬ－１２を投与し、安全性及びバイオマーカーを監視する（図９Ｂ）。臨床活動を、１つ以上のＣＴスキャンによって監視する。ＣＴＣＬ、ＴＮＢＣ、黒色腫、ＧＢＭ、ＭＣＣ、及び／またはカポジ肉腫を患っている対象は、試験のパートＢに適格とされる。
実施例５：エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニストと併用した、表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソームのインビボ投与
表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソームとエクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニストとの相乗効果が抗ＰＤ－１併用療法よりも優れているかどうかを判定するために、Ｂ１６Ｆ１０マウスの２つの異なる部位（「原発」及び「二次」）に腫瘍細胞を皮下接種した。マウスが約５０ｍｍ３の原発腫瘍及び二次腫瘍を発症した接種後６日目に、マウスを７つの処置群に分けた（表７）。群１のマウスには、接種後６、８、９、１０、及び１２日目に（原発腫瘍の）腫瘍内（ＩＴ）注射により空のエクソソームを投与し、接種後６、９、１２、及び１６日目に腹腔内（ＩＰ）注射により１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプコントロールを投与した。群２のマウスには、接種後６、８、９、１０、及び１２日目に（原発腫瘍の）ＩＴ注射により空のエクソソームを投与し、接種後６、９、１２、及び１６日目に腹腔内（ＩＰ）注射により１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ－１抗体を投与した。群３のマウスには、接種後６、９、及び１２日目に（原発腫瘍の）ＩＴ注射により、ＳＴＩＮＧアゴニストをロードした１００ｎｇのエクソソームを投与し、接種後６、９、１２、及び１６日目にＩＰ注射により１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプコントロールを投与した。群４のマウスには、接種後６、９、及び１２日目に（原発腫瘍の）ＩＴ注射により、ＳＴＩＮＧアゴニストをロードした１００ｎｇのエクソソームを投与し、接種後６、９、１２、及び１６日目にＩＰ注射により１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ－１抗体を投与した。群５のマウスには、接種後６、８、及び１０日目に（原発腫瘍の）ＩＴ注射により、ＩＬ－１２をロードした１００ｎｇのエクソソームを投与し、接種後６、９、１２、及び１６日目にＩＰ注射により１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ－１抗体を投与した。群６のマウスには、接種後６、９、及び１２日目に（原発腫瘍の）ＩＴ注射により、ＳＴＩＮＧアゴニストをロードした１００ｎｇのエクソソームを投与し、接種後８、１０、及び１２日目に（原発腫瘍の）ＩＴ注射によりＩＬ－１２をロードした１００ｎｇのエクソソームを投与した。群７のマウスには、接種後６、９、及び１２日目に（原発腫瘍の）ＩＴ注射により、ＳＴＩＮＧアゴニストをロードした１０ｎｇのエクソソームを、接種後８、１０及び１２日目に（原発腫瘍の）ＩＴ注射により、ＩＬ－１２をロードした１０ｎｇのエクソソームを投与した。


Figure 2022551420000034
腫瘍増殖は、原発腫瘍における１００ｎｇ及び１０ｎｇの用量の１）ＳＴＩＮＧアゴニストとエクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニスト、２）エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニストとａＰＤ－１との併用、３）表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソームとａＰＤ－１との併用、及び４）表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソームとエクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニストとの併用療法の施行後に阻害された（図１０Ｂ）。これらの効果は原発腫瘍でより顕著であったが、各処置群で二次（注射されていない）腫瘍の腫瘍増殖速度は少なくともわずかに減少し、エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニストと抗ＰＤ－１抗体との併用療法後の腫瘍増殖速度は有意に減少した（図１０Ａ）。二次腫瘍へのＣＤ８Ｔ細胞の浸潤は、１００ｎｇ及び１０ｎｇの用量のエクソソーム、エクソソームと抗ＰＤ－１抗体との併用、エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニスト、表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソームと抗ＰＤ－１抗体との併用、または表面に提示されたＩＬ－１２を有するエクソソームとエクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニストとの併用療法と比較して、エクソソームにロードされたＳＴＩＮＧアゴニストと抗ＰＤ－１抗体との併用で有意に高かった（図１０Ｃ）。
参照による援用
本出願に引用されるすべての刊行物、特許、特許出願、及び他の文書は、それぞれの個別の刊行物、特許、特許出願、または他の文書があらゆる目的で参照によって個別に援用されていることが示されている場合と同程度に、あらゆる目的でそれらの全体を参照により本明細書に援用するものである。
均等物
本開示は特に、治療薬として使用するためのＳＴＩＮＧアゴニストを封入したエクソソームの組成物を提供する。本開示はまた、ＳＴＩＮＧアゴニストを封入したエクソソームを生成する方法、及びそのようなエクソソームを治療薬として投与する方法も提供する。さまざまな具体的態様を説明及び記載したが、上記の明細書は限定的なものではない。本発明（複数可）の趣旨及び範囲から逸脱することなく、さまざまな変更を行うことができる点は認識されよう。多くの変形例が、本明細書を検討することで当業者には明らかとなろう。

Claims (52)

  1. 腫瘍の治療を必要とする対象の腫瘍を治療する方法であって、（ｉ）細胞外小胞（ＥＶ）とインターフェロン遺伝子タンパク質の刺激因子（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇｅｎｅｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＳＴＩＮＧ）アゴニストとを含む組成物と、（ｉｉ）インターロイキン１２（ＩＬ－１２）部分と、を併用して投与することを含む、前記方法。
  2. 前記ＩＬ－１２部分が第２のＥＶに関連付けられている、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＩＬ－１２部分が、前記ＳＴＩＮＧアゴニストを含む前記ＥＶに関連付けられている、請求項１に記載の方法。
  4. 前記腫瘍が原発腫瘍、二次腫瘍、または原発腫瘍と二次腫瘍の両方である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記投与することが、前記腫瘍の体積を減少させる、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記投与することが、前記ＳＴＩＮＧアゴニストまたは前記ＩＬ－１２部分を含む細胞外小胞のいずれかを投与した（「単剤療法」）後の腫瘍体積と比較して、前記腫瘍の体積を、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍、減少させる、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記投与することが、前記原発腫瘍の体積を減少させる、請求項５または６に記載の方法。
  8. 前記投与することが、前記投与することの１４日目後に前記単剤療法と比較して、前記原発腫瘍の体積を、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍、減少させることができる、請求項７に記載の方法。
  9. 前記投与することが、前記二次腫瘍の体積を減少させる、請求項４～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記投与することが、前記投与することの１４日目後に、前記単剤療法と比較して、前記二次腫瘍の体積を、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、または少なくとも約２倍、減少させることができる、請求項９に記載の方法。
  11. 前記投与することが、前記腫瘍の増殖を減少させる、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記投与することが、前記ＳＴＩＮＧアゴニストまたは前記ＩＬ－１２部分を含む細胞外小胞のいずれかを投与した（「単剤療法」）後の腫瘍体積と比較して、前記腫瘍の増殖を、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍、減少させる、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記投与することが、前記原発腫瘍及び／または前記二次腫瘍の増殖を減少させる、請求項１１または１２に記載の方法。
  14. 抗がん剤を投与することをさらに含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記抗がん剤が、チェックポイント阻害剤を含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体である、請求項１５に記載の方法。
  18. ＳＴＩＮＧアゴニスト及びＩＬ－１２部分を含む、細胞外小胞。
  19. ＳＴＩＮＧアゴニストを含む細胞外小胞と、ＩＬ－１２部分を含む第２のＥＶとを含む、組成物。
  20. 前記ＩＬ－１２部分が、ＩＬ－１２タンパク質、ＩＬ－１２タンパク質をコードする核酸、またはＩＬ－１２活性を有する分子である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法、請求項１８に記載のＥＶ、または請求項１９に記載の組成物。
  21. 前記ＩＬ－１２部分が、ＩＬ－１２タンパク質である、請求項１～１７及び２０のいずれか１項に記載の方法、請求項１８もしくは２０に記載のＥＶ、または請求項１９もしくは２０に記載の組成物。
  22. 前記細胞外小胞が、エクソソーム、ナノ小胞、アポトーシス小体、マイクロベシクル、リソソーム、エンドソーム、リポソーム、脂質ナノ粒子、ミセル、多層構造、再小胞化された小胞、または押し出された細胞である、請求項１～１７、２０、及び２１のいずれか１項に記載の方法、または請求項１８、２０及び２１のいずれか１項に記載のＥＶ。
  23. 前記ＥＶが、エクソソームである、請求項１～１７及び２０～２２のいずれか１項に記載の方法、請求項１８及び２０～２２のいずれか１項に記載のＥＶ、または請求項１９～２２のいずれか１項に記載の組成物。
  24. 前記ＳＴＩＮＧアゴニストが、前記ＥＶに関連付けられている、請求項１～１７及び２０～２３のいずれか１項に記載の方法、請求項１８及び２０～２３のいずれか１項に記載のＥＶ、または請求項１９～２３のいずれか１項に記載の組成物。
  25. 前記ＳＴＩＮＧアゴニストが、前記ＥＶに封入されている、請求項１～１７及び２０～２３のいずれか１項に記載の方法、請求項１８及び２０～２３のいずれか１項に記載のＥＶ、または請求項１９～２３のいずれか１項に記載の組成物。
  26. 前記ＳＴＩＮＧアゴニストが、場合によりリンカーによって前記ＥＶの脂質二重層に連結される、請求項１～１７及び２０～２３のいずれか１項に記載の方法、請求項１８及び２０～２３のいずれか１項に記載のＥＶ、または請求項１９～２３のいずれか１項に記載の組成物。
  27. 前記ＥＶが、プロスタグランジンＦ２受容体ネガティブレギュレーター（ＰＴＧＦＲＮ）タンパク質を過剰発現する、請求項１～１７及び２０～２６のいずれか１項に記載の方法、請求項１８及び２０～２６のいずれか１項に記載のＥＶ、または請求項１９～２６のいずれか１項に記載の組成物。
  28. 前記ＳＴＩＮＧアゴニストが、前記ＰＴＧＦＲＮタンパク質に連結されていない、請求項２７に記載の方法、ＥＶ、または組成物。
  29. 前記細胞外小胞が、ＰＴＧＦＲＮタンパク質を過剰発現する細胞によって生成される、請求項１～１７及び２０～２８のいずれか１項に記載の方法、請求項１８及び２０～２８のいずれか１項に記載のＥＶ、または請求項１９～２８のいずれか１項に記載の組成物。
  30. 前記細胞外小胞が、リガンド、サイトカイン、または抗体をさらに含む、請求項１～１７及び２０～２８のいずれか１項に記載の方法、請求項１８及び２０～２８のいずれか１項に記載のＥＶ、または請求項１９～２８のいずれか１項に記載の組成物。
  31. 前記抗体が、アンタゴニスト抗体及び／またはアゴニスト抗体を含む、請求項３０に記載の方法、ＥＶ、または組成物。
  32. 前記ＳＴＩＮＧアゴニストが、環状ジヌクレオチドである、請求項１～１７及び２０～３１のいずれか１項に記載の方法、請求項１８及び２０～３１のいずれか１項に記載のＥＶ、または請求項１９～３１のいずれか１項に記載の組成物。
  33. 前記ＳＴＩＮＧアゴニストが、非環状ジヌクレオチドである、請求項１～１７及び２０～３１のいずれか１項に記載の方法、請求項１８及び２０～３１のいずれか１項に記載のＥＶ、または請求項１９～３１のいずれか１項に記載の組成物。
  34. 前記ＳＴＩＮＧアゴニストが、脂質結合タグを含む、請求項１～１７及び２０～３３のいずれか１項に記載の方法、請求項１８及び２０～３３のいずれか１項に記載のＥＶ、または請求項１９～３３のいずれか１項に記載の組成物。
  35. 前記ＳＴＩＮＧアゴニストが、物理的及び／または化学的に改変されている、請求項１～１７及び２０～３５のいずれか１項に記載の方法、請求項１８及び２０～３５のいずれか１項に記載のＥＶ、または請求項１９～３５のいずれか１項に記載の組成物。
  36. 前記改変されたＳＴＩＮＧアゴニストが、対応する未改変のＳＴＩＮＧアゴニストとは異なる極性及び／または電荷を有する、請求項３５に記載の方法、ＥＶ、または組成物。
  37. 前記ＳＴＩＮＧアゴニストの濃度が、約０．０１μＭ～１００μＭである、請求項１～１７及び２０～３６のいずれか１項に記載の方法、請求項１８及び２０～３６のいずれか１項に記載のＥＶ、または請求項１９～３６のいずれか１項に記載の組成物。
  38. 前記ＳＴＩＮＧアゴニストの濃度が、約０．０１μＭ～０．１μＭ、０．１μＭ～１μＭ、１μＭ～１０μＭ、１０μＭ～５０μＭ、または５０μＭ～１００μＭである、請求項１～１７及び２０～３７のいずれか１項に記載の方法、請求項１８及び２０～３７のいずれか１項に記載のＥＶ、または請求項１９～３７のいずれか１項に記載の組成物。
  39. 前記ＥＶ内の前記ＳＴＩＮＧアゴニストの濃度が、約１μＭ～１０μＭである、請求項３８に記載の方法、ＥＶ、または組成物。
  40. 前記ＳＴＩＮＧアゴニストが、
    Figure 2022551420000035
     ［式中、
    Ｘ１は、Ｈ、ＯＨ、またはＦであり、
    Ｘ２は、Ｈ、ＯＨ、またはＦであり、
    Ｚは、ＯＨ、ＯＲ１、ＳＨまたはＳＲ１であり、式中、
    ｉ）Ｒ１は、ＮａまたはＮＨ４であるか、または
    ｉｉ）Ｒ１は、ピバロイルオキシメチルなどのインビボでＯＨまたはＳＨを与える酵素不安定基であり、
    Ｂｉ及びＢ２は、以下から選択される塩基であり、
    Figure 2022551420000036
     ただし、
    －式（Ｉ）において：Ｘ１及びＸ２はＯＨではなく、
    －式（ＩＩ）において：Ｘ１及びＸ２がＯＨである場合、Ｂ１はアデニンではなく、Ｂ２はグアニンではなく、かつ、
    －式（ＩＩＩ）において：Ｘ１及びＸ２がＯＨである場合、Ｂ１はアデニンではなく、Ｂ２はグアニンではなく、ＺはＯＨではない。］、またはその薬学的に許容される塩を含む、請求項１～１７及び２０～３９のいずれか１項に記載の方法、請求項１８及び２０～３９のいずれか１項に記載のＥＶ、または請求項１９～３９のいずれか１項に記載の組成物。
  41. 前記ＳＴＩＮＧアゴニストが、
    Figure 2022551420000037
    Figure 2022551420000038
    Figure 2022551420000039
     及びその薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項１～１７及び２０～４０のいずれか１項に記載の方法、請求項１８及び２０～４０のいずれか１項に記載のＥＶ、または請求項１９～４０のいずれか１項に記載の組成物。
  42. 前記ＩＬ－１２部分が、足場部分に連結されている、請求項１８及び２０～４１のいずれか１項に記載のＥＶ。
  43. 前記第２のＥＶが、足場部分を含む、請求項２～１７及び２０～４１のいずれか１項に記載の方法、または請求項１９～４１のいずれか１項に記載の組成物。
  44. 前記ＩＬ－１２部分が、前記足場部分に連結されている、請求項４３に記載の方法または組成物。
  45. 前記足場部分が、ＰＴＧＦＲＮタンパク質を含む、請求項４２に記載のＥＶ、または請求項４３に記載の方法もしくは組成物。
  46. 前記ＰＴＧＦＲＮタンパク質が、配列番号３３を含む、請求項４５に記載のＥＶ、方法、または組成物。
  47. 前記ＰＴＧＦＲＮタンパク質が、配列番号１と少なくとも約７０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一である、請求項４６に記載のＥＶ、方法、または組成物。
  48. 前記ＰＴＧＦＲＮタンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む、請求項４７に記載のＥＶ、方法、または組成物。
  49. 請求項１８～４２及び４５～４８のいずれか１項に記載のＥＶまたは請求項１９～４１及び４３～４８のいずれか１項に記載の組成物と、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
  50. 請求項４９に記載の組成物及び使用説明書を含むキット。
  51. 前記投与が、非経口、経口、静脈内、筋肉内、腫瘍内、腹腔内、または他の任意の適切な投与経路による、請求項１～１７、２０～４１、４３～４８のいずれか１項に記載の方法。
  52. 前記投与が、腫瘍内である、請求項５１に記載の方法。
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