CN105960461B

CN105960461B - 有效的非减数分裂等位基因渐渗

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Publication number: CN105960461B
Application number: CN201480057624.5A
Authority: CN
Inventors: D.F.卡尔森; S.C.法伦克鲁格
Original assignee: Recombinetics Inc
Current assignee: Recombinetics Inc
Priority date: 2013-08-27
Filing date: 2014-04-29
Publication date: 2020-03-17
Anticipated expiration: 2034-04-29
Also published as: US20190106708A1; US20150156996A1; AR096143A1; US20190194687A1; KR20160048179A; JP2016529904A; AU2014311855A1; NZ718194A; US20180051298A1; AU2020286315B2; AU2020286315A1; CA2922084C; US9528124B2; CN111471719A; US10959414B2; CA2922084A1; MX2016002564A; US20240057570A1; CN105960461A; BR112016004020A2

Abstract

用于动物间的等位基因(包括SNP)的渐渗的方法、用途和动物。一个实施方案牵涉将靶向性靶向内切核酸酶系统和HDR模板导入在靶向内切核酸酶和靶定位点的结合中具有错配的细胞中。

Description

有效的非减数分裂等位基因渐渗

对相关申请的交叉引用

本申请要求2013年8月27日提交的美国临时申请No.61/870,401的优先权，其在此通过提及并入本文。

政府支持的声明

本文中描述的工作的方面得到来自国立卫生研究所的拨款1R43RR033149-01A1和来自USDA-国家食品与农业研究所(National Institute of Food and Agriculture)的生物技术风险评估项目竞争拨款号2012-33522-19766支持。美国政府可以具有这些发明的某些权利。

发明领域

技术领域涉及用于生成经遗传修饰的细胞和动物的材料和方法，和用于其的研究工具。

发明背景

从创建第一只转基因猪起，已经记录了以多种方式遗传工程化改造家畜的超过180项试验。动物遗传工程在传统上已经通过表达盒的随机插入，或者用连接的选择标志物的同源重组(低于10⁴之一的效率)实现，所述随机插入遭受低效率和无法预测的表达。

发明概述

已经利用三种最近的靶向性内切核酸酶技术，即锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应器核酸酶(TALEN)和成簇的规律间隔性短回文重复/CRISPR关联内切核酸酶cas9(CRISPR/Cas9)通过非同源末端连接(NHEJ)介导将插入和/或缺失(indel)引入物种基因组中来破坏基因功能。特别地，已经在范围为模式生物体至作物、耕作动物和人的各种物种中证明了TALEN诱导的基因破坏。然而，由NHEJ引入的indel在大小和序列上可变，这使功能性破坏的克隆的筛选变得费力，并且没有实现精确改变。TALEN或CRISPR/Cas9介导的同源性指导修复(HDR)已经支持在低等真核模型(包括酵母、斑马鱼和最近地小鼠)中引入限定的核苷酸变化。这些是容许修饰长传代细胞(long-passage cell)或原生殖细胞以生成转基因动物的模型。

本文中在约15个不同的工作例中在猪、山羊和牛基因组中证明了多种基因的精确的、高频率编辑。在一些实施方案中，基因编辑物与物种或进化枝内存在的等位基因不能区分，并且代表无标志物、非减数分裂等位基因渐渗的第一次证明。在可用于农业、研究工具、或生物医学目的的家畜基因组中的某些商业上重要的基因座中实现了高效率且精确的基因编辑。

这些方法已经将家畜基因编辑工具箱扩展到包含TALEN和使用质粒、rAAV和寡核苷酸模板的CRISPR/Cas9刺激的同源性指导修复(HDR)。实施例之一显示了将牛POLLED等位基因渐渗入有角(horned)Holstein成纤维细胞中。此实施例证明了可以创建没有角的各种乳牛品种。并且，此变化可以在不破坏动物的其它基因或基因组的其它部分的情况下进行。使用TALEN mRNA和寡核苷酸转染以群体中10-50％的效率将单核苷酸变化或小indel(意指替换、插入和/或取代的术语)引入猪、山羊和牛成纤维细胞中的约14个其它基因中。几个选定的编辑物模拟天然存在的性能增强或疾病抗性等位基因，包括第一次模拟单碱基对(bp)的变化。在不选择的情况下增殖的高达70％的成纤维细胞集落含有意图的编辑物，其中超过一半是纯合的。这些效率如此之高以至于这些变化可以在没有报告物的情况下和/或在没有选择标志物的情况下进行。使用编辑的成纤维细胞来产生在DAZL和APC基因中具有敲除等位基因的猪，从而分别为不育和结肠癌建模。这些方法在研究、农业和生物医学应用的家畜细胞、大型哺乳动物和家畜中证明了选择等位基因的无减数分裂物种内和物种间渐渗。

下述专利申请在此通过提及并入本文用于所有目的；在冲突的情况下，以本说明书为准：US 2010/0146655、US 2010/0105140、US 2011/0059160、US 2011/0197290和US2013/0117870。

附图简述

图1显示了使用TAL效应器内切核酸酶(TALEN)的一般方法。

图2显示了使用Cas9/CRISPR内切核酸酶(一种RNA引导内切核酸酶)的一般方法。

图3显示了TALEN运行的理论，其解释了它们为何一般对于进行SNP变化无效；类似的过程适用于其它靶向性内切核酸酶。

图4显示了生成和使用有效生成SNP编辑物靶向内切核酸酶的一般方法。

图5显示了生成和使用有效生成SNP编辑物靶向内切核酸酶的另一种一般方法。

图6：TALEN介导的POLLED渐渗。小图a)将Polled等位基因渐渗入Holstein(HORNED)细胞中的策略的示意图。POLLED等位基因(底部)是一个具有10bp缺失(未显示)的212bp的串联重复(水平箭)。开发出TALEN以特异性靶向HORNED等位基因(垂直箭)，其可以通过使用POLLED HDR质粒的同源重组修复。小图b)具有POLLED的纯合或杂合渐渗的集落的代表性图像。使用三个引物组进行候选集落的阳性分类：F1+R1、F2+R2和F1+P(POLLED特异性)。通过测序F1+R1扩增子确认PCR产物的身份。

图7是为了评估经转染的mRNA作为TALEN的来源而产生的实验数据的图。将由未修饰的mRNA、经修饰的mRNA(mod mRNA)或质粒DNA(pDNA)编码的TALEN导入成纤维细胞中。将两个量的每种TALEN制备物转染到细胞中，随后将细胞于30℃或37℃培养3天，之后分析indel，以％NHEJ报告。

图8A的图显示了使用寡核苷酸供体，TALEN的mRNA来源刺激有效并且一致的HDR。每幅图展示使用寡核苷酸供体模板和以质粒DNA或mRNA投递的TALEN靶向成纤维细胞中的特定基因座(例如ssIL2RG；“ss”代表野猪(Sus scrofa)以及“bt”代表欧洲牛(Bostaurus))的结果。(插图)寡聚物模板的图，其中有阴影的框代表TALEN结合位点，并且间隔物以白色显示。每个寡聚物含有4-bp插入(ins4)或缺失(del4)，其引入用于RFLP分析的新限制性位点。推定的BM用指定的核苷酸替换保守的-1胸苷(相对于TALEN结合位点)。用TALEN编码质粒(3μg)或mRNA(1μg)以及3μM其关联寡聚物同源模板转染成纤维细胞。然后，于37℃或30℃温育细胞3天，之后于37℃扩充，直到第10天。通过第3天的Surveyor测定法(第3天Surveyor)测量TALEN活性，并且在第3天和第10天通过RFLP分析测量HDR(第3天％HDR和第10天％HDR)。每个柱形展示来自三个重复的平均值和SEM。

图8B是为了评估用寡核苷酸模板进行TALEN诱导的HDR的动力学而产生的实验数据的图。用编码TALEN的mRNA或质粒DNA和靶向LDLR或APC基因的具有4个碱基对插入的寡聚物转染细胞。小图a)在指定时间点时对细胞群体的RFLP分析。小图b)通过密度计量术量化来自小图a的结果，并且平均值在具有SEM(n＝3)的情况中以时间函数绘图。HDR信号在转染后12小时第一次出现，并且随时间积累。

图9是为了评估突变类型对HDR频率的影响而产生的实验数据的图。小图a)野生型ssLDR(SEQ ID NO:1)和用于靶向ssLDLR的5种寡聚物的序列：(从上到下：SEQ ID NO:2、3、4、5和6)。在有框的文本中标示TALEN结合位点，并且新的BamHI位点加下划线。对包含BM和插入的SNP画圈。小图b)用LDLR2.1TALEN mRNA(1μg)和寡聚物(2μM最终)转染细胞。通过RFLP分析测定第3天的HDR，并且绘制了平均值及SEM(n＝3)。小图c)用btRosa1.2TALENmRNA和41_mloxP或60_loxP寡聚物(2μM最终)转染牛细胞。数字41和60指同源碱基的数目。每个寡聚物在间隔物中心含有34bp loxP位点，经修饰(mloxP)或野生型(loxP)形式。

图10：CRISPR/Cas9介导的HDR以将p65S531P突变从疣猪(warthog)渐渗入常规的猪中。小图a)S531P错义突变是由猪p65的核苷酸1591处的T-C转换引起的。S-P HDR模板包含成因TC转换突变(大号文本)，其引入新的XmaI位点，并且实现RFLP筛选。小图b)用S-P-HDR寡聚物(2μM)，两个数量的编码hCas9的质粒(0.5μg或2.0μg)；和5个数量的G2A转录质粒(0.05至1.0μg)转染细胞。将来自每种转染的细胞以60:40分开以分别于30和37℃培养3天，之后于37℃延长培养直到第10天。Surveyor测定法揭示了范围为16-30％的活性。小图c和d)对第3天和第10天取样的细胞的RFLP分析。191和118bp的预期切割产物以黑色箭标示。两种gRNA序列是P65_G1S(SEQ ID NO:7)和P65_G2A(SEQ ID NO:8)。野生型猪p65是SEQ IDNO:9，与同源性指导的修复(HDR)模板S-P-HDR(SEQ ID NO:10)比对显示。结合p65DNA的左TALEN序列和右TALEN序列分别是SEQ ID NO:11和12。

图11显示了用于比较TALEN和CRISPR/Cas9介导的HDR的实验数据。相对于野生型APC序列(SEQ ID NO:16)显示了小图a)APC14.2TALEN(SEQ ID NO:13和14)和gRNA序列APC14.2G1a(SEQ ID NO:15)。下文，显示了HDR寡聚物(SEQ ID NO:17)，其投递4bp插入(框示文本)，产生新的HindIII位点。用HDR模板、和TALEN mRNA、编码hCas9的质粒DNA和gRNA表达质粒；或编码hCas9的mRNA加上gRNA表达质粒转染细胞，于30或37℃培养3天，之后于37℃扩充，直到第10天。小图b)展示RFLP和Surveyor测定结果的图。

图12显示了使用寡聚物供体的SNP渐渗的实验数据。小图a)是对于猪LDLR和GDF8维持具有或没有阻断突变(blocking mutation,BM)的HDR等位基因的图。每种寡聚物具有相同的SNP/限制性313位点加或减BM。显示了平均同源重组和SEM(n＝3)。小图b)显示了肌肉抑制素(myostatin)C313Y对Wagyu成纤维细胞的渐渗的结果。C313Y错义突变是由牛肌肉抑制素的核苷酸938处的G-A转换(由大号文本标示)引起的。HDR模板(标记供体，SEQ IDNO:18)也包含T至C转换(画圈)以引入新的EcoRI位点，用于RFLP筛选。设计两种左TALEN，其针对基因座btGDF83.6-G(SEQ ID NO:19)，靶向野生型等位基因(Wt)(SEQ ID NO:20)，和btGDF83.6-A(SEQ ID NO:21)，靶向突变体等位基因(C313Y)；两者都共享共同的右TALEN(SEQ ID NO:22)。如上文进行转染、培养和测量。btGDF83.6-G(n＝30)和btGDF83.6-A(n＝5)的平均值和SEM分别代表12和3个生物重复。使用两侧Student t检验来比较组间的平均值；标示p值。

图13是显示TALEN刺激的HDR等位基因的序列分析的结果的图。对插入(小图a)和SNP等位基因(小图b)绘制完全的意图的HR读出对野生型读出的计数。标示了靶基因座、时间点和寡聚物中包含BM与否。小图c)。来自btGDF8和p65的读出在靶SNP的掺入方面分类，并且分类为意图的(iSNP)对那些具有别的突变的(iSNP+Mut)，并且相对于读出总数绘图。

图14显示了HDR等位基因的序列分析的结果。在BM的掺入方面分析含有正确插入(小图a)或SNP等位基因(小图b)的测序读出。在每幅图下标示了靶基因座、时间点和寡聚物中包含BM与否。小图c)。通过突变类型进一步分类图13小图c的数据，并且比较该数据。一些读出仅含有iSNP，其它具有伴随的indel(iSNP+indel)，或伴随的无意SNP(iSNP+uSNP)。

图15显示了在TALEN DNA结合位点中放置以稳定化EIF4GI基因中的HDR等位基因的多个SNP的实验数据。小图a)显示了野生型EIF4GI Wt-NL(SEQ ID NO:23)的部分和一对TALEN(SEQ ID NO:24和25)，其设计为切割野生型EIF4GI以刺激同源重组。还与Wt序列比对供体寡聚物DF-HDR的核心序列(SEQ ID NO:26)，所述供体寡聚物DF-HDR用于将三个SNP(加下划线的大号字母)引入基因组中。第三个SNP创建新的EagI限制位点，其用于RFLP分析。用EIF4GI14.1TALEN mRNA(2μg)和DF-HDR(2μM)转染猪成纤维细胞，然后于30℃培养3天，之后分析和集落增殖。小图b)显示了转染后3天对群体的RFLP分析。通过实心三角形标示344、177和167bp的预期产物大小。小图c)显示了对分离的细胞克隆的RFLP测定法。经由稀释克隆，使用第3天细胞得出单克隆集落。标示具有杂合(空心三角形)或纯合(实心三角形)HDR等位基因的集落的例子。

图16是用于SNP HDR等位基因的低温处理维持的数据的图。用TALEN mRNA(1μg)和寡聚物(3μM)转染猪成纤维细胞。对于每个重复，合并来自两次独立转染的细胞，并且均匀分配到6孔板的6个孔中，并且于30℃培养。从这些群体中收集样品以在转染后第1-7天(-第6天，沿着X轴的1D至7D)进行RFLP分析，并且将剩余的细胞转移到37℃。在第12天再次收集用于每种条件的样品以进行RFLP分析。在初始收集时和在第12天再一次显示平均HDR和SEM(n＝3)。

图17显示了生成为具有有意的RVD错配以改善引入SNP时正确等位基因的频率的TALEN的实验结果。小图a)显示了设计为靶向caCLPG区的TALEN对(caCLPG 1.1，SEQ ID NO:27-29，上到下，左到右)。利用寡聚物驱动的HDR来引入期望的腺嘌呤至鸟嘌呤SNP(靶定的腺嘌呤是框示的)。期望的SNP容许通过AvaII限制位点的丧失确定基因型。每个TALEN单体在其相应的结合位置上以阴影标示。小图b)显示了caCLPG野生型序列(SEQ ID NO:31)。测序对AvaII有抗性的单细胞衍生的集落的每种等位基因(具有SEQ ID NO:32-45的14种序列，从上到下)。含有感兴趣SNP(框示)的所有等位基因还含有缺失(在AvaII抗性等位基因序列中用短划线标记)或插入(在WT序列中用短划线标记)。在小图c)中，将有意的错配(斜体画圈文本)引入RVD序列(以蛋白质序列SEQ ID NO:46至53表示，上到下)。期望的SNP(框示)在TALEN的右单体中。小图d)显示了如经由CelI测定法测量的TALEN活性。标示非同源末端连接的百分比(％NHEJ)，并且各自测量。小图e)显示了显示的caCLPG野生型序列(SEQ IDNO:60)与用caCLPG 1.1c生成的AvaII抗性单细胞衍生的集落的测序等位基因(6种序列，具有SEQ ID NO:54至59，上到下)的比对。框示期望的SNP。集落37和78在期望的SNP上是杂合的，并且没有显示额外的indel。集落142在期望的SNP上是纯合的，但是含有一个等位基因上的4bp插入。

图18显示了在靶向内切核酸酶中具有和没有错配的情况中渐渗SNP的实验的结果。小图a)显示了K323A周围的牛DGAT序列的示意图(SEQ ID NO:61和62)。灰色箭代表TALEN单体，其中它们结合DGAT序列。左臂由16个RVD组成，右臂由15个RVD组成，并且间隔物长16个碱基对。GC和gga gct(框示)是靶定的碱基对。DGAT寡聚物将GC转化成AA以创建期望的DGAT突变体。作为HDR的标志物，将框示的GGGAGC转化成AAGCTT，这创建新的HindIII限制位点。由于此变化在间隔物中，它不应当影响TALEN结合，从而不干扰有意的错配结果。小图b)DGAT TALEN RVD序列(从上到下：SEQ ID NO:63至70)。btDGAT 14.2在RVD中不含有意的错配。btDGAT 14.4、14.5和14.6各自在左TALEN单体的位置1、3或5处含有一个有意的RVD错配(画圈)。小图c)用1ug Talen和0.4nmole寡聚物转染牛成纤维细胞。转染后3天，裂解细胞，通过PCR扩增DGAT序列，用HindIII消化，并且在丙烯酰胺凝胶上运行。通过密度计量术(HR)测定HDR的百分比效率。小图d)集落的序列分析产生初始14.2TALEN。在12个集落中，在HindIII RFLP方面呈阳性的无一个含有由于与位点重叠的indel所致的期望突变。(从上至下，SEQ ID NO:71至79，81)。小图e)源自TALEN 14.5和14.6的集落产生正确的DGAT突变和HindIII限制位点。这两个TALEN对产生总共2个纯合(HH)和3个杂合(Hh)集落。TALEN 14.4不产生具有正确DGAT突变的任何集落(数据未显示)，从上至下，SEQ ID NO:82至87。

图19列出了TALEN-HDR/RMCE的过程。与同寡聚物相容的TALEN、loxP寡聚物和Cre重组酶来源一起转染敲入(floxed)盒。柱形图显示了在转染中包含YFC-Cre对mCherry时由此方法生成的嘌呤霉素抗性集落的数目。为了确认对SRY基因座的靶向，在预测的交接(显示)间进行PCR会产生370bp产物。此产物仅在包括Cre时是明显的。

发明详述

基因编辑工具，诸如靶向内切核酸酶可用于生成经遗传修饰的动物。使用常规方法，使用这些工具来改变仅一个碱基处的天然等位基因是困难的或不可能的。本文中描述了用于生成单个碱基处的这些编辑物，或多个单碱基编辑物的新技术。这些方法可用于渐渗差异仅在于单核苷多态性(SNP)或多个SNP的等位基因。认为将SNP从一种品种或物种渐渗入另一种的能力创建重要的新机会。术语SNP指在比对和比较两种等位基因时在相同相对位点处的一个碱基的差异；在本文中，术语在一些背景中也用于意指单碱基变化。

图1显示了使用TAL-效应器内切核酸酶(TALEN)的一般过程。描绘了TALEN对；其它过程使用单一TALEN。以dsDNA选择靶位点。生成左和右TALEN，其具有TAL-效应器重复序列，该TAL-效应器重复序列包括选择为匹配靶定位点的重复可变二残基(RVD)。RVD设计为匹配其关联序列。用间接物将内切核酸酶(诸如Fokl)附着于TAL-效应器部分。考虑dsDNA的同源碱基配对，设计左TALEN和右TALEN。将TALEN引入细胞中，并且该TALEN在意图的靶位点处特异性结合。它们通常靶向基因，尽管为了其它目的，实际结合位点在适当时可以在启动子、内含子、外显子或其它位点处以破坏基因或改变其序列。TALEN在DNA中生成双链断裂，然后，该双链断裂通过细胞中的DNA修复机器修复。当存在与断裂位点周围的DNA具有实质性同源性的DNA时，细胞机器可以使用所述DNA作为模板来引导修复过程；此过程是同源性指导修复，并且引导是HDR模板。在缺乏模板的情况中，细胞可以成功修复自身或创建indel。

图2显示了使用Cas9/CRISPR内切核酸酶的一般方法。选择接近原间接物(protospacer)相邻基序的靶DNA。可以将tracrRNA和间隔物RNA组合成“单一引导RNA”分子，其与Cas9和靶序列两者复合，其中它引入双链序列特异性断裂。表达具有gRNA-tracrRNA的Cas9的载体是已知并且容易可用的。与用TALEN一样，细胞修复机器可以完全或在具有indel的情况下修复dsDNA断裂。若存在合适的HDR模板，则模板可以引导修复，并且创建天然DNA中的变化。

图3显示了靶向性内切核酸酶运行的理论，其解释了它们为何一般在生成SNP变化方面无效；类似的过程适用于RNA引导内切核酸酶。显示了天然的双链DNA(dsDNA)，其正暴露于TALEN对和同源性指导的修复(HDR)_模板。TALEN必须在靶定基因处结合。然后，它们可以切割天然的DNA，并且得到释放。在切割后，可以不完全修复天然DNA，从而它具有indel。甚至几个碱基的indel可以足以大大降低TALEN对修复的DNA的再结合。另一种可能性是修复过程会将经切割的DNA返回成其天然序列。或者，可以有序列中的成功HDR驱动的变化，从而它与HDR模板是相同的。然而，经改变的DNA受到TALEN的再结合和再切割。实际上，经切割的DNA已经被解螺旋，并且可用于切割，而天然的DNA可以不是为可用的。编辑的动力学需要HDR模板的参与，而非同源末端连接(NHEJ)的断裂修复不然。因此，认为当期望对天然基因的SNP或其它小变化修饰时，动力学驱动编辑过程至不想要的结果。

图4显示了生成并使用有效生成SNP编辑物的靶向内切核酸酶的一般方法。一种有效的策略是设计靶向内切核酸酶，使得期望的SNP(或其它改变的残基)在内切核酸酶系统的DNA结合部分的关联区中。HDR模板引导SNP中的变化，从而期望的SNP是与RVD或其它DNA结合部分的错配。

此外，任选地，可以对HDR模板添加变化以创建进一步的错配。设计HDR序列以降低DNA结合成员的特异性结合的实施方案包括在如与内源染色体DNA比对的HDR模板序列中放置错配。错配可以包含下列一项或多项：插入、缺失、取代、1-6个残基的插入和/或1-6个残基的缺失、1-6个残基的取代、仅一个SNP、一个或多个SNP；技术人员会理解领会涵盖明确叙述的限度内的所有数值和范围。在天然存在的等位基因的渐渗的背景中，错配可以在存在于天然存在的等位基因中的那些外。

图5显示了生成和使用靶向内切核酸酶的另一种一般方法，所述靶向内切核酸酶有效生成SNP编辑物，或者生成较大的编辑物。生成靶向内切核酸酶之一(和/或两者(若适用的话))的DNA结合序列，其与内源DNA具有有意的错配。在TALEN中，选择RVD作为错配。在CRISPR/Cas9中，引导序列具有一个或多个错配。期望的SNP(指作为渐渗过程的生物目的的变化)可以在DNA结合域的内部和/或外部。创建结合降解似乎是不可能的方法。但是，实际上，实验显示了在初始结合阶段时将效率向下驱动是有助的。

可以组合图4和5的实施方案。TALEN或CRISPR/Cas9可以设计为具有错配以降低对内源DNA的结合和/或HDR模板可以引入错配以降低对靶向内切核酸酶的特异性结合和/或可以选择内源DNA上的位点以对DNA结合域创建关联结合序列中的错配。在天然存在的等位基因的渐渗的背景中，错配可以在存在于天然存在的等位基因中的那些外。因此，方法会包括选择存在于自然界中的等位基因，生成至少包含所述等位基因的一部分的HDR模板，并且在HDR模板中和/或在DNA结合域中生成一个或多个错配。

POLLED等位基因的渐渗

为了保护牧场操作人员和牛的安宁，在美国、欧洲和其它地区从大多数乳牛常规手动除去角。去角是疼痛的，引发动物应激的短暂升高，对动物生产增加费用，并且尽管保护动物免于后续损伤的意图，该实践被一些人视为残忍的。一些食用牛品种是天然无角的(例如Angus)，一种称为POLLED的显性性状。本文中列出的技术通过提供不必经历去角的动物来改善动物福利。最近已经在染色体1上鉴定出赋予无角性(polledness)的两种等位变体。具有这些中任一种突变的乳牛是罕见的，并且一般比其有角对应物在牛奶场遗传选择指数上排序得低得多。可以通过传统的杂交实现POLLED等位基因对有角品种的减数分裂渐渗，但是杂交动物的遗传优点会受损害，并且需要选择育种的多个过长世代来恢复生产能力。

然而，有可能在动物中创建无角性，并且在破坏动物基因组的情况下这样做。在源自有角牛奶场公牛(dairy bull)的成纤维细胞中实现CelticPOLLED等位基因(替换10bp的212bp复制)的非减数分裂渐渗。从Angus品种采集质粒HDR模板，其含有包含Celtic POLLED等位基因的1594bp片段(图6小图a)。设计TALEN，使得它们可以切割HORNED等位基因，但是使POLLED等位基因不受影响。令人惊讶地，此实验显示了作为mRNA投递的一对TALEN与质粒表达盒相比具有相似的活性(图7)。因而，进行实验，该实验以mRNA投递TALEN以消除TALEN表达质粒的可能的基因组整合。226个集落中的5个(2％)通过图6小图b中显示的每种PCR测试以确认POLLED的渐渗。5个克隆中的3个在POLLED渐渗方面呈纯合，并且通过测序确认为与意图的等位基因是100％相同的。2014年1月14日提交的美国系列No.14/154,906(其在此通过提及并入本文)提供关于无角性的更多信息。

猪、山羊和牛基因组中的等位基因渐渗

虽然质粒模板对于POLLED和GDF8的渐渗是有效的，但是发明人相信许多期望的等位基因对应于SNP。第一组实验使用寡核苷酸模板，该寡核苷酸模板在其关联TALEN结合位点中具有重叠，并且还将4bp indel引入间隔物区中以进行限制片段长度多态性(RFLP)分析。用质粒编码的或mRNA编码的TALEN加上寡核苷酸模板转染原代成纤维细胞，并且于30或37℃温育3天。作为mRNA投递的TALEN在于30℃温育的细胞中性能一致好于质粒(图8A)。尽管通过SURVEYOR测定法测量的可察觉的TALEN活性水平，与质粒相比当以mRNA投递TALEN时，HDR一致更高(>2倍)。此观察结果是令人惊讶的，并且推测这可以已经是有利动力学的结果；例如来自mRNA的TALEN更快速被翻译，容许在寡核苷酸降解前利用模板。然而，时间过程实验显示了由质粒对mRNA编码的TALEN之间在HDR开始中的很小差异(图8B)。在于30℃使用TALEN mRNA复制中，累积突变和总HDR的水平是相似的，这提示了大多数突变体等位基因对应于意图的渐渗。

在先前的研究中，TALEN诱导的indel在延长的培养后下降50-90％，除非使用选择过程或标志物(Carlson,D.F.et al.Efficient TALEN-mediated gene knockout inlivestock,Proceedings of the National Academy of Sciences,109:17382-17387(2012),在本文中为“Carlson 2012”)。换言之，即使在可以生成indel时，它们经常是不稳定的，并且必须使用选择标志物过程来鉴定稳定变化。比较而言，在本文中观察到4个基因座处的HDR水平在没有选择性富集的情况下在第3天和第10天测量时是大致等同的，这指示了这些HDR indel等位基因在培养中是稳定的(图8A)。在所有4个基因座处的基因编辑物的高得一致的比率(25-50％)和稳定性提示了经编辑的细胞应当可在没有选择性富集、报告物或选择标志物的情况下通过稀释克隆回收。牵涉对约1,000个集落分析8个不同基因座中的限定indel等位基因的其它实验工作揭示了10-65％(平均42％)的回收率，其中多达32％的集落在意图的编辑物上呈纯合(表1)。数据显示了以mRNA将TALEN引入细胞中有助于效率和稳定性；于30℃延长的培养时间也是有助的。

如本文中使用的，术语报告物指编码报告物和选择标志物的基因或转基因。如本文中使用的，术语选择标志物指赋予性状的遗传表达的生物分子，所述性状容许通过正或负存活选择标准分离。报告物可以是例如荧光标志物，例如绿色荧光蛋白和黄色荧光蛋白。报告物可以是选择标志物，例如嘌呤霉素、更昔洛韦、腺苷脱氨酶(ADA)、氨基葡糖苷磷酸转移酶(neo,G418,APH)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、潮霉素-B-磷酸转移酶、胸苷激酶(TK)或叶黄素-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)。表型标志物是基于可辨别物理性状(例如表位或颜色)、生长速率和/或存活力的标志物。

基因编辑物的差别稳定性

不知道是否有可能具有通过NHEJ或HDR进行的稳定SNP的渐渗。如表1中指示，牛和猪GDF8或猪p65内的HDR的第3天水平(7-18％)和具有意图SNP等位基因的细胞克隆的分离(3-15％)两者显著低于在indel等位基因方面，其中HDR范围为10至约50％。此数据提示了下述假设，即indel比SNP更稳定，因为会预期TALEN间隔物区域中至少4bp的引入或消除降低基因座的再切割，这与对TALEN间隔物长度的约束一致。并且，基于提出的相同基因座内的HDR频率与寡聚物的比较，甚至4bp插入等位基因比SNP等位基因更有效(图9)。此假设还解释了为何序列分析揭示了对于GDF8或猪p65几乎半数的分离的SNP阳性集落含有预期改变TALEN间隔的伴随indel。无论如何，有可能在没有对基因座的任何额外变化的情况下以直至几乎5％水平回收具有GDF8(猪和牛两者)中的G938A和猪p65中的T1591C的纯合转变的集落(表1)。还有可能将绵羊FecB和Callipyge基因座的小的多态性渐渗入山羊基因组中。精确改变单核苷酸或1-3个核苷酸的此能力是令人惊讶且有意义的。作为比较，还有可能设计与p65的T1591C位点重叠的CRISPR gRNA，并且比较使用两种平台的渐渗。尽管在意图位点处有效生成DSB，CRISPR/Cas9介导的HDR在第3天低于6％，并且在第10天低于检测(图10)。具有CRISPR介导的HDR的经修饰克隆的回收也低于用TALEN，即使TALEN切割位点距离SNP位点为35bp(表1)。分析第二个基因座ssAPC14.2处的CRISPR/Cas9诱导的靶向有效得多，但是仍然没有达到此位点处由TALEN诱导的HDR水平，大约30对60％(图11)。

用于等位基因渐渗以及用于稳定化渐渗的SNP等位基因的策略

考虑到刚好在TAL结合位点前的5’胸苷核苷酸的保守，推理改变寡聚物HDR模板中的这些碱基(称为阻断突变(BM))会抑制编辑的等位基因的再切割。令人惊讶地，BM对猪LDLR或GDF8基因座处SNP等位基因的维持没有重大影响(图12小图a)。这提示了以寡核苷酸为模板的HDR的转化道(conversion tract)相当短，并且不掺入BM，或者改变5’-胸苷没有完全消除TALEN活性。

对来自用寡聚物和TALEN mRNA转染的细胞群体的靶位点侧翼的200-250bp扩增子进行ILLUMINA深度测序。来自猪和牛中的5个基因座的结果显示了插入等位基因在群体中一般更普遍和稳定(图13)。鉴于BM对培养物中的意图等位基因的保留具有很少的影响，相对于插入编辑物，有对SNP编辑的等位基因中的BM掺入的略微偏爱(图14)。凭借我们的集落分析，基于在btGDF8和p65中掺入意图的SNP(iSNP)，G938A或T1591C转化分类的读出揭示了几何半数的具有iSNP的读出具有额外的突变(iSNP+Mut)(图13小图b)，其中大多数是indel(图14)。大多数在间隔物中具有indel的iSNP btGDF8读出还含有一个或两个BM(数据未显示)，这证明了保守的5’-胸苷的修饰不能抑制再切割和随后的indel生成。如此，此碱基对于TALEN结合的重要性必须小于通过保守提示的，并且提供了BM不能保持等位基因的分子基础，如上文描述的。

降低SNP编辑物的再切割的另一种策略是设计TALEN，使得其结合位点与靶SNP重叠。评估了TALEN结合位点内的RVD/核苷酸错配对于将G938A SNP渐渗入牛GDF8中的影响。生成了两对TALEN，结合野生型“G”等位基因(btGDF83.6-G)的一个和结合意图的“A”等位基因(btGDF83.6-A)的另一个(图12小图b)。用每个TALEN对的HDR在第3天时是相似的，而使用结合野生型“G”等位基因的TALEN，在第12天时测量的水平显著更高，这指示了再切割在完全靶向修复的等位基因的btGDF83.6-A的情况下更普遍。不同RVD/核苷酸错配可以具有更大的对维持HDR等位基因的影响，因为用于野生型“G”TALEN的NN-RVD能够结合G和A核苷酸两者。为了修饰猪EIF4GI，发现了3个RVD/核苷酸错配对于保护HDR编辑物是足够的，因为几乎70％的分离的集落含有编辑的等位基因，大于半数的那些为纯合子的(表1和图15)。如此，有意改变靶基因座以抵抗再切割是一种用于保持编辑物的有效策略。

假设基因编辑是一种动态过程。建立理论，TALEN切割和再切割与通过NHEJ、用寡核苷酸模板的HDR、和用姐妹染色单体作为模板的HDR的修复处于变化之中。假设观察到的SNP等位基因损失可以如下降低，即延长低温处理，减缓细胞增殖，长得足以久于来自TALENmRNA转染的TALEN活性爆发。实际上，且令人惊讶地，此延长几乎使延长培养后回收的SNPHDR编辑等位基因的水平变成三倍(图16)。

对于生物医学应用，改变除了创建期望功能性的关键碱基外的碱基是可接受的，只要实现期望的表型，并且其它变化明显没有功能相关性。然而，发明人相信对于用于农业的动物期望的是在没有进一步变化的情况下复制自然(天然)等位基因或者在没有进一步变化的情况下仅生成意图的编辑物。与错配源自HDR构建体的成功渐渗的办法形成对比，错配可以源自RVD序列中的变化。对于TALEN，此过程需要TALEN单体构建为具有RVD，其不结合其在天然等位基因中的相应核苷酸(图17小图c)。在设计核酸酶(在此情况中为TALEN)以防止期望物的再切割中的有意错配的此构思是新的，并且在下述理论下运行。TALEN在其结合活性基本上被消除前可以仅容许其结合区中的一些错配。如此，有可能开发下述TALEN，其具有与天然等位基因的有意错配，且仍会切割，但是在创建更多错配时，结合会被消除。有意错配的理论在于在期望等位基因的渐渗后，新的错配会对TALEN密码中的工程化错配具有添加效应以通过至关重要的倾翻点(tipping point)，从而使TALEN无活性。违反直觉的是，通过RVD的有意错配化(mismatching)降低核酸酶对靶物的亲和力提供了渐渗特定突变下至单核苷酸多态性(SNP)，并且降低由于再切割所致的不想要的indel的策略。

作为一个例子，TALEN对(caCLPG 1.1)设计为具有0个错配以靶向山羊(Capraaegagrus hircus)基因组中的CLPG基因座(图17小图a)。期望的突变是腺嘌呤至鸟嘌呤SNP，其已经与后肢肌肉肥大的增加联系起来。SNP由于AvaII限制位点的丧失而容许集落的容易基因型分型。初始限制消化测定法显示了具有有希望的结果的几个集落，然而，当对每个集落的等位基因测序时，14个中的0个是我们的意图产物，因为在期望的SNP外，每个含有不想要的indel(图17小图b和表2标记使用有意错配的成功率)。为了测试有意错配方法，开发出具有有意错配的不同数目和位置的其它3种TALEN对(图17小图c)。这些TALEN能够以与初始caCLPG1.1TALEN对相似的频率切割野生型等位基因(图17小图d)。为了观察对HDR和降低不想要的indel的影响，个别集落源自用caCLPG 1.1c(两个错配)和HDR模板转染的细胞。与用初始caCLPG1.1TALEN的结果形成对比，15个AvaII抗性集落中的3个(20％)在期望的SNP方面呈阳性，并且不含额外的突变(3/15＝20％)(图17小图e和表2)。如此，意图的等位基因的偏差依赖于有意的错配。

在别的例子中，本发明特异性改变牛DGAT基因中的两个碱基。如用CLPG基因座一样，尝试在没有有意错配的情况下渐渗期望突变失败，因为0/12个在HindIII位点上呈阳性的RFLP集落没有indel(图18小图d和表2)。使用有意错配方法，并且发现了群体水平上的HDR总体率(图18小图c)。然而，来自个别集落的测序揭示了三个有意错配设计中的两个是成功的，分别产生2/12和3/12正确等位基因(对于14.5和14.6)(图18小图e和表2)。如用CLPG基因座一样，意图的等位基因的偏离依赖于RVD编码的有意错配。表1中的数据证明了组合编码TALEN的mRNA以及作为模板以指导HDR的寡核苷酸实现用于基因组编辑策略的几种标志：1)仅改变靶核苷酸，并且mRNA转染避免了质粒DNA的非意图整合，2)基因编辑物是有效的；从约10％(对于SNP)至高于50％(对于一些较大的变化)，以及3)方法是可靠的；实现了16/16个位点(15种基因)的靶向性改变。本文报告的效率和精确性是非常令人惊讶的。

基因编辑中的两个顾虑是稳定化靶定位点处的变化并且避免非意图位点的修饰。关于第一点，发现了下述证据，即可以丧失指导单碱基对变化(即SNP)的HDR编辑物(图12和图13小图b)。基于靶定DNA序列前的胸苷影响TAL结合的预测，尝试通过引入BM阻断渐渗的等位基因的再切割。然而，发现了BM不阻止TALEN活性和编辑的等位基因的再切割(图12和图14和15)。比较而言，引入多个SNP或别的序列(图8A和图15)导致更稳定的HDR226编辑物。令人惊讶地，发现了低温培养的延长导致渐渗的SNP等位基因的稳定化。建立理论，低温主要通过延长细胞周期的G1期来减缓细胞增殖，从而此处理以细胞周期依赖性方式差别地有利于寡聚物-HDR与姐妹染色单体为模板的修复。不管机制如何，此办法提供了用于回收具有SNP等位基因的精确渐渗的细胞的直接策略。

通过精确基因编辑实现多种目的(表1)。通过用4bp indel中断编码序列实现生物医学相关性的基因敲除。此策略是可靠的，并且一般在约40％克隆(范围为26-60％)中导致HDR编辑物，并且在那些中，高达三分之一是纯合子。以相似的频率，将经修饰的loxP(mloxP)位点整合到牛和猪中的ROSA26和SRY基因座中，其可以用作着落垫(又称为安全港(safe harbour))以经由重组酶介导的盒交换在家畜中插入新序列。先前，仅已经对家畜的Y染色体证明了NHEJ编辑物，然而，TALEN适合于直接刺激敲除/敲入，至少如在小鼠中证明。还有，存在有物种/品种间的天然等位基因的渐渗，包括到Wagyu牛和Landrace猪基因组中的GDF8双肌性突变(分别来自Piedmontese和Belgian Blue牛的SNP G938A23，25或821del1123-25)。

在一些情况中，用标准质粒载体和同源重组盒的基因靶向会不适合于转基因投递。一些情况可以包括在尝试在周围有重复元件或低复杂性DNA的位点中放置转基因时。在这些情况中，可以优选由寡聚物HDR需要的短同源性以将转基因整合到独特序列的小区域中。然而，寡聚物HDR的货物容量不足以投递转基因。为了避开此问题，我们寻求组合寡聚物HDR用于投递小插入(例如LoxP位点)的效率和重组酶介导的盒交换(RMCE)的大货物容量用于位点特异性整合转基因。重组酶介导的盒交换(RMCE)是一种基于位点特异性重组过程(SSR)的特征的方法。此过程容许通过靶向性整合对高等真核基因组的系统性、重复修饰。此结果通过用先前存在的基因盒对携带感兴趣基因(GOI)的类似盒的干净交换用RMCE实现。

在使用RMCE生成高等脊椎动物(诸如家畜)中的经遗传修饰的动物的情况下有问题。一个重大的问题在于由于衰老前原代家畜细胞的短寿命，此过程必须在单次处理中发生。在一些其它类型的细胞中有可能的是连续进行RMCE过程，其中分离具有插入的LoxP位点的细胞克隆，之后用RCME机器转染，并且分离克隆以鉴定那些具有正确靶向事件的。申请人尝试通过用4种组分同时转染原代成纤维细胞来实施此过程：1)SRY TALEN，2)与SRY具有同源性的寡聚物，其包含两个RMCE相容性loxP位点，3)RMCE相容性转基因和4)Cre重组酶的来源。在图19中，RMCE转基因是嘌呤霉素抗性基因，其实现整合事件的选择。与包含mCherry表达盒代替YFC-Cre的对照组形成对比，嘌呤霉素抗性集落的数目在提供YFC-Cre时显著增加。在嘌呤霉素抗性集落(选自于30℃或37℃处理3天的细胞)中，8(n＝95)和4％(n＝95)在RMCE载体的正确靶向方面呈阳性。这些结果显示了有可能同时提供TALENS、含有loxP位点的HDR模板、侧翼有loxP的感兴趣转基因、和Cre重组酶mRNA，导致对TALEN靶定基因座的RMCE介导的重组。

本发明的实施方案包括使用具有导入宿主细胞或胚胎中的序列的HDR模板进行的同源性依赖性修复的过程，所述HDR模板是着落垫，例如用于外源基因。术语着落垫根据其常规的意义使用，指稳定整合到宿主细胞的基因组中的位点特异性识别序列或位点特异性重组位点。异源位点特异性重组序列在宿主基因组中的存在容许重组酶介导异源多核苷酸或外源物对宿主基因组的位点特异性插入。

实施方案包括在细胞的染色体DNA中创建着落垫的试剂盒、用途、组合物和方法，包括将靶向性核酸酶系统和HDR模板导入细胞中，所述靶向性核酸酶系统包含特异性结合染色体DNA中的内源关联序列的DNA结合成员，其中靶向性核酸酶系统和HDR模板运行以将染色体DNA改变为与HDR模板序列具有同一性，其中HDR模板序列包含着落垫。方法可以在原代细胞或胚胎中应用。实施方案包括导入靶向核酸酶、编码着落垫的HDR模板、与着落垫相容的外源基因、和与其相同的重组酶的来源；可以同时导入所有这些。术语同时与按顺序多次处理细胞的假设过程形成对比；该术语必须在上下文中保留，领会到它指字面上同时导入或经计算使所有因素在同时有生物活性的导入。着落位点可以是例如RMCE相容性loxP位点、FRT、rox、VloxP、SloxP。重组酶可以是例如Cre、FLP、Dre。

在其它实验中，为了改善动物福利，将POLLED等位基因从牛肉生产品种转移到来自有角乳牛的细胞中。将用于非洲猪热病毒恢复力(resilience)的候选SNP等位基因(p6539的T1591C)从疣猪转移到常规猪细胞的基因组，并且将造成升高的生育力(fecundity)(FecB；BMPR-IB)和起源亲本(parent-of-origin)依赖性肌肉肥大(Callipyge)的绵羊SNP渐渗入山羊基因组中。此类渐渗先前通过育种是不可能的，并且会实现相关物种中限定遗传效应的评估。非减数分裂等位基因渐渗在没有选择性富集的情况下按常规尚不可能，并且本文中报告的效率比先前用选择获得的结果高10³-10⁴倍。此类高水平的未选择的单一等位基因渐渗提示了它会适合于在耕作动物的单一世代中改变多个等位基因，这降低了长世代间隔对遗传改进的影响。此外，有效编辑成纯合性会大大提高每个育种间隔的渐渗率。

作为本文中描述的发明的进一步确立，使用定制的内切核酸酶来生成在两个独立基因座处具有精确编辑物的活体动物。经编辑以破坏DAZL基因的猪可用作用于研究通过生殖细胞移植恢复人能育性的模型，或者用于通过转移经遗传修饰的种系干细胞生成经遗传修饰的后代，如在猪、山羊和啮齿类中证明的。经基因编辑的APC等位基因提供了大小相关的结肠癌模型，用于临床前评估治疗剂、手术干预或检测形式。这些结果证明了将遗传修饰，包括多态性，并且包括模拟天然多态性的修饰引入家畜中。基因编辑技术可用于通过物种内和物种间等位基因渐渗来加速工业产品的遗传改善，从而帮助满足对动物蛋白质的不断增长的全球需求。它还可用于开发对于药物和装置测试具有限定遗传学的大型动物，或者用于开发治疗性细胞和器官。其它用途包括生成可以在体外用于研究以了解生殖和传染疾病的机制，并且改善基因编辑和对照的方法的细胞。

基因编辑以避免核酸酶系统的再结合

实验结果提示了靶向性(内切)核酸酶系统在意图的关联位点处有效切割dsDNA。对数据的分析提示了核酸酶会结合已经作为模板的位点，并且再切割该位点，从而使dsDNA逆转成其初始序列。靶向性核酸酶系统包含通过蛋白质与DNA结合或者通过核酸与DNA结合来结合关联DNA的基序。实验证明了可以选择含有多态性的模板来混淆靶向核酸酶的再结合或再切割，从而显著增加精确渐渗的细胞克隆的数目。

用于降低再结合的实施方案包括同源性指导修复(HDR)以将外源等位基因渐渗到细胞的染色体DNA中的方法，包括将靶向性核酸酶系统和包含外源等位基因的HDR模板导入细胞中，其中所述靶向性核酸酶系统包含用于特异性结合染色体DNA中的内源关联序列的DNA结合成员，其中靶向性核酸酶系统和HDR模板运行以将染色体DNA改变为与HDR模板序列具有同一性并且将外源等位基因渐渗到染色体DNA中，替换内源等位基因。在一个实施方案中，HDR模板序列设计为引入多态性，该多态性意图降低渐渗后DNA结合成员对基因组序列的特异性结合。或者，靶向核酸酶的DNA结合成员可以设计为识别不存在于内源或外源序列中的核苷酸序列。鉴于此跛行性(hobbled)DNA结合成员的水平足以实现内源等位基因的切割，来自HDR模板的意图多态性进一步改变靶位点，并且降低精确渐渗的等位基因的再切割。这导致含有那些精确渐渗事件的群体内细胞克隆的较高频率。

术语等位基因意指两种或更多种基因形式之一。生物体的群体或物种通常包含各个个体间每个基因座处的多个等位基因。基因座处的等位变异可以存在的等位基因(多态性)的数目，或群体中杂合子的比例测量。如本文中使用的，术语天然等位基因意指在自然界中在修饰的生物体的相同物种中找到的等位基因。术语新等位基因意指非天然等位基因。放入山羊中的人等位基因是新等位基因。术语合成等位基因意指尚未在自然界中找到的等位基因。外源等位基因是导入生物体中的，而内源等位基因是已经在细胞中的，通常是以其野生型未修饰状态在生物体中的。杂合的动物具有两种等位基因。在一些情况中，期望导入外源等位基因以生成在已经存在于杂合动物中的等位基因方面纯合的动物。等位基因物种间的移动意指从动物的一个物种至另一种，而物种内意指相同物种的动物间的移动。术语外源等位基因是广泛的，并且包括具有例如天然的、新的或合成的SNP或indel、报告物、内切核酸酶消化位点、启动子和载体的DNA。

同源性指导修复(HDR)是细胞中修复ssDNA和双链DNA(dsDNA)损伤的机制。当存在有HDR模板时细胞可以使用此修复机制，所述HDR模板具有与损伤位点具有相当大的同源性的序列。同源性结合在该术语在生物学领域中通常使用时指与非靶序列相比以高亲和力结合靶物的分子，并且一般牵涉多种非共价相互作用，诸如静电相互作用、范德华相互作用、氢键键合等)。特异性结合牵涉结合底物并且自底物释放的过程；因此，它可以受到结合效率的变化和自底物释放及受到对底物的结合强度影响。因而，特异性结合的降低可以源自较小的对底物的亲和力，其降低结合事件的数目，或者它可以源自降低的对底物的结合强度，其降低结合维持多长。在靶向性内切核酸酶的上下文中，不限于具体理论，内切核酸酶或引导序列对DNA的特异性结合的变化可以不仅影响所述实际结合，而且还参与靶定和/或模板DNA或RNA形成复合物的不完全理解的过程。因此，特异性结合可以相对于实际DNA结合事件测量，并且是一种对于操作那些过程有用的特征，即使在染色体水平上的实际事件牵涉超过或少于实际DNA结合。特异性杂交是具有互补序列的核酸之间的特异性结合的形式。蛋白质也可以例如在TALEN或CRISPR/Cas9系统中或者通过Gal4基序特异性结合DNA。等位基因的渐渗指在内源等位基因上以模板引导的过程复制外源等位基因的过程。内源等位基因可以实际上切割，并且在一些情况中被外源核酸等位基因替换，但是存在的理论在于该过程是复制机制的过程。由于等位基因是基因对，它们之间有相当大的同源性。等位基因可以是编码蛋白质的基因，或者它可以具有其它功能，诸如编码生物活性RNA链或提供用于接收调节蛋白或RNA的位点。

HDR模板是包含渐渗的等位基因的核酸。模板可以是dsDNA或单链DNA(ssDNA)。优选地，ssDNA模板是约20至约5000个残基，尽管可以使用其它长度。技术人员会立即领会涵盖明确叙述的范围内的所有范围和数值；例如500至1500个残基、20至100个残基等。模板可以进一步包含侧翼序列，其提供与内源等位基因相邻DNA的同源性。模板也可以包含下述序列，其与靶向性核酸酶系统结合，并且如此是系统的DNA结合成员的关联结合位点。术语关联指通常相互作用的两种生物分子，例如受体和其配体。在HDR过程的背景中，生物分子之一可以设计为具有与意图(即关联)的DNA位点或蛋白质位点结合的序列。

用于降低对靶向性核酸酶系统的特异性结合的一个实施方案包括相对于其与内源DNA的比对做出HDR模板中的变化。一类变化设计为创建关联成员之间的错配。一种变化是插入或缺失一个或多个残基。另一种变化是用一种残基取代另一种残基，该取代不促进结合。术语残基指分子链中的单元，例如蛋白质中的氨基酸或核酸中的碱基。一个做出变化的位置在用于系统的DNA结合成员的关联结合位点。

另一类变化设计为通过在与间隔物一起运行的系统(例如TALEN对)中的间隔物中做出变化干扰核酸酶的运行，可以在间隔物区域中做出变化。这些变化可以包括缺失，例如使得阻断核酸酶做出切割。这些各种变化在本文中一般称为错配，因为它们在比对序列时创建错配；在此上下文中，缺失、插入或取代是错配。技术人员常规做出序列比对，从而容易以特异性鉴定错配。核酸酶对需要提供协同性的空间；可以通过对间隔物添加或扣除破坏其活性。

其它实施方案在外源等位基因中放置错配。系统的DNA结合成员设计为在与内源等位基因至少部分重叠的位点处结合。一旦它渐渗为与外源等位基因具有同一性，DNA结合成员具有降低的结合。如此，DNA结合成员的关联位点从优选的内源等位基因变化成非优选的外源等位基因。关联位点可以涵盖所有等位基因，或仅其一部分。令人惊讶的是，将错配引入外源等位基因中是稳定化外源等位基因渐渗需要的。明显地，再切割的问题对渐渗等位基因的稳定性具有非常大的影响。其他人先前没有获得显示此影响的数据，因为具有相当效率的过程不是常规可用的。

实施方案包括用HDR模板化(templating)过程通过插入、缺失或取代残基创建这些各个位置处的错配。例如，可以插入、缺失或取代1-60个残基；技术人员会立即领会涵盖明确叙述范围内的所有范围和数值；例如1-3个残基、至少10个残基、4个残基、4-20个残基等。可以组合这些中的一种或多种，例如一个位置处的插入、另一个处的缺失、和其它位置处的取代。

实施方案包括设计靶向内切核酸酶的DNA结合成员以在如与内源染色体DNA比对的DNA-结合成员序列中放置错配。错配通常也会是外源DNA的错配。这些错配降低靶向核酸酶再结合。其它错配可以与如已经描述的此方法组合使用，例如用在外源等位基因渐渗的位置处选择的内切核酸酶的DNA结合位点；在DNA结合关联物处具有错配的HDR模板；或者在间隔物区域中以改变间隔。

这些各个实施方案可以在无报告物系统中进行，并且以产生SNP或与SNP相关的实施方案。细胞或动物可以是例如脊椎动物、家畜、灵长类、猪、牛、马、绵羊、山羊、鸡、兔、鱼、犬、小鼠、猫、大鼠和实验室动物。

SNP

这些实验结果提供了用于将单核苷酸多态性(SNP)放入染色体DNA中的过程。SNP可以放置于预先确定的位置处。这种对放置的控制没有先例。例如，可以将SNP放置到内源等位基因中，而没有其它位置处的其它SNP或修饰。此外，且至关重要地，内源等位基因可以替换为仅相差一个SNP的外源等位基因。并且，以最小的变化对细胞基因组中的任何位置处的染色体DNA进行放置。可以渐渗一个或多个SNP。

一个实施方案是在细胞的染色体DNA中创建单核苷酸多态性(SNP)的方法，包括将靶向性核酸酶系统和HDR模板导入细胞中，其中靶向性核酸酶系统包含用于特异性结合染色体DNA中的内源关联序列的DNA结合成员，其中靶向性核酸酶系统和HDR模板运行以将染色体DNA改变为与HDR模板序列具有同一性，其中HDR模板序列包含SNP。HDR模板可以具有多个SNP或仅一个。可以存在其他变化，例如插入、缺失或取代。或者，变化可以限于单一SNP，或者一个或多个渐渗入内源等位基因中的SNP。HDR模板序列可以包含替换内源等位基因的外源等位基因，其中外源等位基因包含与内源等位基因的序列比对中的SNP。

其他实施方案包括将SNP放置到用于靶向性核酸酶系统的DNA结合成员的关联位点中。SNP可以选择为降低对DNA结合成员的结合。如此，可以放置一个SNP，或多个。其它变化、SNP、或其它可以存在于等位基因中或不然。染色体DNA可以没有所有其它变化。

实施方案包括经遗传修饰的动物，所述动物属于具有内源等位基因的动物品种，所述动物包含SNP处的遗传变化以将动物的染色体DNA从内源等位基因改变为存在于动物的另一个物种或另一个品种中的外源等位基因。动物可以包含下列一项或多项：多个SNP以将动物的染色体DNA从内源等位基因改变为存在于动物的另一个物种或另一个品种中的外源等位基因；进一步没有报告物；在多态性、一个或多个SNP上纯合；是家畜、灵长类、猪、牛、马、绵羊、山羊、禽类、鸡、兔、鱼、犬、小鼠、猫、大鼠和实验室动物。

这些各个实施方案可以在无报告物系统中进行，并且以产生SNP或与SNP相关的实施方案。细胞或动物可以是例如家畜、灵长类、猪、牛、马、绵羊、山羊、禽类、鸡、兔、鱼、犬、小鼠、猫、大鼠和实验室动物。

靶向性核酸酶系统

基因组编辑工具，诸如转录激活物样效应器核酸酶(TALEN)和锌指核酸酶(ZFN)已经影响许多生物体中的生物技术、基因疗法和功能性基因组研究的领域。新近，RNA引导内切核酸酶(RGEN)通过互补RNA分子针对其靶位点。Cas9/CRISPR系统是RGEN。tracrRNA是另一种此类工具。这些是靶向性核酸酶系统的例子：这些系统具有将核酸酶定位于靶位点的DNA结合成员。然后，该位点被核酸酶切割。TALEN和ZFN具有与DNA结合成员融合的核酸酶。Cas9/CRISPR是在靶DNA上寻找彼此的关联物。DNA结合成员在染色体DNA中具有关联序列。通常鉴于意图的关联序列设计DNA结合成员，从而获得在意图位点处或附近的溶核性作用。某些实施方案适用于所有此类系统而没有限制；包括使核酸酶再切割最小化的实施方案，用于在意图残基处精确生成SNP的实施方案，和在DNA结合位点处渐渗的等位基因的放置。

TALEN

如本文中使用的，术语TALEN是广泛的，并且包括可以在没有来自另一个TALEN的帮助的情况下切割双链DNA的单体TALEN，例如如在Beurdeley,M.et al.Compact designerTALENs for efficient genome engineering.Nat.Commun.4:1762doi:10.1038/ncomms2782(2013)中的。术语TALEN也用于指工程化改造为一起运行以在相同位点处切割DNA的TALEN对的一个或两个成员。一起运行的TALEN可以称为左-TALEN和右-TALEN，其参考DNA或TALEN对的手性。

已经报告了TAL的密码(PCT公开文本WO 2011/072246)，其中每个DNA结合重复负责识别靶DNA序列中的一个碱基对。可以装配残基以靶向DNA序列。简言之，确定用于TALEN结合的靶位点，并且创建包含核酸酶和识别靶位点的一系列RVD的融合分子。在结合后，核酸酶切割DNA，从而细胞修复机器可以运行以在切割端处产生遗传修饰。术语TALEN意指包含转录激活物样(TAL)效应器结合域和核酸酶域的蛋白质，并且包含本身功能性的单体TALEN以及需要与另一个单体TALEN二聚化的其它TALEN。二聚化在两个单体TALEN都相同时可以产生同二聚体TALEN或者在单体TALEN不同时可以产生异二聚体TALEN。

在一些实施方案中，可以使用单体TALEN。TALEN通常以二聚体发挥功能，用间隔物跨越二分识别位点，使得两个TAL效应器域各自与FokI限制酶的催化域融合，用于每个所得的TALEN的DNA识别位点以间隔物序列分开，并且每个TALEN单体对识别位点的结合容许FokI二聚化，并且在间隔物内创建双链断裂。然而，也可以构建单体TALEN，使得单一TAL效应器与不需要二聚化而发挥功能的核酸酶融合。例如，一种此类核酸酶是FokI的单链变体，其中两个单体以单一多肽表达。其它天然存在或功能化单体核酸酶也可以发挥此作用。用于单体TALEN的DNA识别域可以源自天然存在的TAL效应器。或者，DNA识别域可以工程化改造为识别特定的DNA靶物。工程化单链TALEN可以更易于构建和采纳，因为它们仅需要一个工程化DNA识别域。可以使用两种不同DNA结合域(例如，一个TAL效应器结合域和一个来自另一类分子的结合域)生成二聚体DNA序列特异性核酸酶。TALEN可以以二聚体发挥功能，用间隔物跨越二分识别位点。此核酸酶构造也可以用于自例如一个TALEN单体和一个锌指核酸酶单体生成的靶物特异性核酸酶。在此类情况中，用于TALEN和锌指核酸酶单体的DNA识别位点可以以合适长度的间隔物分开。两个单体的结合可以容许FokI二聚化，并且在间隔物序列内创建双链断裂。也可以将与锌指不同的DNA结合域，诸如同源结构域、myb重复或亮氨酸拉链FokI融合，并且充当与TALEN单体的配偶体以创建功能性核酸酶。

术语核酸酶包括外切核酸酶和内切核酸酶。术语内切核酸酶指能够催化DNA或RNA分子，优选DNA分子内的核酸间的键水解(切割)的任何野生型或变体酶。内切核酸酶的非限制性例子包括II型限制性内切核酸酶，诸如FokI、HhaI、HindlII、NotI、BbvCl、EcoRI、BglII和AlwI。当通常具有长度约12-45个碱基对(bp)，更优选14-45bp的多核苷酸识别位点时，内切核酸酶还包含稀有切割内切核酸酶。稀有切割内切核酸酶包含在限定基因座处的DNA双链断裂(DSB)。稀有切割内切核酸酶可以是例如归巢内切核酸酶、源自工程化锌指域与限制酶诸如FokI的催化域的融合的嵌合锌指核酸酶(ZFN)或化学内切核酸酶。在化学内切核酸酶中，将化学或肽切割剂与核酸聚合物或识别特定靶序列的另一种DNA缀合，从而将切割活性靶向至特定序列。化学内切核酸酶还涵盖合成核酸酶，如邻二氮菲、DNA切割分子和三重形成寡核苷酸(TFO)(已知其结合特定的DNA序列)的缀合物。根据本发明，术语“内切核酸酶”中包含此类化学内切核酸酶。此类内切核酸酶的例子包括I-See I、I-Chu L I-Cre I、I-Csm I、PI-See L PI-Tti L PI-Mtu I、I-Ceu I、I-See IL 1-See III、HO、PI-Civ I、PI-Ctr L PI-Aae I、PI-Bsu I、PI-Dha I、PI-Dra L PI-Mav L PI-Meh I、PI-Mfu L PI-MflI、PI-Mga L PI-Mgo I、PI-Min L PI-Mka L PI-Mle I、PI-Mma I、PI-30Msh L PI-Msm I、PI-Mth I、PI-Mtu I、PI-Mxe I、PI-Npu I、PI-Pfu L PI-Rma I、PI-Spb I、PI-Ssp L PI-Fae L PI-Mja I、PI-Pho L PI-Tag L PI-Thy I、PI-Tko I、PI-Tsp I、I-MsoI。

用于模板指导性修复的延长低温

令人惊讶地，实验显示了延长的低温培养期可以增强模板化过程的效率。已知低温细胞培养物长达约3天有用以引入双链DNA断裂。此效果的常规理论围绕下述想法，即活性酶在被稀释或者通过抑制分类稳定化DNA。

然而，本文中的数据与这些其它理论不一致。取而代之，认为低温使如由姐妹染色单体引导的改变的染色体的再修复最小化。换言之，即使有成功的整合，细胞可以使用改变位点处的姐妹染色单体来消除改变的等位基因。此外，这些数据第一次显示了可以使用低温来影响模板化过程。实验的一个令人惊讶的方面是延长的低温培养没有改善将模板复制到细胞DNA中的效率。它改善的事情是外源等位基因在其已经被复制后的稳定性。实际上，此过程几乎使SNP HDR编辑等位基因的水平变为三倍。上文讨论了此现象的运行的理论。

一个实施方案是模板指导性修复以改变细胞的染色体DNA的低温方法，其包括将靶向性核酸酶系统和核酸模板导入活细胞中，其中靶向性核酸酶系统和模板运行以将染色体DNA改变为与模板序列具有同一性，其中于低于生理温度的低温培养温度将活细胞维持时间段。可以在适当时改变培养的长度，例如超过3天至31天或72至800小时；技术人员会立即领会涵盖明确叙述的范围内的所有范围和数值；例如80至600小时，4天至15天、3.1天至2周等。于约20℃的延长培养时间已经获得成功(数据未显示)。低温培养温度范围为20至34℃；技术人员会立即领会涵盖明确叙述的范围内的所有范围和数值；例如21至30℃。此外，实施方案包括于所述范围内的特定温度维持培养物以及容许培养温度在保持在该范围内的情况下变化。术语“保持在范围内”在此背景中包括这两种实施方案。实施方案包括培养以提供对细胞中导入的等位基因的稳定性；例如，稳定性持续超过5次细胞分裂，或至少3次细胞分裂，或者在3和10之间数值的细胞分裂；技术人员会立即领会涵盖明确叙述的范围内的所有范围和数值。

具有经基因编辑的等位基因的生物医学模式动物的生成

选择猪基因组中的两种经基因编辑的基因座以贯彻到活的动物：APC和DAZL。腺瘤结肠息肉(APC)基因中的突变不仅造成家族性腺瘤息肉病(FAP)，而且还在大多数散发性结肠直肠癌中发挥限速作用。Dazl(无精子症样中的缺失)是一种RNA结合蛋白，其对于脊椎动物中的生殖细胞分化是重要的。DAZL基因与能育性相关，并且可用于不育模型及精子发生停滞。合并具有DAZL或APC的经HDR编辑的等位基因的集落以通过染色质转移克隆。每个合并物从三次转移产生两次妊娠，其中使各一次妊娠产下。从经DAZL修饰的细胞生出总共8只小猪，其中每个反映与源自NHEJ的HDR等位基因或缺失一致的选择集落的基因型。DAZL小猪中的3只是死产的。在来自经APC修饰的细胞的6只小猪中，1只是死产的，3只在1周内死亡，并且另一只在3周后死亡，全部出于可能与克隆相关的未知原因。所有6只APC小猪在意图的经HDR编辑的等位基因上是杂合的，并且除了1个外全部在第二个等位基因上具有3bp符合读码框的插入或缺失。饲养剩余的动物以表型分析精子发生停滞(DAZL-/-建立者)或者形成结肠癌(APC+/-建立者)。

本文中详述了模板驱动的渐渗方法。本发明的实施方案包括模板驱动的渐渗(例如通过HDR模板)以将APC或DAZL等位基因放置到非人动物，或任何物种的细胞中。

此方法及多种方法在本文中一般涉及细胞和动物。这些可以选自下组：脊椎动物、家畜、偶蹄动物、灵长类、牛、猪、绵羊、山羊、禽类、鸡、兔、鱼、犬、小鼠、大鼠、猫或实验室动物。术语家畜意指作为食物或生物材料商品饲养的驯化动物。术语偶蹄动物意指偶蹄目(Artiodactyla)的有蹄哺乳动物，其包括牛、鹿、骆驼、河马、绵羊、猪和山羊，它们在每只脚上具有偶数数目的趾(通常两个或有时四个)。

重组酶

本发明的实施方案包括施用具有重组酶(例如RecA蛋白，Rad51)或与DNA重组有关的其它DNA结合蛋白的靶向性核酸酶系统。重组酶与核酸片段形成细丝，并且实际上搜索细胞DNA以寻找与序列基本上同源的DNA序列。例如，可以组合重组酶与充当HDR模板的核酸序列。然后，组合重组酶与HDR模板以形成细丝，并且放入细胞中。可以将重组酶和/或与重组酶组合的HDR模板以蛋白质、mRNA、或用编码重组酶的载体放置在细胞或胚胎中。美国公开文本2011/0059160(美国系列No.12/869,232)的公开内容在此通过提及并入本文用于所有目的；在冲突的情况下，以说明书为准。术语重组酶指在细胞中酶促催化两个相对较长DNA链间DNA的相对较短部分的连接的遗传重组酶。重组酶包括Cre重组酶、Hin重组酶、RecA、RAD51、Cre、和FLP。Cre重组酶是一种来自P1噬菌体的I型拓扑异构酶，其催化loxP位点间DNA的位点特异性重组。Hin重组酶是一种在细菌沙门氏菌中找到的由198个氨基酸组成的21kD蛋白质。Hin属于DNA转化酶的丝氨酸重组酶家族，其中它依赖于活性位点丝氨酸以启动DNA切割和重组。RAD51是一种人基因。由此基因编码的蛋白质是一种RAD51蛋白家族成员，其帮助修复DNA双链断裂。RAD51家族成员与细菌RecA和酵母Rad51.基因同源。Cre重组酶是一种在实验中用于删除侧翼有loxP位点的特定序列的酶。FLP指源自发面酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的2μ质粒的翻转酶重组酶(FLP或Flp)。

在本文中，“RecA”或“RecA蛋白”指具有基本上所有或大多数相同功能的RecA样重组蛋白家族，特别是：(i)将寡核苷酸或多核苷酸正确放置在它们的同源靶物上以随后由DNA聚合物延伸的能力；(ii)在拓扑学上制备双链体核酸以合成DNA的能力；和(iii)RecA/寡核苷酸或RecA/多核苷酸复合物有效寻找并结合互补序列的能力。最佳表征的RecA蛋白来自大肠杆菌；在蛋白质的初始等位形式外，已经鉴定出许多突变体RecA样蛋白，例如RecA803。此外，许多生物体具有RecA样链转移蛋白，包括例如酵母、果蝇(Drosophila)、哺乳动物，包括人，和植物。这些蛋白质包括例如Rec1、Rec2、Rad51、Rad51B、Rad51C、Rad51D、Rad51E、XRCC2和DMC1。重组蛋白的一个实施方案是来自大肠杆菌的RecA蛋白。或者，RecA蛋白可以是大肠杆菌的突变体RecA-803蛋白，来自另一种细菌来源的RecA蛋白或来自另一种生物体的同源重组蛋白。

用于渐渗的等位基因

等位基因渐渗具有许多重要的应用。下文的等位渐渗表和表1(具有HDR等位基因的集落的回收频率)描述了某些基因及其应用。阅读本申请的技术人员会能够进行并使用渐渗及所得的细胞和动物。技术人员可以容易应用本文中列出的方法以使用这些等位基因作为模板或靶物进行破坏。实施方案包括生成经遗传修饰的细胞或动物(例如，实验室动物、F0建立者、或动物系)，其基因组已经接受来自表1或等位渐渗表的基因，例如通过插入或模板驱动个等位基因渐渗，其用来自表1或等位渐渗表的等位基因替换内源等位基因。报告了一些基因的等位基因提供家畜生产优势，但是以非常低的频率或者在一些品种或物种中缺乏(参见1-9项)。这些等位基因的渐渗对于生产性状可以具有重大价值。例如，来自肉牛品种的Polled等位基因(1项)产生没有角的动物，而牛奶场品种没有此等位基因，因此具有角，并且需要去角作为生产实践。从肉牛品种到有角(牛奶场)品种的等位基因渐渗会产生无角乳牛，其对于生产和动物福利两者具有价值。其它例子涉及可以提高或增强农业产品，诸如肉(4-6项)和牛乳(7-8项)的特征的等位基因。第9项可用于疾病抗性。

已经注意育种许多商业和通常使用的动物品种以建立期望的性状，但是在该育种的过程中已经积累了降低其生殖成功的遗传误差，这是由于能育性损失或者通过增加流产。一些基因的有害等位基因存在于动物群体中。如本文中别处解释，发明技术提供了仅在靶动物中的意图位置处改变等位基因，没有源自遗传工具或减数分裂重组的其它修饰。因此，第一次有可能清除在家畜和动物品种中已经积累的遗传误差，而不破坏动物的基因组，因此不破坏性状或引起不意图的后果。可以使用一些基因的等位基因来控制动物能育性以遗传控制育种原种(2-3项)。术语品种是一项技术术语，指经由选择和育种已经达到彼此类型并且将那些性状一致传给其后代的家畜。

可以生成许多有用的动物模型。某些等位基因是有用的，参见等位渐渗表项10-39。在动物中建立了这些中的一些。已知基因的其它等位基因引起人疾病，因此将这些等位基因渐渗入家畜、实验室动物、或可用于创建人疾病的生物医学模型的其它动物。

本发明的实施方案包括生成经遗传修饰的动物的方法，所述方法包括将胚胎或细胞暴露于编码TALEN的mRNA，其中TALEN特异性结合胚胎或细胞中的靶染色体位点，在替代母体中克隆细胞或者在代替母体中植入胚胎，代替母体由此孕育在没有报告基因的情况下且仅在TALEN靶定染色体位点处遗传修饰的动物，其中等位基因是下组的成员：(a)角无角(polled)基因座，(b)能育性缺陷隐性基因，例如CWC15和/或ApaF1，(c)用于增强家畜性状的基因，例如肉产量(GDF8、IGF2、SOCS2或其组合)和/或乳产量(DGAT1和/或ABCG2)，(d)对非洲猪热病抗性的基因(P65/RELA)，(e)用于改变动物大小的基因(PLAG1，GHRHR)，(f)潜在肿瘤生长的基因(例如TP53、APC、PTEN、RB1、Smad4、BUB1B、BRCA1、BRCA2、ST14或其组合)，(g)用于癌症的动物模型的人癌基因(例如AKT1、EGF、EGFR、KRAS、PDGFRA/B或其组合)，(h)高胆固醇血症(hypercholesterolemia)的动物模型中的基因(以诱导动脉粥样硬化、中风、和阿尔茨海默氏病模型)，例如LDLR、ApoE、ApoB或其组合，(i)炎性肠病，例如NOD2，(j)脊柱裂，例如VANGL1和/或VANGL2，(k)肺性高血压(pulmonary hypertension)，例如miR-145，(l)用于心脏缺陷的基因，例如BMP10、SOS1、PTPN11、Nrg1、Kir6.2、GATA4、Hand2或其组合和(l)乳糜泻基因，例如HLA-DQA1。

等位渐渗表

在没有任何报告物的情况下经遗传修饰的动物；某些TALEN技术；等位渐渗

本发明的某些实施方案涉及在不使用报告物和/或选择标志物的情况下修饰细胞或胚胎的方法。一般地，观察到TALEN和CRISPR/Cas9修饰在几天的时间范围里是不稳定的。因而，可以使用用于使变化稳定化的本文中描述的方法以及US 2013/0117870中描述的其它方法：例如直接mRNA导入和/或使用ssDNA模板。术语直接导入(例如直接mRNA导入)指导入mRNA材料。比较而言，依靠编码mRNA的载体的导入称作间接导入。直接导入的许多方法是已知的，例如电穿孔、转染、脂转染、脂质体、核转染(nucleofection)、生物射弹颗粒、纳米颗粒、脂质转染、电融合、和直接注射。

可以从经修饰的细胞或胚胎立即创建建立者动物，而不需要最初创建经修饰的动物，随后将所述经修饰的动物育种以创建新转基因品系的基础。术语建立者或建立者动物用于指从修饰的克隆细胞或经处理/注射的胚胎直接形成的第一代(“F0”)转基因动物。本文中报告的方法提供了创建仅在染色体靶位点处遗传修饰的建立者，并且没有育种和/或近交的中间步骤。此外，实施方案包括在修饰方面纯合的建立者。可以在全然不将细胞和/或胚胎暴露于报告基因(和/或选择标志物基因)的情况下制备建立者。

生成经遗传修饰的动物的方法包括将TALEN和/或载体导入培养的细胞(例如原代家畜细胞)中。TALEN针对特定的染色体位点，并且引起该位点处的遗传变化。也可以将HDR模板导入细胞中，例如作为双链载体、单链DNA、或直接作为ss核苷酸。随后，培养培养的细胞以形成克隆细胞的集落。通过PCR测试和/或测序集落，或者以其它方式测定遗传修饰，优选在没有报告基因的情况下和/或在没有选择标志物的情况下。从在意图位点处遗传修饰并且在克隆中使用的集落采集细胞。例如，使用10至50,000个细胞来生成10至50,000个胚胎，将胚胎植入代替物中，例如在每个代替物1-500个胚胎的组中；技术人员会立即领会涵盖明确叙述的范围内的所有范围和数值。实施方案包括在没有报告基因的情况下将细胞暴露于TALEN，创建克隆细胞的集落，并且测试集落成员的子集以鉴定在染色体靶位点处掺入修饰的集落。

经遗传修饰的动物

可以使用本领域中已知的各种技术来将核酸构建体导入非人动物中以生成建立者动物，其中将核酸构建体整合到基因组中。此类技术包括但不限于前核(pronuclear)显微注射(美国专利No.4,873,191)、逆转录病毒介导的到精子的基因转移、对胚胎干细胞的基因靶向、胚胎的电穿孔、精子介导的基因转移(Lavitrano et al.,(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:14230-14235；Lavitrano et al.,(2006)Reprod.Fert.Develop.,18:19-23)、和体细胞，诸如卵丘或乳腺细胞、或成年、胎儿或胚胎干细胞的体外转化，接着进行核移植。前核显微注射、精子介导的基因转移、和体细胞核转移以及胞质注射、原生殖细胞移植、和胚泡嵌合体生成是特别有用的技术，由此在胚胎中增殖生殖细胞。

通常，在前核显微注射中，将核酸构建体导入受精卵中；使用1或2个细胞受精卵作为含有精子头的遗传材料的前核，并且卵在原生质内可见。可以在体外或在体内(即从供体动物的输卵管中手术取出)获得前核分期的受精卵，并且可以生成体外受精卵。例如，在猪中，可以在Minitube5孔受精皿中的500μl Minitube PORCPRO IVF MEDIUM SYSTEM(Minitube,Verona,WI)中使成熟卵母细胞受精。在准备体外受精(IVF)中，可以清洗新鲜收集的或冷冻的公猪精液，并且在PORCPRO IVF培养基中重悬到4x 10⁵个精子。可以通过计算机辅助精液分析(SPERMVISION,Minitube,Verona,WI)分析精子浓度。可以在10μl体积中以约40个活动精子/卵母细胞的终浓度(取决于公猪)进行最终体外授精。于38.7℃在5.0％CO₂气氛中温育所有受精的卵母细胞6小时。授精后6小时，可以在NCSU-23中清洗假定的合子两次，并且移到0.5mL相同培养基。此系统可以常规地在大多数公猪间以10-30％多精授精率生成20-30％胚泡。

在体细胞核转移中，可以将经遗传修饰的细胞或卵裂球，例如胚胎卵裂球、胎儿成纤维细胞、成年耳成纤维细胞或颗粒细胞导入去核卵母细胞中以建立组合细胞。在一些惯例中，停滞于减数分裂-2的卵母细胞称作“卵”。在生成胚胎(例如通过融合和活化卵母细胞)后，在活化后约20至24小时将胚胎转移到接受雌性的输卵管中。可以使用标准的育种技术来创建动物，其在来自初始杂合建立者动物的靶核酸方面是纯合的。

载体和核酸

可以将多种核酸导入细胞中。如本文中使用的，术语核酸包括DNA、RNA、和核酸类似物、以及双链或单链(即有义或反义单链)的核酸。可以在碱基模块、糖模块或磷酸主链处修饰核酸类似物以改善例如核酸的稳定性、杂交或溶解度。可以修饰脱氧核糖磷酸主链以生成吗啉代核酸。另外，可以用例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯主链、氨基磷酸酯(phosphoroamidite)或烷基磷酸三酯(alkyl phosphotriester)主链替换脱氧磷酸主链。可以将核酸序列与调节区，诸如启动子可操作连接以进行表达。如本文中使用的，可操作连接指以下述方式相对于核酸序列放置调节区，使得容许或促进靶核酸的转录。可以将任何类型的启动子与靶核酸序列可操作连接。启动子的例子包括但不限于组织特异性启动子、组成性启动子、和对特定刺激物响应或不响应的启动子。

可以使用SssI CpG甲基化酶(New England Biolabs,Ipswich,MA)甲基化核酸构建体。一般地，可以于37℃将核酸构建体与缓冲液中的S-腺苷甲硫氨酸和SssI CpG-甲基化酶一起温育。可以通过于37℃将构建体与1个单位的HinP1I内切核酸酶一起温育1小时，并且通过琼脂糖凝胶电泳测定来确认超甲基化。

可以使用多种技术将核酸构建体导入任何类型的胚胎、胎儿、或成年偶蹄动物细胞，包括例如生殖细胞，诸如卵母细胞或卵、祖细胞、成年或胚胎干细胞、原生殖细胞、肾细胞，诸如PK-15细胞，胰岛素细胞、beta细胞、肾细胞、或成纤维细胞，诸如皮肤成纤维细胞。技术的非限制性例子包括使用转座子系统、可以感染细胞的重组病毒、或脂质体或其它病毒方法，诸如电穿孔、显微注射、或磷酸钙沉淀，其能够将核酸投递到细胞。在转座子系统中，核酸构建体的转录单元(即与靶核酸序列可操作连接的调节区)侧翼有转座子的反向重复。已经开发出几种转座子系统，包括例如Sleeping Beauty(参见美国专利No.6,613,752和美国公开文本No.2005/0003542)；Frog Prince(Miskey et al.,(2003)Nucleic AcidsRes.,31:6873)；Tol2(Kawakami(2007)Genome Biology,8(Suppl.1):S7；Minos(Pavlopoulos et al.,(2007)Genome Biology,8(Suppl.1):S2)；Hsmar1(Miskey et al.,(2007))Mol.Cell Biol.,27:4589)；和Passport以将核酸导入细胞(包括小鼠、人和猪细胞)中。Sleeping Beauty和Passport转座子是特别有用的。转座子可以作为蛋白质投递，与靶核酸在相同核酸构建体上编码，可以在不同核酸构建体上引入，或者作为mRNA(例如体外转录并且加帽的mRNA)提供。

可以将核酸引入载体中。载体是一个广泛的术语，其包括设计为从载体移动到靶DNA中的任何特定DNA区段。载体可以称为表达载体、或载体系统，其是引入对基因组或其它靶定DNA序列的DNA插入需要的组分组，诸如附加体、质粒、或甚至病毒/噬菌体DNA区段。用于在动物中基因投递的载体系统诸如病毒载体(例如逆转录病毒、腺伴随病毒和整合型噬菌体病毒)和非病毒载体(例如转座子)具有两种基本组分：1)由DNA(或RNA，其逆转录成cDNA)构成的载体和2)转座酶、重组酶、或其它整合酶，其识别载体和DNA靶序列两者，并且将载体插入靶DNA序列中。载体最经常含有一种或多种表达盒，其包含一种或多种表达控制序列，其中表达控制序列是分别控制并调节另一DNA序列或mRNA转录和/或翻译的DNA序列。

许多不同类型的载体是已知的。例如，质粒和病毒载体(例如逆转录病毒载体)是已知的。哺乳动物表达质粒通常具有复制起点、合适的启动子和任选的增强子，而且还有任何必需的核糖体结合位点、多聚腺苷酸化位点、剪接供体和接受位点、转录终止序列、和5’侧翼非转录序列。载体的例子包括：质粒(其也可以是另一类载体的载体)、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、慢病毒(例如HIV-1、SIV或FIV)、逆转录病毒(例如ASV、ALV或MoMLV)和转座子(例如Sleeping Beauty、P-元件、Tol-2、Frog Prince、piggyBac)。

如本文中使用的，术语核酸指RNA和DNA两者，包括例如cDNA、基因组DNA、合成(例如化学合成)DNA、及天然存在的和经化学修饰的核酸，例如合成碱基或备选主链。核酸分子可以是双链或单链(即有义或反义单链)。术语转基因在本文中广泛使用，并且指经遗传修饰的生物体或经遗传工程化改造的生物体，其遗传材料已经使用遗传工程技术改变。如此，敲除偶蹄动物是转基因的，不管外源基因或核酸在动物或其后代中表达与否。

根据容许缩写“T”代表“T”或代表“U”的常规实践，意图本文中列出的核酸序列代表DNA和RNA序列两者，对于DNA或RNA而言情况可以如此。多核苷酸是至少3个核苷酸亚单位的核酸分子。多核苷酸类似物或多核酸是经化学修饰的多核苷酸或多核酸。在一些实施方案中，可以通过用备选官能团替换多核苷酸的糖-磷酸主链的部分生成多核苷酸类似物。经吗啉代修饰的多核苷酸(本文中称为“吗啉代类”)是多核苷酸类似物，其中碱基通过吗啉代-二氨基磷酸酯(morpholino-phosphorodiamidate)主链连接(参见例如美国专利No.5,142,047和5,185,444)。在吗啉代类外，多核苷酸类似物的其它例子包括碱基通过聚乙烯主链连接的类似物、碱基通过由假肽2-氨基乙基-甘氨酸基团形成的酰胺键连接的肽核酸(PNA)、核苷亚单位通过膦酸甲酯(methylphosphonate)基团连接的类似物、连接核苷亚单位的磷酸残基用氨基磷酸酯基团替换的类似物、和硫代磷酸化的DNA、含有具有2’O-甲基基团的糖模块的类似物)。可以经由公知且常规使用的固相合成技术生成本发明的多核苷酸。或者，可以使用其它适合于此类合成的方法(例如常见的分子克隆和化学核酸合成技术)。也可以使用类似的技术来制备多核苷酸类似物，诸如吗啉代类或硫代磷酸酯衍生物。另外，可以商业获得多核苷酸和多核苷酸类似物。对于寡核苷酸，药学可接受组合物的例子是盐，其包括例如(a)与阳离子诸如钠、钾、铵等形成的盐；(b)与无机酸，例如氢氯酸、氢溴酸形成的酸加成盐，(c)与有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸形成的盐；和(d)自元素阴离子，例如氯、溴和碘形成的盐。

序列对比是排列DNA、RNA或蛋白质的序列以鉴定相似性区域的方式。核苷酸或氨基酸残基的比对序列通常以矩阵内的行代表，在残基间插入缺口，从而在连续的列中比对相同或相似的字母。

实施例

实施例1：TALEN设计和生成。

使用在线工具“TAL EFFECTOR NUCLEOTIDE TARGETER”鉴定候选TALEN靶DNA序列和RVD序列。然后，通过遵循Golden Gate Assembly方案，使用pCGOLDYTALEN(Addgene ID38143)和RCIscript-GOLDYTALEN(Addgene ID 38143)作为最终目的载体(Carlson 2012)构建用于TALEN DNA转染或体外TALEN mRNA转录的质粒。通过使用

HIPUREPLASMID MIDIPREP试剂盒(Life Technologies)制备最终的pC-GoldyTALEN载体，并且在使用前测序。通过SacI线性化使用QIAPREP SPIN MINIPREP试剂盒(Qiagen)制备的装配的RCIscript载体以用作模板，使用mMESSAGE

T3试剂盒(Ambion)进行体外TALEN mRNA转录，如先前在别处指示的。自RCIScript-GOLDYTALEN载体合成经修饰的mRNA，如先前描述(Carlson 2012)，替代由3’-0-Mem7G(5’)ppp(5’)G RNA帽类似物(New EnglandBiolabs)、5-甲基胞苷三磷酸假尿苷三磷酸(TriLink Biotechnologies,San Diego,CA)和腺苷三磷酸鸟苷三磷酸组成的核糖核苷酸混合物。最终核苷酸反应浓度是对于帽类似物的6mM、对于鸟苷三磷酸的1.5mM和对于其它核苷酸的7.5mM。将所得的mRNA进行DNA酶处理，之后使用MEGACLEAR REACTION CLEANUP试剂盒(Applied Biosciences)纯化。

实施例2：CRISPR/Cas9设计和生成。

将基因特异性gRNA序列根据其方法克隆入Church lab gRNA载体(Addgene ID:41824)中。通过共转染hCas9质粒(Addgene ID:41815)或自RCIScript-hCas9合成的mRNA提供Cas9核酸酶。通过将来自hCas9质粒的XbaI-AgeI片段(涵盖hCas9cDNA)亚克隆入RCIScript质粒中构建此RCIScript-hCas9。如上文进行mRNA的合成，只是使用KpnI进行线性化。

实施例3：供体修复模板制备。

A)BB-HDR(1,623bp)质粒。从Belgian Blue基因组DNA将涵盖Belgian Blue等位基因的1,695bp片段PCR扩增(btGDF8BB 5-1:5’-CAAAGTTGGTGACGTGACAGAGGTC(SEQ ID NO:88)；btGDF8BB 3-1:5’-GTGTGCCATCCCTACTTTGTGGAA(SEQ ID NO:89))，并且TOPO克隆入PCR2.1载体(Life Technologies)中。使用此质粒作为阳性对照模板，用于分析性引物组和用于衍生1,623bp BB-HDR模板，其通过用下述引物(BB del HR 1623 5-1:5’-GATGTATTCCTCAGACTTTTCC(SEQ ID NO:90)；BB del HR 1623 3-1:5’-GTGGAATCTCATCTTACCAA,SEQ ID NO:91)进行PCR得到，并且进行TOPO克隆，如前文。在使用前对每个质粒进行序列确认。使用Fast-Ion MIDI PLASMID ENDO-FREE试剂盒(IBIScientific).rAAV packaging制备转染级质粒。将BB-HDR克隆入pAAV-MCS中，并使用ADENO-ASSOCIATED VIRUS HELPER-FREE系统(Agilent)包装。简言之，用各5μg：pAAV-Helper、pAAV-RC和AAV-BB-HDR质粒转染10cm皿AAV-293细胞。转染后2天，通过刮下将细胞从板移到1ml生长培养基中。通过3个冷冻-融化循环释放病毒颗粒，之后在微量离心机中以最大速度离心5分钟。吸出上清液，并且直接用于感染靶细胞。

B)Polled 1592模板。从Angus基因组DNA将涵盖383POLLED等位基因的1,784bp片段进行PCR扩增(F1:5’-GGGCAAGTTGCTCAGCTGTTTTTG(SEQ ID NO:92)；R1-5’-TCCGCATGGTTTAGCAGGATTCA,SEQ ID NO:93)，并且TOPO克隆到PCR 2.1载体(LifeTechnologies)中。使用此质粒作为阳性对照模板，用于分析性引物组，以及用于衍生1,592bp HDR模板，其通过用下述引物(1594F:5’-ATCGAACCTGGGTCTTCTGCATTG SEQ ID NO:94；R1:5’-TCCGCATGGTTTAGCAGGATTCA,SEQ ID NO:95)进行PCR得到，并且进行TOPO克隆，如前文。在使用前对每个质粒进行序列确认。使用Fast-Ion MIDI Plasmid Endo-Free试剂盒(IBI Scientific)制备转染级质粒，并且与2μg HP1.3TALEN mRNA一起转染5μg或10μg。寡核苷酸模板。所有寡核苷酸模板由Integrated DNA Technologies合成，通过标准脱盐纯化100nmole合成，并且在TE中重悬到400μM。

实施例4：组织培养和转染。

于37或30℃(如指示)于5％CO₂在补充有10％胎牛血清、100I.U./ml青霉素和链霉素和2mM L-谷氨酰胺的DMEM中维持猪或牛成纤维细胞。对于转染，使用Neon转染系统(LifeTechnologies)经由转染投递所有TALEN和HDR模板，除非另有叙述。简言之，将达到100％汇合的低传代Ossabaw、Landrace、Wagyu或Holstein成纤维细胞以1:2分开，并且次日在70-80％汇合时收获。每次转染由与质粒DNA或mRNA和寡聚物混合的缓冲液“R”中重悬的500,000-600,000个细胞构成，并且使用100μl尖端通过下述参数电穿孔：输入电压；1800V；脉冲宽度；20ms；和脉冲数目；1。通常，每次转染中包含2-4μg TALEN表达质粒或1-2μg TALENmRNA和2-3μM对感兴趣基因特异性的寡聚物。图注中标示了与那些量的偏差。在转染后，将细胞以60:40分到6孔皿的两个不同孔中，分别于30或37℃培养3天。在3天后，扩充细胞群体，并且于37℃，直至至少第10天以评估编辑物(edits)的稳定性。

实施例5：细胞克隆的稀释分离。

转染后3天，将50至250个细胞接种到10cm皿上，并且培养到个体集落达到直径约5mm。在此点时，添加在PBS中以1:5(vol/vol)稀释的6ml TrypLE(Life Technologies)，并且吸出集落，转移到24孔皿孔的孔中，并且在相同的420条件下培养。收集达到汇合的集落，并且分开以进行冷冻保存和基因型分型。样品制备：从6孔皿的孔收集第3天和第10天的经转染的细胞群体，并且在50μl 1X PCR相容性裂解缓冲液中重悬10-30％：10mM Tris-Cl pH8.0，2mM EDTA，0.45％Tryton X-100(vol/vol)，0.45％新鲜补充有200μg/ml蛋白酶K的Tween-20(vol/vol)。使用下述程序在热循环仪中处理裂解物：55℃达60分钟，95℃达15分钟。使用20-30μl裂解缓冲液如上文处理来自稀释克隆的集落样品。

实施例6：Wagyu成纤维细胞中的质粒和rAAV HDR。

将低传代Wagyu成纤维细胞培养到70-90％汇合，并且通过NUCLEOFECTION(Lonza)用2μg每种TALEN表达质粒(btGDF83.1L+NR,)以及750ng SLEEPING BEAUTY转座子组分转染，如先前描述，Carlson 2012。对于使用质粒HDR模板的条件，转染中还包含2μg BB-HDR质粒。将经转染的细胞在6孔板的2个孔间分开以于30或37℃培养。对于使用rAAV HDR模板的条件，在转染后2小时将150μl病毒裂解物添加到每孔。温育3天后，通过胰蛋白酶处理收获细胞，其中一部分被裂解以在第3天时分析HDR，并且将剩余部分铺板以进行集落分离，如先前所述，Carlson 2012。

实施例7：突变检测和RFLP分析。

使用PLATINUM TAQ DNA POLYMERASE HIFI(Life Technologies)用1μl细胞裂解物根据制造商的推荐进行在意图位点侧翼的PCR。用SURVEYOR MUTATION DETECTION试剂盒(Transgenomic)根据制造商的推荐使用10ul PCR产物分析群体中的突变频率，如上文描述。使用指定的限制酶对10μl上述PCR反应进行RFLP分析。在10％TBE聚丙烯酰胺凝胶上解析SURVEYOR和RFLP反应，并且通过溴化乙啶染色显现。使用ImageJ进行条带的密度测定测量；并且计算SURVEYOR反应的突变率，如记载于Guschin et al.,201049。经由用RFLP片段的总和强度除以亲本条带+RFLP片段的总和强度计算百分比HDR。为了分析mloxP插入，在10％聚丙烯酰胺凝胶上解析跨越插入位点的小PCR产物，并且可以通过大小区分插入物对野生型等位基因，并且量化。类似处理集落的RFLP分析，只是通过1X MYTAQ RED Mix(Bioline)扩增PCR产物，并且在2.5％琼脂糖凝胶上解析。为了对克隆分析仅GDF8G938A(寡聚物缺乏新的RFLP)的渐渗，最初通过三引物测定法筛选集落，所述三引物测定法可以区分杂合和纯合渐渗。简言之，通过PCR使用1X MYTAQ RED MIX(Bioline)使用下述引物和程序分析来自猪或牛集落的裂解物。牛GDF8(外部F1:5’-CCTTGAGGTAGGAGAGTGTTTTGGG，SEQ IDNO:96，外部R1:5’-TTCACCAGAAGACAAGGAGAATTGC，SEQ ID NO:97，内部F1:5’-TAAGGCCAATTACTGCTCTGGAGACTA，SEQ ID NO:98；和35个循环的(95℃，20s；62℃，20s；72℃，60s)。猪GDF8：外部F1:5’-CCTTTTTAGAAGTCAAGGTAACAGACAC,SEQ ID NO:99，外部R1：5’-TTGATTGGAGACATCTTTGTGGGAG，SEQ ID NO:100内部F1：5’-TAAGGCCAATTACTGCTCTGGAGATTA，SEQ ID NO:101；和35个循环的(95℃，20s；58℃，20s；72℃，60s)。将来自候选物的扩增子直接测序和/或TOPO克隆(Life Technologies)，并且通过Sanger测序来测序。为了检测用BB-HDR模板的TALEN介导的HDR，将1μl或1μl 1:10稀释的PCR-裂解物(1,000个细胞/ul)添加到具有PCR引物bt GDF8BB 5-1(引物“c”)和引物“c”(BB-Detect 3-1-5’-GCATCGAGATTCTGTCACAATCAA,SEQ ID NO:102)的PCR反应，并且使用1X MYTAQ RED MIX(Bioline)进行PCR达40个循环(9459 5℃，20s；66℃，20s；72℃，60s)。为了确认通过上述PCR鉴定的集落中的HDR，用引物bt GDF8BB 5-1和bt GDF8BB 3-1进行整个基因座的扩增，接着进行TOPO克隆(Life Technologies)和测序。

实施例8

通过使用F1引物(参见上文)和“P”引物(5’-ACGTACTCTTCATTTCACAGCCTAC,SEQ IDNO:103)使用1X MyTaq Red mix(Bioline)进行PCR达38个循环(95℃，25s；62℃，25s；72℃，60s)实施POLLED渐渗的检测。使用(F2:5’-GTCTGGGGTGAGATAGTTTTCTTGG，SEQ ID NO:104；R2-5’-GGCAGAGATGTTGGTCTTGGGTGT，SEQ ID NO:105)实施第二PCR测定法。通过使用侧翼F1和R1引物的PCR，接着TOPO克隆和测序分析通过这两种测试的候选物。如先前对绵羊所述，实施FecB渐渗的检测。通过AVAII RFLP测定法检测Callipyge渐渗。参见图6中的结果。

实施例9：扩增子测序和分析。

自经转染的群体分离DNA，并且将100-250ng添加到按制造商的推荐装配的50μlPLATINUM TAQ DNA POLYMERASE HIGH FIDELITY(Life Technologies)。对每份样品分配具有独特条形码以实现多重测序的引物组。在2.5％琼脂糖凝胶上解析PCR产物的部分以确认大小，之后使用MINELUTE PCR PURIFICATION Kit(Qiagen)进行PCR清洁。量化样品，并且将它们合并成单一样品以进行测序。对单一组合样品掺入25％PhiX(用于序列多样性)，并且在Illumina MISEQ测序仪上测序，产生150碱基对的配对末端读出。使用FASTQC读出对评估读出质量，重叠末端使用来自EA-UTILS包的FASTQ-JOIN连接。使用定制PERL脚本来使连接的读出多路解编(demultiplex)，并且计数插入物类型。在多路解编步骤中需要与正向和反向引物的精确匹配。通过RFLP测定法和测序对克隆动物测定基因型。在此例子和其它例子中，在与Minitube of America的合同下克隆猪。

实施例10：评估作为TALEN来源的经转染的mRNA。

参考图7，将p65_11.1TALEN导入猪成纤维细胞中，其由未修饰的mRNA、经修饰的mRNA(mod mRNA)或质粒DNA(pDNA)编码。通过核转染(Lonza)将两个数量的每种TALEN制备物转染到细胞中，于30℃或37℃培养3天，之后分析indel。对于于30℃温育的所有mRNA转染，百分比NHEJ是相似的，而可以在于37℃温育的经转染的细胞观察到剂量应答。值得注意地，于30℃温育的所有组中的mRNA转染性能显著好于在相同条件下以质粒DNA转染的TALEN。在此测试中经修饰的和未修饰的mRNA之间具有较少的差异。P65_11.1TALEN：

CTCCTCCATTGCGGACATGGACTTCTCAGCCCTTCTGAGTCAGATC(SEQ ID NO:106)，下划线标示TALEN结合位点。

实施例11：用寡核苷酸模板的TALEN诱导的HDR的动力学。

参考图8A，TALEN的mRNA来源刺激使用寡聚物供体的有效且一致的HDR。每幅图显示使用寡聚物供体模板和作为质粒DNA或mRNA投递的TALEN靶向成纤维细胞中的特定基因座(例如ssIL2RG；“ss”代表野猪(Sus scrofa)，并且“bt”代表牛(Bos taurus))的结果。(插图)寡聚物模板的图，其中有阴影的框代表TALEN结合位点，并且间隔物以白色显示。每个寡聚物含有4-bp插入(ins4)或缺失(del4)，其引入新的限制性位点以进行RFLP分析。推定的BM用指定的核苷酸替换保守-1胸苷(相对于TALEN结合位点)。用TALEN编码质粒(3μg)或mRNA(1μg)以及3μM其关联寡聚物同源模板转染成纤维细胞。然后，于37℃或30℃温育细胞3d，之后于37℃扩充到第10天。通过在第3天时的Surveyor测定法(第3天Surveyor)测量TALEN活性，并且在第3天和第10天通过RFLP分析(第3天％HDR和第10天％HDR)测量HDR。每个柱形显示来自三个重复的平均值和SEM。

参考图8B，用TALEN编码mRNA或质粒DNA和靶向LDLR或APC基因的具有4个碱基对插入的寡聚物转染猪成纤维细胞。然后，将来自每次转染的细胞均匀分开到7个24孔板孔中，于30℃培养，并且在指定的时间点时通过RFLP测定。小图a)在指定的时间点时对细胞群体的RFLP分析。小图b)通过密度计量术量化来自小图a的结果，并且平均值绘制为具有SEM(n＝3)的时间函数。HDR信号第一次在转染后12小时出现，并且随时间积累。LDLR处的HDR的开始不依赖于TALEN来源，但是24小时和72小时之间的HDR比率与质粒DNA相比在使用mRNA时高得多。

实施例12：突变类型对HDR频率的影响。

参考图9，小图a)用于靶向ssLDLR的5种寡聚物的序列。寡聚物在长度和突变类型上变化。TALEN结合位点以框示文本标示，并且新的BamHI位点有下划线。包含BM和插入的SNP是画圈的。小图b)用LDLR2.1TALEN mRNA(1μg)和寡聚物(2μM最终)转染细胞。通过RFLP分析测定第3天时的HDR，并且绘制平均值及SEM(n＝3)。结果提示了插入等位基因比SNP或缺失更有效掺入，但是46-90bp的同源性长度对HDR效率具有可忽略的影响。c)用btRosa1.2TALEN mRNA和41_mloxP或60_loxP寡聚物(2μM最终)转染牛细胞。数字41和60指同源碱基的数目。每种寡聚物在间隔物中间含有34bp loxP位点，经修饰的(mloxP)或野生型(loxP)形式。第13天和第15天的密度计量术显示了loxP位点的插入既是有效的又是稳定的。

实施例13：CRISPR/Cas9介导的HDR以将p65S531P突变从疣猪(warthog)渐渗到常规猪中。

参考图10，小图a)S531P错义突变由猪p65的核苷酸1591处的T-C转换引起。S-PHDR模板包括成因性TC转换突变(大号文本)，其引入新的XmaI位点，并且实现RFLP筛选。显示了2种gRNA序列(P65_G1S和P65_G2A)以及先前实验中使用的p65.8TALEN。小图b)用S-P-HDR寡聚物(2μM)、2个数量的编码hCas9的质粒(0.5μg或2.0μg)；和5个数量的G2A转录质粒(0.05至1.0μg)转染Landrace成纤维细胞。将来自每次转染的细胞以60:40分开，分别于30和37℃培养3天，之后于37℃的延长培养，直至第10天。Surveyor测定法揭示了范围为16-30％的活性。小图c和d)第3天和第10天取样的细胞的RFLP分析。通过黑色箭标示191和118bp的预期切割产物。尽管双链断裂(DSB)与靶SNP的紧密接近，CRISPR/Cas9介导的HDR在S531P的渐渗方面的效率小于TALEN。还使用每种gRNA序列分析个体集落(数据未显示)。

参考图11，进行实验以比较猪APC处的TALEN和CRISPR/Cas9介导的HDR。小图a)相对于野生型APC序列显示了APC14.2TALEN和gRNA序列APC14.2G1a。下文，显示了HDR寡聚物，其投递4bp插入(橙色文本)，产生新的HindIII位点。用2μM寡聚物HDR模板、和1μg TALENmRNA、每种1μg的编码hCas9的质粒DNA和gRNA表达质粒；或1μg编码hCas9的mRNA和0.5μggRNA表达质粒转染猪成纤维细胞，然后分开，并且于30或37℃培养3天，之后于37℃扩充，直到第10天。小图b)显示RFLP和Surveyor测定法结果的图。如先前测定的，TALEN刺激的HDR于30℃是最有效的，而CRISPR/Cas9介导的HDR于37℃是最有效的。对于此基因座，TALEN在HDR刺激方面比CRISPR/Cas9系统更有效，尽管通过Surveyor测定法测量的DNA切割频率类似。与TALEN形成对比，在相对于质粒以mRNA投递hCas9时，具有很少的HDR差异。

实施例14：使用寡聚物供体的SNP渐渗。

参考图12，小图a)在猪LDLR和GDF8中评估阻断突变(BM)对维持HDR等位基因的影响。每种寡聚物设计为引入相同SNP/限制313位点加或减阻断突变。通过RFLP测定法在经转染的群体中量化HR，所述经转染的群体最初于30℃培养3天，并且进一步于37℃维持到第12天。显示了平均值和SEM(n＝3)。小图b)将肌肉抑制素C313Y渐渗入Wagyu成纤维细胞中。C313Y错义突变由牛肌肉抑制素的核苷酸938处的G-A转换(以大号文本标示)引起。HDR模板还包含T至C转换(画圈)以引入新的EcoRI位点以进行RFLP筛选。针对基因座设计两种左TALEN，靶向野生型等位基因(Wt)的btGDF83.6-G和靶向突变体等位基因(C313Y)的btGDF83.6-A；两者共享共同的右TALEN。如上文进行转染、培养和测量。btGDF83.6-G(n＝30)和btGDF83.6-A(n＝5)的平均值和SEM分别代表12和3个生物重复。使用两侧Student t检验比较组间的平均值；标示p值。

实施例15：SNP。

图13是显示对TALEN刺激的HDR等位基因的序列分析的结果的图。通过ILLUMINA测序对源自经TALEN mRNA和寡聚物转染的细胞群体的靶位点(200-250bp总共)侧翼的PCR扩增子测序。总读出计数范围为每份样品10,000 328至400,000。对于插入(小图a)和SNP等位基因(小图b)绘制了完美的、意图的HR读出对野生型读出的计数。下文指示靶基因座、时间点和在寡聚物中包括BM与否。小图c)分选来自btGDF8和p65的读出以掺入靶SNP，然后分类意图者(iSNP)对具有别的突变的那些(iSNP+Mut)，并且相对于读出总数绘图。

实施例16：对HDR等位基因的序列分析。

参考图14，对含有正确插入(小图a)或SNP等位基因(小图b)的测序读出分析BM的掺入。在每幅图下标示靶基因座、时间点和寡聚物中包含BM与否。一般地，5’BM被最频率掺入HDR转化段中，接着是两种BM的纳入，或仅3’BM。当相对于4bp插入等位基因，对LDLR的意图突变是SNP时，BM的分布稍微偏向两种BM的掺入。还有兴趣注意到，btGDF8的大多数意图读出已经掺入至少一个BM，但是很少具有仅3’BM。如此，虽然BM对维持培养中的意图SNP(iSNP)等位基因的频率没有显著影响，但是其相对于其他基因座的富集提示了它们可以已经提供某种保护免于TALEN再切割。c)通过突变类型进一步分类图13小图c的数据，并且比较。一些读出仅含有iSNP，其它读出具有伴随的indel(iSNP+indel)或伴随的非意图SNP(iSNP+uSNP)。当模板中不包含BM时，似乎有iSNP+indel频率的一些升高，并且大多数indel位于间隔物区域中，因此可能是已经转化的等位基因的再切割的结果。

实施例17：TALEN DNA结合位点中的多个SNP稳定化HDR等位基因。

参考图15，用TALEN DNA结合位点中的多个SNP稳定化EIF4GI基因。小图a)显示了野生型EIF4GI Wt-NL的部分。一个TALEN对设计为切割野生型EIF4GI以刺激同源重组。还与Wt序列联配的是用于将三种SNP(红色大号字母)引入基因组中的供体寡聚物DF-HDR的核心序列。第三种SNP创建用于RFLP分析的新的EagI限制位点。用EIF4GI14.1TALEN mRNA(2μg)和DF-HDR(2μM)转染猪成纤维细胞，然后于30℃培养3天，之后分析和集落增殖。小图b)转染后3天对群体的RFLP分析。通过实心三角形标示预期的产物大小344、177和167bp。小图c)在分离的细胞克隆上的RFLP测定法。使用第3天细胞经由稀释克隆得到单克隆集落。标示具有杂合(空心三角形)或纯合(实心三角形)HDR等位基因的集落的例子。

实施例18：用于维持SNP HDR等位基因的低温处理。

参考图16，用TALEN mRNA(1μg)和寡聚物(3μM)转染猪成纤维细胞。对于每个重复合并来自两个独立转染的细胞，并且均匀分配到6孔板的6孔中，并且于30℃培养。转染后第1-7天(减去第6天，沿着X轴的1D至7D)从这些群体收集样品以进行RFLP分析，并且将剩余的细胞转移到37℃。在第12天时再次收集用于每种条件的样品以进行RFLP分析。在初次收集时并且在第12天再一次显示了平均值HDR和SEM(n＝3)。

实施例19：用于SNP渐渗的有意RVD错配。

参考图17，小图a)TALEN对(caCLPG 1.1)设计为靶向caCLPG区。利用寡聚物驱动的HDR来引入期望的腺嘌呤至鸟嘌呤SNP(靶定的腺嘌呤是框示的)。期望的SNP容许通过AvaII限制位点的丧失确定基因型。每个TALEN单体在其相应的结合位置上方以阴影标示。N端和C端分别用N和C标示。b)测序对AvaII有抗性的单细胞衍生集落的每种等位基因(仅显示AvaII抗性等位基因)。含有我们的感兴趣SNP(框示)的所有等位基因还含有缺失(在AvaII抗性等位基因序列中用虚线标记)或插入(在WT序列中用虚线标记)。c)为了降低再结合以及随后再切割的可能性，将有意错配(斜体画圈文本)引入RVD序列中。在RVD前和/或后直接在RVD中放置错配，所述RVD会结合TALEN的右单体中的期望SNP(框示)。d)经由CelI测定法测量TALEN活性。对于1.1和1.1b，非同源末端连接的百分比(％NHEJ)是相等的(28％)，但是对于1.1a和1.1c，大于1.1(分别为30％和31％)。无RNA阴性对照没有显示TALEN活性(0％)。e)测序用caCLPG 1.1c生成的AvaII抗性单细胞衍生集落的两种等位基因。框示期望的SNP。集落37和78在期望的SNP方面是杂合的，并且没有显示额外的indel。集落142在期望的SNP方面是纯合的，并且在一个等位基因上含有4bp插入。

实施例20：SNP渐渗需要的错配。

参考图18，SNP渐渗需要错配。K323A周围的牛DGAT序列的示意图。灰色箭代表TALEN单体，其中它们结合DGAT序列。左臂由16个RVD组成，右臂由15个RVD组成，并且间隔物长16个碱基对。GC和ggagct(框示)是靶定的碱基对。DGAT寡聚物将GC转化为AA以创建期望的DGAT突变体。作为HDR的标志物，将框示的GGGAGC转化为AAGCTT，其创建新的HindIII限制位点。由于此变化在间隔物中，它不应影响TALEN结合，从而不干扰有意的错配结果。b)DGATTALEN RVD序列。btDGAT 14.2不含RVD中的有意错配。btDGAT 14.4、14.5和14.6各自含有左TALEN单体(画圈)的1、3或5任一位处的一个有意RVD错配。c)牛成纤维细胞，其用1ug talen和0.4nmoles寡聚物转染。转染后3天，裂解细胞，通过PCR扩增DGAT序列，用HindIII消化，并且在丙烯酰胺凝胶上运行。通过密度计量术(HR)测量HDR的百分比效率。d)对集落的序列分析产生初始的14.2TALEN。在12个集落中，在HindIII RFLP方面呈阳性的集落无一由于与位点重叠的indel而含有期望的突变。e)源自TALENs 14.5和14.6的集落产生正确的DGAT突变和HindIII限制位点。这两个TALEN对产生总共两个纯合(HH)和三个杂合(Hh)集落。TALEN14.4不产生具有正确DGAT突变的任何集落(数据未显示)。

实施例21：一体化(All-in-one)TALEN-HDR/Cre-RMCE.

图19描绘了TALEN-HDR/RMCE的过程。连同与寡聚物相容的TALEN、loxP寡聚物和Cre重组酶来源一起转染敲入(floxed)盒。为了使此过程起作用，TALEN必须切割靶基因座，接着用loxP寡聚物修复，之后是Cre介导的对修复位点的RMCE。柱形图显示了在转染中包含YFC-Cre对mCherry时通过此方法生成的嘌呤霉素抗性集落的数目。为了确认对SRY基因座的靶向，跨越预测的交接(如标示)进行PCR，产生370bp产物。仅当包含Cre时，此产物是明显的。对于此组实验，使用下述条件：用1ug SRY TALENs+0.3nMol SSCY_LoxP寡聚体+CLP-YFP-Cre(0.5ug)+敲入PTK(2ug)转染600,000个细胞。阴性对照具有0.5ug mCherry质粒代替CLP-YFP-Cre。SSCY_LoxP寡聚物：

TTTTATATACATTTTACACACATATATATGAAACATAACTTCGTATAGGAGACTTTATACGAAGTTATGGATCCAAGCTTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTGACAGTATTAATGGCCTGAACCTAGCCAGAACT(SEQ ID NO:80)

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在此通过提及将本文中列出的所有专利、专利申请、参考文献和出版物收入本文；在冲突的情况下，以本说明书为准。下文是本文中列出的本发明的实施方案的例子。

某些实施方案涉及用于靶向内切核酸酶使用的低温条件。例如；1.模板指导性修复以改变细胞中的染色体DNA的低温方法，其包括将靶向性核酸酶系统和核酸模板导入活细胞中，其中靶向性核酸酶系统和模板运行以将染色体DNA改变为与模板序列具有同一性，其中在低于生理学温度的低温培养温度将活细胞维持从导入时测量超过3天的时间段。2.1的方法，其中所述低温培养提高所述模板序列对所述染色体DNA的稳定掺入。3.1的方法，其中将所述培养温度保持在20至34℃的范围内。4.1的方法，其中所述时间点是超过3天。5.权利要求1的方法，其中所述时间点范围为超过3天至约2周。6.1的方法，其进一步包括对所述细胞测试所述模板序列。7.1的方法，其中靶向性核酸酶系统包含Cas9和成簇的规律间隔性短回文重复(CRISPR)或与核酸酶(TALEN)融合的多个TAL效应器重复序列。8.6的方法，其中所述核酸引导是ssDNA。9.1的方法，其中将核酸酶、核酸引导和核酸模板中的一种或多种以mRNA导入细胞中。10.1的方法，其中所述细胞选自下组：原代细胞、原代体细胞、卵、精子、合子、生殖细胞、干细胞、卵母细胞、精子和胚胎。11.1的方法，其中所述动物在所述模板序列上是纯合的。12.通过1的方法生成的细胞。

并且，例如1.模板指导性修复以改变细胞的染色体DNA的方法，其包括将靶向性核酸酶系统、核酸模板和用于抑制细胞生长的冷因子(cold-factor)导入活细胞中，其中所述靶向性核酸酶系统和所述模板运行以将所述染色体DNA改变为与所述模板序列具有同一性。2.1的方法，其中所述用于抑制细胞生长的冷因子包含冷诱导型RNA结合蛋白(CIRP)。参见Nishiyama et al.,J.Cell Biol.,(1997):137(4):899-908。3.1的方法，其中通过放置将所述细胞周期抑制剂导入包含所述细胞的培养物中。4.1的方法，其中以蛋白质、以RNA、以mRNA，或者经由编码细胞周期抑制剂的载体导入所述细胞周期抑制剂。5.4的方法，其中所述模板是HDR模板。6.1的方法，其中模板是ssDNA。7.1的方法，其中将核酸酶系统和核酸模板中的一种或多种以mRNA导入所述细胞中。8.1的方法，其中所述细胞选自下组：原代细胞、原代体细胞、合子、生殖细胞、干细胞和胚胎。9.一种根据1-8中任一项的方法制备的经遗传修饰的动物。10.一种通过1-9中任一项的方法生成的建立者动物。11.一种通过1-10中任一项的方法生成的细胞。

清楚明显的是，涵盖本文中列出的各种等位和遗传修饰。这些的实施方案包括例如1.一种非人动物，其包含提供升高的生殖力的可遗传外源等位基因和/或提供起源亲本依赖性肌肉肥大的可遗传外源等位基因。2.1的动物，其是山羊。3.1的动物，其选自下组：家畜、灵长类、猪、牛、马、绵羊、山羊、鸡、兔、鱼、犬、小鼠、猫、大鼠和实验室动物。4.1的动物，其没有荧光标志物、选择标志物和可表达标志物。5.1的动物，其中所述升高的生殖例等位基因是FecB；BMPR-IB。6.1的动物，其中所述肌肉肥大等位基因是Callipyge。7.1的动物，其中所述动物在所述外源等位基因方面是纯合的。

并且例如，1.一种非人动物，其包含APC的外源等位基因。2.1的动物，其中所述等位基因涉及癌性表型。3.1的动物，其中所述外源等位基因是人定位基因。4.1的动物，其是实验室动物模型。5.1的动物，其选自下组：猪、迷你猪、Ossabow猪、兔、犬、绵羊和山羊。6.1的动物，其是建立者。7.1的动物，其没有与外源等位基因的渐渗不同的染色体变化。8.生成1的动物的方法，其包括用靶向性核酸酶系统的外源等位基因的以HDR为模板的渐渗。9.8的方法，其中所述外源等位基因选择为与癌性表型有关的人等位基因。

并且例如，1.一种动物，其包含选自题目为“具有HDR等位基因的集落的回收频率”的表1的外源等位基因。2.一种方法，其包括将等位基因渐渗入动物中，所述等位基因选自所述表1上列出的组或如下。3.1的动物或2的方法，其中所述等位基因：是LDLR，例如用于胆固醇建模；是DAZL，例如用于不育性；是APC，例如用于癌症建模；是p53；是RAG2，例如免疫抑制的敲除；是IL-2，例如免疫抑制的敲除(不在表中)；是用于免疫抑制的RAG2和Il-2的双重敲除(不在表中)；是ROSA，例如用于安全港；是SRY，例如用于对Y染色体的修饰，用于性别选择；--是KISS OR KISSR，例如用于成熟或其阻止，例如敲除；--是GDF8，例如用于提高动物中的肌肉化；--是EIF4G，例如用于对口蹄疫(FMDV)的抗性；--是p65，用于对非洲猪热病的抗性；--是caFecB，用于孪生(twinning)，包括物种间渐渗；--是二脂酰甘油脂酰基转移酶(DGAT)敲除，用于升高的饮食益处；--是ATP结合盒亚家族G成员2(ABCG2)，用于升高的饮食益处；是多形性腺瘤(pleiomorphic adenoma)基因1(PLAG1)，用于影响青春期时的年龄、身高和体重；是Beta乳球蛋白，用于降低乳的变应原性，是类卵粘蛋白、卵清蛋白、卵转铁蛋白或溶菌酶，用于降低禽卵的变应原性。4.如指示的1或3的动物的用途。5.具有3的渐渗等位基因的猪、绵羊、山羊或牛。6.1-5中任一项的细胞或动物。7.6的细胞或动物，其是脊椎动物、家畜、灵长类、猪、牛、马、绵羊、山羊、鸡、兔、鱼、犬、小鼠、猫、大鼠或实验室动物。

并且例如，1.一种在细胞的染色体DNA中创建单核苷酸多态性(SNP)的方法，其包括将靶向性核酸酶系统和HDR模板导入细胞中，其中所述靶向性核酸酶系统包含用于特异性结合所述染色体DNA中的内源关联序列的DNA结合成员，其中所述靶向性核酸酶系统和所述HDR模板运行以将所述染色体DNA改变为与所述HDR模板序列具有同一性，其中所述HDR模板序列包含SNP。2.1的方法，其中所述HDR模板序列包含多个SNP。3.1或2的方法，其中所述HDR模板序列包含替换内源等位基因的外源等位基因，其中所述外源等位基因包含与所述内源等位基因的序列比对中的SNP。4.1-3中任一项的方法，其没有在所述外源等位基因外部的SNP。5.4的方法，其中所述HDR模板序列与所述外源等位基因中的除了一个或多个SNP外的染色体DNA相同。6.5的方法，其中仅有一个SNP。7.1-6中任一项的方法，其中所述HDR模板设计为降低所述DNA结合成员对所述HDR模板序列的特异性结合，并且所述HDR模板序列包含SNP，如与所述染色体DNA比对。

例如：一种来自第一品种的经遗传修饰的动物，其包含选自另一种物种或另一种品种的基因的等位基因；其中所述第一品种的动物没有除了所述等位基因外的遗传变化；生成如本文中列出的动物的方法。

例如：1.同源性指导修复(HDR)将外源等位基因渐渗入细胞的染色体DNA中的方法，其包括将靶向性内切核酸酶系统和包含外源等位基因的HDR模板导入细胞中，其中所述靶向性核酸酶系统包含用于特异性结合染色体DNA中的内源关联序列的DNA结合成员，其中所述靶向性核酸酶系统和所述HDR模板运行以将所述染色体DNA改变为与所述HDR模板序列具有同一性，从而将所述外源等位基因渐渗入所述染色体DNA中，替换内源等位基因，其中所述靶向内切核酸酶系统和/或HDR模板包含降低靶向内切核酸酶系统对DNA的特异性结合的特征。2.1的方法，其中所述降低特异性结合的特征包括相对于所述内源关联序列的所述DNA-结合成员序列中的错配和/或相对于所述HDR模板序列的所述DNA-结合成员序列中的错配。3.2的方法，其中所述靶向性内切核酸酶系统包含与核酸酶(TALEN)融合的多个TAL效应器重复序列，其中所述TALEN包含重复可变二残基(RVD)的序列，并且相对于内源关联序列，错配在RVD的序列中。4.2-3的方法，其中所述靶向性核酸酶系统包含Cas9核酸酶和引导RNA，其中相对于内源关联序列，错配在gRNA序列中。5.2-4的方法，其中所述靶向性内切核酸酶系统包含与核酸酶(TALEN)融合的多个TAL效应器重复序列，其中所述TALEN包含重复可变二残基(RVD)的序列，并且相对于HDR模板序列，错配在RVD的序列中。6.2-5的方法，其中所述靶向性核酸酶系统包含Cas9核酸酶和引导RNA，其中相对于HDR模板序列，所述错配在gRNA中。7.2-6的方法，其中所述外源等位基因是天然等位基因，并且HDR模板包含错配，其中错配创建不存在于自然界中的序列。8.2-7的方法，其中所述外源等位基因没有错配，并且包含由细胞表达的DNA。9.2-8的方法，其中所述外源等位基因包含错配，并且包含由细胞表达的DNA。10.2-9的方法，其包括选择DNA结合成员序列和内源关联序列，从而将染色体DNA改变为与HDR模板序列具有同一性，相对于改变的染色体DNA序列，在DNA-结合成员序列中创建错配。11.1-8的方法，其中所述外源等位基因是天然等位基因，并且HDR模板由天然等位基因和与染色体DNA序列具有同一性的DNA组成。12.1-8的方法，其中选择DNA-结合成员序列和内源关联序列进一步包括在所述内源关联序列中放置第二错配，所述第二错配在所述染色体DNA改变为与HDR模板具有同一性时不改变。13.2-11的方法，其包括选择DNA-结合成员序列和内源关联序列以相对于DNA结合序列在内源关联序列中放置错配，并且将染色体DNA改变为与HDR模板序列具有同一性不除去错配。14.2-13的方法，其中所述错配包含插入、缺失或取代。15.1-12的方法，其中所述插入、缺失或取代具有1至20个残基的长度。16.1-14的方法，其中所述插入、缺失或取代具有1至20个残疾的长度。17.2的方法，其中所述错配是一个SNP。18.2的方法，其包括多个错配。19.1-16的方法，其中所述靶向内切核酸酶系统包含一对TALEN，其用该对间的间隔物序列定位于染色体DNA，其中所述特征包括选择HDR模板以创建间隔物序列长度的变化以阻断TALEN对的DNA切割。20.17的方法，其中所述间隔物长度通过缺失来减少或者通过插入来增加。21.17的方法，其中所述间隔物长度增加或减少范围为1至60的残基数目。22.1-19中任一项的方法，其中所述细胞选自下组：原代细胞、原代体细胞、合子、生殖细胞、干细胞、卵母细胞、精子和胚胎。23.1-20中任一项的方法，其中所述HDR模板是ssDNA。24.1-21中任一项的方法，其中将所述核酸酶系统以mRNA导入所述细胞中。25.1-22中任一项的方法，其中所述靶向性核酸酶系统用结合蛋白特异性结合内源关联序列。26.1-23中任一项的方法，其中所述外源等位基因包含APC等位基因。27.1-24中任一项的方法，其没有报告物、荧光标志物、选择标志物、和可表达标志物。28.1-25中任一项的方法，其中所述细胞是家畜细胞。29.1-25中任一项的方法，其中所述细胞来自脊椎动物、家畜、灵长类、猪、牛、马、绵羊、山羊、鸡、兔、鱼、犬、小鼠、猫、大鼠和实验室动物。30.1-28中任一项的方法，其中所述动物在所述外源等位基因方面是纯合的。31.一种生成经遗传修饰的动物的方法，其包括克隆通过1-30中任一项的方法修饰的细胞。32.1-30中任一项的方法，其中所述动物是建立者。33.根据1-32中任一项的方法制备的经遗传修饰的动物。34.通过1-33中任一项的方法生成的建立者动物。35.通过1-30中任一项的方法生成的细胞。36.一种试剂盒，其包含1-34中任一项的HDR模板和靶向性核酸酶系统。37.1-35中任一项的用途，其包括制备细胞以在体外研究，或者制备细胞以用于生成动物。38.一种经遗传修饰的动物，所述动物属于在动物的染色体DNA中具有内源等位基因的品种，所述动物包含SNP处的变化，相对于存在于动物的另一种物种或另一种品种中的外源等位基因，所述SNP在内源等位基因中。类似地，2一种经遗传修饰的动物，所述动物属于在动物的染色体DNA中具有内源等位基因的品种，所述动物包含存在于动物的另一种物种或另一种品种中的外源等位基因，其中相对于内源等位基因，外源等位基因具有SNP处的变化。换言之，经修饰的动物具有SNP，从而它现在具有通常不存在于其品种中的等位基因，其中等位基因来自一些其它品种或物种。变化可以仅是所述SNP或可以有其它变化，其中SNP是反映期望等位基因必需的。SNP不是随机过程的结果，但是是意图的结果。39.38的动物，其包含多个SNP。40.38的动物，其包含相对于外源等位基因的动物染色体DNA中的其它变化。41.38-40中任一项的动物，其没有报告物。42.38-41中任一项的动物，其在一个或多个SNP方面是纯合的。43.38-42中任一项的动物，其来自脊椎动物、家畜、灵长类、猪、牛、马、绵羊、山羊、鸡、兔、鱼、犬、小鼠、猫、大鼠和实验室动物。44.在细胞的染色体DNA中创建着落垫的方法，其包括将靶向性核酸酶系统和HDR模板导入细胞中，其中所述靶向性核酸酶系统包含用于特异性结合染色体DNA中的内源关联序列的DNA结合成员，其中靶向性核酸酶系统和HDR模板运行以将染色体DNA改变为与HDR模板序列具有同一性，其中所述HDR模板序列包含着落垫。

表1：具有HDR等位基因的集落的回复频率

Claims

1.一种将外源等位基因渐渗入偶蹄动物原代细胞的染色体DNA中的同源性指导修复(HDR)的方法，其包括：

将靶向性内切核酸酶系统和包含所述外源等位基因的HDR模板导入所述偶蹄动物原代细胞中，所述靶向性核酸酶系统包含用于特异性结合所述染色体DNA中的内源关联序列的DNA结合成员，其中所述靶向性核酸酶系统和所述HDR模板运行以将所述染色体DNA改变为与所述HDR模板具有同一性以将所述外源等位基因渐渗入所述染色体DNA中代替内源等位基因，

其中所述靶向性内切核酸酶系统是RNA引导的内切核酸酶(RGEN)；

其中所述靶向性内切核酸酶系统和/或HDR模板包含降低该靶向性内切核酸酶系统对DNA的特异性结合的特征，所述特征包含相对于所述内源关联序列的所述DNA结合成员序列中的错配和/或相对于所述HDR模板序列的所述DNA结合成员序列中的错配。

2.权利要求1的方法，其中所述靶向性核酸酶系统是包含Cas9核酸酶和引导RNA的CRISPR，其中所述错配相对于所述内源关联序列在gRNA序列中。

3.权利要求1的方法，其中所述靶向性核酸酶系统是包含Cas9核酸酶和引导RNA的CRISPR，其中所述错配相对于所述HDR模板序列在所述gRNA中。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述细胞选自下组：体细胞、合子、生殖细胞、干细胞、卵母细胞、和精子。

5.权利要求1-3中任一项的方法，其中将所述核酸酶系统以mRNA导入所述细胞中。

6.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述细胞是家畜细胞。

7.权利要求6的方法，其中所述细胞是猪的、牛的、绵羊的、或山羊的。

8.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述细胞对于导入到细胞中的所述外源等位基因是纯合的。

9.权利要求1的方法，其中所述RGEN包含成簇的规律间隔性短回文重复(CRISPR)核酸酶和引导RNA。

10.权利要求1的方法，其中所述靶向性内切核酸酶系统包含具有Cas9核酸酶和引导RNA的CRISPR。

11.权利要求1的方法，其中所述导入到细胞中的等位基因是天然等位基因。

12.权利要求11的方法，其中所述HDR模板由所述天然等位基因和与染色体DNA序列具有同一性的DNA组成。

13.权利要求1的方法，其中所述HDR模板包含错配，所述错配创建不存于自然界中的序列。

14.权利要求1的方法，其中导入细胞中的所述等位基因增强选自由无角，肉特征，肉产量，乳特征，乳产量，动物大小和疾病抗性组成的组的性状。

15.制备动物的方法，其包括权利要求1-14中任一项所述的方法。

16.权利要求15的方法，其中所述原代细胞是体细胞，并且所述动物通过体细胞核转移从所述细胞制备。

17.权利要求15的方法，其中所述原代细胞是合子，并且通过将所述合子培养成胚泡并在替代母体动物中孕育所述胚泡来制备所述动物。