JP2017212988A5

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Publication number: JP2017212988A5
Application number: JP2017118613A
Authority: JP
Filing date: 2017-06-16
Publication date: 2018-01-25
Anticipated expiration: 2034-11-20

Claims

データベースを用いて被験体のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の可変領域のレパトア（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）を定量的に解析する方法であって、該方法は、
（１）該被験者から非バイアス的に増幅した、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程；
（２）該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定する工程；および
（３）決定された該核酸配列にもとづいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出する工程
を包含し、
該核酸試料は、複数種類のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の核酸配列を含み、該工程（２）は、共通アダプタープライマーを用いる単一の配列決定により前記核酸配列が決定される、方法。
前記工程（１）は、以下の工程：
（１−１）標的となる細胞に由来するＲＮＡ試料を鋳型として相補的ＤＮＡを合成する工程；
（１−２）該相補的ＤＮＡを鋳型として二本鎖相補的ＤＮＡを合成する工程；
（１−３）該二本鎖相補的ＤＮＡに共通アダプタープライマー配列を付加してアダプター付加二本鎖相補的ＤＮＡを合成する工程；
（１−４）該アダプター付加二本鎖相補的ＤＮＡと、該共通アダプタープライマー配列からなる共通アダプタープライマーと、第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーとを用いて第１のＰＣＲ増幅反応を行う工程であって、
該第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、該ＴＣＲまたはＢＣＲの目的とするＣ領域に十分に特異的であり、かつ、他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、工程（１−５）（１−４）のＰＣＲ増幅産物と、該共通アダプタープライマーと、第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーとを用いて第２のＰＣＲ増幅反応を行う工程であって、該第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、該第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該ＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、工程；および
（１−６）（１−５）のＰＣＲ増幅産物と、該共通アダプタープライマーの核酸配列に第１の追加アダプター核酸配列を含む付加共通アダプタープライマーと、第２の追加アダプター核酸配列を第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的配列に付加したアダプター付の第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーとを用いて第３のＰＣＲ増幅反応を行う工程であって、
該第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、該第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該ＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、工程；
を包含する、請求項１に記載の方法。
前記単一の配列決定は、前記核酸試料から配列決定用の試料への増幅において、プライマーとして使用する配列は少なくとも一方がＣ領域をコードする核酸配列またはその相補鎖と同一配列を有することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
前記非バイアス的な増幅が、Ｖ領域特異的な増幅ではない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
前記レパトアはＢＣＲの可変領域のレパトアであり、前記核酸配列はＢＣＲの核酸配列である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
前記工程（１）は、分子同定（ＭＩＤＴａｇ）配列を使用することを包含する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（３）前記ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアの導出は以下の工程
（３−１）Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供する工程：
（３−２）必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供する工程；
（３−３）該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録する工程；
（３−４）該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、Ｄ領域の核酸配列を抽出する工程；
（３−５）該Ｄ領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類する工程；
（３−６）（３−５）での分類に基づいて、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出する工程；
を包含する方法によって達成される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
前記共通アダプタープライマー配列は、増幅に適切な塩基長であり、ホモダイマーおよび分子内ヘアピン構造が取りにくく、安定して２本鎖を形成できるように設計され、該データベース内のすべてのＢＣＲ遺伝子配列と相同性が高くなく、かつ、該Ｃ領域特異的プライマーと同じ程度のＴｍになるように設計される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
前記第１、第２および第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、それぞれ独立して、ＴＣＲまたはＢＣＲのレパトア解析のためのものであり、ＢＣＲである場合、ＩｇＭ，ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＤ，またはＩｇＥの各アイソタイプＣ領域に完全マッチする配列であって、該ＩｇＧおよびＩｇＡの場合は、サブタイプについても完全マッチし、該データベースに含まれる他の配列に相同性を持たない配列であり、かつ、該プライマーの下流においてサブタイプ間に不一致塩基が含まれるように選択される、請求項２に記載の方法。
前記第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、以下の構造：ＣＭ１（配列番号５）、ＣＡ１（配列番号８）、ＣＧ１（配列番号１１）、ＣＤ１（配列番号１４）、ＣＥ１（配列番号１７）、ＣＡ１（配列番号３５）、またはＣＢ１（配列番号３７）を有する、請求項２または９に記載の方法。
前記第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、以下の構造：ＣＭ２（配列番号６）、ＣＡ２（配列番号９）、ＣＧ２（配列番号１２）、ＣＤ２（配列番号１５）、ＣＥ２（配列番号１８）、ＣＡ２（配列番号３５）、またはＣＢ２（配列番号３７）を有する、請求項２、９または１０のいずれか１項に記載の方法。
前記第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、以下の構造：ＣＭ３−ＧＳ（配列番号７）、ＣＡ３−ＧＳ（配列番号１０）、ＣＧ３−ＧＳ（配列番号１３）、ＣＤ３−ＧＳ（配列番号１６）またはＣＥ３−ＧＳ（配列番号１９）を有する、請求項２または９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
前記ＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、いずれも、ＴＣＲまたはＢＣＲのすべてのサブクラスに対応するセットで提供される、請求項２または９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
データベースを用いて被験体のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の可変領域のレパトア（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）を定量的に解析するためのシステムであって、該システムは、
（１）該被験者から非バイアス的に増幅した、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の核酸配列を含む核酸試料を提供するためのキット；
（２）該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定するための装置；および
（３）決定された該核酸配列にもとづいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出するための装置を備え、
該核酸試料は、複数種類のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の核酸配列を含み、（２）該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定するための装置は、共通アダプタープライマーを用いる単一の配列決定により前記核酸配列が決定されるように構成される、システム。
前記キットは、以下：
（１−１）標的となる細胞に由来するＲＮＡ試料を鋳型として相補的ＤＮＡを合成する手段；
（１−２）該相補的ＤＮＡを鋳型として二本鎖相補的ＤＮＡを合成する手段；
（１−３）該二本鎖相補的ＤＮＡに共通アダプタープライマー配列を付加してアダプター付加二本鎖相補的ＤＮＡを合成する手段；
（１−４）該アダプター付加二本鎖相補的ＤＮＡと、該共通アダプタープライマー配列からなる共通アダプタープライマーと、第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーとを用いて第１のＰＣＲ増幅反応を行う手段であって、
該第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、該ＴＣＲまたはＢＣＲの目的とするＣ領域に十分に特異的であり、かつ、他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、手段
（１−５）（１−４）のＰＣＲ増幅産物と、該共通アダプタープライマーと、第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーとを用いて第２のＰＣＲ増幅反応を行う手段であって、該第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、該第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該ＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、手段；および
（１−６）（１−５）のＰＣＲ増幅産物と、該共通アダプタープライマーの核酸配列に第１の追加アダプター核酸配列を含む付加共通アダプタープライマーと、第２の追加アダプター核酸配列を第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的配列に付加したアダプター付の第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーとを用いて第３のＰＣＲ増幅反応を行う手段であって、
該第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーは、該第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該ＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、手段；
を包含する、請求項１４に記載のシステム。
前記キットが、分子同定（ＭＩＤＴａｇ）配列を備える、請求項１４または１５に記載のシステム。
（３）前記ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアの導出のための装置は以下：
（３−１）Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供する手段：
（３−２）必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供する手段；
（３−３）該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録する手段；
（３−４）該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、Ｄ領域の核酸配列を抽出する手段；
（３−５）該Ｄ領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類する手段；
（３−６）（３−５）での分類に基づいて、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出する手段；
を備える、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載のシステム。
該共通アダプタープライマー配列は、増幅に適切な塩基長であり、ホモダイマーおよび分子内ヘアピン構造が取りにくく、安定して２本鎖を形成できるように設計され、該データベース内のすべてのＢＣＲ遺伝子配列と相同性が高くなく、かつ、該Ｃ領域特異的プライマーと同じ程度のＴｍになるように設計される、請求項１４〜１７のいずれかに記載のシステム。
請求項１４〜１８のいずれか１項に記載のシステムと、該システムに基づいて導出されたＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアに基づいて前記被験者の疾患、障害または状態を分析する手段とを備える、被験者の疾患、障害または状態を分析するシステム。
請求項１９に記載のシステムで決定された被験者の疾患、障害または状態と、前記ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアとを定量的に関連付ける手段、および該定量的な関連から、適切な処置または予防のための手段を選択する手段とを備える、該被験者の疾患、障害または状態を処置または予防するためのシステム。
被験者に対するがんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法に使用するための組成物を調製する方法であって、該方法は、
（１）請求項１〜１３に記載の方法によって、または請求項１４〜１８に記載のシステムを用いて該被験者のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）レパトアを解析する工程；
（２）該解析の結果に基づいて、該被験者のがん細胞由来のＴＣＲまたはＢＣＲを決定する工程であって、該決定は該被験者のがん細胞由来のＴＣＲまたはＢＣＲ遺伝子の存在頻度ランキングにおいて、上位ランクの配列が、該がん細胞由来のＴＣＲまたはＢＣＲとして選択することによってなされる、工程；
（３）決定された該がん由来のＴＣＲまたはＢＣＲに基づいて、ＨＬＡ検査ペプチドの候補のアミノ酸配列を決定する工程であって、該決定は、ＨＬＡ結合ペプチド予測アルゴリズムを用いて算出されたスコアに基づきなされる、工程；および
（４）決定されたペプチドを合成する工程；
を包含する、方法。
（Ａ）被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドまたは該被験者に由来するリンパ球または請求項２１に記載の前記決定されたペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程；
（Ｂ）該腫瘍特異的Ｔ細胞のＴＣＲを請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法によって、または請求項１４〜１８に記載のシステムを用いて解析する工程；および
（Ｃ）該解析の結果に基づいて、所望の腫瘍特異的Ｔ細胞を単離する工程
を包含する、ｉｎｖｉｔｒｏ抗原刺激による単離されたがん特異的ＴＣＲ遺伝子を調製する方法。
（Ａ）工程は、前記被験者に由来するリンパ球と、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程である、請求項２２に記載の方法。
（Ａ）工程は、請求項２１に記載の前記決定されたペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程である、請求項２２に記載の方法。
（Ａ）共通のＨＬＡを有する被験体から単離されたリンパ球または癌組織を提供する工程；
（Ｂ）該リンパ球または癌組織について、該腫瘍特異的Ｔ細胞のＴＣＲを請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法によって、または請求項１４〜１８のいずれか１項に記載のシステムを用いて解析する工程；および
（Ｃ）腫瘍特異的Ｔ細胞に共通する配列を有するＴ細胞を単離する工程
を包含する、共通配列検索による単離されたがん特異的ＴＣＲ遺伝子を調製する方法。
請求項２５に記載の方法で単離されたがん特異的ＴＣＲ遺伝子を用いてインビトロで刺激試験を行い有効性および／または安全性評価を行う方法。
（Ａ）患者から採取されたＴリンパ球を提供する工程；
（Ｂ）該Ｔリンパ球を抗原刺激した後に、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法によって、または請求項９〜１５のいずれか１項に記載のシステムを用いてＴＣＲを解析する工程であって、該抗原刺激は、前記被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチド、該被験者に由来する不活性化がん細胞、または腫瘍由来イディオタイプペプチドによってなされる、工程；
（Ｃ)解析された該ＴＣＲにおいて最適抗原および最適ＴＣＲを選択する工程；および
（Ｄ）該最適ＴＣＲのＴＣＲ遺伝子の腫瘍特異的αおよびβＴＣＲ発現ウイルスベクターを生産する工程
を包含する細胞加工療法に使用するための該腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入Ｔリンパ球を調製する方法。
前記抗原刺激は、前記被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドによってなされる、請求項２７に記載の方法。
前記抗原刺激は、前記被験者に由来する不活性化がん細胞によってなされる、請求項２７または２８に記載の方法。
（Ｃ）工程は、前記被験体のがん組織に高発現する抗原を選択することを含む、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の方法。
（Ｃ）工程は、抗原特異的リンパ球刺激試験において最も強くＴ細胞を活性させる抗原を選択することを含む、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
（Ｃ）工程は、抗原刺激前後において請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法によって、または請求１４〜１８のいずれか１項に記載のシステムを用いてレパトア解析から特定のＴＣＲの頻度を最も増加させる抗原を選択することを含む、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の方法。