JP2014073129A - ＰＤＧＦＲβおよびＶＥＧＦ−Ａを阻害するための組成物および方法 - Google Patents

ＰＤＧＦＲβおよびＶＥＧＦ−Ａを阻害するための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

【課題】中和抗ＰＤＧＦＲβ及び抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体を含む、ＰＤＧＦ受容体β（ＰＤＧＦＲβ）及びＶＥＧＦ−Ａのアンタゴニスト、並びに関連する組成物及び方法の提供。
【解決手段】ＰＤＧＦＲβ及びＶＥＧＦ−Ａの両方に結合し、中和することができる二重特異性抗体を含む抗ＰＤＧＦＲβ及び抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体、及び、ＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを用いて癌又は血管新生眼障害などの血管新生障害を治療する方法。
【選択図】図３

Description

１．血管新生
血管新生は、新生血管形成とも呼ばれており、先在血管からの芽の形成及びそれらの周囲組織への侵入を伴う。血管新生の間、血管内皮細胞は、細胞周期に再び入り、基礎をなす基底膜を分解し、移動して、新たな毛細血管芽を形成する。これらの細胞は、次に分化し、成熟血管が形成される。この成長及び分化の過程は、血管新生促進因子と抗血管新生因子とのバランスにより調節される。関連する過程である血管形成では、組織中に既に存在する内皮細胞及び血管芽細胞が分化し、その後それらがともに結合して血管を形成する。
血管新生は、発生中に広範に起こり、外傷又は傷害後の組織への血流を回復させるために創傷治癒時にも健康な身体で起こる。しかし、血管新生は、癌及び腫瘍形成を含む、特定の疾患の発現にも関与している。実際、腫瘍組織における血管の量は、乳癌（非特許文献１）、前立腺癌（非特許文献２）、脳腫瘍（非特許文献３）及び黒色腫（非特許文献４）における強い負の予後指標である。血管新生はまた、最近、リウマチ学、皮膚科学、心臓病学及び眼科学を含む、医学の多くの分野で他の疾患状態に関与している。特に、望ましくない又は病的な組織特異的血管新生は、例えば、関節リウマチ、アテローム動脈硬化症、乾癬、糖尿病性網膜症及び黄班変性を含む、特定の疾患状態に関与している（例えば、非特許文献５；非特許文献６を参照）。さらに、血管透過性の変化は、正常及び病的生理過程のどちらにも役割を果たすと考えられる（非特許文献７；非特許文献８）。これらの疾患のそれぞれにおける血管新生過程は、発生上の血管新生及び腫瘍血管新生と多くの特徴を共有している可能性が高いが、それぞれが、周囲の細胞の影響により付与される特有の側面も有する可能性がある。
塩基性及び酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング成長因子アルファ及びベータ（ＴＧＦα、ＴＧＦβ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、アンジオゲニン、血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）並びに血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を含む、血管新生の複数の分子メディエーターが同定された。血管新生に関与する他の刺激因子には、アンジオポエチン−１、Ｄｅｌ−１、フォリスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、レプチン、ミッドカイン、胎盤成長因子、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、プログラヌリン、プロリフェリン及び腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−アルファ）がある。さらに、血管新生の制御は、アンジオアレスチン、アンジオスタチン（プラスミノーゲンフラグメント）、抗血管新生抗トロンビンＩＩＩ、軟骨由来阻害因子（ＣＤＩ）、ＣＤ５９補体フラグメント、エンドスタチン（コラーゲンＸＶＩＩＩフラグメント）、フィブロネクチンフラグメント、グロ−ベータ、ヘパリナーゼ、ヘパリンヘキササッカリドフラグメント、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、インターフェロンアルファ／ベータ／ガンマ、インターフェロン誘導タンパク質（ＩＰ−１０）、インターロイキン−１２、クリングル５（プラスミノーゲンフラグメント）、メタロプロテイナーゼ阻害因子（ＴＩＭＰ）、２−メトキシエストラジオール、胎盤リボヌクレアーゼ阻害因子、プラスミノーゲンアクチベーター阻害因子、血小板因子−４（ＰＦ４）、プロラクチン１６ｋＤフラグメント、プロリフェリン関連タンパク質（ＰＲＰ）、レチノイド、テトラヒドロコルチゾール−Ｓ、トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）、バスキュロスタチン及びバソスタチン（カルレチクリンフラグメント）を含む、身体により産生される血管新生の多くの負の調節因子によりさらに媒介される。
これらの血管形成調節因子のうち、ＶＥＧＦは、腫瘍成長に付随する異常な血管新生の正の調節因子として重要な役割を果たすと思われる（Ｂｒｏｗｎら、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ及びＲｏｓｅｎ編、１９９６年）；Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７１巻、６０３〜６０６頁、１９９６年に総説されている）。さらに、それが、時として壁細胞と呼ばれる血管周囲細胞、例えば、血管平滑筋、メサンギウム細胞及び周皮細胞の形成、拡大及び適切な機能に役割を果たすと思われるので、最近、シグナル伝達分子のＰＤＧＦファミリーの役割が検討されている。
ＩＩ．ＶＥＧＦ−Ａ
ＶＥＧＦ−Ａ（ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列はそれぞれ配列番号１及び２に示す）は、典型的なシスチンノット構造（シスチンにちなんで命名された、ジスルフィド結合により連結された２つのシステインの二量体）を形成する８つの保存システイン残基の存在によってすべてが特徴付けられる、ホルモン及び細胞外シグナル伝達分子のシスチンノットスーパーファミリーのＶＥＧＦ／ＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）群に属する分泌ジスルフィド結合ホモ二量体糖タンパク質である（Ｖｉｔｔら、Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１５巻、６８１〜６９４頁、２００１年）を参照）。異なるｍＲＮＡスプライス変異体によりコードされる長さが１２１、１４５、１６５、１８９又は２０６アミノ酸の５種のヒトＶＥＧＦ−Ａアイソフォーム（ＶＥＧＦ−Ａ１２１−２０６）が記載され、そのすべてが内皮細胞における有糸細胞分裂を刺激することができる。これらのアイソフォームは、生物学的活性、受容体特異性、並びにＶＥＧＦ−Ａに対する低親和性受容体として挙動する、細胞表面及び細胞外マトリックス結合ヘパラン硫酸プロテオグリカンに対する親和性が異なり、ＶＥＧＦ−Ａ１２１は、ヘパリン又はヘパラン硫酸に結合せず、ＶＥＧＦ−Ａ１４５及びＶＥＧＦ−Ａ１６５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ３２９７７）は、両方がヘパリンに結合することができ、ＶＥＧＦ−Ａ１８９及びＶＥＧＦ−Ａ２０６は、ヘパリン及びヘパラン硫酸に対する最も強い親和性を示す。ＶＥＧＦ−Ａ１６５の大部分は細胞表面及び細胞外マトリックスプロテオグリカンに局在化しているが、ＶＥＧＦ−Ａ１２１、ＶＥＧＦ−Ａ１４５及びＶＥＧＦ−Ａ１６５は、可溶性の形で分泌されるのに対して、ＶＥＧＦ−Ａ１８９及びＶＥＧＦ−Ａ２０６は、細胞外マトリックスに結合したままである。ＶＥＧＦ−Ａ１８９及びＶＥＧＦ−Ａ２０６は、ヘパリン又はヘパリナーゼによる処理によって放出させることができることから、これらのアイソフォームはプロテオグリカンを介して細胞外マトリックスに結合していることが示唆される。細胞結合ＶＥＧＦ−Ａ１８９は、プラスミンなどのプロテアーゼによっても切断することができ、活性な可溶性ＶＥＧＦ−Ａ１１０の放出がもたらされる。
ＶＥＧＦ−Ａ１２１及びＶＥＧＦ−Ａ１６５が優勢な形であるのに対して、ＶＥＧＦ−Ａ２０６はまれに検出されるものであるが、ＶＥＧＦ−Ａを発現する大部分の組織は、いくつかのＶＥＧＦ−Ａアイソフォームを同時に発現することが認められる（Ｆｅｒｒａｒａ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｍｅｄ．、７７巻、５２７〜５４３頁、１９９９年を参照）。ＶＥＧＦ−Ａ１４５は、生殖器官に由来する細胞において主として発現する点が異なる（Ｎｅｕｆｅｌｄら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．、１３巻、９〜２２頁、１９９９年を参照）。最も豊富で、生物学的に活性な形であるヒトＶＥＧＦ−Ａ１６５は、Ａｓｎ７４においてグリコシル化されており、２３ｋＤａサブユニットの４６ｋＤａホモ二量体として一般的に発現する。
ＶＥＧＦ−Ａと相互作用する４つの細胞表面受容体が同定された。これらは、ＶＥＧＦＲ−１／Ｆｌｔ−１（ｆｉｎｓ様チロシンキナーゼ−１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ５１６０２；Ｄｅ Ｖｒｉｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５５巻、９８９〜９９１頁、１９９２年）；ＶＥＧＦＲ−２／ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１（キナーゼ挿入ドメイン含有受容体／胎児肝キナーゼ−１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ５９３９７（Ｆｌｋ−１）及びＬ０４９４７（ＫＤＲ）；Ｔｅｒｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．、１８７巻、１５７９〜１５８６頁、１９９２年；Ｍａｔｔｈｅｗｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８８巻、９０２６〜９０３０頁、１９９１年）；ニューロピリン−１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ００３８７３）及びニューロピリン−２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ００３８７２）である。ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１６５は、ＶＥＧＦＲ−１に結合し、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５及びＶＥＧＦ１６５は、ＶＥＧＦＲ−２に結合し、ＶＥＧＦ１６５は、ニューロピリン−１に結合し、ＶＥＧＦ１６５及びＶＥＧＦ１４５は、ニューロピリン−２に結合する。例えば、Ｎｅｕｆｅｌｄら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．、１３巻、９〜２２頁、１９９９年；Ｓｔａｃｋｅｒ及びＡｃｈｅｎ、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、１７巻、１〜１１頁、１９９９年；Ｏｒｔｅｇａら、Ｆｒｏｎ． Ｂｉｏｓｃｉ．、４巻、１４１〜１５２頁、１９９９年；Ｚａｃｈａｒｙ、Ｉｎｔｌ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、３０巻、１１６９〜１１７４頁、１９９８年；Ｐｅｔｒｏｖａら、Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．、２５３巻、１１７〜１３０頁、１９９９年を参照。
ＶＥＧＦ−Ａにより駆動される血管新生は、癌、眼障害及び関節リウマチを含む、種々のヒト疾患の病因で主要な役割を有する。Ｃａｒｍｅｌｉｅｔら、Ｎａｔｕｒｅ、４０７巻、２４９〜２５７頁、２０００年を参照。いくつかの重要なクラスの癌の発生におけるＶＥＧＦ−Ａの重要性が認識された結果、最近、転移性結腸直腸癌の治療用のＶＥＧＦ−Ａに対するヒト化モノクローナル抗体であるＡＶＡＳＴＩＮ（商標）が承認された。Ｆｅｒｒａｒａら、Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２００４年、３巻、３９１〜４００頁、２００４年を参照。同様に、新生血管眼障害の病因におけるＶＥＧＦ−Ａの重要性は、新生血管（湿性）加齢性黄班変性（ＡＭＤ）の治療用のヒト化モノクローナル抗体フラグメントであるＬＵＣＥＮＴＩＳ（商標）の最近の承認に反映されている。
ＩＩＩ． ＰＤＧＦＲβ
ＰＤＧＦＲβ（血小板由来成長因子受容体β；（ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列はそれぞれ配列番号３及び４に示す）は、種々の血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）アイソフォーム、すなわち、ＰＤＧＦ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ及び−Ｄの生物学的活性を媒介する２つの構造的に関連した細胞表面受容体チロシンキナーゼ（ＰＤＧＦＲα及びＰＤＧＦＲβ）の１つである。ＰＤＧＦは、先に示したように、典型的なシスチンノット構造を形成する８つの保存システイン残基の存在によって特徴付けられる、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）ファミリーに属する。転写物の異なるスプライシングに起因する１９６及び２１１アミノ酸残基を含む、２つの形のＰＤＧＦ−Ａ鎖は、合成され、二量体化され、Ｎ末端がタンパク質分解によりプロセシングされ、約３０ｋＤａの二量体として細胞から分泌される（Ｂｏｎｔｈｒｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８５巻、１４９２〜１４９６頁、１９８８年）；Ｒｏｒｓｍａｎら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、８巻、５７１〜５７７頁、１９８８年）。２４１アミノ酸残基をコードするＰＤＧＦ−Ｂ鎖は、二量体化され、さらなるタンパク質分解によりプロセシングされ、２４ｋＤａの二量体として分泌される（Ｏｓｔｍａｎら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６３巻、１６２０２〜１６２０８頁、１９８８年；Ｏｓｔｍａｎら、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、１１８巻、５０９〜５１９頁、１９９２年）。Ａ及びＢ鎖は、互いにホモ二量体とヘテロ二量体（ＰＤＧＦ−ＡＡ、−ＢＢ及び−ＡＢ）をどちらも形成することができる。全長ＰＤＧＦ−Ｃ及び−Ｄタンパク質は、それぞれ３４５及び３７０アミノ酸残基を含み、両方がＮ末端ＣＵＢドメイン及びＣ末端ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦドメインを含む特有の２ドメイン構造を有する。ＰＤＧＦ Ｃ及びＤのプロフォームは、Ｎ末端の２２シグナルペプチド残基の切断の後に約８５ｋＤａのホモ二量体として分泌される。分泌されたＰＤＧＦ−ＡＡ、−ＢＢ及び−ＡＢは、それらの細胞表面受容体を容易に活性化することができるが、ＰＤＧＦ−ＣＣ及び−ＤＤホモ二量体の成長因子ドメインが細胞表面受容体を活性化するためには、ＣＵＢドメインのタンパク質分解除去が必要である。
両方のＰＤＧＦＲ（ＰＤＧＦＲα及びＰＤＧＦＲβ）が、５つの細胞外免疫グロブリン様ドメイン、すなわち、膜貫通ドメイン、膜近傍ドメイン、スプリットキナーゼドメイン、キナーゼ挿入ドメイン及び細胞質尾部を含む。これらの２つの受容体は、リガンド結合ドメインで３１％の同一性、キナーゼ挿入で２７％の同一性及びＣ末端で２８％の同一性を共有しているが、キナーゼ挿入ドメインの２つの半分については８５％及び７５％同一である（Ｍａｔｓｕｉら、１９８９年；Ｒｏｓｅｎｋｒａｎｚ及びＫａｚｉａｕｓｋａｓ、１９９９年）。３つの二量体ＰＤＧＦ受容体（αα、αβ、ββ）は、ＰＤＧＦアイソフォーム特異的シグナル伝達を媒介する。ＰＤＧＦ−ＡＡは、ＰＤＧＦＲααのみを有効に活性化し、ＰＤＧＦ−ＡＢは、ＰＤＧＦＲαα又はＰＤＧＦＲαβを活性化することができるが、ＰＤＧＦ−ＢＢは、３つの二量体ＰＤＧＦ受容体のすべてを活性化する（Ｃｌａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、８巻、３４７６〜３４８６頁、１９８８年；ＭａｔｓｕｉらＳｃｉｅｎｃｅ、２４３巻、８００〜８０４頁、１９８９年）；Ｃｌａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６９巻、３２０２３〜３２０２６頁、１９９４年）。ＰＤＧＦ−ＣＣの成長因子ドメインは、ＰＤＧＦＲαα及びＰＤＧＦＲαβの両方を活性化し、ＰＤＧＦ−ＤＤの成長因子ドメインは、ＰＤＧＦＲββ及びＰＤＧＦＲαβを活性化する（Ｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、２巻、３０２〜３０９頁、２０００年；Ｂｅｒｇｓｔｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、３巻、５１２〜５１６頁、２００１年；Ｇｉｌｂｅｒｔｓｏｎら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７６巻、２７４０６〜２７４１４頁、２００１年；ＬａＲｏｃｈｅｌｌｅら、Ｎａｔ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、３巻、５１７〜５２１頁、２００１年を参照）。
血管における内皮細胞により産生されるＰＤＧＦは、ＰＤＧＦＲを発現する血管平滑筋細胞／周皮細胞祖先の動員及び増殖を促進する（Ｂｅｔｓｈｏｌｔｚら、２００１年）。ＰＤＧＦ／ＰＤＧＦＲパラクリンシグナル伝達ループにより媒介される走化及び分裂促進活性は、血管の形成、分枝及び維持に極めて重要である。胚形成の場合と同様に、ＰＤＧＦは、ヒト腫瘍における血管新生に重要な役割を果たす。腫瘍の増殖及び転移に必要な腫瘍血管新生は、多くの異なる細胞型及び細胞外因子が関係する複雑で、高度に調節された過程である。内皮細胞及び平滑筋細胞は、血管の主要な成分であり、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーメンバーは、腫瘍血管新生のとりわけ極めて重要なメディエーターである。臨床試験により、腫瘍における血管数とＶＥＧＦ及びＰＤＧＦの発現頻度との間の相関が明らかになった（Ａｎａｎら、Ｓｕｒｇｅｒｙ、１１９巻、３３３〜３３９頁、１９９６年）。ＰＤＧＦは、血管新生過程を直接的及び間接的に刺激する。腫瘍細胞により放出されるＰＤＧＦは、内皮細胞及び血管平滑筋細胞（ｖＳＭＣ）の移動を誘発し、これらの細胞の増殖も誘発することから、血管新生におけるＰＤＧＦの直接的な役割が示唆される（Ｔｈｏｍｍｅｎら、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６４巻、４０３〜４１３頁、１９９７年）。ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦＲβ発現内皮細胞によるＶＥＧＦ−Ａの転写及び分泌を誘発することが示され、ＰＤＧＦ誘発性血管新生に対する間接的な役割が示唆される（Ｗａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５９巻、１４６４〜１４７２頁、１９９９年）。ＰＤＧＦはまた、腫瘍血管新生過程における内皮細胞とｖＳＭＣ／周皮細胞との間のパラクリンシグナル伝達ループを媒介する。ＰＤＧＦ−ＢＢ、−ＡＢ及びＰＤＧＦ−ＣＣの成長因子ドメインは、マウス角膜アッセイにおいて区別できない血管新生反応を誘導するが、ＰＤＧＦ−ＡＡ（ＰＤＧＦＲααに結合するが、ＰＤＧＦＲαβ又はＰＤＧＦＲββに結合しない）は、弱い反応のみを刺激する（Ｃａｏら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．、１６巻、１５７５〜１５８３頁、２００２年））。これは、ＰＤＧＦＲα及びＰＤＧＦＲβが異なる形で血管新生過程を調節することを示唆するものであり、ＰＤＧＦＲβサブユニットが特にＰＤＧＦ誘発性血管新生の重要なメディエーターであるという証拠となるものである、
腫瘍細胞におけるオートクライン成長因子シグナル伝達、腫瘍及び眼血管新生並びに腫瘍又は眼疾患組織における間質細胞、すなわち線維芽細胞の調節の動員を含む、ＰＤＧＦ受容体シグナル伝達は、上述の疾患状態における様々な過程に関連づけられている。ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＰＤＧＦファミリーのほぼすべてのリガンドの発現は、細胞の癌性表現型への形質転換につながる（Ｏｓｔｍａｎ及びＨｅｌｄｉｎ、Ａｄｖ ｉｎ Ｃａｎ Ｒｅｓ、９７巻、２４７〜７４頁、２００７年に総説されている）。この裏づけとして、種々のＰＤＧＦリガンド及び受容体の共発現が様々な癌を含む複数の疾患において示された（Ｏｓｔｍａｎ、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ａｎｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．、１５巻、２７５〜８６頁、２００４年に総説されている）。さらに、ＰＤＧＦ又はＰＤＧＦ受容体の突然変異的活性化が、隆起性皮膚線維肉腫（ＤＦＳＰ）、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）及びＢｃｒ−Ａｂｌ陰性慢性骨髄性白血病を含む、種々の悪性腫瘍と関連することが今や示された（Ｏｓｔｍａｎ及びＨｅｌｄｉｎ、Ａｄｖ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、９７巻、２４７〜７４頁、２００７年に総説されている）。ＰＤＧＦファミリーは、特に腫瘍及び眼血管系への周皮細胞及び血管平滑筋細胞の動員に関して、腫瘍血管新生において重要な役割を果たすことも示された。これらの壁細胞（周皮細胞及び平滑筋細胞）は、血管内皮細胞の成長のための支えとなるフレームワークとなると考えられる。ＰＤＧＦＲβは、腫瘍血管系への周皮細胞の動員及び間葉幹細胞の周皮細胞への分化に必須であることが示された（Ｓｏｎｇら、Ｎａｔ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、７巻、８７０〜７９頁、２００５年；Ｂｅｒｇｅｒｓら、Ｎｅｕｒｏ． Ｏｎｃｏｌ．、７巻、４５２〜６４頁、２００５年）。ＰＤＧＦＲアンタゴニストは、周皮細胞の動員を阻害することによってだけでなく、腫瘍内の内皮細胞の存在を減少させることによっても血管新生を阻害することが示された（Ｂｅｒｇｅｒｓら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．、１１１巻、１２８７〜９５頁、２００３年）。さらに、ＰＤＧＦ及びＰＤＧＦ受容体は、腫瘍間質、すなわち、種々の癌の内部の線維芽細胞において著しく発現し、複数の実験で、腫瘍内の間質細胞の動員におけるＰＤＧＦ−ＢＢ並びにＰＤＧＦＲβ及びＰＤＧＦＲα受容体の極めて重要な役割が示された（Ｏｓｔｍａｎ及びＨｅｌｄｉｎ、Ａｄｖ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、９７巻、２４７〜７４頁、２００７年に総説されている）。一連の最近の研究で、腫瘍の経血管輸送の調節におけるこれらの受容体の機能が示されている。今やその複数の証拠は、経血管輸送を決定づける重要なパラメーターである、腸液圧力（ＩＦＰ）の調節におけるＰＤＧＦ及びＰＤＧＦＲの役割を裏づけるものである。大部分の固形腫瘍は、毛細血管壁を横切る輸送速度の低下及び腫瘍による薬物（化学療法）の取込みの減少をもたらす、高いＩＦＰによって特徴付けられる。ＰＤＧＦ受容体アンタゴニストは、腫瘍ＩＦＰを低下させ、それにより、より良好な抗腫瘍効果につながる、腫瘍内の薬物の取込みの増加を可能にすることが示された（Ｐｉｅｔｒａｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６２巻、５４７６〜８４頁、２００２年；Ｐｉｅｔｒａｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６１巻、２９２９〜３４頁、２００１年）。したがって、ＰＤＧＦＲアンタゴニストは、腫瘍細胞に対するオートクライン効果、血管新生及び腫瘍間質により媒介されるＩＦＰへの影響を含む、腫瘍血管系内の複数の過程を阻害する方法を提供する。他の薬物、すなわち、ＶＥＧＦアンタゴニストのような抗血管新生阻害薬及び／又は化学療法薬との併用は、癌患者にさらなる利益を提供する可能性がある。
ＩＶ．ＶＥＧＦ及びＰＤＧＦ経路の阻害
ＡＶＡＳＴＩＮ（商標）を含む抗血管新生療法が様々な癌について承認された（及びＡＭＤ用のＬＵＣＥＮＴＩＳ（商標））が、有効性は中等度であり、患者は最終的に進行する。有効性を制限する１つの因子は、これらの療法によって阻害されない他の血管新生経路の存在である。マウスモデルにおいて、ＰＤＧＦＲβ発現周皮細胞がＶＥＧＦアンタゴニストを投与した腫瘍に認められ、これらが、新たに形成された内皮細胞が腫瘍内で成長するためのフレームワークとなることが最近示された（非特許文献９）。ＶＥＧＦ及びＰＤＧＦＲ経路の両方を阻害することは、疾患状態における相加的又は相乗的な血管新生阻害をもたらす可能性があり、癌においては、血管及びＩＦＰを正常化することによって化学療法薬の送達の増大をもたらす可能性がある。
科学的証拠がこの治療アプローチを裏づけている。データは、ＰＤＧＦＲ及びＶＥＤＦＲシグナル伝達の両方を同時に標的とすることが、血管内皮の成長をより効果的に阻害し、前臨床疾患モデルにおける腫瘍の成長の阻害により有効であることを示すものである。自発性膵臓腫瘍モデル（ＲＩＰ−Ｔａｇ）において、Ｂｅｒｇｅｒｓと共同研究者らは、ＶＥＧＦ阻害薬（ＳＵ５４１６）及びＰＤＧＦ阻害薬（ＳＵ６６６８又はイマチニブ）の併用で、腫瘍の進行中後期（ＩＴ又はＲＴ）に投与した場合に膵臓腺癌の成長が阻害されたが、ＶＥＧＦ阻害単独では、初期の疾患状態（ＰＴ及びＩＴ）において用いた場合にのみ有効であったことを示した（Ｂｅｒｇｅｒｓら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．、１１１巻、１２８７〜９５頁、２００３年）。腫瘍の成長の減少は、腫瘍関連の内皮細胞及び周皮細胞の減少と血管新生の阻害を伴っていた。同様に、膵臓異種移植モデル（ＢｘＰＣ−３）において、抗ＰＤＧＦＲβ及びＶＥＧＦＲ２抗体の両方の投与は、単剤療法治療法と比較して有意な抗腫瘍効果を示した（Ｓｈｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ、３５７巻、１１４２〜４７頁、２００７年）。Ｐｉｅｔｒａｓと共同研究者らは、抗ＶＥＧＦ及び抗ＰＤＧＦ療法を化学療法と併用した場合に有効性がＲＩＰ−Ｔａｇ膵臓モデルにおいて実質的により高いことをさらに示した（Ｐｉｅｔｒａｓ及びＨａｎａｈａｎ、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ．、２３巻、９３９〜５２頁、２００５年）。ＰＤＧＦＲ及びＶＥＧＦＲ阻害薬を併用する併用療法の有効性は、卵巣癌異種移植モデルにおいても実証された（Ｌｕら、Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１３巻、４２０９〜１７頁、２００７年）。これらのデータは、腫瘍学における両経路を標的とすることに関して強い概念の実証根拠を提供している。さらに、これらの経路の複合標的化により、げっ歯類眼モデルにおける新生血管形成が阻害されることも示され（Ｊｏら、Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．、１６８巻、２０３６〜５３頁、２００６年）、ＡＭＤを含む眼病適応症における可能な有効性の前臨床的裏づけとなっている。
Ｗｅｉｄｎｅｒら、Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．、１９９２年、８４巻、１８７５〜１８８７頁 Ｗｅｉｄｎｅｒら、Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．、１９９３年、１４３巻、４０１〜４０９頁 Ｌｉら、Ｌａｎｃｅｔ、１９９４年、３４４巻、８２〜８６頁 Ｆｏｓｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９９６年、５６巻、２９００〜２９０３頁 Ｆａｎら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｃｉ．、１９９５年、１６巻、５７頁 Ｆｏｌｋｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．、１９９５年、１巻、２７頁 Ｃｕｌｌｉｎａｎ−Ｂｏｖｅら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１９９３年、１３３巻、８２９頁 Ｓｅｎｇｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１９９３年、１２巻、３０３頁 Ｍａｎｃｕｓｏら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．、２００６年、１１６巻、２６１０〜２１頁
１つの態様において、本発明は、ＰＤＧＦＲβの細胞外ドメインに特異的に結合し、ＰＤＧＦＲβ活性を中和する抗体を提供する。いくつかの実施形態において、中和抗ＰＤＧＦＲβは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＬドメイン並びにＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＨドメインを含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号４３３に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号４３４に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号４３５に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１は、配列番号４３６に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号４３７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号４３８〜４４２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。いくつかのそのような実施形態において、ＬＣＤＲ１は、配列番号４３３に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号４４４に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１は、配列番号４４５に示すアミノ酸配列を有する。他のそのような実施形態において、ＬＣＤＲ１は、配列番号４４３に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号４４４に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１は、配列番号４４６に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号４４７に示すアミノ酸配列を有する。いくつかの変形形態において、ＬＣＤＲ１は、配列番号４４３に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号４４４に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１は、配列番号４４６に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号４４７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号４４１〜４４２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
他の実施形態において、中和抗ＰＤＧＦＲβは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＬドメイン並びにＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＨドメインを含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号４３３に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号４３４に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号４３５に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ（ａ）配列番号８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０、（ｂ）配列番号１２の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０、（ｃ）配列番号２４の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１１、（ｄ）配列番号３６の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０、又は（ｅ）配列番号４８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１１に示すアミノ酸配列を有する。
他の実施形態において、中和抗ＰＤＧＦＲβは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＬドメイン並びにＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＨドメインを含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号４３３に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号６又は１０の残基５６〜６２に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号６、１０又は４６の残基９５〜１０３に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１は、配列番号８、１２、２４、３６又は４８の残基３１〜３５に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号８、１２、２４、３６又は４８の残基５０〜６６に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号４３８〜４４２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。いくつかのそのような変形形態において、（ａ）ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号６の残基５６〜６２及び残基９５〜１０３に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０に示すアミノ酸配列を有する、（ｂ）ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１０の残基５６〜６２及び残基９５〜１０３に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１２の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０に示すアミノ酸配列を有する、（ｃ）ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２２の残基５６〜６２及び残基９５〜１０３に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２４の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１１に示すアミノ酸配列を有する、（ｄ）ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号３４の残基５６〜６２及び残基９５〜１０３に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号３６の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０に示すアミノ酸配列を有する、（ｅ）ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号３８の残基５６〜６２及び残基９５〜１０３に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４０の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０に示すアミノ酸配列を有する、又は（ｆ）ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４６の残基５６〜６２及び残基９５〜１０３に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１１に示すアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ＬＣＤＲ１は、配列番号４３３に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号６の残基５６〜６２に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号６の残基９５〜１０３に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１は、配列番号８又は１２の残基３１〜３５に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号８又は１２の残基５０〜６６に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号８又は１２の残基９９〜１１０に示すアミノ酸配列を有する。
上のような中和抗ＰＤＧＦＲβ抗体の特定の変形形態において、ＶＬ及びＶＨドメインは、それぞれ配列番号６及び８；配列番号１０及び１２；配列番号２２及び２４；配列番号３４及び３６；配列番号３８及び４０；又は配列番号４６及び４８に示すアミノ酸配列を含む。
他の実施形態において、中和抗ＰＤＧＦＲβは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＬドメイン並びにＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＨドメインを含み、ＶＬ及びＶＨのＣＤＲの前記組が、（ａ）それぞれ配列番号６の残基２４〜４０、残基５６〜６２及び残基９５〜１０３に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、（ｂ）それぞれ配列番号１０の残基２４〜４０、残基５６〜６２及び残基９５〜１０３に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号１２の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、（ｃ）それぞれ配列番号２２の残基２４〜４０、残基５６〜６２及び残基９５〜１０３に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号２４の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１１に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、（ｄ）それぞれ配列番号３４の残基２４〜４０、残基５６〜６２及び残基９５〜１０３に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号３６の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、（ｅ）それぞれ配列番号４６の残基２４〜４０、残基５６〜６２及び残基９５〜１０３に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号４８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１１に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３からなる群より選択されるＣＤＲの第２の組に対して３つ以下のアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態において、抗体は、ＣＤＲの前記組における０個、１個又は２個のアミノ酸置換を含む。
さらに他の実施形態において、中和抗ＰＤＧＦＲβ抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＬドメイン並びにＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＨドメインを含み、ＶＬ及びＶＨのＣＤＲの前記組が、ＬＣＤＲ１が配列番号１８の残基２４〜３４に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２が配列番号１８の残基５０〜５６に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３が配列番号１８の残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１が配列番号２０の残基３１〜３５に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２が配列番号２０の残基５０〜６６に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３が配列番号２０の残基９９〜１１５に示すアミノ酸配列を有するＣＤＲの第２の組に対して３つ以下のアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態において、抗体は、ＣＤＲの前記組における０個、１個又は２個のアミノ酸置換を含む。特定の変形形態では、抗体は、前記ＣＤＲに０個のアミノ酸置換を含む。具体的な実施形態において、ＶＬドメインは、配列番号１８に示すアミノ酸配列を含み、ＶＨドメインは、配列番号２０に示すアミノ酸配列を含む。
さらに他の実施形態において、中和抗ＰＤＧＦＲβ抗体は、配列番号４の残基２５１〜２７０に示すＰＤＧＦＲβのポリペプチド領域内に含まれる１つ又は複数のアミノ酸を含むエピトープに結合する。このエピトープ特異性を有する例示的な抗ＰＤＧＦＲβ抗体は、次のＶＬ／ＶＨ配列対から選択されるそれぞれのＶＬ及びＶＨアミノ酸配列を有する軽及び重鎖可変ドメインを含む抗体を含む；配列番号６及び８；配列番号１０及び１２；配列番号２２及び２４；並びに配列番号４６及び４８。特定の実施形態において、エピトープは、配列番号４のアミノ酸残基１９６〜２０５又は１９１〜２１０に示すＰＤＧＦＲβの第２のポリペプチド領域内に含まれる１つ又は複数のアミノ酸をさらに含む。このクラスの例示的な抗ＰＤＧＦＲβ抗体は、次のＶＬ／ＶＨ配列対から選択されるそれぞれのＶＬ及びＶＨアミノ酸配列を有する軽及び重鎖可変ドメインを含む抗体を含む；配列番号２２及び２４；並びに配列番号４６及び４８。特定の実施形態において、抗ＰＤＧＦＲβエピトープは、オーバーラップしているＰＤＧＦＲβ（配列番号４）２０ｍｅｒペプチドの使用を含むペプチドマイクロアレイエピトープマッピングにより決定されるエピトープである。
特定の変形形態において、上のような中和抗ＰＤＧＦＲβ抗体は、ＶＥＧＦ−Ａにも結合する二重特異性抗体である。好ましい変形形態において、二重特異性抗体は、ＶＥＧＦ−Ａを中和する。
他の態様において、本発明は、ＶＥＧＦ−Ａに特異的に結合し、ＶＥＧＦ−Ａ活性を中和する抗体を提供する。いくつかの実施形態において、中和抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＬドメイン並びにＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＨドメインを含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号４４８に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号４４９に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号４５０に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１は、配列番号４５１に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号４５２に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号４５３〜４６１からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、ＬＣＤＲ１は、配列番号４６２に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号４６４に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号４６６に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１は、配列番号４６８に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号４７０に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号４５３〜４５９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。いくつかのそのような実施形態において、（ａ）ＬＣＤＲ１及びＬＣＤＲ２は、それぞれ配列番号１７０の残基２４〜３４及び残基５０〜５６に示すアミノ酸配列を有する、（ｂ）ＬＣＤＲ１及びＬＣＤＲ２は、それぞれ配列番号２４２の残基２４〜３４及び残基５０〜５６に示すアミノ酸配列を有する、（ｃ）ＬＣＤＲ１及びＬＣＤＲ２は、それぞれ配列番号２７８の残基２４〜３４及び残基５０〜５６に示すアミノ酸配列を有する、（ｄ）ＬＣＤＲ１及びＬＣＤＲ２は、それぞれ配列番号３０６の残基２４〜３４及び残基５０〜５６に示すアミノ酸配列を有する、（ｅ）ＬＣＤＲ１及びＬＣＤＲ２は、それぞれ配列番号３２２の残基２４〜３４及び残基５０〜５６に示すアミノ酸配列を有する、（ｆ）ＬＣＤＲ１及びＬＣＤＲ２は、それぞれ配列番号３３０の残基２４〜３４及び残基５０〜５６に示すアミノ酸配列を有する、（ｇ）ＬＣＤＲ１及びＬＣＤＲ２は、それぞれ配列番号３７４の残基２４〜３４及び残基５０〜５６に示すアミノ酸配列を有する、（ｈ）ＬＣＤＲ１及びＬＣＤＲ２は、それぞれ配列番号３９４の残基２４〜３４及び残基５０〜５６に示すアミノ酸配列を有する、又は（ｉ）ＬＣＤＲ１及びＬＣＤＲ２は、それぞれ配列番号４２６の残基２４〜３４及び残基５０〜５６に示すアミノ酸配列を有する。上のような抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体の特定の変形形態において、ＨＣＤＲ１は、配列番号１７２、２４４、２８０、３０８又は３２４の残基３１〜３５に示すアミノ酸配列を有する。上のような抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体の他の変形形態において、ＨＣＤＲ１は、配列番号２８０の残基３１〜３５に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号２８０、３７６又は４２８の残基５０〜６６に示すアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、中和抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＬドメイン並びにＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＨドメインを含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号４６３に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号４６５に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号４６７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１は、配列番号２８０の残基３１〜３５に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号２８０の残基５０〜６６に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号４５３〜４５９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ＨＣＤＲ３は、配列番号４５３、４５８及び４５９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
他の実施形態において、中和抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＬドメイン並びにＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＨドメインを含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号１７０、３３０、３９４又は４２６の残基２４〜３４に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号１７０、２４２、３２２、３３０、３９４又は４２６の残基５０〜５６に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号１７０、２４２、２７８、３９４又は４２６の残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１は、配列番号１７２、２４４、２８０、３０８又は３２４の残基３１〜３５に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号１７２、２４４、２８０又は３２４の残基５０〜６６に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号４５３〜４５９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。いくつかのそのような実施形態において、（ａ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１７０の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１７２の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０２に示すアミノ酸配列を有する、（ｂ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２４２の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２４４の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０７に示すアミノ酸配列を有する、（ｃ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２７８の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２８０の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０に示すアミノ酸配列を有する、（ｄ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号３０６の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号３０８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０に示すアミノ酸配列を有する、（ｅ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号３２２の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号３２４の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１１に示すアミノ酸配列を有する、（ｆ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号３３０の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号３３２の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０２に示すアミノ酸配列を有する、（ｇ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号３７４の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号３７６の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０８に示すアミノ酸配列を有する、（ｈ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号３９４の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号３９６の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０２に示すアミノ酸配列を有する、又は（ｉ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４２６の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４２８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０７に示すアミノ酸配列を有する。特定の変形形態において、ＶＬ及びＶＨドメインは、それぞれ配列番号１７０及び１７２；配列番号２４２及び２４４；配列番号２７８及び２８０；配列番号３０６及び３０８；配列番号３２２及び３２４；配列番号３３０及び３３２；配列番号３７４及び３７６；配列番号３９４及び３９６；又は配列番号４２６及び４２８に示すアミノ酸配列を含む。
他の実施形態において、中和抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＬドメイン並びにＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＨドメインを含み、ＶＬ及びＶＨのＣＤＲの前記組は、（ａ）それぞれ配列番号１７０の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号１７２の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０２に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、（ｂ）それぞれ配列番号２４２の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号２４４の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０７に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、（ｃ）それぞれ配列番号２７８の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号２８０の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、（ｄ）それぞれ配列番号３０６の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号３０８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、（ｅ）それぞれ配列番号３２２の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号３２４の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１１に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、（ｆ）それぞれ配列番号３３０の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号３３２の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０２に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、（ｇ）それぞれ配列番号３７４の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号３７６の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０８に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、（ｈ）それぞれ配列番号３９４の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号３９６の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０２に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに（ｉ）それぞれ配列番号４２６の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号４２８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０７に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３からなる群より選択されるＣＤＲの第２の組に対して３つ以下のアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態において、抗体は、ＣＤＲの前記組における０個、１個又は２個のアミノ酸置換を含む。
さらに他の実施形態において、中和抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＬドメイン並びにＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＨドメインを含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号４６２に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号４６３に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号４６４及び４６５からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１は、配列番号４６６に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号４６７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号４６８〜４７０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。いくつかのそのような実施形態において、ＬＣＤＲ１は、配列番号４７１に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号４７４に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１は、配列番号４７７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号４７８に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号４６８及び４６９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
特定の変形形態において、中和抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＬドメイン並びにＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＨドメインを含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号４７２に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号４７５に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号４６４及び４６５からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１は、配列番号４７７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号４７８に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号４６８及び４６９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２４８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０２に示すアミノ酸配列を有する。いくつかのそのような実施形態において、ＬＣＤＲ２は、配列番号４７９に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号４８０に示すアミノ酸配列を有する。
他の実施形態において、中和抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＬドメイン並びにＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＨドメインを含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号２１４、２４６、２７４、２８６、３１０、３３８又は３５４の残基２３〜３５に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号２１４、２４６、２７４、２８６、３１０、３３８又は３５４の残基５１〜５７に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号４６５に、又は、配列番号２１４、２４６、２７４、２８６、３１０若しくは３３８の残基９０〜１００に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１は、配列番号２１６、２４８又は３５６の残基３１〜３５に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号２１６、２４８又は３５６の残基５０〜６６に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号４６８〜４７０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、（ａ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２１４の残基２３〜３５、残基５１〜５７及び残基９０〜１００に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２１６の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０に示すアミノ酸配列を有する、（ｂ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２４６の残基２３〜３５、残基５１〜５７及び残基９０〜１００に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２４８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０２に示すアミノ酸配列を有する、（ｃ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２７４の残基２３〜３５、残基５１〜５７及び残基９０〜１００に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２７６の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０２に示すアミノ酸配列を有する、（ｄ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２８６の残基２３〜３５、残基５１〜５７及び残基９０〜１００に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２８８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０２に示すアミノ酸配列を有する、（ｅ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号３１０の残基２３〜３５、残基５１〜５７及び残基９０〜１００に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号３１２の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０２に示すアミノ酸配列を有する、（ｆ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号３３８の残基２３〜３５、残基５１〜５７及び残基９０〜１００に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号３４０の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０２に示すアミノ酸配列を有する、或いは（ｇ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号３５４の残基２３〜３５、残基５１〜５７及び残基９０〜１０６に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号３５６の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０７に示すアミノ酸配列を有する。特定の変形形態において、ＶＬ及びＶＨドメインは、それぞれ配列番号２１４及び２１６；配列番号２４６及び２４８；配列番号２７４及び２７６；配列番号２８６及び２８８；配列番号３１０及び３１２；配列番号３３８及び３４０；又は配列番号３５４及び３５６に示すアミノ酸配列を含む。
他の実施形態において、中和抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＬドメイン並びにＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＨドメインを含み、ＶＬ及びＶＨのＣＤＲの前記組は、（ａ）それぞれ配列番号２１４の残基２３〜３５、残基５１〜５７及び残基９０〜１００に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号２１６の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、（ｂ）それぞれ配列番号２４６の残基２３〜３５、残基５１〜５７及び残基９０〜１００に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号２４８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０２に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、（ｃ）それぞれ配列番号２７４の残基２３〜３５、残基５１〜５７及び残基９０〜１００に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号２７６の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０２に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、（ｄ）それぞれ配列番号２８６の残基２３〜３５、残基５１〜５７及び残基９０〜１００に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号２８８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０２に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、（ｅ）それぞれ配列番号３１０の残基２３〜３５、残基５１〜５７及び残基９０〜１００に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号３１２の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０２に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、（ｆ）それぞれ配列番号３３８の残基２３〜３５、残基５１〜５７及び残基９０〜１００に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号３４０の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０２に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに（ｇ）それぞれ配列番号３５４の残基２３〜３５、残基５１〜５７及び残基９０〜１０６に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号３５６の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０７に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３からなる群より選択されるＣＤＲの第２の組に対して３つ以下のアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態において、抗体は、ＣＤＲの前記組における０個、１個又は２個のアミノ酸置換を含む。
特定の実施形態において、中和抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、（ａ）配列番号２のアミノ酸残基４２〜５２に示すＶＥＧＦ−Ａの第１のポリペプチド領域内に含まれる１つ又は複数のアミノ酸及び（ｂ）配列番号２のアミノ酸残基７２〜８２に示すＶＥＧＦ−Ａの第２のポリペプチド領域内に含まれる１つ又は複数のアミノ酸を含むエピトープに結合する。このエピトープ特異性を有する例示的な抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、次のＶＬ／ＶＨ配列対から選択されるそれぞれのＶＬ及びＶＨアミノ酸配列を有する軽及び重鎖可変ドメインを含む抗体を含む：配列番号１７０及び１７２；配列番号２４２及び２４４；配列番号２４６及び２４８；並びに配列番号２７８及び２８０。
上のような（ａ）及び（ｂ）を含むエピトープに結合する抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体の特定の実施形態において、エピトープは、配列番号２の残基９０〜１３２（ＥＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣＲＰ）に示すＶＥＧＦ−Ａのポリペプチド領域内に含まれるアミノ酸を含まない。このクラスの例示的な抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、それぞれ配列番号２４６及び２４８に示すアミノ酸配列を有する軽及び重鎖可変ドメインを含む。
上のような（ａ）及び（ｂ）を含むエピトープに結合する抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体の他の実施形態において、エピトープは、（ｃ）配列番号２の残基９８〜１１４に示すＶＥＧＦ−Ａの第３のポリペプチド領域内に含まれる１つ又は複数のアミノ酸をさらに含む。このクラスの例示的な抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、次のＶＬ／ＶＨ配列対から選択されるそれぞれのＶＬ及びＶＨアミノ酸配列を有する軽及び重鎖可変ドメインを含む抗体を含む：配列番号１７０及び１７２；配列番号２４２及び２４４；並びに配列番号２７８及び２８０。
上のような（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むエピトープに結合する抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体のいくつかの実施形態において、抗体は、他方の１０倍以内のＫｄ値でヒト及びマウスＶＥＧＦ−Ａに結合しない。このクラスの例示的な抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、次のＶＬ／ＶＨ配列対から選択されるそれぞれのＶＬ及びＶＨアミノ酸配列を有する軽及び重鎖可変ドメインを含む抗体を含む：配列番号２４２及び２４４；並びに配列番号２７８及び２８０。
特定の実施形態において、上のような抗ＶＥＧＦ−Ａエピトープは、オーバーラップしているＶＥＧＦ−Ａ（配列番号２）１３ｍｅｒペプチドの使用を含むペプチドマイクロアレイエピトープマッピングにより決定されるエピトープである。
特定の変形形態において、上のような中和抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、ＰＤＧＦＲβの細胞外ドメインにも結合する二重特異性抗体である。好ましい変形形態において、二重特異性抗体は、ＰＤＧＦＲβを中和する。
いくつかの実施形態において、上のような中和抗ＰＤＧＦＲβ又は中和抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、抗原結合領域を含む抗体フラグメントである。適切な抗体フラグメントとしては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ又はダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）などがある。いくつかの好ましい実施形態において、抗ＰＤＧＦＲβ又は抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態において、抗ＰＤＧＦＲβ又は抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、ＰＥＧ化されている。
他の態様において、本発明は、ＰＤＧＦＲβ及びＶＥＧＦ−Ａの両方を中和する二重特異性結合組成物を提供する。そのような二重特異性結合組成物は、一般的に（ａ）上述のような単離抗ＰＤＧＦＲβ抗体及び（ｂ）上述のような単離抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体を含む。いくつかの実施形態において、抗ＰＤＧＦＲβ抗体及び抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、リンカーを介して共有結合で連結している。特に適切なリンカーとしては、ポリペプチドリンカーなどがある。いくつかの変形形態において、抗ＰＤＧＦＲβ及び抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、共有結合で連結してタンデム単鎖Ｆｖ（ｔａｓｃＦｖ）又は二単鎖Ｆｖ（ｂｉｓｃＦｖ）を形成した単鎖Ｆｖｓである。いくつかの変形形態において、二重特異性結合組成物は、薬学的に許容される担体を含む。
関連する態様において、本発明は、ＰＤＧＦＲβ及びＶＥＧＦ−Ａの両方を中和する二重特異性抗体を提供する。特定の好ましい実施形態において、二重特異性抗体は、（ａ）上述のような抗ＰＤＧＦＲβ抗体の抗原結合領域及び（ｂ）上述のような抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体の抗原結合領域を含む。特定の実施形態において、二重特異性抗体は、例えば、Ｆｃフラグメントなどの免疫グロブリン重鎖定常領域を含む。適切なＦｃフラグメントは、１つ又は複数のエフェクター機能を減少又は除去するように修飾されたＦｃ領域を含む。いくつかの好ましい変形形態において、二重特異性抗体は、ｔａｓｃＦｖ、ｂｉｓｃＦｖ又はｂｉＡｂである。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、ＰＥＧ化されている。
いくつかの実施形態において、ＰＤＧＦＲβ及びＶＥＧＦ−Ａの両方を中和する二重特異性抗体は、（Ｉ）ＰＤＧＦＲβの細胞外ドメインに特異的に結合し、ＰＤＧＦＲβ活性を中和する第１の抗原結合領域であって、ＰＤＧＦＲβ結合領域が、配列番号４の残基２５１〜２７０に示すＰＤＧＦＲβのポリペプチド領域内に含まれる１つ又は複数のアミノ酸を含み、配列番号４の残基１９６〜２０５に示すＰＤＧＦＲβの第２のポリペプチド領域内に含まれる１つ又は複数のアミノ酸を場合によって含むエピトープに結合する、第１の抗原結合領域、並びに（ＩＩ）ＶＥＧＦ−Ａに特異的に結合し、ＶＥＧＦ−Ａ活性を中和する第２の抗原結合領域であって、ＶＥＧＦ−Ａ結合領域が、（ａ）配列番号２の残基４２〜５２に示すＶＥＧＦ−Ａの第１のポリペプチド領域内に含まれる１つ又は複数のアミノ酸及び（ｂ）配列番号２の残基７２〜８２に示すＶＥＧＦ−Ａの第２のポリペプチド領域内に含まれる１つ又は複数のアミノ酸を含むエピトープに結合する、第２の抗原結合領域を含む。いくつかのそのような実施形態において、抗ＶＥＧＦ−Ａエピトープは、（ｉ）配列番号２の残基９０〜１３２に示すＶＥＧＦ−Ａのポリペプチド領域内に含まれるアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号２の残基９８〜１１４に示すＶＥＧＦ−Ａの第３のポリペプチド領域内に含まれる１つ若しくは複数のアミノ酸をさらに含む。
上のような二重特異性抗体の特定の変形形態において、（Ｉ）ＰＤＧＦＲβ結合領域は、ＬＣＤＲ１ＰＤＧＦＲ、ＬＣＤＲ２ＰＤＧＦＲ及びＬＣＤＲ３ＰＤＧＦＲのＣＤＲを含むＶＬドメイン（ＶＬ−ＰＤＧＦＲ）並びにＨＣＤＲ１ＰＤＧＦＲ、ＨＣＤＲ２ＰＤＧＦＲ及びＨＣＤＲ３ＰＤＧＦＲのＣＤＲを含むＶＨドメイン（ＶＨ−ＰＤＧＦＲ）を含み、ＬＣＤＲ１ＰＤＧＦＲは、配列番号４３３に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２ＰＤＧＦＲは、配列番号４３４に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３ＰＤＧＦＲは、配列番号４３５に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１ＰＤＧＦＲは、配列番号４３６に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２ＰＤＧＦＲは、配列番号４３７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３ＰＤＧＦＲは、配列番号４３８〜４４２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、（ＩＩ）ＶＥＧＦ−Ａ結合領域は、ＬＣＤＲ１ＶＥＧＦ、ＬＣＤＲ２ＶＥＧＦ及びＬＣＤＲ３ＶＥＧＦのＣＤＲを含むＶＬドメイン（ＶＬ−ＶＥＧＦ）並びにＨＣＤＲ１ＶＥＧＦ、ＨＣＤＲ２ＶＥＧＦ及びＨＣＤＲ３ＶＥＧＦのＣＤＲを含むＶＨドメイン（ＶＨ−ＶＥＧＦ）を含み、（Ａ）ＬＣＤＲ１ＶＥＧＦは、配列番号４４８に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２ＶＥＧＦは、配列番号４４９に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３ＶＥＧＦは、配列番号４５０に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１ＶＥＧＦは、配列番号４５１に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２ＶＥＧＦは、配列番号４５２に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３ＶＥＧＦは、配列番号４５３〜４６１からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、又は（Ｂ）ＬＣＤＲ１ＶＥＧＦは、配列番号４６２に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２ＶＥＧＦは、配列番号４６３に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３ＶＥＧＦは、配列番号４６４及び４６５からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１ＶＥＧＦは、配列番号４６６に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２ＶＥＧＦは、配列番号４６７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３ＶＥＧＦは、配列番号４６８〜４７０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、ＬＣＤＲ１ＰＤＧＦＲ、ＬＣＤＲ２ＰＤＧＦＲ及びＬＣＤＲ３ＰＤＧＦＲは、それぞれ配列番号４６の残基２４〜４０、残基５６〜６２及び残基９５〜１０３に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１ＰＤＧＦＲ、ＨＣＤＲ２ＰＤＧＦＲ及びＨＣＤＲ３ＰＤＧＦＲは、それぞれ配列番号４８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１１に示すアミノ酸配列を有する。いくつかの代替の実施形態において、ＬＣＤＲ１ＰＤＧＦＲ、ＬＣＤＲ２ＰＤＧＦＲ及びＬＣＤＲ３ＰＤＧＦＲは、それぞれ配列番号６の残基２４〜４０、残基５６〜６２及び残基９５〜１０３に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１ＰＤＧＦＲ、ＨＣＤＲ２ＰＤＧＦＲ及びＨＣＤＲ３ＰＤＧＦＲは、それぞれ（ａ）配列番号８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０、又は（ｂ）配列番号１２の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０に示すアミノ酸配列を有する。より明確な変形形態において、ＶＬ−ＰＤＧＦＲ及びＶＨ−ＰＤＧＦＲは、それぞれ配列番号４６及び４８に示すアミノ酸配列を含む、又はＶＬ−ＰＤＧＦＲは、配列番号６に示すアミノ酸配列を含み、ＶＨ−ＰＤＧＦＲは、配列番号８若しくは配列番号１２に示すアミノ酸配列を含む。
上のような二重特異性抗体のいくつかの実施形態において、ＶＥＧＦ−Ａ結合領域は、（ＩＩ）（Ａ）に示すＣＤＲの組を含む。特定の変形形態において、（ａ）ＬＣＤＲ１ＶＥＧＦ、ＬＣＤＲ２ＶＥＧＦ及びＬＣＤＲ３ＶＥＧＦは、それぞれ配列番号２４２の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１ＶＥＧＦ、ＨＣＤＲ２ＶＥＧＦ及びＨＣＤＲ３ＶＥＧＦは、それぞれ配列番号２４４の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０７に示すアミノ酸配列を有する、又は（ｂ）ＬＣＤＲ１ＶＥＧＦ、ＬＣＤＲ２ＶＥＧＦ及びＬＣＤＲ３ＶＥＧＦは、それぞれ配列番号２７８の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１ＶＥＧＦ、ＨＣＤＲ２ＶＥＧＦ及びＨＣＤＲ３ＶＥＧＦは、それぞれ配列番号２８０の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０に示すアミノ酸配列を有する。より明確な変形形態において、ＶＬ−ＶＥＧＦ及びＶＨ−ＶＥＧＦは、（ａ）それぞれ配列番号２４２及び２４４に示すアミノ酸配列、又は（ｂ）それぞれ配列番号２７８及び２８０に示すアミノ酸配列を含む。
上のような二重特異性抗体の他の実施形態において、ＶＥＧＦ−Ａ結合領域は、（ＩＩ）（Ｂ）に示すＣＤＲの組を含む。特定の変形形態において、ＬＣＤＲ１ＶＥＧＦ、ＬＣＤＲ２ＶＥＧＦ及びＬＣＤＲ３ＶＥＧＦは、それぞれ配列番号２４６の残基２３〜３５、残基５１〜５７及び残基９０〜１００に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１ＶＥＧＦ、ＨＣＤＲ２ＶＥＧＦ及びＨＣＤＲ３ＶＥＧＦは、それぞれ配列番号２４８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０２に示すアミノ酸配列を有する。より明確な変形形態において、ＶＬ−ＶＥＧＦは、配列番号２４６に示すアミノ酸配列を含み、ＶＨ−ＶＥＧＦは、配列番号２４８に示すアミノ酸配列を含む。
上のような適切な二重特異性抗体としては、二単鎖Ｆｖ（ｂｉｓｃＦｖ）又はｂｉＡｂの形のものがある。二重特異性抗体がｂｉｓｃＦｖである、いくつかの好ましい実施形態において、ｂｉｓｃＦｖは、（ｉ）配列番号６２４のアミノ酸残基２０〜７７０、及び（ｉｉ）配列番号６２８のアミノ酸残基２０〜７７３、及び（ｉｉｉ）配列番号６２６のアミノ酸残基２０〜７６８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。二重特異性抗体がｂｉＡｂである、他の好ましい実施形態において、ｂｉＡｂは、そのＶＬドメインとしてＶＬ−ＰＤＧＦＲを含む免疫グロブリン軽鎖、及びそのＶＨドメインとしてＶＨ−ＰＤＧＦＲを含む免疫グロブリン重鎖を含み、重鎖は、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合体を形成するように、そのＣ末端においてＶＬ−ＶＥＧＦ及びＶＨ−ＶＥＧＦを含む単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と融合している。そのようなｂｉＡｂの特定の変形形態において、免疫グロブリン軽鎖は、配列番号５３７の残基２０〜２３９に示すアミノ酸配列を含み、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合体は、（ｉ）配列番号６３０のアミノ酸残基２０〜７２９、（ｉｉ）配列番号６３４のアミノ酸残基２０〜７３２、（ｉｉｉ）配列番号６３６のアミノ酸残基２０〜７２９、（ｉｖ）配列番号６４０のアミノ酸残基２０〜７３２、（ｖ）配列番号６３２のアミノ酸残基２０〜７２７、及び（ｖｉ）配列番号６３８のアミノ酸残基２０〜７２７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
さらに他の態様において、本発明は、本明細書で述べる抗体及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態において、医薬組成物は、中和抗ＰＤＧＦＲβ抗体を含む。他の実施形態において、医薬組成物は、中和抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体を含む。特定の好ましい変形形態において、医薬組成物は、中和抗ＰＤＧＦＲβ抗体及び中和抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体の両方を含む。本発明による特に好ましい医薬組成物は、ＰＤＧＦＲβ及びＶＥＧＦ−Ａの両方に結合し、中和する二重特異性抗体を含む。
他の態様において、本発明は、上述の抗体のＶＬ及び／又はＶＨドメインをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＰＤＧＦＲβ及びＶＥＧＦ−Ａの両方に結合し、中和する二重特異性抗体をコードする。本発明は、上のようなポリヌクレオチドを含む発現ベクター、並びにそのような発現ベクターを含み、本発明の抗体を産生させる方法に用いることができる宿主細胞をさらに提供する。そのような本発明の抗体を産生させる方法は、宿主細胞を抗体が発現する条件下で培養する工程及び宿主細胞から抗体を単離する工程を一般的に含む。
さらに他の態様において、本発明は、ＰＤＧＦＲβアンタゴニスト及びＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの少なくとも１つを投与することにより、対象における血管新生を阻害する方法を提供する。特定の実施形態において、該方法は、血管新生を有する対象に有効量の上述のような抗ＰＤＧＦＲβ抗体を投与する工程を含み、また該対象に有効量のＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを投与する工程を場合によってさらに含む。他の実施形態において、該方法は、血管新生を有する対象に有効量の上述のような抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体を投与する工程を含み、また該対象に有効量のＰＤＧＦＲβアンタゴニストを投与する工程を場合によってさらに含む。特定の好ましい実施形態において、該方法は、血管新生を有する対象に有効量の抗ＰＤＧＦＲβ抗体及び有効量の抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体を投与する工程を含む。該方法がＰＤＧＦＲβアンタゴニスト及びＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの両方の投与を含む場合、ＰＤＧＦＲβアンタゴニスト及びＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、例えば、別個又は同時に投与することができる。いくつかの変形形態において、ＰＤＧＦＲβアンタゴニスト及びＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの投与は、中和抗ＰＤＧＦＲβ抗体及び中和抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体の両方を含む二重特異性結合組成物を投与することを含む。他の変形形態において、ＰＤＧＦＲβアンタゴニスト及びＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの投与は、ＰＤＧＦＲβ及びＶＥＧＦ−Ａの両方に結合し、中和する二重特異性抗体を投与することを含む。
関連する態様において、本発明は、ＰＤＧＦＲβアンタゴニスト及びＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの少なくとも１つを投与することにより、対象における血管新生障害を治療する方法を提供する。特定の実施形態において、該方法は、血管新生障害を有する対象に有効量の上述のような抗ＰＤＧＦＲβ抗体を投与する工程を含み、また該対象に有効量のＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを投与する工程を場合によってさらに含む。他の実施形態において、該方法は、血管新生障害を有する対象に有効量の上述のような抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体を投与する工程を含み、また該対象に有効量のＰＤＧＦＲβアンタゴニストを投与する工程を場合によってさらに含む。特定の好ましい実施形態において、該方法は、血管新生障害を有する対象に有効量の抗ＰＤＧＦＲβ抗体及び有効量の抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体を投与する工程を含む。該方法がＰＤＧＦＲアンタゴニスト及びＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの両方の投与を含む場合、ＰＤＧＦＲβアンタゴニスト及びＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、例えば、別個又は同時に投与することができる。いくつかの変形形態において、ＰＤＧＦＲβアンタゴニスト及びＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの投与は、中和抗ＰＤＧＦＲβ抗体及び中和抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体の両方を含む二重特異性結合組成物を投与することを含む。他の変形形態において、ＰＤＧＦＲβアンタゴニスト及びＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの投与は、ＰＤＧＦＲβ及びＶＥＧＦ−Ａの両方に結合し、中和する二重特異性抗体を投与することを含む。
血管新生障害を治療する方法のいくつかの実施形態において、血管新生障害は、固形腫瘍の成長によって特徴付けられる癌である。いくつかの特定の変形形態において、癌は、膵臓癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）又は神経膠芽腫である。
血管新生障害を治療する方法の他の実施形態において、血管新生障害は、血管新生眼障害である。特定の変形形態において、血管新生眼障害は、加齢性黄班変性、糖尿病性網膜症、虹彩新生血管形成、血管新生緑内障又は増殖性硝子体網膜症である。
本発明のこれら及び他の態様は、以下の本発明の詳細な説明及び添付図面を参照することによって明らかになるであろう。
定義
特に定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術及び科学用語は、述べる方法及び組成物に関係する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で用いているように、以下の用語及び句は、特に示さない限り、それらに帰せられる意味を有する。
「ポリペプチド」は、自然に又は合成により生成したかどうかに無関係に、ペプチド結合により結合したアミノ酸残基のポリマーである。約１０アミノ酸残基未満のポリペプチドは、一般的に「ペプチド」と呼ばれる。
「タンパク質」は、１つ又は複数のポリペプチド鎖を含む巨大分子である。タンパク質は、炭水化物基などの非ペプチド成分も含むこともできる。炭水化物及び他の非ペプチド置換基は、タンパク質が産生される細胞によってタンパク質に付加される可能性があり、細胞の種類によって異なる。タンパク質は、本明細書ではそれらのアミノ酸骨格構造によって定義し、炭水化物基などの置換基は、一般的に明細に述べないが、それにもかかわらず存在する可能性がある。
「アミノ末端」及び「カルボキシル末端」という用語は、本明細書ではポリペプチド内の位置を表すのに用いる。文脈上妥当である場合、これらの用語は、近接又は相対的位置を表すためにポリペプチドの特定の配列又は部分に関して用いる。例えば、ポリペプチド内の参照配列のカルボキシル末端に位置する特定の配列は、参照配列のカルボキシル末端に近接して位置するが、完全なポリペプチドのカルボキシル末端に必ずしも存在しない。
本明細書で用いているように、「核酸」又は「核酸分子」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により生成したフラグメント、並びに連結反応、切断、エンドヌクレアーゼ作用及びエキソヌクレアーゼ作用のいずれかにより生成したフラグメントを意味する。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド（ＤＮＡ及びＲＮＡ）、若しくは天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば、天然に存在するヌクレオチドのα−鏡像異性体）であるモノマー、又は両方の組合せによって構成することができる。修飾ヌクレオチドは、糖部分及び／又はピリミジン若しくはプリン塩基部分の変化を有し得る。糖の修飾は、例えば、１つ又は複数のヒドロキシル基のハロゲン、アルキル基、アミン及びアジド基による置換を含み、或いは糖は、エーテル又はエステルとして官能化することができる。さらに、糖部分全体を、アザ糖及び炭素環式糖類似体のような立体的及び電子的に類似の構造で置換することができる。塩基部分の修飾の例には、アルキル化プリン及びピリミジン、アシル化プリン若しくはピリミジン、又は他の周知の複素環式置換体がある。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合又はそのような結合の類似物により結合させることができる。ホスホジエステル結合の類似物は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホルアミデートなどを含む。「核酸分子」という用語は、ポリアミド骨格に結合した天然に存在する又は修飾核酸塩基を含む、いわゆる「ペプチド核酸」も含む。核酸は、一本鎖又は二本鎖であってよい。
本明細書で用いているように、「アンタゴニスト」という用語は、生物学的環境において他の化合物の活性を低下させる化合物を意味する。したがって、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、ＶＥＧＦ−Ａの生物学的活性を低下させる化合物であり、ＰＤＧＦＲβアンタゴニストは、ＰＤＧＦＲβの生物学的活性を低下させる化合物である。ＶＥＧＦ−Ａ及びＰＤＧＦＲβの活性は複数の分子（リガンド、受容体及びシグナル伝達系）の相互作用に依存するので、アンタゴニストは、ＶＥＧＦ−Ａ又はＰＤＧＦＲβに対して直接的に作用することによって、或いは同族の生物学的経路における他の分子に作用することによって活性を低下させることができる。例えば、ＰＤＧＦＲβアンタゴニストは、例えば、受容体自体に結合することにより、そのリガンドの１つに結合することにより、受容体二量体化を妨害することにより、又は受容体リン酸化を妨害することにより、ＰＤＧＦＲβ活性を低下させることができる。アンタゴニストには、限定されないが、リガンド若しくはその受容体に結合する、又はその他の形でリガンド−受容体相互作用及び／若しくは他の受容体機能を妨害する、抗体、可溶性受容体及び非タンパク質性化合物がある。
「抗体」という用語は、本明細書において、抗原の存在に応答して身体により産生され、抗原に結合するタンパク質、並びに抗原結合フラグメント及び操作されたその変異体を表すために用いる。したがって、「抗体」及び「抗体（複数）」という用語は、ポリクローナル抗体、親和性精製ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体並びにＦ（ａｂ’）２及びＦａｂフラグメントなどの抗原結合抗体フラグメントを含む。キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖Ｆｖフラグメント、単鎖抗体、ダイアボディ、ミニボディ、線状抗体、多価又は多重特異性ハイブリッド抗体などの遺伝子操作された完全な抗体及びフラグメントも含まれる。したがって、「抗体」という用語は、抗体の抗原結合部位を含み、その抗原に結合することができるあらゆるタンパク質を含むように拡張して用いる。
「遺伝子操作された抗体」という用語は、アミノ酸配列が天然抗体のアミノ酸配列から変化している抗体を意味する。抗体の生成に組換えＤＮＡ技術が関連するため、天然抗体に見いだされるアミノ酸の配列に制限される必要はなく、所望の特性を得るように抗体を再設計することができる。可能な変化は、多く、たった１つ又は数個のアミノ酸の変更から、例えば可変又は定常領域の完全な再設計にまで及ぶ。定常領域の変更は、一般的に、補体結合、細胞との相互作用及び他のエフェクター機能などの特性を改善し又は変化させるために行われる。一般的に、可変領域の変更は、抗原結合特性を改善し、可変領域の安定性を改善し、又は免疫原性のリスクを低減するために行われる。
「抗体の抗原結合部位」は、その抗原に結合するのに十分である抗体の部分である。最小限のそのような領域は、一般的に可変ドメイン又は遺伝子操作されたその変異体である。単一ドメイン結合部位は、ラクダ科動物抗体（例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ及びＬａｕｗｅｒｅｙｓ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｒｅｃｏｇ．、１２巻、１３１〜１４０頁、１９９９年；Ｎｇｕｙｅｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．，１９巻、９２１〜９３０頁、２０００年を参照）から又は単一ドメイン抗体を産生させるための他の種のＶＨドメイン（「ｄＡｂｓ」、Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻、５４４〜５４６頁、１９８９年；Ｗｉｎｔｅｒらへの米国特許第６，２４８，５１６号を参照）から得ることができる。特定の変形形態において、抗原結合部位は、天然に存在する又は天然に存在しない（例えば、突然変異）重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメイン、或いはその組合せの２つの相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを有するポリペプチド領域である（例えば、Ｐｅｓｓｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２巻、３６７〜３６９頁、１９９３年；Ｑｉｕら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２５巻、９２１〜９２９頁、２００７年を参照）。より一般的には、抗体の抗原結合部位は、共通のエピトープに結合する重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインの両方を含む。本発明において、「抗体の抗原結合部位を含む」分子は、抗体の１つ又は複数の第２の抗原結合部位（同じ若しくは異なるエピトープに、又は同じ若しくは異なる抗原に結合してよい）、ペプチドリンカー、免疫グロブリン定常ドメイン、免疫グロブリンヒンジ、両親媒性らせん（Ｐａｃｋ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、３１巻、１５７９〜１５８４頁、１９９２年を参照）、非ペプチドリンカー、オリゴヌクレオチド（Ｃｈａｕｄｒｉら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、４５０巻、２３〜２６頁、１９９９年を参照）などをさらに含んでいてよく、単量体又は多量体タンパク質であってよい。抗体の抗原結合部位を含む分子の例は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｆｖフラグメント、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、ダイアボディ、ミニボディ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ融合体、二重特異性（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧ及び二重特異性（ｓｃＦｖ）２−Ｆａｂなどがある。（例えば、Ｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５６巻、３０５５〜３０６１頁、１９９６年；Ａｔｗｅｌｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３３巻、１３０１〜１３１２頁、１９９６年；Ｃａｒｔｅｒ及びＭｅｒｃｈａｎｔ、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、８巻、４４９〜４５４頁、１９９７年；Ｚｕｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１３巻、３６１〜３６７頁、２０００年；並びにＬｕら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、２６７巻、２１３〜２２６頁、２００２年を参照。）
本明細書で用いているように、「免疫グロブリン」という用語は、免疫グロブリン遺伝子（単数又は複数）により実質的にコードされる１つ又は複数のポリペプチドからなるタンパク質を意味する。免疫グロブリンの１つの形態は、抗体の基本構造単位を構成する。この形態は、四量体であり、免疫グロブリン鎖の２つの同一の対からなっており、各対は、１つの軽鎖と１つの重鎖を有する。各対において、軽及び重鎖可変領域は、抗原への結合に共に関与し、定常領域は、抗体のエフェクター機能に関与する。免疫グロブリンは、脊椎生物において一般的に抗体として機能する。免疫グロブリンタンパク質の５つのクラス（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥ）が高等脊椎動物において同定された。ＩｇＧは、主要なクラスを含み、血漿中に見いだされる第２の最も豊富なタンパク質として存在する。ヒトにおいて、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４と呼ばれる４つのサブクラスからなる。ＩｇＧクラスの重鎖定常領域は、ギリシャ文字γにより識別する。例えば、ＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンは、γ１重鎖定常領域を含む。各免疫グロブリン重鎖は、種における所定のサブクラスについて本質的に不変である定常領域タンパク質ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３；ＩｇＧ３はＣＨ４ドメインも含む）からなる定常領域を有する。ヒト及び非ヒト免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡ配列は、当技術分野で公知である。（例えば、Ｅｌｌｉｓｏｎら、ＤＮＡ、１巻、１１〜１８頁、１９８１年；Ｅｌｌｉｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１０巻、４０７１〜４０７９頁、１９８２年；Ｋｅｎｔｅｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、７９巻、６６６１〜６６６５頁、１９８２年；Ｓｅｎｏら、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１１巻、７１９〜７２６頁、１９８３年；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻、３２３〜３２７頁、１９８８年；Ａｍｓｔｅｒら、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、８巻、２０５５〜２０６５頁、１９８０年；Ｒｕｓｃｏｎｉ及びＫｏｈｌｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、３１４巻、３３０〜３３４頁、１９８５年；Ｂｏｓｓら、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１２巻、３７９１〜３８０６頁、１９８４年；Ｂｏｔｈｗｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ、２９８巻、３８０〜３８２頁、１９８２年；ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｏｏら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、４２巻、３３３〜３４１頁、１９９５年；Ｋａｒｌｉｎら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ．、２２巻、１９５〜２０８頁、１９８５年；Ｋｉｎｄｓｖｏｇｅｌら、ＤＮＡ、１巻、３３５〜３４３頁、１９８２年；Ｂｒｅｉｎｅｒら、Ｇｅｎｅ、１８巻、１６５〜１７４頁、１９８２年；Ｋｏｎｄｏら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３巻、２４５〜２４９頁、１９９３年；及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ００２２８を参照。）免疫グロブリンの構造及び機能の総説については、Ｐｕｔｎａｍ、Ｔｈｅ Ｐｌａｓｍａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｖ巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．、４９〜１４０頁、１９８７年；及びＰａｄｉａｎ、Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３１巻、１６９〜２１７頁、１９９４年を参照。「免疫グロブリン」という用語は、本明細書ではその一般的な意味で用い、文脈によって完全な抗体、その成分鎖又は鎖のフラグメントを意味する。
全長免疫グロブリン「軽鎖」（約２５ｋｄ又は２１４アミノ酸）は、ＮＨ２末端における可変領域遺伝子（約１１０アミノ酸をコードする）及びＣＯＯＨ末端におけるカッパ又はラムダ定常領域遺伝子によりコードされる。全長免疫グロブリン「重鎖」（約５０ｋｄ又は４４６アミノ酸）は、可変領域遺伝子（約１１６アミノ酸をコードする）及びガンマ、ミュー、アルファ、デルタ又はイプシロン定常領域遺伝子（約３３０アミノ酸をコードする）によりコードされ、後者は、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥと定義する。軽及び重鎖内で、可変及び定常領域は、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により結合されており、重鎖は、約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。（一般的にＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ編、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．、第２版、１９８９年）７章を参照。）
免疫グロブリン「Ｆｖ」フラグメントは、非共有結合的相互作用により保持されている、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。したがって、免疫グロブリンＦｖフラグメントは、単一抗原結合部位を含む。Ｆｖフラグメントの二量体構造は、突然変異誘発によりジスルフィド結合を導入することによってさらに安定化させることができる。（Ａｌｍｏｇら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、３１巻、１２８〜１３８頁、１９９８年を参照。）
本明細書で用いているように、「単鎖Ｆｖ」及び「単鎖抗体」という用語は、単一ポリペプチド鎖内に重及び軽鎖の両方の可変領域を含むが、定常領域を欠く抗体フラグメントを意味する。一般的に、単鎖抗体は、抗原結合を可能にする所望の構造を形成させることができる、ＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含む。単鎖抗体は、例えば、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、２６９〜３１５頁（Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９４年）においてＰｌｕｃｋｔｈｕｎにより詳細に述べられている。（ＷＩＰＯ公開ＷＯ８８／０１６４９；米国特許第４，９４６，７７８号及び第５，２６０，２０３号；Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻、４２３〜４２６頁、１９８８年も参照。）単鎖抗体は、二重特異性でもよく、かつ／又はヒト化されていてもよい。
「Ｆａｂフラグメント」は、１本の軽鎖並びに１本の重鎖のＣＨ１及び可変領域を含む。Ｆａｂフラグメントの重鎖は、他の重鎖分子とのジスルフィド結合を形成することはできない。
「Ｆａｂ’フラグメント」は、１本の軽鎖並びに鎖間ジスルフィド結合を２本の重鎖の間で形成させてＦ（ａｂ’）２分子を形成することができるような、ＣＨ１及びＣＨ２ドメイン間の定常領域のより多くを含む１本の重鎖を含む。
「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」は、２本の軽鎖並びに２本の重鎖間に鎖間ジスルフィド結合が形成されるように、ＣＨ１及びＣＨ２ドメイン間の定常領域の一部を含む２本の重鎖を含む。
免疫グロブリン「Ｆｃフラグメント」（又はＦｃドメイン）は、細胞上の抗体受容体及び補体のＣ１ｑ成分への結合に関与する抗体の部分である。Ｆｃは、タンパク質結晶を容易に形成する抗体のフラグメントである、「フラグメント結晶」を表す。タンパク質溶解消化によって最初に記載された別個のタンパク質フラグメントは、免疫グロブリンタンパク質の全体的な一般構造を定義し得る。文献で最初に定義されたように、Ｆｃフラグメントは、ジスルフィド結合重鎖ヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインからなる。しかし、より最近、この用語は、ＣＨ３、ＣＨ２及び第２のそのような鎖とのジスルフィド結合二量体を形成するのに十分なヒンジの少なくとも一部からなる単鎖に適用されている。免疫グロブリンの構造及び機能の総説については、Ｐｕｔｎａｍ、Ｔｈｅ Ｐｌａｓｍａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｖ巻、４９〜１４０頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．、１９８７年）及びＰａｄｌａｎ、Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３１巻、１６９〜２１７頁、１９９４年を参照。本明細書で用いているように、Ｆｃという用語は、天然に存在する配列の変異体を含む。
免疫グロブリン軽又は重鎖可変領域は、３つの超可変領域によって中断された「フレームワーク」領域からなる。したがって、「超可変領域」という用語は、抗原の結合に関与する抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」のアミノ酸残基（例えば、ヒトにおいて、軽鎖可変ドメインにおける残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）及び８９〜９７（Ｌ３）並びに重鎖可変ドメインにおける残基３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）及び９５〜１０２（Ｈ３）（ＥＵインデックスに基づくアミノ酸配列番号；Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ．（１９９１年）を参照）及び／又は「超可変ループ」の残基（ヒトにおいて、軽鎖可変ドメインにおける残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）及び９１〜９６（Ｌ３）並びに重鎖可変ドメインにおける残基２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）及び９６〜１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、１９６巻、９０１〜９１７頁、１９８７年）を含む（両方が参照により本明細書に組み込まれている）。「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」残基は、本明細書で定義した超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。種々の軽又は重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存的である。したがって、「ヒトフレームワーク領域」は、天然に存在するヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域と実質的に同じである（約８５％以上、通常９０〜９５％以上）フレームワーク領域である。抗体のフレームワーク領域、すなわち成分軽及び重鎖の複合フレームワーク領域は、ＣＤＲを位置付け、整列させる役割を果たす。ＣＤＲは、抗原のエピトープへの結合に主として関与する。ＶＬドメインのＣＤＲ Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、本明細書では、それぞれＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３とも呼び、ＶＨドメインのＣＤＲ Ｈ１、Ｈ２及びＨ３は、本明細書では、それぞれＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３とも呼ぶ。
「キメラ抗体」は、軽及び重鎖遺伝子が、典型的には遺伝子工学技術により、異なる種に属する免疫グロブリン可変及び定常領域遺伝子から構築された抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体の遺伝子の可変セグメントをヒト定常領域コードセグメント（例えば、ヒトガンマ１又はガンマ３重鎖遺伝子、及びヒトカッパ軽鎖遺伝子）と結合させることができる。したがって、治療用キメラ抗体は、他の哺乳動物種を用いることができるが、一般的にマウス抗体の可変又は抗原結合ドメイン及びヒト抗体の定常ドメインから構成されるハイブリッドタンパク質である。具体的には、免疫グロブリン軽鎖、重鎖又は両方のヒンジ及び定常領域の全部又は一部を他の動物の免疫グロブリン軽鎖又は重鎖の対応する領域で置換した、キメラ抗体を組換えＤＮＡ技術により生成させる。この方法において、親モノクローナル抗体の抗原結合部分を他の種の抗体の骨格上に移植する。キメラ抗体は、露出残基の置換によりヒト様表面で場合によって「覆い隠す」ことができ、その結果「ベニヤ化抗体」となる。
本明細書で用いているように、「ヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらへの米国特許第５，９３９，５９８号に記載されているように、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、又は１つ若しくは複数のヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックであり、内因性免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体を含む。
「ヒト化免疫グロブリン」という用語は、ヒトフレームワーク領域及び非ヒト（例えば、マウス又はラット）免疫グロブリンの１つ又は複数のＣＤＲを含む免疫グロブリンを意味する。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは、「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは、「アクセプター」と呼ばれる。定常領域は、存在する必要はないが、存在する場合、それらは、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同じ、すなわち、少なくとも約８５〜９０％、好ましくは約９５％以上同じでなければならない。したがって、おそらくＣＤＲを除くヒト化免疫グロブリンのすべての部分は、天然ヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同じである。場合によって、ヒト化抗体は、適切な結合特性を向上させるためにヒト可変領域フレームワークドメイン内の非ヒト残基を保持していてよい（例えば、抗体をヒト化するときに、結合親和性を保存するために、フレームワークにおける突然変異が必要である可能性がある）。「ヒト化抗体」は、ヒト化軽鎖及びヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体である。例えば、キメラ抗体の可変領域の全体が非ヒトであるため、ヒト化抗体は、上で定義した典型的なキメラ抗体を包含しないこととなる。
「二重特異性」又は「二機能性」抗体は、２つの異なる重／軽鎖対及び２つの異なる結合部位を有するハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合又はＦａｂ’フラグメントの連結を含むが、これらに限定されない様々な方法により生成させることができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｌ及びＬａｃｈｍａｎ、Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７９巻、３１５〜３２１頁、１９９０年；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８巻、１５４７〜１５５３頁、１９９２年を参照。
特定の実施形態における「多重特異性」又は「多機能性」抗体以外の「二価抗体」は、同じ抗原特異性を有する２つの結合部位を含む抗体である。
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小抗体フラグメントを意味し、当フラグメントは、同じポリペプチド鎖における軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ−ＶＬ）を含む。短かすぎて同じ鎖上の２つのドメインの間で対形成をすることができないリンカーを用いることにより、ドメインに他の鎖の相補的ドメインと対を形成させて、２つの抗原結合部位を形成する。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９０巻、６４４４〜６４４８頁、１９９３年により十分に記載されている。
「ミニボディ」という用語は、本明細書において天然に存在する又は天然に存在しない（例えば、突然変異）重鎖可変ドメイン若しくは軽鎖可変ドメイン又はその組合せの２つの相補性決定領域（ＣＤＲ）のみをコードするポリペプチドを意味する。ミニボディの例は、Ｐｅｓｓｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２巻、３６７〜３６９頁、１９９３年及びＱｉｕら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２５巻、９２１〜９２９頁、２００７年に記載されている。
「線状抗体」という用語は、Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、８巻、１０５７〜１０６２頁、１９９５年に記載されている抗体を意味する。簡単に述べると、これらの抗体は、抗原結合領域の対を形成するタンデムＦｄセグメントの対（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。線状抗体は、二重特異性又は単一特異性であってよい。
本明細書で用いている「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術により産生される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、真核、原核又はファージクローンを含む単一クローンから得られる抗体を意味し、それを産生する方法ではない。
本明細書で用いている「親抗体」という用語は、変異体の調製に用いるアミノ酸配列によりコードされる抗体を意味する。好ましくは、親抗体は、ヒトフレームワーク領域を有し、存在する場合、ヒト抗体定常領域を有する。例えば、親抗体は、ヒト化又はヒト抗体であってよい。
「変異型」抗ＰＤＧＦＲβ又は抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、本明細書において親抗体配列における１つ又は複数のアミノ酸残基（単数又は複数）の付加、欠失及び／又は置換により「親」抗ＰＤＧＦＲβ又は抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体アミノ酸配列とアミノ酸配列が異なっている分子を意味する。好ましい実施形態において、変異体は、親抗体の１つ又は複数の超可変領域における１つ又は複数のアミノ酸置換（単数又は複数）を含む。例えば、変異体は、親抗体の１つ又は複数の超可変領域における少なくとも１個、例えば、約１個から約１０個、好ましくは約２個から約５個の置換を含んでいてよい。通常、変異体は、親抗体重又は軽鎖可変ドメイン配列との少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。この配列に関する同一性又は相同性は、本明細書において、最大のパーセントの配列同一性を達成するために必要な場合に配列を整列させ、ギャップを導入した後の、親抗体残基と同じである候補配列におけるアミノ酸残基のパーセントと定義する。抗体配列へのＮ末端、Ｃ末端、又は内部の伸長、欠失又は挿入は、配列同一性又は相同性に影響を及ぼすものと解釈してはならない。変異体は、ヒトＰＤＧＦＲβ又はＶＥＧＦ−Ａに結合する能力を保持しており、好ましくは親抗体より優れた特性を有する。例えば、変異体は、より強い結合親和性、ＰＤＧＦＲβ誘導又はＶＥＧＦ−Ａ誘導性の生物学的活性（例えば、血管新生）を阻害する高い能力を有する可能性がある。例えば、抗ＰＤＧＦＲβ又は抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体の形態が本明細書で開示した生物学的活性アッセイにおけるその活性に影響を及ぼすことが見いだされたことから、そのような特性を分析するために、変異体のＦａｂ形を親抗体のＦａｂ形と、又は変異体の全長形を親抗体の全長形と比較すべきである。本明細書において、とりわけ注目すべき変異型抗体は、親抗体と比較したとき生物学的活性の約少なくとも３倍、５倍、１０倍、２０倍又は５０倍の増大を示すものである。
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体への特異的結合の能力のあるタンパク質決定因子を含む。エピトープ決定基は、通常アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面群からなっており、通常特異的な三次元構造の特徴、並びに特異的な電荷の特徴を有する。より具体的には、「ＰＤＧＦＲβエピトープ」又は「ＶＥＧＦ−Ａエピトープ」という用語は、本明細書で用いているように、動物における、好ましくは哺乳動物における、また最も好ましくはマウス又はヒトにおける抗原性又は免疫原活性を有するＰＤＧＦＲβ又はＶＥＧＦ−Ａポリペプチドの部分を意味する。免疫原活性を有するエピトープは、動物における抗体反応を誘発するＰＤＧＦＲβ又はＶＥＧＦ−Ａポリペプチドの部分である。抗原性活性を有するエピトープは、当技術分野で周知の方法、例えば、イムノアッセイにより測定したとき、抗体が免疫特異的に結合するＰＤＧＦＲβ又はＶＥＧＦ−Ａポリペプチドの部分である。抗原性エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。
「クローニングベクター」は、宿主細胞において自律的に複製する能力を有するプラスミド、コスミド又はバクテリオファージなどの核酸分子である。クローニングベクターは、典型的には、ベクターの本質的な生物学的機能の喪失なしに確定できる形での核酸分子、並びにクローニングベクターにより形質転換された細胞の識別及び選択に用いるのに適するマーカー遺伝子をコードするヌクレオチド配列の挿入を可能にする１つ又は少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む。マーカー遺伝子は、テトラサイクリン耐性又はアンピシリン耐性を与える遺伝子を典型的には含む。
「発現」という用語は、核酸によりコードされる産物の生合成を意味する。例えば、問題とするポリペプチドをコードする核酸セグメントの場合、発現は、核酸セグメントのｍＲＮＡへの転写及びｍＲＮＡの１つ又は複数のポリペプチドへの翻訳を含む。
「発現単位」及び「発現カセット」という用語は、本明細書において同義で用い、問題とするポリペプチドをコードし、宿主細胞における核酸セグメントの発現をもたらすことができる核酸セグメントを意味する。発現単位は、一般的にすべてが動作可能な構成である転写プロモーター、問題とするポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム及び転写ターミネーターを含む。転写プロモーター及びターミネーターに加えて、発現単位は、例えば、エンハンサー又はポリアデニル化シグナルなどの他の核酸セグメントをさらに含み得る。
「発現ベクター」という用語は、本明細書で用いているように、１つ又は複数の発現単位を含む、線状又は環状の核酸分子を意味する。１つ又は複数の発現単位に加えて、発現ベクターは、例えば、１つ又は複数の複製起点或いは１つ又は複数の選択可能なマーカーなどのさらなる核酸セグメントも含み得る。発現ベクターは、一般的にプラスミド若しくはウイルスＤＮＡ由来であり、又は両方のエレメントを含み得る。
本明細書で述べるようなタンパク質に関して、配列番号により指定されるものに対応するアミノ酸残基への言及は、そのような残基の翻訳後修飾を含む。
「新生血管形成」及び「血管新生」という用語は、本明細書において同義で用いる。新生血管形成及び血管新生は、細胞、組織又は臓器内の新たな血管の発生を意味する。血管新生の制御は、典型的には特定の疾患状態で変化し、多くの場合、疾患に関連する病的障害は、変化した又は調節されていない血管新生に関連する。持続性の調節されていない血管新生は、内皮細胞による異常な成長によって特徴付けられるものを含む、様々な疾患状態において起こり、血管の漏出や透過性などのこれらの状態で認められる病的障害を支える。
「血管新生障害」という用語は、本明細書において、増大した又は調節されていない血管新生活性によって少なくとも一部媒介される病状を有する疾患又は障害を意味する。そのような疾患又は障害の例は、固形腫瘍（例えば、膵臓癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ））を含む種々の癌並びに新生血管形成を伴う特定の眼疾患（「新生血管眼疾患」）を含む。そのような疾患又は障害は、本明細書においてさらに述べるような血管新生の阻害のための特定の治療方法に特に敏感に反応する。
「血管新生眼障害」は、本明細書で用いているように、患者の眼に関係する血管新生障害（すなわち、患者の眼における増大した又は調節されていない血管新生活性によって少なくとも一部媒介される病状を有する疾患又は障害）を意味する。本発明による治療に敏感に反応する血管新生眼障害の例は、加齢性黄班変性、糖尿病性網膜症、虹彩新生血管形成、新生血管緑内障、増殖性硝子体網膜症、視神経乳頭新生血管形成、角膜新生血管形成、硝子体新生血管形成、パンヌス、翼状片、黄班浮腫、糖尿病性黄班浮腫、血管網膜症、網膜変性、ブドウ膜炎及び網膜の炎症性疾患を含む。
本明細書で述べるような対象へのＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの投与による血管新生障害の治療の状況における「有効量」という用語は、血管新生障害の１つ又は複数の症状の発生を阻害又は改善するように対象における血管新生を阻害するのに十分であるそのような薬剤の量を意味する。薬剤の有効量は、「有効な投薬計画」における本発明の方法により投与する。「有効な投薬計画」という用語は、疾患又は障害の治療又は予防を達成するのに十分な投与薬剤の量及び投与頻度の組合せを意味する。
本明細書で述べるような疾患又は障害の治療の状況における「患者」又は「対象」という用語は、例えば、ヒト及び他の霊長類などの哺乳動物を含む。この用語は、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ及びネコも含む。
２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基が、最大の一致で整列させたときに同じである場合、２つのアミノ酸配列は「１００％のアミノ酸配列の同一性」を有する。同様に、２つのヌクレオチド配列のヌクレオチド残基が、最大の一致で整列させたときに同じである場合、２つのヌクレオチド配列は「１００％のヌクレオチド配列の同一性」を有する。配列の比較は、ＤＮＡＳＴＡＲ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）により製造されているＬＡＳＥＲＧＥＮＥ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓコンピューティングスイートに含まれているような標準ソフトウェアプログラムを用いて行うことができる。最適な整列を決定することによって２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列を比較する他の方法は、当業者に周知である（例えば、Ｐｅｒｕｓｋｉ及びＰｅｒｕｓｋｉ、Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎｅｔ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．、１９９７年）；Ｗｕら（編）、「Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｕｐｅｒｈｉｇｈｗａｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｄａｔａｂａｓｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１２３〜１５１頁（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．、１９９７年）；Ｂｉｓｈｏｐ（編）、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ（第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．、１９９８年））を参照）。２つの配列が互いに対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有する場合、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列は「実質的に同様な配列同一性」又は「実質的な配列同一性」を有するとみなされる。
パーセント配列同一性は、従来の方法により決定される。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｂｕｌｌ． Ｍａｔｈ． Ｂｉｏ．、４８巻、６０３頁、１９８６年並びにＨｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８９巻、１０９１５頁、１９９２年を参照。例えば、１０のギャップ開始ペナルティ、１のギャップ伸長ペナルティ並びに表１（アミノ酸を１文字コードによって示す）に示すようなＨｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ（前出）の「ＢＬＯＳＵＭ６２」スコアリングマトリックスを用いて整列スコアを最適にするように２つのアミノ酸配列を整列させることができる。次いで、パーセント同一性を（［同一対応の数］／［より長い配列の長さ＋２つの配列を整列させるためにより長い配列内に導入したギャップの数］）（１００）として計算する。
当業者は、２つのアミノ酸配列を整列させるために利用可能な多くの確立されたアルゴリズムが存在することを認める。Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの「ＦＡＳＴＡ」類似性検索アルゴリズムは、本明細書で開示するアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列により共有される同一性のレベルを検討するための適切なタンパク質の整列方法である。ＦＡＳＴＡアルゴリズムは、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８５巻、２４４４頁、１９８８年並びにＰｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８３巻、６３頁、１９９０年に記載されている。簡単に述べると、ＦＡＳＴＡは、最初に、保存的アミノ酸の置換、挿入又は欠失を考慮せずに、クエリー配列（例えば、配列番号２の残基２５〜２６６）と同一性の最高密度（ｋｔｕｐ変数が１である場合）又は同一性の対（ｋｔｕｐ＝２である場合）を有する試験配列によって共有される領域を同定することによって配列類似性を明らかにする。次に、アミノ酸置換マトリックスを用いてすべての対となるアミノ酸の類似性を比較することによって、同一性の最高密度を有する１０個の領域を再スコアし、領域の末端を「切り取って」最高スコアに寄与する残基のみを含める。（配列の長さ及びｋｔｕｐ値に基づいて予め定めた式により計算された）「カットオフ」値より大きいスコアを有するいくつかの領域が存在する場合、切り取られた最初の領域を検討して、当該領域を結合させてギャップを有する適切な整列を形成させることができるかどうかを判断する。最後に、アミノ酸の挿入及び欠失を考慮に入れるＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ−Ｓｅｌｌｅｒｓアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、４８巻、４４４頁、１９７０年；Ｓｅｌｌｅｒｓ、ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ．、２６巻、７８７頁、１９７４年）の変法を用いて、２つのアミノ酸配列の最高スコア領域を整列させる。ＦＡＳＴＡ解析の例示的なパラメーターは、ｋｔｕｐ＝１、ギャップ開始ペナルティ＝１０、ギャップ伸長ペナルティ＝１及び置換マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２である。これらのパラメーターは、Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８３巻、６３頁、１９９０年のＡｐｐｅｎｄｉｘ ２に説明されているようにスコアリングマトリックスファイル（「ＳＭＡＴＲＩＸ」）を改変することによってＦＡＳＴＡプログラムに導入することができる。
ＦＡＳＴＡは、上で開示した比を用いて核酸分子の配列同一性を判断するのにも用いることができる。ヌクレオチド配列の比較のために、ｋｔｕｐ値は、１〜６、好ましくは３〜６、最も好ましくは３であり、他のパラメーターは上述のように設定する。
図１Ａ〜１Ｃは、特定の免疫グロブリンＦｃポリペプチドのアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列番号は、ＥＵインデックス（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、１９９１年）に基づいている。示した配列は、野生型ヒト配列（「ｗｔ」；配列番号５３１）並びにＦｃ−４８８（配列番号５３２）、Ｆｃ４（配列番号５３３）、Ｆｃ５（配列番号４９２）、Ｆｃ６（配列番号５３４）及びＦｃ７（配列番号５３５）と呼ぶ５つの変異型配列を含む。軽鎖定常領域（ＬＣ）及び重鎖定常領域（ＨＣ）へのジスルフィド結合に通常関与するＣｙｓ残基を示す。“．”は、当位置における野生型との同一性を示す。＊＊＊は、停止コドンを示す。Ｃ末端Ｌｙｓ残基は、Ｆｃ６残基から除去されている。ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインの境界を示す。 図１Ａ〜１Ｃは、特定の免疫グロブリンＦｃポリペプチドのアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列番号は、ＥＵインデックス（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、１９９１年）に基づいている。示した配列は、野生型ヒト配列（「ｗｔ」；配列番号５３１）並びにＦｃ−４８８（配列番号５３２）、Ｆｃ４（配列番号５３３）、Ｆｃ５（配列番号４９２）、Ｆｃ６（配列番号５３４）及びＦｃ７（配列番号５３５）と呼ぶ５つの変異型配列を含む。軽鎖定常領域（ＬＣ）及び重鎖定常領域（ＨＣ）へのジスルフィド結合に通常関与するＣｙｓ残基を示す。“．”は、当位置における野生型との同一性を示す。＊＊＊は、停止コドンを示す。Ｃ末端Ｌｙｓ残基は、Ｆｃ６残基から除去されている。ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインの境界を示す。 図１Ａ〜１Ｃは、特定の免疫グロブリンＦｃポリペプチドのアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列番号は、ＥＵインデックス（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、１９９１年）に基づいている。示した配列は、野生型ヒト配列（「ｗｔ」；配列番号５３１）並びにＦｃ−４８８（配列番号５３２）、Ｆｃ４（配列番号５３３）、Ｆｃ５（配列番号４９２）、Ｆｃ６（配列番号５３４）及びＦｃ７（配列番号５３５）と呼ぶ５つの変異型配列を含む。軽鎖定常領域（ＬＣ）及び重鎖定常領域（ＨＣ）へのジスルフィド結合に通常関与するＣｙｓ残基を示す。“．”は、当位置における野生型との同一性を示す。＊＊＊は、停止コドンを示す。Ｃ末端Ｌｙｓ残基は、Ｆｃ６残基から除去されている。ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインの境界を示す。 図２Ａ〜２Ｃは、２つの異なる標的（本明細書では標的Ｘ及びＹと呼ぶ）に対する特異性を有するＦｖ領域を有する四価二重特異性Ｆｃ融合及びＭａｂの形を示す図である。標的Ｘに対するＦｖドメインは、縞模様の塗りつぶしにより示し、標的Ｙに対するＦｖドメインは、灰色の塗りつぶしにより示し、Ｉｇ定常ドメインは、小斑点の塗りつぶしにより示す。図２Ａは、タンデム単鎖ＦｖＦｃ融合体（ｔａｓｃＦｖ−Ｆｃ）を示し、図２Ｂは、二単鎖ＦｖＦｃ融合体（ｂｉｓｃＦｖ−Ｆｃ）を示し、図２Ｃは、カルボキシル末端に融合した単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を有する全モノクローナル抗体（ＢｉＡｂ）を示す。 図３は、予防的状況におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養発芽アッセイにおけるＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性アンタゴニストによる内皮細胞の発芽の阻害を示す図である。ＨＵＶＥＣをコートしたＣｙｔｏｄｅｘ−３ビーズをヒト間葉幹細胞とともにフィブリンゲルに埋め込み、組換えヒトＨＧＦを含むＥＧＭ−２完全培地及びＤ５５１線維芽細胞馴化培地（１：１）を用いて培養した。（実施例７５を参照。）アンタゴニスト−抗ＶＥＧＦ−Ａ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；抗ＶＥＧＦ−Ａ＋抗ＰＤＧＦＲβｍＡｂＥ９８９９の組合せ；又はＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体（ｃ１０３５／ｃ８６８ ｂｉｓｃＦｖ、ｃ１０３５／ｃ１０３９ ｂｉｓｃＦｖ、ｃ５９７／ｃ１０３９ ｂｉＡｂ又はｃ６００／ｃ１０３９ ｂｉＡｂ）を示した濃度で培養に（共培養の開始から）２日目に加えた。アンタゴニストを添加してから７日後に、細胞を固定し、抗ＰＥＣＡＭ又は抗ＳＭＡ抗体で、その後、二次抗体で染色した。次いで、細胞を倒立蛍光顕微鏡により観察し、実施例７５で述べるように内皮細胞芽長について分析した。 図４Ａ〜４Ｄは、治療的状況におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養発芽アッセイにおけるＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性アンタゴニストによる内皮細胞の発芽の阻害を示す図である。ＨＵＶＥＣをコートしたＣｙｔｏｄｅｘ−３ビーズをヒト間葉幹細胞とともにフィブリンゲルに埋め込み、組換えヒトＨＧＦを含むＥＧＭ−２完全培地及びＤ５５１線維芽細胞馴化培地（１：１）を用いて培養した。（実施例７５を参照。）アンタゴニスト−抗ＶＥＧＦ−Ａ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）或いはＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体（ｃ１０３５／ｃ８６８ ｂｉｓｃＦｖ（４Ａ）、ｃ１０３５／ｃ１０３９ ｂｉｓｃＦｖ（４Ｂ）、ｃ５９７／ｃ１０３９ ｂｉＡｂ（４Ｃ）又はｃ６００／ｃ１０３９ ｂｉＡｂ（４Ｄ））を示した濃度で培養８日目（ＥＣ芽及び周皮細胞コートが形成された後）に加えた。アンタゴニストを添加してから７日後に、細胞を固定し、抗ＰＥＣＡＭ又は抗ＳＭＡ抗体で、その後、二次抗体で染色した。次いで、細胞を倒立蛍光顕微鏡により観察し、実施例７５で述べるように内皮細胞芽長について分析した。 図４Ａ〜４Ｄは、治療的状況におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養発芽アッセイにおけるＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性アンタゴニストによる内皮細胞の発芽の阻害を示す図である。ＨＵＶＥＣをコートしたＣｙｔｏｄｅｘ−３ビーズをヒト間葉幹細胞とともにフィブリンゲルに埋め込み、組換えヒトＨＧＦを含むＥＧＭ−２完全培地及びＤ５５１線維芽細胞馴化培地（１：１）を用いて培養した。（実施例７５を参照。）アンタゴニスト−抗ＶＥＧＦ−Ａ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）或いはＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体（ｃ１０３５／ｃ８６８ ｂｉｓｃＦｖ（４Ａ）、ｃ１０３５／ｃ１０３９ ｂｉｓｃＦｖ（４Ｂ）、ｃ５９７／ｃ１０３９ ｂｉＡｂ（４Ｃ）又はｃ６００／ｃ１０３９ ｂｉＡｂ（４Ｄ））を示した濃度で培養８日目（ＥＣ芽及び周皮細胞コートが形成された後）に加えた。アンタゴニストを添加してから７日後に、細胞を固定し、抗ＰＥＣＡＭ又は抗ＳＭＡ抗体で、その後、二次抗体で染色した。次いで、細胞を倒立蛍光顕微鏡により観察し、実施例７５で述べるように内皮細胞芽長について分析した。 図４Ａ〜４Ｄは、治療的状況におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養発芽アッセイにおけるＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性アンタゴニストによる内皮細胞の発芽の阻害を示す図である。ＨＵＶＥＣをコートしたＣｙｔｏｄｅｘ−３ビーズをヒト間葉幹細胞とともにフィブリンゲルに埋め込み、組換えヒトＨＧＦを含むＥＧＭ−２完全培地及びＤ５５１線維芽細胞馴化培地（１：１）を用いて培養した。（実施例７５を参照。）アンタゴニスト−抗ＶＥＧＦ−Ａ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）或いはＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体（ｃ１０３５／ｃ８６８ ｂｉｓｃＦｖ（４Ａ）、ｃ１０３５／ｃ１０３９ ｂｉｓｃＦｖ（４Ｂ）、ｃ５９７／ｃ１０３９ ｂｉＡｂ（４Ｃ）又はｃ６００／ｃ１０３９ ｂｉＡｂ（４Ｄ））を示した濃度で培養８日目（ＥＣ芽及び周皮細胞コートが形成された後）に加えた。アンタゴニストを添加してから７日後に、細胞を固定し、抗ＰＥＣＡＭ又は抗ＳＭＡ抗体で、その後、二次抗体で染色した。次いで、細胞を倒立蛍光顕微鏡により観察し、実施例７５で述べるように内皮細胞芽長について分析した。 図４Ａ〜４Ｄは、治療的状況におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養発芽アッセイにおけるＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性アンタゴニストによる内皮細胞の発芽の阻害を示す図である。ＨＵＶＥＣをコートしたＣｙｔｏｄｅｘ−３ビーズをヒト間葉幹細胞とともにフィブリンゲルに埋め込み、組換えヒトＨＧＦを含むＥＧＭ−２完全培地及びＤ５５１線維芽細胞馴化培地（１：１）を用いて培養した。（実施例７５を参照。）アンタゴニスト−抗ＶＥＧＦ−Ａ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）或いはＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体（ｃ１０３５／ｃ８６８ ｂｉｓｃＦｖ（４Ａ）、ｃ１０３５／ｃ１０３９ ｂｉｓｃＦｖ（４Ｂ）、ｃ５９７／ｃ１０３９ ｂｉＡｂ（４Ｃ）又はｃ６００／ｃ１０３９ ｂｉＡｂ（４Ｄ））を示した濃度で培養８日目（ＥＣ芽及び周皮細胞コートが形成された後）に加えた。アンタゴニストを添加してから７日後に、細胞を固定し、抗ＰＥＣＡＭ又は抗ＳＭＡ抗体で、その後、二次抗体で染色した。次いで、細胞を倒立蛍光顕微鏡により観察し、実施例７５で述べるように内皮細胞芽長について分析した。
１．概要
本発明は、癌及び眼血管新生障害を含む、血管新生障害を治療するためのより多くの療法を提供する当技術分野における必要に対応するものである。具体的には、本発明は、ＶＥＧＦ−Ａ受容体及びＰＤＧＦＲβによるシグナル伝達を阻害するＶＥＧＦ−Ａ及びＰＤＧＦＲβアンタゴニスト、特に中和抗ＶＥＧＦ−Ａ及び抗ＰＤＧＦＲβ抗体を提供する。そのようなアンタゴニストを用いるＶＥＧＦ−Ａ及び／又はＰＤＧＦＲβによる血管新生シグナルの阻害は、新生血管形成によって少なくとも一部特徴付けられる病状を有する様々な障害の治療に有用である。例えば、腫瘍中及び腫瘍周囲のＶＥＧＦ−Ａ及び／又はＰＤＧＦＲβによる血管新生シグナルの阻害は、血管新生し、成長し、転移する腫瘍の能力を低下させる。さらに、ＶＥＧＦ−Ａ及び／又はＰＤＧＦＲβによる血管新生シグナルの阻害は、例えば、加齢性黄班変性（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、虹彩新生血管形成及び血管新生緑内障を含む、様々な眼疾患の新生血管形成の特徴を減弱させる。本明細書で述べるように、本発明のＶＥＧＦ−Ａ及びＰＤＧＦＲβアンタゴニストは、併用する場合に特に有効である。したがって、特定の好ましい実施形態において、本発明は、ＶＥＧＦ−Ａ及びＰＤＧＦＲβの両方を中和することができる二重特異性抗体を含む二重特異性薬剤、並びに血管新生に関連する障害の治療用のそのような二重特異性薬剤を用いる関連する方法を提供する。
本発明において用いるＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、ＶＥＧＦ−Ａ又はＶＥＧＦ−Ａ受容体に結合し、それにより、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ニューロピリン１及び／又はニューロピリン２などの受容体を発現する細胞上のＶＥＧＦ−Ａの活性を低下させる分子を含む。特に、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体を含む。他の適切なＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、ＶＥＧＦＲ細胞外ドメインを含む可溶性ＶＥＧＦ−Ａ受容体、並びにＶＥＧＦ−Ａとその受容体との相互作用を阻害することができる、又はその他の形でＶＥＧＦ−Ａ受容体によるＶＥＧＦ−Ａ誘導性細胞内シグナル伝達を阻害することができる小分子アンタゴニストを含む。さらに、非抗体足場に基づく結合タンパク質も用いることができる。（例えば、Ｋｏｉｄｅら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２８４巻、１１４１〜１１５１頁、１９９８年；Ｈｏｓｓｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．、１５巻、１４〜２７頁、２００６年及びその中の参考文献を参照。）本発明において用いる好ましいＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、ＰＤＧＦＲβの結合部位も含む二重特異性抗体を含む、ＶＥＧＦ−Ａに特異的に結合する抗体を含む。ＶＥＧＦ−Ａに特異的な抗体は、ＶＥＧＦ−Ａの少なくとも可溶性分泌形に結合し、また好ましくは細胞表面結合形にも結合する。
本発明において用いるＰＤＧＦＲβアンタゴニストは、ＰＤＧＦＲβ又はそのリガンドに結合し、それにより、受容体を発現する細胞上のＰＤＧＦの活性を低下させる。ＰＤＧＦＲβのリガンドには、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ及びＰＤＧＦ−Ｄがある。特に、ＰＤＧＦＲβアンタゴニストは、抗ＰＤＧＦＲβ抗体を含む。他の適切なＰＤＧＦＲβアンタゴニストには、ＰＤＧＦＲβリガンドに対する抗体（すなわち、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ及び／又はＰＤＧＦ−Ｄに対する抗体）、可溶性ＰＤＧＦＲβ、及びＰＤＧＦＲβとそのリガンドとの相互作用を阻害することができる、又はその他の形でＰＤＧＦＲβによる細胞内シグナル伝達を阻害することができる小分子アンタゴニストがある。さらに、非抗体足場に基づく結合タンパク質も用いることができる。（例えば、Ｋｏｉｄｅら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２８４巻、１１４１〜１１５１頁、１９９８年；Ｈｏｓｓｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．、１５巻、１４〜２７頁、２００６年及びその中の参考文献を参照。）本発明において用いる好ましいＰＤＧＦＲβアンタゴニストは、ＶＥＧＦ−Ａの結合部位も含む二重特異性抗体を含む、ＰＤＧＦＲβに特異的に結合する抗体を含む。
ＩＩ．抗ＰＤＧＦＲβ抗体、抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体及び関連する二重特異性結合組成物
特定の好ましい実施形態において、本発明によるＶＥＧＦ−Ａ及び／又はＰＤＧＦＲβアンタゴニストは、ＶＥＧＦ−Ａ（配列番号２の残基２７〜１９１）及び／又はＰＤＧＦＲβの細胞外ドメイン（配列番号４の残基３３〜５３１）に特異的に結合する抗体である。本発明の特に好ましい抗体は、ＶＥＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦＲβ又はＶＥＧＦ−Ａ及びＰＤＧＦＲβの両方の生物学的活性を中和する。
（１）抗体が結合活性の閾値レベルを示し、（２）抗体が対照ポリペプチド分子と有意に交差反応しない場合、抗体は特異的に結合するとみなされる。例えば、抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体が、対照（非ＶＥＧＦ−Ａ）ポリペプチドに対する結合親和性より少なくとも１０倍大きい親和性でＶＥＧＦ−Ａポリペプチド、ペプチド又はエピトープに結合する場合、結合の閾値レベルが決定される。本発明において用いる抗体は、１０６Ｍ−１以上、好ましくは１０７Ｍ−１以上、より好ましくは１０８Ｍ−１以上、最も好ましくは１０９Ｍ−１以上の結合親和性（Ｋａ）を示すことが好ましい。抗体の結合親和性は、当業者により、自動装置を用いて一般的に表面プラスモン共鳴により容易に測定することができる。他の方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析である（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ、Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、５１巻、６６０〜６７２頁、１９４９年）。
本発明の抗体は、抗原結合特異性を保持している完全な抗体の一部を含む、又はそれからなる。適切な抗体には、例えば、完全ヒト抗体；ヒト化抗体；キメラ抗体；例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ抗体フラグメントなどの抗体フラグメント；単鎖抗体；並びに抗体重若しくは軽鎖又はその混合物の単量体又は二量体がある。本発明の好ましい抗体は、モノクローナル抗体である。軽鎖を含む抗体は、カッパ又はラムダ軽鎖を含んでいてよい。
特定の実施形態において、本発明の抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭ（そのサブタイプを含む）を含むあらゆるアイソタイプの完全な免疫グロブリンを含む。本発明による完全な免疫グロブリンは、好ましくは完全なＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１又はＩｇＡ２）を含む。
［ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びその抗原結合抗体フラグメントを調製し、単離する方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、（Ｃｏｏｌｉｇａｎら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．、２００６年）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、第２版、１９８９年）；及びＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｈｕｒｒｅｌｌ編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ、１９８２年）を参照。ｓｃＦｖを含む抗原結合フラグメントは、当技術分野で公知の方法によりファージディスプレイライブラリーを用いて調製することができる。ファージディスプレイは、非抗体足場に基づく結合タンパク質の調製にも用いることができる（Ｋｏｉｄｅら、前出）。組換えヒトポリクローナル抗体を調製する方法は、Ｗｉｂｅｒｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．、９４巻、３９６〜４０５頁、２００６年；Ｍｅｉｊｅｒら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、３５８巻、７６４〜７７２頁、２００６年；Ｈａｕｒｕｍら、米国特許出願公開第２００２／０００９４５３号；及びＨａｕｒｕｍら、米国特許出願公開第２００５／０１８０９６７号により開示されている。当業者には明らかなように、これらの方法は、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ａ受容体、ＰＤＧＦＲβ及びＰＤＧＦリガンドに対する抗体の産生に同様に適用できる。
当業者には明らかなように、本発明において用いるポリクローナル抗体は、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウス及びラットなどの種々の温血動物のいずれかに免疫原性ポリペプチド又はポリペプチドフラグメントを接種することによって生成することができる。免疫原性ポリペプチドの免疫原性は、ミョウバン（水酸化アルミニウム）又はフロイントの完全若しくは不完全アジュバントなどのアジュバントを用いることによって増大させることができる。免疫化に有用なポリペプチドは、ＶＥＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦＲβ又はその一部と免疫グロブリンポリペプチド又はマルトース結合タンパク質との融合体などの融合ポリペプチドも含む。ポリペプチド免疫原は、全長分子又はその一部であってよい。ポリペプチド部分がハプテン様である場合、免疫化のために巨大分子担体（スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又は破傷風菌トキソイド）に有利に結合又は連結させることができる。
さらに、標的タンパク質又はポリペプチドに対する結合について高度に特異的である抗体の集団を単離するために、抗体を抗体標的に関連する公知のポリペプチド（例えば、例えばＶＥＧＦ−Ａ又はＰＤＧＦＲβのオルソログ、パラログ又は配列変異体）に対してスクリーニングすることができる。そのような高度に特異的な集団は、例えば、ヒトＶＥＧＦ−Ａに結合するが、マウスＶＥＧＦ−Ａには結合しない抗体を含む。関連するポリペプチド分子との交差反応性のそのような欠如は、例えば、ＶＥＧＦ−Ａポリペプチドを検出するが、公知の関連ポリペプチドを検出しない抗体により、標準的なウェスタンブロット分析（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、ＮＹ、１９９３年））又はＥＬＩＳＡ（酵素イムノアッセイ）（Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ（Ｃｈａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．、１９８７年））を用いて示される。他の例において、ＶＥＧＦ−Ａポリペプチドに対して産生させた抗体を不溶性マトリックスに付着させた関連ポリペプチドに吸着させる。ＶＥＧＦ−Ａポリペプチドに対して高度に特異的である抗体は、適切な緩衝条件下でマトリックスを通して流れる。スクリーニングにより、公知の密接に関連するポリペプチドに対して交差反応性を示さないポリクローナル及びモノクローナル抗体の単離が可能となる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８８年；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｏｌｉｇａｎら編、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．、１９９５年）。特異的抗体のスクリーニング及び単離は、当技術分野で周知である。Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ編、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、１９９３年；Ｇｅｔｚｏｆｆら、Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４３巻、１〜９８頁、１９８８年；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｇｏｄｉｎｇ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．、１９９６年）；Ｂｅｎｊａｍｉｎら、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２巻、６７〜１０１頁、１９８４年を参照。
天然モノクローナル抗体（「ｍＡｂｓ」）は、例えば、精製免疫原性タンパク質又はそのフラグメントにより対象動物（例えば、ラット又はマウス）を免疫化することによって調製することができる。一般的な方法において、動物にそれぞれ、一般的にアジュバント（例えば、完全フロイントアジュバント又はＲＩＢＩアジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから入手可能））と混合した精製タンパク質又はフラグメントの最初の腹腔内（ＩＰ）注射を行った後、例えば、２週間間隔で精製タンパク質のブースターＩＰ注射を行う。３回目のブースター注射の投与の７〜１０日後に、動物から採血し、血清を収集する。必要に応じて、追加のブースターを投与することができる。脾細胞及びリンパ節細胞を高力価動物から採取し、従来の方法を用いて骨髄腫細胞（例えば、マウスＳＰ２／０又はＡｇ８細胞）に融合させる。次いで、融合混合物を胸腺細胞の支持細胞層上で培養するか、又は適切な培地添加剤（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｆｕｓｉｏｎ及びＣｌｏｎｉｎｇ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）などの市販の添加剤を含む）を用いて培養する。融合後約１０日後に、標準のアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）を用いて特異的抗体産生ハイブリドーマプールを同定する。陽性プールは、標的タンパク質の活性を阻害又は低下させるそれらの能力についてさらに分析することができる。陽性プールを限界希釈によりクローニングする。
特定の態様において、本発明は、単一標的分子上の異なるエピトープに対して特異的である複数のモノクローナル抗体の使用も含む。そのような複数の抗体の併用は、単一抗体で認められる担体効果を減少させることができ、Ｆｃ受容体によるクリアランスの速度を増加させ、ＡＤＣＣを改善することもできる。２つ、３つ又はそれ以上のモノクローナル抗体を併用することができる。
天然抗体のアミノ酸配列は、組換えＤＮＡ技術の適用により変化させることができる。したがって、抗体は、所望の特徴を得るために再設計することができる。改変抗体は、例えば、その非改変形と比較して安定性及び／又は治療有効性の改善をもたらし得る。可能な変化は、多く、たった１個又は数個のアミノ酸の変更から、例えば可変又は定常領域の完全な再設計までに及ぶ。定常領域の変更は、一般的に、補体結合、膜との相互作用及び他のエフェクター機能などの特性を改善し又は変化させるために行われる。操作された定常領域配列の例を図１Ａ〜１Ｃに示す（配列番号４９２及び５３２〜５３５）。一般的に、可変領域の変更は、抗原結合特性を改善し、可変領域の安定性を改善し、又は免疫原性のリスクを低減するために行われる。ファージディスプレイ技術も用いることができる。例えば、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６巻、１２７５〜１２８１頁、１９８９年；Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，５７１，６９８号を参照。
ヒトで用いるための治療用抗体については、公知の方法により抗体の非ヒト領域をヒト化することが通常望ましい。ヒト化抗体を調製する方法は、例えば、米国特許第５，５３０，１０１号、第５，８２１，３３７号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６２号及び第６，１８０，３７０号に開示されている。一般的に、ヒト化抗ＰＤＧＦＲβ又は抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、マウスドナー免疫グロブリンの相補性決定領域（ＣＤＲ）並びにヒト受容体免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖フレームワークを含む。しばしば、ヒトフレームワーク領域におけるフレームワーク残基は、抗原結合を変化させ、好ましくは改善するために、ＣＤＲドナー抗体の対応する残基で置換する。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法により、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用のモデリング及び特定の位置における異常なフレームワーク残基を同定するための配列の比較により同定される。（例えば、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻、３２３頁、１９８８年を参照。）
非ヒト化キメラ抗体も（例えば、免疫抑制患者において）治療的に用いることができる。したがって、いくつかの変形形態において、本発明による抗体は、とりわけ、非ヒト抗ＰＤＧＦＲβ又は抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体由来のキメラ抗体である。好ましくは、キメラ抗体は、ヒト対象に投与したとき、キメラ抗体がより長い半減期を有し、免疫原性がより低いように、マウス又はラット抗体由来の可変領域及びヒト由来の定常領域を含む。キメラ抗体を製造する方法は、当技術分野で公知である。（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻、１２０２頁、１９８５年；Ｏｉら、Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４巻、２１４頁、１９８６年；Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、１２５巻、１９１〜２０２頁、１９８９年；米国特許第５，８０７，７１５号；第４，８１６，５６７号；及び第４，８１６，３９７号を参照。）
本発明は、卵巣、乳、腎、結腸直腸、肺、子宮内膜又は脳癌患者の末梢血単核細胞由来のものなどの完全なヒト抗体も含む。そのような細胞は、例えば、ＰＤＧＦＲβ又はＶＥＧＦ−Ａに対する完全なヒト抗体を産生するハイブリドーマを形成するために骨髄腫細胞と融合させることができる。ヒト抗体は、トランスジェニック非ヒト動物、一般的にマウスにおいても産生させることができる。例えば、Ｔｏｍｉｚｕｋａら、米国特許第７，０４１，８７０号を参照。一般的に、ヒト以外の哺乳動物をヒト重鎖遺伝子座及びヒト軽鎖遺伝子座についてトランスジェニックとし、対応する内因性免疫グロブリン遺伝子座を不活性化させる。
本発明の抗体は、それらが認識又は特異的に結合するＶＥＧＦ−Ａ又はＰＤＧＦＲβポリペプチドのエピトープ又は部分によって特定することができる。エピトープ又はポリペプチド部分は、例えば、配列番号２に示すＶＥＧＦ−Ａポリペプチド又は配列番号４に示すＰＤＧＦＲβポリペプチドのエピトープ又は他の部分のＮ末端及びＣ末端位置によって特定することができる。
本発明の抗体は、５×１０−２Ｍ未満、１０−２Ｍ未満、５×１０−３Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、５×１０−５Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１５Ｍ未満、又は１０−１５Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）を含む結合親和性を有する。
本発明の抗体は、例えば、共有結合が抗体がそのエピトープに結合することを妨げないような種類の分子の抗体への共有結合により修飾されている誘導体をさらに含む。適切な修飾は、例えば、フコシル化、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化及びアミド化を含む。抗体及びその誘導体は、それら自体、公知の保護／遮断基、タンパク質分解切断、細胞リガンド又は他のタンパク質への結合などによって誘導体化することができる。本発明のいくつかの実施形態において、抗体の少なくとも１つの重鎖をフコシル化する。特定の変形形態において、フコシル化は、Ｎ−結合性である。いくつかの特定の好ましい実施形態において、抗体の少なくとも１つの重鎖は、フコシル化Ｎ−結合オリゴ糖を含む。
本発明の抗体は、単独で、又は細胞毒性薬との免疫コンジュゲートとして用いることができる。いくつかの実施形態において、薬剤は、化学療法薬である。他の実施形態において、薬剤は、例えば、鉛２１２、ビスマス２１２、アスタチン２１１、ヨウ素１３１、スカンジウム４７、レニウム１８６、レニウム１８８、イットリウム９０、ヨウ素１２３、ヨウ素１２５、臭素７７、インジウム１１１又はホウ素１０若しくはアクチニドなどの核分裂性核種などの放射性同位体である。さらに他の実施形態において、薬剤は、例えば、リシン、修飾シュードモナスエンテロトキシンＡ、カリケアマイシン、アドリアマイシン、５−フルオロウラシル、オーリスタチン（例えば、オーリスタチンＥ）、メイタンシンなどの毒素又は細胞毒性薬である。抗体及び抗体フラグメントをそのような薬剤へとコンジュゲートする方法は、当技術分野で公知である。
本発明の抗体は、変異体が参照抗体の１つ又は複数の生物学的特性（例えば、それらの対構造（ＰＤＧＦリガンド又はＶＥＧＦ−Ａ受容体）へのＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａの結合を阻害し、ＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａの生物学的活性を阻害する、結合親和性）を保持するような、参照抗体（例えば、表２又は表４に示すようなＶＬ及び／又はＶＨ配列を有する参照抗体）に対する単一又は複数のアミノ酸置換、欠失、付加又は交換を有する変異体を含む。当業者は、単一又は複数のアミノ酸置換、欠失、付加又は交換を有する変異体を生成させることができる。これらの変異体は、例えば、（ａ）１つ又は複数のアミノ酸残基が保存的又は非保存的アミノ酸で置換されている変異体、（ｂ）１つ又は複数のアミノ酸がポリペプチドに付加されている、又はそれから欠失している変異体、（ｃ）１つ又は複数のアミノ酸が置換基を含む変異体、及び（ｄ）ポリペプチドが、例えば、抗体に対するエピトープ、ポリヒスチジン配列、ビオチン部分などのポリペプチドに有用な特性を付与する可能性がある融合パートナー、タンパク質タグ又は他の化学的部分などの他のペプチド又はポリペプチドと融合している変異体を含む。本発明の抗体は、１つの種のアミノ酸残基が他の種の対応する残基に保存的又は非保存的位置において置換されている変異体を含むことができる。他の実施形態において、非保存的位置のアミノ酸残基が保存的又は非保存的残基により置換されている。遺伝学的（阻害、欠失、突然変異など）、化学的及び酵素的技術を含む、これらの変異体を得るための技術は、当業者に公知である。
本発明は、ＰＤＧＦＲβ及びＶＥＧＦ−Ａの両方に結合する二重特異性抗体も含む。そのような二重特異性ＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、本明細書でさらに述べる。
ＰＤＧＦＲβ及びＶＥＧＦ−Ａに結合する例示的な抗体は、ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって同定されている。ファージディスプレイによりスクリーニングする方法は、Ｂａｂａｓ、Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ Ｐｒｅｓｓ、２００１年）及びＬｏ、Ｂｅｎｎｙ Ｋ．Ｃ．、Ａ．、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２００４年）などの標準参考書に詳細に記載されている。そのようなファージディスプレイライブラリーは、相補的な結合実体を機能的に単離できるように細胞及び他の物質の表面上に発現タンパク質を提示するのに用いることができる。１つのそのようなファージディスプレイライブラリーにおいて、抗体軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の一部をヒト抗体配列をコードする合成ＤＮＡと結合させ、次にこれをファージ及びファージミドライブラリー上にＦａｂ抗体フラグメントとして提示する（Ｄｙａｘ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｄｙａｘ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）。したがって、抗体の可変軽及び重鎖フラグメントをＦａｂの形で単離することができる。次いで、これらの可変領域を操作して、ｓｃＦｖ、二重特異性ｓｃＦｖなどの抗原結合フラグメントを含む抗体、並びにＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａに対する多重特異性、多機能性アンタゴニストを生成することができる。
この技術を用いて、例示的なＦａｂの可変領域は、本明細書で述べるアッセイにおいてＰＤＧＦＲβ又はＶＥＧＦ−Ａに結合し、かつ／又は中和するそれらの特徴について確認されている。（下の実施例を参照。）これらの可変領域を操作して、ＰＤＧＦＲβ又はＶＥＧＦ−Ａに結合し、かつ／又は中和するｓｃＦｖを含む、種々の結合実体を生成させた。下の表２及び４にＰＤＧＦＲβ及びＶＥＧＦ−Ａのいずれかに結合し、中和するそれらの能力について確認された抗ＰＤＧＦＲβ及び抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体クラスターのヌクレオチド及びアミノ酸配列番号表示を示し、表３及び５に表２及び４に列挙した抗ＰＤＧＦＲβ及び抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体のフレームワーク及びＣＤＲ領域に対応するアミノ酸残基位置を列挙する。
表２〜５に列挙した抗ＰＤＧＦＲβ及び抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体をコンセンサスＣＤＲのファミリーにグループ分けした。下の表５に抗ＰＤＧＦＲβ及び抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体のコンセンサスＣＤＲを示す。
特定の実施形態において、本発明の抗ＰＤＧＦＲβ又は抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、表６のＣＤＲファミリーＡ、Ｂ又はＣについて示すような１つ又は複数のコンセンサスＣＤＲを含む。例えば、特定の実施形態において、抗体は、表６のＣＤＲファミリーＡ、Ｂ又はＣについて示すような重鎖コンセンサスＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３領域の少なくとも１つ）及び／又は対応する軽鎖コンセンサスＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３領域の少なくとも１つ）を含む。典型的な実施形態において、抗ＰＤＧＦＲβ抗体は、表６のＣＤＲファミリーＡ、Ｂ又はＣについて示すような２つ若しくは３つの重鎖コンセンサスＣＤＲ及び／又は２つ若しくは３つの軽鎖コンセンサスＣＤＲを含む。特定の実施形態において、抗ＰＤＧＦＲβ又は抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体が表６のＣＤＲファミリーＡ、Ｂ又はＣについて示すような少なくとも１つの重鎖コンセンサスＣＤＲを有する場合、抗体は、同じＣＤＲファミリーの少なくとも１つの軽鎖コンセンサスＣＤＲをさらに含む。
いくつかの実施形態において、本発明の抗ＰＤＧＦＲβ又は抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、表２又は４に列挙した抗ＰＤＧＦＲβ又は抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体の１つ又は複数のＣＤＲ（それぞれ表３及び５に示す対応するＣＤＲ領域の境界）を含む。例えば、特定の変形形態において、抗体は、表２又は４に列挙した抗体の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３領域の少なくとも１つ）及び／又は対応する軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３領域の少なくとも１つ）を含む。典型的な実施形態において、抗ＰＤＧＦＲβ又は抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、表２又は４に列挙した抗体の２つ若しくは３つの重鎖ＣＤＲ及び／又は２つ若しくは３つの軽鎖ＣＤＲを有する。いくつかの変形形態において、抗ＰＤＧＦＲβ又は抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体が表２又は４に列挙した抗体の少なくとも１つの重鎖ＣＤＲを有する場合、抗体は、少なくとも１つの対応する軽鎖ＣＤＲをさらに含む。
特定の典型的な実施形態において、抗ＰＤＧＦＲβ又は抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、重及び／又は軽鎖可変ドメインを含み、重又は軽鎖可変ドメインは、（ａ）表６のＣＤＲファミリーＡ、Ｂ又はＣについて示すような重又は軽鎖コンセンサスＣＤＲに対応する３つのＣＤＲの組、並びに（ｂ）４つのフレームワーク領域の組を有する。
特定の変形形態において、抗ＰＤＧＦＲβ又は抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、重及び／又は軽鎖可変ドメインを含み、重又は軽鎖可変ドメインは、（ａ）表２又は４に列挙した抗体について示すような重又は軽鎖ＣＤＲに対応する３つのＣＤＲの組、並びに（ｂ）４つのフレームワーク領域の組を有する。例えば、抗ＰＤＧＦＲβ又は抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、重及び／又は軽鎖可変ドメインを含んでいてよく、重又は軽鎖可変ドメインは、（ａ）ＣＤＲの組が表２又は４に列挙した抗体からのものである、３つのＣＤＲの組、並びに（ｂ）フレームワーク領域の組が表２又は４に示す同じ抗体のフレームワーク領域の組と同一又は異なる、４つのフレームワーク領域の組を有する。
特定の実施形態において、抗ＰＤＧＦＲβ又は抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、表２又は４に列挙した抗体の重及び／又は軽鎖可変領域（単数又は複数）と実質的に同一である重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含む。
したがって、特定の実施形態において、抗ＰＤＧＦＲβ抗体は、（ａ）表２に列挙したＶＨポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは少なくとも９９．５％同一である重鎖可変ドメイン及び／又は（ｂ）表２に列挙したＶＬポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは少なくとも９９．５％同一である軽鎖可変ドメインを有する。特定の実施形態において、抗ＰＤＧＦＲβ抗体は、表２に列挙したＶＨポリペプチドのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び／又は（ｂ）表２に列挙したＶＬポリペプチドのアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。典型的には、抗体が重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインの両方を含む場合、重及び軽鎖は、表２の同じ参照抗体に対応する。例えば、特定の実施形態において、抗ＰＤＧＦＲβ抗体は、次のＶＬ／ＶＨ配列対から選択される各ＶＬ及びＶＨアミノ酸配列を有する軽及び重鎖可変ドメインを含む：配列番号６及び８；配列番号１０及び１２；配列番号１４及び１６；配列番号１８及び２０；配列番号２２及び２４；配列番号２６及び２８；配列番号３０及び３２；配列番号３４及び３６；配列番号３８及び４０；配列番号４２及び４４；配列番号４６及び４８；配列番号５０及び５２；配列番号５４及び５６；配列番号５８及び６０；配列番号６２及び６４；配列番号６６及び６８；配列番号７０及び７２；配列番号７４及び７６；配列番号７８及び８０；配列番号８２及び８４；配列番号８６及び８８；配列番号９０及び９２；配列番号９４及び９６；配列番号９８及び１００；配列番号１０２及び１０４；配列番号１０６及び１０８；配列番号１１０及び１１２；配列番号１１４及び１１６；配列番号１１８及び１２０；配列番号１２２及び１２４；配列番号１２６及び１２８；配列番号１３０及び１３２；配列番号１３４及び１３６；配列番号１３８及び１４０；配列番号１４２及び１４４；配列番号１４６及び１４８；配列番号１５０及び１５２；配列番号１５４及び１５６；配列番号１５８及び１６０；及び配列番号１６２及び１６４。
他の実施形態において、抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、（ａ）表４に列挙したＶＨポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは少なくとも９９．５％同一である重鎖可変ドメイン及び／又は（ｂ）表４に列挙したＶＬポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは少なくとも９９．５％同一である軽鎖可変ドメインを有する。特定の実施形態において、抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、表４に列挙したＶＨポリペプチドのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び／又は（ｂ）表４に列挙したＶＬポリペプチドのアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。典型的には、抗体が重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインの両方を含む場合、重及び軽鎖は、表４の同じ参照抗体に対応する。例えば、特定の実施形態において、抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、次のＶＬ／ＶＨ配列対から選択される各ＶＬ及びＶＨアミノ酸配列を有する軽及び重鎖可変ドメインを含む：配列番号１６６及び１６８；配列番号１７０及び１７２；配列番号１７４及び１７６；配列番号１７８及び１８０；配列番号１８２及び１８４；配列番号１８６及び１８８；配列番号１９０及び１９２；配列番号１９４及び１９６；配列番号１９８及び２００；配列番号２０２及び２０４；配列番号２０６及び２０８；配列番号２１０及び２１２；配列番号２１４及び２１６；配列番号２１８及び２２０；配列番号２２２及び２２４；配列番号２２６及び２２８；配列番号２３０及び２３２；配列番号２３４及び２３６；配列番号２３８及び２４０；配列番号２４２及び２４４；配列番号２４６及び２４８；配列番号２５０及び２５２；配列番号２５４及び２５６；配列番号２５８及び２６０；配列番号２６２及び２６４；配列番号２６６及び２６８；配列番号２７０及び２７２；配列番号２７４及び２７６；配列番号２７８及び２８０；配列番号２８２及び２８４；配列番号２８６及び２８８；配列番号２９０及び２９２；配列番号２９４及び２９６；配列番号２９８及び３００；配列番号３０２及び３０４；配列番号３０６及び３０８；配列番号３１０及び３１２；配列番号３１４及び３１６；配列番号３１８及び３２０；配列番号３２２及び３２４；配列番号３２６及び３２８；配列番号３３０及び３３２；配列番号３３４及び３３６；配列番号３３８及び３４０；配列番号３４２及び３４４；配列番号３４６及び３４８；配列番号３５０及び３５２；配列番号３５４及び３５６；配列番号３５８及び３６０；配列番号３６２及び３６４；配列番号３６６及び３６８；配列番号３７０及び３７２；配列番号３７４及び３７６；配列番号３７８及び３８０；配列番号３８２及び３８４；配列番号３８６及び３８８；配列番号３９０及び３９２；配列番号３９４及び３９６；配列番号３９８及び４００；配列番号４０２及び４０４；配列番号４０６及び４０８；配列番号４１０及び４１２；配列番号４１４及び４１６；配列番号４１８及び４２０；配列番号４２２及び４２４；配列番号４２６及び４２８；及び配列番号４３０及び４３２。
いくつかの実施形態において、本発明による抗体は、表２又は４に列挙したＶＬ又はＶＨポリペプチドのＣＤＲ（それぞれ表３及び５に示すＣＤＲアミノ酸範囲）に対して０個、１個、２個、３個又は４個のアミノ酸置換を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む重及び／又は軽鎖可変領域を含む。特定の変形形態において、例えば、本発明による抗ＰＤＧＦＲβ抗体は、重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のＣＤＲを含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３の少なくとも１つが表２に示すＶＨポリペプチドに対して０個、１個、２個、３個又は４個のアミノ酸置換を含む。他の変形形態において、本発明による抗ＰＤＧＦＲβ抗体は、軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のＣＤＲを含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の少なくとも１つが表２に示すＶＬポリペプチドに対して０個、１個、２個、３個又は４個のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、抗ＰＤＧＦＲβ抗体は、上のような重鎖及び軽鎖ＣＤＲの両方の組を含む。特に適切な抗ＰＤＧＦＲβ抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のＣＤＲを含む軽鎖可変ドメイン並びにＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のＣＤＲを含む重鎖可変ドメインを含み、重及び軽鎖ＣＤＲの前記組は、表２に示す抗体の重及び軽鎖ＣＤＲに対して６個以下、典型的には５個以下、より典型的には４個以下、最も典型的には３個以下のアミノ酸置換を有する。
他の変形形態において、本発明による抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のＣＤＲを含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３の少なくとも１つは、表４に列挙したＶＨポリペプチドに対して０個、１個、２個、３個又は４個のアミノ酸置換を含む。他の変形形態において、本発明による抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のＣＤＲを含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の少なくとも１つは、表４に列挙したＶＬポリペプチドに対して０個、１個、２個、３個又は４個のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、上のような重鎖及び軽鎖ＣＤＲの両方の組を含む。特に適切な抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のＣＤＲを含む軽鎖可変ドメイン並びにＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のＣＤＲを含む重鎖可変ドメインを含み、重及び軽鎖ＣＤＲの前記組は、表４に列挙した抗体の重及び軽鎖ＣＤＲに対して６個以下、典型的には５個以下、より典型的には４個以下、最も典型的には３個以下のアミノ酸置換を有する。
特定の実施形態において、本発明による抗ＰＤＧＦＲβ抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＬドメイン並びにＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＨドメインを含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号４３３に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号４３４に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号４３５に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１は、配列番号４３６に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号４３７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号４３８〜４４２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。抗ＰＤＧＦＲβ抗体のいくつかのそのような実施形態において、ＬＣＤＲ１は、配列番号４４３に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号４４４に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１は、配列番号４４５に示すアミノ酸配列を有する。例えば、いくつかの変形形態において、ＬＣＤＲ１は、配列番号４４３に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号４３４に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号４４４に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１は、配列番号４４６に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号４４７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号４４１又は配列番号４４２に示すアミノ酸配列を有する。他の変形形態において、ＬＣＤＲ１は、配列番号４４３に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号４３４に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号４４４に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、ｃ５９７、９７５、ｃ６００、ｃ９４１、ｃ９４９及びｃ１０３５からなる群より選択される抗体の重鎖ＣＤＲを有する。
抗ＰＤＧＦＲβ抗体の他の実施形態において、ＬＣＤＲ１は、配列番号４３３に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、ｃ５９７及びｃ６００からなる群より選択される抗体のＬＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号６又は１０の残基５６〜６２）を有し、ＬＣＤＲ３は、ｃ５９７、ｃ６００及びｃ１０３５からなる群より選択される抗体のＬＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号６、１０又は４６の残基９５〜１０３）を有し、ＨＣＤＲ１は、ｃ５９７、ｃ６００、ｃ９４１、ｃ９４９及びｃ１０３５からなる群より選択される抗体のＨＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号８、１２、２４、３６又は４８の残基３１〜３５）を有し、ＨＣＤＲ２は、ｃ５９７、ｃ６００、ｃ９４１、ｃ９４９及びｃ１０３５からなる群より選択される抗体のＨＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号８、１２、２４、３６又は４８の残基５０〜６６）を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号４３８〜４４２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、ｃ５９７、ｃ６００、ｃ９４１、ｃ９４９、ｃ９７５及びｃ１０３５からなる群より選択される抗体のＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列を有する。特定の変形形態において、抗体は、ｃ５９７、ｃ６００、ｃ９４１、ｃ９４９、ｃ９７５及びｃ１０３５からなる群より選択される抗体のＶＬ及びＶＨドメインを含む。
他の実施形態において、本発明による抗ＰＤＧＦＲβ抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＬドメイン並びにＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＨドメインを含み、ＶＬ及びＶＨのＣＤＲの前記組は、ＣＤＲの第２の組に対して３個以下のアミノ酸置換を有し、ＣＤＲの前記第２の組は、ｃ５９７、ｃ６００、ｃ９４１、ｃ９４９、ｃ９７５、及びｃ１０３５からなる群より選択される抗体のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列を有する。特定の変形形態において、抗体は、ＣＤＲの前記組における０個、１個又は２個のアミノ酸置換を含む。
他の実施形態において、本発明による抗ＰＤＧＦＲβ抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＬドメイン並びにＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＨドメインを含み、ＶＬ及びＶＨのＣＤＲの前記組は、抗体のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列がクラスター表示ｃ６１３を有するＣＤＲの第２の組に対して３個以下のアミノ酸置換を有する。特定の変形形態において、抗体は、ＣＤＲの前記組における０個、１個又は２個のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、抗体ｃ６１３のＣＤＲを含む。例えば、特定の変形形態において、抗体は、抗体ｃ６１３のＶＬ及びＶＨドメインを含む（すなわち、ＶＬドメインは、配列番号１８に示すアミノ酸配列を含み、ＶＨドメインは、配列番号２０に示すアミノ酸配列を含む）。
特定の実施形態において、本発明による抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＬドメイン並びにＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＨドメインを含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号４４８に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号４４９に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号４５０に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１は、配列番号４５１に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号４５２に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号４５３〜４６１からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。ＶＥＧＦ−Ａ抗体のいくつかのそのような実施形態において、ＬＣＤＲ１は、配列番号４６２に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号４６４に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号４６６に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１は、配列番号４６８に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号４７０に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号４５３〜４５９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。そのような抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体の特定の変形形態において、ＬＣＤＲ１及びＬＣＤＲ２は、ｃ６３６、ｃ８６８、ｃ１０３９、ｃ１０９２、ｃ１１１１、ｃ１１３５、ｃ１２７０、ｃ１４１０及びｃ１４７６からなる群より選択される抗体のＬＣＤＲ１及びＬＣＤＲ２アミノ酸配列（それぞれ配列番号１７０、配列番号２４２、配列番号２７８、配列番号３０６、配列番号３２２、配列番号３３０、配列番号３７４、配列番号３９４又は配列番号４２６の残基２４〜３４及び残基５０〜５６に示すアミノ酸配列）を有する。いくつかのそのような変形形態において、ＨＣＤＲ１は、ｃ６３６、ｃ８６８、ｃ１０３９、ｃ１０９２及びｃ１１１１からなる群より選択される抗体のＨＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号１７２、２４４、２８０、３０８又は３２４の残基３１〜３５）を有し、ＨＣＤＲ１が抗体ｃ１０３９のＨＣＤＲ１アミノ酸配列を有する特定の実施形態において、ＨＣＤＲ２は、ｃ１０３９、ｃ１２７０及びｃ１４７６からなる群より選択される抗体のＨＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号２８０、３７６又は４２８の残基５０〜６６）を場合によっては有する。
本発明による抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体のいくつかの実施形態において、ＬＣＤＲ１は、配列番号４６３に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号４６５に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号４６７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１は、抗体ｃ１０３９のＨＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号２８０の残基３１〜３５）を有し、ＨＣＤＲ２は、抗体ｃ１０３９のＨＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号２８０の残基５０〜６６）を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号４５３〜４６１からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。いくつかのそのような実施形態において、ＨＣＤＲ３は、配列番号４５３、４５８及び４５９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
本発明による抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体の他の実施形態において、ＬＣＤＲ１は、ｃ６３６、ｃ１１３５、ｃ１４１０及びｃ１４７６からなる群より選択される抗体のＬＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号１７０、３３０、３９４又は４２６の残基２４〜３４）を有し、ＬＣＤＲ２は、ｃ６３６、ｃ８６８、ｃ１１１１、ｃ１１３５、ｃ１４１０及びｃ１４７６からなる群より選択される抗体のＬＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号１７０、２４２、３２２、３３０、３９４又は４２６の残基５０〜５６）を有し、ＬＣＤＲ３は、ｃ６３６、ｃ８６８、ｃ１０３９、ｃ１４１０及びｃ１４７６からなる群より選択される抗体のＬＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号１７０、２４２、２７８、３９４又は４２６の残基８９〜９７）を有し、ＨＣＤＲ１は、ｃ６３６、ｃ８６８、ｃ１０３９、ｃ１０９２及びｃ１１１１からなる群より選択される抗体のＨＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号１７２、２４４、２８０、３０８又は３２４の残基３１〜３５）を有し、ＨＣＤＲ２は、ｃ６３６、ｃ８６８、ｃ１０３９及びｃ１１１１からなる群より選択される抗体のＨＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号１７２、２４４、２８０又は３２４の残基５０〜６６）を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号４５３〜４６１からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。特定の変形形態において、抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、ｃ６３６、ｃ８６８、ｃ１０３９ ＣＤＲ；ｃ１０９２；ｃ１１１１；ｃ１１３５；ｃ１２７０；ｃ１４１０；及びｃ１４７６からなる群より選択される抗体のＣＤＲ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を有する。例えば、特定の実施形態において、抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、ｃ６３６、ｃ８６８、ｃ１０３９ ＣＤＲ；ｃ１０９２；ｃ１１１１；ｃ１１３５；ｃ１２７０；ｃ１４１０；及びｃ１４７６からなる群より選択される抗体の軽及び重鎖可変ドメイン（ＶＬ及びＶＨ）を有する。
他の実施形態において、本発明による抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＬドメイン並びにＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＨドメインを含み、ＶＬ及びＶＨのＣＤＲの前記組は、ＣＤＲの第２の組に対して３個以下のアミノ酸置換を有し、ＣＤＲの前記第２の組は、ｃ６３６、ｃ８６８、ｃ１０３９ ＣＤＲ；ｃ１０９２；ｃ１１１１；ｃ１１３５；ｃ１２７０；ｃ１４１０；及びｃ１４７６からなる群より選択される抗体のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列を有する。特定の変形形態において、抗体は、ＣＤＲの前記組における０個、１個又は２個のアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態において、本発明による抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＬドメイン並びにＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＨドメインを含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号４６２に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号４６３に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号４６４及び４６５からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１は、配列番号４６６に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号４６７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号４６８〜４７０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。いくつかのそのような実施形態において、ＬＣＤＲ１は、配列番号４７１に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号４７４に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１は、配列番号４７７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号４７８に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号４６８及び４６９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体の他のそのような実施形態において、ＬＣＤＲ１は、配列番号４７２に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号４７５に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１は、配列番号４７７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号４７８に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号４６８及び４６９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。特定の変形形態において、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、抗体ｃ８７０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列（それぞれ配列番号２４８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０２に示す）を有する。いくつかのそのような変形形態において、ＬＣＤＲ２は、配列番号４７９に示すアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号４８０に示すアミノ酸配列を有する。
本発明による抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体の他の実施形態において、ＬＣＤＲ１は、ｃ７５２、ｃ８７０、ｃ１０３６、ｃ１０４４、ｃ１０９４ｃ１１５５及びｃ１２５７からなる群より選択される抗体のＬＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号２１４、２４６、２７４、２８６、３１０、３３８又は３５４の残基２３〜３５）を有し、ＬＣＤＲ２は、ｃ７５２、ｃ８７０、ｃ１０３６、ｃ１０４４、ｃ１０９４、ｃ１１５５及びｃ１２５７からなる群より選択される抗体のＬＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号２１４、２４６、２７４、２８６、３１０、３３８又は３５４の残基５１〜５７）を有し、ＬＣＤＲ３は、ｃ７５２、ｃ８７０、ｃ１０３６、ｃ１０４４、ｃ１０９４、ｃ１１５５及びｃ１２５７からなる群より選択される抗体のＬＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号２１４、２４６、２７４、２８６、３１０又は３３８の残基９０〜１００）を有し、ＨＣＤＲ１は、ｃ７５２、ｃ８７０及びｃ１２５７からなる群より選択される抗体のＨＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号２１６、２４８又は３５６の残基３１〜３５）を有し、ＨＣＤＲ２は、ｃ７５２、ｃ８７０及びｃ１２５７からなる群より選択される抗体のＨＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号２１６、２４８又は３５６の残基５０〜６６）を有する。特定の変形形態において、抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、ｃ７５２、ｃ８７０、ｃ１０３６、ｃ１０４４、ｃ１０９４、ｃ１１５５及びｃ１２５７からなる群より選択される抗体のＣＤＲ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を有する。例えば、特定の実施形態において、抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、ｃ７５２、ｃ８７０、ｃ１０３６、ｃ１０４４、ｃ１０９４、ｃ１１５５及びｃ１２５７からなる群より選択される抗体の軽及び重鎖可変ドメイン（ＶＬ及びＶＨ）を有する。
さらに他の実施形態において、本発明による抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＬドメイン並びにＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＨドメインを含み、ＶＬ及びＶＨのＣＤＲの前記組は、ＣＤＲの第２の組に対して３個以下のアミノ酸置換を有し、ＣＤＲの前記第２の組は、ｃ７５２、ｃ８７０、ｃ１０３６、ｃ１０４４、ｃ１０９４、ｃ１１５５及びｃ１２５７からなる群より選択される抗体のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列を有する。特定の変形形態において、抗体は、ＣＤＲの前記組における０個、１個又は２個のアミノ酸置換を含む。
本発明による抗ＰＤＧＦＲβ抗体により認識されるエピトープは、典型的にはヒトＰＤＧＦＲβの細胞外ドメインの５個以上のアミノ酸（配列番号４のアミノ酸残基３３〜５３１）を含む。好ましいエピトープは、ＰＤＧＦＲβの１つ又は複数の次のポリペプチド領域内に含まれる少なくとも１つのアミノ酸を含む：ＬＶＶＴＬＨＥＫＫＧＤＶＡＬＰＶＰＹＤＨ（配列番号４の残基１５６〜１７５）；ＤＲＥＶＤＳＤＡＹＹ（配列番号４のアミノ酸残基１９６〜２０５）；ＫＴＴＩＧＤＲＥＶＤＳＤＡＹＹＶＹＲＬＱ（配列番号４の残基１９１〜２１０）；ＩＴＬＭＣＩＶＩＧＮＥＶＶＮＦＥＷＴＹＰ（配列番号４の残基２３１〜２５０）；及びＲＫＥＳＧＲＬＶＥＰＶＴＤＦＬＬＤＭＰＹ（配列番号４の残基２５１〜２７０）。特定の実施形態において、エピトープは、配列番号４の残基１９６〜２０５及び２５１〜２７０に示すような１つ又は複数のＰＤＧＦＲβポリペプチド領域の少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個又は少なくとも７個のアミノ酸を含む。いくつかの変形形態において、そのようなＰＤＧＦＲβエピトープは、オーバーラップしているＰＤＧＦＲβエピトープ（例えば、連続ペプチドの各対の間の５アミノ酸のシフトを有する例えば２０ｍｅｒペプチド）の使用を含むペプチドマイクロアレイエピトープマッピングにより決定されるエピトープである。
いくつかの関連する変形形態において、本発明による抗ＰＤＧＦＲβ抗体は、配列番号４のアミノ酸残基２５１〜２７０に示すＰＤＧＦＲβの第１のポリペプチド領域内に含まれる１つ又は複数のアミノ酸を含むエピトープに結合する。このエピトープ特異性を有する例示的な抗ＰＤＧＦＲβ抗体は、次のＶＬ／ＶＨ配列対から選択されるそれぞれのＶＬ及びＶＨアミノ酸配列を有する軽及び重鎖可変ドメインを含む抗体を含む；配列番号６及び８；配列番号１０及び１２；配列番号２２及び２４；並びに配列番号４６及び４８。特定の実施形態において、エピトープは、配列番号４のアミノ酸残基１９６〜２０５又は１９１〜２１０に示すＰＤＧＦＲβの第２のポリペプチド領域内に含まれる１つ又は複数のアミノ酸をさらに含む。このクラスの例示的な抗ＰＤＧＦＲβ抗体は、次のＶＬ／ＶＨ配列対から選択されるそれぞれのＶＬ及びＶＨアミノ酸配列を有する軽及び重鎖可変ドメインを含む抗体を含む；配列番号２２及び２４；並びに配列番号４６及び４８。
他の関連する実施形態において、本発明による抗ＰＤＧＦＲβ抗体は、上で指定した１つ又は複数のＰＤＧＦＲβポリペプチド領域に対応する固定化ＰＤＧＦＲβ由来ペプチドに特異的に結合することができる。典型的には、抗ＰＤＧＦＲβ抗体は、配列番号４におけるシステイン残基に対応するアミノ酸がセリンで置換されている、そのようなＰＤＧＦＲβ由来ペプチドに結合することができる。いくつかの実施形態において、ＰＤＧＦＲβ由来ペプチドは、配列番号４の１０、１５、２０、２２、２５、２７又は３０個の連続したアミノ酸からなり、システイン残基に対応する任意のアミノ酸がセリンで置換されている。
特定の変形形態において、抗ＰＤＧＦＲβ抗体は、次のものから選択されるアミノ酸配列を含むＰＤＧＦＲβ由来ペプチドに結合することができる：ＤＲＥＶＤＳＤＡＹＹ（配列番号５８３）、ＲＫＥＳＧＲＬＶＥＰＶＴＤＦＬＬＤＭＰＹ（配列番号５６９）、ＬＶＶＴＬＨＥＫＫＧＤＶＡＬＰＶＰＹＤＨ（配列番号６４９）及びＩＴＬＭＣＩＶＩＧＮＥＶＶＮＦＥＷＴＹＰ（配列番号６５０）。アミノ酸配列ＤＲＥＶＤＳＤＡＹＹを含むＰＤＧＦＲβ由来ペプチドに結合することができる抗ＰＤＧＦＲβ抗体の特定の変形形態において、ＰＤＧＦＲβ由来ペプチドは、次のものから選択されるアミノ酸配列を含む：ＲＳＹＩＳＫＴＴＩＧＤＲＥＶＤＳＤＡＹＹ（配列番号５６６）、ＫＴＴＩＧＤＲＥＶＤＳＤＡＹＹＶＹＲＬＱ（配列番号５６７）及びＤＲＥＶＤＳＤＡＹＹＶＹＲＬＱＶＳＳＩＮ（配列番号５６８）。特定の変形形態において、ＰＤＧＦＲβ由来ペプチドは、配列番号５６６、５６７、５６８、５６９、６４９及び６５０から選択されるアミノ酸配列からなる。
関連する変形形態において、本発明による抗ＰＤＧＦＲβ抗体は、配列番号５６９に示すアミノ酸配列からなる第１の固定化ペプチドに結合することができる。このエピトープ特異性を有する例示的な抗ＰＤＧＦＲβ抗体は、次のＶＬ／ＶＨ配列対から選択されるそれぞれのＶＬ及びＶＨアミノ酸配列を有する軽及び重鎖可変ドメインを含む抗体を含む；配列番号６及び８；配列番号１０及び１２；配列番号２２及び２４；並びに配列番号４６及び４８。特定の実施形態において、そのような抗ＰＤＧＦＲβ抗体は、配列番号５６６、５６７又は５６８に示すアミノ酸配列からなる第２の固定化ペプチドにさらに結合することができる。このクラスの例示的な抗ＰＤＧＦＲβ抗体は、次のＶＬ／ＶＨ配列対から選択されるそれぞれのＶＬ及びＶＨアミノ酸配列を有する軽及び重鎖可変ドメインを含む抗体を含む；配列番号２２及び２４；並びに配列番号４６及び４８。
本発明の抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体により認識されるエピトープは、一般的にヒトＶＥＧＦ−Ａ１６５（配列番号２の残基２７〜１９１）の５個以上のアミノ酸を含む。好ましいエピトープは、ＶＥＧＦ−Ａの１つ又は複数の次のポリペプチド領域内に含まれる少なくとも１つのアミノ酸を含む：ＨＥＶＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳＹＣＨＰＩＥＴＬ（配列番号２のアミノ酸残基３８〜５８）、ＥＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬＭＲＣＧ（配列番号２のアミノ酸残基７０〜８４）、ＥＥＳＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫＰＨＱＧ（配列番号２のアミノ酸残基９８〜１１４）及びＰＣＧＰＣＳＥＲＲＫＨＬＦ（アミノ酸残基１４２〜１５４）。特定の実施形態において、エピトープは、配列番号２の残基３８〜５８、７０〜８４、９８〜１１４及び１４２〜１５４に示すような１つ又は複数のＶＥＧＦ−Ａポリペプチド領域の少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個又は少なくとも７個のアミノ酸を含む。いくつかの変形形態において、そのようなＶＥＧＦ−Ａエピトープは、オーバーラップしているＶＥＧＦ−Ａエピトープ（例えば、連続ペプチドの各対の間の２アミノ酸のシフトを有する例えば１３ｍｅｒペプチド）の使用を含むペプチドマイクロアレイエピトープマッピングにより決定されるエピトープである。
上のような抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体の特定の変形形態において、抗ＶＥＧＦ−Ａエピトープは、ＶＥＧＦ−Ａの１つ又は複数の次のポリペプチド領域内に含まれる少なくとも１つのアミノ酸を含む：ＫＦＭＤＶＹＱＲＳＹＣ（配列番号２のアミノ酸残基４２〜５２）、ＩＦＫＰＳＣＶＰＬＭＲ（配列番号２のアミノ酸残基７２〜８２）、ＩＭＲＩＫＰＨＱＧ（配列番号２のアミノ酸残基１０６〜１１４）及びＰＣＧＰＣＳＥＲＲＫＨＬＦ（アミノ酸残基１４２〜１５４）。特定の実施形態において、エピトープは、配列番号２の残基４２〜５２、７２〜８２、１０６〜１１４及び１４２〜１５４に示すような１つ又は複数のＶＥＧＦ−Ａポリペプチド領域の少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個又は少なくとも７個のアミノ酸を含む。
いくつかの関連する変形形態において、（ａ）配列番号２のアミノ酸残基３８〜５８又は４２〜５２に示すＶＥＧＦ−Ａの第１のポリペプチド領域内に含まれる１つ又は複数のアミノ酸及び（ｂ）配列番号２のアミノ酸残基７０〜８４又は７２〜８２に示すＶＥＧＦ−Ａの第２のポリペプチド領域内に含まれる１つ又は複数のアミノ酸を含むエピトープに結合する。このエピトープ特異性を有する例示的な抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、次のＶＬ／ＶＨ配列対から選択されるそれぞれのＶＬ及びＶＨアミノ酸配列を有する軽及び重鎖可変ドメインを含む抗体を含む：配列番号１７０及び１７２；配列番号２４２及び２４４；配列番号２４６及び２４８；並びに配列番号２７８及び２８０。
上のような（ａ）及び（ｂ）を含むエピトープに結合する抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体の特定の実施形態において、エピトープは、配列番号２の残基９０〜１３２（ＥＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣＲＰ）に示すＶＥＧＦ−Ａのポリペプチド領域内に含まれるアミノ酸を含まない。このクラスの例示的な抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、それぞれ配列番号２４６及び２４８に示すアミノ酸配列を有する軽及び重鎖可変ドメインを含む。
上のような（ａ）及び（ｂ）を含むエピトープに結合する抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体の他の実施形態において、エピトープは、（ｃ）配列番号２の残基９６〜１１４又は１０６〜１１４に示すＶＥＧＦ−Ａの第３のポリペプチド領域内に含まれる１つ又は複数のアミノ酸をさらに含む。このクラスの例示的な抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、次のＶＬ／ＶＨ配列対から選択されるそれぞれのＶＬ及びＶＨアミノ酸配列を有する軽及び重鎖可変ドメインを含む抗体を含む：配列番号１７０及び１７２；配列番号２４２及び２４４；並びに配列番号２７８及び２８０。
上のような（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むエピトープに結合する抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体のいくつかの実施形態において、抗体は、他方の１０倍以内のＫｄ値でヒト及びマウスＶＥＧＦ−Ａに結合しない。このクラスの例示的な抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、次のＶＬ／ＶＨ配列対から選択されるそれぞれのＶＬ及びＶＨアミノ酸配列を有する軽及び重鎖可変ドメインを含む抗体を含む：配列番号２４２及び２４４；並びに配列番号２７８及び２８０。
上のような（ａ）及び（ｂ）を含むエピトープに結合する抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体の他のさらなる変形形態において、エピトープは、（ｄ）配列番号２の残基１４２〜１５４に示すＶＥＧＦ−Ａの第４のポリペプチド領域内に含まれる１つ又は複数のアミノ酸をさらに含む。このクラスの例示的な抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、次のＶＬ／ＶＨ配列対から選択されるそれぞれのＶＬ及びＶＨアミノ酸配列を有する軽及び重鎖可変ドメインを含む抗体を含む：配列番号２４２及び２４４；並びに配列番号２７８及び２８０。
他の関連する実施形態において、本発明による抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、上で指定した１つ又は複数のＶＥＧＦ−Ａポリペプチド領域に対応する固定化ＶＥＧＦ−Ａ由来ペプチドに特異的に結合することができる。典型的には、抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、配列番号２におけるシステイン残基に対応するアミノ酸がセリンで置換されている、そのようなＶＥＧＦ−Ａ由来ペプチドに結合することができる。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦ−Ａ由来ペプチドは、配列番号２の１０、１１、１３、１５、１７、２０又は２５個の連続したアミノ酸からなり、システイン残基に対応するアミノ酸がセリンで置換されている。特定の変形形態において、抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、次のものから選択されるアミノ酸配列を含むＶＥＧＦ−Ａ由来ペプチドに結合することができる：ＫＦＭＤＶＹＱＲＳ（配列番号５７９）、ＩＦＫＰＳＳＶＰＬＭＲ（配列番号５８０）、ＩＭＲＩＫＰＨＱＧ（配列番号５８１）及びＧＰＳＳＥＲＲＫＨＬＦ（配列番号５８２）。いくつかのそのような変形形態において、ＶＥＧＦ−Ａ由来ペプチドは、ＨＥＶＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ（配列番号５４４）、ＶＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳＹＳ（配列番号５４５）、ＫＦＭＤＶＹＱＲＳＹＳＨＰ（配列番号５４６）、ＥＹＩＦＫＰＳＳＶＰＬＭＲ（配列番号５５２）、ＩＦＫＰＳＳＶＰＬＭＲＳＧ（配列番号５５３）、ＩＴＭＱＩＭＲＩＫＰＨＱＧ（配列番号５５８）、ＩＭＲＩＫＰＨＱＧＱＨＩＧ（配列番号５５９）、及びＰＳＧＰＳＳＥＲＲＫＨＬＦ（配列番号５６０）からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドである。
他の変形形態において、抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、下の表３３に示すものから選択されるＶＥＧＦ−Ａ由来ペプチドに結合することができる。
関連する変形形態において、本発明による抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、（ａ）１３個のアミノ酸からなり、配列番号５７９に示すアミノ酸配列を含む第１の固定化ＶＥＧＦ−Ａ由来ペプチド、及び（ｂ）１３個のアミノ酸からなり、配列番号５８０に示すアミノ酸配列を含む第２の固定化ＶＥＧＦ−Ａ由来ペプチドに結合することができる。このエピトープ特異性を有する例示的な抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、次のＶＬ／ＶＨ配列対から選択されるそれぞれのＶＬ及びＶＨアミノ酸配列を有する軽及び重鎖可変ドメインを含む抗体を含む：配列番号１７０及び１７２；配列番号２４２及び２４４；配列番号２４６及び２４８；並びに配列番号２７８及び２８０。
上のような第１及び第２のペプチドに結合する抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体の特定の実施形態において、抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、配列番号２のアミノ酸残基９０〜１３２内に含まれるＶＥＧＦ−Ａの領域に由来するぺプチド（例えば、１３個のアミノ酸からなるペプチド）に結合しない。このクラスの例示的な抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、それぞれ配列番号２４６及び２４８に示すアミノ酸配列を有する軽及び重鎖可変ドメインを含む。
上のような第１及び第２のペプチドに結合する抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体のさらなる他の実施形態において、抗体は、１３個のアミノ酸からなり、配列番号５８１に示すアミノ酸配列を含む第３の固定化ＶＥＧＦ−Ａ由来ペプチドにさらに結合することができる。いくつかのそのような実施形態において、抗体は、他方の１０倍以内のＫｄ値でヒト及びマウスＶＥＧＦ−Ａに結合しない。このクラスの例示的な抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、次のＶＬ／ＶＨ配列対から選択されるそれぞれのＶＬ及びＶＨアミノ酸配列を有する軽及び重鎖可変ドメインを含む抗体を含む：配列番号２４２及び２４４；並びに配列番号２７８及び２８０。
特定の実施形態において、抗ＰＤＧＦＲβ又は抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ又はダイアボディなどの抗体フラグメントである。いくつかの好ましい実施形態において、抗ＰＤＧＦＲβ又は抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、ｓｃＦｖである。ＰＤＧＦＲβ又はＶＥＧＦ−Ａに結合するｓｃＦｖ実体は、可変軽（ＶＬ）領域によりアミノ末端を可変重（ＶＨ）領域に向けるか、又はカルボキシル末端をそれに向けることができる。いくつかの変形形態において、抗ＰＤＧＦＲβｓｃＦｖは、表２に列挙した抗ＰＤＧＦＲβ抗体のＣＤＲを有し、かつ／又は抗ＶＥＧＦ−ＡｓｃＦｖは、表４に列挙した抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体のＣＤＲを有する。特定の変形形態において、抗ＰＤＧＦＲβｓｃＦｖは、表２に列挙した抗ＰＤＧＦＲβ抗体のＶＬ及びＶＨドメインを有し、かつ／又は抗ＶＥＧＦ−ＡｓｃＦｖは、表４に列挙した抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体のＶＬ及びＶＨドメインを有する。特定の実施形態において、抗ＰＤＧＦＲβｓｃＦｖのＣＤＲ又はＶＬ及びＶＨドメインは、ｃ５９７、ｃ６００、ｃ９４１、ｃ９４９、ｃ９７５、ｃ１０３５及びｃ６１３から選択される抗ＰＤＧＦＲβ抗体のものである。他の実施形態において、抗ＶＥＧＦ−ＡｓｃＦｖのＣＤＲ又はＶＬ及びＶＨドメインは、ｃ６３６、ｃ８６８、ｃ１０３９、ｃ１０９２、ｃ１１１１、ｃ１１３５、ｃ１２７０、ｃ１４１０、ｃ１４７６、ｃ１１５５、ｃ７５２、ｃ８７０、ｃ１０３６、ｃ１０９４、ｃ１０４４及びｃ１２５７から選択される抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体のものである。抗ＶＥＧＦ−ＡｓｃＦｖの特定の変形形態において、ｓｃＦｖは、配列番号４９８（ｃ１１１１．１ｓｃＦｖ；配列番号４９７に示すヌクレオチド配列）；配列番号５００（ｃ８７０．１ｓｃＦｖ；配列番号４９９に示すヌクレオチド配列）；配列番号５０２（ｃ１０９２．１ｓｃＦｖ；配列番号５０１に示すヌクレオチド配列）；配列番号５０４（ｃ１０３９．１ｓｃＦｖ；配列番号５０３に示すヌクレオチド配列）；配列番号５０６（ｃ８６８．１ｓｃＦｖ；配列番号５０５に示すヌクレオチド配列）；又は配列番号５０８（ｃ１０８１．１ｓｃＦｖ；配列番号５０７に示すヌクレオチド配列）に示すアミノ酸配列を含む。さらに、ｓｃＦｖは、例えば、タンデムｓｃＦｖ（ｔａｓｃＦｖ）、二単鎖Ｆｖ（ｂｉｓｃＦｖ）及びカルボキシル末端に融合させた単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含む全モノクローナル抗体（ｂｉＡｂ）（下を参照）などの様々な二重特異性抗体の形のいずれかで提供することができる。
特定の態様において、本明細書で述べる抗ＰＤＧＦＲβ又は抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、二重特異性結合組成物として提供される。本明細書で用いているように、「二重特異性結合組成物」という用語は、異なる結合特異性を有する少なくとも２つの結合実体を介して少なくとも２つの異なる標的分子に特異的に結合することができる組成物を意味する。結合実体は、例えば、タンパク質（例えば、抗体又は可溶性受容体）又は小分子であってよい。二重特異性結合組成物の結合実体は、物理的に結合してもよく、又は結合していなくてもよい。
特定の実施形態において、本発明の二重特異性結合組成物は、ＰＤＧＦＲβと第２の標的分子の生物学的活性の両方を中和し、本明細書で述べる抗ＰＤＧＦＲβ抗体を含む。他の実施形態において、本発明の二重特異性結合組成物は、ＶＥＧＦ−Ａと第２の標的分子の生物学的活性の両方を中和し、本明細書で述べる抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体を含む。本発明による好ましい二重特異性結合組成物は、ＰＤＧＦＲβとＶＥＧＦ−Ａの両方を中和することができるものである。したがって、特定の変形形態において、二重特異性結合組成物は、本明細書で述べる抗ＰＤＧＦＲβ抗体、及びＶＥＧＦ−Ａの活性を中和することができる第２の結合実体を含む。他の変形形態において、二重特異性結合組成物は、本明細書で述べる抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体、及びＰＤＧＦＲβの活性を中和することができる第２の結合実体を含む。本発明による特に好ましい二重特異性結合組成物は、本明細書で述べる抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体及び本明細書で述べる抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体の両方を含む。
特定の実施形態において、二重特異性結合組成物の２つ以上の異なる実体をリンカーにより結合させて多量体（例えば、二量体）を形成させる。例えば、少なくとも２つのポリペプチド成分（例えば、抗ＰＤＧＦＲβ抗体及び他のポリペプチド成分；又は抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体及び他のポリペプチド成分）の融合体を含む二重特異性結合組成物の場合、ペプチドリンカー配列を、例えば、各ポリペプチドがその二次及び三次構造に折り重なることを保証するのに十分な距離だけポリペプチド成分を分離するために用いることができる。融合タンパク質は、一般的に、化学的コンジュゲーションを含む標準的な手法を用いて調製することができる。融合タンパク質は、標準的な手法を用いて発現系において組換えタンパク質として発現させることもできる。適切なリンカーについては、本明細書において下でさらに述べる。
リンカーは、天然、合成又は両方の組合せであってよい。例えば、合成リンカーは、例えば、配列及びサイズの両方がランダム化されたリンカーであってよい。１つの態様において、ランダム化リンカーは、完全にランダム化された配列を含んでいてよく、又は場合によって、ランダム化リンカーは、天然リンカー配列に基づいていてよい。リンカーは、例えば、非ポリペプチド部分（例えば、ポリヌクレオチド）、ポリペプチドなどであってよい。
リンカーは、堅い、又は柔軟性があるか、又は両方の組合せであり得る。リンカーの柔軟性は、リンカー及びリンカーが相互作用するサブユニットの両方の組成の関数であり得る。リンカーは、２つの選択される結合実体（例えば、２種の異なる抗体などの２つの別個のポリペプチド又はタンパク質）を結合させ、実体を独立し、かつ分離した状態に維持する。リンカーは、独立し、分離したドメインが、多量体における同じ標的に対する複数の独立した結合部位、又は例えば多量体における異なる標的に対する複数の独立した結合部位のような独立した特性を維持しながら協力することを可能にする。場合によって、ジスルフィド架橋が２つの連結した結合実体の間又はリンカーと結合物質の間に存在する。
２つ以上の結合実体を結合させる特定の場合に適するリンカーの選択は、例えば、結合実体の性質、二重特異性組成物が結合すべき標的の構造及び性質、及び／又はタンパク質溶解及び酸化に対するリンカー（例えば、ペプチドリンカー）の安定性を含む様々なパラメーターに依存する可能性がある。
特に適切なリンカーポリペプチドは、グリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）、アラニン（Ａｌａ）及びトレオニン（Ｔｈｒ）から選択されるアミノ酸残基を主として含む。例えば、ペプチドリンカーは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ及びＴｈｒから選択されるアミノ酸残基の少なくとも７５％（ペプチドリンカーに存在する残基の総数を基準として計算）、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９０％を含んでいてよい。ペプチドリンカーは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ及び／又はＴｈｒ残基のみからなっていてもよい。リンカーポリペプチドは、２つの結合実体が、標的分子に結合するような所望の活性並びにそのような標的結合に関連する可能性のある他の活性（例えば、所定の生体分子に対する作用又は拮抗活性）を保持するように互いに対して適切なコンフォーメーションをとるように結合させるのに十分な長さを有するべきである。
この目的に適した長さは、例えば、少なくとも１つの長さであり、典型的には２〜２５アミノ酸残基、５〜２０アミノ酸残基、５〜１５アミノ酸残基、８〜１２アミノ酸残基又は１１残基などの約５０アミノ酸残基より小さい。他の適切なポリペプチドリンカーのサイズは、例えば、約２〜約１５アミノ酸、約３〜約１５アミノ酸、約４〜約１２アミノ酸、約１０、約８又は約６アミノ酸を含み得る。リンカーポリペプチドに含めるために選択されるアミノ酸残基は、ポリペプチド多量体の活性又は機能を著しく妨げない特性を示すべきである。したがって、ペプチドリンカーは、全体として、多量体の活性若しくは機能と調和しない、又は内部折りたたみを妨げる、又は問題の標的への多量体の結合を著しく妨げるような１つ若しくは複数のドメインにおけるアミノ酸残基との結合若しくは他の相互作用を形成するような変化を示すべきでない。
ポリペプチドを新規な結合融合ポリペプチドに結合させるための天然に存在する並びに人工のペプチドリンカーの使用は、当技術分野で周知である。（例えば、Ｈａｌｌｅｗｅｌｌら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６４巻、５２６０〜５２６８頁、１９８９年；Ａｌｆｔｈａｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、８巻、７２５〜７３１頁、１９９５年；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ及びＳａｕｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３５巻、１０９〜１１６頁、１９９６年；Ｋｈａｎｄｅｋａｒら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７２巻、３２１９０〜３２１９７頁、１９９７年；Ｆａｒｅｓら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１３９巻、２４５９〜２４６４頁、１９９８年；Ｓｍａｌｌｓｈａｗら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、１２巻、６２３〜６３０頁、１９９９年；米国特許第５，８５６，４５６号を参照。）
ペプチドリンカーの使用が広範囲に及ぶ１つの例は、軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）の可変領域が人工リンカーを介して結合している単鎖抗体の製造であり、この特定の分野に多数の刊行物が存在する。広く用いられているペプチドリンカーは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒアミノ酸配列の３反復からなる１５ｍｅｒ（（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３）（配列番号５３９）である。他のリンカーが使用され、適切なリンカー配列を多様化し、選択するためにファージディスプレイ技術並びに選択的感染ファージ技術が使用された（Ｔａｎｇら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７１巻、１５６８２〜１５６８６頁、１９９６年；Ｈｅｎｎｅｃｋｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、１１巻、４０５〜４１０頁、１９９８年）。ペプチドリンカーは、Ｔ細胞受容体、ラムダＣｒｏレプレッサー、Ｐ２２ファージＡｒｃレプレッサー、ＩＬ−１２、ＴＳＨ、ＦＳＨ、ＩＬ−５及びインターフェロンγなどのヘテロ及びホモ二量体タンパク質における個々の鎖を連結させるために用いられている。ペプチドリンカーは、融合ポリペプチドを作製するためにも用いられている。様々なリンカーが使用され、Ａｒｃレプレッサーの場合、単鎖タンパク質の安定性の増大のためにリンカー長及び組成を最適化するためにファージディスプレイが用いられている（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ及びＳａｕｅｒ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９５巻、５９２９〜５９３４頁、１９９８年）。
適切なリンカーを得るさらに他の方法は、ランダム突然変異誘発により単純リンカー（例えば、（（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ）を最適化することによるものである。
上述のように、ペプチドリンカーは、少なくともある程度の柔軟性を有することが一般的に好ましい。したがって、いくつかの変形形態において、ペプチドリンカーは、１〜２５個のグリシン残基、５〜２０個のグリシン残基、５〜１５個のグリシン残基又は８〜１２個のグリシン残基を含む。特に適切なペプチドリンカーは、一般的に、少なくとも７５％のグリシン残基などの少なくとも５０％のグリシン残基を含む。いくつかの変形形態において、ペプチドリンカーは、グリシン残基のみを含む。
特定の変形形態において、ペプチドリンカーは、グリシンに加えて他の残基を含む。グリシンのほかの好ましい残基には、Ｓｅｒ、Ａｌａ及びＴｈｒ、特にＳｅｒがある。特定のペプチドリンカーの１つの例は、アミノ酸配列Ｇｌｙｘ−Ｘａａ−Ｇｌｙｙ−Ｘａａ−Ｇｌｙｚ（配列番号５４０）を有するペプチドリンカーを含み、各Ｘａａは、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、プロリン（Ｐｒｏ）、グリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、チロシン（Ｔｙｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）及びグルタミン酸（Ｇｌｕ）から独立に選択され、ｘ、ｙ及びｚは、それぞれ１〜５の範囲の整数である。いくつかの実施形態において、各Ｘａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ及びＴｈｒからなる群から独立に選択される。特定の変形形態において、ｘ、ｙ及びｚのそれぞれが３に等しい（それにより、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号５４１）を有するペプチドリンカーが得られ、各Ｘａａは上のように選択される）。
場合によって、ある程度の剛性をペプチドリンカーに付与することが望ましく、又は必要であり得る。これは、プロリン残基をペプチドリンカーのアミノ酸配列に含めることによって達成することができる。したがって、他の実施形態において、ペプチドリンカーは、ペプチドリンカーのアミノ酸配列に少なくとも１つのプロリン残基を含む。例えば、ペプチドリンカーは、アミノ酸残基の少なくとも２５％（例えば、少なくとも５０％又は少なくとも７５％）がプロリン残基であるアミノ酸配列を有し得る。本発明の１つの特定の実施形態において、ペプチドリンカーは、プロリン残基のみを含む。
いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、非ポリペプチド部分に対する付着基を含むアミノ酸残基が導入されているような形で修飾されている。そのようなアミノ酸残基の例は、システイン又はリシン残基（非ポリペプチド部分が後に付着する）であってよい。他の選択肢は、ｉｎ ｖｉｖｏ Ｎ−グリコシル化部位を有するアミノ酸配列を含めることである（それにより、ペプチドリンカーに糖部分を付着させる（ｉｎ ｖｉｖｏ））。さらなる選択肢は、進化ｔＲＮＡ及びｔＲＮＡシンテターゼ（例えば、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号を参照）を用いて非天然アミノ酸をポリペプチド結合体又はペプチドリンカーに遺伝学的に組み込むことである。例えば、ケトチロシンの挿入により、発現ポリペプチドへの部位特異的なカップリングが可能となる。
特定の変形形態において、ペプチドリンカーは、１つのシステイン残基などの少なくとも１つのシステイン残基を含む。例えば、いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、少なくとも１つのシステイン残基並びにＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ及びＴｈｒからなる群より選択されるアミノ酸残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、ペプチドリンカーは、グリシン残基及びシステイン残基のみのようなグリシン残基及びシステイン残基を含む。一般的に、ペプチドリンカー当たり１つのシステイン残基のみを含める。システイン残基を含む特定のペプチドリンカーの１つの例は、アミノ酸配列Ｇｌｙｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙｍ（配列番号５４２）を有するペプチドリンカーを含み、ｎ及びｍは、それぞれ１〜１２、例えば、３〜９、４〜８又は４〜７の整数である。特定の変形形態において、そのようなペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＧ−Ｃ−ＧＧＧＧＧ（配列番号５４３）を有する。
前記のように、特定の実施形態において、二重特異性結合組成物は、抗ＰＤＧＦＲβ抗体及び抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体を含む。いくつかのそのような実施形態において、抗ＰＤＧＦＲβ及び抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、共有結合により連結して（例えば、ペプチドリンカーを介して）、二重特異性抗体を形成する。いくつかの変形形態において、二重特異性抗体は、例えば、Ｆｃフラグメントなどの免疫グロブリン重鎖定常領域を含む。特に適切なＦｃフラグメントは、例えば、１つ又は複数のエフェクター機能を減少又は除去するように改変されたＦｃ領域を含むＦｃフラグメント（例えば、配列番号４９２に示すアミノ酸配列を有するＦｃ５）を含む。
例えば、いくつかの実施形態において、本発明によるＰＤＧＦＲβ及びＶＥＧＦ−Ａを中和する二重特異性抗体は、本明細書で述べる抗ＰＤＧＦＲβ抗体の抗原結合部位及び本明細書で述べる抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体の抗原結合部位を含む。特定の実施形態において、二重特異性抗体は、表６に列挙したコンセンサスファミリーＡの抗ＰＤＧＦＲβ ＣＤＲを有する第１の抗原結合領域及び表６に列挙したコンセンサスファミリーＢ又はＣの抗ＶＥＧＦ−Ａ ＣＤＲを有する第２の抗原結合領域を含む。他の実施形態において、二重特異性抗体は、表２に列挙した抗ＰＤＧＦＲβ抗体のＣＤＲを有する第１の抗原結合領域及び表４に列挙した抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体のＣＤＲを有する第２の抗原結合領域を含む。特定の変形形態において、二重特異性抗体は、表２に列挙した抗ＰＤＧＦＲβ抗体のＶＬ及びＶＨドメインを有する第１の抗原結合領域並びに表４に列挙した抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体のＶＬ及びＶＨドメインを有する第２の抗原結合領域を含む。特定の変形形態において、第１の抗原結合領域のＣＤＲ又はＶＬ及びＶＨドメインは、ｃ５９７、ｃ６００、ｃ９４１、ｃ９４９、ｃ９７５、ｃ１０３５及びｃ６１３から選択される抗ＰＤＧＦＲβ抗体のものであり、第２の抗原結合領域のＣＤＲ又はＶＬ及びＶＨドメインは、ｃ６３６、ｃ８６８、ｃ１０３９、ｃ１０９２、ｃ１１１１、ｃ１１３５、ｃ１２７０、ｃ１４１０、ｃ１４７６、ｃ１１５５、ｃ７５２、ｃ８７０、ｃ１０３６、ｃ１０９４、ｃ１０４４及びｃ１２５７から選択される抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体のものである。特定の好ましい実施形態において、本発明による二重特異性抗体は、タンデム短鎖Ｆｖ（ｔａｓｃＦｖ）、二短鎖Ｆｖ（ｂｉｓｃＦｖ）又はカルボキシル末端に融合した短鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含む全モノクローナル抗体（ｂｉＡｂ）である。
ｔａｓｃＦｖ分子については、２つのｓｃＦｖ分子が、１つのｓｃＦｖがタンデム構成で他の１つに対してアミノ末端側にあるように、構築されている。これは、各配向で行うことができる。タンデムｓｃＦｖ分子は、ｓｃＦｖ実体間のリンカーを用いて調製することができる。いくつかの実施形態において、リンカーは、一連のグリシン及びセリン残基を含み、また追加のアミノ酸を場合によって含む、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーである。他の実施形態において、リンカーは、ラムダスタンプ、カッパスタンプ又はＣＨ１スタンプであり、それぞれがＦａｂにおけるＶ領域の直後の天然配列に由来する。ｔａｓｃＦｖは、Ｆｃ成分を含む融合タンパク質としてさらに構築することができる（「ｔａｓｃＦｖＦｃ」）。いくつかのそのような実施形態において、そのようなＦｃフラグメントは、１つ又は複数のエフェクター機能を減少又は除去するように修飾されたＦｃ領域を含む（例えば、配列番号４９２に示すアミノ酸配列を有するＦｃ５）。
ｂｉｓｃＦｖ分子は、タンデム構成ではない。それどころか、これは、ＦｃのＮ末端にｓｃＦｖを、Ｃ末端にもう一つを有する（「ｂｉｓＦｖＦｃ」）。これらの分子は、Ｆｃヒンジに直接融合したＮ末端ｓｃＦｖ、及び第２のｓｃＦｖに結合したＣ末端における短又は長リンカーを用いて作製することができる。これらのリンカーは、典型的にはＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーである。いくつかの実施形態において、Ｆｃフラグメントは、１つ又は複数のエフェクター機能を減少又は除去するように修飾されたＦｃ領域を含む（例えば、配列番号４９２に示すアミノ酸配列を有するＦｃ５）。特定の変形形態において、本発明によるｂｉｓｃＦｖは、Ｎ末端抗ＰＤＧＦＲβｓｃＦｖ及びＣ末端抗ＶＥＧＦ−ＡｓｃＦｖを含む。特定の変形形態において、抗ＰＤＧＦＲβｓｃＦｖは、配列番号６０３（ｃ９４１．１ｓｃＦｖ）及び配列番号６０５（ｃ１０３５．１ｓｃＦｖ）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、抗ＶＥＧＦ−ＡｓｃＦｖは、配列番号６０８（ｃ８６８．１ｓｃＦｖ）、配列番号６１０（ｃ８７０．１ｓｃＦｖ）及び配列番号１２（ｃ１０３９．１ｓｃＦｖ）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの特定の変形形態において、本発明によるｂｉｓｃＦｖは、配列番号６１８の残基２０〜７７０（ｃ９４１．１〜ｃ８６８．１ｂｉｓｃＦｖ）、配列番号６２０の残基２０〜７６８（ｃ９４１．１〜ｃ８７０．１ｂｉｓｃＦｖ）、配列番号６２２の残基２０〜７７３（ｃ９４１．１〜ｃ１０３９．１ｂｉｓｃＦｖ）、配列番号６２４の残基２０〜７７０（ｃ．１０３５．１〜ｃ８６８．１ｂｉｓｃＦｖ）、配列番号６２６の残基２０〜７６８（ｃ．１０３５．１〜ｃ８７０．１ｂｉｓｃＦｖ）及び配列番号６２８の残基２０〜７７３（ｃ．１０３５．１〜ｃ１０３９．１ｂｉｓｃＦｖ）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。上のようなｂｉｓｃＦｖは、例えば、配列番号６１４の残基１〜１９、配列番号６１６の残基１〜１９又は配列番号６１８の残基１〜１９に示すような分泌シグナル配列をさらに含んでいてよい。
ｂｉＡｂ分子もタンデムの形でない。これは、重鎖のＣ末端に融合したｓｃＦｖを有する全モノクローナル抗体を含む。これらの分子は、例えば、１つのｓｃＦｖを変換して軽鎖（カッパ又はラムダ）及びガンマ１重鎖に戻し、第２のｓｃＦｖを短又は長Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーにより連結することにより調製することができる。これらの分子は、抗ＶＥＧＦ−ＡｓｃＦｖに融合した全抗ＰＤＧＦＲβモノクローナル抗体を用いて、又は抗ＰＤＧＦＲβｓｃＦｖに融合した全抗ＶＥＧＦ−Ａモノクローナル抗体を用いて調製することができる。いくつかの特定の実施形態において、本発明によるｂｉＡｂは、配列番号４９８（ｃ１１１１．１ ｓｃＦｖ）、配列番号５００（ｃ８７０．１ ｓｃＦｖ）、配列番号５０２（ｃ１０９２．１ ｓｃＦｖ）、配列番号５０４（ｃ１０３９．１ ｓｃＦｖ）、配列番号５０６（ｃ８６８．１ ｓｃＦｖ）、配列番号５０８（ｃ１０８１．１ ｓｃＦｖ）、配列番号６０７（ｃ８６８．１ ｓｃＦｖ）、配列番号６０９（ｃ８７０．１ ｓｃＦｖ）、又は配列番号６１１（ｃ１０３９．１ ｓｃＦｖ）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む抗ＶＥＧＦ−ＡｓｃＦｖに融合した重鎖のＣ末端を有する全抗ＰＤＧＦＲβモノクローナル抗体（ＩｇＧ１）を含む。いくつかのそのような変形形態において、抗ＰＤＧＦＲβ抗体は、抗ＰＤＧＦＲβ抗体ｃ５９７のＶＬ及びＶＨドメイン（それぞれ配列番号６及び８）を有する。いくつかの変形形態において、本発明によるｂｉＡｂは、配列番号５３７又は配列番号６１４の残基２０〜２３９（ｃ５９７．１又はｃ６００．１軽鎖）に示すアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド並びに配列番号５１２の残基２０〜７３４（ｃ１１１１．１ｓｃＦｖに融合したＣ末端を有するｃ５９７．１ＩｇＧ１重鎖）；配列番号５１４の残基２０〜７２７（ｃ８７０．１ｓｃＦｖに融合したＣ末端を有するｃ５９７．１ＩｇＧ１重鎖）；配列番号５１６の残基２０〜７３３（ｃ１０９２．１ｓｃＦｖに融合したＣ末端を有するｃ５９７．１ＩｇＧ１重鎖）；配列番号５１８の残基２０〜７３３（ｃ１０３９．１ｓｃＦｖに融合したＣ末端を有するｃ５９７．１ＩｇＧ１重鎖）；配列番号２０の残基２０〜７３０（ｃ８６８．１ｓｃＦｖに融合したＣ末端を有するｃ５９７．１ＩｇＧ１重鎖）；配列番号２２の残基２０〜７３１（ｃ１０８１．１ｓｃＦｖに融合したＣ末端を有するｃ５９７．１ＩｇＧ１重鎖）；配列番号６３０の残基２０〜７２９（ｃ８６８．１ｓｃＦｖに融合したＣ末端を有するｃ５９７．１ＩｇＧ１．１重鎖）；配列番号６３２の残基２０〜７２７（ｃ８７０．１ｓｃＦｖに融合したＣ末端を有するｃ５９７．１ＩｇＧ１．１重鎖）；配列番号６３４の残基２０〜７３２（ｃ１０３９．１ｓｃＦｖに融合したＣ末端を有するｃ５９７．１ＩｇＧ１．１重鎖）；配列番号６３６の残基２０〜７２９（ｃ８６８．１ｓｃＦｖに融合したＣ末端を有するｃ６００．１ＩｇＧ１．１重鎖）；配列番号６３８の残基２０〜７２７（ｃ８７０．１ｓｃＦｖに融合したＣ末端を有するｃ６００．１ＩｇＧ１．１重鎖）；及び配列番号６４０の残基２０〜７３２（ｃ１０３９．１ｓｃＦｖに融合したＣ末端を有するｃ６００．１ＩｇＧ１．１重鎖）からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドを含む。上のような第１及び／又は第２のｂｉＡｂポリペプチドは、例えば、配列番号６１４の残基１〜１９、配列番号６１６の残基１〜１９又は配列番号６１８の残基１〜１９に示すような分泌シグナル配列をさらに含んでいてよい。
ＩＩＩ．核酸、宿主細胞及び抗体を製造する方法
本発明は、本発明の抗体の重鎖及び／又は軽鎖をコードする核酸も含む。本発明の核酸は、上の表２又は４に列挙したＶＬ及び／又はＶＨをコードするポリヌクレオチドと実質的に同一である領域を有する核酸を含む。特定の実施形態において、本発明による核酸は、表２又は４に列挙したＶＬ及び／又はＶＨをコードするポリヌクレオチドと少なくとも８０％、一般的に少なくとも約９０％、より一般的に少なくとも約９５％又は少なくとも約９８％の同一性を有する。本発明の核酸は、相補的核酸も含む。いくつかの例において、配列は、整列させるとき、完全に相補的である（不整合なし）。他の例において、配列に約２０％までの不整合が存在する可能性がある。本発明のいくつかの実施形態において、本発明の抗体の重鎖及び軽鎖の両方をコードする核酸を提供する。本明細書に示す核酸配列は、コドン最適化、縮重配列、サイレント突然変異及び特定の宿主における発現を最適化するための他のＤＮＡ技術を用いて活用することができ、本発明は、そのような配列修飾を包含する。
したがって、いくつかの態様において、本発明は、本明細書で述べる抗ＰＤＧＦＲβ及び／又は抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド（単数又は複数）（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を提供する。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、抗ＰＤＧＦＲβｓｃＦｖなどの抗ＰＤＧＦＲβ抗体をコードする。他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、例えば、抗ＶＥＧＦ−ＡｓｃＦｖなどの抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体をコードする。いくつかの変形形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＤＧＦＲβ及びＶＥＧＦ−Ａに結合し、中和する二重特異性抗体をコードする。特定の変形形態において、コードされる二重特異性抗体は、ｔａｓｃＦｖ、ｂｉｓｃＦｖ又はｂｉＡｂである。当業者は、遺伝コードの縮重を考慮して、かなりの配列変動がこれらのポリヌクレオチド分子において可能であることを容易に認識するであろう。
本明細書に示すポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子は、該分子をベクターに挿入することによって増殖される。プラスミドを含む、ウイルス及び非ウイルスベクターを用いる。プラスミドの選択は、増殖が望まれる細胞の種類及び増殖の目的に依存する。特定のベクターは、大量の所望のＤＮＡ配列を増幅し、作製するのに有用である。他のベクターは、培養細胞における発現に適する。さらに他のベクターは、動物又はヒト全体における細胞における転移及び発現に適する。適切なベクターの選択は、当分野の技術の範囲内に十分に入る。多くのそのようなベクターは市販されている。部分又は全長ポリヌクレオチドを、一般的にベクターにおける切断制限酵素部位へのＤＮＡリガーゼ付着により、ベクターに挿入する。或いは、所望のヌクレオチド配列をｉｎ ｖｉｖｏでの相同的組換えにより挿入することができる。典型的には、これは、所望のヌクレオチド配列の隣接部上の相同性領域をベクターに付着させることにより達成される。相同性領域は、オリゴヌクレオチドの連結反応により、又は、例えば、相同性領域及び所望のヌクレオチド配列の一部の両方を含むプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応により付加される。
発現のために、発現カセット又は系を用いることができる。本明細書で開示するポリペプチドをコードする核酸を発現させるために、発現ベクターにおける転写発現を調節する調節配列に作動可能に連結した、ポリペプチドをコードする核酸分子を宿主細胞に導入する。プロモーター及びエンハンサーのような転写調節配列に加えて、発現ベクターは、転写調節配列及び発現ベクターを有する細胞の選択に適するマーカー遺伝子を含んでいてよい。本発明のポリヌクレオチドによりコードされる遺伝子産物を、例えば、細菌、酵母、昆虫、両生類及び哺乳動物系などのいずれかの都合のよい発現系において発現させる。適切なベクター及び宿主細胞は、例えば、米国特許第５，６５４，１７３号に記載されている。発現ベクターにおいて、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、所望の発現特性を得るために適宜、調節配列に連結する。これらは、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、オペレーター、レプレッサー及びインデューサーを含み得る。プロモーターは、調節することができる（例えば、ステロイド誘導ｐＩＮＤベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロモーター）か、又は構成的であり得る（例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０、伸長因子又はＬＴＲ配列のプロモーター）。いくつかの状況において、組織特異的又は発生段階特異的プロモーターなどの条件付きで活性なプロモーターを使用することが望ましいと思われる。これらは、ベクターへの連結のための上述の技術を用いて所望のヌクレオチド配列に連結する。当技術分野で公知のあらゆる技術を用いることができる。したがって、発現ベクターは、誘導性又は構成的であってよい、転写及び翻訳開始領域を一般的に備え、コーディング領域は、転写開始領域の転写調節下で作動可能に連結されており、転写及び翻訳終結領域である。
発現カセット（「発現単位」）は、例えば、プラスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣ、ラムダ、Ｐ１、Ｍ１３などのバクテリオファージ、植物又は動物ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスに基づくベクター、アデノウイルスベクター）などの様々なベクターに導入することができ、ベクターは、通常、発現ベクターを含む細胞の選択を可能にする能力によって特徴付けられる。ベクターは、特にプラスミド又はウイルスとして染色体外維持、或いは宿主染色体への組込みを可能にすることがあり得る。染色体外維持が望まれる場合、最初の配列を、低又は高コピー数であってよいプラスミドの複製のために供給する。様々なマーカー、特に毒素から、より詳細には抗生物質から保護するものが選択のために利用可能である。選択される個々のマーカーは、宿主の性質に従って選択され、場合によって、栄養要求性突然変異宿主については相補性を用いることができる。ＤＮＡ構築物の導入は、例えば、コンジュゲーション、細菌形質転換、カルシウム沈殿ＤＮＡ、エレクトロポレーション、融合、トランスフェクション、ウイルスベクターの感染、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）などのいずれかの都合のよい方法を用いることができる。
したがって、本発明において使用するタンパク質は、従来の技術により遺伝子操作された宿主細胞において産生させることができる。適切な宿主細胞は、外因性ＤＮＡを用いて形質転換又はトランスフェクトすることができ、培養で成長する細胞型であり、細菌、真菌細胞及び培養高等真核細胞（多細胞生物体の培養細胞を含む）、特に培養哺乳動物細胞を含む。クローン化ＤＮＡ分子を操作し、外因性ＤＮＡを様々な宿主細胞に導入する技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９年）及びＡｕｓｕｂｅｌら（前出）により開示されている。
例えば、抗ＶＥＧＦ−Ａ及び／又は抗ＰＤＧＦＲβ抗体の組換え発現のために、発現ベクターは、その重及び／又は軽鎖、或いはプロモーターに作動可能に連結された重及び／又は軽鎖可変ドメインをコードしていてよい。発現ベクターは、例えば、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含んでいてよく（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ８６／０５８０７；ＰＣＴ公開ＷＯ８９／０１０３６；及び米国特許第５，１２２，４６４号を参照）、抗体の可変ドメインは、全重及び／又は軽鎖の発現のためにそのようなベクターにクローニングすることができる。発現ベクターを従来の技術により宿主細胞に転移させ、次いで、トランスフェクト細胞を従来の技術により培養して、抗ＶＥＧＦ−Ａ及び／又は抗ＰＤＧＦＲβ抗体を産生させる。二本鎖抗体の発現の特定の実施形態において、全免疫グロブリン分子の発現のための宿主細胞における別個のベクターから重及び軽鎖を共発現させる。二本鎖抗体の発現の他の実施形態において、全免疫グロブリン分子の発現のための宿主細胞における同じベクターにおける別個の発現単位から重及び軽鎖を共発現させる。
特定の変形形態において、ＶＥＧＦ−Ａ及びＰＤＧＦＲβに対する二重特異性抗体を発現させる。いくつかのそのような変形形態において、抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体及び抗ＰＤＧＦＲβ抗体の抗原結合部位が単一ポリペプチド鎖上に存在する場合（例えば、ｔａｓｃＦｖ又はｂｉｓｃＦｖの場合など）、発現ベクターは、すべてが作動可能な構成である、転写プロモーター、ポリペプチド鎖をコードする核酸セグメント及び転写ターミネーターを含む発現単位を含む。ｂｉｓｃＦｖの発現の特定の実施形態において、核酸セグメントによりコードされるポリペプチドは、配列番号６１８の残基２０〜７７０（ｃ９４１．１〜ｃ８６８．１ ｂｉｓｃＦｖ）；配列番号６２０の残基２０〜７６８（ｃ９４１．１〜ｃ８７０．１ ｂｉｓｃＦｖ）；配列番号６２２の残基２０〜７７３（ｃ９４１．１〜ｃ１０３９．１ ｂｉｓｃＦｖ）；配列番号６２４の残基２０〜７７０（ｃ１０３５．１〜ｃ８６８．１ ｂｉｓｃＦｖ）；配列番号６２６の残基２０〜７６８（ｃ１０３５．１〜ｃ８７０．１ ｂｉｓｃＦｖ）；及び配列番号６２８の残基２０〜７７３（ｃ１０３５．１〜ｃ１０３９．１ ｂｉｓｃＦｖ）からなる群より選択されるアミノ酸を含む。
他の変形形態において、二重特異性抗体が抗ＶＥＧＦ−Ａ及び抗ＰＤＧＦＲβ抗原結合部位の両方を有する分子を形成する少なくとも２種の異なるポリペプチド鎖を含む場合（例えば、ｂｉＡｂの場合など）、それぞれがポリペプチド鎖の１つを発現することができる、別個の発現単位を用いることができる。宿主細胞内の共発現のために、そのような別個の発現単位は、別個の発現ベクター、又は単一ベクター上に存在していてよい。例えば、（ｉ）免疫グロブリン軽鎖及び（ｉｉ）カルボキシル末端に融合したｓｃＦｖを有する免疫グロブリンγ重鎖（ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合体）を含むｂｉＡｂの発現のいくつかの実施形態において、発現ベクターは、第１及び第２の発現単位を含み、第１の発現単位は、第１の転写プロモーター、免疫グロブリン軽鎖をコードする第１のＤＮＡセグメント及び第１の転写ターミネーターを作動可能な組合せで含み、第２の発現単位は、第２の転写プロモーター、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合体をコードする第２のＤＮＡセグメント及び第２の転写ターミネーターを作動可能な組合せで含む。上のようなｂｉＡｂの発現のためのいくつかの別の実施形態において、第１及び第２の発現単位は、別個の発現ベクター上に存在する。免疫グロブリン軽鎖及びＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合体をコードするＤＮＡセグメントは、同じベクター又は別個のベクター上に存在するかどうかを問わず、ｂｉＡｂを産生させるために宿主細胞内で共発現させることができる。ｂｉＡｂの発現のいくつかの特定の実施形態において、第１のＤＮＡセグメントは、配列番号５３７の残基２０〜２３９に示すようなアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖をコードし、第２のＤＮＡセグメントは、配列番号６３０のアミノ酸残基２０〜７２９、配列番号６３４のアミノ酸残基２０〜７３２、配列番号６３６のアミノ酸残基２０〜７２９及び配列番号６４０のアミノ酸残基２０〜７３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合体をコードする。ｂｉＡｂの発現の他の特定の実施形態において、第１のＤＮＡセグメントは、配列番号５３７の残基２０〜２３９に示すようなアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖をコードし、第２のＤＮＡセグメントは、配列番号６３２のアミノ酸残基２０〜７２７及び配列番号６３８のアミノ酸残基２０〜７２７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合体をコードする。
組換えタンパク質を宿主細胞の分泌経路内に導くために、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても公知である）を発現ベクターに導入する。分泌シグナル配列は、組換えタンパク質の天然形の配列であってよく、或いは他の分泌タンパク質由来であってよく（例えば、ｔ−ＰＡ；米国特許第５，６４１，６５５号を参照）又はｄｅ ｎｏｖｏで合成してよい。分泌シグナル配列は、タンパク質コードＤＮＡ配列に作動可能に連結されている。すなわち、２つの配列は、正しい読み枠で結合し、新たに合成されるポリペプチドが宿主細胞の分泌経路内に導かれるように配置されている。特定のシグナル配列は問題のＤＮＡ配列における他所に配置することができる（例えば、Ｗｅｌｃｈら、米国特許第５，０３７，７４３号；Ｈｏｌｌａｎｄら、米国特許第５，１４３，８３０号を参照）が、分泌シグナル配列は、問題のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’に一般的に配置する。特定の変形形態において、本発明により使用する分泌シグナル配列は、配列番号６１４の残基１〜１９、配列番号６１６の残基１〜１９及び配列番号６１８の残基１〜１９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、これらのアミノ酸配列をコードする例示的なヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号６１３の残基１〜５７、配列番号６１５の残基１〜５７及び配列番号６１７の残基１〜５７に示す。
培養哺乳動物細胞は、本発明において使用する組換えタンパク質の産生に適した宿主である。外因性ＤＮＡを哺乳動物宿主細胞に導入する方法には、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ、１４巻、７２５頁、１９７８年；Ｃｏｒｓａｒｏ及びＰｅａｓｏｎ、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、７巻、６０３頁、１９８１年；Ｇｒａｈａｍ及びＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２巻、４５６頁、１９７３年）、エレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１巻、８４１〜８４５頁、１９８２年）、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション（Ａｕｓｕｂｅｌら、前出）及びリポソーム媒介トランスフェクション（Ｈａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎら、Ｆｏｃｕｓ、１５巻、７３頁、１９９３年；Ｃｉｃｃａｒｏｎｅら、Ｆｏｃｕｓ、１５巻、８０頁、１９９３年）がある。培養哺乳動物細胞中の組換えポリペプチドの産生は、例えば、Ｌｅｖｉｎｓｏｎら、米国特許第４，７１３，３３９号；Ｈａｇｅｎら、米国特許第４，７８４，９５０号；Ｐａｌｍｉｔｅｒら、米国特許第４，５７９，８２１号；及びＲｉｎｇｏｌｄ、米国特許第４，６５６，１３４号に開示されている。適切な哺乳動物宿主細胞の例には、アフリカミドリザル腎細胞（Ｖｅｒｏ；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８７）、ヒト胚腎細胞（２９３−ＨＥＫ；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ−２１、ＢＨＫ−５７０；ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８５４４、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０３１４）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ；ＣＲＬ；ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１；ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１；ＣＨＯ ＤＧ４４；ＣＨＯ ＤＸＢ１１（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）；Ｃｈａｓｉｎら、Ｓｏｍ． Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎｅｔ．、１２巻、５５５頁、１９８６年も参照）、ラット下垂体細胞（ＧＨ１；ＡＴＣＣ ＣＣＬ８２）、ＨｅＬａ Ｓ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２．２）、ラット肝癌細胞（Ｈ−４−ＩＩ−Ｅ；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５４８）、ＳＶ４０形質転換サル腎細胞（ＣＯＳ−１；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）及びマウス胚細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）がある。さらなる適切な細胞株は、当技術分野で公知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａなどの公的寄託機関から入手可能である。ＳＶ−４０又はサイトメガロウイルスのプロモーターなどの強い転写プロモーターを用いることができる。例えば、米国特許第４，９５６，２８８号を参照。他の適切なプロモーターには、メタロチオネイン遺伝子からのもの（米国特許第４，５７９，８２１号及び第４，６０１，９７８号）及びアデノウイルス主要後期プロモーターがある。
外来ＤＮＡを挿入した培養哺乳動物細胞の選択に薬剤選択を一般的に用いる。そのような細胞は、通常「トランスフェクタント」と呼ばれる。選択薬の存在下で培養され、問題の遺伝子をそれらの子孫に渡すことができる細胞は「安定トランスフェクタント」と呼ばれる。例示的な選択可能なマーカーには、Ｇ−４１８又は同様なものなどのネオマイシン型薬剤の存在下で選択を行うことを可能にする抗生物質ネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子；ミコフェノール酸／キサンチンの存在下で宿主細胞成長を可能にするキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼのｇｐｔ遺伝子；並びにゼオシン、ブレオマイシンブラストシジン、及びハイグロマイシンに対する耐性を与えるマーカーがある（例えば、Ｇａｔｉｇｎｏｌら、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．、２０７巻、３４２頁、１９８７年；Ｄｒｏｃｏｕｒｔら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１８巻、４００９頁、１９９０年を参照）。選択系は、「増幅」と呼ばれるプロセスである、問題の遺伝子の発現レベルを増加させるのにも用いることができる。増幅は、低レベルの選択薬の存在下でトランスフェクタントを培養し、次いで、選択薬の量を増加させて、導入された遺伝子の高レベルの産生をもたらす細胞を選択することによって行う。例示的な増幅可能な選択性マーカーは、メトトレキサートに対する耐性を与えるジヒドロ葉酸レダクターゼである。他の薬剤耐性遺伝子（例えば、ハイグロマイシン耐性、多剤耐性、プロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）も用いることができる。
昆虫細胞、植物細胞及び鳥類細胞などの他の高等真核細胞も用いることができる。植物細胞における発現遺伝子のベクターとしてのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの使用は、Ｓｉｎｋａｒら、Ｂｉｏｓｃｉ．（Ｂａｎｇａｌｏｒｅ）、１１巻、４７〜５８頁、１９８７年により総説されている。昆虫細胞の形質転換及びそれにおける外来ポリペプチドの産生は、Ｇｕａｒｉｎｏら、米国特許第５，１６２，２２２号及びＷＩＰＯ公開ＷＯ９４／０６４６３に開示されている。
昆虫細胞は、一般的にＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核ポリヘドロシスウイルス（ＡｃＮＰＶ）に由来する組換えバキュロウイルスに感染させることができる。Ｋｉｎｇ及びＰｏｓｓｅｅ、Ｔｈｅ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ（Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ、Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９４年）；及びＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、１９９５年）を参照。組換えバキュロウイルスも、Ｌｕｃｋｏｗら（Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、６７巻、４５６６〜４５７９頁、１９９３年）により記載されたトランスポゾンに基づく系を用いて作製することができる。転移ベクターを用いるこの系は、キットの形で市販されている（ＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣキット；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）。転移ベクター（例えば、ＰＦＡＳＴＢＡＣ１；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、「ｂａｃｍｉｄ」と呼ばれる大プラスミドとしてのＥ．ｃｏｌｉに維持されているバキュロウイルスゲノム内に問題のタンパク質をコードするＤＮＡを移動させるためのＴｎ７トランスポゾンを含む。Ｈｉｌｌ−Ｐｅｒｋｉｎｓ及びＰｏｓｓｅｅ、Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．、７１巻、９７１〜９７６頁、１９９０年；Ｂｏｎｎｉｎｇら、Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．、７５巻、１５５１〜１５５６頁、１９９４年；並びにＣｈａｚｅｎｂａｌｋ及びＲａｐｏｐｏｒｔ、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７０巻、１５４３〜１５４９頁、１９９５年を参照。さらに、転移ベクターは、上で開示したようなポリペプチド伸長又は親和性タグをコードするＤＮＡとのインフレーム融合体を含んでよい。当技術分野で公知の技術を用いて、タンパク質コードＤＮＡ配列を含む転移ベクターをＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞中に形質転換し、組換えバキュロウイルスを示す分断ｌａｃＺ遺伝子を含むｂａｃｍｉｄについて細胞をスクリーニングする。組換えバキュロウイルスゲノムを含むｂａｃｍｉｄ ＤＮＡを一般的な技術を用いて単離し、Ｓｆ９細胞などのＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞をトランスフェクトするのに用いる。問題のタンパク質を発現する組換えウイルスがその後生成する。組換えウイルスストックは、当技術分野で一般的に用いられている方法により調製する。
タンパク質の産生のために、組換えウイルスを用いて、宿主細胞、典型的にはヤガ（ｆａｌｌ ａｒｍｙｗｏｒｍ）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（例えば、Ｓｆ９又はＳｆ２１細胞）又はＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（例えば、ＨＩＧＨ ＦＩＶＥ細胞；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に由来する細胞株を感染させる。一般的にＧｌｉｃｋ及びＰａｓｔｅｒｎａｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ＆ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ（ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．、１９９４年）を参照。米国特許第５，３００，４３５号も参照。無血清培地を用いて細胞を増殖させ、維持する。適切な培地製剤は、当技術分野で公知であり、商業的供給業者から得ることができる。細胞を約２〜５×１０５細胞の接種密度から１〜２×１０６細胞の密度まで増殖させ、その時点に組換えウイルスストックを０．１〜１０、より一般的には約３の感染多重度（ＭＯＩ）で加える。用いる手順は、入手可能な実験マニュアル（例えば、Ｋｉｎｇ及びＰｏｓｓｅｅ、前出；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、前出；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、前出）に一般的に記載されている。
酵母細胞を含む真菌細胞も本発明において用いることができる。この点で特に注目すべき酵母種は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ及びＰｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａなどである。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を外因性ＤＮＡで形質転換し、それから組換えポリペプチドを産生させる方法は、例えば、Ｋａｗａｓａｋｉ、米国特許第４，５９９，３１１号；Ｋａｗａｓａｋｉら、米国特許第４，９３１，３７３号；Ｂｒａｋｅ、米国特許第４，８７０，００８号；Ｗｅｌｃｈら、米国特許第５，０３７，７４３号；及びＭｕｒｒａｙら、米国特許第４，８４５，０７５号に開示されている。形質転換細胞は、選択可能なマーカー、一般的に薬剤耐性又は特定の栄養素（例えば、ロイシン）の非存在下で増殖する能力によって決定される表現型により選択する。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて用いる例示的なベクター系は、グルコース含有培地中の増殖により形質転換細胞を選択することを可能にするＫａｗａｓａｋｉら（米国特許第４，９３１，３７３号）によって開示されたＰＯＴ１ベクター系である。酵母において用いる適切なプロモーター及びターミネーターとしては、糖分解酵素遺伝子（例えば、Ｋａｗａｓａｋｉ、米国特許第４，５９９，３１１号；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、米国特許第４，６１５，９７４号；及びＢｉｔｔｅｒ、米国特許第４，９７７，０９２号を参照）及びアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子からのものなどがある。米国特許第４，９９０，４４６号；第５，０６３，１５４号；第５，１３９，９３６号；及び第４，６６１，４５４号も参照。Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ及びＣａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａを含む他の酵素用の形質転換系は、当技術分野で公知である。例えば、Ｇｌｅｅｓｏｎら、Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１３２巻、３４５９〜３４６５頁、１９８６年；Ｃｒｅｇｇ、米国特許第４，８８２，２７９号；Ｒａｙｍｏｎｄら、Ｙｅａｓｔ、１４巻、１１〜２３頁、１９９８年を参照。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ細胞は、ＭｃＫｎｉｇｈｔら、米国特許第４，９３５，３４９号の方法に従って用いることができる。Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍを形質転換する方法は、Ｓｕｍｉｎｏら、米国特許第５，１６２，２２８号によって開示されている。Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａを形質転換する方法は、Ｌａｍｂｏｗｉｔｚら、米国特許第４，４８６，５３３号によって開示されている。Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａにおける組換えタンパク質の産生は、米国特許第５，７１６，８０８号；第５，７３６，３８３号；第５，８５４，０３９号；及び第５，８８８，７６８号に開示されている。
細菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ及び他の属の系統を含む、原核宿主細胞も本発明における有用な宿主細胞である。これらの宿主を形質転換し、それらにおいてクローニングされた外来ＤＮＡ配列を発現させる技術は、当技術分野で周知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、前出）。Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌において組換えタンパク質を発現させる場合、タンパク質は、一般的に不溶性顆粒として細胞質内に保持されることがあり、又は細菌分泌配列により細胞膜周辺腔に導かれることがある。前者の場合、例えば、イソチオシアン酸グアニジン又は尿素を用いて、細胞を溶解し、顆粒を回収し、変性させる。次に、変性タンパク質は、尿素の溶液並びに還元及び酸化グルタチオンの組合せに対する透析、その後の緩衝生理食塩溶液に対する透析など、変性剤を希釈することによって、再度折りたたみ、二量体化することができる。別の方法では、タンパク質は、変性剤を用いずに細胞質から可溶性の形で回収し、単離することができる。タンパク質は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水中水性抽出物として細胞から回収される。問題のタンパク質を捕捉するために、抽出物を固定化抗体又はヘパリン−セファロースカラムなどのクロマトグラフ媒体に直接加える。分泌タンパク質は、細胞を破壊して（例えば、音波処理又は浸透圧ショックにより）、細胞膜周辺腔の内容物を放出させてタンパク質を回収することによって、可溶性かつ機能し得る形で細胞膜周辺腔から回収することができ、それにより、変性及び再折りたたみの必要がなくなる。単鎖抗体を含む抗体は、公知の方法により細菌宿主細胞中で産生させることができる。例えば、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻、４２３〜４２６頁、１９８８年；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８５巻、５８７９〜５８８３頁、１９８８年；及びＰａｎｔｏｌｉａｎｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３０巻、１０１１７〜１０１２５頁、１９９１年を参照。
形質転換又はトランスフェクト宿主細胞は、選択される宿主細胞の増殖に必要な栄養素及び他の成分を含む培地中で従来の手順に従って培養する。規定の培地及び複合培地を含む様々な適切な培地は、当技術分野で公知であり、一般的に炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン及びミネラルを含む。培地は、必要に応じて成長因子又は血清のような成分も含んでいてよい。増殖培地は、例えば、発現ベクター上で運ばれる、又は宿主細胞内に共トランスフェクトされた選択可能なマーカーにより補足される必須培地中の薬物選択又は欠乏により、外因的に加えられたＤＮＡを含む細胞を一般的に選択する。
ＶＥＧＦ−Ａ及びＰＤＧＦＲβアンタゴニストタンパク質は、従来のタンパク質精製方法、一般的にクロマトグラフ技術の組合せにより精製する。一般的にＡｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ＆ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ、１９８８年）；Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９４年）を参照。免疫グロブリン重鎖ポリペプチドを含むタンパク質は、固定化プロテインＡ上の親和性クロマトグラフィーにより精製することができる。所望のレベルの純度を得るため、又は脱塩、緩衝液交換などを行うために、ゲルろ過などの追加の精製工程を用いることができる。
抗体は、従来のカラム及び他の装置を用いる親和性クロマトグラフィーなどの公知の方法により細胞培養培地から精製することができる。典型的な手順において、馴化培地を回収し、４℃で最長５日間保存することができる。汚染を防ぐために、静菌剤（例えば、アジ化ナトリウム）を一般的に加える。氷酢酸を１滴ずつ加えることなどにより、培地のｐＨを低くする（一般的にｐＨ約５．５に）。より低いｐＨで、プロテインＧ樹脂によるＩｇＧの最適な捕捉がもたらされる。プロテインＧカラムのサイズは、馴化培地の容積に基づいて決定する。充填済みカラムを３５ｍＭ ＮａＰＯ４、１２０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２などの適切な緩衝液で中和する。次いで、培地を、中和されたプロテインＧ樹脂上に培地の容積及びカラムのサイズによって決定される流速で通す。カラム上の可能なさらなる通過に備えて、流通状態を保持する。捕捉された抗体を含む樹脂を中和緩衝液で洗浄する。カラムを０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７又は同等物などの酸性溶出緩衝液を用いて画分に溶出させる。トリス：グリシン１：２０の比率で２Ｍトリス、ｐＨ８．０などにより、各画分を中和する。タンパク質含有画分（例えば、Ａ２８０に基づく）をプールする。プールした画分を脱塩カラムを用いて３５ｍＭ ＮａＰＯ４、１２０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２などの適切な緩衝液に緩衝液交換する。濃度は、１．４４の吸光係数を用いてＡ２８０により測定する。エンドトキシンレベルは、ＬＡＬアッセイにより測定することができる。精製タンパク質は、一般的には−８０℃で凍結保存することができる。
ＩＶ．治療の方法
Ａ．一般事項
他の態様において、本発明は、血管新生を阻害する方法、特に血管新生に関連する疾患又は障害の治療の方法を提供する。一般的に、そのような方法は、血管新生を阻害するのに有効な量でＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを対象に投与する工程を含む。より詳細には、治療用に、血管新生の増加によって特徴付けられる疾患又は障害（「血管新生障害」）に罹患している、又はそれを発症する高いリスクがある対象にＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを投与する。本発明による治療に敏感に反応する血管新生障害には、例えば、固形腫瘍の成長によって特徴付けられる癌（例えば、膵臓癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）並びに様々な血管新生眼障害（例えば、加齢性黄班変性、糖尿病性網膜症、虹彩新生血管形成、血管新生緑内障）がある。本発明による治療に敏感に反応する他の血管新生障害には、例えば、関節リウマチ、乾癬、アテローム動脈硬化症、慢性炎症、肺炎症、子癇前症、心膜液貯留（心膜炎を伴うものなど）及び胸水がある。
ＰＤＧＦＲβアンタゴニストの使用を含む特定の実施形態において、ＰＤＧＦＲβアンタゴニストは、本明細書で述べるような抗ＰＤＧＦＲβ抗体である。いくつかのそのような変形形態において、抗ＰＤＧＦＲβ抗体は、例えば、ＶＥＧＦ−Ａ又はＶＥＧＦ−Ａ受容体に特異的に結合する中和抗体のようなＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストと併用する。
ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの使用を含む他の実施形態において、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、本明細書で述べるような抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体である。いくつかのそのような変形形態において、抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は、例えば、ＰＤＧＦＲβ又はＰＤＧＦリガンド（例えば、ＰＤＧＦ−Ｂ又はＰＤＧＦ−Ｄ）に特異的に結合する中和抗体のようなＰＤＧＦＲβアンタゴニストと併用する。
好ましい変形形態において、ＰＤＧＦＲβ及びＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの両方を用いる。特に好ましいのは、本明細書で述べるような中和抗ＰＤＧＦＲβ抗体と本明細書で述べるような中和抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体の併用である。
ＰＤＧＦＲβアンタゴニストとＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの併用を含む各実施形態において、ＰＤＧＦＲβアンタゴニスト及びＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを同時又は別個（例えば、異なる時点及び／又は別個の投与部位）に投与してよい。したがって、ＰＤＧＦＲβアンタゴニスト及びＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの同時投与を含む特定の変形形態において、この方法は、（ａ）ＰＤＧＦＲβの細胞外ドメインに特異的に結合し、ＰＤＧＦＲβ活性を中和する抗体及び（ｂ）ＶＥＧＦ−Ａに特異的に結合し、ＶＥＧＦ−Ａ活性を中和する抗体を含む二重特異性結合組成物の投与を含む。特に好ましい実施形態において、ＰＤＧＦＲβアンタゴニスト及びＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの投与は、ＰＤＧＦＲβ及びＶＥＧＦ−Ａの両方に結合し、中和する二重特異性抗体を投与することを含む。ＰＤＧＦＲβアンタゴニスト及びＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの別個の投与を含む特定の実施形態において、ＰＤＧＦＲβアンタゴニスト及びＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを連続的に投与する。そのような実施形態において、各薬剤の投与は、同じ又は異なる方法によるものであってよい。
本明細書で述べる治療方法の実施形態のそれぞれにおいて、ＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを、治療が求められる疾患又は障害の管理に関連する従来の方法論と矛盾しない方法で送達する。本明細書における開示に従って、有効量のアンタゴニストをそのような治療を必要とする対象に疾患又は障害を予防又は治療するのに十分な時間及び条件下で投与する。
本明細書で述べるアンタゴニストの投与の対象は、血管新生に関連する個々の疾患又は障害を発症する高いリスクのある患者並びに既存の血管新生障害を示す患者を含む。特定の実施形態において、対象は、治療が求められる疾患又は障害を有すると診断された。さらに、対象は、疾患又は障害の変化について（例えば、疾患又は障害の臨床症状の増加又は減少について）治療中にモニターすることができる。また、いくつかの変形形態において、対象は、ＰＤＧＦＲβ及びＶＥＧＦ−Ａ経路の一方又は両方を阻害することを伴う治療を必要とする他の疾患又は障害に罹患していない。
予防適用において、医薬組成物又は薬剤を、疾患のリスクを除去若しくは低減又は疾患の発生を遅延させるのに十分な量で、特定の疾患に罹りやすい、又はその他の形でそのリスクのある患者に投与する。治療適用において、組成物又は薬剤を、疾患及びその合併症の症状を治癒又は少なくとも部分的に抑えるのに十分な量でそのような疾患の疑いのある、又は既に罹患している患者に投与する。これを達成するのに十分な量を、治療上又は薬学的に有効な用量又は量と呼ぶ。予防及び治療計画において、薬剤は、十分な反応（例えば、不適切な血管新生活性の阻害）が達成されるまで、通常数回投与する。典型的には、反応をモニターし、望まれる反応が消失し始めた場合には、反復投与を行う。
本発明の方法による治療の対象患者を特定するために、特定の血管新生障害に関連するリスクファクターを決定するため、又は対象において特定された既存の障害の状態を決定するために、受け入れられているスクリーニング方法を用いることができる。そのような方法は、例えば、個人が特定の疾患を有すると診断された親族を有するかどうかを決定することを含んでいてよい。スクリーニング方法はまた、例えば、遺伝性の要素を有することが知られている特定の疾患の家族的状態を決定するための通常の精密検査も含んでいてよい。例えば様々な癌が遺伝性の要素を有することも知られている。癌の遺伝性の要素には、例えば、トランスフォームする複数の遺伝子（例えば、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＥＧＦＲ、ｃＭｅｔ及びその他）における突然変異、特定のＨＬＡ及びキラー阻害性受容体（ＫＩＲ）分子の存在若しくは非存在、又は癌細胞がＮＫ細胞及びＴ細胞のような細胞の免疫抑制を直接的若しくは間接的に調節することができるメカニズムがある（例えば、Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ及びＭａｌｍｂｅｒｇ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７巻、３２９〜３３９頁、２００７年；Ｂｏｙｔｏｎ及びＡｌｔｍａｎｎ、Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４９巻、１〜８頁、２００７年を参照）。この目的に向けて、ヌクレオチドプローブを日常的に用いて、問題とする特定の疾患に関連する遺伝的マーカーを有する個人を特定することができる。さらに、特定の疾患のマーカーを同定するのに有用な種々の免疫学的方法が当技術分野で公知である。例えば、特定の腫瘍に関連する抗原を検出するためのモノクローナル抗体プローブを用いる種々のＥＬＩＳＡイムノアッセイの方法が利用可能であり、当技術分野で周知である。スクリーニングを、既知の患者の総合的症状、年齢因子、関連リスクファクターなどによって示されるように実施することができる。これらの方法は、臨床医が、治療のために本明細書で述べる方法を必要とする患者を日常的に選択することを可能にするものである。これらの方法に従って、血管新生の阻害は、独立した治療プログラムとして、或いは、他の療法へのフォローアップ、補助的又は同等の療法として実施することができる。
投与のために、ＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを医薬組成物として製剤化する。ＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを含む医薬組成物は、薬学的に有用な組成物を調製するための公知の方法により製剤化することができ、それにより、治療用分子が薬学的に許容される担体と混合物として混合される。レシピエントの患者が投与に耐えることができる場合、組成物は、「薬学的に許容される担体」と言われる。滅菌リン酸緩衝生理食塩水は、薬学的に許容される担体の１つの例である。他の適切な担体は、当業者に周知である（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ（編）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９版、１９９５年）を参照）。製剤は、１つ又は複数の賦形剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤、ウイルス表面上のタンパク質の喪失を防ぐためのアルブミンなどをさらに含んでいてよい。単一特異性アンタゴニストは、個別に製剤化するか、又は配合製剤として提供することができる。
ＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを含む医薬組成物は、有効量で対象に投与する。本発明の方法によれば、アンタゴニストは、例えば、筋肉内、皮下、静脈内、動脈内、関節内、非経口、鼻腔内、肺内、経皮、胸膜腔内、くも膜下腔内及び経口投与経路による投与方法を含む、種々の投与方法により対象に投与することができる。血管新生眼障害の治療のための医薬品の使用のために、ＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、典型的には従来の方法により硝子体内注射用に製剤化する。予防及び治療目的で、アンタゴニストは、単一ボーラス送達で、長時間にわたる連続送達（例えば、連続経皮送達）により、又は反復投与プロトコール（例えば、毎時、毎日、又は週１回）で投与することができる。
組成物の「治療有効量」は、疾患の進行の統計的に有意な低減又は臓器の機能の統計的に有意な改善などの統計的に有意な効果をもたらす量である。正確な用量は、臨床医が治療する状態の性質及び重症度、患者特性などを考慮に入れ、受け入れられている基準に従って決定する。用量の決定は、当業者のレベル内にある。
この状況における有効用量の決定は、一般的にヒト臨床試験によりフォローアップされる動物モデル試験に基づくものであり、モデル対象における対象疾患又は障害の発生又は重症度を有意に低減させる有効用量及び投与プロトコールを決定することによって導かれる。本発明の組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトであるか又は動物であるか、投与される他の薬剤、処置が予防的であるか又は治療的であるか、並びに組成物自体の特定の活性及び個体における所望の反応を誘発するその能力を含む、多数の異なる因子に応じて様々となる。通常、患者はヒトであるが、ある種の疾患においては、患者は、非ヒト哺乳動物であり得る。典型的には、投与計画は、最適な治療応答をもたらすため、すなわち、安全性及び有効性を最適化するように調整される。したがって、治療又は予防有効量は、血管新生を阻害する有益な効果が望まれない副次的効果よりまさる量でもある。ＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの投与については、用量は、典型的には約０．１μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ又は１μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇであり、より通常には１０μｇ〜５ｍｇ／ｋｇ対象体重である。より特有の実施形態において、薬剤の有効量は、約１μｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇまで、約１０μｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇまで、又は約０．１ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇまでである。この範囲内の用量は、例えば、１日当たり複数回の投与、或いは毎日、週１回、隔週、又は月１回の投与を含む、１回又は複数回の投与によって達成することができる。例えば、特定の変形形態において、投与計画は、初回投与に続く、毎週又は隔週の間隔での複数回のその後の投与からなる。他の投与計画は、初回投与に続く、毎月又は隔月の間隔での複数回のその後の投与からなる。或いは、投与は、ＮＫ細胞活性及び／又は疾患若しくは障害の臨床症状のモニタリングによって示されるように不規則的であり得る。
医薬組成物の用量は、標的部位における所望の濃度を維持するために担当医が変更することができる。例えば、静脈内送達方法を選択する場合、標的組織における血流中の薬剤の局所的濃度は、対象の状態又は計画される測定反応によって１リットル当たり約１〜５０ナノモルの組成物、時として１リットル当たり約１．０から１０、１５又は２５ナノモルであってよい。送達の方法に基づいて、例えば、粘膜表面への送達に対して経皮送達において、より高い又はより低い濃度を選択してよい。用量も投与製剤、例えば、鼻噴霧剤対散剤、持続放出経口又は注射粒子、経皮製剤などの放出速度に基づいて調節すべきである。例えば、同じ血清濃度レベルを達成するために、５ナノモルの放出速度（標準条件下で）を有する徐放性粒子は、１０ナノモルの放出速度を有する粒子の約２倍の用量で投与される。
ＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを含む医薬組成物は、液体の形、エアゾール又は固体の形で提供することができる。液体剤形は、注射用液剤、エアゾール剤、滴剤、トポロジカル液剤及び経口懸濁剤により例示される。例示的な固形剤形には、カプセル剤、錠剤及び放出制御剤形がある。後者の剤形は、微小浸透圧ポンプ及び植込剤により例示される。（例えば、Ｂｒｅｍｅｒら、Ｐｈａｒｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１０巻、２３９頁、１９９７年；Ｒａｎａｄｅ、「Ｉｍｐｌａｎｔｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、９５〜１２３頁（Ｒａｎａｄｅ及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９５年）；Ｂｒｅｍｅｒら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｗｉｔｈ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｐｕｍｐｓ」、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ： Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、２３９〜２５４頁（Ｓａｎｄｅｒｓ ａｎｄ Ｈｅｎｄｒｅｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９９７年）；Ｙｅｗｅｙら、「Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ａ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｉｍｐｌａｎｔ」、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ： Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、９３〜１１７頁（Ｓａｎｄｅｒｓ ａｎｄ Ｈｅｎｄｒｅｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９９７年）を参照。）他の固形剤形は、クリーム剤、ペースト剤、他のトポロジカル適用剤などがある。
リポソームは、治療用ポリペプチドを対象に、例えば、静脈内、腹腔内、くも膜下腔内、筋肉内、皮下、又は経口投与、吸入又は鼻腔内投与により送達する１つの手段を提供する。リポソームは、水性コンパートメントを取り囲む１つ又は複数の脂質二重層からなる顕微視的小胞である。（一般的に、Ｂａｋｋｅｒ−Ｗｏｕｄｅｎｂｅｒｇら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．、１２巻（Ｓｕｐｐｌ． １）、Ｓ６１頁、１９９３年；Ｋｉｍ、Ｄｒｕｇｓ、４６巻、６１８頁、１９９３年；Ｒａｎａｄｅ、「Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｕｓｉｎｇ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ａｓ Ｃａｒｒｉｅｒｓ」、Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、３〜２４頁（Ｒａｎａｄｅ及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９５年）を参照。）リポソームは、細胞膜と組成が類似しており、結果として、リポソームを安全に投与することができ、生分解性である。調製の方法に応じて、リポソームは、単層又は多重層となることがあり、リポソームは、サイズが変化することがあり、直径０．０２μｍから１０μｍまでの範囲にある。種々の薬剤をリポソームに封入することができ、疎水性薬剤は、二重層に分配され、親水性薬剤は、内部の水性腔（単数又は複数）内に分配される。（例えば、Ｍａｃｈｙら、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｌｉｂｂｅｙ、１９８７年）；Ｏｓｔｒｏら、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊ． Ｈｏｓｐ． Ｐｈａｒｍ．、４６巻、１５７６頁、１９８９年を参照。）さらに、リポソームのサイズ、二重層の数、脂質組成、並びにリポソームの電荷及び表面特性を変化させることによって封入薬剤の治療上の利用性を調節することが可能である。
リポソームは、事実上あらゆる種類の細胞に吸着し、次に封入薬剤を徐々に放出することができる。或いは、吸着されたリポソームは、食細胞性である細胞によりエンドサイトーシスにより取り込まれる。エンドサイトーシスに続いて、リポソーム脂質のリソソーム内分解と封入薬剤の放出が起こる（Ｓｃｈｅｒｐｈｏｆら、Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、４４６巻、３６８頁、１９８５年を参照）。静脈内投与後に、小リポソーム（０．１〜１．０μｍ）は、主として肝臓及び脾臓にある網内系の細胞によって一般的に取り込まれるが、３．０μｍより大きいリポソームは、肺に沈着する。網内系の細胞によるより小さいリポソームのこの選択的な取込みは、化学療法薬をマクロファージ及び肝臓の腫瘍に送達するのに用いられている。
網内系は、大用量のリポソーム粒子による飽和、又は薬理学的手段による選択的マクロファージ不活性化を含むいくつかの方法により回避することができる（Ｃｌａａｓｓｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ、８０２巻、４２８頁、１９８４年を参照）。さらに、糖脂質又はポリエチレングリコール誘導体化リン脂質のリポソーム膜内への取込みは、網内系による取込みの有意な減少をもたらすことが示された（Ａｌｌｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ、１０６８巻、１３３頁、１９９１年；Ａｌｌｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ、１１５０巻、９頁、１９９３年を参照）。
リポソームは、リン脂質成分を変化させることによって、或いは受容体又は対抗受容体をリポソームに挿入することによって、特定の細胞又は臓器を標的にするように調製することもできる。例えば、高含量の非イオン性界面活性剤を用いて調製したリポソームは、肝臓を標的とするために用いられた（例えば、Ｈａｙａｋａｗａらへの日本国特許第０４−２４４，０１８号；Ｋａｔｏら、Ｂｉｏｌ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ．、１６巻、９６０頁、１９９３年を参照）。これらの製剤は、メタノール中ダイズホスファチジルコリン、α−トコフェロール及びエトキシル化水素化ヒマシ油（ＨＣＯ−６０）を混合し、混合物を真空中で濃縮し、次いで、混合物を水で再構成することにより調製した。ダイズ由来ステリルグルコシド混合物（ＳＧ）及びコレステロール（Ｃｈ）を用いたジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）のリポソーム製剤も肝臓を標的とすることが示された（Ｓｈｉｍｉｚｕら、Ｂｉｏｌ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ．、２０巻、８８１頁、１９９７年を参照）。
或いは、抗体、抗体フラグメント、炭水化物、ビタミン及び輸送タンパク質などの種々のターゲティング対抗受容体をリポソームの表面に結合させることができる。例えば、肝臓を標的にするために、肝細胞の表面上でのみ発現するアシアロ糖タンパク質（ガラクトース）受容体を標的にする分枝型ガラクトシル脂質誘導体でリポソームを修飾することができる（Ｋａｔｏ及びＳｕｇｉｙａｍａ、Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｔｈｅｒ． Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．、１４巻、２８７頁、１９９７年；Ｍｕｒａｈａｓｈｉら、Ｂｉｏｌ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ．、２０巻、２５９頁、１９９７年を参照）。組織ターゲティングへのより一般的なアプローチにおいて、標的細胞を、標的細胞により発現される対抗受容体に特異的なビオチン化抗体で前標識する（Ｈａｒａｓｙｍら、Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ．、３２巻、９９頁、１９９８年を参照）。遊離抗体の血漿除去の後に、ストレプトアビジンコンジュゲートリポソームを投与する。他のアプローチにおいては、ターゲティング抗体をリポソームに直接結合させる（Ｈａｒａｓｙｍら、前出を参照）。
ポリペプチド及び抗体は、タンパク質のマイクロカプセル化の標準的技術を用いてリポソーム内に封入することができる（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．、３１巻、１０９９頁、１９８１年；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５０巻、１８５３頁、１９９０年；Ｃｏｈｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ、１０６３巻、９５頁、１９９１年；Ａｌｖｉｎｇら、「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ」、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＩＩＩ巻）、３１７頁（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９９３年）；Ｗａｓｓｅｆら、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１４９巻、１２４頁、１９８７年を参照）。上記のように、治療上有用なリポソームは、様々な成分を含んでいてよい。例えば、リポソームは、ポリエチレングリコールの脂質誘導体を含んでいてよい（Ａｌｌｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ、１１５０巻、９頁、１９９３年を参照）。
治療用タンパク質の高い全身レベルを維持するために分解性ポリマーマイクロスフェアが設計された。マイクロスフェアは、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）、ポリ酸無水物、ポリ（オルトエステル）、非生分解性酢酸エチルビニルポリマーなどの分解性ポリマーから調製され、タンパク質がポリマー内に閉じ込められている。（例えば、Ｇｏｍｂｏｔｚ及びＰｅｔｔｉｔ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、６巻、３３２頁、１９９５年；Ｒａｎａｄｅ、「Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、５１〜９３頁（Ｒａｎａｄｅ及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９５年）；Ｒｏｓｋｏｓ及びＭａｓｋｉｅｗｉｃｚ、「Ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ： Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、４５〜９２頁（Ｓａｎｄｅｒｓ及びＨｅｎｄｒｅｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９９７年；Ｂａｒｔｕｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１巻、１１６１頁、１９９８年；Ｐｕｔｎｅｙ及びＢｕｒｋｅ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６巻、１５３頁、１９９８年；Ｐｕｔｎｅｙ、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．、２巻、５４８頁、１９９８年を参照。）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コートナノスフェアも治療用タンパク質の静脈内投与用の担体となり得る（例えば、Ｇｒｅｆら、Ｐｈａｒｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１０巻、１６７頁、１９９７年を参照）。
他の剤形は、例えば、Ａｎｓｅｌ及びＰｏｐｏｖｉｃｈ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ、５版、１９９０年）；Ｇｅｎｎａｒｏ（編）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９版、１９９５年）；並びにＲａｎａｄｅ及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ、Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９６年）により示されているように、当業者が案出することができる。
本明細書で述べる医薬組成物は、併用療法の状況においても使用され得る。「併用療法」という用語は、本明細書において対象に少なくとも１つの治療有効な用量のＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストと他の治療薬を投与することを表すために用いる。ＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、例えば、ＰＤＧＦＲβ及びＶＥＧＦ−Ａの両方に結合し、中和する二重特異性結合組成物であってよい。特に好ましい変形形態では、二重特異性結合組成物は、本明細書で述べる二重特異性抗体である。
例えば、癌免疫療法の状況において、ＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニスト活性を有する組成物は、化学療法又は放射線と組合わせて血管新生阻害薬として用いることができる。ＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、従来型の化学療法又は放射線と相乗的に作用し得る。ＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、腫瘍量をさらに低減することができ、化学療法によるより効果的な死滅を可能にする。
血管新生阻害活性を示す本発明の組成物は、様々なサイトカイン及び共刺激性／阻害性分子を含む免疫調節化合物と併用することもできる。これらは、抗癌免疫反応を刺激するサイトカインの使用を含むが、これらに限定されないと思われる。例えば、ＩＬ−２及びＩＬ−１２の併用は、Ｔ細胞リンパ腫、扁平上皮癌及び肺癌において有用な効果を示す（Ｚａｋｉら、Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ，、１１８巻、３６６〜７１頁、２００２年；Ｌｉら、Ａｒｃｈ． Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇ．、１２７巻、１３１９〜２４頁、２００１年；Ｈｉｒａｋｉら、Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ、３５巻、３２９〜３３頁、２００２年を参照）。さらに、ＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、ＣＤ１３７の活性化（Ｗｉｌｃｏｘら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．、１０９巻、６５１〜９頁、２００２年を参照）又はＣＴＬＡ４の阻害（Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９巻、５６５〜９４頁、２００１年）などの、免疫に基づくエフェクター細胞上に認められる様々な細胞表面分子を共刺激する試薬と併用することができる。或いは、ＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、ＴＲＡＩＬ関連受容体と相互作用することにより腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する試薬と併用することができる（例えば、Ｔａｋｅｄａら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１９５巻、１６１〜９頁、２００２年；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ、Ｎｅｏｐｌａｓｉａ、３巻、５３５〜４６頁、２００１年を参照）。そのような試薬には、ＴＲＡＩＬリガンド、ＴＲＡＩＬリガンド−Ｉｇ融合体、抗ＴＲＡＩＬ抗体などがある。
他の変形形態において、ＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを、血管新生を特異的に標的にしないモノクローナル抗体療法と併用する。そのような併用療法は、モノクローナル抗体、特に腫瘍発現抗原に対して誘導された抗体の使用が乳房細胞癌腫（トラスツズマブ又はＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）及び結腸癌（セツキシマブ又はＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））を含む多くの腫瘍に対する標準診療になりつつある、癌の治療に特に有用である。
医薬組成物は、本明細書で述べるような治療用組成物を含む容器を含むキットとして供給することができる。治療用組成物は、例えば、単回又は反復投与用の注射用液剤の形で、或いは注射前に再構成する滅菌粉末として提供することができる。或いは、そのようなキットは、治療用組成物の投与のための乾燥粉末分散機、液体エアゾール発生機又は噴霧機を含んでいてよい。そのようなキットは、適応症及び医薬組成物の用法に関する情報文書をさらに含んでいてよい。
Ｂ．癌治療
１．癌の種類
本発明による治療に敏感に反応する癌は、固形腫瘍の存在によって特徴付けられる癌を含む。前述のように、腫瘍組織における血管の量は、固形腫瘍の形成を伴う癌の強い負の予後指標であり（例えば、Ｗｅｉｄｎｅｒら、（１９９２年）、前出；Ｗｅｉｄｎｅｒら、（１９９３年）、前出；Ｌｉら、前出；Ｆｏｓｓら、前出を参照）、シグナル伝達分子のＶＥＧＦ及びＰＤＧＦファミリーの両方が固形腫瘍に関連する新たな血管の発生に重要な役割を果たすように思われる。下の表７に、標的組織により主として組織される、固形腫瘍の形成によって特徴付けられるいくつかの癌を列挙する。
したがって、特定の実施形態において、本明細書で述べるようなＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、例えば表７に列挙した癌のいずれかなどの固形腫瘍の存在によって特徴付けられる癌を治療するために用いる。例えば、いくつかの実施形態において、本発明によって治療することができる癌は、次のものから選択される：頭頚部癌（例えば、口腔、口腔咽頭部、鼻咽頭、下咽頭、鼻腔若しくは副鼻腔、咽頭、口唇又は唾液腺）、肺癌（例えば、非小細胞肺癌、小細胞癌又は中皮腫）、胃腸管癌（例えば、結腸直腸癌、胃癌、食道癌又は肛門癌）、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、膵臓腺癌、膵臓腺房細胞癌、小腸の癌、肝臓若しくは胆管樹状構造（ｔｒｅｅ）の癌（例えば、肝細胞腺腫、肝細胞癌、血管肉腫、肝外若しくは肝内胆管肉腫、ファーター膨大部の癌又は胆嚢癌）、乳癌（例えば、転移性乳癌又は炎症性乳癌）、婦人科癌（例えば、子宮頚癌、卵巣癌、ファローピウス管癌、腹膜癌、膣癌、外陰部癌、妊娠性栄養膜新生物又は子宮内膜癌若しくは子宮肉腫を含む子宮癌）、尿路の癌（例えば、前立腺癌、膀胱癌、陰茎癌、尿管癌、又は例えば、腎盤及び尿管を含む、腎細胞癌若しくは移行細胞癌などの腎臓癌）、精巣癌、頭蓋内腫瘍（例えば、星状細胞腫、未分化星状細胞腫、神経膠芽腫、オリゴデンドログリオーマ、未分化オリゴデンドログリオーマ、上衣腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、髄芽腫、生殖細胞腫、松果体新生物、髄膜腫、下垂体腫瘍、神経鞘の腫瘍（例えば、神経鞘腫）、脊索腫、頭蓋咽頭腫、脈絡叢腫瘍（例えば、脈絡叢癌）などの中枢神経系（ＣＮＳ）の癌、或いはニューロン若しくは神経膠起源の他の頭蓋内腫瘍）又は脊髄の腫瘍（例えば、神経鞘腫、髄膜腫）、内分泌腺新生物（例えば、甲状腺癌、髄様癌若しくは甲状腺リンパ腫などの甲状腺癌、例えば、インスリノーマ若しくはグルカゴノーマなどの膵臓内分泌腺腫瘍、例えば、褐色細胞腫などの副腎癌、類癌腫又は上皮小体癌）、皮膚癌（例えば、扁平上皮癌、基底細胞癌、カポジ肉腫、又は例えば、眼内黒色腫などの悪性黒色腫）、骨癌（例えば、骨肉腫、骨軟骨腫又はユーイング肉腫などの骨肉腫）、多発性骨髄腫、緑色腫、軟組織肉腫（例えば、線維腫又は線維組織球腫）、平滑筋又は骨格筋の腫瘍、血管又はリンパ管血管周囲腫瘍（例えば、カポジ肉腫）、滑膜腫瘍、中皮腫、神経腫瘍、傍神経節腫瘍、骨格外軟骨又は骨腫瘍、及び多能性間葉腫瘍。
いくつかの変形形態において、治療することができる癌は、例えば、脳癌、神経芽腫、ウィルムス腫瘍（腎芽腫）、横紋筋肉腫、網膜芽腫又は肝芽腫などの小児癌である。
他の変形形態において、癌は、例えば、黒色腫、腎臓癌、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、子宮頚癌、卵巣癌又は肺癌などの免疫療法に感受性の癌である。
腫瘍反応に関するＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの効果を評価するための適切な動物モデルのいくつかを含む、上で示したいくつかの癌について下でさらに詳細に述べる。
ａ．黒色腫
表在拡大型黒色腫は、黒色腫の最も一般的なタイプである。１０例中７例（７０％）がこのタイプである。それらは、主として中年者に発生する。女性における最も一般的な場所は脚であるが、男性においては躯幹、特に背部がより一般的である。それらは、皮膚の表面にわたって広がることによって始まる傾向があり、これは、水平増殖期として知られている。黒色腫をこの段階で除去する場合、治癒の可能性は非常に高い。黒色腫を除去しない場合、皮膚の層内のより深部へと成長し始めるであろう。そのとき黒色腫が血流又はリンパ系から身体の他の部位に広がるリスクがある。結節型黒色腫は、頬又は背部に最も一般的に発生する。これは、中年者に最も一般的に認められる。これは、除去しない場合には、皮膚のより深部にかなり速やかに成長する傾向がある。このタイプの黒色腫は、皮膚表面の残部の上にしばしば隆起し、こぶのように感ずる。非常に暗い褐色又は黒色である。悪性黒子型黒色腫は、特に高齢者の顔面に最も一般的に認められる。これは、徐々に成長し、発症するのに数年を要することがある。末端性黒色腫は、手掌、足底又は足指爪の周囲に通常認められる。皮膚の黒色腫の他の非常にまれなタイプは、メラニン欠乏性黒色腫（黒色腫がその色素を失い、白色の部位として見える）及び線維形成性黒色腫（線維性瘢痕組織を含む）などである。悪性黒色腫は、皮膚以外の身体の部位で発症し得るが、これは非常にまれである。罹患する可能性がある身体の部位は、眼、口、指爪の下（爪下黒色腫として公知）、外陰部若しくは膣組織又は体内である。
ほとんどの黒色腫は、正常皮膚の外観の変化から始まる。これは、新たな異常な母斑のように見えることがある。１／３未満は、既存の母斑で発生する。母斑と黒色腫との差異を述べることは困難であり得るが、以下のチェックリストを助けとして用いることができる。これは、ＡＢＣＤリストとして公知である。非対称性−通常の母斑は、通常、形状が対称である。黒色腫は、不規則又は非対称である可能性がある。境界−母斑は、はっきりした規則的な境界を有する。黒色腫は、ぎざぎざした縁をもつ不規則な境界を有する可能性がある。色−母斑は、通常、均一な褐色である。黒色腫は、複数の色を有する傾向がある。それらは、黒、赤、ピンク、白又は青みがかった色合いとを混合した褐色の様々な色調であることがある。直径−母斑は、通常、鉛筆の鈍端（直径約６ｍｍ）より大きくない。黒色腫は、通常、直径が７ｍｍを超える。通常の母斑は、皮膚から隆起していることがあり、かつ／又は毛が生えていることがあり得る。痒み、痂皮形成又は出血も黒色腫で起こることがある−これらは、さほど一般的でない徴候であるが、無視すべきではない（ｃａｎｃｅｒｂａｃｕｐインターネットウエブサイト）。腫瘍反応に関するＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの効果は、ＨｅｒｍａｎｓらＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６３巻、８４０８〜１３頁、２００３年；Ｒａｍｏｎｔら、Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．、２９巻、１〜１０頁、２００３年；Ｓａｆｗａｔら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． Ｏｎｃｏｌ．、３巻、１６１〜８頁、２００３年；及びＦｉｄｌｅｒ、Ｎａｔ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ．、２４２巻、１４８〜９頁、１９７３年に記載されているものと同様なマウス黒色腫モデルにおいて評価することができる。
ｂ．腎細胞癌
腎尿細管の細胞の癌性変化を伴う腎臓癌の１つの形である腎細胞癌は、成人における腎臓癌の最も一般的なタイプである。細胞が癌性になる原因は不明である。喫煙歴は、腎細胞癌を発症するリスクを著しく増大させる。一部の人も腎細胞癌を発症する高いリスクを遺伝によって受け継いでおり、腎臓癌の家族歴はリスクを増大させる。脳の毛細血管を罹患させる遺伝病である、フォンヒッペル−リンドウ病を有する人も一般的に腎細胞癌を発症する。治療のために透析を必要とする腎臓障害も腎細胞癌を発症するリスクを増大させる。最初の症状は、通常、血尿である。時には、両腎が罹患する。癌は、最もしばしば肺及び他の臓器に容易に転移又は広がり、患者の約１／３が診断時に転移部を有する（Ｍｅｄｌｉｎｅ Ｐｌｕｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａインターネットウエブサイト）。腫瘍反応に関するＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの効果は、Ｓａｙｅｒｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５０巻、５４１４〜２０頁、１９９０年；Ｓａｌｕｐら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３８巻、６４１〜７頁、１９８７年；及びＬｕａｎら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、７３巻、１５６５〜７２頁、２００２年に記載されているものと同様なマウス腎細胞癌モデルにおいて評価することができる。
ｃ．子宮頚癌
子宮頚部は、膣内に開いている子宮の頚部である。子宮頚癌は、子宮頚癌腫とも呼ばれ、子宮頚部の表面の異常な細胞から発生する。子宮頚癌は、女性を罹患させる最も一般的な癌の１つである。子宮頚癌に通常、子宮頚部の表面の細胞の形成異常、前癌性変化が先行する。これらの異常な細胞は、浸潤性癌に進行し得る。癌が出現したならば、４つの病期を経て進行する。病期は、癌の広がりの程度によって定義される。癌が広がるほど、治療はより広範になる可能性がある。子宮頚癌には次のような２つの主要なタイプがある。（１）扁平タイプ（類表皮癌）：これは、子宮頚癌の約８０％〜８５％を占める最も一般的なタイプである。この癌は、性的に伝達される疾患によって引き起こされることがある。１つのそのような性病は、性病いぼを引き起こすヒト乳頭腫ウイルスである。癌性腫瘍は、子宮頚部上及び内で成長する。この癌は、一般的に子宮頚部の表面上で発症し、パパニコロウスメアにより初期に診断される可能性がある。（２）腺癌：このタイプの子宮頚癌は、子宮頚部の管における子宮頚腺にある組織から発生する。初期の子宮頚癌は、通常症状を引き起こさない。癌は、通常、パパニコロウスメア及び骨盤検査により検出される。これが、性的に活動的になったならば速やかにパパニコロウスメア及び骨盤検査を受けることを始めるべきである理由である。性的に全く活動的でなかった健康な若年女性は、１８歳までに最初の年１回の骨盤検査を受けるべきである。後期の子宮頚癌は、月経期と月経期の間、性交後又は閉経後などの予期しない時に異常な膣出血又は血液が混じった分泌物を引き起こす。異常な膣分泌物は、濁り又は血液が混じることがあり、或いは悪臭のある粘液を含むことがある。進行期の癌は、疼痛を引き起こすことがある（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｈｉｇａｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｙｓｔｅｍインターネットウエブサイト）。腫瘍反応に関するＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの効果は、Ａｈｎら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１４巻、１３８９〜９９頁、２００３年；Ｈｕｓｓａｉｎら、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、４９巻、２３７〜４０頁、１９９２年；及びＳｅｎｇｕｐｔａら、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、４８巻、２５８〜６１頁、１９９１年に記載されているものと同様なマウス子宮頚癌モデルにおいて評価することができる。
ｄ．頭頚部癌
頭頚部のほとんどの癌は、癌（特に扁平上皮癌）と呼ばれるタイプのものである。頭頚部の癌は、口、鼻、喉若しくは耳の内面（ｌｉｎｉｎｇ）、又は舌を覆う表面層を形成する細胞において発症する。しかし、頭頚部の癌は、他のタイプの細胞から発生し得る。リンパ腫は、リンパ系の細胞から発生する。肉腫は、筋肉、軟骨又は血管を構成する支持細胞から発生する。黒色腫は、眼及び皮膚に色を与えるメラノサイトと呼ばれる細胞から発症する。頭頚部癌の症状は、それが存在する場所に依存し、例えば、舌の癌は、発語の不明瞭さの原因となり得る。最も一般的な症状は、数週間以内に治癒しない頭部又は頚部の潰瘍又はびらん部位；嚥下困難又は咀しゃく若しくは嚥下時の疼痛；持続性騒音性呼吸、不明瞭な発語若しくはしゃがれ声などの呼吸又は発語の困難；口内のしびれ感；持続性鼻づまり、又は鼻血；持続性耳痛、耳鳴り又は聴覚障害；口又は頚部の腫脹又は腫れ；顔面又は上顎の疼痛であり、喫煙又はタバコを噛む人において、口の内面又は舌上に前癌変化が起こり得る。これらは、持続性の白色斑（白斑症）又は赤色斑（紅板症）として出現することがある。それらは、通常無痛性であるが、時としてびらんとなることがあり、出血することがある（Ｃａｎｃｅｒｂａｃｕｐインターネットウエブサイト）。腫瘍反応に関するＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの効果は、Ｋｕｒｉａｋｏｓｅら、Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ、２２巻、５７〜６３頁、２０００年；Ｃａｏら、Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５巻、１９２５〜３４頁、１９９９年；Ｈｉｅｒら、Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ、１０５巻、１０７７〜８０頁、１９９５年；Ｂｒａａｋｈｕｉｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５１巻、２１１〜４頁、１９９１年；Ｂａｋｅｒ、Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ、９５巻、４３〜５６頁、１９８５年；及びＤｏｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１０巻、９６〜１０４頁、２００３年に記載されているものと同様なマウス頭頚部癌モデルにおいて評価することができる。
ｅ．脳癌
脳組織において発症する腫瘍は、脳の原発性腫瘍として公知である。原発性脳腫瘍は、細胞の種類又はそれらが始まる脳の部位に従って命名される。最も一般的な原発性脳腫瘍は、神経膠腫である。それらは、神経膠細胞において始まる。神経膠腫には多くのタイプが存在する。（１）星状細胞腫−腫瘍は、星状細胞と呼ばれる星状神経膠細胞から生ずる。成人においては、星状細胞腫は、大脳において最も頻繁に生ずる。小児においては、それらは、脳幹、大脳及び小脳に発生する。グレードＩＩＩの星状細胞腫は、時として未分化星状細胞腫と呼ばれる。グレードＩＶの星状細胞腫は、通常、多形神経膠芽腫と呼ばれる。（２）脳幹神経膠腫−腫瘍は、脳の低部で発生する。脳幹神経膠腫は、若年小児及び中年成人においてしばしば診断される。（３）上衣腫−腫瘍は、脳室又は脊髄の中心管の内面の細胞から生ずる。それらは、小児及び若年成人において最も一般的に認められる。（４）オリゴデンドログリオーマ−このまれな腫瘍は、神経を覆い、保護する脂肪物質を産生する細胞から生ずる。これらの腫瘍は、通常大脳に発生する。それらは、徐々に成長し、通常周囲脳組織に広がらない。それらは、中年成人に最も一般的である。脳腫瘍の症状は、腫瘍のサイズ、タイプ及び位置に依存する。症状は、腫瘍が神経を圧迫したり、脳の特定の部位を損傷する場合に引き起こされることがある。症状はまた、脳が腫脹するか、又は液が頭蓋内に蓄積する場合に引き起こされることがある。これらは、脳腫瘍の最も一般的な症状である。すなわち、頭痛（通常朝により悪い）；悪心又は嘔吐；発語、視力又は聴力の変化；平衡又は歩行の問題；気分、人格又は集中力の変化；記憶の問題；筋肉単収縮又はれん縮（発作又は痙攣）；及び腕又は脚のしびれ又は刺痛（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓインターネットウエブサイト）。腫瘍反応に関するＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの効果は、Ｓｃｈｕｅｎｅｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６３巻、４００９〜１６頁、２００３年；Ｍａｒｔｉｎｅｔら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｓｕｒｇ． Ｏｎｃｏｌ．、２９巻、３５１〜７頁、２００３年；Ｂｅｌｌｏら、Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、８巻、３５３９〜４８頁、２００２年；Ｉｓｉｋａｗａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．、９５巻、９８〜１０３頁、２００４年；Ｄｅｇｅｎら、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．、９９巻、８９３〜８頁、２００３年； Ｅｎｇｅｌｈａｒｄら、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ、４８巻、６１６〜２４頁、２００１年；Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｎｅｕｒｏｌ． Ｒｅｓ．、２４巻、４８５〜９０頁、２００２年；及びＬｕｍｎｉｃｚｋｙら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、９巻、４４〜５２頁、２００２年に記載されているものと同様な神経膠腫動物モデルにおいて評価することができる。
ｆ．甲状腺癌
乳頭状及び濾胞性甲状腺癌は、すべての甲状腺癌の８０〜９０％を占めている。両タイプは、甲状腺の濾胞細胞に始まる。ほとんどの乳頭状及び濾胞性甲状腺癌は、徐々に成長する傾向がある。それらは初期に検出されるならば、ほとんどを成功裏に治療することができる。髄様甲状腺癌は、甲状腺癌の症例の５〜１０％を占めている。これは、Ｃ細胞に生じ、濾胞細胞には生じない。髄様甲状腺癌は、身体の他の部位に広がる前に発見し、治療するならば、コントロールすることがより容易である。未分化甲状腺癌は、最も一般的でないタイプの甲状腺癌である（症例のわずか１〜２％）。これは、濾胞細胞に生ずる。癌細胞は、高度に異常であり、認識することが困難である。このタイプの癌は、癌細胞が非常に速やかに成長し、広がるため、コントロールすることが通常非常に困難である。初期の甲状腺癌は、しばしば症状を引き起こさない。しかし、癌が成長するとき、症状には、次のものが含まれることがある：のどぼとけの近くの首の前面の腫れ又は小瘤；しゃがれ声又は正常の声での発語が困難；特に頚部のリンパ節の腫脹；嚥下又は呼吸困難；或いは喉又は頚部の疼痛（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓインターネットウエブサイト）。腫瘍反応に関するＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの効果は、Ｑｕｉｄｖｉｌｌｅら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１４５巻、２５６１〜７１頁、２００４年（マウスモデル）；Ｃｒａｎｓｔｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６３巻、４７７７〜８０頁、２００３年（マウスモデル）；Ｚｈａｎｇら、Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（Ｏｘｆ）、５２巻、６８７〜９４頁、２０００年（ラットモデル）；及びＺｈａｎｇら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１４０巻、２１５２〜８頁、１９９９年（ラットモデル）に記載されているものと同様なマウス又はラット甲状腺腫瘍モデルにおいて評価することができる。
ｇ．肝臓癌
原発性肝臓癌には２種の異なるタイプがある。最も一般的な種類は、肝癌又は肝細胞癌（ＨＣＣ）であり、肝臓の主要な細胞（肝細胞）から生ずる。このタイプは、時折他の臓器に広がるが、通常肝臓に限定される。これは、肝硬変と呼ばれる肝臓疾患を有する人に主として発生する。若年者に発生する可能性があり、以前の肝疾患に関連しない、線維層板状肝癌と呼ばれる肝癌のよりまれなサブタイプも存在する。他のタイプの原発性肝臓癌は、胆管の内面の細胞に始まるため、胆管細胞癌又は胆管癌と呼ばれる。肝癌を発現するほとんどの人は、肝臓の硬変と呼ばれる状態も通常有する。これは、感染及び長期間にわたる多量の飲酒を含む様々な原因に起因する肝臓全体の微細な瘢痕化である。しかし、肝臓の硬変を有する人のうちのわずかな割合の人が原発性肝臓癌を発現する。Ｂ型肝炎又はＣ型肝炎ウイルスの感染は、肝臓癌につながることがあり、肝癌発症のリスクを増大させる、硬変の原因でもあり得る。体内の鉄の過剰な沈着をもたらす、ヘモクロマトーシスと呼ばれるまれな状態を有する人は、肝癌を発現するより高い可能性を有する。したがって、本発明のＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、肝細胞癌を治療し、予防し、その進行を阻害し、その発生を遅延させ、かつ／又は、肝細胞癌に関連する状態又は症状の重症度を低減し、若しくはその少なくとも１つを阻害するのに用いることができる。肝細胞癌は、肝炎（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎及びＤ型肝炎）感染に関連する可能性も又は関連しない可能性もある。
腫瘍反応に関するＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの効果は、トランスフォーミング成長因子α（ＴＦＧ−α）のみの過剰発現（Ｊｈａｐｐａｎら、Ｃｅｌｌ、６１巻、１１３７〜１１４６頁、１９９０年；Ｓａｎｄｇｒｅｎら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１３巻、３２０〜３３０頁、１９９３年；Ｓａｎｄｇｒｅｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、４巻、７１５〜７２４頁、１９８９年；及びＬｅｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５２巻、５１６２〜５１７０頁、１９９２年）又はｃ−ｍｙｃ（Ｍｕｒａｋａｍｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５３巻、１７１９〜１７２３頁、１９９３年）、突然変異Ｈ−ｒａｓ（Ｓａｉｔｏｈら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、５巻、１１９５〜２０００頁、１９９０年）、ＨｂｓＡｇ及びＨＢｘをコードするＢ型肝炎ウイルス遺伝子（Ｔｏｓｈｋｏｖら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２０巻、１１６２〜１１７２頁、１９９４年；Ｋｏｉｋｅら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、１９巻、８１０〜８１９頁、１９９４年）、ＳＶ４０大Ｔ抗原（Ｓｅｐｕｌｖｅｄａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４９巻、６１０８〜６１１７頁、１９８９年；Ｓｃｈｉｒｍａｃｈｅｒら、Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．、１３９巻、２３１〜２４１頁、１９９１年）並びにＦＧＦ１９（Ｎｉｃｈｏｌｅｓら、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、１６０巻、２２９５〜２３０７頁、２００２年）と組合わせたその過剰発現を含む、肝細胞癌トランスジェニックマウスモデルにおいて評価することができる。
ｈ．肺癌
腫瘍反応に関するＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの効果は、ヒト小／非小細胞肺癌異種移植モデルにおいて評価することができる。簡単に述べると、ヒト腫瘍を免疫不全マウスに移植し、これらのマウスにＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストのみ、或いは腫瘍の成長を評価することにより治療の有効性を示すのに用いることができる他の薬剤と併用して治療する（Ｎｅｍａｔｉら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６巻、２０７５〜８６頁、２０００年；及びＨｕら、Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１０巻、７６６２〜７０頁、２００４年）。
２．固形腫瘍についてのエンドポイント及び抗腫瘍活性
各プロトコールは腫瘍反応評価を異なる形で定義している可能性があるが、ＲＥＣＩＳＴ（固形腫瘍における反応評価基準）の基準は、現在のところ国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）による腫瘍反応の評価に関する推奨ガイドラインであるとみなされる（Ｔｈｅｒａｓｓｅら、Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．、９２巻、２０５〜２１６頁、２０００年）。ＲＥＣＩＳＴ基準によれば、腫瘍反応は、すべての測定可能な病変又は転移部の低減又は消失を意味する。疾患は、従来の技術により≧２０ｍｍ又は医用写真若しくはＸ線、コンピュータ体軸断層撮影（ＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）又は診察（病変が表在性である場合）により明確に定義された境界を用いたスパイラルＣＴスキャンにより≧１０ｍｍと少なくとも１次元で正確に測定することができる病変を含む場合、一般的に測定可能であるとみなされる。測定不能な疾患は、従来の技術による＜２０ｍｍ又はスパイラルＣＴスキャンによる＜１０ｍｍの病変、及び実際に測定不能な病変（小さすぎて正確に測定することができない）を含む疾患を意味する。測定不能な病変は、胸水、復水及び間接的な証拠により示された疾患を含む。
客観的な状態に関する基準は、固形腫瘍反応を評価するためのプロトコールに必要である。代表的な基準は次のものを含む：（１）すべての測定可能な疾患の完全な消失；新たな病変なし；疾患に関連する症状なし；測定不能な疾患の証拠なしと定義される、著効（ＣＲ）；（２）標的病変の最長直径の合計の３０％の減少と定義される、有効（ＰＲ）；（３）標的病変の最長直径の合計の２０％の増加又は新たな病変の出現と定義される、進行性疾患（ＰＤ）；（４）ＣＲ、ＰＲ又は進行性疾患について適格でないと定義される、安定又は無効（Ｔｈｅｒａｓｓｅら、前出を参照）。
腫瘍学の分野内で受け入れられているさらなるエンドポイントには、全生存期間（ｏｖｅｒａｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ）（ＯＳ）、無疾患生存期間（ＤＦＳ）、客観的奏功率（ＯＲＲ）、進行までの期間（ＴＴＰ）及び無進行生存期間（ＰＦＳ）などである（Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ： Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ Ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｐｐｒｏｖａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、２００５年４月、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＦＤＡ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤを参照）。
３．併用癌療法
前述のように、特定の実施形態において、ＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを、血管新生障害の治療のために第２の薬剤と併用する。癌を治療するために用いる場合、本発明のアンタゴニストは、例えば、手術、放射線療法、化学療法又はその組合せなどの従来の癌療法と併用することができる。特定の態様において、ＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストとの併用癌療法に有用な他の治療薬は、他の抗血管新生薬を含む。いくつかの他の態様において、ＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストとの併用癌療法に有用な他の治療薬は、例えば、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（Ｈｅｒ２）、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４又はＴＮＦなどの腫瘍の成長に関与する他の因子のアンタゴニストを含む。いくつかの態様において、ＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストをサイトカイン（例えば、腫瘍に対する免疫反応を刺激するサイトカイン）と併用投与する。癌の治療に特に適用できる例示的な併用療法を下でさらに詳細に述べる。
ａ．ＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストと併用される腫瘍関連抗原を標的とする抗体
特定の腫瘍は、特有の抗原、系統特異的抗原又は正常細胞と比較して過剰な量で存在する抗原を提示するので、抗体療法は、癌治療において特に成功を収めている。モノクローナル抗体の抗腫瘍活性に関連するメカニズムの１つは、抗体依存性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）（ＡＤＣＣ）である。ＡＤＣＣにおいて、モノクローナル抗体は、標的細胞（例えば、癌細胞）に結合し、モノクローナル抗体に対する受容体を発現する特異的なエフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞、単球、顆粒球）は、モノクローナル抗体／標的細胞複合体に結合し、標的細胞死をもたらす。本発明の特定の変形形態において、ＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを腫瘍関連抗原に対するモノクローナル抗体と併用投与する。ＭＡｂの用量及びスケジュールは、特異抗体併用投与に帰せられる薬物動態及び毒物動態の特性に基づくものであり、ＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの投与に関連する可能性がある毒性を最小限にすると同時に、これらの効果を最適化すべきである。
ＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストと腫瘍関連抗原に対するモノクローナル抗体による併用療法は、第１選択の治療が無効であった場合に指示することができ、第２選択の治療とみなすことができる。本発明は、新たに診断され、抗癌剤の投与を以前に受けなかった患者集団（「新規患者」）及びモノクローナル抗体療法を以前に受けなかった患者（「無処置患者」）における第１選択の治療として併用することも提供する。
ＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、腫瘍細胞の直接的な抗体媒介性ＡＤＣＣの非存在下での腫瘍関連抗原に対するモノクローナル抗体との併用療法にも有用である。例えば、免疫系における阻害性シグナルを遮断する抗体は、免疫反応の増強をもたらし得る。例としては、（１）細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ−４）、プログラム死１（ＰＤ−１）、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）などの阻害機能を有するＢ７Ｒファミリーの分子に対する抗体；（２）ＩＬ−１０、ＴＧＦβのような阻害性サイトカインに対する抗体；並びに（３）抗ＣＤ２５又はＣＴＬＡ−４のような抑制性細胞の機能を枯渇又は阻害する抗体がある。例えば、マウス及びヒトにおける抗ＣＴＬＡ４ ＭＡｂは、免疫抑制性調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の機能を抑制するか、或いはＡＰＣ上又は腫瘍細胞上のＢ７−１又はＢ７−２分子へのＴ細胞上のＣＴＬＡ−４の結合により伝達される阻害性シグナルを阻害すると考えられる。
表８は、ＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストとの併用療法が可能であることについて承認済み又は試験中のモノクローナル抗体の非独占的なリストである。
ｂ．ＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストと併用するチロシンキナーゼ阻害剤
いくつかの実施形態において、本明細書で述べるＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストをチロシンキナーゼ阻害剤と併用する。チロシンキナーゼは、標的タンパク質へのアデノシン三リン酸からのγリン酸基の転移を触媒する酵素である。チロシンキナーゼは、受容体及び非受容体タンパク質チロシンキナーゼとして分類することができる。それらは、成長受容体による活性化を含む種々の正常な細胞過程における不可欠の役割を果たしており、種々の細胞型の増殖、生存及び成長に影響を及ぼす。さらに、それらは、腫瘍細胞の増殖を促進し、抗アポトーシス作用を誘導し、血管新生及び転移を促進すると考えられる。成長因子による活性化に加えて、体細胞突然変異によるプロテインキナーゼの活性化が腫瘍形成の一般的メカニズムである。同定された突然変異の一部は、Ｂ−Ｒａｆキナーゼ、ＦＬｔ３キナーゼ、ＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼ、ｃ−ＫＩＴキナーゼ、表皮成長因子（ＥＧＦＲ）及びＰＤＧＦＲ経路に存在する。Ｈｅｒ２、ＶＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔは、癌の進行及び腫瘍形成に関連づけられる他の重要な受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）経路である。多数の細胞過程がチロシンキナーゼにより開始されるので、それらは、阻害剤の重要な標的として同定された。
チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）は、細胞内で作用する小分子であり、受容体及び非受容体チロシンキナーゼ両方の触媒チロシンキナーゼドメインへの結合についてアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）と競合する。この競合的結合は、成長、生存及び血管新生のようなこれらのシグナル伝達事象に関連するエフェクター機能をもたらす下流シグナル伝達の開始を阻害する。構造及び計算アプローチを用いて、チロシンキナーゼを阻害する、多くの医化学コンビナトリアルライブラリーからの多くの化合物が同定された。
ほとんどのＴＫＩは、腫瘍細胞の直接的な阻害により、又は血管新生の阻害により、腫瘍の成長を阻害すると考えられる。さらに、ソラフェニブ及びスニチニブを含む、特定のＴＫＩは、ＶＥＧＦファミリー受容体を介してシグナル伝達に影響を及ぼす。いくつかの場合に、ＴＫＩは、樹状細胞及びＮＫ細胞のような他の自然免疫細胞の機能を活性化することが示された。これは、最近イマチニブについて動物モデルにおいて報告された。イマチニブは、樹状細胞及びＮＫ細胞によるキラー活性を増大させることが示されたＴＫＩである（総説については、Ｓｍｙｔｈら、ＮＥＪＭ、３５４巻、２２８２頁、２００６年を参照）。
ＢＡＹ４３−９００６（ソラフェニブ、Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標））及びＳＵ１１２４８（スニチニブ、Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標））は、転移性腎細胞癌（ＲＣＣ）における使用について最近承認された２つのそのようなＴＫＩである。多くの他のＴＫＩが、種々のタイプの癌の治療用の後期及び初期の開発段階にある。他のＴＫＩには、イマチニブメシラート（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；エルロチニブヒドロクロリド（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；バンデタニブ（Ｚａｃｔｉｍａ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；チピファルニブ（Ｚｅｒｎｅｓｔｒａ（登録商標）、Ｊａｎｓｓｅｎ−Ｃｉｌａｇ）；ダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）：ロナファルニブ（Ｓａｒａｓａｒ（登録商標）、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ）；バタラニブスクシナート（Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ）；ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標）、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）；ニロチニブ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；レスタウルチニブ（Ｃｅｐｈａｌｏｎ）； パゾパニブヒドロクロリド（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）；アキシチニブ（Ｐｆｉｚｅｒ）；カネルチニブジヒドロクロリド（Ｐｆｉｚｅｒ）；ペリチニブ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｗｙｅｔｈ）；タンデュチニブ（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ）；ボスチニブ（Ｗｙｅｔｈ）；セマキサニブ（Ｓｕｇｅｎ、Ｔａｉｈｏ）；ＡＺＤ−２１７１（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＶＸ−６８０（Ｍｅｒｃｋ、Ｖｅｒｔｅｘ）、ＥＸＥＬ−０９９９（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）；ＡＲＲＹ−１４２８８６（Ａｒｒａｙ ＢｉｏＰｈａｒｍａ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＰＤ−０３２５９０１（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＡＭＧ−７０６（Ａｍｇｅｎ）；ＢＩＢＦ−１１２０（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＩｎｇｅｌｈｅｉｍ）；ＳＵ−６６６８（Ｔａｉｈｏ）；ＣＰ−５４７６３２（ＯＳＩ）；ＡＥＥ−７８８（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＢＭＳ−５８２６６４（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）；ＪＮＫ−４０１（Ｃｅｌｇｅｎｅ）；Ｒ−７８８（Ｒｉｇｅｌ）；ＡＺＤ−１１５２ ＨＱＰＡ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＮＭ−３（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）；ＣＰ−８６８５９６（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＢＭＳ−５９９６２６（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）；ＰＴＣ−２９９（ＰＴＣ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）；ＡＢＴ−８６９（Ａｂｂｏｔｔ）；ＥＸＥＬ−２８８０（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）；ＡＧ−０２４３２２（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＸＬ−８２０（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）；ＯＳＩ−９３０（ＯＳＩ）；ＸＬ−１８４（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）；ＫＲＮ−９５１（Ｋｉｒｉｎ Ｂｒｅｗｅｒｙ）；ＣＰ−７２４７１４（ＯＳＩ）；Ｅ−７０８０（Ｅｉｓａｉ）；ＨＫＩ−２７２（Ｗｙｅｔｈ）；ＣＨＩＲ−２５８（Ｃｈｉｒｏｎ）；ＺＫ−３０４７０９（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ）；ＥＸＥＬ−７６４７（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）；ＢＡＹ−５７−９３５２（Ｂａｙｅｒ）；ＢＩＢＷ−２９９２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）；ＡＶ−４１２（ＡＶＥＯ）；ＹＮ−９６８ＤＩ（Ａｄｖｅｎｃｈｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）；ミドスタウリン（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ペリホシン（ＡＥｔｅｒｎａ Ｚｅｎｔａｒｉｓ、Ｋｅｒｙｘ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；ＡＧ−０２４３２２（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＡＺＤ−１１５２（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＯＮ−０１９１０Ｎａ（Ｏｎｃｏｎｏｖａ）；及びＡＺＤ−０５３０（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）があるが、これらに限定されない。
ｃ．化学療法の併用
特定の実施形態において、ＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを１つ又は複数の化学療法薬と併用投与する。化学療法薬は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡに影響を及ぼし、細胞周期の反復を妨害することにより、異なる作用機序を有する。ＤＮＡレベル又はＲＮＡレベルで作用する化学療法薬の例は、代謝アンタゴニスト（アザチオプリン、シタラビン、フルダラビンリン酸、フルダラビン、ゲムシタビン、シタラビン、クラドリビン、カペシタビン６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル及びヒロキシ尿素など）；アルキル化剤（メルファラン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、イホスファミド、ダカラバジン、プロカルバジン、クロラムブシル、チオテパ、ロムスチン、テモゾラミドなど）；抗有糸分裂薬（ビノレルビン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ドセタキセル、パクリタキセルなど）；トポイソメラーゼ阻害薬（ドキソルビシン、アムサクリン、イリノテカン、ダウノルビシン、エピルビシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、イダルビシン、テニポシド、エトポシド、トポテカンなど）；抗生物質（アクチノマイシン及びブレオマイシンなど）；アスパラギナーゼ；アントラサイクリン又はタキサンである。
ｄ．放射線療法の併用
いくつかの変形形態において、ＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを放射線療法と併用して投与する。特定の腫瘍は、放射線又は放射性薬品により治療することができる。放射線療法は、一般的に切除不能若しくは手術不能の腫瘍及び／又は腫瘍転移を治療するのに用いられる。放射線療法は、一般的に３つの方法で提供する。外部放射線照射は、身体から一定の距離で適用するものであり、ガンマ線（６０Ｃｏ）及びＸ線を含む。近接照射療法は、標的組織内又はそれと接触した線源、例えば、６０Ｃｏ、１３７Ｃｓ、１９２Ｉｒ又は１２５Ｉを用いるものである。
ｅ．ホルモン剤の併用
いくつかの実施形態において、ＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストをホルモン又は抗ホルモンと併用して投与する。特定の癌は、ホルモン依存性を伴うものであり、例えば、卵巣癌、乳癌及び前立腺癌を含む。ホルモン依存性癌治療は、抗アンドロゲン又は抗エストロゲン化合物の使用を含み得る。癌の治療に用いられるホルモン及び抗ホルモンは、リン酸エストラムスチン、リン酸ポリエストラジオール、エストラジオール、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、タモキシフェン、酢酸メゲストロール、酢酸メドロキシプロゲステロン、オクトレオチド、酢酸シプロテロン、ビカルツミド、フルタミド、トリトレリン、ロイプロレリン、ブセレリン及びゴセレリンなどである。
Ｃ．血管新生眼障害
いくつかの眼障害は、血管新生の変化を伴い、本発明による治療に敏感に反応する。そのような血管新生眼障害には、例えば、加齢性黄班変性（例えば、「湿性」加齢性黄班変性）、糖尿病性網膜症、虹彩新生血管形成、血管新生緑内障、増殖性硝子体網膜症、視神経乳頭新生血管形成、角膜新生血管形成、硝子体新生血管形成、パンヌス、翼状片、黄班浮腫、糖尿病性黄班浮腫、血管網膜症、網膜変性、ブドウ膜炎及び網膜の炎症性疾患がある。
例えば、糖尿病性網膜症は、成人失明の第３位の主要な原因（米国における失明のほぼ７％を占める）であり、広範な血管新生事象に関連する。非増殖性網膜症は、網膜内の周皮細胞の選択的喪失を伴い、それらの喪失は、関連毛細血管の拡張及び血流の結果としての増加をもたらす。拡張した毛細血管において、内皮細胞は、増殖し、嚢状突出部を形成し、これが微小動脈瘤になり、隣接毛細管は閉塞した状態になり、そのため、これらの微小動脈瘤の周囲の網膜の領域は潅流されない。最終的に、微小動脈瘤の隣接領域の間に短絡血管が出現し、微小動脈瘤及び非潅流網膜の領域を有する初期の糖尿病性網膜症の臨床像が認められる。微小動脈瘤は漏出し、毛細血管は出血することがあり、滲出物及び出血がもたらされる。バックグラウンド糖尿病性網膜症の初期段階が成立したならば、状態は数年間にわたって進行し、増殖性糖尿病性網膜症及び症例の約５％における失明へと進行する。増殖性糖尿病性網膜症は、網膜の一部の領域がそれらの毛細血管を喪失し続け、非潅流網膜の状態になり、視神経乳頭上及び網膜の他所に新たな血管の出現につながる。これらの新たな血管は、硝子体内に成長し、容易に出血し、網膜前出血につながる。進行した糖尿病性網膜症において、大量の硝子体出血が硝子体腔の大部分を満たすことがある。さらに、新たな血管は、牽引網膜はく離につながることがある線維組織増殖を伴う。
糖尿病性網膜症は、主として糖尿病の持続期間に関連する。したがって、集団が加齢し、糖尿病患者がより長期間生存するとき、糖尿病性網膜症の罹患率は増加する。レーザー療法が現在非増殖性及び増殖性糖尿病性網膜症の両方に現在用いられている。黄班部の周囲の漏出性微小動脈瘤の局所レーザー治療は、臨床的に有意な黄班浮腫を有する患者の５０％における視力障害を減少させる。増殖性糖尿病性網膜症において、汎網膜光凝固は、網膜全体（黄班部は残る）に散在する数千の小熱傷をもたらすものである。この療法は、失明率を６０％減少させる。黄班浮腫及び増殖性糖尿病性網膜症の早期の治療により、患者の９５％における失明を５年間防止できるが、後期の治療では５０％における失明がに防止できるにすぎない。したがって、早期の診断と治療が必須である。
新生血管形成を伴う他の眼障害は、６５歳以上のアメリカ人１０人につき約１人に罹患する疾患である、加齢性黄班変性（ＡＭＤ）である。ＡＭＤは、網膜の中心部である黄班の一連の病的変化によって特徴付けられ、特に中心視力に影響する視力の低下を伴う。ＡＭＤには、感覚網膜のすぐ下にある網膜色素上皮と呼ばれる細胞の単層が関与する。これらの細胞は、それらと接触する網膜の部分、すなわち、視色素を含む光受容細胞に栄養を与え、支持している。網膜色素上皮は、ＡＭＤにおいて厚くなり、硬化する基底膜複合板であるブルッフ膜の上にある。新たな血管は、豊富な血管床を含む基礎をなす脈絡膜からのブルッフ膜を通り抜けることがある。これらの血管は、次に網膜色素上皮の下に、また網膜色素上皮と感覚網膜の間にも液を漏出又は出血することがある。その後の線維性瘢痕化が光受容細胞への栄養供給を中断させ、それらの死をもたらし、中心視力の喪失をもたらす。このタイプの加齢性黄班症は、漏出性血管及び網膜下浮腫又は血液のため「湿性」タイプと呼ばれている。湿性タイプは、加齢性黄班症の症例の１０％を占めているにすぎないが、高齢者における黄班変性による法定失明の９０％の症例を生じさせる。「乾性」タイプの加齢性黄班変性は、網膜色素上皮の崩壊並びに上にある光受容細胞の喪失を伴う。乾性タイプは、視力を低下させるが、通常２０／５０〜２０／１００のレベルまでである。
ＡＭＤは、中心視のゆがみを伴い、物体がより大きく若しくはより小さく見え、又は直線がゆがみ、曲がり、若しくは中心部分が欠けて見える。乾性タイプのＡＭＤにおいて、感覚網膜のわずかな剥離が黄班部に認められることがあるが、網膜下血管新生膜の確定診断にはフルオレセイン血管造影が必要である。乾性タイプにおいて、ドルーゼンが黄班部における色素沈着パターンを乱すことがある。ドルーゼンは、細胞内に突出し、それらを前方に突出させる、網膜色素上皮の基底膜の増殖物であり、加齢性黄班変性におけるリスクファクターとしてのそれらの役割は不明である。乾性タイプの加齢性黄班症については、治療法は現在のところ存在しない。湿性タイプの加齢性黄班症の従来の療法は、最初に血管新生膜を除去し、１８カ月目に患者の約５０％における失明をさらに予防するレーザー治療を含む。しかし、６０カ月目までに２０％が実質的に利益を有するにすぎない。
血管新生眼障害の治療における医薬の使用のために、ＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを一般的に従来の方法により硝子体内注射用に製剤化する。一般的に、医薬製剤は、生理食塩水、緩衝食塩水、水中５％デキストロースなどの薬学的に許容される賦形剤と混合したアンタゴニスト（単数又は複数）を含む。眼への使用に関する変形形態において、ＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−ＡアンタゴニストをｐＨ５〜７のリン酸緩衝生理食塩水に入れて製剤化する。
血管新生眼障害の抑制は、血管新生が遅くなるか又は減少するかを測定する受け入れられている方法により評価する。これは、直接的な観察及び主観的症状又は客観的な生理学的指標を評価することなどによる間接的な評価を含む。
例えば、治療有効性は、新生血管形成、微小血管障害、血管漏出又は血管浮腫、或いはそれらのいずれかの組合せの予防又は反転に基づいて評価することができる。眼血管新生障害の抑制を評価するための治療有効性は、視力の安定化又は改善により定義することもできる。
血管新生眼障害の治療又は予防における個々の療法の有効性を判断するに際して、眼科医が患者を注射の数日後及び次回の注射の直前の少なくとも１カ月後に臨床的に評価してもよい。ＥＴＤＲＳ視力、コダクロム（ｋｏｄａｃｈｒｏｍｅ）写真撮影及びフルオレセイン血管造影も眼科医によって要求されるように最初の４カ月間に月１回行う。
例えば、眼新生血管形成を治療するためのＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニスト療法の有効性を評価するために、眼科学の技術分野において周知の標準的方法により、加齢性黄班変性に二次的な窩下脈絡膜新生血管形成に罹患した患者におけるＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの単回又は反復硝子体内注射の適用を含む試験を実施することができる。１つの例示的な試験において、加齢性黄班変性（ＡＭＤ）に二次的な窩下脈絡膜新生血管形成（ＣＮＶ）を有する患者にＰＤＧＦＲβ及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの単回硝子体内注射を行う。治療の有効性は、例えば、眼の評価によりモニターする。治療後３カ月目の安定又は改善した視力を示す、例えば、ＥＴＤＲＳチャート上の視力の３ライン以上の改善を示す患者は、眼血管新生障害を抑制する有効な用量のＰＤＧＦＲβアンタゴニスト及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの投与を受けたと解釈される。
本発明を以下の非限定的な実施例によりさらに説明する。
（実施例１）
ＶＥＧＦ−Ａに結合する抗体のパニング
ＶＥＧＦ−Ａに結合する抗体を、Ｄｙａｘ Ｆａｂ３１０ファージライブラリー（Ｄｙａｘ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）をスクリーニングすることによって同定した。ファージ−抗体ライブラリーの選択及びスクリーニングで選択した方法は、抗原（ＶＥＧＦ−Ａ１６５、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）でコートされたポリスチレンイムノチューブ（ＮＵＮＣ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を利用した。抗体は、数ラウンドの選択後ストリンジェンシーを増加させることによって単離した。最初の抗体の作製はＦａｂの形であった。可溶性Ｆａｂ抗体を、ＭｌｕＩ（＃Ｒ０１９８Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）酵素消化により遺伝子ＩＩＩスタンプをＭ１３ファージから除去することによって作製した。選択、スクリーニング、及び可溶化の同じ戦略を、ｓｃＦｖの形の抗体に適用した。
（実施例２）
ＶＥＧＦ−Ａ結合Ｆａｂクローンの同定
ＶＥＧＦ−Ａに結合するＦａｂクローンを、プレートベースの結合アッセイによって同定した。Ｃｏｓｔａｒ（＃９０１８）９６ウェルプレートを、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６中０．６μｇ／ｍｌのＶＥＧＦ−Ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）又はＰＤＧＦ−Ｄ（配列番号４８１）ホモ二量体５０μｌで、４℃で一晩コートした。翌日、プレートを０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した。各ウェルを、ブロッキングのために１００μｌの２％ミルク（＃１７０−６４０４、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）／ＰＢＳＴで１時間室温で満たした。アッセイプレートを、次いでＰＢＳＴで３回洗浄した。各ウェルを２５μｌの２％ミルク／ＰＢＳＴで満たし、その後２５μｌのＦａｂ上清を添加した。次いでウェルを混合し、１時間室温でインキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。Ｆａｂ検出のために、５０μｌの２％ミルク／ＰＢＳＴ中（１：４０００）抗ヒトＦａｂ特異的ｐＡｂ−ＨＲＰ（＃３１４８２、Ｐｉｅｒｃｅ）を、各ウェルに１時間室温で添加した。次いでプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。５０μｌのＴＭＢ（ＴＭＢＷ−１０００−０１、ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を各ウェルに添加して１５分間発色させ、その後５０μｌの停止緩衝液（ＳＴＰＲ−１０００−０１、ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加して反応をクエンチした。次いでプレートリーダーでプレートを４５０ｎｍで読み取った。
（実施例３）
ＶＥＧＦ−Ａ結合ｓＦａｂのｓｃＦｖへの変換
ラムダ、カッパ、及び重鎖可変領域を、第２ラウンドのプール、アームＡ及びアームＢ ＶＥＧＦ−ＡパニングＦａｂ ＤｙａｘファージＤＮＡから、各サブタイプのフレームワーク配列に対するプライマーを使用して３工程の工程で増幅した。第１ラウンドのＰＣＲは、それぞれの可変フレームワーク領域を増幅し、適切なオーバーハングを付加して第２ラウンドＰＣＲ反応を容易にする。第２ラウンドＰＣＲ反応は、適切なｇｌｙ／ｓｅｒリンカー配列を適当な第１ラウンドＰＣＲ産物の末端に付加し、第３ラウンドＰＣＲ反応は、可変軽鎖ラムダ産物、可変軽鎖カッパ産物、及び可変重鎖産物をオーバーラップさせてＬＨ及びＨＬの両方向にｓｃＦｖ産物を生成し、次いでこれをＡｐａＬＩ／ＮｏｔＩで消化したＰＩＭＤ２１ファージディスプレイベクター中にクローニングした。
（実施例４）
ＶＥＧＦのｓＶＥＧＦＲ２への結合を阻害するｓＦａｂ及びｓｃＦｖの同定
ＶＥＧＦ−Ａ Ｆａｂ及びｓｃＦｖクローンを、プレートベースの中和アッセイによってスクリーニングした。Ｃｏｓｔａｒ（＃９０１８）９６ウェルプレートを、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６中１μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的抗体（＃１０９−００５−０９８、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）１００μｌで、４℃で一晩コートした。翌日、プレートを４００μｌの０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した。各ウェルを、ブロッキングのために１００μｌの１％ＢＳＡ（＃Ａ３０５９−１００Ｇ、ＳＩＧＭＡ）／ＰＢＳＴで１時間室温（ＲＴ）で満たした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ中０．２μｇ／ｍｌのＶＥＧＦＲ２−Ｆｃ（配列番号４８２）１００μｌを、各ウェルに１時間室温で添加した。同時に、別個の９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ３３５７）において、６５μｌのＦａｂ又はｓｃＦｖ上清を、２０ｎｇ／ｍｌの１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ中ビオチン化ＶＥＧＦ−Ａ ６５μｌに１時間室温で添加した。ブロックされたアッセイプレートを、ＰＢＳＴで３回洗浄した。各ウェルを、１００μｌの上清／ビオチン化ＶＥＧＦ−Ａ複合体で１時間室温で満たした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。１００μｌの１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ中（１：４０００）ストレプトアビジン−ＨＲＰ（＃２１１２４、Ｐｉｅｒｃｅ）を、各ウェルに１時間室温で添加した。次いでプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。１００μｌのＴＭＢ（ＴＭＢＷ−１０００−０１、ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を各ウェルに添加して２０分間発色させ、その後１００μｌの停止緩衝液（ＳＴＰＲ−１０００−０１、ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加して反応をクエンチした。次いでプレートリーダーでプレートを４５０ｎｍで読み取った。
（実施例５）
表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）によるヒトＶＥＧＦ受容体−２のヒトＶＥＧＦ−Ａに対する結合親和性の測定
親和性の決定
ＶＥＧＦ受容体−２（ＶＥＧＦＲ−２）とＶＥＧＦ−Ａとの相互作用について、表面プラズモン共鳴によって動態速度定数及び平衡解離定数を測定した。表面プラズモン共鳴は、生体分子相互作用中の結合及び解離相の両方のモニタリングを可能にする（Ｏｈｌｓｏｎ、Ｊ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ、１９９７年）。結合速度定数（ｋａ（Ｍ−１ｓ−１））は、抗原−アンタゴニスト複合体形成の速度を表す値である。解離速度定数（ｋｄ（ｓ−１））は、この複合体の安定性を表す値である。結合速度定数を解離速度定数で割る（ｋａ／ｋｄ）ことによって、平衡結合定数（ＫＡ（Ｍ−１））が得られる。解離速度定数を結合速度定数（ｋｄ／ｋａ）で割ることによって、平衡解離定数（ＫＤ（Ｍ））が得られる。この値は相互作用の結合親和性を示す。同じＫＤを有する相互作用は、広く様々な結合及び解離速度定数を有する可能性がある。したがって、ｋａ及びｋｄの両方を測定することは、より正確に相互作用の親和性を説明するのに役立つ。
材料及び方法
ＶＥＧＦＲ−２とＶＥＧＦ−Ａとの相互作用の結合親和性を測定するために、一連の実験を完了した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（商標）システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用した表面プラズモン共鳴アッセイを使用して、結合動態及び親和性の測定値を得た。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（商標）Ｃｏｎｔｒｏｌソフトウェア、ｖ１．１．１を使用して方法をプログラムした。ヒトＶＥＧＦ−Ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、アミンカップリング化学反応（ＥＤＣ：ＮＨＳ）を使用して約２００ＲＵの密度までＣＭ５センサーチップ上に共有結合で固定化した。固定化後、フローセル上に残存する活性部位を、エタノールアミンでブロックした。非特異的結合タンパク質を、５０ｍＭ ＮａＯＨでの洗浄によって除去した。参照フローセルを活性化し、次いでエタノールアミンでブロックした。
２００ｎＭ〜３．１３ｎＭの範囲のヒトＶＥＧＦＲ−２−Ｆｃ５の連続１：２希釈溶液を表面に注入し、センサーチップ上に固定化されたＶＥＧＦ−Ａに特異的に結合させた。ＶＥＧＦＲ−２−Ｆｃ５の各濃度の注入は、１０分の結合時間及び１５分の解離時間で行った。３０μｌ／分の流速で動的結合試験を行った。すべての結合実験を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ ０．０５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、ｐＨ７．４の緩衝液中で２５℃で行った。機器のノイズ及びドリフトの差し引きを考慮して、緩衝液注入も行った。サイクルの間に、フローセルを１０ｍＭ グリシン、ｐＨ１．５で洗浄して表面を再生した。ベースライン安定性を評価して、再生ステップが一連の注入の全体にわたって一定の結合表面をもたらすことを確認した。
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン１．１．１）を使用してデータをコンパイルした。参照フローセル及びブランク注入を差し引くことによってデータを処理し、ベースライン安定性を評価して、再生ステップが一連の注入の全体にわたって一定の結合表面をもたらすことを確認した。２連の注入の曲線を、再現性について検査した。ＶＥＧＦＲ−２−Ｆｃ５及びＶＥＧＦ−Ａは両方とも二量体分子であるため、二価アナライトモデルが最も適切であると決定し、得られた結合曲線を全体にわたってこのモデルに適合させた。
結果
ＶＥＧＦＲ−２を、ＶＥＧＦ−Ａに対するその結合親和性について特徴付けた（結果を表９にまとめた）。結合速度定数（ｋａ（Ｍ−１ｓ−１））及び解離速度定数（ｋｄ（ｓ−１））を測定した。データは、二価相互作用モデルによく適合した。このモデルは、ｋａ（ｋａ１及びｋａ２）及びｋｄ（Ｋｄ１及びｋｄ２）両方について２つの値を測定する。第１の組の値（ｋａ１及びｋｄ１）は、表９において報告されている相互作用の一価の動態を表す。これらの試料について報告されている親和性はこれらの値に由来し、ＫＤ１と称される。ＫＤ及びＫＡは、ｋａ及びｋｄ値から計算した。これらのアッセイ条件下で、ＶＥＧＦ−Ａ／ＶＥＧＦＲ−２相互作用についての平衡解離速度定数は約１．Ｅ−８Ｍであった。
（実施例６）
表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）によるヒトＶＥＧＦ−ＡアンタゴニストのヒトＶＥＧＦ−Ａとの相互作用の解離速度定数の測定
ヒトＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを、ヒトＶＥＧＦ−Ａに対する結合親和性について、表面プラズモン共鳴を使用してそれらの解離速度定数に従って評価した。解離速度定数を、ＶＥＧＦ−ＡアンタゴニストのＶＥＧＦ−Ａとの相互作用について表面プラズモン共鳴によって測定した。解離速度定数（ｋｄ（ｓ−１））は、この複合体の安定性を表す値である。この値は濃度とは無関係であり、したがって未知の濃度の試料のスクリーニング及びランク付けに適している。
材料及び方法
ＶＥＧＦ−ＡアンタゴニストのＶＥＧＦ−Ａに対する結合親和性を測定するために、一連の実験を完了した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ−１００（商標）システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）において結合動態及び親和性の試験を行った。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（商標）Ｃｏｎｔｒｏｌソフトウェア、ｖ１．１．１を使用して方法をプログラムした。ヒトＶＥＧＦ−Ａを、アミンカップリング化学反応（ＥＤＣ：ＮＨＳ）を使用して約２００ＲＵの密度までＣＭ５センサーチップ上に共有結合で固定化した。ＶＥＧＦ−Ａは、活性なフローセルに対してのみ固定化した。固定化手順の後、フローセル上に残存する活性部位をエタノールアミンでブロックした。非特異的結合タンパク質を、５０ｍＭ ＮａＯＨでの洗浄によって除去した。参照セルを活性化し、次いでエタノールアミンでブロックした。
ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニスト上清（Ｄｙａｘファージライブラリースクリーニングから選択された）をランニング緩衝液中で１：３希釈し、表面に注入し、センサーチップにおいて５分の結合時間及び５分の解離時間でＶＥＧＦ−Ａに特異的に結合させた。１００ｎＭのＶＥＧＦＲ−２−Ｆｃ５及び１００ｎＭの抗ＶＥＧＦ−Ａモノクローナル抗体（Ａｖａｓｔｉｎ（商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）の２連の注入を、陽性対照として使用した。３０μｌ／分の流速を使用して動的結合試験を行った。すべての結合実験を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ ０．０５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４のランニング緩衝液中で２５℃で行った。機器のノイズ及びドリフトの差し引きを考慮して、緩衝液注入も行った。サイクルの間に、フローセルを１０ｍＭ グリシン、ｐＨ１．５で洗浄して表面から結合ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを除去した。
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン１．１．１）を使用してデータをコンパイルした。参照フローセル及びブランク注入を差し引くことによってデータを処理した。ベースライン安定性を評価して、再生ステップが一連の注入の全体にわたって一定の結合表面をもたらすことを確認した。ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの出発濃度は未知であるため、得られた結合曲線を全体にわたって１：１解離結合モデルに適合させて解離速度定数（ｋｄ（ｓ−１））を計算した。
結果
ヒトＶＥＧＦ−Ａに対するＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの解離速度解析を決定した。得られた結合曲線は、１：１解離モデルによく適合した。ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの出発濃度は未知であり、したがって、ｋｄは濃度と無関係であるため解離速度定数（ｋｄ（ｓ−１））のみを報告した。計算した解離速度定数を、最も遅いものから最も速いものまでランク付けした。これらのアッセイ条件下で、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、ＶＥＧＦ−Ａに対する相互作用について広範囲の解離速度定数（１．Ｅ−５〜２．Ｅ−２（ｓ−１））を示す（表１０を参照）。比較のために、ＶＥＧＦＲ−２−Ｆｃ５−ＶＥＧＦ−Ａ相互作用のｋｄは約２．Ｅ−４ｓ−１であり、抗ＶＥＧＦ−Ａモノクローナル抗体Ａｖａｓｔｉｎ（商標）Ｆａｂ−ＶＥＧＦ−Ａ相互作用は約８．Ｅ−５ｓ−１であった。
（実施例７）
Ｅ．ｃｏｌｉペリプラズム画分由来タンパク質の精製
ｓｃＦｖ、タンデムｓｃＦｖ、及びｓＦａｂタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞のペリプラズム空間において発現させた。発酵の規模は、２５ｍＬ振とうフラスコ培養から２Ｌ回分供給系の範囲にわたっていた。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を遠心分離機を使用してスピンダウンし、ペレットにした。湿った細胞ペレットを、ペリプラスティング緩衝液［０．２Ｍ Ｔｒｉｓ、２０％（ｗ／ｖ）スクロース、完全ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）ｐＨ７．５］中に湿細胞重量１グラム当たり２ｍＬの比率で完全に再懸濁した。細胞壁の分解を容易にする酵素であるリゾチームは、手順に含まれていてもよく、又は含まれていなくてもよい。リゾチームを使用するかどうかを決定するために、５００μＬの再懸濁したペレットをエッペンドルフチューブに移し、使用したペリプラスティング緩衝液１μＬ当たり３０ＵのＲｅａｄｙ−Ｌｙｓｅリゾチーム（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を添加し、懸濁液を室温で５分間インキュベートした。インキュベーション後、反転することによって溶液を粘性増加について検査した。溶液がチューブの壁に粘着すれば、早すぎる細胞溶解が起こっている可能性があり、リゾチームは調製溶液中に含めない。溶液がチューブの壁に粘着しなければ、リゾチームを調製溶液中に含める。リゾチームを使用する場合、使用したペリプラスティング緩衝液１μＬ当たり３０ＵのＲｅａｄｙ−Ｌｙｓｅリゾチーム（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を添加し、懸濁液を室温で４〜６分間インキュベートした。もとの湿った細胞ペレット重量１グラム当たり３ｍＬの比率で氷冷水を加え、溶液を少なくとも１０分以上３０分未満の間インキュベートした。残りのスフェロプラストを、室温で少なくとも１５分以上４５分未満の１５０００×ｇ（又は１００００〜２００００ＲＰＭ、いずれか速い方）での遠心分離によってペレット化した。ペリプラズム画分を含有する上清を新しい容器に注ぎ、量り分けた固体を使用して２５ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ ＮａＣｌに調整した。この溶液を、ボトルトップフィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ）を使用して精製前に０．２２μｍフィルターでろ過した。
固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）捕捉
伝統的に、ＩＭＡＣステップのために５ｍＬ ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したが、カラムサイズは分析ＩＭＡＣ−ＳＥＣアッセイによって決定されたペリプラズム画分中のｓｃＦｖ標的の量に応じて拡大又は縮小することができる。このＩＭＡＣ樹脂の結合能は、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ充填床であることが示されている。サイズが１０ｍＬより大きいカラムを使用する場合、内径２及び５ｃｍのＷａｔｅｒｓ Ｇｌａｓｓ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）が好ましかった。適切なクロマトグラフィーステーション（ＵＮＩＣＯＲＮソフトウェア４．１以降［ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ］又はＢｉｏＣＡＤ Ｓｐｒｉｎｔ，７００Ｅを使用したＡｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ、又はＰｅｒｆｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙソフトウェアバージョン３．００以降［Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ］を使用したＶｉｓｉｏｎ）を使用して、ＩＭＡＣカラムを５０ｍＭ ＮａＰＯ４、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾールｐＨ７．５において平衡化し、ペリプラズム画分を１９０ｃｍ／時間未満でなくなるまでその上にロードした。ＵＶ Ａ２５４ｎｍ及びＵＶ Ａ２８０ｎｍのモニターが１９０ｃｍ／時間を超えない流速で少なくとも２ＣＶで安定したベースラインになるまで、カラムを平衡化緩衝液で洗浄した。５０ｍＭ ＮａＰＯ４、５００ｍＭ ＮａＣｌ、４００ｍＭ イミダゾール、ｐＨ７．５を使用して、１９０ｃｍ／時間以下で結合タンパク質を競合的に溶出した。溶出画分を、Ａ２８０ｎｍのＵＶ、分析サイズ排除クロマトグラフィー、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質含量について評価した。
他のクロマトグラフィー技術
ＩＭＡＣプールの純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及び分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって評価した。ＳＥＣによるプールの最終クリーンアップが容易でない場合は、残留宿主細胞夾雑物及び凝集物から標的ｓｃＦｖタンパク質をさらに精製するために他のクロマトグラフィー技術を採用した。これらの従来技術は、陰イオン交換、陽イオン交換、及び疎水性相互作用を含んでいた。抗ｍｙｃ樹脂を介するｃ末端ｍｙｃタグの利用又は共有結合で堅いビーズに連結された適切なリガンドを使用したリガンドに基づく親和性手法を含むがこれらに限定されない、他の親和性に基づく手法もまた使用された。これらの他の技術の使用は、タンパク質毎に決定された。
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
Ａ２８０ｎｍのＵＶ及び分析ＳＥＣ法によって評価されたタンパク質の量から、使用されるゲルろ過カラムのサイズが決定された：＜１ｍｇ＝１０／３００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＧＬカラム、１〜１０ｍｇ＝１６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００、＞１０ｍｇ＝２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（すべてＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。ＩＭＡＣ溶出プールを、１０ｋＤ ＭＷＣＯ Ｕｌｔｒａｃｅｌ遠心濃縮機（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して最終濃縮量が使用されるゲルろ過カラムの３％以下となるように濃縮した。濃縮物をカラムに注入し、タンパク質を流速７６ｃｍ／時間以下及び３４ｃｍ／時間以上でアイソクラティックに溶出した。溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、適切なプールを作製した。
エンドトキシン除去
最終産物のエンドトキシンレベルに関する明細事項は、特定のクラスターの状態によって決定した。１０ｋＤ ＭＷＣＯ Ｕｌｔｒａｃｅｌ遠心濃縮機（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用したＡ２８０ｎｍのＵＶによって決定した場合、ＳＥＣプールは＞０．２５ｍｇ／ｍｌまで濃縮された。Ｍｕｓｔａｎｇ Ｅ０．２２μｍフィルター（ＰＡＬＬ）をＳＥＣ移動相緩衝液で予め湿らせ、手動のシリンジ送達システムを介して約１ｍＬ／分の流速でＳＥＣ濃縮物をこのフィルターでろ過した。最終ろ過産物を、ＰＴＳ ＥｎｄｏＳａｆｅシステム（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を使用してエンドトキシンについて、Ａ２８０ｎｍのＵＶによる濃度についてアッセイし、アリコートにして保管した。
（実施例８）
２９３／ＫＤＲ／ＫＺ１３６レポーター細胞株の樹立
分子のＶＥＧ−Ａ１６５活性を中和する能力を試験するために、ルシフェラーゼレポーター細胞株を生成した。ＶＥＧＦ−Ｒ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）を安定に発現する２９３／ＫＤＲ細胞（Ｓｉｂｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗｉｎｇｔｏｎ、ＣＴ）を、６ウェルプレートにおいて完全培地（ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１×ピルビン酸ナトリウム、１×ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中で２５００００細胞／ウェルの密度で播種し、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターにおいて３７℃で一晩接着させた。翌日、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）並びにｐＫＺ１３６（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ、Ｉｎｃ）というＳＴＡＴ−ＳＲＥ−ルシフェラーゼカセット及びネオマイシン選択マーカーを含有するプラスミドを使用して、製造業者のプロトコールを使用して、細胞をトランスフェクトした。ＶＥＧＦ−Ｒ２を介するシグナル伝達は、血清応答エレメント（ＳＲＥ）の活性化を誘導し、ルシフェラーゼの発現を媒介する。簡潔に述べると、４μｇのｐＫＺ１３６を１つのチューブ中の２５０μｌの無血清ＤＭＥＭに加え、１０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬を別のチューブ中の２５０μｌの無血清ＤＭＥＭに加えた。両方のチューブを穏やかに混合し、室温（ＲＴ）で５分インキュベートし、合わせて全量５００μｌとした。室温で２０分後、細胞から完全培地を吸引し、５００μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ／ＤＮＡ混合物をウェルに加えた。３７℃、５％ＣＯ２で５時間後、２ｍＬの完全培地を加え、細胞をインキュベーターに戻して一晩インキュベートした。翌日、培地を５００μｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇ４１８ Ｓｕｌｆａｔｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する完全培地と交換し、安定なトランスフェクタントの選択を１０〜１４日以内に行った。
２９３／ＫＤＲ／ＫＺ１３６Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ耐性細胞の樹立に続いて、個々のクローンを限界希釈法によって単離した。簡潔に述べると、いくつかの９６ウェル培養プレートを、２００μｌの完全培地において０．２５細胞／ウェルの播種密度でプレーティングした。１５〜２０日後、単一コロニーの樹立を示したウェルを単離し、ＶＥＧＦＡ−１６５に応答するルシフェラーゼ活性についてスクリーニングした。単離されたクローンを、９６ウェル白色不透明細胞培養コートプレート（Ｃｏｓｔａｒ＃３９１７）において１００００細胞／ウェルの播種密度で完全培地中に３連でプレーティングし、一晩接着させた。翌日、完全培地を真空吸引によって除去し、１００μｌの無血清培地（ＤＭＥＭ、１×ピルビン酸ナトリウム、１×ＧｌｕｔａＭａｘ、（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））と交換し、細胞を一晩血清飢餓状態にした。翌日、ＶＥＧＦ−Ａ１６５を無血清培地中０．０２６３、０．２６３、及び２．６３ｎＭの濃度で加え、３７℃で４時間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性を、製造業者のプロトコールに従ってＬｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ１５０１）及びマイクロプレートルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して測定した。最大のルシフェラーゼ活性を有するクローンを２９３／ＫＤＲ／ＫＺ１３６／ｃ２２と称し、スクリーニングアッセイに使用した。
（実施例９）
２９３／ＫＤＲ／ＫＺ１３６／ｃ２２ ＶＥＧＦＡ誘導性ＶＥＧＦ−Ｒ２リン酸化ルミネックスアッセイを使用した中和抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖの同定
ＶＥＧＦＡ活性を中和する能力について候補分子（ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）をスクリーニングするために、ＶＥＧＦ−Ｒ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）のリン酸化を測定する細胞ベースのルミネックスアッセイを行った。２９３／ＫＤＲ／ＫＺ１３６／ｃ２２細胞を、透明９６ウェル組織培養プレートにおいて１００μｌの完全培地（ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１×ピルビン酸ナトリウム、１×ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中に２００００細胞／ウェルの密度でプレーティングし、一晩接着させた。翌日、完全培地を真空吸引によって除去し、１００μｌの無血清培地（ＤＭＥＭ、１×ピルビン酸ナトリウム、１×ＧｌｕｔａＭａｘ）と交換した。細胞を一晩インキュベートした。
翌日、候補ＶＥＧＦ−Ａ中和分子（ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）、陽性対照（ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦＡモノクローナル抗体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ラニビズマブ（抗ＶＥＧＦＡ親和性成熟Ｆａｂ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、及びベバシズマブＦａｂ（自家作製）を、無血清培地において非中和剤（培地のみ）とともに１：５希釈で２００ｎＭから１２ｐＭまで連続希釈した。これらに対して、０．２６ｎＭのＶＥＧＦ−Ａ及び１００ｎＭ〜６ｐＭの中和分子又は陽性対照の最終濃度になるように、等量のＶＥＧＦ−Ａ１６５を０．５４ｎＭで加えた。これらを３７℃で６０分間インキュベートした。
インキュベーション後、培地を真空吸引によって血清飢餓細胞から除去し、１００μｌの上記複合体と交換した。細胞を３７℃で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、培地を真空吸引によって除去し、細胞を１００μｌの氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で穏やかに洗浄した。ＰＢＳを真空吸引によって除去し、細胞を、１ｍＭ ＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ−２７１４、ＤＭＳＯ中）及び完全Ｍｉｎｉ１錠／１０ｍＬ（Ｒｏｃｈｅ、１１８３６１５３００１）を含有するＮＰ−４０溶解緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号ＦＮＮ００２１）２５μｌ中で溶解した。溶解物を４℃で２０分間プラットフォームシェーカー上でインキュベートし、３０００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心分離にかけて透明な溶解物とした。溶解物を新しい９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、アッセイまで−２０℃に置いた。
ＶＥＧＦ−Ｒ２リン酸化ルミネックスアッセイのために、Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＬＨＢ０００２）及びＶＥＧＦＲ２［ｐＹ１０５９］Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｂｅａｄ Ｋｉｔ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＬＨＯ０６０１）を製造業者の使用説明書に従って使用した。溶解物を解凍し、８０μｌのＡｓｓａｙ Ｄｉｌｕｅｎｔと１：５混合した。ルミネックス真空ろ過プレートのウェルを、２００μｌのＷｏｒｋｉｎｇ Ｗａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで予め湿らせた。希釈したビーズをウェル当たり２５μｌ加え、２００μｌのＷｏｒｋｉｎｇ Ｗａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで２回洗浄した。洗浄後、５０μｌの希釈した溶解物、及び５０μｌの希釈した検出用抗体を各ウェルに加え、プレートをホイルに包み、室温（ＲＴ）で３時間プラットフォームシェーカー上で５００ｒｐｍでインキュベートした。インキュベーション後、ビーズを２００μｌのＷｏｒｋｉｎｇ Ｗａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで２回洗浄し、次いで１００μｌの希釈したＡｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ−ＲＰＥを各ウェルに加え、プレートをホイルに包み、室温で３０分間プラットフォームシェーカー上で５００ｒｐｍでインキュベートした。インキュベーション後、ビーズを２００μｌのＷｏｒｋｉｎｇ Ｗａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで３回洗浄し、１２５μｌのＷｏｒｋｉｎｇ Ｗａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ中に再懸濁した。ビーズをプラットフォームシェーカー上で３０秒間５００ｒｐｍで再懸濁し、Ｌｕｍｉｎｅｘ−１００装置（ＢｉｏＲａｄ）において読み取った。データは解析ソフトウェア（Ｓｐｏｔｆｉｒｅ）を使用して解析し、各候補及び対照についてＩＣ５０値を計算した。
ＶＥＧＦ−Ａ１６５のその受容体であるＶＥＧＦ−Ｒ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）に結合する作用は、受容体のリン酸化を誘導する。このルミネックスベースのアッセイは、全ＶＥＧＦ−Ｒ２を、抗ＶＥＧＦ−Ｒ２抗体にコンジュゲートされた蛍光標識ビーズに結合させる。［ｐＹ１０５９］でのリン酸化を検出する二次抗体を使用して、どの程度のＶＥＧＦ−Ｒ２がリン酸化されたかを検出する。受容体リン酸化の減少は、このＶＥＧＦ−Ａを介する活性化が中和されていることを示す。
（実施例１０）
ＶＥＧＦ結合ｓｃＦｖのマウスＶＥＧＦ−Ａに対する交差反応性の試験
マウスＶＥＧＦＡの活性を中和する能力について候補分子（ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）をスクリーニングするために、ＶＥＧＦ−Ｒ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）リン酸化を測定する細胞ベースのルミネックスアッセイを行った。ｍＶＥＧＦ−１６４はヒトＶＥＧＦ−Ｒ２に対して交差反応するので、ヒトＶＥＧＦ−Ｒ２ベースのレポーター系を利用することができる。２９３／ＫＤＲ／ＫＺ１３６／ｃ２２細胞を、透明９６ウェル組織培養プレートにおいて１００μｌの完全培地（ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１×ピルビン酸ナトリウム、１×ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中に２００００細胞／ウェルの密度でプレーティングし、一晩接着させた。翌日、完全培地を真空吸引によって除去し、１００μｌの無血清培地（ＤＭＥＭ、１×ピルビン酸ナトリウム、１×ＧｌｕｔａＭａｘ）と交換した。細胞を一晩インキュベートした。
翌日、候補ＶＥＧＦ−Ａ中和分子（ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）を、無血清培地中で非中和剤（培地のみ）とともに１：５希釈で２００ｎＭから１２ｐＭまで連続希釈した。ＶＥＧＦ−Ｒ２−Ｆｃを、中和の陽性対照として使用した。これらに対して、０．２６ｎＭのＶＥＧＡ及び１００ｎＭ〜６ｐＭの中和分子又は陽性対照の最終濃度になるように、等量のｍＶＥＧＦ−Ａ１６４（４９３−ＭＶ−００５、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を０．５４ｎＭで加えた。これらを３７℃で６０分間インキュベートした。
インキュベーション後、培地を真空吸引によって血清飢餓細胞から除去し、１００μｌの上記複合体と交換した。細胞を３７℃で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、培地を真空吸引によって除去し、細胞を１００μｌの氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で穏やかに洗浄した。ＰＢＳを真空吸引によって除去し、細胞を、１ｍＭ ＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ−２７１４、ＤＭＳＯ中）及び完全Ｍｉｎｉ１錠／１０ｍＬ（Ｒｏｃｈｅ、１１８３６１５３００１）を含有するＮＰ−４０溶解緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号ＦＮＮ００２１）２５μｌ中で溶解した。溶解物を４℃で２０分間プラットフォームシェーカー上でインキュベートし、３０００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心分離にかけて透明な溶解物とした。溶解物を新しい９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、アッセイまで−２０℃に置いた。
ＶＥＧＦ−Ｒ２リン酸化ルミネックスアッセイのために、Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＬＨＢ０００２）及びＶＥＧＦＲ２［ｐＹ１０５９］Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｂｅａｄ Ｋｉｔ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＬＨＯ０６０１）を製造業者の使用説明書に従って使用した。溶解物を解凍し、８０μｌのＡｓｓａｙ Ｄｉｌｕｅｎｔと１：５混合した。ルミネックス真空ろ過プレートのウェルを、２００μｌのＷｏｒｋｉｎｇ Ｗａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで予め湿らせた。希釈したビーズをウェル当たり２５μｌ加え、２００μｌのＷｏｒｋｉｎｇ Ｗａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで２回洗浄した。洗浄後、５０μｌの希釈した溶解物、及び５０μｌの希釈した検出用抗体を各ウェルに加え、プレートをホイルに包み、室温（ＲＴ）で３時間プラットフォームシェーカー上で５００ｒｐｍでインキュベートした。インキュベーション後、ビーズを２００μｌのＷｏｒｋｉｎｇ Ｗａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで２回洗浄し、次いで１００μｌの希釈したＡｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ−ＲＰＥを各ウェルに加え、プレートをホイルに包み、室温で３０分間プラットフォームシェーカー上で５００ｒｐｍでインキュベートした。インキュベーション後、ビーズを２００μｌのＷｏｒｋｉｎｇ Ｗａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで３回洗浄し、１２５μｌのＷｏｒｋｉｎｇ Ｗａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ中に再懸濁した。ビーズをプラットフォームシェーカー上で３０秒間５００ｒｐｍで再懸濁し、Ｌｕｍｉｎｅｘ−１００装置（ＢｉｏＲａｄ）において読み取った。データは解析ソフトウェア（Ｓｐｏｔｆｉｒｅ）を使用して解析し、各候補及び対照についてＩＣ５０値を計算した。
ｍＶＥＧＦ−Ａ１６４のヒト受容体であるＶＥＧＦ−Ｒ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）に結合する作用は、受容体のリン酸化を誘導する。このルミネックスベースのアッセイは、全ＶＥＧＦ−Ｒ２を、抗ＶＥＧＦ−Ｒ２抗体にコンジュゲートされた蛍光標識ビーズに結合させる。［ｐＹ１０５９］でのリン酸化を検出する二次抗体を使用して、どの程度のＶＥＧＦ−Ｒ２がリン酸化されたかを検出する。受容体リン酸化の減少は、このｍＶＥＧＦ−Ａ１６４を介する活性化が中和されていることを示す。
（実施例１１）
２９３／ＫＤＲ／ＫＺ１３６／ｃ２２ ＶＥＧＦ−Ａ誘導性細胞ベースルシフェラーゼアッセイを使用した中和抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖの同定
ＶＥＧＦＡ活性を中和する能力について候補分子（ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）をスクリーニングするために、細胞ベースのルシフェラーゼアッセイを行った。２９３／ＫＤＲ／ＫＺ１３６／ｃ２２細胞を、９６ウェル白色不透明組織培養処理プレート（Ｃｏｓｔａｒ ＃３９１７）において１００μｌの完全培地（ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１×ピルビン酸ナトリウム、１×ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中に１００００細胞／ウェルの播種密度でプレーティングし、３７℃の加湿された５％ＣＯ２インキュベーター中で４８時間インキュベートした。４８時間後、完全培地を真空吸引によって除去し、１００μｌの無血清培地（ＤＭＥＭ、１×ピルビン酸ナトリウム、１×ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））と交換し、一晩インキュベートした。
翌日、候補ＶＥＧＡ中和分子（ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）、陽性対照（ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦＡモノクローナル抗体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ラニビズマブ（抗ＶＥＧＦＡ親和性成熟Ｆａｂ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、及び自家作製したベバシズマブＦａｂ）を、無血清培地において非中和剤（培地のみ）とともに１：５希釈で２００ｎＭから１２ｐＭまで連続希釈した。これらに対して、０．２６ｎＭのＶＥＧＡ及び１００ｎＭ〜６ｐＭの中和分子又は陽性対照の最終濃度になるように、等量のＶＥＧＦＡ−１６５を０．５４ｎＭで加えた。これらを３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション後、培地を血清飢餓細胞から吸引除去し、１００μｌの上記複合体を加え、３７℃で４時間インキュベートした。
４時間インキュベーション後、ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ１５０１）を使用して製造業者の使用説明書に従ってルシフェラーゼアッセイを行った。簡潔に述べると、培地を吸引し、２５μｌの１×緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ１５３Ａ）を各ウェルに加えた。プレートを室温で２０〜３０分間インキュベートして平衡化した。ルシフェラーゼ活性を、マイクロプレートルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、４０μｌの基質注入、１秒の積分時間を使用して測定した。データは解析ソフトウェア（Ｓｐｏｔｆｉｒｅ）を使用して解析し、各候補及び対照についてＩＣ５０値を計算した。
ＶＥＧＦ−Ａ１６５のその受容体ＶＥＧＦ−Ｒ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）に結合する作用は、ＳＴＡＴ（シグナル伝達及び転写活性化因子）及び／又はルシフェラーゼレポーター遺伝子の転写を駆動するＳＲＥ（血清応答エレメント）を活性化するシグナル伝達カスケードを誘導する。ルシフェラーゼ活性の減少は、このＶＥＧＦＡを介するシグナル伝達が中和されていることを示す。
結果
下記表１１及び１２に列挙したｓｃＦｖ及びＢｉＡｂを、中和ＶＥＧＦ誘導性活性についてルシフェラーゼアッセイにおいてスクリーニングした。スクリーニングした多数のｓｃＦｖ及びＢｉＡｂに顕著な阻害が示された（表１１及び１２においてＩＣ５０値として報告）。ＩＣ５０値は、ＶＥＧＦ活性を５０％中和するために必要とされるｓｃＦｖのｎＭ濃度として示す。ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（商標））、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（商標）、及びＡｖａｓｔｉｎ（商標）Ｆａｂ（自家作製）を活性の対照として使用した。
（実施例１２）
ＶＥＧＦ−Ａ刺激ＨＵＶＥＣ細胞に対するＶＥＧＦＡ ｓｃＦｖの中和活性を決定するための増殖アッセイ
ＶＥＧＦ−Ａに対して中程度の親和性を有した中和ＶＥＧＦ−Ａ ｓｃＦｖについてスクリーニングするために、３Ｈ−チミジンアッセイを行った。組換えヒトＶＥＧＦ−Ａ１６５を、陽性対照として２．６ｎＭで使用した。１×インスリン−トランスフェリン−セレン（無血清培地、ＳＦＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含むＤＭＥＭ−Ｆ１２（１：１）培地を、陰性対照として使用した。ヒトＶＥＧＦ−Ａ ｓｃＦｖをＳＦＭにおいて５００ｎＭ、５０ｎＭ、５ｎＭ、０．５ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．００５ｎＭ、及び０．０００５ｎＭに連続希釈した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、９６ウェル平底プレート中に１００μＬの量で９００〜１０００細胞／ウェルの密度でプレーティングした。ＨＵＶＥＣ細胞を、完全ＥＧＭ−２ＭＶ培地（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）において２日間３７℃、５％ＣＯ２でプレーティングした。細胞をＳＦＭで２４時間血清飢餓状態にし、２．６ｎＭの連続希釈した又はしていないＶＥＧＦ−Ａ ｓｃＦｖで２４時間刺激し、増殖している細胞中に取り込まれる３Ｈ−チミジンのウェル当たり１μＣｉで２４時間パルスをかけた（すべて３７℃、５％ＣＯ２）。細胞を回収し、Ｔｏｐｃｏｕｎｔ装置（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して計数した。
結果：アッセイにおいてスクリーニングされた数多くのｓｃＦｖ及びＢｉＡｂが、下記表１３及び１４に示す低ｎＭのＩＣ５０値によって見られるように、ＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ増殖の強力な中和を示した。
（実施例１３）
２９３Ｆ細胞におけるＰＤＧＦＲβ−Ｆｃ５ ｐＺＭＰ４５プラスミドの構築及び発現
酵母における相同組換えによってベクターｐＺＭＰ４５においてＰＤＧＦＲβ−Ｆｃ５をコードする発現プラスミドを構築した。ＰＤＧＦＲβ（アミノ酸１〜５３０）Ｆｃ５配列を含有する既存の発現プラスミドを鋳型として使用して、ＰＣＲによりＰＤＧＦＲβ−Ｆｃ５フラグメントを生成した。フォワードプライマーｚｃ５８３６３（ＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＡＧＧＣＣＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＧＧＣＴＴＣＣＧＧＧＴＧＣＧＡＴＧＣＣＡＧ；配列番号４８３）はｐＺＭＰ４５において５’オーバーラップを生成し、リバースプライマーｚｃ５２５１４（ＧＧＧＧＴＧＧＧＴＡＣＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＣＴＧＴＴＴＴＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧＧＣＴＣＴＴ；配列番号４８４）はｐＺＭＰ４５において３’オーバーラップを生成した。
Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１２５３２−０１６）を使用したＰＣＲ条件は以下の通りであった：９４℃２分間を１サイクル；９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、６８℃２分３０秒間を３０サイクル；次いで４℃で保持。次いでＰＣＲ反応混合物を、１×ＴＡＥを用いて１％アガロースゲル上で泳動した。正しいバンドを切り出し、Ｑｉａｇｅｎのゲル精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８７０４）を使用して精製した。
プラスミドｐＺＭＰ４５は、ＣＭＶ最初期プロモーター／エンハンサー、ＣＭＶイントロンＡ、コーディング配列挿入のための複数の制限部位、及び最適化されたｔＰＡシグナルペプチド配列を有する発現カセット、ＳＶ４０ターミネーター、Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、並びにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける選択及び複製に必要なＵＲＡ３及びＣＥＮ−ＡＲＳ配列を含有する哺乳動物発現ベクターである。
１００μＬのエレクトロコンピテント酵母細胞（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を、４μｌの上記の精製ＤＮＡと合わせ、１００ｎｇのＢｇｌＩＩ−切断ｐＺＭＰ４５プラスミドと混合し、０．２ｃｍエレクトロポレーションキュベットに移した。酵母−ＤＮＡ混合物に０．７５ｋＶ（５ｋＶ／ｃｍ）、∞オーム、２５μＦで電気パルスをかけた。各キュベットに１ｍｌの１．２Ｍ ソルビトールを加え、酵母をＵＲＡ−ＤＳプレート上にプレーティングし、３０℃でインキュベートした。約７２時間後、単一プレートのＵｒａ＋酵母形質転換体から採取した約５０μＬの密集した酵母細胞を、１００μＬの溶解緩衝液（２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％ＳＤＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）、Ｑｉａｇｅｎミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、カタログ番号２７１０４）の１００μＬのＱｉａｇｅｎＰ１緩衝液、及び２０ＵのＺｙｍｏｌｙａｓｅ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｏｒａｎｇｅ、ＣＡ、カタログ番号１００１）中に再懸濁した。この混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、試薬Ｐ２の添加から始めてＱｉａｇｅｎミニプレッププロトコールの残りを行った。４０μＬ ＥＢ試薬でＤＮＡを溶出した。
０．２ｃｍエレクトロポレーションキュベットにおいて、１５μＬのエレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（ＤＨ１２Ｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を２μＬの酵母ＤＮＡで形質転換した。細胞に１．７５ｋＶ、２５μＦ、及び４００オームで電気パルスをかけた。エレクトロポレーション後、１ｍｌのＳＯＣ（２％Ｂａｃｔｏ’Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）、０．５％酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、２０ｍＭ グルコース）をキュベットに加えた。この溶液を、２つのＬＢ ＡＭＰプレート（ＬＢ液体培地（Ｌｅｎｎｏｘ）、１．８％Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ）、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン）上に、１つ目は形質転換体２００μＬで、２つ目は１００μＬでプレーティングした。
個々のクローンを形質転換プレートから取り、ＰＤＧＦＲβ−Ｆｃ５の正しい発現構築物を含有する１つのクローンを特定するために配列決定した。大規模のプラスミドＤＮＡは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎメガプレップキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、カタログ番号４５７００９）を使用して製造業者の使用説明書に従って単離した。
２９３Ｆ細胞へのトランスフェクション
ＰＤＧＦＲβ−Ｆｃ５の発現を試験するために、１００万個の２９３Ｆ細胞を、１００μｌのＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、カタログ番号３１９８５〜０７０）中１μｇのプラスミドＤＮＡ及び１．３μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、カタログ番号１１６６８−０１９）を使用してＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００製品の手順に従って一過的にトランスフェクトした。細胞を、１２０ｒｐｍ、３７℃、６％ＣＯ２で振とうしながら１２ウェルプレートの１つのウェルにおいて増殖させた。９６時間後、培地を回収し、ウェスタンブロットアッセイの準備をした。
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの材料及びプロトコールを、検出抗体としてＨＲＰ−ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ カタログ番号１０９−０３５−００３）を用いるウェスタンブロットに使用した。顕著な発現が観察されたため、大規模トランスフェクションを開始した。
（実施例１４）
ＰＤＧＦＲβに結合する抗体のパニング
ＰＤＧＦＲβの細胞外ドメインに結合する抗体を、Ｄｙａｘ Ｆａｂ３１０及び４１０ファージライブラリー（Ｄｙａｘ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）をスクリーニングすることによって同定した。ファージ−抗体ライブラリーの選択及びスクリーニングは、磁気ビーズのＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ストレプトアビジン（＃１１２−０６Ｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｌ ＡＳ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）上に捕捉された固定化ビオチン化抗原（ＰＤＧＦＲβ−Ｆｃ５；配列番号４８６）を利用した。抗体は、数ラウンドの選択後ストリンジェンシーを増加させることによって単離した。最初の抗体の作製は、Ｆａｂの形であった。可溶性Ｆａｂ抗体を、ＭｌｕＩ（＃Ｒ０１９８Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）酵素消化により遺伝子３をＭ１３ファージから除去することによって作製した。選択、スクリーニング、及び可溶化の同じ戦略を、ｓｃＦｖの形の抗体に適用した。
（実施例１５）
ＰＤＧＦＲβについてのプレートベースの結合アッセイ
ＰＤＧＦＲβについてのＦａｂの形の陽性クローンを、プレートベースの結合アッセイによってスクリーニングした。Ｃｏｓｔａｒ（＃９０１８）９６ウェルプレートを、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６中１μｇ／ｍｌの５０μｌの抗ヒトＩｇＧ Ｆｃｇ特異的抗体（＃１０９−００５−０９８、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）で、４℃で一晩コートした。翌日、プレートを０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した。各ウェルを、ブロッキングのために１００μｌの５％ミルク（＃１７０−６４０４、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）／ＰＢＳＴで１時間室温（ＲＴ）で満たした。２％ＢＳＡ（＃１６００６９ ＭＢ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）／ＰＢＳＴ中０．２５μｇ／ｍｌの５０μｌのＰＤＧＦＲβ−Ｆｃ５（配列番号４８６）又はＩＬ−２７ＲＡ−Ｆｃ５（配列番号４８７）を、各ウェルに１時間室温で加えた。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。各ウェルを、ブロッキングのために１００μｌの５％ミルク／ＰＢＳＴで１時間室温で満たした。アッセイプレートを、次いでＰＢＳＴで３回洗浄した。各ウェルを、５０μｌのＦａｂで満たした。ウェルを次いで混合し、次いで１時間室温でインキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。Ｆａｂ検出のために、２％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ中５０μｌの（１：４０００）抗ヒトＦａｂ特異的ｐＡｂ−ＨＲＰ（＃３１４８２、Ｐｉｅｒｃｅ）を、各ウェルに１時間室温で添加した。次いでプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。５０μｌのＴＭＢ（ＴＭＢＷ−１０００−０１、ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を各ウェルに添加して１０〜２０分間発色させ、その後５０μｌの停止緩衝液（ＳＴＰＲ−１０００−０１、ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加して反応をクエンチした。次いでプレートリーダーでプレートを４５０ｎｍで読み取った。
（実施例１６）
ＰＤＧＦＲβ Ｆａｂ−ＳｃＦｖ変換
ラムダ、カッパ、及び重鎖可変領域を、１０個の第２ラウンドＰＤＧＦＲβパニングＦａｂ ＤｙａｘファージＤＮＡアームのプールから、各サブタイプのフレームワーク配列に対するプライマーを使用して３工程の工程で増幅した。第１ラウンドのＰＣＲは、それぞれの可変フレームワーク領域を増幅し、適切なオーバーハングを付加して第２ラウンドＰＣＲ反応を容易にする。第２ラウンドＰＣＲ反応は、適切なｇｌｙ／ｓｅｒリンカー配列を適当な第１ラウンドＰＣＲ産物の末端に付加し、第３ラウンドＰＣＲ反応は、可変軽鎖ラムダ産物、可変軽鎖カッパ産物、及び可変重鎖産物をオーバーラップさせてＬＨ及びＨＬの両方向にｓｃＦｖ産物を生成し、次いでこれをＡｐａＬＩ／ＮｏｔＩで消化したＰＩＭＤ２１ファージディスプレイベクター中にクローニングした。
（実施例１７）
ＰＤＧＦＲβについてのプレートベースの中和アッセイを使用した中和ｓＦａｂ及びｓｃＦｖの同定
ＰＤＧＦＲβ Ｆａｂ及びｓｃＦｖを、プレートベースの中和アッセイによってスクリーニングした。Ｃｏｓｔａｒ（＃９０１８）９６ウェルプレートを、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６中１μｇ／ｍｌの５０μｌの抗ヒトＩｇＧ Ｆｃｇ特異的抗体（＃１０９−００５−０９８、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）で、４℃で一晩コートした。翌日、プレートを０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した。各ウェルを、ブロッキングのために１００μｌの５％ミルク（＃１７０−６４０４、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）／ＰＢＳＴで１時間室温（ＲＴ）で満たした。２％ＢＳＡ（＃１６００６９ ＭＢ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）／ＰＢＳＴ中０．２５μｇ／ｍｌの５０μｌのＰＤＧＦＲβ（自家作製）を、各ウェルに１時間室温で加えた。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。各ウェルを、ブロッキングのために１００μｌの５％ミルク／ＰＢＳＴで１時間室温で満たした。アッセイプレートを、次いでＰＢＳＴで３回洗浄した。各ウェルを、２％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ中０．０１１２μｇ／ｍｌのＦａｂ又はｓｃＦｖ上清とビオチン化ＰＤＧＦ−Ｂ（配列番号４８８）ホモ二量体（ＰＤＧＦ−ＢＢ）の（１：１）混合物５０μｌで１時間室温で満たした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。５０μｌの２％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ中（１：３０００）ストレプトアビジン−ＨＲＰ（＃２１１２４、Ｐｉｅｒｃｅ）を、各ウェルに１時間室温で添加した。次いでプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。５０μｌのＴＭＢ（ＴＭＢＷ−１０００−０１、ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を各ウェルに添加して２０〜３０分間発色させ、その後５０μｌの停止緩衝液（ＳＴＰＲ−１０００−０１、ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加して反応をクエンチした。次いでプレートリーダーでプレートを４５０ｎｍで読み取った。
（実施例１８）
表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）によるヒトＰＤＧＦ−ＢＢのヒトＰＤＧＦ受容体−βに対する結合親和性の測定
ＰＤＧＦＲ−β−Ｆｃ５とＰＤＧＦ−ＢＢとの相互作用について、表面プラズモン共鳴によって動態速度定数及び平衡解離定数を測定した。表面プラズモン共鳴は、生体分子相互作用中の結合及び解離相の両方のモニタリングを可能にする（Ｏｈｌｓｏｎ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．、１９９７年）。結合速度定数（ｋａ（Ｍ−１ｓ−１））は、抗原−アンタゴニスト複合体形成の速度を表す値である。解離速度定数（ｋｄ（ｓ−１））は、この複合体の安定性を表す値である。結合速度定数を解離速度定数で割る（ｋａ／ｋｄ）ことによって、平衡結合定数（ＫＡ（Ｍ−１））が得られる。解離速度定数を結合速度定数（ｋｄ／ｋａ）で割ることによって、平衡解離定数（ＫＤ（Ｍ））が得られる。この値は相互作用の結合親和性を示す。同じＫＤを有する相互作用は、広く様々な結合及び解離速度定数を有する可能性がある。したがって、ｋａ及びｋｄの両方を測定することは、より正確に相互作用の親和性を説明するのに役立つ。
親和性決定
ＰＤＧＦ−ＢＢとＰＤＧＦＲ−β−Ｆｃ５との相互作用について、表面プラズモン共鳴によって動態速度定数及び平衡解離定数を測定した。結合速度定数（ｋａ（Ｍ−１ｓ−１））は、抗原−アンタゴニスト複合体形成の速度を表す値である。解離速度定数（ｋｄ（ｓ−１））は、この複合体の安定性を表す値である。結合速度定数を解離速度定数で割る（ｋａ／ｋｄ）ことによって、平衡結合定数（ＫＡ（Ｍ−１））が得られる。解離速度定数を結合速度定数（ｋｄ／ｋａ）で割ることによって、平衡解離定数（ＫＤ（Ｍ））が得られる。この値は相互作用の結合親和性を示す。同じＫＤを有する相互作用は、広く様々な結合及び解離速度定数を有する可能性がある。したがって、ｋａ及びｋｄの両方を測定することは、より正確に相互作用の親和性を説明するのに役立つ。
材料及び方法
ＰＤＧＦ−ＢＢとＰＤＧＦＲ−βとの相互作用の結合親和性を測定するために、一連の実験を完了した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ−１００（商標）システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）において結合動態及び親和性の試験を行った。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（商標）Ｃｏｎｔｒｏｌソフトウェア、ｖ１．１．１を使用して方法をプログラムした。ＰＤＧＦＲ−β−Ｆｃ５融合分子を捕捉するために、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ−ガンマ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を、アミンカップリング化学反応（ＥＤＣ：ＮＨＳ）を使用して約１００００ＲＵの密度までＣＭ５センサーチップ上に共有結合で固定化した。次いでＰＤＧＦＲ−β−Ｆｃ５を１０μｌ／分の流速で９０秒間この表面上に注入して、約５００ＲＵを捕捉した。
１．３７ｎＭ〜０．０２ｎＭの範囲のヒトＰＤＧＦ−ＢＢの連続１：３希釈溶液を表面に注入し、センサーチップ上に固定化されたＰＤＧＦＲ−β−Ｆｃ５に特異的に結合させた。ＰＤＧＦ−ＢＢの各濃度の注入は、５分の結合時間及び５分の解離時間で行った。５０μｌ／分の流速で動的結合試験を行った。すべての結合実験を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ ０．０５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４の緩衝液中で２５℃で行った。機器のノイズ及びドリフトの差し引きを考慮して、緩衝液注入も行った。サイクルの間に、フローセルを１０ｍＭ グリシン、ｐＨ１．７５で洗浄して表面を再生した。
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン１．１．１）を使用してデータをコンパイルした。参照フローセル及びブランク注入を差し引くことによってデータを処理した。ベースライン安定性を評価して、再生ステップが一連の注入の全体にわたって一定の結合表面をもたらすことを確認した。２連の注入の曲線を、再現性について検査した。１：１結合モデルが最も適切であると決定し、得られた結合曲線を全体にわたってこのモデルに適合させた。
結果
ＰＤＧＦ−ＢＢを、ＰＤＧＦＲ−β−Ｆｃ５に対するその結合親和性について特徴付けた（結果を表１５にまとめた）。結合速度定数（ｋａ（Ｍ−１ｓ−１））及び解離速度定数（ｋｄ（ｓ−１））を測定した。ＫＤ及びＫＡは、ｋａ及びｋｄ値から計算した。データは、１：１相互作用モデルによく適合した。これらのアッセイ条件下で、ＰＤＧＦ−ＢＢ−ＰＤＧＦＲ−β−Ｆｃ５相互作用についての平衡解離定数は約２．Ｅ−１１Ｍであった。
（実施例１９）
表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）によるヒトＰＤＧＦ受容体−βアンタゴニストとヒトＰＤＧＦ受容体−βとの相互作用の解離速度定数の測定
ヒトＰＤＧＦＲ−βアンタゴニストを、その解離速度定数に反映されるヒトＰＤＧＦＲ−βに対する結合親和性について、表面プラズモン共鳴を使用して評価した。解離速度定数を、ＰＤＧＦＲ−βアンタゴニストとＰＤＧＦＲ−βとの相互作用について表面プラズモン共鳴によって測定した。解離速度定数（ｋｄ（ｓ−１））は、この複合体の安定性を表す値である。この値は濃度とは無関係であり、したがって未知の濃度の試料のスクリーニング及びランク付けに適している。
材料及び方法
ＰＤＧＦＲ−βアンタゴニストのＰＤＧＦＲ−βに対する結合親和性を測定するために、一連の実験を完了した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ−１００（商標）システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）において結合動態及び親和性試験を行った。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（商標）Ｃｏｎｔｒｏｌソフトウェア、ｖ１．１．１を使用して方法をプログラムした。ＰＤＧＦＲ−β−Ｆｃ５分子を捕捉するために、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ−ガンマ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を、アミンカップリング化学反応（ＥＤＣ：ＮＨＳ）を使用して約１００００ＲＵの密度までＣＭ５センサーチップ上に共有結合で固定化した。固定化手順の後、フローセル上に残存する活性部位をエタノールアミンでブロックした。非特異的結合タンパク質を、５０ｍＭ ＮａＯＨでの洗浄によって除去した。ＰＤＧＦＲβを１００ｎＭまで希釈し、次いで１０μｌ／分の流速で２分間この表面上に注入して、約５００ＲＵを捕捉した。
ヒトＰＤＧＦＲ−βアンタゴニスト上清（Ｄｙａｘファージライブラリースクリーニングから選択された）をランニング緩衝液中で１：３希釈し、表面に注入し、５分の結合時間及び５分の解離時間でセンサーチップ上に捕捉されたＰＤＧＦＲ−βＦｃ５に特異的に結合させた。ＰＤＧＦ−ＢＢ及び抗ＰＤＧＦＲ−βモノクローナル抗体（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ）の２連の注入を、陽性対照として行った。対照フローセルもまた、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ−ガンマを約１００００ＲＵの密度まで固定化することによって調製した。ＰＤＧＦＲ−βＦｃ５の代わりに緩衝液をこの表面に注入した後、ＰＤＧＦＲ−βアンタゴニストを注入した。３０ｕｌ／分の流速で動的結合試験を行った。すべての結合実験を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ ０．０５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４のランニング緩衝液中で２５℃で行った。機器のノイズ及びドリフトの差し引きを考慮して、緩衝液注入も行った。サイクルの間に、フローセルを１０ｍＭ グリシン、ｐＨ１．７５で洗浄して結合したＰＤＧＦＲ−βＦｃ５を除去した。
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン１．１．１）を使用してデータをコンパイルした。参照フローセル及びブランク注入を差し引くことによってデータを処理した。ベースライン安定性を評価して、再生ステップが一連の注入の全体にわたって一定の結合表面をもたらすことを確認した。ＰＤＧＦＲ−βアンタゴニストの出発濃度は未知であるため、得られた結合曲線を全体にわたって１：１解離結合モデルに適合させて解離速度定数（ｋｄ（ｓ−１））を計算した。このモデルは、アンタゴニストの濃度に依存しない。
結果
ＰＤＧＦＲ−βＦｃ５に対するＰＤＧＦＲ−βアンタゴニストの解離速度解析を決定した。得られた結合曲線は、１：１解離結合モデルによく適合した。ＰＤＧＦＲ−βアンタゴニストの出発濃度は未知であり、したがって、ｋｄは濃度と無関係であるため解離速度定数（ｋｄ（ｓ−１））のみを報告した。計算した解離速度定数を、最も遅いものから最も速いものまでランク付けした。これらのアッセイ条件下で、ＰＤＧＦＲ−βアンタゴニストは、ＰＤＧＦＲ−βＦｃ５に対する相互作用について広範囲の解離速度定数（１．Ｅ−６〜２．Ｅ−２（ｓ−１））を示す（表１６を参照）。比較のために、ＰＤＧＦ−ＢＢ−ＰＤＧＦＲ−β相互作用のｋｄは約１．Ｅ−３ｓ−１であり、抗ＰＤＧＦＲ−βモノクローナル抗体−ＰＤＧＦＲ−β相互作用は約２．Ｅ−４ｓ−１であった。
（実施例２０）
血清応答エレメントルシフェラーゼレポーターを用いたＢＨＫ５７０細胞のクローニング及び発現
１００×２０ｍｍ組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｐｒｉｎｇｓ、ＣＯ）において、製造業者の使用説明書に従って、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して血清応答エレメント、ルシフェラーゼレポーター、及びＧ４１８耐性（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ）を含有するＫＺ６７プラスミドＤＮＡ１０μｇでＢＨＫ５７０細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）をトランスフェクトした。４８時間後、細胞をトリプシン（Ｇｉｂｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）で除去し、安定なトランスフェクタントを選択するために増殖培地（ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン及び１ｍＭピルビン酸ナトリウムに加えて５００μｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ）において１００×２０ｍｍプレートに播種し、この培地中に維持した。約１週間後、安定な細胞をトリプシンで除去し、血球計数器において計数し、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎを加えた増殖培地１００μｌの量中に１細胞／ウェルの密度で９６ウェル平底プレート（Ｆａｌｃｏｎ）に加えた。増殖の１週間後、ウェルを顕微鏡下で単一コロニーについて記録した。さらなる増殖の後、細胞をトリプシンで除去し、新しい９６ウェルプレートに移してコンフルエントにした。細胞を２５μｌトリプシンで除去し、７５μｌの増殖培地中に再懸濁した。それぞれ３０μｌの細胞混合物を有する３つのレプリカプレートを作製した。２つのプレートは、ルシフェラーゼアッセイ用の９６ウェル白色無地（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）であり、１つは陽性クローン回収用の透明９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）であった。翌日、白色プレートの培地を無血清培地と交換した。細胞を２日間血清飢餓状態にした後、一方のプレートを１００μｌ量の２０％ＦＢＳを含有する新しい培地で誘導し、血清を含まない培地をもう一方のプレートに加えて基礎的な応答を決定した。３７℃及び５％ＣＯ２で４時間のインキュベーション後、製造業者の使用説明書に従ってＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）Ｅ１５００ルシフェラーゼ試薬を用いてルシフェラーゼアッセイを行った。プレートを、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ ＬＢ９６Ｖ−２Ｒルミノメーター（Ｏａｋ Ｒｉｄｇｅ、ＴＮ）において読み取った。血清を含むウェルのシグナルを血清を含まないウェルのシグナルで割ることによって誘導倍率を計算した。陽性クローンを透明プレートからスケールアップし、ルシフェラーゼアッセイによって再度試験した。細胞を９６ウェル白色プレートにおいて１％ＦＢＳ中１００００細胞／ウェルで播種し、２日後ＦＢＳの用量反応とともにルシフェラーゼアッセイを行った。
（実施例２１）
ヒト及びカニクイザルＰＤＧＦＲβを有するＢＨＫ５７０ＫＺ６７Ｅ１０．２Ｂ３細胞のクローニング及び発現
ＢＨＫ５７０Ｅ１０．２Ｂ３細胞（上記参照）を、ＤＨＦＲ耐性遺伝子を含有するｐｚｐ９プラスミド（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ）中のヒトＰＤＧＦＲβで、又はゼオシン耐性遺伝子（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ）を含有するｐＺＭＰ４３プラスミド中のカニクイザルＰＤＧＦＲβで上述の通りトランスフェクトした。クローニング及びルシフェラーゼアッセイを、ヒトトランスフェクタントを選択するために２５０ｎＭメトトレキサート（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用し、カニクイザルトランスフェクタントには２００μｇ／ｍｌゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用したことを除いて上記の通り行った。アッセイ培地（ＤＭＥＭ、０．５％ウシ血清アルブミン（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ）中１０ｎｇ／ｍｌの濃度のＰＤＧＦ ＢＢ（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ）を、９６ウェルプレート由来のクローンの初期誘導のために使用した。アッセイ培地中ＰＤＧＦ ＢＢ１００〜０．０１ｎｇ／ｍｌの用量反応によって、スケールアップしたクローンに対する次の分析を行った。
（実施例２２）
周皮細胞におけるＰＤＧＦＲβリン酸化を決定するためのルミネックスベースのアッセイを使用したＰＤＧＦＲβに対する中和Ｆａｂ及びｓｃＦｖの同定
中和ヒトＰＤＧＦＲβｓｃＦｖをスクリーニングするために、ルミネックスベースのアッセイを行った。アッセイは、細胞溶解物中に存在するリン酸化されたＰＤＧＦＲβの量を検出する。ヒト脳血管周皮細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、９６ウェル平底プレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｐｒｉｎｇｓ、ＣＯ）において、７５００細胞／ウェルの密度で、３７℃及び５％ＣＯ２で完全培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌサプリメントのウシ胎仔血清、周皮細胞増殖サプリメント、及びペニシリン−ストレプトマイシンを含むＳｃｉｅｎＣｅｌｌ周皮細胞培地（ＰＭ））中１００μｌの量で播種した。２日目に培地を、サプリメントを含まないＳｃｉｅｎＣｅｌｌ ＰＭと交換し、２４時間血清飢餓状態にした。３日目に培地を細胞から除去し、連続希釈したｓｃＦｖ及びＰＤＧＦＲβに対する対照モノクローナル抗体（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ、マウス抗ヒト、Ｅ９８９９）をアッセイ培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ ＰＭ及び０．５％ウシ血清アルブミン）中５０μｌの量で加え、３７℃及び５％ＣＯ２で６０分間インキュベートした。ＰＤＧＦ ＢＢ（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を２×濃度で５０μｌ加えて０．４４ｎＭ（ＥＣ８０、８０パーセントで有効な濃度）の最終濃度にし、３７℃及び５％ＣＯ２で１０分間インキュベートした。
次いで細胞をＢｉｏ−Ｐｌｅｘ Ｃｅｌｌ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、製造業者の指示（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に従って溶解溶液で溶解し、細胞上清を−２０℃で凍結した。解凍した細胞上清に、１×ホスホ−ＰＤＧＦＲβビーズを加え、振とう機において１８時間室温でインキュベートした。検出抗体を洗浄したビーズに加え、振とう機において３０分間室温でインキュベートし、次いでストレプトアビジン−ＰＥをビーズとともに室温で１５分間インキュベートした。ビーズをＢｉｏ−Ｐｌｅｘ Ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ中に再懸濁し、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘアレイリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において分析した。
結果：ｓｃＦｖ、Ｆａｂ及びＢｉＡｂは、下記表１７及び１８の低ｎＭのＩＣ５０値によって示されるように、ＰＤＧＦ−ＢＢによって誘導される強力なＰＤＧＦＲリン酸化中和を示した。
（実施例２３）
ＰＤＧＦ−ＢＢ誘導性周皮細胞増殖アッセイを使用したＰＤＧＦＲβに対する中和Ｆａｂ及びｓｃＦｖの同定
ヒトＰＤＧＦＲβのＰＤＧＦ−ＢＢ活性化によって誘導される増殖を中和する能力について候補分子（ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）をスクリーニングするために、３Ｈ−チミジンアッセイを行った。アッセイは、増殖している細胞のＤＮＡ中に取り込まれた放射性標識ヌクレオチドの量を測定する。ヒト脳血管周皮細胞（ＨＢＶＰ；ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、９６ウェル平底プレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｐｒｉｎｇｓ、ＣＯ）において、５００細胞／ウェルの密度で、５％ＣＯ２中３７℃で１５０μｌの完全培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌサプリメントのウシ胎仔血清、周皮細胞増殖サプリメント、及びペニシリン−ストレプトマイシンを含むＳｃｉｅｎＣｅｌｌ周皮細胞培地（ＰＭ））において播種した。２４〜４８時間後、完全培地を１×インスリン−トランスフェリン−セレン（無血清培地、ＳＦＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含むＤＭＥＭ−Ｆ１２（１：１）培地と交換し、細胞をさらに１８〜２４時間前述通りインキュベートした。ＰＤＧＦＲβ−中和分子（ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）、ＰＤＧＦＲβに対する対照モノクローナル抗体（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．Ｅ９８９９）、又はＥ９８９９モノクローナル抗体（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）のＦａｂフラグメントを、一定レベルのヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（０．４ｎＭ、ＥＣ８０、８０％有効濃度、ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．Ａ４９３Ｆ）の存在下で、ＳＦＭにおいて２０００ｎＭ〜０．０２ｎＭまで連続１：４希釈した。血清飢餓細胞を１５０μｌのＳＦＭ、ＳＦＭ中０．４ｎＭのＰＤＧＦ−ＢＢとともに、又は漸増させたＰＤＧＦＲβ分子をＳＦＭ中０．４ｎＭのＰＤＧＦ−ＢＢとともにインキュベートした。１８〜２４時間後、１μＣｉの３Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を各ウェルに加え、細胞を通常通り３〜６時間インキュベートした。細胞をフィルタープレート上に回収し、Ｐａｃｋａｒｄ Ｔｏｐｃｏｕｎｔ装置を使用して３Ｈ−チミジンの取込みを決定した。
結果：ｓｃＦｖ、Ｆａｂ及びＢｉＡｂは、下記表１９及び２０の低ｎＭのＩＣ５０値によって示されるように、ＰＤＧＦ−ＢＢによって誘導される周皮細胞増殖の強力な中和を示した。
（実施例２４）
カニクイザルの完全長ＰＤＧＦＲβのクローニング
カニクイザルＰＤＧＦＲβ（ＣｎＰＤＧＦＲβ）を、高忠実性熱安定性ポリメラーゼ（ＰＦＵ Ｕｌｔｒａ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｏｒｐ．Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｃａ．）を使用してＰＣＲによってクローニングした。チンパンジー及びヒトＰＤＧＦＲβに関するＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒから入手可能な配列情報に基づいて、オリゴヌクレオチド５８３９９（ＡＧＧＡＣＴＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＧＴＧＡ；配列番号４８９）及び５８４００（ＧＡＧＣＴＴＣＡＧＧＣＡＧＧＧＣＡＧＧＧＴ；配列番号４９０）を設計して、自家カニクイザル脾臓ｃＤＮＡライブラリーからカニクイザル遺伝子オープンリーディングフレームを増幅した。複数のＰＣＲ反応由来のＰＣＲ産物を、配列比較のためにＰＣＲ４ ＴＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐ．Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にクローニングした。ヌクレオチドコンセンサス配列（配列番号４９１）を１６個のクローンから得た。
（実施例２５）
カニクイザルＰＤＧＦＲβ受容体に対するＰＤＧＦＲβｓｃＦｖの交差反応性を決定するためのルミネックスアッセイ
ヒトＰＤＧＦＲβｓｃＦｖの交差反応性をスクリーニングするために、ルミネックスベースのアッセイを行った。アッセイは、細胞溶解物中に存在するリン酸化されたＰＤＧＦＲβの量を検出する。カニクイザル皮膚細胞（ＣＹＮＯＭ−Ｋ１細胞）、（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を、９６ウェル平底プレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｐｒｉｎｇｓ、ＣＯ）において、７５００細胞／ウェルの密度で、完全培地（Ｅａｒｌｅ’ｓ ＭＥＭ、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸）中１００μｌの量で３７℃及び５％ＣＯ２で１日間播種した。２日目に細胞をＦＢＳを含まない培地に移し、２４時間血清飢餓状態にした。３日目に培地を細胞から除去し、連続希釈したｓｃＦｖ及びＰＤＧＦＲβに対する対照モノクローナル抗体（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ、Ｅ９８９９）をアッセイ培地（０．５％ウシ血清アルブミン含有ＭＥＭ及び２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ）中５０μｌの量で加え、３７℃及び５％ＣＯ２で６０分間インキュベートした。ＰＤＧＦ ＢＢ（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を２×濃度で５０μｌ加えて０．３３ｎＭ（ＥＣ８０、８０パーセントで有効な濃度）の最終濃度にし、３７℃及び５％ＣＯ２で１０分間インキュベートした。
次いで細胞をＢｉｏ−Ｐｌｅｘ Ｃｅｌｌ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、製造業者の指示（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に従って溶解溶液で溶解し、細胞上清を−２０℃で凍結した。解凍した細胞上清に、１×ホスホ−ＰＤＧＦＲβビーズを加え、振とう機において１８時間室温でインキュベートした。検出抗体を洗浄したビーズに加え、振とう機において３０分間室温でインキュベートし、次いでストレプトアビジン−ＰＥをビーズとともに室温で１５分間インキュベートした。ビーズをＢｉｏ−Ｐｌｅｘ Ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ中に再懸濁し、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘアレイリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において分析した。
結果：ｓｃＦｖ、Ｆａｂ及びＩｇＧは、下記表２１の低ｎＭのＩＣ５０値によって示されるように、ＰＤＧＦ−ＢＢによって誘導される強力なＰＤＧＦＲリン酸化中和を示した。
（実施例２６）
マウスＰＤＧＦＲβに対する抗ＰＤＧＦＲβｓｃＦｖの交差反応性を決定するためのルミネックスアッセイ
ヒトＰＤＧＦＲβｓｃＦｖの交差反応性をスクリーニングするために、ルミネックスベースのアッセイを行った。アッセイは、細胞溶解物中に存在するリン酸化されたＰＤＧＦＲβの量を検出する。マウス胎仔線維芽細胞（３Ｔ３−Ｓｗｉｓｓ ａｌｂｉｎｏ、Ｓｗｉｓｓ；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を、９６ウェル平底プレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｐｒｉｎｇｓ、ＣＯ）において、１０００細胞／ウェルの密度で、完全培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ））中１００μｌの量で播種し、５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートした。２４〜４８時間後、完全培地を１×インスリン−トランスフェリン−セレン（無血清培地、ＳＦＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含むＤＭＥＭ−Ｆ１２（１：１）培地と交換し、細胞をさらに１８〜２４時間前述通りインキュベートした。ＰＤＧＦＲβ−中和分子（ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）、ＰＤＧＦＲβに対する対照モノクローナル抗体（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．Ｅ９８９９）、又はＥ９８９９モノクローナル抗体（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）のＦａｂフラグメントを、ＳＦＭにおいて２０００ｎＭ〜０．０２ｎＭまで連続１：４希釈した。血清飢餓細胞を、１５０μｌのＳＦＭ又はＳＦＭにおいて漸増させたＰＤＧＦＲβ分子とともに５％ＣＯ２中３７℃で１時間インキュベートした。次いで細胞を、５０μｌの１．６ｎＭ ＰＤＧＦ−ＢＢ（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．；０．４ｎＭ最終濃度、ＥＣ８０、８０％有効濃度）により５％ＣＯ２中３７℃で１０分間パルスした。ＰＤＧＦ−ＢＢ刺激を行わない対照ウェルが含まれていた。次いで細胞をＢｉｏ−Ｐｌｅｘ Ｃｅｌｌ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、製造業者の指示（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に従ってアッセイキットに入っていたＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒで溶解し、細胞上清を−２０℃で凍結した。解凍した細胞上清に、１×ホスホ−ＰＤＧＦＲβビーズを加え、振とう機において１８時間室温でインキュベートした。検出抗体を洗浄したビーズに加え、振とう機において３０分間室温でインキュベートし、次いでストレプトアビジン−ＰＥをビーズとともに室温で１５分間インキュベートした。ビーズをＢｉｏ−Ｐｌｅｘ Ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ中に再懸濁し、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘアレイリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において分析した。
（実施例２７）
受容体内部移行に対するＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦＡアンタゴニストの効果を測定するための免疫蛍光ベースの内部移行アッセイ
材料及び方法
低継代数のヒト脳血管周皮細胞（ＨＢＶＰ）（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、４枚のチャンバーガラスＬａｂ−ＴｅｋＩＩチャンバースライド（カタログ番号１５４９１７ Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬ）において、完全培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌサプリメントのウシ胎仔血清、周皮細胞増殖サプリメント、及びペニシリン−ストレプトマイシンを含むＳｃｉｅｎＣｅｌｌ周皮細胞培地（ＰＭ））中５００μｌ／チャンバーの量で、サブコンフルエントな状態でプレーティングする。チャンバースライドを、約７５％コンフルエンシーに達するまで３７℃及び５％ＣＯ２で１〜２日間インキュベートする。ＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦＡアンタゴニスト及び対照抗体の結合を４℃で行うため、すべてのスライドを氷上に置き、冷ＤＭＥＭ＋０．１％ＢＳＡで１回洗浄する。ＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦＡアンタゴニスト及び試験抗体を次いで、ＤＭＥＭ＋３％ＢＳＡ及びＨｅｐｅｓ緩衝液からなる結合緩衝液において１μｇ／ｍｌまで希釈する。各スライドを、２つのアンタゴニスト、１つの対照抗体及び二次抗体のみの１つの対照ウェルが各チャンバースライドに指定されるように構成する。５００μｌ／ウェルのアンタゴニスト、対照、又は培地のみを各チャンバースライドに加える。１時間のインキュベーション後、Ｔ０スライドを、冷ＰＢＳで１回洗浄して１ｍｌ／ウェルのパラホルムアルデヒド溶液を加えることによって固定する。このＴ０スライドは、細胞表面における受容体発現を測定し、３７℃でインキュベートするスライドは経時的な受容体内部移行を測定する。残りのスライドを３７℃のインキュベーター中に置き、３０分、９０分、４時間及び６時間の時点で同様の方法で除去及び固定する。すべてのスライドを、固定後氷上に置く。すべてのスライドを固定したら、ＰＢＳで１回洗浄し、−２０℃のＭｅｔＯＨで２分間透過処理する。スライドを冷ＰＢＳで再度洗浄する。これより室温で染色を行う。スライドを、ＰＢＳで作製した５０ｍＭ グリシン中で５分間室温でインキュベートする。グリシンを除去し、ＰＢＳで洗い流し、スライドをＰＢＳ（＃Ｓ−１０００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）中１０％正常ヤギ血清５００μｌ／ウェルにおいて３０分間ブロックする。ブロッキングステップ後、５００μｌ／ウェルの二次抗体を全ウェルに加える。Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗マウス（カタログ番号Ａ１１０２９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、又はＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ヒト（カタログ番号Ａ１１０１３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を、ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．１％ＢＳＡからなる洗浄緩衝液において１：１５０希釈する。スライドを暗所において室温で４５分間インキュベートする。各スライドを、室温でＰＢＳ中に５分間浸漬することによって３回洗浄する。ＤＡＰＩ染色液を含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤の１滴を各チャンバー（カタログ番号Ｈ−１２００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ Ｃａｌｉｆ．）に加え、スライドをカバーグラスで覆い、蛍光顕微鏡下で調べる。Ｍｅｔａｖｕｅソフトウェアを使用して２色染色プロファイルを視覚化する。
（実施例２８）
ｐＨ６．０及びｐＨ７．４でのＦｃＲｎに対するＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの結合を測定するためのＦｃＲｎ結合アッセイ
材料及び方法
２つのプレートはＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦＡアンタゴニスト及び対照抗体を用いて構成される：１つはｐＨ６．０で洗浄し、１つはｐＨ７．４で洗浄する。１日目：２つのＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルエライザプレート（カタログ番号４４−２４０４）を、１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．３で作製した３００ｎｇ／ウェルのＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．カタログ番号３１０００）でコートする。プレートを４℃で一晩インキュベートする。２日目：プレートを、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で５回洗浄する。プレートを次いで、０．８％ＮａＣｌ、０．０２％ＫＣｌ、０．１０２％Ｎａ２ＨＰＯ４、０．０２％ＫＨ２ＰＯ４、１％ＢＳＡ、０．０５％ポリソルベート、０．０５％Ｐｒｏｃｌｉｎ３００ ｐＨ７．２を含有するブロッキング緩衝液２５０μｌ／ウェルで１時間室温でブロックする。プレートを次いでＰＢＳＴで２回洗浄する。各ウェルを次いで、ＰＢＳＴ＋１％ＢＳＡ中で希釈した１５０ｎｇのビオチン化ＦＣＲＮタンパク質（自家製造した）でコートする。プレートを室温で１時間インキュベートする。ＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦＡアンタゴニスト及び対照抗体（例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）を、ｐＨ６．０に調整した１００ｍＭ ＮａＰＯ４、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）＋０．１％ＢＳＡ（ｐＨ６．０緩衝液）において１５０ｎＭ〜０．０７ｎＭの範囲の濃度で希釈する。試料を、各濃度５０μｌ／ウェルの量で２連で試験する。ｐＨ６．０緩衝液のみを対照として行い、各プレートのバックグラウンドレベルを決定する。プレートを室温で２時間インキュベートする。結合ステップ後、各プレートを別々の緩衝液中で洗浄する：１つのプレートを２５０μｌ／ウェルのｐＨ６．０緩衝液で洗浄し、１つのプレートを２５０μｌ／ウェルのｐＨ７．４に調整した１００ｍＭ ＮａＰＯ４、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）、０．１％ＢＳＡ（ｐＨ７．４緩衝液）で洗浄する。プレートを洗浄緩衝液において室温で、洗浄ステップを２０分毎に行って合計１時間インキュベートする。洗浄ステップに続いて、結合した抗体を１００μｌ／ウェルのＨＲＰヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ）２フラグメントＦｃガンマ特異的二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号１０９−０３６−０９８）で検出する。二次抗体をｐＨ６．０緩衝液において１：５０００希釈し、室温で１時間インキュベーションを行う。プレートを次いでＰＢＳＴで５回洗浄する。最後に、１００μｌのＴＭＢ（ＴＭＢＷ−１０００−０１、ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を各ウェルに加え、プレートを室温で約３分間発色させる。この時点で、１００μｌ／ウェルの停止緩衝液（ＳＴＰＲ−１００−０１、ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加えて反応をクエンチさせる。プレートを、分光光度計において４５０／５７０ｎｍの波長で読み取る。ＯＤ値を調べてｐＨ６．０での結合パターン及びｐＨ７．４での解離パターンを比較する。
（実施例２９）
抗ＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性分子パネルの構築
Ａ．概要
抗ＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性分子のための例示的な発現構築物の形は、タンデム単鎖ＦｖＦｃ（ｔａｓｃＦｖＦｃ）、二単鎖ＦｖＦｃ（ｂｉｓｃＦｖＦｃ）、及びｂｉＡｂを含む。これらの分子の形の定義は、以下の通りである。ｔａｓｃＦｖＦｃは、テザーによって隣り合って連結され、Ｆｃに直接融合されている２つのｓｃＦｖを有する。ｂｉｓｃＦｖＦｃは、カルボキシル末端がリンカーを介して連結されているＦｃに融合されたアミノ末端及びカルボキシル末端ｓｃＦｖの両方を有する。ｔａｓｃＦｖＦｃ及びｂｉｓｃＦｖＦｃは両方とも、この実施例の目的で、Ｆｃを欠くエフェクター機能（Ｆｃ５）を有する（配列番号４９２）。ｂｉＡｂは、カルボキシル末端ｓｃＦｖがリンカーを介して連結されている全免疫グロブリンである。この実施例において記述されるｂｉＡｂの場合、使用される重鎖はヒトガンマ１（ＩｇＧ１．１）を欠くエフェクター機能であり、軽鎖定常領域はカッパであった。これらの分子を、図２に示す。
タンデム単鎖Ｆｖ分子を説明するために、テザーを２つの単鎖Ｆｖを連結するポリペプチドと定義し、リンカーは単鎖Ｆｖを含む２つの可変ドメインを連結するポリペプチド、及びｓｃＦｖをＦｃ又は免疫グロブリン重鎖に連結している任意のポリペプチドのことを指す。この実施例において記述されるｓｃＦｖ分子において使用されるリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）５（配列番号４９４）である。ｔａｓｃＦｖＦｃに使用されるテザー配列は、典型的には（Ｇ４Ｓ）２（配列番号４９６）である。ｂｉｓｃ及びｂｉＡｂの形においてｓｃＦｖをＦｃに連結するために使用されるカルボキシル末端リンカーは、ｔａｓｃＦｖＦｃのテザー配列と同じである。ｓｃＦｖ配列を、ｂｉｓｃＦｖＦｃを欠くエフェクターであるヒトガンマ１Ｆｃの修飾型であるＦｃ５に融合させた。ｓｃＦｖ配列を、ｂｉＡｂの全ヒト免疫グロブリンガンマ１を欠くエフェクター機能であるＩｇＧ１．１に融合させた。
タンデム単鎖ＦｖＦｃの構築
単鎖ＦｖＰＣＲフラグメントを、２５ｍｅｒの（Ｇ４Ｓ）５リンカー中に内部オーバーラップ領域を有する可変重及び可変軽領域に１つずつ、オーバーラップしている２つのＰＣＲフラグメントによってそれぞれ構築する。
２つのＰＣＲフラグメントを各ｓｃＦｖに１つずつ作製し、以下の方法によってタンデムｓｃＦｖＦｃにアセンブルする：５’末端のｓｃＦｖは、マウス２６−１０ＶＨシグナル配列とオーバーラップしている、２つのｓｃＦｖ間にテザー領域を有するオリゴ配列を有する。３’ｓｃＦｖは、テザー及びＦｃ５融合相手とオーバーラップしているオリゴ配列を有する。各ｓｃＦｖフラグメントを、ＰＣＲによってアセンブルする。ｓｃＦｖフラグメントをタンデムｓｃＦｖにアセンブルし、酵母組換えによって下記の通りｐＺＭＰ３１−ｍｓ２６−１０ＶＨ−Ｆｃ５のＮｏｔＩ部位に挿入する。
ＰＣＲ増幅反応条件は、以下の通りである：１サイクル、９５℃、２分；３０サイクル、９５℃、１５秒、その後５５℃、３０秒、その後６８℃、１ｋｂにつき１分。ＰＣＲ反応混合物を１％アガロースゲル上に泳動し、予想される大きさに相当するＤＮＡフラグメントを、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｉｌｌｕｓｔｒａ ＧＦＸＴＭＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｄｏｍ）を使用してゲルから抽出する。
ｃＤＮＡを、酵母組換えによってタンデム単鎖ＦｖＦｃ（ｔａｓｃＦｖ−Ｆｃ）のためのベクターｐＺＭＰ３１−ｍｓ２６−１０ＶＨ−Ｆｃ５（配列番号６４８）中にクローニングする。ｃＤＮＡ挿入の間のＮｏｔＩ制限部位にマウス２６−１０ＶＨシグナル配列及びＦｃ５を付加することによって、ベクターｐＺＭＰ３１−ｍｓ２６−１０ＶＨ−Ｆｃ５をｐＺＭＰ３１（配列番号６４７）から得る。ｐＺＭＰ３１は、キメラＣＭＶエンハンサー／ＭＰＳＶプロモーター、ｃＤＮＡ挿入のための線状化のためのＥｃｏＲＩ部位、ポリオウイルス内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、ＤＨＦＲｃＤＮＡ、ＳＶ４０ターミネーター、Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、並びにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＵＲＡ３及びＣＥＮ−ＡＲＳ遺伝子を有する発現カセットを含有する哺乳動物発現ベクターである。このベクターは、ｐＺＭＰ２１（米国特許第７２６２０２５号）から得られる。
ゲル抽出されたＰＣＲフラグメントを用いた酵母における組換えの前に、ｐＺＭＰ３１−ｍｓ２６−１０ＶＨ−Ｆｃ５プラスミドをＮｏｔＩで消化する。１００μｌのエレクトロコンピテント酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＦ８３８−９Ｄ、ＵＲＡ−）を、約１２μｌのそれぞれゲル抽出されたＰＣＲフラグメント及び約１００ｎｇのＮｏｔＩ消化されたｐＺＭＰ３１−ｍｓ２６−１０ＶＨ−Ｆｃ５ベクターと混合する。混合物を０．２ｃｍエレクトロポレーションキュベットに移す。酵母／ＤＮＡ混合物に、０．７５ｋＶ（５ｋＶ／ｃｍ）、∞オーム、及び２５μＦの電源（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）の設定を使用して電気パルスをかける。６００μｌの１．２Ｍソルビトールをキュベットに添加し、酵母を２つのＵＲＡ−Ｄプレート上に３００μｌアリコートでプレーティングし、３０℃でインキュベートする。約７２時間後、単一プレートのＵｒａ＋酵母形質転換体を１ｍｌのＨ２Ｏ中に再懸濁し、軽くスピンして酵母細胞をペレット化する。細胞ペレットを、０．５ｍｌの溶解緩衝液（２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％ＳＤＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁する。５００μｌの溶解混合物を、２５０μｌの酸洗浄済みガラスビーズ及び３００μｌのフェノール−クロロホルムが入っているエッペンドルフチューブに添加し、３分間ボルテックスにかけ、エッペンドルフ遠心分離機において最大速度で５分間スピンする。３００μｌの水相を新しいチューブに移し、ＤＮＡを６００μｌのエタノールで沈殿させ、その後３０分間最高速度で遠心分離する。チューブをデカントし、ペレットを１ｍＬの７０％エタノールで洗浄する。チューブをデカントし、ＤＮＡペレットを１０μｌの水中に再懸濁する。
エレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞（ＤＨ１０Ｂ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）の形質転換を、１μｌの酵母ＤＮＡ調製物及び２０μｌのＥ．ｃｏｌｉ細胞を使用して行う。細胞に２．０ｋＶ、２５μＦ、及び４００オームで電気パルスをかける。エレクトロポレーション後、１ｍｌのＳＯＣ（２％Ｂａｃｔｏ（商標）Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）、０．５％酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、２０ｍＭ グルコース）を加え、細胞を、２つのＬＢ ＡＭＰプレート（ＬＢ液体培地（Ｌｅｎｎｏｘ）、１．８％Ｂａｃｔｏ（商標）Ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ）、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン）上に５０μｌ及び２００μｌアリコートでプレーティングする。
プラスミドを、各構築物について６個のＥ．ｃｏｌｉクローンから抽出し、配列解析にかけ、正しい配列を含有している１個のクローンをさらに使用するために選択した。大量のプラスミドＤＮＡは、市販のキット（ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して製造業者の使用説明書に従って単離する。
Ａ．ＢｉＡｂの構築
１．最初のＢｉＡｂパネル
単鎖ＦｖＰＣＲフラグメントを、２５ｍｅｒの（Ｇ４Ｓ）５リンカー中に内部オーバーラップ領域を有する可変重及び可変軽領域に１つずつ、オーバーラップしている２つのＰＣＲフラグメントによってそれぞれ構築した。
ａ．ＦａｂからＩｇＧへの変換
ｃ５９７Ｆａｂ配列を、プライマーｚｃ６０３７５（配列番号６４５）及びｚｃ６０３７６（配列番号６４６）を使用して以下の条件でＰＣＲによってｐＭＩＤディスプレイ構築物から増幅した：１サイクル、９５℃、２分；２５サイクル、９５℃、３０秒、その後５０℃、３０秒、その後６８℃、９０秒；１サイクル、６８℃、５分。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してＰＣＲ反応物を精製し、その後ＡｐａＬＩ及びＮｈｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、３７℃で一晩インキュベートした。消化反応物を１．２％アガロースゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して１．１ｋｂのＤＮＡフラグメントをゲルから抽出した。
フラグメントを、ホスファターゼ処理した（Ｐｒｏｍｅｇａ）ＡｐａＬＩ及びＮｈｅＩ切断ｐＲＨ１ａｚ（Ｄｙａｘ）中にＴ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）、１６℃で一晩のインキュベーション、その後６５℃で１０分間の熱不活性化を使用してライゲーションした。ライゲーション反応物をＮａＯＡｃ／エタノール沈殿させ、２０μｌのＨ２Ｏ中に再懸濁した。
５０μｌのＤＨ５αコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造業者のプロトコール通り熱ショックを介して４μｌのライゲーションによって形質転換し、次いで寒天プレート（２×ＹＴ、２％グルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）上にプレーティングして３７℃で一晩増殖させた。
プラスミドを、ＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用して単一コロニーから調製し、次いでＡｓｃＩ及びＭｆｅＩで連続して消化し、各消化物をその後ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットで精製した。６．９ｋｂのＤＮＡフラグメントをホスファターゼ処理し（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１．２％アガロースゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを使用してゲルから抽出した。
ＡｓｃＩ及びＭｆｅＩ（ＮＥＢ）を使用してｐＳｈｕｔｔｌｅ（Ｄｙａｘ）から事前に消化され、次いでＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットで精製されたこの中間ベクター及び６９２ｂｐのフラグメントを含有するライゲーション反応を、前述の通り行った。
ライゲーション反応物をＮａＯＡｃ／エタノール沈殿させ、２０μｌのＨ２Ｏ中に再懸濁した。
７５μｌのＤＨ５αコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造業者のプロトコール通り熱ショックを介して２μｌのライゲーションによって形質転換し、次いで寒天プレート（２×ＹＴ、２％グルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）上にプレーティングして３７℃で一晩増殖させた。
ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用して４個のコロニーからプラスミドを単離し、配列解析にかけた。正しい配列を含有している単一クローンを、大量のプラスミドＤＮＡ調製（ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ）のために選択した。
ｂ．Ｃ末端ｓｃＦｖの挿入
ｃ５９７．１免疫グロブリンガンマ１／ｐＲＨ１ａｚ（配列番号５３６及び配列番号５０９に示すオープンリーディングフレーム）プラスミドは抗ＰＤＧＦＲβ抗体を既に含有しており、重鎖の３’末端で線状化して抗ＶＥＧＦ−Ａ単鎖Ｆｖを挿入した：ｃ１１１１．１は配列番号４９５中に含有されており、ｃ８７０．１は配列番号４９７中に含有されており、ｃ１０９２．１は配列番号４９９中に含有されており、１０３９．１は配列番号５０１中に含有されており、ｃ８６８．１は配列番号５０３中に含有されており、ｃ１０８１．１は配列番号５０５中に含有されていた。２つのＰＣＲフラグメントを作製してカルボキシル末端ｓｃＦｖに付加し、オーバーラップＰＣＲにより一緒に結合させた。最初のＰＣＲは、免疫グロブリンガンマ１Ｆｃ領域においてＢｓｒＧＩ部位とオーバーラップした５’オリゴヌクレオチド、及び（Ｇ４Ｓ）２リンカーとオーバーラップした３’オリゴを使用した。第２のＰＣＲフラグメントは、（Ｇ４Ｓ）２リンカー領域でオーバーラップし、ｓｃＦｖフラグメントを含有する５’オリゴヌクレオチドを使用した。３’オリゴヌクレオチドは、ベクター骨格においてＢｃｌＩ部位とオーバーラップしていた。
ＰＣＲ増幅反応条件は、以下の通りであった：１サイクル、９５℃、２分；３０サイクル、９５℃、１５秒、その後５５℃、３０秒、その後６８℃、１ｋｂにつき１分。ＰＣＲ反応混合物を１％アガロースゲル上に泳動し、予想される大きさに相当するＤＮＡフラグメントを、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｉｌｌｕｓｔｒａ ＧＦＸＴＭＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｄｏｍ）を使用してゲルから抽出した。
オーバーラップＰＣＲによって作製したＰＣＲフラグメントを、ＢｓｒＧＩ及びＢｃｌＩで消化した。このフラグメントを、同じ酵素で事前に消化したｃ５９７．１免疫グロブリンガンマ１／ｐＲＨ１ａｚ（市販のＤｙａｘベクター骨格）中にＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用してライゲーションした。ライゲーションを１６℃で一晩インキュベートし、６５℃で１０分間熱処理した。
ケミカルコンピテントＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞（ＤＨ１０Ｂ−Ｔ１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）の形質転換を、１μｌのライゲーションしたＤＮＡ調製物及び２０μｌのＥ．ｃｏｌｉ細胞を使用して行った。細胞を製品マニュアルに従って形質転換し、次いで２つのＬＢ ＡＭＰプレート（ＬＢ液体培地（Ｌｅｎｎｏｘ）、１．８％Ｂａｃｔｏ（商標）Ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ）、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン）上に５０μｌ及び２００μｌアリコートでプレーティングした。
構築物１個につき４個のコロニーからプラスミドを調製し、配列解析にかけた。正しい配列を含有している少なくとも１個のクローンを、さらに使用するために選択した。大量のプラスミドＤＮＡは、市販のキット（ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して製造業者の使用説明書に従って単離した。
各ｂｉＡｂの構築のためのオリゴヌクレオチドプライマー及び鋳型を、表２２にまとめる。
２．第２のＢｉＡｂパネル
単鎖ＦｖＰＣＲフラグメントを、２５ｍｅｒの（Ｇ４Ｓ）５リンカー中に内部オーバーラップ領域を有する可変重及び可変軽領域に１つずつ、オーバーラップしている２つのＰＣＲフラグメントによってそれぞれ構築した。
ａ．ＦａｂからＩｇＧへの変換
ｃ５９７及びｃ６００Ｆａｂのそれぞれについて、Ｆａｂ配列を、プライマーｚｃ６０３７５（配列番号６４５）及びｚｃ６０３７６（配列番号６４６）を使用して以下の条件でＰＣＲによってｐＭＩＤディスプレイ構築物から増幅した：１サイクル、９５℃、２分；２５サイクル、９５℃、３０秒、その後５０℃、３０秒、その後６８℃、９０秒；１サイクル、６８℃、５分。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してＰＣＲ反応物を精製し、その後ＡｐａＬＩ及びＮｈｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、３７℃で一晩インキュベートした。消化反応物を１．２％アガロースゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して１．１ｋｂのＤＮＡフラグメントをゲルから抽出した。
フラグメントを、ホスファターゼ処理した（Ｐｒｏｍｅｇａ）ＡｐａＬＩ及びＮｈｅＩ切断ｐＲＨ１ａｚ（Ｄｙａｘ）中にＴ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）、１６℃で一晩のインキュベーション、その後６５℃で１０分間の熱不活性化を使用してライゲーションした。ライゲーション反応物をＮａＯＡｃ／エタノール沈殿させ、２０μｌのＨ２Ｏ中に再懸濁した。
５０μｌのＤＨ５αコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造業者のプロトコール通り熱ショックを介して４μｌのライゲーションによって形質転換し、次いで寒天プレート（２×ＹＴ、２％グルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）上にプレーティングして３７℃で一晩増殖させた。
プラスミドを、ＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用して単一コロニーから調製し、次いでＡｓｃＩ及びＭｆｅＩで連続して消化し、各消化物をその後ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットで精製した。６．９ｋｂのＤＮＡフラグメントをホスファターゼ処理し（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１．２％アガロースゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを使用してゲルから抽出した。
ＡｓｃＩ及びＭｆｅＩ（ＮＥＢ）を使用してｐＳｈｕｔｔｌｅ（Ｄｙａｘ）から事前に消化され、次いでＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットで精製されたこの中間ベクター及び６９２ｂｐのフラグメントを含有するライゲーション反応を、前述の通り行った。
ライゲーション反応物をＮａＯＡｃ／エタノール沈殿させ、２０μｌのＨ２Ｏ中に再懸濁した。
７５μｌのＤＨ５αコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造業者のプロトコール通り熱ショックを介して２μｌのライゲーションによって形質転換し、次いで寒天プレート（２×ＹＴ、２％グルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）上にプレーティングして３７℃で一晩増殖させた。
ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用して４個のコロニーからプラスミドを単離し、配列解析にかけた。正しい配列を含有している単一クローンを、大量のプラスミドＤＮＡ調製（ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ）のために選択した。
ｂ．Ｃ末端ｓｃＦｖの挿入
ｃ５９７．１免疫グロブリンガンマ１／ｐＲＨ１ａｚ（配列番号５３６及び配列番号５０９に示すオープンリーディングフレーム）又はｃ６００．１１免疫グロブリンガンマ１／ｐＲＨ１ａｚｐＲＨ１ａｚ（配列番号６１３及び配列番号６１５に示すオープンリーディングフレーム）プラスミドは抗ＰＤＧＦＲβ抗体を既に含んでおり、ＮｈｅＩ部位で重鎖の５’末端で線状化して抗ＶＥＧＦＡ単鎖Ｆｖを挿入した：ｃ８６８．１は配列番号６０７中に含有されており、ｃ８７０．１は配列番号６０９中に含有されており、１０３９．１は配列番号６１１中に含有されていた。２つのＰＣＲフラグメントを作製してカルボキシル末端ｓｃＦｖに付加し、オーバーラップＰＣＲにより一緒に結合させた。最初のＰＣＲは、免疫グロブリンガンマ１．１Ｆｃ領域（配列番号６４１）とするための免疫グロブリンガンマ１においてＮｈｅＩ部位とオーバーラップした５’オリゴヌクレオチド、及び（Ｇ４Ｓ）２リンカーとオーバーラップした３’オリゴを使用した。第２のＰＣＲフラグメントは、（Ｇ４Ｓ）２リンカー領域でオーバーラップし、ｓｃＦｖフラグメントを含有する５’オリゴヌクレオチドを使用した。３’オリゴヌクレオチドは、ベクター骨格においてＢｃｌＩ部位とオーバーラップしていた。ＰＣＲ増幅反応条件は、以下の通りであった：１サイクル、９５℃、２分；３０サイクル、９５℃、１５秒、その後５５℃、３０秒、その後６８℃、１ｋｂにつき１分。ＰＣＲ反応混合物を１％アガロースゲル上に泳動し、予想される大きさに相当するＤＮＡフラグメントを、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｉｌｌｕｓｔｒａ ＧＦＸＴＭＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｄｏｍ）を使用してゲルから抽出した。
オーバーラップＰＣＲによって作製したＰＣＲフラグメントを、ＮｈｅＩ及びＢｃｌＩで消化した。このフラグメントを、同じ酵素で事前に消化したｃ５９７．１免疫グロブリンガンマ１／ｐＲＨ１ａｚ又はｃ６００．１免疫グロブリンガンマ１／ｐＲＨ１ａｚ（市販のＤｙａｘベクター骨格）中にＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用してライゲーションした。ライゲーションを室温で１時間インキュベートし、６５℃で１０分間熱処理した。
ケミカルコンピテントトＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞（ＤＨ１０Ｂ−Ｔ１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）の形質転換を、１μｌのライゲーションしたＤＮＡ調製物及び２０μｌのＥ．ｃｏｌｉ細胞を使用して行った。細胞を製品マニュアルに従って形質転換し、次いで２つのＬＢ ＡＭＰプレート（ＬＢ液体培地（Ｌｅｎｎｏｘ）、１．８％Ｂａｃｔｏ（商標）Ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ）、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン）上に５０μｌ及び２００μｌアリコートでプレーティングした。
構築物１個につき４個のコロニーからプラスミドを調製し、配列解析にかけた。正しい配列を含有している少なくとも１個のクローンを、さらに使用するために選択した。大量のプラスミドＤＮＡは、市販のキット（ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して製造業者の使用説明書に従って単離した。
各ｂｉＡｂの構築のためのオリゴヌクレオチドプライマー及び鋳型を、表２３にまとめる。
Ｃ．二単鎖ＦｖＦｃ（ＢｉｓｃＦｖＦｖ）の構築
１．概要
単鎖ＦｖＰＣＲフラグメントを、２５ｍｅｒの（Ｇ４Ｓ）５リンカー中に内部オーバーラップ領域を有する可変重及び可変軽領域に１つずつ、オーバーラップしている２つのＰＣＲフラグメントによってそれぞれ構築した。
二単鎖ＦｖＦｃ（ｂｉｓｃＦｖＦｃ）分子のアセンブリのために、３つのＰＣＲフラグメントを作製した。ｓｃＦｖは、オリゴ設計を介して付加された、ベクターの５’非翻訳領域及びＦｃ領域とオーバーラップしたマウス２６−１０ＶＨシグナル配列を、５’末端に有していた。第２のＰＣＲフラグメントは、カルボキシル末端ｓｃＦｖをＦｃ領域に連結するリンカー配列とオーバーラップしたＦｃ５フラグメントからなっていた。３’ｓｃＦｖは、Ｆｃ及びポリオウイルスＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）のカルボキシル末端においてリンカー配列とオーバーラップしていた。
ＰＣＲ増幅反応条件は、以下の通りであった：１サイクル、９５℃、２分；３０サイクル、９５℃、１５秒、その後５５℃、３０秒、その後６８℃、１ｋｂにつき１分。ＰＣＲ反応混合物を１％アガロースゲル上に泳動し、予想される大きさに相当するＤＮＡフラグメントを、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｉｌｌｕｓｔｒａ ＧＦＸＴＭＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｄｏｍ）を使用してゲルから抽出した。
ｃＤＮＡを、酵母組換えによってベクターｐＺＭＰ３１中にクローニングした。ｐＺＭＰ３１は、キメラＣＭＶエンハンサー／ＭＰＳＶプロモーター、ｃＤＮＡ挿入のための線状化のためのＥｃｏＲＩ部位、ポリオウイルス内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、ＤＨＦＲｃＤＮＡ、ＳＶ４０ターミネーター、Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、並びにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＵＲＡ３及びＣＥＮ−ＡＲＳ遺伝子を有する発現カセットを含有する哺乳動物発現ベクターである。このベクターは、ｐＺＭＰ２１（米国特許第７２６２０２５号）から得られた。
ゲル抽出されたＰＣＲフラグメントを用いた酵母における組換えの前に、ｐＺＭＰ３１プラスミドをＥｃｏＲＩで消化した。１００μｌのエレクトロコンピテント酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＦ８３８−９Ｄ、ＵＲＡ−）を、約１２μｌのそれぞれゲル抽出されたＰＣＲフラグメント及び約１００ｎｇのＥｃｏＲＩ消化されたｐＺＭＰ３１と混合した。混合物を０．２ｃｍエレクトロポレーションキュベットに移した。酵母／ＤＮＡ混合物に、０．７５ｋＶ（５ｋＶ／ｃｍ）、∞オーム、及び２５μＦの電源（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）の設定を使用して電気パルスをかけた。６００μｌの１．２Ｍソルビトールをキュベットに添加し、酵母を２つのＵＲＡ−Ｄプレート上に３００μｌアリコートでプレーティングし、３０℃でインキュベートした。約７２時間後、単一プレートのＵｒａ＋酵母形質転換体を１ｍｌのＨ２Ｏ中に再懸濁し、軽くスピンして酵母細胞をペレット化した。細胞ペレットを、０．５ｍｌの溶解緩衝液（２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％ＳＤＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁した。５００μｌの溶解混合物を、２５０μｌの酸洗浄済みガラスビーズ及び３００μｌのフェノール−クロロホルムが入っているエッペンドルフチューブに添加し、３分間ボルテックスにかけ、エッペンドルフ遠心分離機において最大速度で５分間スピンした。３００μｌの水相を新しいチューブに移し、ＤＮＡを６００μｌのエタノールで沈殿させ、その後３０分間最高速度で遠心分離した。チューブをデカントし、ペレットを１ｍＬの７０％エタノールで洗浄した。チューブをデカントし、ＤＮＡペレットを１０μｌの水中に再懸濁した。
エレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞（ＤＨ１０Ｂ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）の形質転換を、１μｌの酵母ＤＮＡ調製物及び２０μｌのＥ．ｃｏｌｉ細胞を使用して行った。細胞に２．０ｋＶ、２５μＦ、及び４００オームで電気パルスをかけた。エレクトロポレーション後、１ｍｌのＳＯＣ（２％Ｂａｃｔｏ（商標）Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）、０．５％酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、２０ｍＭ グルコース）を加え、細胞を、２つのＬＢ ＡＭＰプレート（ＬＢ液体培地（Ｌｅｎｎｏｘ）、１．８％Ｂａｃｔｏ（商標）Ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ）、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン）上に５０μｌ及び２００μｌアリコートでプレーティングした。
プラスミドを、各構築物について６個のＥ．ｃｏｌｉクローンから抽出し、配列解析にかけ、正しい配列を含有している１個のクローンをさらに使用するために選択した。大量のプラスミドＤＮＡは、市販のキット（ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して製造業者の使用説明書に従って単離した。
２．ＢｉｓｃＦｖＦｃ ｃ９４１／ｃ８６８、ｃ９４１／ｃ８７０、９４１／ｃ１０３９、ｃ１０３５／ｃ８６８、ｃ１０３５／ｃ８７０、及びｃ１０３５／ｃ１０３９の構築
二単鎖ＦｖＦｃ（ｂｉｓｃＦｖＦｃ）分子のアセンブリのために、３つのＰＣＲフラグメントを作製した。ｓｃＦｖは、配列番号６０３中に含有されているｃ９４１．１又は配列番号６０５中に含有されているｃ１０３５．１であり、オリゴ設計を介して付加された、ベクターの５’非翻訳領域及びＦｃ領域とオーバーラップしたマウス２６−１０ＶＨシグナル配列を５’末端に有していた。第２のＰＣＲフラグメントは、カルボキシル末端ｓｃＦｖをＦｃ領域に連結するリンカー配列とオーバーラップしたＦｃ５フラグメントからなっていた。３’ｓｃＦｖは、配列番号６０７中に含有されているｃ８６８．１、配列番号６０９中に含有されているｃ８７０．１、又は配列番号６１１中に含有されている１０３９．１であり、Ｆｃ及びポリオウイルスＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）のカルボキシル末端においてリンカー配列とオーバーラップしていた。各ｂｉｓｃＦｖＦｃの構築のためのオリゴヌクレオチドプライマー及び鋳型を、表２４にまとめる。
（実施例３０）
ｔａｓｃＦｖ及びｂｉｓｃＦｖ分子の発現
ｔａｓｃ又はｂｉｓｃ構築物の４個の複製物の１００μｇアリコートを、１００単位のＰｖｕＩで３７℃で３時間消化し、ＩＰＡで沈殿させ、１．５ｍＬ微量遠心チューブにおいてスピンダウンする。上清を各ペレットからデカントで除去し、１ｍＬの７０％エタノールを加え、次いで室温で５分間インキュベートさせる。チューブを微量遠心機において５分間１４０００ＲＰＭでスピンし、上清をペレットからデカントで除去する。各ペレットを無菌環境で５００μｌのＺＦ１培地中に再懸濁し、３０分間室温でインキュベートさせる。複製物当たり５Ｅ６〜１Ｅ７ ５×ＳＡ細胞を４個のチューブのそれぞれにおいてスピンダウンし、ＤＮＡ−培地溶液を使用して再懸濁する。各ＤＮＡ／細胞混合物を０．４ｃｍギャップのキュベット中に入れ、以下のパラメーターを使用してエレクトロポレーションをする：９５０μＦ、高キャパシタンス、及び３００Ｖ。キュベットの内容物を除去し、プールし、２５ｍＬのＺＦ１培地の入った１２５ｍＬ振とうフラスコ中に希釈する。フラスコを、１２０ＲＰＭで撹拌しながら振とう機上の３７℃、６％ＣＯ２のインキュベーター中に入れる。細胞株を次いでメトトレキサート（ＭＴＸ）選択にかけ、大量に拡大増殖させる。
各分子の産生は、選択した細胞株を１５００ｍＬのＺＦ１培地において４Ｅ５細胞／ｍＬで３Ｌスピナーフラスコ中に接種することによって達成される。スピナーを８５ＲＰＭで１２０時間３７℃及び６％ＣＯ２でスピンして回収し、１．２μｍ及び０．２μｍフィルターでろ過し、精製に供給する。
（実施例３１）
ｂｉＡｂ分子の発現
ｂｉＡｂ構築物の対の５０μｇの重鎖プラスミド及び５０μｇの軽鎖プラスミドからなるｂｉａｂＤＮＡの４個の複製物の１００μｇアリコートを、１００単位のＰｖｕＩで３７℃で３時間消化し、ＩＰＡで沈殿させ、１．５ｍＬ微量遠心チューブにおいてスピンダウンする。各ペレットの上清をデカントし、１ｍＬの７０％エタノールを加え、次いで室温で５分間インキュベートさせる。チューブを微量遠心機において５分間１４０００ＲＰＭでスピンし、上清をペレットからデカントで除去する。各ペレットを無菌環境で５００μｌのＺＦ１培地中に再懸濁し、３０分間室温でインキュベートさせる。複製物当たり５×１０６〜１×１０７ ５×ＳＡ細胞を４個のチューブのそれぞれにおいてスピンダウンし、ＤＮＡ−培地溶液を使用して再懸濁する。各ＤＮＡ／細胞混合物を０．４ｃｍギャップのキュベット中に入れ、以下のパラメーターを使用してエレクトロポレーションをする：９５０μＦ、高キャパシタンス、及び３００Ｖ。キュベットの内容物を除去し、プールし、２５ｍＬのＺＦ１培地の入った１２５ｍＬ振とうフラスコ中に希釈する。フラスコを、１２０ＲＰＭで撹拌しながら振とう機上の３７℃、６％ＣＯ２のインキュベーター中に入れる。細胞株を次いでメトトレキサート（ＭＴＸ）選択にかけ、大量に拡大増殖させる。
ｂｉａｂの産生は、選択した細胞株を１５００ｍＬのＺＦ１培地において４×１０５細胞／ｍＬで３Ｌスピナーフラスコ中に接種することによって達成される。スピナーを８５ＲＰＭで１２０時間３７℃及び６％ＣＯ２でスピンして回収し、１．２μｍ及び０．２μｍフィルターでろ過し、精製に供給する。
（実施例３２）
２９３細胞由来の二重特異性抗ＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦタンデム単鎖Ｆｖ−Ｆｃ５融合タンパク質の精製
組換え二重特異性タンデム単鎖Ｆｖ−Ｆｃ５融合タンパク質は、標的を＞２ｍｇ／Ｌで発現するトランスフェクトした２９３細胞から産生される。２９３トランスフェクションは、当技術分野において公知の方法を使用して行う。馴化培地を回収し、０．２μｍフィルターを使用して滅菌ろ過し、ｐＨ７．４に調整する。タンパク質を、ＰＯＲＯＳ（登録商標）Ａ５０Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ親和性クロマトグラフィー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）とＳｕｐｅｒｄｅｘ２００サイズ排除クロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）の組合せを使用してろ過した培地から精製する。４ｍｌのＰＯＲＯＳ（登録商標）Ａ５０カラム（１０ｍｍ×５０ｍｍ）を３カラム容量（ＣＶ）の２５ｍＭクエン酸−リン酸（１．６１ｍＭクエン酸ナトリウム−２３．４ｍＭリン酸ナトリウム）、２５０ｍＭ 硫酸アンモニウムｐＨ３緩衝液で予備溶出し、２０ＣＶの２５ｍＭクエン酸−リン酸、２５０ｍＭ硫酸アンモニウムｐＨ７．４で平衡化する。４℃で１５００ｃｍ／時間でカラムに直接ロードすると、馴化培地中の融合タンパク質を捕捉する。ローディングが完了した後、カラムを１０ＣＶの２５ｍＭクエン酸−リン酸、２５０ｍＭ硫酸アンモニウムｐＨ７．４緩衝液で洗浄し、その後、結合タンパク質を１５００ｃｍ／時間で、クエン酸−リン酸−硫酸アンモニウム緩衝液を使用して形成される５ＣＶのｐＨ７．４〜ｐＨ３の勾配で溶出した。各２．０ｍｌの画分を、２００μｌの２．０Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０の入ったチューブに集め、溶出したタンパク質を中和するためにただちに混合する。Ａ２８０及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づいて画分をプールする。
標的を含有するプールを、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ ３０Ｋ ＮＷＭＬ遠心分離デバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、限外ろ過によって、適切なサイズのＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムの＜３％の量まで濃縮する。濃縮物を２５ｍＭヒスチジン、１２５ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ６．８において平衡化したサイズ排除カラムに注入し、３０ｃｍ／時間でアイソクラティックに溶出する。精製された標的を含有する画分を、Ａ２８０及びＳＤＳ ＰＡＧＥに基づいてプールし、０．２μｍフィルターでろ過し、アリコートとして−８０℃で凍結する。最終精製タンパク質の濃度を、２８０ｎＭにおけるＵＶ吸収によって決定する。
精製タンデムｓｃＦｖ−Ｆｃ５融合タンパク質の解析
組換えタンパク質を、タンパク質の０．１％Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｒ２５０染色を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％ＢｉｓＴｒｉｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）及び抗ＩｇＧ−ＨＲＰでの免疫ブロット法によって解析する。精製タンパク質を電気泳動し、ｉＢｌｏｔ（商標）Ｄｒｙ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用してニトロセルロース（０．２μｍ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に移す。フィルターを次いで、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％Ｉｇｅｐａｌ（ＴＢＳ）において１０％脱脂粉乳で室温で１５分間ブロックする。ニトロセルロースを素早くすすぎ、ＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（１：１００００）を加える。ブロットを穏やかに振とうしながら４℃で一晩インキュベートする。インキュベーション後、ブロットをＴＢＳ中で各１０分間、３回洗浄し、次いでＨ２Ｏ中で素早くすすぐ。市販の化学発光基質試薬（Ｐｉｅｒｃｅ ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ）を使用してブロットを発色させ、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ装置及びソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用してシグナルを捕捉する。
（実施例３３）
ＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの抗血管新生活性について試験するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
ＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦＡアンタゴニストの遊走阻害を測定するための内皮細胞遊走アッセイ
ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ＃３５４１４３Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ２４ウェルインサートプレートに、Ｌｏｎｚａ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｎｃ．、ＭＥから購入したサブコンフルエントな低継代数のＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）を播種する。播種密度は、ＤＭＥＭ＋ＨＥＰＥＳ緩衝液及び０．１％ＢＳＡ培地中２５０μｌ量において１０００００細胞／インサートである。すべての試験及び対照試料を３連で行う。細胞を上部インサートに添加後、プレートのウェルを７５０μｌ量の試験溶液及び対照で満たす。陽性対照は１０％ウシ胎仔血清及び０．１〜５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）である。陰性対照はＤＭＥＭ＋ＨＥＰＥＳ緩衝液及び０．１％ＢＳＡである。試験試料は、同様の濃度のＶＥＧＦＡ＋様々な濃度のＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦＡアンタゴニストからなる。ＶＥＧＦＡ試料（＋／−ＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦＡアンタゴニスト）は、低濃度のＦＢＳで作製されてもよい。インサートプレートを３７℃、５％ＣＯ２で２１〜２３時間インキュベートする。遊走したＨＵＶＥＣを、カルセイン、ＡＭ蛍光色素（＃Ｃ３１００ＭＰ）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で標識することによって測定する。カルセインＡＭを、加温した３７℃のＨａｎｋｓ Ｂａｓｉｃ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎにおいて４μｇ／ｍｌの濃度に希釈する。希釈した色素を、新しい２４ウェルプレートの各ウェルに５００μｌ／ウェルで添加する。細胞の入っている内側インサートをもとのプレートから取り出し、インサートの下面に接着している遊走細胞を傷つけないように注意しながら内容物を流しの中に振り落とす。インサートを次いでカルセイン色素を含有するウェル中に入れ、プレート全体を３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに９０分間戻す。Ｃｙｔｏｆｌｏｕｒ４０００（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を使用して４８５／５３０ｎｍの励起／発光波長で、蛍光測定値を底面から読み取る。データは相対蛍光単位（ＲＦＵ）、又は対照に対する遊走倍率として表す。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養発芽アッセイにおけるＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストによる内皮及び周皮細胞増殖の阻害
Ａ．要約
ＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性アンタゴニストの有効性を試験するために、内皮細胞及び周皮細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養系を記述されている通り樹立した（Ｄａｒｌａｎｄら、Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２６４巻（２００３年）、２７５頁）。この共培養において、Ｃｙｔｏｄｅｘビーズ上にコートしたＨＵＶＥＣを、フィブリンゲルにおいてＥＧＭ−２完全培地及びＤ５５１線維芽細胞馴化培地の存在下でヒト間葉系幹細胞（Ｌｏｎｚｏ）と共培養する。実験の開始時又は実験の７日目に、０．１〜５０ｎＭの対照アンタゴニスト、ＰＤＧＦＲβアンタゴニスト、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニスト又はＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを培養物に添加する。細胞を、アンタゴニストの添加後８日目にＰＦＡを使用して固定する。細胞を次いで、それぞれ周皮細胞及び内皮細胞を特定するための抗平滑筋細胞アクチン（ａＳＭＡ）又は抗ＰＥＣＡＭ抗体を使用してＩＨＣによって染色する。対照アンタゴニスト処理したウェルにおいて、これらの細胞は、周皮細胞のコートによって保護された内皮細胞の芽を形成する。ＶＥＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦＲβ、又はＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストで処理した細胞において、発芽数及び発芽長は減少し、アンタゴニストはこのｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養モデルにおいて有効性を示すことを示唆する。ＰＤＧＦＲβ又はＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの有効性は、内皮細胞からの周皮細胞の解離によってさらに実証することもできる。
Ｂ．試験設計
１日目に、Ｃｙｔｏｄｅｘ−３ビーズをＨＵＶＥＣでコートし、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。２日目に、ＨＵＶＥＣビーズ（２００ビーズ／ウェル）を２４ウェルプレートのウェルにおいてヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）（４００００細胞／ウェル）とともにフィブリンゲルに埋め込む。ＥＧＭ−２完全培地及びＤ５５１線維芽細胞培地の１：１混合物を、２ｎｇ／ｍｌのＨＧＦと一緒にこれらの細胞に加える。実験の終了まで２日毎に培地を交換する。アンタゴニストを、２日目（共培養の開始から）又は７日目（共培養形成後）に培養物に加える。アンタゴニスト添加の６日後に細胞を４％ＰＦＡ中で一晩固定する。細胞を、抗ＰＥＣＡＭ又は抗ＳＭＡ抗体、続いて二次抗体（蛍光コンジュゲート）で染色する。次いで細胞を顕微鏡によって観察し、１０ビーズ／ウェルの代表的な組について発芽の数及び長さを手作業で計数する。次いでウェルについての平均を計算する。
対照アンタゴニスト処理したウェルにおいて、これらの細胞は、周皮細胞のコートによって保護された内皮細胞の芽を形成する。ＶＥＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦＲβ、又はＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストで処理した細胞において、発芽数及び発芽長は減少し、アンタゴニストはこのｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養モデルにおいて有効性を示すことを示唆する。ＰＤＧＦＲβ又はＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの有効性は、内皮細胞からの周皮細胞の解離によって示すこともできる。
（実施例３４）
ｉｎ ｖｉｖｏでＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを評価するための漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイ
３日齢の白色レグホン受精卵を割り、無傷の卵黄を有するニワトリ胚を２０×１００ｍｍプラスチックシャーレに注意深く置く。３７℃で３％ＣＯ２において６日間のインキュベーション後、ナイロンメッシュ（３×３ｍｍ）上で乾燥した、少なくとも２つのＰＤＧＦ／ＶＥＧＦ分子（ＶＥＧＦ−Ａ及びＰＤＧＦ−ＢＢなど）並びに対照モノクローナル抗体又は二重特異性抗体物質、及び／又は可溶性ＶＥＧＦＲ複合体を含有するメチルセルロースのディスクを、個々の胚のＣＡＭに植え込み、血管発生に対する二重特異性抗体の影響及び血管形成を阻害するためのその潜在的な用途を決定する。ナイロンメッシュディスクを、１０マイクロリットルの０．４５％メチルセルロース（Ｈ２Ｏ中）の乾燥によって作製する。４〜５日間のインキュベーション後、胚及びＣＡＭを、植え込んだディスクの範囲における新生血管及びリンパ管の形成について立体鏡によって調べる。ＰＢＳを含有するメチルセルロースのディスクを陰性対照として使用する。血管及びリンパ管細胞表面分子の両方を認識する抗体を使用して、これらの管をさらに特徴付ける。対照モノクローナル抗体に対する二重特異性抗体組成物の存在下での新生血管増殖の阻害は、血管新生関連障害の治療のための二重特異性抗体組成物の有効性を示す。
（実施例３５）
ｉｎ ｖｉｖｏでＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを評価するための角膜アッセイ
改良型ｖｏｎ Ｇｒａｅｆｅ白内障ナイフを用いて、雄の５〜６週齢Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス又は雌のニュージーランドシロウサギの両眼に角膜マイクロポケットを作る。スクロース硫酸アルミニウム（Ｂｕｋｈ Ｍｅｄｉｔｅｃ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）のマイクロペレット（０．３５×０．３５ｍｍ）を、様々な濃度の２つ以上のＰＤＧＦ−ＢＢ／ＶＥＧＦ−Ａを、単独で又はｉ）脈管増殖を調節することが公知の因子（例えば、８０ｎｇのＦＧＦ−２）；ｉｉ）増殖因子のうちの１つに特異的なモノクローナル抗体；又はｉｉｉ）二重特異性抗体組成物と組み合わせて含有するヒドロンポリマータイプＮＣＣ（ＩＦＮ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）でコートする。ペレットを角膜縁から０．６〜０．８ｍｍに配置する。移植後、エリスロマイシン／眼軟膏を眼に塗布する。細隙灯生体顕微鏡によって３〜１２日間にわたって眼を調べる。円周方向の新生血管形生の管の長さ及びクロックアワー並びにリンパ管新生を測定する。さらに、眼を切片に切断し、血管及び／又はリンパ管マーカーＬＹＶＥ−１（Ｐｒｅｖｏら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２７６巻：１９４２０〜１９４３０頁、２００１年）、ポドプラニン（Ｂｒｅｉｔｅｎｅｄｅｒ−Ｇｅｌｅｆｆら、Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．１５４巻：３８５〜９４頁、１９９９年）に対して免疫染色して、影響を受けた脈管をさらに特徴付ける。対照抗体に対する二重特異性抗体組成物の存在下での脈管増殖の阻害は、血管新生関連障害の治療のための二重特異性抗体組成物の有効性を示す。
（実施例３６）
腫瘍増殖に対するＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの有効性を評価するためのＡ６７３横紋筋肉腫モデル
要約
マウスにおける腫瘍増殖に対してＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性アンタゴニストが活性を有するかどうかを試験するために、マウス群にＡ６７３横紋筋肉腫腫瘍を０日目に皮下注入する。腫瘍が１５０〜２００ｍｍ３まで増殖すれば、マウス群（ｎ＝１０／ｇｐ）マウスに次いで１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／Ｋｇの対照試薬、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニスト、ＰＤＧＦＲβアンタゴニスト又はＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを１回〜３回／週、３週間注入する。腫瘍体積を３回／週、５週間モニターする。対照試薬を注入したマウスと比較して、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニスト、ＰＤＧＦＲβアンタゴニスト、又はＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを注入したマウスにおいて顕著に小さい腫瘍は、腫瘍増殖の阻害に対するアンタゴニストの有効性を示す。ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニスト又はＰＤＧＦＲβアンタゴニスト単独による個々の処理についてのＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの有効性もまた評価することができる。
試験設計
８〜１０週齢の雌Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の右脇腹に２×１０６個のＡ６７３細胞を０日目に皮下注入する。１５０〜２００ｍｍ３の腫瘍の大きさから開始して、マウス群（ｎ＝１０／群）に１ｍｇ／Ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇの対照試薬、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニスト、ＰＤＧＦＲβアンタゴニスト又はＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを１回〜３回／週、３週間腹腔内注入する。腫瘍増殖を３回／週、５週間、カリパス測定を使用してモニターする。式１／２＊（Ｂ）２＊Ｌ（ｍｍ３）を使用して腫瘍体積を計算する。
（実施例３７）
腫瘍増殖に対するＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの有効性を評価するためのＢｘＰＣ３膵臓癌モデル
要約
マウスにおける腫瘍増殖に対してＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性アンタゴニストが活性を有するかどうかを試験するために、マウス群にＢｘＰＣ３膵臓腫瘍を０日目に皮下注入する。腫瘍が１５０〜２００ｍｍ３まで増殖すれば、マウス群（ｎ＝１０／ｇｐ）マウスに次いで１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／Ｋｇの対照試薬、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニスト、ＰＤＧＦＲβアンタゴニスト又はＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを１回〜３回／週、３週間注入する。腫瘍体積を３回／週、５週間モニターする。対照試薬を注入したマウスと比較して、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニスト、ＰＤＧＦＲβアンタゴニスト、又はＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを注入したマウスにおいて顕著に小さい腫瘍は、腫瘍増殖の阻害に対するアンタゴニストの有効性を示す。ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニスト又はＰＤＧＦＲβアンタゴニスト単独による個々の処理についてのＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの有効性もまた評価することができる。
試験設計
８〜１０週齢の雌Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の右脇腹に２×１０６個のＢｘＰＣ−３細胞を０日目に皮下注入する。１５０〜２００ｍｍ３の腫瘍の大きさから開始して、マウス群（ｎ＝１０／群）に１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／Ｋｇの対照試薬、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニスト、ＰＤＧＦＲβアンタゴニスト又はＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを１回〜３回／週、３週間腹腔内注入する。腫瘍増殖を３回／週、５週間、カリパス測定を使用してモニターする。式１／２＊（Ｂ）２＊Ｌ（ｍｍ３）を使用して腫瘍体積を計算する。
（実施例３８）
ＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの有効性を評価するための眼疾患の角膜新生血管形生（角膜ＮＴ）モデル
角膜新生血管形生は、眼における異常な脈管増殖の明瞭な視覚化を可能にする、広範に使用される動物モデルである。成長して通常血管のない角膜になる脈管は、うまく樹立することができ、これは血管退縮を研究するのに魅力的なモデルである。この実施例では、角膜新生血管形生モデルを使用してＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの有効性を実証する。実験用角膜ＮＶを誘導するために、雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（１８〜２０ｇ；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）に、筋肉内塩酸ケタミン（２５ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔をかける。ＮａＯＨ（２μｌの０．２ｍＭ）を局所的に適用する。角膜及び角膜縁上皮を、＃２１刃（フェザー、大阪、日本）を使用して縁に平行な回転運動を加えることによって除去する。７日又は１０日（退縮モデル）後、マウスを１〜２５ｍｇ／ｋｇの対照試薬、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニスト、ＰＤＧＦＲβアンタゴニスト、又はＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性アンタゴニストの腹腔内注入で処理する。角膜ＮＶ誘導後１４日目又は２０日目（退縮モデル）に、塩酸キシラジン及び塩酸ケタミンで深く麻酔をかけている間にマウスに２０μｇ／ｇのフルオレセインイソチオシアネート結合コンカナバリンＡレクチン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、Ｃａｌｉｆ．）を静脈内投与する。３０分後、マウスの眼を摘出し、角膜を平板スライドにする。角膜ＮＶを蛍光顕微鏡を使用して視覚化し、Ｏｐｅｎｌａｂソフトウェアを使用して定量する。血管に覆われている角膜の割合を、全角膜面積の百分率として計算する。結果は、対照試薬に対する、又はＰＤＧＦＲβ若しくはＶＥＧＦ−Ａアンタゴニスト単独による個々の処理についてのＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの有効性を実証する。
（実施例３９）
加齢性黄班変性（ＡＭＤ）に対するＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの有効性を評価するための眼疾患の角膜新生血管形生（角膜ＮＴ）モデル
実験用ＣＮＶは、加齢性黄班変性（ＡＭＤ）のためのモデルとしてしばしば使用される。このモデルでは、脈絡膜の血管はブルッフ膜の切れ目から網膜中に成長し、ＡＭＤ患者において観察されるものに類似している。実験用ＣＮＶを誘導するために、雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（１８〜２０ｇ；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）に、筋肉内塩酸ケタミン（２５ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔をかけ、１％トロピカミドで瞳孔を広げる。ダイオードレーザー光凝固術（７５μｍスポットサイズ、０．１秒間、９０ｍＷ、Ｏｃｕｌｉｇｈｔ ＳＬ ｌａｓｅｒ、ＩＲＩＤＥＸ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．）及びコンタクトレンズとして手で持ったカバースライドを使用して４つの熱傷を作製する。熱傷は、網膜の後極の３、６、９、及び１２時の位置に集中した。レーザー時の気泡の発生はブルッフ膜の破裂を示し、脈絡膜の新生血管形生の獲得において重要な因子であり、そのため４つすべての熱傷について気泡が発生したマウスのみを試験に含める。７日又は１４日（退縮モデル）後、マウスを１〜２５ｍｇ／ｋｇの対照試薬、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニスト、ＰＤＧＦＲβアンタゴニスト、又はＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性アンタゴニストの腹腔内注入で１日２回、毎日処理する。７日又は１４日間（退縮モデル）の処理後、ＰＥＣＡＭで染色した平板スライド脈絡膜において脈絡膜ＮＶ病変の面積を測定する。平板スライドを蛍光顕微鏡によって調べ、Ｏｐｅｎｌａｂソフトウェアを使用して定量する。対照試薬に対するＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストで処理した眼におけるＣＮＶ面積の減少は、二重特異性アンタゴニストが新生血管形生の強力な阻害剤であることを示す。ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニスト又はＰＤＧＦＲβアンタゴニスト単独に対してＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストで処理した眼におけるＣＮＶ面積の減少は、個々の処理についてのＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの有効性を示す。
（実施例４０）
抗ｈｕ−ＰＤＧＦ受容体βアンタゴニストの特徴付け
ヒトＰＤＧＦＲ−βに対してどのＰＤＧＦＲ−βアンタゴニスト（ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｈｕＩｇＧ、ｍｓＩｇＧ）が同時に結合することができるかを決定するために、エピトープビニング実験を行った。抗原上の同じ、又はオーバーラップしている結合部位（エピトープ）について競合するＰＤＧＦＲ−βアンタゴニストは同時に結合することができず、１つのファミリー又は「エピトープビン」に機能的に分類される。抗原上の同じ結合部位について競合しないＰＤＧＦＲ−βアンタゴニストは同時に結合することができ、別々のファミリー又はエピトープビンに分類される。Ｂｉａｃｏｒｅ３０００（商標）装置を使用して実験を行った。Ｂｉａｃｏｒｅは、抗体フラグメント及びモノクローナル抗体のパネルをエピトープビンに割り当てるために日常的に使用される様々なアッセイ形式の唯一のものである。多くの参考文献（例えば、Ｔｈｅ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、６，６巻 Ｇｌｅｎｎ Ｅ． Ｍｏｒｒｉｓ編）が、抗体フラグメントを「ビニングする」ために使用することができ、ＰＤＧＦＲ−βＦｃ５に対するＰＤＧＦＲ−βアンタゴニストの結合特性に関する比較データを提供することが期待されるであろう代替方法を記述している。ＰＤＧＦＲβ−Ｆｃ５（配列番号４８６）を用いてエピトープビニング実験を行った。
材料及び方法
Ｂｉａｃｏｒｅ３０００（登録商標）システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）においてエピトープビニング試験を行った。Ｂｉａｃｏｒｅ３０００（登録商標）Ｃｏｎｔｒｏｌソフトウェアｖ．３．２を使用して方法をプログラムした。ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ−ガンマ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を、アミンカップリング化学反応（ＥＤＣ：ＮＨＳ）を使用して８０００ＲＵの密度までＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＣＭ５センサーチップに共有結合で固定化した。固定化手順の後、フローセル上の活性部位をエタノールアミンでブロックした。非特異的結合タンパク質を、５０ｍＭ ＮａＯＨでの洗浄によって除去した。ＰＤＧＦＲβ−Ｆｃ５抗原及びＰＤＧＦＲ−βアンタゴニストを５μｇ／ｍｌまで希釈した。
ＰＤＧＦＲ−βＦｃ５を、約２５０ＲＵで抗ヒトＦｃ表面上に捕捉した。これに続いてチップ上の空いているＦｃ結合部位を、全ｈｕ−ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を使用してブロッキングした。一次ＰＤＧＦＲ−βアンタゴニストを２０μｌ／分で１２０秒間注入し、飽和レベルで捕捉されたＰＤＧＦＲβ−Ｆｃ５に特異的に結合させた。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）装置は、センサーチップに結合したタンパク質の質量を測定し、ＰＤＧＦＲβ−Ｆｃ５及び一次ビニング候補の両方の結合を各サイクルについて検証することができる。一次ＰＤＧＦＲ−βアンタゴニストの結合に続いて、二次ＰＤＧＦＲ−βアンタゴニストを注入し、抗ヒトＦｃ表面上に捕捉されているＰＤＧＦＲ−βＦｃ５に結合させた。
すべての結合実験を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ ０．０５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、０．０１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４の緩衝液において２５℃で行った。機器のノイズ及びドリフトの差し引きを考慮して、緩衝液注入も行った。サイクルの間に、フローセルを１０ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ、ｐＨ１．７５で洗浄して結合したＰＤＧＦＲβＦｃ５を除去した。Ｂｉａｃｏｒｅ３０００（商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用してデータをコンパイルした。
実験結果を以下の通り解釈した。二次ＰＤＧＦＲ−βアンタゴニストが一次アンタゴニストと同時にＰＤＧＦＲ−β−Ｆｃ５抗原に結合することができなかった場合、１つのファミリー又はエピトープビンに機能的に分類した。しかしながら、チップ表面上の質量の増加を示すことによって二次ＰＤＧＦＲ−βアンタゴニストが一次アンタゴニストと同時に抗原に結合することができた場合、別々のファミリー又はエピトープビンに分類した。各ＰＤＧＦＲ−βアンタゴニストを陰性対照としてそれ自体に対して試験して、バックグラウンド（結合なし）シグナルのレベルを確立した。
結果
精製したＰＤＧＦＲ−βアンタゴニストを特徴付け、エピトープビンに割り当てた（表２５参照）。Ｂｉａｃｏｒｅによって報告されるシグナル（ＲＵ、応答単位）は、センサーチップ表面上の質量と直接相関している。いったん陰性対照と関連するバックグラウンドシグナルのレベル（ＲＵ）を確立（一次及び二次アンタゴニストとして同じＰＤＧＦＲ−βアンタゴニストを使用）したら、ビニング結果を陽性又は陰性結合として報告した。陽性結合は、２つの異なるＰＤＧＦＲ−βアンタゴニストが同時に抗原に結合することができることを示す。陰性結合は、２つの異なるＰＤＧＦＲ−βアンタゴニストが同時に抗原に結合することができないことを示す。
この実験における陽性及び陰性応答値の間の差は顕著であり、８個の精製ＰＤＧＦＲ−βアンタゴニストの２つの異なるファミリー又はエピトープビンへの明確な割り当てを可能にした。第１のエピトープビンには、クローンｃ９４１．１、ｃ１０３５、ｃ９５１．１、ｃ９７５．１（すべてｓｃＦｖ）、ｃ５９７．１（Ｆａｂ）、ｃ６００．１（ｈＩｇＧ）によって産生されるＰＤＧＦＲ−βアンタゴニスト、及びマウス抗ヒトＰＤＧＦＲ−βモノクローナル抗体１６３．３．１．１．１が相当する。第２のビンには、マウス抗ヒトＰＤＧＦＲ−βモノクローナル抗体１６２．６．２．６．２が相当する。加えて、ＰＤＧＦＲ−βアンタゴニストｃ１０３５．１はビン＃１とビン＃２の間でオーバーラップすることが分かった。
（実施例４１）
ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストのエピトープビニング
ヒトＶＥＧＦ−Ａに対してどのＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが同時に結合することができるかを決定するために、エピトープビニング実験を行った。抗原上の同じ、又はオーバーラップしている結合部位（エピトープ）について競合するＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは同時に結合することができず、１つのファミリー又は「エピトープビン」に機能的に分類される。抗原上の同じ結合部位について競合しないＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは同時に結合することができ、別々のファミリー又はエピトープビンに分類される。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（商標）装置を使用して実験を行った。Ｂｉａｃｏｒｅは、抗体フラグメント及びモノクローナル抗体のパネルをエピトープビンに割り当てるために日常的に使用される様々なアッセイ形式の唯一のものである。多くの参考文献（例えば、Ｔｈｅ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、６，６巻 Ｇｌｅｎｎ Ｅ． Ｍｏｒｒｉｓ編）が、抗体フラグメントを「ビニングする」ために使用することができ、ヒトＶＥＧＦ−Ａに対するＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの結合特性に関する比較データを提供することが期待されるであろう代替方法を記述している。可溶性の天然ヒトＶＥＧＦＡを抗原として用いてエピトープビニング実験を行った。
材料及び方法
ＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ１００（商標）システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）において２つの別々のエピトープビニング実験を行った。両方の実験において、一次ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを、アミンカップリング化学反応（ＥＤＣ：ＮＨＳ）を使用して約８００〜１０００ＲＵの密度までＣＭ５センサーチップ上に共有結合で固定化した。固定化手順の後、フローセル上に残存する活性部位をエタノールアミンでブロックした。非特異的結合タンパク質を、５０ｍＭ ＮａＯＨでの洗浄によって除去した。参照セルも活性化し、次いでＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを含まないエタノールアミンでブロックした。
第１の組の実験において、二次ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニスト及びＶＥＧＦ−Ａ抗原を１００ｎＭまで希釈した。ＶＥＧＦ−Ａ抗原を注入し、センサーチップ上に固定化されたＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストに特異的に結合させた。ＶＥＧＦ−Ａは二量体であり、したがって１つのＶＥＧＦ−Ａアンタゴニスト毎に２つの潜在的な結合部位が存在する。すべての結合部位が占有されていることを確認するために、事前に固定化された一次ＶＥＧＦ−ＡアンタゴニストをＶＥＧＦ−Ａ上に注入した。このステップに続いて、二次ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを注入してＶＥＧＦ−Ａへの同時結合を観察した。
ビニング実験の第２の組において、一次ＶＥＧＦ−ＡアンタゴニストをＢＩＡＣＯＲＥ ＣＭ５センサーチップの別々のフローセルに再度共有結合で固定化した。しかしながらこの実験では、１０ｎＭのＶＥＧＦ−Ａ抗原を１ｍＭの二次ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストと予め混合し、次いで固定化された一次ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニスト上に競合形式で注入した。
すべての結合実験を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ ０．０５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４の緩衝液において２５℃で行った。機器のノイズ及びドリフトの差し引きを考慮して、緩衝液注入も行った。サイクルの間に、５０μｌ／分で１０ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ、ｐＨ１．５の６０秒の注入によって各注入サイクルの後に捕捉表面を再生した。これにより結合したＶＥＧＦ−Ａを表面から除去した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン１．１．１）を使用してデータをコンパイルした。
両方の組の実験結果を以下の通り解釈した。二次ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが一次アンタゴニストと同時にＶＥＧＦ−Ａ抗原に結合することができなかった場合、１つのファミリー又はエピトープビンに機能的に分類した。しかしながら、チップ表面上の質量の増加を示すことによって二次ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが一次アンタゴニストと同時に抗原に結合することができた場合、別々のファミリー又はエピトープビンに分類した。各ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを陰性対照としてそれ自体に対して試験して、バックグラウンド（結合なし）シグナルのレベルを確立した。
結果
精製したＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを、上記の２つの組の実験の結合データを使用してエピトープビンに割り当てた。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって報告されるシグナル（ＲＵ、応答単位）は、センサーチップ表面上の質量と直接相関している。いったん陰性対照と関連するバックグラウンドシグナルのレベル（ＲＵ）を確立（一次及び二次アンタゴニストとして同じＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを使用）したら、ビニング結果を陽性又は陰性結合として報告した。陽性結合は、２つの異なるＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが同時に抗原に結合することができることを示す。陰性結合は、２つの異なるＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが同時に抗原に結合することができないことを示す。
これらの実験における陽性及び陰性応答値の間の差を使用して、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを３つのファミリー又はエピトープビンに割り当てた（表２６参照）。第１のエピトープビンには、クローンｃ６３６によって産生されるＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが相当する。第２のエピトープビンには、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストｃ８６８、ｃ１０３９、及びｃ１０８１が相当する。注目すべきことに、ｃ６３６が最初にＶＥＧＦ−Ａと相互作用した場合、ｃ８６８及びｃ１０３９の両方が同時結合を示した。ｃ８６８又はｃ１０３９のいずれかがＶＥＧＦ−Ａと最初に相互作用した場合、ｃ６３６は結合を示さず、したがってｃ８６８及びｃ１０３９はｃ６３６エピトープとオーバーラップしている。加えて、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストｃ８７０はビン＃１及びビン＃２とオーバーラップしていた。第３のエピトープビンには、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストｃ８２０及び陽性対照ＶＥＧＦ−Ａ抗体（マウス抗ＶＥＧＦ−Ａモノクローナル抗体、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）が相当する。これらのＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの両方が、他のすべてのＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下で同時結合を示した。ビニング実験において試験したすべてのアンタゴニストは、ＶＥＧＦ−Ａ分裂促進活性をある程度まで中和することが示された。
（実施例４２）
表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）によるヒトＶＥＧＦ−ＡアンタゴニストのＶＥＧＦ−Ａに対する結合親和性の測定
クローンｃ８６８、ｃ８７０及びｃ１０３９によって産生された一価ヒトＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを、表面プラズモン共鳴を使用してヒトＶＥＧＦ−Ａに対する結合親和性について評価した。
親和性決定
ＶＥＧＦ−ＡアンタゴニストとＶＥＧＦ−Ａとの相互作用について、表面プラズモン共鳴によって動態速度定数及び平衡解離定数を測定した。結合速度定数（ｋａ（Ｍ−１ｓ−１））は、抗原−アンタゴニスト複合体形成の速度を表す値である。解離速度定数（ｋｄ（ｓ−１））は、この複合体の安定性を表す値である。結合速度定数を解離速度定数で割る（ｋａ／ｋｄ）ことによって、平衡結合定数（ｋＡ（Ｍ−１））が得られる。解離速度定数を結合速度定数で割る（ｋｄ／ｋａ）ことによって、平衡解離定数（ＫＤ（Ｍ））が得られる。この値は相互作用の結合親和性を示す。同じＫＤを有する相互作用は、非常に様々な結合及び解離速度定数を有する可能性がある。したがって、ｋａ及びｋｄの両方を測定することは、より一意的に相互作用の親和性を説明するのに役立つ。
材料及び方法
クローンｃ８６８、ｃ８７０及びｃ１０３９によって産生された精製ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの結合親和性を測定するために、一連の実験を完了した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（商標）システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）において結合動態及び親和性の試験を行った。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（商標）Ｃｏｎｔｒｏｌソフトウェア、ｖ１．１．１を使用して方法をプログラムした。ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを、Ｈｉｓ６／Ｍｙｃエピトープタグとともに産生した。ＣＭ５チップ上に固定化された抗Ｈｉｓ６／Ｍｙｃ抗体を使用して、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを捕捉することによって親和性解析を行った。抗Ｈｉｓ６及び抗Ｍｙｃ抗体を１：１モル比で混合し、アミンカップリング化学反応を使用してＣＭ５センサーチップ上に約７５００ＲＵの密度まで共有結合で固定化した。１０ｎＭのＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを、１０μｌ／分で１分間、別々のフローセル上に注入し、その後１分間安定化した。３３．３ｎＭ〜０．１４ｎＭのＶＥＧＦ−Ａの連続１：３希釈溶液をこの表面上に注入し、センサーチップ上に捕捉されたＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストに特異的に結合させた。各ＶＥＧＦ−Ａ濃縮液の２連の注入を、５分の結合時間及び１０分の解離時間で行った。３０μＬ／分の流速で動的結合試験を行った。すべての結合実験を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ ０．０５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４の緩衝液において２５℃で行った。サイクルの間に、フローセルを５０ｍＭのＨ３ＰＯ４で洗浄して表面を再生した。この洗浄ステップにより捕捉されたＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを固定化抗体表面から除去し、次の試料のその後の結合を可能にした。
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン１．１．１）を使用してデータをコンパイルした。データを、参照フローセル及びブランク注入を差し引くことによって処理した。ベースライン安定性を評価して、再生ステップが一連の注入の全体において一定の結合表面をもたらすことを確認した。２連の注入の曲線を、再現性について検査した。ＶＥＧＦ−Ａ抗原は二量体を形成するため、得られた結合曲線を二価アナライト相互作用モデルに全体にわたって適合させた。
結果
３つのＶＥＧＦＡアンタゴニストを、ＶＥＧＦ−Ａに対するそれらの結合親和性について特徴付けた（結果を表２７にまとめた）。これらのヒトＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストについて結合速度定数（ｋａ（Ｍ−１ｓ−１））及び解離速度定数（ｋｄ（ｓ−１））を測定した。ＫＤ及びＫＡは、ｋａ及びｋｄ値から計算した。データは、二価アナライトモデルによく適合した。このモデルは、ｋａ（ｋａ１及びｋａ２）及びｋｄ（ｋｄ１及びｋｄ２）両方についての２つの値を測定する。第１の組の値（ｋａ１及びｋｄ１）は、表２４において報告されている相互作用の一価動態を表す。これらの試料について報告されている親和性はこれらの値に由来し、ＫＤ１と称される。ＫＤ及びＫＡは、ｋａ及びｋｄ値から計算した。３つすべてのＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが、ＶＥＧＦ−Ａ抗原（ＫＤ＝０．７〜１．０Ｅ−９Ｍ）と同様な親和性を示し、これらの結果は２つの独立したランにおいて一致していた。
（実施例４３）
表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）によるヒトＶＥＧＦＡ／ＰＤＧＦＲβアンタゴニストのＶＥＧＦＡに対する結合親和性の測定
２つのヒトＶＥＧＦ−Ａ／ＰＤＧＦＲ−βアンタゴニストを、表面プラズモン共鳴を使用してヒトＶＥＧＦ−Ａに対する結合親和性について評価した。これらのＶＥＧＦ−Ａ／ＰＤＧＦＲ−βアンタゴニストは両方とも、５個のドメイン：２つのＶＥＧＦ−Ａ結合ドメイン（２つのｃ８６８又は２つのｃ１０３９）及びヒトＦｃタグによってつながれている２つのＰＤＧＦＲ−β結合ドメイン（２つのｃ５９７）からなる。
親和性決定
動態速度定数、平衡結合及び解離定数を、ＶＥＧＦ−Ａ／ＰＤＧＦＲβアンタゴニストＡ２０９９Ｆ（２つのｃ１０３９及び２つのｃ５９７ドメインからなる）及びＡ２１００Ｆ（２つのｃ８６８及び２つのｃ５９７ドメインからなる）のＶＥＧＦ−Ａ抗原との相互作用について表面プラズモン共鳴によって測定した。
材料及び方法
ＶＥＧＦ−Ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｓｍｓ）及びＰＤＧＦＲ−β（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ）抗原に対して作製された精製ＶＥＧＦ−Ａ／ＰＤＧＦＲ−βアンタゴニストの結合親和性を測定するために、一連の実験を完了した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（商標）システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）において結合動態及び親和性の試験を行った。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（商標）Ｃｏｎｔｒｏｌソフトウェア、ｖ１．１．１を使用して方法をプログラムした。ヒトＶＥＧＦ−Ａ抗原を、アミンカップリング化学反応（ＥＤＣ：ＮＨＳ）を使用して約１６０ＲＵの密度までＣＭ５センサーチップのフローセル上に共有結合で固定化した。１１．１ｎＭ〜０．１４ｎＭのＶＥＧＦ−Ａ／ＰＤＧＦＲ−βアンタゴニストの連続１：３希釈溶液を表面上に注入し、センサーチップ上に固定化されたＶＥＧＦ−Ａに特異的に結合させた。ＶＥＧＦ−Ａ／ＰＤＧＦＲ−βアンタゴニストの２連の注入を、１０分の結合時間及び１５分の解離時間で行った。３０μＬ／分の流速で動的結合試験を行った。すべての結合実験を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ ０．０５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４の緩衝液において２５℃で行った。表面を再生するために、フローセルを各サイクルの間に１０ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ、ｐＨ１．５で洗浄した。
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン１．１．１）を使用してデータをコンパイルした。参照フローセル及びブランク注入を差し引くことによってデータを処理し、ベースライン安定性を評価して、再生ステップが一連の注入の全体において一定の結合表面をもたらすことを確認した。２連の注入の曲線を、再現性について検査した。ＶＥＧＦ−Ａ抗原及びＶＥＧＦ−Ａ／ＰＤＧＦＲ−βアンタゴニストは両方とも二価分子であるため、ＶＥＧＦ−Ａ／ＰＤＧＦＲ−βアンタゴニストのＶＥＧＦ−Ａ抗原に対する結合について得られた結合曲線を二価アナライトモデルに全体にわたって適合させた。
結果
精製ＶＥＧＦ−Ａ／ＰＤＧＦＲ−βアンタゴニストを、ＶＥＧＦ−Ａ抗原に対するそれらの結合親和性について特徴付けた（結果を表２８にまとめた）。結合速度定数（ｋａ（Ｍ−１ｓ−１））及び解離速度定数（ｋｄ（ｓ−１））を結合単位について測定した。各相互作用についてのＫＤ及びＫＡは、ｋａ及びｋｄ値から計算した。ＶＥＧＦ−Ａ／ＰＤＧＦＲ−βアンタゴニストのＶＥＧＦ−Ａ抗原に対する結合親和性は、ＶＥＧＦ−Ａ抗原を固定化し、ＶＥＧＦ−Ａ／ＰＤＧＦＲ−βアンタゴニストをこの表面上に注入することによって決定した。得られたデータセットは、二価相互作用アナライトモデルによく適合した。このモデルは、ｋａ（ｋａ１及びｋａ２）及びｋｄ（Ｋｄ１及びｋｄ２）両方についての２つの値を測定する。第１の組の値（ｋａ１及びｋｄ１）は、表２８において報告されている相互作用の一価動態を表す。これらの試料について報告されている親和性はこれらの値に由来し、ＫＤ１と称される。ＫＤ及びＫＡは、ｋａ及びｋｄ値から計算した。これらのアッセイ条件下で、ＶＥＧＦ−Ａ／ＰＤＧＦＲ−βアンタゴニストＡ２１００ＦのＶＥＧＦ−Ａに対する結合親和性は、５．Ｅ−９Ｍであった。
（実施例４４）
抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体を使用したｉｎ ｖｉｖｏでのヒト肝細胞癌細胞増殖の阻害
ｉｎ ｖｉｖｏでのヒト肝細胞癌細胞に対する抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体の抗腫瘍活性を評価するために、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス群にＨｕＨ７又はＣ３Ａ肝細胞癌細胞を０日目に注入する。担癌マウス群（ｎ＝１０／群）に５μｇ〜７５μｇの抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体を、腹腔内又は腫瘍周囲への注入によって、５〜３３日目まで１日おきに（ＥＯＤ）投与する。腫瘍体積を３回／週、６週間モニターする。抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体による腫瘍増殖の阻害は、それぞれのタンパク質がｉｎ ｖｉｖｏでヒト肝細胞癌に対して阻害作用を有することを示す。
試験設計：８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の右脇腹に６×１０６個のＨｕＨ７又はＣ３Ａ細胞を０日目に皮下注入する。マウス群（ｎ＝１０／群）に、５μｇ〜７５μｇの抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体を腹腔内又は腫瘍周囲に５〜３３日目まで注入する。注入は、全量２００μｌで行う。腫瘍増殖を３回／週、６週間、カリパス測定を使用してモニターする。式１／２＊（Ｂ）２＊Ｌ（ｍｍ３）を使用して腫瘍体積を計算した。
（実施例４５）
抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体を使用したｉｎ ｖｉｖｏでのヒト前立腺癌細胞増殖の阻害
ｉｎ ｖｉｖｏでのヒト前立腺癌細胞に対する抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体の抗腫瘍活性を評価するために、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス群にＰＣ−３又はＤＵ−１４５前立腺癌細胞を０日目に注入する。担癌マウス群（ｎ＝１０／群）に５μｇ〜７５μｇの抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体を、腹腔内又は腫瘍周囲への注入によって、５〜３３日目まで１日おきに（ＥＯＤ）投与する。腫瘍体積を３回／週、６週間モニターする。抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体による腫瘍増殖（体積又は重量）の阻害は、それぞれのタンパク質がｉｎ ｖｉｖｏでヒト前立腺癌に対して阻害作用を有することを示す。
試験設計：８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の右脇腹の皮下に又は前立腺葉において同所性に、１０×１０６個のＰＣ−３細胞又は６×１０６個のＤＵ−１４５細胞を０日目に注入する。マウス群（ｎ＝１０／群）に、５μｇ〜７５μｇの抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体を腹腔内又は腫瘍周囲に（皮下モデルのみ）５〜３３日目まで注入する。注入は、全量２００μｌで行う。皮下腫瘍については、腫瘍増殖を３回／週、６週間、カリパス測定を使用してモニターする。式１／２＊（Ｂ）２＊Ｌ（ｍｍ３）を使用して腫瘍体積を計算する。同所性腫瘍については、試験終了時にマウスを屠殺し、腫瘍の重さを量って腫瘍量を評価できるようにする。
（実施例４６）
抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体の有効性を評価するためのマウス前立腺癌モデル
腫瘍応答に対する抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体の作用を、Ｋｗｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６巻：１５０７４〜１５０７９頁、１９９９年において記述されているものと同様のモデルを使用して、マウス前立腺癌モデルにおいて評価する。このモデルでは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて移植されている、マウス前立腺のトランスジェニック腺癌（ＴＲＡＭＰ）由来の前立腺癌細胞株ＴＲＡＭＰ−Ｃ２の転移性成長がある。転移性再発は確実であり、原発腫瘍に非常に近接して流入領域リンパ節において主に発生する。
簡潔に述べると、使用したＣ２細胞株は、前立腺に限局的なＳＶ４０抗原発現に起因する自発性腫瘍を自発的に発症するＴＲＡＭＰマウス由来の初期継代株である。細胞を培養し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに２．５〜５×１０６細胞／０．１ｍｌ培地で皮下注入する。腫瘍移植の後３〜１４日目から始めて、又は腫瘍生着及び増殖速度が安定したときに、マウスを抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体で処理する。０．５〜５ｍｇ／ｋｇの処理レベルを毎日、５〜１４日間投与し、中和抗体形成の証拠が見られなければその後継続してもよい。動物を屠殺した後、腫瘍を切除し、組織化学及び免疫組織化学を使用して体積について分析する。
（実施例４７）
抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体を使用したｉｎ ｖｉｖｏでのヒト結腸癌細胞の阻害
ｉｎ ｖｉｖｏでのヒト結腸癌細胞に対する抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体の抗腫瘍活性を評価するために、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス群にＤＬＤ−１又はＨＣＴ−１１６結腸癌細胞を０日目に注入する。担癌マウス群（ｎ＝１０／群）に５μｇ〜７５μｇのヒト抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体を、腹腔内又は腫瘍周囲への注入によって、５〜３３日目まで１日おきに（ＥＯＤ）投与する。腫瘍体積を３回／週、６週間モニターする。抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体による腫瘍増殖（体積又は重量）の阻害は、それぞれのタンパク質がｉｎ ｖｉｖｏでヒト結腸癌に対して阻害作用を有することを示唆する。
試験設計：８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の右脇腹の皮下に又は結腸壁において同所性に、１０×１０６個のＤＬＤ−１又はＨＣＴ−１１６細胞を０日目に注入する。マウス群（ｎ＝１０／群）に、５μｇ〜７５μｇのヒト抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体を腹腔内又は腫瘍周囲に（皮下モデルのみについて）５〜３３日目まで注入する。注入は、全量２００μｌで行う。皮下腫瘍については、腫瘍増殖を３回／週、６週間、カリパス測定を使用してモニターする。式１／２＊（Ｂ）２＊Ｌ（ｍｍ３）を使用して腫瘍体積を計算する。同所性腫瘍については、試験終了時にマウスを屠殺し、腫瘍の重さを量って腫瘍量を評価できるようにする。
（実施例４８）
抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体の有効性を評価するためのマウス結腸直腸腫瘍モデル
結腸直腸マウスモデルにおける抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体の作用を、Ｙａｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６３巻：５８６〜５９２頁、２００３年に記述されている通り試験する。このモデルにおいて、ＭＣ−２６マウス結腸腫瘍細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスの脾被膜下に移植する。１４日後、処理したマウスに抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体を投与する。腫瘍移植の後３〜１４日目から始めて、又は腫瘍生着及び増殖速度が安定したときに、マウスを抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体で処理する。０．５〜５ｍｇ／ｋｇの処理レベルを毎日、５〜１４日間投与し、中和抗体形成の証拠が見られなければその後継続してもよい。
生存期間の伸長又は腫瘍応答の促進における抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体の有効性を、本明細書に記載のものなどの標準的な技術を使用して評価する。
（実施例４９）
抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体を使用したｉｎ ｖｉｖｏでのヒト膵臓癌細胞の阻害
ｉｎ ｖｉｖｏでのヒト膵臓癌細胞に対する抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体の抗腫瘍活性を評価するために、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス群にＢｘＰＣ−３又はＨＰＡＦ−ＩＩ膵臓癌細胞を０日目に注入する。担癌マウス群（ｎ＝１０／群）に５μｇ〜７５μｇの抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体を、腹腔内又は腫瘍周囲への注入によって、５〜３３日目まで１日おきに（ＥＯＤ）投与する。腫瘍体積を３回／週、６週間モニターする。抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体による腫瘍増殖（体積又は重量）の阻害は、それぞれのタンパク質がｉｎ ｖｉｖｏでヒト膵臓癌に対して阻害作用を有することを示唆する。
試験設計：８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の右脇腹の皮下に又は膵臓葉において同所性に、６×１０６個のＢｘＰＣ−３又はＨＣＴ−１１６細胞を０日目に注入する。マウス群（ｎ＝１０／群）に、５μｇ〜７５μｇの抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体を腹腔内又は腫瘍周囲に（皮下モデルのみについて）５〜３３日目まで注入する。注入は、全量２００μｌで行う。皮下腫瘍については、腫瘍増殖を３回／週、６週間、カリパス測定を使用してモニターする。式１／２＊（Ｂ）２＊Ｌ（ｍｍ３）を使用して腫瘍体積を計算した。同所性腫瘍については、試験終了時にマウスを屠殺し、腫瘍の重さを量って腫瘍量を評価できるようにする。
（実施例５０）
抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体の有効性を評価するためのマウス膵臓癌モデル
マウス膵臓癌モデルにおける抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体の有効性を、Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６５巻：３４５１〜３４６０頁、２０００年によって開発されたプロトコールを使用して評価する。簡潔に述べると、ＭＵＣ１トランスジェニック（ＭＵＣ１．Ｔｇ）マウスを、ＭＥＴ．ＭＵＣ１．Ｔｇマウスと称される、膵臓腫瘍を自発的に発症する癌遺伝子発現マウス（ＥＴマウス）と交配する。ＥＴマウスは、ラットエラスターゼプロモーターの制御下でＳＶ４０ ｌａｒｇｅ Ｔ Ａｇの最初の１２７ａａを発現する。動物の５０％が、約２１週齢までに致命的な膵臓腫瘍を発症する。細胞を、ＭＵＣ１の存在についてフローサイトメトリーによって定期的に試験する。すべてのマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドである。３週間隔で３〜２４週まで、動物を屠殺して特徴付けする。嗜眠、腹部膨満、飲食不能、顕著な体重減少、白色便、及び背弯姿勢を含む疾病−健康の徴候についてマウスを注意深く観察する。
膵臓全体を解剖して脂肪及びリンパ節を切除し、重さを量り、写真撮影のためにビブルスペーパー上に広げる。小節を計数し、膵臓をメタカン中で固定し、従来の方法によって顕微鏡検査用に処理し、５μｍで段階的に切片化し（１つのマウス膵臓当たり約１０切片）、ヘマトキシリン及びエオシンで染色し、光学顕微鏡検査によって調べる。腫瘍進行中の様々な時点で腫瘍をＭＥＴマウスから得、メタカン（６０％メタノール、３０％クロロホルム、１０％氷酢酸）中で固定し、パラフィン中に包埋し、免疫組織化学分析用に切片化する。使用するＭＵＣ１抗体は、ＭＵＣ１のＴＲドメイン中にエピトープを有するＭＵＣ１、ＨＭＦＧ−２、ＢＣ２、及びＳＭ−３のマウス及びヒト細胞質尾部領域を認識するウサギポリクローナルＡｂ、ＣＴ１である。
腫瘍移植の後３〜１４日目から始めて、又は腫瘍生着及び増殖速度が安定したときに、マウスを抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体で処理する。０．５〜５ｍｇ／ｋｇの処理レベルを毎日、５〜１４日間投与し、中和抗体形成の証拠が見られなければその後継続してもよい。
（実施例５１）
抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体のｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍作用を評価するためのＢ１６−Ｆ１０メラノーマモデル
マウス（雌、Ｃ５７Ｂｌ６、９週齢；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、ＮＹ）を３つの群に分ける。０日目に、Ｂ１６−Ｆ１０メラノーマ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−６４７５）を培養から回収し、すべてのマウスに対して尾静脈を介して静脈内注入する（約１０００００細胞／マウス）。マウスを次いで被験物質又は関連ビヒクルで、示されている溶液の０．１ｍｌの腹腔内注入によって処理する。第１群のマウス（ｎ＝２４）を、０、２、４、６、及び８日目に注入されるビヒクル（ＰＢＳ ｐＨ６．０）で処理する。第２群のマウス（ｎ＝２４）を、０、２、４、６、及び８日目に７５μｇの用量で注入される抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体で処理する。第３群のマウス（ｎ＝１２）を、０日目〜９日目まで毎日７５μｇの用量で注入される抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体で処理する。すべてのマウスを１８日目に屠殺し、腫瘍の定量のために肺を採取する。各肺葉のすべての表面上の、直径が０．５ｍｍを超える腫瘍増殖の病巣を計数する。抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体で処理したマウス群の両方において、肺において存在する腫瘍病巣の平均数は、ビヒクルで処理したマウスと比較して顕著に減少する。より高い頻度（すなわち毎日）で処理したマウスは、１日おきに処理したマウスよりも少ない腫瘍病巣を有する。これらの結果は、抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体による処理がＢ１６メラノーマ腫瘍の増殖を遅らせたことを示す。
（実施例５２）
抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体のｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍作用を評価するためのＥＧ．７胸腺腫モデル
マウス（雌、Ｃ５７Ｂｌ６、９週齢；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、ＮＹ）を３つの群に分ける。０日目に、ＥＧ．７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２１１３）を培養から回収し、すべてのマウスにおいて１００００００細胞を腹腔内注入する。マウスを次いで被験物質又は関連ビヒクルで、示されている溶液の０．１ｍＬの腹腔内注入によって処理する。第１群のマウス（ｎ＝６）を、０、２、４、及び６日目に注入されるビヒクル（ＰＢＳ ｐＨ６．０）で処理する。第２群のマウス（ｎ＝６）を、０、２、４、及び６日目に１０μｇの用量で注入される抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体で処理する。第３群のマウス（ｎ＝６）を、０、２、４、及び６日目に７５μｇの用量で注入される抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体で処理する。抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体で処理したマウス群の両方において、生存期間は、ビヒクルで処理したマウスと比較して顕著に増加する。これらの結果は、抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体による処理がＥＧ．７腫瘍の増殖を遅らせたことを示す。
（実施例５３）
抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体の有効性を評価するためのマウス同系卵巣癌モデル
抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体の作用を、Ｚｈａｎｇら、Ａｍ． Ｊ． ｏｆ Ｐａｔｈｏｌ． １６１巻：２２９５〜２３０９頁、２００２年において記述されている通りマウス同系モデルを使用して卵巣癌における有効性について試験する。簡潔に述べると、レトロウイルストランスフェクション及び蛍光活性化細胞ソーティングを使用して、マウスＶＥＧＦ１６４アイソフォーム及び増強緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を安定に過剰発現するＣ５７ＢＬ６マウスＩＤ８卵巣癌細胞株を作製する。ＶＥＧＦ１６４及びＧＦＰ ｃＤＮＡを含有するレトロウイルス構築物を、ＢＯＳＣ２３細胞にトランスフェクトした。細胞をＦＡＣＳ細胞ソーティングによって分析し、ＧＦＰ強陽性細胞を特定する。
ＩＤ８ ＶＥＧＦ１６４／ＧＦＰトランスフェクト細胞をサブコンフルエント状態まで培養し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及び冷ＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）において単一細胞懸濁液に調製する。６〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ６マウスの脇腹に５×１０６個の細胞又はトランスフェクトしていない対照細胞を皮下注入する。或いは、マウスに７×１０６細胞又は対照細胞を腹腔内注入することができる。動物を、生存を追跡するか又は接種の８週間後に屠殺し、腫瘍増殖について評価する。腫瘍移植の後３〜１４日目から始めて、又は腫瘍生着及び増殖速度が安定したときに、マウスを抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体で処理する。０．５〜５ｍｇ／ｋｇの処理レベルを毎日、５〜１４日間投与し、中和抗体形成の証拠が見られなければその後継続してもよい。
（実施例５４）
抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体の有効性を評価するためのマウスＲｅｎＣＡモデル
腎細胞癌モデルにおける抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体の有効性を、本質的にＷｉｇｇｉｎｔｏｎら、Ｊ． Ｎａｔ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔ． ８８巻：３８〜４３頁、１９９６年において記述されている通り、自発性起源のマウス腎臓腺癌、ＲＥＮＣＡ細胞を注入されたＢＡＬＢ／ｃマウスを使用して評価する。
簡潔に述べると、８〜１０週のＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＲｅｎＣＡ細胞Ｒ１×１０５細胞をマウス腎臓被膜中に注入する。腫瘍細胞移植の１２日後、マウスの腎臓を摘出して原発腫瘍を除去する。抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体の投与の前に、マウスを手術から回復させる。腫瘍移植の後３〜１４日目から始めて、又は腫瘍生着及び増殖速度が安定したときに、マウスを抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体で処理する。０．５〜５ｍｇ／ｋｇの処理レベルを毎日、５〜１４日間投与し、中和抗体形成の証拠が見られなければその後継続してもよい。或いは、皮下（５×１０５細胞）又は静脈内（１×１０５細胞）注入によってＲｅｎＣＡ細胞を導入してもよい。
非処理マウスと比較して腫瘍応答についてマウスを評価する。腫瘍体積の評価に加えて、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法を使用して生存を比較する。
（実施例５５）
抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体の有効性を評価するためのマウス乳癌モデル
乳癌のマウスモデルにおける抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体の有効性を、Ｃｏｌｏｍｂｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６２巻：９４１〜９４６頁、２００２年において記述されている通り同系モデルを使用して作製する。簡潔に述べると、ＴＳ／Ａ細胞は、ＢＡＬＢ／Ｃマウスの自発性乳癌である。この細胞を約１週間培養してクローンを選択する。選択したＴＳ／Ａ細胞を増殖させ、２×１０２ＴＳ／Ａ細胞をマウスの脇腹に皮下注入することによって使用してＣＤ−１ｎｕ／ｎｕ ＢＲマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を試験する。
腫瘍移植の後３〜１４日目から始めて、又は腫瘍生着及び増殖速度が安定したときに、マウスを抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体で処理する。０．５〜５ｍｇ／ｋｇの処理レベルを毎日、５〜１４日間投与し、中和抗体形成の証拠が見られなければその後継続してもよい。動物を屠殺した後、腫瘍を切除し、組織化学及び免疫組織化学を使用して体積について分析する。
（実施例５６）
タンパク質産生のためのＣＨＯプールのトランスフェクション及び作製
プラスミドＤＮＡを制限酵素ＰｖｕＩで消化した。ＢｉｓｃＦｖを発現する安定なＣＨＯプールを作製するために、標準的なエレクトロポレーションプロトコールに従って１５μｇの消化したプラスミドＤＮＡをＣＨＯ ＤＸＢ−１１宿主細胞にトランスフェクトした。細胞を振とうフラスコにおいて完全培地中で２日間３７℃で回復させた。回復後、細胞をメトトレキサートを添加した選択培地中に移した。細胞を、少なくとも９０％生存可能となるまで３〜４日毎に繁殖させた。ＢｉＡｂを発現する安定なＣＨＯプールを作製するために、標準的なエレクトロポレーションプロトコールに従って１５μｇの各消化プラスミドＤＮＡをＣＨＯ ＤＸＢ−１１宿主細胞に共トランスフェクトした。細胞を振とうフラスコにおいて完全培地中で２日間３７℃で回復させた。回復後、細胞をピューロマイシンを添加した完全培地中に移した。細胞を、少なくとも８０％生存可能となるまで３〜４日毎に繁殖させた。次いで細胞をピューロマイシン及びメトトレキサートを添加した選択培地中に移した。細胞を、少なくとも９０％生存可能となるまで３〜４日毎に繁殖させた。
トランスフェクトＣＨＯ ＤＸＢ−１１細胞が少なくとも９０％の生存可能性に達したときに、組換えタンパク質産生についてプールをアッセイした。プールを振とうフラスコにおいて産生培地中に接種し、３７℃でインキュベートした。６日後、培養物を回収し、プロテインＡ ＨＰＬＣによって上清を組換えタンパク質産生についてアッセイした。
（実施例５７）
表面プラズマ共鳴によるヒト単量体ＰＤＧＦＲβに対するＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性分子の結合親和性の測定
二重特異性分子を、ヒト単量体ＰＤＧＦＲβに対する結合親和性について評価した。結合及び解離定数を、ＰＤＧＦＲβに対する二重特異性分子の相互作用について測定した。結合親和性を、これらの測定した定数を使用して測定した。
材料及び方法
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ−１００（商標）システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）において結合動態及び親和性の測定を行った。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ−１００（商標）Ｃｏｎｔｒｏｌソフトウェア、ｖ１．１．１を使用して方法をプログラムした。すべての試験を２５℃で行い、試料をオートサンプラー中８℃で保存した。０．４ＭのＥＤＣ［Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジエチルアミノ−プロピル）カルボジイミド］及び０．１ＭのＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）の混合物を使用して、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ−ガンマ特異的抗体をＣＭ４センサーチップ上に固定化した。抗体を、１０ｍＭ 酢酸ナトリウムｐＨ５．０において５０μｇ／ｍＬの濃度まで希釈した。固定化の密度は、約３４００〜３７００ＲＵであった。固定化後、残りの細胞をエタノールアミンでブロックし、非特異的結合タンパク質を５０ｍＭ ＮａＯＨでの洗浄によって除去した。
ＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性分子を、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、ｐＨ７．４）中に２μｇ／ｍＬで希釈した。これらを、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ−ガンマＣＭ４チップの個々のフローセル上で１０μｌ／分で捕捉した。固定化の密度は、８３〜１０８ＲＵであった。
単量体ＰＤＧＦＲβをフローセル上に注入した。アナライトの連続１：３希釈溶液を、１００ｎＭ〜０．０１５ｎＭまでＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で作製した。濃度系列の単回注入を低濃度から高濃度まで行い、その後試料系列の注入を繰り返した。アナライトを３０μｌ／分で９分間（結合時間）注入した。各アナライト注入の解離時間は１５分であった。機械的なノイズ及びドリフトを減じるために緩衝液注入もまた行った。
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いてデータ解析を行った。単量体アナライトの二価分子に対する結合に基づいて、１：１結合モデルを適切であると決定し、得られた結合曲線をこのモデルに適合させた。１：１結合モデルは、結合定数（ｋａ）及び解離定数（ｋｄ）についての１つの値を測定する。全体の結合親和性（ＫＤ）は、ｋｄをｋａで割ることによって得た。
結果
様々な二重特異性分子について得られた速度定数を、表２９にまとめる。共通の抗ＰＤＧＦＲβファミリーグループを有する二重特異性分子は同様な結合親和性を示し、データは１：１結合モデルによく適合した。大部分の分子が低ｎＭ親和性でアナライト（単量体ＰＤＧＦＲβ）に結合した。
（実施例５８）
表面プラズマ共鳴による組換えヒトＶＥＧＦ−Ａに対するＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性分子の結合親和性の測定
二重特異性分子を、組換えヒトＶＥＧＦ−Ａに対する結合親和性について評価した。結合及び解離定数を、ＶＥＧＦ−Ａに対する二重特異性分子の相互作用について測定した。結合親和性を、これらの測定した定数を使用して測定した。
材料及び方法
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ−１００（商標）システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）において結合動態及び親和性の測定を行った。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ−１００（商標）Ｃｏｎｔｒｏｌソフトウェア、ｖ１．１．１を使用して方法をプログラムした。すべての試験を２５℃で行い、試料をオートサンプラー中８℃で保存した。０．４ＭのＥＤＣ［Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジエチルアミノ−プロピル）カルボジイミド］及び０．１ＭのＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）の混合物を使用して、組換えヒトＶＥＧＦ−ＡをＣＭ４センサーチップ上に固定化した。タンパク質を、１０ｍＭ 酢酸ナトリウムｐＨ５．０において２μｇ／ｍＬの濃度まで希釈した。固定化の密度は、約１３ＲＵであった。固定化後、残りの細胞を１Ｍエタノールアミンでブロックし、非特異的結合タンパク質を１０ｍＭ グリシン、ｐＨ１．５での洗浄によって除去した。
ＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性分子を、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、ｐＨ７．４）中に希釈した。アナライトの連続１：３希釈溶液を、１００ｎＭ〜０．０１５ｎＭまでＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で作製した。二重特異性分子をフローセル上に注入した。濃度系列の単回注入を低濃度から高濃度まで行い、その後試料系列の注入を繰り返した。アナライトを３０μｌ／分で９分間（結合時間）注入した。各アナライト注入の解離時間は１５分であった。機械的なノイズ及びドリフトを減じるために緩衝液注入もまた行った。
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いてデータ解析を行った。二量体二重特異性分子の二量体ヒトＶＥＧＦ−Ａに対する結合に基づいて、二価結合モデルを適切であると決定し、得られた結合曲線をこのモデルに適合させた。二価結合モデルは、結合定数（ｋａ１及びｋａ２）及び解離定数（ｋｄ１及びｋｄ２）についての２つの値を測定する。全体の結合親和性（ＫＤ１）は、ｋｄ１をｋａ１で割ることによって得た。
結果
様々な二重特異性分子について得られた速度定数を、表３０にまとめる。共通の抗ＶＥＧＦ−Ａファミリーグループを有する二重特異性分子はある程度同様な結合親和性を示し、データは二価結合モデルによく適合した。大部分の分子が低ｎＭ親和性でＶＥＧＦ−Ａに結合した。
（実施例５９）
表面プラズマ共鳴による組換えヒトＰＤＧＦＲβ及び組換えヒトＶＥＧＦ−Ａの両方に対するＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性分子の共結合の確認
二重特異性分子を、組換えヒトＰＤＧＦＲβ（単量体又は二量体）及び組換えヒトＶＥＧＦ−Ａに同時に共結合する能力について評価した。共結合のモル化学量論を計算した。
材料及び方法
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ−１００（商標）システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）において結合動態及び親和性の測定を行った。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ−１００（商標）Ｃｏｎｔｒｏｌソフトウェア、ｖ１．１．１を使用して方法をプログラムした。すべての試験を２５℃で行い、試料をオートサンプラー中８℃で保存した。０．４ＭのＥＤＣ［Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジエチルアミノ−プロピル）カルボジイミド］及び０．１ＭのＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）の混合物を使用して、組換えヒトＶＥＧＦ−ＡをＣＭ４センサーチップ上に固定化した。タンパク質を、１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．０において２μｇ／ｍＬの濃度まで希釈した。固定化の密度は、約１３ＲＵであった。固定化後、残りの細胞を１Ｍエタノールアミンでブロックし、非特異的結合タンパク質を１０ｍＭ グリシン、ｐＨ１．５での洗浄によって除去した。
ＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性分子を、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、ｐＨ７．４）中に１００ｎＭの濃度で希釈し、１０μｌ／分で５分間フローセル上に注入した。機械的なノイズ及びドリフトを減じるために緩衝液注入もまた行った。
飽和濃度（５００ｎＭ）の単量体ＰＤＧＦＲβ又は二量体ＰＤＧＦＲβ−ＦｃをＨＢＳ−ＥＰ緩衝液において調製し、フローセル上に注入した。アナライトを３０μｌ／分で１０分間（結合時間）注入した。機械的なノイズ及びドリフトを減じるために緩衝液注入もまた行った。
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いてデータ解析を行った。
結果
各二重特異性分子をまず固定化ヒトＶＥＧＦ−Ａに結合させ、結合曲線を形成した。その後、ＰＤＧＦＲβ単量体又はＰＤＧＦＲβ−Ｆｃ二量体を、捕捉されたＶＥＧＦ−Ａ結合二重特異性分子に結合させた。すべての二重特異性分子は、ＶＥＧＦ−Ａ及びＰＤＧＦＲβの両方に同時に結合することができた。様々な二重特異性分子の結合のモル化学量論を、表３１にまとめる。
（実施例６０）
雌ＳＣＩＤマウスにおける単回投与静脈内注入後の二重特異性分子の薬物動態解析
上記実施例において記述されている（例えば、実施例３０を参照）二重特異性分子は、野生型又はＦｃγＲ（エフェクター機能陰性Ｆｃ）に対する結合を阻害する突然変異を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃを有する。典型的には、ＦｃＲｎ（新生児Ｆｃ受容体）に対するこれらの分子の結合は障害されず、したがってこれらの分子は古典的ＩｇＧ抗体と同様な血清半減期（ｔ１／２）を有することが予想される。エフェクターエフェクター機能陰性Ｆｃを含む二重特異性分子の薬物動態特性を、雌ＳＣＩＤマウスにおいて単回投与腹腔内注入後に決定した。
材料及び方法
すべての実験について、８〜１０週齢の雌ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した。２４匹のマウス群に、２５ｍＭヒスチジン／１２５ｎＭ ＮａＣｌ緩衝液中の１００μｌ量の１００μｇの二重特異性分子を尾静脈を介して注入した。様々な時点（０．５、２、６、２４、７２、１６８、３３６、及び５０４時間）で心穿刺（麻酔をかけたマウスにおいて）によって３匹のマウス群から全血を採取し、血清を集めて−８０℃で保存した。様々な試料において血清中の二重特異性分子の量を、定量ＥＬＩＳＡを使用して決定した。
組換えヒトＶＥＧＦ−Ａを、プラスチック（９６ウェル平底プレート）上に固定化した。マウスから単離した血清の連続希釈溶液を作製し、ヒトＶＥＧＦ−Ａでコートしたウェルに加えた（二重特異性分子の捕捉）。ビオチン化抗ヒトＩｇＧ抗体を使用して捕捉された二重特異性（血清中）のＦｃ部分を結合させ、その後基質テトラメチルベンジジンと併せてストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼを使用して検出した。新しい二重特異性分子を使用した標準曲線を使用して次いで血清中の量を計算した。
得られた濃度対時間プロファイルを、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ５．０．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｉｎｃ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して非コンパートメントＰＫ解析に供した。無限大まで外挿した濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣＩＮＦ）についての値を、均一加重を用いて線形台形法を使用して計算した。
結果
二重特異性分子血清濃度は、試験したすべての試料において測定した最後の時点（投与後５０４時間）まで定量可能であった。これらのデータの解析を表３２に示す。これらの結果は、ｃ１０３５．１−ｃ１０３９．１ｂｉｓｃＦｖ並びにｃ５９７．１−ｃ１０３９．１及びｃ６００．１−ｃ１０３９．１ｂｉＡｂが、Ｆｃを含有する古典的な抗体の予想される範囲内の血清半減期を有することを示す。
（実施例６１）
ＳＣＩＤマウスにおける二重特異性分子の単回投与注入後のマウスの血清はｉｎ ｖｉｔｒｏでＶＥＧＦ−Ａ及びＰＤＧＦＲβ活性を中和する
実施例６０の血清を、ヒトＶＥＧＦ−Ａ捕捉に続いて抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体ＥＬＩＳＡを使用した検出を使用して解析した。血清中で検出された分子は活性であることをさらに示すために、単離した血清をＶＥＧＦ−Ａ及びＰＤＧＦＲβ活性化の機能について試験するアッセイにおいて中和活性について試験した。
材料及び方法
ＰＫ抜き取り（０．５及び５０４時間）から単離された血清を、１０％血清中で希釈し、中和活性を試験した。ＶＥＧＦ−Ａに対する中和活性について、実施例１１に記述されているアッセイを使用した（２９３／ＶＥＧＦＲ２細胞におけるヒトＶＥＧＦ−Ａ誘導性ルシフェラーゼ活性）。ＰＤＧＦＲβに対する中和活性について、実施例２２に記述されているＰＤＧＦ−ＢＢ誘導性ＰＤＧＦＲβリン酸化アッセイを使用した。対照として、１０％ＳＣＩＤ血清中に新たに添加した二重特異性分子を使用して活性を中和した。
結果
表３３に示すように、二重特異性分子を注入したマウスの血清はヒトＶＥＧＦ−Ａ及びＰＤＧＦＲβ活性を効果的に中和した。活性は、血清中に新たに添加した二重特異性分子に見られたものと同様であった。これらのデータは、二重特異性分子が単回注入後少なくとも５０４時間まで血清において活性であることを示す。
（実施例６２）
抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体のエピトープマッピング
クローンｃ６３６、ｃ８６８、ｃ８７０及びｃ１０３９によって産生されたモノクローナルヒトＶＥＧＦ−Ａ抗体を、ＪＰＴ ＶＥＧＦ−Ａ ＲｅｐｌｉＴｏｐｅ（商標）スライドを使用してヒトＶＥＧＦ−Ａに対するペプチド結合について評価した。
材料及び方法
各ＪＰＴスライドは、以下のアレイの３つの複製物からなっていた。各アレイは連続し、オーバーラップしているＶＥＧＦ−Ａの１３ａａフラグメント（スポット１〜７８）、続いて連続し、オーバーラップしているＶＥＧＦ−Ａの２０ａａフラグメント（スポット８５〜１１５）からなっていた。加えて、各試験抗体並びにマウス及びヒトＩｇＧの対照スポットは各アレイの上部、底部、及び側面に隣接していた。
ヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質の合成線状ペプチドに対するｓｃＦｖｃ６３６、ｃ８７０、ｃ１０３９、及びｃ８６８の結合能力を決定するために、一連の実験を完了した。抗ヒトＶＥＧＦ−Ａ ｓｃＦｖをＨｉｓ／Ｍｙｃエピトープタグで標識した。１０〜１００μｇ／ｍｌの抗体の溶液をペプチドスライドに塗布した。抗Ｈｉｓ及び／又は抗Ｍｙｃ抗体を次いでスライドに塗布した。シグナルを、キット（Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ（登録商標）ＴＳＡＴＭＢｉｏｔｉｎ Ｓｙｓｔｅｍ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、＃ＮＥＬ７００Ａ）に指定されている方法に従ってビオチン化チラミドで増幅した。ストレプトアビジンアルカリフォスファターゼ及びＤＡＫＯ Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ Ｒｅｄ色素を使用して結合抗体を視覚化した。
Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ２０００Ｕ倒立顕微鏡、ＡＳＩ ＭＳ−２０００モーター駆動ステージ、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ Ｃａｓｃａｄｅ ＩＩ５１２カメラ及びＸ−ｃｉｔｅ１２０蛍光照明システムからなる自家製顕微鏡スライドスキャナーを使用してデータをコンパイルした。シグナル強度を、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ ｖ７．１イメージングソフトウェアを使用して解析した。
結果
結合ペプチドの位置及び配列を下記表３４に示す。数字は全体のシグナル強度に対するペプチドのシグナル強度百分率を示す。
４つすべての試験した抗体は、α２−β２領域周辺の特異的結合部位を示した。データは、試験抗体を２つのカテゴリーに分類することができ得ることを示す：抗体ｃ６３６及びｃ８７０はＶＥＧＦ−ＡのＣ末端側を好んだが、一方抗体ｃ１０３９及びｃ８６８はタンパク質のＮ末端側に対してより強い結合を有していた。抗体ｃ８７０は最少の結合ペプチドを有したが、一方抗体ｃ１０３９は最も分散した結合パターンを有した。各抗体の上位２つの結合部位を下記表３５に列挙する。
（実施例６３）
抗ＰＤＧＦＲβ抗体のエピトープマッピング
要約
この試験の目的は、ペプチドマイクロアレイイムノアッセイを使用して抗ＰＤＧＦＲβ分子の結合部位を決定することであった。この試験において、ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙテクノロジーを使用して５つの抗ＰＤＧＦＲ−β分子：抗ＰＤＧＦＲβＦａｂ ｃ５９７、抗ＰＤＧＦＲβｓｃＦｖｃ１０３５、抗ＰＤＧＦＲβｓｃＦｖｃ９４１、抗ＰＤＧＦＲβＩｇＧ１ｃ６００、ＰＤＧＦＲβｓｃＦｖｃ１２３２、及びマウス抗ＰＤＧＦＲβモノクローナル抗体（Ｅ９８９９）を評価した。
材料及び方法
ＲｅｐｌｉＴｏｐｅ（商標）ペプチドマイクロアレイを、ヒトＰＤＧＦＲβ（２０ａａオーバーラップ及び５ａａシフト）の一連のオーバーラップしているペプチドフラグメントとして調製した。プレート間の再現性のために、対照スポット及びペプチドの両方を、１つのスライドにつき３つの同一な複製アレイにおいてプリントした。結合分子を含むすべてのペプチド及び対照抗体を、リシン側鎖のアミノ官能基を使用して選択的固定化化学によって共有結合で接着させる。対照スポットは、ヒトＩｇＧ、ヤギＩｇＧ、マウスＩｇＧ、ｃ１０３５ｓｃＦｖ、ｃ５９７Ｆａｂ及びｃ９４１ｓｃＦｖからなっていた。
エピトープマッピングを、ＲｅｐｌｉＴｏｐｅ（商標）スライド上でヒトＰＤＧＦＲβに結合している抗ＰＤＧＦＲβ分子を検出することによって決定した。さらなる対照として、マウス抗ヒトＰＤＧＦＲβモノクローナル抗体（Ｅ９８９９；＋対照）及び抗ＶＥＧＦ−Ａ ｓｃＦｖ（−対照）を試験した。スライドを試験する前に、各抗ＰＤＧＦＲβ分子をドットブロット上で試験して一次及び二次抗体のおおよその使用濃度を決定した。各実験は２連で行った。
ＲｅｐｌｉＴｏｐｅ（商標）スライドを、ＰＢで希釈した抗ＰＤＧＦＲβ分子と１時間インキュベートした。Ｈｉｓ６標識抗ＰＤＧＦＲβ分子（ｃ１０３５、ｃ９４１、ｃ５９７及びｃ１２３２）を、以下に概略される方法に記述されている通り抗Ｈｉｓ６二次抗体で染色した。ｃ６００、抗ＰＤＧＦＲβ ＩｇＧ１をヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２フラグメントＦｃγ特異的二次抗体で染色した。Ｅ９８９９、マウスモノクローナルを、ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２フラグメントＦｃγ特異的二次で染色した。ビオチン化チラミド及びストレプトアビジンインキュベーション並びにその後のＴＮＴ洗浄ステップに続いて、スポットが見えるようになるがバックグラウンド染色が発色する前まで（１〜３０分）室温でインキュベートすることによってスライドをＤＡＫＯパーマネントレッドで発色させた。ｄＨ２Ｏですすぐことによって発色を停止させた。スライドを窒素で乾燥し、ペプチドスポットを明視野及び蛍光顕微鏡の両方で視覚化した。蛍光イメージング及びＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェアバージョン７．１を使用して、プレート画像をで４×倍率下でスキャンした。Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用して画像を視覚化し、抗ＰＤＧＦＲβ結合ペプチドの解析を容易にした。結合ペプチドスポットを手作業で決定し、視覚解析によって確認した。ペプチドマイクロアレイ解析の結果を下記表３６にまとめる。
（実施例６４）
２９３／ＫＤＲ／ＫＺ１３６／ｃ２２ ＶＥＧＦ−Ａに誘導される細胞ベースのルシフェラーゼアッセイを使用した中和抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体の同定
ＶＥＧＦ−Ａ活性を中和する能力について二重特異性分子をスクリーニングするために、細胞ベースのルシフェラーゼアッセイを行った。２９３／ＫＤＲ／ＫＺ１３６／ｃ２２細胞を、９６ウェル白色不透明組織培養処理プレート（Ｃｏｓｔａｒ ＃３９１７）において１００μｌの完全培地（ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１×ピルビン酸ナトリウム、１×ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中に１００００細胞／ウェルの播種密度でプレーティングし、３７℃の加湿された５％ＣＯ２インキュベーター中で４８時間インキュベートした。４８時間後、完全培地を真空吸引によって除去し、１００μｌの無血清培地（ＤＭＥＭ、１×ピルビン酸ナトリウム、１×ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））と交換し、一晩インキュベートした。翌日、候補ＶＥＧＦ−Ａ中和分子を、無血清培地中で非中和剤（培地のみ）とともに１：５希釈で２００ｎＭから１２ｐＭまで連続希釈した。これらに対して、０．２６ｎＭのＶＥＧＦ−Ａ及び１００ｎＭ〜６ｐＭの中和分子又は陽性対照の最終濃度になるように、等量のＶＥＧＦ−Ａ１６５を０．５４ｎＭで加えた。
これらを３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション後、培地を吸引除去し、血清飢餓細胞及び１００μｌの上記複合体を加え、３７℃で４時間インキュベートした。
４時間インキュベーション後、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ１５０１）を使用して製造業者の使用説明書に従ってルシフェラーゼアッセイを行った。簡潔に述べると、培地を吸引し、２５μｌの１×緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ１５３Ａ）を各ウェルに加えた。平衡化するためにプレートを室温で２０〜３０分間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性を、マイクロプレートルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、４０μｌの基質注入、１秒の積分時間を使用して測定した。データは解析ソフトウェア（Ｓｐｏｔｆｉｒｅ）を使用して解析し、各候補及び対照についてＩＣ５０値を計算した。
ＶＥＧＦ−Ａ１６５のその受容体ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）に結合する作用は、ＳＴＡＴ（シグナル伝達物質及び転写活性化因子）及び／又はルシフェラーゼレポーター遺伝子の転写を駆動するＳＲＥ（血清応答エレメント）を活性化するシグナル伝達カスケードを誘導する。ルシフェラーゼ活性の減少は、このＶＥＧＦ−Ａを介するシグナル伝達が中和されていることを示す。
結果
スクリーニングした多数の二重特異性物に顕著な阻害が示された（表３７においてＩＣ５０値として報告）。ＩＣ５０値は、ＶＥＧＦ−活性を５０％中和するために必要とされる二重特異性物のｎＭ濃度として示す。
（実施例６５）
ＶＥＧＦ−Ａ刺激ＨＵＶＥＣ細胞に対する抗ＶＥＧＦ−Ａ ＢｉＡｂ及びＢｉｓｃＦｖの中和活性を決定するための増殖アッセイ
ＶＥＧＦ−Ａに対して中程度の親和性を有した中和抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性物（ＢｉＡｂ及びＢｉｓｃＦｖ）についてスクリーニングするために、３Ｈ−チミジンアッセイを行った。組換えヒトＶＥＧＦ−Ａ１６５を、陽性対照として２．６ｎＭで使用した。１×インスリン−トランスフェリン−セレン（無血清培地、ＳＦＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含むＤＭＥＭ−Ｆ１２（１：１）培地を、陰性対照として使用した。二重特異性分子をＳＦＭにおいて５００ｎＭ、５０ｎＭ、５ｎＭ、０．５ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．００５ｎＭ、及び０．０００５ｎＭに連続希釈した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、９６ウェル平底プレート中に１００μＬの量で９００〜１０００細胞／ウェルの密度でプレーティングした。ＨＵＶＥＣ細胞を、完全ＥＧＭ−２ＭＶ培地（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）において２日間３７℃、５％ＣＯ２でプレーティングした。細胞をＳＦＭで２４時間血清飢餓状態にし、２．６ｎＭの連続希釈した又はしていないＶＥＧＦ−Ａ ｓｃＦｖで２４時間刺激し、増殖している細胞中に取り込まれる３Ｈ−チミジンのウェル当たり１μＣｉで２４時間パルスをかけた（すべて３７℃、５％ＣＯ２）。細胞を回収し、Ｔｏｐｃｏｕｎｔ装置（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して計数した。
結果
アッセイにおいてスクリーニングされた数多くの二重特異性物が、下記表３８及び３９に示す低ｎＭのＩＣ５０値によって見られるように、ＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ増殖の強力な中和を示した。

（実施例６６）
ＶＥＧＦＲ２リン酸化アッセイを使用したマウスＶＥＧＦ−Ａに対するＶＥＧＦ−Ａ結合ｓｃＦｖ及び二重特異性抗体の交差反応性試験
マウスＶＥＧＦ−Ａ活性を中和する能力について候補分子（ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、及び二重特異性）をスクリーニングするために、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）リン酸化を測定する細胞ベースのルミネックスアッセイを行った。ｍＶＥＧＦ−Ａ１６４はヒトＶＥＧＦＲ２に対して交差反応するので、ヒトＶＥＧＦＲ２ベースのレポーター系を利用することができる。２９３／ＫＤＲ／ＫＺ１３６／ｃ２２細胞を、透明９６ウェル組織培養プレートにおいて１００μｌの完全培地（ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１×ピルビン酸ナトリウム、１×ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中に２００００細胞／ウェルの密度でプレーティングし、一晩接着させた。翌日、完全培地を真空吸引によって除去し、１００μｌの無血清培地（ＤＭＥＭ、１×ピルビン酸ナトリウム、１×ＧｌｕｔａＭａｘ）と交換した。細胞を一晩インキュベートした。
翌日、候補ＶＥＧＦ−Ａ中和分子（ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）を、無血清培地中で非中和剤（培地のみ）とともに１：５希釈で２００ｎＭから１２ｐＭまで連続希釈した。ＶＥＧＦＲ２−Ｆｃを、中和のための陽性対照として使用した。これらに対して、０．２６ｎＭのＶＥＧＦ−Ａ及び１００ｎＭ〜６ｐＭの中和分子又は陽性対照の最終濃度になるように、等量のｍＶＥＧＦ−Ａ１６４（４９３−ＭＶ−００５、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を０．５４ｎＭで加えた。これらを３７℃で６０分間インキュベートした。
インキュベーション後、培地を真空吸引によって血清飢餓細胞から除去し、１００μｌの上記複合体と交換した。細胞を３７℃で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、培地を真空吸引によって除去し、細胞を１００μｌの氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で穏やかに洗浄した。ＰＢＳを真空吸引によって除去し、細胞を、１ｍＭ ＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ−２７１４、ＤＭＳＯ中）及びＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ１錠／１０ｍＬ（Ｒｏｃｈｅ、１１８３６１５３００１）を含有するＮＰ−４０溶解緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号ＦＮＮ００２１）２５μｌ中で溶解した。
溶解物を４℃で２０分間プラットフォームシェーカー上でインキュベートし、３０００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心分離にかけて透明な溶解物とした。溶解物を新しい９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、アッセイまで−２０℃に置いた。
ＶＥＧＦＲ２リン酸化ルミネックスアッセイのために、Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＬＨＢ０００２）及びＶＥＧＦＲ２［ｐＹ１０５９］Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｂｅａｄ Ｋｉｔ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＬＨＯ０６０１）を製造業者の使用説明書に従って使用した。溶解物を解凍し、８０μｌのＡｓｓａｙ Ｄｉｌｕｅｎｔと１：５混合した。ルミネックス真空ろ過プレートのウェルを、２００μｌのＷｏｒｋｉｎｇ Ｗａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで予め湿らせた。希釈したビーズをウェル当たり２５μｌ加え、２００μｌのＷｏｒｋｉｎｇ Ｗａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで２回洗浄した。洗浄後、５０μｌの希釈した溶解物、及び５０μｌの希釈した検出用抗体を各ウェルに加え、プレートをホイルに包み、室温（ＲＴ）で３時間プラットフォームシェーカー上で５００ｒｐｍでインキュベートした。インキュベーション後、ビーズを２００μｌのＷｏｒｋｉｎｇ Ｗａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで２回洗浄し、次いで１００μｌの希釈したＡｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ−ＲＰＥを各ウェルに加え、プレートをホイルに包み、室温で３０分間プラットフォームシェーカー上で５００ｒｐｍでインキュベートした。インキュベーション後、ビーズを２００μｌのＷｏｒｋｉｎｇ Ｗａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで３回洗浄し、１２５μｌのＷｏｒｋｉｎｇ Ｗａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ中に再懸濁した。ビーズをプラットフォームシェーカー上で３０秒間５００ｒｐｍで再懸濁し、Ｌｕｍｉｎｅｘ−１００装置（ＢｉｏＲａｄ）において読み取った。データは解析ソフトウェア（Ｓｐｏｔｆｉｒｅ）を使用して解析し、各候補及び対照についてＩＣ５０値を計算した。
結果
ｍＶＥＧＦ−Ａ１６４のヒト受容体であるＶＥＧＦ−Ｒ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）に結合する作用は、受容体のリン酸化を誘導する。このルミネックスベースのアッセイは、全ＶＥＧＦ−Ｒ２を、抗ＶＥＧＦＲ２抗体にコンジュゲートされた蛍光標識ビーズに結合させる。［ｐＹ１０５９］でのリン酸化を検出する二次抗体を使用して、どの程度のＶＥＧＦＲ２がリン酸化されたかを検出する。以下の表４０に示すように、ヒトＶＥＧＦ−Ａ活性を中和した多くのｓｃＦｖは、このアッセイにおいてマウスＶＥＧＦ活性も阻害した。これらの同じｓｃＦｖを含有する二重特異性抗体もまた、マウスＶＥＧＦ−Ａ活性を中和した。
（実施例６７）
マウスＶＥＧＦ−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ１６４）刺激ＨＵＶＥＣ細胞におけるｓｃＦｖの中和活性を決定するための増殖アッセイ
マウスＶＥＧＦ−Ａ中和ｓｃＦｖについてスクリーニングするために、３Ｈ−チミジンアッセイを行った。組換えマウスＶＥＧＦ−Ａ１６４を、陽性対照として２．６ｎＭで使用した。１×インスリン−トランスフェリン−セレン（無血清培地、ＳＦＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含むＤＭＥＭ−Ｆ１２（１：１）培地を、陰性対照として使用した。ｓｃＦｖ分子をＳＦＭにおいて５００ｎＭ、５０ｎＭ、５ｎＭ、０．５ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．００５ｎＭ、及び０．０００５ｎＭに連続希釈した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、９６ウェル平底プレート中に１００μＬの量で９００〜１０００細胞／ウェルの密度でプレーティングした。ＨＵＶＥＣ細胞を、完全ＥＧＭ−２ＭＶ培地（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）において２日間３７℃、５％ＣＯ２でプレーティングした。細胞をＳＦＭで２４時間血清飢餓状態にし、２．６ｎＭの連続希釈した又はしていないＶＥＧＦ−Ａ ｓｃＦｖで２４時間刺激し、増殖している細胞中に取り込まれる３Ｈ−チミジンのウェル当たり１μＣｉで２４時間パルスをかけた（すべて３７℃、５％ＣＯ２）。細胞を回収し、Ｔｏｐｃｏｕｎｔ装置（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して計数した。
結果
アッセイにおいてスクリーニングされた数多くのｓｃＦｖが、下記表４１に示す低ｎＭのＩＣ５０値によって見られるように、マウスＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ増殖の強力な中和を示した。
（実施例６８）
マウスＰＤＧＦＲβに対する抗ＰＤＧＦＲβｓＦａｂ及びｓｃＦｖの交差反応性を決定するためのルミネックスアッセイ
ヒトＰＤＧＦＲβｓｃＦｖの交差反応性をスクリーニングするために、ルミネックスベースのアッセイを行った。アッセイは、細胞溶解物中に存在するリン酸化されたＰＤＧＦＲβの量を検出する。マウス胎仔線維芽細胞（３Ｔ３−Ｓｗｉｓｓ ａｌｂｉｎｏ、Ｓｗｉｓｓ；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を９６ウェル平底プレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｐｒｉｎｇｓ、ＣＯ）において、１０００細胞／ウェルの密度で、完全培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ））中１００μｌの量で播種し、５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートした。２４〜４８時間後、完全培地を１×インスリン−トランスフェリン−セレン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ；無血清培地、ＳＦＭ）を含むＤＭＥＭ−Ｆ１２（１：１）培地と交換し、細胞をさらに１８〜２４時間前述通りインキュベートした。ＰＤＧＦＲβ−中和分子（ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）又は対照分子マウスＰＤＧＦＲβ−ヒトＦｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃１０４２−ＰＲ−１００）を、ＳＦＭにおいて２０００ｎＭ〜０．０２ｎＭまで連続１：４希釈した。血清飢餓細胞を、１５０μｌのＳＦＭ又はＳＦＭにおいて漸増させた抗ＰＤＧＦＲβ分子とともに５％ＣＯ２中３７℃で１時間インキュベートした。次いで細胞を、５０μｌの１．６ｎＭ ＰＤＧＦ−ＢＢ（０．４ｎＭ最終濃度、ＥＣ８０、８０％有効濃度）により５％ＣＯ２中３７℃で１０分間パルスした。ＰＤＧＦ−ＢＢ刺激を行わない対照ウェルが含まれていた。次いで細胞をＢｉｏ−Ｐｌｅｘ Ｃｅｌｌ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、製造業者の指示（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に従ってアッセイキットに入っていたＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒで溶解し、細胞上清を−２０℃で凍結した。解凍した細胞上清に、１×ホスホ−ＰＤＧＦＲβビーズを加え、振とう機において１８時間室温でインキュベートした。検出抗体を洗浄したビーズに加え、振とう機において３０分間室温でインキュベートし、次いでストレプトアビジン−ＰＥをビーズとともに室温で１５分間インキュベートした。ビーズをＢｉｏ−Ｐｌｅｘ Ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ中に再懸濁し、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘアレイリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において分析した。
結果：分析したｓｃＦｖ又はＦａｂはどれもマウスＰＤＧＦＲβに対して中和していなかった。
（実施例６９）
ＰＤＧＦ誘導性線維芽細胞増殖アッセイを使用したＰＤＧＦＲβに対する中和ＢｉｓｃＦｖ及びＢｉＡｂの同定
ヒトＰＤＧＦＲβヒト皮膚線維芽細胞のＰＤＧＦ−ＡＢ、−ＢＢ、−ＣＣ及び−ＤＤ活性化によって誘導される増殖を中和する能力について二重特異性候補分子（ｂｉｓｃ、ｂｉＡｂ）をスクリーニングするために、３Ｈ−チミジンアッセイを行った。アッセイは、増殖している細胞のＤＮＡ中に取り込まれた放射性標識ヌクレオチドの量を測定する。ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）を９６ウェル平底プレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｐｒｉｎｇｓ、ＣＯ）において、１００μｌ完全培地（ＭＥＭα（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）＋１０％ウシ胎仔血清）中１０００〜１５００細胞／ウェルの密度で、３７℃で５％ＣＯ２において播種した。２４時間後、完全培地を１×インスリン−トランスフェリン−セレン、０．１％ウシ血清アルブミン画分Ｖ、１ｍＭ ピルビン酸Ｎａ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ；無血清培地、ＳＦＭ）を含むＤＭＥＭ−Ｆ１２（１：１）培地と交換し、細胞をさらに１８〜２４時間前述通りインキュベートした。二重特異性分子（ｂｉｓｃＦｖ、ｂｉＡｂ）又はＰＤＧＦＲβに対する対照モノクローナル抗体（Ｅ９８９９）を、一定レベルのヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（０．２ｎＭ、ＥＣ８０、８０％有効濃度）、ヒトＰＤＧＦ−ＡＢ（３ｎＭ、ＥＣ８０、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヒトＰＤＧＦ−ＣＣ（１ｎＭ、ＥＣ８０）又はヒトＰＤＧＦ−ＤＤ（０．２ｎＭ、ＥＤ８０）の存在下でＳＦＭにおいて２００ｎＭ〜０．００２ｎＭまで連続１：１０希釈した。血清飢餓細胞を１００μｌのＳＦＭ、ＳＦＭ中ＥＣ８０のＰＤＧＦリガンド、又はＳＦＭ中ＥＣ８０のＰＤＧＦリガンドを含む漸増させた抗ＰＤＧＦＲβ分子でインキュベートした。６〜８時間後、１μＣｉの３Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を各ウェルに加え、細胞を通常通り１８〜２４時間インキュベートした。細胞をフィルタープレート上に回収し、Ｐａｃｋａｒｄ Ｔｏｐｃｏｕｎｔ装置を使用して３Ｈ−チミジンの取込みを決定した。
結果
ＢｉｓｃＦｖ及びＢｉＡｂは、下記表４２の低ｎＭのＩＣ５０値によって示されるように、リガンドＰＤＧＦ−ＡＢ、−ＢＢ、−ＣＣ及び−ＤＤによって誘導されるヒト初代線維芽細胞増殖の強力な中和を示した。ＨＤＦのＰＤＧＦ−ＡＢ及びＰＤＧＦ−ＣＣ誘導性増殖の中和は、二重特異性分子がＰＤＧＦＲβホモ二量体だけでなくＰＤＧＦＲβ／ＰＤＧＦＲαヘテロ二量体も中和することを示す。
（実施例７０）
ＰＤＧＦ−ＢＢ誘導性周皮細胞増殖アッセイを使用したＰＤＧＦＲβに対する中和ＢｉｓｃＦｖ及びＢｉＡｂの同定
ヒトＰＤＧＦＲβのＰＤＧＦ−ＢＢ活性化によって誘導される増殖を中和する能力について候補二重特異性分子（ｂｉｓｃＦｖ、ｂｉＡｂ）をスクリーニングするために、３Ｈ−チミジンアッセイを行った。アッセイは、増殖している細胞のＤＮＡ中に取り込まれた放射性標識ヌクレオチドの量を測定する。ヒト脳血管周皮細胞（ＨＢＶＰ；ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、９６ウェル平底プレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｐｒｉｎｇｓ、ＣＯ）において５００〜２０００細胞／ウェルの密度で、５％ＣＯ２中３７℃で１５０μｌの完全培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌサプリメントのウシ胎仔血清、周皮細胞増殖サプリメント、及びペニシリン−ストレプトマイシンを含むＳｃｉｅｎＣｅｌｌ周皮細胞培地（ＰＭ））において播種した。２４〜４８時間後、完全培地を１×インスリン−トランスフェリン−セレン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ；無血清培地、ＳＦＭ）を含むＤＭＥＭ−Ｆ１２（１：１）培地と交換し、細胞をさらに１８〜２４時間前述通りインキュベートした。ＰＤＧＦＲβ−中和分子（ｂｉｓｃＦｖ又はｂｉＡｂ）、ＰＤＧＦＲβに対する対照モノクローナル抗体（Ｅ９８９９）、又はＥ９８９９モノクローナル抗体のＦａｂフラグメントを、一定レベルのヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（０．４ｎＭ、ＥＣ８０、８０％有効濃度）の存在下で、ＳＦＭにおいて２０００ｎＭ〜０．０２ｎＭまで連続１：４希釈した。血清飢餓細胞を１５０μｌのＳＦＭ、ＳＦＭ中０．４ｎＭのＰＤＧＦ−ＢＢで、又は漸増させたａＰＤＧＦＲβ分子をＳＦＭ中０．４ｎＭのＰＤＧＦ−ＢＢでインキュベートした。１８〜２４時間後、１μＣｉの３Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を各ウェルに加え、細胞を通常通り３〜６時間インキュベートした。細胞をフィルタープレート上に回収し、Ｐａｃｋａｒｄ Ｔｏｐｃｏｕｎｔ装置を使用して３Ｈ−チミジンの取込みを決定した。
結果
ＢｉｓｃＦｖ及びＢｉＡｂは、下記表４３及び４４の低ｎＭのＩＣ５０値によって示されるように、ＰＤＧＦ−ＢＢによって誘導される周皮細胞増殖の強力な中和を示した。
（実施例７１）
ＰＤＧＦ−ＤＤ誘導性周皮細胞増殖アッセイを使用したＰＤＧＦＲβに対する中和二重特異性抗体の同定
ヒトＰＤＧＦＲβのＰＤＧＦ−ＤＤ活性化によって誘導される増殖を中和する能力について候補二重特異性分子をスクリーニングするために、３Ｈ−チミジンアッセイを行った。アッセイは、増殖している細胞のＤＮＡ中に取り込まれた放射性標識ヌクレオチドの量を測定する。ヒト脳血管周皮細胞（ＨＢＶＰ；ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、９６ウェル平底プレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｐｒｉｎｇｓ、ＣＯ）において５００〜２０００細胞／ウェルの密度で、５％ＣＯ２中３７℃で１５０μｌの完全培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌサプリメントのウシ胎仔血清、周皮細胞増殖サプリメント、及びペニシリン−ストレプトマイシンを含むＳｃｉｅｎＣｅｌｌ周皮細胞培地（ＰＭ））において播種した。２４〜４８時間後、完全培地を１×インスリン−トランスフェリン−セレン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ；無血清培地、ＳＦＭ）を含むＤＭＥＭ−Ｆ１２（１：１）培地と交換し、細胞をさらに１８〜２４時間前述通りインキュベートした。ＰＤＧＦＲβ中和分子（ｂｉｓｃＦｖ）、ＰＤＧＦＲβに対する対照モノクローナル抗体（Ｅ９８９９）を、一定レベルのヒトＰＤＧＦ−ＤＤ（０．２ｎＭ、ＥＣ８０、８０％有効濃度）又はヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（０．４ｎＭ ＥＣ８０、８０％有効濃度）の存在下で、ＳＦＭにおいて２０００ｎＭ〜０．０２ｎＭまで連続１：４希釈した。血清飢餓細胞を１５０μｌのＳＦＭ、ＳＦＭ中０．４ｎＭのＰＤＧＦ−ＢＢ若しくは０．２ｎＭ ＰＤＧＦ−ＤＤ、又はＳＦＭ中に０．２ｎＭのＰＤＧＦ−ＤＤ若しくは０．４ｎＭのＰＤＧＦ−ＢＢを含む漸増させた二重特異性分子とともにインキュベートした。１８〜２４時間後、１μＣｉの３Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を各ウェルに加え、細胞を通常通り３〜６時間インキュベートした。細胞をフィルタープレート上に回収し、Ｐａｃｋａｒｄ Ｔｏｐｃｏｕｎｔ装置を使用して３Ｈ−チミジンの取込みを決定した。
結果
ＢｉｓｃＦｖ、ｃ１０３５／ｃ８６８及びｃ１０３５／ｃ１０３９、並びにＢｉＡｂ、ｃ６００／ｃ１０３９は、下記表４５の低ｎＭのＩＣ５０値に示されるように、ＰＤＧＦ−ＤＤ誘導性周皮細胞増殖の強力な中和を示した。
（実施例７２）
周皮細胞におけるＰＤＧＦＲβリン酸化を決定するためのルミネックスベースのアッセイを使用したＰＤＧＦＲβに対する中和ｓＦａｂ及びｓｃＦｖの同定
中和ヒトＰＤＧＦＲβｓｃＦｖをスクリーニングするために、ルミネックスベースのアッセイを行った。アッセイは、細胞溶解物中に存在するリン酸化されたＰＤＧＦＲβの量を検出する。ヒト脳血管周皮細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、９６ウェル平底プレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｐｒｉｎｇｓ、ＣＯ）において、７５００細胞／ウェルの密度で、３７℃及び５％ＣＯ２で完全培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌサプリメントのウシ胎仔血清、周皮細胞増殖サプリメント、及びペニシリン−ストレプトマイシンを含むＳｃｉｅｎＣｅｌｌ周皮細胞培地（ＰＭ））中１００μｌの量で播種した。２日目に培地を、サプリメントを含まないＳｃｉｅｎＣｅｌｌ ＰＭと交換し、２４時間血清飢餓状態にした。３日目に培地を細胞から除去し、連続希釈した二重特異性抗体及びヒトＰＤＧＦＲβに対する対照モノクローナル抗体（Ｅ９８９９）をアッセイ培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ ＰＭ及び０．５％ウシ血清アルブミン）中５０μｌの量で加え、３７℃及び５％ＣＯ２で６０分間インキュベートした。ＰＤＧＦ−ＢＢを２×濃度で５０μｌ加えて０．４４ｎＭ（ＥＣ８０、８０パーセントで有効な濃度）の最終濃度にし、３７℃及び５％ＣＯ２で１０分間インキュベートした。
次いで細胞をＢｉｏ−Ｐｌｅｘ Ｃｅｌｌ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、製造業者の指示（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に従って溶解溶液で溶解し、細胞上清を−２０℃で凍結した。解凍した細胞上清に、１×ホスホ−ＰＤＧＦＲβビーズを加え、振とう機において１８時間室温でインキュベートした。検出抗体を洗浄したビーズに加え、振とう機において３０分間室温でインキュベートし、次いでストレプトアビジン−ＰＥをビーズとともに室温で１５分間インキュベートした。ビーズをＢｉｏ−Ｐｌｅｘ Ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ中に再懸濁し、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘアレイリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において分析した。
結果
二重特異性抗体は、下記表４６の低ｎＭのＩＣ５０値によって示されるように、ＰＤＧＦ−ＢＢによって誘導される強力なＰＤＧＦＲリン酸化中和を示した。
（実施例７３）
周皮細胞におけるＰＤＧＦ−ＤＤ誘導性ＰＤＧＦＲβリン酸化を中和する中和二重特異性抗体の同定
中和ヒトＰＤＧＦＲβ二重特異性抗体をスクリーニングするために、ルミネックスベースのアッセイを行った。アッセイは、細胞溶解物中に存在するリン酸化されたＰＤＧＦＲβの量を検出する。ヒト脳血管周皮細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、９６ウェル平底プレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｐｒｉｎｇｓ、ＣＯ）において、７５００細胞／ウェルの密度で、３７℃及び５％ＣＯ２で完全培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌサプリメントのウシ胎仔血清、周皮細胞増殖サプリメント、及びペニシリン−ストレプトマイシンを含むＳｃｉｅｎＣｅｌｌ周皮細胞培地（ＰＭ））中１００μｌの量で播種した。２日目に培地を、サプリメントを含まないＳｃｉｅｎＣｅｌｌ ＰＭと交換し、２４時間血清飢餓状態にした。３日目に培地を細胞から除去し、連続希釈した二重特異性抗体及びヒトＰＤＧＦＲβに対する対照モノクローナル抗体（Ｅ９８９９）をアッセイ培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ ＰＭ及び０．５％ウシ血清アルブミン）において５０μｌの量で加え、３７℃及び５％ＣＯ２で６０分間インキュベートした。ＰＤＧＦ−ＤＤ又はＰＤＧＦ−ＢＢを２×濃度で５０μｌ加えてそれぞれ０．２ｎＭのＰＤＧＦ−ＤＤ及び０．４４ｎＭのＰＤＧＦ−ＢＢ（ＥＣ８０、８０パーセントで有効な濃度）の最終濃度にし、３７℃及び５％ＣＯ２で１０分間インキュベートした。
次いで細胞をＢｉｏ−Ｐｌｅｘ Ｃｅｌｌ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、製造業者の指示（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に従って溶解溶液で溶解し、細胞上清を−２０℃で凍結した。解凍した細胞上清に、１×ホスホ−ＰＤＧＦＲβビーズを加え、振とう機において１８時間室温でインキュベートした。検出抗体を洗浄したビーズに加え、振とう機において３０分間室温でインキュベートし、次いでストレプトアビジン−ＰＥをビーズとともに室温で１５分間インキュベートした。ビーズをＢｉｏ−Ｐｌｅｘ Ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ中に再懸濁し、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘアレイリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において分析した。
結果
ＢｉｓｃＦｖｃ１０３５／ｃ８６８は、下記表４７の低ｎＭのＩＣ５０値によって示されるように、ＰＤＧＦ−ＢＢ又はＰＤＧＦ−ＤＤによって誘導されるＰＤＧＦＲβリン酸化の強力な中和を示した。
（実施例７４）
カニクイザルＰＤＧＦＲβに対するＰＤＧＦＲβ二重特異性抗体の交差反応性を決定するためのルミネックスアッセイ
カニクイザルＰＤＧＦＲβに対する二重特異性抗体の交差反応性をスクリーニングするために、ルミネックスベースのアッセイを行った。アッセイは、細胞溶解物中に存在するリン酸化されたＰＤＧＦＲβの量を検出する。カニクイザル皮膚細胞（ＣＹＮＯＭ−Ｋ１細胞）、（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を、９６ウェル平底プレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｐｒｉｎｇｓ、ＣＯ）において、７５００細胞／ウェルの密度で、完全培地（Ｅａｒｌｅ’ｓＭＥＭ、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸）中１００μｌの量で３７℃及び５％ＣＯ２で１日間播種した。２日目に細胞をＦＢＳを含まない培地に移し、２４時間血清飢餓状態にした。３日目に培地を細胞から除去し、連続希釈した二重特異性抗体及びＰＤＧＦＲβに対する対照モノクローナル抗体（Ｅ９８９９）をアッセイ培地（ＭＥＭ及び０．５％ウシ血清アルブミン及び２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ）中５０μｌの量で加え、３７℃及び５％ＣＯ２で６０分間インキュベートした。ＰＤＧＦ−ＢＢを２×濃度で５０μｌ加えて０．３３ｎＭ（ＥＣ８０、８０パーセントで有効な濃度）の最終濃度にし、３７℃及び５％ＣＯ２で１０分間インキュベートした。
次いで細胞をＢｉｏ−Ｐｌｅｘ Ｃｅｌｌ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、製造業者の指示（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に従って溶解溶液で溶解し、細胞上清を−２０℃で凍結した。解凍した細胞上清に、１×ホスホ−ＰＤＧＦＲβビーズを加え、振とう機において１８時間室温でインキュベートした。検出抗体を洗浄したビーズに加え、振とう機において３０分間室温でインキュベートし、次いでストレプトアビジン−ＰＥをビーズとともに室温で１５分間インキュベートした。ビーズをＢｉｏ−Ｐｌｅｘ Ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ中に再懸濁し、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘアレイリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において分析した。
結果
二重特異性抗体は、下記表４８の低ｎＭのＩＣ５０値によって示されるように、ＰＤＧＦ−ＢＢによって誘導される強力なＰＤＧＦＲβリン酸化中和を示した。
（実施例７５）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養発芽アッセイにおけるＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストによる内皮及び周皮細胞の増殖及び形態形成の阻害
要約
ＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性アンタゴニストの有効性を試験するために、内皮細胞及び周皮細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養系を樹立した。この共培養では、Ｃｙｔｏｄｅｘビーズ上にコートされたＨＵＶＥＣをヒト間葉系幹細胞とともにフィブリンゲルに埋め込む。細胞をＤ５５１ヒト線維芽細胞によって馴化したＥＧＭ−２完全培地中で増殖させる。実験の開始時（予防的状況）又は実験の８日目（治療的状況）に、示される濃度の対照アンタゴニスト、ＰＤＧＦＲβアンタゴニスト（抗ＰＤＧＦＲβ抗体Ｅ９８９９）、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニスト（ベバシズマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）又はＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性アンタゴニストを培養物に添加した。培養物をアンタゴニスト添加の７日後にＰＦＡで固定した。内皮細胞及び周皮細胞を、それぞれ抗ＰＥＣＡＭ及び抗α平滑筋アクチン（αＳＭＡ）抗体で染色した。対照ウェルにおいて、細胞は周皮細胞のコートによって保護された内皮細胞の芽を形成した。ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの添加は内皮の芽の数及び長さの減少をもたらしたのに対して、ＰＤＧＦＲβアンタゴニストは発芽長及び発芽数に影響を及ぼさなかったが周皮細胞を芽から解離させた。ＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性アンタゴニストは、周皮細胞の内皮芽からの解離だけでなく、内皮芽の数及び長さの減少をもたらした。ＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性アンタゴニストによる内皮芽の数及び長さの減少は、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニスト単独よりも顕著に大きかった。
試験設計
１日目に、Ｃｙｔｏｄｅｘ−３ビーズ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＨＵＶＥＣ（Ｌｏｎｚａ）で４００細胞／ビーズの比でコートし、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。２日目に、ＨＵＶＥＣビーズ（１００ビーズ／ウェル）を２４ウェル組織培養プレートのウェルにおいてヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ、Ｌｏｎｚａ、３００００細胞／ウェル）とともにフィブリンゲルに埋め込んだ。新しいＥＧＭ−２完全培地（Ｌｏｎｚａ）及びＤ５５１線維芽細胞馴化ＥＧＭ−２培地の１：１混合物を、２ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＨＧＦと一緒にこれらの細胞に加えた。実験の終了まで２日毎に培地を交換する。２日目に（共培養開始から、予防的状況）又は８日目に（ＥＣ芽及び周皮細胞コートが形成された後、治療的状況）アンタゴニストを培養に加えた。アンタゴニスト添加の７日後、細胞を４％ＰＦＡ中で一晩で４℃固定した。細胞を、抗ＰＥＣＡＭ又は抗ＳＭＡ抗体、続いて二次抗体（蛍光コンジュゲート）で染色した。次いで細胞を倒立蛍光顕微鏡によって観察し、６×画像を取り込んだ。各条件について１０ビーズ／ウェルの代表的な組をランダムに選択した。ビーズ周囲のすべての芽の全長を、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（バージョン７．１．６．０）において血管新生管形成アプリケーションを利用することによって測定した。パラメーターは以下の通りであった：最小近似幅１ピクセル、最大近似幅４０ピクセル、ローカルバックグラウンドより高い強度：４０グレーレベル（予防的状況）又は１００グレーレベル（治療的状況）。
結果
内皮芽に対するＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性アンタゴニストの作用を、図３及び４Ａ〜４Ｄにまとめる。対照アンタゴニスト処理したウェルにおいて、細胞は、周皮細胞のコートによって保護された内皮細胞の芽を形成した。予防的状況において、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニスト単独、ＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性分子（ｃ１０３５／ｃ８６８ ｂｉｓｃＦｖ、ｃ１０３５／ｃ１０３９ ｂｉｓｃＦｖ、ｃ５９７／ｃ１０３９ ｂｉＡｂ、及びｃ６００／ｃ１０３９ ｂｉＡｂ）、及びＶＥＧＦ−ＡとＰＤＧＦＲβアンタゴニストの組合せは、それぞれ対照と比較して内皮芽を阻害した（図３参照）。ＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性分子又はＶＥＧＦ−ＡとＰＤＧＦＲβアンタゴニストの組合せによる内皮芽の阻害は、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニスト単独よりも顕著に大きかった。（同上参照）。
治療的状況において、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニスト単独及びＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性分子−ｃ１０３５／ｃ８６８ ｂｉｓｃＦｖ（図４Ａ）、ｃ１０３５／ｃ１０３９ ｂｉｓｃＦｖ（図４Ｂ）、ｃ５９７／ｃ１０３９ ｂｉＡｂ（図４Ｃ）、及びｃ６００／ｃ１０３９ ｂｉＡｂ（図４Ｄ）−のそれぞれは、対照と比較して内皮発芽を阻害した。（ＶＥＧＦ−ＡとＰＤＧＦＲβアンタゴニストの組合せは治療的状況において試験しなかった。）ＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性分子による内皮芽の阻害は、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニスト単独よりも顕著に大きかった。（図４Ａ〜４Ｄを参照。）
（実施例７６）
受容体内部移行に対するＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦＡアンタゴニストの効果を測定するための免疫蛍光ベースの内部移行アッセイ
要約
抗体及び抗体様分子は、細胞表面受容体に結合すると、受容体の内部移行を媒介し得る。ＰＤＧＦ−ＢＢは、ＰＤＧＦＲβの活性化及び内部移行を誘導する。同様に、ＰＤＧＦＲβに対する抗体は内部移行を媒介することが示されており、このプロセスは抗体のアンタゴニスト活性に一部寄与する。２つのＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体−ｃ１０３５／ｃ１０３９ ｂｉｓｃＦｖ及びｃ１０３５／ｃ８６８ ｂｉｓｃＦｖ−が初代ヒト周皮細胞に結合したときに取り込まれる能力を試験した。二重特異性抗体のアームに予め結合したヒトＶＥＧＦ−Ａが、アンタゴニストによって媒介される内部移行を阻害するかどうかをもまた試験した。
材料及び方法
低継代数のヒト脳血管周皮細胞（ＨＢＶＰ）（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、４枚のチャンバーガラスＬａｂ−ＴｅｋＩＩチャンバースライド（カタログ番号１５４９１７Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬ）において、完全培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌサプリメントのウシ胎仔血清、周皮細胞増殖サプリメント、及びペニシリン−ストレプトマイシンを含むＳｃｉｅｎＣｅｌｌ周皮細胞培地（ＰＭ））中５００μｌ／チャンバーの量で、サブコンフルエントな状態でプレーティングした。チャンバースライドを、約７５％コンフルエンシーに達するまで３７℃及び５％ＣＯ２で１〜２日間インキュベートした。ＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦＡ抗体及び対照抗体の結合を４℃で行うため、すべてのスライドを氷上に置き、冷ＤＭＥＭ＋０．１％ＢＳＡで１回洗浄した。ＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦＡ抗体及び試験抗体を次いで、ＤＭＥＭ＋３％ＢＳＡ及びＨｅｐｅｓ緩衝液からなる結合緩衝液において１μｇ／ｍｌまで希釈した。各スライドを、２つの抗体、１つの対照抗体及び二次抗体のみの１つの対照ウェルが各チャンバースライドに指定されるように構成する。５００μｌ／ウェルのアンタゴニスト、対照、又は培地のみを各チャンバースライドに加える。１時間のインキュベーション後、Ｔ０スライドを、冷ＰＢＳで１回洗浄して１ｍｌ／ウェルのパラホルムアルデヒド溶液を加えることによって固定した。このＴ０スライドは、細胞表面における受容体発現を測定し、３７℃でインキュベートするスライドは経時的な受容体内部移行を測定する。残りのスライドを３７℃のインキュベーター中に置き、３０分、９０分、４時間及び６時間の時点で同様の方法で除去及び固定した。すべてのスライドを、固定後氷上に置いた。すべてのスライドを固定したら、ＰＢＳで１回洗浄し、−２０℃のＭｅｔＯＨで２分間透過処理した。スライドを冷ＰＢＳで再度洗浄した。この時点以降、室温で染色を行った。スライドを、ＰＢＳで作製した５０ｍＭ グリシン中で５分間室温でインキュベートした。グリシンを除去し、ＰＢＳで洗い流し、スライドをＰＢＳ（＃Ｓ−１０００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）中１０％正常ヤギ血清５００μｌ／ウェルにおいて３０分間ブロックした。ブロッキングステップ後、５００μｌ／ウェルの二次抗体を全ウェルに加えた。Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗マウス（カタログ番号Ａ１１０２９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、又はＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ヒト（カタログ番号Ａ１１０１３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を、ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．１％ＢＳＡからなる洗浄緩衝液において１：１５０希釈した。スライドを暗所において室温で４５分間インキュベートした。各スライドを、室温でＰＢＳ中に５分間浸漬することによって３回洗浄した。ＤＡＰＩ染色液を含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤の１滴を各チャンバー（カタログ番号Ｈ−１２００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ Ｃａｌｉｆ．）に加え、スライドをカバーグラスで覆い、蛍光顕微鏡下で調べた。Ｍｅｔａｖｕｅソフトウェアを使用して２色染色プロファイルを視覚化した。
いくつかの実験において、ＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体を、細胞に添加する前に５ｎＭヒトＶＥＧＦ−Ａでプレインキュベートした。その後内部移行を上述の通り行った。
結果
ｃ１０３５／ｃ１０３９及びｃ１０３５／ｃ８６８二重特異性抗体は、３７℃でインキュベーション後の細胞内の斑点状の染色に見られたように効率的に取り込まれた。ＶＥＧＦ−Ａによるプレインキュベーションは、これらの二重特異性分子の内部移行に影響を与えなかった。
（実施例７７）
ｐＨ６．０及びｐＨ７．４でのＦｃＲｎに対するＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの結合を測定するためのＦｃＲｎ結合アッセイ
要約
ＦｃＲｎ（新生児受容体）は、ＩｇＧのＦｃ領域に結合する重要な受容体である。この結合は細胞中への内部移行を誘導し、これらのＩｇＧは次いで血液循環中に「再循環される」。このことが、ＩｇＧが血清中で長い半減期を有する重要な理由である。生理的環境において見られることだが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体がＦｃＲｎにｐＨ６．０で結合しｐＨ７．４で解離する能力を試験した。
材料及び方法
２つのプレートをＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦＡ抗体及び対照抗体とともに配置した：１つはｐＨ６．０で洗浄し、１つはｐＨ７．４で洗浄した。１日目：２つのＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルエライザプレート（カタログ番号４４−２４０４）を、１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．３で作製した３００ｎｇ／ウェルのＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．カタログ番号３１０００）でコートした。プレートを４℃で一晩インキュベートした。２日目：プレートを、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で５回洗浄した。プレートを次いで、０．８％ＮａＣｌ、０．０２％、ＫＣｌ、０．１０２％Ｎａ２ＨＰＯ４、０．０２％ＫＨ２ＰＯ４、１％ＢＳＡ、０．０５％ポリソルベート、０．０５％Ｐｒｏｃｌｉｎ３００ ｐＨ７．２を含有するブロッキング緩衝液２５０μｌ／ウェルで１時間室温でブロックした。プレートを次いでＰＢＳＴで２回洗浄した。各ウェルを次いで、ＰＢＳＴ＋１％ＢＳＡ中で希釈した１５０ｎｇのビオチン化単鎖ＦｃＲｎ（ｓｃＦｃＲｎ）タンパク質（配列番号６４４のアミノ酸残基２１〜４０９）でコートした。プレートを室温で１時間インキュベートした。ＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦＡ抗体及び対照抗体（例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）を、ｐＨ６．０に調整した１００ｍＭ ＮａＰＯ４、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）、＋０．１％ＢＳＡ（ｐＨ６．０緩衝液）において１５０ｎＭ〜０．０７ｎＭの範囲の濃度で希釈した。試料を、各濃度５０μｌ／ウェルの量で２連で試験した。ｐＨ６．０緩衝液のみを対照として行い、各プレートのバックグラウンドレベルを決定した。プレートを室温で２時間インキュベートした。結合ステップ後、各プレートを別々の緩衝液中で洗浄した：１つのプレートを２５０μｌ／ウェルのｐＨ６．０緩衝液で洗浄し、１つのプレートを２５０μｌ／ウェルのｐＨ７．４に調整した１００ｍＭ ＮａＰＯ４、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）、０．１％ＢＳＡ（ｐＨ７．４緩衝液）で洗浄した。プレートを洗浄緩衝液において室温で、洗浄ステップを２０分毎に行って合計１時間インキュベートした。洗浄ステップに続いて、結合した抗体を１００μｌ／ウェルのＨＲＰヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ）２フラグメントＦｃガンマ特異的二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号１０９−０３６−０９８）で検出した。二次抗体をｐＨ６．０緩衝液において１：５０００希釈し、室温で１時間インキュベーションを行った。プレートを次いでＰＢＳＴで５回洗浄した。最後に、１００μｌのＴＭＢ（ＴＭＢＷ−１０００−０１、ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を各ウェルに加え、プレートを室温で約３分間発色させた。この時点で、１００μｌ／ウェルの停止緩衝液（ＳＴＰＲ−１００−０１、ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加えて反応をクエンチさせた。プレートを、分光光度計において４５０／５７０ｎｍの波長で読み取った。ＯＤ値を調べてｐＨ６．０での結合パターン及びｐＨ７．４での解離パターンを比較した。
結果
試験したすべての二重特異性分子（ｃ１０３５／ｃ１０３９ ｂｉｓｃＦｖ、ｃ１０３５／ｃ８６８ ｂｉｓｃＦｖ、ｃ１０３５／ｃ８７０ ｂｉｓｃＦｖ、ｃ５９７／ｃ１０３９ ｂｉＡｂ、ｃ５９７／ｃ８６８ ｂｉＡｂ、ｃ５９７／ｃ８７０ ｂｉＡｂ、ｃ６００／ｃ１０３９ ｂｉＡｂ、ｃ６００／ｃ８７０ ｂｉＡｂ、ｃ６００／ｃ８６８ ｂｉＡｂ）はＦｃＲｎにｐＨ６．０でよく結合し、ｐＨ７．４ではより少ない結合（解離）を示した。得られた曲線は、抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））で見られたものと同様であった。これらのデータは、二重特異性分子がＩｇＧ含有タンパク質について予想した通りＦｃＲｎに結合し、血清中で良好な半減期を有すると予想されることを示す。
（実施例７８）
抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体を使用したｉｎ ｖｉｖｏでのヒト神経膠芽腫細胞の阻害
ｉｎ ｖｉｖｏでのヒト神経膠芽腫細胞に対する抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体の抗腫瘍活性を評価するために、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス又はＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ群にＵ１１８、Ｕ２５１又はＵ８７−ＭＧ神経膠芽腫細胞を０日目に注入する。担癌マウス群（ｎ＝１０／群）に５〜７５μｇのヒト抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体を、腹腔内又は腫瘍周囲への注入によって、５〜３３日目まで１日おきに（ＥＯＤ）投与する。腫瘍体積を３回／週、６週間モニターする。抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体による腫瘍増殖（体積又は重量）の阻害は、それぞれのタンパク質がｉｎ ｖｉｖｏでヒト神経膠芽腫に対して阻害作用を有することを示唆する。
試験設計：８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃヌード又はＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の右脇腹の皮下に又は頭蓋壁中に同所性に、６×１０６個のＵ１１８、Ｕ２５１又はＵ８７−ＭＧ細胞を０日目に注入する。マウス群（ｎ＝１０／群）に、５μｇ〜７５μｇのヒト抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体を腹腔内又は腫瘍周囲に（皮下モデルのみについて）５〜３３日目まで、又は腫瘍が２００ｍｍ３の体積に到達したら注入する。注入は、全量２００μｌで行う。皮下腫瘍については、腫瘍増殖を３回／週、６週間、カリパス測定を使用してモニターする。式１／２＊（Ｂ）２＊Ｌ（ｍｍ３）を使用して腫瘍体積を計算する。同所性腫瘍については、試験終了時にマウスを屠殺し、腫瘍の重さを量って腫瘍量を評価できるようにする。
（実施例７９）
ＳＣＩＤマウスにおけるＡ６７３横紋筋肉腫細胞の増殖を阻害するＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体による予防処置
要約
マウスにおける腫瘍増殖に対してＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性アンタゴニストが活性を有するかどうかを試験するために、マウス群にＡ６７３横紋筋肉腫腫瘍を０日目に皮下注入した。マウス群（ｎ＝１０／ｇｐ）マウスに次いで０．０１ｍｇ／Ｋｇ〜１０ｍｇ／Ｋｇの対照試薬、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニスト、ＰＤＧＦＲβアンタゴニスト又はＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを２回／週、腫瘍接種の１日後から４週間注入した。腫瘍体積を３回／週、４週間モニターした。対照試薬を注入したマウスと比較して、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニスト、又はＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを注入したマウスにおいて顕著に小さい腫瘍は、腫瘍増殖の阻害に対するアンタゴニストの有効性を示した。各試験したＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの抗ＰＤＧＦＲβアームはマウスＰＤＧＦＲβと交差反応しないため、このモデルはＶＥＧＦを標的とする有効性についてのみ試験した。
試験設計
８〜１０週齢の雌Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の右脇腹に２×１０６個のＡ６７３細胞を０日目に皮下注入した。１日目から、マウス群（ｎ＝１０／群）に０．０１ｍｇ／Ｋｇ〜１０ｍｇ／Ｋｇの濃度の対照試薬、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニスト、ＰＤＧＦＲβアンタゴニスト、又はＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを２回／週、４週間腹腔内注入した。腫瘍増殖を３回／週、４週間、カリパス測定を使用してモニターした。式１／２＊（Ｂ）２＊Ｌ（ｍｍ３）を使用して腫瘍体積を計算した。試験終了時（最終投与から２４時間後）に、マウスを屠殺し、腫瘍の重さを量り、組織学的検査にかけた。腫瘍をＮＢＦ中で固定し、次いでマウス内皮細胞に特異的なＭＥＣＡ−３２抗体を使用して免疫組織化学によって血管密度について試験した。
結果
下記の表４９〜５１において示すように、様々な用量の二重特異性抗体は、ビヒクル処理したマウスと比較して腫瘍増殖を顕著に阻害した。二重特異性抗体で見られた有効性は、ベバシズマブ（ＶＥＧＦ−アンタゴニスト）で見られたものに匹敵するものであった。
（実施例８０）
ＳＣＩＤマウスにおけるＡ６７３ 横紋筋肉腫細胞の増殖を阻害するＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体による治療処置
要約
マウスにおける腫瘍増殖に対してＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性アンタゴニストが活性を有するかどうかを試験するために、マウス群にＡ６７３横紋筋肉腫腫瘍を０日目に皮下注入した。腫瘍が２００ｍｍ３の大きさに達したら、マウス群（ｎ＝１０／ｇｐ）マウスに次いで５ｍｇ／Ｋｇの対照試薬、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニスト、又はＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを２回／週、合計５回注入した。腫瘍体積を３回／週モニターした。対照試薬を注入したマウスと比較して、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニスト、又はＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを注入したマウスにおいて顕著に小さい腫瘍は、腫瘍増殖の阻害に対するアンタゴニストの有効性を示した。各試験したＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの抗ＰＤＧＦＲβアームはマウスＰＤＧＦＲβと交差反応しないため、このモデルはＶＥＧＦを標的とする有効性についてのみ試験した。
試験設計
８〜１０週齢の雌Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の右脇腹に２×１０６個のＡ６７３細胞を０日目に皮下注入した。腫瘍が２００ｍｍ３の大きさに達したら、マウス群（ｎ＝１０／群）に次いで５ｍｇ／Ｋｇの対照試薬、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニスト、又はＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを２回／週、５回用量を腹腔内注入した。腫瘍増殖を３回／週、カリパス測定を使用してモニターした。式１／２＊（Ｂ）２＊Ｌ（ｍｍ３）を使用して腫瘍体積を計算した。試験終了時（最終投与から２４時間後）に、マウスを屠殺し、腫瘍の重さを量った。
結果
下記の表５２において示すように、二重特異性抗体はビヒクル処理したマウスと比較して腫瘍増殖を顕著に阻害した。二重特異性抗体で見られた有効性は、同じ用量のベバシズマブ（ＶＥＧＦ−アンタゴニスト）で見られたものに匹敵するものであった。
（実施例８１）
ＰＤＧＦリガンドによって誘導されるＰＤＧＦＲβリン酸化に対するＰＤＧＦＲβ／ＶＥＧＦ−Ａ二重特異性抗体の中和活性を決定するためのルミネックスアッセイ
様々なＰＤＧＦリガンドに対する二重特異性抗体の中和活性についてスクリーニングするために、ヒトＰＤＧＦＲβ（ＢＨＫ５７０Ｅ１０．２Ｂ３、実施例２０及び２１参照）でトランスフェクトしたＢＨＫ細胞のＰＤＧＦ刺激後にルミネックスベースのアッセイを行った。アッセイは、細胞溶解物中に存在するリン酸化されたＰＤＧＦＲβの量を検出する。ヒトＰＤＧＦＲβトランスフェクトＢＨＫ５７０Ｅ１０．２Ｂ３細胞を、９６ウェル平底プレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｐｒｉｎｇｓ、ＣＯ）において、７５００細胞／ウェルの密度で、完全培地中１００μｌの量で３７℃及び５％ＣＯ２で播種した。翌日、培地を細胞から除去し、連続希釈した二重特異性分子（ＢｉｓｃＦｖ及びＢｉＡｂ）及びＰＤＧＦＲβに対する対照モノクローナル抗体（Ｅ９８９９）を無血清アッセイ培地において５０μｌの量で加え、３７℃及び５％ＣＯ２で６０分間インキュベートした。ヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（０．２ｎＭ、ＥＣ８０、８０％有効濃度）、ヒトＰＤＧＦ−ＡＢ（３ｎＭ、ＥＣ８０、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヒトＰＤＧＦ−ＣＣ（１ｎＭ、ＥＣ８０）又はヒトＰＤＧＦ−ＤＤ（０．２ｎＭ、ＥＤ８０）を５０μＬの量で細胞に加え、３７℃及び５％ＣＯ２で１０分間インキュベートした。
次いで細胞をＢｉｏ−Ｐｌｅｘ Ｃｅｌｌ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、製造業者の指示（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に従って溶解溶液で溶解し、細胞上清を−２０℃で凍結した。解凍した細胞上清に、１×ホスホ−ＰＤＧＦＲβビーズを加え、振とう機において１８時間室温でインキュベートした。検出抗体を洗浄したビーズに加え、振とう機において３０分間室温でインキュベートし、次いでストレプトアビジン−ＰＥをビーズとともに室温で１５分間インキュベートした。ビーズをＢｉｏ−Ｐｌｅｘ Ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ中に再懸濁し、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘアレイリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において分析した。
結果
ＢｉｓｃＦｖ及びＢｉＡｂは、下記表の低ｎＭのＩＣ５０値によって示されるように、様々なＰＤＧＦリガンドによって誘導される強力なＰＤＧＦＲリン酸化中和を示した。これらのデータは、これらのＢＨＫ細胞が残留レベルのウシＰＤＧＦＲαを発現するために、ＢｉｓｃＦｖ及びＢｉＡｂがＰＤＧＦＲβ／βホモ二量体により媒介されまたＰＤＧＦＲα／βヘテロ二量体にも起因する活性を中和することを示唆する。
前述のことから、本発明の特定の実施形態を例示の目的で本明細書において説明してきたが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく様々な変更がなされてもよいことが理解されるであろう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲によるものを除いて限定されない。本明細書において引用されたすべての出版物、特許、及び特許出願は、すべての目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (118)

  1. ＰＤＧＦＲβの細胞外ドメインに結合し、ＰＤＧＦＲβ活性を中和する単離抗体であって、前記抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＬドメイン並びにＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＨドメインを含み、
    ＬＣＤＲ１が配列番号４３３に示すアミノ酸配列を有し、
    ＬＣＤＲ２が配列番号４３４に示すアミノ酸配列を有し、
    ＬＣＤＲ３が配列番号４３５に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ１が配列番号４３６に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ２が配列番号４３７に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ３が配列番号４３８〜４４２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、
    抗体。
  2. ＬＣＤＲ１が配列番号４４３に示すアミノ酸配列を有し、
    ＬＣＤＲ３が配列番号４４４に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ１が配列番号４４５に示すアミノ酸配列を有する、
    請求項１に記載の抗体。
  3. ＨＣＤＲ１が配列番号４４６に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ２が配列番号４４７に示すアミノ酸配列を有する、
    請求項２に記載の抗体。
  4. ＨＣＤＲ３が配列番号４４１及び４４２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の抗体。
  5. ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０に示すアミノ酸配列を有する、
    ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号１２の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０に示すアミノ酸配列を有する、
    ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２４の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１１に示すアミノ酸配列を有する、
    ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号３６の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０に示すアミノ酸配列を有する、又は
    ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１１に示すアミノ酸配列を有する、
    請求項２に記載の抗体。
  6. ＬＣＤＲ２が配列番号６又は１０の残基５６〜６２に示すアミノ酸配列を有し、
    ＬＣＤＲ３が配列番号６、１０又は４６の残基９５〜１０３に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ１が配列番号８、１２、２４、３６又は４８の残基３１〜３５に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ２が配列番号８、１２、２４、３６又は４８の残基５０〜６６に示すアミノ酸配列を有する、
    請求項２に記載の抗体。
  7. （ａ）ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６の残基５６〜６２及び残基９５〜１０３に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０に示すアミノ酸配列を有する、
    （ｂ）ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がそれぞれ配列番号１０の残基５６〜６２及び残基９５〜１０３に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号１２の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０に示すアミノ酸配列を有する、
    （ｃ）ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２２の残基５６〜６２及び残基９５〜１０３に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２４の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１１に示すアミノ酸配列を有する、
    （ｄ）ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がそれぞれ配列番号３４の残基５６〜６２及び残基９５〜１０３に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号３６の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０に示すアミノ酸配列を有する、
    （ｅ）ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がそれぞれ配列番号３８の残基５６〜６２及び残基９５〜１０３に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４０の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０に示すアミノ酸配列を有する、又は
    （ｆ）ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４６の残基５６〜６２及び残基９５〜１０３に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１１に示すアミノ酸配列を有する、
    請求項６に記載の抗体。
  8. 前記ＶＬ及びＶＨドメインがそれぞれ配列番号６及び８に示すアミノ酸配列を含む、
    前記ＶＬ及びＶＨドメインがそれぞれ配列番号１０及び１２に示すアミノ酸配列を含む、
    前記ＶＬ及びＶＨドメインがそれぞれ配列番号２２及び２４に示すアミノ酸配列を含む、
    前記ＶＬ及びＶＨドメインがそれぞれ配列番号３４及び３６に示すアミノ酸配列を含む、
    前記ＶＬ及びＶＨドメインがそれぞれ配列番号３８及び４０に示すアミノ酸配列を含む、又は
    前記ＶＬ及びＶＨドメインがそれぞれ配列番号４６及び４８に示すアミノ酸配列を含む、
    請求項６に記載の抗体。
  9. ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がそれぞれ配列番号６の残基５６〜６２及び残基９５〜１０３に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれ（ｉ）配列番号８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０に、又は（ｉｉ）配列番号１２の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０に示すアミノ酸配列を有する、
    請求項６に記載の抗体。
  10. 前記ＶＬ及びＶＨドメインがそれぞれ配列番号６及び８に示すアミノ酸配列を含む、
    前記ＶＬ及びＶＨドメインがそれぞれ配列番号１０及び１２に示すアミノ酸配列を含む、又は
    前記ＶＬ及びＶＨドメインがそれぞれ配列番号３８及び４０に示すアミノ酸配列を含む、
    請求項９に記載の抗体。
  11. ＰＤＧＦＲβの細胞外ドメインに結合し、ＰＤＧＦＲβ活性を中和する単離抗体であって、前記抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＬドメイン並びにＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＨドメインを含み、ＶＬ及びＶＨのＣＤＲの前記組が、
    （ａ）それぞれ配列番号６の残基２４〜４０、残基５６〜６２及び残基９５〜１０３に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、
    （ｂ）それぞれ配列番号１０の残基２４〜４０、残基５６〜６２及び残基９５〜１０３に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号１２の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、
    （ｃ）それぞれ配列番号２２の残基２４〜４０、残基５６〜６２及び残基９５〜１０３に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号２４の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１１に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、
    （ｄ）それぞれ配列番号３４の残基２４〜４０、残基５６〜６２及び残基９５〜１０３に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号３６の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、
    （ｅ）それぞれ配列番号４６の残基２４〜４０、残基５６〜６２及び残基９５〜１０３に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号４８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１１に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３
    からなる群より選択されるＣＤＲの第２の組に対して３つ以下のアミノ酸置換を有する抗体。
  12. ＣＤＲの前記組における０個、１個又は２個のアミノ酸置換を含む、請求項１１に記載の抗体。
  13. 単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の抗体。
  14. ＰＤＧＦＲβの細胞外ドメインに結合し、ＰＤＧＦＲβ活性を中和する単離抗体であって、前記抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＬドメイン並びにＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＨドメインを含み、ＶＬ及びＶＨのＣＤＲの前記組が、
    ＬＣＤＲ１が配列番号１８の残基２４〜３４に示すアミノ酸配列を有し、
    ＬＣＤＲ２が配列番号１８の残基５０〜５６に示すアミノ酸配列を有し、
    ＬＣＤＲ３が配列番号１８の残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ１が配列番号２０の残基３１〜３５に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ２が配列番号２０の残基５０〜６６に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ３が配列番号２０の残基９９〜１１５に示すアミノ酸配列を有する
    ＣＤＲの第２の組に対して３つ以下のアミノ酸置換を有する抗体。
  15. ＣＤＲの前記組における０個、１個又は２個のアミノ酸置換を含む、請求項１４に記載の抗体。
  16. ＣＤＲの前記組における０個の置換を含む、請求項１５に記載の抗体。
  17. 前記ＶＬドメインが配列番号１８に示すアミノ酸配列を含み、前記ＶＨドメインが配列番号２０に示すアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の抗体。
  18. 単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である、請求項１４から１７までのいずれか一項に記載の抗体。
  19. ＰＤＧＦＲβの細胞外ドメインに結合し、ＰＤＧＦＲβ活性を中和する単離抗体であって、配列番号４の残基２５１〜２７０に示すＰＤＧＦＲβのポリペプチド領域内に含まれる１つ又は複数のアミノ酸を含むエピトープに結合する抗体。
  20. それぞれ配列番号６及び８に示すアミノ酸配列を含むＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む抗体、
    それぞれ配列番号１０及び１２に示すアミノ酸配列を含むＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む抗体、
    それぞれ配列番号２２及び２４に示すアミノ酸配列を含むＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む抗体、
    それぞれ配列番号４６及び４８に示すアミノ酸配列を含むＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む抗体
    からなる群より選択される、請求項１９に記載の抗体。
  21. 前記エピトープが、配列番号４の残基１９６〜２０５又は１９１〜２１０に示すＰＤＧＦＲβの第２のポリペプチド領域内に含まれる１つ又は複数のアミノ酸をさらに含む、請求項１９に記載の抗体。
  22. それぞれ配列番号２２及び２４に示すアミノ酸配列を含むＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む抗体、
    それぞれ配列番号４６及び４８に示すアミノ酸配列を含むＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む抗体
    からなる群より選択される、請求項２１に記載の抗体。
  23. 前記エピトープが、オーバーラップしているＰＤＧＦＲβ（配列番号４）２０ｍｅｒペプチドの使用を含むペプチドマイクロアレイエピトープマッピングにより決定されるエピトープである、請求項１９から２２までのいずれか一項に記載の抗体。
  24. 単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である、請求項１９から２３までのいずれか一項に記載の抗体。
  25. ＶＥＧＦ−Ａにも結合する二重特異性抗体である、請求項１から２４までのいずれか一項に記載の抗体。
  26. 請求項１から２５までのいずれか一項に記載の抗体、及び
    薬学的に許容される担体
    を含む医薬組成物。
  27. ＶＥＧＦ−Ａに結合し、ＶＥＧＦ−Ａ活性を中和する単離抗体であって、前記抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＬドメイン並びにＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＨドメインを含み、
    ＬＣＤＲ１が配列番号４４８に示すアミノ酸配列を有し、
    ＬＣＤＲ２が配列番号４４９に示すアミノ酸配列を有し、
    ＬＣＤＲ３が配列番号４５０に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ１が配列番号４５１に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ２が配列番号４５２に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ３が配列番号４５３〜４６１からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、
    抗体。
  28. ＬＣＤＲ１が配列番号４６２に示すアミノ酸配列を有し、
    ＬＣＤＲ２が配列番号４６４に示すアミノ酸配列を有し、
    ＬＣＤＲ３が配列番号４６６に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ１が配列番号４６８に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ２が配列番号４７０に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ３が配列番号４５３〜４５９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、
    請求項２７に記載の抗体。
  29. ＬＣＤＲ１及びＬＣＤＲ２がそれぞれ配列番号１７０の残基２４〜３４及び残基５０〜５６に示すアミノ酸配列を有する、
    ＬＣＤＲ１及びＬＣＤＲ２がそれぞれ配列番号２４２の残基２４〜３４及び残基５０〜５６に示すアミノ酸配列を有する、
    ＬＣＤＲ１及びＬＣＤＲ２がそれぞれ配列番号２７８の残基２４〜３４及び残基５０〜５６に示すアミノ酸配列を有する、
    ＬＣＤＲ１及びＬＣＤＲ２がそれぞれ配列番号３０６の残基２４〜３４及び残基５０〜５６に示すアミノ酸配列を有する、
    ＬＣＤＲ１及びＬＣＤＲ２がそれぞれ配列番号３２２の残基２４〜３４及び残基５０〜５６に示すアミノ酸配列を有する、
    ＬＣＤＲ１及びＬＣＤＲ２がそれぞれ配列番号３３０の残基２４〜３４及び残基５０〜５６に示すアミノ酸配列を有する、
    ＬＣＤＲ１及びＬＣＤＲ２がそれぞれ配列番号３７４の残基２４〜３４及び残基５０〜５６に示すアミノ酸配列を有する、
    ＬＣＤＲ１及びＬＣＤＲ２がそれぞれ配列番号３９４の残基２４〜３４及び残基５０〜５６に示すアミノ酸配列を有する、又は
    ＬＣＤＲ１及びＬＣＤＲ２がそれぞれ配列番号４２６の残基２４〜３４及び残基５０〜５６に示すアミノ酸配列を有する、
    請求項２８に記載の抗体。
  30. ＨＣＤＲ１が配列番号１７２、２４４、２８０、３０８又は３２４の残基３１〜３５に示すアミノ酸配列を有する、請求項２８又は２９に記載の抗体。
  31. ＨＣＤＲ１が配列番号２８０の残基３１〜３５に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ２が配列番号２８０、３７６又は４２８の残基５０〜６６に示すアミノ酸配列を有する、
    請求項３０に記載の抗体。
  32. ＬＣＤＲ１が配列番号４６３に示すアミノ酸配列を有し、
    ＬＣＤＲ２が配列番号４６５に示すアミノ酸配列を有し、
    ＬＣＤＲ３が配列番号４６７に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ１が配列番号２８０の残基３１〜３５に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ２が配列番号２８０の残基５０〜６６に示すアミノ酸配列を有する、
    請求項３１に記載の抗体。
  33. ＨＣＤＲ３が配列番号４５３、４５８及び４５９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項３２に記載の抗体。
  34. ＬＣＤＲ１が配列番号１７０、３３０、３９４又は４２６の残基２４〜３４に示すアミノ酸配列を有し、
    ＬＣＤＲ２が配列番号１７０、２４２、３２２、３３０、３９４又は４２６の残基５０〜５６に示すアミノ酸配列を有し、
    ＬＣＤＲ３が配列番号１７０、２４２、２７８、３９４又は４２６の残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ１が配列番号１７２、２４４、２８０、３０８又は３２４の残基３１〜３５に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ２が配列番号１７２、２４４、２８０又は３２４の残基５０〜６６に示すアミノ酸配列を有する、
    請求項２８に記載の抗体。
  35. （ａ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がそれぞれ配列番号１７０の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号１７２の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０２に示すアミノ酸配列を有する、
    （ｂ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２４２の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２４４の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０７に示すアミノ酸配列を有する、
    （ｃ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２７８の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２８０の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０に示すアミノ酸配列を有する、
    （ｄ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がそれぞれ配列番号３０６の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号３０８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０に示すアミノ酸配列を有する、
    （ｅ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がそれぞれ配列番号３２２の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号３２４の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１１に示すアミノ酸配列を有する、
    （ｆ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がそれぞれ配列番号３３０の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号３３２の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０２に示すアミノ酸配列を有する、
    （ｇ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がそれぞれ配列番号３７４の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号３７６の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０８に示すアミノ酸配列を有する、
    （ｈ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がそれぞれ配列番号３９４の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号３９６の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０２に示すアミノ酸配列を有する、又は
    （ｉ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４２６の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４２８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０７に示すアミノ酸配列を有する、
    請求項３４に記載の抗体。
  36. 前記ＶＬ及びＶＨドメインがそれぞれ配列番号１７０及び１７２に示すアミノ酸配列を含む、
    前記ＶＬ及びＶＨドメインがそれぞれ配列番号２４２及び２４４に示すアミノ酸配列を含む、
    前記ＶＬ及びＶＨドメインがそれぞれ配列番号２７８及び２８０に示すアミノ酸配列を含む、
    前記ＶＬ及びＶＨドメインがそれぞれ配列番号３０６及び３０８に示すアミノ酸配列を含む、
    前記ＶＬ及びＶＨドメインがそれぞれ配列番号３２２及び３２４に示すアミノ酸配列を含む、
    前記ＶＬ及びＶＨドメインがそれぞれ配列番号３３０及び３３２に示すアミノ酸配列を含む、
    前記ＶＬ及びＶＨドメインがそれぞれ配列番号３７４及び３７６に示すアミノ酸配列を含む、
    前記ＶＬ及びＶＨドメインがそれぞれ配列番号３９４及び３９６に示すアミノ酸配列を含む、又は
    前記ＶＬ及びＶＨドメインがそれぞれ配列番号４２６及び４２８に示すアミノ酸配列を含む、
    請求項３４に記載の抗体。
  37. ＶＥＧＦ−Ａに結合し、ＶＥＧＦ−Ａ活性を中和する単離抗体であって、前記抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＬドメイン並びにＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＨドメインを含み、ＶＬ及びＶＨのＣＤＲの前記組が、
    （ａ）それぞれ配列番号１７０の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号１７２の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０２に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、
    （ｂ）それぞれ配列番号２４２の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号２４４の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０７に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、
    （ｃ）それぞれ配列番号２７８の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号２８０の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、
    （ｄ）それぞれ配列番号３０６の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号３０８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、
    （ｅ）それぞれ配列番号３２２の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号３２４の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１１に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、
    （ｆ）それぞれ配列番号３３０の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号３３２の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０２に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、
    （ｇ）それぞれ配列番号３７４の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号３７６の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０８に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、
    （ｈ）それぞれ配列番号３９４の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号３９６の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０２に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに
    （ｉ）それぞれ配列番号４２６の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号４２８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０７に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３
    からなる群より選択されるＣＤＲの第２の組に対して３つ以下のアミノ酸置換を有する抗体。
  38. ＣＤＲの前記組における０個、１個又は２個のアミノ酸置換を含む、請求項３７に記載の抗体。
  39. 単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である、請求項２７から３８までのいずれか一項に記載の抗体。
  40. ＶＥＧＦ−Ａに結合し、ＶＥＧＦ−Ａ活性を中和する単離抗体であって、前記抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＬドメイン並びにＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＨドメインを含み、
    ＬＣＤＲ１が配列番号４６２に示すアミノ酸配列を有し、
    ＬＣＤＲ２が配列番号４６３に示すアミノ酸配列を有し、
    ＬＣＤＲ３が配列番号４６４及び４６５からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ１が配列番号４６６に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ２が配列番号４６７に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ３が配列番号４６８〜４７０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、
    抗体。
  41. ＬＣＤＲ１が配列番号４７１に示すアミノ酸配列を有し、
    ＬＣＤＲ２が配列番号４７４に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ１が配列番号４７７に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ２が配列番号４７８に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ３が配列番号４６８及び４６９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、
    請求項４０に記載の抗体。
  42. ＬＣＤＲ１が配列番号４７２に示すアミノ酸配列を有し、
    ＬＣＤＲ２が配列番号４７５に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ１が配列番号４７７に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ２が配列番号４７８に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ３が配列番号４６８及び４６９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、
    請求項４０に記載の抗体。
  43. ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２４８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０２に示すアミノ酸配列を有する、請求項４２に記載の抗体。
  44. ＬＣＤＲ２が配列番号４７９に示すアミノ酸配列を有し、
    ＬＣＤＲ３が配列番号４８０に示すアミノ酸配列を有する、
    請求項４３に記載の抗体。
  45. ＬＣＤＲ１が配列番号２１４、２４６、２７４、２８６、３１０、３３８又は３５４の残基２３〜３５に示すアミノ酸配列を有し、
    ＬＣＤＲ２が配列番号２１４、２４６、２７４、２８６、３１０、３３８又は３５４の残基５１〜５７に示すアミノ酸配列を有し、
    ＬＣＤＲ３が配列番号４６５に、又は配列番号２１４、２４６、２７４、２８６、３１０若しくは３３８の残基９０〜１００に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ１が配列番号２１６、２４８又は３５６の残基３１〜３５に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ２が配列番号２１６、２４８又は３５６の残基５０〜６６に示すアミノ酸配列を有する、
    請求項４０に記載の抗体。
  46. （ａ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２１４の残基２３〜３５、残基５１〜５７及び残基９０〜１００に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２１６の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０に示すアミノ酸配列を有する、
    （ｂ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２４６の残基２３〜３５、残基５１〜５７及び残基９０〜１００に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２４８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０２に示すアミノ酸配列を有する、
    （ｃ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２７４の残基２３〜３５、残基５１〜５７及び残基９０〜１００に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２７６の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０２に示すアミノ酸配列を有する、
    （ｄ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２８６の残基２３〜３５、残基５１〜５７及び残基９０〜１００に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２８８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０２に示すアミノ酸配列を有する、
    （ｅ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がそれぞれ配列番号３１０の残基２３〜３５、残基５１〜５７及び残基９０〜１００に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号３１２の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０２に示すアミノ酸配列を有する、
    （ｆ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がそれぞれ配列番号３３８の残基２３〜３５、残基５１〜５７及び残基９０〜１００に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号３４０の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０２に示すアミノ酸配列を有する、又は
    （ｇ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がそれぞれ配列番号３５４の残基２３〜３５、残基５１〜５７及び残基９０〜１０６に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号３５６の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０７に示すアミノ酸配列を有する、
    請求項４５に記載の抗体。
  47. 前記ＶＬ及びＶＨドメインがそれぞれ配列番号２１４及び２１６に示すアミノ酸配列を含む、
    前記ＶＬ及びＶＨドメインがそれぞれ配列番号２４６及び２４８に示すアミノ酸配列を含む、
    前記ＶＬ及びＶＨドメインがそれぞれ配列番号２７４及び２７６に示すアミノ酸配列を含む、
    前記ＶＬ及びＶＨドメインがそれぞれ配列番号２８６及び２８８に示すアミノ酸配列を含む、
    前記ＶＬ及びＶＨドメインがそれぞれ配列番号３１０及び３１２に示すアミノ酸配列を含む、
    前記ＶＬ及びＶＨドメインがそれぞれ配列番号３３８及び３４０に示すアミノ酸配列を含む、又は
    前記ＶＬ及びＶＨドメインがそれぞれ配列番号３５４及び３５６に示すアミノ酸配列を含む、
    請求項４５に記載の抗体。
  48. ＶＥＧＦ−Ａに結合し、ＶＥＧＦ−Ａ活性を中和する単離抗体であって、前記抗体は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＬドメイン並びにＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のＣＤＲを含むＶＨドメインを含み、ＶＬ及びＶＨのＣＤＲの前記組が、
    （ａ）それぞれ配列番号２１４の残基２３〜３５、残基５１〜５７及び残基９０〜１００に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号２１６の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、
    （ｂ）それぞれ配列番号２４６の残基２３〜３５、残基５１〜５７及び残基９０〜１００に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号２４８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０２に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、
    （ｃ）それぞれ配列番号２７４の残基２３〜３５、残基５１〜５７及び残基９０〜１００に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号２７６の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０２に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、
    （ｄ）それぞれ配列番号２８６の残基２３〜３５、残基５１〜５７及び残基９０〜１００に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号２８８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０２に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、
    （ｅ）それぞれ配列番号３１０の残基２３〜３５、残基５１〜５７及び残基９０〜１００に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号３１２の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０２に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、
    （ｆ）それぞれ配列番号３３８の残基２３〜３５、残基５１〜５７及び残基９０〜１００に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号３４０の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０２に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、
    （ｇ）それぞれ配列番号３５４の残基２３〜３５、残基５１〜５７及び残基９０〜１０６に示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号３５６の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０７に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３
    からなる群より選択されるＣＤＲの第２の組に対して３つ以下のアミノ酸置換を有する抗体。
  49. ＣＤＲの前記組における０個、１個又は２個のアミノ酸置換を含む、請求項４８に記載の抗体。
  50. 単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である、請求項４０から４９までのいずれか一項に記載の抗体。
  51. ＶＥＧＦ−Ａに結合し、ＶＥＧＦ−Ａ活性を中和する単離抗体であって、前記抗体は、（ａ）配列番号２の残基４２〜５２に示すＶＥＧＦ−Ａの第１のポリペプチド領域内に含まれる１つ又は複数のアミノ酸、及び（ｂ）配列番号２の残基７２〜８２に示すＶＥＧＦ−Ａの第２のポリペプチド領域内に含まれる１つ又は複数のアミノ酸を含むエピトープに結合する、抗体。
  52. それぞれ配列番号１７０及び１７２に示すアミノ酸配列を含むＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む抗体、
    それぞれ配列番号２４２及び２４４に示すアミノ酸配列を含むＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む抗体、
    それぞれ配列番号２４６及び２４８に示すアミノ酸配列を含むＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む抗体、
    それぞれ配列番号２７８及び２８０に示すアミノ酸配列を含むＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む抗体
    からなる群より選択される、請求項５１に記載の抗体。
  53. 前記エピトープが、配列番号２の残基９０〜１３２に示すＶＥＧＦ−Ａのポリペプチド領域内に含まれるアミノ酸を含まない、請求項５１に記載の抗体。
  54. それぞれ配列番号２４６及び２４８に示すアミノ酸配列を含むＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む、請求項５３に記載の抗体。
  55. 前記エピトープが、配列番号２の残基９８〜１１４に示すＶＥＧＦ−Ａの第３のポリペプチド領域内に含まれる１つ又は複数のアミノ酸をさらに含む、請求項５１に記載の抗体。
  56. それぞれ配列番号１７０及び１７２に示すアミノ酸配列を含むＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む抗体、
    それぞれ配列番号２４２及び２４４に示すアミノ酸配列を含むＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む抗体、
    それぞれ配列番号２７８及び２８０に示すアミノ酸配列を含むＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む抗体
    からなる群より選択される、請求項５５に記載の抗体。
  57. 他方のものの１０倍以内のＫｄ値で、ヒト及びマウスＶＥＧＦ−Ａに結合しない、請求項５５に記載の抗体。
  58. 前記エピトープが、配列番号２の残基１４２〜１５４に示すＶＥＧＦ−Ａの第４のポリペプチド領域内に含まれる１つ又は複数のアミノ酸をさらに含む、請求項５５に記載の抗体。
  59. それぞれ配列番号２４２及び２４４に示すアミノ酸配列を含むＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む抗体、
    それぞれ配列番号２７８及び２８０に示すアミノ酸配列を含むＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む抗体
    からなる群より選択される、請求項５７又は５８に記載の抗体。
  60. 前記エピトープが、オーバーラップしているＶＥＧＦ−Ａ（配列番号２）１３ｍｅｒペプチドの使用を含むペプチドマイクロアレイエピトープマッピングにより決定されるエピトープである、請求項５１から５９までのいずれか一項に記載の抗体。
  61. 単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である、請求項５１から６０までのいずれか一項に記載の抗体。
  62. ＰＤＧＦＲβの細胞外ドメインにも結合する二重特異性抗体である、請求項２７から６１までのいずれか一項に記載の抗体。
  63. 請求項２７から６２までのいずれか一項に記載の抗体、及び
    薬学的に許容される担体
    を含む医薬組成物。
  64. ＰＤＧＦＲβ及びＶＥＧＦ−Ａの両方を中和する二重特異性結合組成物であって、
    請求項１から２６までのいずれか一項に記載の単離抗ＰＤＧＦＲβ抗体、
    及び
    請求項２７から６１までのいずれか一項に記載の単離抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体
    を含む組成物。
  65. 前記抗ＰＤＧＦＲβ抗体と前記抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体がリンカーを介して共有結合で連結している、請求項６４に記載の二重特異性結合組成物。
  66. 前記リンカーがポリペプチドリンカーである、請求項６５に記載の二重特異性結合組成物。
  67. 前記抗ＰＤＧＦＲβ及び前記抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体が、共有結合で連結してタンデム単鎖Ｆｖ（ｔａｓｃＦｖ）又は二単鎖Ｆｖ（ｂｉｓｃＦｖ）を形成する単鎖Ｆｖである、請求項６４に記載の二重特異性結合組成物。
  68. 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項６４から６７までのいずれか一項に記載の二重特異性結合組成物。
  69. ＰＤＧＦＲβ及びＶＥＧＦ−Ａの両方を中和する二重特異性抗体であって、
    請求項１から２４までのいずれか一項に記載の抗ＰＤＧＦＲβ抗体の抗原結合領域、及び
    請求項２７から６１までのいずれか一項に記載の抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体の抗原結合領域
    を含む、二重特異性抗体。
  70. 免疫グロブリン重鎖定常領域を含む、請求項６９に記載の二重特異性抗体。
  71. 前記免疫グロブリン重鎖定常領域がＦｃフラグメントである、請求項７０に記載の二重特異性抗体。
  72. 前記Ｆｃフラグメントが、１つ又は複数のエフェクター機能を低下又は消失させるように修飾されたＦｃ領域を含む、請求項７１に記載の二重特異性抗体。
  73. ｔａｓｃＦｖ、ｂｉｓｃＦｖ又はｂｉＡｂである、請求項６９に記載の二重特異性抗体。
  74. ＰＤＧＦＲβ及びＶＥＧＦ−Ａの両方を中和する二重特異性抗体であって、
    （Ｉ）ＰＤＧＦＲβの細胞外ドメインに特異的に結合し、ＰＤＧＦＲβ活性を中和する第１の抗原結合領域であって、前記ＰＤＧＦＲβ結合領域が、配列番号４の残基２５１〜２７０に示すＰＤＧＦＲβのポリペプチド領域内に含まれる１つ又は複数のアミノ酸を含むエピトープに結合する、第１の抗原結合領域、並びに
    （ＩＩ）ＶＥＧＦ−Ａに特異的に結合し、ＶＥＧＦ−Ａ活性を中和する第２の抗原結合領域であって、前記ＶＥＧＦ−Ａ結合領域が、（ａ）配列番号２の残基４２〜５２に示すＶＥＧＦ−Ａの第１のポリペプチド領域内に含まれる１つ又は複数のアミノ酸及び（ｂ）配列番号２の残基７２〜８２に示すＶＥＧＦ−Ａの第２のポリペプチド領域内に含まれる１つ又は複数のアミノ酸を含むエピトープに結合する、第２の抗原結合領域
    を含む、二重特異性抗体。
  75. 前記抗ＰＤＧＦＲβエピトープが、配列番号４の残基１９６〜２０５に示すＰＤＧＦＲβの第２のポリペプチド領域内に含まれる１つ又は複数のアミノ酸をさらに含む、請求項７４に記載の二重特異性抗体。
  76. 抗ＶＥＧＦ−Ａエピトープが、（ｉ）配列番号２の残基９０〜１３２に示すＶＥＧＦ−Ａのポリペプチド領域内に含まれるアミノ酸を含まないか、又は（ｉｉ）配列番号２の残基９８〜１１４に示すＶＥＧＦ−Ａの第３のポリペプチド領域内に含まれる１つ若しくは複数のアミノ酸をさらに含む、請求項７４又は７５に記載の二重特異性抗体。
  77. （Ｉ）前記ＰＤＧＦＲβ結合領域が、ＬＣＤＲ１ＰＤＧＦＲ、ＬＣＤＲ２ＰＤＧＦＲ及びＬＣＤＲ３ＰＤＧＦＲのＣＤＲを含むＶＬドメイン（ＶＬ−ＰＤＧＦＲ）並びにＨＣＤＲ１ＰＤＧＦＲ、ＨＣＤＲ２ＰＤＧＦＲ及びＨＣＤＲ３ＰＤＧＦＲのＣＤＲを含むＶＨドメイン（ＶＨ−ＰＤＧＦＲ）を含み、
    ＬＣＤＲ１ＰＤＧＦＲが配列番号４３３に示すアミノ酸配列を有し、
    ＬＣＤＲ２ＰＤＧＦＲが配列番号４３４に示すアミノ酸配列を有し、
    ＬＣＤＲ３ＰＤＧＦＲが配列番号４３５に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ１ＰＤＧＦＲが配列番号４３６に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ２ＰＤＧＦＲが配列番号４３７に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ３ＰＤＧＦＲが配列番号４３８〜４４２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、
    （ＩＩ）前記ＶＥＧＦ−Ａ結合領域が、ＬＣＤＲ１ＶＥＧＦ、ＬＣＤＲ２ＶＥＧＦ及びＬＣＤＲ３ＶＥＧＦのＣＤＲを含むＶＬドメイン（ＶＬ−ＶＥＧＦ）並びにＨＣＤＲ１ＶＥＧＦ、ＨＣＤＲ２ＶＥＧＦ及びＨＣＤＲ３ＶＥＧＦのＣＤＲを含むＶＨドメイン（ＶＨ−ＶＥＧＦ）を含み、
    （Ａ）ＬＣＤＲ１ＶＥＧＦが配列番号４４８に示すアミノ酸配列を有し、
    ＬＣＤＲ２ＶＥＧＦが配列番号４４９に示すアミノ酸配列を有し、
    ＬＣＤＲ３ＶＥＧＦが配列番号４５０に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ１ＶＥＧＦが配列番号４５１に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ２ＶＥＧＦが配列番号４５２に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ３ＶＥＧＦが配列番号４５３〜４６１からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、
    又は
    （Ｂ）ＬＣＤＲ１ＶＥＧＦが配列番号４６２に示すアミノ酸配列を有し、
    ＬＣＤＲ２ＶＥＧＦが配列番号４６３に示すアミノ酸配列を有し、
    ＬＣＤＲ３ＶＥＧＦが配列番号４６４及び４６５からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ１ＶＥＧＦが配列番号４６６に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ２ＶＥＧＦが配列番号４６７に示すアミノ酸配列を有し、
    ＨＣＤＲ３ＶＥＧＦが配列番号４６８〜４７０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、
    請求項７４に記載の二重特異性抗体。
  78. ＬＣＤＲ１ＰＤＧＦＲ、ＬＣＤＲ２ＰＤＧＦＲ及びＬＣＤＲ３ＰＤＧＦＲがそれぞれ配列番号４６の残基２４〜４０、残基５６〜６２及び残基９５〜１０３に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１ＰＤＧＦＲ、ＨＣＤＲ２ＰＤＧＦＲ及びＨＣＤＲ３ＰＤＧＦＲがそれぞれ配列番号４８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１１に示すアミノ酸配列を有する、請求項７７に記載の二重特異性抗体。
  79. 前記ＶＥＧＦ−Ａ結合領域が（Ａ）に示すＣＤＲを含む、請求項７７又は７８に記載の二重特異性抗体。
  80. （ａ）ＬＣＤＲ１ＶＥＧＦ、ＬＣＤＲ２ＶＥＧＦ及びＬＣＤＲ３ＶＥＧＦがそれぞれ配列番号２４２の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１ＶＥＧＦ、ＨＣＤＲ２ＶＥＧＦ及びＨＣＤＲ３ＶＥＧＦがそれぞれ配列番号２４４の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０７に示すアミノ酸配列を有する、又は
    （ｂ）ＬＣＤＲ１ＶＥＧＦ、ＬＣＤＲ２ＶＥＧＦ及びＬＣＤＲ３ＶＥＧＦがそれぞれ配列番号２７８の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１ＶＥＧＦ、ＨＣＤＲ２ＶＥＧＦ及びＨＣＤＲ３ＶＥＧＦがそれぞれ配列番号２８０の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０に示すアミノ酸配列を有する、
    請求項７８に記載の二重特異性抗体。
  81. ＶＬ−ＰＤＧＦＲが配列番号４６に示すアミノ酸配列を含み、
    ＶＨ−ＰＤＧＦＲが配列番号４８に示すアミノ酸配列を含み、
    ＶＬ−ＶＥＧＦ及びＶＨ−ＶＥＧＦが（ａ）それぞれ配列番号２４２及び２４４に示すアミノ酸配列を、又は（ｂ）それぞれ配列番号２７８及び２８０に示すアミノ酸配列を含む、
    請求項８０に記載の二重特異性抗体。
  82. 二単鎖Ｆｖ（ｂｉｓｃＦｖ）である、請求項７９から８１までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  83. 前記ｂｉｓｃＦｖが、（ｉ）配列番号６２４のアミノ酸残基２０〜７７０及び（ｉｉ）配列番号６２８のアミノ酸残基２０〜７７３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８２に記載の二重特異性抗体。
  84. 前記ＶＥＧＦ−Ａ結合領域が（Ｂ）に示すＣＤＲを含む、請求項７７又は７８に記載の二重特異性抗体。
  85. ＬＣＤＲ１ＶＥＧＦ、ＬＣＤＲ２ＶＥＧＦ及びＬＣＤＲ３ＶＥＧＦがそれぞれ配列番号２４６の残基２３〜３５、残基５１〜５７及び残基９０〜１００に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１ＶＥＧＦ、ＨＣＤＲ２ＶＥＧＦ及びＨＣＤＲ３ＶＥＧＦがそれぞれ配列番号２４８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０２に示すアミノ酸配列を有する、
    請求項８４に記載の二重特異性抗体。
  86. ＶＬ−ＰＤＧＦＲが配列番号４６に示すアミノ酸配列を含み、
    ＶＨ−ＰＤＧＦＲが配列番号４８に示すアミノ酸配列を含み、
    ＶＬ−ＶＥＧＦが配列番号２４６に示すアミノ酸配列を含み、
    ＶＨ−ＶＥＧＦが配列番号２４８に示すアミノ酸配列を含む、
    請求項８５に記載の二重特異性抗体。
  87. 二単鎖Ｆｖ（ｂｉｓｃＦｖ）である、請求項８４から８６までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  88. 前記ｂｉｓｃＦｖが配列番号６２６のアミノ酸残基２０〜７６８に示すアミノ酸配列を含む、請求項８７に記載の二重特異性抗体。
  89. ＬＣＤＲ１ＰＤＧＦＲ、ＬＣＤＲ２ＰＤＧＦＲ及びＬＣＤＲ３ＰＤＧＦＲがそれぞれ配列番号６の残基２４〜４０、残基５６〜６２及び残基９５〜１０３に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１ＰＤＧＦＲ、ＨＣＤＲ２ＰＤＧＦＲ及びＨＣＤＲ３ＰＤＧＦＲがそれぞれ
    （ａ）配列番号８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０、又は
    （ｂ）配列番号１２の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０
    に示すアミノ酸配列を有する、
    請求項７７に記載の二重特異性抗体。
  90. 前記ＶＥＧＦ−Ａ結合領域が（Ａ）に示すＣＤＲを含む、請求項７７又は８９に記載の二重特異性抗体。
  91. （ａ）ＬＣＤＲ１ＶＥＧＦ、ＬＣＤＲ２ＶＥＧＦ及びＬＣＤＲ３ＶＥＧＦがそれぞれ配列番号２４２の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１ＶＥＧＦ、ＨＣＤＲ２ＶＥＧＦ及びＨＣＤＲ３ＶＥＧＦがそれぞれ配列番号２４４の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０７に示すアミノ酸配列を有する、又は
    （ｂ）ＬＣＤＲ１ＶＥＧＦ、ＬＣＤＲ２ＶＥＧＦ及びＬＣＤＲ３ＶＥＧＦがそれぞれ配列番号２７８の残基２４〜３４、残基５０〜５６及び残基８９〜９７に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１ＶＥＧＦ、ＨＣＤＲ２ＶＥＧＦ及びＨＣＤＲ３ＶＥＧＦがそれぞれ配列番号２８０の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１１０に示すアミノ酸配列を有する、
    請求項９０に記載の二重特異性抗体。
  92. ＶＬ−ＰＤＧＦＲが配列番号６に示すアミノ酸配列を含み、
    ＶＨ−ＰＤＧＦＲが配列番号８又は配列番号１２に示すアミノ酸配列を含み、
    ＶＬ−ＶＥＧＦ及びＶＨ−ＶＥＧＦが（ａ）それぞれ配列番号２４２及び２４４に示すアミノ酸配列を、又は（ｂ）それぞれ配列番号２７８及び２８０に示すアミノ酸配列を含む、
    請求項９１に記載の二重特異性抗体。
  93. そのＶＬドメインとしてＶＬ−ＰＤＧＦＲを含む免疫グロブリン軽鎖、及び
    そのＶＨドメインとしてＶＨ−ＰＤＧＦＲを含む免疫グロブリン重鎖を含むｂｉＡｂであり、前記重鎖がそのＣ末端において、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合体を形成するように、ＶＬ−ＶＥＧＦ及びＶＨ−ＶＥＧＦを含む単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と融合している、
    請求項９０から９２までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  94. 前記免疫グロブリン軽鎖が配列番号５３７の残基２０〜２３９に示すアミノ酸配列を含み、
    前記ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合体が
    （ｉ）配列番号６３０のアミノ酸残基２０〜７２９、
    （ｉｉ）配列番号６３４のアミノ酸残基２０〜７３２、
    （ｉｉｉ）配列番号６３６のアミノ酸残基２０〜７２９、及び
    （ｉｖ）配列番号６４０のアミノ酸残基２０〜７３２
    からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、
    請求項９３に記載の二重特異性抗体。
  95. 前記ＶＥＧＦ−Ａ結合領域が（Ｂ）に示すＣＤＲを含む、請求項７７又は８９に記載の二重特異性抗体。
  96. ＬＣＤＲ１ＶＥＧＦ、ＬＣＤＲ２ＶＥＧＦ及びＬＣＤＲ３ＶＥＧＦがそれぞれ配列番号２４６の残基２３〜３５、残基５１〜５７及び残基９０〜１００に示すアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１ＶＥＧＦ、ＨＣＤＲ２ＶＥＧＦ及びＨＣＤＲ３ＶＥＧＦがそれぞれ配列番号２４８の残基３１〜３５、残基５０〜６６及び残基９９〜１０２に示すアミノ酸配列を有する、
    請求項９５に記載の二重特異性抗体。
  97. ＶＬ−ＰＤＧＦＲが配列番号６に示すアミノ酸配列を含み、
    ＶＨ−ＰＤＧＦＲが配列番号８又は配列番号１２に示すアミノ酸配列を含み、
    ＶＬ−ＶＥＧＦが配列番号２４６に示すアミノ酸配列を含み、
    ＶＨ−ＶＥＧＦが配列番号２４８に示すアミノ酸配列を含む、
    請求項９１に記載の二重特異性抗体。
  98. そのＶＬドメインとしてＶＬ−ＰＤＧＦＲを含む免疫グロブリン軽鎖、及び
    そのＶＨドメインとしてＶＨ−ＰＤＧＦＲを含む免疫グロブリン重鎖を含むｂｉＡｂであり、前記重鎖がそのＣ末端において、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合体を形成するように、ＶＬ−ＶＥＧＦ及びＶＨ−ＶＥＧＦを含む単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と融合している、
    請求項９５から９７までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  99. 前記免疫グロブリン軽鎖が配列番号５３７の残基２０〜２３９に示すアミノ酸配列を含み、
    前記ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合体が
    （ｉ）配列番号６３２のアミノ酸残基２０〜７２７、及び
    （ｉｉ）配列番号６３８のアミノ酸残基２０〜７２７、
    からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、
    請求項９８に記載の二重特異性抗体。
  100. ＰＥＧ化されている、請求項６９から９９までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  101. 請求項１から２５、２７から６２及び６９から９９までのいずれか一項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
  102. 請求項１０１に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  103. 請求項１０２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  104. 請求項１から２５、２７から６２及び６９から９９までのいずれか一項に記載の抗体を産生する方法であって、
    請求項１０３に記載の宿主細胞を前記抗体が発現する条件下で培養する工程、及び
    前記宿主細胞から前記抗体を単離する工程
    を含む、方法。
  105. 請求項６９から１００までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体、及び
    薬学的に許容される担体
    を含む医薬組成物。
  106. 血管新生障害を治療する方法であって、
    前記血管新生障害を有する対象に有効量のＰＤＧＦＲβアンタゴニストを投与する工程を含み、前記ＰＤＧＦＲβアンタゴニストが請求項１から２６までのいずれか一項に記載の抗ＰＤＧＦＲβ抗体である、方法。
  107. 前記対象に有効量のＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを投与する工程をさらに含む、請求項１０６に記載の方法。
  108. 血管新生障害を治療する方法であって、
    前記血管新生障害を有する対象に有効量のＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを投与する工程を含み、前記ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが請求項２７から６１までのいずれか一項に記載の抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体である、方法。
  109. 前記対象に有効量のＰＤＧＦＲβアンタゴニストを投与する工程をさらに含む、請求項１０８に記載の方法。
  110. 血管新生障害を治療する方法であって、
    前記血管新生障害を有する対象に有効量のＰＤＧＦＲβアンタゴニスト及び有効量のＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを投与する工程を含み、前記ＰＤＧＦＲβアンタゴニストが請求項１から２６までのいずれか一項に記載の抗ＰＤＧＦＲβ抗体であり、前記ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが請求項２７から６１までのいずれか一項に記載の抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体である、方法。
  111. 前記ＰＤＧＦＲβアンタゴニストと前記ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを別個に投与する、請求項１１０に記載の方法。
  112. 前記ＰＤＧＦＲβアンタゴニストと前記ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを同時に投与する、請求項１１０に記載の方法。
  113. 前記ＰＤＧＦＲβアンタゴニスト及び前記ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの投与が、請求項６４から６７までのいずれか一項に記載の二重特異性結合組成物を投与することを含む、請求項１１０に記載の方法。
  114. 前記ＰＤＧＦＲβアンタゴニスト及び前記ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの投与が、請求項６９から１００までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体を投与することを含む、請求項１１０に記載の方法。
  115. 前記血管新生障害が固形腫瘍の成長によって特徴付けられる癌である、請求項１０６から１１４までのいずれか一項に記載の方法。
  116. 前記癌が膵臓癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）及び神経膠芽腫からなる群より選択される、請求項１１５に記載の方法。
  117. 前記血管新生障害が新生血管眼障害である、請求項１０６から１１４までのいずれか一項に記載の方法。
  118. 前記血管新生眼障害が加齢性黄班変性、糖尿病性網膜症、虹彩新生血管形成、血管新生緑内障及び増殖性硝子体網膜症（ｖｉｔｒｏｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）からなる群より選択される、請求項１１７に記載の方法。
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