JP2020089386A - 効率的な非減数分裂対立遺伝子移入 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2013年8月27日に提出された米国仮特許出願第61/870,401号明細書に対する優先権を主張する。尚、上記出願は、参照により本明細書に組み込むものとする。
本明細書に記載する研究の諸要素は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)からの助成金1R43RR033149−01A1及びUSDA−国立食品・農業研究所(National Institute of Food and Agriculture)からの生物工学リスク評価プログラム(Biotechnology Risk Assessment Program)競争型助成金番号2012−33522−19766による支援を受けた。米国政府は、本発明に関して一定の権利を有し得る。
酪農場オペレータ及び家畜の健康状態を保護するために、米国、欧州、及びその他の地域において、大部分の乳牛から角が常用的に手で除去されている。除角は痛みを伴い、動物のストレスを一時的に増大させ、動物生産に経費を加算することになり、後の負傷から動物を保護する意図であるにもかかわらず、一部には除角の実施が残酷であるという見方もある。一部の肉用種は、天然に無角であり(例えば、アンガス(Angus))、POLLEDと呼ばれる形質が優性である。本明細書に記載する技術は、除角を受ける必要がない動物を提供することによって動物の健康状態を改善する。無角化を付与する2つの対立遺伝子変異体が、染色体1で近年同定されている。これらの突然変異のいずれかを有する乳牛は稀であり、一般に、その有角の対応種よりも、乳牛の遺伝的選抜指数(dairy genetic selection indices)がはるかに低い。有角種へのPOLLED対立遺伝子の減数分裂移入は、伝統的な交雑育種によって達成することができるが、交雑育種した動物の遺伝的メリットは、生産性を回復するために、選択的育種の長期にわたる多数の世代を経ることになり、しかもそれを必要とする。
プラスミド鋳型は、POLLED及びGDF8の移入のために有効であったが、本発明者らは、多くの望ましい対立遺伝子がSNPに対応すると考える。第1群の実験では、そのコグネイトTALEN結合部位にオーバーラップを有し、さらには、制限酵素断片長多型(RFLP)分析のためのスペーサ領域に4bpのindelを導入したオリゴヌクレオチド鋳型を使用した。初代線維芽細胞をプラスミド−又はmRNAコード化TALEN及びオリゴ鋳型でトランスフェクトした後、30又は37℃のいずれかで3日インキュベートした。mRNAとして送達したTALENは一貫して、30℃でインキュベートした細胞中のプラスミドより性能が優れていた(図8A)。SURVEYORアッセイにより測定した相当程度のTALEN活性にもかかわらず、HDRは、一貫して、TALENをmRNAとして送達したとき、プラスミドと比較して高かった(>2倍)。この観察は、意外であり、好都合な動態の結果であった可能性があり;例えば、mRNAからのTALENは、より高速で翻訳されるため、オリゴ分解の前に鋳型を使用することができたことが推測された。しかし、経時的実験から、プラスミド及びmRNAによりコード化されるTALEN同士の間で、HDRの開始にほとんど差がないことが判明した(図8B)。30℃でTALENmRNAを用いた反復実験の間で、蓄積突然変異及び全HDRのレベルは同等であり、これは、突然変異型対立遺伝子の大部分が、意図する移入と一致したことを示唆している。
NHEJ又はHDRによる安定なSNPの移入を有することが可能であるか否かはわかっていなかった。表1に示すように、HDRの3日目レベル(7〜18%)、並びにウシ及びブタGDF8又はブタp65内の意図するSNP対立遺伝子を含む細胞クローンの単離(3〜15%)はいずれも、indel対立遺伝子の場合より有意に低く、HDRは、10〜約50%の範囲であった。このデータは、TALENスペーサ領域における少なくとも4bpの導入又は排除が、TALENスペーサ長さの制約と一致して、遺伝子座の切断を低減すると予想されるため、indelは、SNPよりも安定しているという仮説を示唆するものであった。さらには、同じ遺伝子座内にオリゴを含むHDR頻度の比較によれば、4bp挿入対立遺伝子でさえ、SNP対立遺伝子より効率的であった(図9)。また、この仮定は、何故配列解析によって、GDF8又はブタp65について単離されたSNP陽性コロニーのほぼ半分が、TALEN間隔を変化させると予想されるindelを同時に保有するかが明らかにされたかを説明するものでもあった。それにもかかわらず、遺伝子座にそれ以上の変化なしに、最大で約5%のレベルで、GDF8(ブタ及びウシの両方)ではG938A、及びブタp65ではT1591Cの同型接合変換を有するコロニーを回収することができた(表1)。また、ヒツジFecB及びCallipyge遺伝子座の小さな多型をヤギゲノムに移入させることも可能であった。単一ヌクレオチド又は1〜3ヌクレオチドを正確に改変するこうした能力は、意外であると同時に、有意でもあった。比較として、p65のT1591C部位とオーバーラップするCRISPRgRNAを設計して、2つのプラットフォームを用いた移入を比較することも可能であった。意図する部位でのDSBの効率的な生産にもかかわらず、CRISPR/Cas9媒介のHDRは、3日目に6%より低く、10日目に検出限界を下回った(図10)。さらに、CRISPR媒介のHDRを含む修飾クローンの回収は、TALEN切断部位がSNP部位から35bp離れていても、TALENを含むものより低かった(表1)。第2遺伝子座であるssAPC14.2へのCRISPR/Cas9誘導ターゲティングの分析は、より効率的であったが、この部位でTALENにより誘導されるHDRのレベルには達しなかった(約30対60%)(図11)。
TAL結合部位直前に位置する5’チミジンヌクレオチドの保存を仮定して、オリゴHDR鋳型におけるこれらの塩基の改変(ブロック突然変異(BM)と呼ぶ)が、編集対立遺伝子の再切断を阻害すると推論した。驚くことに、BMは、ブタLDLR又はGDF8遺伝子座でのSNP対立遺伝子の維持に何ら有意な影響を及ぼさなかった(図12、パネルa)。これは、オリゴ鋳型HDRの変換路がかなり短く、BMを組み込まないか、又は5’−チミジンの改変が、TALEN活性を完全には無効にしないかのいずれかであることを示唆した。
実験結果は、標的(エンド)ヌクレアーゼ系が、意図するコグネイト部位でdsDNAを効果的に切断していることを示唆した。データの解析から、ヌクレアーゼが、既に鋳型化された部位に結合して、その部位を再切断し、dsDNAをその元の配列に復帰させることが示された。標的ヌクレアーゼ系は、タンパク質−DNA結合又は核酸−DNA結合のいずれかによって、コグネイトDNAに結合するモチーフを含む。実験から、多型を含有する鋳型を選択して、標的ヌクレアーゼによる再結合又は再切断を妨げ、これによって、正確に移入した細胞クローンの数を有意に増加できることが立証された。
これらの実験結果は、染色体DNA中に一塩基多型(SNP)を配置するための方法を提供する。SNPは、予定位置に配置することができる。配置に対するこの制御は、先例がない。例えば、SNPは、他のSNPなしで、又は他の位置での修飾なしに、内在性対立遺伝子中に配置することができる。これに加え、また重要なことには、内在性対立遺伝子を、1SNPしか違わない外性対立遺伝子で置換することもできる。そして、この置換は、細胞のゲノム中の任意の位置の染色体DNAに対する最小の改変で実施する。1つ又は複数のSNPを移入させることができる。
転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)及びジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)などのゲノム編集ツールは、生物工学、遺伝子療法及び多くの生物の機能的ゲノム研究の分野に影響を与えた。最近では、RNA誘導性エンドヌクレアーゼ(RGEN)が、相補的RNA分子によるその標的部位に向けられた。Cas9/CRISPR系は、RGENである。tracrRNAは、別のこうしたツールである。これらは、標的ヌクレアーゼ系の例であり:これらの系は、ヌクレアーゼを標的部位に局在化するDNA結合メンバーを有する。次に、部位は、ヌクレアーゼにより切断される。TALEN及びZFNは、DNA結合メンバーに融合されるヌクレアーゼを有する。Cas9/CRISPRは、標的DNA上に互いにみいだされるコグネイトである。DNA結合メンバーは、染色体DNA中にコグネイト配列を有する。DNA結合メンバーは、典型的に、意図する部位にもその付近にも核酸分解作用が起こらないように、意図するコグネイト配列を考慮して設計される。いくつかの実施形態は、こうした系の全て、限定はしないが、以下:ヌクレアーゼ再切断を最小化する実施形態、意図する残基に正確にSNPを作製する実施形態、並びにDNA結合部位で移入させる対立遺伝子の配置などに適用可能である。
TALENという用語は、本明細書で用いる場合、広義であり、例えば、Beurdeley,M.et al.Compact designer TALENs for efficient genome engineering.Nat.Commun.4:1762 doi:10.1038/ncomms2782(2013)に記載されているように、別のTALENからの支援なしで二本鎖DNAを切断することができるモノマーTALENを含む。TALENという用語はまた、同じ部位でDNAを切断するように、一緒に作動するように操作されたTALENのペアの一方又は両方のメンバーを指すためにも用いられる。一緒に作動するTALENは、左TALEN及び右TALENと呼ばれることもあり、これは、DNA又はTALENペアの螺旋方向(handedness)に関して言う。
実験は、驚くことに、低温培養の延長期間が、鋳型形成プロセスの効率を高める得ることを明らかにした。低温細胞培養は、二本鎖DNA切断を導入するために、最大約3日にわたって有用であることが知られている。この作用についての従来の理論は、活性酵素を希釈するか、又は分裂を阻害することによって、DNAを安定化するという考えを中心に展開する。
生存動物に輸送するために、ブタゲノム中の2つの遺伝子編集遺伝子座(APC及びDAZL)を選択した。大腸腺腫様ポリポーシス(APC)遺伝子中の突然変異は、家族性腺腫様ポリポーシス(FAP)の原因であるだけでなく、大部分の散発性結腸直腸癌において速度を制限する役割も果たす。Dazl(deleted in azoospermia−like)は、脊椎動物において生殖細胞分化に重要なRNA結合タンパク質である。DAZL遺伝子は、妊性と関連しており、不妊モデル並びに精子形成停止に有用である。DAZL又はAPCのHDR編集対立遺伝子を含むコロニーを、クロマチン移入によるクローニングのためにプールした。各プールは、3つの移入から2件の妊娠を達成し、そのいずれの妊娠も、分娩日まで完遂した。DAZL修飾細胞から合計8匹の子豚が生まれ、その各々が、HDR対立遺伝子又はNHEJから生じた欠失のいずれかと一致する選択コロニーの遺伝子型を表した。DAZL子豚のうち3匹は、死産であった。APC修飾細胞からの6匹の子豚のうち、1匹は死産で、3匹は、1週間以内に死に、もう1匹が3週間後に死んだが、全て原因不明であり、恐らくクローニングに関連すると考えられる。6匹のAPC子豚は全て、意図するHDR編集対立遺伝子に対して異型接合であり、1匹を除く全てが、第2対立遺伝子に3bpのフレーム内挿入又は欠失のいずれか1つを有した。残る子豚は、精子形成停止(DAZL−/−ファウンダ)又は結腸癌(APC+/−ファウンダ)の発生の表現型分析のために飼育した。
本発明の実施形態は、リコンビナーゼ(例えば、RecAタンパク質、Rad51)又はDNA組換えに関連する他のDNA結合タンパク質を含む標的ヌクレアーゼ系の投与を含む。リコンビナーゼは、核酸断片とフィラメントを形成し、実際には、配列と実質的に相同性のDNA配列をみいだすために、細胞DNAを捜索する。例えば、リコンビナーゼを、HDRの鋳型として役立つ核酸配列と組み合わせてもよい。続いて、リコンビナーゼをHDR鋳型と結合させることにより、フィラメントを形成させ、これを細胞に配置する。リコンビナーゼ及び/又はリコンビナーゼと結合するHDR鋳型は、タンパク質、mRNAとして、又はリコンビナーゼをコード化するベクターと一緒に、細胞又は胚に配置してもよい。米国特許出願公開第2011/0059160号明細書(米国特許出願第12/869,232号明細書)の開示内容は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込むものとし;矛盾する場合は、本明細書が優先される。リコンビナーゼという用語は、細胞において、2つの比較的長いDNA鎖間でのDNAの比較的短い部分の結合を酵素的に触媒する遺伝子組換え酵素を指す。リコンビナーゼとしては、Creリコンビナーゼ、Hinリコンビナーゼ、RecA、RAD51、Cre、及びFLPが挙げられる。Creリコンビナーゼは、loxP部位間のDNAの部位特異的組換えを触媒する、P1バクテリオファージ由来のI型トポイソメラーゼである。Hinリコンビナーゼは、サルモネラ菌(Salmonella)にみいだされる198アミノ酸から構成される21kDタンパク質である。Hinは、DNA切断及び組換えを開始するために、活性部位セリンに依存する、DNAインベルターゼのセリンリコンビナーゼファミリーに属する。RAD51は、ヒト遺伝子である。この遺伝子によりコード化されるタンパク質は、DNA二本鎖切断の修復を補助するRAD51タンパク質ファミリーのメンバーである。RAD51ファミリーメンバーは、細菌RecA及び酵母Rad51遺伝子に対して相同性である。Creリコンビナーゼは、loxP部位によってフランキングされる特定の配列を欠失するように、実験において用いられる酵素である。FLPは、パン酵母サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)の2μプラスミドに由来するFlippase組換え酵素(FLP又はFlp)を指す。
対立遺伝子移入は、多くの重要な用途を有する。以下の対立遺伝子移入に関する表、及び表1(HDR対立遺伝子を有するコロニーの回収の頻度)は、特定の遺伝子及びそれらの用途を記載する。本明細書を読んだ当業者は、移入並びにその結果得られる細胞及び動物を作製及び使用することができるであろう。当業者は、本明細書に記載する方法を、鋳型又は破壊の標的としてこれら対立遺伝子を使用するために容易に適用することができよう。いくつかの実施形態は、遺伝子修飾細胞又は動物(例えば、実験動物、F0ファウンダ、若しくは動物系列)を作製するステップを含み、それらのゲノムは、例えば、内在性対立遺伝子を、表1又は対立遺伝子移入に関する表からの対立遺伝子で置換する挿入又は鋳型駆動対立遺伝子移入によって、表1又は対立遺伝子移入に関する表からの遺伝子を受けている。家畜生産に利点をもたらすいくつかの遺伝子の対立遺伝子が報告されているが、頻度が非常に低いか、又は一部の品種若しくは種には存在しない(項目1〜9を参照のこと)。これら対立遺伝子の移入は、生産特性にとって重要な価値がある。例えば、肉牛品種からのPolled対立遺伝子(項目1)は、無角牛をもたらすが、乳牛品種には、この対立遺伝子がないため、角があり、生産作業要領として除角する必要がある。有角(乳牛)品種への肉牛品種由来対立遺伝子の移入によって、生産及び動物の健康状態の両方に価値がある無角乳牛が得られることになる。他の例は、食肉(項目4〜6)及び牛乳(項目7〜8)などの農産物の特徴を高め、又は増強することができる対立遺伝子に関する。項目9は、疾患耐性に有用である。
本発明のいくつかの実施形態は、リポータ及び/又は選択マーカの使用なしで細胞若しくは胚を修飾する方法に関する。一般に、TALEN及びCRISPR/Cas9修飾は、数日の時間枠にわたって不安定であることが観察された。従って、変化を安定化するために本明細書に記載される方法、並びに米国特許出願公開第2013/0117870号明細書に記載される他の方法:例えば、直接的mRNA導入及び/又はssDNA鋳型の使用を用いることができる。直接的導入、例えば、直接的mRNA導入という用語は、mRNA材料の導入を指す。対照的に、mRNAをコード化するベクターを用いた導入は、間接的導入と呼ぶ。多くの直接的導入方法が知られており、例えば、電気泳動、トランスフェクション、リポフェクション、リポソーム、ヌクレオフェクション、パーティクルガン、ナノ粒子、脂質トランスフェクション、電気細胞融合、及び直接的インジェクションが挙げられる。
当技術分野で公知の様々な技術を用いて、核酸構築物を非ヒト動物に導入し、核酸構築物がゲノムに組み込まれたファウンダ動物を作製することができる。このような技術として、限定はしないが、前核マイクロインジェクション(米国特許第4,873,191号明細書)、生殖細胞へのレトロウイルス媒介遺伝子移入、胚幹細胞への遺伝子ターゲティング、胚のエレクトロポレーション、精子媒介遺伝子移入(Lavitrano et al.,(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:14230−14235;Lavitrano et al.,(2006)Reprod.Fert.Develop.,18:19−23)、並びに体細胞、例えば、卵丘細胞若しくは哺乳動物細胞、又は成体、胎児、若しくは胚幹細胞のin vitro形質転換、それに続く核移植が挙げられる。前核マイクロインジェクション、精子媒介遺伝子移入、及び体細胞移植は、特に有用な技術であり、さらには、細胞質注入、始原生殖細胞移植、及び胚盤胞キメラ生産(生殖細胞を胚中で増殖させる)などが挙げられる。
様々な核酸を細胞に導入することができる。本明細書で用いる場合、核酸という用語は、二本鎖又は一本鎖(すなわち、センス又はアンチセンス一本鎖)である、DNA、RNA、及び核酸類似体、並びに核酸を包含する。核酸類似体は、例えば、核酸の安定性、ハイブリダイゼーション、又は溶解度を改善するために、塩基部分、糖部分、リン酸骨格で修飾することができる。モルホリノ核酸を生成するためには、デオキシリボースリン酸骨格を修飾することができる。さらに、デオキシリン酸骨格を例えば、ホスホロチオエート又はホスホロジチオエート骨格、ホスホロアミダイト、又はアルキルホスホトリエステル骨格で置換することもできる。核酸配列は、発現用プロモータなどの調節領域に作動可能に連結することができる。本明細書で用いる場合、作動可能に結合したとは、標的核酸の転写を可能にするか、又は促進するような方法での核酸配列に対する調節領域の配置を指す。任意のタイプのプロモータを標的核酸配列に作動可能に連結することができる。プロモータの例として、限定はしないが、組織特異的プロモータ、構成性プロモータ、及び特定の刺激因子に対して応答性又は非応答性のプロモータが挙げられる。
オンラインツール「TAL EFFECTOR NUCLEOTIDE TARGETER」を用いて、候補TALEN標的DNA配列及びRVD配列を同定した。次に、pCGOLDYTALEN(Addgene ID 38143)及びRCIscript−GOLDYTALEN(Addgene ID 38143)を用いて、Golden Gate Assemblyプロトコルに従うことにより、最終目的ベクターとして(Carlson 2012)、TALEN DNAトランスフェクション又はin vitro TALEN mRNA転写用のプラスミドを構築した。最終pC−GoldyTALENベクターは、PureLink(登録商標)HIPURE PLASMID MIDIPREP Kit(Life Technologies)を用いて調製し、使用前に配列決定した。QIAPREP SPIN MINIPREP kit(Qiagen)を用いて調製した集成RCIscriptベクターをSacIにより線状化して、本明細書の他所に既述したmMESSAGE mMACHINE(登録商標)T3 Kit(Ambion)を用いたin vitro TALEN mRNA転写用の鋳型として用いた。以前に記載されている(Carlson 2012)ように、修飾mRNAをRCIscript−GOLDYTALENベクターから合成し、3’−0−Mem7G(5’)ppp(5’)G RNA キャプ類似体(New England Biolabs)、5−メチルシチジン三リン酸プソイドウリジン三リン酸(TriLink Biotechnologies,San Diego,CA)及びアデノシン三リン酸グアノシン三リン酸から構成されるリボヌクレオチドカクテルを置換する。最終的ヌクレオチド反応濃度は、キャップ類似体については6mM、グアノシン三リン酸については1.5mM、及び他のヌクレオチドについては7.5mMである。得られたmRNAをDNAse処理した後、MEGACLEAR REACTION CLEANUP kit(Applied Biosciences)を用いた精製に付した。
遺伝子特異的gRNA配列を、Church lab gRNAベクター(Addgene ID:41824)に、その方法に従ってクローニングした。Cas9ヌクレアーゼは、hCas9プラスミド(Addgene ID:41815)、又はRCIscript−hCas9から合成されるmRNAの同時トランスフェクションのいずれかにより取得した。このRCIscript−hCas9は、hCas9プラスミド(hCas9cDNAを包含する)からのXbaI−AgeI断片をRCIscriptプラスミドにサブクローニングすることにより構築した。mRNAの合成は、KpnIを用いて線状化を実施した以外、上記と同様に実施した。
A)BB−HDR(1,623bp)プラスミド.ベルギアン・ブルー(Belgian Blue)対立遺伝子を含む1,695bp断片を、ベルギアン・ブルー(Belgian Blue)ゲノムDNAからPCR増幅した(btGDF8 BB 5−1:5’−CAAAGTTGGTGACGTGACAGAGGTC(配列番号88);btGDF8 BB 3−1:5’−GTGTGCCATCCCTACTTTGTGGAA(配列番号89))後、PCR 2.1ベクター(Life Technologies)にTOPOクローニングした。このプラスミドを、分析用プライマーセットの陽性対照鋳型として、並びに以下のプライマー(BB del HR 1623 5−1:5’−GATGTATTCCTCAGACTTTTCC(配列番号90);BB del HR 1623 3−1:5’− GTGGAATCTCATCTTACCAA、配列番号91)を用いたPCRによる1,623bp BB−HDR鋳型の誘導のために用いた後、前述のようにTOPOクローニングした。各プラスミドを使用前に配列確認した。Fast−Ion MIDI PLASMID ENDO−FREE kit(IBI Scientific)を用いて、トランスフェクション用プラスミドを調製した。rAAVパッケージング.BB−HDRをpAAV−MCSにクローニングした後、ADENO−ASSOCIATED VIRUS HELPER−FREE system(Agilent)を用いて、パッケージングした。手短には、10cmディッシュAAV−293細胞を各々5μgのpAAV−Helper、pAAV−RC及びAAV−BB−HDRプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションから2日後、細胞をこすり取ることにより、プレートから除去し、1mlの増殖培地に導入した。3回の凍結−乾燥サイクルによりウイルス粒子を放出させた後、微量遠心機において最大速度で5分間の遠心分離に付した。上澄みを吸収した後、標的細胞の感染のために直接使用した。
ブタ又は家畜線維芽細胞を、10%胎仔ウシ血清、100I.U./mlペニシリン及びストレプトマイシン、並びに2mM L−グルタミンを補充したDMEM中の、5%CO2で、37若しくは30℃(表示の通り)に維持した。トランスフェクションのために、別に記載のない限り、Neon Transfection sysmem(Life Technologies)を用いたトランスフェクションを通じて、全てのTALEN及びHDR鋳型を送達した。手短には、100%密集に達した低継代オサボー(Ossabaw)、ランドレース(Landrace)、和牛(Wagyu)、又はホルスタイン(Holstein)線維芽細胞を1:2に分割し、翌日70〜80%密集で回収した。各トランスフェクションは、プラスミドDNA又はmRNA及びオリゴと混合したバッファー「R」中に再懸濁させた500,000〜600,000細胞からなり、次のパラメータ:入力電圧;1800V;パルス幅;20ms;及びパルス数;1により100μlチップを用いてエレクトロポレーションした。典型的に、2〜4μgのTALEN発現プラスミド又は1〜2μgのTALENmRNA及び2〜3μMの目的遺伝子に特異的なオリゴが各トランスフェクションに含まれた。これらの量からの誘導を図面の説明に記載する。トランスフェクション後、30若しくは37℃のいずれかでそれぞれ3日間の培養のために、細胞を6ウェルディッシュの2つの個別のウェルに60:40で分割した。3日後、細胞集団を拡大し、37℃で少なくとも10日目まで編集物の安定性を評価した。
トランスフェクションから3日後、50〜250細胞を10cmディッシュに接種し、個別のコロニーが直径約5mmに達するまで培養した。この時点で、PBS中に1:5(vol/vol)希釈した6mlのTrypLE(Life Technologies)を添加し、コロニーを吸引し、24ウェルディッシュに移した後、同じ420条件下で培養した。密集に達したコロニーを回収し、冷凍保存及び遺伝子型決定のために分割した。サンプル調製物:3日目及び10日目のトランスフェクト細胞集団を6ウェルディッシュのウェルから回収し、10〜30%を50μlの1×PCR適合性溶解バッファー:200μgのプロテイナーゼKを新しく補充した10mM Tris−ClpH8.0、2mM EDTA、0.45%TrytonX−100(vol/vol)、0.45%Tween−20(vol/vol)中に再懸濁させた。溶解物をサーマルサイクラー中で次のプログラム:55℃で60分、95℃で15分を用いて、処理した。希釈クローニングからのコロニーサンプルを、20〜30μlの溶解バッファーを用いて、前述のように処理した。
低継代和牛(Wagyu)線維芽細胞を、70〜90%密集まで培養した後、以前に記載されている(Carlson 2012)ように、750ngのSLEEPING BEAUTYトランスポゾン成分と一緒に、各々2μgのTALEN発現プラスミド(btGDF83.1L+NR,)を用いたNUCLEOFECTION(Lonza)によりトランスフェクトした。プラスミドHDR鋳型を用いた条件の場合、2μgのBB−HDRプラスミドもトランスフェクションに含んだ。トランスフェクトした細胞は、30又は37℃での培養のために、6ウェルプレートの2つのウェルに分割した。rAAV HDR鋳型を用いた条件の場合、トランスフェクションから2時間後、150μlのウイルス溶解物を各ウェルに添加した。3日のインキュベーション後、細胞をトリプシン処理により回収し、その一部を3日目にHDRの分析のために溶解させ、残りは、以前に記載されている(Carlson 2012)ように、コロニー単離のために平板培養した。
意図する部位にフランキングするPCRを、1μlの細胞溶解物と共に、PLATINUM TAQ DNA POLYMERASE HIFI(Life Technologies)を用いて、製造者の推奨事項に従い実施した。前述のように、10ulのPCR産物を用いて、SURVEYOR MUTATION DETECTION Kit(Transgenomic)により、集団中の突然変異の頻度を分析した。表示の制限酵素を用いて、10μlの上記PCR反応物に対してRFLP分析を実施した。SURVEYOR及びRFLP反応物を10%TBEポリアクリルアミドゲル上で分離し、臭化エチジウム染色により可視化した。バンドの密度測定を、ImageJを用いて実施し;SURVEYOR反応物の突然変異率をGuschin et al.,201049に記載のように計算した。HDRの割合(%)は、RFLP断片の強度和を、親バンド+RFLP断片の強度和で割ることにより算出した。mlmoxP挿入の分析の場合、挿入部位にわたる小PCR産物を10%ポリアクリルアミドゲル上で分離し、野生型対立遺伝子に対する挿入物をサイズにより識別し、定量することができた。PCR産物を1X MYTAQ RED Mix(Bioline)により増幅して、2.5%アガロースゲル上で分離した以外は、コロニーのRFLP分析を同様に処理した。GDF8 G938Aのみ(オリゴには、新規のRFLPが欠如している)の移入のためのコロニーの分析のために、異型接合及び同型接合移入を識別することができる3つのプライマーアッセイにより、コロニーを初めにスクリーニングした。手短には、ブタ又はウシコロニーからの溶解物を、以下のプライマー及びプログラムを使用し、1X MYTAQ RED MIX(Bioline)を用いたPCRにより分析した。ウシGDF8(外部F1:5’−CCTTGAGGTAGGAGAGTGTTTTGGG、配列番号96、外部R1:5’−TTCACCAGAAGACAAGGAGAATTGC、配列番号97、内部F1:5’−TAAGGCCAATTACTGCTCTGGAGACTA、配列番号98;及び35サイクルの(95℃、20秒;62℃、20秒;72℃、60秒)。ブタGDF8:外部F1:5’−CCTTTTTAGAAGTCAAGGTAACAGACAC、配列番号99、外部R1:5’− TTGATTGGAGACATCTTTGTGGGAG、配列番号100 内部F1:5’−TAAGGCCAATTACTGCTCTGGAGATTA、配列番号101;及び35サイクルの(95℃、20秒;58℃、20秒;72℃、60秒)。候補からのアンプリコンを直接配列決定し、及び/又はTOPOクローニングした(Life Technologies)後、サンガー法(Sanger)シーケンシングにより配列決定した。BB−HDR鋳型を用いたTALEN媒介HDRを検出するために、1μlのPCR溶解物(1,000細胞/ul)又はその1:10希釈物1μlのいずれかを、PCRプライマーbt GDF8 BB 5−1(プライマー「c」)及びプライマー「c」(BB−Detect 3−1− 5’−GCATCGAGATTCTGTCACAATCAA、配列番号102)を用いたPCR反応物に添加した後、1X MYTAQ RED MIX(Bioline)を用いたPCRに40サイクル(9 459 5℃、20秒;66℃、20秒;72℃、60秒)付した。PCRにより同定されるコロニー中のHDRを確認するために、全遺伝子座の増幅を、プライマーbt GDF8 BB 5−1及びbt GDF8 BB 3−1を用いて実施した後、TOPOクローニング(Life Technologies)及び配列決定した。
POLLED移入の検出を、1X MyTaq Red MIX(Bioline)を使用し、F1プライマー(前文参照)及び「P」プライマー(5’−ACGTACTCTTCATTTCACAGCCTAC、配列番号103)を用いた38サイクル(95℃、25秒;62℃、25秒;72℃、60秒)のPCRにより、実施した。(F2:5’−GTCTGGGGTGAGATAGTTTTCTTGG、配列番号104;R2−5’−GGCAGAGATGTTGGTCTTGGGTGT、配列番号105)を用いて、実施した。両試験を通過した候補を、フランキングF1及びR1プライマーを用いたPCRにより解析した後、TOPOクローニング及び配列決定した。FecB移入の検出をヒツジについて以前に記載されているように実施した。Callipyge移入をAVAII RFLPアッセイにより検出した。図6の結果を参照されたい。
トランスフェクトした集団からDNAを分離し、100〜250ngを、50μlのPLATINUM TAQ DNA POLYMERASE HIGH FIDELITY(Life Technologies)(製造者の推奨事項に従いアセンブリングした)に添加した。各サンプルに、マルチプレックスシーケンシングを可能にするユニークなバーコードを含むプライマーセットを割り当てた。PCR産物の一部を2.5%アガロースゲル上に分離してサイズを確認した後、MINELUTE PCR PURIFICATION Kit(Qiagen)を用いて、PCRクリーンアップを実施した。サンプルを定量し、配列決定のための単一のサンプル中にプールした。合わせた単一サンプルに25%PhiX(配列多様性のために)を加え、Illumina MISEQシーケンサで配列決定することにより、150塩基対ペアエンドリードを生成した。FASTQCを用いて、リード品質を評価した。オーバーラップエンドを有するリードペアを、EA−UTILSパッケージからのFASTQ−JOINを用いて結合した。カスタムPERLスクリプトを用いて、結合リードを逆多重化し、挿入タイプをカウントする。逆多重化ステップには、フォワード及びリバースプライマーとの厳密なマッチが必要とされた。クローン化動物をRFLPアッセイ及び配列決定により遺伝子型決定した。本実施例及び他におけるブタを、Minitube of Americaとの契約に従いクローニングした。
図7を参照して、非修飾mRNA、修飾mRNA(mod mRNA)又はプラスミドDNA(pDNA)のいずれかによりコード化したブタ線維芽細胞に、P65_11.1 TALENを導入した。2つの量の各TALEN調製物をヌクレオフェクション(Lonza)により細胞にトランスフェクトし、30℃又は37℃で3日培養した後、indelの分析に付した。NHEJの割合(%)は、30℃でインキュベートした全mRNAトランスフェクションについて同様であったが、用量応答は、37℃でインキュベートしたトランスフェクト細胞に認めることができた。特に、30℃でインキュベートした全ての群でのmRNAトランスフェクションは、同じ条件下でプラスミドDNAとしてトランスフェクトしたTALENより、性能が有意に優れていた。この試験において修飾mRNA及び非修飾mRNAの間にほとんど差はなかった。P65_11.1 TALEN:
図8Aを参照すると、TALENのmRNAは、オリゴドナーを用いた効率的かつ一貫したHDRを刺激した。各チャートは、オリゴドナー鋳型と、プラスミドDNA又はmRNAとして送達されたTALENを用いて、線維芽細胞中の特定の遺伝子座(例えば、ssIL2RG;Sus scrofaの場合には「ss」、Bos taurusの場合には「bt」)のターゲティング結果を示す。(差し込み図)オリゴ鋳型の図であり、ここで、陰影を付けたボックスは、TALEN結合部位を表し、スペーサは白で示す。各オリゴは、RFLP分析のための新規制限部位を導入する4bpの挿入(ins4)又は欠失(del4)のいずれかを含有する。推定BMは、保存−1チミジン(TALEN結合部位に対して)を、表示のヌクレオチドで置換する。線維芽細胞は、3μMのそれらのコグネイトオリゴ相同鋳型と一緒に、TALENコード化プラスミド(3μg)又はmRNA(1μg)のいずれかでトランスフェクトした。次に、細胞を37℃又は30℃で3日間インキュベートした後、10日目まで37℃で拡大した。TALEN活性を3日目にSurveyorアッセイにより測定し(3日目Surveyor)、HDRを3日目及び10日目にRFLP分析により測定した(3日目%HDR及び10日目%HDR)。バーは各々、3回の反復実験からの平均及びSEMを示す。
図9を参照して、パネルa)ssLDLRをターゲティングするのに用いられる5つのオリゴの配列。オリゴは、長さ及び突然変異のタイプが異なる。TALEN結合部位は、ボックスで囲んだ文字で示し、新規のBamHI部位には下線を引く。BM及び挿入を含むSNPは、サークルで囲んだ。パネルb)細胞をLDLR2.1 TALEN mRNA(1μg)及びオリゴ(最終2μM)でトランスフェクトした。3日目のHDRをRFLP分析により決定し、SEMを含む平均(n=3)をプロットした。結果は、挿入対立遺伝子が、SNP又は欠失より効率的に組み込まれるが、46〜90bpの相同性長さは、HDR効率に無視できる影響しか及ばさなかったことを示唆している。c)ウシ細胞をbtRosa1.2 TALEN mRNAと、41_mloxP又は60_loxPオリゴのいずれか(最終2μM)でトランスフェクトした。41及び60の数字は、相同的塩基の数を指す。各オリゴは、34bp loxP部位、すなわち修飾(mloxP)又は野生型(loxP)形態のいずれかをスペーサの中央に含有する。3日目及び15日目のデンシトメトリは、loxP部位の挿入が、効率的かつ安定していることを示している。
図10を参照して、パネルa)S531Pミスセンス突然変異を、ブタp65のヌクレオチド1591でのT−Cトランジッションにより誘発する。S−P HDR鋳型は、新規XmaI部位を導入し、RFLPスクリーニングを可能にする原因TCトランジッション突然変異(拡大文字)を含む。2つのgRNA配列(p65_G1S及びp65_G2A)を、以前の実験で用いたp65.8TALENと一緒に示す。パネルb)ランドレース線維芽細胞を、S−P−HDRオリゴ(2μM)、2つの量のhCas9コード化プラスミド(0.5μg又は2.0μg);及び5つの量のG2A転写プラスミド(0.05〜1.0μg)でトランスフェクトした。各トランスフェクションからの細胞を30及び37℃でそれぞれ3日間の培養のために60:40に分割した後、10日目まで37℃で培養を延長した。Surveyorアッセイにより、16〜30%の活性が判明した。パネルc及びd)3日目及び10日目にサンプリングした細胞のRFLP分析。191及び118bpの予測切断産物を黒い矢印で示す。二本鎖切断(DSB)が標的SNPに接近しているにもかかわらず、CRISPR/Cas9媒介HDRは、S531Pの移入についてTALENより非効率的であった。また、各gRNA配列を用いて、個別のコロニーを分析した(データは、示していない)。
図12を参照して、パネルa)HDR対立遺伝子の維持に対するブロック突然変異(BM)の影響を、ブタLDLR及びGDF8において評価した。ブロック突然変異有り又はなしで同じSNP/制限313部位を導入するために、各オリゴを設計した。最初に30℃で3日間培養したトランスフェクトした集団中でHRを定量した後、RFLPアッセイにより12日目まで37℃でさらに維持した。平均及びSEM(n=3)を示す。パネルb)和牛(Wagyu)線維芽細胞へのミオスタチンC313Yの移入。C313Yミスセンス突然変異は、ウシミオスタチンのヌクレオチド938でのG−Aトランジッション(拡大文字により示す)によって誘発する。HDR鋳型は、RFLPスクリーニングのための新規EcoRI部位を導入するために、TからCへのトランジッション(サークルで囲む)も含む。2つの左TALENは、遺伝子座に対して設計され、btGDF83.6−Gは、野生型対立遺伝子(Wt)をターゲティングし、また、btGDF83.6−Aは、突然変異対立遺伝子(C313Y)をターゲティングし:いずれも共通の右TALENを有する。トランスフェクション、培養及び測定は前述のように実施した。btGDF83.6−G(n=30)及びbtGDF83.6−A(n=5)についての平均及びSEMは、それぞれ12及び3回の生物学的反復実験を代表する。両側スチューデントt検定を用いて、群同士の平均を比較し;p値を示す。
図13は、TALEN刺激HDR対立遺伝子の配列分析の結果を示すプロットである。TALEN mRNA及びオリゴトランスフェクト細胞集団から得られた標的部位(合計200〜250bp)にフランキングするPCRアンプリコンをILLUMINAシーケンシングにより配列決定した。総リードカウントは、サンプル当たり10,000328〜400,000の範囲であった。野生型リードに対し、完全な、意図するHRリードのカウントを、挿入(パネルa)及びSNP対立遺伝子(パネルb)についてプロットする。標的遺伝子座、時点、並びにBMがオリゴに含まれていたか否かを下に示す(パネルc)。btGDF8及びp65からのリードを標的SNPの組込みについて選別した後、追加突然変異を含むもの(iSNP+Mut)に対して、意図するもの(iSNP)を分類し、リード総数に対してプロットした。
図14を参照して、正しい挿入(パネルa)又はSNP対立遺伝子(パネルb)を含有する配列決定リードをBMの組込みについて分析した。標的遺伝子座、時点、並びにBMがオリゴに含まれていたか否かを、各グラフの下に示す。一般に、最も頻繁には5’BMがHDR変換路に組み込まれた後、両方のBM、又は3’BMのみが組み込まれた。LDLRへの意図する突然変異が、4bp挿入対立遺伝子と比較して、SNPである場合、BMの分布は、両BMの組込みに幾分傾く。また、興味深いことに、btGDF8について意図するリードの大部分は、少なくとも一方のBMを組み込んだが、3’BMを単独で有するものは稀であることに留意されたい。従って、BMは、培養物中に意図するSNP(iSNP)対立遺伝子を維持する頻度に対して有意な影響をもたらさないが、他の遺伝子座に対するその濃縮は、これらが、TALEN再切断からいくらかの防御をもたらした可能性を示唆している。c)図13パネルcのデータを突然変異タイプによりさらに分類し、比較した。iSNPのみを含むリードもあれば、indelを伴うもの(iSNP+indel)、又は意図しないSNPを伴うもの(iSNP+uSNP)もあった。BMが鋳型に含まれない場合、iSNP+indelの頻度にいくらかの上昇が見られ、indelの大部分はスペーサ領域内に位置し、これは、既に変換された対立遺伝子の再切断の結果であると考えられる。
図15を参照して、EIF4GI遺伝子は、TALEN DNA結合部位における複数のSNPで安定化された。パネルa)野生型EIF4GI Wt−NLの一部を示す。野生型EIF4GIを切断して、相同組換えを刺激するように、TALENのペアを設計した。また、3つのSNP(赤い拡大文字)をゲノムに導入するために用いるドナーオリゴ、DF−HDRのコア配列をWt配列とアラインメントする。第3のSNPは、新規EagI制限部位を形成し、これをRFLP分析に用いた。ブタ線維芽細胞を、EIF4GI14.1 TALEN mRNA(2μg)及びDF−HDR(2μM)でトランスフェクトした後、30℃で3日間培養した後、分析及びコロニー増殖に付した。パネルb)トランスフェクションから3日後の集団に対するRFLP分析。344,177及び167bpの予測産物サイズを、黒い三角形で示す。パネルc)単離した細胞クローンに対するRFLPアッセイ。3日目の細胞を用いて、希釈クローニングによるモノクローナルコロニーを取得した。異型接合(白い三角形)又は同型接合(黒い三角形)HDR対立遺伝子を有するコロニーの例を示す。
図16を参照して、ブタ線維芽細胞をTALEN mRNA(1μg)及びオリゴ(3μM)でトランスフェクトした。2つの独立したトランスフェクションからの細胞を各反復実験についてプールし、6ウェルプレートの6ウェルに均等に配分した後、30℃で培養した。トランスフェクションから1〜7日後(6日目を除き、X軸に沿って1D〜7D)のRFLP分析のために、これらの集団からサンプルを採取し、残る細胞を37℃で移入した。各条件についてのサンプルをRFLP分析のために12日目に再度採取した。最初の採取時及び12日目の平均HDR及びSEM(n=3)を示す。
図17を参照して、パネルa)caCLPG領域をターゲティングするように、TALENペア(caCLPG1.1)を設計した。オリゴ駆動HDRを用いて、要望されるアデニンをグアニンSNPに導入した(標的アデニンをボックスで囲む)。要望されるSNPは、AvaII制限部位の喪失により、遺伝子型決定が可能になった。各TALENモノマーは、それぞれの結合位置の上方に陰影を付けて示す。N及びC末端をN及びCでそれぞれ示す。b)AvaIIに対して耐性であった単一細胞由来コロニーの各対立遺伝子を配列決定した(AvaII耐性対立遺伝子のみを示す)。目的のSNP(ボックスで囲む)を含む対立遺伝子は全て、欠失(AvaII耐性対立遺伝子配列中にダッシュで示す)又は挿入(WT配列中にダッシュで示す)も含有した。c)再結合、並びに後に起こる再切断の可能性を低減するために、意図的ミスマッチ(サークルで囲んだ斜体)をRVD配列に導入した。ミスマッチは、TALENの右モノマーにおける要望のSNP(ボックスで囲む)に結合するであろうRVDの直前及び/又は直後のRVDに配置した。d)TALEN活性をCelIアッセイにより測定した。非相同末端結合(NHEJ)の割合(%)は、1.1及び1.1bと同等であった(28%)が、1.1a及び1.1c(それぞれ30%及び31%)の方が1.1より高かった。e)caCLPG1.1cを用いて生成されたAvaII耐性単一細胞由来コロニーの両方の対立遺伝子を配列決定した。要望されるSNPをボックスで囲む。コロニー37及び78は、要望のSNPに対して異型接合であったが、追加的indelは全く示さなかった。コロニー142は、要望のSNPに対して同型接合であったが、1つの対立遺伝子に4bp挿入を含有した。
図18を参照して、ミスマッチは、SNP移入に必要であった。K323A周辺のウシDGAT配列の概略図。グレイの矢印は、DGAT配列に結合するTALENモノマーを示す。左アームは、16RVDからなり、右アームは、15RVDからなり、スペーサは長さ16塩基対である。ボックスで囲んだGC及びggagctは、標的塩基対である。DGATオリゴは、GCをAAに変換して、要望されるDGAT突然変異体を形成する。HDRのマーカとして、ボックスで囲んだGGGAGCは、AAGCTTに変換され、これが、新規HindIII制限部位を形成する。この変化がスペーサ内であるため、TALEN結合に影響を与えず、従って、意図的ミスマッチ結果を妨害しないはずである。b)DGAT TALEN RVD配列。btDGAT 14.2は、RVDに意図的ミスマッチを一切含まない。btDGAT 14.4、14.5及び14.6は、左TALENモノマーの1、3、若しくは5位(サークルで囲む)のいずれかに1つの意図的RVDミスマッチを含有する。c)ウシ線維芽細胞を1ugのtalen及び0.4nモルのオリゴでトランスフェクトした。トランスフェクションから3日後、細胞を溶解させ、DGAT配列をPCRにより増幅し、HindIIIで消化してから、アクリルアミドゲル上で泳動させた。HDRの効率(%)をデンシトメトリ(HR)により決定した。d)コロニーの配列分析は、オリジナル14.2TALENと共に実施する。該当部位にオーバーラップするindelのために、12コロニーのうち、HindIII RFLPについて陽性であったもので、要望される突然変異を含有したものは1つもなかった。e)TALEN14.5及び14.6から得られたコロニーは、正しいDGAT突然変異及びHindIII制限部位を生成した。これら2つのTALENペアは、合わせて2つの同型接合(HH)コロニーと3つの異型接合(Hh)コロニーを生成した。TALEN14.4は、正しいDGAT突然変異を含むコロニーを全く生成しなかった(データは、示していない)。
図19は、TALEN−HDR/RMCEのプロセスを示す。floxedカセットを、オリゴと適合性のTALEN、loxPオリゴ及びCreリコンビナーゼの供給源と一緒にトランスフェクトした。この方法を機能させるために、TALENは、標的遺伝子座を切断してから、loxPオリゴによる修復の後、修復部位へのCre−媒介RMCEを実施しなければならない。棒グラフは、YFC−Cre及びmCherryをトランスフェクションに含有させた場合に、この方法により生成されたプロマイシン耐性コロニーの数を示す。SRY遺伝子座へのターゲティングを確認するために、370bp産物をもたらすであろう推定結合部(表示の通り)を横断して、PCRを実施した。この産物は、Creが含まれた場合にのみ明確に見える。この実験セットの場合、次の条件を使用した:1ugのSRY TALEN+0.3nモルのSSCY_LoxPオリゴ+CLP−YFP−Cre(0.5ug)+Floxed PTK(2ug)でトランスフェクトした600,000個の細胞。陰性対照は、CLP−YFP−Creの代わりに0.5ugのmCherryプラスミドを有した。SSCY_LoxPオリゴ:
TTTTATATACATTTTACACACATATATATGAAACATAACTTCGTATAGGAGACTTTATACGAAGTTATGGATCCAAGCTTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTGACAGTATTAATGGCCTGAACCTAGCCAGAACT(配列番号80)
本明細書に記載する特許、特許出願、参考文献、及び刊行物は全て、本明細書に参照により組み込むものとし、矛盾が生じる場合には本明細書が優先される。以下は、本明細書に記載する本発明の実施形態の例である。
Claims (30)
- 細胞の染色体DNA中に外性対立遺伝子を移入させる相同組換え修復(HDR)の方法であって、前記細胞に、標的エンドヌクレアーゼ系と、前記外性対立遺伝子を含むHDR鋳型とを導入するステップを含み、前記標的ヌクレアーゼ系は、前記染色体DNAにおける内在性コグネイト配列に特異的に結合するDNA結合メンバーを含み、前記標的ヌクレアーゼ系及び前記HDR鋳型が作動することにより、HDR鋳型配列に対して同一性を有するように前記染色体DNAを改変して、前記染色体DNA中に、内在性対立遺伝子の代わりに前記外性対立遺伝子を移入させ、
前記標的エンドヌクレアーゼ系及び/又はHDR鋳型が、DNAに対する前記標的エンドヌクレアーゼ系の特異的結合を低減する特徴を含む、方法。 - 特異的結合を低減する前記特徴が、前記内在性コグネイト配列に対するDNA結合メンバー配列中のミスマッチ及び/又は前記HDR鋳型配列に対するDNA結合メンバー配列中のミスマッチを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記標的エンドヌクレアーゼ系が、ヌクレアーゼに融合した複数のTALエフェクター反復配列(TALEN)を含み、前記TALENが、反復可変二残基(RVD)の配列を含み、及び前記ミスマッチが、前記内在性コグネイト配列に対してRVDの前記配列中に存在する、請求項2に記載の方法。
- 前記標的ヌクレアーゼ系が、Cas9ヌクレアーゼ及びガイドRNAを含み、前記ミスマッチが、前記内在性コグネイト配列に対してgRNA配列中に存在する、請求項2に記載の方法。
- 前記標的ヌクレアーゼ系が、ヌクレアーゼに融合した複数のTALエフェクター反復配列(TALEN)を含み、前記TALENが、反復可変二残基(RVD)の配列を含み、及び前記ミスマッチが、前記HDR鋳型配列に対してRVDの前記配列中に存在する、請求項2に記載の方法。
- 前記標的ヌクレアーゼ系が、Cas9ヌクレアーゼ及びガイドRNAを含み、前記ミスマッチが、前記HDR鋳型配列に対してgRNA配列中に存在する、請求項2に記載の方法。
- 前記外性対立遺伝子が、天然対立遺伝子であり、及び前記HDR鋳型が、前記ミスマッチを含み、前記ミスマッチが、天然に存在しない配列を形成する、請求項2に記載の方法。
- 前記外性対立遺伝子が、ミスマッチを含まず、かつ前記細胞により発現されるDNAを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記外性対立遺伝子が、前記ミスマッチを含み、かつ前記細胞により発現されるDNAを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記HDR鋳型配列に対して同一性を有するように前記染色体DNAを改変することによって、改変された染色体DNA配列に対し、前記DNA結合メンバー配列に前記ミスマッチを形成するように、前記DNA結合メンバー配列及び前記内在性コグネイト配列を選択するステップを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記外性対立遺伝子が、天然対立遺伝子であり、及び前記HDR鋳型が、前記天然対立遺伝子と、前記染色体DNA配列に対して同一性を有するDNAとから構成される、請求項10に記載の方法。
- 前記DNA結合メンバー配列及び前記内在性コグネイト配列を選択するステップが、前記HDR鋳型に対して同一性を有するように前記染色体DNAが改変されるとき、変化しない内在性コグネイト配列に第2のミスマッチを配置することをさらに含む、請求項10に記載の方法。
- 前記DNA結合配列に対して前記内在性コグネイト配列中に前記ミスマッチを配置するように、前記DNA結合メンバー配列及び前記内在性コグネイト配列を選択するステップを含み、及び前記HDR鋳型配列に対して同一性を有するように前記染色体DNAを改変するステップが、前記ミスマッチを除去しない、請求項2に記載の方法。
- 前記ミスマッチが、挿入、欠失、又は置換を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記挿入、欠失、又は置換が、1〜20残基の長さを有する、請求項14に記載の方法。
- 前記挿入、欠失、又は置換が、1〜20残基の長さを有する、請求項14に記載の方法。
- 前記ミスマッチが、1つのSNPである、請求項2に記載の方法。
- 複数のミスマッチを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記標的エンドヌクレアーゼ系が、TALENのペアを含み、前記TALENは、前記ペアの間にスペーサ配列を有する前記染色体DNAに局在化し、前記特徴が、前記スペーサ配列の長さに変化を生成して、前記TALENペアによる前記DNAの切断を阻止するように、前記HDR鋳型を選択するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記スペーサ長さが、欠失により減少するか、又は挿入により増加する、請求項19に記載の方法。
- 前記細胞が、初代細胞、初代体細胞、接合子、生殖細胞、幹細胞、卵母細胞、精子、及び胚からなる群から選択される、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼ系が、mRNAとして前記細胞中に導入される、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、家畜細胞である、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、ヒト以外の脊椎動物、霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ウサギ、魚類、イヌ、マウス、ネコ、ラット、又は実験動物である、請求項1〜23のいずれ一項に記載の方法。
- 前記細胞が、前記外性対立遺伝子に対して同型接合である、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法により作製される細胞。
- 請求項1〜26のいずれか一項に記載の標的ヌクレアーゼ系及びHDR鋳型を含むキット。
- SNPでの変化によって操作された遺伝子修飾動物であって、前記動物の染色体DNA中に内在性対立遺伝子を有する品種に属し、別の種又は別の品種の動物にみいだされる外性対立遺伝子を含み、前記外性対立遺伝子は、前記内在性対立遺伝子に対してSNPに変化を有する、遺伝子修飾動物。
- 前記内在性対立遺伝子に対して複数のSNPを含む、請求項28に記載の動物。
- 細胞の染色体DNAにランディングパッドを形成する方法であって、前記細胞に標的ヌクレアーゼ系及びHDR鋳型を導入するステップを含み、前記標的ヌクレアーゼ系は、前記染色体DNAにおける内在性コグネイト配列に特異的に結合するDNA結合メンバーを含み、前記標的ヌクレアーゼ系及び前記HDR鋳型が作動することにより、HDR鋳型配列に対して同一性を有するように前記染色体DNAを改変し、前記HDR鋳型配列が、ランディングパッドを含む、方法。
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