KR101908330B1

KR101908330B1 - 신규 항-vegf 항체 및 이를 유효성분으로 포함하는 나이관련 황반변성 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101908330B1
Application number: KR1020170021719A
Authority: KR
Inventors: 양재욱; 이혜숙; 안별님; 김시경; 박범찬; 박재은; 김수영; 유석호; 김응철; 이상필; 신지영
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2017-02-17
Filing date: 2017-02-17
Publication date: 2018-10-16
Also published as: KR20180095349A

Abstract

본 발명은 신규 항-VEGF 항체 및 이를 유효성분으로 포함하는 나이관련 황반변성 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 신규 항-VEGF 항체는 VEGF 항원 단백질에 특이적으로 결합하고, 우수한 결합력을 가지며, 맥락막 신생혈관 마우스 모델에서 신생혈관 억제 및 망막 기능 개선 효과를 가짐으로써, 나이관련 황반변성의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 상기 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법 및 상기 질환을 위한 진단용 키트로 활용될 수 있다.

Description

신규 항-VEGF 항체 및 이를 유효성분으로 포함하는 나이관련 황반변성 예방 또는 치료용 조성물{Novel anti-vascular endothelial growth factor antibody and composition for preventing or treating age-related macular degeneration comprising thereof}

본 발명은 신규 항-VEGF 항체 및 이를 유효성분으로 포함하는 나이관련 황반변성 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

나이관련 황반변성(age-related macular degeneration; AMD)이란 나이가 들면서 망막의 황반부에 여러 가지 변화가 동반되어 생기는 질병이다. 서구에서는 60세 이상의 인구에서 실명의 가장 주된 원인이며, 우리나라에서도 앞으로 노인 인구가 증가함에 따라서 그 발생 빈도는 더욱 증가할 것으로 예상된다. 황반이란, 망막이라고 하는 신경 조직의 중심 부위를 말하는데, 빛 자극에 반응하는 중요한 세포가 밀집되어 있어서 중심 시력을 담당한다. 이 황반부에 변성이 일어나 시력 장애를 일으키는 질환을 황반변성이라 한다. 나이관련 황반변성은 퇴행성 질병으로 이는 망막, 망막색소상피층, 브로크 멤브레인(Bruch's membrane), 맥락막 등에 영향을 끼친다.

나이관련 황반변성은 비삼출성(건성)과 삼출성(습성)의 두 가지 형태가 있다. 나이관련 황반변성의 대부분을 차지하는 비삼출성 형태는 망막에 드루젠(drusen, 노폐물들이 황반부에 쌓여가는 상태)이나 망막색소상피의 위축과 같은 병변이 생긴 경우를 말한다. 이는 보통 심한 시력상실을 유발하지는 않지만 습성 형태로 발전할 수 있다. 삼출성 형태는 망막 밑에 맥락막 신생혈관이 자라는 경우이다. 이러한 신생혈관은 황반부에 삼출물, 출혈 등을 일으켜서 중심시력에 영향을 주며, 발생 후 2개월 내지 3년 사이에 실명을 초래하기도 한다. 삼출성 형태의 황반변성은 진행속도가 매우 빨라서 수 주 안에 시력이 급속히 나빠지는 경우가 많다.

나이관련 황반변성은 일반적으로 일단 시력장애가 시작되면 이전의 시력을 회복할 수 없는 경우가 많으므로 조기 발견이 매우 중요하다. 조기 발견은 정기적인 안과검진을 통해서 가능하며 안저검사를 포함한 안과적 검진으로 나이관련 황반변성이 의심되면, 형광안저혈관조영술 등의 안과 정밀검사들을 시행하여 진단할 수 있다. 비외과적 치료에는 레이저광응고술(photocoagulation), 광역학요법(photodynamic therapy; PDT), 경동공온열치료법, 약물치료법(예를 들면, 혈관 내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor inhibitor(VEGF 억제제) 주입) 등이 있으며, 외과적인 수술법으로는 황반하 수술, 황반변위술이 있다.

혈관 내피세포에 효능이 있는 미토겐(mitogen)인 VEGF는 정상적 및 비정상적 혈관신생의 중추적인 조절인자로 보고되었다. 혈관 형성 과정에 기여하는 다른 성장 인자에 비해, VEGF는 혈관계 내의 내피세포에 대한 높은 특이성에서 특유하다. 신생혈관 형성의 주요 자극원으로서의 VEGF의 인식은 VEGF 활성을 차단하기 위한 다양한 시도들을 이끌어내었다. 억제성 항-VEGF 수용체 항체, 수용성 수용체 구조물(soluble receptor constructs), 역배열 방법(antisense strategies), VEGF에 대한 RNA 압타머(RNA aptamers) 및 저분자량의 VEGF 수용체 티로신 키나아제(receptor tyrosine kinase; TRK) 억제제는 모두 VEGF 신호전달을 방해하는 데 사용하기 위하여 제안되었다. 마우스 유래의 항체 및 아바스틴(Avastin, bevacizumab)이라 칭하는 인간화 항-VEGF 항체(humanized anti-VEGF antibody)를 사용한 마우스에서의 종양 성장의 억제는 임상적 용도로 승인되었다. 따라서, 항-VEGF 항체 또는 다른 VEGF 활성 억제제는 고형 종양 및 다양한 안내 신생혈관 질환의 치료를 위한 유망한 후보물질이다.

대한민국 공개특허 제 10-2005-0062649호(2005.06.23 공개)

본 발명의 목적은 신규 항-VEGF 항체를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항-VEGF 항체를 포함하는 나이관련 황반변성 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신규 항-VEGF 항체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항-VEGF 항체를 포함하는 나이관련 황반변성 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 신규 항-VEGF 항체는 VEGF 항원 단백질에 특이적으로 결합하고, 우수한 결합력을 가지며, 맥락막 신생혈관 마우스 모델에서 신생혈관 억제 및 망막 기능 개선 효과를 가짐으로써, 나이관련 황반변성의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 상기 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법 및 상기 질환을 위한 진단용 키트로 활용될 수 있다.

도 1은 VEGF 항원 단백질을 발현하는 pN293-VEGF 벡터의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 pN293-VEGF 발현벡터로부터 정제한 VEGF 항원 단백질을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 3은 인간 항체 라이브러리로부터 VEGF 항원 단백질에 결합하는 단일 클론 항체를 선별하기 위해, 각 패닝 라운드의 다클론 파지 풀(pool)에 대한 VEGF 항원 결합력을 분석한 결과이다.
도 4는 항-VEGF 단일 클론 파지 항체의 예비 클론을 선별한 결과이다.
도 5는 항-VEGF 단일 클론 파지 항체 3종의 클론(3H1, 4C4 및 7D2)을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 6 및 도 7은 항-VEGF 단일 클론 파지 항체 3종 클론(3H1, 4C4 및 7D2)에 있어서 중쇄 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열 및 염기서열을 나타낸 것이다.
도 8은 항-VEGF 인간항체 3종의 클론(3H1, 4C4 및 7D2)의 VEGF 항원 결합력을 효소면역측정법으로 분석한 결과이다.
도 9는 맥락막 신생혈관 마우스 모델에서 신규 항-VEGF 항체에 의한 신생혈관 억제 효과를 플루오레세인 혈관조영술로 분석한 결과이다.
도 10은 맥락막 신생혈관 마우스 모델에서 신규 항-VEGF 항체에 의한 신생혈관 크기 억제 효과를 광 간섭 단층촬영으로 분석한 결과이다.
도 11은 맥락막 신생혈관 마우스 모델에서 신규 항-VEGF 항체에 의한 망막 기능 개선 효과를 망막 전위도 측정으로 분석한 결과이다.

본 발명의 발명자들은 VEGF 항원 단백질에 특이적으로 결합하는 신규 항-VEGF 항체(3H1, 4C4 및 7D2)를 생산하였으며, 상기 항체들이 VEGF 항원 단백질에 우수한 결합력을 가지고, 맥락막 신생혈관 마우스 모델에서 치료 효과를 가지는 것을 확인하며 본 발명을 완성하였다.

본 발명에서 사용된 용어 “ScFv(single-chain Fv, 단일사슬단편항체 또는 항체 단편)”는 경쇄 및 중쇄의 가변영역을 연결한 항체이다. 경우에 따라서, 15개 내외의 아미노산이 연결된 펩타이드 사슬로 이루어진 링커(linker, 연결부위)를 포함할 수 있으며, 이때, ScFv는 경쇄 가변영역-연결부위-중쇄 가변영역, 또는 중쇄 가변영역- 연결부위-경쇄 가변영역의 구조를 가질 수 있으며, 원 항체와 동일 혹은 유사한 항원특이성을 가진다.

본 발명에서 사용된 용어 “가변영역(variable region)”은 항원과 특이적으로 결합하는 기능을 수행하면서 서열상의 많은 변이를 보이는 부위를 의미하는데, 대체로 상보성 결정 영역(complementarity determining regions; CDR)과 프레임워크 영역(framework region; FR)을 포함한다.

본 발명에서 사용된 용어 “항체(또는 ScFv) 라이브러리”는 서로 다른 서열을 가지는 다양한 항체 유전자들의 집합이다. 항체 라이브러리로부터 임의의 항원에 대해 특이적 항체를 분리하기 위해서는 매우 높은 다양성이 요구되며, 서로 다른 항체 클론들로 이루어진 라이브러리가 구축되어 사용된다. 이러한 항체라이브러리를 이루는 항체 유전자는 예를 들어, 파지미드(phagemid) 벡터에 클로닝되어 형질전환체(대장균)에 형질주입될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 “파지미드” 벡터는 파지 디스플레이에 사용되고, 파지복제시작점(phage origin of replication)을 가지는 플라스미드 DNA이며, 통상적으로 항생제 내성유전자를 선택 마커(selection marker)로 가지고 있다. 파지 디스플레이에 사용되는 파지미드 벡터의 경우 M13 파지의 gIII 유전자 또는 그 일부가 포함되어 있으며, ScFv 유전자는 gIII 유전자의 5' 말단에 라이게이션(ligation)되어 형질전환체를 통해 발현된다.

본 발명에서 사용된 용어 “헬퍼 파지(helper phage)”는 파지미드가 파지 입자로 조립되도록 필요한 유전정보를 제공하는 파지이다. 파지미드에는 파지 유전자 중 gIII 혹은 그 일부만이 존재하므로 파지미드로 형질전환된 숙주세포(형질전환체)를 헬퍼 파지로 감염시켜 나머지 파지 유전자를 공급하게 된다. M13K07 혹은 VCSM13 등의 종류가 있으며 대부분 카나마이신(kanamycin) 등 항생제 내성 유전자를 포함하여 헬퍼 파지에 감염된 형질전환체를 선택할 수 있도록 하고 있다. 또한 조립신호(packaging signal)에 결함이 있으므로 헬퍼 파지 유전자보다 파지미드 유전자가 선별적으로 파지입자 속으로 조립된다.

본 발명에서 사용된 용어 “바이오 패닝(biopanning)”은 파지의 외벽(coat)에 펩타이드를 발현(display)하는 파지 라이브러리로부터, 표적 분자(항체, 효소, 세포표면 수용체 등)와 결합하는 성질을 지닌 펩타이드를 표면에 발현하고 있는 파지만을 선택하는 일련의 선별방법을 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어 “인간항체”는 광범위하게는 인간의 면역글로불린으로부터 유래된 가변영역(CDR 및 FR)을 포함하는 항체를 의미하고, 보다 좁은 범위로는 인간의 면역글로불린으로부터 유래된 가변영역 및 불변영역(constant region)을 포함하는 항체를 의미한다. 상기 인간항체는 전체 항체(whole) 형태일 뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 상기 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결된 형태가 될 수 있는데, 바람직하게는 단일 클론 항체가 될 수 있다. 아울러, 상기 항체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 이중쇄 Fv(dsFv) 등을 포함할 수 있다. 상기 항체 단편 중 상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 포함할 수 있고, 상기 Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 포함한다는 점에서 Fab와 구별될 수 있으며, 상기 F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 형성한다는 점에서 다른 단편과 구별될 수 있다. 한편, 상기 Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각을 의미하고, 통상적으로 단쇄 Fv(scFv)와 이중쇄 Fv(dsFv)로 구별되는데, 상기 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결된 형태가 될 수 있고, 상기 이중쇄 Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결된 형태가 될 수 있다. 이들 기능적인 단편은 다양한 방법으로 제조될 수 있는데, 통상적으로는 효소를 이용한 항체 단백질의 가수분해를 통해 제조될 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하며 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있으며, 이들 재조합 기술은 당업계에 이미 공지되어 있다(WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344). 상기 인간항체는 모든 구성요소가 인간으로부터 유래되었기 때문에, 기존의 인간화 항체 또는 마우스 항체에 비해서 면역화 반응이 일어날 확률이 적어서 인간에게 투여하였을 경우 원하지 않는 면역반응이 일어나지 않는 장점이 있으므로, 인간을 대상으로 하는 치료용 항체로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 “단일 클론 항체”는 단일한 항원성 부위(단일 에피토프)에 대해서 지시되어 이와 특이적인 결합을 하는 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상 본 발명의 단일 클론 항체는 혈관 내피세포 성장인자에 특이적으로 결합하므로, 혈관 내피세포 성장인자를 인식하는 단백질 분자이다.

항원의 특정 에피토프(epitope)를 인식하여 항원-항체 복합체를 형성하는 항체의 주요 부위는 중쇄 및 경쇄의 가변영역, 특히 CDR이 이러한 복합체 형성에 기여하므로, 본 발명은 상기한 본 발명의 단일 클론 항체의 가변영역, 특히 CDR을 포함하는 이의 키메릭(chimeric) 항체, 인간화(humanized) 항체 등을 본 발명의 범위에 포함한다. 또한, 본 발명은 상기한 바와 같은 결합 특성을 갖는 한 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편들을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역(V_H) 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역(V_L)을 포함하며, 혈관 내피세포 성장인자(VEGF)에 특이적으로 결합하는 단일클론 인간항체 4C4를 제공한다.

바람직하게는, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 프레임워크 영역(FR)1, 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 상보성 결정 영역(CDR)1, 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 FR2, 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 CDR2, 서열번호 7의 아미노산 서열을 가지는 FR3, 서열번호 8의 아미노산 서열을 가지는 CDR3 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 가지는 FR4를 포함할 수 있다.

바람직하게는, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 10의 아미노산 서열을 가지는 FR1, 서열번호 11의 아미노산 서열을 가지는 상보성 결정 영역 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열을 가지는 FR2, 서열번호 13의 아미노산 서열을 가지는 CDR2, 서열번호 14의 아미노산 서열을 가지는 FR3, 서열번호 15의 아미노산 서열을 가지는 CDR3 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 가지는 FR4를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 단일클론 인간항체 4C4를 코딩하는 단일클론 인간항체 4C4 cDNA를 제공한다.

바람직하게는, 상기 cDNA는 중쇄 가변영역을 코딩하는 서열번호 17의 염기서열 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 서열번호 18의 염기서열을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 19의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역(V_H) 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역(V_L)을 포함하며, 혈관 내피세포 성장인자(VEGF)에 특이적으로 결합하는 단일클론 인간항체 3H1을 제공한다.

바람직하게는, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 21의 아미노산 서열을 가지는 FR1, 서열번호 22의 아미노산 서열을 가지는 CDR1, 서열번호 23의 아미노산 서열을 가지는 FR2, 서열번호 24의 아미노산 서열을 가지는 CDR2, 서열번호 25의 아미노산 서열을 가지는 FR3, 서열번호 26의 아미노산 서열을 가지는 CDR3 및 서열번호 27의 아미노산 서열을 가지는 FR4를 포함할 수 있다.

바람직하게는, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 28의 아미노산 서열을 가지는 FR1, 서열번호 29의 아미노산 서열을 가지는 상보성 결정 영역 CDR1, 서열번호 30의 아미노산 서열을 가지는 FR2, 서열번호 31의 아미노산 서열을 가지는 CDR2, 서열번호 32의 아미노산 서열을 가지는 FR3, 서열번호 33의 아미노산 서열을 가지는 CDR3 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 가지는 FR4를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 단일클론 인간항체 3H1을 코딩하는 단일클론 인간항체 3H1 cDNA를 제공한다.

바람직하게는, 상기 cDNA는 중쇄 가변영역을 코딩하는 서열번호 35의 염기서열 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 서열번호 36의 염기서열을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 37의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역(V_H) 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역(V_L)을 포함하며, 혈관 내피세포 성장인자(VEGF)에 특이적으로 결합하는 단일클론 인간항체 7D2를 제공한다.

바람직하게는, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 39의 아미노산 서열을 가지는 FR1, 서열번호 40의 아미노산 서열을 가지는 CDR1, 서열번호 41의 아미노산 서열을 가지는 FR2, 서열번호 42의 아미노산 서열을 가지는 CDR2, 서열번호 43의 아미노산 서열을 가지는 FR3, 서열번호 44의 아미노산 서열을 가지는 CDR3 및 서열번호 45의 아미노산 서열을 가지는 FR4를 포함할 수 있다.

바람직하게는, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 46의 아미노산 서열을 가지는 FR1, 서열번호 47의 아미노산 서열을 가지는 상보성 결정 영역 CDR1, 서열번호 48의 아미노산 서열을 가지는 FR2, 서열번호 49의 아미노산 서열을 가지는 CDR2, 서열번호 50의 아미노산 서열을 가지는 FR3, 서열번호 51의 아미노산 서열을 가지는 CDR3 및 서열번호 52의 아미노산 서열을 가지는 FR4를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 단일클론 인간항체 7D2를 코딩하는 단일클론 인간항체 7D2 cDNA를 제공한다.

바람직하게는, 상기 cDNA는 중쇄 가변영역을 코딩하는 서열번호 53의 염기서열 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 서열번호 54의 염기서열을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 4C4, 3H1 및 7D2로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 단일클론 인간항체를 포함하는 나이관련 황반변성 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

나이관련 황반변성 예방 또는 치료를 위해, 항체는 그 자체 또는 항체를 포함하는 조성물로 투여될 수 있다. 항체를 포함하는 조성물의 경우, 투여 방식에 따라 허용 가능한 담체를 포함하여 적절한 제제로 제조된다. 투여 방식에 적합한 제제는 당 분야에 공지되어 있다. 이들 제제는 비경구, 안구 내, 피하, 복강 내, 근육 내 및 국부적 면역억제치료를 위해 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의해 투여된다. 비경구 주입에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함된다. 본 발명의 항체를 포함하는 조성물은 황반변성을 치료하기에 약학적으로 효과적인 양으로 투여될 수 있다. 전형적인 투여량 수준은 표준 임상적 기술을 사용하여 최적화할 수 있다.

또한, 본 발명은 4C4, 3H1 및 7D2로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 단일클론 인간항체를 이용하여 혈관 내피세포 성장인자와의 결합력을 측정하는 단계를 포함하는 나이관련 황반변성 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 4C4, 3H1 및 7D2로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 단일클론 인간항체를 포함하는 나이관련 황반변성 진단용 키트를 제공한다.

이러한 진단용 키트에는 본 발명의 단일클론 항체뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함된다. 이러한 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.

표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.

항원-항체 복합체 형성은 조직면역 염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블랏팅(Western Blotting), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산 분석법(Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으며 이로 제한되지 않는다.

항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하는 라벨에는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소 등이 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린 에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며, 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN)8, [Os(bpy)3]2+, [RU(bpy)3]2+, [MO(CN)8]4- 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 방사선 동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 있으며 이로 제한되지 않는다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : VEGF 항원 단백질 발현 및 정제

1-1. VEGF 항원 단백질 발현벡터 제작

VEGF에 대한 ORF(open reading frame)를 얻기 위해 Jurkat 세포로부터 유래된 cDNA 라이브러리(Stratagene, 미국)를 구입하여 템플릿(template)으로 사용하였고, 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다. PCR을 위한 프라이머(primer)는 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 5'-과 3'-말단 각각에 제한효소 SfiⅠ 사이트가 포함된 VEGF 증폭용 프라이머인 VEGF-F(forward)와 VEGF-R(reverse)를 이용하였다. 증폭된 PCR 산물은 도 1에 나타낸 바와 같이, 6x His 테그(tag)를 포함하고 있는 포유류 발현 벡터인 N293F 벡터에 서브클로닝(subcloning)하여 최종적으로 pN293-VEGF 발현벡터를 완성하였다.

프라이머	서열(5'-> 3')
VEGF-F(서열번호 55)	gcacccatggcagaaggaggaggg
VEGF-R(서열번호 56)	ccgcctcggcttgtcacatctgcaagtacgt

1-2. VEGF 항원 단백질의 발현 및 정제

VEGF 항원 단백질을 생산하기 위해 HEK293F 세포에 pN293-VEGF 발현벡터를 일시적 형질주입(transient transfection)하였다. 구체적으로 정제된 625 μg의 pN293-VEGF 발현벡터를 1250 μg의 폴리에틸렌이민(polyethylenimine; PEI, Aldrich, cat. 408727)과 섞어 폴리플렉스(polyplex)를 형성시켰다. 폴리플렉스는 하루 전날 Freestyle^TM 293 배지(Gibco, cat. A13835) 1L에 HEK293F 세포를 5 X 10⁵ 세포/ml의 농도로 접종하여 키운 배양액에 넣어 세포와 혼합되도록 잘 섞어 주었다. 형질주입 후, 발프로산(valproic acid; VPA, Sigma, P4543) 1 nM을 첨가하고 6일 동안 더 배양하였다.

발현된 VEGF 항원 단백질은 Ni² ⁺-NTA 레진(resin)을 이용하여 1차 정제하였고, 1차 정제된 단백질은 Superdex 200(1.5 cm*100 cm) 겔 여과 크로마토그래피(gel filtration chromatography)를 이용하여 2차 정제하였다. 정제된 단백질은 12% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 이용하여 순도를 확인하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 정제된 단백질은 95% 이상의 순도를 가지는 것을 확인하였다.

실시예 2 : 인간 항체 라이브러리로부터 VEGF 항원 단백질에 결합하는 단일 클론 인간 항체 스크리닝

2-1. 라이브러리 파지(library phage)의 제조

다양성을 가진 인간 유래 scFv(single-chain Fv, 단일 사슬 단편 항체 또는 항체 단편) 항체 라이브러리 파지미드(phagemid)를 함유하는 세포 1.7 X 10¹¹개를 2XYT-CM[17 g 트립톤(tryptone, CONDA, 1612.00), 10 g 효모 추출물(Yeast extract, CONDA, 1702.00), 5 g 염화나트륨(NaCl, Sigma, S7653), 34 μg/ml 클로람페니콜(chloramphenicol, Sigma, C0857)]에 2% 글루코오스(glucose, Sigma, G5400) 및 5 mM 염화마그네슘(MgCl₂, Sigma, M2393)을 함유하는 배지 1L에 접종하고, 37℃에서 2시간 내지 3시간 동안 배양한 후(OD₆₀₀=0.5 내지 0.7), 헬퍼 파지(helper phage)를 감염시켜 1 mM의 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, ELPISBIO, IPTG025)를 함유하는 2XYT-CMK(2XYT-CM + 70 μg/ml의 카나마이신(Kanamycin, Sigma, K1876) 배지에 접종하고, 다시 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양한 세포는 4℃, 4500 rpm에서 15분 동안 원심분리한 후, 상등액을 취해 4% 폴리에틸렌글라이콜(polyethylene glycol; PEG, Fluka, 81253) 6000과 3% 염화나트륨을 첨가하여 잘 녹인 다음 얼음에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, 4℃, 8000 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 펠렛(pellet)을 얻고, 펠렛에 인산완충식염수(phosphate buffered salin; PBS)를 첨가하여 녹인 다음 4℃, 12000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 라이브러리 파지를 포함하는 상등액을 얻었다. 상등액은 새 튜브에 옮겨 4℃에서 보관하였다.

2-2. 바이오패닝 ( biopanning )

상기 실시예 <1-2>에서 정제된 50 μg의 VEGF 항원 단백질과 2 ml의 코팅 버퍼[coating buffer; 1.59 g 탄산나트륨(Na₂CO₃, Sigma S7795), 2.93 g 탄산수소나트륨(NaHCO₃, Sigma, S8875), 0.2g 아지드화 나트륨(NaN₃, Sigma, S2002)]를 면역흡착 튜브(immunosorb tube, Nunc, 470319)에 넣고 4℃에서 16시간 동안 회전자(rotator)로 회전시켜 코팅시킨 후, 4% 탈지분유(BD, 32100)를 함유하는 1X PBS를 이용하여 상온에서 2시간 동안 블로킹(blocking) 시켰다. 그 다음 상기 면역흡착 튜브에 2 ml의 라이브러리 파지를 넣은 후, 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 0.05%의 PBS-T[140 mM 염화나트륨, 10 mM 제2인산나트륨(Na₂HPO₄, Sigma, S7907), 1.8 mM 제1인산칼륨(KH₂PO₄, Sigma, S5655), 2.7 mM 염화칼륨(KCl, Sigma, p9541), 0.05% 트윈20(Tween20, Sigma, p1379)]로 5회 세척하고, PBS로 2회 세척하였다. 세척 후, 특이적으로 결합한 scFv-파지들만 100 mM 트리에탄올아민(triethanolamine; TEA, Sigma, T-0886)으로 용출하였으며, 상기 용출된 파지들을 대장균(XL1-Blue, Stratagene, 200249)에 감염시켜 증폭시켰다. 1차 패닝(panning)에서 증폭된 파지들은 PBS-T 세척 횟수만 변경하여(2차: 13회, 3차: 23회) 동일한 방법으로 2차 및 3차 패닝을 수행하였다.

그 결과, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 3차 패닝에서 결합한 파지의 수는 2.0 X 10⁹으로 2차에 비해 크게 증가한 것을 확인하였다.

표적항원	패닝 라운드	주입된 파지의 수	결합 파지의 수
VEGF-His	1차	2.0 X 10¹³	3.6 X 10⁷
	2차	1.2 X 10¹³	7.0 X 10⁷
	3차	2.0 X 10¹³	2.0 X 10⁹

2-3. 패닝 결과 확인

다음으로 상기 실시예 <2-2>의 각 패닝 라운드에서 얻어진 파지 풀(pool)인 다클론 파지(polyphage)의 항원 결합력을 확인하였다. 각 패닝 라운드에서 얻어진 대장균 스톡(stock)을 2% 글루코오스 및 5 mM 염화마그네슘이 함유된 2XYT-CM 배지 5 ml에 OD₆₀₀ 값이 0.1 되도록 넣어준 후, OD₆₀₀ 값이 0.5 내지 0.7이 되도록 37℃에서 2시간 내지 3시간 동안 배양하였다. 상기 배양액에 M1-헬퍼 파지를 감염시켜 5 mM 염화마그네슘 및 1 mM IPTG를 함유하는 2XYT-CMK 배지에 접종하고, 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 그 후, 4℃, 4500 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 각 패닝 라운드의 다클론 파지를 포함하는 상등액을 취하여 새 튜브로 옮겼다. 항원인 VEGF-His 또는 비특이적 결합의 지표인 ITGA6-Fc를 각각 96 웰-면역플레이트(96 well-immunoplate, Nunc, 439454)에 웰 당 100 ng씩 넣고, 4℃에서 16시간 동안 코팅 버퍼로 코팅한 후, 4%의 탈지분유를 함유하는 PBS를 이용하여 각 웰을 블로킹시켰다. 각 웰은 0.2 ml의 0.05% PBS-T로 세척한 후, 각 패닝 라운드의 다클론 파지를 웰 당 100 μl씩 넣고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 후, 각 웰은 0.2 ml의 0.05% PBS-T로 4회 세척하고, 이차 항체인 항-M13-HRP(Amersham 27-9421-01)를 1:2000으로 희석하여 상온에서 1시간 동안 반응시킨 다음 0.2 ml의 0.05% PBS-T로 세척하였다. OPD 타블렛(Sigma, 8787-TAB)을 PC 버퍼[5.1 g Cu₆H₈O₇·H₂O(Sigma, C0706), 7.3 g 제2인산나트륨(Sigma, S7907)]에 넣어 기질 용액을 만든 후, 웰 당 100 μl씩 넣어 10분 동안 발색시킨 다음 분광광도계(spectrophotometer, MolecularDevice)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 3을 참조하여 보면, VEGF-His 항원에 대한 결합력이 3라운드 다클론 파지에서 크게 증가하였고, 이는 3라운드 패닝의 양성 파지 풀(pool)에 항-VEGF 파지 항체가 성공적으로 풍부하게 생산되었음을 의미한다.

2-4. 단일 파지 클론 선별

실시예 <2-3>의 다클론 파지 항체군에서 단일 클론 항체를 선별하기 위한 실험을 수행하였다. 구체적으로, 2% 글루코오스 및 5 mM 염화마그네슘을 함유하는 2XYT-CM 배지를 96-딥(deep) 웰 프레이트(Bioneer, 90030)에 웰 당 1 ml씩 분주한 후, 결합능력이 가장 큰 3차 패닝 다클론 파지 항체군의 대장균 콜로니를 첨가하여 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 상기 배양된 대장균으로부터 100 내지 200 μl를 취하여 2% 글루코오스 및 5 mM 염화마그네슘이 함유된 2XYT-CM 배지 1ml에 OD₆₀₀ 값이 0.1이 되도록 넣어준 후, OD₆₀₀ 값이 0.5 내지 0.7이 되도록 37℃에서 2시간 내지 3시간 동안 배양하였다. 상기 배양액에 M1 헬퍼 파지를 MOI(multiplicity of infection) 값이 1:20이 되도록 감염시키고 5 mM 염화마그네슘 및 1 mM IPTG를 함유하는 2XYT-CMK 배지에 접종하여 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양된 대장균은 4℃, 4500 rpm에서 15분 동안 원심분리한 후, 상등액을 취해 4% PEG 6000과 3% 염화나트륨을 첨가하여 잘 녹인 다음 얼음에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, 4℃, 8000 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 펠렛을 얻고, 펠렛에 PBS를 첨가하여 녹인 다음 4℃, 12000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 단일 클론 scFv-파지를 포함하는 상등액 얻었다. 상등액은 새 튜브로 옮겨 4℃에서 보관하였다.

2-5. 단일 클론 파지 항체군의 ELISA 분석

상기 실시예 <2-4>에서 얻은 단일 클론 항체군을 이용하여 효소면역분석법(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)을 수행하였다. 구체적으로, Gpr171-D4-mFc 항원을 96-웰 면역플레이트에 웰 당 100 ng씩 넣고, 4℃에서 16시간 동안 코팅 버퍼로 코팅한 후, 4% 탈지분유를 함유하는 PBS를 이용하여 블로킹시켰다. 각 웰은 0.2 ml의 0.05% PBS-T로 세척한 후, 3차 패닝하여 얻은 단일 클론 scFv-파지(각각 100 scFv-파지)를 웰 당 100 μl씩 넣고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 후, 각 웰은 0.2 ml의 0.05% PBS-T로 4회 세척하고, 이차 항체인 항-M13-HRP를 1:2000으로 희석하여 상온에서 1시간 동안 반응시킨 다음 0.2 ml의 0.05% PBS-T로 세척하였다. 그 후, OPD 타블렛을 PC 버퍼에 넣어 만든 기질 용액을 웰 당 100 μl씩 넣어 5분 동안 발색시킨 다음 분광광도계를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 4를 참조하여 보면, 단일 클론 scFv-파지들이 VEGF-His에만 강하게 결합하는 것을 확인하였으며, 수십 종의 예비 항체 클론들이 선별되었다.

2-6. 핑거프린팅(fingerprinting)에 의한 검증

상기 실시예 <2-5>를 통해 수득한 단일 파지 클론이 정확한 클론인지 여부를 확인하기 위하여, 콜로니 PCR을 수행하였다. 구체적으로, 1 μl의 선별된 단일 클론 세포, 0.2 μl의 Taq DNA 중합효소(Taq DNA polymerase, 5 U/μl, 젠닥스), 10 pmole/μl의 전방향 프라이머(forward primer-pelB5, 5'-CTAGATAACGAGGGCAAATCATG-3'; 서열번호 57) 및 역방향 프라이머(reverse primer-cla3; 5'-CGTCACCAATGAAACCATC-3'; 서열번호 58), 3 μl의 10X 버퍼, 0.6 μl의 10 mM dNTP mix, 0.2 μl의 pelB(50p/μl), 0.2 μl의 cla3(50p/μl), 및 24.8 μl의 증류수를 혼합하여 콜로니 PCR(iCycler iQ; BIO-RAD)을 수행하였다. PCR 프로그램의 조건은 하기 표 3에 나타낸 바와 같다.

온도	시간	사이클(cycle)
95℃	5분	1 사이클
95℃	30초	30 사이클
56℃	30초
72℃	1분
72℃	10분	1 사이클

상기 PCR 수행 후 수득한 콜로니 생성물은 1% 아가로스 겔(agarose gel, Seakem LE, CAMERES 50004)에 로딩하여 확인하였고, 제한효소 BstNI(10U/μl, Roche, 11288075001) 0.2 μl를 가하여 37℃에서 2시간 내지 3시간 동안 반응시켰다. 제한효소 반응 조건은 하기 표 4에 나타낸 바와 같다.

10X 버퍼	3 μl
콜로니 PCR 생성물	10 μl
BstNI(10 U/μl)	0.2 μl
증류수	16.8 μl

그 결과, 도 5를 참조하여 보면, 각각의 PCR 생성물이 BstNI에 의해 절단된 것을 8% DNA 폴리아크릴아마이드 겔(2.66 ml의 30% 아크릴아마이드, 1 ml의 10X TBE(Tris-borate-EDTA), 6.27 ml의 dH₂O, 70 μl의 10% 과황산암모늄(ammonium persulfate; APS) 및 7 μl의 테트라메틸에틸렌디아민(N, N, N', N'-tetramethylethylenediamine; TEMED)에서 확인하였다.

2-7. 서열 분석에 의한 검증

제한효소 BstN1에 의해 핑거프린팅으로 확인된 단일 파지 클론들 각각에 대하여 서열 분석을 수행하였다. 구체적으로, 단일 클론을 갖는 대장균을 2% 글루코오스 및 5 mM 염화마그네슘을 함유하는 2XYT-CM 배지 5 ml에 접종하고, 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양한 대장균은 DNA-정제 키트(DNA-prep.kit, Nuclogen, 5112)를 이용하여 DNA를 추출하고 pelB5 프라이머(5'-CTAGATAACGAGGGCAAATCATG-3'; 서열번호 57)로 서열 분석을 수행하였다(솔젠트, 한국). 서열 분석 결과를 이용하여, 선별된 항체의 중쇄 가변영역(V_H) 및 경쇄 가변역역(V_L)의 상보성 결정 영역(CDR)을 확인하였고, 이들 항체와 생식계열(germline) 항체군의 유사성을 NCBI의 웹페이지 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/의 I g 블라스트(BLAST) 프로그램을 이용하여 조사하였다.

그 결과, 하기 표 5에 나타낸 바와 같이, VEGF에 특이적인 단일 클론 파지 항체 3종(3H1, 4C4 및 7D2)을 얻었으며, 각 클론들의 생식계열 서열과의 상동성을 확인하였다. 또한, 3종 각 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 CDR3 아미노산 서열도 확인하였다. 상기 항-VEGF 단일 클론 파지 항체 3종 클론의 중쇄 및 경쇄 가변영역(FR1, FR2, FR3, FR4, CDR1, CDR2, CDR3)의 아미노산 서열 및 염기서열은 도 6 및 도 7에 상세히 나타내었다.

클론 이름	생식계열 V_H	상동성 (%)	V_H (CDR3 아미노산 서열)	생식계열 V_L	상동성 (%)	V_L (CDR3 아미노산 서열)
3H1	V_H3-21	92	DASWGLIQGLDS	V_K1-39	95	QQSYSTPYT
4C4	V_H1-69	86	YKSGSYGMDV	V_L2-14	86	SSYSSSTFYV
7D2	V_H3-48	91	DSRYYGIHGMDV	V_K1-39	96	QQSSSTPRT

실시예 3 : IgG형 항- VEGF 인간항체의 생산

3-1. scFv 파지 항체의 IgG 형태로의 변환

선별된 3종의 단일 클론 파지 항체들을 scFv 형태에서 IgG 형태로 전환하기 위하여 중쇄 및 경쇄 가변영역의 염기서열을 제한효소 SfiI/NheI 및 SfiI/BglⅡ를 이용하여 pN293-V_H 및 pN293-V_L에 각각 서브클로닝 하였다.

3-2. IgG 항체의 생산 및 정제

VEGF에 특이적 단일 클론 항체인 클론 3H1, 4C4 및 7D2는 동물 세포(mammalian cells)에서 임시 발현 시스템을 이용하여 생산하였다. 형질주입 전 날, 세포 계수기(LUNA, 로고스바이오시스템즈, 한국)를 이용하여 세포 수를 센 후, 5 X 10⁵ 세포/ml 농도로 50 ml 튜브에 옮겨 담고 2000 rpm에서 5분 동안 원심분리 하였다. 상층액을 제거한 후, Freestyle^TM 293 배지 1L에 재현탁하여 1 X 10⁶ 세포/ml의 농도가 되도록 24시간 전후로 배양하였다. 폴리플렉스를 만들기 위한 반응액은 1L 형질주입 기준 20 ml의 볼륨으로 수행하였다. 먼저 freestyle^TM 293 배지 20 ml를 50 ml 튜브에 담고, 항원의 경우 플라스미드 DNA 625 μg와 PEI 1250 μg을, 항체의 경우 넣은 후 약 10초간 볼텍싱(vortexing)을 실시하였다. 그 후, 두 튜브를 섞어 5 내지 10초간 2회 약하게 볼텍싱한 다음 15 내지 20분 동안 상온에서 반응시키고 배양 세포에 넣어 주었다. 형질주입 후, 세포는 Freestyle^TM 293 배지에 6일 동안 추가 배양하여 항체 생산을 종료하였다.

6일 동한 배양한 항체 생산 배양액은 8,000 rpm에서 30분 동안 원심분리 하여 세포 잔해를 제거하고, 0.22 μm 기공 크기(pore size)의 필터(bottle top filter, Millipore, Cat. No. SCGPS01RE)를 이용하여 여과하였다. 정제를 수행하기 위해, 빈 컬럼(Bio-rad, BR731-1550)에 프로테인 A 세파로즈 레진 슬러리(sepharose resin slurry, GE Healthcare Life Sciences, Cat. No. 17-1279-04) 4 ml를 넣어 준 후, DPBS(Dulbecco's PBS) 100 ml로 레진을 패킹(packing) 및 세척하였다. 패킹된 레진에 여과시킨 배지를 넣고 EP-1 Econo pump(Bio-Rad, USA)를 연결하여 1분 당 1 ml의 속도로 흘려 주었다. 그 후, 레진은 DPBS 150 ml로 세척하고 0.1 M glycine-HCl(pH 2.5) 10 ml로 추출하여 항체 추출액을 얻었다. 항체 추출액에 1M의 Tris-HCl(pH 9.0)을 10% 첨가하여 pH를 중화시키고, Amicon Ultra-15(Millipore, UFC901096)를 이용하여 DPBS로 버퍼를 교체해 주었다. 이 과정을 3회 정도 반복하여 항체 추출액이 1 ml 정도로 농축되었을 때 실험을 종료하고, Nano-drop으로 농도를 측정하였다.

3-3. 정제된 IgG 항체의 SDS-PAGE 분석 및 생산성 확인

정제가 끝난 단백질의 순도 및 분자량을 확인하기 위해 SDS-PAGE를 수행하였다. 정제된 항체 시료 각 3 μg을 reducing 샘플 버퍼(sample buffer) 또는 non-reducing 샘플 버퍼 5 μl와 각각 혼합하여 100℃에서 3분 동안 끓인 후, SDS-PAGE 겔의 각 웰에 로딩(loading)하고, 200 V에서 1시간 동안 전기영동으로 분리하였다. 그 후, 탱크(tank)에서 겔을 분리하여 염색 버퍼(staining buffer)로 1시간 동안 교반기 위에서 염색하였다. 그 후, 염색 버퍼를 버리고 탈색 버퍼로 1시간 동안 교반기 위에서 탈색 하고, 새로운 탈색 버퍼로 교체하여 다시 한번 탈색시켰다. 탈색이 종료된 겔은 증류수로 세척한 후, 이미지 장비를 이용하여 이미지를 분석하였다.

그 결과, 도 5를 참조하여 보면, 3종의 항-VEGF 단일 클론 인간 항체가 95% 이상의 순도를 가지는 것을 확인하였으며, reducing 조건에서는 약 50 kDa의 중쇄와 약 25 kDa의 경쇄를 가지고, non-reducing 조건에서는 약 150 kDa 이상의 중쇄와 경쇄가 복합체를 이루는 IgG 항체의 평균 크기에서 밴드가 관찰되었다.

한편, 하기 표 6에 나타난 바와 같이, HEK293 세포에서 3종의 항-VEGF 단일 클론 항체의 임시 발현 생산성은 3H1이 59.4 mg/L, 4C4가 113.3 mg/L, 그리고 7D2가 34.1 mg/L로 정제 후 수율(productivity)을 가지는 것을 확인하였다.

항체 이름	생산성(mg/L)
3H1	59.4
4C4	113.3
7D2	34.1

실시예 4: 항- VEGF 인간항체의 항원 결합력

항-VEGF 인간항체의 항원 결합력을 확인하기 위해 효소면역분석법을 수행하였다. 구체적으로, VEGF-His 항원 단백질을 96-웰 면역플레이트에 웰 당 100 ng씩 넣고, 4℃에서 16시간 동안 코팅 버퍼로 코팅한 후, 4% 탈지분유를 함유하는 PBS를 이용하여 블로킹시켰다. 각 웰은 0.2 ml의 PBS-T로 세척한 후, 각 단일 클론 항체를 50 nM 부터 1/2씩 순차적으로 희석하여 항원이 코팅된 플레이트에 100 μl씩 넣고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 후, 각 웰은 0.2 ml의 PBS-T로 3회 세척하고, 이차 항체인 항-인간 Fc-HRP를 1:4000으로 희석하여 상온에서 50분 동안 반응시킨 다음 0.2 ml의 PBS-T로 세척하였다. 그 후, OPD 타블렛을 PC 버퍼에 넣어 만든 기질 용액을 웰 당 100 μl씩 넣어 5분 동안 발색시킨 다음 분광광도계를 이용하여 490 ㎚에서 흡광도를 측정하였고, 상기 효소면역분석 결과는 그래피패드 프리즘(Graphpad prism ver.4 소프트웨어, Graphpad Software Inc., USA)을 이용하여 분석하였다.

그 결과, 도 8을 참조하여 보면, 정제된 항-VEGF 항체의 항원에 대한 결합력(Kd)은 3H1이 60 pM, 4C4가 25 pM, 그리고 7D2가 50 pM로 모두 우수한 것을 확인하였다.

실시예 5: 나이관련 황반변성 마우스 모델에 대한 신규 항- VEGF 항체의 효능 평가

5-1. 실험동물 및 맥락막 신생혈관( CNV ) 모델 제작

동물실험은 인제대학교 및 부산백병원(No.IJUBPH-2016-003-04)의 동물실험 윤리위원회 지침에 따라 수행되었다. C57BL/6 마우스(7주령)는 오리엔트 바이오(Orient Bio)에서 구입하였으며, 1주일 동안의 순화 기간을 거친 후 실험에 사용하였다. C57BL/6 마우스에 알팍산(Alfaxan, 60 mg/kg) 및 자일라진 하이드로클로라이드(xylazine hydrochloride, 2.5 mg/kg) 혼합물을 복강 주사하여 전신 마취하고, 시신경 주위로 3, 6, 9 및 12시 방향으로 레이저(Image-Guided Laser, Phoenix, USA)를 조사하였다. 레이저 조건은 532 nm, 80 ms 및 200 mW이며 스팟(spot)의 크기는 50 μm로 시행하였다. 각 실험군은 각각 5마리씩 C57BL/6 마우스 양안을 이용하여 진행하였다.

5-2. 시험물질 투여

신규 항-VEGF(3H1, 4C4 및 7D2) 항체 및 애플리버셉트(Aflibercept, 양성대조군)를 Day 0(레이저 조사 직후)과 Day 2에 각 안구 당 10 μg씩 안구 내에 투여하였다.

5-3. 안저 플루오레세인 혈관조영술( fundus fluorescein angiography ; FFA )

신규 항-VEGF 항체의 맥락막 신생혈관 억제 효능을 평가하기 위해, 레이저 조사 7일 후, 맥락막 신생혈관(choroidal neovascularization; CNV) 마우스의 양안을 산동하고 마취한 후, 1% 플루오레세인(Fluorescein, Sigma)을 복강 주사하여 혈관을 염색하였다. 플루오레세인 주입 5분 후, 레이저에 의해 유도된 신생혈관 병변 부위는 마이크론 IV 이미지(Micron IV image) 장비로 촬영하였다. CNV 영역은 이미지 J 프로그램(Image J program)을 이용하여 하기 계산식 1에 나타난 바와 같이 CTF(calculate the corrected total fluorescence)로 산출하여 나타내었다.

[계산식 1]

CTF= 적분 밀도 - (선택된 영역의 면적 X 배경의 평균 형광)

그 결과, 도 9를 참조하여 보면, 3종의 신규 항-VEGF 항체 모두 PBS 처리군에 비하여 맥락막 신생혈관을 억제하였으며, 특히 4C4는 양성대조군인 애플리버셉트와 비슷하게 수준으로 맥락막 신생혈관을 억제하는 것을 확인하였다.

5-4. 광 간섭 단층촬영(optical coherence tomography ; OCT)

CNV 마우스의 양안을 산동하고 마취한 후, 광 간섭 단층촬영(Image guided OCT) 장비로 망막 단층을 촬영하였다.

그 결과, 도 10을 참조하여 보면, 레이저 조사 7일 후, 망막 단면에서 맥락막 신생혈관이 관찰되었다. 반면, 신규 항-VEGF 항체를 안구 내에 직접 처리한 군은 PBS 처리군 보다 맥락막 신생혈관의 크기가 작은 것을 확인할 수 있었다.

5-5. 망막 전위도 측정( electroretinography ; ERG)

망막 기능 평가시험은 마우스를 24시간 동안 암순응 시킨 후 암실에서 수행하였다. 마우스를 마취시킨 후, 전극을 각각 피부, 꼬리 및 각막에 접촉시켜 망막 전위도 검사를 수행하였다. 단일 백색광으로 망막을 자극하여 반응값을 얻고, a파의 골에서 b파의 정점까지의 진폭을 측정하여 이를 망막 기능의 지표로 평가하였다.

그 결과, 도 11을 참조하여 보면, 레이저 조사 7일 후, 맥락막 신생혈관 발생에 의하여 광수용 세포(photoreceptor cell)의 백색광에 대한 반응 정도가 감소한 반면, 신규 항-VEGF 항체를 처리한 군에서 백색광에 대한 반응이 회복되는 것을 확인할 수 있었다. 특히 4C4와 애플리버셉트는 맥락막 신생혈관 발생을 유도하지 않은 정상 마우스의 백색광에 대한 반응과 유사한 수준으로 망막 기능을 회복하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> inje university industry-academic cooperation foundation <120> Novel anti- vascular endothelial growth factor antibody and composition for preventing or treating age-related macular degeneration comprising thereof <130> ADP-2017-0056 <160> 58 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF antibody_4C4_VH <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Ser 20 25 30 Ala Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Ile Pro Met Phe Asp Met Thr Asp Tyr Ala Gln Arg Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Leu Thr Ile Ile Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Lys Ser Gly Ser Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF 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attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatgcg 300 tcgtggggac taatacaggg tcttgactcc tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 36 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF antibody_3H1_VL <400> 36 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcaggaacca 120 gggaaagccc ctaaactcct aatctatgat gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatcg 180 aggttcagtg gcggaggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctacaacct 240 gaagattttg cagcttacta ctgtcaacag agttacagta ccccgtacac ttttggccaa 300 gggaccaagg tggatatcaa a 321 <210> 37 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF antibody_7D2_VH <400> 37 Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Asn Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ser Arg Tyr Tyr Gly Ile His Gly Met Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Ile Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 38 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF antibody_7D2_VL <400> 38 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Thr Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Ser Thr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 39 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF 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gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gaccattagc acctatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaaactcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc cgggacagat ttcactctta ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttccagta cccctcggac cttcggccaa 300 gggacacgac tggagatcaa a 321 <210> 55 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF-F primer <400> 55 gcacccatgg cagaaggagg aggg 24 <210> 56 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF-R primer <400> 56 ccgcctcggc ttgtcacatc tgcaagtacg t 31 <210> 57 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pelB5-F primer <400> 57 ctagataacg agggcaaatc atg 23 <210> 58 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cla3-R primer <400> 58 cgtcaccaat gaaaccatc 19

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변영역(V_H) 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변영역(V_L)을 포함하며, 혈관 내피세포 성장인자(VEGF)에 특이적으로 결합하는 단일클론 인간항체 4C4.
제 1항에 있어서,
상기 중쇄 가변영역은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 프레임워크 영역(FR)1, 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 상보성 결정 영역(CDR)1, 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 FR2, 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 FR3, 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는 FR4를 포함하는 단일클론 인간항체 4C4.
제 1항에 있어서,
상기 경쇄 가변영역은 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어지는 FR1, 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어지는 상보성 결정 영역 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어지는 FR2, 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어지는 FR3, 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어지는 FR4를 포함하는 단일클론 인간항체 4C4.
제 1항의 단일클론 인간항체 4C4를 코딩하는 단일클론 인간항체 4C4 cDNA.
제 4항에 있어서,
상기 cDNA는 중쇄 가변영역을 코딩하는 서열번호 17의 염기서열 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 서열번호 18의 염기서열을 포함하는 단일클론 인간항체 4C4 cDNA.
서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변영역(V_H) 및 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변영역(V_L)을 포함하며, 혈관 내피세포 성장인자(VEGF)에 특이적으로 결합하는 단일클론 인간항체 3H1.
제 6항에 있어서,
상기 중쇄 가변영역은 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어지는 FR1, 서열번호 22의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어지는 FR2, 서열번호 24의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 서열번호 25의 아미노산 서열로 이루어지는 FR3, 서열번호 26의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3 및 서열번호 27의 아미노산 서열로 이루어지는 FR4를 포함하는 단일클론 인간항체 3H1.
제 6항에 있어서,
상기 경쇄 가변영역은 서열번호 28의 아미노산 서열로 이루어지는 FR1, 서열번호 29의 아미노산 서열로 이루어지는 상보성 결정 영역 CDR1, 서열번호 30의 아미노산 서열로 이루어지는 FR2, 서열번호 31의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 서열번호 32의 아미노산 서열로 이루어지는 FR3, 서열번호 33의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3 및 서열번호 34의 아미노산 서열로 이루어지는 FR4를 포함하는 단일클론 인간항체 3H1.
제 6항의 단일클론 인간항체 3H1을 코딩하는 단일클론 인간항체 3H1 cDNA.
제 9항에 있어서,
상기 cDNA는 중쇄 가변영역을 코딩하는 서열번호 35의 염기서열 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 서열번호 36의 염기서열을 포함하는 단일클론 인간항체 3H1 cDNA.
서열번호 37의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변영역(V_H) 및 서열번호 38의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변영역(V_L)을 포함하며, 혈관 내피세포 성장인자(VEGF)에 특이적으로 결합하는 단일클론 인간항체 7D2.
제 11항에 있어서,
상기 중쇄 가변영역은 서열번호 39의 아미노산 서열로 이루어지는 FR1, 서열번호 40의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열번호 41의 아미노산 서열로 이루어지는 FR2, 서열번호 42의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 서열번호 43의 아미노산 서열로 이루어지는 FR3, 서열번호 44의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3 및 서열번호 45의 아미노산 서열로 이루어지는 FR4를 포함하는 단일클론 인간항체 7D2.
제 11항에 있어서,
상기 경쇄 가변영역은 서열번호 46의 아미노산 서열로 이루어지는 FR1, 서열번호 47의 아미노산 서열로 이루어지는 상보성 결정 영역 CDR1, 서열번호 48의 아미노산 서열로 이루어지는 FR2, 서열번호 49의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 서열번호 50의 아미노산 서열로 이루어지는 FR3, 서열번호 51의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3 및 서열번호 52의 아미노산 서열로 이루어지는 FR4를 포함하는 단일클론 인간항체 7D2.
제 11항의 단일클론 인간항체 7D2를 코딩하는 단일클론 인간항체 7D2 cDNA.
제 14항에 있어서,
상기 cDNA는 중쇄 가변영역을 코딩하는 서열번호 53의 염기서열 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 서열번호 54의 염기서열을 포함하는 단일클론 인간항체 7D2 cDNA.
제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항의 단일클론 인간항체를 포함하는 나이관련 황반변성 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항의 단일클론 인간항체를 이용하여 혈관 내피세포 성장인자와의 결합력을 측정하는 단계를 포함하는 나이관련 황반변성 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항의 단일클론 인간항체를 포함하는 나이관련 황반변성 진단용 키트.