JP2016504019A - タグを用いた核酸の配列決定 - Google Patents

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Abstract

本発明により、核酸試料を配列決定するためのチップ、システムおよび方法が提示される。タグ化ヌクレオチドは、膜にナノ細孔を含有する反応チャンバへと導入される。当該タグ化ヌクレオチドの個々のタグ化ヌクレオチドは、ヌクレオチドに連結されたタグを含有しても良く、そのタグは、当該ナノ細孔を用いて検出可能である。次に、当該タグ化ヌクレオチドの個々のタグ化ヌクレオチドは、核酸試料由来の一本鎖核酸分子に対して相補的な増殖鎖へと組み込まれても良い。ナノ細孔を用いて、個々のタグ化ヌクレオチドと結合したタグが、当該個々のタグ化ヌクレオチドの組み込みで検出されても良い。タグは、当該タグがヌクレオチドから放出されるときに、ナノ細孔を用いて検出されても良い。【選択図】なし

Description

相互参照
本出願は、２０１２年１１月９日に出願された米国仮特許出願第６１／７２４，８６９号、２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，６２１号、２０１３年９月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／８８０，４０７号の優先権を主張し、それら各々は、参照によりその全体で本明細書に援用される。
核酸の配列決定は、核酸試料に関する配列情報を提示するために用いられうるプロセスである。そのような配列情報は、対象の診断および／または治療に有益なものとなる可能性がある。たとえば、対照の核酸配列を用いて、遺伝性疾患を特定および診断を行うことができ、および、遺伝性疾患に対する治療法が開発される可能性がある。他の例においては、病原体に関する研究により、感染性疾患に対する治療法が導かれる可能性がある。
核酸の配列決定に用いることが出来る方法はある。しかしながら、そのような方法は高価であり、対象を診断および／または治療するために必要とされうる精度および期間内に、配列情報を提示することはできない。
一本鎖核酸分子に、ナノ細孔を通過させる核酸配列決定方法は、診断目的および／または治療目的のデータを提示するには不十分な、または、不適切な感度である可能性がある。核酸分子（たとえば、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）および／または（Ｕ））を含有する核酸塩基は、互いに十分に明確に異なるシグナルを提示しない可能性がある。特に、プリン類（すなわち、ＡおよびＧ）は、互いに同じようなサイズ、形態および電荷であり、一部の例においては十分に明確に異なるシグナルを提示しない。また、ピリミジン類（すなわち、Ｃ、ＴおよびＵ）は、互いに同じようなサイズ、形態および電荷であり、一部の例においては十分に明確に異なるシグナルを提示しない。そこで、核酸分子の同定および核酸配列決定のための方法を改善する必要性があると、認識されている。
一部の実施態様において、核酸組み込み事象（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｅｖｅｎｔｓ）（たとえば、鋳型鎖に対して相補的である核酸鎖への、ヌクレオチドの組み込み）により、ナノ細孔へタグが提示され、および／または、ヌクレオチドからタグが放出され、ナノ細孔により検出される。ユニークなタグが放出され、および／または、ユニークなタグがヌクレオチドの各型（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵ）に対して提示されることにより、組み込まれた塩基が特定されうる。
一部の実施態様においては、タグがナノ細孔と相互作用していることが検出される期間に基づいて、タグは、成功裏に組み込まれたヌクレオチドとみなされる。当該期間は、ナノ細孔を通るヌクレオチドタグの自由な流れに関連した期間よりも長くても良い。また、成功裏に組み込まれたヌクレオチドタグが検出される期間も、組み込まれたかったヌクレオチド（たとえば、鋳型鎖に合致しないヌクレオチド）の期間よりも長くても良い。
一部の例においては、ポリメラーゼは、ナノ細孔と結合し（たとえば、ナノ細孔に共有結合し）、および、ポリメラーゼによりヌクレオチド組み込み事象が行われる。タグは、タグ化されたヌクレオチドがポリメラーゼと結合するときに、ナノ細孔により検出されても良い。一部の例においては、組み込まれていないタグ化されたヌクレオチドは、ナノ細孔を通り過ぎる。当該方法は、組み込まれていないヌクレオチドに結合したタグと、組み込まれたヌクレオチドと結合したタグを、タグ化されたヌクレオチドがナノ細孔により検出される時間の長さに基づいて識別することができる。１つの実施態様において、組み込まれていないヌクレオチドは、約１ミリ秒未満の間、ナノ細孔により検出され、組み込まれたヌクレオチドは、少なくとも約１ミリ秒の間、ナノ細孔により検出される。
一部の実施態様において、約１００ｍｓの平均検出時間で、少なくとも１ミリ秒の間、タグがナノ細孔により検出可能である場合、ポリメラーゼは、ゆっくりとした反応速度工程を有する。ポリメラーゼは、変異型ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼであっても良い。
ポリメラーゼに変異を導入し、ポリメラーゼがヌクレオチドを核酸鎖（たとえば、増殖核酸鎖）へと組み込む比率を減少させてもよい。一部の例において、たとえば、鋳型核酸鎖のメチル化等を介して、立体障害をもたらすために、ヌクレオチドおよび／または鋳型鎖を官能基化することにより、ヌクレオチドが核酸鎖へと組み込まれる比率を減少させても良い。一部の例において、当該比率は、メチル化ヌクレオチドを組み込むことにより減少される。
ある態様において、検出電極に隣接する膜のナノ細孔を用いて核酸試料を配列決定する方法には、（ａ）タグ化されたヌクレオチドを、ナノ細孔を含有する反応チャンバへと導入することであって、ここで、タグ化ヌクレオチド（複数）の個々のタグ化ヌクレオチドは、ヌクレオチドに連結されたタグを含有しており、そのタグはナノ細孔を用いて検出可能であり；（ｂ）ポリメラーゼを用いて重合反応を行い、それによりタグ化ヌクレオチド（複数）の個々のタグ化ヌクレオチドを、核酸試料由来の一本鎖核酸分子に相補的な増殖鎖へと組み込むこと；ならびに、（ｃ）ナノ細孔を用いて、個々のタグ化ヌクレオチドの組み込み時、および／または、個々のタグ化ヌクレオチドの組み込みの間に、個々のタグ化ヌクレオチドに結合したタグを検出することであって、ここで、当該タグは、ヌクレオチドがポリメラーゼと結合しているときに、ナノ細孔を用いて検出される、ことを含む。
一部の実施態様において、タグは、ポリメラーゼに結合している間、複数回検出される。
一部の実施態様において、電極は、タグ検出期間の間に再充電される。
一部の実施態様において、当該方法は、組み込まれたタグ化ヌクレオチドと組み込まれていないタグヌクレオチドを、タグ化ヌクレオチドがナノ細孔により検出される時間の長さに基づいて識別する。
一部の実施態様において、組み込まれたタグ化ヌクレオチドがナノ細孔により検出される時間と、組み込まれていないタグ化ヌクレオチドがナノ細孔により検出される時間の比率は、少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１０００、または、１０，０００である。
一部の実施態様において、組み込まれたヌクレオチドと結合したタグが、ナノ細孔と相互作用する（および、ナノ細孔を用いて検出される）期間と、組み込まれていないヌクレオチドと結合したタグがナノ細孔と相互作用する期間の比率は、少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１０００、または、１０，０００である。
一部の実施態様において、ヌクレオチドは、少なくとも約１ミリ秒の平均（ａｖｅｒａｇｅまたはｍｅａｎ）期間の間、ポリメラーゼと結合する。
一部の実施態様において、タグ化ヌクレオチドは、当該ヌクレオチドがポリメラーゼと結合しない場合、１ミリ秒（ｍｓ）未満でナノ細孔を通り過ぎる。
一部の実施態様において、タグは、ナノ細孔により検出可能となるように選択された長さを有する。
一部の実施態様において、第一のタグ化ヌクレオチドの組み込みは、第二のタグ化ヌクレオチドと結合したタグのナノ細孔検出を干渉しない。
一部の実施態様において、第一のタグ化ヌクレオチドと結合したタグのナノ細孔検出は、第二のタグ化ヌクレオチドの組み込みを干渉しない。
一部の実施態様において、ナノ細孔は、組み込まれたタグ化ヌクレオオチドと、組み込まれていないタグヌクレオチドを、少なくとも９５％の精度で識別することができる。
一部の実施態様において、ナノ細孔は、組み込まれたタグ化ヌクレオオチドと、組み込まれていないタグヌクレオチドを、少なくとも９９％の精度で識別することができる。
一部の実施態様において、個々のタグ化ヌクレオチドと結合したタグは、当該タグが個々のタグ化ヌクレオチドから放出されるときに検出される。
ある態様において、検出電極に隣接する膜のナノ細孔を用いて核酸試料を配列決定する方法には、（ａ）タグ化されたヌクレオチドを、ナノ細孔を含有する反応チャンバへと導入することであって、ここで、タグ化ヌクレオチド（複数）の個々のタグ化ヌクレオチドは、ヌクレオチドに連結されたタグを含有しており、そのタグはナノ細孔を用いて検出可能であり；（ｂ）酵素を用いて、タグ化ヌクレオチド（複数）の個々のタグ化ヌクレオチドを、核酸試料由来の一本鎖核酸分子に相補的な増殖鎖へと組みこむこと；および、（ｃ）個々のタグ化ヌクレオチドの組み込みの間に、ナノ細孔を用いて、個々のタグ化ヌクレオチドと結合したタグを、組み込まれていない１以上の個々のタグ化ヌクレオチドと結合した１以上のタグから識別すること、が含まれる。
一部の実施態様において、当該酵素は、核酸ポリメラーゼ、または、鋳型ポリマーに基づいて、新たに合成鎖を伸長しうる任意の酵素である。
一部の実施態様において、（ｂ）において組み込まれた個々のタグ化ヌクレオチドは、（ｂ）において組み込まれた個々のタグ化ヌクレオチドおよび組み込まれていない個々のタグ化ヌクレオチドがナノ細孔を用いて検出される時間の長さ、および／または、時間の比率に基づいて、組み込まれていない個々のタグ化ヌクレオチドから識別される。
ある態様において、膜のナノ細孔を用いた核酸の配列決定方法には、（ａ）タグ化ヌクレオチドを、ナノ細孔を含有する反応チャンバへと導入することであって、ここで、タグ化ヌクレオチドの個々のタグ化ヌクレオチドは、ナノ細孔により検出することができるタグを含有しており；（ｂ）タグ化ヌクレオチドを増殖核酸鎖へと組み込むことであって、ここで、タグ化ヌクレオチド（複数）の個々のタグ化ヌクレオチドと結合するタグは、組み込みの間、ナノ細孔の少なくとも一部の中に存在する、または少なくとも一部に近接し、ここで、組み込まれたタグ化ヌクレオチドがナノ細孔により検出される時間と、組み込まれていないタグがナノ細孔により検出される時間の比率は、少なくとも、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０００、１０，０００であり；および（ｃ）ナノ細孔を用いてタグを検出すること、が含まれる。
一部の実施態様において、組み込まれたタグ化ヌクレオチドがナノ細孔により検出される時間と、組み込まれていないタグがナノ細孔により検出される時間の比率は、少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０００、または１０，０００である。
一部の実施態様において、タグは、ヌクレオチドの組み込みで、個々のヌクレオチドとの結合を維持している。
一部の実施態様において、個々のヌクレオチドと結合したタグは、ヌクレオチドの組み込みで、放出される。
一部の実施態様において、当該方法はさらに、ナノ細孔からタグを排出することを含む。
一部の実施態様において、タグは、タグがナノ細孔に入った方向と逆の方向に排出される。
一部の実施態様において、タグは、少なくとも約１００ｍｓの間、ナノ細孔に存在する。
一部の実施態様において、タグは、少なくとも約１０ｍｓの間、ナノ細孔に存在する。
一部の実施態様において、タグは、少なくとも約１ｍｓの間、ナノ細孔に存在する。
一部の実施態様において、タグ化ヌクレオチドは、最大でも約１ヌクレオチド／秒の速度で組み込まれる。
一部の実施態様において、ナノ細孔は、電圧パルスとともにタグ分子を排出する。
一部の実施態様において、タグ分子は、少なくとも９９％、電圧パルスと共に排出される可能性がある。
一部の実施態様において、ナノ細孔は、２つのタグ分子が同時にナノ細孔に存在しないように、期間内に、タグ分子を排出する。
一部の実施態様において、ナノ細孔は、当該ナノ細孔中に２つのタグ分子が同時に存在する可能性が、最大で１％であるように、期間内にタグ分子を排出する。
一部の実施態様において、タグは、約１．４ｎｍ未満の直径を有する。
一部の実施態様において、組み込まれたタグ化ヌクレオチドと結合した各タグは、タグが当該ヌクレオチドに付着している間に、ナノ細孔を用いて検出される。
一部の実施態様において、個々のタグ化ヌクレオチドと結合したタグは、タグが個々のタグ化ヌクレオチドから排出されるときに検出される。
ある態様において、核酸試料を配列決定するためのチップは、複数のナノ細孔を含有し、当該複数のナノ細孔は、電極に隣接または近接して配置された膜に少なくとも１つのナノ細孔を有し、ここで、各ナノ細孔は、タグ化ヌクレオチドが増殖核酸鎖に組み込まれる間に個々のタグ化ヌクレオチドと結合したタグを検出する。一部の実施態様において、ナノ細孔は、個々にアドレス可能である。
一部の実施態様において、個々のナノ細孔は、ナノ細孔をタグが次に通り抜ける間、または、ナノ細孔に隣接してタグが次に通る間に、前記ヌクレオチドに結合したタグを検出する。
一部の実施態様において、チップは、平方ミリメートル当たり、個々にアドレス可能な電極を少なくとも５００含有する。一部の実施態様において、チップは、平方ミリメートル当たり、個々にアドレス可能な電極を少なくとも５０含有する。
一部の実施態様において、チップは、組み込まれたタグ化ヌクレオチドと、組み込まれていないタグヌクレオチドを、タグ化ヌクレオチドがナノ細孔により検出される時間の長さに少なくとも部分的に基づいて、識別する。
一部の実施態様において、組み込まれたタグ化ヌクレオチドがナノ細孔により検出される時間と、組み込まれていないタグがナノ細孔により検出される時間の比率は、少なくとも約１．５である。
一部の実施態様において、第一のタグ化ヌクレオチドの組み込みは、第二のタグ化ヌクレオチドと結合したタグのナノ細孔検出を干渉しない。
一部の実施態様において、第一のタグ化ヌクレオチドと結合したタグのナノ細孔検出は、第二のタグ化ヌクレオチドの組み込みを干渉しない。
一部の実施態様において、ナノ細孔は、組み込まれたタグ化ヌクレオチドと、組み込まれていないタグヌクレオチドを、少なくとも９５％の精度で識別することができる。
一部の実施態様において、ナノ細孔は、組み込まれたタグ化ヌクレオチドと、組み込まれていないタグヌクレオチドを、少なくとも９９％の精度で識別することができる。
一部の実施態様において、電極は、集積回路の一部である。
一部の実施態様において、電極は、集積回路に連結されている。
一部の実施態様において、組み込まれたタグに結合した各タグは、タグが当該ヌクレオチドに付着している間に、ナノ細孔を用いて検出される。
一部の実施態様において、個々のタグ化ヌクレオチドと結合したタグは、個々のタグ化ヌクレオチドからタグが放出される際に検出される。
ある態様において、核酸試料を配列決定するためのチップには：複数のナノ細孔が含まれ、ここで、当該複数のナノ細孔は、電極に隣接して配置された膜のナノ細孔を少なくとも１つ含有し、ここで、各ナノ細孔は、タグ種を含有する核酸分子が増殖核酸鎖に組み込まれる間、または、タグ種を含有する核酸分子が増殖核酸鎖へ組み込まれる際、タグ種を検出することができ、ここで、組み込まれたタグ化ヌクレオチドがナノ細孔により検出される時間と、組み込まれていないタグがナノ細孔により検出される時間の比率は、少なくとも約１．５である。一部の実施態様において、複数のナノ細孔は、個々にアドレス可能である。
一部の実施態様において、タグ種は、組み込みで、ナノ細孔を通過しない。
一部の実施態様において、チップは、ナノ細孔からタグ種が排出されるように構成される。
一部の実施態様において、ナノ細孔は、電圧パルスと共にタグ種を排出する。
一部の実施態様において、電極は、集積回路の一部である。
一部の実施態様において、電極は、修正回路に連結されている。
一部の実施態様において、組み込まれたタグ化ヌクレオチドと結合した各タグは、当該タグがヌクレオチドに付着される間に、ナノ細孔を用いて検出される。
一部の実施態様において、核酸分子のタグ種は、当該核酸分子から放出されているタグ種を用いずに、検出される。
ある態様において、核酸試料を配列決定するためのシステムには、：（ａ）１以上のナノ細孔デバイスを含有するチップが含まれ、１以上のナノ細孔デバイスのそれぞれは、電極に隣接している膜にナノ細孔を含有し、ここで、ナノ細孔デバイスは、ポリメラーゼによるタグ化ヌクレオチドの組み込みの間に、個々のタグ化ヌクレオチドに結合したタグを検出し；および、（ｂ）チップに連結されたプロセッサが含まれ、ここで、当該プロセッサは、ナノ細孔デバイスから受け取った電気信号に基づいた、核酸試料の核酸配列の特徴付けを支援するようにプログラムされている。
一部の実施態様において、ナノ細孔デバイスは、ナノ細孔を通る、または隣接するタグの次なる進行の間に、個々のタグ化ヌクレオチドに結合したタグを検出する。
一部の実施態様において、ナノ細孔デバイスは、個々にアドレス可能なナノ細孔を含有する。
一部の実施態様において、チップは、平方ミリメートル当たり、少なくとも５００の個々にアドレス可能な電極を含有する。一部の実施態様において、チップは、平方ミリメートル当たり、少なくとも５０の個々にアドレス可能な電極を含有する。
一部の実施態様において、チップは、組み込まれたタグ化ヌクレオチドと、組み込まれていないタグヌクレオチドを、タグ化ヌクレオチドがナノ細孔により検出される時間の長さに少なくとも部分的に基づいて、識別する。
一部の実施態様において、組み込まれたタグ化ヌクレオチドがナノ細孔により検出される時間と、組み込まれていないタグがナノ細孔により検出される時間の比率は、少なくとも約１．５である。
一部の実施態様において、第一のタグ化ヌクレオチドの組み込みは、第二のタグ化ヌクレオチドと結合したタグのナノ細孔検出に干渉しない。
一部の実施態様において、第一のタグ化ヌクレオチドと結合したタグのナノ細孔検出は、第二のタグ化ヌクレオチドの組み込みに干渉しない。
一部の実施態様において、ナノ細孔は、組み込まれたタグ化ヌクレオチドと、組み込まれていないタグ化ヌクレオチドを、少なくとも９５％の精度で識別することができる。
一部の実施態様において、ナノ細孔は、組み込まれたタグ化ヌクレオチドと、組み込まれていないタグ化ヌクレオチドを、少なくとも９９％の精度で識別することができる。
一部の実施態様において、電極は、集積回路の一部である。
一部の実施態様において、電極は、集積回路に連結されている。
一部の実施態様において、組み込まれたタグ化ヌクレオチドに結合した各タグは、タグがヌクレオチドに付着している間に、ナノ細孔を用いて検出される。
一部の実施態様において、個々のタグ化ヌクレオチドに結合したタグは、個々のタグ化ヌクレオチドからタグが放出される際に検出される。
一部の実施態様において、タグは、所与の駆動力（たとえば、ナノ細孔、またはナノ細孔を含有する膜に適用された電位（Ｖ＋）等）を用いて、ナノ細孔の少なくとも一部へと向かう、または通過する。タグは、ナノ細孔の開口部からナノ細孔へと向かっても良い。次いで、駆動力を逆転させ（たとえば、反対の極性の電位を適用させる、またはＶ−等）、開口部を通して、ナノ細孔からタグの少なくとも一部を排出させても良い。次いで、駆動力を再度適用し（たとえば、Ｖ＋）、開口部を通して、タグの少なくとも一部をナノ細孔へと向かわせても良い。あるいは、タグの極性を反転させ、Ｖ−、Ｖ＋およびＶ−を含む、一連の電位を用いても良い。これにより、ナノ細孔を用いてタグを検出することができる期間を延長することができる。
一部の実施態様において、ナノ細孔において、ヌクレオチドと結合したタグが、他の方向（たとえば、孔の外側へ）よりも１つの方向（たとえば、孔の中側へ）に、より動くようなエネルギー景観をもたらすように、ナノ細孔および／またはタグが構成される。
一部の実施態様において、鋳型試料鎖中の修飾塩基（たとえば、メチル化）の検出は、ヌクレオチドタグのヌクレオチド部分が新たに合成された鎖に組み込まれる間に、および／または、組み込みで、ポリメラーゼと結合する間に、タグ化ヌクレオチドのタグがナノ細孔により検出される時間における差異により検出されても良い。一部の例において、試料配列の反対側のヌクレオチドが、メチル化されたヌクレオチドである場合、非メチル化ヌクレオチドと比較して、ヌクレオチドタグが酵素と結合している時間はより長くなる。
本明細書に記述されるタグ化ヌクレオチドの例は、開裂可能なタグで修飾された任意の天然型ヌクレオチド、または開裂可能なタグで修飾された、合成の非天然型ヌクレオチドアナログであっても良い。たとえば、開裂可能なタグまたは開裂できないタグで修飾されたユニバーサル塩基を用いて、試料鎖における塩基の数を単純に数えてもよい。
本明細書に記述されるタグ化ヌクレオチドの例は、二量体ヌクレオチド、または、二量体ユニットとして伸長することができる二量体ヌクレオチドアナログであっても良く、および、当該タグは、ポリメラーゼ酵素と結合した時間、および、ナノ細孔デバイスにより検出されたシグナルレベルに基づいて、二量体ヌクレオチドの混合二量体の組成を報告するものである。
タグが酵素と結合している時間を用いて、組み込まれたヌクレオチドと組み込まれていないヌクレオチドを識別することができる一方、ナノ細孔におけるタグの、印加電圧または、可変印加電圧に対するユニークな電流レベルおよび／または電気的応答によって、異なるヌクレオチドと結合したタグを識別することができる。
ある態様において、核酸を配列決定する方法には、ナノ細孔および検出電極に近接した回路へ交流電流（ＡＣ）の波形を適用させることが含まれ、ここで、鋳型核酸鎖に対して相補的な増殖核酸鎖へと組み込まれているヌクレオチドと結合したタグは、波形が第一の極性を有している際に検出され、および、電極は、波形が第二の極性を有している際に再充電される。
他の態様において、核酸分子を配列決定する方法には、（ａ）１以上のタグ化ヌクレオチドを電極に隣接する膜のナノ細孔に導入すること；（ｂ）前記１以上のタグ化ヌクレオチドの個々のタグ化ヌクレオチドを、前記核酸分子に相補的な鎖へと組み込むこと；および、（ｃ）前記タグ化ヌクレオチドと結合したタグを、前記電極に適用した交流電流（ＡＣ）波形を用いて、１回以上検出することであって、ここで、前記タグは、前記タグが前記鎖へと組み込まれた前記個々のタグ化ヌクレオチドに付着されている間に検出されること、が含まれる。
一部の実施態様において、波形は、電極が少なくとも約１秒、１０秒、３０秒、１分、１０分、２０分、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、２４時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週、２週、３週、または１か月の期間にわたり枯渇することがないものである。
一部の実施態様において、タグの同一性は、測定電流と、様々な電圧での波形により適用された電圧の間の関係性により測定される。
一部の実施態様において、ヌクレオチドは、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、ウラシル（Ｕ）、またはそれらの任意の誘導体を含有する。
一部の実施態様において、鋳型核酸鎖の塩基のメチル化は、当該塩基がメチル化されていないときよりも、メチル化されているときに、タグがより長い期間、検出されていることにより測定される。
ある態様において、検出電極に隣接した膜のナノ細孔を用いた、核酸またはその断片の長さの測定方法は、（ａ）前記ナノ細孔を含有する反応チャンバへとタグ化ヌクレオチドを導入することであって、ここで、少なくとも２つの異なる塩基を有するヌクレオチドは、ヌクレオチドに連結された同じタグを含有し、そのタグは、前記ナノ細孔を用いて検出することができ；（ｂ）ポリメラーゼを用いて重合反応を行い、それにより前記タグ化ヌクレオチド（複数）の個々のタグ化ヌクレオチドを、前記核酸試料由来の一本鎖核酸分子に相補的な増殖鎖へと組み込むこと；および、（ｃ）前記ナノ細孔を用いて、前記個々のタグ化ヌクレオチドの組み込みの間、または組込みの後に、前記個々のタグ化ヌクレオチドに結合したタグを検出すること、を含む。
ある態様において、検出電極に隣接した膜のナノ細孔を用いた、核酸またはその断片の長さの測定方法は、（ａ）前記ナノ細孔を含有する反応チャンバへとタグ化ヌクレオチドを導入することであって、ここで、前記タグ化ヌクレオチド（複数）の個々のタグ化ヌクレオチドは、ヌクレオチドに連結されたタグを含有し、そのタグは、タグが存在しない場合の電流と比較して、前記ナノ細孔を通る電流の強さを減少させることができるものであり；（ｂ）ポリメラーゼを用いて重合反応を行い、それにより、前記核酸試料由来の一本鎖核酸分子に相補的な増殖鎖に前記タグ化ヌクレオチド（複数）の個々のタグ化ヌクレオチドを組込み、前記ナノ細孔を通る電流の強さを減少させること；および（ｃ）ナノ細孔を用いて、前記個々のタグ化ヌクレオチドの組み込みの間の時間を検出すること、を含む。一部の実施態様において、前記ナノ細孔を通る電流の強さは、前記個々のタグ化ヌクレオチドの組込みの間の期間の間に、最大電流の少なくとも８０％にまで戻る。
一部の実施態様において、全てのヌクレオチドが、当該ヌクレオチドに連結された同じタグを有する。一部の実施態様において、ヌクレオチドの少なくとも一部が、当該ヌクレオチドを特定するタグを有する。一部の実施態様において、ヌクレオチドの最大２０％が、当該ヌクレオチドを特定するタグを有する。一部の実施態様において、ヌクレオチドのすべてが、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、および／または、ウラシル（Ｕ）であるとして特定される。一部の実施態様において、核酸またはその断片のすべてが、Ｓｈｏｒｔ Ｔａｎｄｅｍ Ｒｅｐｅａｔ（ＳＴＲ）である。
ある態様において、複数のサブユニットを有するタンパク質のアセンブリの方法には、（ａ）複数の第一のサブユニットを導入すること；（ｂ）複数の第二のサブユニットを導入することであって、ここで、第二のサブユニットは、第一のサブユニットに対して改変されており；（ｃ）第一のサブユニットと第二のサブユニットを、第一のサブユニットと第二のサブユニットを有する複数のタンパク質が形成されるような第一の比率で接触させ、ここで、当該複数のタンパク質は、第一のサブユニットと第二のサブユニットの比率を複数有するものであり；および（ｄ）第一のサブユニットと第二のサブユニットの第二の比率を有するタンパク質を富化するよう、当該複数のタンパク質を分画化し、ここで、第二の比率は、１第二のサブユニット／（ｎ−１）第一のサブユニットであり、ここで、「ｎ」は、当該タンパク質を含有するサブユニットの数である。
一部の実施態様において、タンパク質は、ナノ細孔である。
一部の実施態様において、ナノ細孔は、α溶血素に対し、少なくとも８０％の相同性である。
一部の実施態様において、第一のサブユニットまたは第二のサブユニットは、精製タグを含有している。
一部の実施態様において、精製タグは、ポリヒスチジンタグである。
一部の実施態様において、分画は、イオン交換クロマトグラフィーを用いて行われる。
一部の実施態様において、第二の比率は、１第二のサブユニット／６第一のサブユニットである。
一部の実施態様において、第二の比率は、２第二のサブユニット／５第一のサブユニットであり、１つのポリメラーゼが、第二のサブユニットのそれぞれに付着している。
一部の実施態様において、第二のサブユニットは、化学的に反応性な部分を含有し、当該方法はさらに、（ｅ）当該化学的に反応性な部分に実体を付着させるための反応を行うことを含む。
一部の実施態様において、タンパク質はナノ細孔であり、実体はポリメラーゼである。
一部の実施態様において、第一のサブユニットは野生型である。
一部の実施態様において、第一のサブユニットおよび／または第二のサブユニットは、組換え体である。
一部の実施態様において、第一の比率は、第二の比率に大よそ等しい。
一部の実施態様において、第一の比率は、第二の比率よりも大きい。
一部の実施態様において、当該方法にはさらに、第二の比率のサブユニットを有するタンパク質を二重層へと挿入することを含む。
一部の実施態様において、当該方法はさらに、第二の比率のサブユニットを有するタンパク質を用いて核酸分子を配列決定することを含む。
他の態様において、ナノ細孔は、複数のサブユニットを含み、ここで、ポリメラーゼは、サブユニットのうちの１つに付着されており、および、少なくとも１つのサブユニットおよびすべてではないサブユニットは、第一の精製タグを含有する。
一部の実施態様において、ナノ細孔は、α溶血素に対し少なくとも８０％の相同性である。
一部の実施態様において、すべてのサブユニットは、第一の精製タグまたは第二の精製タグを含有する。
一部の実施態様において、第一の精製タグは、ポリヒスチジンタグである。
一部の実施態様において、第一の精製タグは、ポリメラーゼが付着したサブユニット上にある。
一部の実施態様において、第一の精製タグは、ポリメラーゼが付着していないサブユニット上にある。
他の態様において、検出電極に隣接した膜のナノ細孔を用いて核酸試料を配列決定するための方法は、（ａ）前記ナノ細孔を含有する反応チャンバにタグ化ヌクレオチドを導入することであって、ここで、前記タグ化ヌクレオチド（複数）の個々のタグ化ヌクレオチドは、ヌクレオチドに連結されたタグを含有し、そのタグは、前記ナノ細孔を用いて検出可能であり；（ｂ）ポリメラーゼを用いて重合反応を行うことであって、それにより、前記タグ化ヌクレオチド（複数）の個々のタグ化ヌクレオチドが、前記核酸試料由来の一本鎖核酸分子に相補的な増殖鎖へと組み込まれ；（ｃ）ナノ細孔を用いて、前記個々のタグ化ヌクレオチドが組み込まれている間に、前記個々のタグ化ヌクレオチドと結合したタグを検出することであって、ここで、前記タグは、前記ヌクレオチドが前記ポリメラーゼに結合しているときに前記ナノ細孔を用いて検出され、および、前記検出することには、（ｉ）前記ナノ細孔全体に印加電圧を与えること、および（ｉｉ）前記印加電圧での、前記検出電極との電流を測定すること、が含まれ；ならびに（ｄ）前記印加電圧を較正すること、を含む。
一部の実施態様において、前記較正には、（ｉ）前記タグ分子に対する複数の脱出電圧を測定すること、（ｉｉ）測定された脱出電圧と基準点の間の差異をコンピューターにより計算すること、および（ｉｉｉ）算出された差異により印加電圧を変えること、が含まれる。
一部の実施態様において、時間に対する、予測脱出電圧の分布が、推測される。
一部の実施態様において、基準点は、測定された脱出電圧の平均またはメジアンである。
一部の実施態様において、当該方法は、予測脱出電圧分布における、検出変動を除去する。
一部の実施態様において、当該方法は、検出電極にそれぞれ隣接した、個々にアドレス可能な複数のナノ細孔上で行われる。
一部の実施態様において、印加電圧は経時的に減少する。
一部の実施態様において、ナノ細孔におけるタグの存在により、印加電圧で検出電極を用いて測定された電流が減少する。
一部の実施態様において、タグ化ヌクレオチドは、複数の異なるタグを含有し、および、当該方法は、複数の異なるタグのそれぞれを検出する。
一部の実施態様において、工程（ａ）〜（ｃ）の実行と比較した際、当該方法の精度は（ｄ）により増加する。
一部の実施態様において、（ｄ）は、電気化学的条件における経時的な変化を補正する。
一部の実施態様において、（ｄ）は、複数のナノ細孔を有するデバイスにおける、異なる電気化学的条件を有する異なるナノ細孔に対して補正する。
一部の実施態様において、（ｄ）は、当該方法の遂行それぞれに対する異なる電気化学的条件を補正する。
一部の実施態様において、当該方法はさらに、（ｅ）電流利得における変動、および／または、電流オフセットにおける変動を較正すること、を含む。
一部の実施態様において、前記タグは、前記ポリメラーゼが結合している間、複数の時点で検出される。
一部の実施態様において、電極は、タグ検出期間の間に再充電される。
一部の実施態様において、当該方法は、組み込まれたタグ化ヌクレオチドと、組み込まれていないタグヌクレオチド間を、前記タグ化ヌクレオチドが前記ナノ細孔により検出される時間の長さに基づいて識別する。
他の態様において、検出電極に隣接した膜のナノ細孔を用いた、核酸試料を配列決定する方法は、（ａ）核酸試料から反復核酸配列を除去し、配列決定のために一本鎖核酸分子をもたらすこと；（ｂ）タグ化ヌクレオチドを、前記ナノ細孔を含有する反応チャンバへと導入することであって、ここで、前記タグ化ヌクレオチド（複数）の個々のタグ化ヌクレオチドは、ヌクレオチドに連結されたタグを含有し、そのタグは、前記ナノ細孔を用いて検出可能であり；（ｃ）ポリメラーゼを用いて重合反応を実行することであって、それにより、前記タグ化ヌクレオチド（複数）の個々のタグ化ヌクレオチドを一本鎖核酸分子に相補的な増殖鎖へと組み込むことであって；および、（ｄ）ナノ細孔を用いて、前記個々のタグ化ヌクレオチドの組み込みの間に、前記個々のタグ化ヌクレオチドと結合したタグを検出することであって、ここで、前記タグは、前記ヌクレオチドが前記ポリメラーゼと結合しているときに、前記ナノ細孔を用いて検出される、ことを含む。
一部の実施態様において、反復核酸配列は、少なくとも２０の連続的な核酸塩基を含有する。
一部の実施態様において、反復核酸配列は、少なくとも２００の連続的な核酸塩基を含有する。
一部の実施態様において、反復核酸配列は、少なくとも２０の連続的な反復された核酸塩基のサブユニットを含有する。
一部の実施態様において、反復核酸配列は、少なくとも２００の連続的な反復された核酸塩基のサブユニットを含有する。
一部の実施態様において、反復核酸配列は、当該反復核酸配列に相補的な核酸配列とハイブリダイゼーションされることにより除去される。
一部の実施態様において、反復核酸配列に相補的な核酸配列は、固形支持体上に固定される。
一部の実施態様において、固形支持体は、表面である。
一部の実施態様において、固形支持体はビーズである。
一部の実施態様において、反復核酸配列に相補的な核酸配列は、Ｃｏｔ−１ＤＮＡを含有する。
一部の実施態様において、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡは、約５０〜約１００核酸塩基の間の長さを有する反復核酸配列において富化される。
他の態様において、検出電極に隣接した膜のナノ細孔を用いた核酸試料を配列決定するための方法には、（ａ）前記ナノ細孔を含有する反応チャンバへタグ化ヌクレオチドを導入することであって、ここで、前記タグ化ヌクレオチド（複数）の個々のタグ化ヌクレオチドは、ヌクレオチドに連結されたタグを含有し、そのタグは、前記ナノ細孔を用いて検出可能であり；（ｂ）ナノ細孔へリンカーにより付着されたポリメラーゼを用いた重合反応を実行することであって、それにより、前記タグ化ヌクレオチド（複数）の個々のタグ化ヌクレオチドが、前記核酸試料由来の一本鎖核酸分子に相補的な増殖鎖へと組み込まれることであって；および（ｃ）前記ナノ細孔を用いて、前記個々のタグ化ヌクレオチドの組み込みの間に、前記個々のタグ化ヌクレオチドと結合したタグを検出することであって、ここで、前記タグは、前記ヌクレオチドが前記ポリメラーゼと結合しているときに、前記ナノ細孔を用いて検出される、ことが含まれる。
一部の実施態様において、リンカーは、可塑性がある。
一部の実施態様において、リンカーは、少なくとも５ナノメーターの長さである。
一部の実施態様において、リンカーは、直接付着しているものである。
一部の実施態様において、リンカーは、アミノ酸を含有する。
一部の実施態様において、ナノ細孔およびポリメラーゼは、１つのポリペプチドを含有する。
一部の実施態様において、リンカーは、核酸またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含有する。
一部の実施態様において、リンカーは、非共有結合を含有する。
一部の実施態様において、リンカーは、ビオチンおよびストレプトアビジンを含有する。
一部の実施態様において、（ａ）ポリメラーゼのＣ末端は、ナノ細孔のＮ末端に付着されている；（ｂ）ポリメラーゼのＣ末端は、ナノ細孔のＣ末端に付着されている；（ｃ）ポリメラーゼのＮ末端は、ナノ細孔のＮ末端に付着されている；（ｄ）ポリメラーゼのＮ末端は、ナノ細孔のＣ末端に付着されている；および、（ｅ）ポリメラーゼは、ポリメラーゼおよびナノ細孔の内の少なくとも１つが末端に付着されていない場合に、ナノ細孔に付着されている、のうちの少なくとも１つである。
一部の実施態様において、リンカーは、タグがナノ細孔を用いて検出されるよう、ポリメラーゼを、ナノ細孔に対して正しい位置に配置する。
一部の実施態様において、ポリメラーゼは２以上のリンカーによりナノ細孔に付着されている。
一部の実施態様において、リンカーは、配列番号２〜３５、または、それらから産生されるＰＣＲ産物のうちの１以上を含有する。
一部の実施態様において、リンカーは、配列番号１〜３５、またはそれらから産生されるＰＣＲ産物のうちの１以上によりコードされるペプチドを含有する。
一部の実施態様において、ナノ細孔は、α溶血素に対して少なくとも８０％相同性である。
一部の実施態様において、ポリメラーゼは、ｐｈｉ−２９に対して少なくとも８０％相同性である。
他の態様において、タグ分子は、（ａ）第一のセグメントおよび第二のセグメントを含有する第一のポリマー鎖であって、ここで、第二のセグメントは、第一のセグメントよりも狭く；および、（ｂ）２つの末端を含有する第二のポリマー鎖であって、ここで、第一の末端は、第二のセグメントに隣接する第一のポリマー鎖に取り付けられており、および、第二の末端は、第一のポリマー鎖に取り付けられておらず、ここで、当該タグ分子は、第二のポリマー鎖が第二のセグメントに隣接して並べられている、第一の方向で、ナノ細孔を通り抜けることができるものである、を含む。
一部の実施態様において、タグ分子は、第二のポリマー鎖が、第二のセグメントに隣接して並べられていない、第二の方向で、ナノ細孔を通り抜けることができない。
一部の実施態様において、第二のポリマー鎖が、第二のセグメントに隣接して並べられていない場合、第二のポリマー鎖は、第一のポリマー鎖と塩基対を形成する。
一部の実施態様において、第一のポリマー鎖は、ヌクレオチドに取り付けられている。
一部の実施態様において、第一のポリマー鎖は、ヌクレオチドが増殖核酸鎖へ組み込まれているときに、ヌクレオチドから放出される。
一部の実施態様において、第一のポリマー鎖は、ヌクレオチドの末端リン酸塩に取り付けられている。
一部の実施態様において、第一のポリマー鎖は、ヌクレオチドを含有する。
一部の実施態様において、第二のセグメントは、基本的なヌクレオチドを含有する。
一部の実施態様において、第二のセグメントは、炭素鎖を含有する。
他の態様において、検出電極に隣接した膜のナノ細孔を用いた核酸試料を配列決定する方法は、（ａ）前記ナノ細孔を含有する反応チャンバへタグ化ヌクレオチドを導入することであって、ここで、前記タグ化ヌクレオチド（複数）の個々のタグ化ヌクレオチドは、ヌクレオチドに連結されたタグを含有し、そのタグは、前記ナノ細孔を用いて検出可能であり、ここで、当該タグは、（ｉ）第一のセグメントおよび第二のセグメントを含有する第一のポリマー鎖であって、ここで、第二のセグメントは第一のセグメントよりも狭く、および、（ｉｉ）２つの末端を含有する第二のポリマー鎖であって、ここで、第一の末端は第二のセグメントに隣接した第一のポリマー鎖に取り付けられており、および、第二の末端は第一のポリマー鎖に取り付けられていない、を含有し、ここで、当該タグ分子は、第二のポリマー鎖が第二のセグメントに隣接して並べられている、第一の方向でナノ細孔を通り抜けることができるものであり；（ｂ）ポリメラーゼを用いて重合反応を実行することであって、それによって、前記タグ化ヌクレオチド（複数）の個々のタグ化ヌクレオチドは、前記核酸試料由来の一本鎖核酸分子に対して相補的な増殖鎖へと組み込まれ；および、（ｃ）前記ナノ細孔を用いて、前記個々のタグ化ヌクレオチドの組み込みの間に、前記個々のタグ化ヌクレオチドに結合したタグが検出され、ここで、前記タグは、前記ヌクレオチドが前記ポリメラーゼと結合しているときに、前記ナノ細孔を用いて検出される、を含む。
一部の実施態様において、タグ分子は、第二のポリマー鎖が第二のセグメントに隣接して並べられていない、第二の方向でナノ細孔を通り抜けることができない。
一部の実施態様において、前記タグは、前記ポリメラーゼと結合している間に、複数回、検出される。
一部の実施態様において、電極は、タグ検出期間の間に再充電される。
一部の実施態様において、タグは、個々のタグ化ヌクレオチドの組み込みの間にナノ細孔に入り、および、ここで、当該タグは、電極が再充電されていない場合には、ナノ細孔を出ない。
一部の実施態様において、当該方法は、組み込まれたタグ化ヌクレオチドと、組み込まれていないタグヌクレオチドを、前記タグ化ヌクレオチドが前記ナノ細孔により検出される時間の長さに基づいて識別する。
一部の実施態様において、組み込まれたタグ化ヌクレオチドがナノ細孔により検出される時間と、組み込まれていないタグ化ヌクレオチドがナノ細孔により検出される時間の比率は、少なくとも１．５である。
他の態様において、核酸配列決定の方法は、（ａ）配列決定される一本鎖核酸を導入すること；（ｂ）複数のプローブを導入することであって、ここで、当該プローブは、（ｉ）一本鎖核酸とハイブリダイズすることができるハイブリダイゼーション部分、（ｉｉ）２つの末端の有するループ構造であって、ここで、各末端は当該ハイブリダイゼーション部分に付着されているもの、および、（ｉｉｉ）ループ構造の末端の間のハイブリダイゼーション部分に位置づけられている開裂可能な基であって、ここで、当該ループ構造は、当該ループ構造が逆の方向でナノ細孔を通り抜けることを阻害するゲートを含有する、を含有し；（ｃ）配列決定される一本鎖核酸とのハイブリダイゼーション部分のハイブリダイゼーションにより決定される順番で、複数のプローブを重合し；
開裂可能な基を開裂して、配列決定される伸長スレッドをもたらすこと；（ｄ）当該伸長スレッドがナノ細孔を通り抜けることであって、ここで、当該ゲートは、当該伸長スレッドが、逆の方向でナノ細孔を通り抜けることを阻害し；および、（ｅ）ナノ細孔を用いて、配列決定される一本鎖核酸とのハイブリダイゼーション部分のハイブリダイゼーションにより決定される順番で、伸長スレッドのループ構造を検出し、それにより、配列決定される一本鎖核酸を配列決定すること、を含む。
一部の実施態様において、ループ構造は、狭いセグメントを含有し、ゲートは、２つの末端を含有するポリマーであり、ここで、第一の末端は狭いセグメントに隣接してループ構造に取り付けられており、第二の末端はループ構造に取り付けられておらず、ここで、ループ構造は、ゲートが狭いセグメントに隣接して並べられている第一の方向で、ナノ細孔を通り抜けることができる。
一部の実施態様において、ループ構造は、ゲートが狭いセグメントに隣接して並べられていない逆の方向で、ナノ細孔を通り抜けることができない。
一部の実施態様において、ゲートは、ゲートが狭いセグメントに隣接して並べられていない場合に、ループ構造と塩基対を形成する。
一部の実施態様において、ゲートはヌクレオチドを含有する。
一部の実施態様において、狭いセグメントは、基本的なヌクレオチドを含有する。
一部の実施態様において、狭いセグメントは炭素鎖を含有する。
一部の実施態様において、電極は、検出期間の間に再充電される。
一部の実施態様において、伸長スレッドは、電極が再充電されている場合、逆の方向でナノ細孔を通り抜けない。
本発明のさらなる態様および利点が、以下の詳述から当業者には明らかであり、本開示の解説的な実施態様のみが示され、記述される。理解されるように、本開示は、他の異なる実施態様を包含するものであり、そのいくつかの詳細は、様々な明らかな点で改変することができ、それらすべては、本開示から逸脱することは無い。ゆえに、図面および記述は、解説のためであり、限定ではないとみなされるべきである。
参照による援用
本明細書に言及されるすべての公表文献、特許および特許出願は、個々の公表文献、特許または特許出現のそれぞれが具体的におよび個々に参照により援用されると示されているのと同程度にまで、参照により本明細書に援用される。
本発明の新規特徴は、添付の特許請求の範囲に具体的に記載する。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理を利用した例示的な実施形態、および添付図面の以下の詳細な説明を参照することによって得られる。
図１は、本方法のステップを模式的に示す。 図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、ナノ細孔検出器の例を示し、図２Ａは電極上に配置されたナノ細孔を有し、図２Ｂは、ウェルの膜に挿入されたナノ細孔を有し、図２Ｃは、突起電極上にナノ細孔を有する。 同上。 同上。 図３は、装置および方法の構成要素を示す。 図４は、タグがポリメラーゼに結合している間に、放出されたタグがナノ細孔によって検出される核酸配列決定の方法を示す。 図５は、タグがヌクレオチドの組込み事象の際に放出されず、ナノ細孔によって検出される核酸配列決定の方法を示す。 図６は、ナノ細孔に短期間留まるタグによって生成される信号の例を示す。 図７は、一連のナノ細孔検出器を示す。 図８は、ナノ細孔を含むが、ウェルを含まないチップセット・アップの例を示す。 図９は、テストチップセル配列構成の例を示す。 図１０は、セルのアナログ回路の例を示す。 図１１は、超小型の測定回路の例を示す。 図１２は、超小型の測定回路の例を示す。 図１３は、ヌクレオチドのリン酸に結合されるタグ分子の例を示す。 図１４は、代替タグの位置の例を示す。 図１５は、検出可能なＴＡＧ−ポリリン酸塩と検出可能なＴＡＧを示す。 図１６は、シーケンサーを制御するように構成されたコンピュータシステムを示す。 図１７は、溶血素のナノ細孔へのｐｈｉ２９ポリメラーゼのドッキングを示す。 図１８は、２つの限定的な運動ステップを示すポリメラーゼの滞留時間の確率密度を示す。 図１９は、検出回路により近いナノ細孔の側で結合パートナーと結合するタグを示す。 図２０は、ナノ細孔から流出するよりも簡単にナノ細孔を通って流れる逆とげのあるタグを示す。 図２１は、波形の例を示す。 図２２は、４つの核酸塩基のアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびチミン（Ｔ）について、印加電圧に対する抽出された信号のプロットを示す。 図２３は、４つの核酸塩基のアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびチミン（Ｔ）を複数回実行するための、抽出された信号対印加電圧のプロットを示す。 図２４は、４つの核酸塩基のアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびチミン（Ｔ）を複数回実行するための、パーセント基準の導電性の差（％ＲＣＤ）対印加電圧のプロットを示す。 図２５は、核酸ポリメラーゼの進行を遅らせるためのオリゴヌクレオチドスピードバンプの使用を示す。 図２６は、ポリメラーゼの他に、ヘリカーゼまたは核酸結合タンパク質等の第二の酵素またはタンパク質の使用を示す。 図２７は、修正されたサブユニットの規定の数を有する多量体タンパク質を形成する方法の例を示す。 図２８は、修正されたサブユニットの異なる数の分布を有する複数のナノ細孔を分画する例を示す。 図２９は、修正されたサブユニットの異なる数の分布を有する複数のナノ細孔を分画する例を示す。 図３０は、印加電圧の較正の例を示す。 図３１は、ゲートを有するタグ付きヌクレオチドの例を示す。 図３２は、ゲートを有するタグ付きヌクレオチドを用いて核酸配列の例を示す。 図３３は、ｅｘｐａｎｄａｍｅｒ配列決定に使用するためのプローブの例を示す。 図３４は、重合されたｅｘｐａｎｄａｍｅｒプローブの例を示す。 図３５は、配列決定される拡張されたスレッドを提供するために切断可能な基を切断する例を示す。 図３６は、ナノ細孔を通って拡張されたスレッドを通す例を示す。 図３７は、非ファラデー伝導の例を示す。 図３８は、２つのタグ分子の捕獲の例を示す。 図３９は、配列決定された核酸、タグ付けされたヌクレオチド、およびナノ細孔とポリメラーゼとの融合の間で形成された三元複合体の例を示す。 図４０は、タグ付けされたヌクレオチドの存在なしに、ナノ細孔を通って流れる電流の例を示す。 図４１は、異なるタグ付けされたヌクレオチドを区別するために電流レベルを用いた例を示す。 図４２は、異なるタグ付けされたヌクレオチドを区別するために電流レベルを用いた例を示す。 図４３は、異なるタグ付けされたヌクレオチドを区別するために電流レベルを用いた例を示す。 図４４は、タグ付けされたヌクレオチドを用いて核酸分子を配列決定する電流レベルを用いた例を示す。 図４５は、タグ付けされたヌクレオチドを用いて核酸分子を配列決定する電流レベルを用いた例を示す。 図４６は、タグ付けされたヌクレオチドを用いて核酸分子を配列決定する電流レベルを用いた例を示す。 図４７は、タグ付けされたヌクレオチドを用いて核酸分子を配列決定する電流レベルを用いた例を示す。
本発明の様々な実施態様が本明細書に示され、および記述されるが、当業者には、そのような実施態様が例示の目的でのみ提示されていることが明らかである。多くの変更、変化、置換が、本発明から逸脱することなく当業者により為されうる。本明細書に記述される本発明の実施態様に対する様々な変更が行われうることを理解されたい。
本明細書において、「ナノ細孔」という用語は、通常、膜にもたらされる、または形成される、孔、チャンネル、または通路を指す。膜は、たとえば脂質二重層等の有機膜、または、たとえばポリマー物質で形成された膜等の合成膜であっても良い。膜は、ポリマー物質であっても良い。ナノ細孔は、検出回路、または検出回路（たとえば、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）回路、または、電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）回路等）に連結された電極に隣接して、または近接して配置されても良い。一部の例において、ナノ細孔は、０．１ナノメーター（ｎｍ）から約１０００ｎｍの位数の、特徴的な幅または直径を有する。一部のナノ細孔は、タンパク質である。α溶血素は、タンパク質ナノ細孔の例である。
本明細書において、「核酸」という用語は、通常、１以上の核酸サブユニットを含有する分子を指す。核酸は、アデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）またはそれらの変異体から選択される１以上のサブユニットを含有しても良い。ヌクレオチドは、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴもしくはＵ、またはそれらの変異体を含んでも良い。ヌクレオチドは、増殖核酸鎖へ組み込まれうる、任意のサブユニットを含んでも良い。そのようなサブユニットは、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴもしくはＵであってもよく、または、１以上の相補的なＡ、Ｃ、Ｇ、ＴもしくはＵに特異的である任意の他のサブユニット、または、プリン（すなわち、ＡもしくはＧ、またはそれらの変異体）もしくはピリミジン（すなわち、Ｃ、ＴもしくはＵ、またはそれらの変異体）に相補的である、任意の他のサブユニットであっても良い。サブユニットは、個々の核酸塩基または塩基の群（たとえば、ＡＡ、ＴＡ、ＡＴ、ＧＣ、ＣＧ、ＣＴ、ＴＣ、ＧＴ、ＴＧ、ＡＣ、ＣＡまたはそれらのウラシル−カウンターパート）を変換（ｒｅｓｏｌｖｅ）されるようにすることができる。一部の例において、核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）もしくはリボ核酸（ＲＮＡ）、またはそれらの誘導体である。核酸は、一本鎖または二本鎖であっても良い。
本明細書において、「ポリメラーゼ」という用語は、通常、重合反応を触媒することができる任意の酵素を指す。ポリメラーゼの例としては、限定されないが、核酸ポリメラーゼ、転写酵素、またはリガーゼが挙げられる。ポリメラーゼは、重合酵素であっても良い。
試料を配列決定するための方法およびシステム
本明細書において、１以上のナノ細孔を用いた、または活用した、核酸の配列決定のための方法、デバイスおよびシステムが開示される。当該１以上のナノ細孔は、集積回路の一部である、または集積回路に連結された、電極に近接した検出器中に、または隣接して配置された、膜（たとえば、脂質二重層）中にあっても良い。
一部の例において、ナノ細孔デバイスは、電極に近接した検出器中に、または隣接した膜中の１つのナノ細孔を含有する。他の例においては、ナノ細孔デバイスは、センサー回路または検出電極に近接した、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０００、または１０，０００のナノ細孔を含有する。１以上のナノ細孔が、個々の電極および検出集積回路、または複数の電極および検出集積回路と関連していても良い。
システムは、１以上のナノ細孔デバイスを含有する反応チャンバを含んでも良い。ナノ細孔デバイスは、個々にアドレス可能なナノ細孔デバイス（たとえば、システム中の他のナノ細孔デバイスから独立しているシグナル検出し、アウトプットを提示することができるデバイス）であっても良い。個々にアドレス可能なナノ細孔は、個々に読み取り可能であっても良い。一部の例において、個々にアドレス可能なナノ細孔は、個々に書き込み可能であっても良い。あるいは、個々にアドレス可能なナノ細孔は、個々に読み取り可能、および個々に書き込み可能であっても良い。システムには、試料調製、および、たとえば核酸配列決定等の本開示の様々な操作を促進するための１以上のコンピュータープロセッサを含んでも良い。当該プロセッサは、ナノ細孔デバイスと連結されていても良い。
ナノ細孔デバイスは、複数の個々にアドレス可能な検出電極を含んでも良い。各検出電極は、電極に隣接した膜、および当該膜中の１以上のナノ細孔を含んでも良い。
本開示の方法、デバイス、およびシステムは、たとえば、鋳型に相補的な増殖鎖へのヌクレオチドの組み込み等の、個々のヌクレオチドの組み込み事象を正確に検出しうる。酵素（たとえば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、リガーゼ等）が、増殖ポリヌクレオチド鎖へとヌクレオチドを組み込んでも良い。本明細書に提示される酵素（たとえば、ポリメラーゼ）は、ポリマー鎖を生成することができる。
追加のヌクレオチドは、増殖鎖にハイブリダイズされる（たとえば、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ））、対応する鋳型核酸鎖に相補的であっても良い。ヌクレオチドは、限定されないが、ヌクレオチドのリン酸塩（たとえば、ガンマリン酸塩）、糖部分、または窒素塩基部分を含む、ヌクレオチドの任意の位置に連結される、タグ（または、タグ種）を含有しても良い。一部の例において、タグは、ヌクレオチドタグの組み込み中、タグがポリメラーゼと結合している間に、検出される。ヌクレオチド組込み、ならびに、引き続くタグの開裂および／または放出の後に、タグがナノ細孔を通り移動するまで、タグを継続して検出しても良い。一部の例において、ヌクレオチド組込み事象により、ナノ細孔を通り抜け、検出されるヌクレオチドからタグが放出される。タグは、ポリメラーゼにより放出されても良く、または、限定されないが、ポリメラーゼの近くに位置する酵素による開裂等を含む、任意の適切な方法で、開裂／放出されても良い。この方法において、組み込まれた塩基は、ヌクレオチド（すなわち、アデニン、シトシン、グアニン、チミンまたはウラシル）の各タイプからユニークなタグが放出されることにより、特定されても良い（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵ）。一部の場合において、ヌクレオチド組込み事象はタグを放出しない。そのような場合において、組み込まれたヌクレオチドに連結されたタグは、ナノ細孔を用いて検出される。一部の例において、タグは、ナノ細孔を通り、または近接して移動し、および、ナノ細孔を用いて検出されてもよい。
本開示の方法およびシステムは、たとえば、所与の期間内に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、５００、１０００、５０００、１００００、５００００、または、１０００００核酸塩基（塩基）の変換等の、核酸組込み事象の検出を行うことができる。一部の例において、ナノ細孔デバイスを用いて、個々の核酸組込み事象を、各事象を個々の核酸塩基と関連させながら、検出する。他の例においては、ナノ細孔デバイスを用いて、複数の塩基と関連している事象を検出する。たとえば、ナノ細孔デバイスにより検出されたシグナルは、少なくとも２、３、４または５塩基由来の混合シグナルであっても良い。
一部の例において、タグは、ナノ細孔を通過しない。タグは、ナノ細孔により検出されても良く、および、ナノ細孔を通過することなく、ナノ細孔を出ても良い（たとえば、ナノ細孔にタグが入った方向と逆の方向から出る）。ナノ細孔からタグを能動的に排出するようにチップを構成しても良い。
一部の例において、タグは、ヌクレオチド組込み事象で放出されない。一部の例において、ヌクレオチド組込み事象は、ナノ細孔にタグを「提示」する（すなわち、タグを放出しない）。タグは、放出されることなく、ナノ細孔により検出されても良い。タグは、タグを検出のためにナノ細孔に提示する十分な長さのリンカーによりヌクレオチドに付着されていてもよい。
ヌクレオチド組込み事象は、リアルタイムで（すなわち、発生しながら）、ナノ細孔を用いて、検出されても良い。一部の例において、ナノ細孔に付着した、または近接した酵素（たとえば、ＤＮＡポリメラーゼ）は、ナノ細孔を通る、または隣接する核酸分子の流れを促進しても良い。ヌクレオチド組込み事象、または複数のヌクレオチドの組み込みにより、１以上のタグ種（または、本明細書において、「タグ」（複数））が放出または提示されても良く、それらは、ナノ細孔により検出されても良い。検出は、タグがナノ細孔を通り流れながら、もしくは隣接して流れながら、ナノ細孔にタグが存在しながら、および／または、タグがナノ細孔に提示されながら、為されても良い。一部の例において、ナノ細孔に付着された、または近接した酵素は、１以上のヌクレオチドの組み込みでのタグの検出を補助してもよい。
本開示のタグは、原子もしくは分子、または原子もしくは分子の集まりであっても良い。タグは、光学的、電気化学的、磁性的、または静電気的（たとえば、誘導的、容量的）な特徴を提示するものであっても良く、その特徴は、ナノ細孔を用いて検出されても良い。
本明細書に記述される方法は、一分子方法（ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｍｅｔｈｏｄｓ）であっても良い。すなわち、検出されるシグナルは、１つの分子により生成されたものであり（すなわち、１つのヌクレオチド組込み）、複数のクローン分子から生成されたものではない。当該方法は、ＤＮＡ増幅を必要としなくてもよい。
ヌクレオチド組込み事象は、複数のヌクレオチド（たとえば、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ（Ｎは、アデノシン（Ａ）、シチジン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）、グアノシン（Ｇ）、またはウリジン（Ｕ）である）））を含有する混合物から発生してもよい。ヌクレオチド組込み事象は、必ずしもヌクレオチドの１つの型（たとえば、ｄＡＴＰ）を含有する溶液から発生しない。ヌクレオチド組込み事象は、必ずしも複数のヌクレオチド（たとえば、ｄＡＴＰ、次いで、ｄＣＴＰ、次いで、ｄＧＴＰ、次いで、ｄＴＴＰ、次いで、ｄＡＴＰ）の別の溶液から発生しない。一部の例においては、複数のヌクレオチド（たとえば、ＡＡ、ＡＧ、ＡＣ、ＡＴ、ＧＡ、ＧＧ、ＧＧ、ＧＣ、ＧＴ、ＣＡ等の二量体）がリガーゼにより組み込まれる。
核酸同定および配列決定の方法
核酸を配列決定する方法には、配列決定される核酸を有する生物学的試料を回収すること、当該生物学的試料から核酸試料を抽出、または単離すること、および、一部の例においては、配列決定のために核酸試料を調製することが含まれても良い。
図１には、核酸試料を配列決定するための方法を図示する。当該方法は、生物学的試料（たとえば、組織試料、液体試料等）から核酸分子を単離すること、および、配列決定のために核酸試料を調製することが含まれる。一部の例において、核酸試料は、細胞から抽出される。核酸抽出技術の例は、リゾチーム、ソニケーション、抽出、高圧、またはそれらの任意の組み合わせを用いるものである。核酸は、一部の例においてはセルフリーの核酸であり、細胞からの抽出は必要としない。
一部の例において、核酸試料は、タンパク質、細胞壁残渣、および核酸試料由来の他の成分を除去することを含むプロセスにより、配列決定のための調製がなされても良い。たとえばスピンカラム等、これを行うための多くの市販製品がある。また、エタノール沈殿および遠心を用いても良い。
核酸試料は、複数の断片へ分割（または破砕）されても良く、それにより、たとえばアレイに複数のナノ細孔を含有するデバイスを用いた核酸配列決定が容易になりうる。しかし、配列決定される核酸分子（複数含む）の破砕は、必ずしも必要ではない。
一部の例において、長い配列が測定される（すなわち、「ショットガンシークエンス」法は必要ではない）。核酸配列の任意の適切な長さが測定されても良い。たとえば、少なくとも約５、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約８００、約１０００、約１５００、約２０００、約２５００、約３０００、約３５００、約４０００、約４５００、約５０００、約６０００、約７０００、約８０００、約９０００、約１００００、約２００００、約４００００、約６００００、約８００００、または約１０００００等の塩基が配列決定されても良い。一部の例においては、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも８００、少なくとも１０００、少なくとも１５００、少なくとも２０００、少なくとも２５００、少なくとも３０００、少なくとも３５００、少なくとも４０００、少なくとも４５００、少なくとも５０００、少なくとも６０００、少なくとも７０００、少なくとも８０００、少なくとも９０００、少なくとも１００００、少なくとも２００００、少なくとも４００００、少なくとも６００００、少なくとも８００００、少なくとも１０００００等の塩基が配列決定される。一部の例において、配列決定される塩基は、連続的である。一部の例において、配列決定される塩基は、連続的ではない。たとえば、所与の数の塩基が、連続的に配列決定されても良い。他の例において、１以上の配列決定される塩基が、配列情報が測定されない、および／または、利用可能ではない、１以上のブロックにより分離されていても良い。一部の実施態様において、鋳型は、複数回配列決定されても良く（たとえば、環状核酸鋳型を用いて）、一部の例においては、重複する配列情報が作成される。一部の例においては、ソフトウェアを用いて配列を提示しても良い。一部の例においては、核酸試料は、配列決定の前に分割されても良い。一部の例において、核酸試料鎖を処理し、所与の二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ領域を環状に作製して、当該二本鎖ＤＮＡまたは当該ＲＮＡ／ＤＮＡ領域の対応するセンス部分およびアンチセンス部分が、当該環状ＤＮＡまたは当該環状ＤＮＡ／ＲＮＡ分子に含まれるようにしても良い。そのような例においては、そのような分子から配列決定された塩基は、データアセンブリ、および、塩基位置読み取りのチェックを容易に行うことができる。
ナノ細孔配列決定および分子検出
本明細書において、ナノ細孔を用いた、核酸分子を配列決定するためのシステムおよび方法が提示される。当該ナノ細孔は、たとえば集積回路等の検出回路の検出電極に隣接して配置された膜に形成される、または、膜に組み込まれても良い。集積回路は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）であっても良い。一部の例において、集積回路は、電界効果トランジスタ、または相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）である。検出回路は、ナノ細孔を有するチップ、または他のデバイスに位置づけられても良く、または、たとえば外部構造物等の外部チップまたはデバイスに位置づけられても良い。半導体は、任意の半導体（限定されないが、ＩＶ群（たとえば、シリコン）およびＩＩＩ−Ｖ群半導体（たとえば、ヒ化ガリウム等）を含む）であっても良い。
一部の例において、核酸またはタグがナノ細孔を通り、または隣接して流れるにつれ、検出回路は、当該核酸またはタグに関連した電気信号を検出する。核酸は、より大きな鎖のサブユニットであっても良い。タグは、ヌクレオチド組込み事象、または他のタグ化核酸と、ナノ細孔（もしくはナノ細孔に隣接しているもの（たとえば、核酸からタグを開裂する酵素））の間の相互作用の副産物であっても良い。タグは、ヌクレオチドに付着したままであっても良い。検出されたシグナルは回収され、メモリ位置に保存され、後で核酸配列を構築するために用いられても良い。回収されたシグナルを処理し、たとえばエラー等の、検出シグナル中の任意の異常を解説しても良い。
図２において、温度対照を有するナノ細孔検出器（またはセンサー）の例を示す（米国特許出願２０１１／０１９３５７０（参照により、本明細書に全体が援用される）に記述される方法に従い調製されてもよい）。図２Ａについて、ナノ細孔検出器には、伝導性溶液２０７（たとえば、塩溶液）に接触したトップ電極２０１を含有する。ボトム伝導性電極２０２は、ナノ細孔２０６の近く、隣接、または近接しており、膜２０５に挿入されている。一部の例において、ボトム伝導性電極２０２は、半導体基板２０４に組み込まれた電気回路である半導体２０３に組み込まれている。半導体２０３の表面は、疎水性となるように処置されていても良い。検出される試料は、ナノ細孔２０６の孔を通り抜ける。半導体チップセンサーは、パッケージ２０８に置かれ、次いで、これは、温度制御要素２０９の近辺に置かれる。温度制御要素２０９は、熱電加熱デバイスおよび／または冷却デバイス（たとえば、Ｐｅｌｔｉｅｒデバイス等）であっても良い。複数のナノ細孔検出器が、ナノ細孔アレイを形成しても良い。
図２Ｂについて、類似の数字は、類似の要素を表し、膜２０５は、壁２１０の上に置かれても良く、センサー２０２は壁の表面の一部を形成する。図２Ｃにおいて、電極２０２が、処置された半導体表面２０３から突き出ている例を示す。
一部の例において、膜２０５は、半導体２０３上ではなく、ボトム伝導性電極２０２の上に形成される。そのような場合、膜２０５は、ボトム伝導性電極２０２と結合相互作用を形成しても良い。しかしながら、一部の例において、膜２０５は、ボトム伝導性電極２０２および半導体２０３の上に形成される。あるいは、膜２０５は、ボトム伝導性電極２０２の上ではなく、半導体２０３の上に形成されても良く、しかし、ボトム伝導性電極２０２の上には伸長されない。
一部の例においては、電気的検出を用いた核酸の間接的な配列決定のために、ナノ細孔を用いてもよい。間接的な配列決定は、増殖鎖に組み込まれたヌクレオチドがナノ細孔を通過しない任意の方法であっても良い。核酸分子は、ナノ細孔からの任意の適切な距離内で、および／または、ナノ細孔に近接して、通り過ぎても良い（一部の例においては、ヌクレオチド組込み事象から放出されたタグがナノ細孔で検出されるような距離内で）。
ヌクレオチド組込み事象の副産物を、ナノ細孔により検出してもよい。「ヌクレオチド組み込み事象」は、増殖ポリヌクレオチド鎖へのヌクレオチドの組み込みである。副産物は、所与のタイプのヌクレオチドの組み込みと相関していても良い。ヌクレオチド組込み事象は通常、たとえばＤＮＡポリメラーゼ等の酵素により触媒され、および、各位置での組込みに利用可能なヌクレオチドの中で選択するための、鋳型分子との塩基対相互作用を利用する。
核酸試料は、タグ化ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを用いて配列決定されても良い。一部の例において、核酸分子を配列決定する方法には、（ａ）タグ化ヌクレオチドを組み込む（たとえば、重合する）ことであって、個々のヌクレオチドに結合したタグは、組込みで放出され、および、（ｂ）ナノ細孔を用いて放出されたタグを検出すること、が含まれる。一部の例において、当該方法はさらに、付着したタグ、または、個々のヌクレオチドから放出されたタグに、ナノ細孔を通過することを指示することを含む。放出されたタグ、または付着したタグは、任意の適切な技術（一部の例においては、酵素（または分子モーター）および／または孔の全体にわたる電圧差を用いたもの）により、指示されても良い。あるいは、放出されたタグ、または付着したタグは、酵素を使用せずに、ナノ細孔を通過することを指示されても良い。たとえば、タグは、本明細書に記述されるように、ナノ細孔の全体にわたる電圧差により指示されても良い。
プレロードされたタグを用いた配列決定
ナノ細孔へロードされることなく放出されたタグは、ナノ細孔から拡散してしまい、ナノ細孔により検出されない。これにより、核酸分子の配列決定において、エラーが生じる可能性がある（たとえば、核酸の位置を見落とす、または間違った順でタグを検出する等）。本明細書において、タグがヌクレオチドから放出される前に、タグ分子がナノ細孔へと「プレロード」される、核酸分子の配列決定方法を提示する。プレロードされたタグは、プレロードされていないタグよりも、ナノ細孔によって検出される可能性が高まりうる（たとえば、少なくとも約１００倍、高い可能性）。また、タグをプレロードすることにより、タグ化ヌクレオチドが増殖核酸鎖に組み込まれているか否かを測定する方法がもたらされる。組み込まれたヌクレオチドと結合したタグは、組み込まれずにナノ細孔を通り過ぎる（およびナノ細孔により検出される）タグ（たとえば、平均で約１ｍｓ未満）よりも長い期間（たとえば、平均で少なくとも約５０ミリ秒（ｍｓ））、ナノ細孔と結合することができる。一部の例において、組み込まれたヌクレオチドと結合したタグは、少なくとも約１ミリ秒（ｍｓ）、２０ｍｓ、３０ｍｓ、４０ｍｓ、５０ｍｓ、１００ｍｓ、２００ｍｓ、または２５０ｍｓ超の平均時間の間、ナノ細孔と結合することができ、または、ナノ細孔に隣接した酵素（たとえば、ポリメラーゼ等）に連結、もしくは保持されることができる。一部の例において、組み込まれたヌクレオチドと結合したタグのシグナルは、少なくとも１ミリ秒（ｍｓ）、２０ｍｓ、３０ｍｓ、４０ｍｓ、５０ｍｓ、１００ｍｓ、２００ｍｓ、または２５０ｍｓ超の平均検出存続時間を有し得る。タグは、連結された、組み込みヌクレオチドに連結されていてもよい。組み込まれたヌクレオチドに起因する平均検出存続時間より短い平均検出時間を有するタグシグナル（たとえば、約１ｍｓ未満）は、タグに連結された、組み込まれていないヌクレオチドに起因しうる。一部の例において、少なくとも「ｘ」の平均検出存続時間は、組み込まれたヌクレオチドに起因し、および、「ｘ」よりも短い平均検出存続時間は、組み込まれていないヌクレオチドに起因しうる。一部の例において、「ｘ」は、０．１ｍｓ、１ｍｓ、２０ｍｓ、３０ｍｓ、４０ｍｓ、５０ｍｓ、１００ｍｓ、１秒であっても良い。
タグは、膜に少なくとも１つのナノ細孔を有するナノ細孔デバイスを用いて検出されても良い。タグは、個々のタグ化ヌクレオチドの組み込みの間、個々のタグ化ヌクレオチドと結合しても良い。本明細書に提示される方法には、ナノ細孔を用いて、１以上の組み込まれていない個々のタグ化ヌクレオチドと結合した１以上のタグから、個々のタグ化ヌクレオチドと結合したタグを識別することが含まれる。一部の例において、ナノ細孔デバイスは、組み込みの間に、個々のタグ化ヌクレオチドと結合したタグを検出する。タグ化ヌクレオチド（増殖核酸鎖に組み込まれているか、または組み込まれていないかのいずれか）は、ナノ細孔によって所与の期間の間、検出され、測定され、または識別され、一部の例においては、ナノ細孔デバイスの電極および／またはナノ細孔を用いて、所与の期間の間に、検出、測定、または識別される。ナノ細孔デバイスがタグを検出する期間は、短くても良く、一部の例においては、タグおよび／またはタグに連結されたヌクレオチドが酵素（たとえば、ポリメラーゼ等の、核酸鎖へのヌクレオチドの組み込みを促進する酵素）により保持されている期間よりも実質的に短くてもよい。一部の例において、タグは、組み込まれたタグ化ヌクレオチドが酵素と結合している期間内に、複数回、電極により検出されても良い。たとえば、タグは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、１０，０００、１００，０００、または１，０００，０００回、組み込まれたタグ化ヌクレオチドが酵素と結合している時間内に、電極により検出されても良い。
検出時間の任意の列挙または、検出の平均時間の任意の列挙は、既定時間もしくは平均時間を上回る、または下回る検出時間の割合を考慮するものである。一部の例において、複数の核酸塩基を配列決定する場合の検出時間は、統計学的に分布している（たとえば、指数分布またはＧａｕｓｓｉａｎ分布）。指数分布は、たとえば図１８に見られるように、比較的大きな割合の、平均検出時間を下回る検出時間を有しうる。
一部の例において、タグをプレロードすることには、タグがヌクレオチドに付着している間に、タグの少なくとも一部がナノ細孔の少なくとも一部を通るように指示することを含み、そのヌクレオチドは核酸鎖（たとえば、増殖核酸鎖）に組み込まれている、または、核酸鎖へ組み込まれているところである、または、核酸鎖にまだ組み込まれていないが、核酸鎖に組み込まれうるものである。一部の例において、タグをプレロードすることには、ヌクレオチドが核酸鎖に組み込まれる前に、または、ヌクレオチドが核酸鎖に組み込まれている間に、タグの少なくとも一部が、ナノ細孔の少なくとも一部を通るように指示することを含む。一部の例において、タグをプレロードすることには、ヌクレオチドが核酸鎖に組み込まれた後で、タグの少なくとも一部が、ナノ細孔の少なくとも一部を通るよう指示することを含んでも良い。
図３において、本方法の主要な構成要素を示す。ここで、ナノ細孔３０１は、膜３０２で形成される。酵素３０３（たとえば、ＤＮＡポリメラーゼ等のポリメラーゼ）は、ナノ細孔と結合している。一部の例において、酵素は、以下に記述されるようにナノ細孔に共有結合している。ポリメラーゼは、配列決定される一本鎖核酸分子３０４と関連している。一本鎖核酸分子は、一部の例においては環状であるが、必須ではない。一部の例において、核酸分子は直線状である。一部の実施態様において、核酸プライマー３０５は、核酸分子の一部にハイブリダイズされている。一部の例において、プライマーは、ヘアピン構造（たとえば、環状鋳型を最初に回った後、外れて、新たに生成された核酸鎖がナノ細孔を通り抜けるのを防ぐため）を有する。ポリメラーゼは、鋳型として一本鎖核酸分子を用いたプライマーへのヌクレオチドの組み込みを触媒する。ヌクレオチド３０６は、本明細書に記述されるタグ種（タグ（複数））３０７を含有する。
図４において、「プレロード」されたタグを用いた、核酸配列決定方法を図示する。Ａ部分は、図３に記述される主要な構成要素を示す。Ｃ部分は、ナノ細孔へロードされたタグを示す。「ロードされた」タグは、たとえば、少なくとも０．１ミリ秒（ｍｓ）、少なくとも１ｍｓ、少なくとも５ｍｓ、少なくとも１０ｍｓ、少なくとも５０ｍｓ、少なくとも１００ｍｓ、または少なくとも５００ｍｓ、または少なくとも１０００ｍｓ等の、適切な時間の間、ナノ細孔内に位置づけられている、および／または、ナノ細孔内に維持もしくはナノ細孔の近くに維持されているものであっても良い。一部の例において、「プレロード」されたタグは、ヌクレオチドから放出される前に、ナノ細孔内にロードされる。一部の例においては、ヌクレオチド組込み事象で放出された後に、タグがナノ細孔を通りすぎる（および／または、ナノ細孔により検出される）可能性が適切に高い場合（たとえば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、少なくとも９９．９９％、または、少なくとも９９．９９９％等）に、タグがプレロードされる。
部分Ａから部分Ｂへの推移において、ヌクレオチドは、ポリメラーゼと結合するようになっている。結合したヌクレオチドは、一本鎖核酸分子と塩基対を形成する（たとえば、ＡとＴ、および、ＧとＣ）。一本鎖核酸分子と塩基対を形成しない、多くのヌクレオチドが、ポリメラーゼと一時的に結合するようになりうることが知られている。対形成しないヌクレオチドは、ポリメラーゼにより拒絶され、通常は、ヌクレオチドが塩基対形成する場合においてのみ、ヌクレオチドの組み込みが進行する。対形成しないヌクレオチドは、通常は、正確に対形成したヌクレオチドがポリメラーゼとの結合を維持している時間スケールよりも短い時間スケールの間に、拒絶される。対形成しないヌクレオチドは、少なくとも約１００ナノ秒（ｎｓ）、１ｍｓ、１０ｍｓ、１００ｍｓ、１秒の間（平均）に拒絶され、一方で、正確に対形成したヌクレオチドは、ポリメラーゼとの結合を、より長い時間（たとえば、少なくとも約１ミリ秒（ｍｓ）、１０ｍｓ、１００ｍｓ、１秒または１０秒の平均時間）、維持する。図４の部分Ａと部分Ｂの間にナノ細孔を通り過ぎる電流は、一部の例においては、３〜３０ピコアンペア（ｐＡ）であっても良い。
図４、部分Ｃにおいて、ナノ細孔とポリメラーゼの結合を示す。ポリメラーゼは、ナノ細孔が存在する膜、またはナノ細孔に適用された電圧（ＤＣまたはＡＣ電圧）により、ナノ細孔へと引き寄せられても良い。また、図１７において、ポリメラーゼとナノ細孔の結合を示す（この場合、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（φ２９ＤＮＡポリメラーゼ）と、α溶血素ナノ細孔である）。タグは、電気力（たとえば、膜および／またはナノ細孔に適用された電圧により生成された電場の存在下で生成された力等）による結合の間、ナノ細孔へと引き寄せられても良い。一部の実施態様において、図４の部分Ｃの間にナノ細孔を流れる電流は、約６ｐＡ、約８ｐＡ、約１０ｐＡ、約１５ｐＡ、または約３０ｐＡである。ポリメラーゼは、増殖核酸分子へのヌクレオチドの組み込みおよびタグ分子の放出のための、異性化反応およびリン酸転移反応を経る。
部分Ｄにおいて、タグのナノ細孔通過が示されている。タグは、本明細書に記述されるように、ナノ細孔により検出される。サイクルを繰り返すことにより（すなわち、部分Ａ〜Ｅ、または部分Ａ〜Ｆ）、核酸分子の配列決定が可能となる。
一部の例において、増殖核酸分子に組み込まれていないタグ化ヌクレオチドもまた、図４の部分Ｆに見られるように、ナノ細孔を通り過ぎる。一部の例においては、組み込まれていないヌクレオチドがナノ細孔により検出されることができるが、当該方法は、ナノ細孔でヌクレオチドが検出される時間に少なくとも部分的に基づいて、組み込まれていないヌクレオチドと組み込まれたヌクレオチドを識別する手段を提示するものである。組み込まれていないヌクレオチドに結合したタグは、すばやくナノ細孔を通過し、短い時間（たとえば、１００ｍｓ未満）、検出される一方で、組み込まれたヌクレオチドに結合したタグはナノ細孔にロードされ、長い時間（たとえば、少なくとも１００ｍｓ）、検出される。
一部の実施態様において、当該方法は、組み込まれた（たとえば、重合された）タグ化ヌクレオチドと、組み込まれていないタグヌクレオチドを、ナノ細孔によりタグ化ヌクレオチドが検出される時間の長さに基づいて、識別する。タグは、組み込まれていない場合よりも、組み込まれている場合において、より長い時間、ナノ細孔に近接して保持されることができる。一部の例においては、ポリメラーゼを変異させ、組み込まれたタグ化ヌクレオチドと、組み込まれていないタグ化ヌクレオチドの間の時間差を増加させる。組み込まれたタグ化ヌクレオチドがナノ細孔により検出される時間と、組み込まれていないタグがナノ細孔により検出される時間の比率は、任意の適切な値であっても良い。一部の実施態様において、組み込まれたタグ化ヌクレオチドがナノ細孔により検出される時間と、組み込まれていないタグがナノ細孔により検出される時間の比率は、約１．５、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１２、約１４、約１６、約１８、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、または、約１０００である。一部の実施態様において、組み込まれた（たとえば、重合された）タグ化ヌクレオチドがナノ細孔により検出される時間と、組み込まれていないタグがナノ細孔により検出される時間の比率は、少なくとも約１．５、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１２、少なくとも約１４、少なくとも約１６、少なくとも約１８、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、または少なくとも約１０００である。
タグがナノ細孔にロードされる（および／またはナノ細孔により検出される）時間は、任意の適切な値である。一部の例において、タグは、平均で約１０ミリ秒（ｍｓ）、２０ｍｓ、約３０ｍｓ、約４０ｍｓ、約５０ｍｓ、約６０ｍｓ、約８０ｍｓ、約１００ｍｓ、約１２０ｍｓ、約１４０ｍｓ、約１６０ｍｓ、約１８０ｍｓ、約２００ｍｓ、約２２０ｍｓ、約２４０ｍｓ、約２６０ｍｓ、約２８０ｍｓ、約３００ｍｓ、約４００ｍｓ、約５００ｍｓ、約６００ｍｓ、約８００ｍｓ、または約１０００ｍｓの間、ナノ細孔により検出される。一部の例において、タグは、平均で、少なくとも約１０ミリ秒（ｍｓ）、少なくとも約２０ｍｓ、少なくとも約３０ｍｓ、少なくとも約４０ｍｓ、少なくとも約５０ｍｓ、少なくとも約６０ｍｓ、少なくとも約８０ｍｓ、少なくとも約１００ｍｓ、少なくとも約１２０ｍｓ、少なくとも約１４０ｍｓ、少なくとも約１６０ｍｓ、少なくとも約１８０ｍｓ、少なくとも約２００ｍｓ、少なくとも約２２０ｍｓ、少なくとも約２４０ｍｓ、少なくとも約２６０ｍｓ、少なくとも約２８０ｍｓ、少なくとも約３００ｍｓ、少なくとも約４００ｍｓ、少なくとも約５００ｍｓ、少なくとも約６００ｍｓ、少なくとも約８００ｍｓ、または、少なくとも約１０００ｍｓの間、ナノ細孔により検出される。
一部の例において、鋳型の少なくとも一部に相補的な増殖鎖へと組み込まれているヌクレオチドに起因して、タグは、少なくとも約１ｍｓ、少なくとも約１０ｍｓ、少なくとも約５０ｍｓ、少なくとも約８０ｍｓ、少なくとも約１００ｍｓ、少なくとも約１２０ｍｓ、少なくとも約１４０ｍｓ、少なくとも約１６０ｍｓ、少なくとも約１８０ｍｓ、少なくとも約２００ｍｓ、少なくとも約２２０ｍｓ、少なくとも約２４０ｍｓ、または、少なくとも約２６０ｍｓの期間、シグナルを生成する。一部の例において、増殖鎖に組み込まれていないヌクレオチドに起因して、タグは、約１００ｍｓ未満、約８０ｍｓ未満、約６０ｍｓ未満、約４０ｍｓ未満、約２０ｍｓ未満、約１０ｍｓ未満、約５ｍｓ未満、または、約１ｍｓ未満の期間、シグナルを生成する。
核酸分子は直線状であっても良い（図５を参照）。一部の例において、図３に見られるように、核酸分子３０４は、環状であっても良い（たとえば、環状ＤＮＡ、環状ＲＮＡ）。環状化（たとえば、一本鎖）核酸は、複数回、配列決定されても良い（たとえば、ポリメラーゼ３０３は環を完全に周回しながら、鋳型の一部の配列決定を再度開始する）。環状ＤＮＡは、共にライゲートされる同じゲノムの位置に対して、センスおよびアンチセンスであっても良い（一部の場合においては、よりしっかりした、正確な読み取りが行われるように）。環状核酸は、適切な精度が得られるまで、配列決定されても良い（たとえば、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９％、または少なくとも９９．９９％の精度）。一部の例において、核酸は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０回、少なくとも４０回、少なくとも５０回、少なくとも１００回、または、少なくとも１０００回、配列決定される。
ある態様において、本明細書に記述される方法およびデバイスは、組み込まれていないヌクレオチドよりも長い時間、ナノ細孔により検出される、および／または、検出可能となる、組み込まれたヌクレオチドの一部に基づいて、組み込まれたヌクレオチドと組み込まれていないヌクレオチドを識別する。一部の例において、配列決定される核酸鎖にハイブリダイズされた第二の核酸鎖（二本鎖核酸）の移動により、組み込まれたヌクレオチドと組み込まれていないヌクレオチドの検出の間の時間差が増加する。第一の配列決定の後、ポリメラーゼは二本鎖核酸と出会い（たとえば、プライマー３０５と出会ったときから開始される）、および第二の核酸鎖は、配列決定を継続するために、鋳型から移動される必要がありうる（図３を参照）。この移動により、鋳型が一本鎖の場合と比較して、ポリメラーゼが減速され、および／またはヌクレオチド組込み事象の比率が低下しうる。
一部の例において、鋳型核酸分子は、一本鎖鋳型へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション由来の二本鎖である。図２５において、複数のオリゴヌクレオチド２５００がハイブリダイズされている例を示す。示される方向２５０２におけるポリメラーゼ２５０１の進行により、鋳型からオリゴヌクレオチドが移動する。ポリメラーゼは、オリゴヌクレオチドが存在しない場合よりも、よりゆっくりと進行することができる。一部の例において、本明細書に記述されるオリゴヌクレオチドの使用により、組み込まれていないヌクレオチドよりも長い時間、組み込まれたヌクレオチドがナノ細孔により検出される、および／または、検出可能となることに部分的に基づいて、組み込まれたヌクレオチドと組み込まれていないヌクレオチドの間の分離が改善される。オリゴヌクレオチドは任意の適切な長さ（たとえば、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１２、約１４、約１６、約１８、または、約２０塩基の長さ）であっても良い。オリゴヌクレオチドは、天然型塩基（たとえば、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、および／または、ウラシル（Ｕ））、ユニバーサル塩基（たとえば、５−ニトロインドール、３−ニトロピロール、３−メチル ７−プロピニルイソカルボスチリル（ＰＩＭ）、３−メチルイソカルボスチリル（ＭＩＣＳ）、および／または、５−メチルイソカルボスチリル（５ＭＩＣＳ））、または任意の割合でのそれらの任意の組み合わせ、を含有しても良い。
一部の例において、核酸ポリメラーゼは、非メチル化核酸鋳型よりも、メチル化核酸鋳型とのほうが、よりゆっくりと進行する。ある態様において、本明細書に記述される方法、および／または、デバイスは、メチル化核酸を使用する、および／または核酸分子をメチル化する。一部の例において、メチル基は、シトシンピリミジン環の５位に存在する、および／もしくは、付加され、ならびに／または、アデニンプリン環の６位の窒素に存在する、および／もしくは、付加される。配列決定される核酸は、核酸をメチル化する生物体から単離されても良い。一部の例において、核酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでメチル化されても良い（たとえば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素を用いることにより）。時間を用いて、非メチル化塩基からメチル化塩基を識別しても良い。これにより、エピジェネティック研究が可能となりうる。
一部の例において、メチル化塩基は、電流／時間プロットの特徴的な形態、または特徴的な電流に基づいて、非メチル化塩基から識別することが可能である。たとえば、タグ化ヌクレオチドは、核酸鋳型が所与の位置でメチル化塩基を有しているか否かに基づいて（たとえば、ポリメラーゼにおける立体配座の差異により）、異なる遮断電流を発生させることができる。一部の例において、Ｃおよび／またはＡ塩基はメチル化されており、ならびに、対応するＧおよび／またはＴのタグ化ヌクレオチドの組み込みにより、電流が変化する。
核酸配列決定のための酵素
当該方法は、酵素（たとえば、ポリメラーゼ、転写酵素またはリガーゼ）を用いて、本明細書に記述されるナノ細孔およびタグ化ヌクレオチドと共に、核酸分子を配列決定することができる。一部の例において、当該方法には、ポリメラーゼ（たとえば、ＤＮＡポリメラーゼ）を用いてタグ化ヌクレオチドを組み込む（たとえば、重合）ことが含まれる。一部の例においては、ポリメラーゼを変異させ、タグ化ヌクレオチドを受容させる。また、ポリメラーゼを変異させて、タグがナノ細孔により検出される時間を延長させることが可能である（たとえば、図４の部分Ｃの時間）。
一部の実施態様において、酵素は、ヌクレオチドのリン酸塩結合により核酸鎖を生成する任意の酵素である。一部の例において、ＤＮＡポリメラーゼは、９°Ｎポリメラーゼまたはその変異体、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、シーケナーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎポリメラーゼ（ｅｘｏ−）Ａ４８５Ｌ／Ｙ４０９Ｖ、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（φ２９ ＤＮＡポリメラーゼ）、Ｂｃｔポリメラーゼ、またはそれらの変異体、突然変異体、またはホモログである。ホモログは、限定されないが、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または、少なくとも約９５％の配列同一性を含む、任意の適切な相同性割合を有してもよい。
図３に関しては、酵素３０３は、ナノ細孔３０１に付着されていても良い。ナノ細孔への酵素付着のための適切な方法としては、たとえば、分子内ジスルフィド結合の形成等の架橋が挙げられる。ナノ細孔および酵素はまた、融合タンパク質（すなわち、１つのポリペプチド鎖によりコードされる）であってもよい。融合タンパク質を製造する方法としては、酵素に対するコード配列を、ナノ細孔に対するコード配列に対し、インフレームで隣接して融合させること（その間に、ストップコドンを伴わない）、および、この融合配列を１つのプロモーターから発現させることが含まれても良い。一部の例において、酵素３０３は、分子ステープルまたはタンパク質フィンガーを用いて、ナノ細孔３０１に連結、または付着されても良い。一部の例において、酵素は、中間分子を介して付着される（たとえば、ビオチンが両酵素に結合され、および、ストレプトアビジン四量体を有するナノ細孔が両ビオチンに連結される）。また、酵素は、抗体と共にナノ細孔に付着されても良い。一部の例において、互いに共有結合を形成するタンパク質（たとえば、ＳｐｙＴａｇ（登録商標）／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（登録商標）システム）を用いて、ナノ細孔にポリメラーゼを付着させる。一部の例においては、ホスファターゼ酵素または、ヌクレオチドからタグを開裂させる酵素がまた、ナノ細孔に付着される。
ＤＮＡポリメラーゼは、一部の例において、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼである。当該ポリメラーゼを変異させて、変異させてないポリメラーゼと比較し、増殖核酸分子へのタグ化ヌクレオチドの組み込みに対する変異ポリメラーゼの効率を増加および／または改善させてもよい。ポリメラーゼを変異させて、ポリメラーゼの活性部位領域へのヌクレオチドアナログ（たとえば、タグ化ヌクレオチド）のエントリーを改善してもよく、および／または、活性領域におけるヌクレオチドとの適合のために変異させても良い。
一部の実施態様において、ポリメラーゼは、ヌクレオチドアナログ（たとえば、ＶｅｎｔＡ ４８８Ｌ）を受け入れるポリメラーゼの活性領域に対して相同性である（たとえば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％のアミノ酸位の同一性）、アミノ酸配列を有する活性領域を有している。
ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼの適切な変異としては、限定されないが、残基５０５〜５２５の欠損、残基５０５〜５２５内の欠損、Ｋ１３５Ａ変異、Ｅ３７５Ｈ変異、Ｅ３７５Ｓ変異、Ｅ３７５Ｋ変異、Ｅ３７５Ｒ変異、Ｅ３７５Ａ変異、Ｅ３７５Ｑ変異、Ｅ３７５Ｗ変異、Ｅ３７５Ｙ変異、Ｅ３７５Ｆ変異、Ｅ４８６Ａ変異、Ｅ４８６Ｄ変異、Ｋ５１２Ａ変異、およびそれらの組み合わせが挙げられる。一部の例において、ＤＮＡポリメラーゼはさらに、Ｌ３８４Ｒ変異を含有する。適切なＤＮＡポリメラーゼは、米国特許出願２０１１／００５９５０５（参照により本明細書に全体が援用される）に記述されている。一部の実施対態様において、ポリメラーゼは、Ｎ６２Ｄ、Ｌ２５３Ａ、Ｅ３７５Ｙ、Ａ４８４Ｅおよび／またはＫ５１２Ｙの変異を有するｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼである。
ｐｈｉ２９ポリメラーゼの適切な変異は、タグ化ヌクレオチドの組み込みの改善に寄与する変異に限定されない。他の変異（たとえば、アミノ酸置換、挿入、欠損および／または外因性の特性）も、変異の無い（野生型）のｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼと比較して、限定されないが、金属イオン配位の増加、エキソヌクレアーゼ活性の減少、ポリメラーゼ動態サイクルの１以上の工程での反応速度の減少、分岐率の減少、補因子選択性の変化、産生量の増加、温度安定性の増加、精度の増加、スピードの増加、読み取り長の増加、塩耐容性の増加等に寄与しうる。
ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼの適切な変異としては、限定されないが、Ｅ３７５位での変異、Ｋ５１２位での変異、および、Ｌ２５３、Ａ４８４、Ｖ２５０、Ｅ２３９、Ｙ２２４、Ｙ１４８、Ｅ５０８、および、Ｔ３６８からなる群から選択される１以上の位置での変異が挙げられる。
一部の実施態様において、Ｅ３７５位の変異は、Ｅ３７５Ｙ、Ｅ３７５Ｆ、Ｅ３７５Ｒ、Ｅ３７５Ｑ、Ｅ３７５Ｈ、Ｅ３７５Ｌ、Ｅ３７５Ａ、Ｅ３７５Ｋ、Ｅ３７５Ｓ、Ｅ３７５Ｔ、Ｅ３７５Ｃ、Ｅ３７５Ｇ、および、Ｅ３７５Ｎからなる群から選択されるアミノ酸置換を含有する。一部の例において、Ｋ５１２位での変異は、Ｋ５１２Ｙ、Ｋ５１２Ｆ、Ｋ５１２Ｉ 、Ｋ５１２Ｍ、Ｋ５１２Ｃ、Ｋ５１２Ｅ、Ｋ５１２Ｇ、Ｋ５１２Ｈ、Ｋ５１２Ｎ、Ｋ５１２Ｑ、Ｋ５１２Ｒ、Ｋ５１２Ｖ、および、Ｋ５１２Ｈからなる群から選択されるアミノ酸置換を含有する。１つの実施態様において、Ｅ３７５位での変異は、Ｅ３７５Ｙ置換を含有し、および、Ｋ５１２位での変異は、Ｋ５１２Ｙ置換を含有する。
一部の例において、変異型ｐｈｉ２９ポリメラーゼは、Ｌ２５３Ａ、Ｌ２５３Ｃ、Ｌ２５３Ｓ、Ａ４８４Ｅ、Ａ４８４Ｑ、Ａ４８４Ｎ、Ａ４８４Ｄ、Ａ４８４Ｋ、Ｖ２５０Ｉ、Ｖ２５０Ｑ、Ｖ２５０Ｌ、Ｖ２５０Ｍ、Ｖ２５０Ｃ、Ｖ２５０Ｆ、Ｖ２５０Ｎ、Ｖ２５０Ｒ、Ｖ２５０Ｔ、Ｖ２５０Ｙ、Ｅ２３９Ｇ、Ｙ２２４Ｋ、Ｙ２２４Ｑ、Ｙ２２４Ｒ、Ｙ１４８Ｉ、Ｙ１４８Ａ、Ｙ１４８Ｋ、Ｙ１４８Ｆ、Ｙ１４８Ｃ、Ｙ１４８Ｄ、Ｙ１４８Ｅ、Ｙ１４８Ｇ、Ｙ１４８Ｈ、Ｙ１４８Ｋ、Ｙ１４８Ｌ、Ｙ１４８Ｍ、Ｙ１４８Ｎ、Ｙ１４８Ｐ、Ｙ１４８Ｑ、Ｙ１４８Ｒ、Ｙ１４８Ｓ、Ｙ１４８Ｔ、Ｙ１４８Ｖ、Ｙ１４８Ｗ、Ｅ５０８Ｒ、および、Ｅ５０８Ｋからなる群から選択されるアミノ酸置換を１以上含有する。
一部の例において、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｄ５１０、Ｅ５１５、およびＦ５２６からなる群から選択される１以上の位置で変異を含有する。当該変異は、Ｄ５１０Ｋ、Ｄ５１０Ｙ、Ｄ５１０Ｒ、Ｄ５１０Ｈ、Ｄ５１０Ｃ、Ｅ５１５Ｑ、Ｅ５１５Ｋ、Ｅ５１５Ｄ、Ｅ５１５Ｈ、Ｅ５１５Ｙ、Ｅ５１５Ｃ、Ｅ５１５Ｍ、Ｅ５１５Ｎ、Ｅ５１５Ｐ、Ｅ５１５Ｒ、Ｅ５１５Ｓ、Ｅ５１５Ｔ、Ｅ５１５Ｖ、Ｅ５１５Ａ、Ｆ５２６Ｌ、Ｆ５２６Ｑ、Ｆ５２６Ｖ、Ｆ５２６Ｋ、Ｆ５２６Ｉ、Ｆ５２６Ａ、Ｆ５２６Ｔ、Ｆ５２６Ｈ、Ｆ５２６Ｍ、Ｆ５２６Ｖ、および、Ｆ５２６Ｙからなる群から選択されるアミノ酸置換を１以上含有しても良い。本開示方法で用いられうるＤＮＡポリメラーゼの例は、米国特許出願２０１２／００３４６０２（参照により本明細書に全体が援用される）に記述されている。
ポリメラーゼは、ナノ細孔によりタグの検出に適切な動力学的速度プロファイルを有しても良い。速度プロファイルは、ヌクレオチド組込みの全体的な速度、および／または、たとえばヌクレオチド付加、たとえば閉鎖状態に対する、もしくは閉鎖状態からの酵素的異性化、補因子結合もしくは放出、産生物放出、増殖核酸への核酸の組み込み、または転座等のヌクレオチド組込みの任意の工程の速度を指しても良い。
本開示のシステムにより、配列決定に関連した１以上の事象の検出が可能となる。当該事象は、動力学的に観察可能であってもよく、および／または、非動力学的に観察可能であっても良い（たとえば、ポリメラーゼと接触することなしに、ナノ細孔を通りヌクレオチドが移動する）。
ポリメラーゼは、配列決定事象の検出が可能となるように適合されても良い。一部の実施態様において、ポリメラーゼの速度プロファイルは、タグが、平均で約０．１ミリ秒（ｍｓ）、約１ｍｓ、約５ｍｓ、約１０ｍｓ、約２０ｍｓ、約３０ｍｓ、約４０ｍｓ、約５０ｍｓ、約６０ｍｓ、約８０ｍｓ、約１００ｍｓ、約１２０ｍｓ、約１４０ｍｓ、約１６０ｍｓ、約１８０ｍｓ、約２００ｍｓ、約２２０ｍｓ、約２４０ｍｓ、約２６０ｍｓ、約２８０ｍｓ、約３００ｍｓ、約４００ｍｓ、約５００ｍｓ、約６００ｍｓ、約８００ｍｓ、または約１０００ｍｓの間、ナノ細孔へとロードされる（および／または、ナノ細孔により検出される）ようなものであっても良い。一部の実施態様において、ポリメラーゼの速度プロファイルは、タグが、平均で少なくとも約５ミリ秒（ｍｓ）、少なくとも約１０ｍｓ、少なくとも約２０ｍｓ、少なくとも約３０ｍｓ、少なくとも約４０ｍｓ、少なくとも約５０ｍｓ、少なくとも約６０ｍｓ、少なくとも約８０ｍｓ、少なくとも約１００ｍｓ、少なくとも約１２０ｍｓ、少なくとも約１４０ｍｓ、少なくとも約１６０ｍｓ、少なくとも約１８０ｍｓ、少なくとも約２００ｍｓ、少なくとも約２２０ｍｓ、少なくとも約２４０ｍｓ、少なくとも約２６０ｍｓ、少なくとも約２８０ｍｓ、少なくとも約３００ｍｓ、少なくとも約４００ｍｓ、少なくとも約５００ｍｓ、少なくとも約６００ｍｓ、少なくとも約８００ｍｓ、または少なくとも約１０００ｍｓの間、ナノ細孔へとロードされる（および／またはナノ細孔により検出される）ようなものであっても良い。一部の例において、タグは、平均で約８０ｍｓ〜２６０ｍｓ、約１００ｍｓ〜２００ｍｓ、または約１００ｍｓ〜１５０ｍｓの間、ナノ細孔により検出される。
一部の例において、ポリメラーゼ反応は、ヌクレオチド、またはポリリン酸産物がポリメラーゼ酵素に結合されている中間体から進行する２つの動力学的工程を示し、および、ヌクレオチドおよびポリリン酸産物がポリメラーゼ酵素に結合されていない中間体から進行する２つの動力学的工程を示す。２つの動力学的工程には、酵素異性化、ヌクレオチド組込み、および産物の放出が含まれうる。一部の例において、２つの動力学的工程は、鋳型の転座およびヌクレオチド結合である。
図１８において、１つの動力学的工程が存在する場合、滞留時間としてのナノ細孔におけるタグの所与の滞留時間が、指数関数的に減少する可能性が増加し１８００、それにより、ナノ細孔におけるタグの滞留時間が短くなる可能性が比較的高い分布１８０１が生じる（および、それゆえに、ナノ細孔により検出されない可能性がある）。また、図１８において、２以上の動力学的工程（たとえば観察可能な、または「遅い」工程）１８０２が存在する場合、ナノ細孔におけるタグの滞留時間が非常に早くなる可能性は、１つの遅い工程１８０１を有する場合と比較して、比較的低くなる１８０３。別の言い方をすると、２つの指数関数の付加により、ガウス関数または分布１８０２がもたらされうる。さらに、２つの遅い工程に関する確率分布は、滞留時間１８０２に対して、確率密度分布のプロットにおいてピークを示す。このタイプの滞留時間分布は、本明細書に記述される核酸の配列決定に対して有益でありうる（たとえば、高い割合の組み込まれたタグを検出することが望ましい場合）。ヌクレオチド組込み事象が比較的多い場合、分単位の時間よりも長い時間、ナノ細孔にタグがロードされる（Ｔｍｉｎ、一部の例においては、１００ｍｓよりも長くなりうる）
一部の例において、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを野生型酵素に対して変異させ、２つの動力学的に遅い工程をもたらす、および／または、ナノ細孔によるタグの検出に適している速度プロファイルをもたらす。一部の例において、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼは、４８４位、１９８位、および３８１位から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換、または置換の組み合わせを有する。一部の実施態様において、アミノ酸置換は、Ｅ３７５Ｙ、Ｋ５１２Ｙ、Ｔ３６８Ｆ、Ａ４８４Ｅ、Ａ４８４Ｙ、Ｎ３８７Ｌ、Ｔ３７２Ｑ、Ｔ３７２Ｌ、Ｋ４７８Ｙ、１３７０Ｗ、Ｆ１９８Ｗ、Ｌ３８１Ａ、およびそれらの任意の組み合わせから選択される。適したＤＮＡポリメラーゼは、米国特許第８，１３３，６７２号（参照により本明細書に全体が援用される）に記述されている。
また、酵素の動態は、酵素と接触する溶液含有物の操作により影響および／または制御されうる。たとえば、ポリメラーゼを遅延させるために、非触媒二価イオン（たとえば、たとえばストロンチウム（Ｓｒ２+）等のポリメラーゼ機能を促進しないイオン）を、触媒二価イオン（たとえば、マグネシウム（Ｍｇ２+）および／またはマンガン（Ｍｎ２+）等のポリメラーゼ機能を促進するイオン）と混合することができる。触媒イオンと非触媒イオンの比率は、任意の適切な値であっても良く、約２０、約１５、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、約２、約１、約０．５、約０．２、または約０．１が挙げられる。一部の例において、当該比率は、一価の塩（たとえば、塩化カルシウム（ＫＣｌ））の濃度、温度、および／または、ｐＨに依存する。１つの例において、溶液は、１マイクロモルのＭｇ２+と０．２５マイクロモルのＳｒ２+を含有する。他の例において、溶液は、３マイクロモルのＭｇ２+と０．７マイクロモルのＳｒ２+を含有する。マグネシウム（Ｍｇ２+）とマンガン（Ｍｎ２+）の濃度は、任意の適切な値であっても良く、酵素の動力学に影響を与えるために変化しても良い。１つの例において、溶液は、１マイクロモルのＭｇ２+と０．２５マイクロモルのＭｎ２+を含有する。他の例において、溶液は、３マイクロモルのＭｇ２+と０．７マイクロモルのＭｎ２+を含有する。
プレロードされたタグ分子のナノ細孔配列決定
タグは、標的鎖に相補的な核酸鎖の合成の間に、組み込まれたヌクレオチドから放出されることなく検出されることができる。タグは、タグがナノ細孔に提示されるようにリンカーでヌクレオチドに付着されることができる（たとえば、タグは、ナノ細孔の少なくとも一部にぶら下がる、またはナノ細孔の少なくとも一部を通って伸長する）。リンカーの長さは、タグがナノ細孔の少なくとも一部に伸長することが可能となる、または、タグがナノ細孔の少なくとも一部を通って伸長することが可能となる十分な長さであっても良い。一部の例において、タグは、電圧差によりナノ細孔に提示される（すなわち、ナノ細孔に移動する）。孔へのタグ提示の他の方法もまた、適している可能性がある（たとえば、酵素、磁石、電場、圧力差の使用等）。一部の例において、能動的な力はタグに適用されない（すなわち、タグはナノ細孔に拡散する）。
本発明のある態様において、核酸を配列決定する方法が提示される。当該方法には、タグ化ヌクレオチドを組み込む（たとえば、重合する）ことが含まれる。個々のヌクレオチドと結合したタグは、組込みでヌクレオチドから放出されることなく、ナノ細孔により検出されうる。
核酸試料を配列決定するためのチップは、複数の個々のアドレス可能なナノ細孔を含有しても良い。複数の個々のアドレス可能なナノ細孔は、集積回路に隣接して配置された膜に形成されたナノ細孔を少なくとも１つ含有しても良い。個々のアドレス可能なナノ細孔のそれぞれは、個々のヌクレオチドと結合したタグを検出することができてもよい。ヌクレオチドは、組み込まれても良く（たとえば、重合されてもよく）、および、タグは、組込みでヌクレオチドから放出されなくても良い。
当該方法の例を図５に示す。ここでは、核酸鎖５００は、ナノ細孔５０２を横切って通過、またはナノ細孔５０２に近接して通過する（しかし、５０１で矢印により示されるように、通らない）。酵素５０３（たとえば、ＤＮＡポリメラーゼ）は、鋳型５００として第一の核酸分子を用いて、同時に、１つのヌクレオチドを組み込むことにより増殖核酸鎖５０４を伸長する（すなわち、酵素は、ヌクレオチド組込み事象を触媒する）。タグは、ナノ細孔５０２により検出される。タグは、しばらくの間、ナノ細孔中に存在しても良い。
酵素５０３は、ナノ細孔５０２に付着されていても良い。ナノ細孔に酵素を付着させる適切な方法としては、たとえば、分子内ジスルフィド結合の形成等の架橋および／または、上述の融合タンパク質の生成等が挙げられる。一部の例において、ホスファターゼ酵素もまた、ナノ細孔に付着される。これらの酵素はさらに、開裂タグ上の残りのリン酸塩に結合し、ナノ細孔における滞留時間をさらに延長させることによって、より明瞭なシグナルを生成しうる。適切なＤＮＡポリメラーゼとしては、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（φ２９ ＤＮＡポリメラーゼ）が挙げられ、および、限定されないが、上述のものがさらに挙げられる。
図５に関して続けると、酵素は、タグ分子（５０５と指示される白丸）に付着されたヌクレオチド（５０５と指示される黒丸）のプールから引き出される。ヌクレオチドの各タイプは異なるタグ分子に付着され、タグがナノ細孔５０２にある際に、それらは、ナノ細孔と関連したシグナル、またはナノ細孔において生成されたシグナルに基づいて、互いに識別されうる。
一部の例において、タグは、ヌクレオチド組込み事象でナノ細孔に提示され、ヌクレオチドから放出される。一部の例において、放出されたタグはナノ細孔を通過する。タグは、一部の例においてはナノ細孔を通過しない。一部の例において、ヌクレオチド組込み事象で放出されたタグは、少なくとも部分的にナノ細孔における滞留時間により、ナノ細孔を流れて通過しうるタグから識別されるが、ヌクレオチド組込み事象で放出されない。一部の例において、少なくとも約１００ミリ秒（ｍｓ）の間、ナノ細孔に滞留するタグは、ヌクレオチド組込み事象で放出され、および、１００ｍｓ未満の間、ナノ細孔に滞留するタグは、ヌクレオチド組込み事象で放出されない。一部の例において、タグは、第二の酵素またはタンパク質（たとえば、核酸結合タンパク質）により捕捉され、および／または、ナノ細孔を通るよう指示されてもよい。第二の酵素は、ヌクレオチド組込み事象で（たとえば、組込み事象の間、または後）、タグを開裂しても良い。タグとヌクレオチドの間のリンカーは、開裂されても良い。
図２６に示されるように、第二の酵素またはタンパク質２６００は、ポリメラーゼに付着することができる。一部の実施態様において、第二の酵素またはタンパク質は、二本鎖鋳型の一本鎖鋳型への解離を促進する核酸ヘリカーゼである。一部の例において、第二の酵素またはタンパク質は、ポリメラーゼに付着しない。第二の酵素またはタンパク質は、鋳型の一本鎖構造の維持を補助するために、一本鎖核酸鋳型に結合する核酸結合タンパク質であっても良い。核酸結合タンパク質は、一本鎖核酸分子に沿ってスライドしても良い。
組み込まれたヌクレオチドは、ヌクレオチドに結合したタグがナノ細孔を用いて検出される時間の長さに基づいて、組み込まれていないヌクレオチドから識別されても良い。一部の例において、核酸鎖に組み込まれたヌクレオチド（組み込まれたヌクレオチド）と結合したタグは、少なくとも約５ミリ秒（ｍｓ）、１０ｍｓ、２０ｍｓ、３０ｍｓ、４０ｍｓ、５０ｍｓ、６０ｍｓ、７０ｍｓ、８０ｍｓ、９０ｍｓ、１００ｍｓ、２００ｍｓ、３００ｍｓ、４００ｍｓ、または、５００ｍｓの平均時間の間、ナノ細孔により、またはナノ細孔を用いて検出される。組み込まれていない（たとえば、遊離し流動している）ヌクレオチドに結合したタグは、約５００ｍｓ、４００ｍｓ、３００ｍｓ、２００ｍｓ、１００ｍｓ、９０ｍｓ、８０ｍｓ、７０ｍｓ、６０ｍｓ、５０ｍｓ、４０ｍｓ、３０ｍｓ、２０ｍｓ、１０ｍｓ、５ｍｓ、または１ｍｓよりも短い平均時間の間、ナノ細孔により検出される。一部の場合において、組み込まれたヌクレオチドに結合したタグは、少なくとも約１００ｍｓの平均時間の間、ナノ細孔により検出され、組み込まれていないヌクレオチドと結合したタグは、１００ｍｓ未満の平均時間の間、ナノ細孔により検出される。
一部の例において、組み込まれたヌクレオチドに連結されたタグは、ナノ細孔にタグが残留する時間、または、組み込まれていないヌクレオチドからナノ細孔を用いて検出されたシグナルに基づいて、増殖相補鎖に組み込まれていないヌクレオチドと結合したタグから識別される。組み込まれていないヌクレオチドは、約１ナノ秒（ｎｓ）〜１００ｍｓ、または約１ｎｓ〜５０ｍｓの間の時間、検出可能なシグナル（たとえば、電圧差、電流）を生成し、一方で、組み込まれたヌクレオチドは、約５０ｍｓ〜５００ｍｓ、または１００ｍｓ〜２００ｍｓの間、持続するシグナルを生成しうる。一部の例において、組み込まれていないヌクレオチドは、約１ｎｓ〜１０ｍｓ、または１ｎｓ〜１ｍｓの間の時間、検出可能なシグナルを生成しうる。一部の例において、組み込まれていないヌクレオチドは、組み込まれたタグがナノ細孔により検出可能となる時間よりも長い（平均）時間、ナノ細孔により検出可能となる。
一部の例において、組み込まれたヌクレオチドは、組み込まれていないヌクレオチドよりも短い時間、ナノ細孔により検出される、および／または、検出可能となる。これらの時間の差および／または比率を用いて、ナノ細孔により検出されるヌクレオチドが組み込まれているか否かを、本明細書に記述されるように決定することができる。
検出期間は、ヌクレオチドがナノ細孔を通る自由な流れに基づいていてもよく；組み込まれていないヌクレオチドは、約１ナノ秒（ｎｓ）〜１００ｍｓ、または約１ｎｓ〜５０ｍｓの間の時間、ナノ細孔に滞留し、または近接し、一方で、組み込まれたヌクレオチドは、約５０ｍｓ〜５００ｍｓ、または１００ｍｓ〜２００ｍｓの間の時間、ナノ細孔に滞留し、または近接しうる。期間は処理状態によって変化しうるが、しかしながら、組み込まれたヌクレオチドは、組み込まれていないものよりも長い時間、滞留しうる。
重合（たとえば、組込み）および検出の両方を、互いに干渉せずに進行させることができる。一部の実施態様において、第一のタグ化ヌクレオチドの重合は、第二のタグ化ヌクレオチドと結合したタグのナノ細孔検出を、はっきりとは干渉しない。一部の実施態様において、第一のタグ化ヌクレオチドと結合したタグのナノ細孔検出は、第二のタグ化ヌクレオチドの重合を干渉しない。一部の例において、タグは、ナノ細孔による検出に十分な長さであり、および／または、ヌクレオチド組込み事象を妨害することなく検出するために十分な長さである。
タグ（またはタグ種）は、検出可能な原子もしくは分子、または複数の検出可能な原子もしくは分子を含有しても良い。一部の例において、タグは、核酸分子のリン酸基、糖、もしくは窒素性塩基を含む、任意の位置に連結された、１以上のアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、または、それらの誘導体を含有する。一部の例において、タグは、核酸塩基のリン酸基に共有結合された、１以上のアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、またはそれらの誘導体を含む。
タグは、少なくとも約０．１ナノメーター（ｎｍ）、１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４，ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、または、１０００ｎｍの長さを有しても良い。
タグは、たとえば複数のアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、またはそれらの誘導体等の、反復サブユニットの尾部を有しても良い。たとえば、タグは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、またはそれらの誘導体の、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０００、１０，０００、または、１００，０００のサブユニットを有する尾部を含有しても良い。当該サブユニットは、互いに、核酸のリン酸基に連結された末端で、連結されていても良い。タグ部分の他の例は、たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリスルホン酸塩、アミノ酸、または、任意の完全に、もしくは部分的に正荷電された、陰荷電された、または荷電されていないポリマー等の、任意のポリマー物質が挙げられる。
タグ種は、組込みの間に、組み込まれた核酸分子のタイプに特有な、電子的特徴を有してもよい。たとえば、アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルである核酸塩基は、それぞれ、アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルに特有な１以上の種を有するタグ種を有しても良い。
図６において、ナノ細孔により検出される際に、異なるタグにより生成される異なるシグナルの例を示す。４つの異なるシグナル強度（６０１、６０２、６０３、および６０４）が検出される。これらは、４つの異なるタグに対応しうる。たとえば、ナノ細孔に提示されるタグ、および／または、アデノシン（Ａ）の組み込みにより放出されるタグは、振幅６０１のシグナルを生成しうる。ナノ細孔に提示され、および／または、シトシン（Ｃ）の組み込みにより放出されるタグは、より高い振幅６０３のシグナルを生成し；ナノ細孔に提示され、および／または、グアニン（Ｇ）の組み込みにより放出されるタグは、さらに高い振幅６０４のシグナルを生成し；および、ナノ細孔に提示され、チミン（Ｔ）の組み込みにより放出されるタグは、さらに高い振幅６０２のシグナルを生成しうる。また、図６において、ヌクレオチド組込み事象で、ヌクレオチドから放出され、および／または、ナノ細孔に提示される、タグ分子の検出例を示す。本明細書に記述される方法は、ナノ細孔に挿入され、次いで開裂されるタグ（たとえば、図４、Ｄを参照のこと）と、浮遊し、開裂されていないタグ（たとえば、図４、Ｆを参照のこと）を識別することが出来うる。
本明細書に記述される方法は、放出された（または開裂された）タグと、放出されていない（または開裂されていない）タグの間を、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９５％、または、少なくとも約９９．９９％、または、少なくとも約９９．９９９％、または、少なくとも約９９．９９９９％の精度で、識別することが出来ても良い。
図６に関して、電流の強度は、タグにより、任意の適切な量（約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または、約９９％）にまで減少されても良い。一部の実施態様において、電流の強度は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または、少なくとも９９％まで減少される。一部の実施態様において、電流の強度は、最大で５％、最大で１０％、最大で１５％、最大で２０％ｏ、最大で２５％、最大で３０％、最大で４０％、最大で５０％、最大で６０％、最大で７０％、最大で８０％、最大で９０％、最大で９５％、または、最大で９９％まで減少される。
当該方法にはさらに、個々のタグ化ヌクレオチドの組み込みの間の時間を検出することが含まれても良い（たとえば、図６の期間６０５）。個々のタグ化ヌクレオチドの組み込みの間の期間は、高い強度の電流を有しても良い。一部の実施態様において、ヌクレオチド組込み事象の間のナノ細孔を通る電流の強度は、最大電流（たとえば、タグが存在しない場合）の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約９９％である（たとえば、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約９９％に戻る）。一部の実施態様において、ヌクレオチド組込み事象の間のナノ細孔を通る電流の強度は、最大電流の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または、少なくとも９９％である。個々のタグ化ヌクレオチドの組み込みの間の期間中の、電流の検出および／または観察によって、一部の例（たとえば、連続して３以上の同じ塩基等の核酸の反復配列を配列決定する場合）においては、配列決定の精度が改善されうる。ヌクレオチド組込み事象の間の期間は、クロック信号として用いられても良く、それにより、配列決定される核酸分子またはそのセグメントの長さが与えられる。
本明細書に記述される方法は、組み込まれた（たとえば、重合された）タグ化ヌクレオチドと、重合されていないタグヌクレオチドの間を識別することが出来ても良い（たとえば、図５の５０６と５０５）。一部の例において、組み込まれたタグ化ヌクレオチドは、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％ｏ、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９５％、または少なくとも約９９．９９％、または少なくとも約９９．９９９％、または少なくとも約９９．９９９９％の精度で、組み込まれていないタグヌクレオチドから識別されてもよい。
タグとナノ細孔との結合
一態様では、本明細書に記載される方法および装置は、タグがナノ細孔と結合し、および／またはナノ細孔によって検出可能な時間量（または回数の比）に部分的に基づいて、核酸分子に組み込まれているタグ付きヌクレオチドと、組み込まれていないタグ付きヌクレオチド核酸分子とを区別する。いくつかの例では、ヌクレオチドとポリメラーゼとの相互作用は、タグがナノ細孔と結合し、および／またはナノ細孔によって検出できる時間の量を増加させる。いくつかの場合では、タグは、ナノ細孔と相互作用し、および／または結合する。
タグは、ナノ細孔から取り除くよりも、ナノ細孔に挿入するほうが比較的容易になる可能性がある。いくつかの例では、ナノ細孔から離脱するタグに比べ、タグは、より急速におよび／または少ない力でナノ細孔に入る。ナノ細孔と結合すると、タグは、ナノ細孔に入った方向からナノ細孔から離脱するタグと比較して、急速におよび／またはより少ない力でナノ細孔を通過することができる。
タグとナノ細孔の間の結合は、非共有結合、可逆的、静電気または動電力またはその組み合わせ等の、任意の適切な力または相互作用になることができる。いくつかの場合では、タグはナノ細孔と相互作用するように設計され、ナノ細孔は突然変異しているか、またはタグと相互作用するように設計され、またはタグとナノ細孔の両方は互いの結合を形成するように設計または選択されている。
タグとナノ細孔との結合は、任意の適切な強度になることができる。いくつかの場合では、結合は、ナノ細孔からタグを駆出せずに電極を再充電することができるほど十分に強い。ナノ細孔の両端の電圧の極性を反転し、電極を再充電することができ、いくつかの例では、再び変転させ、タグがナノ細孔を残さないでタグを検出することができる。
図１９は、タグ付きヌクレオチド１９０２のタグ部分が、親和性パートナー（例えば、親和性分子）、またはポリメラーゼと反対のナノ細孔１９０１側の結合パートナー１９０３と結合および／または相互作用する例を示す。アフィニティー分子または結合パートナー１９０３は、ナノ細孔１９０１から分離しているが、ナノ細孔に結びついているか、または代替として、ナノ細孔１９０１の一部であることができる。結合パートナーは、ナノ細孔または膜等の任意の適切な表面に結合させることができる。いくつかの例では、タグ分子と結合パートナーとの任意の適切な組合せを使用することができる。いくつかの例では、タグ分子と結合パートナーは、互いにハイブリダイズする核酸分子を含む。いくつかの例では、タグ分子と結合パートナーは互いに結合するストレプトアビジンおよびビオチンを含む。代替として、結合パートナー１９０３は、ナノ細孔１９０１の一部であってもよい。
図２０は、タグ付きヌクレオチドがヌクレオチド部分２００１およびタグ部分に逆とげのあるタグ部分２００２を含む例を示す。タグ部分は、タグがナノ細孔に入る方向にナノ細孔から逃れるより、簡単に（例えば、より速くおよび／またはより少ない力で）ナノ細孔２００３を通って流れるように（例えば、逆とげのある）に形成される。一実施形態では、タグ部分は、一本鎖核酸を含み、および塩基（例えば、Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ）がタグ付けされたヌクレオチド（すなわち逆とげのある）塩基部分２００１に向かって指す角度で、核酸タグの骨格に接続される。代替として、ナノ細孔は、（例えば、ナノ細孔から）第一方向に沿ったタグ部分の流れを許容し、第二方向（例えば、第二方向とは逆の方向）に沿ってタグ部分が流れることを防ぐフラップまたは他の障害物を含むことができる。フラップは、任意のヒンジ付き障害物であってもよい。
（例えば、ナノ細孔の細孔部分で）ナノ細孔と結合および／または関連付けるために、（例えば、定向進化を使用して）タグを設計または選択してよい。いくつかの実施形態では、タグは、ナノ細孔に結合する疎水性、親水性、正電気を帯びた、および負電気を帯びたアミノ酸残基の配列を有するペプチドである。いくつかの実施形態では、タグは、ナノ細孔と結合する塩基配列を有する核酸である。
ナノ細孔は、突然変異をしてタグ分子に関連付けてもよい。例えば、ナノ細孔は、（例えば、定方向進化を使用して）設計または選択し、タグ分子に結合する疎水性、親水性、正電気を帯びた、および負電気を帯びたアミノ酸残基の配列を有することができる。アミノ酸残基は、ナノ細孔の前庭および／または細孔であることができる。
ナノ細孔からタグの排出
本開示は、タグ分子がナノ細孔から排出する方法を提供する。例えば、タグがナノ細孔に属する、または、例えば、配列決定の最中等のヌクレオチドの取り込み事象でナノ細孔に提示される場合において、タグ分子を排出するように、チップを適合させることができる。タグは、それが（例えば、タグがナノ細孔を通過しないで）ナノ細孔に入った方向から反対方向に排出されてもよく、例えば、タグは、第一の開口からナノ細孔に配向されてもよく、第一の開口とは異なる第二の開口からナノ細孔から排出されてもよい。あるいは、タグは、それがナノ細孔に入った開口部から排出してもよく、例えばタグは、第一の開口からナノ細孔に配向されてもよく、第一の開口からナノ細孔から排出されてもよい。
本発明の一態様は、核酸試料を配列決定するためのチップを提供し、チップは、個々にアドレス可能な複数のナノ細孔を含み、集積回路に隣接して配置された膜に形成された少なくとも一つのナノ細孔を有する複数の個々にアドレス可能なナノ細孔を含み、それぞれ、ナノ細孔からタグ分子を排出するように適合された個別にアドレス指定可能なナノ細孔である。いくつかの実施形態では、チップは、タグがナノ細孔に入った方向にタグを排出するように適合される（または方法によって排出される）。いくつかの場合では、ナノ細孔は、電圧パルスまたは一連の電圧パルスでタグ分子を排出する。電圧パルスは、約１ナノ秒〜１分、または１０ナノ秒〜１秒の持続時間を有してよい。
２つのタグ分子が同時にナノ細孔に存在しないような期間内に、タグ分子を排出する（または方法によって排出する）ようにナノ細孔を適合してよい。２つの分子が同時にナノ細孔に存在する確率は最大１％、最大０．５％、最大０．１％、最大０．０５％、またはいくつかの実施形態では最大０．０１％である。
いくつかの例では、タグがナノ細孔に入ったときの約０．１ミリ秒、０．５ミリ秒、１ミリ秒、５ミリ秒、１０ミリ秒、または５０ミリ秒（より短い時間期間内に）タグ分子を排出するようにナノ細孔は適合される。
タグは、電位（または電圧）を用いて、ナノ細孔から排出することができる。電圧は、いくつかの場合では、ナノ細孔にタグを描画するために使用される極性とは反対の極性であることができる。電圧は、少なくとも約１ナノ秒、１０ナノ秒、１００ナノ秒、５００ナノ秒、１マイクロ秒、１００マイクロ秒、１ミリ秒（ｍｓ）で、５ミリ秒、１０ミリ秒、２０ミリ秒、３０ミリ秒、４０ミリ秒、５０ミリ秒、１００ミリ秒、２００ミリ秒、３００ミリ秒、４００ミリ秒、５００ミリ秒、６００ミリ秒、７００ミリ秒、８００ミリ秒、９００ミリ秒、１秒、２秒、３秒、４秒、５秒、６秒、７秒、８秒、９秒、１０秒、１００秒、２００秒、３００秒、４００秒、５００秒、または１０００秒の周期を有する交流電流（ＡＣ）波形を用いて適用することができる。
交流電流（ＡＣ）波形の変化
核酸鎖をナノ細孔を通過させることよって核酸分子を配列決定するには、（例えば、分子がナノ細孔を移動する方向が反転しないように）直流電流を印加する必要がある可能性がある。しかしながら、直流を用いて長時間ナノ細孔センサーを操作することによって、電極の組成が変化し、ナノ細孔を横切るイオン濃度をアンバランスにし、および他の望ましくない影響を有する可能性がある。交流電流（ＡＣ）波形を印加すると、これらの望ましくない効果を避けることができ、下記のように特定の利点を有することができる。タグ付きヌクレオチドを利用した本明細書に記載の核酸配列決定法は、ＡＣ印加された電圧と完全に互換性があり、したがって、前記利点を達成するために使用することができる。
犠牲電極または通電反応（例えば、銀を含む電極）で分子特性を変化させる電極、または通電反応で分子特性を変化させる電極を使用するときに、検出サイクル中に電極を再充電する能力は有利である。いくつかの場合では、電極は、検出サイクル中に枯渇しないが、検出サイクルの最中に枯渇する可能性がある。再充電することによって、電極が完全に枯渇する等の所与の枯渇限界に達することを防ぐことができ、このことは電極が小さいとき（例えば、電極は平方ミリメートル当たり少なくとも５００個の電極を有する電極の配列を提供するのに十分小さいとき）に問題になり得る。いくつかの場合では、電極の寿命が増減し、少なくとも部分的に電極の幅に依存する。
いくつかの例では、電極は、多孔質および／または「海綿状」である。多孔質電極は、非多孔性電極に比べ、バルク液体の二重層の静電容量を高めることができる。多孔質電極は、界面活性剤の存在下で表面に金属（例えば、貴金属）を電気鍍金することによって形成することができる。電気鍍金される金属は、任意の適切な金属であってよい。金属は、貴金属（例えば、パラジウム、銀、オスミウム、イリジウム、白金、銀、または金）であることができる。いくつかの場合では、表面は、金属表面（例えば、パラジウム、銀、オスミウム、イリジウム、白金、銀、または金）である。いくつかの場合では、表面は直径が約５ミクロンであり、滑らかである。洗剤は、表面にナノメートルスケールの間隙空間を作成することができ、多孔質または「海綿状」にする。多孔質および／または海綿状の電極を製造するための別の方法は、金属酸化物（例えば、酸化白金）を堆積させることであり、還元剤（例えば、４％Ｈ２）に暴露することである。還元剤は、金属酸化物（例えば、酸化白金）を金属（例えば、白金）に還元することができ、そうすることで海綿状および／または多孔質電極を提供することができる。（例えば、パラジウム）海綿は、電解液を吸収し、大きな有効表面積を作成することができる（例えば、電極トップダウン面積１平方ミクロン当たり３３ピコファラッド）。本明細書に記載されるように多孔質にすることによって、電極の表面積を増大させることによって、完全に枯渇しない静電容量を有する電極を作成することができる。
いくつかの例では、（例えば、核酸をナノ細孔を介して通過させることにより、核酸を配列決定するときに）長時間、検出している間に、ナノ細孔の両端の保存された極性の電圧差を維持する必要性は、電極を枯渇し、検出継続時間および／または電極の大きさの制限することができる。本明細書に記載された装置および方法は、検出時間をより長くし（例えば、無限大）、および／または電極を（検出中の電極の枯渇以外の考慮事項によって制限されるように）任意の小さなサイズに縮小することができる。本明細書に記載されるように、タグは、ポリメラーゼに結合しているほんの一部の時間、検出することができる。検出期間の合間に、ナノ細孔の両端の電圧の極性および／または大きさを切り替える（例えば、ＡＣ波形を印加する）ことによって、電極を再充電することができる。いくつかの場合では、タグは複数回検出される（例えば、１００ミリ秒の期間に、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００回）。
いくつかの例では、ナノ細孔の両端の電圧の極性が周期的に反転する。検出時間を任意の適切な量の時間（例えば、約１ミリ秒、約５ミリ秒、約１０ミリ秒、約１５ミリ秒、約２０ミリ秒、約２５ミリ秒、約３０ミリ秒、約４０ミリ秒、約５０ミリ秒、約６０ミリ秒、約８０ミリ秒、約１００ミリ秒、約１２５ミリ秒、約１５０ミリ秒、約２００ミリ秒等）を持続した後に、電圧の極性を反転することができる。電極の充電期間中の電場の時間および強度（すなわち、電圧の極性は、タグ検出についての電圧と反対である場合）は、検出（例えば、電極の質量）前の状態に、電極が復元するようになっている。ナノ細孔の両端の正味の電圧は、いくつかの例ではゼロである（例えば、正電圧の期間は、１秒、１分、または５分等の適切に長い時間スケールにわたり、負電圧の期間をキャンセルする）。いくつかの場合では、ナノ細孔に印加される電圧は、ナノ細孔に隣接するまたは近接する検出電極によって正味ゼロの電流が検出されるように調和がとれている。
いくつかの例では、交流電流（ＡＣ）波形は、膜中のナノ細孔またはナノ細孔を通過するもしくは近接するタグを描画し、タグを放出するために、膜に隣接する電極に印加される。ＡＣ波形は、少なくとも約１０マイクロ秒、約１ミリ秒（ｍｓ）、約５ミリ秒、約１０ミリ秒、約２０ミリ秒、約１００ミリ秒、約２００ミリ秒、約３００ミリ秒、約４００ミリ秒、約５００ミリ秒の周波数を有することができる。波形が交互に順次タグを捕獲し、タグを放出する、またはそうでなければ複数の方向（例えば、反対方向に）にタグを動かすことを支援し、タグがナノ細孔に関連付けられる全体の時間を増加させてもよい。充電および放電のこのバランスは、ナノ細孔電極および／または所与のタグからのより長い信号を生成することができる。
いくつかの例では、繰り返しナノ細孔の中のタグ付けされたヌクレオチド（例えば、組み込まれたタグ付けされたヌクレオチド）に関連付けられたタグの少なくとも一部に向けて、およびナノ細孔の外の少なくとも一部のタグに向けるように、交流波形を印加する。タグまたはタグに結合されたヌクレオチドは、酵素（例えば、ポリメラーゼ）によって保持されてもよい。酵素によって保持される単一のタグのこの繰り返し負荷と排出は、有利にタグを検出する機会をより多く提供することができる。例えば、タグが４０ミリ秒（ｍｓ）酵素によって保持され、高いＡＣ波形を５ミリ秒間印加し（ナノ細孔の中へタグに向ける）、低いＡＣ波形を５ミリ秒間印加する（ナノ細孔の外のタグに向けられる）場合、ナノ細孔を使用して約４回タグを読み取ることができる。複数回の読み込みによって、ナノ細孔の中へおよび／またはナノ細孔の外から通っているタグに関連するエラー等のエラーを補正することができる。
波形は（例えば、ある期間にわたって繰り返す）規則的な形状および（例えば、１時間、１日または１週間等の任意の適切な長期にわたって繰り返さない）不規則な形状のいずれかを含む任意の適切な形状を有することができる。図２１は、いくつかの適切な（規則的な）波形を示す。波形の例として、三角波、（パネルＡ）、正弦波（パネルＢ）、鋸歯状波、方形波等が挙げられる。
交流電流（ＡＣ）波形を印加したときのように、何らかの理由で、ナノ細孔の両端の電圧極性を反転すること（すなわち、正から負へまたは負から正へ）ことができ、限定されないが（ａ）電極を再充電すること（例えば、金属電極の化学組成を変化させること）、（ｂ）膜のシスおよびトランス側でイオン濃度を再調和すること、（ｃ）ナノ細孔の両端で非ゼロ印加電圧を再確立すること、および／または（ｄ）二重層静電容量を変化させること（例えば、金属電極および分析物の界面に存在する電圧または電荷を、所望のレベル、例えば、ゼロに再設定すること）が挙げられる。
図２１Ｃは、大きさに比例して上方に延びる正電圧および大きさに比例して下方に延びる負電圧を帯びたナノ細孔の両端のゼロ電位差の水平な破線を示す。波形の形状がどうであれ、「デューティサイクル」は、正方向２１００における電圧対時間プロットの曲線の下での複合面積を、負方向２１０１における曲線の下での複合面積と比較する。いくつかの場合では、正面積２１００は、負面積２１０１と等しい（すなわち、正味のデューティサイクルがゼロである）が、ＡＣ波形は、任意のデューティサイクルを有することができる。いくつかの例では、最適化されたデューティサイクルを有するＡＣ波形を法定使用し、（ａ）電気化学的に電極のバランスがとれている（例えば、充電も枯渇もない）、（ｂ）膜のシス側とトランス側のイオン濃度のバランスがとれている、（ｃ）ナノ細孔の両端の印加電圧が周知である（例えば、電極の静電容量の二重層を周期的に再設定し、極性のそれぞれの反転と同じ程度にコンデンサが放電するため）、（ｄ）ナノ細孔中のタグ分子を（例えば、極性のそれぞれの反転を持つタグを排出し、取り戻すことによって）複数回識別する、（ｅ）タグ分子をそれぞれ読み込むことから、追加情報を取り戻す（例えば、測定された電流は、各タグ分子について印加電圧の異なる関数にすることができるため）、（ｆ）ナノ細孔センサーの高密度を達成する、（例えば、金属電極組成は変化していないため、電極を含む金属の量によって制約されない）、および／または（ｇ）チップの低消費電力が達成される、の１つ以上を達成することができる。これらの利点は、装置の継続的な拡張動作（例えば、少なくとも１時間、少なくとも１日、少なくとも１週間）を可能にする。
いくつかの状況では、ナノ細孔の両端に正電位を印加すると、第一の電流を測定し、ナノ細孔の両端に（例えば、正の電位に等しい絶対値の）負電位を印加すると、第二の電流を測定する。第一の電流と第二の電流は等しくなり得るが、いくつかの場合では第一の電流と第二の電流は異なり得る。例えば、第一の電流は、第二の電流より小さくてよい。いくつかの例では、正電流および負電流の一方のみが測定される。
いくつかの場合では、ナノ細孔は、比較的小さい電圧で比較的長時間、タグ付けされたヌクレオチド（例えば、図２１、指示２１００）を検出し、比較的大きい電圧で比較的短時間、電極を再充電する（例えば、図２１、指示２１０１）。いくつかの場合では、検出時間は、電極の充電のための時間よりも、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも５０倍長い。
いくつかの例では、波形は、入力に応じて変更される。いくつかの場合では、入力は、電極の枯渇のレベルである。いくつかの場合では、極性および／または電圧の大きさは、電極の枯渇または通電イオンの枯渇に基づいて、少なくとも部分的に変化し、波形は不規則である。
短時間（例えば、約５秒未満、約１秒未満、約５００ミリ秒未満、約１００ミリ秒未満、約５０ミリ秒未満、約１０ミリ秒未満または約１ミリ秒未満）繰り返し電極を検出し、再充電する能力によって、一定の直流（ＤＣ）電位およびＤＣ電流を維持することができる電極より小さい電極を使用することができ、ナノ細孔を通り抜けるポリヌクレオチドを配列決定するために使用される。より小さい電極は、表面の（例えば、電極、感知回路、ナノ細孔およびポリメラーゼを含む）の多数の検出部位を可能にする。
表面は、別個の部位の任意の適切な密度（例えば、一定時間内または所定のコストで核酸試料を配列決定するために適した密度）を含む。実施形態では、表面は、１ｍｍ２あたり約５００のサイト以上の別個の部位の密度を有する。いくつかの実施形態では、表面は１ｍｍ２あたり、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約２０００、約３０００、４０００、約５０００、約６０００、約７０００、約８０００、約９０００、約１００００、約２００００、約４００００、約６００００、約８００００、約１０００００、または１ミリメートルあたり約５０００００の個別の部位の密度を有する。いくつかの実施形態では、表面は、１ｍｍ２あたり、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくともの別個の部位の密度を有する約９００、少なくとも約１０００、少なくとも約２０００、少なくとも約３０００、少なくとも約４０００、少なくとも約５０００、少なくとも約６０００、少なくとも約７０００、少なくとも約８０００、少なくとも約９０００、少なくとも約１００００、少なくとも約２００００、少なくとも約４００００、少なくとも約６００００、少なくとも約８００００、少なくとも約１０００００、または少なくとも約５０００００のサイトの個別の部位の密度を有する。
電極は、ヌクレオチドの組込み事象の前、間、または最中、または後に再充電することができる。いくつかの場合では、電極は、約２０ミリ秒（ｍｓ）、約４０ミリ秒、約６０ミリ秒、約８０ミリ秒、約１００ミリ秒、約１２０ミリ秒、約１４０ミリ秒、約１６０ミリ秒、約１８０ミリ秒、約２００ミリ秒で再充電される。いくつかの場合では、電極は、約２０ミリ秒（ｍｓ）未満、約４０ミリ秒未満、約６０ミリ秒未満、約８０ミリ秒未満、約１００ミリ秒未満、約１２０ミリ秒未満、約１４０ミリ秒未満、約１６０ミリ秒未満、約１８０ミリ秒未満、約２００ミリ秒未満、約５００ミリ秒未満、または約１秒未満で再充電される。
チップは切断されたタグおよび非切断タグを区別することができる。
別の態様は、核酸試料を配列決定するためのチップを提供する。例では、チップは、複数の個々にアドレス可能なナノ細孔を含む。個々にアドレス可能な複数のナノ細孔は、集積回路に隣接して配置された膜中に形成された少なくとも一つのナノ細孔を有することができる。それぞれ個別にアドレス指定可能なナノ細孔は、タグ分子がヌクレオチドに結合しているか、若しくはヌクレオチドに結合していないかを決定し、または異なるタグ間の変化を読み取るように適応させることができる。
いくつかの場合では、チップは、個々にアドレス可能な複数のナノ細孔を含むことができる。個々にアドレス可能な複数のナノ細孔は、集積回路に隣接して配置された膜中に形成された少なくとも一つのナノ細孔を有することができる。それぞれ個別にアドレス指定可能なナノ細孔は、タグ分子が取り込まれた（例えば、重合された）ヌクレオチドまたは取り込まれていないヌクレオチドに結合しているかどうかを決定するために適合させることができる。
本明細書に記載のチップは、放出タグと非放出タグ（例えば、図４のＤ対Ｆ）を区別することができる。いくつかの実施形態では、チップは放出タグと非放出タグを、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９５％、または少なくとも約９９．９９％の精度で区別することができる。約５、４、３、または２個の連続するヌクレオチドの群を検出するときに、精度レベルは達成することができる。いくつかの場合では、精度は、単一塩基分解能（すなわち、１個の連続するヌクレオチド）について達成される。
本明細書に記載のチップは、組み込まれタグ付けされたヌクレオチドと組み込まれていないタグ付けされたヌクレオチドを区別することができる（例えば、図５の５０６と５０５）。いくつかの実施形態では、チップは組み込まれたタグ付けされたヌクレオチドと組み込まれていないタグ付けされたヌクレオチドを、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９５％、または少なくとも約９９．９９％の精度で区別することができる。約５、４、３、または２個の連続するヌクレオチドの群を検出するときに、精度レベルは達成することができる。いくつかの場合では、精度は、単一塩基分解能（すなわち、１個の連続するヌクレオチド）について達成される。
ナノ細孔は、少なくとも部分的に電気信号の差に基づいて、タグ分子はヌクレオチドに結合しているのか、またはヌクレオチドに結合していないのかどうかを決定するのを補助することができる。いくつかの場合では、ナノ細孔は、少なくとも部分的にナノ細孔中の滞留時間に基づいて、タグ分子がヌクレオチドに結合しているのか、またはヌクレオチドに結合していないのかどうかを決定するのを補助することができる。ナノ細孔は、少なくとも部分的にタグまたはタグ付けされたヌクレオチドがナノ細孔を出ていく電圧である脱落した電圧に基づいて、タグ分子ヌクレオチドがヌクレオチドに結合しているかどうかを決定するのを補助することができる。
チップは、高い割合の切断されたタグを捕獲することができる
別の態様は、核酸試料を配列決定するためのチップを提供する。例では、チップは、複数の個々にアドレス可能なナノ細孔を含む。個々にアドレス可能な複数のナノ細孔は、集積回路に隣接して配置された膜中に形成された少なくとも一つのナノ細孔を有することができる。それぞれ個別にアドレス指定可能なナノ細孔は、タグ付けされたヌクレオチドを取り込む（例えば、重合）ときに放出されるタグ分子の大部分を捕獲するように適合することができる。
チップは、（例えば、適切に高精度の核酸配列を決定するために）タグの任意の適切に高い割合を捕獲するように構成することができる。いくつかの実施形態では、チップは、タグ分子の少なくとも９０％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９％、または少なくとも９９．９９％を捕獲する。
いくつかの実施形態では、ナノ細孔は、単一の電流レベルで、複数の異なるタグ分子を捕獲する（例えば、４個のヌクレオチドを取り込むときに放出される４個の異なるタグ分子）。チップは、タグ分子が放出されるのと同じ順序でタグ分子を捕獲するように適合させることができる。
装置のセットアップ
図８は、本明細書に記載の核酸を配列決定し、および／またはタグ分子を検出するために使用され得るナノ細孔装置１００（またはセンサー）を模式的に示す。脂質二重層を含むナノ細孔は、抵抗と静電容量を特徴とする。ナノ細孔装置１００は、導電性固体基板１０６の脂質二重層互換性表面１０４上に形成される脂質二重層１０２を含み、脂質二重層互換性表面１０４は、脂質二重層非互換性表面１０５によって絶縁されてもよく、導電性固体基板１０６は絶縁材料１０７によって電気的に絶縁されてもよく、脂質二重層１０２は脂質二重層非互換性表面１０５に形成される非晶質脂質１０３によって囲まれていてもよい。脂質二重層１０２は、特徴付けられたタグ分子および／または脂質二重層１０２の２つの側の間の小イオン（例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、ＣＩ−“）を通過するのに十分に大きいナノ細孔１１０を有する単一のナノ細孔構造１０８を埋め込むことができる。水分子の層１１４は、脂質二重層互換性表面１０４上で吸収され、脂質二重層１０２と脂質二重層互換性表面１０４の間に挟まれてもよい。親水性の脂質二重層互換性表面１０４上で吸収される水性膜１１４は、脂質分子の順序付けを促進し、脂質二重層互換性表面１０４上での脂質二重層の形成を容易にすることができる。核酸分子１１２の溶液を含有する試料室１１６タグ付きヌクレオチドは、脂質二重層１０２上に設けることができる。溶液は、電解質を含有する水溶液であってもよく、最適なイオン濃度に緩衝され、ナノ細孔１１０を開口し続けるように最適なｐＨで維持されてよい。装置は、脂質二重層の両端に電気的刺激（例えば、電圧バイアス）を提供し、脂質二重層の電気的特性（例えば、抵抗、静電容量、およびイオン電流の流れ）を検知するために可変電圧源１２０に結合された一対の電極１１８（負のノード１１８ａおよび正のノード１１８ｂを含む）を含む。正電極１１８ｂの表面は、脂質二重層互換性表面１０４の一部であるか、または形成する。導電性固体基板１０６は、電極１１８の１つの一部に結合され、または形成してもよい。装置１００はまた、電気刺激を制御し、検出された信号を処理するために、電気回路１２２も含んでよい。いくつかの実施形態では、可変電圧源１２０は、電気回路１２２の一部として含まれる。電気回路１２２は、増幅器、積分器、ノイズフィルタ、フィードバック制御ロジック、および／または様々な他の成分を含んでもよい。電気回路１２２は、シリコン基板１２８内に集積電気回路を統合してもよく、さらにメモリ１２６に電対されたコンピュータープロセッサ１２４に電対することができる。
脂質二重層互換性表面１０４は、イオン伝達および脂質二重層の形成を容易にするガス形成に適した様々な材料から形成することができる。いくつかの実施形態では、それらは、脂質二重層の電気的特性の変化を良好に検出することができるため、導電性または半導電性の親水性の材料を用いることができる。例示的な材料として、Ａｇ−ＡｇＣｌ、Ａｕ、Ｐｔ、またはドープシリコンまたは他の半導体材料が挙げられる。いくつかの場合は、電極は、犠牲電極ではない。
脂質二重層非互換性表面１０５は、脂質二重層の形成に適していない様々な材料から形成することができ、それらは一般的に疎水性である。いくつかの実施形態では、互いから電気的に脂質二重層領域を分離する他に、脂質二重層領域を絶縁するため、非導電性の疎水性材料が好ましい。脂質二重層非互換性材料の例として、例えば窒化ケイ素（例えば、Ｓｉ３Ｎ４）、テフロン、疎水性分子でシラン化されたシリコン酸化物（例えば、ＳｉＯ２）が挙げられる。
ある例では、図８のナノ細孔装置１００は、アルミニウム材１０６上にコーティングされた脂質二重層互換性銀（Ａｇ）の表面１０４上に形成されたジフィタノイルホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）脂質二重層１０２に埋め込まれた単一のアルファ溶血素（ａＨＬ）タンパク質１０８を有するアルファ溶血素（ａＨＬ）ナノ細孔装置である。脂質二重層互換性Ａｇ表面１０４は、脂質二重層非互換性窒化ケイ素表面１０５により絶縁され、アルミニウム材１０６はシリコン窒化物材料１０７によって電気的に絶縁されている。アルミニウム１０６はシリコン基板１２８に一体化されている電気回路１２２に電対されている。チップ上に配置された、またはカバープレート１２８から下方向に延びている銀−塩化銀電極は、核酸分子を含有する水溶液と接触する。
ａＨＬナノ細孔は、７個の個別のペプチドのアセンブリである。ａＨＬのナノ細孔の入り口または前庭は、直径が約２６オングストロームであり、ｄｓＤＮＡの分子の一部を収容するのに十分に広幅である。前庭から、ａＨＬのナノ細孔は、最初に広がり、次に約１５オングストロームの直径を有するバレルに狭くなり、単一のｓｓＤＮＡ分子（またはより小さなタグ分子）が通過するのに十分に広幅であるが、ｄｓＤＮＡ（またはより大きなタグ分子）が通過するには十分に広幅ではない。
ＤＰｈＰＣの他に、ナノ細孔装置の脂質二重層は、様々な他の適切な両親媒性の材料から組み立てることができ、使用されるナノ細孔の種類、特徴付けられる分子の種類、安定性および透過性、抵抗、および形成される脂質二重層の静電容量等の形成される脂質二重層の種々の物理的、化学的および／また電気的特性等の様々な考慮事項に基づいて選択される。両親媒性材料の例として、パルミトイル−オレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）およびジオレオイル−ホスファチジル−メチルエステル（ＤＯＰＭＥ）、ジフィタノイルホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）、１、２−ジ−Ｏ−フィタニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤｏＰｈＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、およびスフィンゴミエリン等の様々なリン脂質が挙げられる。
上記に示したａＨＬナノ細孔の他に、ナノ細孔はナノ細孔の他の様々な種類のものであってもよい。例として、γ溶血素、ロイコシジン、メリチン、マイコバクテリアスメグマチスポリンＡ（ＭｓｐＡ）、様々な他の天然に存在する、改変された天然、および合成ナノ細孔が挙げられる。適切なナノ細孔は、ナノ細孔の細孔径に関係する分析物分子の大きさ等の分析物分子の種々の特性に基づいて選択することができる。例えば、約１５オングストロームの限定的な孔サイズを有するａＨＬナノ細孔がある。
電流測定
いくつかの場合では、異なる印加電圧で電流を測定してもよい。これを達成するために、所望の電位を電極に印加することができ、印加された電位は、その後、測定全体にわたって維持することができる。以下に説明するように、実装では、オペアンプ積分器トポロジーをこの目的のために使用することができる。積分器は、静電容量性フィードバックを用いて電極の電位を維持する。積分回路は、優れた直線性、セル間の整合を提供し、特徴を相殺することができる。オペアンプ積分器は、典型的には、必要な性能を達成するために大きなサイズを必要とする。よりコンパクトな積分器トポロジーについて以下に説明する。
いくつかの場合では、電位「Ｖｌｉｑｕｉｄ」は、チップ上のすべてのセルに共通の電位（例えば、３５０ｍＶ）を提供するチャンバに適用してもよい。積分回路は、一般的な液体電位よりも高い電位に（電気的に積分コンデンサの天板である）電極を初期化することができる。例えば、４５０ｍＶで付勢することによって、電極と液体の間の正の１００ｍＶの電位を与えることができる。この正の電圧は、電流を電極から液室接触へ流すことができる。この例では、キャリアは以下のである。（ａ）二層の電極（トランス）側から二層の液溜め（シス）側へポアを通って流れるＫ＋イオン、および（ｂ）電気化学反応：Ａｇ＋Ｃｌ−→ＡｇＣｌ＋ｅ−により銀電極と反応するトランス側の塩素（Ｃｌ−）イオン。
いくつかの場合では、Ｃｌ−が塩化銀に変換されている間に、Ｋ＋が（二層トランスからのシス側に）流出する。二重層の電極側が電流の流れの結果として脱塩され得る。いくつかの場合では、銀／塩化銀液体スポンジ材またはマトリックスは、回路を完成するために、電気室の接点で発生する逆反応にＣｌ−イオンを供給するためのリザーバとして機能することができる。
いくつかの場合では、電子は測定された電流を生成する積分コンデンサの上面側に最終的に流れる。電気化学反応によって銀は塩化銀に変換し、電流は変換される利用可能な銀がある限り流れ続ける。いくつかの場合では、限定される銀の供給が、電流に依存する電極の寿命につながる。いくつかの実施形態では、枯渇していない電極材料（例えば、白金）が用いられる。
一定の電位をナノ細孔検出器に印加した場合、タグはナノ細孔を通って流れるイオン電流を調節することができ、電流の記録によってタグの同一性を決定することができる。しかし、一定の電位は異なるタグを十分に区別できない（例えば、Ａ、Ｃ、ＴまたはＧに関連付けられたタグ）。ある態様では、印加電圧を変化させて（例えば、電圧の範囲にわたって掃引する）、（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９％、少なくとも９９．９９％の信頼度で）タグを識別することができる。
図２１に示す波形のいずれかに従うことを含む任意の適切な方法で、印加電圧を変化させることができる。電圧は約１２０ｍＶから約１５０ｍＶ、約４０ｍＶから約１５０ｍＶを含む任意の適切な範囲にわたって変化させることができる。
図２２は、抽出された信号（例えば、差分ログコンダクタンス（ＤＬＣ））対ヌクレオチドアデニン（Ａ、緑）、シトシン（Ｃ、青）、グアニン（Ｇ、黒）とチミン（Ｔ、赤）についての印加電圧を示す。図２３は、複数のヌクレオチド（多くの実験試行）について同じ情報を示す。ここに見られるように、シトシンは、１２０ｍＶで比較的容易にチミンと区別するが、１５０ｍＶで互いを区別することは難しい（例えば、抽出された信号は１５０ｍＶでのＣとＴにほぼ等しいため）。また、チミンは１２０ｍＶでアデニンと区別することは難しいが、１５０ｍＶで区別することは比較的容易である。したがって、実施形態では、印加電圧は、ヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧおよびＴのそれぞれを区別するために、１２０ｍＶ〜１５０ｍＶの範囲で変化させることができる。
図２４は、ヌクレオチドアデニン（Ａ、緑）、シトシン（Ｃ、青）、グアニン（Ｇ、黒）およびチミン（Ｔ赤）について印加電圧の関数として、パーセントの基準導電性の差を示す（％ＲＣＤ）。（本質的に３０Ｔの参照分子に参照される各分子のコンダクタンスの差である）％ＲＣＤをプロットすると、オフセットを取り除き、実験間の変動を得ることができる。図２４は１７／２０試行の最初のブロックからの個々のＤＮＡ波形を含む。全ての一塩基のＤＮＡの％ＲＣＤは、全１７の良好な試行について番号５０〜２００を捕獲する。ヌクレオチドの各々が識別可能である電圧を示す。
図２２〜２４は、ヌクレオチドについて変化した印加電圧に対する反応を示し、様々な印加電圧の概念は、タグ分子（例えば、タグ付きヌクレオチドに結合している）を区別するために使用することができる。
セル回路
セル回路の一例を図１２に示す。印加電圧ＶａはＭＯＳＦＥＴ電流コンベアゲート１２０１の前方のオペアンプ１２００に適用される。また、電極１２０２並びに装置１２０３によって検出された核酸および／またはタグの抵抗もここに示す。
印加電圧Ｖａが電流コンベアゲート１２０１を駆動することができる。電極に生じる電圧はＶａ−Ｖｔであり、ＶｔはＭＯＳＦＥＴのしきい値電圧である。いくつかの例では、このことによって、ＭＯＳＦＥＴの閾値電圧は、プロセス、電圧、温度、さらにはチップ内の装置間でもかなり変化するため、電極に印加される実際の電圧の制限された制御がもたらされる。このＶｔの変動は、サブスレッショルド・リーク効果が作用し始めることができる、低電流レベルで大きくすることができる。したがって、印加電圧のよりよい制御を提供するために、オペアンプを、電流コンベア装置と共に従動フィードバック構成で使用することができる。このことによりＭＯＳＦＥＴのしきい値電圧の変動とは無関係に、電極に印加される電圧がＶａであることを保証する。
セル回路の別の例を図１０に示し、積分器、比較器、および制御ビットをシフトし、同時に比較器出力の状態をシフトアウトするデジタル・ロジックを含む。セル回路は、本明細書に提供されるシステムおよび方法と共に使用するために適合させることができる。Ｂ１ラインを通るＢ０は、シフトレジスタから来てもよい。デジタルラインがセルからセルへのデイジーチェーンであることができる一方で、アナログ信号はバンク内の全てのセルによって共有される。
セルデジタル論理は、５ビットデータシフトレジスタ（ＤＳＲ）、５ビットの並列ロードレジスタ（ＰＬＲ）、制御ロジック、およびアナログ積分器回路を含む。ＬＩＮ信号を用いて、ＤＳＲ内にシフトされる制御データをＰＬＲに平行してロードされる。これらの５ビットは、セル内でスイッチを制御する、デジタル「ブレークビフォメーク」タイミングロジックを制御する。さらに、デジタルロジックは、コンパレータ出力の切り替えを記録するためのセット・リセット（ＳＲ）ラッチを有する。
アーキテクチャは、個々のセルの電流に比例する可変サンプルレートを提供する。電流がより高いと低い電流より毎秒サンプルが多くなり得る。電流測定の分解能は、測定される電流に関係する。小さな電流が大きい電流よりより細かい分解能で測定することができ、固定分解能測定システムを上まわる利益になり得る。ユーザーが積分器の電圧振幅を変化させることにより、サンプルレートを調整することを可能にするアナログ入力がある。これは、生物学的に速いプロセスを分析するために、サンプルレートを増加させ、または生物学的に遅いプロセスを分析するために、サンプルレートを遅くする（それにより精度を得る）ことが可能である。
積分器の出力は、電圧ＬＶＢ（低電圧バイアス）に初期化され、電圧ＣＭＰまで積分される。積分器出力がこれらの２つのレベル間で振幅するたびに、サンプルが生成される。したがって、電流が大きいほど、積分器出力が速く振幅し、サンプルレートがより速くなる。ＣＭＰ電圧が低下した場合も同様に、新たなサンプルを生成するために必要な積分器の出力振幅が減少し、したがって、サンプルレートが増加する。したがって、単にＬＶＢとＣＭＰとの間の電圧差を減少させることによって、サンプルレートを増加する機構を提供する。
ナノ細孔に基づく配列決定チップは、自律的に動作するか、個別にアドレス指定可能なアレイとして構成される多数のセルを取り込むことができる。例えば、１００万個のセルのアレイは、セルの１０００列によるセルの１０００行で構成することができる。この配列は、ヌクレオチドの組込み事象の際に放出されたタグが、例えば、ナノ細孔によって検出されるときに、コンダクタンスの差を測定することによって、核酸分子のパラレルシークエンシングを可能にする。さらにこの回路の実装は、タグ間を区別するのに価値があり得る細孔‐分子複合体のコンダクタンスの特徴を決定することを可能にする。
集積ナノ細孔／二重層電子セル構造は、電流測定を行うために適切な電圧を印加することができる。例えば、（ａ）電極電位を制御し、および（ｂ）正しく行うために、同時に電極電流をモニターすることの両方が必要になり得る。
さらに、互いから独立したセルを制御する必要があり得る。セルの独立した制御は、異なる物理的状態にあってもよい多数のセルを管理するために必要とされ得る。電極に印加される区分線形電圧波形刺激の正確な制御は、セルの物理的状態との間で移行するために使用することができる。
回路規模および複雑さを低減するために、２つの別々の電圧を印加するためのロジックを提供することは差支えない。このことによって、セルの２つの独立した群および対応する状態遷移刺激を適用することが可能となる。状態遷移は、比較的低い発生率で、本質的に確率論的である。したがって、適切な制御電圧を断定し、その後、所望の状態遷移が発生したかどうかを決定するために測定することができることが極めて有用であり得る。例えば、適切な電圧をセルに印加し、その後、二重層が形成されたか否かを決定するために電流を測定してよい。セルは、２つの群に分けられる。（ａ）二層の形態を有しており、もはや電圧を印加する必要がないもの。これらのセルは、ヌルオペレーション（ＮＯＰ）を行うために適用され、０Ｖのバイアスを有していてもよく、同じ状態にとどまる、および（ｂ）二重層が形成されていないもの。これらのセルは、電圧が印加した二層形態を再び有する。
実質的に単純化し、回路サイズを縮小することは、許容印加電圧を２つに制約し、物理的な状態間のバッチのセルを繰り返し移行することによって達成できる。例えば、許容印加電圧を制約することによって、少なくとも１．１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、または１００個の因子の減少を達成することができる。
さらにコンパクトな測定回路を用いる本発明の別の実施形態を、図１１に示す。いくつかの例では、小型の測定回路は、本明細書に記載の高いアレイ密度を達成するために使用することができる。この回路はまた、同時に低レベルの電流を測定しながら、電極に電圧を印加するようにも設計されている。
セルは、超小型積分器（ＵＣＩ）として動作し、基本的な操作は、本明細書に記載する。セルはＥｌｅｃｔｒｏｄ−Ｓｅｎｓｅ（ＥＬＳＮＳ）接続を介して電気化学的に活性な電極（例えば、塩化銀）に電気的に接続される。ＮＭＯＳトランジスタＭ１１は２つの独立した機能を実行する：（１）（Ｖｇ１−Ｖｔ１）によって与えられるＥＬＳＮＳノードに電圧を印加するソースフォロワとして動作し、および（２）コンデンサＣ１からＥＬＳＮＳノード（およびその逆）に電子を移動するために電流コンベヤとして動作する。
いくつかの例では、制御された電位をＥＬＳＮＳ電極に印加してもよく、これは、電極ソースフォロワミルＭｌｌのゲートの電圧を変更するだけで変化し得る。さらにＭｌｌのソースピンからの電流は、コンデンサＣ０に蓄積するＭｌｌドレイン端子に直接かつ正確に伝達される。したがって、ＭｌｌとＣ０は、超小型の積分器として一緒に作動する。この積分器は、以下に係るコンデンサ上に集積された電圧の変化を測定することにより、電極に／から供給され／低くなった電流を決定するために使用してよい。Ｉ＊ｔ＝Ｃ＊Ｖであり、Ｉは電流であり、ｔは時間であり、Ｃは静電容量であり、Ｖは電圧変化である。
いくつかの場合では、固定された間隔ｔ（例えば、１ミリ秒毎）に電圧変化を測定する。
トランジスタＭ２は、コンデンサの電圧をバッファリングし、積分電圧の低インピーダンス表現を提供するために、ソースフォロワとして構成されてもよい。これによって電荷共有がコンデンサの電圧を変化することを防ぐ。
トランジスタＭ３は、多くの他のセルと共有される列として接続されたアナログ電圧出力ＡＯＵＴを有する行のアクセス装置として使用することができる。単一セルの電圧が測定されるように、ＡＯＵＴシグナルを接続された列の単一の行が有効になる。
代替の実装では、トランジスタＭ２のドレインを行選択可能な「ｓｗｉｔｃｈｅｄ ｒａｉｌ」に接続することによって、トランジスタＭ３を省略することができる。
トランジスタＭ４は、セルを、電圧が集積された予め定めた始動電圧に再設定するために使用することができる。例えば、高電圧（例えば、ＶＤＤ＝１．８Ｖへ）をＲＳＴとＲＶの両方に印加することは、（ＶＤＤ−ＶＴ５）のプリチャージ値にまでコンデンサを引っ張ってくる。正確な開始値は、セルからセル（Ｍ４およびＭ２のＶｔの変動による）、並びにリセットスイッチ熱ノイズ（平方根（ＫＴＣ）ノイズ）による測定から測定の両方を変化し得る。その結果、相関二重サンプリング（ＣＤＳ）の技術は、積分期間中の実際の電圧変化を測定するために積分開始電圧と終了電圧を測定するために使用される。
トランジスタＭ４のドレインは、制御された電圧ＲＶ（リセット電圧）に接続されてもよいことを留意されたい。通常動作では、これはＶＤＤに駆動されてもよいが、低電圧に駆動されてもよい。Ｍ４の「ドレイン」が実際にグランドに駆動されている場合、電流の流れを反転してもよい（すなわち、電流がＭ１およびＭ４を介して電極から回路に流れ、ソースおよびドレインの概念を交換してもよい）。いくつかの場合では、当該モードで回路を動作させるとき、（液体の基準に対する）電極に印加される負電圧は、（Ｖｇ１およびＶｇ５が少なくともＲＶより大きい閾値であると仮定して）当該ＲＶ電圧によって制御される。したがって、ＲＶの接地電圧は電極に負電圧を印加するために使用することができる（例えばエレクトロポレーションまたは二層の形成を達成する）。
一定時間、集積電流を決定するために、アナログ−デジタル変換器（ＡＤＣ、図示せず）はリセット直後にＡＯＵＴ電圧を測定し、再び積分期間後（ＣＤＳ測定を行う）。ＡＤＣは、列ごとに実装され、または複数の列の間に単一のＡＤＣを共有するアナログＭＵＸとして列ごとに使用される個別のトランジスタを実装することができる。当該列マルチプレクサ係数はノイズ、精度、スループットの要件に応じて変えることができる。
任意の時点で、各セルは、以下の４つの異なる物理的状態のいずれであってもよい。（１）液体に短絡、（２）形成された二層、（３）二層＋細孔、（４）二層＋細孔＋核酸および／またはタグ分子。
いくつかの例では、状態間のセルを移動させるために電圧を印加する。ＮＯＰ操作は、他のセルが印加電位で刺激され、ある状態から別の状態に移動しながら、特定の所望の状態にセルを残すために使用される。
これは、２（またはそれ以上）の異なる電圧を有することによって達成することができ、液体の電位に対して電極に印加される電圧を制御するために間接的に使用されるＭ１ソースフォロワのゲート電圧に印加されてもよい。電圧Ｂを印加するためにトランジスタＭ６を使用しながら、電圧Ａを印加するためにトランジスタＭ５を使用する。このように、ＳＥＬＡまたはＳＥＬＢのいずれかを高駆動させ電圧を選択しながら、アナログマルチプレクサとして、Ｍ５およびＭ６は一緒に動作する。
すべてのセルが可能な異なる状態にあってもよく、ＳＥＬＡおよびＳＥＬＢが相補的であるため、記憶素子を各セルで使用し、電圧ＡまたはＢを選択するためことができる。当該記憶素子は、サイクル毎にリフレッシュされた動的素子（コンデンサ）または単純なチーターラッチ記憶素子（クロス接続されたインバータ）であってよい。
オペアンプのテストチップ構造
いくつかの例では、テストチップは６６個のセンサーセルそれぞれの４つの別々のグループ（別名バンク）に配置された２６４個のセンサーのアレイを含む。各グループは、順番に各列に２２個のセンサー「セル」を有する３つの「列」に分割される。「セル」という名前は、理想的には、二脂質層および挿入されたナノ細孔から成る仮想セルが、アレイ中の２６４個のセンサーの上方に形成されると適切である（装置は密に集合されたセンサーセルの一部分のみで正常に動作し得るが）。
ダイの表面に取り付けられた導電性シリンダー内に含まれる液体に電位を印加する単一のアナログＩ／Ｏパッドがある。この「液体」の電位は、細孔の上面に印加され、検出器アレイ内のすべてのセルに共通である。細孔の底面は露出した電極を有し、各センサーセルは、電極に異なる底部側電位を適用することができる。電流は、上部液体接続と、細孔の底部側の各セルの電極接続部との間で測定される。細孔内を通過するタグ分子によって変調されるように、センサーセルは、細孔を通過する電流を測定する。
いくつかの場合では、５つのビットは、各センサーセルのモードを制御する。図９を続けて参照すると、アレイ中２６４個の各セルは個別に制御することができる。値は６６個のセルの群に別々に適用される。群内の６６個のセルのそれぞれのモードは、ＤａｔａＳｈｉｆｔＲｅｇｉｓｔｅｒ（ＤＳＲ）に、３３０（６６＊５ビット／セル）デジタル値で直列にシフトすることによって制御される。これらの値は、ＫＩＮ（クロック）を使用してアレイ内にシフトされ、ＤＩＮ（ｄａｔ ｉｎ）が６６個のセルの各群について、別個のピンでピンを打つ。
したがって３３０個のクロックは、ＤＳＲシフトレジスタに３３０ビットをシフトするために使用される。対応するＬＩＮ＜ｉ＞（負荷入力）がハイにアサートされるときに、第二の３３０ビットパラレル・ロード・レジスタ（ＰＬＲ）は、当該シフトレジスタから並列ロードされる。ＰＬＲが並列ロードされると同時に、セルの状態値がＤＳＲにロードされる。
完全な動作は、ＤＳＲに３３０個のデータビットでシフトする３３０個のクロック、ＬＩＮ信号でハイにアサートされる単一のクロックサイクル、続いて、ＤＳＲからシフトされた捕獲されたステータスデータを読み込む３３０個のクロックサイクルから構成されてよい。３３０ビットがアレイから読み出されている間に、新たな３３０ビットが同時にＤＳＲにシフトすることができるように、動作はパイプライン化されている。したがって、５０ＭＨｚのクロック周波数で、読み取りのためのサイクル時間は、３３１／５０ＭＨｚの＝６．６２ｕｓである。
配列決定のためのナノ細孔のアレイ
本開示は、核酸を配列決定するためのナノ細孔検出器（またはセンサー）のアレイを提供する。図７を参照すると、複数の核酸分子は、ナノ細孔検出器のアレイで配列決定することができる。ここで、各ナノ細孔の場所（例えば、７０１）は、いくつかの場合では、ポリメラーゼ酵素および／またはホスファターゼ酵素に結合されるナノ細孔を含む。一般的に、本明細書の他の箇所に記載されるように、各アレイ位置にセンサーもある。
いくつかの例では、核酸ポリメラーゼに結合されるナノ細孔のアレイが提供され、タグ付けされたヌクレオチドは、ポリメラーゼと取り込まれる。重合中に、タグは、（例えば、ナノ細孔内に、またはナノ細孔を通って放出および通過することによって、またはナノ細孔に提示されることによって）ナノ細孔によって検出される。ナノ細孔のアレイは、ナノ細孔の任意の適切な数を有していてもよい。いくつかの例では、アレイは、約２００、約４００、約６００、約８００、約１０００、約１５００、約２０００、約３０００、約４０００、約５０００、約１００００、約１５０００、約２００００、約４００００、約含む６００００、約８００００、約１０００００、約２０００００、約４０００００、約６０００００、約８０００００、約１００００００等のナノ細孔を含む。いくつかの例では、アレイは、少なくとも２００、少なくとも４００、少なくとも６００、少なくとも８００、少なくとも１０００、少なくとも１５００、少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも１００００を含む少なくとも１５０００、少なくとも２００００、少なくとも４００００、少なくとも６００００、少なくとも８００００、少なくとも１０００００、少なくとも２０００００、少なくとも４０００００、少なくとも６０００００、少なくとも８０００００個、または少なくとも１００００００ナノ細孔を含む。
いくつかの場合では、単一のタグは放出され、および／または単一のヌクレオチドの取り込みの際に提示され、ナノ細孔によって検出される。他の場合では、複数のタグは放出され、および／または複数のヌクレオチドの取り込みの際に提示される。ナノ細孔に隣接するナノ細孔センサーは、個々のタグまたは複数のタグを検出してもよい。複数のタグに関連付けられた１つ以上の信号が検出され、平均化信号を生成するために処理されてもよい。
タグは、時間を関数としてセンサーによって検出することができる。経時的に検出されたタグは、センサーデータを記録し、データから配列情報を生成するようにプログラムされたコンピュータシステム（例えば、図１６を参照）を用いて、核酸試料の核酸配列を決定するために使用することができる。
ナノ細孔検出器のアレイは、高い密度の別個の部位を有することができる。例えば、単位面積（すなわち、密度）あたりの比較的多数の部位は、携帯式、低コスト、または他の有利な特徴を有する小型の装置の構築を可能にする。アレイ内の個々の部位は、個々にアドレス可能な部位であり得る。ナノ細孔および感知回路を備える多数の部位は、例えば、並列配列決定を介するなど、比較的多数の核酸分子を一度に配列決定することができる。当該システムは、スループットを増加させ、および／または核酸試料を配列決定のコストを減少させることができる。
核酸試料は、別個の部位を含む表面を備えた基板を有するセンサー（または検出器）を使用して配列決定されてもよく、各個別の部位はナノ細孔、ポリメラーゼ、およびいくつかの場合では、ナノ細孔に結合した少なくとも１つのホスファターゼ酵素、並びにナノ細孔に隣接する検知回路を有する。システムはさらに、基板と流体連通するフローセルを含んでもよく、フローセルは、基板に１つ以上の試薬を送達するように適合される。
表面は、任意の適切な密度の別個の部位（例えば、一定時間内または所定のコストで核酸試料を配列決定するために適した密度）を含む。各個別の部位は、センサーを含むことができる。表面は、１ｍｍ２あたり約５００以上のある密度の別個の部位を有することができる。いくつかの実施形態では、表面は、１ｍｍ２あたり、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約２０００、約３０００、４０００、約５０００、約６０００、約７０００、約８０００、約９０００、約１００００、約２００００、約４００００、約６００００、約８００００、約１０００００、または約５０００００のある密度の別個の部位を有する。いくつかの場合では、表面は、１ｍｍ２当たり、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも６０００、少なくとも７０００、少なくとも８０００、少なくとも９０００、少なくとも１００００、少なくとも２００００、少なくとも４００００、少なくとも６００００、少なくとも８００００を、少なくとも１０００００、少なくとも５０００００部位のある密度の別個の部位を有する。
タグ付きヌクレオチド
いくつかの場合では、タグ付きヌクレオチドは、ヌクレオチド組込み事象で切断し、ナノ細孔を用いて検出することができるタグを含む。タグは、ヌクレオチドの５’リン酸に結合することができる。いくつかの例では、タグはフルオロフォアではない。タグは、その電荷、形状、サイズ、またはそれらの任意の組み合わせによって検出することができる。タグの例として、種々のポリマーが挙げられる。ヌクレオチドの各タイプ（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）は、一般的にユニークなタグを含む。
タグは、ヌクレオチド上の任意の適切な位置に配置することができる。図１３はタグ付きヌクレオチドの例を示す。ここで、他の修正は許容可能であるが、Ｒ１は一般にＯＨであり、Ｒ２はＨ（すなわちＤＮＡについて）またはＯＨ（すなわち、ＲＮＡについて）である。図１３では、Ｘは任意の適切なリンカーである。いくつかの場合では、リンカーは切断可能である。リンカーの例として、限定されないが、Ｏ、ＮＨ、ＳまたはＣＨ２が挙げられる。位置Ｚに適した化学基の例として、Ｏ、Ｓ、またはＢＨ３が挙げられる。塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、またはその誘導体を含む核酸に取り込むのに適した任意の塩基である。普遍的な塩基もいくつかの場合では許容可能である。
リン酸塩の数（ｎ）は、任意の適切な整数値（例えば、ヌクレオチドが核酸分子に取り込むことができるようなリン酸塩の数）である。いくつかの例では、すべての種類のタグ付きヌクレオチドは同数のリン酸塩を有するが、必須ではない。いくつかの用途では、塩基の種類ごとに異なるタグがあり、リン酸塩の数は、様々なタグを区別するために必ずしも使用されるわけではない。しかし、いくつかの場合では、１つ以上の種類のヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｃ、Ｔ、ＧまたはＵ）は、同じタグ分子を有し、あるヌクレオチドを別のヌクレオチドと区別する能力は、（ｎについて異なる値を有する様々な種類ヌクレオチドを有する）リン酸塩の数によって少なくとも部分的に決定される。いくつかの実施形態では、ｎの値は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上である。
適切なタグを以下に記載する。いくつかの例では、タグは、残りの化合物への電荷に対して符号が逆の電荷を有する。タグが結合される場合、化合物全体の電荷は中性であり得る。タグの放出によって、２つの分子、荷電タグおよび荷電ヌクレオチドになり得る。帯電したタグはナノ細孔を通過し、いくつかの場合では検出される。
適切なタグ付きヌクレオチドのより多くの例を図１４に示す。タグは、糖分子、塩基分子、またはそれらの任意の組み合わせに付着してもよい。図１３を参照すると、Ｙはタグであり、Ｘは、（いくつかの場合では切断可能である）リンカーである。さらに、Ｒ１は存在する場合、一般的にＯＨ、−ＯＣＨ２Ｎ３または−Ｏ−２−ニトロベンジルであり、およびＲ２は存在する場合、一般的にＨである。また、Ｚは、一般に、Ｏ、ＳまたはＢＨ３、ｎは１、２、３、または４を含む任意の整数である。いくつかの場合では、Ａは、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、ＣＨＦ、ＣＦＦ、またはＮＨである。
図１４を続けて参照すると、各ｄＮＰＰ類似体上の塩基の種類は、他の３つのｄＮＰＰ類似体上のそれぞれの塩基の種類と一般的に異なり、各ｄＮＰＰ類似体上のタグのタイプは、他の３つのｄＮＰＰ類似体上のそれぞれのタグの種類と一般的に異なる。適切な塩基として、限定されないが、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはチミン、またはそれらの誘導体が挙げられる。いくつかの場合では、塩基は、７−デアザグアニン、７−デアザアデニンまたは５−メチルシトシンの１つである。
Ｒ１が−Ｏ−ＣＨ２Ｎ３である場合では、方法は−ＣＨ２Ｎ３を取り除くために、取り込まれたｄＮＰＰ類似体を処理することをさらに含むことができ、３’位に結合したＯＨ基をもたらし、それによってさらなるｄＮＰＰ類似体の取り込みを可能にする。
Ｒ１が−Ｏ−２−ニトロベンジルである場合では、方法は、−２−ニトロベンジルを取り除くために、取り込まれたヌクレオチド類似体を処理することを含むことができ、３’位に結合したＯＨ基をもたらし、それによってさらにｄＮＰＰ類似体の取り込みを可能にする。
タグの例
タグは、ナノ細孔中に検出することができる任意の化学基または分子であってよい。いくつかの場合では、タグは、１つ以上のエチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪族酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組み合わせを含む。
タグはさらに、化合物中のリン酸塩の数のバランスをとるために、適切な数のリジンまたはアルギニンを含むことが理解される。
いくつかの場合では、タグはポリマーである。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、ポリマーの一例であり、以下の構造を有する。
任意の数のエチレングリコール単位（Ｗ）を使用することができる。いくつかの例では、Ｗは０〜１００の整数である。いくつかの場合では、エチレングリコール単位の数は、ヌクレオチドの種類ごとに異なる。ある実施形態では、４種類のヌクレオチドは、１６、２０、２４または３６個のエチレングリコール単位を有するタグを含む。いくつかの場合では、タグはさらに、クマリン系色素等の追加の識別可能な部分を含む。いくつかの場合では、ポリマーは荷電される。いくつかの例では、ポリマーは荷電されず、タグは高濃度の塩（例えば、３〜４Ｍ）で検出される。
用語「アルキル」は、本明細書に使用するとき、特定数の炭素原子を有する分枝および直鎖の両方の飽和脂肪族炭化水素基を含み、非置換でも置換されていてもよい。「アルケニル」は、本明細書に使用するとき、少なくとも１個の炭素二重結合を含む、非芳香族炭化水素基、直鎖または分枝を意味し、非芳香族炭素−炭素二重結合の最大可能な数が存在してもよく、非置換または置換されていてもよい。用語「アルキニル」は、少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を含む、直鎖または分岐の炭化水素基を意味し、最大の非芳香族炭素−炭素の最大可能な数が存在してもよく、および非置換または置換されていてもよい。
用語「置換された」は、アルキルまたはヒドロカルビル等の上述の官能基を意味し、通常の原子価が保持され、置換によって安定な化合物になるのであれば、そこに含まれる水素原子の少なくとも一つの結合は非水素または非炭素原子との結合によって置換される。置換基はまた、炭素または水素原子との１つ以上の結合が、二重結合または三重結合を含む１つ以上の結合によって、ヘテロ原子に置換される基を含む。
いくつかの場合では、タグは、一つの方向（例えば、方向を反転させることなく）にナノ細孔を通過することしかできない。タグは、ゲートが別方向ではなく一方向にタグと整列するときに、ナノ細孔を通過するのに十分に薄いタグに結合されたヒンジ付きゲートを有することができる。図３１を参照すると、本開示は、第一セグメント３１１０および第二セグメント３１１５を含む第１のポリマー鎖３１０５を含むタグ分子を提供し、第二セグメントは第一のセグメントよりも狭い。第二セグメントは、ナノ細孔の最も狭い開口部よりも小さい幅を有することができる。タグ分子は、２つの端部を含む第二ポリマー鎖３１２０を含み、第一端部は第二セグメントに隣接する第一ポリマー鎖に固定され、第二端部は第一ポリマー鎖に固定されない。タグ分子は、第二のポリマー鎖が第二セグメント３１２５に隣接して整列する、第一方向にナノ細孔を通り抜けることができる。いくつかの場合では、タグ分子は、第二のポリマー鎖が第二のセグメント３１３０に隣接して整列していない第二方向にナノ細孔を通り抜けることができない。第二方向は第一方向と反対であることができる。
第一および／または第二のポリマー鎖はヌクレオチドを含むことができる。いくつかの場合では、第二ポリマー鎖が第二セグメントに隣接して整列しないとき、第二ポリマー鎖の塩基は、第一ポリマー鎖と対になる。いくつかの例では、第一ポリマー鎖はヌクレオチド３１３５に（例えば、ヌクレオチドの末端リン酸塩に）固定される。ヌクレオチドが伸長する核酸鎖に取り込まれたとき、第一ポリマー鎖はヌクレオチドから放出させることができる。
第二セグメントは、ゲート（第二ポリマー）と整列した場合、ナノ細孔を通過するのに十分な薄さの任意のポリマーまたは他の分子を含むことができる。例えば、第二セグメントは、基本的なヌクレオチド（すなわち、任意の核酸塩基を有していない核酸鎖）、または炭素鎖を含むことができる。
本開示はまた、検知電極に隣接する膜内のナノ細孔を用いて核酸試料の配列を決定する方法を提供する。図３２を参照すると、本方法は、ナノ細孔を含む反応室内にタグ付けされたヌクレオチド３２０５を提供することを含み、タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドタグは、タグがナノ細孔を用いて検出可能であるヌクレオチドに結合されたタグを含む。タグは、第一セグメントおよび第二セグメントを含む第一ポリマー鎖を含み、第二セグメントは第一セグメントおよび２つの端部を含む第二ポリマーより狭く、第一端部が第二セグメントに隣接する第一ポリマーに固定され、第二端部は第一ポリマー鎖に固定されない。タグ分子は、第二ポリマー鎖が第二セグメントに隣接して整列する第一方向３２１０にナノ細孔を通り抜けることができる。
方法は、ポリメラーゼ３２１５を用いて重合反応を行うことが含み、それにより核酸試料からの一本鎖核酸分子３２２５に相補的な伸長鎖３２２０に、タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドを取り込む。方法は、ナノ細孔３２３０を用いて、個々のタグ付きヌクレオチドを取り込んでいる最中に、個々のタグ付きヌクレオチド関連付けられたタグを検出することを含み、タグは、ヌクレオチドがポリメラーゼと関連付けられているときに、ナノ細孔を用いて検出される。
いくつかの場合では、タグ分子は、第二ポリマー鎖が第二セグメントに隣接して整列していない、第二方向にナノ細孔を通り抜けることができない。
タグはポリメラーゼに結合しながら複数回検出することができる。いくつかの実施形態では、電極は、タグ検出期間の間に再充電される。いくつかの場合では、個々のタグ付きヌクレオチドを取り込んでいる最中に、タグはナノ細孔に入り込み、電極が再充電されると、タグはナノ細孔から抜け出られない。
タグを結合させる方法
タグを結合させるために任意の適切な方法を使用することができる。ある例では、（ａ）環状トリメタリン酸の産生を可能にする条件下で、ジシクロヘキシルカルボジイミド／ジメチルヌクレオチド三リン酸塩を接触させ；（ｂ）−ＯＨまたは−ＮＨ２官能化化合物を形成するように、ステップａ）から得られる生成物を求核試薬に接触させ；および（ｃ）タグを末端リン酸に間接的に結合することができる条件下で、ステップｂ）の生成物をそこに結合される−ＣＯＲ基を有するタグと反応させ、それによってヌクレオチド三リン酸塩類似体を形成することによってタグを末端リン酸塩に結合させることができる。
いくつかの場合では、求核試薬は、Ｈ２Ｎ−Ｒ−ＯＨ、Ｈ２Ｎ−Ｒ−ＮＨ２、Ｒ’Ｓ−Ｒ−ＯＨ、Ｒ’Ｓ−Ｒ−ＮＨ２、または

である。
いくつかの例では、方法は、ステップｂ）では、ステップａ）から得られる生成物を以下の構造を有する化合物と接触させることを含み：

次にまたは同時に、以下の構造を有する化合物を形成するように、生成物をＮＨ４ＯＨと接触させる。
ステップｂ）の生成物は、タグを末端リン酸塩に間接的に結合することが可能な条件下で、それに結合される−ＣＯＲ基を有するタグと反応させてもよく、それによって以下の構造を有するヌクレオチド三リン酸塩類似体を形成する。
Ｒ１はＯＨであり、Ｒ２はＨまたはＯＨであり、塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、７−デアザプリンまたは５−メチルピリミジンである。
タグの放出
タグは、任意の様式で放出され得る。タグは、または伸長する核酸鎖へのタグを有するヌクレオチドの取り込み中または後に放出することができる。いくつかの場合では、タグはポリリン酸に結合し（例えば、図１３）、核酸分子へのヌクレオチドの取り込みは、それに結合されたタグを有するポリリン酸塩の放出をもたらす。取り込みは、ナノ細孔に結合することができる少なくとも１つのポリメラーゼによって触媒され得る。いくつかの例では、少なくとも１つのホスファターゼ酵素も細孔に結合される。ホスファターゼ酵素は、タグを放出するためにポリリン酸塩からタグを切断することができる。いくつかの場合では、ホスファターゼ酵素は、ポリメラーゼ反応によって生成されるピロリン酸塩が、細孔に入る前にホスファターゼ酵素と相互作用するように配置される。
いくつかの場合では、タグはポリリン酸塩に結合していない（例えば、図１４を参照）。これらの場合、タグは、切断可能なリンカー（Ｘ）によって結合されている。切断可能な蓋をされ、および／または切断可能に連結されたヌクレオチド類似体の製造方法は、米国特許第６６６４０７９号に開示され、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。リンカーは、切断可能である必要はない。
リンカーは、任意の適切なリンカーであってもよく、任意の適切な方法で切断することができる。リンカーは光切断可能であってもよい。ある実施形態では、ＵＶ光を使用して光化学的に切断可能なリンカーおよび部分を光化学的に切断するために使用される。ある実施形態では、光切断可能なリンカーは、２−ニトロベンジル部分である。
−ＣＨ２Ｎ３基をＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）で処理して、ｄＮＰＰ類似体またはｒＮＰＰ類似体の３’Ｏ原子から取り除いてもよく、それによって３’ＯＨ基を作製する。
タグの検出
いくつかの例では、複数の異なる塩基（例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、および／またはＵ）を含むタグ付きヌクレオチドのプールから、ポリメラーゼを引き出す。ポリメラーゼを様々な種類のタグ付けされた塩基と繰り返し接触させることも可能である。この場合では、各タイプのヌクレオチドは固有の塩基を有する必要はないかもしれないが、いくつかの場合では、異なる塩基型との間で循環することによって、プロセスのコストおよび複雑さが加えられるが、この実施形態は本発明に包含される。
図１５は（例えば、テンプレートと対になったプライマーの塩基を拡張するためにポリメラーゼを用いて）核酸分子にタグ付けされたヌクレオチドの取り込むことを示し、いくつかの実施形態では、検出可能なＴＡＧ−ポリリン酸塩を放出することができることを示す。いくつかの場合では、ナノ細孔を通過するときにＴＡＧ−ポリリン酸塩が検出される。いくつかの実施形態では、ＴＡＧ−ポリリン酸塩はナノ細孔内に存在するように検出される。
いくつかの場合では、方法は、ポリリン酸塩を含むリン酸塩の数に基づいてヌクレオチドを区別する（例えば、ＴＡＧが同一である場合でも）。それにもかかわらず、ヌクレオチドの各タイプは、一般的にユニークなタグを有する。
図１５を参照すると、タグがナノ細孔の中へおよび／またはナノ細孔を通過し、イオン電流を測定する前に、ＴＡＧ−ポリリン酸塩化合物をホスファターゼ（例えば、アルカリホスファターゼ）で処理してもよい。
ヌクレオチドから放出された後に、タグはナノ細孔を通って流れることができる。いくつかの例では、電圧を印加し、タグをナノ細孔から引っ張りだす。少なくとも約８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９または少なくとも９９．９９％の放出されたタグは、ナノ細孔を通って転位することができる。
いくつかの例では、タグは、検出される時間、ナノ細孔内に存在する。いくつかの例では、電圧を印加して、タグをナノ細孔に引っ張り出し、タグを検出し、タグをナノ細孔から排出し、またはそれらの任意の組み合わせを行う。タグは、ヌクレオチド組込み事象のときに放出されるかヌクレオチドに結合したままであり得る。
タグは、その電荷のために（少なくとも部分的に）ナノ細孔中に検出され得る。いくつかの例では、タグ化合物は、第一の正味電荷を有し、化学的、物理的または生物学的反応の後に、異なる第二の正味電荷を有する代替的に帯電した化合物である。いくつかの例では、タグ上の電荷の大きさは、残りの化合物の電荷の大きさと同じである。ある実施形態では、タグは、正電荷を有し、タグを除去すると化合物の電荷が変化する。
いくつかの場合では、タグがナノ細孔の中に、および／またはナノ細孔を通過するときに、電子的変化が発生し得る。いくつかの場合では、電子的変化は、電流の振幅の変化、ナノ細孔のコンダクタンスの変化、またはそれらの任意の組み合わせである。
ナノ細孔は、生物学的または合成であってもよい。また、細孔はタンパク質性であり、例えば、細孔はα溶血素タンパク質であることも理解される。合成ナノ細孔の例は、固体の細孔またはグラフェンである。
いくつかの場合では、ポリメラーゼ酵素および／またはホスファターゼ酵素がナノ細孔に結合している。融合タンパク質またはジスルフィド架橋は、タンパク質性ナノ細孔に結合させる方法の一例である。固体状態のナノ細孔の場合では、ナノ細孔の近くの表面への結合は、ビオチン−ストレプトアビジン結合を介してもよい。ある例では、ＤＮＡポリメラーゼは、アミノ基で官能化されるアルカンチオール自己組織化単分子膜で修飾した金表面を介して固体表面に結合し、アミノ基は、ＤＮＡポリメラーゼのアミノ基に結合するためにＮＨＳエステルに修飾される。
この方法は任意の適切な温度で行うことができる。いくつかの実施形態では、温度は、４℃〜１０℃である。いくつかの実施形態では、温度は周囲温度である。
方法は、任意の適切な溶液および／または緩衝液中で実施してもよい。いくつかの例では、緩衝液は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳでｐＨ７．０〜８．０に緩衝された３００ｍＭのＫＣｌである。いくつかの実施形態では、緩衝液は、二価陽イオンを含まない。いくつかの場合では、方法は二価カチオンの存在に影響されない。
核酸試料を配列決定するためのコンピュータシステム
本開示の核酸配列決定システムおよび方法は、コンピュータシステムを用いて調節することができる。図１６は、核酸配列決定システム１６０２に接続されたコンピュータシステム１６０１を含むシステム１６００を示す。コンピュータシステム１６０１は、サーバまたは複数のサーバであってもよい。コンピュータシステム１６０１は、試料の調製および処理、並びに配列決定システム１６０２によって核酸配列決定を調節するようにプログラムすることができる。本明細書に記載のように、配列決定システム１６０２は、ナノ細孔に基づくシーケンサー（または検出器）であってもよい。
コンピュータシステムは、本発明の方法を実施するようにプログラムされてもよい。コンピュータシステム１６０１は、シングルコアまたはマルチコアプロセッサ、または並列処理のために複数のプロセッサとすることができる中央処理装置（ＣＰＵ、本明細書では「プロセッサ」とも呼ばれる）１６０５を含む。コンピュータシステム１６０１はまた、メモリ１６１０（例えば、ランダムアクセスメモリ、読み出し専用メモリ、フラッシュメモリ）、電子記憶装置１６１５（例えば、ハードディスク）、１つ以上の他のシステムと通信するための通信インターフェース１６２０（例えば、ネットワークアダプタ）、およびキャッシュ、他のメモリ、データ記憶および／または電子ディスプレイアダプタ等の周辺機器１６２５を含む。メモリ１６１０、記憶装置１６１５、インターフェース１６２０および周辺機器１６２５は、マザーボード等の通信バス（実線）を介してＣＰＵ１６０５と通信する。記憶装置１６１５は、データを格納するためのデータ記憶部（またはデータレポジトリ）とすることができる。コンピュータシステム１６０１は、通信インターフェース１６２０を用いてコンピュータネットワーク（「ネットワーク」）に動作可能に接続することができる。ネットワークは、インターネットおよび／またはエクストラネット、またはイントラネットおよび／またはインターネットと通信するエクストラネットであることができる。ネットワークは、分散コンピューティングを可能にすることができる１つまたは複数のコンピュータサーバを含むことができる。
本発明の方法は、例えば、メモリ１６１０または電子記憶ユニット１６１５上等の、コンピュータシステム１６０１の電子記憶場所に格納された、マシン（またはコンピュータープロセッサ）実行可能コード（またはソフトウェア）によって実現することができる。使用中に、プロセッサ１６０５によってコードを実行することができる。いくつかの場合では、コードは、記憶部１６１５から取得することができ、プロセッサ１６０５によって手早くアクセスするためにメモリ１６１０に格納される。いくつかの状況では、電子記憶ユニット１６１５は、排除することができ、機械実行可能命令がメモリ１６１０に格納される。
コードは、プリコンパイルし、マシンで使用するように構成することができ、コードを実行するようにプロセッサを適合させ、または実行中にコンパイルすることができる。コードは、コンパイル前またはコンパイルされた形式で実行することができるように選択ことができるプログラミング言語で供給することができる。
コンピュータシステム１６０１は、例えば、名前、物理アドレス、電子メールアドレス、電話番号、インスタントメッセージ（ＩＭ）処理、教育情報、仕事情報、社会的好みおよび／または社会的に嫌いなもの、ユーザーまたは他のユーザーへの潜在的な関連性の他の情報等の店舗利用者等のプロファイル情報に適合させることができる。当該プロファイル情報は、コンピュータシステム１６０１の記憶装置１６１５に格納することができる。
コンピュータシステム１６０１等の本明細書に提供されるシステムおよび方法の態様は、プログラミングに実装することができる。技術の様々な態様は、マシン（またはプロセッサ）実行コードおよび／またはある種の機械可読媒体で実行されまたは実装される関連データの形式で、典型的には、「製品」または「製造物品」として考えることができる。機械実行可能コードは、メモリ（例えば、ＲＯＭ、ＲＡＭ）またはハードディスク等の電子記憶ユニットに格納することができる。「ストレージ」タイプのメディアは、様々な半導体メモリ、磁気テープ・ドライブ、ディスク・ドライブ等の、コンピューター、プロセッサ等、またはその関連したモジュール等の実体メモリのいずれかまたはすべてを含むことができ、ソフトウェアプログラミングのためにいつでも非一時的記憶装置を提供することができる。ソフトウェアのすべてまたは一部は、常時インターネットまたは他の様々な通信ネットワークを介して通信することができる。当該通信は、コンピューターまたはプロセッサから別のもの、例えば、管理サーバまたはホストコンピュータからアプリケーションサーバのコンピュータプラットフォームに、ソフトウェアのローディングを可能にする。したがって、ソフトウェア要素を有してもよい別のタイプのメディアは、有線および光陸線ネットワーク、および様々なエアリンクを介して、ローカルデバイス間の物理インターフェースを横切って使用される等、光学的、電気的および電磁波を含む。有線または無線リンク、光リンク等の電磁波を運ぶ物理的要素も、ソフトウェアを担持媒体とみなすことができる。非一時的に制限されていない限り、有形の「記憶」媒体、コンピューターまたはマシン「読み取り可能媒体」等の用語は、本明細書に使用するとき、実行のためにプロセッサへの命令の提供に関与する任意の媒体を意味する。
したがって、コンピューター実行可能コード等の機械可読媒体は、有形の記憶媒体、搬送波媒体または物理伝送媒体を含むがこれらに限定されない多くの形態をとることができる。不揮発性記憶媒体として、図示等のデータベースを実装するために使用することができるような任意のコンピューター等のいずれかの記憶デバイス等、例えば、光ディスクまたは磁気ディスクが挙げられる。揮発性の記憶媒体は、当該コンピュータプラットフォームのメインメモリ等のダイナミックメモリを含む。有形の伝送媒体は、同軸ケーブル、銅線および光ファイバを含み、コンピュータシステム内のバスを含むワイヤを含む。担体−波伝送媒体は、無線周波数（ＲＦ）および赤外線（ＩＲ）データ通信中に生成される等、電気または電磁信号、または音波または光波の形態をとることができる。コンピューター可読媒体の一般的な形態として、したがって、例えば、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、他の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、またはＤＶＤ−ＲＯＭ、他の任意の光媒体、カード紙パンチテープ、孔のパターンを有する任意の他の物理的記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭ、およびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ−ＥＰＲＯＭ、その他のメモリチップまたはカートリッジ、搬送波輸送データまたは命令、ケーブルまたはそのようなキャリアを輸送リンク波、またはコンピューターがプログラミングコードおよび／またはデータを読み取ることができる他の任意の媒体が挙げられる。コンピューター可読媒体のこれらの形態の多くは、実行のためにプロセッサに１つ以上の命令の１つ以上のシーケンスを運ぶことに関与してもよい。
システムおよび本開示の方法は、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）およびタンパク質等の様々なタイプの生物学的試料を、配列決定するために使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、装置およびシステムは、生物学的試料（例えば、タンパク質または核酸）をソートするために使用することができる。ソートされた試料および／または分子をさらに分析するために、種々のビンに向けることができる。
配列決定の精度
本明細書に提供される方法は、正確に個々のヌクレオチド組込み事象（例えば、単一分子イベント）を区別することができる。方法は、すなわち、所与の核酸分子を再配列する必要がなく、単一のパスでの個々のヌクレオチドの組込み事象を正確に区別することができる。いくつかの場合では、本明細書で提供される方法は、核酸分子を配列および再配列するために使用され、または単回もしくは複数回タグ付けされた分子に結合するタグを検出することができる。例えば、タグは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、または１０，０００回ナノ細孔を用いて検出することができる。タグは、例えば、ナノ細孔を有する膜に印加される電圧を用いて、感知され、再検知されてもよく、ナノ細孔にタグを描画したり、ナノ細孔からタグを排出することができる。
核酸配列決定の方法は、約４σより大きい精度で個々のヌクレオチドの組込み事象を区別することを含む。いくつかの場合では、ヌクレオチド組込み事象は、ナノ細孔を用いて検出される。ヌクレオチドに関連付けられているタグは取り込みの際に放出され、タグがナノ細孔を通過する。いくつかの例では、タグは解放されない（例えば、ナノ細孔に提示される）。さらに別の実施形態では、タグは放出されているが存在する（例えば、ナノ細孔を通過しない）。異なるタグは、各種のヌクレオチドの（例えば、Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ）に関連付けられている、および／またはそれから放出され、ナノ細孔によって検出することができる。エラーとして、限定されないが、（ａ）タグを検出に失敗する、（ｂ）タグを誤識別する、（ｃ）タグが存在しないタグを検出する、（ｄ）誤った順序（例えば、第一の順序で２つのタグは放出されるが、第二の順序で検出されない）でタグを検出する、（ｅ）ヌクレオチドから放出されていないタグが、放出されているとして検出される、（ｆ）取り込まれたヌクレオチドに結合していないタグが、伸長しているヌクレオチド鎖、またはそれらの任意の組合せに取り込まれているとして検出される、ことが挙げられる。いくつかの実施形態では、個々のヌクレオチドの組込み事象を区別する精度は、エラーが発生する割合（すなわち、エラー率）を差し引いた１００％である。
個々のヌクレオチド組込み事象を区別する精度は、任意の適切な割合である。個々のヌクレオチドの組込み事象を区別する精度は、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％、約９９．９％、約９９．９９％、約９９．９９９％、約９９．９９９９％、等であってよい。いくつかの場合では、個々のヌクレオチドの組込み事象を区別する精度は、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９である％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、少なくとも９９．９９％、少なくとも９９．９９９％、９９．９９９９％等である。いくつかの例では、個々のヌクレオチドの組込み事象を区別する精度はシグマ（σ）の単位で報告される。シグマは、欠陥のない製品の割合としてエラー率を報告するために、経営管理と製造戦略で使用されることのある統計的変数である。ここで、シグマの値は、以下のように関係に係る精度と交換可能に使用され得る。４σは９９．３８％の精度、５σは９９．９７７％の精度、６σは９９．９９９６６％の精度である。
個々のヌクレオチド組込み事象の区別は、本明細書に記載の方法に従って、正確に核酸配列を決定するために使用することができる。いくつかの例では、核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）の核酸配列の決定は、エラーを含む。エラーの例として、欠失（核酸を検出することができない）、挿入（真に存在しない核酸を検出する）および置換（誤った核酸を検出する）が挙げられるが、これらに限定されない。核酸配列決定の精度は、真の核酸配列で測定された核酸配列を並べ（例えば、バイオインフォマティクス技術による）、欠失、挿入および／または置換である核酸位置のパーセンテージを決定することによって、決定することができる。エラーは欠失、挿入および置換の任意の組み合わせである。精度は、０％〜１００％の範囲にあり、１００％は核酸の配列決定を完全に修正する。同様に、エラー率が１００％であることは、精度が０％〜１００％の範囲にあり、０％のエラー率は核酸の配列決定を完全に正確に修正する。
方法に従って実行する、および／または本明細書に記載の装置を使用するとき、核酸配列決定の精度は高い。精度は任意の適切な高い値である。いくつかの例では、精度は約９５％、約９５．５％、約９６％、約９６．５％、約９７％、約９７．５％、約９８％、約９８．５％、約９９％、約９９．５％、約９９．９％である、約９９．９９％、約９９．９９９％、約９９．９９９９％等である。いくつかの例では、精度は、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、少なくとも９９．９９％、少なくとも９９．９９９％、９９．９９９９％等である。いくつかの例では、精度は、約９５％〜９９．９９９９％、約９７％〜９９．９９９９％、約９９％〜９９．９９９９％、約９９．５％〜９９．９９９９％、約９９．９％〜９９．９９９９％等である。
高精度は複数のパスを実行することによって達成することができる（すなわち、例えば、ナノ細孔を介して、または近接して核酸を通過させ、核酸分子の核酸塩基を配列決定することによって、複数回、核酸分子を配列決定する）。複数のパスからのデータを組み合わせることができる（他の繰り返されたパスからのデータを用いて、第一のパスの欠失、挿入および／または置換を修正する）。いくつかの例では、タグの検出精度を、例えば、ナノ細孔または膜に印加される電圧（例えば、ＤＣまたはＡＣ電圧）を反転させることにより等の、ナノ細孔を介してまたは隣接したタグを複数回、通過させることによって、増加させることができる。方法は（また、読み取り、多数の配列決定カバレッジとも呼ばれる）いくつかのパスで高い精度を提供する。パスの数は任意の適切な数であり、整数である必要はない。いくつかの実施形態では、核酸分子は、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１２回、１４回、１６回、１８回、２０回、２５回、３０回、３５回、４０回、４５回、５０回等、配列決定される。いくつかの実施形態では、核酸分子は、最大１回、最大２回、最大３回、最大４回、最大５回、最大６回、最大７回、最大８回、最大９回、最大１０回、最大１２回、最大１４回、最大１６回、最大１８回、最大２０回、最大２５回、最大３０回、最大３５回、最大４０回、最大４５回、最大５０回等、で配列決定される。いくつかの実施形態では、核酸分子は、約１〜１０回、約１〜５回、約１〜３回等、配列決定される。精度のレベルはせいぜい２０パスから収集されたデータを組み合わせることによって達成することができる。いくつかの実施形態では、精度のレベルはせいぜい１０パスから収集されたデータを組み合わせることによって達成される。いくつかの実施形態では、精度のレベルはせいぜい５パスから収集されたデータを組み合わせることによって達成される。いくつかのケースでは、精度のレベルは、単一パスで達成される。
エラー率は、任意の適切に低い割合である。いくつかの例では、エラー率は約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％、約０．５％、約０．１％、約０．０１％、約０．００１％、約０．０００１である。いくつかの例では、エラー率は、最大１０％、最大５％、最大４％、最大３％、最大２％、最大１％、最大０．５％、最大０．１％、最大０．０１％、最大０．００１％、最大０．０００１％等である。いくつかの例では、エラー率は、１０％〜０．０００１％、３％〜０．０００１％、１％〜０．０００１％、０．０１％〜０．０００１％等である。
反復配列の除去
ゲノムＤＮＡは、核酸配列決定反応を行う際に、場合によっては対象としない反復配列を含む可能性がある。これらの反復配列を除去する方法（例えば、反復配列、例えばＣｏｔ−１ ＤＮＡ、に相補的な配列とのハイブリダイゼーションによって）を本明細書で提供する。
ある態様では、検出電極に隣接する膜中のナノ細孔を用いて核酸試料の配列を決定する方法は、核酸試料から反復核酸配列を除去し、配列決定のために一本鎖核酸分子を提供することを含む。この方法はさらに、ナノ細孔を含む反応室にタグ付けされたヌクレオチドを提供することを含むことができ、タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付けされたヌクレオチドは、ナノ細孔を用いて検出可能であるヌクレオチドに結合されたタグを含む。いくつかの場合では、方法は、ポリメラーゼを用いて重合反応を行うことを含み、それによって一本鎖核酸分子に相補的な伸長する鎖に、タグ付けされたヌクレオチドの個々のタグ付けされたヌクレオチドを取り込む。方法は、ナノ細孔を用いて、個々のタグ付きヌクレオチドを取り込んでいる最中に、個々のタグ付きヌクレオチドに関連付けられたタグを検出することを含み、タグはヌクレオチドがポリメラーゼと関連付けられているときに、ナノ細孔を用いて検出される。
いくつかの場合では、反復配列が物理的に反応物から除去されないが、配列決定することができず、反応混合物に残っている（例えば、反復配列を二本鎖にし、効果的に「取り除かれ」、配列決定反応を形成する、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡでハイブリダイゼーションすることによって）。いくつかの場合では、反復配列は二本鎖にされる。
反復配列は、任意の適切な長さを有することができる。いくつかの場合では、反復核酸配列は、約２０、約４０、約６０、約８０、約１００、約２００、約４００、約６００、約８００、約１０００、約５０００、約１００００、または約５００００の核酸塩基を含む。いくつかの場合では、反復核酸配列は、少なくとも約２０、少なくとも約４０、少なくとも約６０、少なくとも約８０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約４００、少なくとも約６００、少なくとも約８００、少なくとも約１０００、少なくとも約５０００、少なくとも約１００００、または少なくとも約５００００の核酸塩基を含む。いくつかの場合では、塩基は連続している。
反復核酸配列は、任意の数の反復サブユニットを有することができる。いくつかの場合では、反復サブユニットは連続している。いくつかの実施形態では、反復核酸配列は、約２０、約４０、約６０、約８０、約１００、約２００、約４００、約６００、約８００、または約１０００個の核酸塩基の反復サブユニットを含む。いくつかの場合では、反復核酸配列は、少なくとも約２０、少なくとも約４０、少なくとも約６０、少なくとも約８０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約４００、少なくとも約６００、少なくとも約８００、または少なくとも約１０００個の核酸塩基の反復サブユニットを含む。
いくつかの場合では、反復核酸配列は、反復核酸配列に相補的な核酸配列とのハイブリダイゼーションによって除去される。反復核酸配列に相補的な核酸配列は、表面またはビーズ等の固体支持体上に固定することができる。いくつかの場合では、反復核酸配列に相補的な核酸配列は、（約５０〜約１００個の核酸塩基の長さを有する反復核酸配列の例である）Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを含む。
ナノ細孔のアセンブリおよび挿入
本明細書に記載の方法は、ナノ細孔に結合されるポリメラーゼを有するナノ細孔を使用することができる。いくつかの場合では、（例えば、唯一の核酸分子が、各ナノ細孔に配列決定されるように）ナノ細孔ごとに唯一のポリメラーゼを有することが望ましい。しかし、α−溶血素（αＨＬ）を含む多くのナノ細孔は、複数のサブユニットを有する多量体タンパク質（例えば、αＨＬについて７個のサブユニット）であることができる。サブユニットは、同じポリペプチドの同一のコピーであることができる。未修飾のサブユニットに修飾されたサブユニットの規定の比を有する多量体タンパク質（例えば、ポア）を本明細書は提供する。また、未修飾サブユニットに対する修飾サブユニットの規定の比を有する多量体タンパク質（例えば、ナノ細孔）を製造する方法を本明細書は提供する。
図２７を参照すると、複数のサブユニットを有するタンパク質を組み立てる方法は、複数の第一サブユニット２７０５を提供し、複数の第二サブユニット２７１０を提供することを含み、第一サブユニットに比べ第二のサブユニットは修飾されている。いくつかの場合では、第一サブユニットは、（例えば、天然源から精製または組換えで生成された）野生型である。第二サブユニットは、任意の適切な方法で修飾することができる。いくつかの場合では、第二サブユニットは、（例えば、融合タンパク質として）結合されたタンパク質（例えば、ポリメラーゼ）を有する。修飾されたサブユニットは、化学的に反応性の部分（例えば、結合を形成するのに適したアジドまたはアルキン基）を含むことができる。いくつかの場合では、方法はさらに、化学的に反応性部分に、実体（例えば、ポリメラーゼ）を結合させるために、反応（例えば、クリックケミストリ環化付加）を実施することを含む。
本方法はさらに、複数のタンパク質２７２０を形成する第一の比で、第一サブユニットを第二のサブユニット２７１５に接触させることができる。例えば、ポリメラーゼを結合させるのに適した反応性基を有する１部の修飾αＨＬサブユニットは、６部の野生型αＨＬサブユニットと（いわゆる１：６の第一の比で）混合することができる。複数のタンパク質は、複数の第二サブユニットに対する第一サブユニットの比を持つことができる。例えば、混合サブユニットは未修飾サブユニットに改変された化学量論の分布（例えば、１：６、２：５、３：４）を有するいくつかのナノ細孔を形成することができる。
いくつかの場合では、タンパク質は、サブユニットを単純に混合することによって形成される。例えばαＨＬのナノ細孔の場合では、洗浄剤（例えば、デオキシコール酸）が、αＨＬモノマーをトリガーし、細孔の形成を採用することができる。ナノ細孔また、脂質（例えば、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰｈＰＣ）またはｌ，２−ジ−Ｏ−フィタニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤｏＰｈＰＣ）および適度な温度（例えば、約１００°Ｃ未満）を用いて形成することもできる。いくつかの場合では、緩衝液でＤＰｈＰＣを混合することによって、大きな多層状小胞（ＬＭＶ）が作成され、当該溶液にαＨＬサブユニットを加え、４０℃で３０分間混合物をインキュベートし、細孔形成を得る。
２つの異なる種類のサブユニット（例えば、単一点突然変異を含むことができる天然の野生型タンパク質および第二αＨＬモノマー）を使用する場合、得られるタンパク質は、（例えば、野生型および変異体タンパク質の）混合化学量論を有することができる。これらのタンパク質の化学量論は、細孔形成反応に使用される２つのタンパク質の濃度比に依存する式に従うことができる。当該式は以下であり：
１００Ｐｍ＝１００［ｎ！／ｍ！（ｎ−ｍ）！］・ＦＭＵＴ ｍ・ＦＷＴｎ〜ｍここで、
Ｐｍ＝ｍの数の変異体サブユニットを有する細孔の確率、
ｎ＝サブユニットの総数（例えば、αＨＬについて７個）、
ｍ＝「変異体」サブユニットの数、
ｆｍｕｔ＝一緒に混合した変異体サブユニットの画分または比、
ｆｗｔ＝一緒に混合した野生型サブユニットの画分または比、
方法は、さらに、第二サブユニット２７２５に対する第一サブユニットの第二の比を有するタンパク質を濃縮するために複数のタンパク質を分画することを含むことができる。例えば、唯一の修飾サブユニット（１：６の第二の比）を有するナノ細孔タンパク質を単離することができる。しかし、任意の第二の比が適切である。第二の比の分布はまた、１つまたは２つの修飾サブユニットを有するタンパク質を濃縮するように分画することもできる。図２７に示されるように、タンパク質を形成するサブユニットの総数は、常に７ではない（例えば、異なるナノ細孔使用することができ、またはα溶血素ナノ細孔は、６つのサブユニットを有して形成することができる）。いくつかの場合では、たった１つの修飾サブユニットを有するタンパク質が濃縮される。このような場合では、第二の比は、（ｎ−１）の第一サブユニット当たり１つの第二サブユニットであり、ｎはタンパク質を含むサブユニットの数である。
第一の比は、第二の比と同じであってもよいが、必須ではない。いくつかの場合では、変異したモノマーを有するタンパク質は、変異したサブユニットを有していないものよりも低い効率で形成することができる。この場合、第一の比は、第二の比よりも大きくすることができる（例えば、６個の非変異サブユニットに対して１個の変異サブユニットという第二の比がナノ細孔に望ましい場合、適切な数の１：６のタンパク質の形成には、１：６より大きい比でサブユニットを混合する必要があり得る）。
サブユニットの異なる第二の比を有するタンパク質は、分離において異なるふるまいをすることができる（例えば、異なる保持時間を有する）。いくつかの場合では、タンパク質は、イオン交換クロマトグラフィーまたは親和クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーを用いて分画される。第一および第二のサブユニットが修飾とは別に同一である可能性があるため、タンパク質上の修飾の数は、分離のための基礎として役立つことができる。いくつかの場合では、第一または第二のサブユニットは、（例えば、修飾の他に）精製タグを有し、分画の効率の向上を可能にし、または改善することができる。いくつかの場合にでは、ポリ−ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）、ストレプトアビジンタグ（Ｓｔｒｅｐタグ）、または他のペプチドタグが使用される。いくつかの例では、第一および第二のサブユニットは、それぞれ異なるタグを含み、分画ステップが各タグに基づいて分割する。Ｈｉｓタグの場合では、低いｐＨで、電荷がタグ上に作成される（ヒスチジン残基は側鎖のｐＫａ以下に正に帯電する）。αＨＬ分子の１つの電荷は他に比べかなりの差があるため、イオン交換クロマトグラフィーを使用して、０、１、２、３、４、５、６、または７個の「電荷タグ付けされた」αＨＬサブユニットを有するオリゴマーを分離することができる。原則として、当該電荷タグは、均一な電荷を運ぶ任意のアミノ酸の鎖であることができる。Ｈｉｓタグに基づくナノ細孔の分画の例を図２８および図２９に示す。図２８は、２８０ナノメートルでの紫外吸光度、２６０ナノメートルでの紫外吸光度、および導電率のプロットを示す。ピークは修飾および非修飾サブユニットの種々の比を有するナノ細孔に対応する。図２９は、ＨｉｓタグとＳｔｒｅｐタグの両方を使用して、αＨＬナノ細孔およびその変異体の分画を示す。
いくつかの場合では、実体（例えば、ポリメラーゼ）は分画２７３０の後にタンパク質と結合する。タンパク質はナノ細孔であることができ、実体はポリメラーゼであることができる。いくつかの例では、方法はさらに、第二の比のサブユニットを有するタンパク質を二重層に挿入することを含む。
いくつかの状況では、ナノ細孔は、複数のサブユニットを含むことができる。ポリメラーゼはサブユニットの一つと結合することができ、少なくとも一つのサブユニット、および全てのサブユニットより小さいサブユニットは、第一の精製タグを含む。いくつかの例では、ナノ細孔は、α−溶血素またはその変異体である。いくつかの例では、全てのサブユニットは、第一の精製タグまたは第二の精製タグを含む。第一の精製タグは、（例えば、結合されたポリメラーゼを有するサブユニット上で）ポリヒスチジンタグであることができる。
リンカー
本明細書に記載の方法は、核酸配列決定を含むナノ細孔検出のためのナノ細孔に結合される酵素（例えば、ポリメラーゼ）を使用することができる。いくつかの場合では、酵素とナノ細孔の連結は、システムの性能に影響を与えることができる。例えば、細孔（α−溶血素）へのＤＮＡポリメラーゼの結合を操作することにより、効果的にタグ付けされたヌクレオチドの濃度を増加させることができ、それによりエントロピー障壁を低下させる。いくつかの場合では、ポリメラーゼは、ナノ細孔に直接結合している。他の例では、リンカーは、ポリメラーゼとナノ細孔との間で使用される。
本明細書に記載のタグの配列決定は、電位によって誘導されるαＨＬ細孔に、特定のタグヌクレオチドを効率的に捕えることから利益を得ることができる。捕獲は、ＤＮＡテンプレートに基づいて、ポリメラーゼプライマー伸長中または後に発生することができる。捕獲の効率を改善する一つの方法は、ポリメラーゼとαＨＬ細孔との間の接続を最適化することである。限定しないが、最適化するための接続の３つの特徴は以下であり：（ａ）接続の長さ（有効なタグ付きヌクレオチド濃度を増加し、捕獲の動態に影響を与え、および／またはエントロピー障壁を変化することができる）；（ｂ）接続の柔軟性（コネクターの立体構造の変化の動力学に影響を与えることができる）；並びに（ｃ）ポリメラーゼとナノ細孔との接続の数および位置（利用可能な立体構造の状態の数を減らすことができ、それによって適切な細孔ポリメラーゼ配向の可能性を増加させ、有効なタグ付きヌクレオチド濃度を増加させ、エントロピー障壁を減らす）。
酵素およびポリメラーゼは任意の適切な方法で接続することができる。いくつかの場合では、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、直接、またはアミノ酸のリンカーと融合する。融合は、任意の順序であってもよい。いくつかの場合では、化学結合が（例えば、クリックケミストリーによって）形成される。いくつかの場合では、接続は非共有結合である（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用を介し、あるいは、ＰＤＺ、ＧＢＤ、ＳｐｙＴａｇ、Ｈａｌｏタグ、またはＳＨ３リガンド等の、タンパク質−タンパク質タグを介する分子ステープル）。
いくつかの場合では、リンカーは、ペプチド、核酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のポリマーである。リンカーは、任意の適切な長さであることができる。例えば、リンカーは、約５ナノメートル（ｎｍ）、約１０ｎｍ、約１５ｎｍ、約２０ｎｍ、約４０ｎｍ、約５０ｎｍ、または約１００ｎｍの長さにすることができる。いくつかの場合では、リンカーは、少なくとも約５ナノメートル（ｎｍ）、少なくとも約１０ｎｍ、少なくとも約１５ｎｍ、少なくとも約２０ｎｍ、少なくとも約４０ｎｍ、少なくとも約５０ｎｍ、または少なくとも約１００ｎｍの長さである。いくつかの場合では、リンカーは最大約５ナノメートル（ｎｍ）、最大約１０ｎｍ、最大約１５ｎｍ、最大約２０ｎｍ、最大約４０ｎｍ、最大約５０ｎｍ、または最大約１００ｎｍの長さである。リンカーは、強固、柔軟性があり、またはそれらの任意の組み合わせとすることができる。いくつかの場合では、リンカーを使用しない（例えば、ポリメラーゼがナノ細孔に直接付着している）。
いくつかの場合では、１つ以上のリンカーはナノ細孔を有する酵素を接続する。ポリメラーゼとナノ細孔の接続の数および位置を変えることができる。例として、ポリメラーゼＮ末端に対するαＨＬ Ｃ末端、ポリメラーゼＣ末端に対するαＨＬ Ｎ末端、および末端に存在しないアミノ酸の接続が挙げられる。
ある態様では、検出電極に隣接する膜中のナノ細孔を用いて核酸試料の配列を決定する方法は、ナノ細孔を含む反応室にタグ付けされたヌクレオチドを提供することを含み、タグ付けされたヌクレオチドの個別のタグ付きヌクレオチドは、ナノ細孔を用いて検出可能であるヌクレオチドに結合されたタグが含まれる。この方法は、ナノ細孔へのリンカーによって結合されたポリメラーゼを用いて重合反応を行うことを含むことができ、それによって、核酸試料から一本鎖核酸分子に相補的な伸長している鎖にタグ付けされたヌクレオチドの個々のタグ付けされたヌクレオチドを取り込む。方法は、ナノ細孔を用いて、個々のタグ付きヌクレオチドを取り込んでいる最中に、個々のタグ付きヌクレオチドに結合するタグを検出することを含み、タグは、ヌクレオチドがポリメラーゼと関連付けられているときに、ナノ細孔を用いて検出される。
いくつかの例では、リンカーは、タグがナノ細孔を用いて検出されるように、ナノ細孔に対するポリメラーゼを方向付ける。いくつかの例では、ポリメラーゼは、２つ以上のリンカーによってナノ細孔に結合する。
いくつかの場合では、リンカーは、配列番号２〜３５またはそれから製造されるＰＣＲ産物の一つ以上を含む。いくつかの例では、リンカーは、配列番号２〜３５またはそれから製造されるＰＣＲ産物の１つ以上によってコードされるペプチドを含む。
印加電圧の較正
単一分子のナノ細孔センサー装置からの分子固有の出力信号は、電解液に囲まれるイオン透過性の膜の両端の電気化学的電位差の存在から生じることができる。当該膜貫通電位差は、電極表面で生じる犠牲的（すなわち、ファラデー）または非犠牲的（すなわち、静電容量）反応のいずれかを介して、装置内の電子回路によって検出することができるナノ細孔固有の電気化学的電流の強さを決定することができる。
ナノ細孔の任意の所与の状態（すなわち、オープンチャネル、捕獲状態等）について、時間依存性膜貫通電位は、時間を関数として、ナノ細孔複合体を通って流れる得られる電流を決定することができる入力信号として作用することができる。当該ナノ細孔電流は、ナノ細孔センサー装置によって特定の分子信号出力を提供することができる。オープンチャネルのナノ細孔電流は、ナノ細孔と部分的にチャンネルを通るイオンの流れを遮断する捕獲された分子の間の相互作用により様々な程度に調節することができる。
これらの調節は、捕獲された分子の種類についての特異性を示すことができ、いくつかの分子をナノ細孔の電流変調から直接識別することができる。所与の分子の種類および固定したセットの装置の条件について、この種の捕獲された分子によるオープンチャネルナノ細孔の電流の変調度は、印加される膜貫通電位に応じて変化することができ、各種の分子を特定の電流−対−電圧（Ｉ−Ｖ）曲線にマッピングする。
印加電圧の設定と膜貫通電位の体系的な可変オフセット出力信号は、当該Ｉ−Ｖ曲線の水平方向のシフトを横軸の電圧に沿って導入することができ、出力信号としてナノ細孔センサー装置によって報告される測定された電流信号に基づいて、分子の同定精度が潜在的に低下する。したがって、印加膜貫通電位と膜貫通電位との間の制御されていないオフセットは、同条件下で同分子の測定値を正確に比較するのに問題となり得る。
外部印加電位と実際の膜貫通電位のいわゆる「オフセット電位」は実験内および実験間の両方で変化することができる。オフセット電位の変動は、初期条件の両方の変化によって、およびナノ細孔センサー装置内の電気化学的条件の時間依存的変動（ドリフト）によって引き起こすことができる。
各実験の印加電圧と膜貫通電位との間の時間依存的オフセットを較正することによって、本明細書に記載されるように、これらの測定値のエラー取り除くことができる。物理的に、ナノ細孔捕獲分子の脱出イベントを観察する確率は、印加される膜貫通電位に依存する可能性があり、当該確率分布は、同条件下で分子の同一の試料について同じであることができる（例えば、割合が試料間で変化しないならば、試料は異なる種類の分子の混合物であってよい）。いくつかの場合では、脱出イベントが固定した試料の種類について発生する電圧の分布は、印加電位と膜貫通電位との間のオフセットの測定値を提供する。この情報は、ナノ細孔の両端の印加電圧を較正するために使用することができ、実験内および実験間の潜在的なオフセットに起因するエラーの系統的な原因を排除し、分子の同定および他の測定値の精度を改善する。
同分子試料および試薬で動作する所与のナノ細孔センサー装置について、脱出電圧の分布の期待値は、（各個別のイベントは無作為な変動を前提とする確率過程になることができるが）単一の分子の脱出イベントの統計的試料から推定することができる。当該推定は、実験内のオフセット電位の時間的なドリフトを考慮するために時間依存的であることができる。このことにより、印加電圧の設定と細孔で感じられる実際の電圧との間に可変差を修正することができ、Ｉ−Ｖ空間にプロットしたとき、水平方向のすべての測定値を効果的に「並べる」。
いくつかの場合では、電位（すなわち電圧）オフセット較正は、電流利得および電流オフセット変動を考慮しておらず、ナノ細孔電流測定の精度および再現性を向上するように較正することもできる。しかし、これらは順に取り付け電流対電圧（Ｉ−Ｖ）曲線を含むことができ、これらの適合の結果は、電圧オフセットの変動の影響を受けるため、潜在的なオフセット較正は、一般に、電流利得および電流オフセット変動を推測するときにエラーを防ぐためにゲイン補正およびオフセット補正する前に行われる。すなわち、Ｉ−Ｖ空間に（水平に）左から右へデータをシフトすることは、その後の電流利得およびオフセット電流適合にエラーを導入する可能性がある。
図３０は、ナノ細孔を流れる電流のプロット（実線）および印加電圧（破線）対時間を示す。分子がナノ細孔３００５で捕獲されたときに電流が減少する可能性がある。印加電圧が時間３０１０にかけて減少するため、分子がナノ細孔３０１５から落ちてしまうまで電流が減少し、そのとき、電流は印加電圧で期待されるレベルまで増加する。分子が落ちる印加電圧は、分子の長さに依存し得る。例えば、５０塩基を有するタグが約１０ｍＶで落ちる一方、３０塩基を有するタグが約４０ｍＶで落ちる。異なるナノ細孔または同ナノ細孔の経時的な異なる測定値について、転落した電圧に変動３０２０があり得る。この転落した電圧を期待値に調整することで、データが解釈しやすく、および／またはより正確にすることができる。
一態様では、検出電極に隣接する膜中のナノ細孔を用いて、核酸試料の配列決定を行う方法を本明細書は提供する。方法はさらに、ナノ細孔を含む反応室にタグ付けされたヌクレオチドを提供することを含むことができ、タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付けされたヌクレオチドは、ナノ細孔を用いて検出可能なヌクレオチドに結合されたタグを含む。方法は、ポリメラーゼを用いて、重合反応を実施することを含むことができ、それによって、核酸試料から一本鎖核酸分子に相補的な伸長している鎖に、タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付けされたヌクレオチドを取り込む。方法は、ナノ細孔を用いて、個々のタグ付きヌクレオチドを取り込んでいる最中に、個々のタグ付きヌクレオチドに結合するタグを検出することを含み、タグは、ヌクレオチドがポリメラーゼと関連付けられているときに、ナノ細孔を用いて検出される。いくつかの場合では、検出は、ナノ細孔両端の印加電圧を印加し、印加電圧での検出電極で電流を測定することを含む。
いくつかの場合では、印加電圧は較正される。較正は、検出電極について、期待される脱出電圧分布対時間を推定することを含む。較正は、期待される脱出電圧分布と基準点（例えば、ゼロ等の任意の基準点）との差を計算することができる。較正は、計算した差によって印加電圧をシフトさせることができる。いくつかの場合では、印加電圧が時間とともに減少する。
いくつかの場合では、時間に対する期待される脱出電圧の分布を推定する。いくつかの例では、基準点はゼロボルトである。この方法は、期待される脱出電圧の分布の検出のばらつきを除去することができる。いくつかの場合では、方法は、検出電極に隣接する独立してアドレス指定可能な複数のナノ細孔上で実行される。
いくつかの実施形態では、ナノ細孔内のタグの存在は、印加電圧での感知電極で測定される電流を減少させる。いくつかの場合では、タグ付けされたヌクレオチドは、複数の異なるタグを含み、方法は、複数の異なるタグのそれぞれを検出する。
いくつかの例では、較正は、較正なしで方法を実施することに比べ、方法の精度を増加させる。いくつかの場合では、較正は、経時的に電気化学的条件の変化を補償する。いくつかの例では、較正は、複数のナノ細孔を有する装置の異なる電気化学的条件を有する異なるナノ細孔を補償する。いくつかの実施形態では、較正は、方法のそれぞれの性能について異なる電気化学的条件を補償する。いくつかの場合において、方法はさらに、オフセット電流の電流利得および／または変動のばらつきを校正する。
ｅｘｐａｎｄａｍｅｒ配列決定法
本開示は、ｅｘｐａｎｄａｍｅｒ配列決定を使用して、核酸分子を配列決定する方法を提供する。ｅｘｐａｎｄａｍｅｒ配列決定は、配列決定される核酸よりも長く、配列決定される核酸分子に由来する配列を有する発泡ポリマーを作成するいくつかのステップを含む。発泡ポリマーは、ナノ細孔を通り抜けて配列決定される。本明細書に記載するように、発泡ポリマーは、発泡ポリマーは、一方向のみにナノ細孔を通り抜けることができるように、その上にゲートを有することができる。方法のステップは、図３３〜３６に示される。膨張による核酸配列（すなわち、ｅｘｐａｎｄａｍｅｒ）に関するさらなる情報は、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる米国特許第８，３２４，３６０号に見出すことができる。
図３３を参照すると、ある態様では、核酸配列決定の方法は、配列決定される一本鎖核酸を提供し、複数のプローブを提供することを含む。プローブは、一本鎖核酸でハイブリダイズ可能なハイブリダイゼーション部分３３０５、２つの端部を有するループ構造３３１０を含み、各端部は、ハイブリダイゼーション部分、およびループ構造の端部の間のハイブリダイゼーション部位に位置する切断可能なグループ３３１５と結合する。ループ構造は、ループ構造が逆方向にナノ細孔を通り抜けることを防ぐゲート３３２０を含む。
図３４を参照すると、方法は、配列決定される一本鎖核酸３４１０とハイブリダイゼーション部分のハイブリダイゼーションによって決定される順序で、複数のプローブを重合すること３４０５を含むことができる。図３５を参照すると、方法は、切断可能な基を切断すること３５０５を含み、配列決定された拡張スレッドを提供することができる。
図３６を参照すると、方法は、拡張スレッド３６１０がナノ細孔３６１５を通り抜けること３６０５を含み、ゲートは、拡張スレッドが逆方向３６２０にナノ細孔を通り抜けることを防ぐ。この方法は、ハイブリダイゼーション部分と、配列決定される一本鎖核酸とのハイブリダイゼーションによって決定される順序で、ナノ細孔を用いて、拡張スレッドのループ構造を検出することを含み、それによって配列決定される一本鎖核酸を配列決定する。
いくつかの例では、ループ構造は狭いセグメントを含み、ゲートは２つの端部を含むポリマーであり、第一の端部は、狭いセグメントに隣接するループ構造に固定され、第二の端部はループ構造に固定されていない。ループ構造は、狭いセグメントに隣接してゲートが整列する第一の方向に、ナノ細孔を通り抜けることができる。いくつかの実施形態では、ループ構造は、狭いセグメントに隣接してゲートが整列しない逆方向にナノ細孔を通り抜けることができない。
いくつかの場合では、ゲートはヌクレオチドを含む。ゲートは、狭いセグメントに隣接して整列していない場合にループ構造と塩基対を形成することができる。
狭いセグメントは、ゲートが狭いセグメントと整列している場合に、ポリマーがナノ細孔を通り抜けるのに十分に狭い任意のポリマーまたは分子を含むことができる。いくつかの場合では、狭いセグメントは、基本的なヌクレオチド（すなわち、それに結合したヌクレオチド塩基を有していない核酸の側鎖）、または炭素鎖を含む。
いくつかの例では、電極は、検出期間の間に再充電される。電極が再充電されると、拡張スレッドは、一般的に逆方向にナノ細孔を通り抜けない。
非配列決定法と適用
本明細書に記載される装置および方法は、核酸配列より、核酸試料および／または核酸分子の特性を測定するために使用することができる（例えば、配列の長さ、または、限定されないが、試料中の核酸の架橋度を含む拡散試料の特質の測定）。いくつかの場合では、核酸分子の配列を決定しないことが望ましい場合がある。例えば、個々のヒト（またはウマ等の他の生物）は、ゲノム内のある反復配列の長さを決定することによって識別することができる（例えば、マイクロサテライト、単純反復配列（ＳＳＲ）、または短いタンデム反復（ＳＴＲ）として知られている）。ＳＴＲおよび／またはＳＴＲの（５’）の前、または（３’）の後に認められるＤＮＡの配列を知らずに（例えば、個人の人種、病気になる見込み等を識別しないように）、（例えば、犯罪の加害者を識別するために）１つ以上のＳＴＲの長さを知りたい。
ある態様では、方法は、ゲノム中に存在する１つ以上のＳＴＲを同定する。任意の数のＳＴＲは、（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上）識別することができる。ＳＴＲ反復セグメントを含めることができる（例えば、配列番号の「ＡＧＧＴＣＴ」）任意の数の核酸塩基（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上の塩基）を有する配列番号１−ＡＧＧＴＣＴ ＡＧＧＴＣＴ ＡＧＧＴＣＴ ＡＧＧＴＣＴ ＡＧＧＴＣＴ ＡＧＧＴＣＴ ＡＧＧＴＣＴ）。ＳＴＲは、任意の数の反復される反復セグメントを含むことができる（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上の回数繰り返される）。
ヌクレオチドの組込み事象の数および／または核酸またはそのセグメントの長さは、タグ付けられたヌクレオチドのいくつか、大部分またはすべてに結合される同じタグを有するヌクレオチドによって決定することができる。タグの検出は（リリース前にナノ細孔内に前負荷されるかまたはタグ付けされたヌクレオチドからの放出後に、ナノ細孔に向けられる）、ヌクレオチド組込み事象が起こったことを示しているが、この例ではどのヌクレオチドが取り込まれたか識別しない（例えば、配列情報が決定されない）。
いくつかの実施形態では、全てのヌクレオチド（例えば、すべてのアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、および／またはウラシル（Ｕ）ヌクレオチド）は、ヌクレオチドに結合された同じタグを有する。しかし、いくつかの場合では、このことは必要とされないかもしれない。少なくともいくつかのヌクレオチドは、ヌクレオチドを識別するタグを有することができる（例えば、いくつかの配列情報が決定されるように）。いくつかの場合では、ヌクレオチドの約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、または約５０％は、ヌクレオチドを識別するタグを有する（例えば、いくつかの核酸の位置は配列決定されているように）。配列決定された核酸の位置は、核酸鎖に沿って無作為に分布させることができる。いくつかの場合では、単一のヌクレオチドのタイプのすべては識別タグを有する（例えば、すべてのアデニンは、例えば、配列決定されるように）。いくつかの場合では、ヌクレオチドの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％がヌクレオチドを識別するタグを有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドの最大５％、最大１０％、最大１５％、最大２０％、最大２５％、最大３０％の最大で４０％、または最大５０％は、ヌクレオチドを識別するタグを有する。いくつかの実施形態では、全ての核酸またはそのセグメントは短いタンデム反復（ＳＴＲ）である。
ある態様では、検出電極に隣接する膜中のナノ細孔を用いて、核酸またはそのセグメントの長さを決定する方法は、ナノ細孔を含む反応室にタグ付きヌクレオチドを提供することを含む。ヌクレオチドは、ヌクレオチドと対になる同じタグを含む少なくとも２つの異なる塩基等の異なる塩基を有することができ、タグはナノ細孔を用いて検出可能である。方法は、さらに、ポリメラーゼを用いて、重合反応を実施することを含むことができ、それによって核酸試料から一本鎖核酸分子に相補的な伸長している鎖に、タグ付けされたヌクレオチドの個々のタグ付けされたヌクレオチドを取り込む。方法はさらに、ナノ細孔を用いて、個々のタグ付きヌクレオチドを取り込んでいる最中、または取り込んだ後に、個別のタグ付きヌクレオチド結合するタグを検出することを含むことができる。
ある態様では、検出電極に隣接する膜中のナノ細孔を用いて、核酸またはそのセグメントの長さを決定する方法は、ナノ細孔を含む反応室にタグ付きヌクレオチドを提供することを含む。タグ付けされたヌクレオチドの個々のタグ付けされたヌクレオチドは、ヌクレオチドに結合されたタグを含むことができ、タグは、タグが存在しない場合、現在のナノ細孔に相対して、ナノ細孔を流れる電流の大きさを減少させることができる。
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼを用いて重合反応を行うことをさらに含み、それによって核酸試料から一本鎖核酸分子に相補的な伸長している鎖に、タグ付けされたヌクレオチドの個々のタグ付けされたヌクレオチドを取り込み、ナノ細孔を通って流れる電流の大きさを減少させる。電流の大きさは、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約９９％を含む、任意の適切な量で減少することができる。いくつかの実施形態では、電流の大きさは、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％減少する。いくつかの実施形態では、電流の大きさは、最大５％、最大１０％、最大１５％、最大２０％、最大２５％、最大３０％、最大４０％、最大５０％、最大６０％、最大７０％、最大８０％、最大９０％、最大９５％、最大９９％に減少する。
方法は、さらに、ナノ細孔を用いて、個々のタグ付きヌクレオチドの取り込みの間の時間を検出することを含むことができる（例えば、図６の時間６０５）。個々のタグ付きヌクレオチドの取り込みの間の時間は、大きい電流を有することができる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドの組込み事象間のナノ細孔を通って流れる電流の大きさは、（例えば、タグが存在しない場合）最大電流の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約９９％である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドの組込み事象間のナノ細孔を通って流れる電流の大きさは、最大電流の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％である。
いくつかの例では、ＳＴＲの（５’）の前、または（３’）の後に核酸の区画を配列決定し、そのＳＴＲがナノ細孔内（例えば、複数のプライマーが複数のＳＴＲに向けられる多重コンテキストの中で）で決定される長さを有しているのかを識別する。いくつかの場合では、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上の核酸が、ＳＴＲの（５’）の前、または（３’）の後に配列決定される。
パターンマッチ
本開示はまた、周知の（または参照）信号を有するナノ細孔装置によって検出される信号のパターンを一致させる電子リーダーも提供する。本明細書の他に記載するように、ナノ細孔装置は、膜にナノ細孔を含むことができる。周知の信号は、ナノ細孔装置を含むチップ上に位置するリモートデータベースまたはメモリ場所等のメモリ位置に維持することができる。電子リーダーは、パターンマッチアルゴリズムを用いてパターンを一致させることができ、電子リーダーのコンピュータープロセッサを用いて実装することができる。電子リーダーは、チップ上に配置することができる。
パターンマッチングは、ナノ細孔装置によってデータ収集されている最中に、リアルタイムに実装することができる。代替として、パターンマッチングが最初の収集データによって実装され、次にパターンに一致するデータを処理することができる。
いくつかの場合では、リーダーは、ユーザーにとって関心のある１つ以上の核酸配列のリスト（本明細書では「ホワイトリスト」とも呼ばれる）を含み、ユーザーにとって関心のない１つ以上の他の核酸配列のリスト（または複数リスト）（本明細書では「ブラックリスト」とも呼ばれる）を含むことができる。核酸の組込み事象を含む核酸の検出の間、リーダーは、ホワイトリストにある核酸配列を検出および記録することができ、ブラックリストにある核酸配列を検出または記録しない。
実施例１−非ファラデー伝導
図３７は、非ファラデー伝導が変調からナノ細孔を分離できることを示す。図の縦軸は、−３０〜３０の範囲のピコアンペア（ｐＡ）で測定された電流である。横軸は０〜２の範囲の秒（ｓ）単位で測定された時間である。波形は４０％のデューティサイクルを有する。データポイント３７０５は、１５０ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．５の２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液および３ｍＭのＳｒＣｌ２の存在下で、二重層の上および下で、海綿状の白金作用電極で測定される電流である。２４０ｎｍの粘着性ポリメラーゼおよび０．０４６４Ｏ．Ｄ．の５ＧＳサンドイッチがある。脂質は７５％ホスファチジルエタノラミン（ＰＥ）おおび２５％ホスファチジルコリン（ＰＣ）である。作用電極と対向電極（ＡｇＣｌペレット）を横切る模擬電圧３７１０は、プロット上に収まるように１００を乗じて示される。ナノ細孔ポリメラーゼ複合体３７１５を横切る模擬電気化学電位は、プロット上に収まるように１００を乗じて示されている。電流３７２０は、ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｃｉｒｃｕｉｔ ｅｍｐｈａｓｉｓ（ＳＰＩＣＥ）モデルを備えたシミュレーションプログラムを使用して模擬される。
実施例２−タグの捕獲
図３８は、交流電流（ＡＣ）システムでナノ細孔に捕獲されている２つのタグを示す。図の縦軸は、０〜２５の範囲のピコアンペア（ｐＡ）で測定された電流である。横軸は約７６９〜７８０の範囲の秒（ｓ）単位で測定された時間である。第一タグ３８０５は、約１０ｐＡに捕獲されている。第二タグ３８１０は、約５ｐＡに捕獲されている。オープンチャネル電流３８１５は、約１８ｐＡである。データポイントは、タグを急速に捕獲するために、オープンチャネル電流ではデータポイントはほとんど見られない。波形は、１０Ｈｚで０〜１５０ｍＶおよび４０％のデューティサイクルである。溶液は１５０ｍＭのＫＣｌを含む。
実施例３−タグの配列決定
図３９は、配列決定されるテンプレートＤＮＡ分子３９０５、溶血素ナノ細孔３９１０とＤＮＡポリメラーゼ３９１５の融合物、並びにタグ付きヌクレオチド３９２０の間で形成された三元複合体３９００の例を示す。ポリメラーゼ３９１５はタンパク質リンカー３９２５でナノ細孔３９１０に結合している。ナノ細孔／ポリメラーゼ構築物は、ナノ細孔の７個のポリペプチド単量体のたった１つが、ポリメラーゼを結合させるように形成される。タグ付けされたヌクレオチド３９２０の部分は、ナノ細孔を通り抜け、ナノ細孔を通過する電流に影響を与える。
図４０は、配列決定されるがタグ付きヌクレオチドのないテンプレートＤＮＡの存在下でナノ細孔を通って流れる電流を示す。ナノ細孔と接触している溶液は、１００ｍＶの印加電圧で、１５０ｍＭのＫＣｌ、０．７ｍＭのＳｒＣｌ２、３ｍＭのＭｇＣｌ２およびｐＨ７．５の２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液を有する。電流は、いくつかの例外４００５がある１８ピコアンペア（ｐＡ）に近いままにある。例外は、電子ノイズが存在する可能性があること、および水平時間軸上のたった１つのデータポイントであることである。電子ノイズは、例えば、適応信号処理アルゴリズム等の、ノイズを信号と区別するアルゴリズムを使用して軽減することができる。
図４１、図４２と図４３は、異なるタグが異なる電流レベルを提供することを示す。全ての実施例では、ナノ細孔と接触している溶液は、１００ｍＶの印加電圧で、１５０ｍＭのＫＣｌ、０．７ｍＭのＳｒＣｌ２、３ｍＭのＭｇＣｌ２およびｐＨ７．５の２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液を有する。図４１は、チミン（Ｔ）４１１０と区別されているグアニン（Ｇ）４１０５を示す。タグは、約８〜１０ｐＡの電流レベルを有する（Ｔについて）ｄＴ６Ｐ−Ｔ６−ｄＳｐ８−Ｔ１６−Ｃ３、および約４〜５ｐＡの電流レベルを有する（Ｇについて）ｄＧ６Ｐ−Ｃｙ３−３０Ｔ−Ｃ６である。図４２は、アデニン（Ａ）４２１０と区別されているグアニン（Ｇ）４２０５を示す。タグは約６〜７ｐＡの電流レベルを有する（Ａについて）ｄＡ６Ｐ−Ｔ４−（Ｓｐ１８）−Ｔ２２−Ｃ３、および約４〜５ｐＡの電流レベルを有する（Ｇについて）ｄＧ６Ｐ−Ｃｙ３−３０Ｔ−Ｃ６である。図４３は、シトシン（Ｃ）４３１０と区別されているグアニン（Ｇ）４３０５を示す。タグは約１〜３ｐＡの電流レベルを有する（Ｃについて）ｄＧ６Ｐ−Ｔ４−（Ｓｐ１８）−Ｔ２２−Ｃ３および約４〜５ｐＡの電流レベルを有する（Ｇについて）ｄＧ６Ｐ−Ｃｙ３−３０Ｔ−Ｃ６である。
図４４、図４５、図４６、および図４７はタグ付けされたヌクレオチドを用いた配列の例を示す。配列決定されるＤＮＡ分子は一本鎖であり、配列ＡＧＴＣＡＧＴＣ（配列番号３６）を有し、２つの隣接ヘアピン構造によって安定になっている。全ての例では、ナノ細孔と接触する溶液は、１００ｍＶの印加電圧で、１５０ｍＭのＫＣｌ、０．７ｍＭのＳｒＣｌ２、３ｍＭのＭｇＣｌ２および２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．５を有する。グアニン（ｄＧ６Ｐ−Ｃｙ３−３０Ｔ−Ｃ６）、アデニン（ｄＡ６Ｐ−Ｔ４−（Ｓｐ１８）−Ｔ２２−Ｃ３）、シトシン（ｄＣ６Ｐ−Ｔ４−（Ｓｐ１８）−Ｔ２２−Ｃ３）およびチミン（ｄＴ６Ｐ−Ｔ６−ｄＳｐ８−Ｔ１６−Ｃ３）に対応する４個のタグは溶液中に含まれる。図４４は、４つの連続したタグ付きのヌクレオチド（すなわち、Ｃ４４０５、Ａ４４１０、Ｇ４４１５およびＴ４４２０）が、配列番号３６の配列ＧＴＣＡに対応して識別される例を示している。タグは、伸長する鎖に取り込まれる前に、数回、ナノ細孔の中および外を通過することができる（例えば、各組込み事象について、電流レベルは、オープンチャネル電流とタグを区別する減少した電流レベルとに数回切り替わることができる）。
電流減少の持続時間は、何らかの理由で、試行間で異なるが、タグが異なるナノ細孔に入るおよび／または出て行く時間、および／またはタグがポリメラーゼによって短時間保持されるが、伸長する核酸鎖に完全に取り込まれていない時間が挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、電流減少の持続時間は試行間でほぼ一致する（例えば、約２００％、１００％、５０％、または２０％しか変動しない）。いくつかの場合では、酵素、印加された電圧波形、二価および／または一価イオンの濃度、温度、および／またはｐＨは、電流減少の持続時間が試行間でほぼ一致するように選択される。図４５は、配列番号３６の同じ配列ＧＴＣＡを示し、図４４に示したように識別される（すなわち、この場合では、識別されたタグ付きヌクレオチドはＣ４５０５、Ａ４５１０、Ｇ４５１５およびＴ４５２０である）。いくつかの場合では、電流は長期間減少したままである（例えば４５２０に示すように、約２秒）。
図４６は、配列番号３６の配列ＡＧＴＣＡに対応して識別される５つの連続したタグ付きヌクレオチド（すなわち、Ｔ４６０５、Ｃ４６１０、Ａ４６１５、Ｇ４６２０、Ｔ４６２５）を示す。図４７は、配列番号３６の配列ＡＧＴＣＡＧに対応して識別される５つの連続したタグ付きヌクレオチド（すなわち、Ｔ４７０５、Ｃ４７１０、Ａ４７１５、Ｇ４７２０、Ｔ４７２５、Ｃ４７３０）を示す。
本発明の好ましい実施形態を本明細書に図示し、説明してきたが、当該実施形態は例のためだけに提供されることは当業者には明らかであろう。本発明は明細書の範囲内に提供される特定の実施例によって限定されるものではない。本発明は、前述の明細書を参照して説明してきたが、本明細書の実施形態の説明および図は、限定的な意味で解釈されることを意味しない。本発明から逸脱することなく、多くの変形、変更、および置換が当業者に想起されるであろう。さらに、本発明の全ての態様は、様々な条件および変数に依存する本明細書に記載される特定の描写、構成または相対的な比率に限定されるものではないことを理解されなければばらない。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替が、本発明を実施する際に使用され得ることが理解されるべきである。したがって、本発明はまた、当該代替、修正、変更または均等物を網羅することも意図される。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲および均等物の範囲内の方法および構造がそれによって網羅されることが意図される。

Claims (92)

  1. 検出電極に隣接する膜のナノ細孔を用いて核酸試料を配列決定する方法であって：
    （ａ）タグ化されたヌクレオチドを、ナノ細孔を含有する反応チャンバへと導入することであって、ここで、前記タグ化ヌクレオチドの個々のタグ化ヌクレオチドは、ヌクレオチドに連結されたタグを含有しており、そのタグは前記ナノ細孔を用いて検出可能であり；
    （ｂ）ポリメラーゼを用いて重合反応を行い、それにより前記タグ化ヌクレオチドの個々のタグ化ヌクレオチドを、核酸試料由来の一本鎖核酸分子に相補的な増殖鎖へと組み込むこと；
    （ｃ）ナノ細孔を用いて、前記個々のタグ化ヌクレオチドの組み込みの間に、前記個々のタグ化ヌクレオチドに結合したタグを検出することであって、ここで、前記タグは、前記ヌクレオチドが前記ポリメラーゼと結合している間に、前記ナノ細孔を用いて検出されること、を含む方法。
  2. 前記タグは、前記ポリメラーゼに結合している間に、複数回、検出される、請求項１に記載の方法。
  3. 電極は、タグ検出期間の間に再充電される、請求項２に記載の方法。
  4. （ｃ）において、組み込まれたタグ化ヌクレオチドは、前記タグ化ヌクレオチドが前記ナノ細孔により検出される時間の長さに基づいて、組み込まれていないタグヌクレオチドから識別される、請求項１に記載の方法。
  5. 組み込まれたタグ化ヌクレオチドがナノ細孔により検出される時間と、組み込まれていないタグ化ヌクレオチドがナノ細孔により検出される時間の比率が、少なくとも約１．５ある、請求項４に記載の方法。
  6. 組み込まれたタグ化ヌクレオチドがナノ細孔により検出される時間と、組み込まれていないタグ化ヌクレオチドがナノ細孔により検出される時間の比率が、少なくとも１０である、請求項４に記載の方法。
  7. 前記ヌクレオチドが、少なくとも平均約１ミリ秒の期間、前記ポリメラーゼと結合する、請求項１に記載の方法。
  8. 前記タグ化ヌクレオチドは、前記ヌクレオチドが前記ポリメラーゼと結合しない場合、１ミリ秒未満で前記ナノ細孔を通過する、請求項１に記載の方法。
  9. 前記ナノ細孔は、組み込まれたタグ化ヌクレオチドと、組み込まれていないタグヌクレオチドを、少なくとも９５％の精度で識別することができる、請求項１に記載の方法。
  10. 前記ナノ細孔は、組み込まれたタグ化ヌクレオチドと、組み込まれていないタグヌクレオチドを、少なくとも９９％の精度で識別することができる、請求項１に記載の方法。
  11. 前記個々のタグ化ヌクレオチドと結合した前記タグは、前記タグが、前記個々のタグ化ヌクレオチドから放出される際に検出される、請求項１に記載の方法。
  12. （ｂ）において、前記個々のタグ化ヌクレオチドと結合したタグは、前記ナノ細孔の少なくとも一部を通り抜ける、請求項１に記載の方法。
  13. （ｃ）において、前記タグは、前記ナノ細孔の少なくとも一部を通り抜ける間に検出される、請求項１２に記載の方法。
  14. 検出電極に隣接した膜のナノ細孔を用いて、核酸試料を配列決定する方法であって：
    （ａ）タグ化ヌクレオチドを、前記ナノ細孔を含有する反応チャンバへと導入することであって、ここで、前記タグ化ヌクレオチドの個々のタグ化ヌクレオチドは、ヌクレオチドに連結されたタグを含有しており、そのタグは、前記ナノ細孔を用いて検出可能である；
    （ｂ）酵素を用いて、前記タグ化ヌクレオチドの個々のタグ化ヌクレオチドを、前記核酸試料由来の一本鎖核酸分子に相補的な増殖鎖へと組みこむこと；および、
    （ｃ）前記個々のタグ化ヌクレオチドの組み込みの間に、または、前記個々のタグ化ヌクレオチドの組み込みで、ナノ細孔を用いて、前記個々のタグ化ヌクレオチドと結合したタグを、組み込まれていない１以上の個々のタグ化ヌクレオチドと結合した１以上のタグから識別すること、を含む方法。
  15. （ｂ）において組み込まれた前記個々のタグ化ヌクレオチドは、（ｂ）において組み込まれた前記個々のタグ化ヌクレオチドおよび前記組み込まれていない個々のタグ化ヌクレオチドが前記ナノ細孔を用いて検出される時間の長さに基づいて、組み込まれていない個々のタグ化ヌクレオチドから識別される、請求項１４に記載の方法。
  16. 膜のナノ細孔を用いた核酸の配列決定方法であって、
    （ａ）タグ化ヌクレオチドを、前記ナノ細孔を含有する反応チャンバへと導入することであって、ここで、前記タグ化ヌクレオチドの個々のタグ化ヌクレオチドは、前記ナノ細孔により検出することができるタグを含有し；
    （ｂ）前記タグ化ヌクレオチドを増殖核酸鎖へと組み込むことであって、ここで、前記タグ化ヌクレオチドの個々のタグ化ヌクレオチドと結合するタグは、組み込みの間、前記ナノ細孔の少なくとも一部の中に存在するか、または少なくとも一部に近接しており、ここで、組み込まれたタグ化ヌクレオチドがナノ細孔により検出される時間と、組み込まれていないタグがナノ細孔により検出される時間の比率は、少なくとも、１．５であり；および、
    （ｃ）前記ナノ細孔を用いて前記タグを検出すること、を含む方法。
  17. （ｂ）において、前記タグは、前記ナノ細孔の少なくとも一部を通り抜ける、請求項１６に記載の方法。
  18. （ｃ）において、前記タグは、前記ナノ細孔の少なくとも一部を通り抜ける間に検出される、請求項１７に記載の方法。
  19. 核酸試料を配列決定するためのチップであって、前記チップは、複数のナノ細孔を含有し、前記複数のナノ細孔は、電極に隣接または近接して配置された膜に少なくとも１つのナノ細孔を有し、ここで、前記ナノ細孔は、前記ナノ細孔内へと通ったタグを有するタグ化ヌクレオチドを有し、ここで、個々のナノ細孔は、増殖核酸鎖へのヌクレオチドの組み込みの間にタグ化ヌクレオチドと結合したタグを検出する、チップ。
  20. 前記個々のナノ細孔は、前記ナノ細孔をタグが次に通り抜ける間、または、前記ナノ細孔に隣接してタグが次に通る間に、前記ヌクレオチドに結合したタグを検出する、請求項１９に記載のチップ。
  21. 前記ナノ細孔は、個々にアドレス可能である、請求項１９に記載のチップ。
  22. 前記チップは、平方ミリメートル当たり、少なくとも５００の電極を含有する、請求項１９に記載のチップ。
  23. 組み込まれたタグ化ヌクレオチドと、組み込まれていないタグヌクレオチドを、前記ナノ細孔により前記タグが検出される時間の長さに少なくとも部分的に基づいて識別するようプログラムされているコンピュータープロセッサをさらに含有する、請求項１９に記載のチップ。
  24. 前記電極は、集積回路の一部である、請求項１９に記載のチップ。
  25. 前記電極は、集積回路に連結されている、請求項１９に記載のチップ。
  26. 前記タグは、前記タグが前記ヌクレオチドに付着されている間に検出される、請求項１９に記載のチップ。
  27. 前記タグは、前記タグが、前記個々のタグ化ヌクレオチドから放出される際に検出される、請求項１９に記載のチップ。
  28. 前記タグは、前記タグが前記個々のナノ細孔を通り抜ける間に検出される、請求項１９に記載のチップ。
  29. 核酸試料を配列決定するためのシステムであって：
    （ａ）１以上のナノ細孔デバイスを含有するチップであって、個々のナノ細孔デバイスは、電極に隣接している膜にナノ細孔を含有し、ここで、前記ナノ細孔デバイスは、ポリメラーゼによる前記タグ化ヌクレオチドの組み込みの間に、個々のタグ化ヌクレオチドに結合したタグを検出する；および、
    （ｂ）前記チップに操作可能に連結されたプロセッサであって、ここで、前記コンピュータープロセッサは、（ｉ）前記１以上のナノ細孔デバイスから電気信号を受け取り、および、（ｉｉ）前記ナノ細孔デバイスから受け取った電気信号に基づいて、前記核酸試料の核酸配列の特徴付けを行うようプログラムされている、
    を含有する、システム。
  30. （ａ）において、前記個々のナノ細孔デバイスは、前記タグの前記ナノ細孔を通る次なる進行の間、または、前記タグの前記ナノ細孔に隣接した次なる進行の間に、個々のタグ化ヌクレオチドに結合したタグを検出する、請求項２９に記載のシステム。
  31. 前記プロセッサは、組み込まれたタグ化ヌクレオチドと、組み込まれていないタグヌクレオチドを、前記ナノ細孔により前記タグ化ヌクレオチドが検出される時間の長さに少なくとも部分的に基づいて識別するようプログラムされている、請求項２９に記載のシステム。
  32. 前記コンピュータープロセッサは、組み込まれたタグ化ヌクレオチドと、組み込まれていないタグヌクレオチドを、少なくとも９５％の精度で識別するようプログラムされている、請求項２９に記載のシステム。
  33. 前記コンピュータープロセッサは、組み込まれたタグ化ヌクレオチドと、組み込まれていないタグヌクレオチドを、少なくとも９９％の精度で識別するようプログラムされている、請求項２９に記載のシステム。
  34. 前記電極は、集積回路の一部である、請求項２９に記載のシステム。
  35. 前記電極は、集積回路に連結されている、請求項２９に記載のシステム。
  36. 前記コンピュータープロセッサは、前記タグが前記個々のタグ化ヌクレオチドに付着されている間に、前記タグを検出する、請求項２９に記載のシステム。
  37. 前記コンピュータープロセッサは、前記タグが前記個々のタグ化ヌクレオチドから放出される際に、前記タグを検出する、請求項２９に記載のシステム。
  38. 前記コンピュータープロセッサは、前記タグが前記ナノ細孔を通り抜ける間に、前記タグを検出するようプログラムされている、請求項２９に記載のシステム。
  39. 核酸を配列決定するための方法であって、ナノ細孔および検出電極に近接した回路へ交流電流（ＡＣ）の波形を適用させることを含み、ここで、鋳型核酸鎖に対して相補的な増殖核酸鎖に組み込まれているヌクレオチドと結合したタグは、波形が第一の極性を有している際に検出され、および、電極は、波形が第二の極性を有している際に再充電される、方法。
  40. 前記ＡＣの波形は、少なくとも１時間の間にわたり、前記電極を枯渇させない、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記タグの同一性は、測定電流と、様々な電圧でのＡＣ波形により適用された電圧の間の関係性により測定される、請求項３９に記載の方法。
  42. 前記鋳型核酸鎖の塩基のメチル化は、前記塩基がメチル化されていないときよりも、前記塩基がメチル化されているときに、より長い期間、前記タグが検出されることにより、測定される、請求項３９に記載の方法。
  43. 核酸分子を配列決定するための方法であって、
    （ａ）１以上のタグ化ヌクレオチドを電極に隣接する膜のナノ細孔に導入すること；
    （ｂ）前記１以上のタグ化ヌクレオチドの個々のタグ化ヌクレオチドを、前記核酸分子に相補的な鎖へと組み込むこと；および、
    （ｃ）前記個々のタグ化ヌクレオチドと結合したタグを、前記電極に適用した交流電流（ＡＣ）波形を用いて、１回以上検出することであって、ここで、前記タグは、前記タグが、前記鎖へと組み込まれた前記個々のタグ化ヌクレオチドに付着されている間に検出される、を含む方法。
  44. 前記ＡＣ波形は、少なくとも１時間の期間にわたり、前記電極を枯渇させない、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記タグの同一性は、測定電流と、前記ＡＣ波形により適用された様々な電圧の間の関係性により測定される、請求項４３に記載の方法。
  46. 前記タグ化ヌクレオチドの少なくとも一部は、メチル化塩基を含有する、請求項４３に記載の方法。
  47. タグ化ヌクレオチドと結合し、メチル化された塩基を有するタグは、メチル化された塩基を有していないタグ化ヌクレオチドと結合したタグと比較して、より長い期間、検出される、請求項４６に記載の方法。
  48. 検出電極に隣接した膜のナノ細孔を用いた、核酸またはその断片の長さを測定する方法であって：
    （ａ）前記ナノ細孔を含有する反応チャンバへとタグ化ヌクレオチドを導入することであって、ここで、少なくとも２つの異なる塩基を有するヌクレオチドは、ヌクレオチドに連結された同じタグを含有し、そのタグは、前記ナノ細孔を用いて検出可能であり；
    （ｂ）ポリメラーゼを用いて重合反応を行い、それにより、前記核酸試料由来の一本鎖核酸分子に相補的な増殖鎖に前記タグ化ヌクレオチドの個々のタグ化ヌクレオチドを組込み；および
    （ｃ）前記ナノ細孔を用いて、前記個々のタグ化ヌクレオチドに結合したタグを、前記個々のタグ化ヌクレオチドの組み込みの間に、または前記個々のタグ化ヌクレオチドの組み込みの後で、検出すること、を含む方法。
  49. 全てのヌクレオチドは、前記ヌクレオチドに連結された同じタグを有する、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記ヌクレオチドの少なくとも一部は、前記ヌクレオチドを特定するタグを有する、請求項４８に記載の方法。
  51. 前記核酸またはその断片は、Ｓｈｏｒｔ Ｔａｍｄｅｍ Ｒｅｐｅａｔ（ＳＴＲ）である、請求項４８に記載の方法。
  52. 検出電極に隣接した膜のナノ細孔を用いて、核酸またはその断片の長さを測定する方法であって：
    （ａ）前記ナノ細孔を含有する反応チャンバにタグ化ヌクレオチドを導入することであって、ここで、前記タグ化ヌクレオチドの個々のタグ化ヌクレオチドは、ヌクレオチドに連結されたタグを含有し、そのタグは、前記タグが存在しない場合の電流と比較して、前記ナノ細孔を通る場合の電流の強度を減少させることができ；
    （ｂ）ポリメラーゼを用いて重合反応を行うことであって、それにより、前記タグ化ヌクレオチドの個々のタグ化ヌクレオチドが、前記核酸試料由来の一本鎖核酸分子に相補的な増殖鎖へと組み込まれ、および、前記ナノ細孔を通る電流の強度を減少させ；ならびに、
    （ｃ）前記ナノ細孔を用いて、前記個々のタグ化ヌクレオチドの組み込みの間の時間を検出すること、を含む方法。
  53. 複数のサブユニットを有するタンパク質のアセンブリの方法であって：
    （ａ）複数の第一のサブユニットを導入すること；
    （ｂ）複数の第二のサブユニットを導入することであって、ここで、前記第二のサブユニットは、第一のサブユニットに対して改変されており；
    （ｃ）第一のサブユニットと第二のサブユニットを、第一のサブユニットと第二のサブユニットを有する複数のタンパク質が形成されるような第一の比率で接触させ、ここで、前記複数のタンパク質は、第一のサブユニットと第二のサブユニットの比率を複数有するものであり；および
    （ｄ）第一のサブユニットと第二のサブユニットの第二の比率を有するタンパク質を富化するよう、前記複数のタンパク質を分画化し、ここで、第二の比率は、１第二のサブユニット／（ｎ−１）第一のサブユニットであり、ここで、「ｎ」は、前記タンパク質を含有するサブユニットの数である、を含む方法。
  54. 前記タンパク質は、ナノ細孔である、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記ナノ細孔は、α溶血素に対し、少なくとも８０％の相同性である、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記第一のサブユニットまたは前記第二のサブユニットは、精製タグを含有している、請求項５３に記載の方法。
  57. 前記精製タグは、ポリヒスチジンタグである、請求項５６に記載の方法。
  58. （ｄ）において、分画は、イオン交換クロマトグラフィーを用いて行われる、請求項５３に記載の方法。
  59. 前記第二の比率は、１第二のサブユニット／６第一のサブユニットである、請求項５３に記載の方法。
  60. 前記第二の比率は、２第二のサブユニット／５第一のサブユニットであり、１つのポリメラーゼが、前記第二のサブユニットのそれぞれに付着されている、請求項５３に記載の方法。
  61. 前記第二のサブユニットは、化学的に反応性な部分を含有する、請求項５３に記載の方法。
  62. 前記方法はさらに、（ｅ）当該化学的に反応性な部分に実体を付着させるための反応を行うことを含む、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記タンパク質はナノ細孔であり、前記実体はポリメラーゼである、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記第一のサブユニットは野生型である、請求項５３に記載の方法。
  65. 前記第一のサブユニットおよび／または第二のサブユニットは、組換え体である、請求項５３に記載の方法。
  66. 前記第一の比率は、前記第二の比率に大よそ等しい、請求項５３に記載の方法。
  67. 前記第一の比率は、前記第二の比率よりも大きい、請求項５３に記載の方法。
  68. 前記第二の比率のサブユニットを有するタンパク質を二重層へと挿入することをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
  69. 前記第二の比率のサブユニットを有するタンパク質を用いて、核酸分子を配列決定することをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
  70. 複数のサブユニットを含むナノ細孔であって、ここで、ポリメラーゼは、前記サブユニットのうちの１つに付着されており、および、少なくとも１つのサブユニットおよびすべてではないサブユニットが、第一の精製タグを含有する、ナノ細孔。
  71. 前記ナノ細孔は、α溶血素に対し少なくとも８０％の相同性である、請求項７０に記載のナノ細孔。
  72. すべてのサブユニットは、第一の精製タグまたは第二の精製タグを含有する、請求項７０に記載のナノ細孔。
  73. 前記第一の精製タグは、ポリヒスチジンタグである、請求項７０に記載のナノ細孔。
  74. 前記第一の精製タグは、ポリメラーゼが付着したサブユニット上にある、請求項７０に記載のナノ細孔。
  75. 前記第一の精製タグは、ポリメラーゼが付着していないサブユニット上にある、請求項７０に記載のナノ細孔。
  76. 検出電極に隣接した膜のナノ細孔を用いて核酸試料を配列決定するための方法であって：
    （ａ）前記ナノ細孔を含有する反応チャンバにタグ化ヌクレオチドを導入することであって、ここで、前記タグ化ヌクレオチドの個々のタグ化ヌクレオチドは、ヌクレオチドに連結されたタグを含有し、そのタグは、前記ナノ細孔を用いて検出可能であり；
    （ｂ）ポリメラーゼを用いて重合反応を行うことであって、それにより、前記タグ化ヌクレオチドの個々のタグ化ヌクレオチドが、前記核酸試料由来の一本鎖核酸分子に相補的な増殖鎖へと組み込まれ；
    （ｃ）前記ナノ細孔を用いて、前記個々のタグ化ヌクレオチドが組み込まれている間に、前記個々のタグ化ヌクレオチドと結合したタグを検出することであって、ここで、前記タグは、前記ヌクレオチドが前記ポリメラーゼに結合しているときに前記ナノ細孔を用いて検出され、および、前記検出することには、（ｉ）前記ナノ細孔全体に印加電圧を与えること、および（ｉｉ）前記印加電圧での、前記検出電極との電流を測定すること、が含まれ；ならびに、
    （ｄ）前記印加電圧を較正すること、を含む方法。
  77. 前記較正には、
    （ｉ）前記タグ分子に対する複数の脱出電圧を測定すること、
    （ｉｉ）測定された脱出電圧と基準点の間の差異をコンピューターにより計算すること、および、
    （ｉｉｉ）算出された差異により印加電圧を変えること、が含まれる、請求項７６に記載の方法。
  78. 時間に対する、予測脱出電圧の分布が、推測される、請求項７６に記載の方法。
  79. 前記基準点は、測定された脱出電圧の平均またはメジアンである、請求項７８に記載の方法。
  80. （ａ）〜（ｄ）は、検出電極にそれぞれ隣接した個々のアドレス可能な複数のナノ細孔上で行われる、請求項７６に記載の方法。
  81. 前記印加電圧は経時的に減少する、請求項７６に記載の方法。
  82. （ｅ）電流利得における変動、および／または、電流オフセットにおける変動を較正すること、をさらに含む、請求項７６に記載の方法。
  83. 前記タグは、前記ポリメラーゼが結合している間、複数の時点で検出される、請求項７６に記載の方法。
  84. 電極は、タグ検出期間の間に再充電される、請求項８３に記載の方法。
  85. 検出電極に隣接した膜のナノ細孔を用いた、核酸試料を配列決定する方法であって：
    （ａ）核酸試料から反復核酸配列を除去し、配列決定のために一本鎖核酸分子をもたらすこと；
    （ｂ）タグ化ヌクレオチドを、前記ナノ細孔を含有する反応チャンバへと導入することであって、ここで、前記タグ化ヌクレオチドの個々のタグ化ヌクレオチドは、ヌクレオチドに連結されたタグを含有し、そのタグは、前記ナノ細孔を用いて検出可能であり；
    （ｃ）ポリメラーゼを用いて重合反応を実行することであって、それにより、前記タグ化ヌクレオチドの個々のタグ化ヌクレオチドを前記一本鎖核酸分子に相補的な増殖鎖へと組み込むこと；および、
    （ｄ）ナノ細孔を用いて、前記個々のタグ化ヌクレオチドの組み込みの間に、前記個々のタグ化ヌクレオチドと結合したタグを検出することであって、ここで、前記タグは、前記ヌクレオチドが前記ポリメラーゼと結合しているときに、前記ナノ細孔を用いて検出される、ことを含む方法。
  86. 前記反復核酸配列は、前記反復核酸配列に相補的な核酸配列とハイブリダイゼーションされることにより除去される、請求項８５に記載の方法。
  87. 前記反復核酸配列に相補的な核酸配列は、固形支持体上に固定される、請求項８６に記載の方法。
  88. 前記反復核酸配列に相補的な核酸配列は、Ｃｏｔ−１ＤＮＡを含有する、請求項８５に記載の方法。
  89. 検出電極に隣接した膜のナノ細孔を用いた核酸試料を配列決定するための方法であって：
    （ａ）前記ナノ細孔を含有する反応チャンバへタグ化ヌクレオチドを導入することであって、ここで、前記タグ化ヌクレオチドの個々のタグ化ヌクレオチドは、ヌクレオチドに連結されたタグを含有し、そのタグは、前記ナノ細孔を用いて検出可能であり；
    （ｂ）ナノ細孔へリンカーにより付着されたポリメラーゼを用いた重合反応を実行することであって、それにより、前記タグ化ヌクレオチドの個々のタグ化ヌクレオチドが、前記核酸試料由来の一本鎖核酸分子に相補的な増殖鎖へと組み込まれることであって；および、
    （ｃ）前記ナノ細孔を用いて、前記個々のタグ化ヌクレオチドの組み込みの間に、前記個々のタグ化ヌクレオチドと結合したタグを検出することであって、ここで、前記タグは、前記ヌクレオチドが前記ポリメラーゼと結合しているときに、前記ナノ細孔を用いて検出される、ことを含む方法。
  90. （ａ）第一のセグメントおよび第二のセグメントを含有する第一のポリマー鎖であって、ここで、前記第二のセグメントは、前記第一のセグメントよりも狭く；および、
    （ｂ）２つの末端を含有する第二のポリマー鎖であって、ここで、第一の末端は、前記第二のセグメントに隣接する前記第一のポリマー鎖に取り付けられており、および、第二の末端は、前記第一のポリマー鎖に取り付けられておらず、ここで、前記タグ分子は、前記第二のポリマー鎖が前記第二のセグメントに隣接して並べられている、第一の方向で、ナノ細孔を通り抜けることができるものである、
    ことを含む、タグ分子。
  91. 検出電極に隣接した膜のナノ細孔を用いた核酸試料を配列決定する方法であって：
    （ａ）前記ナノ細孔を含有する反応チャンバへタグ化ヌクレオチドを導入することであって、ここで、前記タグ化ヌクレオチドの個々のタグ化ヌクレオチドは、ヌクレオチドに連結されたタグを含有し、そのタグは、前記ナノ細孔を用いて検出可能であり、ここで、当該タグは、（ｉ）第一のセグメントおよび第二のセグメントを含有する第一のポリマー鎖であって、ここで、第二のセグメントは第一のセグメントよりも狭く、および、（ｉｉ）２つの末端を含有する第二のポリマー鎖であって、ここで、第一の末端は前記第二のセグメントに隣接した前記第一のポリマー鎖に取り付けられており、および、第二の末端は前記第一のポリマー鎖に取り付けられていないもの、を含有し、ここで、前記タグ分子は、第二のポリマー鎖が第二のセグメントに隣接して並べられている、第一の方向でナノ細孔を通り抜けることができるものであり；
    （ｂ）ポリメラーゼを用いて重合反応を実行することであって、それによって、前記タグ化ヌクレオチドの個々のタグ化ヌクレオチドは、前記核酸試料由来の一本鎖核酸分子に対して相補的な増殖鎖へと組み込まれ；および、
    （ｃ）前記ナノ細孔を用いて、前記個々のタグ化ヌクレオチドの組み込みの間に、前記個々のタグ化ヌクレオチドに結合したタグを検出することであって、ここで、前記タグは、前記ヌクレオチドが前記ポリメラーゼと結合しているときに、前記ナノ細孔を用いて検出される、を含む方法。
  92. 核酸配列決定の方法であって、
    （ａ）一本鎖核酸を導入すること；
    （ｂ）複数のプローブを導入することであって、ここで、前記プローブは、
    （ｉ）前記一本鎖核酸とハイブリダイズすることができるハイブリダイゼーション部分、
    （ｉｉ）２つの末端の有するループ構造であって、ここで、各末端は前記ハイブリダイゼーション部分に付着されており、および、
    （ｉｉｉ）ループ構造の末端の間のハイブリダイゼーション部分に位置づけられている開裂可能な基であって、ここで、前記ループ構造は、前記ループ構造が逆の方向でナノ細孔を通り抜けることを阻害するゲートを含有するもの、
    を含有し；
    （ｃ）配列決定される前記一本鎖核酸とのハイブリダイゼーション部分のハイブリダイゼーションにより決定される順番で、前記複数のプローブを重合すること；
    （ｄ）前記開裂可能な基を開裂して、配列決定される伸長スレッドをもたらすこと；
    （ｅ）前記伸長スレッドに、ナノ細孔を通り抜けさせることであって、ここで、前記ゲートは、前記伸長スレッドが、逆の方向でナノ細孔を通り抜けることを阻害し；および、
    （ｆ）ナノ細孔を用いて、配列決定される前記一本鎖核酸とのハイブリダイゼーション部分のハイブリダイゼーションにより決定される順番で、前記伸長スレッドのループ構造を検出し、それにより、配列決定される一本鎖核酸を配列決定すること、を含む方法。
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