JP2015511002A - 乳癌診断用マルチバイオマーカーセット、その検出方法、及びそれに対する抗体を含む乳癌診断キット - Google Patents

乳癌診断用マルチバイオマーカーセット、その検出方法、及びそれに対する抗体を含む乳癌診断キット Download PDF

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Abstract

本発明はアポリポタンパク質Ｃ１、アポリポタンパク質（ａ）、神経細胞接着分子Ｌ１類似タンパク質、炭酸脱水酵素１、及びフィブロネクチンのうちの２種以上のタンパク質マーカーからなる乳癌診断用バイオマーカーセット、前記バイオマーカーセットを多重反応モニタリング技法により血液試料から検出する方法、前記バイオマーカーセットのタンパク質に特異的な抗体を含む乳癌診断キット、及び抗原-抗体結合反応を用いて血液から前記マーカーセットのタンパク質を検出する方法に関する。ＭＲＭ技法または抗原-抗体結合反応によって血液試料から本発明の乳癌診断用タンパク質マーカーセットを検出する方法及び診断キットは、単一マーカーを利用した診断方法に比べて診断の敏感度及び正確度が遥かに高いだけでなく、患者の血液を用いて極めて簡易に乳癌を診断することができ、乳癌の早期診断に有用に用いることができる。

Description

本発明は乳癌診断に関する。より具体的に、本発明は血液から乳癌発病の有無を選択的に診断することができるマルチバイオマーカーセット及びその検出方法、及びそれを特異的に認識する抗体を含む乳癌診断キットに関する。
乳癌の原因については明確に解明されていないが、女性ホルモン、家族力、過去力、出産力、食生活習慣などの様々な因子が挙げられている。２００５年統計庁の調査によると、韓国女性の乳癌の発病が最近急増しており、１９９８年に子宮頸部癌を追い越して以来、２００１年には、発病した韓国女性癌患者の１６．１％を占めるなど、胃癌を追い抜いて女性癌１位になった。特に、２００２年には２００１年に比べて乳癌（１１．１％）が最も急増した癌であると示され、低出産、短い授乳期間、早い月経、遅い閉経などの生理的に旺盛な身体的変化を経験する時期の女性では女性ホルモンの刺激を受ける回数の急激な増加による乳腺組織の敏感度の増加、食生活の西欧化、生活環境の汚染などの理由から乳癌の発病が急増している。
このような乳癌の発病率及び乳癌による死亡率の増加は、現在の西欧化実態からみて、今後も相当期間持続すると予想される。乳癌は癌細胞の成長による周辺組織への浸潤またはリンパ節転移などの症状をきたすのが普通であるが、その大半は何らの症状がなくても自己検診にて診断することができる。したがって、乳癌による死亡率を減らすためには、乳癌を有効に早期診断するのが何より重要である（Tuli et al., Breast J. 12: 343-348, 2006）。
乳癌を診断するために様々な方法が複合的に用いられており、現在までのところ、乳癌患者の７０％が自己診断によって来院している。しかし、このような自己診断方法では悪性腫瘍と良性腫瘍とを区分するのが非常に難しいという不具合がある。その他、乳癌の診断方法としてＸ線乳房撮影法、超音波検査法、微細針吸引細胞検査法、磁気共鳴撮影法などがあり、最終的には組織検査により確認するのが重要である。Ｘ線乳房撮影法はＸ線で乳房を撮影して検査する方法であって、腫瘍が良性なのか悪性なのかを鑑別するうえで優れているだけでなく、隠れている腫瘍を発見する方法として、自己診断で腫瘍が感じられる以前に初期乳癌を診断するうえで最も有効な方法である。しかし、乳房撮影法は若い女性のように乳腺が多く発達していたり、乳房が小さく繊維質の多い我が国の女性には診断率が落ちるという短所があり、また頻繁に撮影するとむしろ乳癌が誘発されることもあるという不具合がある。このような乳房撮影法の代案として超音波検査法が用いられているが、該超音波検査法は、結節腫と硬い腫瘍とを区別するうえでは効果的であるが、悪性腫瘍と良性腫瘍とを鑑別する能力に劣る。
このような既存の診断方法の短所を補完するための方法として、患者の血液から腫瘍標識子（ｍａｒｋｅｒ）の濃度を測定して乳癌を診断しようとする試みがあった（Clinton et al., Biomed Sci. Instrum. 39: 408-414、2003; Rui et al., Proteomics. 3: 433-439, 2003; Soletormos et al., 48: 229-255, 2001）。しかし、このような腫瘍標識子の診断的または予後因子としての価値が研究されているものの、未だ制限的に用いられているだけであって、公式的に勧奨されている乳癌標識子はないのが実情である。
そこで、本発明者らは、乳癌患者の血液で特異的に量が変化するマーカータンパク質を乳癌の診断に利用する方法を開発するために鋭意研究を重ねた結果、複数のバイオマーカーからなるマーカーセットの乳癌による変化パターンを比較することが、単一のバイオマーカーの変化による方法よりも乳癌を効果的に診断することができるという事実を見出し、このような複数のタンパク質マーカーを効率的に追跡するために多重反応モニタリング技法にてそれぞれのバイオマーカータンパク質を代表することができるペプチドの発現程度をモニタリングすることにより、乳癌を簡易に診断することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
したがって、本発明の目的は、血液中に存在する複数のバイオマーカーセットの乳癌発病の有無による変化様相を用いて簡易に乳癌を確認することができる方法を提供することである。
前記目的を達成するために、本発明は、乳癌診断用タンパク質マーカーセットを提供する。
また、本発明は、三重四極子質量分析計を利用した多重反応モニタリングにより血液試料から前記バイオマーカーセットを検出する方法を提供する。
さらに、本発明は、前記バイオマーカーセットを構成するそれぞれのマーカーに特異的な抗体を含む乳癌診断キットを提供する。
さらにまた、本発明は、前記バイオマーカーセットを構成するそれぞれのマーカーに特異的な抗体を利用した抗原-抗体結合反応によって血液試料から前記バイオマーカーセットを検出する方法を提供する。
以下、本発明を詳しく説明することにする。
本発明の一態様に従い、本発明は、乳癌診断のための、下記の表１に表された５種のタンパク質マーカーのうちの２種以上からなるバイオマーカーセットを提供する。好ましくは、本発明のバイオマーカーセットは、下記の５種のタンパク質マーカーのうちの３種からなり、より好ましくは４種からなり、最も好ましくは５種のタンパク質マーカーからなる。
Figure 2015511002
本発明のバイオマーカーセットを構成する第一のタンパク質は配列番号１に示されるアポリポタンパク質Ｃ１であって、これは遊離脂肪酸と結合して細胞中でこれらのエステル化を減少させる（Westerterp M. et al., J. Lipid Res.,48:1353-1361, 2007）。第二のタンパク質は配列番号２に示されるアポリポタンパク質（ａ）であって、これはセリンプロテイナーゼの活性を有しており自己タンパク質分解作用をしたりもする（Salonen E.M. et al., EMBO J., 8:4035-4040, 1989）。第三のタンパク質は配列番号３に示される神経細胞接着分子Ｌ１類似タンパク質であって、これは細胞の外基質と細胞との粘着に関与するタンパク質であって、主に神経系の発達とシナプス可塑性において重要な役割をする（Wei M.H. et al., Hum. Genet., 103:355-364, 1998）。第四のタンパク質は配列番号４に示される炭酸脱水酵素１であって、これは二酸化炭素の可逆的水和反応とシアナミドを水和してユレアに変形させる（Briganti F. et al., J. Biol. Inorg. Chem., 4:528-536, 1999）。最後の第五のタンパク質は配列番号５に示されるフィブロネクチンであって、これは細胞と基質の接着に際してタンパク質付着を提供し細胞を膠質側へ浸透させる機能をする（Morla A. et al., Nature, 367:193-196, 1994）。
一方、三重四極子質量分析計（ｔｒｉｐｌｅ ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ｍａｓｓ-ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）を利用した多重反応モニタリング（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ；ＭＲＭ）は、特定の分析物質を選択的に分離して検出し定量することでその濃度変化をモニタリングすることができる分析技法である。ＭＲＭは既に小さい分子の定量分析に活用され特定の遺伝病の診断に用いられてきている。ＭＲＭ技法は多数のペプチドの同時測定が容易であり、且つ標準品や抗体なしで正常人と癌患者間でのタンパク質診断マーカー候補の相対的濃度の差を確認することができるという長所がある。また敏感度と選択性に優れ、特に、質量分析計を利用したプロテオーム分析にて血液中にある複雑なタンパク質とペプチッドの分析のためにＭＲＭ分析技法が導入されている（Anderson L. et al., Mol Cell Proteomics, 5: 375-88, 2006； DeSouza, L. V. et al., Anal. Chem., 81: 3462-70, 2009）。
本発明者らは、乳癌患者の血液で特異的にその量が変化して乳癌の診断に有用に用いることができる診断マーカータンパク質セットを選抜するために、８０名の乳癌患者と８０名の非患者対照群から血液試料を得、三重四極子質量分析計を利用した多重反応モニタリング（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ；ＭＲＭ）を行うことで定量分析した。その結果、アポリポタンパク質Ｃ１、アポリポタンパク質（ａ）、神経細胞接着分子Ｌ１類似タンパク質、炭酸脱水酵素１、及びフィブロネクチンが、非患者対照群の血液に比べて乳癌患者の血液で量の変化が見られ、これにより、乳癌患者を効果的に区分可能であることを確認した。
本発明で確認された５種のタンパク質のうちの２種以上からなるマルチバイオマーカーセットを乳癌診断のために使用した場合、相互補完によって一層優れた診断正確性を確保することができ、特に、５種タンパク質からなるマルチバイオマーカーセットは単一のマーカーとは比べ物にならないほど優れた診断正確性を確保することができるようになる。また、前記マーカータンパク質セットは、血液から検出が可能であることから生検（ｂｉｏｐｓｙ）を行わなくて済み、その結果、患者に不便をかけることなく簡易な方法にて乳癌を診断するのに活用することができる。
本発明の他の態様に従い、本発明は、三重四極子質量分析計を利用した多重反応モニタリングによって血液試料からアポリポタンパク質Ｃ１、アポリポタンパク質（ａ）、神経細胞接着分子Ｌ１類似タンパク質、炭酸脱水酵素１、及びフィブロネクチンのうちの２種以上のタンパク質マーカーを検出する方法を提供する。
好ましくは、本方法は、
１）被検者の血液試料及び対照群血液試料のタンパク質をペプチド切片にする段階と；
２）前記ペプチド切片を三重四極子質量分析計に注入してアポリポタンパク質Ｃ１、アポリポタンパク質（ａ）、神経細胞接着分子Ｌ１類似タンパク質、炭酸脱水酵素１、及びフィブロネクチンをそれぞれ代表するターゲットペプチドのうちの２種以上に対して多重反応モニタリングを行う段階；
３）前記多重反応モニタリング結果を内部標準物質に対する割合にて表示する段階；及び
４）被検者と対照群に対する検出結果を比較する段階とを含む。
本発明の一実施例によれば、被検者の血液試料を採取し、前記アポリポタンパク質Ｃ１、アポリポタンパク質（ａ）、神経細胞接着分子Ｌ１類似タンパク質、炭酸脱水酵素１、及びフィブロネクチンのうちの２種以上を被検者の血液試料からＭＲＭ技法にて検出し、非患者対照群の検出結果と比較することでタンパク質量の増減の有無を確認することにより、乳癌の発病の有無を確認することができ、好ましくは、アポリポタンパク質Ｃ１、アポリポタンパク質（ａ）、神経細胞接着分子Ｌ１類似タンパク質、炭酸脱水酵素１、及びフィブロネクチンを被検者の血液試料からＭＲＭ技法にて検出し、非患者対照群の検出結果と比較することで前記５種のタンパク質マーカーの量の増減の有無を確認することにより、乳癌の発病の有無を確認することができる。
本発明の目的上、ターゲットタンパク質をＭＲＭ技法にて検出するためには、各タンパク質を代表することができる特定のペプチドの選定と各ペプチドのＭＲＭモニタリングターゲットである親イオン／娘イオンの対の選定が先に行われる必要がある。本発明の５種のマーカータンパク質の場合、アポリポタンパク質Ｃ-１を代表するターゲットペプチドは配列番号６の配列を有し、ターゲットペプチドの親イオン／娘イオンの対はそれぞれｍ／ｚ ５２６．８とｍ／ｚ ６０５．３であり、アポリポタンパク質（a）を代表するターゲットペプチドは配列番号７の配列を有し、ターゲットペプチドの親イオン／娘イオンの対はそれぞれｍ／ｚ ５２１．８とｍ／ｚ ６３４．３であり、神経細胞接着分子Ｌ１類似タンパク質を代表するターゲットペプチドは配列番号８の配列を有し、ターゲットペプチドの親イオン／娘イオンの対はそれぞれｍ／ｚ ６４２．８とｍ／ｚ ８３６．４であり、炭酸脱水酵素１を代表するターゲットペプチドは配列番号９の配列を有し、ターゲットペプチドの親イオン／娘イオンの対はそれぞれｍ／ｚ ４８５．８とｍ／ｚ ７５８．４であり、フィブロネクチンを代表するターゲットペプチドは配列番号１０の配列を有し、ターゲットペプチドの親イオン／娘イオンの対はそれぞれｍ／ｚ ５５５．８とｍ／ｚ ８２１．４である。
また、ターゲットタンパク質を検出するためにＭＲＭ技法にてモニタリングする一部のアミノ酸が安定同位元素で置換された特定のペプチドを合成し、ＭＲＭ分析の際に内部標準物質として使用すると、ターゲットタンパク質の血液中の絶対量も測定することができ、より正確な分析結果を導出することができる。本発明における内部標準物質は、ＭＲＭ分析の際に一般に用いられる任意の内部標準物質が用いられていてよく、例えば、大膓菌β-ガラクトシダーゼが用いられていてよい。ターゲットタンパク質の血液中の絶対量を測定するために一部のアミノ酸が安定同位元素で置換された特定のペプチドを内部標準物質として合成する場合、同位元素で置換されたアミノ酸はリジン（Ｌｙｓｉｎｅ）やアルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）が好ましいが、これらに制限されるものではない。合成されたペプチドは、９５％以上の純粋分離されたペプチドを用いることが好ましい。
本発明に係る５種のタンパク質マーカーのうちの２種以上からなるバイオマーカーセットをＭＲＭ技法にて検出する方法は、患者の血液を用いるといった新規な診断技法であって、敏感度に優れるだけでなく、抗原抗体を用いる既存の免疫化学的方法よりも検出したいタンパク質に対する選択性が極めて高く且つ生検を用いることなく血液を対象に簡易に分析することができ、また単一のマーカーを利用するものに比べて乳癌発病の有無の確認正確度が遥かに優れ、その結果、乳癌の早期診断に有用に用いることができる。
また、本発明は、ＭＲＭ技法にて前記５種のタンパク質マーカーのうちの２種以上からなるバイオマーカーセットを血液試料から検出するための診断キットを提供する。本診断キットは、ＭＲＭ技法にてアポリポタンパク質Ｃ１、アポリポタンパク質（ａ）、神経細胞接着分子Ｌ１類似タンパク質、炭酸脱水酵素１、及びフィブロネクチンのうちの２種以上のタンパク質マーカーを検出するために必要な２種以上のタンパク質のそれぞれのターゲットペプチド及び該ターゲットペプチドの親イオン／娘イオンの対に関する情報を含み、当分野において質量分析の際に一般に使用される道具、試薬などが含まれる。最も好ましくは、本診断キットは、前記５種のタンパク質マーカーのいずれものためのターゲットペプチドと該ターゲットペプチドの親イオン／娘イオンの対に関する情報を含む。

一方、本発明に係るバイオマーカーセットは、ＭＲＭ技法だけでなく、抗原-抗体結合反応によっても血液試料から検出することができる。したがって、本発明に係る他の態様に従い、本発明は、アポリポタンパク質Ｃ１、アポリポタンパク質（ａ）、神経細胞接着分子Ｌ１類似タンパク質、炭酸脱水酵素１、及びフィブロネクチンのそれぞれに特異的な抗体のうちの２種以上の抗体を含み、血液試料から２種以上のタンパク質マーカーを検出するための乳癌診断試薬及び乳癌診断キットを提供する。好ましくは、本発明に係る診断試薬及び診断キットは、前記５種のタンパク質マーカーのそれぞれに特異的な抗体のうちの３種の抗体を含み、より好ましくは、４種の抗体を含み、最も好ましくは、５種の抗体を含む。
前記タンパク質マーカーのそれぞれに選択的に結合する抗体を製造するためには、前記タンパク質マーカーの入手が先に行われる必要があり、これは、本発明の配列番号１〜配列番号５のアミノ酸配列を用いて合成するかまたは遺伝子組み換えを用いて微生物から産生することができ、または血液から直接分離して準備することもできる。
本発明の目的上、前記抗体は、多クローン抗体及び単クローン抗体をいずれも含んでいてよいが、抗原とより特異的に結合することができる単クローン抗体が好ましい。
多クローン抗体は、当業者に公知の従来方法に従い、免疫原（ａｎｔｉｇｅｎ）としてのタンパク質マーカーまたはその断片を外部の宿主に注射することで調製していてよい。このような外部の宿主としては、マウス、ラット、ヤギ、ウサギのような哺乳動物が挙げられ、免疫原は一般に抗原性を増加させるための補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）とともに筋肉内、腹腔内または皮下注射などの方法で投与され、外部の宿主を免疫化させる。免疫化された外部の宿主から定期的に血清を採取し、向上した力価及び抗原に対する特異性を示す血清を回収するか、またはこれらから抗体を分離・精製し、マーカータンパク質に特異的な多クローン抗体を調製することができる。
単クローン抗体は、当業者に公知の融合（ｆｕｓｉｏｎ）による不滅化された細胞株生成方法（Kohler G. et al., Nature, 256: 495-497, 1975）にて調製することができる。該方法について簡略に説明すると、先ず純粋なマーカータンパク質またはその断片でマウスを免疫化するか、またはそのペプチドを合成してウシ血清アルブミンと結合させてマウスを免疫化する。免疫化されたマウスから分離した抗体-産生Ｂリンパ球をヒトまたはマウスの骨髄腫細胞と融合して不滅化されたハイブリドーマ細胞を生成する。次いで、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ；Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）にてハイブリドーマ細胞の単クローン抗体の生成の有無を調査して陽性クローンを選抜し、これを培養した後、抗体を分離・精製するかまたはマウスの腹腔に注入してから複数を採取して、マーカータンパク質に特異的な単クローン抗体を調製することができる。
本発明に係るタンパク質マーカーの検出に用いられる抗体は、２個の全長の軽鎖及び２個の全長の中鎖を有する完全な形態だけでなく、抗体分子の機能的な断片を含む。抗体分子の機能的な断片とは、少なくとも抗原結合能を持っている断片のことを意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖなどがある。
本発明に係る乳癌診断キットには、５種のタンパク質マーカーのそれぞれを選択的に認知する抗体だけでなく、当分野において免疫学的分析に一般に使用される道具、試薬などが含まれる。
本発明の一実施例によれば、前記乳癌診断キットは、５種のタンパク質マーカーのそれぞれに特異的な５種の抗体のうちの２種以上；基質との反応によって発色する標識体が接合された二次抗体接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）；前記標識体と発色反応する発色基質溶液；洗浄液；及び酵素反応停止液を含んでいてよい。
また、本発明に係る乳癌診断キットは、前記５種のマーカータンパク質標準抗原を含む陽性対照群と前記抗原が注入されていない動物の抗血清を含む陰性対照群とをさらに含んでいてよい。
本発明に係る乳癌診断キットは、抗原-抗体結合反応によって抗体タンパク質に対する抗原を定量または定性分析することで乳癌を診断することができ、前記抗原-抗体結合反応は、通常の酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｎｏａｓｓａｙ、ＲＩＡ）、サンドイッチ測定法（ｓａｎｄｗｉｃｈ ａｓｓａｙ）、ウェスタンブロッティング、免疫沈降法、免疫組織化学染色法（ｉｍｍｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ）、蛍光免疫法、酵素基質発色法、抗原-抗体凝集法などの方法を用いて測定することができる。例えば、検体及び対照群を表面にコートした９６ウェルマイクロタイタープレートなどを利用して組み換え単クローン抗体タンパク質と反応するＥＬＩＳＡを行うように前記診断キットを提供していてよい。
抗原-抗体結合反応のための固定体としては、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜、ポリビニル樹脂またはポリスチレン樹脂で合成されたウェルプレート、ガラスからなるスライドガラスなどが使用されていてよい。
二次抗体の標識体は、発色反応をする通常の発色剤が好ましく、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリフォスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、コロイドゴールド（ｃｏｌｏｉｄ ｇｏｌｄ）、ＦＩＴＣ（ポリ-Ｌ-リジン-フルオレセインイソチオシアネート）、ＲＩＴＣ（ローダミン-Ｂ-イソチオシアネート）などの蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）及び色素（ｄｙｅ）などの標識体が用いられていてよい。
発色を誘導するための発色基質は、発色反応をする標識体に応じて用いることが好ましく、ＴＭＢ（３,３’,５,５’-テトラメチルベジジン）、ＡＢＴＳ［２,２’-アジノ−-ビス（３-エチルベンゾチアゾリン-６-スルホン酸）］、ＯＰＤ（ｏ-フェニレンジアミン）などを用いていてよい。このとき、発色基質は、緩衝溶液（０．１Ｍ ＮａＡｃ、ｐＨ５．５）に溶解された状態で提供されるのがより好ましい。ＴＭＢのような発色基質は、二次抗体接合体の標識体として用いられたＨＲＰによって分解され発色沈積体を生成し、該発色沈積体の沈積程度を目視して確認することで前記マーカータンパク質の存在の有無を検出する。
洗浄液は、リン酸塩緩衝溶液、ＮａＣｌ及びツイン２０（Ｔｗｅｅｎ ２０）を含むものが好ましく、０．０２Ｍのリン酸塩緩衝溶液、０．１３ＭのＮａＣｌ、及び０．０５％のツイン２０からなる緩衝溶液（ＰＢＳＴ）がより好ましい。洗浄液は、抗原-抗体の結合反応後、抗原-抗体結合体に二次抗体を反応させた後に適量を固定体に添加して３〜６回洗浄する。反応停止液は、硫酸溶液（Ｈ２ＳＯ４）が好ましく用いられる。

さらに、本発明のまた他の態様は、アポリポタンパク質Ｃ１、アポリポタンパク質（ａ）、神経細胞接着分子Ｌ１類似タンパク質、炭酸脱水酵素１、及びフィブロネクチンのそれぞれのタンパク質に特異的な抗体を利用した抗原-抗体結合反応によって血液試料から前記タンパク質マーカーのうちの２種以上を検出する方法を提供する。好ましくは、本発明は、前記５種のタンパク質のそれぞれに特異的な抗体を利用した抗原-抗体結合反応によって血液試料から３種のタンパク質マーカーを検出する方法を提供し、より好ましくは、４種のタンパク質マーカーを検出する方法を提供し、最も好ましくは、５種のタンパク質マーカーを検出する方法を提供する。
前記検出方法は、血液中のタンパク質を固定化させるか、または電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離させてからＰＶＤＦ膜に転移させ、前記タンパク質マーカー群のタンパク質を選択的に認知する抗体と接触させて、抗原-抗体結合反応によってマーカータンパク質群の存在を間接的に確認することを含む。前記抗原-抗体結合反応としては、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫分析法（ＲＩＡ）、サンドイッチ測定、ウェスタンブロッティング、免疫沈降法、免疫組織化学染色法、蛍光免疫法、酵素基質発色法、抗原-抗体凝集法などが挙げられる。試料としては、血清、血漿、または血液を用いていてよく、血漿が最も好ましい。
本発明の好適な実施例によれば、前記検出方法は、
１）被検者の血液試料及び対照群血液試料のタンパク質を固定体にコートするかまたは固定させる段階と；
２）前記固定体にアポリポタンパク質Ｃ１、アポリポタンパク質（ａ）、神経細胞接着分子Ｌ１類似タンパク質、炭酸脱水酵素１、及びフィブロネクチンのそれぞれのタンパク質に特異的な抗体のうちの２種以上を添加して抗原-抗体結合反応を行う段階；
３）前記抗原-抗体結合反応によって生成された抗原-抗体結合反応物を二次抗体接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）及び発色基質溶液を利用して検出する段階；及び
４）被検者血液試料と対照群血液試料に対する検出結果を比較する段階とを含んでいてよい。
前記検出方法の一実施例としては、先ず血液試料から血漿タンパク質を電気泳動などによって分子量に応じて分離し、該分離されたタンパク質をＰＶＤＦ膜のような固定体に転移させて固定する。次いで、固定されたタンパク質抗原にそれぞれのマーカータンパク質に特異的な抗体を加えて抗原-抗体結合反応を行う。血液試料にマーカータンパク質が存在すれば、前記タンパク質が固定された膜に、マーカータンパク質に特異的な抗体が加えられたとき、抗原-抗体結合反応が起こるようになる。マーカータンパク質とこれに対する抗体の結合程度を測定するために、マーカータンパク質抗体に親和性を持つ二次抗体、例えば抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰと結合させる段階を行い、二次抗体に接合されたＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が基質であるＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）と反応して発色反応を起こすか否かやその程度を対照群と比べることで血液試料中の乳癌診断タンパク質マーカーの存在の有無及び対照群に比べてのその量の増減の有無を検出するようになる。
一方、本発明に係る５種のタンパク質マーカーのそれぞれに特異的な抗体のうちの２種以上を生物学的マイクロチップ（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ）上に固定させた後、対象者から分離された血液試料と反応させて前記抗体タンパク質に対する抗原を検出することができる生物学的マイクロチップ及び自動化されたマイクロアレイシステム（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｓｙｓｔｅｍ）を利用すれば、一回の分析で大量の試料を分析することができるという長所がある。したがって、本発明は、本発明に係る５種のタンパク質マーカーのそれぞれに特異的に結合する抗体のうちの２種以上が固形基質に集積されたバイオチップを提供する。バイオチップの固形基質の例としては、プラスチック、ガラス、金属、シリコンなどが挙げられる。
前述したように、本発明に係る５種の乳癌診断用タンパク質マーカーのうちの２種以上からなるバイオマーカーセットを血液試料からＭＲＭ技法にて検出する方法は、患者の血液を用いるといった新規な診断技法であって、敏感度に優れるだけでなく、抗原抗体を用いる既存の免疫化学的方法よりも検出したいタンパク質に対する選択性が極めて高く且つ生検を用いることなく血液を対象に簡易に分析することができ、また、前記バイオマーカーセットに対する抗体を用いた乳癌診断キット及び診断方法も比較的採取が容易な血液を試料とするため、生検を対象とする既存の乳癌診断方法とは異なり、患者に負担を与えることなく極めて簡易に乳癌を診断することができるだけでなく、診断の正確度及び敏感度が高く、さらに、このようなバイオマーカーセットをＭＲＭ技法または抗原抗体反応によって検出する方法は、単一マーカーを利用する診断法に比べて極めて高い正確度及び敏感度を提供することができるため、乳癌の早期診断に有用に用いることができる。
アポリポタンパク質Ｃ-１マーカータンパク質を、８０名の乳癌患者と８０名の非患者対照群に対してＭＲＭ技法にて測定した抗原の濃度（大膓菌β-ガラクトシダーゼに対する割合）を示す図であって、図１ａは箱図表であり、図１ｂはＲＯＣ曲線である。 アポリポタンパク質Ｃ-１マーカータンパク質を、８０名の乳癌患者と８０名の非患者対照群に対してＭＲＭ技法にて測定した抗原の濃度（大膓菌β-ガラクトシダーゼに対する割合）を示す図であって、図１ａは箱図表であり、図１ｂはＲＯＣ曲線である。 アポリポタンパク質（ａ）マーカータンパク質を、８０名の乳癌患者と８０名の非患者対照群に対してＭＲＭ技法にて測定した抗原の濃度（大膓菌β-ガラクトシダーゼに対する割合）を示す図であって、図２ａは箱図表であり、図２ｂはＲＯＣ曲線である。 アポリポタンパク質（ａ）マーカータンパク質を、８０名の乳癌患者と８０名の非患者対照群に対してＭＲＭ技法にて測定した抗原の濃度（大膓菌β-ガラクトシダーゼに対する割合）を示す図であって、図２ａは箱図表であり、図２ｂはＲＯＣ曲線である。 神経細胞接着分子Ｌ１類似タンパク質を、８０名の乳癌患者と８０名の非患者対照群に対してＭＲＭ技法にて測定した抗原の濃度（大膓菌β-ガラクトシダーゼに対する割合）を示す図であって、図３ａは箱図表であり、図３ｂはＲＯＣ曲線である。 神経細胞接着分子Ｌ１類似タンパク質を、８０名の乳癌患者と８０名の非患者対照群に対してＭＲＭ技法にて測定した抗原の濃度（大膓菌β-ガラクトシダーゼに対する割合）を示す図であって、図３ａは箱図表であり、図３ｂはＲＯＣ曲線である。 炭酸脱水酵素１マーカータンパク質を、８０名の乳癌患者と８０名の非患者対照群に対してＭＲＭ技法にて測定した抗原の濃度（大膓菌β-ガラクトシダーゼに対する割合）を示す図であって、図４ａは箱図表であり、図４ｂはＲＯＣ曲線である。 炭酸脱水酵素１マーカータンパク質を、８０名の乳癌患者と８０名の非患者対照群に対してＭＲＭ技法にて測定した抗原の濃度（大膓菌β-ガラクトシダーゼに対する割合）を示す図であって、図４ａは箱図表であり、図４ｂはＲＯＣ曲線である。 フィブロネクチンマーカータンパク質を、８０名の乳癌患者と８０名の非患者対照群に対してＭＲＭ技法にて測定した抗原の濃度（大膓菌β-ガラクトシダーゼに対する割合）を示す図であって、図５ａは箱図表であり、図５ｂはＲＯＣ曲線である。 フィブロネクチンマーカータンパク質を、８０名の乳癌患者と８０名の非患者対照群に対してＭＲＭ技法にて測定した抗原の濃度（大膓菌β-ガラクトシダーゼに対する割合）を示す図であって、図５ａは箱図表であり、図５ｂはＲＯＣ曲線である。 表１に表されたバイオマーカーセットを、８０名の乳癌患者と８０名の非患者対照群に対してＭＲＭ技法にて測定した抗原の濃度（大膓菌β-ガラクトシダーゼに対する割合）をＲＯＣ曲線で示した図である。 表１に表されたバイオマーカーセットを、３７名の第１期乳癌患者と８０名の非患者対照群に対してＭＲＭ技法にて測定した抗原の濃度（大膓菌β-ガラクトシダーゼに対する割合）をＲＯＣ曲線で示した図である。
以下、実施例を挙げて本発明をより詳しく説明することにする。なお、これらの実施例は本発明をより具体的に説明するためのものであるに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものではない。
実施例１．多重反応モニタリング（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ；ＭＲＭ）技法を用いた乳癌診断のためのバイオマーカーセットの検出
本発明者らは、前記表１に表されたタンパク質群を血液から乳癌の選択的診断のためのマーカーとして使用することができるか否かを確認するために、次のように三重四極子質量分析計を利用した多重反応モニタリング技法にて定量分析する方法を用いた（Anderson L. et al., Mol Cell Proteomics, 5: 375-88, 2006）。ＭＲＭとは、質量分析計を利用した定量に主に用いられる技法であって、関心のある親イオンから生成された特定の娘イオンを観察して情報を得る技法である。例えば、ｍ／ｚ １０００を有する幾つかの親イオンのうちの1個のイオンだけがｍ／ｚ ５００の娘イオンを有するとした場合、そのようなイオンを追跡するためにｍ／ｚ １０００を有する親イオンを選択して断片化させ、ｍ／ｚ ５００の娘イオンを調査することがＭＲＭである。
１．１試料の準備
本発明に係る５種のバイオマーカータンパク質の効率性を確認するために、乳癌患者８０名と非患者対照群８０名から得た血液試料におけるタンパク質の発現程度を確認し、統計処理して、バイオマーカーセットの乳癌診断効率を確認した。１６０名から得た血液からそれぞれ２００μｇのタンパク質試料を準備した。準備された試料毎に１０ｍＭのジチオトレイトールを処理してから１時間反応させ、タンパク質をペプチド切片にする過程を妨害し得るタンパク質中のアミノ酸のうちのシスチンのチオール（ｔｈｉｏｌ−）残基間の結合を切断した。このようにして切断されたチオール結合は、６０ｍＭのヨードアセトアミドを処理してから暗所で１時間反応させ、チオール残基間の再結合を防いだ。準備されたタンパク質試料にタンパク質２００μｇ全体の１／５０に該当する量の４μｇのトリプシン２０μｌ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製、ＵＳＡ）を添加し、３７℃で１６時間処理を施して複数のペプチド切片に分離した。このようにして得たペプチド切片を、Ｃ１８カートリッジを利用して塩を除去することで質量分析のための最終試料として準備した。
１．２三重四極子質量分析計を利用した多重反応モニタリングの実施
ＭＲＭ分析のためには、特定のタンパク質を代表することができるペプチドの選定と該ペプチドから断片化によって生成された娘イオン、すなわちターゲットペプチドを効果的にモニタリングできる親イオンと娘イオンの対を先に選定する必要がある。表１に表された５個のタンパク質の親イオンと娘イオンの対を選定するために、血液試料をそのままタンデム質量分析にかけてアポリポタンパク質Ｃ-１とアポリポタンパク質（ａ）を同定した。このタンデム質量分析スペクトルからアポリポタンパク質Ｃ-１を代表することができる配列番号６のペプチドと、アポリポタンパク質（ａ）を代表することができる配列番号７のペプチドを選定し、これらの各ペプチドの親イオン／娘イオンの対を選定して下記の表２に表した。血液試料をそのままタンデム質量分析にかけることでは確認することができなかった残りの３個のタンパク質のカラムにおける残留時間と、タンデム質量分析スペクトルを確認するために残りの３個のタンパク質（神経細胞接着分子Ｌ１類似タンパク質、炭酸脱水酵素１、フィブロネクチン）のそれぞれを代表することができるペプチドを合成した（ジェイピーティーペプチドテクノロジー（ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｇｍｂｈ）社製、Ｇｅｒｍａｎｙ）。その結果、神経細胞接着分子Ｌ１類似タンパク質は配列番号８に示されるペプチドを、炭酸脱水酵素１は配列番号９に示されるペプチドを、フィブロネクチンは配列番号１０に示されるペプチドを選定し、これらの各ペプチドの親イオン／娘イオンの対を選定して下記の表２に表した。
Figure 2015511002
実施例１．１で準備された最終試料を逆相樹脂クロマトグラフィーにかけて血漿ペプチド切片を分離し、三重四極子質量分析計（機器：５５００Ｑｔｒａｐ、ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製、ＵＳＡ）を使用して各ペプチドのＭＲＭスペクトルを得た。このとき、逆相樹脂クロマトグラフィーは、Ｃ１８コラムとしてのＨＡＬＯＴＭ（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ社製、ＵＳＡ）で４５分間５％〜４０％のアセトニトリル濃度勾配を用いて実施した。コンピューター定量分析プログラムとしてのＭｕｌｔｉＱｕａｎｔＴＭ（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製、ＵＳＡ）にてターゲットペプチドのＭＲＭクロマトグラムのピーク面積を計算することで定量情報を確認した。このとき、各ターゲットペプチドの定量値は、内部標準物質として注入した大膓菌β-ガラクトシダーゼ（表２）のＭＲＭクロマトグラムのピーク面積に対する割合にて表した。各ペプチドのＭＲＭクロマトグラム面積比を求めることで乳癌患者と非患者対照群間でのタンパク質の発現量の差を確認することができた。
前記方法にて測定された５個のマーカータンパク質のそれぞれの濃度をグラフで図示した。具体的に、配列番号１に示されるアポリポタンパク質Ｃ-１の場合、図１ａに示したように箱図表にて図示した結果、前記マーカータンパク質が、非患者対照群に比べて乳癌患者群で１．４１倍減少することを確認した。また、図１ｂに示したように受信者操作特性（ＲＯＣ）グラフにて図示した結果、前記マーカータンパク質のＡＵＣ（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ）は０．７１と示された。
配列番号２に示されるアポリポタンパク質（ａ）の場合、図２ａに示したように箱図表にて図示した結果、前記マーカータンパク質が、非患者対照群に比べて乳癌患者群で１．３５倍増加することを確認した。また、図２ｂに示したように受信者操作特性（ＲＯＣ）グラフにて図示した結果、前記マーカータンパク質のＡＵＣ（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ）は０．６４と示された。
配列番号３に示される神経細胞接着分子Ｌ１類似タンパク質の場合、図３aに示したように箱図表にて図示した結果、前記マーカータンパク質が、非患者対照群に比べて乳癌患者群で１．４３倍増加することを確認した。また、図３ｂに示したように受信者操作特性（ＲＯＣ）グラフにて図示した結果、前記マーカータンパク質のＡＵＣ（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ）は０．７５と示された。
配列番号４に示される炭酸脱水酵素１の場合、図４ａに示したように箱図表にて図示した結果、前記マーカータンパク質が、非患者対照群に比べて乳癌患者群で１．６０倍増加することを確認した。また、図４ｂに示したように受信者操作特性（ＲＯＣ）グラフにて図示した結果、前記マーカータンパク質のＡＵＣ（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ）は０．７２と示された。
最後に、配列番号５に示されるフィブロネクチンの場合、図５ａに示したように箱図表にて図示した結果、前記マーカータンパク質が、非患者対照群に比べて乳癌患者群で１．５６倍増加することを確認した。また、図５ｂに示すように受信者操作特性（ＲＯＣ）グラフにて図示した結果、前記マーカータンパク質のＡＵＣ（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ）は０．７０と示された。
参考として、ＲＯＣグラフは観察されたデータの全範囲に亘って判定閾値を連続して変化させて得られる全ての感受性／特異性の対のグラフであって、主に試験の正確度を示す（Zweig et al., Clin. Chem. 39:561-577, 1993）。
１．３バイオマーカーセットによる乳癌の診断
前記実施例１．２で確認された５個のマーカータンパク質群の定量結果をロジスティック回帰分析にて一つにまとめて多数のマーカーから構成された一つの診断マーカー（多標識マーカー）を作成し、これを用いて乳癌診断効率を確認した。
その結果、図６ａに示すように、多標識マーカーを８０名の乳癌患者と８０名の非患者対照群に対する受信者操作特性（ＲＯＣ）グラフにて図示した結果、ＡＵＣ（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ）は０．８６と示された。また、８０％の特異度で７５％の敏感度を示し、前記分析が既存の単一標識マーカーに比べて高い敏感性と正確性を兼ね備えれていることが分かった。
さらに、図６ｂに示すように、前記多標識マーカーを８０名の非患者対照群と３７名の第１期乳癌患者に対する受信者操作特性（ＲＯＣ）グラフにて図示した結果、ＡＵＣ（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ）は０．９２と示された。また、８０％の特異度で９２％の敏感度を示し、前記分析が初期乳癌患者の診断に極めて有効であることが分かった。

Claims (28)

  1. 配列番号１の配列を有するアポリポタンパク質Ｃ１、配列番号２の配列を有するアポリポタンパク質（ａ）、配列番号３の配列を有する神経細胞接着分子Ｌ１類似タンパク質、配列番号４の配列を有する炭酸脱水酵素１、及び配列番号５の配列を有するフィブロネクチンのうちの２種以上のタンパク質マーカーからなる、乳癌診断用バイオマーカーセット。
  2. 前記５種のタンパク質マーカーのうちの３種からなる、請求項１に記載の乳癌診断用バイオマーカーセット。
  3. 前記５種のタンパク質マーカーのうちの４種からなる、請求項１に記載の乳癌診断用バイオマーカーセット。
  4. 前記５種のタンパク質マーカーからなる、請求項１に記載の乳癌診断用バイオマーカーセット。
  5. 非患者対照群に比べてアポリポタンパク質Ｃ１の発現量の減少、アポリポタンパク質（ａ）の発現量の増加、神経細胞接着分子Ｌ１類似タンパク質の発現量の増加、炭酸脱水酵素１の発現量の増加、及びフィブロネクチンの発現量の増加が乳癌の発病を示す、請求項１〜４のいずれかに記載の乳癌診断用バイオマーカーセット。
  6. 三重四極子質量分析計を利用した多重反応モニタリング（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）により血液試料から請求項１〜４のいずれかに記載の乳癌診断用バイオマーカーセットを検出する方法。
  7. １）被検者の血液試料及び対照群血液試料のタンパク質をペプチド切片にする段階と；
    ２）前記ペプチド切片を三重四極子質量分析計に注入してアポリポタンパク質Ｃ１、アポリポタンパク質（ａ）、神経細胞接着分子Ｌ１類似タンパク質、炭酸脱水酵素１、及びフィブロネクチンをそれぞれ代表するターゲットペプチドのうちの２種以上に対して多重反応モニタリングを行う段階と；
    ３）前記多重反応モニタリングの結果を内部標準物質に対する割合にて表示する段階；及び
    ４）被検者と対照群に対する検出結果を比較する段階とを含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
  8. アポリポタンパク質Ｃ-１を代表するターゲットペプチドは配列番号６の配列を有し、ターゲットペプチドの親イオン／娘イオンの対はそれぞれｍ／ｚ ５２６．８とｍ／ｚ ６０５．３であり、アポリポタンパク質（ａ）を代表するターゲットペプチドは配列番号７の配列を有し、ターゲットペプチドの親イオン／娘イオンの対はそれぞれｍ／ｚ ５２１．８とｍ／ｚ ６３４．３であり、神経細胞接着分子Ｌ１類似タンパク質を代表するターゲットペプチドは配列番号８の配列を有し、ターゲットペプチドの親イオン／娘イオンの対はそれぞれｍ／ｚ ６４２．８とｍ／ｚ ８３６.４であり、炭酸脱水酵素１を代表するターゲットペプチドは配列番号９の配列を有し、ターゲットペプチドの親イオン／娘イオンの対はそれぞれｍ／ｚ ４８５．８とｍ／ｚ ７５８．４であり、フィブロネクチンを代表するターゲットペプチドは配列番号１０の配列を有し、ターゲットペプチドの親イオン／娘イオンの対はそれぞれｍ／ｚ ５５５．８とｍ／ｚ ８２１．４であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
  9. 内部標準物質として大膓菌β-ガラクトシダーゼが用いられ、大膓菌β-ガラクトシダーゼを代表するターゲットペプチドは配列番号１１の配列を有し且つ親イオンと娘イオンはそれぞれｍ／ｚ ５４２．３とｍ／ｚ ６３６．３であることを特徴とする請求項７または８に記載の方法。
  10. 試料は血漿または血清であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
  11. 多重反応モニタリング技法を用いて血液試料から請求項１〜４のいずれかに記載の乳癌診断用バイオマーカーセットを検出するために必要な各タンパク質のターゲットペプチド及びターゲットペプチドの親イオン／娘イオンの対に関する情報を含む、乳癌診断キット。
  12. 乳癌診断タンパク質マーカーであるアポリポタンパク質Ｃ１、アポリポタンパク質（ａ）、神経細胞接着分子Ｌ１類似タンパク質、炭酸脱水酵素１、及びフィブロネクチンのそれぞれに特異的に結合する抗体のうちの２種以上を含み、血液試料から前記タンパク質マーカーのうちの２種以上を検出するためのものである乳癌診断キット。
  13. 前記５種のタンパク質マーカーを検出するためのものである、請求項１２に記載の乳癌診断キット。
  14. 前記抗体が多クローン抗体または単クローン抗体であることを特徴とする請求項１２または１３に記載の乳癌診断キット。
  15. 基質との反応によって発色する標識体が接合された二次抗体接合体；前記標識体と発色反応する発色基質溶液；洗浄液；及び酵素反応停止液をさらに含むことを特徴とする請求項１２または１３に記載の乳癌診断キット。
  16. 二次抗体接合体の標識体がＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリフォスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、コロイドゴールド（ｃｏｌｏｉｄ ｇｏｌｄ）、蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、及び色素（ｄｙｅ）からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１５に記載の乳癌診断キット。
  17. 発色基質がＴＭＢ（３,３’,５,５’-テトラメチルベジジン）、ＡＢＴＳ［２,２’-アジノ-ビス（３-エチルベンゾチアゾリン-６-スルホン酸）］及びＯＰＤ（ｏ-フェニレンジアミン）からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１５に記載の乳癌診断キット。
  18. アポリポタンパク質Ｃ１、アポリポタンパク質（ａ）、神経細胞接着分子Ｌ１類似タンパク質、炭酸脱水酵素１、及びフィブロネクチンのそれぞれに特異的に結合する抗体を利用した抗原-抗体結合反応によって血液試料から前記５種のタンパク質マーカーのうちの２種以上を検出する方法。
  19. １）被検者の血液試料及び対照群血液試料のタンパク質を固定体にコートするか固定させる段階と；
    ２）前記固定体にアポリポタンパク質Ｃ１、アポリポタンパク質（ａ）、神経細胞接着分子Ｌ１類似タンパク質、炭酸脱水酵素１、及びフィブロネクチンのそれぞれのタンパク質に特異的な抗体のうちの２種以上を添加して抗原-抗体結合反応を行う段階と；
    ３）前記抗原-抗体結合反応によって生成された抗原-抗体結合反応物を二次抗体接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）及び発色基質溶液を利用して検出する段階；及び
    ４）被検者血液試料と対照群血液試料に対する検出結果を比較する段階とを含むことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
  20. ５種のタンパク質マーカーを検出することを特徴とする請求項１８または１９に記載の方法。
  21. 段階１）の血液試料が血清または血漿であることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
  22. 段階１）の固定体がニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜、ポリビニル（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ）またはポリスチレン（ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）樹脂で合成されたウェルプレート、及びガラスからなるスライドガラスからなる群より選ばれることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
  23. 段階２）の前記抗原-抗体結合反応が酵素免疫測定法（ｅｎｚｙｍｅ-ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）、放射能免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｎｏａｓｓａｙ、ＲＩＡ）、サンドイッチ測定法（ｓａｎｄｗｉｃｈ ａｓｓａｙ）、ウェスタンブロッティング、免疫沈降法、免疫組織化学染色法（ｉｍｍｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ）、蛍光免疫法、酵素基質発色法、抗原-抗体凝集法からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
  24. 段階３）の二次抗体接合体の標識体がＨＲＰ、アルカリフォスファターゼ、コロイドゴールド、蛍光物質、及び色素からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
  25. 段階３）の発色基質がＴＭＢ、ＡＢＴＳ、及びＯＰＤからなる群より選ばれることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
  26. アポリポタンパク質Ｃ１、アポリポタンパク質（ａ）、神経細胞接着分子Ｌ１類似タンパク質、炭酸脱水酵素１、及びフィブロネクチンのそれぞれに特異的に結合する抗体のうちの２種以上が固形基質に集積された乳癌診断用バイオチップ。
  27. ５種の抗体が固形基質に集積された、請求項２６に記載のバイオチップ。
  28. 固形基質はプラスチック、ガラス、金属、及びシリコンからなる群より選ばれることを特徴とする請求項２６または２７に記載のバイオチップ。
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Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101903838B1 (ko) * 2015-09-07 2018-10-02 동국대학교 산학협력단 유방암 관련 stk32c 유전자 및 이의 용도
CN108562736A (zh) * 2018-01-03 2018-09-21 兰州大学 基于微孔阵列芯片和智能移动设备的免疫检测装置及方法
ES2876038T3 (es) 2018-02-18 2021-11-11 Marquez Marquez Lidia Método, aparato y kit para la detección temprana de cáncer de mama
KR20200012380A (ko) 2018-07-27 2020-02-05 조한준 유방암 환자의 예후 진단 및 치료 전략 결정용 재발 특이적 마커
WO2020045984A1 (ko) 2018-08-28 2020-03-05 주식회사 제이엘메디랩스 타겟 물질 검출을 위한 방법 및 키트
CN111650372A (zh) * 2019-03-04 2020-09-11 中国医学科学院药物研究所 载脂蛋白c1在作为胃癌诊断及预后评价生物标记物中的应用
US20230314427A1 (en) * 2019-06-14 2023-10-05 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Detection of antigens
KR102185866B1 (ko) 2019-09-09 2020-12-02 주식회사 제이엘메디랩스 다중 바이오마커 동시 검출용 키트 및 이를 이용한 검출 방법
KR102215982B1 (ko) 2019-09-09 2021-02-16 주식회사 제이엘메디랩스 다중 바이오마커 동시 검출용 키트 및 검출방법
KR102180845B1 (ko) 2019-09-09 2020-11-19 주식회사 제이엘메디랩스 다중 바이오마커 동시 검출용 키트 및 검출 방법
CN110658341B (zh) * 2019-09-25 2020-12-08 武汉金开瑞生物工程有限公司 一种测定蛋白质或多肽相对含量的方法
CN110716043B (zh) * 2019-10-23 2023-02-28 郑州大学 一种用于乳腺癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物、试剂盒及检测方法
KR102280672B1 (ko) * 2019-12-20 2021-07-23 주식회사 베르티스 암의 진단용 조성물
KR102280360B1 (ko) * 2019-12-20 2021-07-23 주식회사 베르티스 암의 진단용 조성물
KR102316892B1 (ko) * 2019-12-20 2021-10-27 주식회사 베르티스 암의 진단용 조성물
KR102325731B1 (ko) * 2020-01-15 2021-11-15 주식회사 베르티스 암의 진단용 조성물
KR102325742B1 (ko) * 2020-01-15 2021-11-15 주식회사 베르티스 암의 진단용 조성물
KR102433986B1 (ko) * 2020-02-27 2022-08-22 주식회사 베르티스 암의 진단용 조성물
KR102535150B1 (ko) * 2020-04-14 2023-05-23 주식회사 베르티스 암의 예후 예측용 조성물
CN112345755B (zh) * 2020-09-23 2023-06-16 杭州凯保罗生物科技有限公司 乳腺癌的生物标志物及其应用
KR20230143570A (ko) * 2022-03-31 2023-10-12 주식회사 베르티스 암의 진단용 조성물
WO2024026314A1 (en) * 2022-07-25 2024-02-01 The General Hospital Corporation Methods and systems of enhancing electromagnetic radiation signals from extracellular vesicles
CN116008548B (zh) * 2022-11-18 2023-11-24 汕头大学医学院附属肿瘤医院 乳腺癌术后复发与转移的检测试剂盒、检测装置及应用
CN116148482A (zh) * 2023-04-20 2023-05-23 天津云检医学检验所有限公司 用于乳腺癌患者鉴定的设备及其制备用途
CN116735883B (zh) * 2023-08-14 2023-10-20 天津理工大学 一种便携式检测乳腺癌标志物的比色传感芯片制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007506075A (ja) * 2003-09-22 2007-03-15 ベー・エル・アー・ハー・エム・エス・アクティエンゲゼルシャフト アポリポ蛋白質ｃ−ｉの測定による疾患の診断方法
JP2009511915A (ja) * 2005-10-13 2009-03-19 アプレラ コーポレイション 生体分子の検定を開発するための方法
US20100173788A1 (en) * 2005-06-21 2010-07-08 Vermillion, Inc. Biomarkers for breast cancer

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002077176A2 (en) 2001-03-22 2002-10-03 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Aberrantly expressed proteins in laser capture microdissected tumors
KR101122647B1 (ko) * 2008-01-18 2012-03-13 주식회사 바이오인프라 유방암 모니터링，진단 및 스크리닝용 단백질 마커 및 이를이용한 유방암 모니터링，진단 및 스크리닝 방법
KR101114228B1 (ko) 2009-06-01 2012-03-05 한국기초과학지원연구원 데이터 비의존성 분석법과 데이터 의존성 분석법을 복합화한 단백질 분석방법
CN102353789A (zh) * 2011-06-22 2012-02-15 江苏迈迪基因生物科技有限公司 心脑血管疾病相关的蛋白标志物的联合检测方法及其诊断试剂盒
KR20130017525A (ko) * 2011-08-11 2013-02-20 주식회사 젠닥스 대장암, 유방암, 신장암 또는 갑상선암의 조기 진단을 위한 바이오 마커 및 이의 용도

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007506075A (ja) * 2003-09-22 2007-03-15 ベー・エル・アー・ハー・エム・エス・アクティエンゲゼルシャフト アポリポ蛋白質ｃ−ｉの測定による疾患の診断方法
US20100173788A1 (en) * 2005-06-21 2010-07-08 Vermillion, Inc. Biomarkers for breast cancer
JP2009511915A (ja) * 2005-10-13 2009-03-19 アプレラ コーポレイション 生体分子の検定を開発するための方法
US20100233815A1 (en) * 2005-10-13 2010-09-16 Life Technologies Corporation Methods for the Development of a Biomolecule Assay

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN7017000225; Ｅ Ｒｕｉｚ-Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．: 'Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ １ ａｎｄ ＣＸＣＬ９ ａｓ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃ' Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｖｏｌ．１０２，Ｎｏ．３, 20100112, Ｐａｇｅ．４６２-４６８ *
JPN7017000226; Ｎａｒｇｅｓ Ｋ． Ｔａｆｒｅｓｈｉ ｅｔ ａｌ．: 'Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｌｙｍｐｈ Ｎｏｄｅ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｕｓｉｎｇ Ｃａｒｂｏｎｉｃ Ａｎｈｙｄｒａｓｅｓ ＩＸ ａｎｄ ＸＩＩ Ｔａ' Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．１, 20120101, Ｐａｇｅ．２０７-２１９ *

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