JP2019013252A - アンジオポエチン様3(ANGPTL3)iRNA組成物及びその使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2011年6月21日に出願された米国仮特許出願第61/499,620号明細書、及び2012年4月25日に出願された米国仮特許出願第61/638,288号明細書の優先権を主張するものであり、これらの仮特許出願のそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
本発明がより容易に理解され得るように、いくつかの用語がまず定義される。更に、変数の値又は値の範囲が記載されるときは常に、記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図されることに留意されたい。
ANGPTL3遺伝子の発現を阻害するiRNAが本明細書に記載される。一実施形態において、iRNA剤は、対象、例えば、哺乳動物(例えば、家族性高脂血症などの脂質代謝障害に罹患しているヒトなど)中の細胞などの細胞内でのANGPTL3遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(dsRNA)分子を含む。dsRNAは、ANGPTL3遺伝子の発現中に形成されるmRNAの少なくとも一部に相補的な、相補性の領域を有するアンチセンス鎖を含み、相補性の領域は、約30ヌクレオチド長以下(例えば、約30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、又は18ヌクレオチド長以下)である。ANGPTL3遺伝子を発現する細胞と接触すると、iRNAは、例えば、PCR又は分岐DNA(bDNA)法、あるいは、例えば、ウエスタンブロット法又はフローサイトメトリー技術を用いた免疫蛍光分析などによるタンパク質に基づいた方法によってアッセイした際に少なくとも約10%、ANGPTL3遺伝子(例えば、ヒト、霊長類、非霊長類、又は鳥類のANGPTL3遺伝子)の発現を阻害する。
一実施形態において、本発明のiRNAのRNA、例えば、dsRNAは、安定性又は他の有益な特性を向上させるために化学的に修飾される。本発明に取り上げられる核酸は、参照により本明細書に援用される“Current protocols in nucleic acids chemistry,”Beaucage,S.L.et al.(Edrs.),John Wiley & Sons,Inc.,New York,NY,USAに記載されるものなどの当該技術分野において十分に確立された方法によって合成及び/又は修飾され得る。修飾としては、例えば、末端修飾、例えば、5’末端修飾(リン酸化、コンジュゲート、逆結合(inverted linkage))又は3’末端修飾(コンジュゲート、DNAヌクレオチド、逆結合など);塩基修飾、例えば、安定塩基、不安定塩基、又は広範なパートナーと塩基対合する塩基による置換、塩基の除去(非塩基性ヌクレオチド)、又はコンジュゲート塩基;糖修飾(例えば、2’位又は4’位で)又は糖の置換;及び/又はホスホジエステル結合の修飾又は置換を含む、骨格修飾が挙げられる。本明細書に記載される実施形態に有用なiRNA化合物の具体例としては、限定はされないが、修飾された骨格を含むか又は天然のヌクレオシド間結合を含まないRNAが挙げられる。修飾された骨格を有するRNAとしては、特に、骨格中にリン原子を有さないものが挙げられる。本明細書の目的のために、及び当該技術分野において時折言及されるように、ヌクレオシド間骨格中にリン原子を有さない、修飾されたRNAは、オリゴヌクレオシドであるとみなすこともできる。ある実施形態において、修飾されたiRNAは、そのヌクレオシド間骨格中にリン原子を有する。
本発明のiRNAのRNAの別の修飾は、iRNAの活性、細胞分布又は細胞取り込みを向上させる1つ又は複数のリガンド、部分又はコンジュゲートをRNAに化学的に結合することを含む。このような部分としては、限定はされないが、コレステロール部分(Letsinger et al.,(1989)Proc.Natl.Acid.Sci.USA,86:6553−6556)、コール酸(Manoharan et al.,(1994)Biorg.Med.Chem.Let.,4:1053−1060)、チオエーテル、例えば、ベリル−S−トリチルチオール(Manoharan et al.,(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.,660:306−309;Manoharan et al.,(1993)Biorg.Med.Chem.Let.,3:2765−2770)、チオコレステロール(Oberhauser et al.,(1992)Nucl.Acids Res.,20:533−538)、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基(Saison−Behmoaras et al.,(1991)EMBO J,10:1111−1118;Kabanov et al.,(1990)FEBS Lett.,259:327−330;Svinarchuk et al.,(1993)Biochimie,75:49−54)、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−rac−グリセロール又はトリエチル−アンモニウム1,2−ジ−O−ヘキサデシル−rac−グリセロ−3−ホスホネート(Manoharan et al.,(1995)Tetrahedron Lett.,36:3651−3654;Shea et al.,(1990)Nucl.Acids Res.,18:3777−3783)、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖(Manoharan et al.,(1995)Nucleosides & Nucleotides,14:969−973)、又はアダマンタン酢酸(Manoharan et al.,(1995)Tetrahedron Lett.,36:3651−3654)、パルミチル部分(Mishra et al.,(1995)Biochim.Biophys.Acta,1264:229−237)、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ−カルボニルオキシコレステロール部分(Crooke et al.,(1996)J.Pharmacol.Exp.Ther.,277:923−937)などの脂質部分が挙げられる。
一実施形態において、リガンド又はコンジュゲートは、脂質又は脂質ベースの分子である。このような脂質又は脂質ベースの分子は、好ましくは、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン(HSA)に結合する。HSA結合リガンドは、身体の標的組織、例えば、非腎臓標的組織へのコンジュゲートの分配を可能にする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含む肝臓であり得る。HSAに結合し得る他の分子も、リガンドとして使用され得る。例えば、ネプロキシン(neproxin)又はアスピリンが使用され得る。脂質又は脂質ベースのリガンドは、(a)コンジュゲートの分解に対する耐性を増大し、(b)標的細胞又は細胞膜への標的化又は輸送を増大し、及び/又は(c)血清タンパク質、例えば、HSAへの結合を調整するのに使用され得る。
別の態様において、リガンドは、細胞透過剤(cell−permeation agent)、好ましくは、らせん状細胞透過剤である。好ましくは、この剤は両親媒性である。例示的な剤は、tat又はアンテノペディア(antennopedia)などのペプチドである。この剤がペプチドである場合、それは、ペプチジル模倣体、逆転異性体、非ペプチド又は擬ペプチド結合、及びD−アミノ酸の使用を含めて修飾され得る。らせん状剤は、好ましくはα−へリックス剤であり、これは、好ましくは、親油性及び疎油性相を有する。
本発明の組成物及び方法のある実施形態において、iRNAオリゴヌクレオチドは、炭水化物を更に含む。炭水化物コンジュゲートiRNAは、本明細書に記載するように、インビボでの核酸の送達に有利であり、また組成物は、インビボでの治療的使用に好適である。本明細書で使用される「炭水化物」は、少なくとも6個の炭素原子(直鎖状、分枝状又は環状であってもよい)を有し、該炭素原子の各々に酸素、窒素又は硫黄原子が結合している1つ又は複数の単糖単位から構成されている炭水化物それ自体である化合物;又はその一部として、1つ又は複数の単糖単位から構成されている炭水化物部分を有し、該単糖単位の各々が少なくとも6個の炭素原子(直鎖状、分枝状又は環状であってもよい)を有し、該炭素原子の各々に酸素、窒素又は硫黄原子が結合している化合物のいずれかを指す。代表的な炭水化物には、糖(単糖、二糖、三糖、及び、約4、5、6、7、8、又は9単糖単位を含むオリゴ糖)、並びに澱粉、グリコーゲン、セルロース及び多糖ゴムなどの多糖が挙げられる。特定の単糖には、C5以上(例えば、C5、C6、C7、又はC8)の糖が挙げられ;二及び三糖には、2つ又は3つの単糖単位(例えば、C5、C6、C7又はC8)を有する糖が挙げられる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載したコンジュゲート又はリガンドは、切断可能又は非切断可能であってもよい様々なリンカーを用いて、iRNAオリゴヌクレオチドに結合されてもよい。
一実施形態において、切断可能な結合基は、還元又は酸化後に切断される酸化還元切断可能な結合基である。還元的に切断可能な結合基の例は、ジスルフィド結合基(−S−S−)である。切断可能な候補結合基が好適な「還元的に切断可能な結合基」であるか、又は例えば特定のiRNA部分及び特定のターゲティング剤との使用に好適であるかを決定するために、本明細書に記載した方法に注目し得る。例えば、候補は、ジチオトレイトール(DTT)、又は当技術分野にて既知の試薬を使用した他の還元剤とのインキュベーションによって評価することができ、これは、細胞、例えば標的細胞内で観察されるであろう切断の速度を模倣する。候補は血液又は血清条件を模倣するよう選択された条件下でも評価し得る。その1つにおいて、候補化合物は、血液中で多くて約10%切断される。別の実施形態では、有用な候補化合物は、血液中(又は、細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロでの条件下)と比較して、細胞内(又は、細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロでの条件下)で少なくとも約2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90、又は約100倍速く分解される。候補化合物の切断速度は、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下での標準的な酵素動力学アッセイを用いて決定され、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較され得る。
別の実施形態では、切断可能なリンカーは、リン酸ベースの切断可能な結合基を含む。リン酸ベースの切断可能な結合基は、リン酸基を分解又は加水分解する薬剤によって切断される。細胞内でリン酸基を切断する薬剤の一例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。リン酸ベースの結合基の例は、−O−P(O)(ORk)−O−、−O−P(S)(ORk)−O−、−O−P(S)(SRk)−O−、−S−P(O)(ORk)−O−、−O−P(O)(ORk)−S−、−S−P(O)(ORk)−S−、−O−P(S)(ORk)−S−、−S−P(S)(ORk)−O−、−O−P(O)(Rk)−O−、−O−P(S)(Rk)−O−、−S−P(O)(Rk)−O−、−S−P(S)(Rk)−O−、−S−P(O)(Rk)−S−、−O−P(S)(Rk)−S−である。好ましい実施形態は、−O−P(O)(OH)−O−、−O−P(S)(OH)−O−、−O−P(S)(SH)−O−、−S−P(O)(OH)−O−、−O−P(O)(OH)−S−、−S−P(O)(OH)−S−、−O−P(S)(OH)−S−、−S−P(S)(OH)−O−、−O−P(O)(H)−O−、−O−P(S)(H)−O−、−S−P(O)(H)−O−、−S−P(S)(H)−O−、−S−P(O)(H)−S−、−O−P(S)(H)−S−である。好ましい実施形態は、−O−P(O)(OH)−O−である。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価することができる。
別の実施形態では、切断可能なリンカーは、酸切断可能な結合基を含む。酸切断可能な結合基は、酸性条件下で切断される結合基である。好ましい実施形態では、酸切断可能な結合基は、約6.5以下(例えば、約6.0、5.75、5.5、5.25、5.0、又はそれ未満)のpHを有する酸性環境内で、又は一般的な酸として作用し得る酵素などの薬剤により、切断される。細胞内では、エンドソーム及びリソソームなどの、特定の低pH小器官は、酸切断可能な結合基のための切断環境を提供し得る。酸切断可能な結合基の例には、非限定的にヒドラゾン、エステル、及びアミノ酸のエステルが挙げられる。酸切断可能な基は、一般式−C=NN−、C(O)O、又は−OC(O)を有してもよい。好ましい実施形態は、エステルの酸素に結合した炭素(アルコキシ基)が、アリール基、置換アルキル基、又はジメチルペンチル若しくはt−ブチルなどの第三級アルキル基である場合である。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価することができる。
別の実施形態では、切断可能なリンカーは、エステルベースの切断可能な結合基を含む。エステルベースの切断可能な結合基は、細胞内のエステラーゼ及びアミラーゼなどの酵素により切断される。エステルベースの切断可能な結合基の例には、非限定的にアルキレン、アルケニレン及びアルキニレン基のエステルが挙げられる。エステル切断可能な結合基は、一般式−C(O)O−、又は−OC(O)−を有する。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価することができる。
更なる別の実施形態において、切断可能なリンカーは、ペプチドベースの切断可能な結合基を含む。ペプチドベースの切断可能な結合基は、細胞内のペプチダーゼ及びプロテアーゼなどの酵素により切断される。ペプチドベースの切断可能な結合基の例は、アミノ酸間で形成されてオリゴペプチド(例えば、ジペプチド、トリペプチドなど)及びポリペプチドを与えるペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能な基は、アミド基(−C(O)NH−)を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレン又はアルキニレンの間で形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸間で形成されてペプチド及びタンパク質を与えるアミド結合の特別なタイプである。ペプチドベースの切断基は、一般に、アミノ酸間で形成されてペプチド及びタンパク質を与えるペプチド結合(即ち、アミド結合)に限定され、アミド官能基全部は含まない。ペプチドベースの切断可能な結合基は、一般式−NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)−を有し、式中、RA及びRBは、2つの隣接する2つのアミノ酸のR基である。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価することができる。
P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5Cは、各々、各存在に関して独立して不在、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH又はCH2Oであり;
Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5Cは、各存在に関して独立して不在、アルキレン、置換されたアルキレンであり、ここで1つ又は複数のメチレンは、O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R’)=C(R’’)、C≡C又はC(O)のうちの1つ又は複数により中断又は終結されてもよく;
R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5Cは、各々、各存在に関して独立して不在、NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、−C(O)−CH(Ra)−NH−、CO、CH=N−O、
L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B及びL5Cは、リガンドを表し;即ち、各々、各存在に関して独立して単糖(GalNAcなどの)、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、又は多糖であり;Raは、H又はアミノ酸側鎖である。式(XXXV)のものなどの、三価コンジュゲートGalNAc誘導体は、RNAi剤と共に使用されて、標的遺伝子の発現を阻害するのに特に有用である:
細胞、例えば、ヒト対象(例えば、脂質代謝障害に罹患している対象などの、iRNAを必要とする対象)などの対象中の細胞への本発明のiRNAの送達は、いくつかの様々な方法で行うことができる。例えば、送達は、細胞を、本発明のiRNAとインビトロ又はインビボのいずれかで接触させることによって行われ得る。インビボ送達はまた、iRNA、例えば、dsRNAを含む組成物を対象に投与することによって直接行われ得る。あるいは、インビボ送達は、iRNAの発現をコードし、それを導く1つ又は複数のベクターを投与することによって、間接的に行われ得る。これらの代替例は、以下に更に説明される。
ANGPTL3遺伝子を標的とするiRNAは、DNA又はRNAベクターに挿入された転写単位から発現され得る(例えば、Couture,A,et al.,TIG.(1996),12:5−10;Skillern,A.らの国際PCT公開番号国際公開第00/22113号パンフレット、Conradの国際PCT公開番号国際公開第00/22114号パンフレット、及びConradの米国特許第6,054,299号明細書を参照)。発現は、使用される特定の構築物及び標的組織又は細胞型に応じて、一時的(およそ数時間から数週間)であるか又は持続され得る(数週間から数カ月又はそれ以上)。これらの導入遺伝子は、線状構築物、環状プラスミド、又はウイルスベクターとして導入することができ、これらは、組み込み又は非組み込みベクターであり得る。導入遺伝子は、染色体外プラスミドとして継承されるのを可能にするように構築することもできる(Gassmann,et al.,(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:1292)。
本発明は、本発明のiRNAを含む医薬組成物及び製剤も含む。一実施形態において、本明細書に記載されるiRNAと、薬学的に許容され得る担体とを含有する医薬組成物が本明細書に提供される。iRNAを含有する医薬組成物は、ANGPTL3遺伝子の発現又は活性に関連する疾病又は障害、例えば、高トリグリセリド血症などの脂質代謝障害を処置するのに有用である。
本発明の組成物及び方法に使用するためのiRNAは、膜分子集合体、例えば、リポソーム又はミセル中の送達用に製剤化され得る。本明細書において使用される際、「リポソーム」という用語は、少なくとも1つの二重層、例えば、1つの二重層又は複数の二重層に配置された両親媒性の脂質から構成される小胞を指す。リポソームは、親油性材料及び水性内部から形成される膜を有する単層及び多層小胞を含む。水性部分は、iRNA組成物を含有する。親油性材料は、水性外部から水性内部を分離し、通常、iRNA組成物を含まないが、場合によっては、含むことがある。リポソームは、作用部位への活性成分の移送及び送達に有用である。リポソーム膜は生体膜と構造が類似しているため、リポソームが組織に付着されると、リポソームの二重層が、細胞膜の二重層と融合する。リポソーム及び細胞の融合が進むにつれて、iRNAを含む内部の水性内容物が、細胞に送達され、ここで、iRNAは、標的RNAに特異的に結合することができ、RNAiを仲介することができる。場合によっては、リポソームはまた、例えば、iRNAを特定の細胞型に指向するように、特異的に標的化される。
本発明のiDNAすなわちAPOC3 dsRNAは、脂質製剤中に完全に封入されて、例えばSPLP、pSPLP、SNALP、又は他の核酸−脂質粒子を形成してもよい。本明細書で使用される用語「SNALP」は、SPLPを含む安定な核酸−脂質粒子を指す。本明細書で使用される用語「SPLP」は、脂質ベシクル内に封入されたプラスミドDNAを含む核酸−脂質粒子を指す。SNALP及びSPLPは、典型的には、陽イオン性脂質、非陽イオン性脂質、及び粒子の凝集を防止する脂質(例えば、PEG−脂質コンジュゲート)を含む。SNALP及びSPLPは、静脈内(i.v.)注射後に延長された循環寿命を有し、かつ遠位部位(例えば、投与部位から物理的に分離された部位)に蓄積するため、全身適用に極めて有用である。SPLPは「pSPLP」を含み、pSPLPは、PCT公開第国際公開第00/03683号パンフレットに示されているように、封入された縮合剤−核酸複合体を含む。本発明の粒子は、典型的には、約50nm〜約150nm、より典型的には約60nm〜約130nm、より典型的には約70nm〜約110nm、最も典型的には約70nm〜約90nmの平均粒径を有し、かつ実質的に無毒である。加えて、核酸は、本発明の核酸−脂質粒子中に存在する場合、水性溶液中で、ヌクレアーゼによる分解に耐性である。核酸−脂質粒子、及びそれらの調製方法は、例えば米国特許第5,976,567号明細書;米国特許第5,981,501号明細書;米国特許第6,534,484号明細書;米国特許第6,586,410号明細書;米国特許第6,815,432号明細書;米国特許出願公開第2010/0324120号明細書及びPCT公開国際公開第96/40964号パンフレットに開示されている。
DPPC:ジパルミトイルホスファチジルコリン
PEG−DMG:PEG−ジジミリストイル(didimyristoyl)グリセロール(C14−PEG、又はPEG−C14)(2000の平均分子量を有するPEG)
PEG−DSG:PEG−ジスチリルグリセロール(C18−PEG、又はPEG−C18)(2000の平均分子量を有するPEG)
PEG−cDMA:PEG−カルバモイル−1,2−ジミリスチルオキシプロピルアミン(2000の平均分子量を有するPEG)
SNALP(l,2−ジリノレニルオキシ−N,N−ジメチルアミンプロパン(DLinDMA))を含む製剤が、参照により本明細書に援用される、2009年4月15日に出願された国際公開第2009/127060号パンフレットに記載されている。
本発明の核酸−脂質粒子に使用される、例えば、カチオン性脂質などの化合物のいずれも、実施例により詳細に記載される方法を含む公知の有機合成技術によって調製され得る。全ての置換基は、特に示されない限り、以下に定義されるとおりである。
ある実施形態において、本発明の核酸−脂質粒子は、式A:
DLin−M−C3−DMA(すなわち、(6Z,9Z,28Z,31Z)−ヘプタトリアコンタ−6,9,28,31−テトラエン−19−イル4−(ジメチルアミノ)ブタノエート)の調製は以下のとおりであった。ジクロロメタン(5mL)中の(6Z,9Z,28Z,31Z)−ヘプタトリアコンタ−6,9,28,31−テトラエン−19−オール(0.53g)、4−N,N−ジメチルアミノ酪酸塩酸塩(0.51g)、4−N,N−ジメチルアミノピリジン(0.61g)及び1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(0.53g)の溶液を、室温で一晩撹拌した。溶液を、希塩酸で洗浄し、続いて、希炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機画分を、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、ろ過し、溶媒を回転蒸発器において除去した。残渣を、1〜5%のメタノール/ジクロロメタン溶出勾配を用いてシリカゲルカラム(20g)に通した。精製された生成物を含有する画分を組み合わせて。溶媒を除去し、無色油(0.54g)を得た。
二口丸底フラスコ(1L)中で、200mlの無水THF中のLiAlH4(3.74g、0.09852mol)の撹拌懸濁液に、70mLのTHF中の514(10g、0.04926mol)の溶液を、窒素雰囲気下で、0℃でゆっくりと加えた。完全に加えた後、反応混合物を室温まで温め、次に、4時間加熱還流させた。反応の進行をTLCによって監視した。(TLCによる)反応の完了後、混合物を00℃に冷却し、飽和Na2SO4溶液の慎重な添加によってクエンチした。反応混合物を室温で4時間撹拌し、ろ過して取り除いた。残渣をTHFで十分に洗浄した。ろ液及び洗浄液を混合し、400mLのジオキサン及び26mLの濃HClで希釈し、室温で20分間撹拌した。揮発性物質を、減圧下で取り除いて、白色の固体として515の塩酸塩を得た。収量:7.12g 1H−NMR(DMSO、400MHz):δ=9.34(broad,2H)、5.68(s,2H)、3.74(m,1H)、2.66〜2.60(m,2H)、2.50〜2.45(m,5H)。
250mLの二口丸底フラスコ中で、100mLの乾燥DCM中の化合物515の撹拌溶液に、NEt3を加え(37.2mL、0.2669mol)、窒素雰囲気下で0℃に冷却した。50mLの乾燥DCM中のN−(ベンジルオキシ−カルボニルオキシ)−スクシンイミド(20g、0.08007mol)をゆっくりと加えた後、反応混合物を、室温まで温めた。反応(TLCによって2〜3時間)の完了後、混合物を、1NのHCl溶液(1×100mL)及び飽和NaHCO3溶液(1×50mL)で連続して洗浄した。次に、有機層を、無水Na2SO4上で乾燥させ、溶媒を蒸発させて、粗材料を得て、それを、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、粘着性の塊として516を得た。収量:11g(89%)。1H−NMR(CDCl3、400MHz):δ=7.36〜7.27(m,5H)、5.69(s,2H)、5.12(s,2H)、4.96(br.,1H)2.74(s,3H)、2.60(m,2H)、2.30〜2.25(m,2H)。LC−MS[M+H]−232.3(96.94%)。
シクロペンテン516(5g、0.02164mol)を、500mLの一口丸底フラスコ中で、220mLのアセトン及び水(10:1)の溶液に溶解させ、それに、N−メチルモルホリン−N−オキシド(7.6g、0.06492mol)、続いて、4.2mLの、tert−ブタノール中のOsO4(0.275g、0.00108mol)の7.6%溶液を室温で加えた。反応(約3時間)の完了の後、混合物を、固体Na2SO3の添加によってクエンチし、得られた混合物を、室温で1.5時間撹拌した。反応混合物を、DCM(300mL)で希釈し、水(2×100mL)、続いて、飽和NaHCO3(1×50mL)溶液、水(1×30mL)及び最後に塩水(1×50mL)で洗浄した。有機相を、無水Na2SO4上で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。粗材料のシリカゲルカラムクロマトグラフィー精製により、ジアステレオマーの混合物を得て、それを、分取HPLCによって分離した。収量:−6gの粗517A−ピーク−1(白色の固体)、5.13g(96%)。1H−NMR(DMSO、400MHz):δ=7.39〜7.31(m,5H)、5.04(s,2H)、4.78〜4.73(m,1H)、4.48〜4.47(d,2H)、3.94〜3.93(m,2H)、2.71(s,3H)、1.72〜1.67(m,4H)。LC−MS−[M+H]−266.3、[M+NH4+]−283.5存在、HPLC−97.86%。X線により確認された立体化学。
化合物505の合成について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物518(1.2g、41%)を無色油として得た。1H−NMR(CDCl3、400MHz):δ=7.35〜7.33(m,4H)、7.30〜7.27(m,1H)、5.37〜5.27(m,8H)、5.12(s,2H)、4.75(m,1H)、4.58〜4.57(m,2H)、2.78〜2.74(m,7H)、2.06〜2.00(m,8H)、1.96〜1.91(m,2H)、1.62(m,4H)、1.48(m,2H)、1.37〜1.25(br m,36H)、0.87(m,6H)。HPLC−98.65%。
ヘキサン(15mL)中の化合物518(1当量)の溶液を、THF(1M、2当量)中のLAHの氷冷した溶液に滴下して加えた。完全に加えた後、混合物を、0.5時間にわたって40℃で加熱し、次に、氷浴上で再度冷却した。混合物を、飽和Na2SO4水溶液を用いて慎重に加水分解し、次に、セライトを通してろ過し、還元して油にした。カラムクロマトグラフィーにより、純粋な519(1.3g、68%)が得られ、これは、無色油として得られた。13C NMR δ=130.2、130.1(×2)、127.9(×3)、112.3、79.3、64.4、44.7、38.3、35.4、31.5、29.9(×2)、29.7、29.6(×2)、29.5(×3)、29.3(×2)、27.2(×3)、25.6、24.5、23.3、226、14.1;エレクトロスプレーMS(+ve):C44H80NO2についての分子量(M+H)+計算値654.6、実測値654.6。
i.エマルション
本発明の組成物は、エマルションとして、調製され、製剤化され得る。エマルションは、典型的に、1つの液体が、通常、直径が0.1μmを超える液滴の形態の別の液体中に分散された不均一系である(例えば、Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY;Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199;Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Volume 1,p.245;Block in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 2,p.335;Higuchi et al.,in Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985,p.301を参照)。エマルションは、多くの場合、互いに親密に混合され及び分散された2つの非混和性液体相を含む二層系である。一般に、エマルションは、油中水(w/o)又は水中油(o/w)の種類のいずれかであり得る。水性相が微小液滴として塊の油相中に微細に分割され及び分散された場合、得られた組成物は、油中水(w/o)エマルションと呼ばれる。代替的に、油相が微小液滴として塊の水性相中に微細に分割され及び分散された場合、得られた組成物は、水中油(o/w)エマルションと呼ばれる。エマルションは、分散相及び活性薬物に加えて追加の構成成分を含むことができ、該構成成分は、水性相、油相中の溶液として、又はそれ自体が別個の相として存在し得る。必要に応じてエマルション中に乳化剤、安定剤、染料、及び抗酸化剤などの医薬賦形剤も存在し得る。医薬エマルションは、例えば、油中水中油(o/w/o)及び水中油中水(w/o/w)エマルションの場合など、3つ以上の相からなる多エマルションであり得る。そのような複合製剤は、多くの場合、単純な二成分エマルションが提供しない所定の利点を提供する。o/wエマルションの個々の油小滴が小さい水小滴を囲い込む多エマルションは、w/o/wエマルションを構成する。同様に、油の連続相中で安定化された水の小球中に囲い込まれた油小滴の系は、o/w/oエマルションを提供する。
本発明の一実施形態において、iRNA及び核酸の組成物は、マイクロエマルションとして製剤化される。マイクロエマルションは、単一の光学的に等方性で且つ熱力学的に安定した液体溶液である、水、油及び両親媒性物質の系として定義され得る(例えば、Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY;Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245を参照)。典型的には、マイクロエマルションは、最初に油を水性界面活性剤溶液中に分散した後、十分な量の第四の構成成分、一般に中間の鎖長のアルコールを加えて透明系を形成することにより調製される。従って、マイクロエマルションは、表面活性分子の界面フィルムにより安定化されている2つの非混和性液体からなる熱力学的に安定な、等方的に透明な分散物として記載されている(Leung and Shah,in:Controlled Release of Drugs:Polymers and Aggregate Systems,Rosoff,M.,Ed.,1989,VCH Publishers,New York,pp.185−215)。マイクロエマルションは通常、油、水、界面活性剤、補助界面活性剤及び電解質を含む3〜5つの構成成分の組み合わせを用いて調製される。マイクロエマルションが油中水(w/o)タイプ又は水中油(o/w)タイプのいずれのものであるかは、使用される油及び界面活性剤の特性と、界面活性剤分子の極性頭部及び炭化水素尾部の構造及び幾何学的充填(geometric packing)とに依存する(Schott,in Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985,p.271)。
本発明のRNAi剤は、粒子、例えば、微粒子に組み込まれてもよい。微粒子は、噴霧乾燥によって生成され得るが、凍結乾燥、蒸発、流体床乾燥、真空乾燥、又はこれらの技術の組合せを含む他の方法によって生成されてもよい。
一実施形態において、本発明は、動物の皮膚への、核酸、特にiRNAの効率的な送達を行うために様々な浸透促進剤を用いる。ほとんどの薬剤が、イオン化及び非イオン化の両方の形態で溶液中に存在する。しかしながら、通常、脂溶性又は親油性の薬剤のみが、細胞膜を容易に横断する。横断される膜が浸透促進剤で処理されている場合、非親油性薬剤でも細胞膜を横断することができることが発見されている。細胞膜をわたる非親油性薬剤の拡散の補助に加えて、浸透促進剤は、親油性薬剤の浸透性も向上させる。
本発明の所定の組成物は、製剤中に担体化合物も組み込んでいる。本明細書で使用される「担体化合物」又は「担体」は、不活性(即ち、生物学的活性perseを所有しない)であり得るが、例えば、生物学的に活性な核酸を分解し、又は循環からの核酸の除去を促進することによる、生物学的活性を有する核酸のバイオアベイラビリティを低下させるインビボでのプロセスによって、核酸であると認識される核酸又はその類似体を指すことができる。核酸及び担体化合物の共投与、典型的には過剰な後者の物質による共投与により、おそらくは共通の受容体に対する担体化合物と核酸との競合に起因して、肝臓、腎臓又は他の循環外リザーバ(extracirculatory reservoir)中で回収される核酸の量が実質的に低下し得る。例えば、肝組織内での部分的ホスホロチオエートの回収は、それがポリイノシン酸、デキストラン硫酸塩、ポリシチジル酸(polycytidic acid)又は4−アセトアミド−4’イソチオシアノ−スチルベン−2,2’−ジスルホン酸と共投与された際、低下され得る(Miyao et al.,DsRNA Res.Dev.,1995,5,115−121;Takakura et al.,DsRNA&Nucl.Acid Drug Dev.,1996,6,177−183。
担体化合物とは対照的に、「医薬担体」又は「賦形剤」は、動物に1つ又は複数の核酸を送達するための薬学的に許容され得る溶媒、懸濁剤、又は任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は、液体又は固体とすることができ、計画された投与方法を考慮に入れて、核酸及び医薬組成物の他の所定の構成成分と組み合わされた際に、所望の嵩、稠度などを提供するように選択される。典型的な医薬担体には、非限定的に、結合剤(例えば、α化トウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロースなど);充填剤(例えば、乳糖及び他の糖、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート又はリン酸水素カルシウムなど);滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、水素化植物油、トウモロコシ澱粉、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど);錠剤崩壊剤(例えば、澱粉、澱粉グリコール酸ナトリウムなど);及び湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど)が挙げられる。
本発明の組成物は更に、医薬組成物中に従来見出される他の補助構成成分も、当技術分野にて確立されたそれらの使用レベルで含有し得る。それ故、例えば、組成物は、例えば、鎮痒薬、収斂薬、局所麻酔薬若しくは抗炎症薬剤などの更なる、適合可能な、医薬的に活性な材料を含有することができ、又は、染料、風味剤、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤及び安定剤などの、本発明の組成物の様々な剤形を物理的に処方するのに有用な更なる材料を含有することができる。しかしながら、それらの材料は、加えられた際、本発明の組成物の構成成分の生物学的活性を過度に妨害しない必要がある。製剤は滅菌されてもよく、また所望の場合、製剤の核酸と有害に相互作用しない補助剤、例えば滑沢剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝液、着色料、調味料及び/又は芳香性物質などと混合される。
本発明は、細胞内でのANGPTL3の発現を低下させ、及び/又は阻害するために、本発明のiRNA及び/又は本発明のiRNAを含有する組成物の使用方法も提供する。本方法は、細胞を、本発明のdsRNAと接触させる工程と、細胞を、ANGPTL3遺伝子のmRNA転写物の分解を得るのに十分な時間にわたって維持し、それにより、細胞内でのANGPTL3遺伝子の発現を阻害する工程とを含む。遺伝子発現の低下は、当該技術分野において公知の任意の方法によって評価され得る。例えば、ANGPTL3の発現の低下は、当業者にとって日常的な方法、例えば、ノーザンブロット法、qRT−PCRを用いて、ANGPTL3のmRNA発現レベルを測定することによって;ウエスタンブロット法、免疫学的技法などの当業者にとって日常的な方法を用いて、ANGPTL3のタンパク質レベルを測定することによって、測定されてもよい。ANGPTL3の発現の低下はまた、ANGPTL3の生物学的活性の低下、例えば、血清脂質、トリグリセリド、コレステロール及び/又は遊離脂肪酸のレベルの低下を測定することによって、間接的に評価されてもよい。
試薬供給源
本明細書に試薬供給源が特に与えられていない場合、それらの試薬は、分子生物学における任意の供給業者から、分子生物学での用途の品質/純度基準で得ることができる。
NCBI Gene database(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)において注釈付けされたヒトANGPTL3転写物及び肝臓RNAから調製されたcDNAのシークエンシングによって産生されたカニクイザル(カニクイザル(Macaca fascicularis);これ以降、「cyno」)ANGPTL3転写物を標的とするsiRNAを特定するために、siRNA設計を行った。cyno ANGPTL3 mRNAのシークエンシングを、社内で行った。mRNA配列は、配列番号9に示される。
全ての可能な19量体(19mer)の予測される特異性を、各配列から予測した。次に、7ヌクレオチドより長い反復がない候補19量体を選択した。次に、これらの977の候補ヒト/cyno siRNA、及びマウスとも一致した38のサブセット(「ヒト/cyno/マウス候補siRNA」)を、パイソンスクリプト(python script)「BruteForce.py」で実施される包括的な「力まかせ(brute−force)」アルゴリズムを用いて、ヒトトランスクリプトーム(ヒトNCBI Refseqセット内のNM_及びXM_レコードのセットとして定義される)に対する包括的検索に使用した。次に、スクリプトが、転写物−オリゴのアライメントを解析して、siRNAと、あらゆる可能性のある「オフターゲット」転写物とのミスマッチの位置及び数に基づいてスコアを生成する。オフターゲットスコアを重み付けして、分子の5’末端から2〜9位にある、siRNAの「シード」領域の差異を強調する。力まかせ探索(brute−force search)による各オリゴ−転写物対に、個々のミスマッチスコアを合計することによってミスマッチスコアを与え;2〜9位にあるミスマッチを、2.8とみなし、切断部位10〜11のミスマッチを、1.2とみなし、領域12〜19のミスマッチを、1.0とみなした。更なるオフターゲット予測を、各オリゴの3つの異なる、シード指向性の6量体から誘導される7量体及び8量体の頻度を比較することによって行った。5’開始点に対して2〜7位からの6量体を用いて、2つの7量体及び1つの8量体を生成した。3’Aを6量体に加えることによって「7量体1」を生成し;5’Aを6量体に加えることによって「7量体2」を生成し;Aを6量体の5’及び3’末端の両方に加えることによって、8量体を生成した。ヒト3’UTRome(コード領域「CDS」の末端が明確に定義されたNCBIのRefseqデータベースからのトランスクリプトームの部分列として定義される)における8量体及び7量体の頻度を予め計算した。8量体の頻度の範囲からの中央値を用いて、8量体の頻度を7量体の頻度に対して標準化した。次に、「mirSeedScore」を、((3×標準化された8量体の数値)+(2×7量体2の数値)+(1×7量体1の数値))の和を計算することによって計算した。
ヒト/cynoセットからのsiRNAオリゴに由来する合計で47のセンス及び47のアンチセンスを合成し、二本鎖に形成した。ヒト/cyno/マウスセットからのsiRNAに由来する合計で15のセンス及び15のアンチセンスを合成し、二本鎖に形成した。
1又は0.2μmolのいずれかの規模で、MerMade 192合成装置においてANGPTL3配列を合成した。トランスフェクションに基づいたインビトロスクリーニングのために2’O−メチル修飾を有する一本鎖を合成した。自由取り込み(free−uptake)スクリーニングアッセイに使用するために、2’F及び2’−O−メチル化学的修飾を有する3’GalNAcコンジュゲートを作製した。これらの設計では、GalNAc部分を、センス鎖の3’末端に配置した。アンチセンス配列は、23ヌクレオチド長であり、また、3’末端に2つのホスホロチオエート結合を有する2’F及び2’Oメチル化学的修飾を含んでいた。
・センス鎖における全てのピリミジン(シトシン及びウリジン)を、2’−O−メチルヌクレオチド(2’O−メチルC及び2’−O−メチルU)で修飾した。
・アンチセンス鎖において、リボAヌクレオシドに(5’位に向かって)隣接するピリミジンを、それらの対応する2’−O−メチルヌクレオシドで置換した。
・センス及びアンチセンス配列の両方の3’末端に2つの塩基dTsdT伸長を導入した。
ANGPTL3配列の合成は、ホスホラミダイト化学を用いた固相担持オリゴヌクレオチド合成を使用した。21量体のエンドライト配列では、デオキシチミジンCPGを固体担体として使用した一方、GalNAcコンジュゲートでは、センス鎖のためのGalNAc固体担体及びアンチセンス鎖のための汎用CPGを使用した。
ANGPTL3配列を沈殿させ、Sephadexカラムを用いてAKTA Purifierシステムにおいて精製した。ANGPTL3を周囲温度で実験した。試料の注入及び収集を、1.8mLの深さのウェルを有する96ウェルプレートにおいて行った。完全長の配列に対応する単一ピークを、溶出液中に収集した。脱塩したANGPTL3配列を、濃度(A260におけるUV測定によって)及び純度(イオン交換HPLCによって)について分析した。次に、相補的な一本鎖を、1:1の化学量論比で組み合わせて、siRNA二本鎖を形成した。
細胞培養及びトランスフェクション
Hep3B細胞(ATCC,Manassas,VA)を5%CO2の雰囲気下、10%FBS、ストレプトマイシン及びグルタミン(ATCC)で補充したRPMI(ATCC)中、37℃でほぼコンフルエンスまで増殖させた後、トリプシン処理によりプレートから解放した。ウェル当たり14.8μlのOpti−MEM+0.2μlのLipofectamine RNAiMax(Invitrogen,Carlsbad CA.cat#13778−150を、96ウェルプレート内に、ウェル当たり5μlのsiRNA二本鎖に加えることによりトランスフェクションを行い、室温で15分間インキュベートした。次いで、抗生物質を有さない、〜2×104Hep3B細胞を含む80μlの完全増殖培地をsiRNA混合物に加えた。RNA精製に先だって細胞を24又は120時間のいずれかでインキュベートした。別に示されない限り、10nM及び0.1nMの最終二本鎖濃度で単一用量実験を行い、10、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005、及び0.00001nMの最終二本鎖濃度で用量応答実験を行った。
PBS中の5μlの各GalNacコンジュゲートsiRNAを、96ウェルプレートの各ウェル中で、95μlのIn Vitro Gro CP媒体(In Vitro Technologies−Celsis,Baltimore,MD)に再懸濁された4×104個の、融解したばかりの凍結保存カニクイザル肝細胞と組み合わせた。混合物を、5%のCO2の雰囲気中で、37℃で約24時間インキュベートした。有効性自由取り込みアッセイのために、siRNAを、500nM、100nM及び10nMの最終濃度で試験した。用量反応スクリーニングのために、最終的なsiRNA濃度は、500nM、100nM、20nM、4nM、0.8nM、0.16nM、0.032nM及び0.0064nMであった。
細胞を回収し、150μlの溶解/結合緩衝液中に溶解した後、エッペンドルフサーモミキサーを使用して、850rpmで5分間混合した(混合速度は、プロセス全体において同一であった)。10マイクロリットルの磁気粒及び80μlの溶解/結合緩衝液混合物を丸底プレートに加え、1分間混合した。磁気スタンドを使用して磁気粒を捕捉し、粒を乱すことなく上清を除去した。上清の除去後、溶解した細胞を残りの粒に加え、5分間混合した。上清の除去後、磁気粒を150μlの洗浄緩衝液Aで2回洗浄し、1分間混合した。粒を再度捕捉し、上清を除去した。次いで、粒を150μlの洗浄緩衝液Bで洗浄し、捕捉し、上清を除去した。次に粒を150μlの溶出緩衝液で洗浄し、捕捉し、上清を除去した。粒を2分間乾燥させた。乾燥後、50μlの溶出緩衝液を加え、70℃で5分間混合した。粒を磁石上で5分間捕捉した。40μlの上清を除去し、他の96ウェルプレートに加えた。
反応当たり2μlの10X緩衝液、0.8μlの25X dNTPs、2μlのランダムプライマー、1μlの逆転写酵素、1μlのRNAe阻害剤及び3.2μlのH2Oからなるマスターミックスを、10μlの総RNAに加えた。Bio−RadC−1000又はS−1000サーモサイクラー(Hercules,CA)を使用して、以下のステップを介してcDNAを生成した:25℃ 10分間、37℃ 120分間、85℃ 5秒間、4℃保持。
2μlのcDNAを、384ウェル50プレート(Roche cat#04887301001)内にて、ウェル当たり0.5μlのGAPDHTaqManプローブ(Applied Biosystems Cat#4326317E)、0.5μlのANGPTL3 TaqManプローブ(Applied Biosystems cat#Hs00163644_m1)及び5μlのLightcycler 480プローブマスターミックス(Roche Cat#04887301001)を含むマスターミックスに加えた。ΔΔCt(RQ)アッセイを用いて、ABI7900HT Real Time PCRシステム(Applied Biosystems)内でリアルタイムPCRを行った。概略表内に特に記さない限り、各二本鎖を2つの独立トランスフェクションにて試験し、各トランスフェクションを二回アッセイした。
10、1、0.5、0.1、0.05nMのsiRNAでトランスフェクションした後に、HeLa及びHep3B細胞において、3日目及び6日目に細胞生存率を測定した。96ウェルプレートの1つのウェル当たり10,000個の細胞の密度で細胞を平板培養した。各siRNAを3回アッセイし、データを平均した。PLK1及びAD−19200を標的とするsiRNAが、生存率の低下についての陽性対照として含まれ、AD−1955及び模擬トランスフェクト細胞が陰性対照として含まれていた。PLK1及びAD−19200は、用量依存的な生存率の低下の結果を生じた。生存率を測定するために、20μlのCellTiter Blue(Promega)を、3日後又は6日後に96ウェルプレートの各ウェルに加え、37℃で2時間インキュベートした。次に、プレートを、分光光度計(Molecular Devices)において560Ex/590Emで読み取った。生存率を、3つの反復するトランスフェクション+/−標準偏差から光の単位の平均値として表した。相対的な生存率を、3つの反復するトランスフェクションをまず平均し、次に、模擬トランフフェクト細胞を標準化することによって評価した。データは、生存細胞の%として表される。
これらのモノマーは、オリゴヌクレオチド中に存在する場合、5’−3’−ホスホジエステル結合によって相互に結合されたことが理解されるであろう。
表3に列挙される修飾オリゴヌクレオチド二本鎖を用いて、実験を行った。AD−15838.2の配列は、AD−15838.1の配列と同一である。siRNA二本鎖の送達を、LNPを用いて行った。
表3に列挙される修飾オリゴヌクレオチド二本鎖を用いて、実験を行った。AD−15838.2の配列は、AD−15838.1の配列と同一である。
表3に列挙される修飾オリゴヌクレオチド二本鎖を用いて、実験を行った。AD−15838.2の配列は、AD−15838.1の配列と同一である。生存率データは、模擬処置された(mock treated)細胞と比べた生存率%として表される。
これらの配列は、GalNalコンジュゲートを含まないことを除き、表7に列挙される配列と同じである。
これらの配列は、GalNalコンジュゲートを含まないことを除き、表8に列挙される配列と同じである。
Hep3b細胞内でのトランスフェクション及び上記の用量での初代カニクイザル(PCH)細胞内での自由取り込みによって、修飾siRNAを試験した。
単回投与スクリーニングからの活性なsiRNAのサブセット(表11中のデータを参照)を、PCH細胞内での自由取り込みによって、用量反応実験において試験した。また、これらの活性なsiRNAのサブセットを、トランスフェクションによってHep3B細胞内での用量反応において試験した。
表10からの活性なANGPTL3 siRNAのサブセットを、用量反応スクリーニングにおいてHep3B細胞内でのトランスフェクションによって試験した。
これらの二本鎖は、同じ配列及び修飾パターンを有する。
実施例3
被験物質
本発明のdsRNA配列を用いて、インビボ実験を行った。実験に使用されるdsRNA配列は、GalNacコンジュゲートAD−52981(「ANG」、センス配列:AfcAfuAfuUfuGfAfUfcAfgUfcUfuUfuUfL96(配列番号657);アンチセンス配列:aAfaAfaGfaCfuGfaucAfaAfuAfuGfusUfsg(配列番号842)であった。陰性対照として使用されるdsRNA配列は、ルシフェラーゼコンジュゲートAD−48399B1(「Luc」、センス配列:CfaCfuUfaCfgCfuGfaGfuAfcUfuCfgAfL96(配列番号1728)、アンチセンス配列:uCfgAfaGfuAfcUfcAfgCfgUfaAfgUfgsAfsu(配列番号1729))であった。交互の2’−メチル及び2’フルオロ修飾を含有するGalNalコンジュゲートAD−1955も陰性対照として使用された。
dsRNA配列を、C57BL/6(野生型(WT))及びob/obマウスにおいて試験した。野生型(WT)マウスに、PBS中のdsRNA、20mg/kgのLuc、又は5又は20mg/kgのANGを1日1回5日間投与し;ob/obマウスに、20mg/kgの、Lucで製剤化されたNPL又は20mg/kgのANGを1日1回5日間投与した。図1に示される手順にしたがって、全ての被験物質を皮下注射によって投与した。具体的には、被験物質の1日1回5日間の投与を、5日間連続で行い(0日目、1日目、2日目、3日目及び4日目)、血液試料を、投与の5、3又は1日前、ならびに投与後0、1、2、3、4、7、9、11、15、18、21、25、30、37、45及び50日目に採取した。採取された血液試料を用いて、ELISAアッセイを用いてANGPTL3タンパク質の発現を測定した。また、血清トリグリセリド(TG)、低比重リポタンパクコレステロール(LDLc)、高比重リポタンパクコレステロール(HDLc)及び総コレステロール(TC)のレベルを、Olympus Analyzerを用いて測定した。
図2に示されるパネルAは、5又は20mg/kgの対照又はANGの投与後に野生型(WT)マウスにおいて測定されたマウスANGPTL3(mANGPTL3タンパク質のレベルである。また、図2に示されるパネルBは、20mg/kgの対照又はANGの投与後にob/obマウスにおいて測定されたmANGPTL3タンパク質のレベルである。データは、野生型(WT)及びob/obマウスの両方について、ANGの投与が、対照と比較して、mANGPTL3タンパク質のレベルを低下させたことを示す。
被験物質
ANGPTL3タンパク質にレベルに対する本発明のdsRNA配列の単回投与の効果を試験した。実験に使用されるdsRNA配列は、GalNacコンジュゲートAD−52981(「ANG」、センス配列:AfcAfuAfuUfuGfAfUfcAfgUfcUfuUfuUfL96(配列番号657);アンチセンス配列:aAfaAfaGfaCfuGfaucAfaAfuAfuGfusUfsg(配列番号842))であった。PBSを陰性対照として使用した。
完全長のヒトPCSK9遺伝子の肝臓特異的な発現を特徴とするヒトPCSトランスジェニックマウスにおいて、dsRNA配列を試験した。ヒトPCSトランスジェニックマウスに、単回の皮下注射を用いてAD−52981又はPBSを投与した。マウスを、各群が2匹の雄及び2匹の雌からなる4つの群に分けた。各群に、PBSの注射又はAD−52981の5mg/kg、20mg/kg又は60mg/kgの投与を行った。血液試料を、投与の1日前及び0日前、及び投与の72時間後に採取した。ANGPTL3タンパク質レベルを、ELISAによって測定し、投与の1日前及び0日前のレベルと比較した。
図7に示されるのは、ヒトPCSトランスジェニックマウスにおいて測定されたマウスANGPTL3タンパク質(mANGPTL3)のレベルである。示されるデータは、PBS対照と比べて表され、各群の2匹の雄及び2匹の雌の平均を表す。エラーバーは、標準偏差を表す。データは、AD−52981の単回の注射の投与が、用量依存的にマウスにおけるANGPTL3タンパク質のレベルを低下させ、60mg/kgの用量が、ANGPTL3タンパク質のレベルを、5分の1未満に低下させることを示す(図7を参照)。
配列番号1
>gi|41327750|ref|NM_014495.2|ヒト(Homo sapiens)アンジオポエチン様3(ANGPTL3)、mRNA
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>gi|297278846|ref|XM_001086114.2|PREDICTED:アカゲザル(Macaca mulatta)アンジオポエチン様3(ANGPTL3)、mRNA
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>gi|142388354|ref|NM_013913.3|ハツカネズミ(Mus musculus)アンジオポエチン様3(Angptl3)、mRNA
CAGGAGGGAGAAGTTCCAAATTGCTTAAAATTGAATAATTGAGACAAAAAATGCACACAATTAAATTATTCCTTTTTGTTGTTCCTTTAGTAATTGCATCCAGAGTGGATCCAGACCTTTCATCATTTGATTCTGCACCTTCAGAGCCAAAATCAAGATTTGCTATGTTGGATGATGTCAAAATTTTAGCGAATGGCCTCCTGCAGCTGGGTCATGGACTTAAAGATTTTGTCCATAAGACTAAGGGACAAATTAACGACATATTTCAGAAGCTCAACATATTTGATCAGTCTTTTTATGACCTATCACTTCGAACCAATGAAATCAAAGAAGAGGAAAAGGAGCTAAGAAGAACTACATCTACACTACAAGTTAAAAACGAGGAGGTGAAGAACATGTCAGTAGAACTGAACTCAAAGCTTGAGAGTCTGCTGGAAGAGAAGACAGCCCTTCAACACAAGGTCAGGGCTTTGGAGGAGCAGCTAACCAACTTAATTCTAAGCCCAGCTGGGGCTCAGGAGCACCCAGAAGTAACATCACTCAAAAGTTTTGTAGAACAGCAAGACAACAGCATAAGAGAACTCCTCCAGAGTGTGGAAGAACAGTATAAACAATTAAGTCAACAGCACATGCAGATAAAAGAAATAGAAAAGCAGCTCAGAAAGACTGGTATTCAAGAACCCTCAGAAAATTCTCTTTCTTCTAAATCAAGAGCACCAAGAACTACTCCCCCTCTTCAACTGAACGAAACAGAAAATACAGAACAAGATGACCTTCCTGCCGACTGCTCTGCCGTTTATAACAGAGGCGAACATACAAGTGGCGTGTACACTATTAAACCAAGAAACTCCCAAGGGTTTAATGTCTACTGTGATACCCAATCAGGCAGTCCATGGACATTAATTCAACACCGGAAAGATGGCTCACAGGACTTCAACGAAACATGGGAAAACTACGAAAAGGGCTTTGGGAGGCTCGATGGAGAATTTTGGTTGGGCCTAGAGAAGATCTATGCTATAGTCCAACAGTCTAACTACATTTTACGACTCGAGCTACAAGACTGGAAAGACAGCAAGCACTACGTTGAATACTCCTTTCACCTGGGCAGTCACGAAACCAACTACACGCTACATGTGGCTGAGATTGCTGGCAATATCCCTGGGGCCCTCCCAGAGCACACAGACCTGATGTTTTCTACATGGAATCACAGAGCAAAGGGACAGCTCTACTGTCCAGAAAGTTACTCAGGTGGCTGGTGGTGGAATGACATATGTGGAGAAAACAACCTAAATGGAAAATACAACAAACCCAGAACCAAATCCAGACCAGAGAGAAGAAGAGGGATCTACTGGAGACCTCAGAGCAGAAAGCTCTATGCTATCAAATCATCCAAAATGATGCTCCAGCCCACCACCTAAGAAGCTTCAACTGAACTGAGACAAAATAAAAGATCAATAAATTAAATATTAAAGTCCTCCCGATCACTGTAGTAATCTGGTATTAAAATTTTAATGGAAAGCTTGAGAATTGAATTTCAATTAGGTTTAAACTCATTGTTAAGATCAGATATCACCGAATCAACGTAAACAAAATTTATC
>gi|68163568|ref|NM_001025065.1|ドブネズミ(Rattus norvegicus)アンジオポエチン様3(Angptl3)、mRNA
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カニクイザル(Macaca fascicularis)アンジオポエチン様3(Angptl3)、mRNA
GGGTAGTATATAGAGTTAAGAAGTCTAGGTCTGCTTCCAGAAGAACACAGTTCCACGCTGCTTGAAATTGAAAATCAGGATAAAAATGTTCACAATTAAGCTCCTTCTTTTTATTGTTCCTCTAGTTATTTCCTCCAGAATTGACCAAGACAATTCATCATTTGATTCTGTATCTCCAGAGCCAAAATCAAGATTTGCTATGTTAGACGATGTAAAAATTTTAGCCAATGGCCTCCTTCAGTTGGGACATGGTCTTAAAGACTTTGTCCATAAGACTAAGGGCCAAATTAATGACATATTTCAAAAACTCAACATATTTGATCAGTCTTTTTATGATCTATCACTGCAAACCAGTGAAATCAAAGAAGAAGAAAAGGAACTGAGAAGAACTACATATAAACTACAAGTCAAAAATGAAGAGGTAAAGAATATGTCACTTGAACTCAACTCAAAACTTGAAAGCCTCCTAGAAGAAAAAATTCTACTTCAACAAAAAGTGAAATATTTAGAAGAGCAACTAACTAACTTAATTCAAAATCAACCTGCAACTCCAGAACATCCAGAAGTAACTTCACTTAAAAGTTTTGTAGAAAAACAAGATAATAGCATCAAAGACCTTCTCCAGACTGTGGAAGAACAATATAAGCAATTAAACCAACAGCATAGTCAAATAAAAGAAATAGAAAATCAGCTCAGAATGACTAATATTCAAGAACCCACAGAAATTTCTCTATCTTCCAAGCCAAGAGCACCAAGAACTACTCCCTTTCTTCAGCTGAATGAAATAAGAAATGTAAAACATGATGGCATTCCTGCTGATTGTACCACCATTTACAATAGAGGTGAACATATAAGTGGCACGTATGCCATCAGACCCAGCAACTCTCAAGTTTTTCATGTCTACTGTGATGTTGTATCAGGTAGTCCATGGACATTAATTCAACATCGAATAGATGGATCACAAAACTTCAATGAAACGTGGGAGAACTACAAATATGGTTTCGGGAGGCTTGATGGAGAATTCTGGTTGGGCCTAGAGAAGATATACTCCATAGTGAAGCAATCTAATTACGTTTTACGAATTGAGTTGGAAGACTGGAAAGACAACAAACATTATATTGAATATTCTTTTTACTTGGGAAATCACGAAACCAACTATACGCTACATGTAGTTAAGATTACTGGCAATGTCCCCAATGCAATCCCGGAAAACAAAGATTTGGTGTTTTCTACTTGGGATCACAAAGCAAAAGGACACTTCAGCTGTCCAGAGAGTTATTCAGGAGGCTGGTGGTGGCATGATGAGTGTGGAGAAAACAACCTAAATGGTAAATATAACAAACCAAGAACAAAATCTAAGCCAGAGCGGAGAAGAGGATTATCCTGGAAGTCTCAAAATGGAAGGTTATACTCTATAAAATCAACCAAAATGTTGATCCATCCAACAGATTCAGAAAGCTTTGAATGAACTGAGGCAAATTTAAAAGGCAATAAATTAAACATTAAACTCATTCCAAGTTAATGTGGTTTAATAATCTGGTATTAAATCCTTAAGAGAAGGCTTGAGAAATAGATTTTTTTATCTTAAAGTCACTGTCAATTTAAGATTAAACATACAATCACATAACCTTAAAGAATACCATTTACATTTCTCAATCAAAATTCTTACAACACTATTTGTTTTATATTTTGTGATGTGGGAATCAATTTTAGATGGTCGCAATCTAAATTATAATCAACAGGTGAACTTACTAAATAACTTTTCTAAATAAAAAACTTAGAGACTTTAATTTTAAAAGTCATCATATGAGCTAATGTCACAATTTTCCCAGTTTAAAAAACTAGTTTTCTTGTTAAAACTCTAAACTTGACTAAATAAAGAGGACTGATAATTATACAGTTCTTAAATTTGTTGTAATATTAATTTCAAAACTAAAAATTGTCAGCACAGAGTATGTGTAAAAATCTGTAATATAAATTTTTAAACTGATGCCTCATTTTGCTACAAAATAATCTGGAGTAAATTTTTGATAGGATTTATTTATGAAACCTAATGAAGCAGGATTAAATACTGTATTAAAATAGGTTCGCTGTCTTTTAAACAAATGGAGATGATGATTACTAAGTCACATTGACTTTAATATGAGGTATCACTATACCTTAACATATTTGTTAAAACGTATACTGTATACATTTTGTGT
Claims (40)
- ANGPTL3の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(dsRNA)であって、前記dsRNAが、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号1のヌクレオチド配列と3つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15連続ヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号5のヌクレオチド配列と3つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15連続ヌクレオチドを含む、二本鎖リボ核酸(dsRNA)。
- ANGPTL3の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(dsRNA)であって、前記dsRNAが、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、表2、3、7、8、9及び10に列挙されるアンチセンス配列のいずれか1つと3つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15連続ヌクレオチドを含む相補性の領域を含む、二本鎖リボ核酸(dsRNA)。
- 前記センス鎖及びアンチセンス鎖が、表7及び8のAD−52981.1、AD−53063.1、AD−53001.1、AD−53015.1、AD−52986.1、AD−52953.1、AD−53024.1、AD−53033.1、AD−53030.1、AD−53080.1、AD−53073.1、AD−53132.1、AD−52983.1、AD−52954.1、AD−52961.1、AD−52994.1、AD−52970.1、AD−53075.1、AD−53147.1、AD−53077.1からなる群から選択される配列を含む、請求項2に記載のdsRNA。
- 少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項1又は2に記載のdsRNA。
- 前記修飾ヌクレオチドの少なくとも1つが、2’−O−メチル修飾ヌクレオチド、5’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、及びコレステリル誘導体又はドデカン酸ビスデシルアミド基に結合された末端ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項4に記載のdsRNA。
- 前記修飾ヌクレオチドが、2’−デオキシ−2’−フルオロ修飾ヌクレオチド、2’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、固定ヌクレオチド、非塩基性ヌクレオチド、2’−アミノ−修飾ヌクレオチド、2’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート、及び非天然塩基を含むヌクレオチドからなる群から選択される、請求項4に記載のdsRNA。
- 前記相補性の領域が、少なくとも17ヌクレオチド長である、請求項2に記載のdsRNA。
- 前記相補性の領域が、19〜21ヌクレオチド長である、請求項2に記載のdsRNA。
- 前記相補性の領域が、19ヌクレオチド長である、請求項8に記載のdsRNA。
- それぞれの鎖が、30ヌクレオチド長以下である、請求項1又は2に記載のdsRNA。
- 少なくとも1本の鎖が、少なくとも1つのヌクレオチドに3’オーバーハングを含む、請求項1又は2に記載のdsRNA。
- 少なくとも1本の鎖が、少なくとも2つのヌクレオチドに3’オーバーハングを含む、請求項1又は2に記載のdsRNA。
- リガンドを更に含む、請求項1又は2に記載のdsRNA。
- 前記リガンドが、dsRNAの前記センス鎖の3’末端にコンジュゲートされている、請求項13に記載のdsRNA。
- 前記リガンドが、N−アセチルガラクトサミン(GalNAc)誘導体である、請求項13に記載のdsRNA。
- 前記相補性の領域が、表2、3、7、8、9及び10のアンチセンス配列のうちの1つからなる、請求項2に記載のdsRNA。
- 表2、3、9及び10の配列から選択されるセンス鎖配列からなるセンス鎖と、表2、3、7、8、9及び10の配列から選択されるアンチセンス配列からなるアンチセンス鎖とを含む、請求項1又は2に記載のdsRNA。
- 請求項1又は2に記載のdsRNAを含有する細胞。
- dsRNAの少なくとも1本の鎖をコードするベクターであって、前記dsRNAが、ANGPTL3をコードするmRNAの少なくとも一部に相補性の領域を含み、前記dsRNAが、30塩基対以下の長さであり、前記dsRNAが、切断のために前記mRNAを標的とするベクター。
- 前記相補性の領域が、少なくとも15ヌクレオチド長である、請求項20に記載のベクター。
- 前記相補性の領域が、19〜21ヌクレオチド長である、請求項20に記載のベクター。
- 請求項20に記載のベクターを含む細胞。
- ANGPTL3遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物であって、請求項1又は2に記載のdsRNA又は請求項20に記載のベクターを含む医薬組成物。
- 脂質製剤を更に含む、請求項24に記載の医薬組成物。
- 前記脂質製剤が、SNALP、又はXTCを含む、請求項24に記載の医薬組成物。
- 前記脂質製剤が、MC3を含む、請求項24に記載の医薬組成物。
- 細胞内でのANGPTL3の発現の阻害方法であって、
a)前記細胞を、請求項1又は2に記載のdsRNA又は請求項20に記載のベクターと接触させる工程と;
b)工程(a)で生成された前記細胞を、ANGPTL3遺伝子のmRNA転写物の分解を得るのに十分な時間にわたって維持し、それにより、前記細胞内での前記ANGPTL3遺伝子の発現を阻害する工程と
を含む方法。 - 前記細胞が、対象中にある、請求項28に記載の方法。
- 前記対象がヒトである、請求項29に記載の方法。
- 前記ヒト対象が、脂質代謝障害に罹患している、請求項30に記載の方法。
- 前記脂質代謝障害が、高脂血症又は高トリグリセリド血症である、請求項31に記載の方法。
- 前記ANGPTL3の発現が、少なくとも約30%阻害される、請求項28〜32のいずれか一項に記載の方法。
- ANGPTL3の発現の低下から利益を得られ得る障害に罹患している対象の処置方法であって、治療有効量の請求項1又は2に記載のdsRNA又は請求項20に記載のベクターを前記対象に投与し、それにより、前記対象を処置する工程を含む方法。
- 前記障害が、脂質代謝障害である、請求項34に記載の方法。
- 前記脂質代謝障害が、高脂血症又は高トリグリセリド血症である、請求項35に記載の方法。
- 前記対象への前記dsRNAの前記投与が、1つ又は複数の血清脂質の減少及び/又はANGPTL3タンパク質の蓄積の低下を引き起こす、請求項34に記載の方法。
- 前記dsRNAが、約0.01mg/kg〜約10mg/kg又は約5mg/kg〜約50mg/kgの用量で投与される、請求項34に記載の方法。
- 対象におけるANGPTL3の発現の阻害方法であって、治療有効量の請求項1又は2に記載のdsRNA又は請求項20に記載のベクターを前記対象に投与し、それにより、前記対象におけるANGPTL3の発現を阻害する工程を含む方法。
- 前記dsRNAが、約0.01mg/kg〜約10mg/kg又は約5mg/kg〜約50mg/kgの用量で前記対象に投与される、請求項39に記載の方法。
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