JP2017517499A - 脳中の転移乳癌および他の癌を処置するための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
出願人は、電子的形態で提出される配列表資料を引用することにより本明細書に組み込む。本ファイルは「14−7028PCT_ST25.txt」と表示される。
本明細書に記述される組成物およびレジメンは抗悪性腫瘍免疫グロブリン構築物の中枢神経系への送達に有用である。AAV−Igを含んでなる本明細書に記述される組成物は、中枢神経系(CNS)の癌(腫瘍)および具体的には脳中に位置するものに十分に適する。
クローナル抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、細胞内抗体(「イントラボディ(intraobodies)」、組換え抗体、多特異性抗体、Fv、Fab、F(ab)2、F(ab)3、Fab’、Fab’−SH、F(ab’)2のような抗体フラグメント、一本鎖可変フラグメント抗体(scFv)、タンデム/ビスscFv、Fc、pFc’、scFvFc(若しくはscFv−Fc)、ジスルフィドFv(dsfv)、BiTE抗体のような二特異性抗体(bc−scFv);ラクダ科動物の(camelid)抗体、表面再構成(resurfaced)抗体、ヒト化抗体、完全にヒトの抗体、単一ドメイン抗体(sdAb、NANOBORY(登録商標)としてもまた知られる)、キメラ抗体、最低1個のヒト定常領域を含んでなるキメラ抗体などを包含する多様な形態で存在しうる。「抗体フラグメント」は、その標的例えば腫瘍細胞に結合する免疫グロブリンの可変領域の少なくとも一部分を指す。
ノ酸配列、ならびにトラスツズマブのX線構造の研究から得られる配列は、受託番号DB00072でこのデータベース上で提供され、この配列は引用することにより本明細書に組み込まれる。212−Pb−TCMC−trastuzumab[Areva Med、メリーランド州ベセスダ]もまた参照されたい。目的の別の抗体は、例えばペルツズマブ、すなわちヒト上皮成長因子受容体2タンパク質(HER2)の細胞外二量体化ドメイン(サブドメインII)を標的とする組換えヒト化モノクローナル抗体を包含する。それはそれぞれ448および214残基を有する2本の重鎖および2本の軽鎖よりなる。FDA承認2012年6月8日。その重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、例えば、www.drugbank.ca/drugs/DB06366(異名は2C4、MOAB 2C4、モノクローナル抗体2C4およびrhuMAb−2C4を包含する)中のこのデータベース上に受託番号DB06366で提供される。HER2に加え、他のHER標的を選択しうる。
α)若しくはCD140、腫瘍関連糖タンパク質72(TAG−72)、テネイシンC、腫瘍壊死因子(TNF)受容体(TRAIL−R2)、血管内皮増殖因子(VEGF)A(例えばベバシズマブにより標的とされる)ならびにVEGFR2(例えばラムシルマブにより標的とされる)を包含する。他の抗体およびそれらの標的は、例えばモノクローナル抗体APN301(hu14.19−IL2)[小児における悪性黒色腫および神経芽腫、Apeiron Biologics、オーストリア・ウィーン]を包含する。例えば、転移乳癌を包含する充実性腫瘍の処置に有用であると記述されているモノクローナル抗体8H9もまた参照されたい。モノクローナル抗体8H9はB7H3抗原に対する特異性をもつマウスIgG1抗体である[United Therapeutics Corporation]。このマウス抗体はヒト化され得る。B7−H3および/若しくはB7−H4抗原を標的とするなお他の免疫グロブリン構築物を本発明で使用しうる。別の抗体はS58(抗GD2、神経芽腫)である。CotaraTM[Perregrince Pharmaceuticals]は再発性膠芽腫の処置について記述されているモノクローナル抗体である。他の抗体は、例えばアバスチン、フィクラツズマブ(ficlatuzumab)、medi−575およびオララツマブ(olaratumab)を包含しうる。なお他の免疫グロブリン構築物若しくはモノクローナル抗体を本発明での使用のため選択しうる。例えば、Medicines in Development Biologics,2013 Report、pp.1−87、PhRMA’s Communications&Public Affairs Departmentの刊行物。(202)835−3460(本明細書に引用することにより組み込まれる)を参照されたい。
れるとおり設計されたコドン最適化されたコーディング領域を合成するために利用可能である。こうした改変若しくは合成は、当業者に公知の標準かつ慣例の分子生物学的操作を使用して実施し得る。1アプローチにおいて、長さ各80〜90ヌクレオチドのかつ所望の配列の長さにわたる一連の相補オリゴヌクレオチド対を標準的方法により合成する。アニーリングに際してそれらが付着端を含有する80〜90塩基対の二本鎖フラグメントを形成するようなこれらのオリゴヌクレオチド対を合成し、例えば、該対中の各オリゴヌクレオチドを、該対中の他のオリゴヌクレオチドに相補的である領域を超え3、4、5、6、7、8、9、10若しくはそれ以上の塩基を伸長するように合成する。オリゴヌクレオチドの各対の一本鎖端を、オリゴヌクレオチドの別の対の一本鎖端とアニーリングするよう設計する。該オリゴヌクレオチド対をアニーリングさせ、そしてこれら二本鎖フラグメントのおよそ5ないし6個をその後、付着一本鎖端を介して一緒にアニーリングさせ、そしてその後それらを一緒に連結し、そして標準的細菌クローニングベクター、例えばInvitrogen Corporation、カリフォルニア州カールズバッドから入手可能なTOPO(登録商標)ベクター中にクローン化する。該構築物をその後標準的方法によりシークエンスする。一緒に連結された80ないし90塩基対フラグメントの5ないし6フラグメント、すなわち約500塩基対のフラグメントよりなるこれら構築物のいくつかを製造し、その結果所望の配列全体が一連のプラスミド構築物中で表示される。これらプラスミドの挿入物をその後適切な制限酵素で切断し、そして一緒に連結して最終構築物を形成する。該最終構築物をその後標準的細菌クローニングベクターにクローン化しかつシークエンスする。付加的な方法は当業者に直ちに明らかであろう。加えて、遺伝子合成は容易に商業的に利用可能である。
方法およびコンピュータプログラムが当業者に利用可能かつ公知である。本出願で言及されるアミノ酸位置は配列番号3および25(重鎖)ならびに配列番号4(軽鎖)中で提供されるところのトラスツズマブの番号付けに基づく。置換は、(1文字記号により特定されるアミノ酸)−位置番号−(1文字記号により特定されるアミノ酸)としてもまた書くことができ、それにより第一のアミノ酸は置換されるアミノ酸でありかつ第二のアミノ酸は指定される位置の置換するアミノ酸である。本明細書で使用されるところの「置換」および「アミノ酸の置換」ならびに「アミノ酸置換」という用語は、アミノ酸配列中の1アミノ酸の別のものでの置換を指し、ここで後者は置き換えられるアミノ酸と異なる。アミノ酸の置換方法は当業者に公知であり、そして限定されるものでないが該アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の突然変異を挙げることができる。IgG中のアミノ酸置換の作成方法は、例えば、アミノ酸改変技術のその議論について引用することにより組み込まれる第WO2013/046704号明細書について記述されるとは言え、この文書は本明細書に記述されるところの結合親和性を低下若しくは除去することよりむしろFcRn親和性を増大することを記述する。
a279)、P257(配列番号25のaa280)、P271(配列番号25のaa294)、T307(配列番号25のaa330)、Q311(配列番号25のaa334)、D376(配列番号25のaa399)、E380(配列番号25のaa403)、M428(配列番号25のaa451)および/若しくはN434(配列番号25のaa457)、または相互との若しくは本明細書に記述される他の改変とのこれらの組合せ1種若しくはそれ以上のような、FcRnに機能的に結合することに関与する他の位置を変異させうる。他の適する改変は、I253(配列番号25のaa276)、S254(配列番号25のaa277)、K288(配列番号25のaa311)、V305(配列番号25のaa328)、Q311(配列番号25のaa334)、D312(配列番号25のaa335)、K317(配列番号340のaa340)、K360(配列番号25のaa383)、Q362(配列番号25のaa385)、E380(配列番号25のaa403)、S415(配列番号25のaa438)、S424(配列番号25のaa447)、H433(配列番号25のaa456)、N434(配列番号25のaa457)、H435(配列番号25のaa458)および/若しくはY436(配列番号25のaa459)、または2種若しくはそれ以上の組合せに配置しうる。上述されたとおり、他のIgG重鎖CH2およびCH2中の対応する位置を選択しうる。本明細書の「1若しくはそれ以上」への言及は、例えば1、2、3、4、5、の個別の態様を包括することを意図している。付加的な態様において、「1若しくはそれ以上」という用語は、トラスツズマブ重鎖可変領域配列番号3、軽鎖可変領域配列番号4、重鎖配列番号25若しくは本明細書で同定される別のアミノ酸配列に対する最低約85%の同一性、最低90%の同一性、最低約95%の同一性若しくは最低約99%の同一性を生じるとみられる、本明細書に記述されるポリペプチド中の多数の置換を包含する。
Devel Ther、2009、3;7−16、オンライン公開2009年9月21日。GA Lazarら、Proc Natl Acad Sci、vol.103、no.11、p.4005−4010(Mar 14,2006);およびGL Mooreら、MAbs、2010 Mar−Apr;2(2):181−189に記述されている。
of Proteins of Immunological Interest.No.91−3242 U.S.Public Health Services、National Institutes of Health、ベセスダ)を包含する。
ズマブのアミノ酸配列は、例えばP.Carterら、Proc Natl Acad Sci.、89:4285−4289(May 1982)に記述されている。トラスツズマブ重鎖のアミノ酸配列は図1に提供され、配列表[配列番号25]およびEU番号付け体系双方を示す。トラスツズマブ重鎖可変領域のアミノ配列は[配列番号3]に示され、また、トラスツズマブ軽鎖可変領域は付属として付けられる配列表[配列番号4]に提供される。トラスツズマブを発現するため、ヒトにおけるトラスツズマブポリペプチドの最適の発現のため選択されたコドンを含有する新規核酸分子が設計された。さらに、該新規核酸分子は、可変および定常領域から構成される重および軽鎖ポリペプチドの上流に融合されたIL−2シグナルリーダーペプチドをコードするトラスツズマブの各重鎖および軽鎖にとって異種のリーダー配列を包含する。しかしながら、別の異種リーダー配列をIL−2シグナル/リーダーペプチドの一方若しくは双方の代わりに使用しうる。シグナル/リーダーペプチドは、各重鎖および軽鎖免疫グロブリン構築物について同一若しくは異なることができる。これらは免疫グロブリン(例えばIgG)中に天然に見出されるシグナル配列でありうるか、若しくは異種供給源からでありうる。こうした異種供給源は、とりわけ、サイトカイン(例えばIL−2、IL12、IL18など)、インスリン、アルブミン、β−グルクロニダーゼ、アルカリプロテアーゼ若しくはフィブロネクチン分泌シグナルペプチドでありうる。プロモーター(1種若しくは複数)は、多様な供給源、例えばヒトサイトメガロウイルス(CMV)前初期エンハンサー/プロモーター、SV40初期エンハンサー/プロモーター、JCポリモウイルス(polymovirus)プロモーター、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)若しくはグリア線維酸性タンパク質(GFAP)プロモーター、単純疱疹ウイルス(HSV−1)潜伏関連プロモーター(LAP)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)末端反復配列(LTR)プロモーター、ニューロン特異的プロモーター(NSE)、血小板由来増殖因子(PDGF)プロモーター、hSYN、メラニン凝集ホルモン(MCH)プロモーター、CBA、マトリックスメタロプロテインプロモーター(MPP)およびニワトリβ−アクチンプロモーターから選択し得る。
は配列番号1の核酸2407ないし2711に配置される。
トは多様な公的若しくは商業的に利用可能な多配列アライメントプログラムのいずれかを使用して実施する。配列アライメントプログラム、例えば「Clustal X」、「MAP」、「PIMA」、「MSA」、「BLOCKMAKER」、「MEME」および「Match−Box」プログラムがアミノ酸配列に利用可能である。一般に、これらのプログラムのいずれもデフォルトの設定で使用されるとは言え、当業者はこれらの設定を必要とされるとおり変更し得る。あるいは、当業者は、少なくとも、参照されるアルゴリズムおよびプログラムにより提供されるもののような同一性若しくはアライメントの水準を提供する別のアルゴリズム若しくはコンピュータプログラムを利用し得る。例えば、J.D.Thomsonら、Nucl.Acids.Res.、“A comprehensive comparison of multiple sequence alignments”、27(13):2682−2690(1999)を参照されたい。
免疫グロブリン構築物配列を移入するAAVベクターを生成するために有用な遺伝要素(例えばプラスミド)中に操作される。選択されるベクターは、トランスフェクション、電気穿孔法、リポソーム送達、膜融合技術、高速DNA被覆ペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合を包含するいずれかの適する方法によりAAVパッケージング細胞に送達しうる。安定なパッケージング細胞もまた作成し得る。こうした構築物を作成するのに使用される方法は核酸操作の当業者に既知であり、そして遺伝子工学、組換え工学および合成技術を包含する。例えば、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、GreenとSambrook編、Cold Spring
Harbor Press、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー(2012)を参照されたい。
本明細書に記述されるところのAAVベクターは、そのそれぞれが抗悪性腫瘍免疫グロブリン構築物の重および/若しくは軽鎖ポリペプチドまたは他のポリペプチドの1種若しくはそれ以上をコードする1種若しくはそれ以上の核酸配列を含み得る。適しては、組成物はin vivoで抗悪性腫瘍構築物を形成するポリペプチドの全部を含有する1種若しくはそれ以上のAAVベクターを含有する。例えば、完全長抗体は4個のポリペプチドすなわち重(H)鎖ポリペプチドの2個の同一のコピーおよび軽(L)鎖ポリペプチドの2コピーよりなる。重鎖のそれぞれは1個のN末端可変(VH)領域および3個のC末端定常(CH1、CH2およびCH3)領域を含有し、ならびに各軽鎖は1個のN末端可変(VL)領域および1個のC末端定常(CL)領域を含有する。軽および重鎖の各対の可変領域は抗体の抗原結合部位を形成する。この点に関して、本明細書に記述されるところのAAVベクターは、免疫グロブリン構築物の2個の重鎖ポリペプチド(例えば定常、可変(conant variable)および2個の軽鎖ポリペプチドをコードする単一核酸配列を含み得る。あるいは、AAVベクターは、最低1個の重鎖定常ポリペプチドおよび最低1個の重鎖可変ポリペプチドをコードする第一の発現カセット、ならびに免疫グロブリン構築物の双方の軽鎖ポリペプチドをコードする第二の発現カセットを含み得る。なお別の態様において、AAVベクターは、第一の重鎖ポリペプチドをコードする第一の発現カセット、第二の重鎖ポリペプチドをコードする第二の発現カセット、第一の軽鎖ポリペプチドをコードする第三の発現カセット、および第二の軽鎖ポリペプチドをコードする第四の発現カセットを含み得る。
ITRの他の供給源を利用しうる。
の細胞の一過性トランスフェクションにより供給し得るか、若しくは、細胞を、ヘルパー機能をコードする遺伝子を安定に含有するように操作することができ、その発現を転写若しくは翻訳後レベルで制御し得る。なお別の系において、ITRおよびrep/cap遺伝子により隣接されている導入遺伝子を、バキュロウイルスに基づくベクターへの感染により昆虫細胞中に導入する。これら産生系に関する総説については、全般として、例えばZhangら、2009、“Adenovirus−adeno−associated
virus hybrid for large−scale recombinant adeno−associated virus production”、Human Gene Therapy 20:922−929(その各内容はそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる)を参照されたい。これらおよび他のAAV産生系の作成および使用方法は、以下の米国特許(その各内容はそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる)すなわち第5,139,941号明細書;第5,741,683号明細書;第6,057,152号明細書;第6,204,059号明細書;第6,268,213号明細書;第6,491,907号明細書;第6,660,514号明細書;第6,951,753号明細書;第7,094,604号明細書;第7,172,893号明細書;第7,201,898号明細書;第7,229,823号明細書;および第7,439,065号明細書にもまた記述されている。
とみなされる一語で記述されるもののような他者を包含する他のAAVが、本明細書に記述されるAAVベクターを製造するために選択しうる。
適するのは、本発明の組成物は、AAVベクターが、免疫グロブリン構築物、および選択された細胞中でその免疫グロブリンの発現を命令する制御配列をコードする核酸発現カセットを所持するように設計される。CNS中への該ベクターの投与後に、ベクターは発現カセットをCNSに送達し、そしてタンパク質性免疫グロブリン構築物をin vivoで発現する。抗悪性腫瘍の方法における本明細書に記述される組成物の使用が、1種若しくはそれ以上の他の抗悪性腫瘍若しくは他の有効な剤の送達を場合によっては必要としうる抗悪性腫瘍レジメンでのこれらの組成物の使用がそうであるように、記述される。
でのCSFを取り出し、およびその中でベクターを該CSFと混合かつ/若しくは適合性の担体に懸濁しそして被験体に送達する脊椎穿刺を実施する。一例において、ベクター濃度は約3×1013GC、しかし約1×109GC、約5×109GC、約1×1010GC、約5×1010GC、約1×1011GC、約5×1011GC、約1×1012GC、約5×1012GC若しくは約1.0×1013GCのような他の量である。
ない。
GFPおよびmAbの双方が、5×1012ゲノムコピー(gc)/kgのCMV若しくはCB7いずれかのプロモーター下にGFP導入遺伝子を含有するAAV9ベクターの大槽内注入後にカニクイザルのCNSで発現されている。14日後に、マカクを剖検しかつ組織学および生体分布研究を実施した。剖検後組織学的分析は、大脳、小脳、脈絡叢、髄膜および脊髄前角におけるGFPの広範なCSN発現を示した。
アカゲザル抗SIV mac251 gp120 IgG−201(Glamannら
J Virol.1998;74(15):7158−7163.doi:10.1128/JVI.74.15.7158−7163.2000.更新。)イムノアドヘシン(201IA)のコドン最適化されたヌクレオチド配列を、AAV発現構築物中にクローン化した。該構築物はAAV2末端逆位配列により隣接され、そしてCB7プロモーター、キメライントロンおよびウサギグロビンポリアデニル化配列を含有した(pAAV.CB7.CI.201IA.rBG)。
201IA遺伝子に相補的しかし重鎖アミノ酸配列のI253A[配列番号24はこの突然変異をもつCH2.CH3フラグメントを提供する]若しくはH453A[配列番号23はこの突然変異をもつCH2.CH3フラグメントを提供する](Kabatの番号付け)に対応する突然変異を含有する、ヌクレオチド配列長さ768bpを、GeneArt(Life Technologies)から得た。該配列はpAAV.CB7.CI.201IA.rBG中のものに一致するPst1およびBstZ17I制限部位により隣接された。該変異された配列を、製造元により記述されるとおり、示される酵素(NEB)を使用する制限消化および連結(TaKaRa Inc.)によりpAAV.CB7.CI.201IA.rBGに別個にクローン化した。サンガーシークエンシング(GeneWiz)を使用して、pAAV.CB7.CI.201IA.rBG[配列番号5(配列番号6はコードされる201IA配列に対応する)]、pAAV.CB7.CI.201IA(I253A).rBG[配列番号7(配列番号8をコードする)]およびpAAV.CB7.CI.201IA(H435A).rBG[配列番号9(配列番号10をコードする]の相補性を、所望の突然変異のいずれの側でも確認した。
3×108HEK293細胞(293細胞)を、10%FBSおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシンで補充されたダルベッコ変法イーグル培地(DMEM、Corning CellGro)(DMEM complete)中で10スタックCellSTACK(登録商標)(Corning)中に播種し、そして37℃ 5%CO2で48時間インキュベートした。TE緩衝液(Qiagen)中の1mgのpAAV.CB7.CI.201IA.rBG若しくはpAAV.CB7.CI.201IA(I253A).r
BGを42mLの室温の抗生物質および血清を含まないDMEMで希釈した。1mg/mLおよびpH7.1の2mLのPEI−Max 40kDa、直鎖状(Polysciences)を、42mLの室温の抗生物質および血清を含まないDMEMで別個に希釈した。希釈されたDNAおよび希釈されたPEIを組合せそして室温で15分間インキュベートした。DNA−PEI混合物を1L最終容量の抗生物質および血清を含まないDMEMに添加した。293T細胞を無菌PBSで2回洗浄した。該DNA−PEI DMEM混合物を添加し、そして細胞とともに37℃ 5%CO2で72時間インキュベートした。上清を収集し、そして3000×gで10分間遠心分離して細胞破片をペレットにした。上清をその後、製造元の説明書に従ってCentrikon(登録商標)Plus−70遠心式フィルターユニット(EMD Millipore)を使用して濃縮した。201IA若しくは201IA(I253A)をその後、プロテインA抗体精製キット(Sigma)を使用して精製し、そしてNanoDrop 2000(Thermo Scientific)を使用して定量した。精製されたIAをその後、グリセロールを使用して1mg/mLに希釈しかつ−20℃で保存した。
NuPage試薬(Life Technologies)を使用するSDS−PAGEを製造元の説明書に従って実施した。簡潔には、1μgの201IA、201IA(I253A)若しくは201IA(H453A)を293上清から精製したか、または、組織内で以前に精製された201IAを、NuPage試料緩衝液およびNuPage還元剤と混合しかつ70℃で10分間加熱した。プレキャストNuPage 4−12%ビス−トリス1mmアクリルアミドゲルに試料およびMagicMark XPウエスタンタンパク質標準(LifeTechnologies)を負荷し、そして1×NuPage
MOPS SDS泳動緩衝液中200Vで1時間泳動した。Trans−Blot(登録商標)TurboTM 1×転写装置(BioRad)を使用してタンパク質をLF PVDFメンブレンに転写した。イオンリザーバースタックを1×Trans−Blot(登録商標)TurboTM(TBT)転写緩衝液で2〜3分間濡らした。プレカットLF PVDFメンブレンを透明まで100%エタノールに浸漬し、その後1×TBT緩衝液に2〜3分間移した。転写スタックを組み立て、そして1.3Aおよび25Vで7分間泳動した。該LF PVDFメンブレンを、1×NET緩衝液+2%ゼラチン(二重蒸留されたH2O中50mMトリスHCL、pH7、125mM NaCl、5mM EDTA pH8、0.05%Triton X−100、2%ゼラチン)中で穏やかな振とうを伴い一夜ブロッキングした。ビオチンに結合されたヤギ抗ヒトIgGポリクローナル抗体(Abcam)を1×NET+2%ゼラチンで希釈し、そしてメンブレンとともに室温でインキュベートし、1×NETで洗浄し、1×NET+2%ゼラチンで希釈されたストレプトアビジン−ワサビペルオキシダーゼ(Abcam)とともにインキュベートし、そして1×NETで洗浄した。ウエスタンブロットを、製造元のプロトコルに従いSuperSignal(登録商標)West Pico化学発光基質(Thermo Scientific)を使用して検出した。画像は、高解像度化学発光自動設定を伴うBioRad
ChemiDocTM MP画像装置(Thermo Scientific)を使用して撮影した。
全部の手順は別の方法で示されない限り室温で実施した。プレートを、PBS+0.05%Tween−20を使用してBioTek 405TSマイクロプレート洗浄装置で洗浄した。PBSで2μg/mLに希釈されたmac251 gp120(Immune
Technology Corp.)を、Costar(登録商標)96ウェルEasyWashTM ELISAアッセイプレート(Corning)上4℃で一夜インキュベートした。プレートがその後、201IA ELISAブロッキング緩衝液(PBS+5%熱不活性化ウシ胎児血清+1mM EDTA+0.07%Tween−20)でブロッ
キングされた。希釈された試料をプレートに添加しかつプレートを2倍に最低4回希釈した。プレートを37℃で1hインキュベートし、そして201IA ELISAブロッキング緩衝液中で再度ブロッキングした。プレートをその後、PBSで希釈されたAffiniPureポリクローナルヤギ抗ヒトIgG−ビオチン(Jackson ImmunoResearch Labs)、その後PBSで希釈されたストレプトアビジン−ワサビペルオキシダーゼ(Abcam)とともにインキュベートした。3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)基質を使用してプレートを発色させた。H2SO4で発色反応を停止した後に、プレートを、SpectraMax M3(Molecular
Devices)プレートリーダーを使用して450nmで読み取った。
pAAV.CB7.CI.201IA.rBGおよびpAAV.CB7.CI.201IA(I253A).rBGを、M.Lockら、Hum Gene Ther.2010 Oct;21(1);1259−1271、オンライン公開2010年9月24日に以前に記述されたとおり、293細胞の三重トランスフェクションによりAAV9キャプシドにパッケージングしかつ精製した。
全部の動物は、研究における動物の管理と使用についてのNIHおよびUSDAのガイドラインに従って飼養した。C57BL/6バックグラウンドの6〜8週齢雌性Rag1−/−(Jackson Labs #002216)、FcRn−/− Rag1−/−(Jackson Labs #017700)若しくはヒトFcRnトランスジェニックマウス(mFcRn−/− hFcRn+/+、Jackson Labs #016919)を得、そしてペンシルバニア大学(University of Pennsylvania)で飼育した。
を−80℃で保ち、そして血清201IA濃度を測定するためにD部で上述された201IA ELISAで使用した。
3〜5kgの間の体重である4匹の3〜4年齢雌性カニクイザルを、研究における動物の管理と使用についてのNIHおよびUSDAのガイドラインに従って、ペンシルバニア大学で12時間の明/暗周期でステンレス鋼製ケージングに収容した。動物を試験の開始前7週馴化させた。サルに霊長類飼料(Primate Diet)5049(PMI Feeds Inc.)を与えた。水は自動給水装置から任意に与えた。
乳癌脳転移の十分に公表されたマウス異種移植モデルを使用して、CNSで発現されるトラスツズマブが生存を延長若しくは腫瘍量を軽減するかどうかを確認する[Martinez−Aranda Aら、Development of a Preclinical Therapeutic Model of Human Brain Metastasis with Chemoradiotherapy.Int J Mol Sci.2013;14:8306−8327]。HER2陽性ヒトBT474乳管癌細胞をルシフェラーゼでトランスフェクトし、そしてヌードマウスの脳実質に定位注入する。腫瘍サイズを発光強度により監視することができる。腫瘍が10mm2に増殖する場合に、マウスに、トラスツズマブ導入遺伝子を運搬する変動する濃度のAAV9ベクターを脳室内注入することができる。
法は、延長された生存、無増悪生存ならびに/または腫瘍量の軽減および/若しくは安定化を提供するはずである。
トラスツズマブの重および軽鎖のWHO公表されたヌクレオチド配列に一致する配列をGeneArt(Life Technologies)から得た。軽鎖配列はEcoRVおよびBsiW1制限部位により隣接され、そして重鎖配列はXba1およびSal1制限部位により隣接され[該核酸配列は、トラスツズマブ重鎖可変(配列番号12)、重鎖定常(配列番号13)、軽鎖可変(配列番号14)、κ鎖(配列番号15)およびAmp−R(配列番号16)をコードする配列番号11に提供されている]、こうしてトラスツズマブ重および軽鎖を含有するプラスミドの配列を提供する。
3×108HEK293細胞[ATCCから得られた]を、10スタックCellSTACK(登録商標)中でDMEM complete中37℃ 5%CO2で48時間播種した。1mgのpAAV.CMV.CI.trastuzumab.SV40(A部に記述された)を42mLの室温の抗生物質および血清を含まないDMEMで希釈した。1mg/mLかつpH7.1の2mLのPEI−Max 40KDa、直鎖状(Polysciences)を、42mLの室温の抗生物質および血清を含まないDMEMで別個に希釈した。希釈されたDNAおよび希釈されたPEIを組合せそして室温で15分間インキュベートした。該DNA−PEI混合物を1Lの最終容量の抗生物質および血清を含まないDMEMに添加した。293細胞を無菌PBSで2回洗浄し、そして細胞をその後DNA−PEI DMEM混合物とともに72時間インキュベートした。上清を収集し、3000×gで10分間遠心分離して細胞破片をペレットにし、そして製造元の説明書に従い、Centricon(登録商標)Plus−70遠心式フィルターユニット(EMD
Millipore)を使用して濃縮した。トラスツズマブをその後、プロテインA抗体精製キット(Sigma)を使用して精製し、そしてNanoDrop 2000(Thermo Scientific)を使用して定量した。精製されたトラスツズマブを、グリセロールを使用して1mg/mLに希釈しかつ−20℃で保存した。
NuPage試薬(Life Technologies)を使用するSDS−PAGEを製造元の説明書に従って実施した。簡潔には、本実施例のB部に記述されたとおり293上清から精製された1μgのトラスツズマブ、若しくはPBSに再懸濁されたトラスツズマブ臨床生成物(Hoffmann−La Roche、HUP Pharmacy)を、NuPage試料緩衝液およびNuPage還元剤と混合しかつ70℃で10分間加熱した。プレキャストNuPAGE(登録商標)4−12%勾配ビス−トリス(中性のpH)1mmアクリルアミドゲルに試料およびMagicMarkTM XPウエスタンタンパク質標準(LifeTechnologies)を負荷し、そして1×NuPage(登録商標)3−モルホリノプロパン−1−スルホン酸(MOPS)SDS泳動緩衝液中200Vで1時間泳動した。Trans−Blot(登録商標)TurboTM 1×転写システム(BioRad)を使用して、タンパク質を低蛍光(LF)フッ化ポリビニリデ
ン(PVDF)メンブレンに転写した。イオンリザーバースタックを1×Trans−Blot(登録商標)TurboTM(TBT)転写緩衝液で2〜3分間濡らした。プレカットLF PVDFメンブレンを透明まで100%エタノールに浸漬し、その後1×TBT緩衝液に2〜3分間移した。転写スタックを組み立て、そして1.3Aおよび25Vで7分間泳動した。該LF PVDFメンブレンを、1×NET緩衝液+2%ゼラチン(二重蒸留H2O中50mMトリスHCl pH7、125mM NaCl、5mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)pH8、0.05%TritonTM X−100(TritonTM X−100は親水性ポリエチレンオキシド鎖および芳香族炭化水素親油すなわち疎水性基を有する非イオン性界面活性剤であり)、2%ゼラチン)中で穏やかな振とうを伴い一夜ブロッキングした。ビオチンに結合されたヤギ抗ヒトIgGポリクローナル抗体(Abcam)を1×NET+2%ゼラチンで希釈し、そしてメンブレンと室温でインキュベートし、1×NETで洗浄し、1×NET+2%ゼラチンで希釈されたストレプトアビジン−ワサビペルオキシダーゼ(Abcam)とインキュベートし、そして1×NETで洗浄した。ウエスタンブロットを、製造元のプロトコルに従いSuperSignal(登録商標)West Pico化学発光基質(Thermo Scientific)を使用して検出した。画像は、高解像度化学発光自動設定を伴うBioRad ChemiDocTM MP画像システム(Thermo Scientific)を使用して撮影した。
pAAV.CMV.CI.trastuzumab.SV40は293細胞の三重トランスフェクションによりAAV9キャプシドにパッケージングし、そして以前に記述された(Lockら、2010、上で引用される)とおり精製した。
トラスツズマブのミモトープのELISAを、以前に記述された(Jiangら J Biol Chem.2005 Feb 11;280(6):4656−62.電子出版(Epub)2004年11月9日)とおり開発した。全部の段階は別の方法で述べられない限り室温で実施した。プレートをBioTek 405TSマイクロプレート洗浄装置で洗浄した。トラスツズマブが結合するHER2のエピトープのペプチドミモトープLLGPYELWELSH[配列番号22]を該ミモトープから得、DMSOに再懸濁しかつ−80℃で保存した。Costar(登録商標)96ウェルEasyWashTM ELISAアッセイプレート(Corning)を、100mM重炭酸塩溶液(pH9.6)中1μg/mLのLLGPYELWELSH[配列番号22]で被覆し、4℃で一夜インキュベートし、そしてトラスツズマブELISAブロッキング緩衝液(TEB、PBS+5%ウシ血清アルブミン+1mM EDTA+0.07%Tween−20)でブロッキングした。試料をTEBで希釈しかつプレーティングし、TEBでELISAプレートを2倍に希釈しかつインキュベートした。プレートをその後、TEBで希釈されたAffiniPureポリクローナルヤギ抗ヒトIgG−ビオチン(Jackson ImmunoResearch Labs)、次いでTEBで希釈されたストレプトアビジン−ワサビペルオキシダーゼ(Abcam)とインキュベートした。プレートをTMB基質で発色させ、2N H2SO4で停止し、その後SpectraMax M3(Molecular Devices)プレートリーダーを使用して450nmで読み取った。
C57BL/6バックグラウンドの6〜8週齢雌性Rag1−/−マウス(Jackson Labs #002216)を得かつペンシルバニア大学で飼育し、そして研究における動物の管理と使用についてのNIHおよびUSDAのガイドラインに従って飼養した。
継代27のHER2+BT474.M1ヒト乳管癌細胞はLouis ChodoshとJason Ruthから恵与された。[BT474.MI細胞はカリフォルニア太平洋医療センター(California Pacific Medical Center)から得ることができるBT474のサブクローンであり;Si Tuen Lee−Hoeflichら、Cancer Res July 15、2008 68;5878。]細胞を、10%FBSおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシンで補充されたDMEM/F12培地(Corning Cellgro)(DMEM/F12 complete)中、T75組織培養フラスコ(Corning)中で増殖させた。VSVG.
HIV.SIN.cPPT.CMV.ff−luciferase.WPREレンチウイルスベクターをPenn Vector Coreから得た[E.Copriniら、Viruses、Aug 2010、2(8):1577−1588。]BTB474−M1細胞が60〜70%コンフルエントになった場合に、培地を吸引し、細胞を無菌PBSで洗浄し、トリプシン処理しかつ計数した。2mLのDMEM/F12 complete中の2.5×105細胞を6ウェル組織培養処理済みプレート(Falcon)のウェルに添加し、そして37℃ 5%CO2で一夜インキュベートした。ベクターを、抗生物質および血清を含まないDMEM/F12で3.5×108VG/mLに希釈し、そして5回の2倍連続希釈を調製した。6種のベクター希釈の1mLを、PBS洗浄されたBT474−M1細胞および1mLの抗生物質および血清を含まないDMEM/F12を含有する6ウェルプレートの対応するウェルに添加した。プレートを37℃ 5%CO2で48時間インキュベートした。培地を吸引しそしてDMEM/F12 completeで置き換えた。細胞病理は顕微鏡検査により示されなかった。別の72時間後に、最高濃度のベクターを受領した3ウェル中の細胞を無菌PBSで洗浄し、トリプシン処理し、混合し、そしてT75フラスコ中、DMEM/F12 complete中で培養した。37℃ 5%CO2で72時間後に、細胞をトリプシン処理しかつ200μLのDMEM/F12 completeあたり1細胞の濃度に希釈した。ウェルあたり200μLの細胞懸濁液を96ウェル組織培養処理済みプレート(Falcon)にプレーティングし、そして37℃ 5%CO2で6週間インキュベートした。培地を2週ごとに変えた。プレーティング2週後に、クローン細胞の単一コロニーを含むウェルが顕微鏡検査により示された。ウェルがクローン細胞の単一クラスターで70%コンフルエントとなった場合に、15クローンを、24ウェルプレート中、その後6ウェルプレート、その後T25組織培養フラスコ(Corning)中の70〜80%コンフルエンシーへのさらなる増殖のため選択した。細胞の形態学を親BT474.M1細胞株と比較しそして同等であることが示された。
2007 Feb1)]。異種移植実験のため選ばれたクローンを継代数52まで増殖させ、そして5%DMSOおよび20%FBSを含むDMEM/F12中で液体窒素中に凍結保存した。
本実施例のG部に記述されるとおり製造されたBT474−M1.ffluc細胞を融解し、DMEM/F12 completeで洗浄し、DMEM/F12 complete中37℃ 5%CO2でT175フラスコ(Corning)中で増殖させ、そして腫瘍細胞移植の最低1週前に1回継代した。注入の日に、継代53の細胞を70%〜80%コンフルエンシーでトリプシン処理し、そして血球計数器を使用して計数した。細胞を1000×gで3分間遠心分離しそして無菌PBSで洗浄した。再度遠心分離した後に、細胞を1×105細胞/1μLで無菌PBSに再懸濁しかつ注入まで氷上に保存した。腫瘍細胞注入手順のため、マウスを無菌PBS中100mg/kgケタミンおよび10mg/kgキシラジンの腹腔内(IP)注入により麻酔して麻酔の脊髄面を誘導した。眼軟膏をマウスの眼に適宜塗布した。毛を電気バリカンを使用してマウスの頭の頂上から剪断した。エストロゲンペレット(1.6mg、60日放出)を、露出された皮膚を最初にポビドンヨードその後70%エタノールで消毒することにより皮下に移植した。胸椎を覆う皮
膚中の小型切開を作成し、そして皮膚および下にある筋膜を平滑に(bluntly)切開した。エストロゲンペレットを皮下に移植し、そして切開を4.0 vicrylで縫合した。次に、マウスをその後定位装置に固定した。頭蓋上の露出された皮膚をポビドンヨード次いで70%エタノールで清浄にした。前後方切開およそ1cm長を、22替刃メスで頭蓋の頂上の上に作成した。十字縫合を特定した。空気ドリルの位置を十字縫合に定めそして座標を書き留めた。ドリル点を十字縫合の−0.8mm前後方、+2.2mm内外方向に動かし、そしてバーホールを脳実質が達せられるまで突き通した。ドリルを定位装置から取り外し、そして10μLハミルトンシリンジを1μLの細胞懸濁液で負荷した。針の位置を装置上で定め、十字縫合にもたらし、そして上で示された座標に動かした。針をバーホール上の正確な位置決めに関して確認し、そして座標を、十字縫合の−4.0mm DV、その後+1.0mm貫入する前に相応して調節した。1μLの細胞懸濁液を5分にわたり注入した。針を注入後5分間正しい位置に残し、その後ゆっくりと除去した。マウスを定位装置から取り外し、そして4.0 vicrylを使用して頭蓋上の切開を縫合した。マウスを、37℃に設定された加熱パッドの上のクリーンケージに入れた。麻酔から回復した後、マウスに、無菌PBS中の0.3mg/kgブプレノルフィンと一緒に無菌PBS中の100μLの15mg/kgエンロフロキサシン(Bayer)を皮下に与えた。マウスは処置後2日間エンロフロキサシンを皮下に受領した。
6〜8週齢雌性Rag1−/−マウス(Jackson Labs #002216)を、1×1011VGのAAV9.CMV.CI.trastuzumab.SV40(n=9)、AAV9.CB7.CI.201IA.rBG(n=10)若しくは処置なし(n=5)のICV注入で、腫瘍移植21日前に処置した。腫瘍を移植しかつ生物発光を上で示されたとおり測定した。血液をベクター注入後D20、36、62および72にマウスから後眼窩採取して、CNSトラスツズマブ発現の代理物として血清トラスツズマブを測定した。1×108光量子/秒の腫瘍BLIに達した後に、マウスを毎日監視し、そして嗜眠、背を丸めること(hunching)、麻痺、神経学的欠陥若しくは痙攣を包含する神経学的障害若しくは重大な病的状態と定義される臨床エンドポイントで殺す。
れでも観察される。より高用量(1×1011GC)で、有意により高レベルのベクターが双方の送達方法について肝で見出される一方、脳中の有意により高レベルがicv投与を受領する動物でのみ見出される。このベクターが組織非特異的プロモーターを含有したことは注目すべきである。安全性の懸念は、肝での発現を最小限にするために、脳の細胞および場合によっては他の神経細胞若しくは中枢神経系の細胞を特異的に標的とする組織特異的プロモーターの使用を介して低減させうる。あるいは、肝での発現は、他器官への乳癌転移を予防若しくは制御するためにトラスツズマブの全身送達に有益でありうる。
6〜8週齢雌性NSGマウス(Jackson Labs #005557)をペンシルバニア大学で飼育した。腫瘍を、腫瘍細胞の調製および注入技術に対する以下の変更を伴い上で示されたとおり移植した。腫瘍細胞は、50%MatriGel(登録商標)(Corning)/50%無菌PBSに5μLあたり1×105細胞で再懸濁した。注入量を1μLから5μLに増大した。脳実質中で針の位置を定めた後に、注入を開始する前に5分が経過した。注入は10分にわたりゆっくりと実施し、そしてシリンジを除去前に正しい位置に5分残した。マウスを監視し、そして生物発光を本文書の別の場所に示されるとおり測定した。該データは腫瘍細胞の脳中への成功裏の生着を示した。腫瘍増殖の速度を評価して、このモデルが脳への乳癌転移の研究に望ましいかどうかを決定することができる。
Claims (20)
- 中枢神経系送達のため配合される少なくとも1つのAAVベクターを含んでなる組成物であって、前記組成物が、そのための発現制御配列に作動可能に連結されている脳への送達のための抗悪性腫瘍免疫グロブリン構築物をコードする配列を含有する少なくとも1つの発現カセットおよび製薬学的に許容できる担体を含んでなる、上記組成物。
- 抗悪性腫瘍免疫グロブリン構築物が、胎児性Fc受容体(FcRn)に対する低下された親和性を有するか若しくは測定可能な親和性を有しないように改変されている免疫グロブリンを含んでなる、請求項1に記載の組成物。
- 抗悪性腫瘍免疫グロブリン構築物が、増大されたADCC活性を有するように改変されている免疫グロブリンを含んでなる、請求項1若しくは請求項2に記載の組成物。
- 免疫グロブリン構築物が、位置Y436(配列番号25のaa459)、S254(配列番号25のaa277)、I253(配列番号25のaa276)および/若しくはH435(配列番号25のaa458)の1種若しくはそれ以上で改変されている、請求項2若しくは請求項3に記載の組成物。
- 抗悪性腫瘍免疫グロブリン構築物が、モノクローナル抗体、Fv、Fab、F(ab)2、F(ab)3、Fab’、Fab’−SH、F(ab’)2、イムノアドヘシン若しくは一本鎖可変フラグメント抗体から選択される、請求項1ないし4のいずれか1つに記載の組成物。
- 免疫グロブリン構築物が原発若しくは転移CNS癌に向けられる、請求項1ないし5のいずれか1つに記載の組成物。
- 免疫グロブリンが、トラスツズマブ、212−Pb−TCMC−トラスツズマブ若しくはペルツズマブよりなる群から選択される抗Her2抗体である、請求項6に記載の組成物。
- トラスツズマブの重鎖をコードする配列が、配列番号1のnt61−1410の核酸配列若しくはそれに最低90%同一の配列を有する、請求項7に記載の組成物。
- トラスツズマブの軽鎖をコードする配列が、配列番号1のnt2070−2711に示される核酸配列若しくはそれに最低90%同一の配列を有する、請求項7に記載の組成物。
- 少なくとも1つのAAVベクターがAAV9、AAV rh10若しくはAAV hu37キャプシドを有する、請求項1ないし9のいずれか1つに記載の組成物。
- 組成物が最低2種の異なる抗体発現カセットを含んでなるAAVを含んでなる、請求項1ないし10のいずれか1つに記載の組成物。
- 組成物が単一抗体発現カセットを含んでなる、請求項1ないし10のいずれか1つに記載の組成物。
- FcRnについての破壊された結合を有する抗Her2重鎖を含んでなる、AA9キャプシドを有しかつ抗Her2 IgG抗体若しくはその機能的フラグメントをコードする発現カセットをその中にパッケージングしているAAVウイルスベクターを含んでなる組
成物。 - 脳中の腫瘍の増殖を遅らせる方法であって、前記方法が請求項1ないし13のいずれか1つに記載の組成物をそれの必要な被験体に投与することを含んでなる、上記方法。
- 前記組成物がくも膜下腔内に投与される、請求項14に記載の方法。
- 前記組成物が血液脳関門の化学的若しくは物理的破壊の非存在下で投与される、請求項14若しくは15に記載の方法。
- 脳中の転移乳癌の処置方法であって、前記方法が請求項1ないし13のいずれか1つに記載の組成物をそれの必要な被験体に投与することを含んでなる、上記方法。
- 前記組成物がくも膜下腔内に投与される、請求項17に記載の方法。
- 前記組成物が血液脳関門の化学的若しくは物理的破壊の非存在下で投与される、請求項17若しくは18に記載の方法。
- 生物学的製剤、小分子、抗悪性腫瘍薬、放射線および/若しくは化学療法剤と組合せの請求項1ないし13のいずれかに記載の組成物を投与することを含んでなる抗悪性腫瘍レジメン。
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