JP2016535724A - 擬似移動床クロマトグラフィーを用いる中性ヒトミルクオリゴ糖の精製方法 - Google Patents
擬似移動床クロマトグラフィーを用いる中性ヒトミルクオリゴ糖の精製方法 Download PDFInfo
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Abstract
本出願は、中性ヒトミルクオリゴ糖（中性ＨＭＯ）の精製方法を開示する。本方法は、大量の高純度ＨＭＯの連続精製を可能にする擬似移動床（ＳＭＢ）クロマトグラフィーを使用する。中性ＨＭＯの化学合成経路およびそれらの後続精製と対照的に、提示した方法は有害化学物質、たとえば痕跡量の重金属または有機溶媒を含まないＨＭＯを提供できる。個々の中性ＨＭＯ製品は、噴霧乾燥により固体状で、または濃縮シロップとして得ることができる。提供される中性ＨＭＯは食品用として使用するのにきわめて好適である。
Description
本出願は、中性ヒトミルクオリゴ糖(neutral human milk oligosaccharide)（中性ＨＭＯ）の精製方法を開示する。本方法は、大量の高純度ＨＭＯの連続精製を可能にする擬似移動床(simulated moving bed)（ＳＭＢ）クロマトグラフィーを使用する。中性ＨＭＯの化学合成経路およびそれらの後続精製と対照的に、提示した方法は有害化学物質、たとえば痕跡量の重金属または有機溶媒を含まないＨＭＯを提供できる。個々の中性ＨＭＯ製品は、噴霧乾燥により固体状で、または濃縮シロップとして得ることができる。提供される中性ＨＭＯは食品用として使用するのにきわめて好適である。
ヒトミルク（人乳）は、炭水化物、脂肪、タンパク質、ビタミン、無機質および微量元素の複雑な混合物である。明らかに最も多量に存在する画分は炭水化物であり、それはさらにラクトースとより複雑なオリゴ糖に分類される。乳児によりラクトースはエネルギー源として使われるのに対し、複雑なオリゴ糖は代謝されない。複雑なオリゴ糖の画分は最大で総炭水化物画分の１／１０を占め、おそらく１５０種類を超えるオリゴ糖からなる。これらの複雑なオリゴ糖の存在および濃度はヒトに特有であり、よって他の哺乳動物、たとえば家畜化された酪農動物のミルクには多量にはみられない。
ヒトミルクにこれらの複雑なオリゴ糖が存在することは以前から既に知られており、これらのオリゴ糖の生理的機能について数十年間にわたって医学的研究が行なわれてきた。より多量に存在するヒトミルクオリゴ糖のうちあるものについては、特異的機能が既に同定されている。
個々のＨＭＯの純粋な画分の供給量に限界があり、入手が困難であることにより、これらの複雑な分子のうちあるものに対して化学的経路が開発された。しかし、化学合成、酵素合成または発酵によるＨＭＯの合成は困難であることが証明された。今日まで、少なくとも大規模な量および食品用として適した量は提供できなかった。これに関して、特に特定のＨＭＯの化学合成経路（たとえば、ＨＭＯである２’−フコシルラクトース；WO 2010/115935 A1を参照）は、幾つかの有害化学物質を伴ない、それらは最終製品の汚染のリスクを伴なう。
ヒトミルクオリゴ糖の化学合成に伴なう困難さのため、幾つかの酵素法および発酵法が開発された。しかし、これらの方法は複雑なオリゴ糖混合物を生成する；すなわち、目的生成物には出発物質、たとえばラクトース、生合成中間体、ならびに基質、たとえば個々の単糖類およびポリペプチドなどが混在する。
これらの複雑な混合物から個々のオリゴ糖製品を精製するための従来技術水準の方法は技術的に複雑であり、かつ食品用として経済的ではない。二糖であるラクトースまたはスクロースを乳清や糖蜜などの複雑な混合物から精製するために、多数回の結晶化を伴なう工業規模の方法が開発された。それらの方法の欠点は、それらが複雑であり、低い収率が得られるにすぎないことである。
複雑なオリゴ糖、たとえばＨＭＯの精製のためには、現在までゲル濾過クロマトグラフィーが一般に好まれる方法であった。ゲル濾過クロマトグラフィーの欠点は、それが効率的にスケールアップできないこと、および連続操作に適さないことである。よって、ゲル濾過クロマトグラフィーは経済的でなく、特定のＨＭＯ − たとえばＨＭＯである２’−フコシルラクトース− をヒトの食品に使用するのに妥当な量および品質で提供するのは不可能である。
擬似移動床（ＳＭＢ）クロマトグラフィーはそれのルーツが石油化学および鉱工業にある。今日、ＳＭＢクロマトグラフィーは医薬産業により鏡像異性体をラセミ混合物から分離するために用いられている。ＳＭＢクロマトグラフィーは、単糖フルクトースをフルクトース−グルコース溶液から分離するために、また二糖スクロースをテンサイまたはサトウキビのシロップから大規模に分離するために、既に用いられている。しかし、ＳＭＢクロマトグラフィーはＨＭＯまたは発酵由来の他のいずれかの複雑なオリゴ糖を精製するためにはまだ採用されていない。
擬似移動床（ＳＭＢ）クロマトグラフィーは、精留などの連続的な化学物質分離法と同様に連続分離法として開発された。精留においては、液相と気相の間に向流が樹立され、こうしてそれにより供給と製品（単数または複数）取出しの連続適用が可能になる。さらに、向流クロマトグラフィー操作は理論的には一般的な交差流操作より優れた分離を達成するはずである。しかし、クロマトグラフィー向流操作には反対方向に移動する移動相と固定相が必要であろう。よって、連続クロマトグラフィー分離法における移動性固体クロマトグラフィー材料の概念に関係する難点に対する実際的な解決策として、ＳＭＢクロマトグラフィーが開発された。
標準的なＳＭＢの概念は、４つの外部適用流を備えた４つの異なるゾーンを伴なう；分離すべき成分を含む供給材料の流れ、脱着剤または移動相の流れ、エクストラクト(extract)およびラフィネート(raffinate)の流れ（ラフィネート流は保持した成分（単数または複数）がより少ない）。これらの液流は、ＳＭＢシステムを下記のタスクをもつ４つの異なるゾーン（それぞれのゾーンまたはセクションは１以上のカラムを含むことができる）に分割する：ゾーンＩは固相の再生のために必要であり、ゾーンＩＩの目的は脱着度がより弱い物質の脱着であり、ゾーンＩＩＩのタスクは吸着度が強い物質の吸着であり、最後にゾーンＩＶのタスクは吸着性がより弱い物質の吸着である。よって、より強く吸着する成分はゾーンＩＩで濃縮波(concentration wave)を樹立してエクストラクトポートへ輸送され、これに対し、より弱く吸着する成分はラフィネートポートへ向かって移動する。
原理的に、ゾーンＩおよびＩＶは固相の再生に用いられ（再生ゾーン）、これに対しゾーンＩＩおよびＩＩＩはそのシステムの実際の分離ゾーンとみなすことができる（分離ゾーン）。４つの液流および得られるゾーンのほかに、このシステムは（閉ループ操作について）移動相（脱着剤）のための再循環ポンプを含み、移動相は固定ゾーン内を１方向に通過する。次いで周期的なシフティング、ならびに順にシステム内の１カラムから次のカラムへの供給材料、脱着剤および製品の連続的な供給または取出しにより、向流が達成される。
標準的な閉ループ、４ゾーンＳＭＢシステムのほかに、開ループ、３ゾーンシステムも使用できる。３ゾーン−開ループシステムは、新鮮な溶媒がかなり安価である場合、たとえば水または水／エタノールを移動相として用いる場合には経済的である。３ゾーン−開ループ構造を用いると、液相の再生はもはや必要がなく、よってゾーンＩＶは採用されなくなる。
２成分混合物の分離のための標準的なＳＭＢシステムのほかに、２成分より多い成分の分離のために８ゾーン−閉ループまたは５ゾーン−開ループＳＭＢシステムも開発された。
ＳＭＢシステムは、連続操作モードおよびかなり大きなカラムサイズを使用できるため、原理的に数百トンの生産体積にまで規模を拡大できる。
この先行技術から出発すると、技術的な課題は、高純度で有害化学物質を含まない中性ＨＭＯを大量に得るための新規な方法を提供することである。
技術的な課題は、請求項１による方法、請求項１４による中性ＨＭＯ、および請求項１８による中性ＨＭＯの使用により解決される。従属請求項は有利な態様を示す。
本発明は、中性ＨＭＯ（たとえば、２’−フコシルラクトース）および夾雑物を含む粗製溶液から中性ヒトミルクオリゴ糖を連続クロマトグラフィーで（または連続的に）精製する方法を提供し、その際、中性ＨＭＯ（たとえば、２’−フコシルラクトース）および夾雑物を含む粗製溶液が、微生物発酵抽出液、生体触媒反応溶液、化学合成溶液、およびその組合わせからなる群から選択される溶液を含むかまたはそれからなり、その際、溶液中の中性ＨＭＯ（たとえば、２’−フコシルラクトース）の純度は＜８０％である。本方法は、粗製溶液に、擬似移動床クロマトグラフィーを用いる少なくとも１つの精製工程を適用することを特徴とする。この方法で、純度≧８０％の所望の中性ＨＭＯ（たとえば、２’−フコシルラクトース）を含む精製溶液が得られる。
本発明は、中性ＨＭＯ（たとえば、２’−フコシルラクトース）および夾雑物を含む粗製溶液から中性ヒトミルクオリゴ糖を連続クロマトグラフィーで（または連続的に）精製する方法を提供し、その際、中性ＨＭＯ（たとえば、２’−フコシルラクトース）および夾雑物を含む粗製溶液が、微生物発酵抽出液、生体触媒反応溶液、化学合成溶液、およびその組合わせからなる群から選択される溶液を含むかまたはそれからなり、その際、溶液中の中性ＨＭＯ（たとえば、２’−フコシルラクトース）の純度は＜８０％である。本方法は、粗製溶液に、擬似移動床クロマトグラフィーを用いる少なくとも１つの精製工程を適用することを特徴とする。この方法で、純度≧８０％の所望の中性ＨＭＯ（たとえば、２’−フコシルラクトース）を含む精製溶液が得られる。
中性ＨＭＯを連続クロマトグラフィーで精製する方法は、中性ＨＭＯを連続的に精製する方法であってもよい。これに関して、中性ＨＭＯは２’−フコシルラクトースまたはラクト−Ｎ−テトラオースであってもよい。
本出願人は、擬似移動床クロマトグラフィーを用いる精製工程を伴なうこの開発された方法によれば、高純度で重金属夾雑物を含まないＨＭＯを連続的に提供できることを見出した。よって、大量の高純度ＨＭＯをきわめて簡便かつ経済的に、たとえば微生物発酵に由来する粗製溶液から提供できる。本発明方法は、擬似移動床クロマトグラフィー工程に用いるカラム材料（たとえば、カチオン性カラム材料）の再生工程が無くても高度に安定であることも分かった。事実、全プロセスを数か月間にわたって安定かつ連続的に操作できる。
好ましい態様において、粗製溶液中の中性ＨＭＯの純度は≦７０％、≦６０％、≦５０％、≦４０％、≦３０％、≦２０％、≦１０％もしくは≦５％であり、および／または精製溶液は純度≧８０％、好ましくは≧９０％の中性ＨＭＯを含む。用語“粗製溶液”は１つの移動床クロマトグラフィー精製工程の前の中性ＨＭＯ含有溶液を表わし、これに対し精製溶液は１つの移動床クロマトグラフィー工程の後の溶液を表わす。
少なくとも１つの擬似移動床クロマトグラフィー工程は、
ｉ）少なくとも４つのカラム、好ましくは少なくとも８つのカラム、より好ましくは少なくとも１２のカラムを有し、その際、少なくとも１つのカラムが弱または強カチオン交換樹脂、好ましくはＨ＋−形またはＣａ２＋−形のカチオン交換樹脂を含む；および／または
ｉｉ）流速の異なる４つのゾーンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶを有する；および／または
ｉｉｉ）水、好ましくはエタノールおよび水、より好ましくは５〜１５体積％(vol %)のエタノールおよび８５〜９５体積％の水、最も好ましくは９〜１１体積％のエタノールおよび８９〜９１体積％の水を含むかまたはそれからなる溶離剤を有し、その際、溶離剤は場合によりさらに硫酸、好ましくは≦１０ｍＭの硫酸；より好ましくは≦２〜５ｍＭの硫酸を含む；および／または
ｉｖ）１５℃〜６０℃、好ましくは２０℃〜５５℃、より好ましくは２５℃〜５０℃の操作温度を有する
ことができる。
ｉ）少なくとも４つのカラム、好ましくは少なくとも８つのカラム、より好ましくは少なくとも１２のカラムを有し、その際、少なくとも１つのカラムが弱または強カチオン交換樹脂、好ましくはＨ＋−形またはＣａ２＋−形のカチオン交換樹脂を含む；および／または
ｉｉ）流速の異なる４つのゾーンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶを有する；および／または
ｉｉｉ）水、好ましくはエタノールおよび水、より好ましくは５〜１５体積％(vol %)のエタノールおよび８５〜９５体積％の水、最も好ましくは９〜１１体積％のエタノールおよび８９〜９１体積％の水を含むかまたはそれからなる溶離剤を有し、その際、溶離剤は場合によりさらに硫酸、好ましくは≦１０ｍＭの硫酸；より好ましくは≦２〜５ｍＭの硫酸を含む；および／または
ｉｖ）１５℃〜６０℃、好ましくは２０℃〜５５℃、より好ましくは２５℃〜５０℃の操作温度を有する
ことができる。
精製すべきＨＭＯが２’−フコシルラクトースであれば、少なくとも１つの擬似移動床クロマトグラフィー工程は、
ｉ）流速の異なる４つのゾーンＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶを有し、その際、流速は好ましくは：ゾーンＩにおいて２８〜３２ｍｌ／分、ゾーンＩＩにおいて１９〜２３ｍｌ／分、ゾーンＩＩＩにおいて２１〜２５ｍｌ／分、および／またはゾーンＩＶにおいて１６〜２０ｍｌ／分である；および／または
ｉｉ）２〜４ｍｌ／分、好ましくは３ｍｌ／分の供給速度を有する；および／または
ｉｉｉ）１０〜１３ｍｌ／分、好ましくは１１．５ｍｌ／分の溶離剤流速を有する；および／または
ｉｖ）１６〜２０分、好ましくは１７〜１９分、より好ましくは１８分のスイッチング時間を有する
ことができる。
ｉ）流速の異なる４つのゾーンＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶを有し、その際、流速は好ましくは：ゾーンＩにおいて２８〜３２ｍｌ／分、ゾーンＩＩにおいて１９〜２３ｍｌ／分、ゾーンＩＩＩにおいて２１〜２５ｍｌ／分、および／またはゾーンＩＶにおいて１６〜２０ｍｌ／分である；および／または
ｉｉ）２〜４ｍｌ／分、好ましくは３ｍｌ／分の供給速度を有する；および／または
ｉｉｉ）１０〜１３ｍｌ／分、好ましくは１１．５ｍｌ／分の溶離剤流速を有する；および／または
ｉｖ）１６〜２０分、好ましくは１７〜１９分、より好ましくは１８分のスイッチング時間を有する
ことができる。
好ましくは、少なくとも１つのカラムは０．１〜５０００ｋｇのカチオン交換樹脂、好ましくは０．２〜５００ｋｇのカチオン交換樹脂、より好ましくは０．５〜５０ｋｇのカチオン交換樹脂、最も好ましくは１．０〜２０ｋｇのカチオン交換樹脂を含む。
重要なことは、カチオン交換材料の量、種々のゾーンにおける流速、供給速度、溶離剤流速および／またはスイッチング時間のスケールアップが可能なことである。スケールアップは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０００倍またはそれらの数値の間のあらゆる可能なスケールアップ倍率であってもよい。
カラム中に、強いカチオン交換樹脂を固定相として使用できる。好ましくは、カチオン交換樹脂はスルホン酸樹脂、より好ましくはＰｕｒｏｌｉｔｅ（登録商標） ＰＣＲ８３３Ｈ（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ，ドイツ、ラーティンゲン）、Ｌｅｗａｔｉｔ ＭＤＳ ２３６８および／またはＬｅｗａｔｉｔ ＭＤＳ １３６８樹脂である。カチオン性イオン交換樹脂をカラム中に用いる場合、それは硫酸で再生できる。硫酸を溶離剤中に、好ましくは１０ｍＭ以下の硫酸濃度で使用できる。（強）カチオン交換樹脂はＨ＋−形またはＣａ２＋−形で存在することができる。
擬似移動床クロマトグラフィーに際して６０℃を超える操作温度は好ましくない。特に、固定相としての強カチオン性イオン交換樹脂（Ｈ＋−形またはＣａ２＋−形のもの）の存在下で、適用した中性オリゴ糖が有意に脱安定化、すなわち解重合し、それは中性ＨＭＯの最終収率に対して有害であることが見出された。
本発明の有利な態様において、本発明は精製溶液に擬似移動床クロマトグラフィーを用いる少なくとも１つのさらなる精製工程を適用することを特徴とし、その際、≧９０％、好ましくは≧９２％、より好ましくは≧９３％の純度をもつ中性ヒトミルクオリゴ糖を含む精製溶液が得られる。特に、本発明は、組換えＤＮＡを含まずかつ宿主株タンパク質を含まないＨＭＯ製品を生成する。
このさらなる擬似移動床クロマトグラフィーは、
ｉ）少なくとも４つのカラム、好ましくは少なくとも８つのカラム、最も好ましくは少なくとも１２のカラムを有し、その際、少なくとも１つのカラムが弱または強カチオン交換樹脂、好ましくはＨ＋−形またはＣａ２＋−形のカチオン交換樹脂を含む；および／または
ｉｉ）流速の異なる４つのゾーンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶを有する；および／または
ｉｉｉ）水、好ましくはエタノールおよび水、より好ましくは５〜１５体積％のエタノールおよび８５〜９５体積％の水、最も好ましくは９〜１１体積％のエタノールおよび８９〜９１体積％の水を含むかまたはそれからなる溶離剤を有し、その際、溶離剤は場合によりさらに硫酸、好ましくは≦１０ｍＭの硫酸；より好ましくは≦２〜５ｍＭの硫酸を含む；および／または
ｉｖ）１５℃〜６０℃、好ましくは２０℃〜５５℃、より好ましくは２５℃〜５０℃の操作温度を有する
ことができる。
ｉ）少なくとも４つのカラム、好ましくは少なくとも８つのカラム、最も好ましくは少なくとも１２のカラムを有し、その際、少なくとも１つのカラムが弱または強カチオン交換樹脂、好ましくはＨ＋−形またはＣａ２＋−形のカチオン交換樹脂を含む；および／または
ｉｉ）流速の異なる４つのゾーンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶを有する；および／または
ｉｉｉ）水、好ましくはエタノールおよび水、より好ましくは５〜１５体積％のエタノールおよび８５〜９５体積％の水、最も好ましくは９〜１１体積％のエタノールおよび８９〜９１体積％の水を含むかまたはそれからなる溶離剤を有し、その際、溶離剤は場合によりさらに硫酸、好ましくは≦１０ｍＭの硫酸；より好ましくは≦２〜５ｍＭの硫酸を含む；および／または
ｉｖ）１５℃〜６０℃、好ましくは２０℃〜５５℃、より好ましくは２５℃〜５０℃の操作温度を有する
ことができる。
精製すべきＨＭＯが２’−フコシルラクトースであれば、このさらなる擬似移動床クロマトグラフィー工程は、
ｉ）流速の異なる４つのゾーンＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶを有し、その際、流速は好ましくは：ゾーンＩにおいて２８〜３２ｍｌ／分、ゾーンＩＩにおいて１９〜２３ｍｌ／分、ゾーンＩＩＩにおいて２１〜２５ｍｌ／分、および／またはゾーンＩＶにおいて１６〜２０ｍｌ／分である；および／または
ｉｉ）２〜４ｍｌ／分、好ましくは３ｍｌ／分の供給速度を有する；および／または
ｉｉｉ）１０〜１３ｍｌ／分、好ましくは１１．５ｍｌ／分の溶離剤流速を有する；および／または
ｉｖ）１６〜２０分、好ましくは１７〜１９分、より好ましくは１８分のスイッチング時間を有する
ことができる。
ｉ）流速の異なる４つのゾーンＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶを有し、その際、流速は好ましくは：ゾーンＩにおいて２８〜３２ｍｌ／分、ゾーンＩＩにおいて１９〜２３ｍｌ／分、ゾーンＩＩＩにおいて２１〜２５ｍｌ／分、および／またはゾーンＩＶにおいて１６〜２０ｍｌ／分である；および／または
ｉｉ）２〜４ｍｌ／分、好ましくは３ｍｌ／分の供給速度を有する；および／または
ｉｉｉ）１０〜１３ｍｌ／分、好ましくは１１．５ｍｌ／分の溶離剤流速を有する；および／または
ｉｖ）１６〜２０分、好ましくは１７〜１９分、より好ましくは１８分のスイッチング時間を有する
ことができる。
特に、少なくとも１つのカラムは０．１〜５０００ｋｇのカチオン交換樹脂、好ましくは０．２〜５００ｋｇのカチオン交換樹脂、より好ましくは０．５〜５０ｋｇのカチオン交換樹脂、最も好ましくは１．０〜２０ｋｇのカチオン交換樹脂を含む。
重要なことは、カチオン交換材料の量、種々のゾーンにおける流速、供給速度、溶離剤流速および／またはスイッチング時間のスケールアップが可能なことである。スケールアップは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０００倍またはそれらの数値の間のあらゆる可能なスケールアップ倍率であってもよい。
擬似移動床クロマトグラフィーを用いる精製工程の後、好ましくは塩基の添加によって、より好ましくはＮａＯＨ（たとえば、０．２Ｍ ＮａＯＨ）の添加によって、精製溶液のｐＨをｐＨ７に調整することができる。
本発明によれば、中性ＨＭＯおよび夾雑物を含む粗製溶液は、微生物発酵、微生物発酵抽出液、生体触媒反応溶液、化学合成溶液、およびその組合わせからなる群から選択される溶液を含むかまたはそれからなる。中性ＨＭＯの供給源としての発酵は、それが化学合成または生体触媒（すなわち、酵素）合成よりコスト効果が大きいという利点をもつ。よって、微生物発酵抽出液が好ましい。
好ましくは、溶液に少なくとも１つの擬似移動床クロマトグラフィー工程を適用する前に、中性ヒトミルクオリゴ糖を含む溶液（好ましくは、微生物発酵溶液）を
ｉ）濾過または遠心してバイオマスおよび／またはいずれかの不溶性物質を除去し、好ましくは活性炭、チャコール、セライトで濾過し、および／またはクロスフロー濾過により、いずれかの不溶性物質および有機夾雑物を除去し、より好ましくはクロスフロー濾過により濾過し、最も好ましくは精密濾過膜を用いるクロスフロー濾過により濾過する；および／または
ｉｉ）カチオンおよび／またはアニオン交換クロマトグラフィーを用いる少なくとも１つの精製工程、好ましくは最初に少なくとも１つのカチオン交換クロマトグラフィー工程、次いで少なくとも１つのアニオン交換クロマトグラフィー工程を適用する。
ｉ）濾過または遠心してバイオマスおよび／またはいずれかの不溶性物質を除去し、好ましくは活性炭、チャコール、セライトで濾過し、および／またはクロスフロー濾過により、いずれかの不溶性物質および有機夾雑物を除去し、より好ましくはクロスフロー濾過により濾過し、最も好ましくは精密濾過膜を用いるクロスフロー濾過により濾過する；および／または
ｉｉ）カチオンおよび／またはアニオン交換クロマトグラフィーを用いる少なくとも１つの精製工程、好ましくは最初に少なくとも１つのカチオン交換クロマトグラフィー工程、次いで少なくとも１つのアニオン交換クロマトグラフィー工程を適用する。
さらなる好ましい態様において、溶液に擬似移動床クロマトグラフィーを用いる少なくとも１つの精製工程を適用する前に、または擬似移動床クロマトグラフィーを用いる精製工程の後に、中性ＨＭＯを含む溶液を電気透析および／または透析濾過し、好ましくはナノ濾過膜で透析濾過し、より好ましくはサイズ排除限界≦２０Åを有するナノ濾過膜で透析濾過する。最も好ましくは、溶液を≦１５ｍＳ／ｃｍ、好ましくは≦１０ｍＳ／ｃｍ、より好ましくは≦５ｍＳ／ｃｍの導電率にまで透析する。
溶液に擬似移動床クロマトグラフィーを用いる少なくとも１つの精製工程を適用する前に粗製溶液を透析する場合、主な夾雑物は中性ＨＭＯ画分の由来（すなわち、化学合成、生体触媒反応または発酵）に依存する。一般的な夾雑物は単糖類（たとえば、グルコース、ガラクトース、フコースなど）、二糖類（たとえば、ラクトース）および副産物（たとえば、ラクツロース）である。発酵を中性ＨＭＯの供給源として用いた場合、粗製溶液は通常は用いた炭素源（たとえば、グリセロール、スクロースおよび／またはグルコース）および用いた微生物の副産物（たとえば、より高分子量のオリゴ糖）を夾雑物として含む。さらなる夾雑物として、用いたグリコシルトランスフェラーゼ（たとえば、合成する細胞中のグリコシルトランスフェラーゼであって、目的生成物、基質または中間生成物を汚染オリゴ糖に変換するもの）の作用混乱(promiscuity)のため生成したオリゴ糖が存在する可能性もある。それらの夾雑物は、擬似移動床（ＳＭＢ）クロマトグラフィーを用いる精製工程によって効率的に除去することができる。
透析後に、好ましくは電気透析および／または透析濾過の後に（場合により、溶液にＳＭＢクロマトグラフィープロセスを適用する前に）ＨＭＯを含む溶液を、特に
ｉ）≧５０ｇ／ｌ、≧１００ｇ／ｌ、好ましくは≧２００ｇ／ｌ、より好ましくは≧３００ｇ／ｌの濃度にまで；および／または
ｉｉ）真空濃縮を用いて；および／または
ｉｉｉ）ナノ濾過により；および／または
ｉｖ）４℃〜５０℃、好ましくは１０℃〜４５℃、場合により２０℃〜４０℃または３０℃〜３５℃の温度で
濃縮することができる。
ｉ）≧５０ｇ／ｌ、≧１００ｇ／ｌ、好ましくは≧２００ｇ／ｌ、より好ましくは≧３００ｇ／ｌの濃度にまで；および／または
ｉｉ）真空濃縮を用いて；および／または
ｉｉｉ）ナノ濾過により；および／または
ｉｖ）４℃〜５０℃、好ましくは１０℃〜４５℃、場合により２０℃〜４０℃または３０℃〜３５℃の温度で
濃縮することができる。
より好ましくは、ナノ濾過を用いてＨＭＯ含有画分を濃縮する。ナノ濾過工程はさらに、汚染塩類を透析除去するために使用できる。この場合、ＨＭＯ画分をまずナノ濾過によって濃縮し、次いで得られた濃縮ＨＭＯ画分をその後、水、好ましくは２回蒸留Ｈ２Ｏ（ｄｄＨ２Ｏ）または脱イオン水で希釈し、次いでこの希釈ＨＭＯ画分を再びナノ濾過膜を用いて濃縮することができる。
ナノ濾過による濃縮は、高温への中性ＨＭＯの曝露を免れることができるので、特に好ましい。よって、その濃縮方法はＨＭＯの構造に対する破壊性が熱処理より低い；すなわち、それは濃縮に際して中性ＨＭＯに対する熱的損傷を誘発しない。ナノ濾過のさらに他の利点は、それを中性ＨＭＯの濃縮と透析の両方（透析濾過）のために使用できることである。言い換えると、本発明方法において濃縮工程と透析工程を連続して実施すれば、ナノ濾過に用いる膜を交換する必要がない。さらに、中性ＨＭＯを含有する溶液の塩濃度を有意に低下させることができる。これにより材料および時間が節約され、プロセス全体がより経済的になる。好ましくは、ナノ濾過を電気透析と組み合わせる。この組合わせは濃縮および脱塩において卓越した結果を与えることが分かった。
本発明の好ましい態様において、精製溶液を、好ましくは３ｋＤａフィルターによる精製溶液の濾過により、無菌濾過し、および／またはエンドトキシン除去する。
精製溶液を噴霧乾燥すること、特に、２０〜６０％（ｗ／ｖ）、好ましくは３０〜５０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは３５〜４５％（ｗ／ｖ）の中性ＨＭＯ濃度、１１０〜１５０℃、好ましくは１２０〜１４０℃、より好ましくは１２５〜１３５℃の入口温度、および／または６０〜８０℃、好ましくは６５〜７０℃の出口温度で噴霧乾燥することができる。
精製溶液を噴霧乾燥すること、特に、２０〜６０％（ｗ／ｖ）、好ましくは３０〜５０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは３５〜４５％（ｗ／ｖ）の中性ＨＭＯ濃度、１１０〜１５０℃、好ましくは１２０〜１４０℃、より好ましくは１２５〜１３５℃の入口温度、および／または６０〜８０℃、好ましくは６５〜７０℃の出口温度で噴霧乾燥することができる。
本発明の方法の好ましい態様において、精製すべき中性ＨＭＯは３以上の単糖単位を有する中性ＨＭＯ、好ましくは中性ヒトミルク三糖、四糖、五糖または六糖である。より好ましくは、中性ＨＭＯは、２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、２’，３−ジフコシルラクトース、ラクト−Ｎ−トリオースＩＩ、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＶ、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＶ、ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースＩ、ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースＩＩ、６’−ガラクトシルラクトース、３’−ガラクトシルラクトース、ラクト−Ｎ−ヘキサオース、ラクト−Ｎ−ネオヘキサオース、パラ−ラクト−Ｎ−ヘキサオース、パラ−ラクト−Ｎ−ネオヘキサオースおよびジフコシル−ラクト−Ｎ−ネオヘキサオースからなる群から選択される。最も好ましくは、中性ＨＭＯは２’−フコシルラクトースまたはラクト−Ｎ−ネオテトラオースである。
場合により、中性ＨＭＯは２’−フコシルラクトースではなくてもよい。
本発明の有利な態様において、本発明の方法は、中性ヒトミルクオリゴ糖および夾雑物を含む粗製溶液が微生物発酵抽出液を含むかまたはそれからなり、その際、微生物発酵抽出液が少なくとも１つの微生物発酵工程、好ましくはそれに続く少なくとも１つの下記の工程で得られることを特徴とする：
ａ）微生物発酵後に可溶性物質を不溶性物質から分離するための、溶液、好ましくは粗製溶液の濾過；および／または
ｂ）溶液、好ましくは工程ａ）で得られた溶液の、イオン交換クロマトグラフィー、好ましくはカチオン交換クロマトグラフィー、より好ましくはカチオン交換クロマトグラフィーに続くアニオン交換クロマトグラフィー；および／または
ｃ）溶液、好ましくは工程ｂ）で得られた溶液の濃縮、より好ましくは水の蒸発による濃縮、および／またはナノ濾過による濃縮、場合により１回より多い濃縮；および／または
ｄ）溶液、好ましくは工程ｃ）で得られた溶液の透析、より好ましくは電気透析および／または透析濾過による透析、最も好ましくはナノ濾過膜を用いる透析濾過による透析、場合により１回より多い透析；および／または
ｅ）溶液、好ましくは工程ｄ）で得られた溶液の、擬似移動床クロマトグラフィーを用いるクロマトグラフィー；および／または
ｆ）中性ヒトミルクオリゴ糖を有色夾雑物から分離するための、溶液、好ましくは工程ｅ）で得られた溶液の濾過、より好ましくは活性炭による濾過；および／または
ｇ）中性ヒトミルクオリゴ糖を含む精製溶液、好ましくは工程ｆ）で得られた精製溶液の、噴霧乾燥。
本発明の有利な態様において、本発明の方法は、中性ヒトミルクオリゴ糖および夾雑物を含む粗製溶液が微生物発酵抽出液を含むかまたはそれからなり、その際、微生物発酵抽出液が少なくとも１つの微生物発酵工程、好ましくはそれに続く少なくとも１つの下記の工程で得られることを特徴とする：
ａ）微生物発酵後に可溶性物質を不溶性物質から分離するための、溶液、好ましくは粗製溶液の濾過；および／または
ｂ）溶液、好ましくは工程ａ）で得られた溶液の、イオン交換クロマトグラフィー、好ましくはカチオン交換クロマトグラフィー、より好ましくはカチオン交換クロマトグラフィーに続くアニオン交換クロマトグラフィー；および／または
ｃ）溶液、好ましくは工程ｂ）で得られた溶液の濃縮、より好ましくは水の蒸発による濃縮、および／またはナノ濾過による濃縮、場合により１回より多い濃縮；および／または
ｄ）溶液、好ましくは工程ｃ）で得られた溶液の透析、より好ましくは電気透析および／または透析濾過による透析、最も好ましくはナノ濾過膜を用いる透析濾過による透析、場合により１回より多い透析；および／または
ｅ）溶液、好ましくは工程ｄ）で得られた溶液の、擬似移動床クロマトグラフィーを用いるクロマトグラフィー；および／または
ｆ）中性ヒトミルクオリゴ糖を有色夾雑物から分離するための、溶液、好ましくは工程ｅ）で得られた溶液の濾過、より好ましくは活性炭による濾過；および／または
ｇ）中性ヒトミルクオリゴ糖を含む精製溶液、好ましくは工程ｆ）で得られた精製溶液の、噴霧乾燥。
最も好ましくはすべての工程ａ）〜ｇ）を連続的に実施する。すべての工程ａ）〜ｇ）を連続的に実施するのは本発明方法の最も有利な態様であることが見出された。その方法は、コストおよび時間効果が高く、大量の高純度の噴霧乾燥した（すなわち、非晶質）中性ＨＭＯを微生物発酵（抽出液）から得ることができる。特に、ナノ濾過を用いるＨＭＯ溶液の濃縮工程および脱塩工程は、きわめてコスト効果が高く、望ましくない副産物の形成が阻止される緩和な操作工程である。
よって、本発明は本発明方法により製造できる中性ＨＭＯを提供する。中性ＨＭＯ（たとえば、２’−フコシルラクトースまたはラクト−Ｎ−テトラオース）を、好ましくは噴霧乾燥する。精製した中性ＨＭＯは、高純度でありかつ重金属夾雑物および／または有機溶媒を含まないという利点をもつ。
本発明による中性ＨＭＯは、
ｉ）固体顆粒形態；および／または
ｉｉ）示差走査熱量測定により測定して、６０〜９０℃、好ましくは６２〜８８℃、より好ましくは６４〜８６℃のガラス転移温度；および／または
ｉｉｉ）レーザー回折により測定して、５〜５００μｍ、好ましくは１０〜３００μｍの粒径；および／または
ｉｖ）レーザー回折により測定して、１０〜１００μｍ、好ましくは２０〜９０μｍ、より好ましくは３０〜８０μｍ、最も好ましくは４０〜７０μｍの平均粒径；および／または
ｖ）非晶質状態、好ましくはＸ線粉末回折で結晶性物質の特徴的なピークをもたない非晶質状態；および／または
ｖｉ）≦１０％、好ましくは≦８％、より好ましくは＜５％の含水率
をもつことができる。
ｉ）固体顆粒形態；および／または
ｉｉ）示差走査熱量測定により測定して、６０〜９０℃、好ましくは６２〜８８℃、より好ましくは６４〜８６℃のガラス転移温度；および／または
ｉｉｉ）レーザー回折により測定して、５〜５００μｍ、好ましくは１０〜３００μｍの粒径；および／または
ｉｖ）レーザー回折により測定して、１０〜１００μｍ、好ましくは２０〜９０μｍ、より好ましくは３０〜８０μｍ、最も好ましくは４０〜７０μｍの平均粒径；および／または
ｖ）非晶質状態、好ましくはＸ線粉末回折で結晶性物質の特徴的なピークをもたない非晶質状態；および／または
ｖｉ）≦１０％、好ましくは≦８％、より好ましくは＜５％の含水率
をもつことができる。
中性ＨＭＯは、医薬、好ましくは胃腸障害の予防または治療に使用できる。それは、栄養補給、好ましくは医療栄養補給または乳製品栄養補給（たとえば、シリアル製品）にも使用できる。
本発明の好ましい態様において、中性ヒトミルクオリゴ糖は３以上の単糖単位を有する中性ＨＭＯ、好ましくは中性ヒトミルク三糖、四糖、五糖または六糖である。より好ましくは、中性ＨＭＯは、２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、２’，３−ジフコシルラクトース、ラクト−Ｎ−トリオースＩＩ、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＶ、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＶ、ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースＩ、ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースＩＩ、６’−ガラクトシルラクトース、３’−ガラクトシルラクトース、ラクト−Ｎ−ヘキサオース、ラクト−Ｎ−ネオヘキサオース、パラ−ラクト−Ｎ−ヘキサオース、パラ−ラクト−Ｎ−ネオヘキサオースおよびジフコシル−ラクト−Ｎ−ネオヘキサオースからなる群から選択される。最も好ましくは中性ＨＭＯは２’−フコシルラクトースまたはラクト−Ｎ−ネオテトラオースである。
場合により、中性ＨＭＯは２’−フコシルラクトースではなくてもよい。
さらに、本発明による中性ＨＭＯを食品における添加剤として、好ましくはヒトの食品および／またはペットフードにおける添加剤として、より好ましくはヒトのベビーフードにおける添加剤として使用することを提唱する。
さらに、本発明による中性ＨＭＯを食品における添加剤として、好ましくはヒトの食品および／またはペットフードにおける添加剤として、より好ましくはヒトのベビーフードにおける添加剤として使用することを提唱する。
以下の図面および実施例に関して、本発明による主題をより詳細に説明するものとするが、その主題を本明細書に示す特定の態様に限定するためのものではない。
実施例１：擬似移動床クロマトグラフィー（ＳＭＢクロマトグラフィー）を用いる２’−フコシルラクトースの精製
濃度２５０ｇ／Ｌの２’−フコシルラクトースを含有する透明な、粒子を含まない溶液を、０．５ｍＳ／ｃｍになるまで、ＰＣ−Ｃｅｌｌ Ｅ２００膜積層体を備えたＰＣ−Ｃｅｌｌ ＢＥＤ １−３ 電気透析装置（ＰＣ−Ｃｅｌｌ，ドイツ、ホイスヴァイラー）を用いて電気透析した。その積層体はサイズ排除限界６０Ｄａをもつ下記の膜から構成されていた：カチオン交換膜(cation exchange membrane)ＣＥＭ：ＰＣ ＳＫ、およびアニオン交換膜(anion exchange membrane)ＡＥＭ：ＰｃＡｃｉｄ６０。
濃度２５０ｇ／Ｌの２’−フコシルラクトースを含有する透明な、粒子を含まない溶液を、０．５ｍＳ／ｃｍになるまで、ＰＣ−Ｃｅｌｌ Ｅ２００膜積層体を備えたＰＣ−Ｃｅｌｌ ＢＥＤ １−３ 電気透析装置（ＰＣ−Ｃｅｌｌ，ドイツ、ホイスヴァイラー）を用いて電気透析した。その積層体はサイズ排除限界６０Ｄａをもつ下記の膜から構成されていた：カチオン交換膜(cation exchange membrane)ＣＥＭ：ＰＣ ＳＫ、およびアニオン交換膜(anion exchange membrane)ＡＥＭ：ＰｃＡｃｉｄ６０。
ＳＭＢ精製のために、真空濃縮装置を用いて４０℃で２’−フコシルラクトース溶液を３００ｇ／Ｌにまで濃縮した。ＳＭＢクロマトグラフィーには、４ゾーンに配列された１２のカラム（Ｐｒｏｓｅｐ（登録商標） カラム；寸法：４０ｍｍ×７４０ｍｍ（Ｌａｔｅｋ，ドイツ、エッペルハイム））を備えた閉ループＳＭＢシステムを用いた。各カラムには７６０ｇのＰｕｒｏｌｉｔｅ（登録商標） ＰＣＲ８３３Ｈ＋（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ，ドイツ、ラーティンゲン）強カチオン性イオン交換樹脂が含まれていた。
このシステムを２５℃の温度において下記の設定フローパラメーターで操作した：ゾーンＩの流速を３０．００ｍｌ／分に設定し、ゾーンＩＩの流速を２１．００ｍｌ／分に設定し、ゾーンＩＩＩの流速を２１．４８ｍｌ／分に設定し、ゾーンＩＶの流速を１８．４４ｍｌ／分に設定し、供給を３．００ｍｌ／分に設定し、溶離剤流速を１１．５６ｍｌ／分に設定し、スイッチング時間を１７．９２分に設定した。溶離剤として、１０％（ｖ／ｖ）の食品用エタノールを含む水を用いた。
主な夾雑物、たとえばラクトース、単糖類、たとえばフコース、グルコース、ガラクトースおよびグリセロールは、エクストラクト中へ分画された。2’−フコシルラクトースおよびより大きなオリゴ糖夾雑物（たとえば、ジフコシルラクトース）は、ラフィネート中へ分画された。
２’−フコシルラクトースはＳＭＢ精製工程でわずかに希釈された−ラフィネート中の２’−フコシルラクトースの濃度は２００ｇ／ｌと測定された。０．２Ｎ ＮａＯＨを用いてラフィネートのｐＨをｐＨ７に調整した。上記のセッティングでこのＳＭＢシステムは少なくとも３か月間は連続操作できた。
次いで、得られた溶液に、０．５ｍＳ／ｃｍ未満の導電率が得られるまで再び電気透析を施し、濃縮して４０％（ｗ／ｖ）の２’−フコシルラクトース溶液を得た。
溶液を３ｋＤａフィルター（Ｐａｌｌ Ｍｉｃｒｏｚａ限外濾過中空繊維モジュールＳＥＰ−２０１３，Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ドライアイヒ）に通すことにより、この溶液に次いで無菌濾過およびエンドトキシン除去を施した。
溶液を３ｋＤａフィルター（Ｐａｌｌ Ｍｉｃｒｏｚａ限外濾過中空繊維モジュールＳＥＰ−２０１３，Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ドライアイヒ）に通すことにより、この溶液に次いで無菌濾過およびエンドトキシン除去を施した。
このプロトコルを用いて、純度９０．４％の２’−フコシルラクトースを得ることができた。主な夾雑物は、３’−フコシルラクトース（２．６％）、ジフコシルラクトース（１．５％）およびラクトース（１．４％）であった。精製の収率はおおよそ８０％であった。
実施例２：マルチコンポーネントＳＭＢクロマトグラフィー分離を用いる２’−フコシルラクトースの精製
濃度２５０ｇ／Ｌの２’−フコシルラクトースを含有する透明な、粒子を含まない溶液を、０．５ｍＳ／ｃｍになるまで、ＰＣ−Ｃｅｌｌ Ｅ２００膜積層体を備えたＰＣ−Ｃｅｌｌ ＢＥＤ １−３ 電気透析装置（ＰＣ−Ｃｅｌｌ，ドイツ、ホイスヴァイラー）を用いて電気透析した。その積層体はサイズ排除限界６０Ｄａをもつ下記の膜から構成されていた：カチオン交換膜ＣＥＭ：Ｐｃ ＳＫ、およびアニオン交換膜ＡＥＭ：ＰｃＡｃｉｄ６０。
濃度２５０ｇ／Ｌの２’−フコシルラクトースを含有する透明な、粒子を含まない溶液を、０．５ｍＳ／ｃｍになるまで、ＰＣ−Ｃｅｌｌ Ｅ２００膜積層体を備えたＰＣ−Ｃｅｌｌ ＢＥＤ １−３ 電気透析装置（ＰＣ−Ｃｅｌｌ，ドイツ、ホイスヴァイラー）を用いて電気透析した。その積層体はサイズ排除限界６０Ｄａをもつ下記の膜から構成されていた：カチオン交換膜ＣＥＭ：Ｐｃ ＳＫ、およびアニオン交換膜ＡＥＭ：ＰｃＡｃｉｄ６０。
ＳＭＢ精製のために、真空濃縮装置を用いて４０℃で２’−フコシルラクトース溶液を３００ｇ／Ｌにまで濃縮した。ＳＭＢクロマトグラフィーには、２×４ゾーンに配列された２４のカラム（Ｐｒｏｓｅｐ（登録商標） カラム；寸法：４０ｍｍ×７４０ｍｍ（Ｌａｔｅｋ，ドイツ、エッペルハイム））を備えた閉ループマルチコンポーネントＳＭＢシステムを用いた。各カラムには７６０ｇのＰｕｒｏｌｉｔｅ（登録商標） ＰＣＲ８３３Ｈ＋（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ，ドイツ、ラーティンゲン）強カチオン性イオン交換樹脂が収容されていた。
このシステムを２５℃において下記の設定フローパラメーターで操作した：ゾーンＩａの流速を３０．００ｍｌ／分に設定し、ゾーンＩＩａの流速を２１．００ｍｌ／分に設定し、ゾーンＩＩＩａの流速を２１．４８ｍｌ／分に設定し、ゾーンＩＶａの流速を１８．４４ｍｌ／分に設定し、供給を３．００ｍｌ／分に設定し、溶離剤流速を１１．５６ｍｌ／分に設定し、スイッチング時間を１７．９２分に設定した。
１回目の分離のラフィネートを３．０４ｍｌ／分の流速で第２分離工程へ送った。ゾーンＩｂの流速を３０ｍｌ／分に維持し、ゾーンｌｌｂの流速を１９．６１ｍｌ／分に設定し、ゾーンＩＩＩｂの流速を２１．６３ｍｌ／分に設定し、ゾーンＩＶｂの流速を１８．４６ｍｌ／分に設定し、溶離剤流速を同様に１１．５６ｍｌ／分に設定し、ゾーンＩｂからＩＶｂへのスイッチング時間は１０．４６分であった。
溶離剤として、１０％（ｖ／ｖ）の食品用エタノールを含む水を用いた。
マルチコンポーネント分離において、夾雑物、たとえばラクトース、単糖類、たとえばフコース、グルコース、ガラクトースおよびグリセロールは第１分離工程のエクストラクト中にみられ、より大きなオリゴ糖夾雑物（たとえば、ジフコシルラクトース）は第２分離工程のラフィネート中に分画された。
マルチコンポーネント分離において、夾雑物、たとえばラクトース、単糖類、たとえばフコース、グルコース、ガラクトースおよびグリセロールは第１分離工程のエクストラクト中にみられ、より大きなオリゴ糖夾雑物（たとえば、ジフコシルラクトース）は第２分離工程のラフィネート中に分画された。
２’−フコシルラクトースは第１分離工程のラフィネート中に分画され、よって第２分離工程のエクストラクトは低分子量および高分子量の夾雑物を含まなかった。２’−フコシルラクトースはこのＳＭＢ精製工程でわずかに希釈されたにすぎない−第２精製工程のエクストラクト中の２’−フコシルラクトースの濃度は２００ｇ／ｌと測定された。
０．２Ｎ ＮａＯＨを用いて第１分離工程後のラフィネートのｐＨをｐＨ７に調整した。
このプロトコルを用いて、純度９３．０％の２’−フコシルラクトースを得ることができた。主な夾雑物は、３’−フコシルラクトース（１．１％）、ジフコシルラクトース（０．９％）およびラクトース（１．０％）であった。
このプロトコルを用いて、純度９３．０％の２’−フコシルラクトースを得ることができた。主な夾雑物は、３’−フコシルラクトース（１．１％）、ジフコシルラクトース（０．９％）およびラクトース（１．０％）であった。
実施例３：噴霧乾燥による固体状２’−フコシルラクトースの取得
ＳＭＢクロマトグラフィーにより得られた２’−フコシルラクトース画分に、０．５ｍＳ／ｃｍ未満の導電率が得られるまで再び電気透析処理を施した。これらの画分を次いで真空下で濃縮して、４０％（ｗ／ｖ）の２’−フコシルラクトースを含有する２’−フコシルラクトース画分を得た。その後、溶液を３ｋＤａフィルター（Ｐａｌｌ Ｍｉｃｒｏｚａ限外濾過中空繊維モジュールＳＥＰ−２０１３，Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ドイツ、ドライアイヒ）に通すことにより、これらの溶液に無菌濾過およびエンドトキシン除去を施した。
ＳＭＢクロマトグラフィーにより得られた２’−フコシルラクトース画分に、０．５ｍＳ／ｃｍ未満の導電率が得られるまで再び電気透析処理を施した。これらの画分を次いで真空下で濃縮して、４０％（ｗ／ｖ）の２’−フコシルラクトースを含有する２’−フコシルラクトース画分を得た。その後、溶液を３ｋＤａフィルター（Ｐａｌｌ Ｍｉｃｒｏｚａ限外濾過中空繊維モジュールＳＥＰ−２０１３，Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ドイツ、ドライアイヒ）に通すことにより、これらの溶液に無菌濾過およびエンドトキシン除去を施した。
こうして得られた無菌２’−フコシルラクトース溶液を、次いでＮＵＢＩＬＯＳＡ ＬＴＣ−ＧＭＰ噴霧乾燥器（ＮＵＢＩＬＯＳＡ，ドイツ、コンスタンツ）を用いて噴霧乾燥した。２’−フコシルラクトースの噴霧乾燥のために、４０％（ｗ／ｖ）溶液を加圧下で入口温度１３０℃に設定した噴霧乾燥器ノズルに通した。６６℃〜６７℃の出口温度を維持するように流速を調整した。
これらの設定を用いて、含水率５％未満の噴霧乾燥粉末を得ることができた。含水率をカールフィッシャー滴定法により測定した。
実施例４：噴霧乾燥した２’−フコシルラクトースの特性分析
1.示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ８２１ｅ（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ，ドイツ、ギーセン）を用いて、噴霧乾燥した２’−フコシルラクトースの２つの試料（試料＃１および試料＃２）の熱事象を測定した。
実施例４：噴霧乾燥した２’−フコシルラクトースの特性分析
1.示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ８２１ｅ（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ，ドイツ、ギーセン）を用いて、噴霧乾燥した２’−フコシルラクトースの２つの試料（試料＃１および試料＃２）の熱事象を測定した。
おおよそ２５ｍｇの噴霧乾燥試料を、クリンプ加工Ａｌ製るつぼ（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ，ドイツ、ギーセン）内で分析した。試料を１０Ｋ／分で０℃にまで冷却し、１０Ｋ／分の走査速度で１００℃にまで再加熱した。２回目の加熱サイクルで試料を０℃にまで冷却した後、試料を１５０℃に加熱した。加熱走査におけるベースラインの吸熱シフトの中間点をＴｇとして採用した。発熱および吸熱のピークを、この事象のピーク温度および正規化したエネルギーにより報告する。試料のＤＳＣ分析の結果を表１にまとめる。
試料＃１のＤＳＣ分析により、２回目の加熱走査で６７．４℃に主ガラス転移（Ｔｇ）がみられた。２回目の加熱走査において１２２．６℃にも小さな第２のＴｇが検出された。１回目の加熱走査においては主ガラス転移が検出され、続いてそのＴｇより高い温度で発熱および吸熱事象が検出された。これらの事象は試料における緩和効果(relaxation effect)に起因する。
試料＃２のＤＳＣ分析は、２回目の加熱走査において実質的なより高い８４．６℃の主ガラス転移（Ｔｇ）を示し、これは１回目の加熱走査中にも検出された。これは試料＃１と比較して試料＃２の残留含水率がより低いことを指摘している可能性がある。ガラス転移は１回目の加熱走査の最終温度付近で検出されたので、潜在的な弛緩現象は検出できなかった。この試料において、第２ガラス転移は検出できなかったが、２回目の加熱走査中に１２５．９℃に小さな発熱ピークがみられた。
２．Ｘ線粉末回折
広角Ｘ線粉末回折（ＸＲＤ）を用いて試料＃１および＃２の形態を調べた。銅アノード（４５ｋＶ，４０ｍＡ，波長０．１５４ｎｍにおけるＫα１発光）およびＰＩＸｃｅｌ３Ｄ検出器を備えた、Ｘ線回折計Ｅｍｐｙｒｅａｎ（Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ，オランダ、アルメロ）を用いた。おおよそ１００ｍｇの噴霧乾燥試料を、反射モードで、角度範囲５〜４５° ２θ、ステップサイズ０．０４° ２θ、およびステップ当たりのカウンティング時間１００秒で分析した。
広角Ｘ線粉末回折（ＸＲＤ）を用いて試料＃１および＃２の形態を調べた。銅アノード（４５ｋＶ，４０ｍＡ，波長０．１５４ｎｍにおけるＫα１発光）およびＰＩＸｃｅｌ３Ｄ検出器を備えた、Ｘ線回折計Ｅｍｐｙｒｅａｎ（Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ，オランダ、アルメロ）を用いた。おおよそ１００ｍｇの噴霧乾燥試料を、反射モードで、角度範囲５〜４５° ２θ、ステップサイズ０．０４° ２θ、およびステップ当たりのカウンティング時間１００秒で分析した。
試料＃１および＃２のＸＲＤ分析は、両試料の完全非晶質状態を明らかにし、結晶性物質の特徴的ピークを示さなかった（両回折図のオーバーレイについては図４を参照）。
３．レーザー回折
＞５００ｎｍの粒子を検出するための６０５ｎｍレーザーダイオードおよび＜５００ｎｍの粒子を検出するための４０５ｎｍ青色発光ダイオード（ＬＥＤ）を備えた、Ｐａｒｔｉｃａ ＬＡ−９５０レーザー回折粒度分布分析計（堀場，日本、京都）を用いて、レーザー回折測定を実施した。イソオクタン（１．３９１の屈折率）を分散媒として用いた。試料の屈折率は未知であったので、ショ糖（二糖）粒子の屈折率（１．５３０）を用いた。最大５分間の超音波処理によりイソオクタン中に試料を分散させた。測定前に、システムをイソオクタンでブランキングした。各試料の分散液を３回測定し、平均値および標準偏差を報告する。
３．レーザー回折
＞５００ｎｍの粒子を検出するための６０５ｎｍレーザーダイオードおよび＜５００ｎｍの粒子を検出するための４０５ｎｍ青色発光ダイオード（ＬＥＤ）を備えた、Ｐａｒｔｉｃａ ＬＡ−９５０レーザー回折粒度分布分析計（堀場，日本、京都）を用いて、レーザー回折測定を実施した。イソオクタン（１．３９１の屈折率）を分散媒として用いた。試料の屈折率は未知であったので、ショ糖（二糖）粒子の屈折率（１．５３０）を用いた。最大５分間の超音波処理によりイソオクタン中に試料を分散させた。測定前に、システムをイソオクタンでブランキングした。各試料の分散液を３回測定し、平均値および標準偏差を報告する。
平均粒径（体積粒度の重み付き平均）およびモード粒径(mode particle size)（分布のピーク）を記録した。体積粒度分布（ｑ％）のほかに、下記の結果を記録した：
ｄ（ｖ，１０）：１０体積％の累積ふるい下分布(cumulative undersize distribution)に対応する粒径
ｄ（ｖ，５０）：５０体積％の累積ふるい下分布に対応する粒径
ｄ（ｖ，９０）：９０体積％の累積ふるい下分布に対応する粒径
試料＃１および＃２の粒度分布を図５に示す。最高強度の粒径を表わすモード径は両試料について同等である。全体として、それぞれ６７．８５μｍ（試料＃１）および４３．６５μｍ（試料＃２）の平均粒度を噴霧乾燥粒子について異例に高いとみなす。より高い粒径で検出された画分はおそらく凝集粉末粒子により生じたものであろう。
ｄ（ｖ，１０）：１０体積％の累積ふるい下分布(cumulative undersize distribution)に対応する粒径
ｄ（ｖ，５０）：５０体積％の累積ふるい下分布に対応する粒径
ｄ（ｖ，９０）：９０体積％の累積ふるい下分布に対応する粒径
試料＃１および＃２の粒度分布を図５に示す。最高強度の粒径を表わすモード径は両試料について同等である。全体として、それぞれ６７．８５μｍ（試料＃１）および４３．６５μｍ（試料＃２）の平均粒度を噴霧乾燥粒子について異例に高いとみなす。より高い粒径で検出された画分はおそらく凝集粉末粒子により生じたものであろう。
表２に試料＃１および＃２の粒子サイズ特性をまとめる。
実施例５：２’−フコシルラクトースを含む上清のナノ濾過による体積低減および脱塩
２’−フコシルラクトースを含む培養上清の濃縮および脱塩のために、ＮＦ９９（Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＮＦ９９）またはＮＦ９９ＨＦ（Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＮＦ９９ＨＦ）ナノ濾過膜のいずれかを備えた、Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ Ｍ−２０膜濾過モジュールを用いた。用いた２’−フコシルラクトース含有培養上清（２５ｇ／ｌの２’−フコシルラクトースを含有）は、発酵微生物バイオマスからクロスフロー濾過を用いて分離された。クロスフロー濾過膜の分子カットオフは１５０ｋＤａであった（ＳｔｒａｓｓＢｕｒｇｅｒ Ｆｉｌｔｅｒ Ｍｉｃｒｏ Ｃｒｏｓｓ Ｍｏｄｕｌｅ（登録商標） ＦＳ１０ＬＦＣ−ＦＵＳ１５８２）。
２’−フコシルラクトースを含む培養上清の濃縮および脱塩のために、ＮＦ９９（Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＮＦ９９）またはＮＦ９９ＨＦ（Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＮＦ９９ＨＦ）ナノ濾過膜のいずれかを備えた、Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ Ｍ−２０膜濾過モジュールを用いた。用いた２’−フコシルラクトース含有培養上清（２５ｇ／ｌの２’−フコシルラクトースを含有）は、発酵微生物バイオマスからクロスフロー濾過を用いて分離された。クロスフロー濾過膜の分子カットオフは１５０ｋＤａであった（ＳｔｒａｓｓＢｕｒｇｅｒ Ｆｉｌｔｅｒ Ｍｉｃｒｏ Ｃｒｏｓｓ Ｍｏｄｕｌｅ（登録商標） ＦＳ１０ＬＦＣ−ＦＵＳ１５８２）。
無細胞濾液を次いでカチオン性イオン交換体（Ｌｅｗａｔｉｔ Ｓ２５６８，プロトン形（Ｌａｎｘｅｓｓ））およびアニオン性イオン交換体（Ｌｅｗａｔｉｔ Ｓ６３６８，カーボネート形（Ｌａｎｘｅｓｓ））で処理した後、ナノ濾過した。各イオン交換工程の後、それぞれ水酸化ナトリウム溶液または塩酸を用いて溶液を中和した。膜モジュールの入口圧力は４２バールであり、出口圧力は４０バールであり、膜モジュール内の供給材料の流速は８リットル／分であった。透過液をプロセスから除去し、これに対し残留物を溜めおよび膜モジュールへ戻した。膜積層体に接続した溜めの体積は６リットルであった。２’−フコシルラクトース含有溶液の濃縮に際して、８倍濃縮溶液が得られるまで、溜めに連続的に２’−フコシルラクトース培養上清溶液を満たした。
図７は、用いた２種類の膜について得られたフラックス（Ｌ／ｍ２／時）を体積濃度係数（ＶＣＦ）に対してプロットしたものを示す。２’−フコシルラクトースがおおよそ２００ｇ／ｌの２’−フコシルラクトースに８倍濃縮されると、透過液が膜モジュールから得られるのと同じ速度で脱イオン水を添加することにより、濃縮溶液を脱塩のために透析濾過した。ＨＦ９９ＨＦ膜を用いて、透析濾過工程により２’−フコシルラクトース濃縮液の導電率を２５ｍＳから７ｍＳ未満にまで低下させることができた。
このナノ濾過法を用いることにより、緩和な条件下で（熱曝露を避けて）２’−フコシルラクトース溶液を２’−フコシルラクトース≧２００ｇ／ｌの２’−フコシルラクトース濃度に８倍濃縮することができ、透析濾過工程で大画分の塩含有物を除去することができた。この２’−フコシルラクトース濃縮物に、塩含量をさらに低減するために電気透析を施した。
実施例６：２つの擬似移動床クロマトグラフィー工程およびＨ＋形イオン交換樹脂を用いるラクト−Ｎ−テトラオースの精製
細菌発酵から得られた透明な、粒子を含まないラクト−Ｎ−テトラオース溶液（３０ｇ／ｌ）を、ＰＣ−Ｃｅｌｌ電気透析装置を用いて０．５ｍＳ／ｃｍの導電率にまで電気透析した（前記を参照）。ＳＭＢクロマトグラフィーのために、ラクト−Ｎ−テトラオース溶液を真空下に４０℃で５０ｇ／ｌにまで濃縮した。あるいは、ラクト−Ｎ−テトラオース含有溶液をナノ濾過膜（たとえば、ナノ濾過膜ＨＦ９９ＨＦ，Ａｌｆａ Ｌａｖａｌから）により脱塩および濃縮することができる。
細菌発酵から得られた透明な、粒子を含まないラクト−Ｎ−テトラオース溶液（３０ｇ／ｌ）を、ＰＣ−Ｃｅｌｌ電気透析装置を用いて０．５ｍＳ／ｃｍの導電率にまで電気透析した（前記を参照）。ＳＭＢクロマトグラフィーのために、ラクト−Ｎ−テトラオース溶液を真空下に４０℃で５０ｇ／ｌにまで濃縮した。あるいは、ラクト−Ｎ−テトラオース含有溶液をナノ濾過膜（たとえば、ナノ濾過膜ＨＦ９９ＨＦ，Ａｌｆａ Ｌａｖａｌから）により脱塩および濃縮することができる。
ＳＭＢクロマトグラフィーのために、４ゾーンに配列された１２カラム（Ｐｒｏｓｅｐ（登録商標） ガラスカラム；寸法：４０ｍｍ×７４０ｍｍ（Ｌａｔｅｋ，ドイツ、エッペルハイム））を備えた閉ループＳＭＢシステムを用いた。各ガラスカラムには７６０ｇのＰｕｒｏｌｉｔｅ（登録商標） ＰＣＲ８３３Ｈ＋ 強カチオン性イオン交換樹脂が収容されていた。強カチオン交換樹脂はＨ＋−形で存在していた。
このシステムを２５℃において下記のパラメーターセッティングで操作した：ゾーンＩの流速を３０．００ｍｌ／分に設定し、ゾーンＩＩの流速を１９．０７ｍｌ／分に設定し、ゾーンＩＶの流速を１８．４４ｍｌ／分に設定した。供給を１ｍｌ／分に維持し、溶離剤流速を１１．５６ｍｌ／分に設定し、スイッチング時間を１７．９２分に設定した。溶離剤として、１０％（ｖ／ｖ）の食品用エタノールを含む水を用いた。
これらのパラメーター下で、ラクト−Ｎ−テトラオースおよびより大きな中性オリゴ糖はラフィネート中へ分画された。ラクト−Ｎ−テトラオースの純度は、ＳＭＢ供給材料における３３．４％の代わりに８６．３％であった（ＳＭＢ供給材料のＨＰＬＣ分析については図７Ａ、ＳＭＢラフィネートのＨＰＬＣ分析については図７Ｂを参照）。夾雑物、たとえばラクトース、単糖類およびグリセロールはＳＭＢエクストラクト画分中にみられた（ＳＭＢエクストラクト画分のＨＰＬＣ分析については図８を参照）。ラクト−Ｎ−テトラオース含有ラフィネートを、０．２Ｎ ＮａＯＨ溶液を用いて中性ｐＨに調整した。
得られたラクト−Ｎ−テトラオース含有エクストラクトのｐＨを、０．２Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨ７に調整した。次いで、得られた溶液に０．５ｍＳ未満の導電率が再び得られるまで電気透析を施した。この溶液を次いで真空下でおおよそ５０ｇ／ｌのラクト−Ｎ−テトラオースにまで濃縮し、次いで３ｋＤａクロスフローフィルター（Ｐａｌｌ Ｍｉｃｒｏｚａ限外濾過中空繊維モジュールＳＥＰ−２０１３，Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ドライアイヒ）に通すことにより無菌濾過した。
より大きなオリゴ糖夾雑物をラクト−Ｎ−テトラオースから分離除去するために、２回目のＳＭＢクロマトグラフィー分離を実施した。同じＳＭＢシステムを用い、パラメーターを下記のように変更した：ゾーンＩの流速３０ｍｌ／分、ゾーンＩＩの流速１９．２７ｍｌ／分、ゾーンＩＶの流速１７．３０ｍｌ／分。供給を２．０８ｍｌ／分に設定し、溶離剤流速を１２．７０ｍｌ／分に設定した。ラフィネート流速は４．０４ｍｌ／分であり、エクストラクト流速は１０．７３ｍｌ／分であった。ＳＭＢ分離のスイッチング時間を１０．４６分に設定した。溶離剤として、この場合もに水／エタノール混合物 ９：１（ｖ／ｖ）を用いた。ＳＭＢクロマトグラフィーによる２回目のラクト−Ｎ−テトラオース分離のエクストラクトのＨＰＬＣ分析を図１０に示す。
これらの条件下で、ラクト−Ｎ−テトラオースはエクストラクト中へ分画され、総量の５〜１０％のより大きな中性オリゴ糖がラフィネート中にみられた。このプロトコル（２回目のＳＭＢ工程後のアミノ官能化シリカカラム）を用いて、純度９３．１％のラクト−Ｎ−テトラオースを得ることができた。
実施例７：Ｃａ２＋形イオン交換樹脂による擬似移動床クロマトグラフィーを用いるラクト−Ｎ−テトラオースの精製
細菌発酵から得られた透明な、粒子を含まないラクト−Ｎ−テトラオース溶液（３０ｇ／ｌ）を、ＰＣ−Ｃｅｌｌ電気透析装置を用いて０．５ｍＳ／ｃｍの導電率にまで電気透析した（前記を参照）。
細菌発酵から得られた透明な、粒子を含まないラクト−Ｎ−テトラオース溶液（３０ｇ／ｌ）を、ＰＣ−Ｃｅｌｌ電気透析装置を用いて０．５ｍＳ／ｃｍの導電率にまで電気透析した（前記を参照）。
対イオンとしてカルシウムを含むＳＭＢクロマトグラフィーのために、ラクト−Ｎ−テトラオース溶液を真空下に４０℃で５０ｇ／ｌにまで濃縮した。ＳＭＢクロマトグラフィーには、４ゾーンに配列された１２のカラム（Ｐｒｏｓｅｐ（登録商標） ガラスカラム；寸法：４０ｍｍ×７４０ｍｍ（Ｌａｔｅｋ，ドイツ、エッペルハイム））を備えた閉ループＳＭＢシステムを用いた。
各カラムには７６０ｇのＰｕｒｏｌｉｔｅ（登録商標） ＰＣＲ８３３Ｈ＋ 強カチオン性イオン交換樹脂が収容されていた。カチオン性イオン交換樹脂を５０リットルの２００ｍＭ ＣａＣｌ２で洗浄して、Ｈ＋イオンをＣａ２＋イオンにより交換した。よって、この強カチオン交換樹脂はＣａ２＋−形で存在していた。
このシステムを２５℃において下記のパラメーターセッティングで操作した：ゾーンＩの流速を３０．００ｍｌ／分に設定し、ゾーンＩＩの流速を２０．０７ｍｌ／分に設定し、ゾーンＩＶの流速を１７．０４ｍｌ／分に設定した。供給を２．５ｍｌ／分に維持し、溶離剤流速を１１．５６ｍｌ／分に設定し、スイッチング時間を１７．９２分にした。溶離剤として、１０％（ｖ／ｖ）の食品用エタノールを含む水を用いた。
実施例８：噴霧乾燥による固体状ラクト−Ｎ−テトラオースの取得
ラクト−Ｎ−テトラオースを含有する画分を真空下で濃縮して、ラクト−Ｎ−テトラオース濃度２５％（ｗ／ｖ）を得た。この溶液を次いで無菌濾過およびエンドトキシン除去のために３ｋＤａフィルター（Ｐａｌｌ Ｍｉｃｒｏｚａ限外濾過中空繊維モジュールＳＥＰ−１０１３，Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ドイツ、ドライアイヒ）に通した。
ラクト−Ｎ−テトラオースを含有する画分を真空下で濃縮して、ラクト−Ｎ−テトラオース濃度２５％（ｗ／ｖ）を得た。この溶液を次いで無菌濾過およびエンドトキシン除去のために３ｋＤａフィルター（Ｐａｌｌ Ｍｉｃｒｏｚａ限外濾過中空繊維モジュールＳＥＰ−１０１３，Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ドイツ、ドライアイヒ）に通した。
こうして得られた無菌ラクト−Ｎ−テトラオース溶液を、次いでミニ噴霧乾燥器Ｂ−２９０（Ｂｕｅｃｈｉ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ ＧｍｂＨ，ドイツ、エッセン）を用いて噴霧乾燥した。ラクト−Ｎ−テトラオースの噴霧乾燥のために、溶液を加圧下で出口温度１２０℃〜１３０℃の噴霧乾燥器ノズルに通し、排出温度６６℃〜６７℃を維持するように流速を調整した。これらのセッティングを用いて、含水率７〜９％および収率７２％の噴霧乾燥ラクト−Ｎ−テトラオースを含む噴霧乾燥粉末を得ることができた。含水率をカールフィッシャー滴定法により測定した。
Claims (18)
- 中性ヒトミルクオリゴ糖および夾雑物を含む粗製溶液から中性ヒトミルクオリゴ糖を連続クロマトグラフィーで精製する方法であって、
中性ヒトミルクオリゴ糖および夾雑物を含む粗製溶液が、微生物発酵抽出液、生体触媒反応溶液、化学合成溶液、およびその組合わせからなる群から選択される溶液を含むかまたはそれからなり、その際、溶液中の中性ヒトミルクオリゴ糖の純度は＜８０％であり、
粗製溶液に、擬似移動床クロマトグラフィーを用いる少なくとも１つの精製工程を適用し、その際、純度≧８０％の中性ヒトミルクオリゴ糖を含む精製溶液が得られることを特徴とする方法。 - 粗製溶液中の中性ヒトミルクオリゴ糖の純度が≦７０％、≦６０％、≦５０％、≦４０％、≦３０％、≦２０％、≦１０％もしくは≦５％であり、および／または精製溶液が純度≧８５％、好ましくは≧９０％の中性ヒトミルクオリゴ糖を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 少なくとも１つの擬似移動床クロマトグラフィーが、
ｉ）少なくとも４つのカラム、好ましくは少なくとも８つのカラム、より好ましくは少なくとも１２のカラムを有し、その際、少なくとも１つのカラムが弱または強カチオン交換樹脂、好ましくはＨ＋−形またはＣａ２＋−形のカチオン交換樹脂を含む；および／または
ｉｉ）流速の異なる４つのゾーンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶを有する；
ｉｉｉ）水、好ましくはエタノールおよび水、より好ましくは５〜１５体積％のエタノールおよび８５〜９５体積％の水、最も好ましくは９〜１１体積％のエタノールおよび８９〜９１体積％の水を含むかまたはそれからなる溶離剤を有し、その際、溶離剤は場合によりさらに硫酸、好ましくは≦１０ｍＭまたはそれより少ない硫酸を含む；および／または
ｉｖ）１５℃〜６０℃、好ましくは２０℃〜５５℃、より好ましくは２５℃〜５０℃の操作温度を有する；
ことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。 - 精製溶液に、擬似移動床クロマトグラフィーを用いる少なくとも１つのさらなる精製工程を適用し、その際、純度≧９２％の中性ヒトミルクオリゴ糖を含む精製溶液が得られることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- さらなる擬似移動床クロマトグラフィーが、
ｉ）少なくとも４つのカラム、好ましくは少なくとも８つのカラム、より好ましくは少なくとも１２のカラムを有し、その際、少なくとも１つのカラムが弱または強カチオン交換樹脂、好ましくはＨ＋−形またはＣａ２＋−形のカチオン交換樹脂を含む；および／または
ｉｉ）流速の異なる４つのゾーンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶを有する；
ｉｉｉ）水、好ましくはエタノールおよび水、より好ましくは５〜１５体積％のエタノールおよび８５〜９５体積％の水、最も好ましくは９〜１１体積％のエタノールおよび８９〜９１体積％の水を含むかまたはそれからなる溶離剤を有し、その際、溶離剤は場合によりさらに硫酸、好ましくは≦１０ｍＭまたはそれより少ない硫酸を含む；および／または
ｉｖ）１５℃〜６０℃、好ましくは２０℃〜５５℃、より好ましくは２５℃〜５０℃の操作温度を有する；
ことを特徴とする、請求項４に記載の方法。 - 中性ヒトミルクオリゴ糖および夾雑物を含む粗製溶液が微生物発酵抽出液を含むかまたはそれからなり、その際、微生物発酵抽出液が少なくとも１つの微生物発酵工程、好ましくはそれに続く少なくとも１つの下記の工程で得られ：
ａ）微生物発酵後に可溶性物質を不溶性物質から分離するための、溶液、好ましくは粗製溶液の濾過；
ｂ）溶液、好ましくは工程ａ）で得られた溶液の、イオン交換クロマトグラフィー、好ましくはカチオン交換クロマトグラフィー、より好ましくはカチオン交換クロマトグラフィーに続くアニオン交換クロマトグラフィー；
ｃ）溶液、好ましくは工程ｂ）で得られた溶液の濃縮、より好ましくは水の蒸発による濃縮、および／またはナノ濾過による濃縮、場合により１回より多い濃縮；
ｄ）溶液、好ましくは工程ｃ）で得られた溶液の透析、より好ましくは電気透析および／または透析濾過による透析、最も好ましくはナノ濾過膜を用いる透析濾過による透析、場合により１回より多い透析；
ｅ）溶液、好ましくは工程ｄ）で得られた溶液の、擬似移動床クロマトグラフィーを用いるクロマトグラフィー；
ｆ）中性ヒトミルクオリゴ糖を有色夾雑物から分離するための、溶液、好ましくは工程ｅ）で得られた溶液の濾過、より好ましくは活性炭による濾過；ならびに
ｇ）中性ヒトミルクオリゴ糖を含む精製溶液、好ましくは工程ｆ）で得られた精製溶液の、噴霧乾燥；
その際、最も好ましくはすべての工程ａ）〜ｇ）を連続的に実施する
ことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。 - 溶液に少なくとも１つの擬似移動床クロマトグラフィー工程を適用する前に、中性ヒトミルクオリゴ糖を含む溶液を
ｉ）濾過していずれかの不溶性物質を除去し、好ましくは活性炭、チャコールおよび／またはセライトで濾過していずれかの不溶性物質および有機夾雑物を除去し、より好ましくはクロスフロー濾過により濾過し、最も好ましくは精密濾過膜を用いるクロスフロー濾過により濾過する；および／または
ｉｉ）カチオンおよび／またはアニオン交換クロマトグラフィーを用いる少なくとも１つの精製工程、好ましくは最初に少なくとも１つのカチオン交換クロマトグラフィー工程、次いで少なくとも１つのアニオン交換クロマトグラフィー工程を適用する；
ことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。 - 溶液に擬似移動床クロマトグラフィーを用いる少なくとも１つの精製工程を適用する前に、または擬似移動床クロマトグラフィーを用いる精製工程の後に、中性ヒトミルクオリゴ糖を含む溶液を電気透析および／または透析濾過し、好ましくはナノ濾過膜で透析濾過し、より好ましくはサイズ排除限界≦２０Åを有するナノ濾過膜で透析濾過し、その際、最も好ましくは溶液を≦１５ｍＳ／ｃｍ、好ましくは≦１０ｍＳ／ｃｍ、より好ましくは≦５ｍＳ／ｃｍの導電率にまで透析することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
- 透析後に、中性ヒトミルクオリゴ糖を含む溶液を、
ｉ）≧１００ｇ／Ｌ、好ましくは≧２００ｇ／Ｌ、より好ましくは≧３００ｇ／Ｌの濃度にまで；および／または
ｉｉ）真空濃縮を用いて；および／または
ｉｉｉ）ナノ濾過により；および／または
ｉｖ）４℃〜５０℃、好ましくは１０℃〜４５℃、場合により２０℃〜４０℃または３０℃〜３５℃の温度で
濃縮することを特徴とする、請求項８に記載の方法。 - 精製溶液を、好ましくは３ｋＤａフィルターによる精製溶液の濾過により、無菌濾過および／またはエンドトキシン除去することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
- 精製溶液を噴霧乾燥すること、特に、２０〜６０％（ｗ／ｖ）、好ましくは３０〜５０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは３５〜４５％（ｗ／ｖ）の中性ヒトミルクオリゴ糖濃度、１１０〜１５０℃、好ましくは１２０〜１４０℃、より好ましくは１２５〜１３５℃のノズル温度、および／または６０〜８０℃、好ましくは６５〜７０℃の出口温度で噴霧乾燥することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
- 中性ヒトミルクオリゴ糖が３以上の単糖単位を有する中性ヒトミルクオリゴ糖、好ましくは中性ヒトミルク三糖、四糖、五糖または六糖であり、より好ましくは中性ヒトミルクオリゴ糖が２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、２’，３−ジフコシルラクトース、ラクト−Ｎ−トリオースＩＩ、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＶ、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＶ、ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースＩ、ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースＩＩ、６’−ガラクトシルラクトース、３’−ガラクトシルラクトース、ラクト−Ｎ−ヘキサオース、ラクト−Ｎ−ネオヘキサオース、パラ−ラクト−Ｎ−ヘキサオース、パラ−ラクト−Ｎ−ネオヘキサオースおよびジフコシル−ラクト−Ｎ−ネオヘキサオースからなる群から選択され、最も好ましくは中性ヒトミルクオリゴ糖が２’−フコシルラクトースまたはラクト−Ｎ−テトラオースであることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
- 中性ヒトミルクオリゴ糖を連続クロマトグラフィーで精製する方法が中性ヒトミルクオリゴ糖を連続的に精製する方法であり、その際、中性ヒトミルクオリゴ糖は好ましくは２’−フコシルラクトースまたはラクト−Ｎ−テトラオースであることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
- 請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法で製造できる中性ヒトミルクオリゴ糖、好ましくは噴霧乾燥された中性ヒトミルクオリゴ糖。
- 請求項１４に記載の中性ヒトミルクオリゴ糖であって、
ｉ）固体顆粒形態；および／または
ｉｉ）示差走査熱量測定により測定して、６０〜９０℃、好ましくは６２〜８８℃、より好ましくは６４〜８６℃のガラス転移温度；および／または
ｉｉｉ）レーザー回折により測定して、５〜５００μｍ、好ましくは１０〜３００μｍの粒径；および／または
ｉｖ）レーザー回折により測定して、１０〜１００μｍ、好ましくは２０〜９０μｍ、より好ましくは３０〜８０μｍ、最も好ましくは４０〜７０μｍの平均粒径；および／または
ｖ）非晶質状態、好ましくはＸ線粉末回折で結晶性物質の特徴的なピークをもたない非晶質状態；および／または
ｖｉ）≦１０％、好ましくは≦８％、より好ましくは＜５％の含水率
を有する中性ヒトミルクオリゴ糖。 - 医薬に使用するための、好ましくは胃腸障害の予防または治療に使用するための、請求項１４または１５に記載の中性ヒトミルクオリゴ糖。
- 中性ヒトミルクオリゴ糖が３以上の単糖単位を有する中性ヒトミルクオリゴ糖、好ましくは中性ヒトミルク三糖、四糖、五糖または六糖であり、より好ましくは中性ヒトミルクオリゴ糖が２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、２’，３−ジフコシルラクトース、ラクト−Ｎ−トリオースＩＩ、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＶ、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＶ、ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースＩ、ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースＩＩ、６’−ガラクトシルラクトース、３’−ガラクトシルラクトース、ラクト−Ｎ−ヘキサオース、ラクト−Ｎ−ネオヘキサオース、パラ−ラクト−Ｎ−ヘキサオース、パラ−ラクト−Ｎ−ネオヘキサオースおよびジフコシル−ラクト−Ｎ−ネオヘキサオースからなる群から選択され、最も好ましくは中性ヒトミルクオリゴ糖が２’−フコシルラクトースまたはラクト−Ｎ−テトラオースであることを特徴とする、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の中性ヒトミルクオリゴ糖。
- 食品における添加剤としての、好ましくはヒトの食品および／またはペットフードにおける添加剤としての、より好ましくはヒトのベビーフードにおける添加剤としての、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の中性ヒトミルクオリゴ糖の使用。
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