CN117396213A - 用于癌症治疗的脱氧核糖核酸酶与细胞疗法的组合 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用脱氧核糖核酸酶和包含表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞的过继细胞免疫疗法的组合来治疗癌症的方法。在特定实施方案中，脱氧核糖核酸酶可以肠胃外给予或由载体编码或由包含TCR或CAR的细胞分泌。

Description

用于癌症治疗的脱氧核糖核酸酶与细胞疗法的组合

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年1月8日提交的美国临时专利申请第63/135,438号和2021年2月11日提交的美国临时专利申请第63/148,304号的优先权，其公开内容通过引用以其整体并入本文。

序列表

本申请包括序列表，所述序列表已经以ASCII格式电子提交并且特此通过引用以其整体并入。创建于2022年1月7日的所述ASCII副本被命名为252732_000023SL.txt，并且大小是117,776字节。

发明领域

本发明涉及利用脱氧核糖核酸酶和包含表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞的过继细胞免疫疗法的组合来治疗癌症的方法。

发明概述

本发明解决了本领域对新的和更有效的癌症治疗的巨大需求。

在一方面，本发明提供了一种治疗有相应需要的受试者的癌症的方法，包括向受试者施用脱氧核糖核酸酶(DNase)和至少一种包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞。在一些实施方案中，所述DNase酶以有效减少肿瘤组织中免疫抑制蛋白的表达和/或增加肿瘤组织内CAR表达细胞或TCR表达细胞的含量的量使用。

在另一方面，本发明提供了一种在有相应需要的受试者中预防CAR-T细胞疗法的一种或更多种副作用的方法，包括向受试者施用脱氧核糖核酸酶(DNase)，其中所述DNase酶与所述CAR-T细胞疗法同时或顺序施用。在一些实施方案中，CAR-T细胞疗法的副作用选自神经副作用、细胞因子释放综合征(CRS)、中性粒细胞减少症、贫血、发热、发热性中性粒细胞减少症和血小板减少症。

在另一方面，本发明提供了一种在受试者中通过CAR-T细胞疗法治疗所述疾病后预防疾病复发的方法，包括向受试者施用脱氧核糖核酸酶(DNase)，其中所述DNase酶与所述CAR-T细胞疗法同时或顺序施用。

在又另一方面，本发明提供了一种增加经历CAR-T细胞疗法的受试者血液中CAR-T细胞持久性的方法，包括向受试者施用脱氧核糖核酸酶(DNase)，其中所述DNase酶与所述CAR-T细胞疗法同时或顺序施用。

在另一方面，本发明提供了一种在有相应需要的受试者中增加CAR-T细胞疗法效力的方法，包括向受试者施用脱氧核糖核酸酶(DNase)，其中所述DNase酶与所述CAR-T细胞疗法同时或顺序施用。

在任何上述方法的一些实施方案中，DNase酶以DNase酶蛋白的形式施用。

在任何上述方法的一些实施方案中，DNase酶由载体编码。在一些实施方案中，载体是基因治疗载体。在一些实施方案中，载体是重组腺相关病毒(rAAV)载体，包含(i)衣壳蛋白和(ii)核酸，所述核酸包含可操作地连接到编码DNase酶的核苷酸序列的启动子。在一些实施方案中，启动子是肝特异性启动子。在一些实施方案中，启动子对肿瘤起源组织或转移靶组织是特异性的。

在任何上述方法的一些实施方案中，DNase酶由mRNA分子编码。

在任何上述方法的一些实施方案中，DNase酶被肠胃外施用或向肿瘤部位施用。

在任何上述方法的一些实施方案中，DNase酶由包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞共表达。

在任何上述方法的一些实施方案中，CAR表达细胞或TCR表达细胞被肠胃外施用或向肿瘤部位施用。在任何上述方法的一些实施方案中，CAR表达细胞或TCR表达细胞是单靶向的或多靶向的。

在任何上述方法的一些实施方案中，CAR包含能够特异性结合选自以下的一种或更多种抗原的抗原结合结构域：(i)肿瘤抗原，所述肿瘤抗原选自CD5、CD7、CD19、CD28、间皮素、CD123、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、FR-1、c-MET、EGFR/CD133、IL13Ra2、HER2、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、Prostase、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、TSHR、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WTl、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6,E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、存活蛋白、端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NAI7、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYPIB1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、和mut hsp70-2；(ii)与实体瘤相关的抗原；(iii)实体瘤相关抗原，所述实体瘤相关抗原选自间皮素、EGFRvIII、GD2、CLDN6、Tn Ag、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、豆荚蛋白、CD171、PSCA、TARP、MAD-CT-1、LewisY、CD24、叶酸受体α、叶酸受体β、ERBBs、MUC1、EGFR、NCAM、PDGFR-β、MAD-CT-2、Fos相关抗原、SSEA-4、中性粒细胞弹性蛋白酶、CAIX、HPV E6、HPV E7、ML-IAP、NA17、ALK、雄激素受体、聚唾液酸、TRP-2、CYP1B 1、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、精子蛋白17、HMWMAA、β人绒毛膜促性腺激素、AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、肠羧基酯酶和mut hsp 70-2；(iv)存在于间皮瘤、肺癌、胰腺癌、食管腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠直肠癌、膀胱癌或其任何组合中/上的实体瘤相关抗原；(v)与血液学癌症相关的肿瘤抗原；(vi)存在于选自以下的疾病中的肿瘤抗原：急性白血病(包括但不限于B细胞急性淋巴细胞白血病(“BALL”)、T细胞急性淋巴细胞白血病(“TALL”)、急性淋巴细胞白血病(ALL))、和慢性白血病(包括但不限于慢性髓性白血病(CIVIL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL))，以及(vii)存在于抗治疗性癌症中的肿瘤抗原，包括但不限于髓过氧化物酶和中性粒细胞弹性蛋白酶，其包括为ScFv、Fab、CDR环、CDR嫁接物(graft)、dAb和纳米抗体片段的非实质性变体、突变体、片段或衍生物的任何蛋白或肽，无论是由细胞系产生，由杂交瘤表达，由细菌、酵母或其他宿主细胞体外表达，还是任何其他合成方法。

在任何上述方法的一些实施方案中，DNase酶包含与SEQ ID NO:4具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

在任何上述方法的一些实施方案中，DNase酶包含与SEQ ID NO:53具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

在使用DNase酶蛋白的任何上述方法的一些实施方案中，在施用CAR表达细胞或TCR表达细胞的同一天或前一天静脉内注射一次DNase酶蛋白。

在使用DNase酶蛋白的任何上述方法的一些实施方案中，在施用CAR表达细胞或TCR表达细胞后开始，每周一次静脉内注射DNase酶蛋白。

在使用DNase酶蛋白的任何上述方法的一些实施方案中，在施用CAR表达细胞或TCR表达细胞后开始，每月一次静脉内注射DNase酶蛋白。

在使用DNase酶蛋白的任何上述方法的一些实施方案中，在施用CAR表达细胞或TCR表达细胞前一周静脉内注射DNase酶蛋白。

在使用DNase酶蛋白的任何上述方法的一些实施方案中，在施用CAR表达细胞或TCR表达细胞前一个月静脉内注射DNase酶蛋白。

在使用DNase酶蛋白的任何上述方法的一些实施方案中，在施用CAR表达细胞或TCR表达细胞之前21天至之后14天静脉内注射一次DNase酶蛋白。

在使用DNase酶蛋白的任何上述方法的一些实施方案中，在施用CAR表达细胞或TCR表达细胞后，静脉内注射DNase酶蛋白至少14天。

在使用DNase酶蛋白的任何上述方法的一些实施方案中，在施用CAR表达细胞或TCR表达细胞后，静脉内注射DNase酶蛋白至少16天。

在使用DNase酶蛋白的任何上述方法的一些实施方案中，在施用CAR表达细胞或TCR表达细胞之前、同时或之后静脉内注射DNase酶蛋白至少3天。

在使用DNase酶蛋白的任何上述方法的一些实施方案中，在施用CAR表达细胞或TCR表达细胞后，静脉内注射DNase酶蛋白至少7天。

在使用DNase酶蛋白的任何上述方法的一些实施方案中，在施用CAR表达细胞或TCR表达细胞之前，静脉内注射DNase酶蛋白至少7天。

在使用DNase酶蛋白的任何上述方法的一些实施方案中，在施用CAR表达细胞或TCR表达细胞之前或之后，静脉内注射DNase酶蛋白至少3天。

在使用DNase酶蛋白的任何上述方法的一些实施方案中，以至少250μg/kg/天的剂量静脉内注射DNase酶蛋白。

在使用DNase酶蛋白的任何上述方法的一些实施方案中，以至少600μg/kg/天的剂量静脉内注射DNase酶蛋白。

在使用DNase酶蛋白的任何上述方法的一些实施方案中，以至少900μg/kg/天的剂量静脉内注射DNase酶蛋白。

在使用DNase酶蛋白的任何上述方法的一些实施方案中，以至少2.5mg/kg/天的剂量静脉内注射DNase酶蛋白。

在使用DNase酶蛋白的任何上述方法的一些实施方案中，以至少5mg/kg/天的剂量静脉内注射DNase酶蛋白。

在使用DNase酶蛋白的任何上述方法的一些实施方案中，静脉内注射DNase酶蛋白至少7.5mg/kg/天。。

在任何上述方法的一些实施方案中，CAR表达细胞或TCR表达细胞被进一步修饰以表达免疫检查点抑制剂分子。

在任何上述方法的一些实施方案中，DNase酶以增加低氧环境中CAR表达细胞的效力的量使用。

在使用编码DNase酶的载体的任何上述方法的一些实施方案中，在施用CAR表达细胞或TCR表达细胞之前至少14天静脉内注射和/或在肿瘤部位注射编码DNase酶的载体。

在使用编码DNase酶的载体的任何上述方法的一些实施方案中，在施用CAR表达细胞或TCR表达细胞之前至少3天静脉内注射和/或在肿瘤部位注射编码DNase酶的载体。

在使用编码DNase酶的载体的任何上述方法的一些实施方案中，在施用CAR表达细胞或TCR表达细胞的同时静脉内注射和/或在肿瘤部位注射编码DNase酶的载体。

在使用编码DNase酶的载体的任何上述方法的一些实施方案中，在施用CAR表达细胞或TCR表达细胞后3天静脉内注射和/或在肿瘤部位注射编码DNase酶的载体。

在任何上述方法的一些实施方案中，CAR表达细胞是CAR T细胞。

在单独的方面，本发明提供了表达(i)脱氧核糖核酸酶(DNase)和(ii)嵌合抗原受体(CAR)和/或T细胞受体(TCR)的细胞。在一些实施方案中，细胞还表达免疫检查点抑制剂分子。在一些实施方案中，CAR或TCR是单靶向的或多靶向的。在一些实施方案中，CAR包含能够特异性结合选自以下的一种或更多种抗原的抗原结合结构域：(i)肿瘤抗原，所述肿瘤抗原选自CD5、CD7、CD19、CD28、间皮素、CD123、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、FR-1、c-MET、EGFR/CD133、IL13Ra2、HER2、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、Prostase、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、TSHR、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WTl、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPVE6,E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、存活蛋白、端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NAI7、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYPIB1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、和mut hsp70-2；(ii)与实体瘤相关的抗原；(iii)实体瘤相关抗原，所述实体瘤相关抗原选自间皮素、EGFRvIII、GD2、CLDN6、Tn Ag、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、豆荚蛋白、CD171、PSCA、TARP、MAD-CT-1、Lewis Y、CD24、叶酸受体α、叶酸受体β、ERBBs、MUC1、EGFR、NCAM、PDGFR-β、MAD-CT-2、Fos相关抗原、SSEA-4、中性粒细胞弹性蛋白酶、CAIX、HPV E6、HPV E7、ML-IAP、NA17、ALK、雄激素受体、聚唾液酸、TRP-2、CYP1B 1、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、精子蛋白17、HMWMAA、β人绒毛膜促性腺激素、AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CAIX、人端粒酶逆转录酶、肠羧基酯酶和mut hsp 70-2；(iv)存在于间皮瘤、肺癌、胰腺癌、食管腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠直肠癌、膀胱癌或其任何组合中/上的实体瘤相关抗原；(v)与血液学癌症相关的肿瘤抗原；(vi)存在于选自以下的疾病中的肿瘤抗原：急性白血病(包括但不限于B细胞急性淋巴细胞白血病(“BALL”)、T细胞急性淋巴细胞白血病(“TALL”)、急性淋巴细胞白血病(ALL))、和慢性白血病(包括但不限于慢性髓性白血病(CIVIL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL))，以及(vii)存在于抗治疗性癌症中的肿瘤抗原，包括但不限于髓过氧化物酶和中性粒细胞弹性蛋白酶，其包括为ScFv、Fab、CDR环、CDR嫁接物(graft)、dAb和纳米抗体片段的非实质性变体、突变体、片段或衍生物的任何蛋白或肽，无论是由细胞系产生，由杂交瘤表达，由细菌、酵母或其他宿主细胞体外表达，还是任何其他合成方法。在一些实施方案中，DNase酶包含与SEQ IDNO:4具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，脱氧核糖核酸酶包含与SEQ ID NO:53具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

通过下面的描述、权利要求和附图，本发明的这些和其他方面对于本领域普通技术人员来说将是明显的。

附图简述

图1示出了通过卡尺测量并使用椭球体公式估算的以下实验组的肿瘤体积(mm³)：对照，CAR19与DNase I，CAR19，和DNase I。静脉内(IV)注射人类重组DNase I酶为CD19 CART细胞提供了显著的效力增强。

图2示出了对照、CAR19与DNase I、CAR19、和DNase I实验组的存活图，显示来自CAR T细胞和AAV DNase I基因转移组合的存活益处。

图3A-图3C示出了展示表达PD-L1的转移性MC32a细胞的百分比的流式细胞术分析。相对于对照(图3A)，来自AAV-DNase I基因转移与CAR T细胞组合治疗(图3B)、以及CART细胞治疗(图3C)的小鼠的转移性病变的转移性MC32a细胞中PD-L1表达被抑制。

图4示出了MC32a转移性病变的实质中靶向癌胚抗原(CEA)的CAR T细胞的百分比图。数据示出了来自用CAR T细胞和AAV DNase I基因转移组合治疗的小鼠转移性病变中CAR T细胞增加的百分比。

图5A-图5B示出了示例性病毒载体构建的示意图。图5A示出了包含EF-1α启动子和CD3ζ结构域的mDNase I mut P2A 4D5 IgG4 CAR(4,237bp)的图。图5B示出了包含mDNaseIP2A IgG4 CAR的病毒载体(12,146bp)的全序列图。

图6示出了在DNase I FL1-CAR-T、FL1-CAR-T和未转导的对照T细胞的培养基中使用荧光探针分析DNase活性的图。活性测量为pM/s(皮米每秒)。数据显示DNase I FL1-CAR-T的培养基中脱氧核糖核酸酶活性逐渐增加。

图7示出了通过乳酸脱氢酶(LDH)释放测定对与Raji-FL1细胞共孵育的FL1-CAR-T、DNase I FL1-CAR-T和未转导(模拟)对照T细胞的细胞毒性的评价。T细胞重编程以同时表达CAR和DNase I酶提供了针对靶淋巴瘤细胞的更高的细胞毒性。E:T比——效应细胞与靶细胞的比。

图8示出了通过卡尺测量并使用椭球体公式估算的以下实验组的肿瘤体积(mm³)：安慰剂对照(第1组)，FL1 CAR T细胞(第2组)，和表达脱氧核糖核酸酶的FL1 CAR T细胞(第3组)。T细胞重编程以同时表达CAR和脱氧核糖核酸酶为这样的双重重编程的T细胞提供了更高的效力。

图9示出了外周血中CAR-T细胞的数量(使用生物素化蛋白L和与FITC缀合的链霉抗生物素蛋白通过流式细胞术检测来确定)。数据显示，DNase和CAR-T细胞疗法的组合使用显著(所有p<0.05)增加了CAR-T细胞在血液中的持久性。

图10显示DNase和CAR-T细胞疗法的组合使用增加了动物存活。

图11示出了患有细胞因子释放综合征(CRS)的动物的百分比，显示DNase的使用增加了CAR-T疗法的安全性，并保护免于CAR-T相关的副作用。

发明详述

本发明涉及利用脱氧核糖核酸酶和包含表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞的过继细胞免疫疗法的组合来治疗癌症的方法。在特定实施方案中，脱氧核糖核酸酶可以肠胃外给予或由载体编码或由包含TCR或CAR的细胞分泌。

定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指代物。因此，例如，提及“一种(a)方法”包括一种或更多种方法、和/或本文描述的类型的步骤，和/或其对本领域技术人员而言在阅读本公开内容后将变得明显。

术语“约”或“大约”包括在统计上有意义的值的范围内。这样的范围可以在给定值或范围的一定数量级内，优选地在50％内，更优选地在20％内，还更优选地在10％内，并且甚至更优选地在5％内。术语“约”或“大约”所涵盖的允许的变化取决于所研究的特定系统，并且可以被本领域普通技术人员容易地理解。

DNase酶

在某些方面，本发明提供了一种治疗有相应需要的受试者的癌症的方法，包括向受试者施用脱氧核糖核酸酶(DNase)和至少一种包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞。在相关方面，本发明提供了一种治疗有相应需要的受试者的癌症的方法，包括向受试者施用DNase酶和至少一种包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞，其中所述DNase酶有效地减少肿瘤组织中免疫抑制蛋白的表达和/或增加肿瘤组织内包含嵌合抗原受体或T细胞受体的细胞的含量。在一些实施方案中，DNase酶以脱氧核糖核酸酶蛋白的形式肠胃外施用。在一些实施方案中，DNase酶由载体编码。在一些实施方案中，DNase酶由包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞共表达。在一些实施方案中，DNase酶用于增加低氧环境中CAR表达细胞的效力。

可用于本发明的任何方法的DNase酶的非限制性实例包括例如DNase I、DNase X、DNaseγ、DNase1L1、DNase1L2、DNase 1L3、DNase II、DNase IIα、DNase IIβ、胱天蛋白酶激活的DNase(CAD)、内切核酸酶G(ENDOG)、颗粒酶B(GZMB)、磷酸二酯酶I、乳铁蛋白、乙酰胆碱酯酶及其突变体或衍生物、变体或类似物。

在一些实施方案中，DNase可以是DNase I或其突变体或衍生物。

在一些实施方案中，DNase I可以是人类DNase I或其突变体或衍生物。在一些实施方案中，DNase I可以是非人类DNase I或其突变体或衍生物，诸如但不限于啮齿动物(例如小鼠)DNase I或其突变体或衍生物。

在一些实施方案中，DNase酶包含与人类DNase I酶具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，DNase酶包含与人类DNase I酶具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，DNase酶包含与DNase1样3(D1L3)酶(SEQ ID NO:51)的氨基酸21至305具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，DNase酶包含与DNase1样3(D1L3)酶(SEQ ID NO:51)的氨基酸21至305具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，DNase I包含与SEQ ID NO:1的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，DNase I氨基酸序列由与SEQIDNO:22具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，DNase I包含由SEQ ID NO:22的核苷酸序列编码的SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

在一些实施方案中，DNase I包含与SEQ ID NO:4的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，DNase I氨基酸序列由与SEQ ID NO:23具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，DNase I包含由SEQ ID NO:23的核苷酸序列编码的SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

在一些实施方案中，DNase I突变体可以包含肌动蛋白结合位点中的一种或更多种突变。在一些实施方案中，肌动蛋白结合位点中的一种或更多种突变选自Gln-9、Glu-13、Thr-14、His-44、Asp-53、Tyr-65、Val-66、Val-67、Glu-69、Asn-74、Ala-114处的突变及其任何组合。在一些实施方案中，肌动蛋白结合位点中的突变之一是Ala-114处的突变。

在一些实施方案中，DNase I突变体包含一种或更多种增加DNase活性的突变。在一些实施方案中，增加DNase活性的一种或更多种突变选自由以下组成的组：Q9R、E13R、E13K、T14R、T14K、H44R、H44K、N74K、A114F及其任何组合。在一些实施方案中，增加DNase活性的一种或更多种突变选自由以下组成的组：Q9R、E13R、N74K和A114F。

在一些实施方案中，DNase I突变体包含一种或更多种选自由以下组成的组的突变：H44C、H44N、L45C、V48C、G49C、L52C、D53C、D53R、D53K、D53Y、D53A、N56C、D58S、D58T、Y65A、Y65E、Y65R、Y65C、V66N、V67E、V67K、V67C、E69R、E69C、A114C、A114R、H44N:T46S、D53R:Y65A、D53R:E69R、H44A:D53R:Y65A、H44A:Y65A:E69R、H64N:V66S、H64N:V66T、Y65N:V67S、Y65N:V67T、V66N:S68T、V67N:E69S、V67N:E69T、S68N:P70S、S68N:P70T、S94N:Y96S、S94N:Y96T及其任何组合。在一些实施方案中，DNase I突变体是DNase的长效形式。在一些实施方案中，DNase I突变体是DNase的超活性变体形式。在一些实施方案中，DNase I突变体包含氨基酸序列SEQ ID NO:5。在一些实施方案中，DNase I突变体包含氨基酸序列SEQ ID NO:2。

在一些实施方案中，DNase I突变体包含与SEQ ID NO:5的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，DNase I突变体氨基酸序列由与SEQ ID NO:21具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，DNase I突变体氨基酸序列由与SEQ ID NO:18具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，DNase I突变体包含突变Q9R、E13R、N74K和A114F。在一些实施方案中，DNase I突变体包含SEQ IDNO:5的序列。在一些实施方案中，DNase I突变体包含由SEQ ID NO:21的核苷酸序列编码的SEQ ID NO:5的氨基酸序列。

在一些实施方案中，DNase I突变体包含与SEQ ID NO:2的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，DNase I突变体氨基酸序列由与SEQ ID NO:19具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，DNase I突变体包含突变Q9R、E13R、N74K和A114F。在一些实施方案中，DNase I突变体包含SEQ ID NO:2的序列。在一些实施方案中，DNase I突变体包含由SEQ ID NO:19的核苷酸序列编码的SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

在一些实施方案中，DNase I突变体由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的序列组成。

在本发明的任何方法的一些实施方案中，编码DNase的序列包含分泌信号序列，其中所述分泌信号序列在载体向受试者施用时介导酶有效分泌到肝门窦循环中。在一些实施方案中，分泌信号序列选自由以下组成的组：DNase I分泌信号序列、IL2分泌信号序列、白蛋白分泌信号序列、β-葡萄糖醛酸糖苷酶分泌信号序列、碱性蛋白酶分泌信号序列和纤连蛋白分泌信号序列。在一些实施方案中，分泌信号序列包含与序列MRGMKLLGALLALAALLQGAVS(SEQ ID NO:6)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分泌信号序列包含序列MRGMKLLGALLALAALLQGAVS(SEQID NO:6)。在一些实施方案中，分泌信号序列由序列MRGMKLLGALLALAALLQGAVS(SEQ ID NO:6)组成。在一些实施方案中，分泌信号序列包含与序列MYRMQLLSCIALSLALVTNS(SEQ ID NO:7)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，分泌信号序列包含序列MYRMQLLSCIALSLALVTNS(SEQ ID NO:7)。在一些实施方案中，分泌信号序列由序列MYRMQLLSCIALSLALVTNS(SEQ ID NO:7)组成。

在一些实施方案中，DNase酶选自由以下组成的组：DNase I、DNase X、DNaseγ、DNase1L1、DNase1L2、DNase 1L3、DNase II、DNase IIα、DNase IIβ、胱天蛋白酶激活的DNase(CAD)、内切核酸酶G(ENDOG)、颗粒酶B(GZMB)、磷酸二酯酶I、乳铁蛋白、乙酰胆碱酯酶及其突变体或衍生物、变体或类似物。在一些实施方案中，DNase酶是DNase I或其突变体或衍生物。在一些实施方案中，DNase I是人类DNase I或其突变体或衍生物。在一些实施方案中，DNase I突变体包含肌动蛋白结合位点中的一种或更多种突变。在一些实施方案中，肌动蛋白结合位点中的一种或更多种突变选自Gln-9、Glu-13、Thr-14、His-44、Asp-53、Tyr-65、Val-66、Val-67、Glu-69、Asn-74、Ala-114处的突变及其任何组合。在一些实施方案中，肌动蛋白结合位点中的突变之一是Ala-114处的突变。在一些实施方案中，DNase I突变体包含一种或更多种增加DNase活性的突变。在一些实施方案中，增加DNase活性的一种或更多种突变选自由以下组成的组：Q9R、E13R、E13K、T14R、T14K、H44R、H44K、N74K、A114F及其任何组合。在一些实施方案中，增加DNase活性的一种或更多种突变选自由以下组成的组：Q9R、E13R、N74K和A114F及其任何组合。在一些实施方案中，DNase I突变体包含与SEQ IDNO:5的序列具有至少80％或至少85％或至少90％或至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，DNase I突变体包含突变Q9R、E13R、N74K和A114F。在一些实施方案中，DNase I突变体包含SEQ ID NO:5的序列。在一些实施方案中，DNase I突变体由SEQ ID NO:5的序列组成。在一些实施方案中，DNase I突变体包含与SEQ ID NO:2的序列具有至少80％或至少85％或至少90％或至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，DNase I突变体包含突变Q9R、E13R、N74K和A114F。在一些实施方案中，DNase I突变体包含SEQ ID NO:2的序列。在一些实施方案中，DNase I突变体由SEQ ID NO:2的序列组成。在一些实施方案中，DNase I突变体包含一种或更多种选自由以下组成的组的突变：H44C、H44N、L45C、V48C、G49C、L52C、D53C、D53R、D53K、D53Y、D53A、N56C、D58S、D58T、Y65A、Y65E、Y65R、Y65C、V66N、V67E、V67K、V67C、E69R、E69C、A114C、A114R、H44N:T46S、D53R:Y65A、D53R:E69R、H44A:D53R:Y65A、H44A:Y65A:E69R、H64N:V66S、H64N:V66T、Y65N:V67S、Y65N:V67T、V66N:S68T、V67N:E69S、V67N:E69T、S68N:P70S、S68N:P70T、S94N:Y96S、S94N:Y96T及其任何组合。在一些实施方案中，核酸编码包含序列SEQ ID NO:4的DNase I。在一些实施方案中，核酸包含与SEQ ID NO:23至少85％或至少90％或至少95％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO:23。在一些实施方案中，核酸编码包含序列SEQ ID NO:1的DNase I。在一些实施方案中，核酸包含与SEQ ID NO:22至少85％或至少90％或至少95％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO:22。在一些实施方案中，核酸包含与SEQ ID NO:32至少85％或至少90％或至少95％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO:32。在一些实施方案中，核酸编码包含序列SEQ ID NO:24的DNase I。在一些实施方案中，核酸包含与SEQ ID NO:29至少85％或至少90％或至少95％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO:29。在一些实施方案中，核酸编码包含SEQ ID NO:26的序列的DNase I。在一些实施方案中，核酸包含与SEQ IDNO:28至少85％或至少90％或至少95％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO:28。在一些实施方案中，核酸编码包含序列SEQ ID NO:5的DNase I突变体。在一些实施方案中，核酸包含与SEQ ID NO:21至少85％或至少90％或至少95％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO:21。在一些实施方案中，核酸编码包含序列SEQ ID NO:2的DNase I突变体。在一些实施方案中，核酸包含与SEQID NO:19至少85％或至少90％或至少95％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO:19。在一些实施方案中，DNase酶是融合蛋白，其包含与(ii)白蛋白或Fc或其片段连接的(i)DNase酶或其片段。在一些实施方案中，编码DNase酶的序列包含编码分泌信号序列的序列，其中所述分泌信号序列介导酶的有效分泌。在一些实施方案中，分泌信号序列选自由以下组成的组：DNase I分泌信号序列、IL2分泌信号序列、白蛋白分泌信号序列、β-葡萄糖醛酸糖苷酶分泌信号序列、碱性蛋白酶分泌信号序列和纤连蛋白分泌信号序列。在一些实施方案中，分泌信号序列包含序列MRGMKLLGALLALAALLQGAVS(SEQ IDNO:6)或MYRMQLLSCIALSLALVTNS(SEQ ID NO:7)。在一些实施方案中，分泌信号序列由序列MRGMKLLGALLALAALLQGAVS(SEQ ID NO:6)或MYRMQLLSCIALSLALVTNS(SEQ ID NO:7)组成。在一些实施方案中，分泌信号序列包含与MRGMKLLGALLALAALLQGAVS(SEQ ID NO:6)的序列具有至少80％或至少85％或至少90％或至少95％序列同一性的序列或与MYRMQLLSCIALSLALVTNS(SEQ ID NO:7)的序列具有至少85％或至少90％或至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，编码分泌信号序列的序列包含与SEQ ID NO:20至少85％或至少90％或至少95％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码分泌信号序列的序列包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列。在一些实施方案中，分泌信号序列包含序MRYTGLMGTLLTLVNLLQLAGT(SEQ ID NO:25)。在一些实施方案中，分泌信号序列由序列MRYTGLMGTLLTLVNLLQLAGT(SEQ ID NO:25)组成。在一些实施方案中，分泌信号序列包含与MRYTGLMGTLLTLVNLLQLAGT(SEQ ID NO:25)的序列具有至少80％或至少85％或至少90％或至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，编码分泌信号序列的序列包含核苷酸序列SEQ ID NO:27。在单独的实施方案中，本发明的核酸包含SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31的序列。

AAV载体

在一些实施方案中，本文公开的DNase酶可以由载体(例如基因治疗载体)编码。在一些实施方案中，基因治疗载体是重组腺相关病毒(rAAV)表达载体，包含(i)衣壳蛋白和(ii)核酸，该核酸包含可操作地连接到编码脱氧核糖核酸酶(DNase)的核苷酸序列的启动子。

在一些实施方案中，载体是病毒载体。病毒载体的非限制性实例包括例如腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体(例如慢病毒载体)和嗜肝病毒载体(例如乙型肝炎病毒(HBV)载体)。

在某些实施方案中，本发明的载体是细小病毒载体，诸如腺相关病毒(AAV)载体。如本文使用的术语“细小病毒(parvovirus)”涵盖细小病毒科(Parvoviridae)，包括自主复制的细小病毒和依赖病毒。自主细小病毒包括细小病毒属、红病毒属、浓核病毒属、重复病毒属(Iteravirus)和Contravirus属的成员。自主细小病毒包括但不限于小鼠微小病毒、牛细小病毒、犬细小病毒、鸡细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒、猫细小病毒、鹅细小病毒、H1细小病毒、番鸭细小病毒、B 19病毒和任何其他现在已知或后来发现的自主细小病毒。本领域技术人员已知其他自主细小病毒。参见，例如，Bernard N.Fields等人，Virology，第2卷，第69章(第4版，Lippincott-Raven Publishers)。

在一些实施方案中，细小病毒载体是单链细小病毒载体，诸如AAV载体。AAV(依赖病毒属)通常感染人类(例如血清型1、2、3A、3B、4、5和6)或灵长类动物(例如血清型1和4)，或其他温血动物(例如牛AAV、犬AAV、马AAV和绵羊AAV)。关于细小病毒和细小病毒科其它成员的进一步信息例如在Kenneth I.Berns,“Parvoviridae：The Viruses and TheirReplication”,第69章,Fields,Virology(第3版1996)中提供。

本文公开的AAV载体可以来源于任何AAV血清型，包括血清型的组合(例如，“假型(pseudotyped)”AAV)，或来自各种基因组(例如，单链或自我互补的)。“血清型”传统上是基于一种病毒的抗体与另一种病毒的抗体之间相比缺乏交叉反应性来定义的。这样的交叉反应性差异通常是由于衣壳蛋白序列/抗原决定簇的差异(例如，由于VP1、VP2和/或VP3序列差异)造成的。可用于开发本发明的AAV表达载体的AAV血清型的非限制性实例包括例如AAV血清型1(AAV1)、AAV2、AAV3(包括3A型和3B型)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh10(如例如在美国专利第9,790,472号、国际专利申请公布第WO2017180857号和第WO2017/180861号中公开的)、AAV-LK03、AAV-LK06、AAV-LK12(如例如在Wang等人，Mol.Ther.,2015,23(12):1877-1887中公开的)、AAV-KP1(如在国际专利申请公布第WO2019191701A1号中公开的)、AAVhu37(如在国际专利申请公布第WO2017180857号中公开的)、AAVrh64R1(如在国际专利申请公布第WO2017180857号中公开的)、Anc80(基于血清型AAV1、AAV2、AAV8和AAV9的预测祖先；参见Zinn等人，Cell Rep.,2015,12(67):1056-1068)、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、绵羊AAV及其任何嵌合体。参见，例如，Fields等人，Virology，第2卷，第69章(第4版，Lippincott-Raven Publishers)。

许多推定的新AAV血清型和分支已被鉴定(参见，例如，Gao等人，(2004)J.Virology78:6381-6388；Moris等人，(2004)Virology 33-:375-383)。AAV和自主细小病毒的各种血清型的基因组序列，以及末端重复、Rep蛋白和衣壳亚基的序列在本领域是已知的，例如，Srivistava等人,(1983)J.Virology 45:555；Chiorini等人,(1998)J.Virology71:6823；Chiorini等人,(1999)J.Virology 73:1309；Bantel-Schaal等人,(1999)J.Virology 73:939；Xiao等人,(1999)J.Virology73:3994；Muramatsu等人,(1996)Virology 221:208；Shade等人,(1986)J.Virol.58:921；Gao等人,(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 99:11854；Moris等人,(2004)Virology 33-:375-383；GenBank登录号U89790；GenBank登录号J01901；GenBank登录号AF043303；GenBank登录号AF085716；GenBank登录号NC 006152；GenBank登录号Y18065；GenBank登录号NC 006260；GenBank登录号NC_006261；国际专利公布第WO 00/28061号、第WO 99/61601号、第WO 98/11244号；和美国专利第6,156,303号，其公开内容通过引用并入本文，用于教导细小病毒和AAV核酸和氨基酸序列。

所有已知AAV血清型的基因组组织非常相似。AAV的基因组是线性的单链DNA分子，长度小于约5,000个核苷酸(nt)。末端反向重复(ITR)位于非结构复制(Rep)蛋白和结构(VP)蛋白的独特编码核苷酸序列的侧翼。VP蛋白(VP1、VP2和VP3)形成衣壳。末端145个核苷酸是自我互补的，并且被组织成可以形成能量稳定的分子内双链体，形成T形发夹。这些发夹结构作为病毒DNA复制的起点发挥作用，用作细胞DNA聚合酶复合物的引物。在哺乳动物细胞中wtAAV感染后，Rep基因(即Rep78和Rep52)分别从P5启动子和P19启动子表达，并且两种Rep蛋白在病毒基因组的复制中具有功能。

在一些实施方案中，重组AAV(rAAV)载体包含一种或更多种感兴趣的核苷酸序列，其侧翼是至少一种细小病毒或AAV末端反向重复序列(ITR)。当在表达AAV rep和cap基因产物(即AAV Rep和Cap蛋白)的包装细胞中产生时，这样的rAAV载体可以被复制并包装到病毒颗粒中。如本文使用的术语“AAV Cap蛋白”或“AAV衣壳蛋白”是指具有天然AAV Cap蛋白(例如，VP1、VP2、VP3)的至少一种功能活性的多肽。Cap蛋白(例如VP1、VP2、VP3)的功能活性的实例包括诱导衣壳形成、促进单链DNA积累、促进AAV DNA包装到衣壳中(即衣壳化)、结合细胞受体以及促进病毒体进入宿主细胞的能力。

在一些实施方案中，AAV载体可以包含期望的蛋白或蛋白变体。如本文使用的“变体”是指一个或更多个氨基酸被改变的氨基酸序列。变体可以具有“保守”变化，其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学特性，例如用异亮氨酸替代亮氨酸。更罕见的是，变体可以具有“非保守”变化，例如，用色氨酸替代甘氨酸。类似的微小变异也可以包括氨基酸缺失或插入，或两者。

AAV载体被包装到AAV病毒衣壳中。AAV病毒衣壳蛋白的序列限定了特定AAV载体的许多特征。例如，衣壳蛋白影响衣壳结构和装配、与AAV非结构蛋白诸如Rep和AAP蛋白的相互作用、与宿主体液和细胞外基质的相互作用、病毒从血液中的清除、血管渗透性、抗原性、对中和抗体的反应性、组织/器官/细胞类型趋向性、细胞附着和内化的效率、细胞内运输途径、病毒体脱壳率等。可以改变衣壳蛋白(例如VP3)的序列以增强向肝的递送。

AAV构建体可以包含编码一种或更多种包装本文公开的多核苷酸序列的衣壳蛋白(VP1和/或VP2，和/或VP3衣壳蛋白，优选地仅VP3衣壳蛋白)的序列。编码用于本发明上下文的衣壳蛋白的序列可以取自任何已知的42种血清型，诸如例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、Anc80，或者通过例如衣壳改组技术和/或使用AAV衣壳文库获得的新开发的AAV样颗粒。对于衣壳蛋白序列的一些非限制性实例，参见例如美国专利第9,790,472号、第9,677,089号、第7,282,199号；国际专利申请公布第WO 2015/054653号，第WO2017/180857号(AAV8、AAV9、AAVrh10、AAVhu37、AAVrh64R1)、第WO2017/180861号(AAVrh10)、第WO2017/180854号(AAV8突变体)，和Wang等人，Mol.Ther.,2015,23(12):1877-1887(AAV8、AAVrh10、AAV3B和AAV-LK03)。当编码衣壳蛋白的序列来源于与ITR不同的AAV血清型时，AAV构建体被称为“杂合(hybrid)”细小病毒基因组(即，其中AAV衣壳和AAV末端重复来自不同的AAV)，如国际专利申请公布第WO 00/28004号和Chao等人，(2000)Molecular Therapy 2:619中描述的。

在一些实施方案中，衣壳蛋白介导AAV载体对肝的有效靶向。在一些实施方案中，衣壳蛋白介导AAV载体对肝的优先靶向。一些衣壳蛋白(例如Anc80、AAV8和AAV3B的VP3)是天然的肝特异性的。本发明还涵盖增强肝靶向和/或肝特异性的AAV衣壳突变体的用途。AAV8衣壳序列的这样的点突变的非限制性实例包括例如S279A、S671A、K137R和T252A，以及国际专利申请公布第WO2017/180854号中公开的AAV8衣壳突变(例如，AAV3G1、AAVT20或AAVTR1，氨基酸263-267[例如，263NGTSG267->SGTH或263NGTSG267->SDTH(“NGTSG”公开为SEQ ID NO:54；“SGTH”公开为SEQ ID NO:55，并且“SDTH”公开为SEQ ID NO:56)]、和/或氨基酸457-459[例如，457TAN459->SRP]、和/或氨基酸455-459[例如，455GGTAN459->DGSGL(“GGTAN”公开为SEQ ID NO:57并且“DGSGL”公开为SEQ ID NO:58)]、和/或氨基酸583-597中的VP3突变)。

在一些实施方案中，衣壳蛋白介导AAV载体对神经系统的有效靶向。在一些实施方案中，衣壳蛋白介导AAV载体对肝和对神经系统两者的优先靶向。一些衣壳蛋白会自然地靶向肝和神经系统两者。本发明还涵盖增强对肝和/或神经系统的靶向的AAV衣壳突变体的用途。

在一些实施方案中，衣壳蛋白包含一种或更多种突变，与对应的野生型衣壳蛋白相比，这些突变改善了将载体递送至肝和/或神经系统的效率和/或特异性。在一种实施方案中，改善的将载体递送至肝的效率和/或特异性导致与其他组织和器官相比，酶在肝中的表达大幅增加。在一种实施方案中，改善的将载体递送至神经系统的效率和/或特异性导致与其他组织和器官相比，酶在神经系统中的表达大幅增加。在一种实施方案中，衣壳蛋白包括VP3。在一种实施方案中，衣壳蛋白中的一种或更多种突变选自由以下组成的组S279A、S671A、K137R、T252A及其任何组合。在一种实施方案中，衣壳蛋白中的一种或更多种突变包括突变K137R。在一种实施方案中，衣壳蛋白包含序列SEQ ID NO:34。在一种实施方案中，衣壳蛋白由序列SEQ ID NO:34组成。

在一些实施方案中，衣壳蛋白包含选自由以下组成的组的一种或更多种突变：S279A、S671A、K137R、T252A及其任何组合。在一种实施方案中，衣壳蛋白中的一种或更多种突变包括突变K137R。在一种实施方案中，衣壳蛋白包含序列SEQ ID NO:3[Anc80]。在一种实施方案中，衣壳蛋白由序列SEQ ID NO:3[Anc80]组成。在一种实施方案中，衣壳蛋白包含序列SEQ ID NO:9[Anc80]。在一种实施方案中，衣壳蛋白由序列SEQ ID NO:9[Anc80]组成。在一种实施方案中，衣壳蛋白包含序列SEQ ID NO:34[Anc80L65]。在一种实施方案中，衣壳蛋白由序列SEQ ID NO:34[Anc80L65]组成。在一种实施方案中，衣壳蛋白包含序列SEQ IDNO:35[Anc80L65变体]。在一种实施方案中，衣壳蛋白由序列SEQ ID NO:35[Anc80L65变体]组成。在一种实施方案中，衣壳蛋白是突变体AAV8衣壳蛋白，诸如例如国际专利申请公布第WO2017/180854号中公开的AAV3G1、AAVT20或AAVTR1、或其他突变体衣壳蛋白(例如，包括氨基酸263-267[例如，263NGTSG267->SGTH或263NGTSG267->SDTH(“NGTSG”公开为SEQ ID NO:54；“SGTH”公开为SEQ ID NO:55，并且“SDTH”公开为SEQ ID NO:56)]、和/或氨基酸457-459[例如，457TAN459->SRP]、和/或氨基酸455-459[例如，455GGTAN459->DGSGL](“GGTAN”公开为SEQ ID NO:57并且“DGSGL”公开为SEQ ID NO:58)]、和/或氨基酸583-597中的VP3突变)。在一种实施方案中，衣壳蛋白包含序列SEQ ID NO:47[AAV-LK03]。在一种实施方案中，衣壳蛋白由序列SEQ ID NO:47[AAV-LK03]组成。在一种实施方案中，衣壳蛋白包含序列SEQ IDNO:49[AAV-KP1]。在一种实施方案中，衣壳蛋白由序列SEQ ID NO:49[AAV-KP1]组成。

本文公开的AAV载体包含编码脱氧核糖核酸酶(DNase)的核酸。在各种实施方案中，核酸还可以包含一种或更多种允许表达和分泌所编码的酶的调节序列，诸如例如启动子、增强子、多腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点(IRES)、编码蛋白转导结构域(PTD)的序列、分泌信号序列等。因此，在一些实施方案中，核酸可以包含可操作地连接到编码序列的启动子区域，以引起或改善感兴趣的蛋白在转染的细胞中的表达。这样的启动子可以是遍在性的、细胞或组织特异性的、强的、弱的、受调节的、嵌合的等，例如允许在肝和/或神经系统中有效和稳定地产生蛋白。启动子可以与编码的蛋白同源或异源，尽管通常在公开的方法中使用的启动子在人类细胞中是有功能的。受调节的启动子的实例包括但不限于含Tet开/关元件的启动子、雷帕霉素诱导型启动子、他莫昔芬诱导型启动子和金属硫蛋白启动子。可以使用的其他启动子包括组织特异性的启动子，例如对肝、神经系统和/或肠特异的启动子。肝特异性启动子的非限制性实例包括例如白蛋白启动子(Alb)、人类α-1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子、甲状腺素结合球蛋白(TBG)，载脂蛋白E肝控制区启动子、载脂蛋白A-II(APOA2)启动子、丝酶抑制蛋白肽酶抑制剂分支A成员1(SERPINA1)(hAAT)启动子、细胞色素P450家族3亚家族A多肽4(CYP3A4)启动子、微RNA 122(miR-122)启动子、肝特异性IGF-II启动子P1、鼠甲状腺素运载蛋白(MTTR)启动子和α-甲胎蛋白(AFP)启动子。神经系统特异性启动子的非限制性实例包括例如小胶质细胞特异性启动子(例如F4/80、CD68、TMEM119、CX3CR1、CMV、Iba1)、髓系特异性启动子(例如TTR、CD11b、c-fes)、神经元特异性启动子(例如CMV、NSE、突触蛋白[SynI、SynII]、CamKII、α-CaMKII、VGLUT1)和其他神经和胶质细胞(例如少突胶质细、胞星形胶质细胞)类型特异性启动子(例如GFAP)。肠特异性启动子的非限制性实例包括MUC2、绒毛蛋白、T3b、CB/CMV、GFAP、miCMV、CMV+I、tetO-CMV和β-acti-CMV。遍在性启动子的非限制性实例包括例如病毒启动子诸如CMV启动子、RSV启动子、SV40启动子等，以及细胞启动子诸如磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、EF1a启动子、CMVE/CAG启动子系统和β-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，启动子对肿瘤起源组织或转移靶组织是特异性的。

在一些实施方案中，本文公开的任何AAV载体可以包含位于启动子上游或下游的一种或更多种增强子。在一些实施方案中，一种或更多种增强子可选自由以下组成的组：载脂蛋白E(ApoE)增强子、α甲胎蛋白增强子、TTR增强子、LSP增强子、α1-微球蛋白/双库尼茨抑制剂增强子、白蛋白基因增强子(Ealb)、nPE2增强子、Gal4增强子、foxP2增强子、aMef2增强子、CMV增强子及其任何组合。在一种实施方案中，增强子是载脂蛋白E(ApoE)增强子。在一些实施方案中，增强子是肝控制区(HCR)增强子。在一些实施方案中，增强子包含与SEQID NO:17具有至少80％或至少85％或至少90％或至少95％序列同一性的序列。在一种实施方案中，增强子包含序列SEQ ID NO:17。在一种实施方案中，增强子由序列SEQ ID NO:17组成。

在以上描述的任何载体的一种实施方案中，核酸还包含多聚腺苷酸化信号，该信号可操作地连接到编码DNase酶的核苷酸序列。

在一些实施方案中，核酸还包含Kozak序列。在一种特定实施方案中，Kozak序列包含5′-GCCGCCACC-3′(SEQ ID NO:33)的序列。在一种实施方案中，核酸包含与SEQ ID NO:30至少80％相同的核苷酸序列。在一种实施方案中，核酸包含与SEQ ID NO:30至少85％相同的核苷酸序列。在一种实施方案中，核酸包含与SEQ ID NO:30至少90％相同的核苷酸序列。在一种实施方案中，核酸包含与SEQ ID NO:30至少95％相同的核苷酸序列。在一种实施方案中，核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO:30。

在以上描述的任何载体的一种实施方案中，核酸还包含转录后调节元件。在一种实施方案中，转录后调节元件是土拨鼠肝炎转录后调节元件(WPRE)。在一种实施方案中，WPRE不编码功能性X蛋白。在一种实施方案中，转录后调节元件包括与SEQ ID NO:16具有至少80％或至少85％或至少90％或至少95％序列同一性的序列。在一种实施方案中，转录后调节元件包含序列SEQ ID NO:16。在一种实施方案中，转录后调节元件由序列SEQ ID NO:16组成。

本发明的AAV载体还可以包含不可解开的末端重复。如本文使用的，表述“不可解开的末端重复(non-resolvable terminal repeat)”涉及不被AAV Rep蛋白识别和解开(即“切口(nick)”)的末端重复，使得末端重复的解开显著降低(例如，与可解开的末端重复相比至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或更高)或消除。这样的不可解开的末端重复可以是天然存在的末端重复序列(包括其改变的形式)，并且例如可以来源于细小病毒，包括AAV，或者可以来自另一种病毒，或者作为另外的替代，可以是部分或完全合成的。不可解开的末端重复可以是不被AAV Rep蛋白识别的非AAV病毒序列，或者它可以是已经被修饰(例如，通过插入、取代和/或缺失)使得它不再被AAV Rep蛋白识别的AAV末端重复。此外，不可解开的末端重复可以是在用于产生病毒载体的条件下不可解开的任何末端重复。此外，AAV末端重复可以被修饰，使得被AAV Rep蛋白的解开显著降低或消除。不可解开的末端重复可以是形成发夹结构并且不能被AAV Rep蛋白切口的任何反向重复序列。

末端反向重复(ITR)通常以至少两个拷贝存在于AAV载体中，通常位于含有编码DNase酶的核苷酸序列的表达盒的侧翼。ITR通常将位于编码DNase酶的核苷酸序列的5′端和3′端，但不需要与其相邻。ITR可以彼此相同或不同。术语“末端重复”包括形成发夹结构并作为末端反向重复发挥作用的任何病毒末端重复和/或部分或完全合成的序列，诸如Samulski等人的美国专利第5,478,745号中描述的“双D序列(double-D sequence)”。“AAV末端重复”可以来自任何AAV，包括但不限于血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、Anc80或任何现在已知或后来发现的其他AAV。AAV末端重复不需要具有野生型序列(例如，野生型序列可以通过插入、缺失、截短或错义突变来改变)，只要末端重复介导期望的功能，例如复制、切口、病毒包装、整合和/或原病毒拯救等。载体构建体可以包含一个或更多个(例如，两个)AAV末端重复，其可以相同或不同。此外，一个或更多个AAV末端重复可以来自与AAV衣壳相同的AAV血清型，或者可以不同。在特定实施方案中，载体构建体包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12和/或Anc80末端重复。

细小病毒ITR核苷酸序列通常是回文序列，包含大部分互补、对称排列的序列，也称为“A”、“B”和“C”区。ITR用作复制的起点，在复制中具有“顺式”作用的位点，即作为反式作用复制蛋白诸如例如Rep 78(或Rep68)(其识别回文序列和回文序列内部的特定序列)的识别位点。ITR序列对称性的一个例外是ITR的“D”区。D区是唯一的(在一个ITR内不具有互补序列)。单链DNA的切口发生在A区和D区之间的连接处。这是新DNA合成起始的区域。D区通常位于回文序列的一侧，并且为核酸复制步骤提供方向性。在哺乳动物细胞中复制的细小病毒通常具有两个ITR序列。然而，可以对ITR工程化，使得结合位点位于A区的两条链上，而D区对称定位，回文结构的每一侧各一个。在双链环状DNA模板(例如，质粒)上，Rep78或Rep68辅助的核酸复制然后在两个方向上进行，并且单个ITR足以用于环状载体的细小病毒复制。因此，在本发明的上下文中可以使用一个ITR核苷酸序列。可以使用两个或其他偶数个常规ITR。

功能性ITR序列对于AAV病毒体的复制、拯救和包装是必需的。ITR序列可以是野生型序列，或者可以与野生型序列具有至少80％、85％、90％、95％或100％的序列同一性。只要它们保持功能，ITR序列可以通过例如核苷酸的插入、突变、缺失或取代来改变。在这种上下文中，功能性是指指导基因组包装到衣壳壳中，并且然后允许在待转导的宿主细胞或靶细胞中表达的能力。

AAV载体可以包含单链或双链(自我互补)的DNA。单链核酸分子是有义链或反义链，因为两种极性同样能够进行基因表达。AAV载体还可以包含标志或报告基因，诸如本领域已知的例如编码抗生素抗性基因、荧光蛋白(例如GFP)的基因或编码化学、酶促或其他可检测和/或可选择的产物(例如lacZ、aph等)的基因。

AAV表达载体可以包含核酸，该核酸可以包含允许从转导的细胞分泌所编码的DNase酶的分泌信号序列。这样的分泌信号序列的非限制性实例包括例如DNase I分泌信号序列、IL2分泌信号序列、白蛋白分泌信号序列、β-葡萄糖醛酸糖苷酶分泌信号序列、碱性蛋白酶分泌信号序列和纤连蛋白分泌信号序列。

在一些实施方案中，基于AAV8或基于Anc80的载体被用作表达载体。AAV8和Anc80载体特别适合于肝靶向和表达。例如，与AAV2载体相比，AAV8和Anc80载体都可以以更高的效率转染肝细胞。与一些其他AAV载体相比，AAV8和Anc80两者还诱导更低量的中和抗体。

包含编码DNase酶的核苷酸的AAV8载体或Anc80载体可以肝内施用(例如，经由直接器官注射)或全身施用(例如，通过静脉内注射)，其中AAV8或Anc80载体有效地转染肝细胞并介导所编码的DNase酶的有效产生及其在内皮周间隙和Disse间隙中的分泌。在一些实施方案中，Anc80衣壳蛋白(例如，包含序列SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:9的Anc80 VP1衣壳蛋白，或包含SEQ ID NO:34的序列的Anc80L65 VP1衣壳蛋白，或包含SEQ ID NO:35的序列的变体Anc80L65 VP1衣壳蛋白)由表达载体中的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，AAV8衣壳蛋白(例如，AAV8 VP1或AAV8 VP3)由表达载体中的核苷酸序列编码。本发明AAV载体的外周施用可以包括全身注射，诸如例如肌肉内、静脉内、腹膜内和动脉内注射。

在一些实施方案中，基于AAV3的或AAV-LK03或AAV-KP1载体被用作表达载体。AAV3、AAV-LK03和AAV-KP1载体特别适合于肝靶向和表达。例如，与AAV2载体相比，AAV3、AAV-LK03和AAV-KP1载体可以以更高的效率转染肝细胞。与一些其他AAV载体相比，AAV-LK03和AAV-KP1两者还诱导更低量的中和抗体。

本发明编码DNase酶的AAV载体的期望剂量可以由技术人员容易地调整，例如，取决于疾病状况、受试者、治疗方案等。在一些实施方案中，每剂施用10e5至10e14个重组病毒颗粒，例如10e6至10e11、10e7至10e11或10⁸至10¹⁴。在其他实施方案中，用于实现治疗作用的示例性剂量可以包括至少约10e5、10e6、10e7、10e8、10e9、10e10或10e11个重组病毒颗粒或更多的滴度。

外源靶向序列可以替代或取代部分或全部主要衣壳亚基(例如VP3)。作为另外的替代，可以将多于一种的外源靶向序列，例如两种、三种、四种、五种或更多种序列引入到病毒体衣壳中。在可选实施方案中，可以在次要衣壳亚基(例如VP1和VP2)内进行插入和取代。对于AAV衣壳，可以在VP2或VP3中进行插入或取代。

天然病毒体的趋向性可以通过氨基酸序列的插入或取代而减少或消除。可选地，外源氨基酸序列的插入或取代可以将病毒体靶向特定的细胞类型。外源靶向序列可以是编码改变病毒体趋向性的蛋白或肽的任何氨基酸序列。在特定的实施方案中，靶向肽或蛋白可以是天然存在的，或者替代地是完全或部分合成的。示例性肽和蛋白包括与肝细胞中存在的细胞表面受体结合的配体和其他肽，包括能够结合载脂蛋白E的Sr-B1受体的配体、半乳糖和乳糖特异性凝集素、低密度脂蛋白受体配体、无唾液酸糖蛋白(半乳糖末端)配体等。

可选地，外源靶向序列可以是抗体或其抗原识别部分。如本文使用的术语“抗体”是指所有类型的免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。抗体可以是单克隆的或多克隆的，并且可以是任何物种来源的抗体，包括(例如)小鼠、大鼠、兔、马或人类，或者可以是嵌合抗体。术语“抗体”还涵盖本领域技术人员已知的双特异性或“桥接”抗体。本发明范围内的抗体片段包括例如Fab、F(ab′)2和Fc片段，以及从IgG以外的抗体获得的相应片段。这样的片段可以通过已知的技术产生。插入病毒体衣壳中的外源氨基酸序列可以是促进病毒体纯化或检测的序列。例如，外源氨基酸序列可以包括本领域技术人员已知的可用于在镍柱上纯化病毒体的多组氨酸序列，或者可用于通过标准免疫纯化技术纯化病毒体的抗原肽或蛋白。可选地，氨基酸序列可以编码受体配体或任何其他肽或蛋白，其可以用于通过亲和纯化或本领域已知的任何其他技术(例如，基于不同尺寸、密度、电荷或等电点的纯化技术、离子交换色谱或肽色谱)来纯化修饰的病毒体。

可选地，外源靶向序列可以是抗体或其抗原识别部分。如本文使用的术语“抗体”是指所有类型的免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。抗体可以是单克隆的或多克隆的，并且可以是任何物种来源的抗体，包括(例如)小鼠、大鼠、兔、马或人类，或者可以是嵌合抗体。术语“抗体”还涵盖本领域技术人员已知的双特异性或“桥接”抗体。本发明范围内的抗体片段包括例如Fab、F(ab′)2和Fc片段，以及从IgG以外的抗体获得的相应片段。这样的片段可以通过已知的技术产生。

插入病毒体衣壳中的外源氨基酸序列可以是促进病毒体纯化或检测的序列。根据本发明的这一方面，外源氨基酸序列不一定也改变修饰的细小病毒的病毒体。例如，外源氨基酸序列可以包括本领域技术人员已知的可用于在镍柱上纯化病毒体的多组氨酸序列，或者可用于通过标准免疫纯化技术纯化病毒体的抗原肽或蛋白。可选地，氨基酸序列可以编码受体配体或任何其他肽或蛋白，其可以用于通过亲和纯化或本领域已知的任何其他技术(例如，基于不同尺寸、密度、电荷或等电点的纯化技术、离子交换色谱或肽色谱)来纯化修饰的病毒体。

在一些实施方案中，本文公开的AAV载体可用于治疗和/或预防有相应需要的受试者的神经退行性疾病、神经发育性疾病、精神病、肿瘤疾病或自身免疫性疾病或感染，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的任何以上描述的rAAV载体或包含这样的载体的药物组合物。

启动子

在一些实施方案中，本文公开的载体可以是重组腺相关病毒(rAAV)表达载体，包含(i)衣壳蛋白和(ii)核酸，该核酸包含可操作地连接到编码脱氧核糖核酸酶(DNase)的核苷酸序列的启动子。在一些实施方案中，启动子是肝特异性启动子。在一些实施方案中，启动子对肿瘤起源组织或转移靶组织是特异性的。在一些实施方案中，肝特异性启动子对肿瘤起源组织或转移靶组织是特异性的。

可用于本发明载体的启动子的非限制性实例包括例如白蛋白启动子、α1-抗胰蛋白酶(AAT)启动子、甲状腺激素结合球蛋白启动子、α甲胎蛋白启动子、醇脱氢酶启动子、因子VIII(FVIII)启动子、HBV基本核心启动子(BCP)、HBV PreS2启动子、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)启动子、甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子、肝控制区(HCR)-ApoCII杂合启动子、HCR-hAAT杂合启动子、载脂蛋白E(ApoE)启动子、低密度脂蛋白启动子、丙酮酸激酶启动子、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶启动子、苯丙氨酸羟化酶启动子、卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)启动子、载脂蛋白H(ApoH)启动子、载脂蛋白A-II启动子(APOA2)、转铁蛋白启动子、甲状腺素运载蛋白启动子、α-纤维蛋白原启动子、β-纤维蛋白原启动子、α1-抗胰凝乳蛋白酶启动子、α2-HS糖蛋白启动子、触珠蛋白启动子、铜蓝蛋白启动子、纤溶酶原启动子、补体蛋白启动子、α1-酸性糖蛋白启动子、LSP1启动子、丝酶抑制蛋白肽酶抑制剂分支A成员1(SERPINA1)(hAAT)启动子、细胞色素P450家族3亚家族A多肽4(CYP3A4)启动子、微RNA 122(miR-122)启动子、肝特异性IGF-II启动子P1、甲状腺素运载蛋白(MTTR)启动子和α-甲胎蛋白(AFP)启动子。

在一些实施方案中，启动子是肝特异性/神经系统特异性串联启动子。在一些实施方案中，与其他组织和器官相比，肝特异性/神经系统特异性串联启动子介导肝和/或神经系统中大幅增加的酶的表达。在一些实施方案中，肝特异性/神经系统特异性串联启动子包含选自由以下组成的组的肝特异性启动子：白蛋白启动子、α1-抗胰蛋白酶(AAT)启动子、甲状腺激素结合球蛋白启动子、α甲胎蛋白启动子、醇脱氢酶启动子、因子VIII(FVIII)启动子、HBV基本核心启动子(BCP)、HBV PreS2启动子、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)启动子、甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子、肝控制区(HCR)-ApoCII杂合启动子、HCR-hAAT杂合启动子、载脂蛋白E(ApoE)启动子、低密度脂蛋白启动子、丙酮酸激酶启动子、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶启动子、苯丙氨酸羟化酶启动子、卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)启动子、载脂蛋白H(ApoH)启动子、载脂蛋白A-II启动子(APOA2)、转铁蛋白启动子、甲状腺素运载蛋白启动子、α-纤维蛋白原启动子、β-纤维蛋白原启动子、α1-抗胰凝乳蛋白酶启动子、α2-HS糖蛋白启动子、触珠蛋白启动子、铜蓝蛋白启动子、纤溶酶原启动子、补体蛋白启动子、α1-酸性糖蛋白启动子、LSP1启动子、丝酶抑制蛋白肽酶抑制剂分支A成员1(SERPINA1)(hAAT)启动子、细胞色素P450家族3亚家族A多肽4(CYP3A4)启动子、微RNA 122(miR-122)启动子、肝特异性IGF-II启动子P1、甲状腺素运载蛋白(MTTR)启动子和α-甲胎蛋白(AFP)启动子。在一些实施方案中，肝特异性启动子是抗胰蛋白酶(AAT)启动子。在一些实施方案中，AAT启动子是人类α1-抗胰蛋白酶(hAAT)启动子。在一些实施方案中，肝特异性启动子包含与序列SEQ ID NO:15具有至少80％或至少85％或至少90％或至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，肝特异性启动子包含序列SEQ ID NO:15。在一些实施方案中，肝特异性启动子由序列SEQID NO:15组成。在一些实施方案中，肝特异性启动子是白蛋白启动子。在一些实施方案中，肝特异性启动子包含与序列SEQ ID NO:8具有至少80％或至少85％或至少90％或至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，肝特异性启动子包含序列SEQ ID NO:8。在一些实施方案中，肝特异性启动子由序列SEQ ID NO:8组成。在一些实施方案中，肝特异性/神经系统特异性串联启动子包含选自由以下组成的组的神经系统特异性启动子：F4/80启动子、CD68启动子、TMEM119启动子、CX3CR1启动子、CMV启动子、MEF2启动子、FoxP2启动子、Iba1启动子、TTR启动子、CD11b启动子、c-fes启动子、NSE启动子、突触蛋白启动子、CamKII启动子、α-CaMKII启动子、VGLUT1启动子和胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)启动子。在一些实施方案中，神经系统特异性启动子是突触蛋白启动子。在一些实施方案中，突触蛋白启动子是人类突触蛋白启动子。在一种实施方案中，神经系统特异性启动子是F4/80启动子。在一些实施方案中，神经系统特异性启动子是CMV启动子。在一些实施方案中，神经系统特异性启动子是TMEM119启动子。在一些实施方案中，神经系统特异性启动子是MEF2启动子。在一些实施方案中，神经系统特异性启动子是FoxP2启动子。在一些实施方案中，肝特异性/神经系统特异性串联启动子包含神经特异性启动子，该神经特异性启动子包含与序列SEQ ID NO:36和38-42中的任一种具有至少80％或至少85％或至少90％或至少95％序列同一性的序列。在一种实施方案中，神经系统特异性启动子包含序列SEQ ID NO:36和38-42中的任一种。在一种实施方案中，神经系统特异性启动子由序列SEQ ID NO:36和38-42中的任一种组成。

在本发明的任何方法的一些实施方案中，启动子是肝特异性启动子。在本发明的任何方法的一些实施方案中，与其他组织和器官相比，肝特异性启动子介导肝中大幅增加的酶表达。肝特异性启动子的非限制性实例包括例如白蛋白启动子(Alb)、人类α-1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子、甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子、载脂蛋白E肝控制区启动子、载脂蛋白A-II(APOA2)启动子、丝酶抑制蛋白肽酶抑制剂分支A成员1(SERPINA1)(hAAT)启动子、细胞色素P450家族3亚家族A多肽4(CYP3A4)启动子、微RNA 122(miR-122)启动子、肝特异性IGF-II启动子P1、鼠甲状腺素运载蛋白(MTTR)启动子、α甲胎蛋白(AFP)启动子、甲状腺激素结合球蛋白启动子、醇脱氢酶启动子、因子VIII(FVIII)启动子、HBV基本核心启动子(BCP)和PreS2启动子、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)启动子、肝控制区(HCR)-ApoCII杂合启动子、与小鼠白蛋白基因增强子(Ealb)元件组合的AAT启动子、低密度脂蛋白启动子、丙酮酸激酶启动子、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶启动子、卵磷脂-胆固醇酰基转移酶(LCAT)启动子、载脂蛋白H(ApoH)启动子、转铁蛋白启动子、甲状腺素运载蛋白启动子、α-纤维蛋白原和β-纤维蛋白原启动子、α1-抗胰凝乳蛋白酶启动子、α2-HS糖蛋白启动子、触珠蛋白启动子、铜蓝蛋白启动子、纤溶酶原启动子、补体蛋白(例如，C1q、C1r、C2、C3、C4、C5、C6、C8、C9、补体因子I和因子H)启动子、C3补体激活子和[α]1-酸性糖蛋白启动子。另外的组织特异性启动子可见于组织特异性启动子数据库(Tissue-Specific Promoter Database,TiProD)(NucleicAcids Research,J4:D104-D107(2006))。

在一些实施方案中，例如，当肝靶向由衣壳蛋白介导时，编码DNase酶的核酸可以可操作地连接到允许有效全身表达的启动子(例如，CMV启动子、鸡β肌动蛋白启动子(CBA)、EF1a启动子)。

在一些实施方案中，肝特异性启动子是α1-抗胰蛋白酶(AAT)启动子。在一种特定实施方案中，抗胰蛋白酶启动子是人类α1-抗胰蛋白酶(AAT)启动子。在一些实施方案中，启动子是α1-抗胰蛋白酶(AAT)启动子。在一些实施方案中，启动子是人类α1-抗胰蛋白酶(hAAT)启动子。在一些实施方案中，抗胰蛋白酶启动子包含与SEQ ID NO:15的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，AAT启动子包含SEQ IDNO:15的序列。在一些实施方案中，AAT启动子由SEQ ID NO:15的序列组成。

在一些实施方案中，启动子区域可以可操作地连接到编码序列，以引起或改善感兴趣的蛋白在转染的细胞中的表达。这样的启动子可以是遍在性的、细胞或组织特异性的、强的、弱的、受调节的、嵌合的等，例如允许在肝和/或神经系统中有效和稳定地产生蛋白。启动子可以与编码的蛋白同源或异源，尽管通常在公开的方法中使用的启动子在人类细胞中是有功能的。受调节的启动子的实例包括但不限于含Tet开/关元件的启动子、雷帕霉素诱导型启动子、他莫昔芬诱导型启动子和金属硫蛋白启动子。

在一些实施方案中，可用于本发明的启动子可包括组织特异性的启动子，例如对肝和/或神经系统特异的启动子。肝特异性启动子的非限制性实例包括例如白蛋白启动子(Alb)、人类α-1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子、甲状腺素结合球蛋白(TBG)，载脂蛋白E肝控制区启动子、载脂蛋白A-II(APOA2)启动子、丝酶抑制蛋白肽酶抑制剂分支A成员1(SERPINA1)(hAAT)启动子、细胞色素P450家族3亚家族A多肽4(CYP3A4)启动子、微RNA122(miR-122)启动子、肝特异性IGF-II启动子P1、鼠甲状腺素运载蛋白(MTTR)启动子和α-甲胎蛋白(AFP)启动子。神经系统特异性启动子的非限制性实例包括例如小胶质细胞特异性启动子(例如F4/80、CD68、TMEM119、CX3CR1、CMV、Iba1)、髓系特异性启动子(例如TTR、CD11b、c-fes)、神经元特异性启动子(例如CMV、NSE、突触蛋白[SynI、SynII]、CamKII、α-CaMKII、VGLUT1)和其他神经和胶质细胞(例如少突胶质细胞、星形胶质细胞)类型特异性启动子(例如GFAP)。肠特异性启动子的非限制性实例包括MUC2、绒毛蛋白、T3b、CB/CMV、GFAP、miCMV、CMV+I、tetO-CMV和β-acti-CMV。

在一些实施方案中，可用于本发明的启动子可以包括遍在性启动子。遍在性启动子的非限制性实例包括例如病毒启动子诸如CMV启动子、RSV启动子、SV40启动子等，以及细胞启动子诸如磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、EF1a启动子、CMVE/CAG启动子系统和β-肌动蛋白启动子。

DNase酶施用

在一方面，本发明提供了治疗有相应需要的受试者的癌症的方法，包括向受试者施用脱氧核糖核酸酶和至少一种包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞。

在相关方面，本发明提供了治疗有相应需要的受试者的癌症的方法，包括向受试者施用脱氧核糖核酸酶和至少一种包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞，其中所述脱氧核糖核酸酶有效地减少肿瘤组织中免疫抑制蛋白的表达和/或增加肿瘤组织内包含嵌合抗原受体或T细胞受体的细胞的含量。免疫抑制蛋白的非限制性例子包括例如PD-L1、PD-L2、CD80、CD86和MHC。

根据本发明方法的DNase酶施用可以通过任何合适的途径进行，包括全身施用以及直接施用到疾病部位(例如，施用到原发性肿瘤)。有用的施用途径的具体非限制性实例包括静脉内(IV)、皮下(SC)、腹膜内(IP)和肌肉内。

在任何上述方法的一些实施方案中，脱氧核糖核酸酶蛋白经由注射施用。在一些实施方案中，脱氧核糖核酸酶蛋白经由静脉内注射施用。在一些实施方案中，在输注本文公开的CAR表达细胞或TCR表达细胞之后，静脉内注射脱氧核糖核酸酶蛋白。在一些实施方案中，在输注本文公开的CAR表达细胞或TCR表达细胞之前，静脉内注射脱氧核糖核酸酶蛋白。在一些实施方案中，静脉内注射脱氧核糖核酸酶蛋白，同时一起输注本文公开的CAR表达细胞或TCR表达细胞。在一些实施方案中，在输注CAR表达细胞或TCR表达细胞之后，静脉内注射脱氧核糖核酸酶蛋白至少14天。在一些实施方案中，在输注CAR表达细胞或TCR表达细胞后，静脉内注射脱氧核糖核酸酶蛋白至少16天。在一些实施方案中，在输注CAR表达细胞或TCR表达细胞之前、同时或之后静脉内注射脱氧核糖核酸酶蛋白至少3天。在一些实施方案中，在输注CAR表达细胞或TCR表达细胞之后，静脉内注射脱氧核糖核酸酶蛋白至少7天。在一些实施方案中，在输注CAR表达细胞或TCR表达细胞之前，静脉内注射脱氧核糖核酸酶蛋白至少7天。在一些实施方案中，在输注CAR表达细胞或TCR表达细胞之前或之后，静脉内注射脱氧核糖核酸酶蛋白至少3天。在一些实施方案中，静脉内注射脱氧核糖核酸酶蛋白至少14天。

在本发明方法中有用的DNase剂量取决于CAR/TCR疗法的类型、患者的临床病史和对DNase的响应，以及主治医师的判断。有用剂量范围的非限制性实例包括0.5至100mg/kg/天，或1000至200000KU/kg/天，优选地0.5至50mg/kg/天，或1000至100000Kunitz单位(KU)/kg/天，更优选地1.5至50mg/kg/天，或3000至100000KU/kg/天，最优选地10至50mg/kg/天，或20000至100000KU/kg/天。

在一些实施方案中，以250μg/kg/天静脉内注射脱氧核糖核酸酶蛋白。在一些实施方案中，以250μg/kg/天静脉内注射脱氧核糖核酸酶蛋白至少14天。

在一些实施方案中，CAR包含能够特异性结合选自以下的一种或更多种抗原的实体瘤相关靶抗原结合结构域：BCMA、CD44v6、CAIX(碳酸酐酶IX)、CEA(癌胚抗原)、CD5、CD7、CD19、CD20、CD22、CD30、CD36、CD37、CD70、CD123、CD133、c-Met(肝细胞生长因子受体)、EGFR(表皮生长因子)、EGFRvIII(III型变体表皮生长因子、EGFRB3、Epcam(上皮细胞黏附分子)、EphA2(产红细胞生成素肝细胞癌A2)、胎儿乙酰胆碱受体、FLT3、GD2(神经节苷脂GD2)、GPC3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3)、GUCY2C(鸟苷酸环化酶C)、HER1(人类表皮生长因子受体1)、HER2(人类表皮生长因子受体2)、ICAM-1(细胞间黏附分子1)、IL3R-α、IL13Rα2(白细胞介素13受体α2)、IL11Rα(白细胞介素11受体α)、Kras(Kristen大鼠肉瘤病毒癌基因同源物)、KrasG12D、L1CAM(L1细胞黏附分子)、MAGE、MET、间皮素、MUC(黏蛋白1)、MUC16 ecto(黏蛋白16)、NKG2D(自然杀伤组2成员D)、NY-ESO-1、PSCA(前列腺干细胞抗原)、PSMA、ROR1和WT-1(肾母细胞瘤1)。

如本文使用的，“有效量”包括适于治疗患有临床上定义的紊乱的哺乳动物的剂量。

“类似物”、“变体”或“衍生物”是与天然存在的分子在结构上大体上相似并且具有相同的生物活性(尽管在某些情况下程度不同)的化合物。例如，多肽变体是指与参考多肽共享大体上相似的结构并且具有相同的生物活性的多肽。基于一个或更多个突变，变体或类似物与类似物衍生自的天然存在的多肽相比在它们的氨基酸序列的组成方面不同，所述突变包括(i)在多肽的一个或更多个末端和/或天然存在的多肽序列的一个或更多个内部区域(例如片段)处一个或更多个氨基酸残基的缺失，(ii)在多肽的一个或更多个末端(典型地“添加”或“融合”)和/或天然存在的多肽序列的一个或更多个内部区域(典型地“插入”)处一个或更多个氨基酸的插入或添加，或(iii)将天然存在的多肽序列中一个或更多个氨基酸取代为其他氨基酸。通过实例的方式，“衍生物”是指已经被修饰(例如化学地修饰)的与参考多肽共享相同或大体上相似的结构的多肽。

变体或类似物多肽包括插入变体，其中一个或更多个氨基酸残基被添加到本发明的蛋白氨基酸序列中。插入序列(insertion)可以位于蛋白的任一末端或两个末端处，和/或可以被定位在蛋白氨基酸序列的内部区域内。在任一末端或两个末端处具有另外的残基的插入变体包括例如融合蛋白和包含氨基酸标签或其他氨基酸标记的蛋白。在一方面，蛋白分子任选地包含N-末端Met，特别是当该分子在例如酵母、昆虫细胞或细菌细胞诸如大肠杆菌中重组表达时。

在缺失变体中，如本文描述的蛋白或多肽中的一个或更多个氨基酸残基被去除。缺失可以在蛋白或多肽的一个或两个末端处实现，和/或通过在蛋白氨基酸序列内去除一个或更多个残基实现。因此，缺失变体包括蛋白或多肽序列的片段。

在取代变体中，蛋白或多肽的一个或更多个氨基酸残基被去除并被可选的残基替代。在一方面，取代本质上是保守的，并且这种类型的保守取代是本领域熟知的。替代地，本发明也包括非保守的取代。示例性的保守取代在通过引用并入本文的Lehninger,[Biochemistry,第2版；Worth Publishers,Inc.,New York(1975),第71-77页]中被描述。

脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物，和/或至少一种包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞可以口服、局部(topically)、经皮、肠胃外、通过吸入喷雾、阴道、直肠或通过颅内注射施用。如本文使用的术语肠胃外包括皮下注射、静脉内、肌肉内、脑池内注射或输注技术。也设想了通过静脉内、皮内、肌肉内、乳房内、腹膜内、鞘内、眼球后、肺内注射和/或在特定部位处的手术植入施用。通常，脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物，和/或至少一种包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞基本上不含致热原以及可能对接受者有害的其它杂质。

脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物，和/或至少一种包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞的单次或多于一次施用可以用治疗医师选择的剂量水平和模式进行。对于癌症的预防或治疗，适当的剂量将取决于如上文所描述的待治疗的疾病的类型、癌症的严重程度和进程、药物被施用是用于预防目的还是治疗目的、先前的治疗、患者的临床病史和对药物的响应，以及主治医师的判断。

本发明还涉及脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物，和/或至少一种包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞，包含药学上可接受的载体、稀释剂、盐、缓冲剂或赋形剂。药物组合物可以用于治疗临床上定义的紊乱。本发明的药物组合物可以是溶液或冻干产品。药物组合物的溶液可以进行任何合适的冻干过程。

在该实施方案的其他方面，本文公开的脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物使癌症的严重程度降低例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在该实施方案的又其他方面，本文公开的脱氧核糖核酸酶蛋白使肿瘤尺寸降低例如，约5％至约100％、约10％至约100％、约20％至约100％、约30％至约100％、约40％至约100％、约50％至约100％、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％、约10％至约90％、约20％至约90％、约30％至约90％、约40％至约90％、约50％至约90％、约60％至约90％、约70％至约90％、约10％至约80％、约20％至约80％、约30％至约80％、约40％至约80％、约50％至约80％、或约60％至约80％、约10％至约70％、约20％至约70％、约30％至约70％、约40％至约70％或约50％至约70％。

在该实施方案的方面，本文公开的脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物的剂量可以是例如至少25μg/kg、至少50μg/kg、至少75μg/kg、至少100μg/kg、至少125μg/kg、至少150μg/kg、至少175μg/kg、至少200μg/kg、至少225μg/kg、至少250μg/kg、至少275μg/kg、至少300μg/kg、至少325μg/kg、至少350μg/kg、至少375μg/kg、至少400μg/kg、至少425μg/kg、至少450μg/kg、至少475μg/kg、至少500μg/kg、至少525μg/kg、至少550μg/kg、至少575μg/kg、至少600μg/kg、至少625μg/kg、至少650μg/kg、至少67μg/kg、至少700μg/kg、至少725μg/kg、至少750μg/kg、至少775μg/kg、至少800μg/kg、至少825μg/kg、至少850μg/kg、至少875μg/kg、至少900μg/kg、至少925μg/kg、至少950μg/kg、至少975μg/kg、至少1mg/kg、至少1.25mg/kg、至少1.5mg/kg、至少2mg/kg、至少2.5mg/kg、至少3mg/kg、至少3.5mg/kg、至少4mg/kg、至少4.5mg/kg、至少5mg/kg、至少5.5mg/kg、至少6mg/kg、至少6.5mg/kg、至少7mg/kg、至少7.5mg/kg、至少8mg/kg、至少8.5mg/kg、至少9mg/kg、至少9.5mg/kg、至少10mg/kg、至少10.5mg/kg、至少11mg/kg、至少11.5mg/kg、至少12mg/kg、至少12.5mg/kg、至少13mg/kg、至少13.5mg/kg、至少14mg/kg、至少14.5mg/kg、至少15mg/kg、至少15.5mg/kg、至少16mg/kg、至少16.5mg/kg、至少17mg/kg、至少17.5mg/kg、至少18mg/kg、至少18.5mg/kg、至少19mg/kg、至少19.5mg/kg、至少20mg/kg、至少20.5mg/kg、至少21mg/kg、至少21.5mg/kg、至少22mg/kg、至少22.5mg/kg、至少23mg/kg、至少23.5mg/kg、至少24mg/kg、至少24.5mg/kg、至少25mg/kg、至少25.5mg/kg、至少26mg/kg、至少26.5mg/kg、至少27mg/kg、至少27.5mg/kg、至少28mg/kg、至少28.5mg/kg、至少29mg/kg、至少29.5mg/kg、至少30mg/kg、至少31mg/kg、至少32mg/kg、至少33mg/kg、至少34mg/kg、至少35mg/kg、36mg/kg、至少37mg/kg、至少38mg/kg、至少39mg/kg、至少40mg/kg、41mg/kg、至少42mg/kg、至少43mg/kg、至少44mg/kg、至少45mg/kg、至少46mg/kg、至少mg/kg、至少48mg/kg、至少49mg/kg至少50mg/kg、至少51mg/kg、至少52mg/kg、至少53mg/kg、至少54mg/kg、至少55mg/kg、至少56mg/kg、至少57mg/kg、至少58mg/kg、至少59mg/kg、至少60mg/kg、至少61mg/kg、至少62mg/kg、至少63mg/kg、至少64mg/kg、至少65mg/kg、至少66mg/kg、至少67mg/kg、至少68mg/kg、至少69mg/kg、至少70mg/kg、至少71mg/kg、至少72mg/kg、至少73mg/kg、至少74mg/kg、至少75mg/kg、至少76mg/kg、至少77mg/kg、至少78mg/kg、至少79mg/kg、至少80mg/kg、81mg/kg、至少82mg/kg、至少83mg/kg、至少84mg/kg、至少85mg/kg、至少86mg/kg、至少87mg/kg、至少88mg/kg、至少89mg/kg、至少90mg/kg、至少91mg/kg、至少92mg/kg、至少93mg/kg、至少94mg/kg、至少95mg/kg、至少96mg/kg、至少97mg/kg、至少98mg/kg、至少99mg/kg、至少100mg/kg、至少150mg/kg、至少200mg/kg、至少250mg/kg、至少300mg/kg、至少350mg/kg、至少400mg/kg、至少450mg/kg、至少500mg/kg、至少550mg/kg、至少600mg/kg、至少650mg/kg、至少700mg/kg、至少750mg/kg、至少800mg/kg、至少850mg/kg、至少900mg/kg、至少950mg/kg、至少1g/kg、至少2g/kg、至少3g/kg、至少4g/kg、至少5g/kg、至少6g/kg、至少7g/kg、至少8g/kg、至少9g/kg、至少10g/kg、至少15g/kg、至少20g/kg、至少25g/kg、至少50g/kg、至少100g/kg。

在该实施方案的方面，本文公开的脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物的剂量可以是例如约25μg/kg、约50μg/kg、约75μg/kg、约100μg/kg、约125μg/kg、约150μg/kg、约175μg/kg、约200μg/kg、约225μg/kg、约250μg/kg、约275μg/kg、约300μg/kg、约325μg/kg、约350μg/kg、约375μg/kg、约400μg/kg、约425μg/kg、约450μg/kg、约475μg/kg、约500μg/kg、约525μg/kg、约550μg/kg、约575μg/kg、约600μg/kg、约625μg/kg、约650μg/kg、约675μg/kg、约700μg/kg、约725μg/kg、约750μg/kg、约775μg/kg、约800μg/kg、约825μg/kg、约850μg/kg、约875μg/kg、约900μg/kg、约925μg/kg、约950μg/kg、约975μg/kg、约1mg/kg、约1.25mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约3.5mg/kg、约4mg/kg、约4.5mg/kg、约5mg/kg、约5.5mg/kg、约6mg/kg、约6.5mg/kg、约7mg/kg、约7.5mg/kg、约8mg/kg、约8.5mg/kg、约9mg/kg、约9.5mg/kg、约10mg/kg、约10.5mg/kg、约11mg/kg、约11.5mg/kg、约12mg/kg、约12.5mg/kg、约13mg/kg、约13.5mg/kg、约14mg/kg、约14.5mg/kg、约15mg/kg、约15.5mg/kg、约16mg/kg、约16.5mg/kg、约17mg/kg、约17.5mg/kg、约18mg/kg、约18.5mg/kg、约19mg/kg、约19.5mg/kg、约20mg/kg、约20.5mg/kg、约21mg/kg、约21.5mg/kg、约22mg/kg、约22.5mg/kg、约23mg/kg、约23.5mg/kg、约24mg/kg、约24.5mg/kg、约25mg/kg、约25.5mg/kg、约26mg/kg、约26.5mg/kg、约27mg/kg、约27.5mg/kg、约28mg/kg、约28.5mg/kg、约29mg/kg、约29.5mg/kg、约30mg/kg、约31mg/kg、约32mg/kg、约33mg/kg、约34mg/kg、约35mg/kg、36mg/kg、约37mg/kg、约38mg/kg、约39mg/kg、约40mg/kg、41mg/kg、约42mg/kg、约43mg/kg、约44mg/kg、约45mg/kg、约46mg/kg、约mg/kg、约48mg/kg、约49mg/kg约50mg/kg、约51mg/kg、约52mg/kg、约53mg/kg、约54mg/kg、约55mg/kg、约56mg/kg、约57mg/kg、约58mg/kg、约59mg/kg、约60mg/kg、约61mg/kg、约62mg/kg、约63mg/kg、约64mg/kg、约65mg/kg、约66mg/kg、约67mg/kg、约68mg/kg、约69mg/kg、约70mg/kg、约71mg/kg、约72mg/kg、约73mg/kg、约74mg/kg、约75mg/kg、约76mg/kg、约77mg/kg、约78mg/kg、约79mg/kg、约80mg/kg、81mg/kg、约82mg/kg、约83mg/kg、约84mg/kg、约85mg/kg、约86mg/kg、约87mg/kg、约88mg/kg、约89mg/kg、约90mg/kg、约91mg/kg、约92mg/kg、约93mg/kg、约94mg/kg、约95mg/kg、约96mg/kg、约97mg/kg、约98mg/kg、约99mg/kg、约100mg/kg、约150mg/kg、约200mg/kg、约250mg/kg、约300mg/kg、约350mg/kg、约400mg/kg、约450mg/kg、约500mg/kg、约550mg/kg、约600mg/kg、约650mg/kg、约700mg/kg、约750mg/kg、约800mg/kg、约850mg/kg、约900mg/kg、约950mg/kg、约1g/kg、约2g/kg、约3g/kg、约4g/kg、约5g/kg、约6g/kg、约7g/kg、约8g/kg、约9g/kg、约10g/kg、约15g/kg、约20g/kg、约25g/kg、约50g/kg、约100g/kg。

在该实施方案的方面，本文公开的脱氧核糖核酸酶和/或其衍生物、变体或类似物的剂量可以是例如不超过25μg/kg、不超过50μg/kg、不超过75μg/kg、不超过100μg/kg、不超过125μg/kg、不超过150μg/kg、不超过175μg/kg、不超过200μg/kg、不超过225μg/kg、不超过250μg/kg、不超过275μg/kg、不超过300μg/kg、不超过325μg/kg、不超过350μgikg、不超过375μg/kg、不超过400μg/kg、不超过425μg/kg、不超过450μg/kg、不超过475μg/kg、不超过500μg/kg、不超过525μg/kg、不超过550μg/kg、不超过575μg/kg、不超过600μg/kg、不超过625μg/kg、不超过650μg/kg、不超过675μg/kg、不超过700μg/kg、不超过725μg/kg、不超过750μg/kg、不超过775μg/kg、不超过800μg/kg、不超过825μg/kg、不超过850μg/kg、不超过875μg/kg、不超过900μg/kg、不超过925μg/kg、不超过950μg/kg、不超过975μg/kg、不超过1mg/kg、不超过1.25mg/kg、不超过1.5mg/kg、不超过2mg/kg、不超过2.5mg/kg、不超过3mg/kg、不超过3.5mg/kg,不超过4mg/kg、不超过4.5mg/kg、不超过5mg/kg、不超过5.5mg/kg、不超过6mg/kg、不超过6.5mg/kg、不超过7mg/kg、不超过7.5mg/kg、不超过8mg/kg、不超过8.5mg/kg、不超过9mg/kg、不超过9.5mg/kg、不超过10mg/kg、不超过10.5mg/kg、不超过11mg/kg、不超过11.5mg/kg、不超过12mg/kg、不超过12.5mg/kg、不超过13mg/kg、不超过13.5mg/kg、不超过14mg/kg、不超过14.5mg/kg、不超过15mg/kg、不超过15.5mg/kg、不超过16mg/kg、不超过16.5mg/kg、不超过17mg/kg、不超过17.5mg/kg、不超过18mg/kg、不超过18.5mg/kg、不超过19mg/kg、不超过19.5mg/kg、不超过20mg/kg、不超过20.5mg/kg、不超过21mg/kg、不超过21.5mg/kg、不超过22mg/kg、不超过22.5mg/kg、不超过23mg/kg、不超过23.5mg/kg、不超过24mg/kg、不超过24.5mg/kg、不超过25mg/kg、不超过25.5mg/kg、不超过26mg/kg、不超过26.5mg/kg、不超过27mg/kg、不超过27.5mg/kg、不超过28mg/kg、不超过28.5mg/kg、不超过29mg/kg、不超过29.5mg/kg、不超过30mg/kg、不超过31mg/kg、不超过32mg/kg、不超过33mg/kg、不超过34mg/kg、不超过35mg/kg、36mg/kg、不超过37mg/kg、不超过38mg/kg、不超过39mg/kg、不超过40mg/kg、41mg/kg、不超过42mg/kg、不超过43mg/kg、不超过44mg/kg、不超过45mg/kg、不超过46mg/kg、不超过mg/kg、不超过48mg/kg、不超过49mg/kg不超过50mg/kg、不超过51mg/kg、不超过52mg/kg、不超过53mg/kg、不超过54mg/kg、不超过55mg/kg、不超过56mg/kg、不超过57mg/kg、不超过58mg/kg、不超过59mg/kg、不超过60mg/kg、不超过61mg/kg、不超过62mg/kg、不超过63mg/kg、不超过64mg/kg、不超过65mg/kg,不超过66mg/kg、不超过67mg/kg、不超过68mg/kg、不超过69mg/kg、不超过70mg/kg、不超过71mg/kg、不超过72mg/kg、不超过73mg/kg、不超过74mg/kg、不超过75mg/kg、不超过76mg/kg、不超过77mg/kg、不超过78mg/kg、不超过79mg/kg、不超过80mg/kg、81mg/kg、不超过82mg/kg、不超过83mg/kg、不超过84mg/kg、不超过85mg/kg、不超过86mg/kg、不超过87mg/kg、不超过88mg/kg、不超过89mg/kg、不超过90mg/kg、不超过91mg/kg、不超过92mg/kg、不超过93mg/kg、不超过94mg/kg、不超过95mg/kg、不超过96mg/kg、不超过97mg/kg、不超过98mg/kg、不超过99mg/kg、不超过100mg/kg、不超过150mg/kg、不超过200mg/kg、不超过250mg/kg、不超过300mg/kg、不超过350mg/kg、不超过400mg/kg、不超过450mg/kg、不超过500mg/kg、不超过550mg/kg、不超过600mg/kg、不超过650mg/kg、不超过700mg/kg、不超过750mg/kg、不超过800mg/kg、不超过850mg/kg、不超过900mg/kg、不超过950mg/kg、不超过1g/kg、不超过2g/kg、不超过3g/kg、不超过4g/kg、不超过5g/kg、不超过6g/kg、不超过7g/kg、不超过8g/kg、不超过9g/kg、不超过10g/kg、不超过15g/kg、不超过20g/kg、不超过25g/kg、不超过50g/kg、不超过100g/kg。

在该实施方案的又其他方面，本文公开的脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物的剂量范围可以是例如约1μg/kg至约30mg/kg、约5μg/kg至约50mg/kg、约5μg/kg至约75μg/kg、约100μg/kg至约40mg/kg、约500μg/kg至约35mg/kg、约100μg/kg至约30mg/kg、约150μg/kg至约35mg/kg、约250μg/kg至约25mg/kg、约350μg/kg至约30mg/kg、约500μg/kg至约25mg/kg、约150μg/kg至约30mg/kg、约750μg/kg至约30mg/kg、约500μg/kg至约12mg/kg、约200μg/kg至约30mg/kg、约250μg/kg至约40mg/kg、约100μg/kg至约10mg/kg、约200μg/kg至约35mg/kg、约500μg/kg至约30mg/kg、或约10μg/kg至约30mg/kg、约1mg/kg至约30mg/kg、约5mg/kg至约50mg/kg、约5mg/kg至约75mg/kg、约10mg/kg至约40mg/kg、约5mg/kg至约35mg/kg、约10mg/kg至约30mg/kg、约15mg/kg至约35mg/kg、约25mg/kg至约50mg/kg、约35mg/kg至约60mg/kg、约50mg/kg至约75mg/kg、约15mg/kg至约60mg/kg、约150mg/kg至约100mg/kg、约5mg/kg至约120mg/kg、约20mg/kg至约60mg/kg、约25mg/kg至约75mg/kg、约10mg/kg至约35mg/kg、约20mg/kg至约35mg/kg、约15mg/kg至约30mg/kg或约10mg/kg至约30mg/kg。

在该实施方案的方面，本文公开的治疗有效量的脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物使与癌症相关的症状减少例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。

在该实施方案的其他方面，本文公开的治疗有效量的脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物使与癌症相关的症状减少例如至多10％、至多15％、至多20％、至多25％、至多30％、至多35％、至多40％、至多45％、至多50％、至多55％、至多60％、至多65％、至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％、至多95％或至多100％。

在该实施方案的又其他方面，本文公开的治疗有效量的脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物使与癌症相关的症状减少例如约10％至约100％、约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约10％至约60％、约10％至约50％、约10％至约40％、约20％至约100％、约20％至约90％、约20％至约80％、约20％至约20％、约20％至约60％、约20％至约50％、约20％至约40％、约30％至约100％、约30％至约90％、约30％至约80％、约30％至约70％、约30％至约60％或约30％至约50％。

在一种实施方案中，与未接受相同治疗的患者相比，本文公开的脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物能够使罹患癌症的个体的疾病严重程度降低，例如，至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。

在该实施方案的其他方面，与未接受相同治疗的患者相比，脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物能够使罹患癌症的个体的疾病严重程度降低，例如，约10％至约100％、约20％至约100％、约30％至约100％、约40％至约100％、约50％至约100％、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％、约10％至约90％、约20％至约90％、约30％至约90％、约40％至约90％、约50％至约90％、约60％至约90％、约70％至约90％、约10％至约80％、约20％至约80％、约30％至约80％、约40％至约80％、约50％至约80％、或约60％至约80％、约10％至约70％、约20％至约70％、约30％至约70％、约40％至约70％或约50％至约70％。

在该实施方案的方面，本文公开的治疗有效量的脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物、以及至少一种包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞使与癌症相关的症状减少例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。

在该实施方案的其他方面，本文公开的治疗有效量的脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物、以及至少一种包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞使与癌症相关的症状减少例如至多10％、至多15％、至多20％、至多25％、至多30％、至多35％、至多40％、至多45％、至多50％、至多55％、至多60％、至多65％、至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％、至多95％或至多100％。

在该实施方案的又其他方面，本文公开的治疗有效量的脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物、以及至少一种包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞使与癌症相关的症状减少例如约10％至约100％、约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约10％至约60％、约10％至约50％、约10％至约40％、约20％至约100％、约20％至约90％、约20％至约80％、约20％至约20％、约20％至约60％、约20％至约50％、约20％至约40％、约30％至约100％、约30％至约90％、约30％至约80％、约30％至约70％、约30％至约60％或约30％至约50％。

在一种实施方案中，与未接受相同治疗的患者相比，本文公开的脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物、以及至少一种包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞能够使罹患癌症的个体的疾病严重程度降低，例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。

在该实施方案的其他方面，与未接受相同治疗的患者相比，脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物、以及至少一种包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞能够使罹患癌症的个体的疾病严重程度降低，例如，约10％至约100％、约20％至约100％、约30％至约100％、约40％至约100％、约50％至约100％、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％、约10％至约90％、约20％至约90％、约30％至约90％、约40％至约90％、约50％至约90％、约60％至约90％、约70％至约90％、约10％至约80％、约20％至约80％、约30％至约80％、约40％至约80％、约50％至约80％、或约60％至约80％、约10％至约70％、约20％至约70％、约30％至约70％、约40％至约70％或约50％至约70％。

在另外的实施方案中，在第一次施用脱氧核糖核酸酶蛋白后，每1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月或更长时间施用一次或更多次脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物。

在另外的实施方案，在第一次施用脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物、以及至少一种包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞后，每2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月或更长时间施用一次或更多次脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物、以及至少一种包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞。

在实施方案中，脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物的施用时间段持续10分钟、20分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长时间。

在实施方案中，脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物、以及至少一种包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞的施用时间段持续约10分钟、约20分钟、约30分钟、约45分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约12个月或更长时间。

在实施方案中，脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物的施用时间段持续至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少45分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少9小时、至少10小时至少11小时、至少12小时、至少13小时、至少14小时、至少15小时、至少16小时、至少17小时、至少18小时、至少19小时、至少20小时、至少21小时、至少22小时、至少23小时、至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周、至少10周、至少11周、至少12周、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月或更长时间。

在实施方案中，脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物的施用时间段持续不超过10分钟、不超过20分钟、不超过30分钟、不超过45分钟、不超过1小时、不超过2小时、不超过3小时、不超过4小时、不超过5小时、不超过6小时、不超过7小时、不超过8小时、不超过9小时、不超过10小时不超过11小时、不超过12小时、不超过13小时、不超过14小时、不超过15小时、不超过16小时、不超过17小时、不超过18小时、不超过19小时、不超过20小时、不超过21小时、不超过22小时、不超过23小时、不超过1天、不超过2天、不超过3天、不超过4天、不超过5天、不超过6天、不超过7天、不超过8天、不超过9天、不超过10天、不超过11天、不超过12天、不超过13天、不超过14天、不超过3周、不超过4周、不超过5周、不超过6周、不超过7周、不超过8周、不超过9周、不超过10周、不超过11周、不超过12周、不超过4个月、不超过5个月、不超过6个月、不超过7个月、不超过8个月、不超过9个月、不超过10个月、不超过11个月、不超过12个月或更长时间。

在另外的实施方案中，脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物停止施用的时间段持续10分钟、20分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长时间。

在另外的实施方案中，脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物停止施用的时间段持续约10分钟、约20分钟、约30分钟、约45分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约12个月或更长时间。

在另外的实施方案中，脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物的施用停止持续不超过10分钟、不超过20分钟、不超过30分钟、不超过45分钟、不超过1小时、不超过2小时、不超过3小时、不超过4小时、不超过5小时、不超过6小时、不超过7小时、不超过8小时、不超过9小时、不超过10小时、不超过11小时、不超过12小时、不超过13小时、不超过14小时、不超过15小时、不超过16小时、不超过17小时、不超过18小时、不超过19小时、不超过20小时、不超过21小时、不超过22小时、不超过23小时、不超过1天、不超过2天、不超过3天、不超过4天、不超过5天、不超过6天、不超过7天、不超过8天、不超过9天、不超过10天、不超过11天、不超过12天、不超过13天、不超过14天、不超过3周、不超过4周、不超过5周、不超过6周、不超过7周、不超过8周、不超过9周、不超过10周、不超过11周、不超过12周、不超过4个月、不超过5个月、不超过6个月、不超过7个月、不超过8个月、不超过9个月、不超过10个月、不超过11个月、不超过12个月或更长时间。

在另外的实施方案中，脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物的施用停止持续至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少45分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少9小时、至少10小时、至少11小时、至少12小时、至少13小时、至少14小时、至少15小时、至少16小时、至少17小时、至少18小时、至少19小时、至少20小时、至少21小时、至少22小时、至少23小时、至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周、至少10周、至少11周、至少12周、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月或更长时间。

在实施方案中，脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物、和/或至少一种包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞的施用时间段持续10分钟、20分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长时间。

在实施方案中，脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物、和/或至少一种包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞的施用时间段持续约10分钟、约20分钟、约30分钟、约45分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约12个月或更长时间。

在实施方案中，脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物、和/或至少一种包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞的施用时间段持续至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少45分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少9小时、至少10小时、至少11小时、至少12小时、至少13小时、至少14小时、至少15小时、至少16小时、至少17小时、至少18小时、至少19小时、至少20小时、至少21小时、至少22小时、至少23小时、至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周、至少10周、至少11周、至少12周、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月或更长时间。

在实施方案中，脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物、和/或至少一种包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞的施用时间段持续不超过10分钟、不超过20分钟、不超过30分钟、不超过45分钟、不超过1小时、不超过2小时、不超过3小时、不超过4小时、不超过5小时、不超过6小时、不超过7小时、不超过8小时、不超过9小时、不超过10小时、不超过11小时、不超过12小时、不超过13小时、不超过14小时、不超过15小时、不超过16小时、不超过17小时、不超过18小时、不超过19小时、不超过20小时、不超过21小时、不超过22小时、不超过23小时、不超过1天、不超过2天、不超过3天、不超过4天、不超过5天、不超过6天、不超过7天、不超过8天、不超过9天、不超过10天、不超过11天、不超过12天、不超过13天、不超过14天、不超过3周、不超过4周、不超过5周、不超过6周、不超过7周、不超过8周、不超过9周、不超过10周、不超过11周、不超过12周、不超过4个月、不超过5个月、不超过6个月、不超过7个月、不超过8个月、不超过9个月、不超过10个月、不超过11个月、不超过12个月或更长时间。

在另外的实施方案中，脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物、和/或至少一种包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞的施用时间段期间停止施用持续10分钟、20分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长时间。

在实施方案中，脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物、和/或至少一种包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞的施用时间段持续不超过10分钟、不超过20分钟、不超过30分钟、不超过45分钟、不超过1小时、不超过2小时、不超过3小时、不超过4小时、不超过5小时、不超过6小时、不超过7小时、不超过8小时、不超过9小时、不超过10小时、不超过11小时、不超过12小时、不超过13小时、不超过14小时、不超过15小时、不超过16小时、不超过17小时、不超过18小时、不超过19小时、不超过20小时、不超过21小时、不超过22小时、不超过23小时、不超过1天、不超过2天、不超过3天、不超过4天、不超过5天、不超过6天、不超过7天、不超过8天、不超过9天、不超过10天、不超过11天、不超过12天、不超过13天、不超过14天、不超过3周、不超过4周、不超过5周、不超过6周、不超过7周、不超过8周、不超过9周、不超过10周、不超过11周、不超过12周、不超过4个月、不超过5个月、不超过6个月、不超过7个月、不超过8个月、不超过9个月、不超过10个月、不超过11个月、不超过12个月或更长时间。

在另外的实施方案中，停止施用脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物、和/或至少一个包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞的时间段持续1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长时间。

在实施方案中，脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物、和/或至少一种包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞的施用时间段持续至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少45分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少9小时、至少10小时、至少11小时、至少12小时、至少13小时、至少14小时、至少15小时、至少16小时、至少17小时、至少18小时、至少19小时、至少20小时、至少21小时、至少22小时、至少23小时、至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周、至少10周、至少11周、至少12周、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月或更长时间。

在另外的实施方案中，脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物、和/或至少一种包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞的施用时间段期间停止施用持续10分钟、20分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长时间。

在另外的实施方案中，脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物、和/或至少一种包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞的施用时间段期间停止施用持续至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少45分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少9小时、至少10小时、至少11小时、至少12小时、至少13小时、至少14小时、至少15小时、至少16小时、至少17小时、至少18小时、至少19小时、至少20小时、至少21小时、至少22小时、至少23小时、至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周、至少10周、至少11周、至少12周、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月或更长时间。

在另外的实施方案中，脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物、和/或至少一种包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞的施用时间段期间停止施用持续不超过10分钟、不超过20分钟、不超过30分钟、不超过45分钟、不超过1小时、不超过2小时、不超过3小时、不超过4小时、不超过5小时、不超过6小时、不超过7小时、不超过8小时、不超过9小时、不超过10小时、不超过11小时、不超过12小时、不超过13小时、不超过14小时、不超过15小时、不超过16小时、不超过17小时、不超过18小时、不超过19小时、不超过20小时、不超过21小时、不超过22小时、不超过23小时、不超过1天、不超过2天、不超过3天、不超过4天、不超过5天、不超过6天、不超过7天、不超过8天、不超过9天、不超过10天、不超过11天、不超过12天、不超过13天、不超过14天、不超过3周、不超过4周、不超过5周、不超过6周、不超过7周、不超过8周、不超过9周、不超过10周、不超过11周、不超过12周、不超过4个月、不超过5个月、不超过6个月、不超过7个月、不超过8个月、不超过9个月、不超过10个月、不超过11个月、不超过12个月或更长时间。

在另外的实施方案中，脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物、和/或至少一种包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞的施用时间段期间停止施用持续约10分钟、约20分钟、约30分钟、约45分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约12个月或更长时间。

在该实施方案的方面，本文公开的治疗有效量的脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物使个体的癌症严重程度降低或维持例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。在该实施方案的其他方面，本文公开的治疗有效量的脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物使个体的癌症严重程度降低或维持例如至多10％、至多15％、至多20％、至多25％、至多30％、至多35％、至多40％、至多45％、至多50％、至多55％、至多60％、至多65％、至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％、至多95％或至多100％。在该实施方案的又其他方面，本文公开的治疗有效量的脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物使个体的疾病严重程度降低或维持例如约10％至约100％、约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约10％至约60％、约10％至约50％、约10％至约40％、约20％至约100％、约20％至约90％、约20％至约80％、约20％至约20％、约20％至约60％、约20％至约50％、约20％至约40％、约30％至约100％、约30％至约90％、约30％至约80％、约30％至约70％、约30％至约60％或约30％至约50％。

在该实施方案的方面，本文公开的治疗有效量的脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物、以及至少一种包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞使个体的癌症严重程度降低或维持例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。在该实施方案的其他方面，本文公开的治疗有效量的脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物、以及至少一种包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞使个体的癌症严重程度降低或维持例如至多10％、至多15％、至多20％、至多25％、至多30％、至多35％、至多40％、至多45％、至多50％、至多55％、至多60％、至多65％、至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％、至多95％或至多100％。在该实施方案的又其他方面，本文公开的治疗有效量的脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物、以及至少一种包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞使个体的疾病严重程度降低或维持例如约10％至约100％、约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约10％至约60％、约10％至约50％、约10％至约40％、约20％至约100％、约20％至约90％、约20％至约80％、约20％至约20％、约20％至约60％、约20％至约50％、约20％至约40％、约30％至约100％、约30％至约90％、约30％至约80％、约30％至约70％、约30％至约60％或约30％至约50％。

将脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物、以及至少一种包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞向个体施用。个体通常是人类，但可以是动物，包括但不限于狗、猫、鸟、牛、马、绵羊、山羊、爬行动物和其他动物，无论是否驯养的。通常，作为治疗候选者的任何个体都是对该个体所罹患的疾病进行某种形式的疗法的候选者，无论该疾病是良性的还是恶性的。关于癌症，最常见的癌症类型包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、结肠和直肠癌、子宫内膜癌、肾癌(kidney cancer)、肾癌(renal cancer)、白血病、肺癌、黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、胃癌和甲状腺癌。除了公开程序的所有相关风险和益处的全面知情同意之外，术前评估典型地包括例行病史和身体检查。

在实施方案中，本文公开的脱氧核糖核酸酶蛋白或包含这样的治疗化合物的组合物可以被制成液体制剂。在实施方案中，适合肠内或肠胃外施用的液体制剂包括但不限于溶液、糖浆、酏剂、分散体、乳液和悬浮液。在实施方案中，可以但不限于根据本领域已知的用于制造药物组合物的任何方法来制备本文公开的意图用于这样的施用的治疗化合物或组合物。在实施方案中，这样的液体剂型中，本文公开的治疗化合物或组合物可以与以下但不限于以下混合：(a)合适的水性和非水性载体，(b)稀释剂，(c)溶剂诸如但不限于水、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、甘油、植物油(诸如但不限于菜籽油和橄榄油)，以及可注射有机酯(诸如油酸乙酯)；和/或流动剂(诸如但不限于表面活性剂或包衣剂如卵磷脂)。在分散体或悬浮液的情况下，流动性也可以通过维持特定粒度来控制。在实施方案中，在液体制剂中，本文公开的治疗化合物的治疗有效量通常可以在约0.0001％(w/v)至约90％(w/v)之间、0.0001％(w/v)至约80％(w/v)之间、0.0001％(w/v)至约70％(w/v)之间、0.0001％(w/v)至约60％(w/v)之间、0.0001％(w/v)至约50％(w/v)之间、0.0001％(w/v)至约40％(w/v)之间、0.0001％(w/v)至约30％(w/v)之间、0.0001％(w/v)至约20％(w/v)之间、0.0001％(w/v)至约10％(w/v)之间、约0.001％(w/v)至约90.0％(w/v)之间、0.001％(w/v)至约80.0％(w/v)之间、0.001％(w/v)至约70.0％(w/v)之间、0.001％(w/v)至约60.0％(w/v)之间、0.001％(w/v)至约0.0％(w/v)之间、0.001％(w/v)至约40.0％(w/v)之间、0.001％(w/v)至约30.0％(w/v)之间、0.001％(w/v)至约20.0％(w/v)之间、0.001％(w/v)至约10.0％(w/v)之间、或约0.01％(w/v)至约90.0％(w/v)之间、约0.01％(w/v)至约80.0％(w/v)之间、约0.01％(w/v)至约70.0％(w/v)之间、约0.01％(w/v)至约60.0％(w/v)之间、约0.01％(w/v)至约50.0％(w/v)之间、约0.01％(w/v)至约40.0％(w/v)之间、约0.01％(w/v)至约30.0％(w/v)之间、约0.01％(w/v)至约20.0％(w/v)之间或约0.01％(w/v)至约10.0％(w/v)之间。

在实施方案中，液体悬浮液可以但不限于通过将治疗化合物(包括但不限于本文公开的脱氧核糖核酸酶蛋白)与适合于制造水性悬浮液的赋形剂混合悬浮来配制。在实施方案中，这样的赋形剂是悬浮剂，例如但不限于羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、果胶、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、天然树胶、琼脂、黄蓍胶和阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂可以是天然存在的磷脂，例如卵磷脂，或环氧烷与脂肪酸的缩合产物，例如但不限于聚氧乙烯硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物，例如但不限于，十七亚乙基氧基十六醇，或环氧乙烷与源自脂肪酸的偏酯的缩合产物，例如但不限于聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。

作为另外的方面，本发明包括包含本发明的组合物的试剂盒，该组合物以促进其用于向受试者施用的方式包装。在一种实施方案中，这样的试剂盒包括本文描述的化合物或组合物(例如，包含脱氧核糖核酸酶蛋白和/或其衍生物、变体或类似物、以及至少一种包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞的组合物)，包装在容器诸如密封瓶或器皿中，具有贴在容器上或包含在包装中的标签，描述化合物或组合物在实施该方法中的用途。在一种实施方案中，试剂盒包含具有包含脱氧核糖核酸酶蛋白的组合物的第一容器、和含有用于第一容器中的组合物的生理学上可接受的重构溶液的第二容器。在一方面，化合物或组合物被包装在单位剂型中。该试剂盒还可以包括适合于根据特定施用途径施用组合物的装置。优选地，试剂盒包含描述治疗性蛋白或肽组合物的用途的标签。

在某些实施方案中，DNase酶被配制成含有药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。

本发明方法中使用的制剂可以方便地以单位剂型呈现，并且可以通过本领域已知的方法制备。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将取决于所治疗的宿主和特定的施用模式而变化。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常将是产生治疗效果的化合物的量。

一般来说，制剂可以用液体载体或细分的固体载体或两者来制备，并且然后，如果必要，将产品成形。

适用于肠胃外施用的药物组合物可以包含一种或更多种活性成分(DNase酶和任选的另一种化合物[例如抗癌化合物])与以下的组合：一种或更多种药学上可接受的无菌等渗水性溶液或非水性溶液、分散体、悬浮液或乳液，或者可以在使用前重构成无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末，其可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质、或悬浮剂或增稠剂。可以被用于本发明的药物组合物的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、以及其合适的混合物、植物油(诸如橄榄油)、和可注射的有机酯(诸如油酸乙酯)。可以例如通过使用包衣材料诸如卵磷脂、在分散体的情况下通过维持所需要的粒度、以及通过使用表面活性剂，维持合适的流动性。

这些组合物还可以包含防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。预防微生物的作用可以通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来确保在组合物中包含等渗剂，诸如糖、氯化钠以及类似物也可能是合意的。另外，可注射的药物形式的延长的吸收可以通过包含延迟吸收的剂诸如单硬脂酸铝和明胶来实现。

可注射贮库形式可以通过在可生物降解的聚合物诸如聚丙交酯-聚乙交酯中形成一种或更多种活性成分的微包封的基质来制备。根据活性成分与聚合物的比率以及所采用的特定聚合物的性质，可以控制活性成分的释放速率。其他可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。贮库可注射制剂还通过将活性成分包封在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备。

用于口服施用的制剂可以是胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、粉末、颗粒剂的形式，或者作为水性或非水性液体中的溶液或悬浮液(例如，作为漱口水、作为待吞咽的组合物或作为灌肠剂)，或者是作为水包油或油包水液体乳剂等，每种都包含预定量的一种或更多种活性成分。

在用于口服施用的固体剂型(胶囊、片剂、丸剂、糖衣丸、粉末、颗粒等)中，一种或更多种活性成分可与一种或更多种药学上可接受的载体，诸如柠檬酸钠或磷酸氢钙，和/或以下中的任一种混合：(1)填料或增量剂，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，诸如例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯树胶；(3)保湿剂，诸如甘油；(4)崩解剂，诸如琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液阻滞剂，诸如石蜡；(6)吸收加速剂，诸如季铵化合物；(7)润湿剂，诸如例如十六醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，诸如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，诸如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠及其混合物；以及(10)着色剂。在胶囊、片剂和丸剂的情况中，药物组合物还可以包含缓冲剂。相似类型的固体组合物还可以用作使用诸如乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等的赋形剂软填充和硬填充的明胶胶囊中的填充剂。

除了一种或更多种活性成分之外，悬浮液还可以包含悬浮剂，诸如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝(aluminummetahydroxide)、膨润土、琼脂-琼脂、黄蓍胶及其混合物。

除了一种或更多种活性成分之外，粉末和喷雾剂还可以包含赋形剂，诸如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末，或者这些物质的混合物。喷雾剂可以另外包含常规喷射剂，诸如氟氯烃和挥发性未取代烃，诸如丁烷和丙烷。

癌症及其他治疗

在一方面，本发明提供了治疗有相应需要的受试者的癌症的方法，包括向受试者施用脱氧核糖核酸酶和至少一种包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞。

在相关方面，本发明提供了治疗有相应需要的受试者的癌症的方法，包括向受试者施用脱氧核糖核酸酶和至少一种包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞，其中所述脱氧核糖核酸酶有效地减少肿瘤组织中免疫抑制蛋白的表达和/或增加肿瘤组织内包含嵌合抗原受体或T细胞受体的细胞的含量。

本发明的方法可用于罹患广泛范围的癌症的受试者。相关癌症的非限制性实例包括例如乳腺癌、前列腺癌、多发性骨髓瘤、移行细胞癌、肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC))、肾癌、甲状腺癌、白血病(例如慢性髓系白血病、急性髓系白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病)、淋巴瘤(例如B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤)、头颈癌、食管癌、胃癌、结肠癌、肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、胰腺癌、肝癌、胆管癌、胆囊癌、卵巢癌、子宫内膜癌、阴道癌、宫颈癌、膀胱癌癌症、神经母细胞瘤、肉瘤、骨肉瘤、恶性黑素瘤、鳞状细胞癌、骨癌，包括两种原发性骨癌(例如，骨肉瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、釉质瘤、巨细胞瘤和脊索瘤)和继发性(转移性)骨癌、软组织肉瘤、基底细胞癌、血管肉瘤(angiosarcoma)、血管肉瘤(hemangiosarcoma)、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、成骨肉瘤、血管肉瘤(angiosarcoma)、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、睾丸癌、子宫癌、胃肠癌、间皮瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、华氏巨球蛋白血症(Waldenstroom’s macroglobulinemia)、乳头状腺癌、囊腺癌、支气管肺癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤(Wilms’tumor)、上皮癌、胶质瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、视网膜母细胞瘤、髓样癌、胸腺瘤、肉瘤等。

在本发明的任何方法的一些实施方案中，受试者是人类。

实施例

本发明还通过以下实施例进行描述和体现。然而，在说明书中的任何地方使用这些和其他实例仅是说明性的，且绝不限制本发明或任何示例性术语的范围和含义。同样地，本发明不限于此处描述的任何特定优选的实施方案。事实上，在阅读本说明书后，本发明的许多修改和变化对本领域技术人员可以是明显的，并且可以进行此类变化而在精神上或在范围内不脱离本发明。因此，本发明仅受所附权利要求的条款连同这些权利要求所赋予的等同物的全部范围的限制。

实施例1.脱氧核糖核酸酶增加携带嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的治疗效力。

使用平均体重为16g至20g的6至8周龄雌性NOD SCID(CB17-Prkdc^scid/NcrCrl)小鼠。通过将200μl 0.9％盐水溶液中的5×10⁶个Raji细胞皮下接种到小鼠左侧，进行淋巴瘤移植。在肿瘤达到至少50mm³的可触及的体积后,将小鼠随机分配到4个实验组：

“对照”组：在肿瘤接种后第10天单次IV注射3×10⁶个未转导的人类CD8 T细胞；

“DNase I”组：从肿瘤接种后第10天开始，以4mg/kg的剂量10次每天IV注射人类重组DNase I酶(Kevelt AS；SEQ ID NO:4)；

“CAR19”组：在肿瘤接种后第10天单次IV注射3×10⁶个用慢病毒载体转导的人类CD8 T细胞，所述慢病毒载体编码CD19 CAR[FMC63 scFv/IgG4铰链/IgG4CH2-CH3/CD28TM/OX-40/CD3z](Stepanov AV,Markov OV,Chernikov IV,Gladkikh DV,Zhang H,Jones T,Sen’kova AV,Chernolovskaya EL,Zenkova MA,Kalinin RS,Rubtsova MP,Meleshko AN,Genkin DD,Belogurov AA Jr,Xie J,Gabibov AG,Lerner RA.Autocrine-basedselection of ligands for personalized CAR-T therapy of lymphoma.SciAdv.2018Nov 14；4(11):eaau4580.doi:10.1126/sciadv.aau4580.PMID:30443597；PMCID:PMC6235538)；

“CAR19与DNase I”组：在肿瘤接种后第10天单次IV注射3×10⁶个用编码CD19 CAR[FMC63 scFv/IgG4铰链/IgG4 CH2-CH3/CD28TM/OX-40/CD3z]的慢病毒载体转导的人类CD8T细胞，加上肿瘤接种后第10天开始以4mg/kg剂量10次每天IV注射人类重组DNase I酶。

肿瘤体积用卡尺测量，并使用椭球体公式估算。数据在图1中示出。数据清楚地显示IV注射人类重组DNase I酶为CD19 CAR T细胞提供了统计学显著(p<0.05)的效力增强。

实施例2.脱氧核糖核酸酶的AAV基因转移增加携带嵌合抗原受体(CAR)的T细胞向肿瘤组织中的募集，并减少局部免疫抑制

AAV-DNase I载体如以下中描述地的产生：Xia Y,He J,Zhang H等人AAV-mediated gene transfer of DNase I in the liver of mice with colorectal cancerreduces liver metastasis and restores local innate and adaptive immuneresponse[印刷前在线公布，2020年8月19日]Mol Oncol.2020；14(11):2920-2935.doi:10.1002/1878-0261.12787。简而言之，使用编码Anc80L65衣壳的rep/cap质粒、pCLS-014和腺病毒辅助质粒进行聚乙烯亚胺三质粒转染在HEK293细胞中产生AAV-DNase I载体，并按比例在碘克沙醇梯度上进一步纯化。质粒pAAV-ApoEHCR增强子-hAAT启动子-hDNase I(超活性)-WPRE Xinact(pCLS-014)具体包含由以下组成的转基因表达盒：(a)载脂蛋白E-肝控制区(APOE-HCR增强子)和人类α-1-抗胰蛋白酶(hAAT)启动子，(b)Kozak序列，(c)包含天然信号序列的人类超活性、肌动蛋白抗性DNase I-变体，(d)通过突变起始密码子使X蛋白编码区失活的土拨鼠肝炎病毒转录后元件(WPRE)。纯化的AAV-DNase I载体在补充有35mMNaCl和0.001％ Pluronic F68的PBS中重新配制，并且滴度(基因组拷贝[GC]/mL)通过定量PCR确定。通过SDS/PAGE分析纯化的AAV载体，观察到比例为～1:1:10的60kDa、72kDa和90kDa的三个条带，其对应于VP1-3蛋白。AAV-null除了不含DNase I cDNA之外，包含CLS-014转基因表达盒的所有组分。

使用专有(proprietary)的scFv噬菌体展示文库产生了对CEA特异的单克隆抗体scFv。将scFv与CD8α铰链、CD28跨膜结构域加CD3ζ和CD28信号结构域一起克隆到pMS3逆转录病毒载体中。如以下中描述地产生了靶向小鼠CEA的CAR T细胞：在Wang L,Ma N,OkamotoS等人Efficient tumor regression by adoptively transferred CEA-specific CAR-Tcells associated with symptoms of mild cytokine releasesyndrome.Oncoimmunology.2016；5(9):e1211218.2016年7月25日公布.doi:10.1080/2162402X.2016.1211218。在六孔板的一个孔中用固定化抗CD3(1mg/mL；145-2C11)和可溶性抗CD28(1mg/mL；37.51)刺激来自C57BL/6(CD45.1)同类系(congeneric)小鼠的全脾细胞(1.5×10⁷个细胞/5mL)。刺激后一天(在第1天)，通过使用RetroNectin结合的病毒感染方法用病毒载体转导5×10⁵个细胞，其中将病毒溶液预加载到24孔板的包含1mL培养基的Retro-Nectin(Takara Bio)包被的孔上。在第3天，将细胞转移到包含10mL培养基的50mL瓶中进行扩增。在第5天，收获细胞并用于实验。在培养期间添加60IU/mL的重组人类IL-2(Novartis)。

为了建立肝转移模型，将麻醉的C57BL/6小鼠置于仰卧位。对手术区域的皮肤进行消毒后，进行腹部正中切口，然后动员十二指肠以识别门静脉。使用30-G针将100万个CEA+MC32a细胞注射到门静脉中。取出针后，通过用棉签温和按压穿刺部位止血。注射后，将肠恢复位置，并且腹壁用不可吸收的缝线闭合。

在肿瘤攻击后的第5天，将小鼠(每组7只动物)随机分配到4组：

“对照”组：对照荷瘤小鼠；

“CAR19”组：IV注射5×10⁶个CAR-T细胞；

“AAV-DNase I”组：以1.5×10¹²GC/小鼠IV注射AAV-DNase I载体

“CAR19与AAV-DNase I”组：IV注射5×10⁶个CAR-T细胞与以1.5×10¹²GC/小鼠剂量的AAV-DNase I载体组合。

存活图在图2中呈现。图2中的数据清楚地显示出来自CAR T细胞和AAV DNase I基因转移组合的有意义的存活(p<0.05)益处。

在第15天，对“对照”组、“CAR19”组和“CAR19与AAV-DNase I”组各组中的一只动物实施安乐死(每组一只小鼠)，并且收获肝进行检查。使用抗PD-L1抗体(克隆10F.9G2，Merck)通过流式细胞术[如描述在Xia Y,He J,Zhang H等人AAV-mediated gene transferof DNase I in the liver of mice with colorectal cancer reduces livermetastasis and restores local innate and adaptive immune response.MolOncol.2020；14(11):2920-2935.doi:10.1002/1878-0261.12787]分析转移组织的PD L1表达，并且使用生物素化蛋白L和与FITC缀合的链霉抗生物素蛋白通过流式细胞术分析转移组织中靶向CEA的CAR T细胞的普遍率。

图3示出了表达PD L1的转移性MC32a细胞的百分比。数据显示出用CAR T细胞和AAV-DNase I基因转移组合治疗的小鼠的转移性病变的转移性MC32a细胞中PD-L1表达的有意义的抑制(p<0.05)。

图4示出了MC32a转移性病变实质中靶向CEA的CAR T细胞的百分比。数据显示出用CAR T细胞和AAV DNase I基因转移组合治疗的小鼠转移性病变中CAR T细胞数量的有意义的增加(p<0.05)。

实施例3.表达脱氧核糖核酸酶的携带嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的开发

来自健康供者的人类外周血T细胞用包含以下的FL1 CAR来工程化：CILDLPKFC/IgG1Fc间隔物结构域(“CILDLPKFC”公开为SEQ ID NO:59)、GGGS接头(SEQ ID NO:60)、CD28跨膜及细胞内区域以及OX-40和CD3ζ的细胞内结构域(Stepanov等人Autocrine-basedselection of ligands for personalized CAR-T therapy of lymphoma.Sci Adv.2018,4(11):eaau4580.doi:10.1126/sciadv.aau4580)，通过自切割肽P2A而含有或不含全长人类超活性肌动蛋白抗性突变体DNase I的基因(SEQ ID NO:5)。参见图5。

在补充有人类IL-2(40U/ml)的完全RPMI 1640培养基中孵育细胞6小时期间，使用荧光探针(Terekhov等人，PNAS2017,114(10):2550-2555)分析FL1-CAR-T细胞、DNaseIFL1-CAR-T细胞和未转导的对照T细胞的培养基中的DNase活性。所有实验以一式三份进行。数据在图6中呈现。数据显示出DNase I FL1-CAR-T细胞的培养基中DNase活性逐渐增加。

在标准LDH释放测定(CytoTox 96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay,Promega)中按照制造商的建议评估工程化T细胞的细胞毒性和特异性。将FL1-CAR-T细胞、DNase I FL1-CAR-T细胞和未转导的对照T细胞与10⁴个Raji-FL1细胞一起在补充有人类IL-2(40U/ml)的完全RPMI 1640培养基中共孵育6小时。所有实验以一式三份进行。

数据在图7中示出。数据清楚地显示T细胞重编程以同时表达CAR和脱氧核糖核酸酶提供了针对靶淋巴瘤细胞的更高的细胞毒性(p<0.01)。

实施例4.表达脱氧核糖核酸酶的携带嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的生物活性

使用平均体重为16g至20g的6至8周龄雌性NOD SCID(CB17-Prkdc^scid/NcrCrl)小鼠。通过将200μl 0.9％盐水溶液中的5×10⁶个Raji-FL1 CAR细胞皮下接种到小鼠左侧进行肿瘤移植。在肿瘤达到至少50mm³的可触及的体积后，将小鼠随机分配并处理如下：在第10天和第15天，向荷瘤小鼠静脉内注射3×10⁶个FL1 CAR T细胞(第2组；6只小鼠)，3×10⁶个表达超活性肌动蛋白抗性突变体DNase I(SEQ ID NO:5)的FL1 CAR T细胞(第3组；6只小鼠)和安慰剂对照(第1组；6只小鼠)。肿瘤体积用卡尺测量并使用椭球体公式估算。在第20天对动物实施安乐死。

数据在图8中示出。数据清楚地显示出T细胞重编程以同时表达CAR和DNase酶为这样的双重重编程的T细胞提供了更高的效力(p<0.05)。

实施例5.用DNase治疗增加CAR-T细胞疗法的效力

来自健康供者的人类外周血T细胞用包含FMC63 scFv/IgG4铰链/IgG4CH2-CH3/CD28TM/OX-40/CD3z的CD19 CAR工程化(如在Stepanov等人,Autocrine-based selectionof ligands for personalized CAR-T therapy of lymphoma.Sci Adv.2018,4(11):eaau4580.doi:10.1126/sciadv.aau4580中描述的)。使用平均体重为16g至20g的6至8周龄雌性NOD SCID(CB17-Prkdc^scid/NcrCrl)小鼠。通过将200μl 0.9％盐水溶液中的5×10⁶个Raji-CD19 CAR细胞皮下接种到小鼠左侧进行肿瘤移植。在肿瘤达到至少50mm³的可触及的体积后，将小鼠随机分配并处理如下：在第10天和第15天，荷瘤小鼠以0.5×10⁶个CAR-T细胞/kg的剂量单独静脉内注射CD19嵌合抗原受体(CAR)T细胞，或与不同DNase I方案(人类重组DNase I酶(Kevelt AS；SEQ ID NO:4)，通过i.v.注射施用)组合。

将动物随机分为不同组：

第1组(n＝5只小鼠)-用CD19 CAR-T细胞治疗；

第2组(n＝5只小鼠)-用CD19 CAR-T细胞治疗+在起始CAR-T细胞疗法前24小时用DNase I 500μg/kg治疗1次；

第3组(n＝5只小鼠)-用CD19 CAR-T细胞治疗+在起始CAR-T细胞疗法前24小时和之后24小时用DNase I 1000μg/kg治疗2次；

第4组(n＝5只小鼠)-用CD19 CAR-T细胞治疗+在起始CAR-T细胞疗法前72小时和后30天用DNase I 1000μg/kg治疗2次；

第5组(n＝5只小鼠)-用CD19 CAR-T细胞治疗+在起始CAR-T细胞疗法前3天用DNase I 250μg/kg治疗；

第6组(n＝5只小鼠)-用CD19 CAR-T细胞治疗+在起始CAR-T细胞疗法前1天用DNase I 2500μg/kg治疗，以及从起始CAR-T细胞疗法开始每天用DNase I 2500μg/kg治疗持续6天；

第7组(n＝5只小鼠)-用CD19 CAR-T细胞治疗+在起始CAR-T细胞疗法前7天用DNase I 500μg/kg治疗1次；

第8组(n＝5只小鼠)-用CD19 CAR-T细胞治疗+在起始CAR-T细胞疗法前7天、以及在起始CAR-T细胞疗法后接下来8周的每周，用DNase I 500μg/kg治疗1次；

第9组(n＝5只小鼠)-用CD19 CAR-T细胞治疗+在起始CAR-T细胞疗法前28天用DNase I 1500μg/kg治疗1次。

监测临床效力和副作用。

图9示出了使用生物素化蛋白L和与FITC缀合的链霉抗生物素蛋白对外周血中的CAR-T细胞进行流式细胞术检测(参见Stepanov等人,Autocrine-based selection ofligands for personalized CAR-T therapy of lymphoma.Sci Adv.2018,4(11):eaau4580.doi:10.1126/sciadv.aau4580)。数据显示，DNase和CAR-T细胞疗法的组合使用显著(所有p<0.05)增加了CAR T细胞在血液中的持久性。

图10显示，DNase和CAR-T细胞疗法的组合使用增加了动物存活。所有测试的DNaseI与CD19 CAR-T细胞治疗的组合均示为显著优于单独的CD19 CAR-T细胞治疗。第9组中用高剂量DNase I预处理的小鼠产生了特殊的优势，这可能与在CD19 CAR-T细胞治疗之前对肿瘤微环境的更广泛的预调节有关。

实施例6.用DNase治疗减少了与CAR-T细胞疗法相关的细胞因子释放综合征

为了模拟细胞因子释放综合征(CRS)，我们使用6-8周龄雌性C.B.Igh-1b/GbmsTac-Prkdc^scidLyst^bgN7(SCID)小鼠(Charles River)腹膜内注射3×10⁶个Raji细胞。在肿瘤生长后第25天，腹膜内注射3×10⁷个CD19 CAR-T细胞(与实施例5相同)。CAR-T细胞单独施用或与不同的DNase I方案(人类重组DNase I酶(Kevelt AS；SEQ ID NO:4)，通过i.v.注射施用)组合。

将动物随机分为不同组：

第1组(n＝5只小鼠)-用CAR-T细胞治疗；

第2组(n＝5只小鼠)-用CAR-T细胞治疗+在起始CAR-T细胞疗法前24小时用DNaseI 500μg/kg治疗1次；

第3组(n＝5只小鼠)-用CAR-T细胞治疗+在起始CAR-T细胞疗法后24小时用DNaseI 1000μg/kg治疗；

第4组(n＝5只小鼠)-用CAR-T细胞治疗+在起始CAR-T细胞疗法前72小时用DNaseI 1000μg/kg治疗2次；

第5组(n＝5只小鼠)-用CAR-T细胞治疗+在起始CAR-T细胞疗法前7天用DNaseI500μg/kg治疗1次；

第6组(n＝5只小鼠)-用CAR-T细胞治疗+在起始CAR-T细胞疗法前28天用DNaseI1500μg/kg治疗1次。

图11中示出的关于患有CRS的动物％数据显示，使用DNase增加了CAR-T疗法的安全性，并保护免于CAR-T相关副作用。

序列

SEQ ID NO:1-人类DNase I野生型(WT)前体；Genbank登录号NP_005214.2；分泌信号序列加下划线：

SEQ ID NO:2-人类DNase I突变体，前体；与SEQ ID NO:1相比的突变残基加粗并加下划线；分泌信号序列加下划线：

SEQ ID NO:3-Anc80 VP1衣壳蛋白：

X¹＝K或R；X²＝A或S；X³＝A或G；X⁴＝R或K；X⁵＝E或Q；X⁶＝T或E；X⁷＝A或T；X⁸＝S或N；X⁹＝Q或E；X¹⁰＝S或A并且X¹¹＝N或D。

SEQ ID NO:4-成熟野生型(WT)人类DNase I(无分泌信号序列；Genbank登录号4AWN_A)：

SEQ ID NO:5-成熟人类DNase I突变体(无分泌信号序列)；与SEQ ID NO:4相比的突变残基加粗并加下划线：

SEQ ID NO:6-人类DNase I的分泌信号序列：

SEQ ID NO:7-IL2的分泌信号序列：

SEQ ID NO:8-人类白蛋白启动子：

SEQ ID NO:9-Anc80 VP1衣壳蛋白：

X¹＝K或R；X²＝A或S；X³＝A或G；X⁴＝R或K；X⁵＝E或Q；X⁶＝T或E；

X⁷＝A或T；X⁸＝S或N；X⁹＝Q或E；X¹⁰＝S或A并且X¹¹＝N或D

SEQ ID NO:10-人类β珠蛋白引物：

SEQ ID NO:11-正向NLRP3引物：

SEQ ID NO:12-反向NLRP3引物：

SEQ ID NO:13-正向16S通用细菌RNA基因引物：

SEQ ID NO:14-反向16S通用细菌RNA基因引物：

SEQ ID NO:15-人类抗胰蛋白酶启动子序列：

SEQ ID NO:16-不编码功能性蛋白X的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件：

SEQ ID NO:17-载脂蛋白E(ApoE)增强子，肝控制区(HCR)：

SEQ ID NO:18-编码SEQ ID NO:5的人类DNase I超活性变体的多核苷酸：

SEQ ID NO:19-编码SEQ ID NO:2的人类DNase I突变体前体的多核苷酸：(分泌信号序列加下划线)：

/>

SEQ ID NO:20-编码人类DNase I的分泌信号序列(SEQ ID NO:6)的多核苷酸：

SEQ ID NO:21-编码SEQ ID NO:5的成熟人类DNase I突变体的多核苷酸(无分泌信号序列)：

SEQ ID NO:22-编码SEQ ID NO:1的人类DNase I野生型(WT)前体的多核苷酸:

/>

SEQ ID NO:23-编码SEQ ID NO:4的成熟野生型(WT)人类DNase I的多核苷酸：

SEQ ID NO:24-小家鼠(Mus musculus)野生型DNase I前体；Genbank登录号NP_034191.3；分泌信号序列加下划线：

SEQ ID NO:25-小家鼠野生型DNase I的分泌信号序列

SEQ ID NO:26-成熟野生型(WT)小家鼠野生型DNase I

SEQ ID NO:27-编码小家鼠野生型DNase I分泌信号序列的多核苷酸

SEQ ID NO:28-编码成熟野生型(WT)小家鼠野生型DNase I的多核苷酸

SEQ ID NO:29-编码小家鼠野生型DNase I前体的多核苷酸

SEQ ID NO:30-ApoEHCR增强子-hAAT启动子-hDNase I(超活性)正确前导-WPREXinact的完整序列(VR-18013AD)

/>

(APOE HCR增强子：碱基1-320；人类α-1-抗胰蛋白酶启动子：碱基321-717；Kozak序列：碱基718-726；具有天然全长正确前导序列的人类DNase I超活性变体：碱基727-1575；失活的WPRE X蛋白：碱基1576-2212)

SEQ ID NO:31-ApoEHCR增强子-hAAT启动子-hDNase I野生型-WPRE Xinact的完整序列(VR-18014AD)

/>

(APOE HCR增强子：碱基1-320；人类α-1-抗胰蛋白酶启动子：碱基321-717；Kozak序列：碱基718-726；具有天然完全正确前导序列的人类DNase I野生型：碱基727-1575；失活的WPRE X蛋白：碱基1576-2212)

SEQ ID NO:32-编码具有终止密码子的SEQ ID NO:1的人类DNase I野生型(WT)前体的多核苷酸:

SEQ ID NO:33-Kozak序列

SEQ ID NO:34-Anc80L65 VP1衣壳蛋白

SEQ ID NO:35-变体Anc80L65 VP1衣壳蛋白

SEQ ID NO:36-人类突触蛋白启动子

SEQ ID NO:37-CMV启动子

SEQ ID NO:38-F4/80启动子

SEQ ID NO:39-TMEM119启动子

SEQ ID NO:40-MEF2启动子

SEQ ID NO:41-FoxP2启动子

/>

SEQ ID NO:42-hDNase I(超活性)正确先导-WPRE.bGH

/>

SEQ ID NO:43-hDNase I(野生型)WPRE.bGH

SEQ ID NO:44-人类DNase I突变体

/>

SEQ ID NO:45-AAV5衣壳序列(VP1)

SEQ ID NO:46-AAV9衣壳序列(VP1)

SEQ ID NO:47-AAVLK03 VP1衣壳蛋白：

/>

SEQ ID NO:48-编码AAV-LK03 VP1衣壳蛋白的多核苷酸：

/>

SEQ ID NO:49-AAV-KP1 VP1衣壳蛋白：

SEQ ID NO:50-编码AAV-KP1 VP1衣壳蛋白的多核苷酸：

/>

SEQ ID NO:51-人类DNASE1L3(Q13609)前体(信号肽加下划线)

SEQ ID NO:52-编码人类DNase1L3(Q13609)前体的多核苷酸

SEQ ID NO:53-成熟DNase1L3：

NGTSG(SEQ ID NO:54)

SGTH(SEQ ID NO:55)

SDTH(SEQ ID NO:56)

GGTAN(SEQ ID NO:57)

DGSGL(SEQ ID NO:58)

CILDLPKFC(SEQ ID NO:59)，IgG1 Fc间隔物结构域

GGGS接头(SEQ ID NO:60)

***

本发明的范围不受本文描述的具体实施方案的限制。事实上，除了本文描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域普通技术人员而言从前述描述将变得明显。这样的修改预期落入所附权利要求书的范围之内。

本文引用的所有专利、申请、出版物、测试方法、文献和其他材料通过引用以其整体特此并入，就像物理上存在于本说明书中一样。

序列表

<110> D·金基恩

G·泰茨

V·泰茨

阿列克谢·斯特潘诺夫

<120> 用于癌症治疗的脱氧核糖核酸酶与细胞疗法的组合

<130> 252732.000023

<140>

<141>

<150> 63/148,304

<151> 2021-02-11

<150> 63/135,438

<151> 2021-01-08

<160> 60

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 282

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

Met Arg Gly Met Lys Leu Leu Gly Ala Leu Leu Ala Leu Ala Ala Leu

1 5 10 15

Leu Gln Gly Ala Val Ser Leu Lys Ile Ala Ala Phe Asn Ile Gln Thr

20 25 30

Phe Gly Glu Thr Lys Met Ser Asn Ala Thr Leu Val Ser Tyr Ile Val

35 40 45

Gln Ile Leu Ser Arg Tyr Asp Ile Ala Leu Val Gln Glu Val Arg Asp

50 55 60

Ser His Leu Thr Ala Val Gly Lys Leu Leu Asp Asn Leu Asn Gln Asp

65 70 75 80

Ala Pro Asp Thr Tyr His Tyr Val Val Ser Glu Pro Leu Gly Arg Asn

85 90 95

Ser Tyr Lys Glu Arg Tyr Leu Phe Val Tyr Arg Pro Asp Gln Val Ser

100 105 110

Ala Val Asp Ser Tyr Tyr Tyr Asp Asp Gly Cys Glu Pro Cys Gly Asn

115 120 125

Asp Thr Phe Asn Arg Glu Pro Ala Ile Val Arg Phe Phe Ser Arg Phe

130 135 140

Thr Glu Val Arg Glu Phe Ala Ile Val Pro Leu His Ala Ala Pro Gly

145 150 155 160

Asp Ala Val Ala Glu Ile Asp Ala Leu Tyr Asp Val Tyr Leu Asp Val

165 170 175

Gln Glu Lys Trp Gly Leu Glu Asp Val Met Leu Met Gly Asp Phe Asn

180 185 190

Ala Gly Cys Ser Tyr Val Arg Pro Ser Gln Trp Ser Ser Ile Arg Leu

195 200 205

Trp Thr Ser Pro Thr Phe Gln Trp Leu Ile Pro Asp Ser Ala Asp Thr

210 215 220

Thr Ala Thr Pro Thr His Cys Ala Tyr Asp Arg Ile Val Val Ala Gly

225 230 235 240

Met Leu Leu Arg Gly Ala Val Val Pro Asp Ser Ala Leu Pro Phe Asn

245 250 255

Phe Gln Ala Ala Tyr Gly Leu Ser Asp Gln Leu Ala Gln Ala Ile Ser

260 265 270

Asp His Tyr Pro Val Glu Val Met Leu Lys

275 280

<210> 2

<211> 282

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 2

Met Arg Gly Met Lys Leu Leu Gly Ala Leu Leu Ala Leu Ala Ala Leu

1 5 10 15

Leu Gln Gly Ala Val Ser Leu Lys Ile Ala Ala Phe Asn Ile Arg Thr

20 25 30

Phe Gly Arg Thr Lys Met Ser Asn Ala Thr Leu Val Ser Tyr Ile Val

35 40 45

Gln Ile Leu Ser Arg Tyr Asp Ile Ala Leu Val Gln Glu Val Arg Asp

50 55 60

Ser His Leu Thr Ala Val Gly Lys Leu Leu Asp Asn Leu Asn Gln Asp

65 70 75 80

Ala Pro Asp Thr Tyr His Tyr Val Val Ser Glu Pro Leu Gly Arg Lys

85 90 95

Ser Tyr Lys Glu Arg Tyr Leu Phe Val Tyr Arg Pro Asp Gln Val Ser

100 105 110

Ala Val Asp Ser Tyr Tyr Tyr Asp Asp Gly Cys Glu Pro Cys Gly Asn

115 120 125

Asp Thr Phe Asn Arg Glu Pro Phe Ile Val Arg Phe Phe Ser Arg Phe

130 135 140

Thr Glu Val Arg Glu Phe Ala Ile Val Pro Leu His Ala Ala Pro Gly

145 150 155 160

Asp Ala Val Ala Glu Ile Asp Ala Leu Tyr Asp Val Tyr Leu Asp Val

165 170 175

Gln Glu Lys Trp Gly Leu Glu Asp Val Met Leu Met Gly Asp Phe Asn

180 185 190

Ala Gly Cys Ser Tyr Val Arg Pro Ser Gln Trp Ser Ser Ile Arg Leu

195 200 205

Trp Thr Ser Pro Thr Phe Gln Trp Leu Ile Pro Asp Ser Ala Asp Thr

210 215 220

Thr Ala Thr Pro Thr His Cys Ala Tyr Asp Arg Ile Val Val Ala Gly

225 230 235 240

Met Leu Leu Arg Gly Ala Val Val Pro Asp Ser Ala Leu Pro Phe Asn

245 250 255

Phe Gln Ala Ala Tyr Gly Leu Ser Asp Gln Leu Ala Gln Ala Ile Ser

260 265 270

Asp His Tyr Pro Val Glu Val Met Leu Lys

275 280

<210> 3

<211> 732

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (166)..(166)

<223> Lys或Arg

<220>

<221> MOD_RES

<222> (202)..(202)

<223> Ala或Ser

<220>

<221> MOD_RES

<222> (263)..(263)

<223> Ala或Gly

<220>

<221> MOD_RES

<222> (308)..(308)

<223> Arg或Lys

<220>

<221> MOD_RES

<222> (408)..(408)

<223> Glu或Gln

<220>

<221> MOD_RES

<222> (456)..(456)

<223> Thr或Glu

<220>

<221> MOD_RES

<222> (489)..(489)

<223> Ala或Thr

<220>

<221> MOD_RES

<222> (558)..(558)

<223> Ser或Asn

<220>

<221> MOD_RES

<222> (572)..(572)

<223> Gln或Glu

<220>

<221> MOD_RES

<222> (583)..(583)

<223> Ser或Ala

<220>

<221> MOD_RES

<222> (605)..(605)

<223> Asn或Asp

<400> 3

Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser Glu

1 5 10 15

Gly Ile Arg Glu Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro Lys Ala

20 25 30

Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro Gly Tyr

35 40 45

Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Val Asn

50 55 60

Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Gln Gln

65 70 75 80

Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala Asp Ala

85 90 95

Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asn Leu

100 105 110

Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Leu Gly

115 120 125

Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg Pro Val

130 135 140

Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly Lys Lys

145 150 155 160

Gly Gln Gln Pro Ala Xaa Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr Gly Asp

165 170 175

Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro Ala Ala

180 185 190

Pro Ser Gly Val Gly Ser Asn Thr Met Xaa Ala Gly Gly Gly Ala Pro

195 200 205

Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly

210 215 220

Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile Thr Thr

225 230 235 240

Ser Thr Arg Thr Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Gln

245 250 255

Ile Ser Ser Gln Ser Gly Xaa Ser Thr Asn Asp Asn Thr Tyr Phe Gly

260 265 270

Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His

275 280 285

Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Phe

290 295 300

Arg Pro Lys Xaa Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu

305 310 315 320

Val Thr Thr Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser

325 330 335

Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Leu

340 345 350

Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp Val Phe

355 360 365

Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser Gln Ala

370 375 380

Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met

385 390 395 400

Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Xaa Phe Ser Tyr Thr Phe Glu Asp Val

405 410 415

Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Asn

420 425 430

Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr Gln Thr Thr

435 440 445

Ser Gly Thr Ala Gly Asn Arg Xaa Leu Gln Phe Ser Gln Ala Gly Pro

450 455 460

Ser Ser Met Ala Asn Gln Ala Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Cys Tyr

465 470 475 480

Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Xaa Asn Gln Asn Asn Asn Ser Asn

485 490 495

Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly Arg Asp Ser

500 505 510

Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Thr His Lys Asp Asp Glu Asp

515 520 525

Lys Phe Phe Pro Met Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys Gln Gly Ala

530 535 540

Gly Asn Ser Asn Val Asp Leu Asp Asn Val Met Ile Thr Xaa Glu Glu

545 550 555 560

Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Xaa Tyr Gly Thr Val

565 570 575

Ala Thr Asn Leu Gln Ser Xaa Asn Thr Ala Pro Ala Thr Gly Thr Val

580 585 590

Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Xaa Arg Asp Val

595 600 605

Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His

610 615 620

Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro

625 630 635 640

Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Pro Thr

645 650 655

Thr Phe Ser Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr

660 665 670

Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser

675 680 685

Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser

690 695 700

Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro

705 710 715 720

Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu

725 730

<210> 4

<211> 260

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 4

Leu Lys Ile Ala Ala Phe Asn Ile Gln Thr Phe Gly Glu Thr Lys Met

1 5 10 15

Ser Asn Ala Thr Leu Val Ser Tyr Ile Val Gln Ile Leu Ser Arg Tyr

20 25 30

Asp Ile Ala Leu Val Gln Glu Val Arg Asp Ser His Leu Thr Ala Val

35 40 45

Gly Lys Leu Leu Asp Asn Leu Asn Gln Asp Ala Pro Asp Thr Tyr His

50 55 60

Tyr Val Val Ser Glu Pro Leu Gly Arg Asn Ser Tyr Lys Glu Arg Tyr

65 70 75 80

Leu Phe Val Tyr Arg Pro Asp Gln Val Ser Ala Val Asp Ser Tyr Tyr

85 90 95

Tyr Asp Asp Gly Cys Glu Pro Cys Gly Asn Asp Thr Phe Asn Arg Glu

100 105 110

Pro Ala Ile Val Arg Phe Phe Ser Arg Phe Thr Glu Val Arg Glu Phe

115 120 125

Ala Ile Val Pro Leu His Ala Ala Pro Gly Asp Ala Val Ala Glu Ile

130 135 140

Asp Ala Leu Tyr Asp Val Tyr Leu Asp Val Gln Glu Lys Trp Gly Leu

145 150 155 160

Glu Asp Val Met Leu Met Gly Asp Phe Asn Ala Gly Cys Ser Tyr Val

165 170 175

Arg Pro Ser Gln Trp Ser Ser Ile Arg Leu Trp Thr Ser Pro Thr Phe

180 185 190

Gln Trp Leu Ile Pro Asp Ser Ala Asp Thr Thr Ala Thr Pro Thr His

195 200 205

Cys Ala Tyr Asp Arg Ile Val Val Ala Gly Met Leu Leu Arg Gly Ala

210 215 220

Val Val Pro Asp Ser Ala Leu Pro Phe Asn Phe Gln Ala Ala Tyr Gly

225 230 235 240

Leu Ser Asp Gln Leu Ala Gln Ala Ile Ser Asp His Tyr Pro Val Glu

245 250 255

Val Met Leu Lys

260

<210> 5

<211> 260

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 5

Leu Lys Ile Ala Ala Phe Asn Ile Arg Thr Phe Gly Arg Thr Lys Met

1 5 10 15

Ser Asn Ala Thr Leu Val Ser Tyr Ile Val Gln Ile Leu Ser Arg Tyr

20 25 30

Asp Ile Ala Leu Val Gln Glu Val Arg Asp Ser His Leu Thr Ala Val

35 40 45

Gly Lys Leu Leu Asp Asn Leu Asn Gln Asp Ala Pro Asp Thr Tyr His

50 55 60

Tyr Val Val Ser Glu Pro Leu Gly Arg Lys Ser Tyr Lys Glu Arg Tyr

65 70 75 80

Leu Phe Val Tyr Arg Pro Asp Gln Val Ser Ala Val Asp Ser Tyr Tyr

85 90 95

Tyr Asp Asp Gly Cys Glu Pro Cys Gly Asn Asp Thr Phe Asn Arg Glu

100 105 110

Pro Phe Ile Val Arg Phe Phe Ser Arg Phe Thr Glu Val Arg Glu Phe

115 120 125

Ala Ile Val Pro Leu His Ala Ala Pro Gly Asp Ala Val Ala Glu Ile

130 135 140

Asp Ala Leu Tyr Asp Val Tyr Leu Asp Val Gln Glu Lys Trp Gly Leu

145 150 155 160

Glu Asp Val Met Leu Met Gly Asp Phe Asn Ala Gly Cys Ser Tyr Val

165 170 175

Arg Pro Ser Gln Trp Ser Ser Ile Arg Leu Trp Thr Ser Pro Thr Phe

180 185 190

Gln Trp Leu Ile Pro Asp Ser Ala Asp Thr Thr Ala Thr Pro Thr His

195 200 205

Cys Ala Tyr Asp Arg Ile Val Val Ala Gly Met Leu Leu Arg Gly Ala

210 215 220

Val Val Pro Asp Ser Ala Leu Pro Phe Asn Phe Gln Ala Ala Tyr Gly

225 230 235 240

Leu Ser Asp Gln Leu Ala Gln Ala Ile Ser Asp His Tyr Pro Val Glu

245 250 255

Val Met Leu Lys

260

<210> 6

<211> 22

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 6

Met Arg Gly Met Lys Leu Leu Gly Ala Leu Leu Ala Leu Ala Ala Leu

1 5 10 15

Leu Gln Gly Ala Val Ser

20

<210> 7

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 7

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser

20

<210> 8

<211> 214

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 8

actagttcca gatggtaaat atacacaagg gatttagtca aacaattttt tggcaagaat 60

attatgaatt ttgtaatcgg ttggcagcca atgaaataca aagatgagtc tagttaataa 120

tctacaatta ttggttaaag aagtatatta gtgctaattt ccctccgttt gtcctagctt 180

ttctcttctg tcaaccccac acgcctttgg cacc 214

<210> 9

<211> 726

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (165)..(165)

<223> Lys或Arg

<220>

<221> MOD_RES

<222> (201)..(201)

<223> Ala或Ser

<220>

<221> MOD_RES

<222> (261)..(261)

<223> Ala或Gly

<220>

<221> MOD_RES

<222> (306)..(306)

<223> Arg或Lys

<220>

<221> MOD_RES

<222> (406)..(406)

<223> Glu或Gln

<220>

<221> MOD_RES

<222> (454)..(454)

<223> Thr或Glu

<220>

<221> MOD_RES

<222> (486)..(486)

<223> Ala或Thr

<220>

<221> MOD_RES

<222> (554)..(554)

<223> Ser或Asn

<220>

<221> MOD_RES

<222> (568)..(568)

<223> Gln或Glu

<220>

<221> MOD_RES

<222> (579)..(579)

<223> Ser或Ala

<220>

<221> MOD_RES

<222> (600)..(600)

<223> Asn或Asp

<400> 9

Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser Glu

1 5 10 15

Gly Ile Arg Glu Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro Lys Ala

20 25 30

Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro Gly Tyr

35 40 45

Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Val Asn Ala

50 55 60

Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Gln Gln Leu

65 70 75 80

Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala Asp Ala Glu

85 90 95

Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asn Leu Gly

100 105 110

Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Leu Gly Leu

115 120 125

Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg Pro Val Glu

130 135 140

Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly Lys Lys Gly

145 150 155 160

Gln Gln Pro Ala Xaa Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr Gly Asp Ser

165 170 175

Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro Ala Ala Pro

180 185 190

Ser Gly Val Gly Ser Asn Thr Met Xaa Ala Gly Gly Gly Ala Pro Ala

195 200 205

Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asn Trp

210 215 220

His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile Thr Thr Ser Thr

225 230 235 240

Arg Thr Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Gln Ile Ser

245 250 255

Ser Gln Ser Gly Xaa Ser Thr Asn Asp Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser

260 265 270

Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser

275 280 285

Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro

290 295 300

Lys Xaa Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr

305 310 315 320

Thr Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val

325 330 335

Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser

340 345 350

Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp Val Phe Met Ile

355 360 365

Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly

370 375 380

Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg

385 390 395 400

Thr Gly Asn Asn Phe Xaa Phe Ser Tyr Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe

405 410 415

His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Asn Pro Leu

420 425 430

Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr Gln Thr Thr Ser Gly

435 440 445

Thr Ala Gly Asn Arg Xaa Leu Gln Phe Ser Gln Ala Gly Pro Ser Ser

450 455 460

Ala Asn Gln Ala Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln

465 470 475 480

Arg Val Ser Lys Thr Xaa Asn Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp

485 490 495

Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn

500 505 510

Pro Gly Pro Ala Met Ala Thr His Lys Asp Asp Glu Asp Lys Phe Phe

515 520 525

Pro Met Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Asn Ser

530 535 540

Asn Val Asp Leu Asp Asn Val Ile Thr Xaa Glu Glu Glu Ile Lys Thr

545 550 555 560

Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Xaa Tyr Gly Thr Val Ala Thr Asn Leu

565 570 575

Gln Ser Xaa Asn Thr Ala Pro Ala Thr Gly Thr Val Asn Ser Gln Gly

580 585 590

Ala Leu Pro Gly Val Trp Gln Xaa Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro

595 600 605

Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro

610 615 620

Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile

625 630 635 640

Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Pro Thr Thr Phe Ser Pro Ala

645 650 655

Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val

660 665 670

Glu Ile Glu Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu

675 680 685

Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala

690 695 700

Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg

705 710 715 720

Tyr Leu Thr Arg Asn Leu

725

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列描述：合成引物

<400> 10

caacttcatc cacgttcacc 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列描述：合成引物

<400> 11

gttctgagct ccaaccattc t 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列描述：合成引物

<400> 12

cactgtgggt ccttcatctt t 21

<210> 13

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列描述：合成引物

<220>

<221> modified_base

<222> (42)..(42)

<223> a, c, t, g, 未知或其他

<400> 13

tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctacgg gnggcwgcag 50

<210> 14

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列描述：合成引物

<400> 14

gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggactac hvgggtatct aatcc 55

<210> 15

<211> 397

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 15

gatcttgcta ccagtggaac agccactaag gattctgcag tgagagcaga gggccagcta 60

agtggtactc tcccagagac tgtctgactc acgccacccc ctccaccttg gacacaggac 120

gctgtggttt ctgagccagg tacaatgact cctttcggta agtgcagtgg aagctgtaca 180

ctgcccaggc aaagcgtccg ggcagcgtag gcgggcgact cagatcccag ccagtggact 240

tagcccctgt ttgctcctcc gataactggg gtgaccttgg ttaatattca ccagcagcct 300

cccccgttgc ccctctggat ccactgctta aatacggacg aggacagggc cctgtctcct 360

cagcttcagg caccaccact gacctgggac agtgaat 397

<210> 16

<211> 637

<212> DNA

<213> 土拨鼠肝炎病毒（Woodchuck hepatitis virus）

<400> 16

agtggcggcc gctcgagcta gcggccgctc tagaagataa tcaacctctg gattacaaaa 60

tttgtgaaag attgactggt attcttaact atgttgctcc ttttacgcta tgtggatacg 120

ctgctttaat gcctttgtat catgctattg cttcccgtat ggctttcatt ttctcctcct 180

tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg aggagttgtg gcccgttgtc aggcaacgtg 240

gcgtggtgtg cactgtgttt gctgacgcaa cccccactgg ttggggcatt gccaccacct 300

gtcagctcct ttccgggact ttcgctttcc ccctccctat tgccacggcg gaactcatcg 360

ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt gggcactgac aattccgtgg 420

tgttgtcggg gaaatcatcg tcctttcctt ggctgctcgc ctgtgttgcc acctggattc 480

tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt cggccctcaa tccagcggac cttccttccc 540

gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc cgcgtcttcg ccttcgccct cagacgagtc 600

ggatctccct ttgggccgcc tccccgcatc ggactag 637

<210> 17

<211> 320

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 17

aggctcagag gcacacagga gtttctgggc tcaccctgcc cccttccaac ccctcagttc 60

ccatcctcca gcagctgttt gtgtgctgcc tctgaagtcc acactgaaca aacttcagcc 120

tactcatgtc cctaaaatgg gcaaacattg caagcagcaa acagcaaaca cacagccctc 180

cctgcctgct gaccttggag ctggggcaga ggtcagagac ctctctgggc ccatgccacc 240

tccaacatcc actcgacccc ttggaatttc ggtggagagg agcagaggtt gtcctggcgt 300

ggtttaggta gtgtgagagg 320

<210> 18

<211> 840

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列描述：合成多核苷酸

<400> 18

atgaagctgc tgggggcgct gctggcactg gcggccctac tgcagggggc cgtgtccctg 60

aagatcgcag ccttcaacat caggacattt gggaggacca agatgtccaa tgccaccctc 120

gtcagctaca ttgtgcagat cctgagccgc tatgacatcg ccctggtcca ggaggtcaga 180

gacagccacc tgactgccgt ggggaagctg ctggacaacc tcaatcagga tgcaccagac 240

acctatcact acgtggtcag tgagccactg ggacggaaga gctataagga gcgctacctg 300

ttcgtgtaca ggcctgacca ggtgtctgcg gtggacagct actactacga tgatggctgc 360

gagccctgcg ggaacgacac cttcaaccga gagccattca ttgtcaggtt cttctcccgg 420

ttcacagagg tcagggagtt tgccattgtt cccctgcatg cggccccggg ggacgcagta 480

gccgagatcg acgctctcta tgacgtctac ctggatgtcc aagagaaatg gggcttggag 540

gacgtcatgt tgatgggcga cttcaatgcg ggctgcagct atgtgagacc ctcccagtgg 600

tcatccatcc gcctgtggac aagccccacc ttccagtggc tgatccccga cagcgctgac 660

accacagcta cacccacgca ctgtgcctat gacaggatcg tggttgcagg gatgctgctc 720

cgaggcgccg ttgttcccga ctcggctctt ccctttaact tccaggctgc ctatggcctg 780

agtgaccaac tggcccaagc catcagtgac cactatccag tggaggtgat gctgaagtga 840

<210> 19

<211> 849

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列描述：合成多核苷酸

<400> 19

atgaggggca tgaagctgct gggggcgctg ctggcactgg cggccctact gcagggggcc 60

gtgtccctga agatcgcagc cttcaacatc aggacatttg ggaggaccaa gatgtccaat 120

gccaccctcg tcagctacat tgtgcagatc ctgagccgct atgacatcgc cctggtccag 180

gaggtcagag acagccacct gactgccgtg gggaagctgc tggacaacct caatcaggat 240

gcaccagaca cctatcacta cgtggtcagt gagccactgg gacggaagag ctataaggag 300

cgctacctgt tcgtgtacag gcctgaccag gtgtctgcgg tggacagcta ctactacgat 360

gatggctgcg agccctgcgg gaacgacacc ttcaaccgag agccattcat tgtcaggttc 420

ttctcccggt tcacagaggt cagggagttt gccattgttc ccctgcatgc ggccccgggg 480

gacgcagtag ccgagatcga cgctctctat gacgtctacc tggatgtcca agagaaatgg 540

ggcttggagg acgtcatgtt gatgggcgac ttcaatgcgg gctgcagcta tgtgagaccc 600

tcccagtggt catccatccg cctgtggaca agccccacct tccagtggct gatccccgac 660

agcgctgaca ccacagctac acccacgcac tgtgcctatg acaggatcgt ggttgcaggg 720

atgctgctcc gaggcgccgt tgttcccgac tcggctcttc cctttaactt ccaggctgcc 780

tatggcctga gtgaccaact ggcccaagcc atcagtgacc actatccagt ggaggtgatg 840

ctgaagtga 849

<210> 20

<211> 66

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 20

atgaggggca tgaagctgct gggggcgctg ctggcactgg cggccctact gcagggggcc 60

gtgtcc 66

<210> 21

<211> 783

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列描述：合成多核苷酸

<400> 21

ctgaagatcg cagccttcaa catcaggaca tttgggagga ccaagatgtc caatgccacc 60

ctcgtcagct acattgtgca gatcctgagc cgctatgaca tcgccctggt ccaggaggtc 120

agagacagcc acctgactgc cgtggggaag ctgctggaca acctcaatca ggatgcacca 180

gacacctatc actacgtggt cagtgagcca ctgggacgga agagctataa ggagcgctac 240

ctgttcgtgt acaggcctga ccaggtgtct gcggtggaca gctactacta cgatgatggc 300

tgcgagccct gcgggaacga caccttcaac cgagagccat tcattgtcag gttcttctcc 360

cggttcacag aggtcaggga gtttgccatt gttcccctgc atgcggcccc gggggacgca 420

gtagccgaga tcgacgctct ctatgacgtc tacctggatg tccaagagaa atggggcttg 480

gaggacgtca tgttgatggg cgacttcaat gcgggctgca gctatgtgag accctcccag 540

tggtcatcca tccgcctgtg gacaagcccc accttccagt ggctgatccc cgacagcgct 600

gacaccacag ctacacccac gcactgtgcc tatgacagga tcgtggttgc agggatgctg 660

ctccgaggcg ccgttgttcc cgactcggct cttcccttta acttccaggc tgcctatggc 720

ctgagtgacc aactggccca agccatcagt gaccactatc cagtggaggt gatgctgaag 780

tga 783

<210> 22

<211> 846

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 22

atgaggggca tgaagctgct gggggcgctg ctggcactgg cggccctact gcagggggcc 60

gtgtccctga agatcgcagc cttcaacatc cagacatttg gggagaccaa gatgtccaat 120

gccaccctcg tcagctacat tgtgcagatc ctgagccgct atgacatcgc cctggtccag 180

gaggtcagag acagccacct gactgccgtg gggaagctgc tggacaacct caatcaggat 240

gcaccagaca cctatcacta cgtggtcagt gagccactgg gacggaacag ctataaggag 300

cgctacctgt tcgtgtacag gcctgaccag gtgtctgcgg tggacagcta ctactacgat 360

gatggctgcg agccctgcgg gaacgacacc ttcaaccgag agccagccat tgtcaggttc 420

ttctcccggt tcacagaggt cagggagttt gccattgttc ccctgcatgc ggccccgggg 480

gacgcagtag ccgagatcga cgctctctat gacgtctacc tggatgtcca agagaaatgg 540

ggcttggagg acgtcatgtt gatgggcgac ttcaatgcgg gctgcagcta tgtgagaccc 600

tcccagtggt catccatccg cctgtggaca agccccacct tccagtggct gatccccgac 660

agcgctgaca ccacagctac acccacgcac tgtgcctatg acaggatcgt ggttgcaggg 720

atgctgctcc gaggcgccgt tgttcccgac tcggctcttc cctttaactt ccaggctgcc 780

tatggcctga gtgaccaact ggcccaagcc atcagtgacc actatccagt ggaggtgatg 840

ctgaag 846

<210> 23

<211> 780

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 23

ctgaagatcg cagccttcaa catccagaca tttggggaga ccaagatgtc caatgccacc 60

ctcgtcagct acattgtgca gatcctgagc cgctatgaca tcgccctggt ccaggaggtc 120

agagacagcc acctgactgc cgtggggaag ctgctggaca acctcaatca ggatgcacca 180

gacacctatc actacgtggt cagtgagcca ctgggacgga acagctataa ggagcgctac 240

ctgttcgtgt acaggcctga ccaggtgtct gcggtggaca gctactacta cgatgatggc 300

tgcgagccct gcgggaacga caccttcaac cgagagccag ccattgtcag gttcttctcc 360

cggttcacag aggtcaggga gtttgccatt gttcccctgc atgcggcccc gggggacgca 420

gtagccgaga tcgacgctct ctatgacgtc tacctggatg tccaagagaa atggggcttg 480

gaggacgtca tgttgatggg cgacttcaat gcgggctgca gctatgtgag accctcccag 540

tggtcatcca tccgcctgtg gacaagcccc accttccagt ggctgatccc cgacagcgct 600

gacaccacag ctacacccac gcactgtgcc tatgacagga tcgtggttgc agggatgctg 660

ctccgaggcg ccgttgttcc cgactcggct cttcccttta acttccaggc tgcctatggc 720

ctgagtgacc aactggccca agccatcagt gaccactatc cagtggaggt gatgctgaag 780

<210> 24

<211> 284

<212> PRT

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 24

Met Arg Tyr Thr Gly Leu Met Gly Thr Leu Leu Thr Leu Val Asn Leu

1 5 10 15

Leu Gln Leu Ala Gly Thr Leu Arg Ile Ala Ala Phe Asn Ile Arg Thr

20 25 30

Phe Gly Glu Thr Lys Met Ser Asn Ala Thr Leu Ser Val Tyr Phe Val

35 40 45

Lys Ile Leu Ser Arg Tyr Asp Ile Ala Val Ile Gln Glu Val Arg Asp

50 55 60

Ser His Leu Val Ala Val Gly Lys Leu Leu Asp Glu Leu Asn Arg Asp

65 70 75 80

Lys Pro Asp Thr Tyr Arg Tyr Val Val Ser Glu Pro Leu Gly Arg Lys

85 90 95

Ser Tyr Lys Glu Gln Tyr Leu Phe Val Tyr Arg Pro Asp Gln Val Ser

100 105 110

Ile Leu Asp Ser Tyr Gln Tyr Asp Asp Gly Cys Glu Pro Cys Gly Asn

115 120 125

Asp Thr Phe Ser Arg Glu Pro Ala Ile Val Lys Phe Phe Ser Pro Tyr

130 135 140

Thr Glu Val Gln Glu Phe Ala Ile Val Pro Leu His Ala Ala Pro Thr

145 150 155 160

Glu Ala Val Ser Glu Ile Asp Ala Leu Tyr Asp Val Tyr Leu Asp Val

165 170 175

Trp Gln Lys Trp Gly Leu Glu Asp Ile Met Phe Met Gly Asp Phe Asn

180 185 190

Ala Gly Cys Ser Tyr Val Thr Ser Ser Gln Trp Ser Ser Ile Arg Leu

195 200 205

Arg Thr Ser Pro Ile Phe Gln Trp Leu Ile Pro Asp Ser Ala Asp Thr

210 215 220

Thr Val Thr Ser Thr His Cys Ala Tyr Asp Arg Ile Val Val Ala Gly

225 230 235 240

Ala Leu Leu Gln Ala Ala Val Val Pro Asn Ser Ala Val Pro Phe Asp

245 250 255

Phe Gln Ala Glu Tyr Gly Leu Ser Asn Gln Leu Ala Glu Ala Ile Ser

260 265 270

Asp His Tyr Pro Val Glu Val Thr Leu Arg Lys Ile

275 280

<210> 25

<211> 22

<212> PRT

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 25

Met Arg Tyr Thr Gly Leu Met Gly Thr Leu Leu Thr Leu Val Asn Leu

1 5 10 15

Leu Gln Leu Ala Gly Thr

20

<210> 26

<211> 262

<212> PRT

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 26

Leu Arg Ile Ala Ala Phe Asn Ile Arg Thr Phe Gly Glu Thr Lys Met

1 5 10 15

Ser Asn Ala Thr Leu Ser Val Tyr Phe Val Lys Ile Leu Ser Arg Tyr

20 25 30

Asp Ile Ala Val Ile Gln Glu Val Arg Asp Ser His Leu Val Ala Val

35 40 45

Gly Lys Leu Leu Asp Glu Leu Asn Arg Asp Lys Pro Asp Thr Tyr Arg

50 55 60

Tyr Val Val Ser Glu Pro Leu Gly Arg Lys Ser Tyr Lys Glu Gln Tyr

65 70 75 80

Leu Phe Val Tyr Arg Pro Asp Gln Val Ser Ile Leu Asp Ser Tyr Gln

85 90 95

Tyr Asp Asp Gly Cys Glu Pro Cys Gly Asn Asp Thr Phe Ser Arg Glu

100 105 110

Pro Ala Ile Val Lys Phe Phe Ser Pro Tyr Thr Glu Val Gln Glu Phe

115 120 125

Ala Ile Val Pro Leu His Ala Ala Pro Thr Glu Ala Val Ser Glu Ile

130 135 140

Asp Ala Leu Tyr Asp Val Tyr Leu Asp Val Trp Gln Lys Trp Gly Leu

145 150 155 160

Glu Asp Ile Met Phe Met Gly Asp Phe Asn Ala Gly Cys Ser Tyr Val

165 170 175

Thr Ser Ser Gln Trp Ser Ser Ile Arg Leu Arg Thr Ser Pro Ile Phe

180 185 190

Gln Trp Leu Ile Pro Asp Ser Ala Asp Thr Thr Val Thr Ser Thr His

195 200 205

Cys Ala Tyr Asp Arg Ile Val Val Ala Gly Ala Leu Leu Gln Ala Ala

210 215 220

Val Val Pro Asn Ser Ala Val Pro Phe Asp Phe Gln Ala Glu Tyr Gly

225 230 235 240

Leu Ser Asn Gln Leu Ala Glu Ala Ile Ser Asp His Tyr Pro Val Glu

245 250 255

Val Thr Leu Arg Lys Ile

260

<210> 27

<211> 66

<212> DNA

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 27

atgcggtaca cagggctaat gggaacactg ctcaccttgg tcaacctgct gcagctggct 60

gggact 66

<210> 28

<211> 789

<212> DNA

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 28

ctgagaattg cagccttcaa cattcggact tttggggaga ctaagatgtc caatgctacc 60

ctctctgtat actttgtgaa aatcctgagt cgctatgaca tcgctgttat ccaagaggtc 120

agagactccc acctggttgc tgttgggaag ctcctggatg aactcaatcg ggacaaacct 180

gacacctacc gctatgtagt cagtgagccg ctgggccgca aaagctacaa ggaacagtac 240

ctttttgtgt acaggcctga ccaggtgtct attctggaca gctatcaata tgatgatggc 300

tgtgaaccct gtggaaatga caccttcagc agagagccag ccattgttaa gttcttttcc 360

ccatacactg aggtccaaga atttgcgatc gtgcccttgc atgcagcccc aacagaagct 420

gtgagtgaga tcgacgccct ctacgatgtt tacctagatg tctggcaaaa gtggggcctg 480

gaggacatca tgttcatggg agacttcaat gctggctgca gctacgtcac ttcctcccag 540

tggtcctcca ttcgccttcg gacaagcccc atcttccagt ggctgatccc tgacagtgcg 600

gacaccacag tcacatcaac acactgtgct tatgacagga ttgtggttgc tggagctctg 660

ctccaggctg ctgttgttcc caactcggct gttccttttg atttccaagc agaatacgga 720

ctttccaacc agctggctga agccatcagt gaccattacc cagtggaggt gacactcaga 780

aaaatctga 789

<210> 29

<211> 855

<212> DNA

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 29

atgcggtaca cagggctaat gggaacactg ctcaccttgg tcaacctgct gcagctggct 60

gggactctga gaattgcagc cttcaacatt cggacttttg gggagactaa gatgtccaat 120

gctaccctct ctgtatactt tgtgaaaatc ctgagtcgct atgacatcgc tgttatccaa 180

gaggtcagag actcccacct ggttgctgtt gggaagctcc tggatgaact caatcgggac 240

aaacctgaca cctaccgcta tgtagtcagt gagccgctgg gccgcaaaag ctacaaggaa 300

cagtaccttt ttgtgtacag gcctgaccag gtgtctattc tggacagcta tcaatatgat 360

gatggctgtg aaccctgtgg aaatgacacc ttcagcagag agccagccat tgttaagttc 420

ttttccccat acactgaggt ccaagaattt gcgatcgtgc ccttgcatgc agccccaaca 480

gaagctgtga gtgagatcga cgccctctac gatgtttacc tagatgtctg gcaaaagtgg 540

ggcctggagg acatcatgtt catgggagac ttcaatgctg gctgcagcta cgtcacttcc 600

tcccagtggt cctccattcg ccttcggaca agccccatct tccagtggct gatccctgac 660

agtgcggaca ccacagtcac atcaacacac tgtgcttatg acaggattgt ggttgctgga 720

gctctgctcc aggctgctgt tgttcccaac tcggctgttc cttttgattt ccaagcagaa 780

tacggacttt ccaaccagct ggctgaagcc atcagtgacc attacccagt ggaggtgaca 840

ctcagaaaaa tctga 855

<210> 30

<211> 2212

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列描述：合成多核苷酸

<400> 30

aggctcagag gcacacagga gtttctgggc tcaccctgcc cccttccaac ccctcagttc 60

ccatcctcca gcagctgttt gtgtgctgcc tctgaagtcc acactgaaca aacttcagcc 120

tactcatgtc cctaaaatgg gcaaacattg caagcagcaa acagcaaaca cacagccctc 180

cctgcctgct gaccttggag ctggggcaga ggtcagagac ctctctgggc ccatgccacc 240

tccaacatcc actcgacccc ttggaatttc ggtggagagg agcagaggtt gtcctggcgt 300

ggtttaggta gtgtgagagg gatcttgcta ccagtggaac agccactaag gattctgcag 360

tgagagcaga gggccagcta agtggtactc tcccagagac tgtctgactc acgccacccc 420

ctccaccttg gacacaggac gctgtggttt ctgagccagg tacaatgact cctttcggta 480

agtgcagtgg aagctgtaca ctgcccaggc aaagcgtccg ggcagcgtag gcgggcgact 540

cagatcccag ccagtggact tagcccctgt ttgctcctcc gataactggg gtgaccttgg 600

ttaatattca ccagcagcct cccccgttgc ccctctggat ccactgctta aatacggacg 660

aggacagggc cctgtctcct cagcttcagg caccaccact gacctgggac agtgaatgcc 720

gccaccatga ggggcatgaa gctgctgggg gcgctgctgg cactggcggc cctactgcag 780

ggggccgtgt ccctgaagat cgcagccttc aacatcagga catttgggag gaccaagatg 840

tccaatgcca ccctcgtcag ctacattgtg cagatcctga gccgctatga catcgccctg 900

gtccaggagg tcagagacag ccacctgact gccgtgggga agctgctgga caacctcaat 960

caggatgcac cagacaccta tcactacgtg gtcagtgagc cactgggacg gaagagctat 1020

aaggagcgct acctgttcgt gtacaggcct gaccaggtgt ctgcggtgga cagctactac 1080

tacgatgatg gctgcgagcc ctgcgggaac gacaccttca accgagagcc attcattgtc 1140

aggttcttct cccggttcac agaggtcagg gagtttgcca ttgttcccct gcatgcggcc 1200

ccgggggacg cagtagccga gatcgacgct ctctatgacg tctacctgga tgtccaagag 1260

aaatggggct tggaggacgt catgttgatg ggcgacttca atgcgggctg cagctatgtg 1320

agaccctccc agtggtcatc catccgcctg tggacaagcc ccaccttcca gtggctgatc 1380

cccgacagcg ctgacaccac agctacaccc acgcactgtg cctatgacag gatcgtggtt 1440

gcagggatgc tgctccgagg cgccgttgtt cccgactcgg ctcttccctt taacttccag 1500

gctgcctatg gcctgagtga ccaactggcc caagccatca gtgaccacta tccagtggag 1560

gtgatgctga agtgaagtgg cggccgctcg agctagcggc cgctctagaa gataatcaac 1620

ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctggtattct taactatgtt gctcctttta 1680

cgctatgtgg atacgctgct ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt 1740

tcattttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg 1800

ttgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg 1860

gcattgccac cacctgtcag ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc cctattgcca 1920

cggcggaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca 1980

ctgacaattc cgtggtgttg tcggggaaat catcgtcctt tccttggctg ctcgcctgtg 2040

ttgccacctg gattctgcgc gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag 2100

cggaccttcc ttcccgcggc ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc 2160

gccctcagac gagtcggatc tccctttggg ccgcctcccc gcatcggact ag 2212

<210> 31

<211> 2212

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列描述：合成多核苷酸

<400> 31

aggctcagag gcacacagga gtttctgggc tcaccctgcc cccttccaac ccctcagttc 60

ccatcctcca gcagctgttt gtgtgctgcc tctgaagtcc acactgaaca aacttcagcc 120

tactcatgtc cctaaaatgg gcaaacattg caagcagcaa acagcaaaca cacagccctc 180

cctgcctgct gaccttggag ctggggcaga ggtcagagac ctctctgggc ccatgccacc 240

tccaacatcc actcgacccc ttggaatttc ggtggagagg agcagaggtt gtcctggcgt 300

ggtttaggta gtgtgagagg gatcttgcta ccagtggaac agccactaag gattctgcag 360

tgagagcaga gggccagcta agtggtactc tcccagagac tgtctgactc acgccacccc 420

ctccaccttg gacacaggac gctgtggttt ctgagccagg tacaatgact cctttcggta 480

agtgcagtgg aagctgtaca ctgcccaggc aaagcgtccg ggcagcgtag gcgggcgact 540

cagatcccag ccagtggact tagcccctgt ttgctcctcc gataactggg gtgaccttgg 600

ttaatattca ccagcagcct cccccgttgc ccctctggat ccactgctta aatacggacg 660

aggacagggc cctgtctcct cagcttcagg caccaccact gacctgggac agtgaatgcc 720

gccaccatga ggggcatgaa gctgctgggg gcgctgctgg cactggcggc cctactgcag 780

ggggccgtgt ccctgaagat cgcagccttc aacatccaga catttgggga gaccaagatg 840

tccaatgcca ccctcgtcag ctacattgtg cagatcctga gccgctatga catcgccctg 900

gtccaggagg tcagagacag ccacctgact gccgtgggga agctgctgga caacctcaat 960

caggatgcac cagacaccta tcactacgtg gtcagtgagc cactgggacg gaacagctat 1020

aaggagcgct acctgttcgt gtacaggcct gaccaggtgt ctgcggtgga cagctactac 1080

tacgatgatg gctgcgagcc ctgcgggaac gacaccttca accgagagcc agccattgtc 1140

aggttcttct cccggttcac agaggtcagg gagtttgcca ttgttcccct gcatgcggcc 1200

ccgggggacg cagtagccga gatcgacgct ctctatgacg tctacctgga tgtccaagag 1260

aaatggggct tggaggacgt catgttgatg ggcgacttca atgcgggctg cagctatgtg 1320

agaccctccc agtggtcatc catccgcctg tggacaagcc ccaccttcca gtggctgatc 1380

cccgacagcg ctgacaccac agctacaccc acgcactgtg cctatgacag gatcgtggtt 1440

gcagggatgc tgctccgagg cgccgttgtt cccgactcgg ctcttccctt taacttccag 1500

gctgcctatg gcctgagtga ccaactggcc caagccatca gtgaccacta tccagtggag 1560

gtgatgctga agtgaagtgg cggccgctcg agctagcggc cgctctagaa gataatcaac 1620

ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctggtattct taactatgtt gctcctttta 1680

cgctatgtgg atacgctgct ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt 1740

tcattttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg 1800

ttgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg 1860

gcattgccac cacctgtcag ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc cctattgcca 1920

cggcggaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca 1980

ctgacaattc cgtggtgttg tcggggaaat catcgtcctt tccttggctg ctcgcctgtg 2040

ttgccacctg gattctgcgc gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag 2100

cggaccttcc ttcccgcggc ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc 2160

gccctcagac gagtcggatc tccctttggg ccgcctcccc gcatcggact ag 2212

<210> 32

<211> 849

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 32

atgaggggca tgaagctgct gggggcgctg ctggcactgg cggccctact gcagggggcc 60

gtgtccctga agatcgcagc cttcaacatc cagacatttg gggagaccaa gatgtccaat 120

gccaccctcg tcagctacat tgtgcagatc ctgagccgct atgacatcgc cctggtccag 180

gaggtcagag acagccacct gactgccgtg gggaagctgc tggacaacct caatcaggat 240

gcaccagaca cctatcacta cgtggtcagt gagccactgg gacggaacag ctataaggag 300

cgctacctgt tcgtgtacag gcctgaccag gtgtctgcgg tggacagcta ctactacgat 360

gatggctgcg agccctgcgg gaacgacacc ttcaaccgag agccagccat tgtcaggttc 420

ttctcccggt tcacagaggt cagggagttt gccattgttc ccctgcatgc ggccccgggg 480

gacgcagtag ccgagatcga cgctctctat gacgtctacc tggatgtcca agagaaatgg 540

ggcttggagg acgtcatgtt gatgggcgac ttcaatgcgg gctgcagcta tgtgagaccc 600

tcccagtggt catccatccg cctgtggaca agccccacct tccagtggct gatccccgac 660

agcgctgaca ccacagctac acccacgcac tgtgcctatg acaggatcgt ggttgcaggg 720

atgctgctcc gaggcgccgt tgttcccgac tcggctcttc cctttaactt ccaggctgcc 780

tatggcctga gtgaccaact ggcccaagcc atcagtgacc actatccagt ggaggtgatg 840

ctgaagtga 849

<210> 33

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸

<400> 33

gccgccacc 9

<210> 34

<211> 736

<212> PRT

<213> 腺相关病毒(Adeno-associated virus)

<400> 34

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly

145 150 155 160

Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro

180 185 190

Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Asn Thr Met Ala Ala Gly Gly Gly

195 200 205

Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala

210 215 220

Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile

225 230 235 240

Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

245 250 255

Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp Asn Thr

260 265 270

Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe

275 280 285

His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn

290 295 300

Trp Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln

305 310 315 320

Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn

325 330 335

Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro

340 345 350

Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala

355 360 365

Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly

370 375 380

Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro

385 390 395 400

Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe

405 410 415

Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp

420 425 430

Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg

435 440 445

Thr Gln Thr Thr Ser Gly Thr Ala Gly Asn Arg Thr Leu Gln Phe Ser

450 455 460

Gln Ala Gly Pro Ser Ser Met Ala Asn Gln Ala Lys Asn Trp Leu Pro

465 470 475 480

Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Thr Asn Gln Asn

485 490 495

Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn

500 505 510

Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Thr His Lys

515 520 525

Asp Asp Glu Asp Lys Phe Phe Pro Met Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly

530 535 540

Lys Gln Gly Ala Gly Asn Ser Asn Val Asp Leu Asp Asn Val Met Ile

545 550 555 560

Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Glu

565 570 575

Tyr Gly Thr Val Ala Thr Asn Leu Gln Ser Ala Asn Thr Ala Pro Ala

580 585 590

Thr Gly Thr Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln

595 600 605

Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His

610 615 620

Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu

625 630 635 640

Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala

645 650 655

Asn Pro Pro Thr Thr Phe Ser Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr

660 665 670

Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln

675 680 685

Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn

690 695 700

Tyr Asn Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asp Thr Asn Gly Val

705 710 715 720

Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu

725 730 735

<210> 35

<211> 730

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 35

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Val

50 55 60

Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Gln

65 70 75 80

Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala Asp

85 90 95

Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asn

100 105 110

Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Leu

115 120 125

Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg Pro

130 135 140

Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly Lys

145 150 155 160

Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr Gly

165 170 175

Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro Ala

180 185 190

Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Asn Thr Met Ala Ala Gly Gly Gly Ala

195 200 205

Pro Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly

210 215 220

Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile Thr Thr

225 230 235 240

Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys

245 250 255

Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp Asn Thr Tyr Phe

260 265 270

Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys

275 280 285

His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly

290 295 300

Phe Arg Pro Lys Lys Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys

305 310 315 320

Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr

325 330 335

Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr Val

340 345 350

Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp Val

355 360 365

Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser Gln

370 375 380

Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln

385 390 395 400

Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Glu Asp

405 410 415

Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu

420 425 430

Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr Gln

435 440 445

Thr Thr Ser Gly Thr Ala Gly Asn Arg Thr Leu Gln Phe Ser Gln Ala

450 455 460

Gly Pro Ser Ser Ala Asn Gln Ala Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Cys

465 470 475 480

Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Thr Asn Gln Asn Asn Asn Ser

485 490 495

Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly Arg Asp

500 505 510

Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Thr His Lys Asp Asp Glu

515 520 525

Asp Lys Phe Phe Pro Met Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys Gln Gly

530 535 540

Ala Gly Asn Ser Asn Val Asp Leu Asp Asn Val Ile Thr Asn Glu Glu

545 550 555 560

Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Glu Tyr Gly Thr Val

565 570 575

Ala Thr Asn Leu Gln Ser Ala Asn Thr Ala Pro Ala Thr Gly Thr Val

580 585 590

Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr

595 600 605

Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe

610 615 620

His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro

625 630 635 640

Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Pro Thr Thr

645 650 655

Phe Ser Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly

660 665 670

Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg

675 680 685

Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Thr Asn

690 695 700

Val Asp Phe Ala Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro

705 710 715 720

Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu

725 730

<210> 36

<211> 448

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 36

agtgcaagtg ggttttagga ccaggatgag gcggggtggg ggtgcctacc tgacgaccga 60

ccccgaccca ctggacaagc acccaacccc cattccccaa attgcgcatc ccctatcaga 120

gagggggagg ggaaacagga tgcggcgagg cgcgtgcgca ctgccagctt cagcaccgcg 180

gacagtgcct tcgcccccgc ctggcggcgc gcgccaccgc cgcctcagca ctgaaggcgc 240

gctgacgtca ctcgccggtc ccccgcaaac tccccttccc ggccaccttg gtcgcgtccg 300

cgccgccgcc ggcccagccg gaccgcacca cgcgaggcgc gagatagggg ggcacgggcg 360

cgaccatctg cgctgcggcg ccggcgactc agcgctgcct cagtctgcgg tgggcagcgg 420

aggagtcgtg tcgtgcctga gagcgcag 448

<210> 37

<211> 768

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列描述：合成多核苷酸

<400> 37

gcggccgctc tagagagctt ggcccattgc atacgttgta tccatatcat aatatgtaca 60

tttatattgg ctcatgtcca acattaccgc catgttgaca ttgattattg actagttatt 120

aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat 180

aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa 240

taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg 300

agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc 360

cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct 420

tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga 480

tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa 540

gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc 600

caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg 660

aggtctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat cgcctggaga cgccatccac 720

gctgttttga cctccataga agacaccggg accgatccag cctccggt 768

<210> 38

<211> 664

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列描述：合成多核苷酸

<400> 38

cctctgtctg tctgtctgtc tctttggtgt gatgtatgtg gtgtgtgtgt attctacaag 60

gttgacatga tgacagaatt taattttctt agcagcaagc tcatggatcc tggtgataaa 120

tgcagcatga ctttactgaa aaggctttgt gatcttgaag agtggattga cttcactgtc 180

ggcagcacat gcaatctcac ttgtttggtg taatgaaaga agagaatgag aggtggaagg 240

gggatggtaa tgttgaaaaa aagaatggta cagaggaaac tgaggttgga gagagatggg 300

gtagatggta agagatggag aaagagggaa ggaaatggag agaaagacag agagacagag 360

agagacacac agagagacac acagagacag agaggaaggg aaagggaaag agaaaggaag 420

aggaagaggg ggaggggaag gggaagggga aggggaaggg agagggagaa atgtggacac 480

tagccagatt taagggagaa attagggggt tgccagtctg tccacctctg atggtggcaa 540

ctcagcagaa agctgctggg ctcagtctgg ctttgttgag caaccctgac tccacccctt 600

ttcttcccca caaagcaagc ttttaaaggg aaggctttct tcattgaatg actgccacag 660

tacg 664

<210> 39

<211> 1497

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列描述：合成多核苷酸

<400> 39

gggggtgagc gagggctgct gggaccattg cagggaacaa tgataatcta ggcttggttc 60

ctacccagag agcacgcact catccttcat gcactcccct gttccaaacc ctcactggct 120

ccgtactgcc tccgaccttc cgagacttta gcctggctcc tgtcaacatc tctgaccctt 180

actacatgat cctctctttg gtccatgctc cagcctaatc taattgcggt ggcttgtgcg 240

tggtggcatt cccagccacc atacctttac ccacgctggt ccttccatgc ggaatgcctt 300

tccagggcct gctttgcccg cttctgctca tacacaggca tgccctccag gatggcttcc 360

tacctctttc ccttggggga ttgatctctc tgtcttgggg ttctcggagc ccttgacctg 420

acccctttct gtttggcaaa aaagtaattt acctcggtgt ccttctccct ggtagtctgt 480

gagctcccca aggctgggct gtgcctgatt cacctctgga acttgcttag cacagtgcgt 540

ggcctgctgc aggtgttcat tgagcacttg ccgaatgaat gcatgaatga atgaatgaat 600

gaatgaatgc aaggggctgc taatccacag gactcctcag gtcagccaga cgtcccggtt 660

ccaaggcctg ccactgactc acctcaggac cctgcttgaa ccattagaac tcaccctgcc 720

tcactttccc cctctgtgaa atggggctcc aactcctatt caagctacta tcatttgggg 780

gcattgtgag gccacagatc ccagaacatc agagtcagag gtagcccaga aagcttccca 840

cccatcccta caaatgggaa actgaggtct ggagagggaa gggcagagtt gggctccctg 900

tctcaggctc ggacccacca tcaggcctgt ctctaaaacg aatcccagct cccacgctgc 960

accctgagcc tggaagcctg agccacacaa ggacggggaa ttttccttcc cacttccaga 1020

ggcctctgaa cctccctgag cttgtcccct ttggagggta ttgggcagca gcgtgggcag 1080

aaccccagct cactgtctgg gggagcgctg caggacagcc ttgtctgtct gtctcagcct 1140

gccctgggga cccgaggtca gggaggaagt gccgcatctg gtcttcccca gagcgagagt 1200

gtgagcaagg gtgggattgc gtgtggcccg agagtagccc ctcccctccc cctgtcccca 1260

ccccaaaccc tcttaatgaa atcaagctgg ccctgcggcc cagccgggga gggaggaagg 1320

aggagggacg ggaggaggga cgggaggagg gagggcgggc aggcgccagc ccagagcagc 1380

cccgggcacc agcacggact ctctcttcca gcccaggtgc cccccactct cgctccattc 1440

ggcgggagca cccagtcctg tacgccaagg aactggtgag tcctggggtc ccctcct 1497

<210> 40

<211> 1515

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列描述：合成多核苷酸

<400> 40

acatgcaggc actgtggccc cgaaaaactc ttcagaggtg agcggctttc aggatgagag 60

ggccaacaat ggctcatctc ctaaagacct cgataaacat aatcagtagc cccagaaaac 120

acaacagctg tcccaagcct atcccctttg cacctatctc agaaaaggca acatgcagag 180

tggtcaggag ttcaagtcct cagggcccta ctctgaagct gtgaccctga caggtcactt 240

tagcgctcag cttccctttc ctcatctgta aaatgggaat agaaactgaa tctgcttcat 300

ggggccttgt aagtattaca taagctgtca tatgcaaaat gtccatcaca tagttcaccg 360

ccccaggcat cctagaaact attaagtcac gataaggagg ttgctactgt cctgggacct 420

ggggagctcg gctgtccagt ccgaaagggc cttctcgccc tcgagacccc ttcaagtccc 480

tttctctccg ggcccgggtc ccagagtccc cttgtgcttg ctcctgaggg tgacctgccc 540

gtgccccggg gcgagcacag gtgcggccct ggccacaatg cgggcgtggc gagccgacac 600

ccggggaggc caagggcgcc tcgagggagg gagggaggag gctgacccgg gcgtcccgaa 660

ggacccgccc ggccccggac tccgggcggc agccggcctc gcgccccgcc cccgccccgg 720

gagccccgcc cagtcccgtc gcgccgcgcc gccccaccgc ccgggttggc tgccctggag 780

gccacgcgcg gcgatttgcc acgcgccgcg tcaccgggcc gctcccggcc tgggctcccg 840

ggggctggtc agggaggtgg cggcggctga gcggcggagc gggggcggca gggcgcgacg 900

ccgccgggcc gccccgccct gggaggcgcc cgggccctca tcaagtgacc agtatccctt 960

ccaggggaac acggtccttc agaggaaagc gagctccaac ccgcggcccc ggcgccaagc 1020

cgccgtcatc ttcttcctgt gccaggtgat cgtctcctca cccacccgga aaaacatagt 1080

ccgcccccac gtccttgtgg aatagcgccc gcttccaagc accgtgactc tctttgccct 1140

acccttgtct ttcccattcc aattactcta gaacccaccg agaggataat tcagtcctga 1200

aaagaaactg atggggagaa gcgaggaagg gaacccagga gggaggggag gcagggctgc 1260

ggagggacac cgaggcggcg gaggtagtgc gcacgcgcag cacagaacga gttccggtct 1320

ggccgaggct tgtctcctaa aaatagcccc ggtgtgggga tccgtgcgcg gatgtcccgg 1380

cgagtcccgg gctgaaagag gcggctccgg gcggcgcgaa gcgctggtgg cgggcccggg 1440

ctgcggcgtg tgcgcgcccg ccagctgctc cggagatacg gtgagggccg cgggcagcgg 1500

ggctcagtcc gcgac 1515

<210> 41

<211> 1545

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列描述：合成多核苷酸

<400> 41

agtgcagcct caggggttga aggtgaaatg tgaaatttgc tgtaattact tacccaaaat 60

gtctgtatta aaggctatta gaagcagtta ttttaagtac ttctttatac atctttccct 120

cttctgttta gtatttaaat gtgcaacaaa agtagtggca gatgttactc atctgaagaa 180

actaaaacaa gataagtcag tggcaggagt ggtggccggt taaagatctc ttcgaagtgc 240

tttgttcagt aactgttgtt ttgtctcaca ttaagttgta ggtggggtgc tgttaaagct 300

tgtccactca cgatggtgtt cagctgagac ctgtgagttc aagttgtctt gcccagagtt 360

aaaggccata aaactaagac agtgtcgttc ctgtcttggg tgtaactcct aaaaaactag 420

tcagttcttg caataggagg aaaattattg caaataaacc tttgatttac cagcttcagt 480

aagttgttca ttctgtctct gtagctgtag tttttacctt aacagtttga ggctaccatt 540

tctcttcctt tcatgcttat ggggtccaca caaaccctgc taggctacct acagtataaa 600

atcttaaaac tccatgtggt gttgtgagct ggtagcagat ggactttctt ttgcatctgc 660

tgtgtacaga cttggctttg tactcttttc ctgggggaga gaaagtcttt cttctctgct 720

agttgattcc tgtttttgtg aaacagctaa gaaaacatct gtggcaggca gaaaaattga 780

caaaggattg acaaacacca ttagctgaaa attttccatt tcattgcaac tatgcattgt 840

ttactttact gtaaatatct taatacatca tcctctgaat atgctggcag agaagctgga 900

gaactgtgat ttcaattaag gttagtaatt gatggtatct agtgttcaaa ggctgaagct 960

tgattaacat ctgcttggac aaattgtcat tgtgaagtgg ttttgatgtg cattgaagat 1020

tatttctttc tggcttatct gatgttgtgg ctgtgaaatg cttgtcttgg gtttgcttat 1080

ttttgtaaac tacttccttt ggctgtaaat tgcagagcac tggagcttta ccaaaagtgc 1140

agtgtataat ggtaagcttg tcctaataag ggaagcaaga agtgtattta tcacagacat 1200

gaaagctaac cgaggacttg agagactcaa actggtgctt ttgtctctct ctctctgtct 1260

ttctctctct cacacacaca ctcacacact cacacacatg cacacacaca catacacaca 1320

cacaaaaatg aagcacttac tttagaaaga ttatggtaag catgctggct cagtcttgaa 1380

cctttgtcac ccctcacgtt gcacaccaaa gacataccct agtgattaaa tgctgatttt 1440

gtgtacgatt gtccacggac gccaaaacaa tcacagagct gcttgatttg ttttaattac 1500

cagcacaaaa tgccatcagt ctgggacgtg atcgggcaga ggtgt 1545

<210> 42

<211> 2030

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列描述：合成多核苷酸

<400> 42

atgaggggca tgaagctgct gggggcgctg ctggcactgg cggccctact gcagggggcc 60

gtgtccctga agatcgcagc cttcaacatc aggacatttg ggaggaccaa gatgtccaat 120

gccaccctcg tcagctacat tgtgcagatc ctgagccgct atgacatcgc cctggtccag 180

gaggtcagag acagccacct gactgccgtg gggaagctgc tggacaacct caatcaggat 240

gcaccagaca cctatcacta cgtggtcagt gagccactgg gacggaagag ctataaggag 300

cgctacctgt tcgtgtacag gcctgaccag gtgtctgcgg tggacagcta ctactacgat 360

gatggctgcg agccctgcgg gaacgacacc ttcaaccgag agccattcat tgtcaggttc 420

ttctcccggt tcacagaggt cagggagttt gccattgttc ccctgcatgc ggccccgggg 480

gacgcagtag ccgagatcga cgctctctat gacgtctacc tggatgtcca agagaaatgg 540

ggcttggagg acgtcatgtt gatgggcgac ttcaatgcgg gctgcagcta tgtgagaccc 600

tcccagtggt catccatccg cctgtggaca agccccacct tccagtggct gatccccgac 660

agcgctgaca ccacagctac acccacgcac tgtgcctatg acaggatcgt ggttgcaggg 720

atgctgctcc gaggcgccgt tgttcccgac tcggctcttc cctttaactt ccaggctgcc 780

tatggcctga gtgaccaact ggcccaagcc atcagtgacc actatccagt ggaggtgatg 840

ctgaagtgaa gtggcggccg ctcgagctag cggccgctct agaagataat caacctctgg 900

attacaaaat ttgtgaaaga ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat 960

gtggatacgc tgctttaatg cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt 1020

tctcctcctt gtataaatcc tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca 1080

ggcaacgtgg cgtggtgtgc actgtgtttg ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg 1140

ccaccacctg tcagctcctt tccgggactt tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg 1200

aactcatcgc cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca 1260

attccgtggt gttgtcgggg aaatcatcgt cctttccttg gctgctcgcc tgtgttgcca 1320

cctggattct gcgcgggacg tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc 1380

ttccttcccg cggcctgctg ccggctctgc ggcctcttcc gcgtcttcgc cttcgccctc 1440

agacgagtcg gatctccctt tgggccgcct ccccgcatcg gactagaagc ttgcctcgag 1500

cagcgctgct cgagagatct acgggtggca tccctgtgac ccctccccag tgcctctcct 1560

ggccctggaa gttgccactc cagtgcccac cagccttgtc ctaataaaat taagttgcat 1620

cattttgtct gactaggtgt ccttctataa tattatgggg tggagggggg tggtatggag 1680

caaggggcaa gttgggaaga caacctgtag ggcctgcggg gtctattggg aaccaagctg 1740

gagtgcagtg gcacaatctt ggctcactgc aatctccgcc tcctgggttc aagcgattct 1800

cctgcctcag cctcccgagt tgttgggatt ccaggcatgc atgaccaggc tcagctaatt 1860

tttgtttttt tggtagagac ggggtttcac catattggcc aggctggtct ccaactccta 1920

atctcaggtg atctacccac cttggcctcc caaattgctg ggattacagg cgtgaaccac 1980

tgctcccttc cctgtccttc tgattttgta ggtaaccacg tgcggaccga 2030

<210> 43

<211> 2030

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列描述：合成多核苷酸

<400> 43

atgaggggca tgaagctgct gggggcgctg ctggcactgg cggccctact gcagggggcc 60

gtgtccctga agatcgcagc cttcaacatc cagacatttg gggagaccaa gatgtccaat 120

gccaccctcg tcagctacat tgtgcagatc ctgagccgct atgacatcgc cctggtccag 180

gaggtcagag acagccacct gactgccgtg gggaagctgc tggacaacct caatcaggat 240

gcaccagaca cctatcacta cgtggtcagt gagccactgg gacggaacag ctataaggag 300

cgctacctgt tcgtgtacag gcctgaccag gtgtctgcgg tggacagcta ctactacgat 360

gatggctgcg agccctgcgg gaacgacacc ttcaaccgag agccagccat tgtcaggttc 420

ttctcccggt tcacagaggt cagggagttt gccattgttc ccctgcatgc ggccccgggg 480

gacgcagtag ccgagatcga cgctctctat gacgtctacc tggatgtcca agagaaatgg 540

ggcttggagg acgtcatgtt gatgggcgac ttcaatgcgg gctgcagcta tgtgagaccc 600

tcccagtggt catccatccg cctgtggaca agccccacct tccagtggct gatccccgac 660

agcgctgaca ccacagctac acccacgcac tgtgcctatg acaggatcgt ggttgcaggg 720

atgctgctcc gaggcgccgt tgttcccgac tcggctcttc cctttaactt ccaggctgcc 780

tatggcctga gtgaccaact ggcccaagcc atcagtgacc actatccagt ggaggtgatg 840

ctgaagtgaa gtggcggccg ctcgagctag cggccgctct agaagataat caacctctgg 900

attacaaaat ttgtgaaaga ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat 960

gtggatacgc tgctttaatg cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt 1020

tctcctcctt gtataaatcc tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca 1080

ggcaacgtgg cgtggtgtgc actgtgtttg ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg 1140

ccaccacctg tcagctcctt tccgggactt tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg 1200

aactcatcgc cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca 1260

attccgtggt gttgtcgggg aaatcatcgt cctttccttg gctgctcgcc tgtgttgcca 1320

cctggattct gcgcgggacg tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc 1380

ttccttcccg cggcctgctg ccggctctgc ggcctcttcc gcgtcttcgc cttcgccctc 1440

agacgagtcg gatctccctt tgggccgcct ccccgcatcg gactagaagc ttgcctcgag 1500

cagcgctgct cgagagatct acgggtggca tccctgtgac ccctccccag tgcctctcct 1560

ggccctggaa gttgccactc cagtgcccac cagccttgtc ctaataaaat taagttgcat 1620

cattttgtct gactaggtgt ccttctataa tattatgggg tggagggggg tggtatggag 1680

caaggggcaa gttgggaaga caacctgtag ggcctgcggg gtctattggg aaccaagctg 1740

gagtgcagtg gcacaatctt ggctcactgc aatctccgcc tcctgggttc aagcgattct 1800

cctgcctcag cctcccgagt tgttgggatt ccaggcatgc atgaccaggc tcagctaatt 1860

tttgtttttt tggtagagac ggggtttcac catattggcc aggctggtct ccaactccta 1920

atctcaggtg atctacccac cttggcctcc caaattgctg ggattacagg cgtgaaccac 1980

tgctcccttc cctgtccttc tgattttgta ggtaaccacg tgcggaccga 2030

<210> 44

<211> 849

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列描述：合成多核苷酸

<400> 44

atgaggggca tgaagctgct gggggcgctg ctggcactgg cggccctact gcagggggcc 60

gtgtccctga agatcgcagc cttcaacatc aggacatttg ggaggaccaa gatgtccaat 120

gccaccctcg tcagctacat tgtgcagatc ctgagccgct atgacatcgc cctggtccag 180

gaggtcagag acagccacct gactgccgtg gggaagctgc tggacaacct caatcaggat 240

gcaccagaca cctatcacta cgtggtcagt gagccactgg gacggaagag ctataaggag 300

cgctacctgt tcgtgtacag gcctgaccag gtgtctgcgg tggacagcta ctactacgat 360

gatggctgcg agccctgcgg gaacgacacc ttcaaccgag agccattcat tgtcaggttc 420

ttctcccggt tcacagaggt cagggagttt gccattgttc ccctgcatgc ggccccgggg 480

gacgcagtag ccgagatcga cgctctctat gacgtctacc tggatgtcca agagaaatgg 540

ggcttggagg acgtcatgtt gatgggcgac ttcaatgcgg gctgcagcta tgtgagaccc 600

tcccagtggt catccatccg cctgtggaca agccccacct tccagtggct gatccccgac 660

agcgctgaca ccacagctac acccacgcac tgtgcctatg acaggatcgt ggttgcaggg 720

atgctgctcc gaggcgccgt tgttcccgac tcggctcttc cctttaactt ccaggctgcc 780

tatggcctga gtgaccaact ggcccaagcc atcagtgacc actatccagt ggaggtgatg 840

ctgaagtga 849

<210> 45

<211> 724

<212> PRT

<213> 腺相关病毒(Adeno-associated virus)

<400> 45

Met Ser Phe Val Asp His Pro Pro Asp Trp Leu Glu Glu Val Gly Glu

1 5 10 15

Gly Leu Arg Glu Phe Leu Gly Leu Glu Ala Gly Pro Pro Lys Pro Lys

20 25 30

Pro Asn Gln Gln His Gln Asp Gln Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro Gly

35 40 45

Tyr Asn Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Arg Gly Glu Pro Val

50 55 60

Asn Arg Ala Asp Glu Val Ala Arg Glu His Asp Ile Ser Tyr Asn Glu

65 70 75 80

Gln Leu Glu Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Asp

85 90 95

Ala Glu Phe Gln Glu Lys Leu Ala Asp Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asn

100 105 110

Leu Gly Lys Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Phe

115 120 125

Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Thr Gly Lys Arg Ile

130 135 140

Asp Asp His Phe Pro Lys Arg Lys Lys Ala Arg Thr Glu Glu Asp Ser

145 150 155 160

Lys Pro Ser Thr Ser Ser Asp Ala Glu Ala Gly Pro Ser Gly Ser Gln

165 170 175

Gln Leu Gln Ile Pro Ala Gln Pro Ala Ser Ser Leu Gly Ala Asp Thr

180 185 190

Met Ser Ala Gly Gly Gly Gly Pro Leu Gly Asp Asn Asn Gln Gly Ala

195 200 205

Asp Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asp Trp His Cys Asp Ser Thr Trp

210 215 220

Met Gly Asp Arg Val Val Thr Lys Ser Thr Arg Thr Trp Val Leu Pro

225 230 235 240

Ser Tyr Asn Asn His Gln Tyr Arg Glu Ile Lys Ser Gly Ser Val Asp

245 250 255

Gly Ser Asn Ala Asn Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr

260 265 270

Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Ser His Trp Ser Pro Arg Asp Trp Gln

275 280 285

Arg Leu Ile Asn Asn Tyr Trp Gly Phe Arg Pro Arg Ser Leu Arg Val

290 295 300

Lys Ile Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Val Gln Asp Ser Thr

305 310 315 320

Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp

325 330 335

Asp Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Val Gly Asn Gly Thr Glu Gly Cys

340 345 350

Leu Pro Ala Phe Pro Pro Gln Val Phe Thr Leu Pro Gln Tyr Gly Tyr

355 360 365

Ala Thr Leu Asn Arg Asp Asn Thr Glu Asn Pro Thr Glu Arg Ser Ser

370 375 380

Phe Phe Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Lys Met Leu Arg Thr Gly Asn

385 390 395 400

Asn Phe Glu Phe Thr Tyr Asn Phe Glu Glu Val Pro Phe His Ser Ser

405 410 415

Phe Ala Pro Ser Gln Asn Leu Phe Lys Leu Ala Asn Pro Leu Val Asp

420 425 430

Gln Tyr Leu Tyr Arg Phe Val Ser Thr Asn Asn Thr Gly Gly Val Gln

435 440 445

Phe Asn Lys Asn Leu Ala Gly Arg Tyr Ala Asn Thr Tyr Lys Asn Trp

450 455 460

Phe Pro Gly Pro Met Gly Arg Thr Gln Gly Trp Asn Leu Gly Ser Gly

465 470 475 480

Val Asn Arg Ala Ser Val Ser Ala Phe Ala Thr Thr Asn Arg Met Glu

485 490 495

Leu Glu Gly Ala Ser Tyr Gln Val Pro Pro Gln Pro Asn Gly Met Thr

500 505 510

Asn Asn Leu Gln Gly Ser Asn Thr Tyr Ala Leu Glu Asn Thr Met Ile

515 520 525

Phe Asn Ser Gln Pro Ala Asn Pro Gly Thr Thr Ala Thr Tyr Leu Glu

530 535 540

Gly Asn Met Leu Ile Thr Ser Glu Ser Glu Thr Gln Pro Val Asn Arg

545 550 555 560

Val Ala Tyr Asn Val Gly Gly Gln Met Ala Thr Asn Asn Gln Ser Ser

565 570 575

Thr Thr Ala Pro Ala Thr Gly Thr Tyr Asn Leu Gln Glu Ile Val Pro

580 585 590

Gly Ser Val Trp Met Glu Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp

595 600 605

Ala Lys Ile Pro Glu Thr Gly Ala His Phe His Pro Ser Pro Ala Met

610 615 620

Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Met Met Leu Ile Lys Asn

625 630 635 640

Thr Pro Val Pro Gly Asn Ile Thr Ser Phe Ser Asp Val Pro Val Ser

645 650 655

Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Glu Met Glu

660 665 670

Trp Glu Leu Lys Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln

675 680 685

Tyr Thr Asn Asn Tyr Asn Asp Pro Gln Phe Val Asp Phe Ala Pro Asp

690 695 700

Ser Thr Gly Glu Tyr Arg Thr Thr Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu

705 710 715 720

Thr Arg Pro Leu

<210> 46

<211> 736

<212> PRT

<213> 腺相关病毒(Adeno-associated virus)

<400> 46

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly

145 150 155 160

Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro

180 185 190

Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly

195 200 205

Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser

210 215 220

Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile

225 230 235 240

Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

245 250 255

Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn

260 265 270

Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg

275 280 285

Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn

290 295 300

Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile

305 310 315 320

Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn

325 330 335

Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu

340 345 350

Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro

355 360 365

Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp

370 375 380

Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe

385 390 395 400

Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu

405 410 415

Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu

420 425 430

Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser

435 440 445

Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser

450 455 460

Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro

465 470 475 480

Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn

485 490 495

Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn

500 505 510

Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys

515 520 525

Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly

530 535 540

Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile

545 550 555 560

Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser

565 570 575

Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln

580 585 590

Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln

595 600 605

Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His

610 615 620

Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met

625 630 635 640

Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala

645 650 655

Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr

660 665 670

Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln

675 680 685

Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn

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Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val

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Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu

725 730 735

<210> 47

<211> 736

<212> PRT

<213> 腺相关病毒(Adeno-associated virus)

<400> 47

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Gln Pro Gly Ala Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

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Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

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Lys Ser Gly Lys Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro

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245 250 255

Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr

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275 280 285

Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp

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Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val

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Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu

325 330 335

Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr

340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Glu

405 410 415

Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg

420 425 430

Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg Thr

435 440 445

Gln Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Asn Gln Ser Arg Leu Leu Phe Ser

450 455 460

Gln Ala Gly Pro Gln Ser Met Ser Leu Gln Ala Arg Asn Trp Leu Pro

465 470 475 480

Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Leu Ser Lys Thr Ala Asn Asp Asn

485 490 495

Asn Asn Ser Asn Phe Pro Trp Thr Ala Ala Ser Lys Tyr His Leu Asn

500 505 510

Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys

515 520 525

Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Met His Gly Asn Leu Ile Phe Gly

530 535 540

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Thr Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln

565 570 575

Tyr Gly Thr Val Ala Asn Asn Leu Gln Ser Ser Asn Thr Ala Pro Thr

580 585 590

Thr Arg Thr Val Asn Asp Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln

595 600 605

Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His

610 615 620

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Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln

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Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val

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Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu

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<210> 48

<211> 2211

<212> DNA

<213> 腺相关病毒(Adeno-associated virus)

<400> 48

atggctgctg acggttatct tccagattgg ctcgaggaca acctttctga aggcattcga 60

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<210> 49

<211> 737

<212> PRT

<213> 腺相关病毒(Adeno-associated virus)

<400> 49

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro

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Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Thr Asp Ser Ala Ala Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro

180 185 190

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Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln

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Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala Asn Asn

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Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro

340 345 350

Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala

355 360 365

Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly

370 375 380

Ser Gln Ala Met Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro

385 390 395 400

Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Thr Tyr Thr Phe

405 410 415

Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp

420 425 430

Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg

435 440 445

Thr Gln Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Asn Gln Ser Arg Leu Leu Phe

450 455 460

Ser Gln Ala Gly Pro Gln Ser Met Ser Leu Gln Ala Arg Asn Trp Leu

465 470 475 480

Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Leu Ser Lys Thr Ala Asn Asp

485 490 495

Asn Asn Asn Ser Asn Phe Pro Trp Thr Ala Ala Ser Lys Tyr His Leu

500 505 510

Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His

515 520 525

Lys Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Met His Gly Asn Leu Ile Phe

530 535 540

Gly Lys Glu Gly Thr Thr Ala Ser Asn Ala Glu Leu Asp Asn Val Met

545 550 555 560

Ile Thr Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu

565 570 575

Gln Tyr Gly Thr Val Ala Asn Asn Leu Gln Ser Ser Asn Thr Ala Pro

580 585 590

Thr Thr Arg Thr Val Asn Asp Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp

595 600 605

Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro

610 615 620

His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly

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Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro

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Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu

675 680 685

Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser

690 695 700

Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Ser Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly

705 710 715 720

Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn

725 730 735

Leu

<210> 50

<211> 2214

<212> DNA

<213> 腺相关病毒(Adeno-associated virus)

<400> 50

atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60

cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120

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ggggccttac ctggcatggt gtggcaagat cgtgacgtgt accttcaagg acctatctgg 1860

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cagtacacct ccaactacta caaatctaca agtgtggact ttgctgttaa tacagaaggc 2160

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<210> 51

<211> 305

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 51

Met Ser Arg Glu Leu Ala Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Ile His

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Glu Ser Lys Gln Glu Asp Lys Asn Ala Met Asp Val Ile Val Lys Val

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Val Lys Arg Ser Tyr His Tyr His Asp Tyr Gln Asp Gly Asp Ala Asp

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Ser Val Lys Glu Ile Asp Glu Leu Val Glu Val Tyr Thr Asp Val Lys

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Gly Cys Ser Tyr Val Pro Lys Lys Ala Trp Lys Asn Ile Arg Leu Arg

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Thr Asp Pro Arg Phe Val Trp Leu Ile Gly Asp Gln Glu Asp Thr Thr

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Val Lys Lys Ser Thr Asn Cys Ala Tyr Asp Arg Ile Val Leu Arg Gly

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Gln Glu Ile Val Ser Ser Val Val Pro Lys Ser Asn Ser Val Phe Asp

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Phe Gln Lys Ala Tyr Lys Leu Thr Glu Glu Glu Ala Leu Asp Val Ser

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Asp His Phe Pro Val Glu Phe Lys Leu Gln Ser Ser Arg Ala Phe Thr

275 280 285

Asn Ser Lys Lys Ser Val Thr Leu Arg Lys Lys Thr Lys Ser Lys Arg

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Ser

305

<210> 52

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<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 52

atgtcacggg agctggcccc actgctgctt ctcctcctct ccatccacag cgccctggcc 60

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aaggacagca acaacaggat ctgccccata ctgatggaga agctgaacag aaattcaagg 240

agaggcataa cgtacaacta tgtgattagc tctcggcttg gaagaaacac atataaagaa 300

caatatgcct ttctctacaa ggaaaagctg gtgtctgtga agaggagtta tcactaccat 360

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tccgttaagg agatcgatga gttggttgag gtctacacgg acgtgaaaca ccgctggaag 540

gcggagaatt tcattttcat gggtgacttc aatgccggct gcagctacgt ccccaagaag 600

gcctggaaga acatccgctt gaggactgac cccaggtttg tttggctgat cggggaccaa 660

gaggacacca cggtgaagaa gagcaccaac tgtgcatatg acaggattgt gcttagagga 720

caagaaatcg tcagttctgt tgttcccaag tcaaacagtg tttttgactt ccagaaagct 780

tacaagctga ctgaagagga ggccctggat gtcagcgacc actttccagt tgaatttaaa 840

ctacagtctt caagggcctt caccaacagc aaaaaatctg tcactctaag gaagaaaaca 900

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<210> 53

<211> 285

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 53

Met Arg Ile Cys Ser Phe Asn Val Arg Ser Phe Gly Glu Ser Lys Gln

1 5 10 15

Glu Asp Lys Asn Ala Met Asp Val Ile Val Lys Val Ile Lys Arg Cys

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Asp Ile Ile Leu Val Met Glu Ile Lys Asp Ser Asn Asn Arg Ile Cys

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Tyr Asn Tyr Val Ile Ser Ser Arg Leu Gly Arg Asn Thr Tyr Lys Glu

65 70 75 80

Gln Tyr Ala Phe Leu Tyr Lys Glu Lys Leu Val Ser Val Lys Arg Ser

85 90 95

Tyr His Tyr His Asp Tyr Gln Asp Gly Asp Ala Asp Val Phe Ser Arg

100 105 110

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Ile Asp Glu Leu Val Glu Val Tyr Thr Asp Val Lys His Arg Trp Lys

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Ala Glu Asn Phe Ile Phe Met Gly Asp Phe Asn Ala Gly Cys Ser Tyr

165 170 175

Val Pro Lys Lys Ala Trp Lys Asn Ile Arg Leu Arg Thr Asp Pro Arg

180 185 190

Phe Val Trp Leu Ile Gly Asp Gln Glu Asp Thr Thr Val Lys Lys Ser

195 200 205

Thr Asn Cys Ala Tyr Asp Arg Ile Val Leu Arg Gly Gln Glu Ile Val

210 215 220

Ser Ser Val Val Pro Lys Ser Asn Ser Val Phe Asp Phe Gln Lys Ala

225 230 235 240

Tyr Lys Leu Thr Glu Glu Glu Ala Leu Asp Val Ser Asp His Phe Pro

245 250 255

Val Glu Phe Lys Leu Gln Ser Ser Arg Ala Phe Thr Asn Ser Lys Lys

260 265 270

Ser Val Thr Leu Arg Lys Lys Thr Lys Ser Lys Arg Ser

275 280 285

<210> 54

<211> 5

<212> PRT

<213> 腺相关病毒(Adeno-associated virus)

<400> 54

Asn Gly Thr Ser Gly

1 5

<210> 55

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 55

Ser Gly Thr His

1

<210> 56

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 56

Ser Asp Thr His

1

<210> 57

<211> 5

<212> PRT

<213> 腺相关病毒(Adeno-associated virus)

<400> 57

Gly Gly Thr Ala Asn

1 5

<210> 58

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 58

Asp Gly Ser Gly Leu

1 5

<210> 59

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 59

Cys Ile Leu Asp Leu Pro Lys Phe Cys

1 5

<210> 60

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 60

Gly Gly Gly Ser

1

Claims (51)

1.一种治疗有相应需要的受试者的癌症的方法，包括向所述受试者施用脱氧核糖核酸酶(DNase)和至少一种包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNase酶以有效减少肿瘤组织中免疫抑制蛋白的表达和/或增加肿瘤组织内CAR表达细胞或TCR表达细胞的含量的量使用。

3.一种在有相应需要的受试者中预防CAR-T细胞疗法的一种或更多种副作用的方法，包括向所述受试者施用脱氧核糖核酸酶(DNase)，其中所述DNase酶与所述CAR-T细胞疗法同时或顺序施用。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述CAR-T细胞疗法的所述副作用选自神经副作用、细胞因子释放综合征(CRS)、中性粒细胞减少症、贫血、发热、发热性中性粒细胞减少症和血小板减少症。

5.一种在受试者中通过CAR-T细胞疗法治疗疾病后预防所述疾病复发的方法，包括向所述受试者施用脱氧核糖核酸酶(DNase)，其中所述DNase酶与所述CAR-T细胞疗法同时或顺序施用。

6.一种增加经历CAR-T细胞疗法的受试者血液中CAR-T细胞持久性的方法，包括向所述受试者施用脱氧核糖核酸酶(DNase)，其中所述DNase酶与所述CAR-T细胞疗法同时或顺序施用。

7.一种在有相应需要的受试者中增加CAR-T细胞疗法效力的方法，包括向所述受试者施用脱氧核糖核酸酶(DNase)，其中所述DNase酶与所述CAR-T细胞疗法同时或顺序施用。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述DNase酶以DNase酶蛋白的形式施用。

9.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述DNase酶由载体编码。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述载体是重组腺相关病毒(rAAV)表达载体，包含(i)衣壳蛋白和(ii)核酸，所述核酸包含可操作地连接到编码所述DNase酶的核苷酸序列的启动子。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述启动子是肝特异性启动子。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述启动子对肿瘤起源组织或转移靶组织是特异性的。

13.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述DNase酶由mRNA分子编码。

14.根据权利要求8-13中任一项所述的方法，其中所述DNase酶被肠胃外施用或向肿瘤部位施用。

15.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述DNase酶由包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞共表达。

16.根据权利要求1、2和8-15中任一项所述的方法，其中所述CAR表达细胞或所述TCR表达细胞被肠胃外施用或向肿瘤部位施用。

17.根据权利要求1、2和8-16中任一项所述的方法，其中所述CAR表达细胞或TCR表达细胞是单靶向的或多靶向的。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述CAR包含能够特异性结合选自以下的一种或更多种抗原的抗原结合结构域：(i)肿瘤抗原，所述肿瘤抗原选自CD5、CD7、CD19、CD28、间皮素、CD123、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、TnAg、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、FR-1、c-MET、EGFR/CD133、IL13Ra2、HER2、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、Prostase、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、TSHR、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WTl、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6,E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、存活蛋白、端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NAI7、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYPIB1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、和mut hsp70-2；(ii)与实体瘤相关的抗原；(iii)实体瘤相关抗原，所述实体瘤相关抗原选自间皮素、EGFRvIII、GD2、CLDN6、Tn Ag、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、豆荚蛋白、CD171、PSCA、TARP、MAD-CT-1、LewisY、CD24、叶酸受体α、叶酸受体β、ERBBs、MUC1、EGFR、NCAM、PDGFR-β、MAD-CT-2、Fos相关抗原、SSEA-4、中性粒细胞弹性蛋白酶、CAIX、HPV E6、HPV E7、ML-IAP、NA17、ALK、雄激素受体、聚唾液酸、TRP-2、CYP1B 1、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、精子蛋白17、HMWMAA、β人绒毛膜促性腺激素、AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CAIX、人端粒酶逆转录酶、肠羧基酯酶和mut hsp 70-2；(iv)存在于间皮瘤、肺癌、胰腺癌、食管腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠直肠癌、膀胱癌或其任何组合中/上的实体瘤相关抗原；(v)与血液学癌症相关的肿瘤抗原；(vi)存在于选自急性白血病和慢性白血病的疾病中的肿瘤抗原，以及(vii)存在于抗治疗性癌症中的肿瘤抗原。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述DNase酶包含与SEQ ID NO:4具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

20.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述DNase酶包含与SEQ ID NO:53具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

21.根据权利要求8和16-20中任一项所述的方法，其中在施用所述CAR表达细胞或TCR表达细胞的同一天或前一天静脉内注射一次所述DNase酶蛋白。

22.根据权利要求8和16-20中任一项所述的方法，其中在施用所述CAR表达细胞或TCR表达细胞后开始，每周一次静脉内注射所述DNase酶蛋白。

23.根据权利要求8和16-20中任一项所述的方法，其中在施用所述CAR表达细胞或TCR表达细胞后开始，每月一次静脉内注射所述DNase酶蛋白。

24.根据权利要求8和16-20中任一项所述的方法，其中在施用所述CAR表达细胞或TCR表达细胞前一周静脉内注射所述DNase酶蛋白。

25.根据权利要求8和16-20中任一项所述的方法，其中在施用所述CAR表达细胞或TCR表达细胞前一个月静脉内注射所述DNase酶蛋白。

26.根据权利要求8和16-20中任一项所述的方法，其中在施用所述CAR表达细胞或TCR表达细胞之前21天至之后14天静脉内注射一次所述DNase酶蛋白。

27.根据权利要求8和16-20中任一项所述的方法，其中在施用所述CAR表达细胞或TCR表达细胞后，静脉内注射所述DNase酶蛋白至少14天。

28.根据权利要求8和16-20中任一项所述的方法，其中在施用所述CAR表达细胞或TCR表达细胞后，静脉内注射所述DNase酶蛋白至少16天。

29.根据权利要求8和16-20中任一项所述的方法，其中在施用所述CAR表达细胞或TCR表达细胞之前、同时或之后静脉内注射所述DNase酶蛋白至少3天。

30.根据权利要求8和16-20中任一项所述的方法，其中在施用所述CAR表达细胞或TCR表达细胞后，静脉内注射所述DNase酶蛋白至少7天。

31.根据权利要求8和16-20中任一项所述的方法，其中在施用CAR表达细胞或TCR表达细胞之前，静脉内注射所述DNase酶蛋白至少7天。

32.根据权利要求8和16-20中任一项所述的方法，其中在施用CAR表达细胞或TCR表达细胞之前或之后静脉内注射DNase酶蛋白至少3天。

33.根据权利要求8和16-32中任一项所述的方法，其中以至少250μg/kg/天的剂量静脉内注射所述DNase酶蛋白。

34.根据权利要求33所述的方法，其中以至少600μg/kg/天的剂量静脉内注射所述DNase酶蛋白。

35.根据权利要求34所述的方法，其中以至少900μg/kg/天的剂量静脉内注射所述DNase酶蛋白。

36.根据权利要求35所述的方法，其中以至少2.5mg/kg/天的剂量静脉内注射所述DNase酶蛋白。

37.根据权利要求36所述的方法，其中以至少5mg/kg/天的剂量静脉内注射所述DNase酶蛋白。

38.根据权利要求37所述的方法，其中静脉内注射所述DNase酶蛋白至少7.5mg/kg/天。

39.根据权利要求1-38中任一项所述的方法，其中所述CAR表达细胞或TCR表达细胞被进一步修饰以表达免疫检查点抑制剂分子。

40.根据权利要求1-39中任一项所述的方法，其中所述DNase酶以增加低氧环境中CAR表达细胞的效力的量使用。

41.根据权利要求9-12和16-20中任一项所述的方法，其中在施用所述CAR表达细胞或TCR表达细胞之前至少14天静脉内注射和/或在肿瘤部位注射所述编码DNase酶的载体。

42.根据权利要求9-12和16-20中任一项所述的方法，其中在施用所述CAR表达细胞或TCR表达细胞之前至少3天静脉内注射和/或在肿瘤部位注射所述编码DNase酶的载体。

43.根据权利要求9-12和16-20中任一项所述的方法，其中在施用CAR表达细胞或TCR表达细胞的同时静脉内注射和/或在肿瘤部位注射所述编码DNase酶的载体。

44.根据权利要求9-12和16-20中任一项所述的方法，其中在施用CAR表达细胞或TCR表达细胞后3天静脉内注射和/或在肿瘤部位注射所述编码DNase酶的载体。

45.根据权利要求1-44中任一项所述的方法，其中所述CAR表达细胞是CAR T细胞。

46.一种细胞，所述细胞表达(i)脱氧核糖核酸酶(DNase)和(ii)嵌合抗原受体(CAR)和/或T细胞受体(TCR)。

47.根据权利要求46所述的细胞，所述细胞还表达免疫检查点抑制剂分子。

48.根据权利要求46或权利要求47所述的细胞，其中所述CAR或TCR是单靶向的或多靶向的。

49.根据权利要求46-48中任一项所述的细胞，其中所述CAR包含能够特异性结合选自以下的一种或更多种抗原的抗原结合结构域：(i)肿瘤抗原，所述肿瘤抗原选自CD5、CD7、CD19、CD28、间皮素、CD123、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、TnAg、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、FR-1、c-MET、EGFR/CD133、IL13Ra2、HER2、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、Prostase、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、TSHR、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WTl、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6,E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、存活蛋白、端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NAI7、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYPIB1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、和mut hsp70-2；(ii)与实体瘤相关的抗原；(iii)实体瘤相关抗原，所述实体瘤相关抗原选自间皮素、EGFRvIII、GD2、CLDN6、Tn Ag、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、豆荚蛋白、CD171、PSCA、TARP、MAD-CT-1、LewisY、CD24、叶酸受体α、叶酸受体β、ERBBs、MUC1、EGFR、NCAM、PDGFR-β、MAD-CT-2、Fos相关抗原、SSEA-4、中性粒细胞弹性蛋白酶、CAIX、HPV E6、HPV E7、ML-IAP、NA17、ALK、雄激素受体、聚唾液酸、TRP-2、CYP1B 1、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、精子蛋白17、HMWMAA、β人绒毛膜促性腺激素、AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CAIX、人端粒酶逆转录酶、肠羧基酯酶和mut hsp 70-2；(iv)存在于间皮瘤、肺癌、胰腺癌、食管腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠直肠癌、膀胱癌或其任何组合中/上的实体瘤相关抗原；(v)与血液学癌症相关的肿瘤抗原；(vi)存在于选自急性白血病和慢性白血病的疾病中的肿瘤抗原，以及(vii)存在于抗治疗性癌症中的肿瘤抗原。

50.根据权利要求46-49中任一项所述的细胞，其中所述DNase酶包含与SEQ ID NO:4具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

51.根据权利要求46-49中任一项所述的细胞，其中所述脱氧核糖核酸酶包含与SEQ IDNO:53具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。