JP2016187357A - リコンビナーゼポリメラーゼ増幅を多重化するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2005年7月25日に出願された米国特許出願第60/702,533号および2005年10月18日に出願された米国特許出願第60/728,424号より優先権の利益を主張する。
リコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)は、酵素を利用して合成オリゴヌクレオチドプライマーを二本鎖DNA内のそれらの相補的パートナーへマッチさせるDNA増幅プロセスである(Armes and Stemple、2002年2月21日に提出された米国特許出願第60/358,563号)。RPAは、細胞DNA複製および修復機構の構成要素に依存している。インビトロDNA増幅のためにこの機構の一部を使用するという考えはしばらくの間は存続していたが(Zarlingら、特許文献1)、この概念は、主として大腸菌(E. coli)recAタンパク質を含むリコンビナーゼ機能の分野における長年の研究の歴史にもかかわらず実用的技術へは変換されていなかったが、近年になってようやくDNAの感受性増幅を許容するインビトロ条件が決定されるに至った(Piepenburgら、2004年9月1日に提出された米国特許出願第10/931,916号、さらにPiepenburgら、PlosBiology 2006)。
本発明は、容易に多重化できるプロセスにおいて核酸を迅速かつ効率的に増幅させるための新規なリコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)プロトコールを含む核酸増幅の方法に関する。
二本鎖核酸内の非相補的塩基の存在が二本鎖核酸内でバブルを生成するであろうことは知られている。1つの非相補的もしくは修飾された内部残基が本発明の方法とともに機能するために十分である場合は、2つ以上の非相補的もしくは修飾された内部残基を使用できる。2つ以上が使用される場合は、それらはオリゴヌクレオチド上で相互に隣接してよい、またはそれらは離れていてよい。ヌクレアーゼがミスマッチもしくは非相補的場所で標的核酸を切断する場合は、標的DNAはテンプレートとしてプライマーを用いてdNTPおよびポリメラーゼによって迅速に修復されることに留意されたい。このために、この反応は本開示のプロセスには影響を及ぼさないであろう。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
DNAの第1鎖および第2鎖を含む標的核酸分子をDNA増幅させるRPAプロセスであって:
(a)リコンビナーゼ因子を第1核酸プライマーおよび第2核酸プライマーならびに1つまたは複数の非相補的もしくは修飾された内部残基を含む第3伸長ブロック化プライマーと接触させて、第1核タンパク質プライマー、第2核タンパク質プライマーおよび第3核タンパク質プライマーを形成させる工程と;
(b)該第1核タンパク質プライマーおよび該第2核タンパク質プライマーを該二本鎖標的核酸と接触させ、それにより、該第1核タンパク質プライマーと該DNAの第1鎖の第1部分の該第1鎖との間で第1二本鎖構造を形成させ、そして該第2核タンパク質プライマーと該DNAの第2鎖の第2部分の該第2鎖との間で第2二本鎖構造を形成させ、その結果、該第1核タンパク質プライマーおよび該第1核タンパク質プライマーの3’末端が、該3’末端間に標的核酸の第3部分を有して同一標的核酸分子上で相互に向けて方向付けられる工程と;
(c)1つまたは複数のポリメラーゼおよびdNTPを用いて該第1核タンパク質プライマーおよび該第2核タンパク質プライマーの3’末端を伸長させて、該核酸の第3部分を含む内部領域を備える第1の増幅された標的核酸を生成する工程と;
(d)該増幅された標的核酸を該第3核タンパク質プライマーと接触させて、ヌクレアーゼの存在下で該増幅させた標的核酸の第3部分で第3二本鎖構造を形成する工程であって:このとき該ヌクレアーゼは、該第3二本鎖構造の形成後にのみ該非相補的内部残基を特異的に切断して、第3の5’プライマーおよび第3の3’伸長ブロック化プライマーを形成する工程と;
(e)1つまたは複数のポリメラーゼおよびdNTPを用いて該第3の5’プライマーの3’末端を伸長させて、該第1核酸プライマーおよび該第3の5’プライマーを含む第2二本鎖増幅核酸を生成する工程と;
(f)所望の程度の第2二本鎖増幅核酸が達成されるまで、(b)と(e)とを繰り返して反応を継続する工程と、を含むプロセス。
(項目2)
前記第1二本鎖構造は第1Dループの一部であり、前記第2二本鎖構造は第2Dループの一部である、項目1に記載のプロセス。
(項目3)
前記ヌクレアーゼは、DNAグリコシラーゼもしくはAPエンドヌクレアーゼである、項目1に記載のプロセス。
(項目4)
前記修飾された内部残基は、ウラシル残基もしくはイノシン残基である、項目1に記載のプロセス。
(項目5)
前記ヌクレアーゼは前記ウラシル残基もしくは前記イノシン残基を認識し、前記第3伸長ブロック化プライマーを該ウラシル残基もしくは該イノシン残基において切断する、項目4に記載のプロセス。
(項目6)
前記ヌクレアーゼは前記第3伸長ブロック化プライマーの非相補的塩基と前記標的核酸との間の塩基ミスマッチを認識し、該第3伸長ブロック化プライマーを該非相補的塩基において切断する、項目1に記載のプロセス。
(項目7)
前記ヌクレアーゼは、fpg、Nth、MutY、MutS、MutM、大腸菌MUG、ヒトMUG、ヒトOgg1、脊椎動物Nei様(Neil)グリコシラーゼ、ウラシルグリコシラーゼ、ヒポキサンチン−DNAグリコシラーゼならびにそれらの機能的アナログからなる群から選択される、項目1に記載のプロセス。
(項目8)
前記ヌクレアーゼは大腸菌Nfoもしくは大腸菌エキソヌクレアーゼIIIであり、前記修飾された残基はテトラヒドロフラン残基もしくは炭素リンカーである、項目1に記載のプロセス。
(項目9)
前記修飾された内部塩基は、8−オキソグアニン、チミングリコール、無塩基性部位模擬体からなる群から選択される、項目1に記載のプロセス。
(項目10)
前記無塩基性部位模擬体は、テトラヒドロフラン残基またはD−スペーサーである、項目9に記載のプロセス。
(項目11)
前記第3伸長ブロック化プライマーは、DNAポリメラーゼによる伸長に抵抗性であるブロック化3’残基を含む、項目1に記載のプロセス。
(項目12)
前記ブロック化3’残基は、ポリメラーゼによる前記プライマーの伸長を防止するブロック部分を含む、項目11に記載のプロセス。
(項目13)
前記ブロック部分は、3’残基の糖の3’部位または2’部位に付着させられる、項目12に記載のプロセス。
(項目14)
前記ブロック部分は、検出可能標識である、項目12に記載のプロセス。
(項目15)
前記検出可能標識は、蛍光体、酵素、クエンチャー、酵素阻害剤、放射性標識、結合対の一方のメンバーおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目14に記載のプロセス。
(項目16)
前記ブロック化3’残基は、ジデオキシヌクレオチドである、項目11に記載のプロセス。
(項目17)
前記第1核酸プライマーは第1検出可能標識を含み、前記第3伸長ブロック化プライマーは第2検出可能標識を含む、項目1に記載のプロセス。
(項目18)
前記第1検出可能標識と前記第2検出可能標識とは相違しており、前記第2二本鎖増幅核酸の産生は、単一の二本鎖DNA分子上の該第1検出可能標識および該第2検出可能標識の存在を検出することによって監視される、項目17に記載のプロセス。
(項目19)
前記第2二本鎖増幅核酸の産生は、第1抗体が前記第1検出可能標識に結合し、第2抗体が前記第2検出可能標識に結合するサンドイッチアッセイによって検出される、項目18に記載のプロセス。
(項目20)
前記第3伸長ブロック化プライマーは1つまたは複数の検出可能標識をさらに含む、項目1に記載のプロセス。
(項目21)
前記プロセスは、前記第3伸長ブロック化プライマー上の前記検出可能標識を検出することによってRPA反応の進行を監視する工程をさらに含む、項目20に記載のプロセス。
(項目22)
前記検出可能標識は、蛍光体、酵素、クエンチャー、酵素阻害剤、放射性標識、結合対の一方のメンバーおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目20に記載のプロセス。
(項目23)
前記蛍光体は、蛍光体−dTアミダイト残基によって前記第3伸長ブロック化プライマーに付着させられる、項目22に記載のプロセス。
(項目24)
前記クエンチャーは、クエンチャー−dTアミダイト残基によって前記第3伸長ブロック化プライマーに付着させられる、項目22に記載のプロセス。
(項目25)
前記第3伸長ブロック化プライマーは蛍光体およびクエンチャーを含む、項目22に記載のプロセス。
(項目26)
前記蛍光体と前記クエンチャーとは0〜2塩基離れている、項目25に記載のプロセス。
(項目27)
前記蛍光体と前記クエンチャーとは0〜5塩基離れている、項目25に記載のプロセス。
(項目28)
前記蛍光体と前記クエンチャーとは0〜8塩基離れている、項目25に記載のプロセス。
(項目29)
前記蛍光体と前記クエンチャーとは0〜10塩基離れている、項目25に記載のプロセス。
(項目30)
前記蛍光体と前記クエンチャーとは、前記伸長ブロック化プライマーが前記標的核酸にハイブリダイズする場合よりも、該伸長ブロック化プライマーがハイブリダイズしない場合の方が長い距離離れている、項目25に記載のプロセス。
(項目31)
前記蛍光体または前記クエンチャーは、非相補的もしくは修飾された内部残基に付着させられ、該蛍光体および該クエンチャーは、前記ヌクレアーゼによる修飾された内部残基の切断に続いて分離される、項目25に記載のプロセス。
(項目32)
前記蛍光体は、フルオレセイン、FAM、TAMRAの群から選択される、項目25に記載のプロセス。
(項目33)
前記クエンチャーはダーククエンチャーである、項目25に記載のプロセス。
(項目34)
前記ダーククエンチャーは、Dark Quencher 1、Dark Quencher 2、Black Hole Quencher 1およびBlack Hole
Quencher 2からなる群から選択される、項目33に記載のプロセス。
(項目35)
前記第1プライマー、前記第2プライマーもしくは前記第3伸長ブロック化プライマーは、長さが12〜30残基である、項目1に記載のプロセス。
(項目36)
前記第1プライマー、前記第2プライマーもしくは前記第3伸長ブロック化プライマーは、長さが12〜40残基である、項目1に記載のプロセス。
(項目37)
前記第1プライマー、前記第2プライマーもしくは前記第3伸長ブロック化プライマーは、長さが12〜60残基である、項目1に記載のプロセス。
(項目38)
前記プロセスは、14℃〜21℃の温度で実施される、項目1に記載のプロセス。
(項目39)
前記プロセスは、21℃〜25℃の温度で実施される、項目1に記載のプロセス。
(項目40)
前記プロセスは、25℃〜30℃の温度で実施される、項目1に記載のプロセス。
(項目41)
前記プロセスは、30℃〜37℃の温度で実施される、項目1に記載のプロセス。
(項目42)
前記プロセスは、40℃〜43℃の温度で実施される、項目1に記載のプロセス。
(項目43)
前記プロセスは、前記標的核酸の少なくとも第3部分を少なくとも107倍増幅させる、項目1に記載のプロセス。
(項目44)
前記プロセスは、1%〜12%のPEGの存在下で実施される、項目1に記載のプロセス。
(項目45)
前記プロセスは、6%〜8%のPEGの存在下で実施される、項目1に記載のプロセス。
(項目46)
前記dNTPはdUTPを含み、前記RPAプロセスは20分間未満の第1期間にわたりウラシルグリコシラーゼの存在下で実施され、該プロセスは該第1期間後にウラシルグリコシラーゼ阻害剤の存在下で実施される、項目1に記載のプロセス。
(項目47)
前記プロセスは、前記ウラシルグリコシラーゼの温度に基づく不活性化を伴わずに実施される、項目46に記載のプロセス。
(項目48)
前記ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、枯草菌ファージPBS1ウラシルグリコシラーゼ阻害剤または枯草菌ファージPBS2ウラシルグリコシラーゼ阻害剤である、項目46に記載のプロセス。
(項目49)
前記dNTPは、dATP、dUTP、dCTPおよびdGTPからなる、項目46に記載のプロセス。
(項目50)
前記dNTPはdTTPを含有していない、項目46に記載のプロセス。
(項目51)
1つの反応において1つまたは複数の二本鎖標的核酸上で1より多くのRPAプロセスを実施する工程を含むRPAの多重プロセスであって、各プロセスが以下の工程:
(a)リコンビナーゼ因子を第1核酸プライマーおよび第2核酸プライマーならびに1つまたは複数の非相補的もしくは修飾された内部残基を含む第3伸長ブロック化プライマーと接触させて、第1核タンパク質プライマー、第2核タンパク質プライマーおよび第3核タンパク質プライマーを形成させる工程と;
(b)該第1核タンパク質プライマーおよび該第2核タンパク質プライマーを該二本鎖標的核酸と接触させ、それにより、該第1核タンパク質プライマーと該DNAの第1鎖の第1部分の該第1鎖との間で第1二本鎖構造を形成させ、そして該第2核タンパク質プライマーと該DNAの第2鎖の第2部分の該第2鎖との間で第2二本鎖構造を形成させ、その結果、該第1核タンパク質プライマーおよび該第1核タンパク質プライマーの3’末端が、該3’末端間に標的核酸の第3部分を有して同一標的核酸分子上で相互に向けて方向付けられる工程と;
(c)1つまたは複数のポリメラーゼおよびdNTPを用いて該第1核タンパク質プライマーおよび該第2核タンパク質プライマーの3’末端を伸長させて、該核酸の第3部分を含む内部領域を備える第1増幅された標的核酸を生成する工程と;
(d)該増幅された標的核酸を該第3核タンパク質プライマーと接触させて、ヌクレアーゼの存在下で該増幅させた標的核酸の第3部分で第3二本鎖構造を形成する工程であって:このとき該ヌクレアーゼは、該第3二本鎖構造の形成後にのみ該非相補的内部残基を特異的に切断して、第3の5’プライマーおよび第3の3’伸長ブロック化プライマーを形成する工程と;
(e)1つまたは複数のポリメラーゼおよびdNTPを用いて該第3の5’プライマーの3’末端を伸長させて、該第1核酸プライマーおよび該第3の5’プライマーを含む第2二本鎖増幅核酸を生成する工程と;
(f)所望の程度の第2二本鎖増幅核酸が達成されるまで、(b)と(e)とを繰り返して反応を継続する工程と;を含み、
このとき各RPAプロセスは、該第1核酸プライマーおよび該第2核酸プライマーの相違する組み合わせを用いて実施され、各プロセスは同一の第3伸長ブロック化プライマーを用いて実施されるプロセス。
(項目52)
前記1より多くのRPAプロセスは、少なくとも2つの別個のRPAプロセスを含む、項目51に記載のプロセス。
(項目53)
前記1より多くのRPAプロセスは、少なくとも4つの別個のRPAプロセスを含む、項目51に記載のプロセス。
(項目54)
前記1より多くのRPAプロセスは、少なくとも5つの別個のRPAプロセスを含む、項目51に記載のプロセス。
(項目55)
前記1より多くのRPAプロセスは、少なくとも7つの別個のRPAプロセスを含む、項目51に記載のプロセス。
(項目56)
前記1より多くのRPAプロセスは、少なくとも10の別個のRPAプロセスを含む、項目51に記載のプロセス。
(項目57)
前記修飾された内部残基は、ウラシル残基またはイノシン残基である、項目51に記載のプロセス。
(項目58)
前記第2二本鎖増幅核酸の形成を検出して、前記1より多くのRPAプロセスのいずれかの累積増幅を決定する工程をさらに含む、項目51に記載のプロセス。
(項目59)
各RPAプロセスの前記第1核酸プライマーは同一の第1検出可能標識で標識され、前記第3伸長ブロック化プライマーは第2検出可能標識で標識され、および前記検出する工程は該第1検出可能標識および該第2検出可能標識の両方を含む二本鎖核酸を検出する工程を含む、項目51に記載のプロセス。
(項目60)
前記第2二本鎖増幅核酸の産生は、第1抗体が前記第1検出可能標識に結合し、第2抗体が前記第2検出可能標識に結合するサンドイッチアッセイによって検出される、項目59に記載のプロセス。
(項目61)
前記ヌクレアーゼはDNAグリコシラーゼもしくはAPエンドヌクレアーゼである、項目51に記載のプロセス。
(項目62)
前記ヌクレアーゼは前記第3伸長ブロック化プライマーの非相補的塩基と前記標的核酸との間の塩基ミスマッチを認識し、該第3伸長ブロック化プライマーを該非相補的塩基で切断する、項目51に記載のプロセス。
(項目63)
前記ヌクレアーゼは、fpg、Nth、MutY、MutS、MutM、大腸菌MUG、ヒトMUG、ヒトOgg1、脊椎動物Nei様(Neil)グリコシラーゼ、ウラシルグリコシラーゼ、ヒポキサンチン−DNAグリコシラーゼならびにそれらの機能的アナログからなる群から選択される、項目51に記載のプロセス。
(項目64)
前記ヌクレアーゼは大腸菌Nfoもしくは大腸菌エキソヌクレアーゼIIIであり、前記修飾された残基はテトラヒドロフラン残基もしくは炭素リンカーである、項目51に記載のプロセス。
(項目65)
前記修飾された内部塩基は、8−オキソグアニン、チミングリコール、または無塩基性部位模擬体からなる群から選択される、項目51に記載のプロセス。
(項目66)
前記無塩基性部位模擬体は、テトラヒドロフラン残基またはD−スペーサーである、項目65に記載のプロセス。
(項目67)
前記無塩基性部位模擬体は、テトラヒドロフラン残基またはD−スペーサーである、項目66に記載のプロセス。
(項目68)
前記第3伸長ブロック化プライマーは、DNAポリメラーゼによる伸長に抵抗性であるブロック化3’残基を含む、項目51に記載のプロセス。
(項目69)
前記ブロック化3’残基は、ポリメラーゼによる前記プライマーの伸長を防止するブロック部分を含む、項目68に記載のプロセス。
(項目70)
前記ブロック部分は、3’残基の糖の3’部位または2’部位に付着させられる、項目69に記載のプロセス。
(項目71)
前記ブロック化3’残基は、ジデオキシヌクレオチドである、項目70に記載のプロセス。
(項目72)
DNAの第1鎖および第2鎖を含む二本鎖標的核酸分子をDNA増幅させるRPAプロセスであって、以下の工程:
(a)リコンビナーゼ因子を第1核酸プライマーおよび第2核酸プライマーと接触させて、第1核タンパク質プライマーおよび第2核タンパク質プライマーを形成させる工程と;
(b)該第1核タンパク質プライマーおよび該第2核タンパク質プライマーを該二本鎖標的核酸と接触させ、それにより、該第1核タンパク質プライマーと該DNAの第1鎖の第1部分の該第1鎖との間で第1二本鎖構造を形成させ、そして該第2核タンパク質プライマーと該DNAの第2鎖の第2部分の該第2鎖との間で第2二本鎖構造を形成させ、その結果、該第1核タンパク質プライマーおよび該第2核タンパク質プライマーの3’末端が、同一の二本鎖標的核酸分子上で相互に向けて方向付けられる工程と;
(c)1つまたは複数のポリメラーゼならびにdNTPおよびdUTPを用いて該第1核タンパク質プライマーおよび第2核タンパク質プライマーの3’末端を伸長させて、増幅された標的核酸分子を生成する工程と;
(d)ウラシルグリコシラーゼの存在下で20分間以内の第1期間にわたり(b)および(c)を繰り返すことで反応を継続する工程と;
(e)所望の程度の増幅が達成されるまで、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤の存在下で、(b)および(c)の繰り返しを通して反応を継続する工程と、を含むプロセス。
(項目73)
前記第1期間は10分間以内である、項目72に記載のプロセス。
(項目74)
前記第1期間は5分間以内である、項目72に記載のプロセス。
(項目75)
前記第1期間は2分間以内である、項目72に記載のプロセス。
(項目76)
前記ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、枯草菌ファージPBS1ウラシルグリコシラーゼ阻害剤または枯草菌ファージPBS2ウラシルグリコシラーゼ阻害剤である、項目72に記載のプロセス。
(項目77)
前記dNTPは、dATP、dUTP、dCTPおよびdGTPからなる、項目72に記載のプロセス。
(項目78)
前記dNTPはdTTPを含有していない、項目72に記載のプロセス。
RPAでは、特異的DNAフラグメントの等温増幅は、対向オリゴヌクレオチドプライマーをテンプレートDNAに結合させ、ポリメラーゼによるそれらの伸長によって達成される(図1A)。標的テンプレートの包括的融解を必要とするPCRとは相違して、RPAは、二本鎖DNAを走査して同族部位での鎖交換を促進するためにリコンビナーゼ−プライマー複合体を使用する。生じた構造は、置換されたテンプレート鎖と相互作用し、それによって分子鎖移動によるプライマーの放出を防止する一本鎖DNA結合タンパク質(SSB)によって安定化させられる。リコンビナーゼは、この場合には枯草菌の大きなフラグメントPoll(Bsu)(Okazakiら、1964を参照)であるDNAポリメラーゼを置換する鎖へ接近可能なオリゴヌクレオチドの3’末端を分解して残し、そしてこれにプライマー伸長が続く。指数関数的増幅は、このプロセスの周期的反復によって遂行される。
RPA反応は、RPA反応に含まれる酵素に最適な温度を反映して、約37℃で最適に機能する。37℃は研究室内では容易に達成されるが、30℃もしくは25℃で効率的に機能できるRPA反応はRPAの有用性を増加させ、37℃でのインキュベートを利用できない現場条件下でのリアルタイム増幅を可能にするであろう。
RPA反応は、繰り越し汚染を制御するための方法としてのdUTPの使用と適合する。初期の実験データに関する補足説明は、この反応を開始するためにはウラシルグリコシラーゼ酵素を熱不活性化しなければならなかったことである。これはRPAとの2つの不適合問題を有する。第1に、熱不活性化は、RPA試薬が熱安定性ではないために完全RPA反応液もまた不活性化するであろう。第2に、熱不活性化は、サーマルサイクリングの回避というRPAの1つの目標と一致しない。
DNA塩基配列をクローニングし、C末端ヘキサヒスチジンタグを用いて大腸菌内で発現させた。本発明者らは、さらにまた大腸菌ウラシルグリコシラーゼ遺伝子をクローニングし、それをC末端ヘキサヒスチジンを用いて発現させた。本発明者らは、これらのタンパク質調製物を使用して、繰り越し汚染系をそれらと一緒に使用できるかどうか試験した。図6は、そのようなアプローチの妥当性を確認する、実施された実験の例を示している。図6では、テンプレートの開始時標的コピー数は、使用されたヒトDNAの800コピーであった。反応条件は次のとおりであった:50mMのTris(pH8.4)、100mMの酢酸カリウム、10mMの酢酸マグネシウム、2mMのDTT、5%のPEG化合物(Carbowax−20M)、3mMのATP、25mMのホスホクレアチン、100ng/μLのクレアチンキナーゼ、600ng/μLのgp32、125ng/μLのuvsX、30ng/μLのuvsY、100μMのdNTP、300nMの各オリゴヌクレオチド(SRY8およびSRY9プライマー)。反応時間、75分間。反応量、50μL。大腸菌を使用した場合はUNGを150ng/μLで使用し、UNG阻害剤は140ng/μLで使用した。汚染は、研究室用液体処理装置内ではこのアプリコンについて存在する真性の繰り越し汚染であった。反応は、ポリメラーゼ以外の全増幅成分を用いて確立された。反応1〜4はゲノムテンプレートDNAを有しており、反応5および6は汚染物質だけを含有していた。サンプルは、サンプル2、3、4、および6ではUNGを用いて5分間にわたり処理した。サンプル2、4、および6ではUNG阻害剤を5分後に加えた。全部の場合に、5分間のインキュベーション期間が終了した後に、UNGを含めて、もしくは含まずに、そしてその後のUNG阻害剤の添加を行って、もしくは行わずに、DNA合成を開始させるためにポリメラーゼを加えた。この実験では、本発明者らは:(1)大腸菌UNGはdUTP基質を含有するRPA反応を阻害するであろう、(2)阻害剤ペプチドの共含有はこの阻害を克服する、(3)dUTP含有汚染物質は最初に大腸菌UNGを用いて、次に阻害剤を用いて処理されるとアンプリコン生成が抑制されるが、それでもまだ真性テンプレートは有効であることを証明する。使用した条件下では、本発明者らは、反応液内にUNGが存在する場合には頑丈性/産物レベルのある程度減少する証拠を見いだした。しかし本発明者らは、この系をより最適に構成できると予測している。
DNA(もしくはRNA)配列を検出する際のRPAプロセスの多数の可能性のある適用は、リアルタイムフォーマットで適用することから利益が得られるであろう。RPAはすでに、SYBRグリーンなどのマイナーグルーブ結合色素と結び付けると有効であることが証明されている(2005年4月11日に提出されたPCT特許出願PCT/IB2005/001560)。しかし、反応挙動を評価するためにDNA蓄積のそのような一般的インジケータを使用することには潜在的限界がある。第1に、これらの色素は形成された様々な産物間を識別できないので、増幅反応を多重化する能力がない。例えば数多くの臨床試験では、偽陰性を排除するために内部増幅コントロールを含める必要があるであろう。第2に、RPA反応はサンプル中に標的が存在しない場合でさえ一部のDNA合成が場合によっては発生する範囲で、ほとんどの他のDNA増幅プロセスと類似である。結果として、蛍光検出の現行方法に基づいて数コピーの標的核酸の存在と核酸のコピーの不在とを識別することは困難もしくは不可能になることがある。
このプローブは、プライマーJ1およびK2によって生成されたアンプリコン内に含有される枯草菌SpoOB遺伝子座の一部と相同である。蛍光体およびクエンチャーは、それらを市販で入手できるアミダイト上に直接的に組み込むことができるように配列内のT残基上にあるように設計された。図7Cは、蛍光増加によって監視される増幅およびプローブ切断動態を示している。増幅反応は、様々な濃度の標的枯草菌ゲノムDNAを用いて確立された。反応は氷上で確立され、次に38℃に設定したステージを備えるBIOTEK Flx800マイクロプレートリーダー内でインキュベートされた。増幅条件は次のとおりである:開始時標的コピー数は指示したとおりであった。反応条件:50mMのTris(pH7.9)、100mMの酢酸カリウム、12mMの酢酸マグネシウム、2mMのDTT、5%のPEG化合物(Carbowax−20M)、3mMのATP、25mMのホスホクレアチン、100ng/μLのクレアチンキナーゼ、900ng/μLのgp32、120ng/μLのuvsX、30ng/μLのuvsY、180μLのNfo、100μMのdNTP、450nMのK2プライマー、150nMのJ1プライマー、100nMのプローブ。反応時間、60分間。反応量、20μL。
MRSAは、黄色ブドウ球菌ゲノム内の特定の場所で耐性カセットであるmecAカセットを統合することによって抗生物質耐性を発生した一群の黄色ブドウ球菌株を含んでいる。同一の一般ゲノム統合部位が常に使用されるが、正確な統合部位接合部およびカセットの方向付けは変動する可能性がある。この変動にもかかわらず、独立単離菌は代表的な統合構造を備える限定数の一般群に分離することができる。この複雑性に加えて、増幅プライマーおよびプローブの有効性を弱める可能性がある菌株間の塩基多型性の存在に起因してまた別の困難が発生する。そこでMRSA病原体は、単一試験における臨床標本中で一般に見いだされる菌株の90%超を捕捉するためにはmecA耐性カセット統合遺伝子座の3つの構造的に相違する変化の検出に適応する、そして一部の一般多形を説明することが必要であるので、複合標的を表している。さらに、アンプリコンは、増幅させた任意のmecA配列が黄色ブドウ球菌ゲノムの状況内にあり、非関連性細菌中には存在しなかったことを保証するために、統合カセット内の1つの群にわたっていることが必要である。
3種のプローブを使用した:
ここで(T)はdT−TAMRA、(F)はdT−フルオレセイン、(H)はTHF、(q1)はdT−BHQ1、(q2)はdT−BHQ2、(q3)はdT−DDQ1である。プローブは、60nMのSATamra1(MRSAIII実験)もしくは45nMのSATamra1、45nMのSATamra2、60nMのBSFlc(多重実験)を使用した。Nfoは200ng/μLで使用した。励起/検出は、485/525nm(SybrGreenI、BSFlc)または530/575nm(SATamra1/2)で実施した。測定値は、30秒間もしくは45秒間(多重実験)毎に入手した。蛍光プローブデータは、水コントロールおよび調整した増幅前ベースライン値に対して標準化した。読み出し値の対数を反応時間に対してプロットした。
RPAは、ポータブル型で機器不要の、または軽量な機器によるDNA試験の開発にとって理想的に適合する。しかしそのような試験は、増幅が発生したかどうかを決定するために安価で使用法が簡便なアプローチを使用するのが理想的であろう。伝統的には、規定サイズの産物が蓄積したかどうかを判定するためにはゲル電気泳動が使用されている。または、蛍光プローブを使用できる。いずれの場合においても、分析を実施するためにはかなり大きなハードウエアが必要とされるので、これは適切な装置を有していないエンドユーザーが本試験を使用することを妨害する。
(タンパク質およびDNA)
uvsx、uvsy、gp32、BsuおよびNfoについてのコーディング配列は、ゲノムDNA(DSMZ社、ドイツ国)から増幅させ、ヘキサヒスチジンタグ(uvsY、BsuおよびNfoについてはN末端、uvsXおよびgp32についてはC末端)へ縮合させ、適切な発現ベクター内へクローニングした。過剰発現および精製は、ニッケル−NTA樹脂(Qiagen社)を用いて標準プロトコールによって実施した。黄色ブドウ球菌対立遺伝子は、EMRSA−3(SCCmecタイプI;MRSAI)、EMRSA−16(MRSAII)、EMRSA−I(MRSAIII)および野生型MSSAであった。以下に提供した追加の配列情報を参照されたい。
(実施例2:RPA反応の速度)
RPAプロセスの略図は図12Aに示されている。リコンビナーゼ/プライマーフィラメントは、テンプレートDNAを相同配列(赤色/青色)について走査する。鎖置換に続いて、置換された鎖はgp32(緑色)によって結合され、プライマーはBsuポリメラーゼ(青色)によって伸長させられる。対向するプライマーの繰り返しの結合/伸長イベントは、指数関数的DNA増幅を生じさせる。
本発明者らは、RPAアンプリコンを検出するためにラテラルフロー・ストリップテクノロジーを使用する方法を考案した。この方法は、特異的抗体を使用して、2種の抗原性標識を含有する複合体を固定化かつ検出する(図13A)。手短には、標的核酸は2種の相違するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅させられるが、このとき各プライマーは相違する標識もしくは抗原を有する。そこで、生成したすべてのアンプリコンは2種の標識もしくは抗原に結合するであろう(すなわち、二重標識アンプリコン)。
(タンパク質およびDNA)
uvsx、uvsy、gp32、BsuおよびNfoについてのコーディング配列は、ゲノムDNA(DSMZ、ドイツ)から増幅させ、ヘキサヒスチジンタグ(uvsY、BsuおよびNfoについてはN末端、uvsXおよびgp32についてはC末端)へ縮合させ、適切な発現ベクター内へクローニングした。過剰発現および精製は、ニッケル−NTA樹脂(Qiagen社)を用いて標準プロトコールによって実施した。
反応は37℃で60分間、または指示したように実施した。標準条件は、50mMのTris(pH8.4)、80mMの酢酸カリウム、10mMの酢酸マグネシウム、2mMのDTT、5%のCarbowax 20M、200μMのdNTP、3mMのATP、20mMのホスホクレアチン、100ng/μLのクレアチンキナーゼ、20ng/μLのBsuであった。対照的に、MRSAの増幅は、50mMのTris(pH7.9)、100mMの酢酸カリウム、14mMの酢酸マグネシウムで実施した;多重実験でのCarbowax20Mは5.5%であった。gp32/uxsX/uvsYの濃度(単位:ng/μL)は、600/200/60(STR実験)、600/120/30(枯草菌実験)または900/120/30(MRSA実験)であった。プライマーは、500nMのsccIII、100nMのorfX(MRSAIII実験)もしくは265nMのsccI/II、265nMのsccIII、70nMのorfX(多重実験)または240nMのBiosccl/II、240nMのBio−sccIII、120nMのorfX(ラテラルフロー・ストリップ実験)を使用したMRSA増幅を除いて、各300nMで使用した。反応量は、STR実験(40μL)および枯草菌実験(50μL)を除いて、20μLであった。
リアルタイムRPAは、SybrGreenI(1:50000、Molecular
Probes社)または蛍光体/クエンチャープローブ(Eurogentec社)の存在下で、プレートリーダー(BioTek Flx−800)内で実施した。3種のプローブを使用した:
ここで(T)はdT−TAMRA、(F)はdT−フルオレセイン、(H)はTHF、(q1)はdT−BHQ1、(q2)はdT−BHQ2、(q3)はdT−DDQ1である。プローブは、60nMのSATamra1(MRSAIII実験)もしくは45nMのSATamra1、45nMのSATamra2、60nMのBSFlc(多重実験)を使用した。Nfoは200ng/μLで使用した。励起/検出は、485/525nm(SybrGreenI、BSFlc)または530/575nm(SATamra1/2)で実施した。測定値は、30秒間もしくは45秒間(多重実験)毎に入手した。蛍光プローブデータは、水コントロールおよび調整した増幅前ベースライン値に対して標準化した。読み出し値の対数を反応時間に対してプロットした。
ラテラルフロー・ストリップ実験のためには2種のプローブを各75nMで使用した:
sccI/IIおよびsccIIIの5’−ビオチン化形をプライマーとして利用した。製造業者の取扱説明書にしたがって、各反応液(20μL)に対して1μLを5μLのランニングバッファー(PBS/3%のTween)で希釈し、HybriDetect−ストリップ(Milenia社)へ直接塗布した。
(RPA条件)
RPAは、リコンビナーゼ−オリゴヌクレオチド複合体の形成を支持する反応環境の確立に依存する。このプロセスはATP依存性であるので(Formosaら、1986)、持続性活性のためにエネルギー再生システムを必要とする。この実験では、本発明者らは、それらが増幅性能に及ぼす影響を決定するためにRPA反応混合液の重要な成分を滴定した。結果は、図14に示されている。図14は、ヒトSry遺伝子座のためのプライマーを用いたRPA反応のポリアクリルアミドゲル電気泳動を示している。反応は、37℃で120分間にわたり実施し、所定の成分が試験下にある場合を除いて、300nMのプライマーsry3およびsry4、50mMのTris(pH8.4)、80mMの酢酸カリウム、10mMの酢酸マグネシウム、2mMのDTT、3mMのATP、200μMのdNTP、20mMのホスホクレアチン、100ng/μLのクレアチンキナーゼ、5%のCarbowax20M、600ng/μLのgp32、200ng/μLのuvsX、60ng/μLのuvsYおよび20ng/μLのBsuを含有していた。この特定標的を効果的に増加させるためのgp32(図14A)、uvsY(図14B)、uvsX(図14C)、Carbowax20M(図14D)、ATP(図14E)およびBsu(図14F)の最適量を決定した。(G)ADP−(R)−Sおよび(H)ATP−(c)−Sは反応を阻害する。1,500コピー/μLのヒトY染色体DNAは30μL(1サンプルに付き同等の10μL反応量をゲル上に装填した)の反応液中でテンプレートとして機能した。
本発明者らは、RPAを使用して広範囲の標的を増幅させた。プライマーの設計は配列組成自体の制限を明らかにしなかったが、オリゴヌクレオチドがRPAに適合するために所定のパラメーターが満たされなければならない。本発明者らは、これらのパラメーターを図15に示した実験において調査した。図15は、ヒトアポリポタンパク質B遺伝子座のためのプライマーを用いたRPA反応のアガロースゲル電気泳動を示している。プライマーApoB4は、指示したサイズの産物を生成できる対向するプライマーと結合された。反応は37℃で120分間実施し、使用した条件は、50mMのTris(pH8.4)、80mMの酢酸カリウム、10mMの酢酸マグネシウム、2mMのDTT、3mMのATP、200μMのdNTP、20mMのホスホクレアチン、100ng/μLのクレアチンキナーゼ、5%のCarbowax20M、600ng/μLのgp32、125ng/μLのuvsX、25ng/μLのuvsYおよび20ng/μLのBsuであった。450コピーのヒトDNAを30μL(1サンプルに付き同等の10μL反応量をゲル上に装填した)の反応液中でテンプレートとして使用した。300bpアンプリコンの一部を2×および3×ユニット長へ変換させて一部のヘアピン媒介性産物複製が発生したことに留意されたい(*)。RPAは1,500bp以上のアンプリコンを生成できなかった。この実験は、使用した条件下でのアンプリコンサイズがほぼ1kbに限定されることを証明している。
図2Cに示した実験において陰性コントロールとして機能する野生型黄色ブドウ球菌DNA(MSSA)(Enrightら、2002;Huletskyら、2004を参照)は、プライマー対であるorfX/mssaと結合した場合にRPAのためのテンプレートとして機能する(図16)。
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