CN110997713A - 抗bet v 1人抗体及其使用方法 - Google Patents

抗bet v 1人抗体及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本文提供了结合壳斗目植物过敏原、壳斗目植物相关过敏原、桦树花粉或Bet v 1的抗体；包含所述抗体的组合物；编码所述抗体的核酸；以及使用所述抗体的方法。根据某些实施方式，所述抗体是结合至Bet v 1的全人单克隆抗体。所述抗体可用于在体内结合Bet v 1，由此防止过敏原结合至肥大细胞或嗜碱粒细胞表面上的预先形成的IgE。在这种情况下，所述抗体起到防止组胺和其他炎性介质从肥大细胞和/或嗜碱粒细胞释放的作用，由此改善敏感个体对壳斗目植物过敏原的不良反应。

Description

抗BET V 1人抗体及其使用方法
技术领域
本发明涉及结合至桦树花粉过敏原Bet v 1的人抗体和人抗体的抗原结合片段、包含所述抗体的治疗性组合物以及使用所述抗体的方法。
序列表
序列表的正式副本通过EFS-Web以电子方式与本说明书同时提交，该序列表为ASCII格式，文件名是10301WO01_SEQ_LIST_ST25，创建日期为2018年5月31日，大小是约137千字节。该ASCII格式的文件中包含的序列表是说明书的一部分，并且以全文引用的方式并入本文中。
背景技术
桦树是在美国导致23％的患者过敏和在欧洲导致14％的患者过敏的主要致敏物(Datamonitor关于过敏性鼻炎的报告(Datamonitor report on Allergic Rhinitis)，2010年7月)，而且还是在春季引起整个欧洲、北美、俄罗斯及澳大利亚发生1型过敏的主要原因(Breiteneder等人，《欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)》1989,8(7):1935-8)。Bet v 1蛋白质是在来自疣皮桦(Betula verrucosa)(欧洲白桦树，也与垂枝桦(Betula pendula)同义)的花粉中鉴别出的一种主要桦树过敏原，并且在超过95％的桦树花粉过敏患者中引起IgE结合(Breiteneder，前述)。Bet v 1是具有三个α螺旋的较小的7股反平行β折叠，具有已知的结晶结构(Kofler等人，2012,422(1):109-23；Markovic Housley等人，《分子生物学杂志(J Mol Biol.)》2003,325(1):123-33；Spangfort等人，《免疫学杂志(J Immunol.)》2003,171(6):3084-90)。WO94/10194涉及来源于壳斗目(Fagales order)树木的肽。
百分之六十的桦树花粉过敏患者仅仅对Bet v 1起反应(Jarolim等人，《国际变态反应学与应用免疫学文集(Int Arch Allergy Appl Immunol.)》1989,88(1-2):180-2)。仅仅一颗桦树就可以产生多达五百万个花粉粒，这些花粉粒通过空气传播到距该树多达100码的地方。桦树花粉过敏的症状可以从轻度鼻炎和结膜炎到危及生命的哮喘反应。
免疫球蛋白E(IgE)会引起1型超敏反应，其表现为过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、花粉热、过敏性哮喘、蜂毒过敏及食物过敏。IgE在血液中循环并结合至嗜碱粒细胞和肥大细胞上的针对IgE的高亲和力FcεR1α受体。在大多数过敏反应中，过敏原通过吸入、摄入或通过皮肤进入身体。接着，过敏原与已结合至肥大细胞和嗜碱粒细胞表面上的高亲和力受体的预先形成的IgE结合，使得若干IgE分子交联并触发组胺和其他炎性介质的释放，由此引起各种过敏症状。
过敏的治疗包括用于抑制免疫活性的类固醇和用于缓解哮喘症状的支气管扩张剂。脱敏疗法也被用于严重过敏患者。已对使个体对特定过敏原(例如Bet v 1)脱敏的肽疫苗组合进行测试(参见US9,017,689)。抗体已被提议作为过敏的疗法，因为抗体能够阻止致敏分子进入粘膜组织中，或可以在过敏原有机会与结合至肥大细胞或嗜碱粒细胞上的高亲和力受体的IgE结合之前，结合该过敏原，由此防止组胺和其他炎性介质从这些细胞释放。
美国专利号5,670,626描述了使用单克隆抗体，通过阻断过敏原与粘膜组织的结合来治疗IgE介导的过敏性疾病(如过敏性鼻炎、过敏性哮喘和过敏性结膜炎)。美国专利号6,849,259描述了使用过敏原特异性抗体来抑制小鼠过敏模型体内的过敏性炎症。基于牛奶和基于蛋的抗体系统也有描述。例如，US2003/0003133A1公开了使用牛奶作为过敏原的载体来诱导针对桦树花粉和其他过敏原的口服耐受性。WO1994/024164A2中描述了通过使用抑制过敏原结合至肥大细胞的能力的分子来减轻动物对环境中过敏原的过敏反应的组合物和方法。在US2010/0034812中还提到了其他抗Bet v 1抗体。
本发明旨在解决上文所论述的一个或多个问题。
发明概述
本文提供了结合桦树花粉，例如天然Bet v 1、垂枝桦花粉提取物(BPE)、河桦(Betula nigra)BPE或杨叶桦(Betula populifolia)BPE的全人单克隆抗体和其抗原结合片段。在敏感患者暴露于桦树过敏原之后，所述抗体可用于在体内结合Bet v 1过敏原，并因此可以用以促进天然Bet v 1、垂枝桦花粉提取物(BPE)、河桦BPE或杨叶桦BPE的清除，或阻断过敏原与肥大细胞或嗜碱粒细胞表面上预先形成的IgE的结合。借此，本文所述的抗体可以防止组胺或其他炎性介质从肥大细胞或嗜碱粒细胞释放，从而预防或减少在对桦树过敏原敏感的患者中所观察到的不良影响。在某些实施方式中，所述抗体能够减轻、最大限度地减少或预防对桦树过敏原或桦树相关过敏原敏感的患者的至少一种症状，如打喷嚏、鼻腔充血(congestion)、鼻塞、咳嗽、喘鸣、支气管收缩、鼻炎或结膜炎。在一些实施方式中，所述抗体能够预防敏感个体与暴露于桦树花粉过敏原相关的甚至更严重的体内并发症，如哮喘反应、全身性过敏反应(anaphylaxis)，甚至是死亡。
本文提供的抗体可以是全长的例如IgG1或IgG4抗体，或可仅包含抗原结合部分例如Fab、F(ab')2或scFv片段，并且可以被修饰成影响功能性，例如消除残留效应功能(Reddy等人,2000,《免疫学杂志(J.Immunol.)》164:1925-1933)。
本发明的第一方面提供了一种结合天然Bet v 1、垂枝桦花粉提取物(BPE)、河桦BPE和/或杨叶桦BPE的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方式中，所述分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段抑制天然Bet v1、垂枝桦BPE、河桦BPE或杨叶桦BPE结合至过敏原特异性的IgE。
在一个实施方式中，所述分离的人抗体或其抗原结合片段以等于或小于10-8M的KD结合至Bet v 1。在一个实施方式中，所述人抗体或其抗原结合片段以在约10-8至约10-11M范围内的KD结合至Bet v 1。在一个实施方式中，所述分离的人抗体或其抗原结合片段以等于或小于27.9nM的KD结合至Bet v 1。在一个实施方式中，所述分离的人抗体或其抗原结合片段以在约0.66nM至约27.9nM等效范围内的KD结合至Bet v 1。
在一个实施方式中，所述分离的人抗体是全人单克隆抗体。
在一个实施方式中，所述分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段与一种或多种选自下组的过敏原交叉反应：Aln g1、Cor a1、Car b1、Que a1、Api g2、Api g1、Dau c1、Mald1、Ost c1、Fag s1和Cas s1。这些过敏原也可以称为PR-10蛋白质，或所谓的致病相关(PR)蛋白质。另外的PR-10蛋白质(Bet v 1家族成员)还包括Act c 8和Act d 8(奇异果)、Ara h8(花生)、Pru ar 1(杏)、Pru av 1(樱桃)、Pru p 1(桃)、Pyr c 1(梨)、Gly m 4(大豆)、Vigr 1(绿豆)、Sola I 4(番茄)、Cuc m 3(瓜)、Rub i 1(覆盆子)和Fra a 1(草莓)。这些过敏原也可以被视为壳斗目植物相关过敏原。
在一个实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段与一种或多种选自下组的过敏原交叉反应：Aln g1、Mal d1、Api g1、Car b1和Cor a1。
在一个实施方式中，所述分离的人抗体或其抗原结合片段包含三个重链CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，所述重链CDR包含于选自下组的任一重链可变区(HCVR)序列内：SEQ ID NO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、282及290；以及三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，所述三个轻链CDR包含于选自下组的任一轻链可变区(LCVR)序列内：SEQ ID NO:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266及298。用于鉴别HCVR和LCVR氨基酸序列内的CDR的方法和技术是本领域中众所周知的，并且可以用于鉴别本文所公开的指定HCVR和/或LCVR氨基酸序列内的CDR。可以用于鉴别CDR边界的示例性约定包括例如卡巴特定义(Kabat定义)、科西亚定义(Chothia定义)和AbM定义。一般来说，卡巴特定义是基于序列可变性，科西亚定义是基于各结构环区域的位置，并且AbM定义是卡巴特法与科西亚法之间的折中。参见例如Kabat，“免疫相关蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)”，美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)，马里兰州贝塞斯达(Bethesda,Md.)(1991)；Al-Lazikani等人，(1997),《分子生物学杂志》273:927-948；以及Martin等人,(1989)，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》86:9268-9272。公共数据库也可用于鉴别抗体内的CDR序列。
在一个实施方式中，所述分离的人抗体或其抗原结合片段包含三个重链CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，所述重链CDR包含于选自下组的任一重链可变区(HCVR)序列内：SEQ ID NO:114、146、98及290；以及三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，所述三个轻链CDR包含于选自下组的任一轻链可变区(LCVR)序列内：SEQ ID NO:122、154、106及298。
在一个实施方式中，所述分离的人抗体或其抗原结合片段包含具有选自下组的氨基酸序列的HCVR：SEQ ID NO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、282及290。
在一个实施方式中，所述分离的人抗体或其抗原结合片段包含具有选自下组的氨基酸序列的HCVR：SEQ ID NO:114、146、98及290。
在一个实施方式中，所述分离的人抗体或其抗原结合片段包含具有选自下组的氨基酸序列的LCVR：SEQ ID NO:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266及298。
在一个实施方式中，所述分离的人抗体或其抗原结合片段包含具有选自下组的氨基酸序列的LCVR：SEQ ID NO:122、154、106及298。
在一个实施方式中，所述分离的人抗体或其抗原结合片段包含：(a)具有选自下组的氨基酸序列的HCVR：SEQ ID NO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、282及290；和(b)具有选自下组的氨基酸序列的LCVR：SEQ ID NO:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266及298。
在一个实施方式中，所述分离的人抗体或其抗原结合片段包含：(a)具有选自下组的氨基酸序列的HCVR：SEQ ID NO:114、146、98及290；和(b)具有选自下组的氨基酸序列的LCVR：SEQ ID NO:122、154、106及298。
在一个实施方式中，所述分离的人抗体或其抗原结合片段包含：
(a)具有选自下组的氨基酸序列的HCDR1结构域：SEQ ID NO:4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、284及292；
(b)具有选自下组的氨基酸序列的HCDR2结构域：SEQ ID NO:6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、286及294；
(c)具有选自下组的氨基酸序列的HCDR3结构域：SEQ ID NO:8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、288及296；
(d)具有选自下组的氨基酸序列的LCDR1结构域：SEQ ID NO:12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268及300；
(e)具有选自下组的氨基酸序列的LCDR2结构域：SEQ ID NO:14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270及302；以及
(f)具有选自下组的氨基酸序列的LCDR3结构域：SEQ ID NO:16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272及304。
在一个实施方式中，所述分离的人抗体或其抗原结合片段包含选自下组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO:2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/266、282/266及290/298。
在一个实施方式中，所述分离的人抗体或其抗原结合片段包含选自下组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO:114/122、146/154、98/106及290/298。
在一个实施方式中，所述结合至Bet v 1的分离的人抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NO:146/154和290/298的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
在一个实施方式中，所述结合至Bet v 1的分离的人抗体或其抗原结合片段与选自下组的氨基酸序列的至少一个相互作用：在SEQ ID NO:306的约23位至约44位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约44位至约70位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约2位至约19位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约57位至约70位范围内的氨基酸残基；以及在SEQ ID NO:306的约81位至约96位范围内的氨基酸残基。
在一个实施方式中，所述结合至Bet v 1的分离的人抗体或其抗原结合片段与在SEQ ID NO:306的约23位至约44位范围内的氨基酸残基相互作用。
在一个实施方式中，所述结合至Bet v 1的分离的人抗体或其抗原结合片段与在SEQ ID NO:306的约23位至约43位范围内的氨基酸残基相互作用。
在一个实施方式中，所述结合至Bet v 1的分离的人抗体或其抗原结合片段与在SEQ ID NO:306的约44位至约70位范围内的氨基酸残基相互作用。
在一个实施方式中，所述结合至Bet v 1的分离的人抗体或其抗原结合片段与在SEQ ID NO:306的约44位至约56位范围内的氨基酸残基相互作用。
在一个实施方式中，所述结合至Bet v 1的分离的人抗体或其抗原结合片段与在SEQ ID NO:306的约2位至约19位范围内的氨基酸残基相互作用。
在一个实施方式中，所述结合至Bet v 1的分离的人抗体或其抗原结合片段与在SEQ ID NO:306的约57位至约70位范围内的氨基酸残基相互作用。
在一个实施方式中，所述结合至Bet v 1的分离的人抗体或其抗原结合片段与在SEQ ID NO:306的约57位至约66位范围内的氨基酸残基相互作用。
在一个实施方式中，所述结合至Bet v 1的分离的人抗体或其抗原结合片段与在SEQ ID NO:306的约81位至约96位范围内的氨基酸残基相互作用。
在一个实施方式中，所述结合至Bet v 1的分离的人抗体或其抗原结合片段与在SEQ ID NO:306的约81位至约89位范围内的氨基酸残基相互作用。
在一个实施方式中，所述结合至Bet v 1的分离的人抗体或其抗原结合片段与选自下组的氨基酸序列的至少一个相互作用：SEQ ID NO:307、308、309、310及311。包含SEQID NO:307、308、309、310或311的表位可以在C末端或N末端上延伸1至5个氨基酸、或5至10个氨基酸。例如，SEQ ID NO:311所示表位延伸5至10个氨基酸时，则涵盖了SEQ ID NO:115所示表位。换句话说，包含SEQ ID NO:311的表位例如包括SEQ ID NO:315所示表位。
在一个实施方式中，所述结合至Bet v 1的分离的人抗体或其抗原结合片段与SEQID NO:307相互作用。
在一个实施方式中，所述结合至Bet v 1的分离的人抗体或其抗原结合片段与SEQID NO:308相互作用。
在一个实施方式中，所述结合至Bet v 1的分离的人抗体或其抗原结合片段与SEQID NO:309相互作用。
在一个实施方式中，所述结合至Bet v 1的分离的人抗体或其抗原结合片段与SEQID NO:310相互作用。
在一个实施方式中，所述结合至Bet v 1的分离的人抗体或其抗原结合片段与SEQID NO:311相互作用。
在一个实施方式中，所述结合至Bet v 1的分离的人抗体或其抗原结合片段与SEQID NO:315相互作用。
在一个实施方式中，所述结合至Bet v 1的分离的人抗体或其抗原结合片段与选自下组的氨基酸序列的至少一个相互作用：SEQ ID NO:307、308、309、310、311及315，并且包含选自下组的HCVR/LCVR序列对：SEQ ID NO:114/122、146/154、98/106及290/298。
在一个实施方式中，与SEQ ID NO:307相互作用的分离的人抗体或其抗原结合片段包含包含于SEQ ID NO:146所示重链可变区中的三个HCDR以及包含于SEQ ID NO:154所示轻链可变区中的三个LCDR。
在一个实施方式中，与SEQ ID NO:310相互作用的分离的人抗体或其抗原结合片段包含包含于SEQ ID NO:290所示重链可变区中的三个HCDR以及包含于SEQ ID NO:298所示轻链可变区中的三个LCDR。
在一个实施方式中，结合Bet v 1的人抗体或其抗原结合片段包含分别由SEQ IDNO:148、150和152所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列，以及分别由SEQ ID NO:156、158和160所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
在一个实施方式中，结合至Bet v 1的人抗体或其抗原结合片段包含分别由SEQID NO:292、294和296所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列，以及分别由SEQ ID NO:300、302和304所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
在一个实施方式中，结合至Bet v 1的人抗体或其抗原结合片段包含分别由SEQID NO:4、6和8所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列，以及分别由SEQ ID NO:12、14和16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
在一个实施方式中，结合至Bet v 1的人抗体或其抗原结合片段包含分别由SEQID NO:20、22和24所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列，以及分别由SEQ ID NO:28、30和32所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
在一个实施方式中，结合至Bet v 1的人抗体或其抗原结合片段包含分别由SEQID NO:36、38和40所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列，以及分别由SEQ ID NO:44、46和48所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
在一个实施方式中，结合至Bet v 1的人抗体或其抗原结合片段包含分别由SEQID NO:52、54和56所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列，以及分别由SEQ ID NO:60、62和64所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
在一个实施方式中，结合至Bet v 1的人抗体或其抗原结合片段包含分别由SEQID NO:68、70和72所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列，以及分别由SEQ ID NO:76、78和80所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
在一个实施方式中，结合至Bet v 1的人抗体或其抗原结合片段包含分别由SEQID NO:84、86和88所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列，以及分别由SEQ ID NO:92、94和96所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
在一个实施方式中，结合至Bet v 1的人抗体或其抗原结合片段包含分别由SEQID NO:100、102和104所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列，以及分别由SEQ ID NO:108、110和112所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
在一个实施方式中，结合至Bet v 1的人抗体或其抗原结合片段包含分别由SEQID NO:116、118和120所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列，以及分别由SEQ ID NO:SEQID NO:124、126和128所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
在一个实施方式中，结合至Bet v 1的人抗体或其抗原结合片段包含分别由SEQID NO:132、134和136所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列，以及分别由SEQ ID NO:140、142和144所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
在一个实施方式中，结合至Bet v 1的人抗体或其抗原结合片段包含分别由SEQID NO:164、166和168所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列，以及分别由SEQ ID NO:172、174和176所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
在一个实施方式中，结合至Bet v 1的人抗体或其抗原结合片段包含分别由SEQID NO:180、182和184所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列，以及分别由SEQ ID NO:188、190和192所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
在一个实施方式中，结合至Bet v 1的人抗体或其抗原结合片段包含分别由SEQID NO:196、198和200所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列，以及分别由SEQ ID NO:204、206和208所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
在一个实施方式中，结合至Bet v 1的人抗体或其抗原结合片段包含分别由SEQID NO:212、214和216所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列，以及分别由SEQ ID NO:220、222和224所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
在一个实施方式中，结合至Bet v 1的人抗体或其抗原结合片段包含分别由SEQID NO:228、230和232所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列，以及分别由SEQ ID NO:236、238和234所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
在一个实施方式中，结合至Bet v 1的人抗体或其抗原结合片段包含分别由SEQID NO:244、246和248所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列，以及分别由SEQ ID NO:252、254和256所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
在一个实施方式中，结合至Bet v 1的人抗体或其抗原结合片段包含分别由SEQID NO:260、262和264所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列，以及分别由SEQ ID NO:268、270和272所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
在一个实施方式中，结合至Bet v 1的人抗体或其抗原结合片段包含分别由SEQID NO:276、278和280所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列，以及分别由SEQ ID NO:SEQID NO:268、270和272所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
在一个实施方式中，结合至Bet v 1的人抗体或其抗原结合片段包含分别由SEQID NO:284、286和288所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列，以及分别由SEQ ID NO:SEQID NO:268、270和272所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
在一个实施方式中，本发明提供一种结合至天然Bet v 1、垂枝桦BPE、河桦BPE或杨叶桦BPE的全人单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段展现以下特征中的一种或多种：(i)包含具有选自下组的氨基酸序列的HCVR：SEQ ID NO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、282及290、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列；(ii)包含具有选自下组的氨基酸序列的LCVR：SEQ ID NO:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266及298、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列；(iii)包含具有选自下组的氨基酸序列的HCDR3结构域：SEQ IDNO:8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、288及296、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列；以及具有选自下组的氨基酸序列的LCDR3结构域：SEQ ID NO:16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272及304、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列；(iv)包含具有选自下组的氨基酸序列的HCDR1结构域：SEQ ID NO:4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、284及292、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列；具有选自下组的氨基酸序列的HCDR2结构域：SEQ ID NO:6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、286及294、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列；具有选自下组的氨基酸序列的LCDR1结构域：SEQ ID NO:12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268及300、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列；以及具有选自下组的氨基酸序列的LCDR2结构域：SEQ IDNO:14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270及302、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列；(v)以等于或小于10-8且在约10-8至约10-11范围内的KD结合至Bet v 1；(vi)在至少一种具有全身性过敏反应或炎症的动物模型中表现出功效；或(vii)与参照抗体竞争结合至天然Bet v 1、垂枝桦BPE、河桦BPE或杨叶桦BPE。
在一个实施方式中，“参照抗体”可以包括例如具有选自下组的重链和轻链氨基酸序列对组合的抗体：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/266、282/266及290/298。
本发明涵盖具有修饰的糖基化模式的抗体。在一些应用中，去除不合需要的糖基化位点的修饰可能是有用的，或例如去除岩藻糖部分可增加抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能(参见Shield等人,2002、JBC 277:26733)。在其他应用中，可以进行半乳糖基化修饰以改变补体依赖性细胞毒性(CDC)。
第二方面提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，其与这样的抗体或抗原结合片段竞争特异性结合至天然Bet v 1、垂枝桦BPE、河桦BPE或杨叶桦BPE：包含重链可变区(HCVR)的互补决定区(CDR)，其中所述HCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、282及290；以及包含轻链可变区(LCVR)的CDR，其中所述LCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266及298。
一个实施方式提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，其与这样的抗体或抗原结合片段竞争特异性结合至天然Bet v 1、垂枝桦BPE、河桦BPE或杨叶桦BPE：包含重链可变区(HCVR)的互补决定区(CDR)，其中所述HCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:114、146、98和290；以及包含轻链可变区(LCVR)的CDR，其中所述LCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:122、154、106和298。
在一个相关实施方式中，本发明提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，其与这样的抗体或抗原结合片段竞争特异性结合至天然Bet v 1、垂枝桦BPE、河桦BPE或杨叶桦BPE：包括包含于选自下组的重链和轻链序列对内的重链和轻链CDR：SEQ ID NO:2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/266、282/266及290/298。
第三方面提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合Bet v 1上的与以下抗体或抗原结合片段结合的相同表位，抗体或抗原结合片段包含：重链可变区(HCVR)的互补决定区(CDR)，其中所述HCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、282及290；以及轻链可变区(LCVR)的CDR，其中所述LCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266及298。
一个实施方式提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合Bet v 1上的与以下抗体或抗原结合片段结合的相同表位，抗体或抗原结合片段包含：重链可变区(HCVR)的互补决定区(CDR)，其中所述HCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:114、146、98及290；以及轻链可变区(LCVR)的CDR，其中所述LCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:122、154、106及298。
在一个相关实施方式中，本文提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合Bet v1上的与以下抗体或抗原结合片段结合的相同表位，抗体或抗原结合片段包含包含于选自下组的重链和轻链序列对内的重链和轻链CDR：SEQ ID NO:2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/266、282/266及290/298。
在第四方面，本发明提供了编码Bet v 1抗体或其片段的核酸分子。本文还涵盖了携带此类核酸的重组表达载体，和引入了此类载体的宿主细胞，以及产生所述抗体的方法，该方法通过在允许产生所述抗体的条件下培养所述宿主细胞，并收集所产生的抗体。
在一个实施方式中，本文提供了核酸分子，其编码结合至天然Bet v 1、垂枝桦BPE、河桦BPE或杨叶桦BPE的人单克隆抗体或其片段。
在一个实施方式中，本文提供了一种抗体或其片段，其包含选自下组的核酸序列所编码的HCVR：SEQ ID NO:1、17、33、49、65、81、97、113、129、145、161、177、193、209、225、241、257、273、281及289、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的基本上一致的序列。
在一个实施方式中，HCVR是由选自下组的核酸序列编码：SEQ ID NO:113、145、257及289。
在一个实施方式中，所述抗体或其片段还包含由选自下组的核酸序列所编码的LCVR：SEQ ID NO:9、25、41、57、73、89、105、121、137、153、169、185、201、217、233、249、265及297、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的基本上一致的序列。
在一个实施方式中，LCVR是由选自下组的核酸序列编码：SEQ ID NO:121、153、265及297。
在一个实施方式中，本文提供了一种抗体或抗体的抗原结合片段，其包含：由选自下组的核苷酸序列所编码的HCDR3结构域：SEQ ID NO:7、23、39、55、71、87、103、119、135、151、167、183、199、215、231、247、263、279、287及295、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列；以及由选自下组的核苷酸序列所编码的LCDR3结构域：SEQ ID NO:15、31、47、63、79、95、111、127、143、159、175、191、207、223、239、255、271及303、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
在一个实施方式中，本文提供了一种抗体或其片段，其还包含：由选自下组的核苷酸序列所编码的HCDR1结构域：SEQ ID NO:3、19、35、51、67、83、99、115、131、147、163、179、195、211、227、243、259、275、283及291、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列；由选自下组的核苷酸序列所编码的HCDR2结构域：SEQ ID NO:5、21、37、53、69、85、101、117、133、149、165、181、197、213、229、245、261、277、285及293、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列；由选自下组的核苷酸序列所编码的LCDR1结构域：SEQ ID NO:11、27、43、59、75、91、107、123、139、155、171、187、203、219、235、251、267及299、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列；以及由选自下组的核苷酸序列所编码的LCDR2结构域：SEQ ID NO:13、29、45、61、77、93、109、125、141、157、173、189、205、221、237、253、269及301、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列。
第五方面提供了一种药物组合物，其包括治疗有效量的一种或多种结合天然Betv 1、垂枝桦BPE、河桦BPE或杨叶桦BPE的分离的人抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。
在一个实施方式中，所述药物组合物包括治疗有效量的两种或更多种结合Bet v1的分离的人抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。
在一个实施方式中，所述药物组合物包括：
a)结合Bet v 1的第一分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含具有如SEQID NO:146所示氨基酸序列的HCVR；以及具有如SEQ ID NO:154所示氨基酸序列的LCVR；
b)结合Bet v 1的第二分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含具有选自SEQ ID NO:114、98和290的氨基酸序列的HCVR；以及具有选自SEQ ID NO:122、106和298的氨基酸序列的LCVR；和
c)一种或多种药学上可接受的赋形剂。
在一个实施方式中，所述药物组合物包括：
a)结合Bet v 1的第一分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含具有如SEQID NO:290所示氨基酸序列的HCVR；以及具有如SEQ ID NO:298所示氨基酸序列的LCVR；
b)结合Bet v 1的第二分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含具有选自SEQ ID NO:114、146和98的氨基酸序列的HCVR；以及具有选自SEQ ID NO:122、154和106的氨基酸序列的LCVR；和
c)一种或多种药学上可接受的赋形剂。
在一个实施方式中，所述药物组合物包括：
a)结合Bet v 1的第一分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含具有如SEQID NO:146所示氨基酸序列的HCVR；以及具有如SEQ ID NO:154所示氨基酸序列的LCVR；
b)结合Bet v 1的第二分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含具有如SEQID NO:290所示氨基酸序列的HCVR；以及具有如SEQ ID NO:298所示氨基酸序列的LCVR；和
c)一种或多种药学上可接受的赋形剂。
在一个实施方式中，所述药物组合物包括：
a)第一分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO:146所示氨基酸序列的HCVR以及具有SEQ ID NO:154所示氨基酸序列的LCVR；
b)第二分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO:290所示氨基酸序列的HCVR以及具有SEQ ID NO:298所示氨基酸序列的LCVR；
c)一种或多种其他分离的人单克隆抗体或抗原结合片段，其包含具有选自SEQ IDNO:114和98的氨基酸序列的HCVR，以及具有选自SEQ ID NO:122和106的氨基酸序列的LCVR；和
d)一种或多种药学上可接受的赋形剂。
在一个实施方式中，所述药物组合物包括：
结合Bet v 1的第一分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ IDNO:146/154组成的HCVR/LCVR氨基酸序列对；
结合Bet v 1的第二分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含选自下组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO:114/122、98/106和290/298；和
一种或多种药学上可接受的赋形剂。
在一个实施方式中，所述药物组合物包括：
结合至Bet v 1的第一分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ IDNO:146/154组成的HCVR/LCVR氨基酸序列对；
结合至Bet v 1的第二分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ IDNO:290/298组成的HCVR/LCVR氨基酸序列对；和
一种或多种药学上可接受的赋形剂。
在一个实施方式中，所述药物组合物包括两种或更多种结合至Bet v 1的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段以及一种或多种药学上可接受的赋形剂，所述分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段包含选自下组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO:2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/266、282/266及290/298。
在一个实施方式中，所述药物组合物包括三种或更多种结合至Bet v 1的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段以及一种或多种药学上可接受的赋形剂，所述分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段包含选自下组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO:2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/266、282/266及290/298。
在一个实施方式中，所述药物组合物包括四种结合至Bet v 1的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段以及一种或多种药学上可接受的赋形剂，其中所述人抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:114/122、146/154、98/106及290/298所示的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
在一个实施方式中，所述药物组合物包括：命名为H4H16992P的抗体，其具有SEQID NO:146/154所示的HCVR/LCVR氨基酸序列对；命名为H4H17082P2的抗体，其具有SEQ IDNO:290/298所示的HCVR/LCVR氨基酸序列对；和命名为H4H17038P2的抗体，其具有SEQ IDNO:98/106所示的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
在一个实施方式中，所述药物组合物包括：命名为H4H16992P的抗体，其具有SEQID NO:146/154所示的HCVR/LCVR氨基酸序列对；命名为H4H17082P2的抗体，其具有SEQ IDNO:290/298所示的HCVR/LCVR氨基酸序列对；命名为H4H17038P2的抗体，其具有SEQ ID NO:98/106所示的HCVR/LCVR氨基酸序列对；和命名为H4H16987P的抗体，其具有SEQ ID NO:114/122所示的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
在一个实施方式中，所述药物组合物包括治疗有效量的结合至Bet v 1的第一分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述第一抗体或其片段与在SEQ ID NO:306的约23位至约44位范围内的氨基酸残基相互作用；和结合至Bet v 1的第二分离人单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗体或其片段与在SEQ ID NO:306的约44位至约70位范围内的氨基酸残基相互作用；以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。
在一个实施方式中，所述药物组合物包括治疗有效量的结合至Bet v 1的第一分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂，其中所述第一抗体或其片段与在SEQ ID NO:306的约23位至约43位范围内的氨基酸残基相互作用；和结合至Bet v 1的第二分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗体或其片段与在SEQ ID NO:306的约44位至约56位范围内的氨基酸残基相互作用。
在一个实施方式中，所述药物组合物包含治疗有效量的结合至Bet v 1的第一分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂，其中所述第一抗体或其片段与SEQ ID NO:307所示的氨基酸序列相互作用；和结合至Bet v 1的第二分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗体或其片段与SEQ ID NO:308、309、310、311或315所示的氨基酸序列相互作用。
在一个实施方式中，所述药物组合物包括治疗有效量的结合至Bet v 1的第一分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，和结合至Bet v 1的一种或多种其他分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂，其中所述第一抗体或其片段与选自下组的氨基酸序列至少一个相互作用：在SEQ ID NO:306的约23位至约43位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约44位至约56位范围内的氨基酸残基；在SEQ IDNO:306的约2位至约19位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约57位至约70位范围内的氨基酸残基；和在SEQ ID NO:306的约81位至89位或约81位至约96位范围内的氨基酸残基。
在一个实施方式中，所述一种或多种其他分离的人单克隆抗体或其片段与选自下组的氨基酸序列的至少一个相互作用：在SEQ ID NO:306的约23位至约43位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约44位至约56位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约2位至约19位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约57位至约70位范围内的氨基酸残基；以及在SEQ ID NO:306的约81位至89位或约81位至约96位范围内的氨基酸残基，其中所述一种或多种其他分离的人单克隆抗体中的至少一种与不同于所述第一分离的人单克隆抗体的氨基酸序列相互作用。
在一个实施方式中，所述药物组合物包括治疗有效量的结合至Bet v 1的第一分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，和结合至Bet v 1的一种或多种其他分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂，其中所述第一抗体或其片段与SEQ ID NO:307所示的氨基酸序列相互作用，并且其中所述一种或多种其他抗体或其片段与选自下组的氨基酸序列相互作用：SEQ ID NO:308、309、310、311及315。
在一个实施方式中，所述药物组合物包括治疗有效量的至少两种结合至天然Betv 1或BPE的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂，其中所述至少两种抗体并不竞争结合天然Bet v 1或BPE。在某些方面，所述抗体或其抗原结合片段是Bet v 1抗体H4H16992P和H4H17082P2，其分别包含SEQ ID NO:146/154和290/298所示的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
在一个实施方式中，所述药物组合物包括治疗有效量的至少三种结合至天然Betv 1或BPE的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂，其中所述至少三种抗体并不竞争结合天然Bet v 1或BPE。在某些方面，所述抗体或其抗原结合片段是Bet v 1抗体H4H16992P、H4H17082P2和H4H17038P2，其分别包含SEQ ID NO:146/154、290/298和98/106所示的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
在一个实施方式中，所述药物组合物包括治疗有效量的至少四种结合至天然Betv 1或BPE的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂，其中所述至少四种抗体不竞争结合天然Bet v 1或BPE。在某些方面，所述抗体或其抗原结合片段是Bet v 1抗体H4H16992P、H4H17082P2、H4H17038P2和H4H16987P，其分别包含SEQID NO:146/154、290/298、98/106及114/122所示的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
在一个实施方式中，所述药物组合物包括治疗有效量的结合至Bet v 1的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂，其中所述抗体或其抗原结合片段与一种或多种选自下组的过敏原交叉反应：Aln g1、Cor a1、Car b1、Quea1、Api g2、Api g1、Dau c1、Mal d1、Ost c1、Fag s1和Cas s1。在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段与一种或多种选自下组的过敏原交叉反应：Aln g1、Mal d1、Api g1、Car b1和Cor a1。
在一个实施方式中，本发明的特征在于一种组合物，所述组合物是治疗有效量的一种或多种本发明的抗Bet v 1抗体或其抗原结合片段和治疗有效量的第二治疗剂，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合。
第二治疗剂可以是小分子药物、蛋白质/多肽、抗体、核酸分子，如反义分子或siRNA。第二治疗剂可以是合成的或天然来源的。
第二治疗剂可以是任何能有利地与本发明的抗体或其片段组合的药剂，例如除本文所描述的抗体外的能够阻断Bet v 1与肥大细胞或嗜碱粒细胞上存在的IgE结合的另一种抗体。第二治疗剂也可以是任何用作治疗针对过敏原的过敏反应的标准护理的药剂。此类第二治疗剂可以是抗组胺剂、肾上腺素、解充血剂、皮质类固醇或肽疫苗。
在某些实施方式中，如果可能发生与本发明的抗体或抗体的抗原结合片段相关的任何可能副作用，则所述第二治疗剂可以是有助于抵消或减轻此类副作用的药剂。
还应了解，本发明的抗体和药学上可接受的组合物可以用于组合疗法中，即所述抗体和药学上可接受的组合物可以在一种或多种其他期望的治疗剂或医疗程序的同时、之前或之后进行施用，包括例如与过敏原特异性免疫疗法(SIT)方案的组合，其中在SIT之前或期间施用所述抗体。用于组合方案中的特定疗法组合(治疗剂或程序)将考虑所期望的治疗剂和/或程序的相容性和待实现的所期望的治疗作用。还应了解，所用疗法可以实现针对相同病症的所期望的作用(例如抗体可以与用于治疗相同病症的另一种药剂并行地施用)，或这些疗法可以实现不同的作用(例如控制任何不良作用)。如本文所使用，通常施用以治疗或预防特定疾病或病况的另外治疗剂适于所治疗的疾病或病况。
如相关领域所认可的，当共施用多种治疗剂时，可以相应地调整剂量。
第六方面提供了一种治疗表现有针对壳斗目植物蛋白质、壳斗目植物相关过敏原、桦树花粉或其提取物、或Bet v 1蛋白质的敏感性或过敏反应的患者，或治疗与针对壳斗目植物蛋白质、壳斗目植物相关过敏原、桦树花粉或其提取物、或Bet v 1蛋白质的敏感性或过敏反应相关的至少一种症状或并发症的方法，该方法包括向有需要的患者施用有效量的一种或多种结合至天然Bet v 1、垂枝桦BPE、河桦BPE或杨叶桦BPE的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，或包括有效量的一种或多种结合至天然Bet v 1、垂枝桦BPE、河桦BPE或杨叶桦BPE的分离的人单克隆抗体或其片段的药物组合物，其中在施用一种或多种所述结合至天然Bet v 1、垂枝桦BPE、河桦BPE或杨叶桦BPE的分离的人单克隆抗体或其片段之后，或在施用包括了前述抗体中的任一种或多种的组合物之后，所述针对壳斗目植物蛋白质、壳斗目植物相关过敏原、桦树花粉或其提取物、或Bet v 1蛋白质的敏感性或过敏反应得到预防，或其严重程度降低和/或持续时间减少，或与所述针对壳斗目植物蛋白质、壳斗目植物相关过敏原、桦树花粉或其提取物、或Bet v 1蛋白质的敏感性或过敏反应相关的至少一种症状或并发症得到预防或改善，或所述针对壳斗目植物蛋白质、壳斗目植物相关蛋白质、桦树花粉或其提取物、或Bet v 1蛋白质的敏感性或过敏反应的频率降低和/或持续时间减少、或严重程度降低。
在一些实施方式中，桦树花粉提取物选自下组：天然Bet v 1、垂枝桦BPE、河桦BPE及杨叶桦BPE。
在一些实施方式中，所述治疗使得患者暴露于在壳斗目植物蛋白质、壳斗目植物相关过敏原、桦树花粉或其提取物、或Bet v 1蛋白质之后引起的过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、过敏性哮喘或全身性过敏反应(anaphylactic response)减轻。
在一些实施方式中，所述方法还包括施用有效量的可用于减轻针对壳斗目植物蛋白质、壳斗目植物相关过敏原、桦树花粉或其提取物、或Bet v 1蛋白质的过敏反应的第二治疗剂。第二治疗剂可选自下组：皮质类固醇、支气管扩张剂、抗组胺剂、肾上腺素、解充血剂、另一种不同的抗Bet v 1抗体及肽疫苗。
在一些实施方式中，所述方法还包括刚好用所述抗体或其片段、或包括了所述抗体的药物组合物治疗所述患者之后或同时，用过敏原特异性免疫疗法(SIT)方案治疗所述患者。
在一个实施方式中，本发明提供一种治疗表现有针对一种或多种壳斗目植物过敏原或壳斗目植物相关过敏原的敏感性或过敏反应的壳斗目植物过敏性患者，或治疗与针对一种或多种壳斗目植物过敏原或壳斗目植物相关过敏原的敏感性或过敏反应相关的至少一种症状或并发症的方法，该方法包括向有需要的患者施用有效量的一种或多种结合至Bet v 1的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，或包括了有效量的一种或多种结合至Bet v 1的分离的人单克隆抗体或其片段的药物组合物，其中在施用一种或多种所述结合Bet v 1的分离的人单克隆抗体或其片段之后，或在施用包含了前述抗体中的任一种或多种的组合物之后，所述针对壳斗目植物过敏原或壳斗目植物相关过敏原的敏感性或过敏反应得到预防，或其严重程度降低和/或持续时间减少，或与所述针对壳斗目植物过敏原或壳斗目植物相关过敏原的敏感性或过敏反应相关的至少一种症状或并发症得到预防或改善，或所述针对壳斗目植物过敏原或壳斗目植物相关过敏原的敏感性或过敏反应的频率降低和/或持续时间减少、或严重程度降低。
在一些实施方式中，所述一种或多种壳斗目植物过敏原选自下组：Bet v 1、Alng1、Cor a1、Car b1和Que a1。
在一个实施方式中，本发明提供了一种包括了一种或多种结合天然Bet v 1、垂枝桦BPE、河桦BPE及杨叶桦BPE的本文所描述的抗体的药物组合物，其用于治疗表现有针对壳斗目植物蛋白质、壳斗目植物相关过敏原、桦树花粉或其提取物、或Bet v 1蛋白质的敏感性或过敏反应的患者，或用于治疗与针对壳斗目植物蛋白质、壳斗目植物相关过敏原、桦树花粉或其提取物、或Bet v 1蛋白质的敏感性或过敏反应相关的至少一种症状或并发症，其中所述针对壳斗目植物蛋白质、壳斗目植物相关过敏原、桦树花粉或其提取物、或Bet v 1蛋白质的敏感性或过敏反应得到预防，或其严重程度降低和/或持续时间减少，或与所述针对壳斗目植物蛋白质、壳斗目植物相关过敏原、桦树花粉或其提取物、或Bet v 1蛋白质的敏感性或过敏反应相关的至少一种症状或并发症得到预防或改善，或所述针对壳斗目植物蛋白质、壳斗目植物相关过敏原、桦树花粉或其提取物、或Bet v 1蛋白质的敏感性或过敏反应的频率降低和/或持续时间减少、或严重程度降低。
在一个实施方式中，本发明提供包括了一种或多种本发明结合至Bet v 1的抗体的药物组合物在制备用于治疗表现有针对壳斗目植物蛋白质、壳斗目植物相关过敏原、桦树花粉或其提取物、或Bet v 1蛋白质的敏感性或过敏反应的患者，或治疗与针对壳斗目植物蛋白质、壳斗目植物相关过敏原、桦树花粉或其提取物、或Bet v 1蛋白质的敏感性或过敏反应相关的至少一种症状或并发症的药物种的用途，其中所述针对壳斗目植物蛋白质、壳斗目植物相关过敏原、桦树花粉或其提取物、或Bet v 1蛋白质的敏感性或过敏反应得到预防，或其严重程度降低和/或持续时间减少，或与所述针对壳斗目植物蛋白质、壳斗目植物相关过敏原、桦树花粉或其提取物、或Bet v 1蛋白质的敏感性或过敏反应相关的至少一种症状或并发症得到预防或改善，或所述针对壳斗目植物蛋白质、壳斗目植物相关过敏原、桦树花粉或其提取物、或Bet v 1蛋白质的敏感性或过敏反应的频率降低和/或持续时间减少、或严重程度降低。
在一个实施方式中，本发明提供了如上文所描述的药物组合物的用途，其中所述组合物是与可用于减轻针对壳斗目植物蛋白质、桦树花粉或其提取物、或Bet v 1蛋白质的过敏反应的第二治疗剂组合施用。在一个实施方式中，本发明提供如上文所描述的药物组合物的用途，其中所述第二治疗剂选自皮质类固醇、支气管扩张剂、抗组胺剂、肾上腺素、解充血剂、另一种不同的抗Bet v 1抗体及肽疫苗。
在某些实施方式中，本发明的结合至Bet v 1的抗体能够减轻、最大限度地减少或预防对桦树花粉或Bet v 1敏感的患者的至少一种症状，如打喷嚏、鼻腔充血、鼻塞、咳嗽、喘鸣、支气管收缩、鼻炎或结膜炎。
在一个实施方式中，本发明的结合至Bet v 1的抗体、或包括了一种或多种本发明的抗体的组合物可用于预防与Bet v 1过敏相关的甚至更严重的体内并发症，包括哮喘反应、过敏性休克，甚至是由全身性过敏反应引起的死亡。
在一个实施方式中，所述药物组合物与第二治疗剂组合施用给患者。
在另一个实施方式中，第二治疗剂选自下组：抗组胺剂、肾上腺素、解充血剂、皮质类固醇、另一种不同的抗Bet v 1抗体、肽疫苗以及可用于减轻过敏反应之严重程度或用于改善与过敏反应相关的至少一种症状的任何其他姑息性疗法。
在又一个实施方式中，所述药物组合物在一种或多种其他期望的治疗剂或医疗程序的同时、之前或之后进行施用，包括例如在过敏原特异性免疫疗法(SIT)方案之前或同时进行施用。在一些方面，将SIT方案与本文所提供的抗体一起使用来提供协同作用。
在一个实施方式中，提供了用于增强过敏原特异性免疫疗法(SIT)方案的功效和/或安全性的方法，所述方法包括在即将施用SIT方案之前或同时，向有需要的患者施用有效量的一种或多种如本文所提供的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，或包括了有效量的一种或多种分离的人单克隆抗体或其片段的药物组合物，其中针对SIT方案的过敏反应的严重程度减轻。在一些实施方式中，所述SIT方案包括递增剂量阶段，随后是维持阶段。在一些实施方式中，所述SIT方案是紧急SIT方案。
在另一个方面，提供了用于防止或减少与壳斗目植物蛋白质、壳斗目植物相关过敏原、桦树花粉或桦树花粉提取物、或Bet v 1致敏作用相关的肥大细胞脱粒的方法，所述方法包括向有需要的患者施用本文所描述的药物组合物。
在一些实施方式中，BPE选自下组：天然Bet v 1、垂枝桦BPE、河桦BPE及杨叶桦BPE。
通过阅读以下详细说明，其他实施方式将变得显而易见。
附图说明
图1提供了有关H4H16992P与Bet v 1相互作用的H/D交换/MS表位的定位。
图2提供了有关H4H17082P与Bet v 1相互作用的H/D交换/MS表位的定位。
图3提供了有关H4H17038P2与Bet v 1相互作用的H/D交换/MS表位的定位。
图4提供了有关H4H16987P与Bet v 1相互作用的H/D交换/MS表位的定位。
图5提供了有关H4H16992P、H4H17082P、H4H17038P2及H4H16987P与Bet v 1相互作用的H/D交换/MS表位的定位。
图6是用于确定抗体组合在人源化小鼠PCA模型中阻止由Bet v 1诱导的肥大细胞脱粒方面的有效性的方案的图。
图7描绘了抗Bet v 1抗体组合在人源化小鼠PCA模型中阻断利用获自三名Bet v1敏感供体的含IgE的血清引起肥大细胞脱粒的能力。
图8描绘了两个图，第一个图提供了展示抗Bet v 1抗体组合阻断从一名桦树过敏供体获得的PBMC中嗜碱性粒细胞活化的代表性数据。条形图提供的数据描绘了相对于各单独抗体，抗Bet v 1抗体组合阻断获自多名供体的PBMC中的嗜碱性粒细胞活化的阻断百分比。
发明内容详述
在描述本发明组合物和方法之前，应理解，本发明不限于所描述的特定组合物和方法以及实验条件，因为这些方法、组合物和条件可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述特定实施方式的目的，而不旨在为限制性的，因为本发明的范围仅由权利要求书限定。
除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所理解的相同的含义。如本文所使用的术语“约”，当用于所叙述的特定数字值时，意思指该值可与所述值有不超过1％的差异。例如，如本文所使用，表述“约100”包括99和101以及两者之间的所有值(例如99.1、99.2、99.3、99.4等)。
尽管可以在本发明的实践或测试中使用与本文所描述的方法和材料类似或等效的方法和材料，但本文描述的是优选的方法和材料。
定义
如本文所使用，术语“Bet v 1”是指至少一种呈天然/原生形式或以重组方式制造的Bet v 1蛋白质。Bet v 1蛋白质包含SEQ ID NO:306所示的氨基酸序列和SEQ ID NO:305所示的核酸序列。天然Bet v 1蛋白质约17kD，并且以这样的方式存在：7股反平行β-折叠(β1-β7)形式，两个短α-螺旋(α1和α2)连接β1和β2、一个长C末端α-螺旋(α3)，并在β2与β3之间存在富含甘氨酸的环基元(Kofler等人(2012)，《分子生物学杂志》422(1):109-123)。以重组方式制造的突变型Bet v 1，即SEQ ID NO:312，包含Uniprot P15494的G2-N160以及S85A的取代，并含有Myc-Myc-六聚组氨酸标签。来自Uniprot:P15494的Bet v 1氨基酸序列，即SEQ ID NO:314，也可以称为Bet v 1。
“Bet v 1”是包含SEQ ID NO:306或SEQ ID NO:314或其同源序列所示的氨基酸序列，或替代地由该氨基酸序列组成的多肽。如本文所使用，短语“SEQ ID NO:306或SEQ IDNO:314的同源序列”是指与SEQ ID NO:306或SEQ ID NO:314具有大于70％、优选地大于80％、更优选地大于90％并且甚至更优选地大于95％的同一性的多肽。
如本文所使用，术语“Bet v 1片段”是指包含Bet v 1的至少一个抗原位点或替代地由该至少一个抗原位点组成的多肽。在一个实施方式中，如本文所使用，术语“Bet v 1片段”是指包含Bet v 1的至少两个抗原位点或替代地由该至少两个抗原位点组成的多肽。在一个实施方式中，抗原位点是共价连接的。在一个实施方式中，抗原位点是通过至少一个肽键连接的。在一个实施方式中，两个抗原位点是通过至少一个肽键以及在所述抗原位点之间的间隔子连接的。在一个实施方式中，所述至少两个抗原位点包含了Uniprot P15494的氨基酸序列的23-44位和44-56位。在一个实施方式中，所述至少两个抗原位点包含了在SEQID NO:306、307、308、309、310、311及315中的任一个内的氨基酸序列。在一个实施方式中，所述Bet v 1片段中的任一个能够在体内诱导产生特异性结合至天然存在的Bet v 1或以重组方式产生的Bet v 1的抗体。
如本文所使用，术语“抗体”意思指包含至少一个特异性结合至特定抗原(例如Betv1)或与所述特定抗原相互作用的互补决定区(CDR)的任何抗原结合分子或分子复合物。如本文所使用，术语“抗体”意图指免疫球蛋白分子，其包含四条多肽链，即通过二硫键互连的两条重(H)链与两条轻(L)链(即“完全抗体分子”)；以及其多聚体(例如IgM)，或其抗原结合片段。每条重链包含重链可变区(“HCVR”或“VH”)和重链恒定区(包含结构域CH1、CH2和CH3)。每条轻链包含轻链可变区(“LCVR”或“VL”)和轻链恒定区(CL)。VH和VL区可以进一步细分成称为互补决定区(CDR)高变区，其穿插分布于被称为构架区(FR)的更为保守的区域。每个VH和VL都由从氨基末端至羧基末端按以下顺序布置的三个CDR和四个FR组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明的某些实施方式中，抗体(或其抗原结合片段)的FR可以与人类种系序列一致，或可以被天然地或人工地修饰。氨基酸共有序列可基于两个或更多个CDR的并行分析来限定。
一个或多个CDR残基的替换或一个或多个CDR的省略也是可能的。已有科学文献中描述了这样的抗体，其中省去一个或两个CDR仍可以达到结合目的。Padlan等人(1995,《美国实验生物学学会联合会杂志(FASEB J.)》9:133-139)基于已公开的晶体结构分析了抗体与其抗原之间的接触区，并由此得出结论——仅约五分之一至三分之一的CDR残基实际接触抗原。Padlan还发现在许多抗体中有一个或两个CDR中没有与抗原接触的氨基酸(另参见Vajdos等人,2002,《分子生物学杂志》320:415-428)。
可以基于先前的研究，通过分子建模和/或经验从位于Chothia CDR外侧的KabatCDR区域鉴定不接触抗原的CDR残基(例如CDRH2中的残基H60-H65通常是不需要的)。如果一个CDR或其残基被省略，则它通常被在另一人抗体序列或此类序列的共有序列中占据相应位置的氨基酸所替换。还可根据经验选择CDR中替换的的位置和替换的氨基酸。经验性替换可以是保守或非保守性取代。
本文所公开的特异性结合至Bet v 1的全人单克隆抗体相较于相应种系序列可在重链和轻链可变结构域的框架区和/或CDR区中包含一个或多个氨基酸替换、插入和/或缺失。通过将本文所公开的氨基酸序列与从例如公共抗体序列数据库得到的种系序列相进行比较，可以容易地确定这些突变。本发明包括来源于本文所公开的任一氨基酸序列的抗体和其抗原结合片段，其中一个或多个框架区和/或CDR区内的一个或多个氨基酸突变成该抗体所来源的种系序列中的相应残基，或突变成另一人种系序列中的相应残基，或突变成相应种系残基的保守氨基酸替换(此类序列变化在本文中统称为“种系突变”)。本领域的普通技术人员从本文所公开的重链和轻链可变区序列开始，可以容易地产生许多包含一个或多个单种系突变或其组合的抗体和抗原结合片段。在某些实施方式中，VH和/或VL结构域内的所有框架和/或CDR残基回复突变成在所述抗体来源的原始种系序列中存在的残基。在其他实施方式中，只有某些残基回复突变成原始种系序列，例如仅在FR1的前8个氨基酸内或在FR4的后8个氨基酸内发现的突变残基，或仅在CDR1、CDR2或CDR3内发现的突变残基。在其他实施方式中，一个或多个框架和/或CDR残基突变成不同种系序列(即与最初得到所述抗体的种系序列不同的生殖系序列)中的相应残基。
此外，本发明的抗体可以包含在框架区和/或CDR区内的两个或更多个种系突变的任意组合，例如其中某些单个的残基突变成特定种系序列中的相应的残基，而不同于原始种系序列的某些其他残基以保持不变或突变成不同种系序列中的相应残基。一旦得到含有一个或多个种系突变的抗体和抗原结合片段后，就可以容易地测试所述抗体和抗原结合片段的一种或多种所期望的性质，如改善的结合特异性、提高的结合亲和力、改善或增强的拮抗或激动生物学性质(视具体情况而定)、降低的免疫原性等。以这种通用方式获得的抗体和抗原结合片段涵盖在本发明内。
本发明还包括全人单克隆抗体，其包含了具有一个或多个保守性替换的本文所公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一个的变体。例如，本发明包括的抗体具有相对于本文所公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一个的有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等保守氨基酸替换的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列。
如本文所使用，术语“人抗体”意图包括非天然存在的人抗体。该术语包括在非人类哺乳动物中或在非人类哺乳动物的细胞中以重组方式产生的抗体。该术语不旨在包括从人类受试者中分离或在人类受试者体内产生的抗体。
在一些实施方式中，本发明的抗体可以是重组和/或非天然存在的人抗体。如本文所使用，术语“重组人抗体”意图包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，如使用转染至宿主细胞(在下文进一步描述)中的重组表达载体表达的抗体、从重组、组合人抗体文库(在下文进一步描述)中分离的抗体、从人免疫球蛋白基因转基因动物(例如小鼠)中分离的抗体(参见例如Taylor等人(1992)，《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》20:6287-6295)，或通过包含将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。在某些实施方式中，这类重组人抗体经历体外诱变(或当使用人Ig序列转基因动物时，经历体内体细胞诱变)，因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是与人种系VH和VL序列相关的，但可能在体内并非天然存在于人抗体种系谱系内的序列。
人抗体可以呈与铰链异质性有关的两种形式存在。在一种形式中，免疫球蛋白分子包含约150-160kDa的稳定四链构建体，其中二聚体通过链间重链二硫键保持在一起。在另一种形式中，二聚体不是通过链间二硫键连接，并且约75-80kDa的分子是由共价偶合的轻链和重链构成(半抗体)。这些形式极难分离，即使是在亲和纯化之后也是如此。
在各种完整IgG同型中另一种形式(second form)的频繁出现，是由于但不限于与抗体的铰链区同型有关的结构差异引起。人IgG4铰链的铰链区中的单个氨基酸替换可以使所述另一种形式的出现明显减少(Angal等人,1993,《分子免疫学(MolecularImmunology)》30:105)至使用人IgG1铰链时通常观察到的水平。本发明涵盖了在铰链区、CH2区或CH3区中具有一个或多个突变的抗体，所述突变可能是提高所期待的抗体形式的产率(例如在制造过程中)所期待的。
如本文所使用，表述“抗原结合分子”意指包含至少一个互补决定区(CDR)或由其组成的蛋白质、多肽或分子复合物，所述CDR单独地或与一个或多个另外的CDR和/或框架区(FR)组合地特异性结合至特定抗原。在某些实施方式中，抗原结合分子是抗体或抗体的片段，这些术语如本文其他地方所定义。
术语“特异性结合”或“特异性结合至”等意指抗体或其抗原结合片段与抗原形成在生理条件下相对较稳定的复合物。特异性结合可以通过至少约1×10-6M或更低的平衡解离常数表征(例如较小的KD表示更紧密的结合)。用于确定两个分子是否特异性结合的方法是本领域众所周知的，并且包括例如平衡透析、表面等离子体共振等。如本文所描述，已通过表面等离子体共振(例如BIACORETM)鉴定了特异性结合至Bet v 1的抗体。
短语“高亲和力”抗体是指如通过表面等离子体共振(例如BIACORETM)或溶液亲和力ELISA所测量，与Bet v 1的结合亲和力以KD表示是至少10-8M；优选地是10-9M；更优选地是10-10M，甚至更优选地是10-11M，甚至更优选地是10-12M的单克隆抗体。
术语“低解离速率”、“Koff”或“kd”意指如通过表面等离子体共振(例如BIACORETM)所测定，抗体以1×10-3s-1或更低、优选地以1×10-4s-1或更低的速率常数与Bet v 1解离。
如本文所使用，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括特异性结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、可酶促获得、合成或经过基因工程改造的多肽或糖蛋白。如本文所使用，术语抗体的“抗原结合部分”或“抗体片段”是指保留结合至Betv 1的能力的抗体的一个或多个片段。
本发明的具体实施方式，抗体或抗体片段可以与治疗性部分(如皮质类固醇、另一种抗Bet v 1抗体或肾上腺素、疫苗或任何其他可用于治疗针对Bet v 1的过敏反应的治疗性部分)缀合(“免疫缀合物”)。
本发明的抗体可以是分离的抗体。如本文所使用，“分离的抗体”意指从天然环境的至少一种组分中鉴别和分离和/或回收的抗体。例如，出于本发明的目的，从生物体的至少一种组分，或从天然存在或天然产生抗体的组织或细胞中分离或移出的抗体是“分离的抗体”。分离的抗体还包括在重组细胞内原位产生的抗体。分离的抗体是经历至少一个纯化或分离步骤的抗体。根据某些实施方式，分离的抗体可以基本上不含其他细胞物质和/或化学试剂。
根据某些实施方式，分离的抗体可以基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体(Ab)(例如特异性结合Bet v 1的分离的抗体或其片段基本上不含特异性结合除壳斗目植物抗原外的抗原或在一些方面除Bet v 1外的抗原的Ab)。
如本文所使用，“阻断抗体”或“中和抗体”(或“中和Bet v 1活性的抗体”)意指与Bet v 1的结合会引起至少一种Bet v 1生物活性抑制的抗体或其抗原结合部分。例如，本发明的抗体可以帮助预防针对Bet v 1的原发性过敏反应。或者，本发明的抗体可以表现有预防针对Bet v 1的继发性过敏反应、或针对Bet v 1的过敏反应的至少一症状(包括由Betv 1引起的打喷嚏、咳嗽、哮喘病况或全身性过敏反应)的能力。可通过用若干标准的体外或体内分析法(如本文中所描述的被动皮肤全身性过敏反应分析法)或本领域中已知的其他体内分析法(例如用于观察在施用一种或多种本文所描述的抗体之后对Bet v 1激发的防护作用的其他动物模型)中的一种或多种来测量一种或多种Bet v 1生物活性的指示物而评估针对Bet v 1生物活性的抑制作用。
如本文所使用，“表面等离子体共振”是指一种光学现象，其允许通过例如使用BIACORETM系统(瑞典乌普萨拉(Uppsala,Sweden)和新泽西州皮斯卡塔威(Piscataway,N.J.)的Pharmacia Biosensor AB)检测生物传感器基质内蛋白质浓度的变化来分析实时生物分子相互作用。
如本文使用，术语“KD”意指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
术语“表位”是指与抗体分子可变区中的特定抗原结合位点(称为互补位)相互作用的抗原决定簇。单个抗原可以具有一个以上的表位。因此，不同抗体可以结合至抗原上的不同区域，并且可以具有不同的生物效应。术语“表位”还指抗原上的引发B细胞和/或T细胞应答的位点。它还指抗体所结合的抗原的区域。表位可以是线性的或具有空间构象的。线性表位是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。构象表位是通过空间并置来自线性多肽链不同区段的氨基酸而产生的表位。在某些实施方式中，表位可以包括作为分子的化学活性表面基团的决定簇，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方式中，表位可具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。表位也可以定义为结构性或功能性表位。功能性表位一般是结构性表位的子集并且具有直接贡献了相互作用的亲和力的那些残基。由连续氨基酸形成的表位在暴露于变性溶剂时通常被保留，而由三级折叠形成的表位在用变性溶剂处理时通常丢失。表位通常包括至少3个且更经常至少5个或8-10个氨基酸，呈独特的空间构象。
当涉及核酸或其片段时，术语“基本同一性”或“基本上一致”是指当通过适当核苷酸插入或缺失而与另一核酸(或其互补链)最佳地比对时，核苷酸碱基存在至少约90％并且更优选地至少约95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸序列同一性，所述同一性通过任何公知的序列同一性的算法(如FASTA、BLAST或GAP)测量。在某些情况下，与参照核酸分子具有基本同一性的核酸分子可以编码与参照核酸分子所编码的多肽具有相同或基本上类似的氨基酸序列的多肽。
当应用于多肽时，术语“基本相似性”或“基本上类似”意指当使用默认空位权重，如通过程序GAP或BESTFIT进行最佳地比对时，两肽序列共有至少90％的序列同一性，甚至更优选地至少95％、98％或99％的序列同一性。优选地，不相同的残基位置是因保守氨基酸替换而不同。“保守氨基酸替换”是指氨基酸残基被侧链(R基团)具有类似化学特性(例如电荷或疏水性)的另一氨基酸残基替换的氨基酸替换。一般来说，保守氨基酸替换基本上不会改变蛋白质的功能特性。在两个或更多个氨基酸序列因保守性替换而彼此不同的情况下，可以上调相似性百分比或程度以校正替换的保守性。做出这一调整的手段是本领域的技术人员众所周知的。(参见例如Pearson,1994,《分子生物学方法(Methods Mol.Biol.》24:307-331)。侧链具有类似化学特性的氨基酸组的实例包括1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；以及7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸替换组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守替换是在Gonnet等人(1992,《科学(Science)》256:1443-45)中所公开的PAM250对数似然矩阵(log-likelihoodmatrix)中具有正值的任何变化。“适度保守”替换是在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。
通常使用序列分析软件测量多肽的序列相似性。蛋白质分析软件使用了指定给包括保守氨基酸替换在内的各种替换、缺失和其他修饰的相似性量度来匹配相似序列。例如，GCG软件含有可以使用默认参数的程序如GAP和BESTFIT，以测定密切相关的多肽之间(如来自不同生物物种的同源多肽之间或野生型蛋白质与其突变蛋白质之间)的序列同源性或序列同一性。参见例如6.1版GCG。还可以使用FASTA，利用默认或推荐的参数比较多肽序列；6.1.FASTA版GCG的程序(例如FASTA2和FASTA3)提供了查询序列与搜索序列之间最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比(Pearson,2000,同上)。当比较本发明序列与含有来自不同生物的大量序列的数据库时，另一优选的算法是使用默认参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。(参见例如Altschul等人,1990,《分子生物学杂志》215:403-410以及1997《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》25:3389-3402)。
短语“治疗有效量”意指产生施用其所期望达成的作用的量。确切的量将取决于治疗目的，并且可由本领域的技术人员使用已知技术来确定(参见例如Lloyd(1999)《药物混配的艺术、科学和技术(The Art,Science and Technology of PharmaceuticalCompounding)》)。
本发明的抗体可用于使壳斗目植物过敏性个体“脱敏”。术语“脱敏”在本文中定义为减少壳斗目植物过敏性个体暴露于壳斗目植物过敏原(如桦树花粉，例如Bet v 1、Alng1、Cor a1、Car b1、Que a1、Api g2、Api g1、Dau c1、Mal d1、Ost c1、Fag s1和/或Cas s1)的过敏反应(减少至低于否则壳斗目植物过敏性个体将经历的水平的水平)，或暴露于壳斗目植物相关过敏原的过敏反应。术语“脱敏”在本文中还定义为减少个体针对PR-10蛋白质的过敏反应，所述PR-10蛋白质包括Act c 8和Act d 8(奇异果)、Ara h 8(花生)、Pru ar 1(杏)、Pru av 1(樱桃)、Pru p 1(桃)、Pyr c 1(梨)、Gly m 4(大豆)、Vig r 1(绿豆)、SolaI 4(番茄)、Cuc m 3(瓜)、Rub i 1(覆盆子)及Fra a 1(草莓)。
一般描述
属于壳斗目的树是春季过敏症状的来源，并且主要的桦树过敏原Bet v 1在超过95％的桦树花粉过敏性患者中引起IgE结合(Breiteneder,《欧洲分子生物学杂志》1989,8(7):1935-8)。桦树是美国23％的过敏患者和欧洲14％的过敏患者的主要致敏物。(DataMonitor关于过敏性鼻炎的报告，2010年7月)。对桦树花粉表现有敏感性的个体的症状的严重程度范围从相对较轻的鼻炎和结膜炎到可能危及生命的哮喘病况。据显示，对桦树花粉过敏患者中超过60％具有针对Bet v 1的IgE抗体(Jarolim等人,《国际变态反应学与应用免疫学文集》1989,88(1-2):180-2)。
壳斗目树木显示了独特的地理分布，其中桦树和桤木是欧洲和北美的北方地区特有的，而榛树、角树和橡树则偏好温暖的气候，由此实际上生活于这些大陆的南方地区。全部五个物种的共同群体常常见于温带气候区5。(Spieksma FTM.,Regional Europeanpollen calendars.D′Amato G,Spieksma FTM,Bonini S编,Allergenic pollen andpollinosis in Europe.Hoboken,NJ:Wiley Blackwell；1991.第49-65页)包括桤木、榛树和角树在内的若干桦木科树木有可能在敏感个体中引发针对Bet v 1样过敏原的敏感，由此产生高交叉反应性IgE抗体。(Hauser等人,2011,《临床与实验变态反应(Clin ExpAllergy.)》41:1804-14)
本文所定义的壳斗目植物过敏原或壳斗目植物过敏原包括桦树花粉(Bet v 1)、桤木花粉(Aln g1和Aln g4)、榛树花粉(Cor a1、Cor a2、Cor a8、Cor a9、Cor a10、Cora11、Cor a12、Cor a13及Cor a14)、角树花粉(Car b1)、霍布叶铁木(hop-hornbeam)花粉(Ost c1)、栗树花粉(Cas s1、Cas s5、Cas s8及Cas s9)、山毛榉花粉(Fag s1)及白橡树花粉(Que a1和Que a2)。在非桦树花粉中，Aln g1、Cor a1、Car b1、Ost c1、Cas s1、Fag s1及Que a1与Bet v 1即壳斗目植物相关过敏原类似或相关。这些过敏原也在壳斗目树木的坚果以及属于蔷薇目的不相关树木的果实中表达。这些过敏原的交叉反应性可促使花粉过敏患者的食物过敏症状。示例性的交叉反应性食物过敏包括苹果、樱桃、杏、梨、苜蓿、豌豆、大豆、番茄、芹菜、胡萝卜及芦笋。(《过敏原和过敏原免疫疗法：皮下、舌下和口服(Allergensand Immunotherapy:Subcutaneous,Sublingual,and Oral)》,第5版,Richard F.Lockey,Dennis K.Ledford编,CRC Press,Taylor&Francis Group,纽约州伦敦(London,NY),2014,第114、118-119页)。
如本文所使用，短语“壳斗目植物过敏原”包括壳斗目植物相关过敏原。在一些实施方式中，“壳斗目植物相关过敏原”定义为与Bet v 1具有至少约35％总体序列同源性、或与Bet v 1的表位1具有至少约50％序列同源性、或与Bet v 1的表位2具有至少约40％序列同源性、或与Bet v 1的表位3具有至少约25％序列同源性、或与Bet v 1的表位4具有至少约15％序列同源性的蛋白质。在一些实施方式中，“壳斗目植物相关过敏原”定义为与抗Betv 1抗体发生交叉反应的蛋白质，包括来自蔷薇目的过敏原。
免疫球蛋白E(IgE)会引起1型超敏反应，其表现为过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、花粉热、过敏性哮喘、蜂毒过敏及食物过敏。IgE在血液中循环，并结合至嗜碱粒细胞和肥大细胞上的针对IgE的高亲和力Fc受体。在大多数过敏反应中，过敏原通过吸入、摄入或通过皮肤进入身体。接着，过敏原与已结合至肥大细胞和嗜碱粒细胞表面上的高亲和力受体的预先形成的IgE结合，使得若干IgE分子交联并触发组胺和其他炎性介质的释放，由此引起各种过敏症状。
桦树花粉过敏的治疗包括脱敏疗法，该疗法涉及重复注射递增剂量的粗桦树花粉提取物或来源于Bet v 1的短肽。过敏原特异性免疫疗法的不足包括较长的治疗持续时间，这导致患者顺应性问题，以及导致针对注射的蛋白质的常见过敏反应(高达30％)。在认为脱敏疗法有效之前，可能要花费若干年。成功治疗取决于提取物的组成和质量，并且在重度哮喘/食物过敏患者中，由于存在IgE介导的严重不良事件风险而禁忌该疗法。因此，桦树花粉过敏治疗领域中需要针对治疗对壳斗目植物过敏原(特别是Bet v 1)敏感的患者的替代策略。
抗体已被提议作为过敏的通用治疗策略，因为抗体能够阻止致敏分子进入粘膜组织中，或可以在过敏原有机会与结合至肥大细胞或嗜碱粒细胞上的高亲和力受体的IgE结合之前，结合该过敏原，由此防止组胺和其他炎性介质从这些细胞释放。美国专利号5,670,626描述了使用单克隆抗体，通过阻断过敏原与粘膜组织的结合来治疗IgE介导的过敏性疾病，如过敏性鼻炎、过敏性哮喘和过敏性结膜炎。美国专利号6,849,259描述了使用过敏原特异性抗体来抑制小鼠过敏模型体内的过敏性炎症。基于牛奶和基于蛋的抗体系统也有描述。例如，US20030003133A1公开了使用牛奶作为过敏原的载体来诱导针对桦树花粉和其他过敏原的口服耐受性。WO1994/024164A2中描述了通过使用抑制过敏原结合至肥大细胞的能力的分子来减少动物对环境中过敏原的过敏反应的组合物和方法。在U.S.2010/0034812中也提到了其他抗Bet v 1抗体。
本文所描述的全人抗体展示了与Bet v 1的特异性结合，并且可用于治疗遭受桦树花粉过敏的患者，特别是对Bet v 1过敏原表现有敏感性的患者。使用此类抗体可以是治疗遭受壳斗目树木花粉过敏的患者的有效手段，或这些抗体可用于防止在二次暴露时针对Bet v 1的反应加强，或预防与过敏相关的伴随症状，或可用于降低/减少与初次暴露于桦树花粉过敏原或在二次暴露时症状复发相关的过敏反应的严重程度和/或持续时间。这些抗体可单独使用，或作为辅助疗法与本领域中已知用于治疗此类过敏的其他治疗部分或方式(例如但不限于皮质类固醇或肾上腺素治疗)一起使用。它们可与第二种或第三种不同的Bet v 1特异性抗体结合使用。它们可与过敏原特异性免疫疗法(SIT)一起使用。在一些实施方式中，与SIT组合的结果是协同起效的。
与脱敏疗法不同，用本文所描述的抗体治疗可以在开始治疗的约2周内、或在开始治疗的约10天或约8天内实现有效缓解。结合暴露于Bet v 1蛋白质或肽、或一种或多种另外的壳斗目植物过敏原，用本文所描述的全人抗体治疗不仅可以阻断过敏反应，而且还能更有效地或协同地使遭受壳斗目树木花粉过敏的患者脱敏。
在某些实施方式中，本发明的抗体是从免疫接种第一免疫原(如天然Bet v 1)的小鼠获得，所述免疫原可以是商购的(例如购自弗吉尼亚州(VA)的IndoorBiotechnologies，#NA-BV1-1)，或可以通过重组方式制备。Bet v 1的全长氨基酸序列如SEQ ID NO:306所示。全长Bet v 1氨基酸序列还可见于来自Uniprot:P15494的SEQ ID NO:314。
所述免疫原可以是天然、原生或以重组方式制备的Bet v 1的生物活性和/或免疫原性片段，或是编码其活性片段的DNA。所述片段可以来源于Bet v 1的N末端或C末端，或来源于Bet v 1氨基酸序列内的任何位点。
抗体的抗原结合片段
除非另外具体指示，否则如本文所使用，术语“抗体”应理解为涵盖了包含两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链的抗体分子(即“完全抗体分子”)以及其抗原结合片段。如本文所使用，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括特异性结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、以酶促可获得的、合成或经过基因工程改造的多肽或糖蛋白。如本文所使用，术语抗体的“抗原结合部分”或“抗体片段”是指抗体的保留了特异性结合至Bet v 1的能力的一个或多个片段。抗体片段可以包括Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、dAb片段、含有CDR的片段或分离的CDR。抗体的抗原结合片段可使用任何适合的标准技术(例如蛋白质水解消化或涉及操纵和表达编码抗体可变域和(任选地)恒定域的DNA的重组基因工程技术)从例如完整抗体分子中得到。此类DNA是已知的和/或易于从例如商业来源、DNA文库(包括例如噬菌体-抗体文库)得到，或可合成得到。可以通过化学方式或通过使用分子生物学技术对DNA进行测序和操作，从而例如将一个或多个可变和/或恒定结构域排列成适合的构型，或引入密码子，产生半胱氨酸残基，修饰、添加或缺失氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；及(vii)由模拟抗体高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元(例如分离的互补决定区(CDR)，如CDR3肽)或受约束的FR3-CDR3-FR4肽。其他工程改造的分子，如结构域特异性抗体、单域抗体、域缺失的抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、双功能抗体、三抗体、四抗体、微抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块免疫药物(small modular immunopharmaceuticals，SMIP)及鲨鱼可变IgNAR结构域也涵盖在如本文所使用的表述“抗原结合片段”内。
抗体的抗原结合片段通常包含至少一个可变结构域。所述可变结构域可具有任何尺寸的或氨基酸组成，并且一般包含至少一个邻近一个或多个框架序列或与一个或多个框架序列同框的CDR。在具有VH结构域与VL结构域缔合的抗原结合片段中，VH结构域和VL结构域可以以任何适合的排列彼此相对定位。例如，可变区可以是二聚体并且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。或者，抗体的抗原结合片段可含有单体VH或VL结构域。
在某些实施方式中，抗体的抗原结合片段可含有与至少一个恒定结构域共价连接的至少一个可变结构域。可以在本发明抗体的抗原结合片段内存在的可变结构域和恒定结构域的非限制性、示例性构型包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；以及(xiv)VL-CL。在可变结构域和恒定结构域的任何构型(包括上文所列的示例性构型)中，可变结构域和恒定结构域可以彼此直接连接，或可通过完整的或部分的铰链区或连接子区连接。铰链区可以由至少2个(例如5、10、15、20、40、60个或更多个)氨基酸组成，其在单一多肽分子中的邻近可变结构域和/或恒定结构域之间产生柔性或半柔性连接。此外，本发明抗体的抗原结合片段可以包含彼此非共价缔合和/或与一个或多个单体VH或VL域非共价缔合(例如通过二硫键缔合)的以上所列的任何可变结构域和恒定结构域构型的同二聚体或异二聚体(或其他多聚体)。
人抗体的制备
在转基因小鼠中产生人抗体的方法是本领域中已知的。任何此类已知方法都可用于本发明中以制备特异性结合至Bet v 1的人抗体。
使用VELOCIMMUNETM技术(参见例如US 6,596,541，Regeneron Pharmaceuticals，
Figure BDA0002378941660000291
)或用于产生单克隆抗体的任何其他已知方法，先分离出具有人可变区和小鼠恒定区的高亲和力抗Bet v 1嵌合抗体。
Figure BDA0002378941660000292
技术涉及转基因小鼠的产生，所述转基因小鼠具有含可操作地连接至内源性小鼠恒定区基因座的人重链和轻链可变区的基因组，使得所述小鼠应答抗原刺激而产生包含人可变区和小鼠恒定区的抗体。分离出编码抗体重链和轻链可变区的DNA，并将其可操作地连接至编码人重链和轻链恒定区的DNA。接着，在能够表达全人抗体的细胞中表达所述DNA。
一般来说，用目标抗原激发
Figure BDA0002378941660000293
小鼠，并从表达抗体的小鼠中回收淋巴细胞(如B细胞)。淋巴细胞可与骨髓瘤细胞系融合以制备无限增殖的杂交瘤细胞系，并且对这些杂交瘤细胞系进行筛选和选择，以鉴别出产生对目标抗原具有特异性的抗体的杂交瘤细胞系。可将编码重链和轻链可变区的DNA分离，并连接至所期望的同种型的重链和轻链恒定区。可在细胞，如CHO细胞中产生此类抗体蛋白。或者，可直接从抗原特异性淋巴细胞中分离出编码抗原特异性嵌合抗体或轻链和重链可变结构域的DNA。
首先，分离出具有人可变区和小鼠恒定区的高亲和力嵌合抗体。如以下实验部分中所述，界定抗体的特征并针对所期望的特征(包括亲和力、选择性、表位等)来进行选择。小鼠恒定区被期望的人恒定区置换以产生本发明的全人抗体，例如野生型或修饰的IgG1或IgG4。虽然选择的恒定区可根据具体用途而变化，但是高亲和力抗原结合和目标特异性特征仍存在于可变区中。
一般来说，本发明的抗体具有极高亲和力，当通过结合至固定于固相上或处于溶液相中的抗原来测量时，通常具有约10-12至约10-9M的KD。用所期望的人恒定区置换小鼠恒定区以产生本发明的全人抗体。虽然选择的恒定区可根据具体用途而变化，但是高亲和力抗原结合和目标特异性特征仍存在于可变区中。
生物等效物
本发明的抗Bet v 1抗体和抗体片段涵盖了具有这样的氨基酸序列的蛋白质：所述氨基酸序列不同于所述抗体的氨基酸序列，但仍保留了结合Bet v 1的能力。当与亲本序列相比较时，这些变体抗体和抗体片段包含一个或多个氨基酸添加、缺失或替换，但显示出与所述抗体的生物活性基本上等效的生物活性。同样，本发明的编码抗体的DNA序列涵盖了这样的序列：当与所公开的序列相比较时包含一个或多个核苷酸添加、缺失或替换，但其编码的抗体或抗体片段与本发明的抗体或抗体片段基本上是生物等效。
如果例如两种抗原结合蛋白质或抗体是药物等效物或药物替代物，如当在类似实验条件下以单次剂量或多次剂量施用相同摩尔剂量时，它们的吸收速率和程度未显示显著差异，则将其视为生物等效的。如果一些抗体的吸收程度相同但吸收速率不同，则认为这些抗体是等效物或药物替代物，且由于这种吸收速率的差异是有意产生的并以标记反映，对于在例如长期使用中达到有效的身体药物浓度无影响并且被视为对于所研究的特定药品是医学不显著的，则仍可以将其视为生物等效的。
在一个实施方式中，如果两种抗原结合蛋白质的安全性、纯度和效力无临床上有意义的差异，则这两种抗原结合蛋白质是生物等效的。
在一个实施方式中，如果患者可以在参照产品与生物产品之间转换一次或多次且与无此类转换的持续疗法相比，没有预计的不良作用风险增加(包括临床上显著的免疫原性变化)或有效性降低，则两种抗原结合蛋白质是生物等效的。
在一个实施方式中，如果两种抗原结合蛋白质在使用条件方面均通过共同的作用机理来起作用(在已知的这样的机理范围内)，则这两种抗原结合蛋白质是生物等效的。
生物等效性可以通过体内和体外方法证明。生物等效性测量包括例如(a)在人体或其他哺乳动物中进行的体内测试，其中随时间测量在血液、血浆、血清或其他生物流体中所述抗体或其代谢物的浓度；(b)与人体内生物利用率数据相关，并可合理地预测这些数据的体外测试；(c)在人体或其他哺乳动物中进行的体内测试，其中随时间测量抗体(或其靶点)的适当急性药理学作用；以及(d)确定抗体的安全性、功效或生物利用率或生物等效性的具有良好控制的临床试验。
可以通过例如对残基或序列进行各种替换，或缺失生物活性不需要的末端或内部的残基或序列来构建本发明抗体的生物等效变体。例如，可以缺失或用其他氨基酸替换对于生物活性不重要的半胱氨酸残基，以防止在复性时形成不必要或不正确的分子内二硫桥。在其他情况下，生物等效抗体可以包括含氨基酸变化的抗体变体，这些变化改变抗体的糖基化特征，例如消除或去除糖基化的突变。
抗体的生物特征
一般来说，本发明的抗体可以通过结合至Bet v 1、Bet v 1的片段、或Bet v 1和一种或多种壳斗目植物过敏原或壳斗目植物相关过敏原起作用。
在某些实施方式中，本发明的抗体可以结合至位于Bet v 1蛋白质内的表位或片段，例如包含SEQ ID NO:306的约23位至约43位范围内的氨基酸残基的表位或片段；包含SEQ ID NO:306的约44位至约56位范围内的氨基酸残基的表位或片段；包含SEQ ID NO:306的约2位至约19位范围内的氨基酸残基的表位或片段；包含SEQ ID NO:306的约57位至约70位范围内的氨基酸残基的表位或片段；或包含SEQ ID NO:306的约81位至约89位或约81位至约96位范围内的氨基酸残基的表位或片段。在某些实施方式中，本发明的抗体可以结合到至少一个选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:307、308、309、310、311及315，其中表位序列可以在C末端或N末端延伸1至5个氨基酸、或约5至约10个氨基酸。
在某些实施方式中，本发明的抗体可以通过阻断或抑制对Bet v 1过敏原敏感的患者中IgE与肥大细胞或嗜碱粒细胞的结合来起作用。在某些实施方式中，当与同型对照抗体相比较时，本文提供的抗体抑制或阻断嗜碱性粒细胞活化例如至少约70％。在某些实施方式中，当与同型对照抗体相比较时，所述抗体抑制或阻止肥大细胞脱粒例如至少约70％、或至少约75％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％。
在一个实施方式中，本发明提供一种结合至Bet v 1的全人单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段展现以下特征中的一种或多种：(i)包含HCVR，其具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、282及290、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列；(ii)包含LCVR，其具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266及298、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列；(iii)包含具有选自下组的氨基酸序列的HCDR3结构域：SEQ ID NO:8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、288及296、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列，以及具有选自以组的氨基酸序列的LCDR3结构域：SEQ ID NO:16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272及304、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列；(iv)包含具有选自下组的氨基酸序列的HCDR1结构域：SEQ ID NO:4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、284及292、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列；具有选自下组的氨基酸序列的HCDR2结构域：SEQ ID NO:6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、286及294、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列；具有选自下组的氨基酸序列的LCDR1结构域：SEQ ID NO:12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268及300、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列；以及具有选自下组的氨基酸序列的LCDR2结构域：SEQ ID NO:14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270及302、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列；(v)以等于或小于10-8或在约10-8至约10-11范围内的KD结合至Bet v 1；(vi)在至少一种全身性过敏反应或炎症动物模型中表现有功效；或(vii)与参照抗体竞争结合至Bet v 1。
在一个实施方式中，本发明提供了两种或更多种本发明的全人抗体或其片段的组合用于制备组合物的用途，其中所述抗体结合至Bet v 1，并且其中所述组合物内所包含的各抗体或其片段展现以下特征中的一种或多种：(i)包含HCVR，其具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、282及290、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列；(ii)包含LCVR，其具有选自以下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266及298、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列；(iii)包含具有选自下组的氨基酸序列的HCDR3结构域：SEQ ID NO:8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、288及296、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列；及具有选自下组的氨基酸序列的LCDR3结构域：SEQ ID NO:16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272及304、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列；(iv)包含具有选自下组的氨基酸序列的HCDR1结构域：SEQ ID NO:4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、284及292、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列；具有选自下组的氨基酸序列的HCDR2结构域：SEQ ID NO:6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、286及294、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列；具有选自下组的氨基酸序列的LCDR1结构域：SEQ ID NO:12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268及300、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列；以及具有选自下组的氨基酸序列的LCDR2结构域：SEQ ID NO:14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270及302、或其其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似的序列；(v)以等于或小于10-8或在约10-8至约10-11范围内的KD结合至Bet v 1；(vi)在至少一种全身性过敏反应或炎症动物模型中表现有功效；或(vii)与参照抗体竞争结合至Bet v 1。
如通过体外或体内测定所确定，本发明的某些Bet v 1抗体在单独或组合使用时能够结合至Bet v 1并中和其至少一种生物作用。如本文所描述，本发明的抗体结合至Betv 1并中和其活性的能力可以使用本领域的技术人员已知的任何标准方法进行测量，包括结合测定或活性中和(例如防止全身性过敏反应)测定。
用于测量结合活性的非限制性、示例性的体外测定示于本文实施例3中。在实施例3中，通过表面等离子体共振确定人抗Bet v 1抗体的结合亲和力和动力学常数。
Bet v 1蛋白质或肽可以被修饰成包括某些残基的添加或替换以进行标记或达到与载体分子如KLH缀合的目的。例如，可以在肽的N末端或C末端处添加半胱氨酸，或可添加连接子序列以制备供与例如KLH缀合的肽来进行免疫接种。对Bet v 1具有特异性的抗体可不含另外的标记或部分，或这些抗体可含有N末端或C末端标记或部分。在一个实施方式中，所述标记或部分是生物素。在结合测定中，标记(如果存在的话)的位置可以确定肽相对于该肽所结合的表面的取向。例如，如果用抗生物素蛋白涂布表面，则含N末端生物素的肽的取向将使得该肽的C末端部分远离所述表面。
表位定位和相关技术
如本文所使用，术语“表位”是指与抗体分子可变区中的特定抗原结合位点(互补位)相互作用的抗原决定簇。单个抗原可以具有一个以上的表位。因此，不同抗体可以结合至抗原上的不同区域并且可以具有不同的生物作用。表位可以是构象表位或线性表位。构象表位是通过空间并置来自线性多肽链不同区段的氨基酸产生的。线性表位是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。在某些情况中，表位可以包括抗原上的糖、磷酰基或磺酰基部分。
本文提供了抗Bet v 1抗体，所述抗体与Bet v 1分子内的，包括例如SEQ ID NO:306所示的Bet v 1的任何片段内，或以重组方式制备的Bet v 1蛋白质的类似区域内发现的一个或多个氨基酸相互作用。抗体所结合的表位可以由位于Bet v 1分子内的3个或更多个(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个)氨基酸构成的单一连续序列组成。示例性的连续序列包括在SEQ ID NO:306的约23位至约44位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约23位至约43位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约23位至约38位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约23位至约41位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约26位至约43位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约29位至约43位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约44位至约70位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约44位至约56位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约45位至约56位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约2位至约19位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约5位至约10位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约5位至约19位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约8位至约19位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约11位至约19位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约57位至约70位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约57位至约66位范围内的氨基酸残基；在SEQID NO:306的约81位至约96位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约84位至约96位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约85位至约96位范围内的氨基酸残基；以及在SEQID NO:306的约81位至约89位范围内的氨基酸残基。其他示例性的连续序列包括至少一个选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:307、308、309、310、311及315，其中此类序列可以在C末端或N末端延伸约1至约5个氨基酸、或约5至约10个氨基酸。或者，所述表位可以由位于Betv 1分子内的多个不连续氨基酸(或氨基酸序列)组成(例如构象表位)。
本领域的普通技术人员已知的各种技术都可以用于确定抗体是否“与多肽或蛋白质内的一个或多个氨基酸相互作用”。示例性的技术包括例如常规交叉阻断测定，如Harlow和Lane的《抗体(Antibodies)》(Cold Spring Harbor Press,纽约州冷泉港(Cold SpringHarb.,NY))中所描述的。其他方法包括丙氨酸扫描突变分析、肽印迹分析(Reineke(2004)《分子生物学方法(Methods Mol Biol)》248:443-63)、肽裂解分析、结晶研究及NMR分析。此外，还可以采用如抗原的表位切除、表位提取和化学修饰等方法(Tomer(2000),《蛋白质科学(Protein Science)》9:487-496)。可以用于鉴别多肽内与抗体相互作用的氨基酸的另一方法是由质谱法检测的氢/氘交换。一般来说，氢/氘交换法包括以氘标记所关注的蛋白质，随后使抗体结合至氘标记的蛋白质。接下来，将蛋白质/抗体复合物转移至水中，并且抗体复合物所保护的氨基酸内的可交换质子经历氘-氢逆交换的速率比不作为界面一部分的氨基酸内的可交换质子要慢。因此，形成蛋白质/抗体界面的一部分的氨基酸可以保留氘，并因此相较于不包括在界面中的氨基酸，展现出相对较高的质量。在抗体解离之后，对靶蛋白进行蛋白酶裂解和质谱分析，由此揭露出氘标记的残基，这些残基对应于与抗体相互作用的特定氨基酸。参见例如Ehring(1999)《分析生物化学(Analytical Biochemistry)》267(2):252-259；Engen和Smith(2001)《分析化学(Anal.Chem.)》73:256A-265A。抗原/抗体复合物的X射线晶体学也可以用于表位定位目的。
修饰辅助分型(Modification-Assisted Profiling，MAP)，又称为基于抗原结构的抗体图谱分析(Antigen Structure-based Antibody Profiling，ASAP)，是根据各抗体与以化学或以酶促修饰的抗原表面的结合特征的相似性，对针对同一抗原的大量单克隆抗体(单克隆抗体)分类的一种方法(US 2004/0101920)。每一类别可以反映与另一类别所表示的表位明显不同或部分地重叠的特有表位。这一技术允许快速过滤在遗传上一致的抗体，由此使得表征可以集中于遗传上不同的抗体。当应用于杂交瘤筛选时，MAP可有助于鉴别产生具有所期望特征的单克隆抗体的稀少杂交瘤克隆。可用MAP将本发明的抗体分选为结合不同表位的抗体组。
在某些实施方式中，抗Bet v 1抗体或其抗原结合片段结合Bet v 1内的表位或其片段，所述Bet v 1呈天然或原生形式，例如SEQ ID NO:306或SEQ ID NO:314所示(来自Uniprot:P15494的Bet v 1氨基酸序列)，或以重组方式制备。在某些实施方式中，如表1中所示，本发明的抗体与至少一个选自下组的氨基酸序列相互作用：在SEQ ID NO:306的约23位至约44位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约23位至约43位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约23位至约38位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约23位至约41位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约26位至约43位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约29位至约43位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约44位至约70位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约44位至约56位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约45位至约56位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约2位至约19位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约5位至约10位范围内的氨基酸残基；在SEQID NO:306的约5位至约19位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约8位至约19位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约11位至约19位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约57位至约70位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约57位至约66位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约81位至约96位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约84位至约96位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约85位至约96位范围内的氨基酸残基；以及在SEQ ID NO:306的约81位至约89位范围内的氨基酸残基。这些区域进一步以例如SEQ ID NO:307、308、309、310、311及315所示。
本发明还包括与本文在表1中所描述的特定示例性抗体中的任一种、或具有表1中所述示例性抗体中任一种的CDR序列的抗体结合至同一表位或所述表位的一部分的抗Betv1抗体。同样，本发明还包括与本文在表1中所描述的特定示例性抗体中的任一种、或具有表1中所述示例性抗体中任一种的CDR序列的抗体竞争结合至Bet v 1或Bet v 1片段的抗Bet v 1抗体。
通过使用本领域中已知的常规方法可以容易地确定抗体是否与参照抗Bet v 1抗体结合至同一表位，或是否与参照抗Bet v 1抗体竞争结合。例如，为了确定测试抗体是否与本发明的参照抗Bet v 1抗体结合至同一表位，使参照抗体在饱和条件下结合至Bet v 1蛋白质或肽。接下来，评估测试抗体结合至Bet v 1分子的能力。如果在用参照抗Bet v 1抗体饱和结合之后，测试抗体仍能够结合至Bet v 1，则可以得出测试抗体与参照抗Bet v 1抗体结合至不同的表位的结论。另一方面，如果在用参照抗Bet v 1抗体饱和结合之后，测试抗体不能结合至Bet v 1分子，则测试抗体可以结合至与本发明的参照抗Bet v 1抗体所结合的表位相同的表位。
为了确定抗体是否与参照抗Bet v 1抗体竞争结合，以两个方向执行上文所描述的结合方法：在第一种方向中，使参照抗体在饱和条件下结合至Bet v 1分子，随后评估测试抗体与Bet v 1分子的结合。在第二种方向中，使测试抗体在饱和条件下结合至Bet v 1分子，随后评估参照抗体与Bet v 1分子的结合。如果在两种方向中，仅第一种(饱和)抗体能够结合至Bet v 1分子，则可得出测试抗体与参照抗体竞争结合至Bet v 1的结论。本领域的普通技术人员应了解，与参照抗体竞争结合的抗体可能未必与参照抗体结合至同一表位，但可以通过结合重叠或相邻的表位，空间阻断参照抗体的结合。
如果两种抗体各自竞争性抑制(阻断)另一抗体抗原的结合，则这两种抗体结合至相同或重叠的表位。也就是说，如在竞争性结合分析中所测量，1、5、10、20或100倍过量的抗体使另一抗体的结合抑制至少50％，但优选地75％、90％或甚至99％(参见例如Junghans等人,《癌症研究(Cancer Res.)》1990 50:1495-1502)。或者，如果抗原中减少或消除一种抗体结合的所有氨基酸突变，基本上也减少或消除另一种抗体的结合，则这两种抗体具有相同表位。如果减少或消除一种抗体结合的氨基酸突变，其一些也减少或消除另一种抗体的结合，则这两种抗体具有重叠表位。
接着，可以进行另外的常规实验(例如肽突变和结合分析)以确定所观察到的测试抗体结合的缺乏是否实际上是由与参照抗体结合至同一表位引起，或空间阻断(或另一现象)是否引起所观察到的结合的缺乏。此类实验可以使用ELISA、RIA、表面等离子体共振、流式细胞术或本领域中可利用的任何其他定量或定性抗体结合分析进行。
免疫缀合物
本发明涵盖了人抗Bet v 1单克隆抗体与治疗性部分的缀合物(“免疫缀合物”)，所述治疗性部分例如是这样的药剂：能够减轻针对Bet v 1过敏原或在存在壳斗目树木的环境中的过敏反应的严重程度，或改善与暴露于桦树花粉或Bet v 1过敏原相关的至少一种症状，包括鼻炎、结膜炎或呼吸困难或其严重程度。此类药剂可以是皮质类固醇、另一种不同的抗Bet v 1抗体或疫苗。可与Bet v 1抗体缀合的治疗性部分的类型将考虑待治疗的病况以及期望实现的治疗作用。或者，如果所期望的治疗作用是治疗与暴露于Bet v 1过敏原相关的后遗症或症状、或由此类暴露引起的任何和其他病况，如但不限于鼻炎或结膜炎，则缀合适于治疗所述病况的后遗症或症状、或缓解本发明抗体的任何副作用的药剂可能有利的。适于形成免疫缀合物的药剂的实例是本领域中已知的，参见例如WO05/103081。
治疗性施用和制剂
本发明提供了包含本发明的抗Bet v 1抗体或其抗原结合片段的治疗性组合物。本发明的治疗性组合物的施用将通过适合途径施用，包括但不限于静脉内、皮下、肌肉内、鼻内施用，其中利用适合的载体、赋形剂以及并入制剂中以提供改善的转移、递送、耐受性等的其他试剂。众多的适当制剂可见于所有医药化学家已知的处方集中：《雷氏药学大全(Remington's Pharmaceutical Sciences)》,宾夕法尼亚州伊斯顿(Easton,PA)的MackPublishing Company。这些配制物包括例如散剂、糊剂、软膏、凝胶剂、蜡、油、脂质、含囊泡(阳离子或阴离子脂质)的脂质(如LIPOFECTINTM)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳液、卡波蜡乳剂(carbowax)(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶及含有卡波蜡的半固体混合物。还参见Powell等人，“用于肠胃外配制物的赋形剂的概要(Compendium ofexcipients for parenteral formulations)”，PDA(1998)，《药物科学与技术杂志(JPharm Sci Technol)》52:238-311。
抗体的剂量可以依据患者的年龄和体格、目标疾病、状况、施用途径等而变化。当使用本发明的抗体治疗对Bet v 1敏感的个体的与暴露于壳斗目树木的花粉、或桦树花粉、或Bet v 1相关的鼻炎或结膜炎，或预防对壳斗目植物的全身性过敏反应，或减轻过敏反应的严重程度时，有利地，通常以每公斤体重约0.01至约30mg、更优选地每公斤体重约0.02mg至约7mg、约0.03mg至约5mg、或约0.05mg至约3mg的单次剂量静脉内施用本发明的抗体。取决于病况的严重程度，可以调整治疗的频率和持续时间。在某些实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以按至少约0.1mg至约800mg、约1至约500mg、约5至约300mg、约10至约200mg、至约100mg或至约50mg的初始剂量施用。在某些实施方式中，初始剂量之后可以施用所述抗体或其抗原结合片段的第二次或多次后续剂量，其量可以大致等于或小于初始剂量，其中所述后续剂量间隔至少1天至3天；至少一周；至少2周；至少3周；至少4周；至少5周；至少6周；至少7周；至少8周；至少9周；至少10周；至少12周；或至少14周。
各种递送系统是已知的并且都可以用于施用本发明的药物组合物，例如以脂质体包封、微米粒子、微胶囊、能够表达突变病毒的重组细胞、受体介导的内吞作用(参见例如Wu等人,1987,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》262:4429-4432)。引入方法包括但不限于皮内、透皮、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外及口服途径。所述组合物可以通过任何便利的途径，例如通过输注或快速注射、通过经上皮或粘膜皮肤内层(例如口腔粘膜、直肠和肠道粘膜等)吸收施用，并且可以与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身或局部的。
所述药物组合物也可以通过囊泡，特别是脂质体递送(参见例如Langer,1990,《科学》249:1527-1533)。
在某些情形下，药物组合物可以通过控制释放系统递送。在一个实施方式中，可使用泵。在另一个实施方式中，可以使用聚合材料。在又另一个实施方式中，可以将控制释放系统放入组合物的目标附近，由此仅需要一部分全身剂量。
可注射制剂可以包括用于静脉内、皮下、皮內和肌肉内注射、滴液输注等的剂型。这些可注射制剂可以通过众所周知的方法制备。例如，可注射制剂可例如通过在常用于注射的无菌水性介质或油性介质中溶解、悬浮或乳化上述抗体或其盐来制备。作为注射用水性介质，存在例如生理盐水、含有葡萄糖和其他助剂的等渗溶液等，这些可以与适当增溶剂如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子型表面活性剂[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(聚氧乙烯(50mol)与氢化蓖麻油的加合物)]等组合使用。作为油性介质，采用了例如芝麻油、大豆油等，它们可以与增溶剂如苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等组合使用。由此制备的注射剂优选地填充于适当安瓿中。
本发明的药物组合物可用标准针和注射器皮下或静脉内递送。此外，对于皮下递送，笔式递送装置易用于递送本发明的药物组合物。这种笔式递送装置可重复使用或是一次性的。可重复使用的笔式递送装置一般利用含药物组合物的可更换药筒。一旦药筒内的所有药物组合物都被施用并且药筒变空时，可以容易地丢弃空药筒并更换为含药物组合物的新药筒。所述笔式递送装置随后可再使用。在一次性笔式传递装置中，没有可更换的药筒。实际上，一次性笔式递送装置在装置内的储集器中预填充有药物组合物。一旦排空储集器中的药物组合物，就丢弃整个装置。
多种可重复使用的笔式和自动注射器递送装置可用于皮下递送本发明的药物组合物。实例包括但不限于AUTOPENTM(英国伍德斯托克(Woodstock,UK)的Owen Mumford,Inc.)、DISETRONICTM笔(瑞士布格多夫(Burghdorf,Switzerland)的Disetronic MedicalSystems)、HUMALOG MIX 75/25TM笔、HUMALOGTM笔、HUMALIN 70/30TM笔(印第安纳州印第安纳波利斯(Indianapolis,IN)的Eli Lilly and Co.)、NOVOPENTMI、II和III(丹麦哥本哈根(Copenhagen,Denmark)的Novo Nordisk)、NOVOPEN JUNIORTM(丹麦哥本哈根的NovoNordisk)、BDTM笔(新泽西州富兰克林湖(Franklin Lakes,NJ)的Becton Dickinson)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM及OPTICLIKTM(德国法兰克福(Frankfurt,Germany)的sanofi-aventis)等。可用于皮下递送本发明的药物组合物的一次性笔式递送装置的实例包括但不限于SOLOSTARTM笔(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)和KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLICKTM自动注射器(加利福尼亚州千橡树市(Thousand Oaks,CA)的Amgen)、PENLETTM(德国斯图加特(Stuttgart,Germany)的Haselmeier)、EPIPEN(Dey,L.P.)以及HUMIRATM笔(伊利诺伊州阿博特帕克(Abbott Park IL)的Abbott Labs)等。
有利地，将供上述口服或肠胃外使用的药物组合物制备成呈适合于符合活性成分剂量的单位剂量的剂型。这类呈单位剂量的剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊、注射液(安瓿)、栓剂等。所包含的前述抗体的量一般是单位剂量中每种剂型约5至约500mg；尤其是对于注射液形式，优选所包含的前述抗体是约5至约100mg，并且对于其他剂型优选是约10至约250mg。
抗体的治疗用途
由于可与Bet v 1相互作用，本发明的抗体可用于治疗在个体暴露于壳斗目植物过敏原、桦树花粉或含有Bet v 1蛋白质的环境之后的原发反应，或与过敏反应相关的至少一种症状，如眼睛发痒、结膜炎、鼻炎、喘鸣、呼吸困难；或用于预防针对Bet v 1过敏原的继发反应，包括更严重的全身性过敏反应；或用于再暴露于壳斗目植物过敏原之后、降低症状的严重程度、减少持续时间和/或降低频率。因此，设想本发明的抗体可以用于预防或治疗目的。
在本发明的又另一个实施方式中，本发明抗体被用于制备治疗遭受对桦树花粉或其提取物和/或Bet v 1蛋白质敏感的患者的药物组合物。在本发明的又另一个实施方式中，本发明的抗体被用于制备降低初次暴露于Bet v 1的严重程度、或降低针对Bet v 1的过敏性反应的严重程度、持续时间和/或减少其次数的药物组合物。在本发明的另一个实施方式中，使用本发明的抗体作为可用于治疗壳斗目植物过敏原的任何其他药剂的辅助疗法，所述药剂包括皮质类固醇、疫苗、过敏原特异性免疫疗法(SIT)或本领域的技术人员已知的任何其他姑息性疗法。
组合疗法
组合疗法可以包括本发明的抗Bet v 1抗体以及可以有利地与本发明的抗体或与本发明抗体的生物活性片段组合的任何其他治疗剂。
例如，可以使用第二治疗剂来帮助减轻在暴露于壳斗目植物过敏原、桦树花粉或其提取物、或Bet v 1，或暴露于存在壳斗目树木和开花的环境之后的过敏性症状，如皮质类固醇。所述抗体还可与其他疗法，如对Bet v 1过敏原具有特异性的疫苗结合使用。所述其他治疗活性组分可以在施用本发明的抗Bet v 1抗体之前、同时或之后施用。出于本公开的目的，此类施用方案被视为抗Bet v 1抗体与第二治疗活性组分“组合”施用。
过敏原特异性免疫疗法(SIT)
如本文所使用，表述“过敏原特异性免疫疗法”、“特异性免疫疗法”、“SIT”、“SIT方案”等是指随时间向患者重复施用过敏原作为治疗或预防过敏和过敏性反应、或减少或消除过敏性反应的手段。在典型SIT方案中，先向过敏性患者施用少量过敏原，随后施用增加量的过敏原。在某些情况下，SIT方案包含至少两个连续阶段：(1)递增剂量阶段，和(2)维持阶段。在递增剂量阶段中，施用递增剂量的过敏原，直至获得有效且安全的剂量。随后，在整个维持阶段过程中向患者施用在递增剂量阶段结束时确定的剂量。递增剂量阶段的持续时间可以是若干周或若干个月。然而，在某些实施方式中，递增剂量阶段具有基本上较短的持续时间(例如少于一周、少于6天、少于5天、少于4天、少于3天或少于2天)。包含少于5天的递增剂量阶段的SIT方案有时称为“紧急”免疫疗法或“紧急SIT”。SIT方案的维持阶段可以持续若干周、若干个月、若干年或是无限期的。
施用方案
根据本发明的某些实施方式，可在指定时程内向患者施用多次剂量的一种或多种抗Bet v 1抗体(抗体组合)。根据本发明这一方面，该方法包含向患者依序施用多次剂量的抗体、抗体组合。如本文所使用，“依序施用”意思指在不同时间点(例如在间隔预定时间间隔(例如数小时、数天、数周或数月)的不同日子)向患者施用每剂抗体或抗体组合。本发明包括的方法包含向患者依序施用单初始剂量的抗体或抗体组合，随后施用一次或多次第二剂量的抗体，任选地随后施用一次或多次第三剂量的抗体。
术语“初始剂量”、“第二剂量”和“第三剂量”针对施用本文提供的抗体或抗体组合的时间顺序。因此，“初始剂量”是在治疗方案开始时施用的剂量(又称“基线剂量”)；“第二剂量”是在初始剂量之后施用的剂量；并且“第三剂量”是在第二剂量之后施用的剂量。初始剂量、第二剂量和第三剂量都可以含有相同量的抗体或抗体组合，但施用频率一般可能彼此不同。然而，在某些实施方式中，初始剂量、第二剂量和/或第三剂量中所包含的抗体或抗体组合的量在治疗过程期间彼此不同(例如适当时上调或下调)。在某些实施方式中，在治疗方案开始时施用两次或更多次(例如2、3、4或5次)剂量作为“负荷剂量”(loadingdoses)，随后以较小频率施用后续剂量(例如“维持剂量”(maintance doses))。
在本发明的一个例示性实施方式中，在紧接着前次剂量之后1至26(例如1、11/2、2、21/2、3、31/2、4、41/2、5、51/2、6、61/2、7、71/2、8、81/2、9、91/2、10、101/2、11、111/2、12、121/2、13、131/2、14、141/2、15、151/2、16、161/2、17、171/2、18、181/2、19、191/2、20、201/2、21、211/2、22、221/2、23、231/2、24、241/2、25、251/2、26、261/2或更长)周施用各第二剂量和/或第三剂量。如本文所使用，短语“紧接着前次剂量”意思指在多次施用序列中，在施用所述序列中紧接着的下次剂量之前施用给患者的抗体或抗体组合的剂量，且无中间剂量。
根据本发明这一方面的方法，可包含向患者施用多种第二和/或第三剂量的抗体或抗体组合。例如，在某些实施方式中，仅向患者施用单次第二剂量。在其他实施方式中，向患者施用两次或更多次(例如2、3、4、5、6、7、8或更多次)第二剂量。同样，在某些实施方式中，仅向患者施用单次第三剂量。在其他实施方式中，向患者施用两次或更多次(例如2、3、4、5、6、7、8或更多次)第三剂量。
在涉及多次第二剂量的实施方式中，每次第二剂量可以按与其他第二剂量相同的频率施用。例如，在紧接着前次剂量之后的1至2周，可向患者施用每次的第二剂量。类似地，在涉及多次第三剂量的实施方式中，每次第三剂量可以按与其他第三剂量相同的频率施用。例如，在紧接着前次剂量之后的2至4周，可向患者施用每次的第三剂量。或者，向患者施用第二和/或第三剂量的频率在治疗方案的过程内可以变化。医师在临床检查后，可以在治疗过程期间根据个别患者的需要来调整施用频率。
抗体的诊断用途
本发明的抗Bet v 1抗体还可用于检测和/或测量样品中的Bet v 1，例如用于诊断目的。设想可以通过使用本发明抗体中的任一种或多种测量任一Bet v 1的存在来确定被认为由Bet v 1引起的过敏反应。关于Bet v 1的示例性诊断测定可包含例如使获自患者的样品与本发明的抗Bet v 1抗体接触，其中所述抗Bet v 1抗体标记有可检测标记或报告分子或被用作捕捉配体以从患者样品中选择性分离出Bet v 1蛋白质。或者，未标记的抗Bet v 1抗体可以与本身作为可检测标记的二次抗体组合用于诊断应用中。可检测标记或报告分子可以是放射性同位素，如3H、14C、32P、35S或125I；荧光或化学发光部分，如异硫氰酸荧光素或罗丹明(rhodamine)；或酶，如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化酶或荧光素酶。可以用于检测或测量样品中的Bet v 1的具体示例性测定包括酶联结免疫吸附分析法(ELISA)、放射免疫分析(RIA)和荧光活化细胞分选(FACS)。
可以用于根据本发明的Bet v 1诊断分析中的样品包括在正常或病理条件下获自患者的含有可检测量的Bet v 1蛋白质或其片段的任何组织或流体样品。一般来说，将测量获自健康/非过敏性患者(例如未患有与Bet v 1的存在相关的敏感的患者)的特定样品中Bet v1的水平，以先建立Bet v 1的基线或标准水平。随后，可将这一基线Bet v 1水平与获自疑似对桦树花粉中的Bet v 1敏感或疑似患有与此类病况相关的症状的个体的样品中所测量的Bet v 1水平相比较。
尽管已参照多个实施方式具体地展示和描述本发明，但本领域的技术人员应理解，可在不脱离本发明的主旨和范围的情况下对本文所公开的各种实施方式的形式和细节作出修改，并且本文所公开的各种实施方式不打算用作对权利要求书范围的限制。
实施例
阐述以下实施例以便向本领域的普通技术人员提供有关如何制备并使用本发明方法和组合物的完整公开内容和描述，并且这些实施例不旨在限制本发明人认为是他们的发明的内容的范围。已经努力确保关于所用数字(例如量、温度等)的准确性，但应该考虑到仍存在一些实验误差和偏差。除非另外指明，否则份数是重量份，分子量是平均分子量，温度以摄氏度为单位，并且压力是或接近大气压。
实施例1：针对Bet v 1的人抗体的生成
可使用包含以下任一种的免疫原产生抗Bet v 1抗体。在某些实施例中，本发明的抗体是从免疫接种了第一免疫原、随后免疫接种了第二免疫原或天然蛋白质的免疫原性活性片段的小鼠中获得，所述第一免疫原例如是全长天然Bet v 1(nBet v 1)，它可以是商购的(例如购自北卡罗来纳州勒诺(Lenoir,NC)的Stallergenes Greer，#XP527D3A25)，或从桦树花粉分离(参见例如Buters等人(2012),《大气环境(Atomospheric Environment)》55:496-505)，或可以通过重组方式制备(关于Bet v 1的全长氨基酸序列，参见GenBank寄存编号P15494)，或所述第一免疫原是所述Bet v 1蛋白质的片段。可以使用本领域的技术人员已知的Bet v 1蛋白质的各部分制备各种构建体。这些构建体可单独使用或以各种组合使用，以在体内引起抗体反应。例如，可以使用重组Bet v 1构建体，如SEQ ID NO:307、308、309、310、311及315中举例说明的构建体或其片段作为免疫原。
在某些实施例中，本发明的抗体是从免疫接种了第一免疫原如天然Bet v 1的生物活性和/或免疫原性片段，或编码其活性片段的DNA的小鼠中获得。所述片段可以来源于Bet v1的N末端或C端部分。
在某些实施例中，本文所描述的研究中使用的重组Bet v 1蛋白质构建体还可以包括如下文所指示的C末端标签(myc-myc-六组氨酸标签)。在其他实施例中，重组Bet v 1蛋白质构建体包括Uniprot P15494的氨基酸G2至N160。在一些实施例中，所述构建体包含S85A取代。所述蛋白质是在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达。用于促进在CHO细胞中的表达的外源信号序列不包括在序列表中。
在某些实施例中，免疫原可以是Bet v 1片段或融合蛋白，其包含以下任一种或多种：i)Bet v 1的氨基酸残基23-43(参见Uniprot P15494和SEQ ID NO:307)；ii)Bet v 1的氨基酸残基44-56(参见Uniprot P15494和SEQ ID NO:308)；iii)Bet v 1的氨基酸残基2-19(参见Uniprot P15494和SEQ ID NO:309)；iv)Bet v 1的氨基酸残基57-70(参见UniprotP15494和SEQ ID NO:310)；v)Bet v 1的氨基酸残基81-89(参见Uniprot P15494和SEQ IDNO:311)和vi)Bet v 1的氨基酸残基81-96(参见Uniprot P15494以及和SEQ ID NO:315)。
在某些实施例中，可以使用上述区域的片段，或从本文所描述的区域的N末端或C末端或两者延伸超过所述区域约5至约20个氨基酸残基的肽来制备特异性结合至Bet v 1的抗体。在某些实施例中，可以使用上述区域或其片段的任何组合来制备Bet v 1特异性抗体。在某些实施例中，可以使用上述Bet v 1区域中的任一个或多个，或其片段来制备单特异性、双特异性或多特异性抗体。
将如上所述用作免疫原的全长蛋白质或其片段与刺激免疫反应的佐剂一起直接施用给
Figure BDA0002378941660000421
小鼠(该小鼠包含编码人免疫球蛋白重链和κ轻链可变区的DNA)。
如美国专利7,582,298中所描述，直接从抗原阳性B细胞(未与骨髓瘤细胞融合)中分离出抗Bet v 1抗体。使用这一方法，获得若干全人抗Bet v 1抗体(即，具有人可变域和人恒定域的抗体)；以此方式产生的示例性抗体命名如下：H4H16943P、H4H16946P、H4H16950P、H4H16960P、H4H16967P、H4H16971P、H4H16979P、H4H16987P、H4H16991P、H4H16992P、H4H17001P、H4H17015P、H4H17027P、H4H17028P、H4H17031P、H4H17033P、H4H17038P2、H4H17045P2、H4H17067P2及H4H17082P2。
根据本实施例的方法产生的示例性抗体的生物特性详细地描述于以下所示实施例中。
实施例2：重链和轻链氨基酸序列
表1a提供了所选的抗Bet v 1抗体的重链和轻链可变区及CDR的氨基酸序列标识符。表1b提供了所选的抗Bet v 1抗体的重链和轻链可变区及CDR的核酸序列标识符。
表1a：氨基酸序列标识符
Figure BDA0002378941660000422
表1b：核酸序列标识符
Figure BDA0002378941660000423
Figure BDA0002378941660000431
抗体在本文中通常根据以下命名法命名：Fc前缀(例如“H4H”、“H2M”等)，随后是数字标识符(例如“16943”、“17001”等，如表1中所示)，随后是“P”或“P2”后缀。本文使用的抗体名称中的H4H和H2H前缀指示抗体的特定的Fc区同种型。因此，根据这一命名法，抗体在本文中可称为例如“H4H16943P”等，如“H4H”表示抗体具有人IgG4Fc(如由抗体名称中的第一个‘H’所示，所有可变区都是全人可变区)。本领域的普通技术人员应了解，具有特定Fc同种型的抗体可以被转化成具有不同Fc同种型的抗体(例如具有人IgG1 Fc的抗体可以被转化成具有人IgG4的抗体等)，但在任何情况下，由表1中所示数字标识符指示的可变域(包括CDR)将保持不变，并且预期与抗原的结合特性也一致或基本上类似，而不论Fc域的性质如何。
表1c提供了所选的抗Bet v 1抗体的全长重链和轻链的氨基酸序列标识符。
表1c：重链和轻链氨基酸序列标识符
Figure BDA0002378941660000432
实施例3：通过表面等离子体共振测定抗体结合至Bet v 1
在Biacore 4000仪器上使用实时表面等离子体共振生物传感器(SPR-Biacore)测定天然Bet v 1与纯化的抗Bet v 1单克隆抗体的结合的平衡解离常数(KD)。所有结合研究都是在25℃和37℃下于10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA及0.05％v/v表面活性剂Tween-20，pH 7.4(HBS-ET)操作缓冲液中执行。Biacore CM5传感器表面先通过与单克隆小鼠抗人Fc抗体(GE,#BR-1008-39)胺偶合进行衍生化，随后捕捉抗Bet v 1单克隆抗体。先在HBS-ET操作缓冲液中制备不同浓度的天然Bet v 1(Indoor，目录号NA-BV1-1)或CHO制备的含有S85A突变且C末端具有myc-myc六组氨酸标签的重组Bet v 1(突变Bet v 1-MMH；SEQ IDNO:312)试剂(100nM-1.23nM；连续稀释3倍)，并将其以30μL/分钟流动速率注射于抗人Fc捕捉的抗Bet v 1单克隆抗体表面上，保持4分钟，同时在HBS-ET操作缓冲液中监测单克隆抗体结合的Bet v 1试剂的解离，保持10分钟。通过使用Scrubber 2.0c曲线拟合软件将实时结合传感图与1:1结合模型相拟合，测定缔合(ka)和解离(kd)速率常数。根据动力学速率常数计算结合解离平衡常数(KD)和解离半衰期(t1/2)：
Figure BDA0002378941660000441
且
Figure BDA0002378941660000442
在25℃和37℃下天然Bet v 1和突变Bet v 1-MMH与本发明的不同抗Bet v 1单克隆抗体的结合动力学参数显示于表2至表5中。
如表2中所示，在25℃下，本发明的所有抗Bet v 1单克隆抗体都以在0.66nM至13.5nM范围内的KD值结合至天然Bet v 1。如表3中所示，在37℃下，本发明的所有抗Bet v1单克隆抗体都以在1.59nM至27.9nM范围内的KD值结合至天然Bet v 1。在25℃和37℃下，同种型对照抗体未展示出与天然Bet v 1的任何明显结合。
在25℃和37℃下，20种本发明的抗Bet v 1单克隆抗体中有3种不结合至突变Betv 1-MMH。如表4中所示，在25℃下，20种抗Bet v 1单克隆抗体中有17种结合至突变Bet v1-MMH，其KD值在348pM至43.8nM范围内。如表5中所示，在37℃下，20种本发明的抗Bet v 1单克隆抗体中有17种结合至突变的Bet v 1-MMH，其KD值在655pM至106nM范围内。在25℃和37℃下，同种型对照抗体未展示出与突变Bet v 1-MMH的任何明显结合。
表2：在25℃下天然Bet v 1结合至Bet v 1单克隆抗体的结合动力学参数。
Figure BDA0002378941660000443
Figure BDA0002378941660000451
*NB指示在当前实验条件下未观察到结合。
表3：在37℃下天然Bet v 1结合至Bet v 1单克隆抗体的结合动力学参数。
Figure BDA0002378941660000452
*NB指示在当前实验条件下未观察到结合。
表4：在25℃下突变Bet v 1-MMH结合至Bet v 1单克隆抗体的结合动力学参数。
Figure BDA0002378941660000461
*NB指示在当前实验条件下未观察到结合。
表5：在37℃下突变的Bet v 1-MMH结合至Bet v 1单克隆抗体的结合动力学参数。
Figure BDA0002378941660000462
Figure BDA0002378941660000471
*NB指示在当前实验条件下未观察到结合。
实施例4：通过表面等离子体共振测定抗体结合至相关过敏原
在Biacore 4000仪器上使用实时表面等离子体共振生物传感器(SPR-Biacore)测定不同的相关过敏原与纯化的抗Bet v 1单克隆抗体的结合的平衡解离常数(KD)。所有结合研究都是在25℃下于10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA及0.05％v/v表面活性剂Tween-20，pH 7.4(HBS-ET)操作缓冲液中执行。Biacore CM5传感器表面先通过与单克隆小鼠抗人Fc抗体(GE,#BR-1008-39)胺偶合进行衍生化，以捕捉抗Bet v 1单克隆抗体。针对以下相关过敏原进行结合研究：桤木(Aln g 1，MyBiosource，目录号MBS1041484)、苹果(Mal d 1，MyBiosource，目录号MBS1224919)、胡萝卜(Dau c 1.2，MyBiosource，目录号MBS1212920)、芹菜(Api g 1，MyBiosource，目录号MBS1171376)、芹菜(Api g 2，MyBiosource，目录号MBS1047880)、欧洲角树(Car b 1同种型1A和1B，MyBiosource，目录号MBS1200018)、欧洲角树(Car b 1同种型2MyBiosource，目录号MBS1043940)、榛树(Cor A1，MyBiosource，目录号MBS5304600)及白色橡树(Que a 1，MyBiosource，目录号MBS1258822)。在HBS-ET操作缓冲液中制备不同浓度的相关过敏原(100nM-6.25nM；连续稀释4倍)，接着将其以30μL/分钟流动速率注射于抗人Fc捕捉的抗Bet v 1单克隆抗体表面上，保持3分钟，同时在HBS-ET作缓冲液中监测单克隆抗体结合的过敏原的解离，保持8分钟。通过使用Scrubber 2.0c曲线拟合软件将实时结合传感图与1:1结合模型相拟合，测定缔合(ka)和解离(kd)速率常数。根据动力学速率常数计算结合解离平衡常数(KD)和解离半衰期(t1/2)：
Figure BDA0002378941660000472
且
Figure BDA0002378941660000473
在25℃下相关过敏原与本发明的不同抗Bet v 1单克隆抗体的结合动力学参数显示于表6至表11中。
如表6中所示，在25℃下，20种本发明的抗Bet v 1抗体中有9种展示出与Aln g 1的可测量的结合，其KD值在1.03nM至175nM范围内。另外11种抗体在该测试条件下未展示出与Aln g 1的任何可测量的结合。
如表7中所示，在25℃下，20种本发明的抗Bet v 1抗体中有两种展示出与Mal d 1的可测量的结合，其KD值是29.8nM和494nM。另外18种抗体在该测试条件下未展示出与Mald 1的任何可测量的结合。
如表8中所示，在25℃下，本发明的抗Bet v 1抗体中有1种展示出与Api g 1的可测量的结合，其KD值是167nM。另外19种抗体在该测试条件下未展示出与Api g 1的任何可测量的结合。
如表9中所示，在25℃下，20种本发明的抗Bet v 1抗体中有8种展示出与Car b 1同工型1A和1B的可测量的结合，其KD值在1.2nM至380nM范围内。另外12种抗体在该测试条件下未展示出与Car b 1同工型1A和1B的任何可测量的结合。
如表10中所示，在25℃下，20种本发明的抗Bet v 1抗体中有14种展示出与Car b1同工型2的可测量的结合，其KD值在335pM至564nM范围内。另外6种抗体在该测试条件下未展示出与Car b 1同工型2的任何可测量的结合。
如表11中所示，在25℃下，本发明的抗Bet v 1抗体中有1种展示出与Cor A 1的可测量的结合，其KD值是396nM。另外19种抗体在该测试条件下未展示与Cor A 1的任何可测量的结合。
本发明的抗体在测试条件下都未展示与Dau c 1.2、Api g 2或Que a 1(数据未示出)的可测量的结合。同种型对照抗体未展示出与任何测试过敏原的任何可测量的结合。
表6：在25℃下桤木(Aln g1)结合至Bet v 1单克隆抗体的结合动力学参数。
Figure BDA0002378941660000481
Figure BDA0002378941660000491
*NB指示在当前实验条件下未观察到结合。
表7：在25℃下苹果(Mal d 1)结合至Bet v 1单克隆抗体的结合动力学参数。
Figure BDA0002378941660000492
*NB指示在当前实验条件下未观察到结合。
表8：在25℃下芹菜(Api g 1)结合至Bet v 1单克隆抗体的结合动力学参数。
Figure BDA0002378941660000493
Figure BDA0002378941660000501
*NB指示在当前实验条件下未观察到结合。
表9：在25℃下欧洲角树(Car b 1同种型1A和1B)结合至Bet v 1单克隆抗体的结合动力学参数。
Figure BDA0002378941660000502
*NB指示在当前实验条件下未观察到结合。
表10：在25℃下欧洲角树(Car b 1同种型2)结合至Bet v 1单克隆抗体的结合动力学参数。
Figure BDA0002378941660000511
*NB指示在当前实验条件下未观察到结合。
表11：在25℃下榛树(Cor A1)结合至Bet v 1单克隆抗体的结合动力学参数。
Figure BDA0002378941660000512
Figure BDA0002378941660000521
*NB指示在当前实验条件下未观察到结合。
实施例5：抗Bet v 1 IgG抗体阻断Bet v 1与过敏原特异性IgE的结合
使用ELISA测定单一的本发明抗Bet v 1抗体或本发明抗Bet v 1抗体的组合阻断Bet v1与板捕捉的来自过敏的人供体血浆/血清的IgE的结合的能力。测试单独或呈多克隆混合物形式的抗体。对于所述测定，在4℃下，用被制备成具有C末端小鼠Fc标签的人FcεR1α(IgE的高亲和力受体)细胞外域蛋白质(hFcεR1α-mFc；SEQ ID NO:313)涂布微量滴定板，过夜。随后，在室温(RT)下，用0.5％BSA(w/v)阻断该板1小时。稀释来自过敏供体的血浆，接着总IgE被捕捉于受体涂布的表面上。将恒定量0.1nM生物素标记的天然Bet v 1(IndoorBiotechnologies,#NA-BV1-1)与1μg/mL单一浓度的或从10μg/mL开始连续稀释的抗Bet v1抗体或1μg/mL的各抗体预混合，并在室温下培育1小时，以使Bet v 1-抗体相互作用达到平衡。随后，将抗体-Bet v 1混合物添加至IgE涂布的板上，保持1小时。随后，洗涤板并使用1:10,000稀释的抗生蛋白链菌素与辣根过氧化酶的缀合物(Thermo Scientific,#N200/QJ223091)来检测结合至板的天然Bet v 1的量，并且在室温下培育1小时。在上述ELISA方案的每个步骤之间用PB-T洗涤板。为了使比色反应显色，将TMB/H2O2底物(BD Pharmingen试剂A#51-2602KC+试剂B，#51-2607KC)添加至板中并在室温下培育20分钟。使用2N硫酸(H2SO4；VWR，BDH3500-1)以停止反应。随后，在分光光度计(Victor，Perkin Elmer)上，在450nm下测量吸光度。使用如下所述的各测定中所使用的最高抗体浓度来计算阻断百分比。
Figure BDA0002378941660000522
以单一抗体的形式使用所述ELISA测试20种抗Bet v 1抗体阻断Bet v 1与板捕捉的来自过敏的人供体血浆的IgE的结合能力。个别单克隆抗体能够部分地阻断IgE与Bet v1的结合达8.5-64％，由此表明IgE的多克隆性。如表12中所示，有7种抗体在10μg/mL的最高测试抗体浓度下显示出36-64％范围内的阻断。
在单点阻断测定中测试4种抗Bet v 1抗体，即H4H17082P2、H4H17038P2、H4H16987P及H4H16992P。H4H17082P2和H4H16992P的组合在十名IgE供体中的七名中展示出大于90％的阻断。如表13中所示，三种和四种单克隆抗体组合展示出类似的结果，并且相较于H4H17082P2与H4H16992P两种抗体的组合，其看起来没有增加任何额外的阻断效应。
随后，以单一单克隆抗体形式和以2种、3种和4种单克隆抗体的组合形式，在利用3名供体IgE样品进行的剂量反应阻断测定中测试四种单克隆抗体，即H4H17082P2、H4H17038P2、H4H16987P及H4H16992P。如表14中所示，结果显示，H4H17082P2与H4H16992P两种抗Bet v 1单克隆抗体的组合使Bet v 1与3名供体中过敏原特异性IgE的结合阻断超过90％且接近于基线。测试的3种和4种抗体的组合显示类似的阻断活性广度和效力。作为阳性对照，纯化的小鼠抗Bet v 1多克隆IgG展示>90％的阻断。
表12：抗Bet v 1抗体阻断Bet v 1与过敏原特异性IgE的结合
Figure BDA0002378941660000531
在这些测定中，以1:50稀释过敏供体的血浆。
表13：单一抗体和抗体组合阻断Bet v 1与过敏原特异性IgE的结合
Figure BDA0002378941660000532
Figure BDA0002378941660000541
在本测定中，将过敏供体的血浆归一化至1:20(6名供体)、1:10(3名供体)或1:9(1名供体)的Bet v 1特异性IgE效价，随后以1:50稀释。
表14：抗体组合阻断Bet v 1与过敏原特异性IgE的结合
Figure BDA0002378941660000542
Figure BDA0002378941660000551
实施例6：通过氢氘(H/D)交换进行抗Bet v 1抗体与Bet v 1的结合的表位定位
为了确定Bet v 1中与H4H16992P2、H4H17082P2、H4H17038P2及H4H16987P相互作用的氨基酸残基[(Uniprot P15494的氨基酸M1-N160]，进行利用质谱研究的H/D交换表位定位。关于H/D交换方法的大体说明阐述于例如Ehring(1999)《分析生物化学(AnalyticalBiochemistry)》267(2):252-259；以及Engen和Smith(2001)《分析化学(Anal.Chem.)》73:256A-265A中。
在一体式Waters HDX/MS平台上进行HDX-MS实验，所述HDX/MS平台由以下组成：用于氘标记的Leaptec HDX PAL系统、用于样品消化和装载的Waters Acquity M-Class(辅助溶剂管理器(Auxiliary solvent manager))、用于分析柱梯度的Waters Acquity M-Class(μBinary溶剂管理器)及用于胃蛋白酶肽质量测量的Synapt G2-Si质谱仪。
在pD 7.0(等效于pH 6.6)的于D2O中的10mM PBS缓冲液中制备标记溶液。对于氘标记，将3.8μL天然Bet v 1(Indoor Biotech，目录号NA-BV1-1，28pmol/μL)、与各抗体预混合的Bet v 1、或呈1:1摩尔比的全部4种抗Bet v 1抗体的混合物与56.2μL D2O标记溶液一起培育不同的时间(例如非氘化对照＝0秒，标记1分钟、5分钟、10分钟及20分钟)。通过将50μL样品转移至50μL预先冷却的含0.2M TCEP、6M氯化胍的100mM磷酸盐缓冲液pH 2.5(淬灭缓冲液)中来淬灭氘化，并在1.0℃培育混合样品2分钟。接着，将淬灭的样品注射至WatersHDX管理器中以进行在线胃蛋白酶/蛋白酶XIII消化。在0℃下，将消化的肽截留至ACQUITYUPLC BEH C18 1.7μm，2.1×5mm VanGuard前置柱上并洗脱至分析柱ACQUITY UPLC BEHC18 1.7μm，1.0×50mm上，以5％-40％B进行9分钟的梯度分离(流动相A：含0.1％甲酸的水，流动相B：含0.1％甲酸的乙腈)。质谱仪设置成37V锥孔电压、0.5秒扫描时间及50-1700Th的质量/电荷范围。
为鉴别来自Bet v 1的肽，通过Waters ProteinLynx Global Server(PLGS)软件处理来自非氘化样品的LC-MSE数据并搜索包括Bet v1和其随机化序列的数据库。将鉴别出的肽输入DynamX软件中并根据两个标准进行过滤：1)每个氨基酸的最小产物：0.3；和2)复制文件阈值：3。随后，DynamX软件基于滞留时间和多个时间点的高质量准确性(<10ppm)自动测定各肽的氘吸收，其中每个时间重复测定3次。
使用结合MSE数据采集的在线胃蛋白酶/蛋白酶XIII柱，在抗体不存在或存在下，可再现地鉴别来自Bet v 1的总计36种肽，其表示了91.2％的序列覆盖。当结合至H4H16992P2、H4H17082P2、H4H17038P2、H4H16987P及4种抗体的组合时，氘吸收明显减少的肽分别示于图1至4和5中。记录的肽质量对应于Bet v 1与一种或多种抗Bet v 1抗体的复合物的三个重复试样的质心MH+质量平均值。
如图1中所示，在H4H16992P的存在下，对应于氨基酸23-43(FILDGDNLFPKVAPQAISSVE，SEQ ID NO:307)的肽具有较慢的氘化速率。
如图2中所示，在H4H17082P的存在下，对应于氨基酸44-56(NIEGNGGPGTIKK，SEQID NO:308)的肽具有较慢的氘化速率。
如图3中所示，在H4H17038P2的存在下，对应于氨基酸2至19(GVFNYETETTSVIPAARL，SEQ ID NO:309)的肽具有较慢的氘化速率。
如图4中所示，在H4H16987P的存在下，对应于氨基酸57-70(ISFPEGFPFKYVKD，SEQID NO:310)和81-96(KYNYSVIEGGPIGDTL，SEQ ID NO:315)的肽具有较慢的氘化速率。
如图5中所示，在4种抗Bet v 1抗体的组合(H4H16992P、H4H17082P、H4H17038P2及H4H16987P)的存在下，对应于氨基酸23-43(FILDGDNLFPKVAPQAISSVE，SEQ ID NO:307)、氨基酸44-56(NIEGNGGPGTIKK，SEQ ID NO:308)、氨基酸2-19(GVFNYETETTSVIPAARL，SEQ IDNO:309)、氨基酸57-70(ISFPEGFPFKYVKD，SEQ ID NO:310)及81-96(KYNYSVIEGGPIGDTL，SEQID NO:315)的肽具有较慢的氘化速率。
此外，在H4H17082P、H4H17038P2和H4H16987P的存在下，还观察到对肽23-43的适当的保护，由此鉴别出这一区域可以表示针对这些单克隆抗体的次级表位。
实施例7：抗Bet v 1抗体在被动皮肤全身性过敏反应(PCA)体内模型中的作用
为了测定本发明的抗Bet v 1抗体阻止过敏原诱导的肥大细胞脱粒的功效，使用了被动皮肤全身性过敏反应(PCA)体内模型。这一模型涉及将过敏原特异性抗血清皮内注射至皮肤上的局部区域中，随后静脉内注射抗原以及染料。过敏反应在敏感部位处引起毛细管扩张和血管渗透性的增加，使得染料优先在此部位积累。可以从所述组织提取出染料并以分光光度法定量。随后，可将用测试抗血清致敏的组织中的染料外渗与用不相关抗血清致敏的组织中的外渗相比较。
在第0天，通过对Balb/c小鼠免疫接种含5μg天然Bet v 1蛋白质(IndoorBiotechnologies，#NA-BV1-1)的1mg/mL矾的1×磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)溶液，产生抗血清用于所述测定。一周后(第7天)，用含5μg天然Bet v 1蛋白质的1mg/mL矾的1×PBS溶液对敏感小鼠进行增强免疫。增强免疫之后两周，在第21天、第24天和第28天，用含0.5μg天然Bet v 1蛋白质的20μL PBS对小鼠进行鼻内气管激发。随后，在第31天处死小鼠并收集血清。根据制造商的说明书，使用OptEIATMELISA试剂盒(BD Biosciences，#555248)测定分离的抗血清中的总IgE浓度。在PBS中将Bet v 1抗血清的最终浓度稀释至2600ng/mL IgE。
在第0天，通过对Balb/c小鼠免疫接种含5μg从猫毛提取物中纯化的天然Fel d 1蛋白质(Indoor Biotechnologies，#LTN-FD1-1)的1mg/mL矾的PBS溶液，产生在所述测定中用作阴性对照的抗血清。在第14天和第21天，用含5μg Fel d 1蛋白质的1mg/mL矾的PBS溶液对小鼠进行增强免疫。最后一次增强免疫之后一周(第28天)，处死小鼠并收集血清。根据制造商的说明书，使用OptEIATMELISA试剂盒(BD Biosciences，#555248)测定分离的抗血清中的总IgE浓度。在PBS中将抗血清的最终浓度稀释至2500ng/mL IgE。
对于PCA测定，先对数组Balb/c小鼠(每个实验n≥5只)皮下注射1mg/kg剂量(总抗体剂量)的同种型对照抗体、抗Bet v 1抗体或抗Bet v 1抗体组合。施用抗体之后三天，将10μL的1.5ng Bet v 1抗血清或3ng阴性对照抗血清分别注射至每组中小鼠的右耳和左耳中。在局部施用过敏原特异性抗血清之后二十四小时，通过静脉内注射(每只小鼠100μL)溶解于含0.5％(w/v)伊凡氏蓝色染料(Evan's blue dye)(Sigma Aldrich，#E2129)的PBS中的1μg/mL天然Bet v 1的溶液来激发小鼠。在抗原激发之后一小时，处死小鼠，切除其双耳，放入1mL甲酰胺中，随后在50-56℃下培育3天，以提取伊凡氏蓝色染料。随后，从甲酰胺中取出耳组织，进行印迹以去除过量液体并称重。将二百微升各甲酰胺提取物的等分试样转移至96孔板中，一式两份，接着在620nm下测量其吸光度。使用标准曲线将测量的光学密度转化成伊凡氏蓝色染料浓度，并表示为每毫克组织中伊凡氏蓝色染料的纳克数。每组的平均值±标准差显示于表15中。在GraphPad Prism中，使用邦费罗尼多重比较测试(Bonferroni's multiple comparisons test)计算相较于同种型对照的平均差异。
如表15中所示，在第一项研究中，相较于同种型对照，单一抗Bet v 1抗体H4H17082P2未展示出染料外渗的显著减少。相比之下，在研究2中，本发明的两种抗Bet v 1抗体(H4H16992P和H4H17082P2)的组合以及本发明的四种抗Bet v 1抗体(H4H16992P、H4H17082P2、H4H17038P2及H4H16987P)的组合相较于同种型对照治疗展示出染料外渗的显著减少，且分别减少35.26ng/mg和36.49ng/mg。类似地，在研究3中，本发明的两种抗Bet v1抗体(H4H16992P和H4H17082P2)的组合相较于同种型对照治疗也展示出染料外渗的显著减少，且减少41.09ng/mg。如先前在研究1中所展示，在研究3中，单一抗Bet v 1抗体H4H17082P2相较于同种型对照未展示出染料外渗的显著减少。然而，另一种单独的抗体H4H16992P相较于同种型对照展示出染料外渗的显著减少，且减少25.86ng/mg。根据进行的研究可以看出，在被动皮肤全身性过敏反应体内模型中，通过双因素方差分析和邦费罗尼事后检验所测定，与同种型对照相比，单一抗体H4H16992P、H4H17082P2+H4H16992P两种抗体的组合以及H4H17082P2+H4H16992P+H4H17038P2+H4H16987P四种抗体的组合通过染料外渗的显著减少指示其能够阻止肥大细胞脱粒。在进行的两项研究中，相较于同种型，染料外渗的增加指示单独的H4H17082P2抗体不能阻止肥大细胞脱粒。每组使用的小鼠数量(n)在表中的圆括号内示出。
表15：抗Bet v 1抗体在被动皮肤全身性过敏反应体内模型中的作用。
Figure BDA0002378941660000581
所有抗体治疗组使用1mg/kg总抗体浓度
*P≤.05，***P≤.001，***P≤.0001
n＝每组中小鼠的数量
实施例8：在被动皮肤全身性过敏反应(PCA)体内模型中抗Bet v 1抗体针对三种 不同桦树花粉提取物的作用
在被动皮肤全身性过敏反应(PCA)体内模型中测试本文提供的抗Bet v 1抗体阻止过敏原诱导的肥大细胞脱粒的功效。将过敏原特异性抗血清经皮注射至皮肤上的局部区域中，随后静脉内注射抗原以及染料。过敏反应在敏感部位处引起毛细管扩张和血管渗透性的增加，使得染料优先在此部位积累。可以从所述组织提取出染料并以分光光度法定量。随后，可将用测试抗血清致敏的组织中的染料外渗与用不相关抗血清致敏的组织中的外渗相比较。
在第0天，通过对Balb/c小鼠免疫接种含5μg天然Bet v 1蛋白质(IndoorBiotechnologies，目录号NA-BV1-1，批号36164)或5μg花粉提取物(BPE)(即垂枝桦(Stallargenes Greer，目录号XP527D3A25，批号#277329)、河桦(Stallargenes Greer，目录号XP79D3A25，批号#285077)或杨叶桦(Stallargenes Greer，目录号XP80D3A2.5，批号#273622)BPE)的1mg/ml矾的1×磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)溶液，产生针对天然Bet v1、垂枝桦(又称为疣皮桦)BPE、河桦BPE及杨叶桦BPE的抗血清用于本测定。一周后(第7天)，用含5μg天然Bet v 1蛋白质或5μg对应的BPE(垂枝桦、河桦或杨叶桦)的1mg/mL矾的1×PBS溶液对敏感小鼠进行增强免疫。增强免疫之后两周，在第21天、第24天和第28天，用含0.5μg天然Bet v 1蛋白质或0.5μg对应的桦树花粉提取物的20μL 1×PBS对小鼠进行鼻内气管激发。随后，在第31天处死小鼠并收集血清。根据制造商的说明书，使用OptEIATMELISA试剂盒(BDBiosciences，#555248)测定分离的抗血清批料中的总IgE浓度。在1×PBS中将Bet v 1抗血清的最终浓度稀释至2500ng/mL IgE，并将桦树花粉提取物抗血清批料的最终浓度针对垂枝桦稀释至3000ng/mL、针对河桦稀释至1900ng/mL、和针对杨叶桦稀释至3700ng/mL。
通过对Balb/c小鼠免疫接种含5μg从猫毛提取物中纯化的天然Fel d 1蛋白质(Indoor Biotechnologies，目录号LTN-FD1-1，批号#36099)的1mg/mL矾的1×PBS溶液，产生在所述测定中用作阴性对照的抗血清。在第14天和第21天，用含5μg Fel d 1蛋白质的1mg/mL矾的1×PBS溶液对小鼠进行增强免疫。最后一次增强免疫之后一周(第28天)，处死小鼠并收集血清。根据制造商的说明书，使用OptEIATMELISA试剂盒(BD Biosciences，#555248)测定分离的抗血清中的总IgE浓度。在PBS中将抗血清的最终浓度稀释至4800ng/mLIgE。
对于PCA测定，先向数组Balb/c小鼠(每个实验n≥4只，重复三次)皮下注射1mg/kg剂量(总抗体剂量)的同种型对照抗体或两种抗Bet v 1抗体的组合。施用抗体之后三天，将10μL的1ng Bet v 1抗血清、25ng垂枝桦抗血清、25ng河桦抗血清或25ng杨叶桦抗血清注射至指定组中各小鼠的右耳中。向左耳施用1ng或25ng Fel d 1(阴性对照)以匹配相应右耳的抗血清浓度。局部施用过敏原特异性抗血清之后二十四小时，通过静脉内注射(每只小鼠100μL)溶解于含0.5％(w/v)伊凡氏蓝色染料(Sigma Aldrich，#E2129)的1×PBS中的1μg/mL天然Bet v 1(目录号NA-BV1-1，批号36164)或1μg/mL对应的BPE(Stallargenes Greer，目录号XP527D3A25，批号#277329；目录号XP79D3A25，批号#285077；及目录号XP80D3A2.5，批号#273622)的溶液来激发小鼠。抗原激发之后一小时，处死小鼠，切除双耳，放入1mL甲酰胺中，随后在50℃下培育3天，以提取伊凡氏蓝色染料。随后，从甲酰胺中取出耳组织，进行印迹以去除过量液体并称重。将二百微升各甲酰胺提取物的等分试样转移至96孔板中，一式两份。在620nm下测量所得上清液的吸光度。使用标准曲线将测量的光学密度转化成伊凡氏蓝色染料浓度，并表示为每毫克耳组织中伊凡氏蓝色染料的纳克数。每组的平均值±标准差显示于表1中。在GraphPad Prism中，使用邦费罗尼多重比较测试计算相较于同种型对照的平均差异。
表16展示出当与所有测试组中的同种型对照相比较时，通过染料外渗的显著减少指示了H4H16992P和H4H17082P2两种抗Bet v 1抗体的组合具有功效。如所示，在针对致敏作用的被动皮肤体内模型中，H4H17082P2/H4H16992P两种抗Bet v 1单克隆抗体的组合阻止肥大细胞脱粒，随后相较于同种型对照，用天然Bet v 1激发，由此展示出染料外渗显著减少88.34。类似地，相较于对应同种型对照组，在针对全部三种桦树花粉提取物的H4H17082P2/H4H16992P治疗组中也观察到染料外渗的减少，且对于垂枝桦统计显著减少62.52，对于河桦统计显著减少71.19，和对于杨叶桦统计显著减少91.47。通过双因素方差分析和邦费罗尼事后检验计算相较于同种型对照的平均差异。每组使用的小鼠数量(n)在各表中的圆括号内示出。
表16：抗Bet v 1抗体在被动皮肤全身性过敏反应(PCA)体内模型中的作用
Figure BDA0002378941660000601
所有抗体治疗组使用1mg/kg总抗体浓度
*P≤.05，***P≤.001，***P≤.0001
n＝每组中小鼠的数量
实施例9：抗Bet v 1单克隆抗体之间的交叉竞争
使用实时、无标记的生物层干涉测量测定，在Octet HTX生物传感器平台(PallForteBio Corp.)上测定一组抗Bet v 1单克隆抗体的结合竞争。在25℃下，在10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA及0.05％v/v表面活性剂Tween-20、1mg/mL BSA，pH 7.4(HBS-EBT)缓冲液中进行整个实验，同时以1000rpm速度振荡板。为了评估2种抗体是否能彼此竞争结合至其在表达带有C末端myc-myc-六组氨酸标签的重组突变Bet v 1(突变Bet v 1-MMH；SEQID NO:312)上的对应表位，先通过将涂布抗五组氨酸抗体的Octet生物传感器尖端(Fortebio Inc，#18-5122)浸入含有5μg/mL突变Bet v 1-MMH溶液的孔中，保持90秒，将约0.21nm突变Bet v 1-MMH捕捉至所述生物传感器尖端上。随后，通过将抗原捕捉的生物传感器尖端浸渍于含有50μg/mL mAb-1溶液的孔中，保持4分钟，以用第一种抗Bet v 1单克隆抗体(称为mAb-1)使所述生物传感器尖端饱和。随后，将生物传感器尖端浸渍于含有50μg/mL第二种抗Bet v 1单克隆抗体(称为mAb-2)溶液的孔中，保持3分钟。在本实验的每个步骤之间，在HBS-EBT缓冲液中洗涤生物传感器尖端。在整个实验过程中监测实时结合反应，并记录每个步骤结束时的结合反应。比较mAb-2结合至与mAb-1预先形成复合物的突变Bet v 1-MMH的反应，并如表17中所示，测定不同抗Bet v 1单克隆抗体的竞争性/非竞争性特性。
20种抗Bet v 1单克隆抗体中有3种不结合至突变Bet v 1-MMH，并且发现交叉竞争数据并无说服力。
表17.抗Bet v 1单克隆抗体之间的交叉竞争
Figure BDA0002378941660000611
Figure BDA0002378941660000621
*IC表示这些抗Bet v 1单克隆抗体不结合至突变Bet v 1-MMH并且发现交叉竞争数据并无说服力。
实施例10.抗Bet v 1抗体组合在人源化小鼠PCA模型中阻止Bet v 1诱导的肥大 细胞脱粒的能力
为了探究人桦树过敏个体中过敏原特异性IgE反应的多克隆性，利用人源化FcεR1α小鼠模型以促进人IgE与小鼠肥大细胞表面上FcεR1α的结合。由于人IgE不能结合小鼠FcεR1α，故制备经过基因修饰的小鼠，其中内源性小鼠FcεR1α被相应人FcεR1α序列置换并表示为FcεR1αhu/hu。通过展示人FcεR1α的表面表达以及对过敏原起反应的能力来验证用于本模型中的FcεR1αhu/hu小鼠：IgE在被动皮肤全身性过敏反应(PCA)模型中以与野生型小鼠类似的方式活化。这一PCA模型涉及将过敏性人血清皮内注射至皮肤上的局部区域中，随后静脉内注射相关过敏原以及染料。过敏反应在敏感部位处引起毛细管扩张和血管渗透性的增加，使得染料优先在此部位积累。可以从所述组织提取出染料并以分光光度法定量。将用测试抗血清致敏的组织中的染料外渗与用非过敏性人血清致敏的组织中的外渗相比较。
方法
为了确定抗Bet v 1抗体对本模型中肥大细胞脱粒的作用，在第1天，人源化FcεR1α小鼠接受皮下注射同种型对照抗体或抗Bet v 1抗体组合。对于每名人供体，进行两个独立实验，n＝5只小鼠/组并且合并数据。各组由无单克隆抗体阴性对照、同种型阴性对照、REGN5713+REGN5715两种抗Bet v 1抗体治疗组及REGN5713+REGN5714+REGN5715三种抗Betv 1抗体治疗组组成。总抗体浓度或组合抗体浓度是1mg/kg或IgG4同种型对照抗体(抗IL6Rα作为阴性同型对照)。三天后，将来自桦树过敏患者的血清或来自非桦树过敏患者的血清(阴性对照)分别皮内(ID)注射至右耳和左耳中，以使过敏原特异性IgE结合肥大细胞上的FcεRI。为了确保在实验中使用相同量的来自各供体的过敏原特异性IgE，归一化各抗血清注射液至
Figure BDA0002378941660000631
10KUa/L的Bet v 1特异性IgE。
局部施用过敏原特异性抗体之后二十四小时，通过IV注射稀释于含0.5％伊凡氏蓝色染料的PBS的1μg Bet v 1来激发小鼠。过敏原激发之后一小时，处死小鼠。从耳组织提取出伊凡氏蓝色染料并使用标准曲线以分光光度法定量。(关于所用方案的图，参见图6。)通过同种型对照抗体治疗组中伊凡氏蓝色染料的浓度B(同种型，平均值)减去抗体治疗组的施用桦树过敏血清的耳中伊凡氏蓝色染料的浓度B(mAb，i)(根据组织重量归一化)，来计算伊凡氏蓝色染料外渗的平均减少值。随后，用这一数值除以B(同种型，平均值)与抗体治疗组的施用非过敏血清的耳中的染料浓度[N(mAb,i)]之间的差值并乘以100，从而得到染料外渗的总体平均减少百分比(减少％)。该公式显示于下：
减少(平均)％＝100*[B(同种型，平均值)-B(mAb,i)]/[B(同种型，平均值)-N(mAb,i)]
相较于阴性同种型对照组，抗Bet v1抗体治疗组中染料渗漏的减少百分比的增加是Bet v 1抗体或抗体组合阻止肥大细胞脱粒的有效量度。
结论
在这一模型中，当使用来自3名桦树过敏供体的含IgE血清时，组合使用命名为H4H16992P(又称为REGN5713)、H4H17038P2(又称为REGN5714)和H4H17082P2(又称为REGN5715)的抗Bet v 1抗体在3名供体中展示出对IgE介导的反应的最大阻断(参见图7)。使用来自桦树过敏供体25609的血清，相较于同种型对照，H4H16992P、H4H17038P2和H4H17082P2组合使用时，对肥大细胞脱粒的阻止达到95％(平均差异-42.04+/-6.9(p<0.0001))，并且相较于同种型对照，组合使用H4H16992P和H4H17082P2，对肥大细胞脱粒的阻止达到93％(平均差异-41.74+/-3.7(p<0.0001))。使用来自桦树过敏供体23658的血清，相较于同种型对照，H4H16992P、H4H17038P2和H4H17082P2组合时，对肥大细胞脱粒的阻止达到90％(平均差异-53.67+/-7.1(p<0.0001))，并且相较于同种型对照，H4H16992P与H4H17082P2的组合阻止肥大细胞脱粒达到74％(平均差异-44.58+/-11.4(p<0.0001))。最后，使用来自桦树过敏供体25414的血清，相较于同种型对照，H4H16992P、H4H17038P2和H4H17082P2组合时，对肥大细胞脱粒的阻止达到92％(平均差异-39.72+/-7.5(p<0.0001))，并且相较于同种型对照，H4H16992P与H4H17082P2的组合阻止肥大细胞脱粒达到80％(平均差异-34.27+/-7.8(p<0.0001))。
实施例11.在磷酸化流式分析测定(Phospho-Erk Phosphoflow Assay)中抗Bet v 1抗体组合阻断嗜碱性粒细胞活化的能力
使用来自8名桦树过敏个体的样品，通过测试抗Bet v 1抗体H4H16992P(又称为REGN5713)、H4H17038P2(又称为REGN5714)和H4H17082P2(又称为REGN5715)的各种组合在抑制嗜碱性粒细胞活化方面的作用来探究人IgE反应。更确切地说，为了评估FcεR接合和活化，在功能性磷流式测定中测试嗜碱粒细胞，该测定测量了激酶ERK的磷酸化情况，即嗜碱性粒细胞活化和脱粒的近端读数(proximal readout)(Liu,Y.等人(2007),《实验医学杂志(J Exp Med)》204,93-103。
方法
从桦树过敏患者(n＝8)抽取血液，并通过在Ficoll层上进行密度离心而分离出PBMC，洗涤，再悬浮，并单点涂铺于96孔。同时，制备2×刺激板，该板包括纯化的Bet v 1的剂量反应以及与恒定剂量(最终浓度100pM)纯化的Bet v 1混合的抗Bet v 1抗体和抗体组合的剂量反应(2.56pM-200nM)。刺激细胞，随后用含有pErk-Alexa 488、CD123-BUV395和HLA-DR-APC抗体的抗体混合液染色。染色之后，使用LSR-Fortessa仪器获取数据并通过计算嗜碱性粒细胞门内的磷酸化Erk染色的MFI进行分析。如下计算最大抑制百分比：100-((100×最大抗体反应)/同种型反应)。“最大抗体反应”是剂量反应曲线(曲线平线区)中前三种剂量抗体中磷酸化Erk的平均中值荧光强度(MFI)减去基线MFI(复制的未刺激样品的平均值)，并且“同种型反应”是Regeneron制造的同种型对照抗体(REGN1945抗Fel d 1IgG4P)的剂量反应中所有MFI值的平均值减去基线MFI。
结果
来自全部8名桦树花粉过敏个体的嗜碱粒细胞对不同强度的Bet v 1刺激起反应。参见图8。H4H16992P、H4H17038P2和H4H17082P2抑制该8名供体至少70％的嗜碱性粒细胞活化，而H4H16992P与H4H17082P2的组合在8名供体中的6名中实现相同的抑制量值。值得注意的是，当分开测试时，个别抗体显示出影响过敏原结合至IgE的能力的高可变性。H4H16992P在8名供体中的3名中实现≥70％阻断，H4H17082P2在8名供体中的4名中实现70％的嗜碱性粒细胞活化阻断。H4H17038P2仅在8名测试供体中的1名中展示70％阻断。
实施例12：三种抗Bet v 1单克隆抗体与天然Bet v 1的同时结合的测定
进行本实验以确保三种所选Bet v 1单克隆抗体的结合表位是独特的，并且不考虑单克隆抗体结合的次序，当三种抗体同时结合时未展现空间位阻。另外，还评估所述三种Bet v 1单克隆抗体之间的次序依赖性竞争。
使用基于实时、无标记表面等离子体共振的Biacore 3000生物传感器平台(GEHealthcare.)测定三种抗Bet v 1单克隆抗体与同一Bet v 1的同时结合。在25℃下，在含有10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA及0.05％v/v表面活性剂Tween-20的pH7.4操作缓冲液(HBS-ET)中进行整个实验。使用EDC/NHS化学物质将抗体固定于CM5传感器的不同表面上，以达到5000-13,000RU的固定水平。同时固定REGN1945(Fel d 1单克隆抗体)作为阴性对照。将10nM或20nM天然Bet v 1(nBet v 1)注射于固定有不同Bet v 1单克隆抗体的传感器表面上，保持10-12秒，随后以15μL/分钟依序注射不同的Bet v 1单克隆抗体，保持6分钟。
使用Scrubber 2.0c测量不同Bet v 1单克隆抗体与结合至固定有单克隆抗体的传感器表面的nBet v 1的结合。结果显示于表18中。结合信号小于1RU(共振单元)指示，当注射Bet v 1单克隆抗体时未观察到结合，而较高结合信号(大于2RU)表示无竞争。本实施例中包括的全部三种Bet v 1单克隆抗体能够同时结合至nBet v 1并且结合反应不受抗体添加次序的影响。
表18：抗Bet v 1抗体同时结合竞争
Figure BDA0002378941660000651
Figure BDA0002378941660000661
数据表示至少3次独立注射Bet v 1单克隆抗体相对于nBet v 1与固定的Bet v 1单克隆抗体的复合物的平均值
概述
不管抗体与Bet v 1结合的次序如何，对全部三种抗体的同时结合都没有竞争阻碍，表明REGN5713、REGN5714和REGN5715结合至不重叠的独特表位。
序列表
<110> 瑞泽恩制药公司
J·M·奥伦戈
A·J·莫菲
A·T·巴迪斯
V·卡玛
Y·刘
<120> 抗BET V 1人抗体及其使用方法
<130> 10301WO01
<140> TBD
<141> 2018-05-31
<150> 62/513,872
<151> 2017-06-01
<150> 62/571,696
<151> 2017-10-12
<150> 62/662,165
<151> 2018-04-24
<160> 323
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 1
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtacag cctctggatt catgtctagt atgtattgga tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtgtccaac ataaagcaag atggaactga gaaaaactat 180
gtggagtctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaataa acagcctgag aggcgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatctg 300
tatagcagtt cgtccggcta ctattactac ggtttggacg tctggggcca agggaccacg 360
gtcaccgtct cctca 375
<210> 2
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Met Ser Ser Met Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Asn Ile Lys Gln Asp Gly Thr Glu Lys Asn Tyr Val Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Ser Leu Arg Gly Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Tyr Ser Ser Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Leu
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 3
ggattcatgt ctagtatgta ttgg 24
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 4
Gly Phe Met Ser Ser Met Tyr Trp
1 5
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 5
ataaagcaag atggaactga gaaa 24
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 6
Ile Lys Gln Asp Gly Thr Glu Lys
1 5
<210> 7
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 7
gcgagagatc tgtatagcag ttcgtccggc tactattact acggtttgga cgtc 54
<210> 8
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 8
Ala Arg Asp Leu Tyr Ser Ser Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Leu
1 5 10 15
Asp Val
<210> 9
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 9
gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60
atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg catagtaata aatacaatta tttggattgg 120
tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct atttgagttc taatcgggcc 180
tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggctcaggca cagaatttac actgaaaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tgttggtatt tattactgca tgcaagctct acacactccg 300
ctcactttcg gcggagggac caaggtggag atcaaa 336
<210> 10
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 10
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Lys Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ser Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Leu His Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 11
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 11
cagagcctcc tgcatagtaa taaatacaat tat 33
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 12
Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Lys Tyr Asn Tyr
1 5 10
<210> 13
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 13
ttgagttct 9
<210> 14
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 14
Leu Ser Ser
1
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 15
atgcaagctc tacacactcc gctcact 27
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 16
Met Gln Ala Leu His Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 17
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 17
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggttcagc ctggagggtc cctgagactc 60
tcctgtgtag cctctggatt caccttcagt aattatgaca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccaggggagg ggctggaatg gatttcatac attagttata gtgatcataa catatactat 180
atagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctattt attactgtgc gagagaggcc 300
ctagcatcat cttcctttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 18
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 18
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Asp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Tyr Ser Asp His Asn Ile Tyr Tyr Ile Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ala Leu Ala Ser Ser Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 19
ggattcacct tcagtaatta tgac 24
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 20
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Asp
1 5
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 21
attagttata gtgatcataa cata 24
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 22
Ile Ser Tyr Ser Asp His Asn Ile
1 5
<210> 23
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 23
gcgagagagg ccctagcatc atcttccttt gactac 36
<210> 24
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 24
Ala Arg Glu Ala Leu Ala Ser Ser Ser Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 25
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 25
gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagtcacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagt ggcaacttag cctggtacca gcagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatagt gcatccaccg gggccactgg tgtcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240
gaagattttg cactttatta ctgtcagcag tataataaat ggcctcggac gatcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 26
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 26
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Gly Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Thr Gly Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Lys Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Ile Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 27
cagagtgtta gtggcaac 18
<210> 28
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 28
Gln Ser Val Ser Gly Asn
1 5
<210> 29
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 29
agtgcatcc 9
<210> 30
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 30
Ser Ala Ser
1
<210> 31
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 31
cagcagtata ataaatggcc tcggacg 27
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 32
Gln Gln Tyr Asn Lys Trp Pro Arg Thr
1 5
<210> 33
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 33
caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaaga cttctggtta cacctttacc aactatggta tcacctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag gacttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtaa cacaaactat 180
gcacagaatg tccagggcag agtcactatg accacggaca catccacgag cacagcctac 240
atggaggtga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagaagaagc 300
agcatgttac acttccagca ctggggccag ggcaccctgg tcactgtctc ctca 354
<210> 34
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Asn Val
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Val Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ser Ser Met Leu His Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 35
ggttacacct ttaccaacta tggt 24
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 36
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly
1 5
<210> 37
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 37
atcagcgctt acaatggtaa caca 24
<210> 38
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 38
Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr
1 5
<210> 39
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 39
gcgagaagaa gcagcatgtt acacttccag cac 33
<210> 40
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 40
Ala Arg Arg Ser Ser Met Leu His Phe Gln His
1 5 10
<210> 41
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 41
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gcatgtttta tacgactcca gtaatgagaa ctacttagct 120
tggttccagc agaagccagg acagcctcct aaacttctca tttactgggc atctacccgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagtc tgcaggctga agatgtggcg gtttattact gtcagcaata ttctagtgct 300
ccgtacactt ttggccaggg gaccaagctg gagatcaaa 339
<210> 42
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 42
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln His Val Leu Tyr Asp
20 25 30
Ser Ser Asn Glu Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Ser Ser Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 43
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 43
cagcatgttt tatacgactc cagtaatgag aactac 36
<210> 44
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 44
Gln His Val Leu Tyr Asp Ser Ser Asn Glu Asn Tyr
1 5 10
<210> 45
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 45
tgggcatct 9
<210> 46
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 46
Trp Ala Ser
1
<210> 47
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 47
cagcaatatt ctagtgctcc gtacact 27
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 48
Gln Gln Tyr Ser Ser Ala Pro Tyr Thr
1 5
<210> 49
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 49
cagctgcagc tgcaggagtc gggcccaggg ctggtgaggc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtagtaatt actggtgggg ctggatccgc 120
cagcccccag ggaaggggct ggagtggatt ggtagtatct attatagcgg gatcacctac 180
tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atatccgcgg acacgtctaa ggaccagttc 240
tccctgaagc tgaggtctgt gaccgccgcg gacacggctg tgtattactg tgcgaaattg 300
gagtggctgc gcttggactt ctggggccag ggaaccacgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 50
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 50
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Asn Tyr Trp Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ile Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asp Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Lys Leu Glu Trp Leu Arg Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 51
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 51
ggtggctcca tcagcagtag taattactgg 30
<210> 52
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 52
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser Asn Tyr Trp
1 5 10
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 53
atctattata gcgggatcac c 21
<210> 54
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 54
Ile Tyr Tyr Ser Gly Ile Thr
1 5
<210> 55
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 55
gcgaaattgg agtggctgcg cttggacttc 30
<210> 56
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 56
Ala Lys Leu Glu Trp Leu Arg Leu Asp Phe
1 5 10
<210> 57
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 57
gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagt agctggttag tctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagtcc ccaagctcct gatctatgct gcatccagtt tacaaagtgg ggtcccatta 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttacta ttgtcaacag gctaaaagtt tccctctcac cttcggccaa 300
gggacacgac tggagattaa a 321
<210> 58
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 58
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Leu Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Lys Ser Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 59
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 59
cagggtatta gtagctgg 18
<210> 60
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 60
Gln Gly Ile Ser Ser Trp
1 5
<210> 61
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 61
gctgcatcc 9
<210> 62
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 62
Ala Ala Ser
1
<210> 63
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 63
caacaggcta aaagtttccc tctcacc 27
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 64
Gln Gln Ala Lys Ser Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 65
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 65
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactggtt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtgggagtt atatggtctg atggaagtga taaaaagtat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
cttcttatga acagcctgag agacgatgac acggctgtgt atcactgtgc gagagagggg 300
gggttccttt atagcagctc gtcccacttt gactactggg gccagggaac cctggtcacc 360
gtctcctca 369
<210> 66
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 66
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Asp Gly Ser Asp Lys Lys Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Leu Met Asn Ser Leu Arg Asp Asp Asp Thr Ala Val Tyr His Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Gly Phe Leu Tyr Ser Ser Ser Ser His Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 67
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 67
ggattcacct tcagtagcta tggc 24
<210> 68
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 68
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly
1 5
<210> 69
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 69
atatggtctg atggaagtga taaa 24
<210> 70
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 70
Ile Trp Ser Asp Gly Ser Asp Lys
1 5
<210> 71
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 71
gcgagagagg gggggttcct ttatagcagc tcgtcccact ttgactac 48
<210> 72
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 72
Ala Arg Glu Gly Gly Phe Leu Tyr Ser Ser Ser Ser His Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 73
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 73
gccatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc ggacaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaaactcct gatctttgct gcatccagtt tacaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tggcacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caatttatta ctgtctacaa gattacaagt acccattcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 74
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 74
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Lys Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 75
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 75
cagggcatta gaaatgat 18
<210> 76
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 76
Gln Gly Ile Arg Asn Asp
1 5
<210> 77
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 77
gctgcatcc 9
<210> 78
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 78
Ala Ala Ser
1
<210> 79
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 79
ctacaagatt acaagtaccc attcact 27
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 80
Leu Gln Asp Tyr Lys Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 81
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 81
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctgggtt caccttcagt tcctatggcc tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcagatg atggaagtta taaattctat 180
gcagactcca tgaagggccg attcaccatc tctagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gaaagatcgg 300
ggtcgcagtg gctggtacta ctttgactac tggggccagg gaaccctggt cactgtctcc 360
tca 363
<210> 82
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 82
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Asp Asp Gly Ser Tyr Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Met
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Gly Arg Ser Gly Trp Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 83
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 83
gggttcacct tcagttccta tggc 24
<210> 84
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 84
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly
1 5
<210> 85
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 85
atatcagatg atggaagtta taaa 24
<210> 86
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 86
Ile Ser Asp Asp Gly Ser Tyr Lys
1 5
<210> 87
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 87
gcgaaagatc ggggtcgcag tggctggtac tactttgact ac 42
<210> 88
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 88
Ala Lys Asp Arg Gly Arg Ser Gly Trp Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 89
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 89
gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtagggga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctataag gcgtctagtt tagaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gatgattttg caacttatta ctgccaacag tatgatagtt attctcggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 90
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 90
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Ser Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 91
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 91
cagagtatta gtagctgg 18
<210> 92
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 92
Gln Ser Ile Ser Ser Trp
1 5
<210> 93
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 93
aaggcgtct 9
<210> 94
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 94
Lys Ala Ser
1
<210> 95
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 95
caacagtatg atagttattc tcggacg 27
<210> 96
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 96
Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Ser Arg Thr
1 5
<210> 97
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 97
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ttggtacagc ctggagggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agttatgaaa tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gtctggagtg ggtttcattc attagtgata gtagtagtaa catatactac 180
gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa gtcactgtat 240
cttcaaatga ccagcctgag ggccgaggac acggctgttt attactgtgc gagagaagcc 300
attggcagca cctcctttga caactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 98
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 98
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Ser Asp Ser Ser Ser Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ala Ile Gly Ser Thr Ser Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 99
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 99
ggattcacct tcagtagtta tgaa 24
<210> 100
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 100
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Glu
1 5
<210> 101
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 101
attagtgata gtagtagtaa cata 24
<210> 102
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 102
Ile Ser Asp Ser Ser Ser Asn Ile
1 5
<210> 103
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 103
gcgagagaag ccattggcag cacctccttt gacaac 36
<210> 104
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 104
Ala Arg Glu Ala Ile Gly Ser Thr Ser Phe Asp Asn
1 5 10
<210> 105
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 105
gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagtttag cctggtacca gcagaaacct 120
ggccaggctc ccaggcgcct catctatagt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240
gaagattttg caatttatta ctgtcatcaa tataataact ggcctctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 106
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 106
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 107
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 107
cagagtgtta gcagcagt 18
<210> 108
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 108
Gln Ser Val Ser Ser Ser
1 5
<210> 109
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 109
agtgcatcc 9
<210> 110
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 110
Ser Ala Ser
1
<210> 111
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 111
catcaatata ataactggcc tctcact 27
<210> 112
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 112
His Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 113
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 113
gaggtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctgggtt caccgtcagt agcaactcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccaggggagg ggctggagtg ggtctcagtt atttttagcg gtggtatcac atactactca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agacacaatt ccaagaacac gctgtatctt 240
caaatgaaca gcctgagaac tgaggacacg gccgtatatt actgtgcgcg tcattctaac 300
tggaactttg atgcttttga tatctggggc caagggacaa tggtcaccgt ctcttca 357
<210> 114
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 114
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Phe Ser Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg His Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg His Ser Asn Trp Asn Phe Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 115
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 115
gggttcaccg tcagtagcaa ctcc 24
<210> 116
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 116
Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn Ser
1 5
<210> 117
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 117
atttttagcg gtggtatcac a 21
<210> 118
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 118
Ile Phe Ser Gly Gly Ile Thr
1 5
<210> 119
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 119
gcgcgtcatt ctaactggaa ctttgatgct tttgatatc 39
<210> 120
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 120
Ala Arg His Ser Asn Trp Asn Phe Asp Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 121
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 121
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagctttgac acctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaacctcct gatctatgct acatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg gaacttacta ttgtcaacag agttacagta tcccgtacac ttttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 122
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 122
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Phe Asp Thr Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 123
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 123
cagagctttg acacctat 18
<210> 124
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 124
Gln Ser Phe Asp Thr Tyr
1 5
<210> 125
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 125
gctacatcc 9
<210> 126
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 126
Ala Thr Ser
1
<210> 127
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 127
caacagagtt acagtatccc gtacact 27
<210> 128
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 128
Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Tyr Thr
1 5
<210> 129
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 129
caggtgcagc tggtacagtc tggggctgag gtgaggaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggata caccttcacc ggctactatc tacactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggattg atcaacccta atactggtgg cacaaacttt 180
gcacagaaat ttcagggcag ggtcaccatg accagggact cgtcaatcag cgcagcctac 240
atggaactga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagacaacac 300
tggaaccgtt attttgacaa ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 130
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 130
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Asn Thr Gly Gly Thr Asn Phe Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Ser Ser Ile Ser Ala Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln His Trp Asn Arg Tyr Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 131
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 131
ggatacacct tcaccggcta ctat 24
<210> 132
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 132
Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr
1 5
<210> 133
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 133
atcaacccta atactggtgg caca 24
<210> 134
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 134
Ile Asn Pro Asn Thr Gly Gly Thr
1 5
<210> 135
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 135
gcgagacaac actggaaccg ttattttgac aac 33
<210> 136
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 136
Ala Arg Gln His Trp Asn Arg Tyr Phe Asp Asn
1 5 10
<210> 137
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 137
gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcct ctgttggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggccagtca gagtgttggt aactggttgg cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaaactcct gatccaagag gcgtccagta tagaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctta tcgtcagcag cctgcagcct 240
gatgattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt attcgtggac gttcggccac 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 138
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 138
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Asn Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Gln Glu Ala Ser Ser Ile Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Ile Val Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Trp
85 90 95
Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 139
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 139
cagagtgttg gtaactgg 18
<210> 140
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 140
Gln Ser Val Gly Asn Trp
1 5
<210> 141
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 141
gaggcgtcc 9
<210> 142
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 142
Glu Ala Ser
1
<210> 143
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 143
caacagtata atagttattc gtggacg 27
<210> 144
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 144
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Trp Thr
1 5
<210> 145
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 145
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgctctg tctctggtgg ctccatcact aattacttct ggacctggat ccggcagtcc 120
ccagggaagg gactggaatg gattgggtat atctattaca gtgggggcac caactataac 180
ccctccctca agagtcgagt caccatatca atagacacgt ccaagaacca attctccctg 240
aatatgaatt ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtctatt actgtgcggg gagctactac 300
tacggtgtgg acgtctgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcctca 348
<210> 146
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 146
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Asn Tyr
20 25 30
Phe Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Asn Met Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Gly Ser Tyr Tyr Tyr Gly Val Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 147
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 147
ggtggctcca tcactaatta cttc 24
<210> 148
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 148
Gly Gly Ser Ile Thr Asn Tyr Phe
1 5
<210> 149
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 149
atctattaca gtgggggcac c 21
<210> 150
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 150
Ile Tyr Tyr Ser Gly Gly Thr
1 5
<210> 151
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 151
gcggggagct actactacgg tgtggacgtc 30
<210> 152
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 152
Ala Gly Ser Tyr Tyr Tyr Gly Val Asp Val
1 5 10
<210> 153
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 153
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtattaaa agcttcttag cctggtaccg acagaaacct 120
ggccaggctc ccagactcct catctatgat gcatccaaca ggcccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcaacag cctagagtct 240
gaagattttg cagtttattt ctgtcagcag cgtaacaact ggccattcac tttcggccct 300
gggaccaaag tggatatcaa a 321
<210> 154
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 154
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Lys Ser Phe
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Pro Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Arg Asn Asn Trp Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 155
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 155
cagagtatta aaagcttc 18
<210> 156
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 156
Gln Ser Ile Lys Ser Phe
1 5
<210> 157
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 157
gatgcatcc 9
<210> 158
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 158
Asp Ala Ser
1
<210> 159
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 159
cagcagcgta acaactggcc attcact 27
<210> 160
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 160
Gln Gln Arg Asn Asn Trp Pro Phe Thr
1 5
<210> 161
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 161
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gactactaca tgaactggat ccgccaggct 120
ccaggaaagg ggctagagtg gatttcactc attagtagta gtggtagtgc catatattac 180
tcagactctg tgaagggccg attcaccata tccagggaca atgccaggaa atcactgtat 240
ctgcaagtga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gagagatcgg 300
ggggagtggg ccctcggagc ctactactac ggtttggacg tctggggcca agggaccacg 360
gtcaccgtct cctca 375
<210> 162
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 162
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ser Leu Ile Ser Ser Ser Gly Ser Ala Ile Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Lys Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Val Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Gly Glu Trp Ala Leu Gly Ala Tyr Tyr Tyr Gly Leu
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 163
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 163
ggattcacct tcagtgacta ctac 24
<210> 164
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 164
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr
1 5
<210> 165
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 165
attagtagta gtggtagtgc cata 24
<210> 166
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 166
Ile Ser Ser Ser Gly Ser Ala Ile
1 5
<210> 167
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 167
gcgagagatc ggggggagtg ggccctcgga gcctactact acggtttgga cgtc 54
<210> 168
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 168
Ala Arg Asp Arg Gly Glu Trp Ala Leu Gly Ala Tyr Tyr Tyr Gly Leu
1 5 10 15
Asp Val
<210> 169
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 169
gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60
atctcctgca ggtctagtca gagcctccta catagtgatg gatacaacta tttggattgg 120
tacctgcaga agtcagggca gtctccacag ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc 180
tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240
agcagaatgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaagctct acaaactccg 300
tacacttttg gccaggggac caagctggag atcaaa 336
<210> 170
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 170
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asp Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Ser Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 171
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 171
cagagcctcc tacatagtga tggatacaac tat 33
<210> 172
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 172
Gln Ser Leu Leu His Ser Asp Gly Tyr Asn Tyr
1 5 10
<210> 173
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 173
ttgggttct 9
<210> 174
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 174
Leu Gly Ser
1
<210> 175
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 175
atgcaagctc tacaaactcc gtacact 27
<210> 176
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 176
Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 177
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 177
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtgctgatc actactggag ctggatccgc 120
cagcagccag ggaagggcct ggaatggatt gggtacattt cttatagagg gacaacctac 180
tacaacccga ccctcgagag tcgtgttagc atttcagtag acacgtttaa gaatcaattc 240
tccctgatgt tgcactccgt gactgtcgcg gacacggccg tgtattattg tgcgaaagta 300
ctccaagggc tcgtcagatt cagggactac ggtttcgacg tctggggcca agggaccacg 360
gtcaccgtct cctca 375
<210> 178
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 178
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Asp His Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Gln Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Thr
50 55 60
Leu Glu Ser Arg Val Ser Ile Ser Val Asp Thr Phe Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Met Leu His Ser Val Thr Val Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Lys Val Leu Gln Gly Leu Val Arg Phe Arg Asp Tyr Gly Phe
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 179
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 179
ggtggctcca tcagcagtgc tgatcactac 30
<210> 180
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 180
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ala Asp His Tyr
1 5 10
<210> 181
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 181
atttcttata gagggacaac c 21
<210> 182
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 182
Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Thr
1 5
<210> 183
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 183
gcgaaagtac tccaagggct cgtcagattc agggactacg gtttcgacgt c 51
<210> 184
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 184
Ala Lys Val Leu Gln Gly Leu Val Arg Phe Arg Asp Tyr Gly Phe Asp
1 5 10 15
Val
<210> 185
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 185
gacatccagt tgacccagtc tccacccttc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgct gggccagtca ggacattagc agttatttag cctggtatca gcaaaatccc 120
gggaaatccc ctaaactcct gatctatgat gcttttactt tacacactgg ggtcccatca 180
aggtttagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240
gaggattttg caacttttta ctgtcaacac ctttatagtt ttccattcac tttcggccct 300
gggaccaaag tggatatcaa a 321
<210> 186
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 186
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Pro Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Trp Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Asn Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Phe Thr Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Phe Tyr Cys Gln His Leu Tyr Ser Phe Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 187
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 187
caggacatta gcagttat 18
<210> 188
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 188
Gln Asp Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 189
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 189
gatgctttt 9
<210> 190
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 190
Asp Ala Phe
1
<210> 191
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 191
caacaccttt atagttttcc attcact 27
<210> 192
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 192
Gln His Leu Tyr Ser Phe Pro Phe Thr
1 5
<210> 193
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 193
gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcgggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagg aattatgcca tgcactgggt ccgacaagct 120
ccaggggagg gcctggagtg ggtcgcagcc atttatcgga atagtgattc catagactat 180
gcggactctg tgaagggccg attcaccatt tccagagaca acgccaagaa ctccctatat 240
ctgcaaatga acagtctgaa aactgaggac acggcgttgt attactgtgc aaaagatgag 300
ggatttttgg agtactttga ctcctggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 194
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 194
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Tyr Arg Asn Ser Asp Ser Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Glu Gly Phe Leu Glu Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 195
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 195
ggattcacct ttaggaatta tgcc 24
<210> 196
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 196
Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr Ala
1 5
<210> 197
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 197
atttatcgga atagtgattc cata 24
<210> 198
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 198
Ile Tyr Arg Asn Ser Asp Ser Ile
1 5
<210> 199
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 199
gcaaaagatg agggattttt ggagtacttt gactcc 36
<210> 200
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 200
Ala Lys Asp Glu Gly Phe Leu Glu Tyr Phe Asp Ser
1 5 10
<210> 201
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 201
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagcctcc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagcttct tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctac ggtgtatcca gcaggttcat tggcatccca 180
gacaggttca gtggcggtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcac cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta ggtcaccgtg gacgttcggc 300
caagggacca aggtggaaat caaa 324
<210> 202
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 202
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Val Ser Ser Arg Phe Ile Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Arg Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 203
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 203
cagagtgtta gcagcagctt c 21
<210> 204
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 204
Gln Ser Val Ser Ser Ser Phe
1 5
<210> 205
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 205
ggtgtatcc 9
<210> 206
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 206
Gly Val Ser
1
<210> 207
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 207
cagcagtatg gtaggtcacc gtggacg 27
<210> 208
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 208
Gln Gln Tyr Gly Arg Ser Pro Trp Thr
1 5
<210> 209
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 209
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgcgactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agatatgcca tacattgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg gactggaatg ggtggcagtt atatcatatg atggagatga taaatactat 180
ggagactccg tgaagggccg attcaccatt tccagagaca attccaagac catggtgtat 240
ctgcacatga acagcctgag aactgaggac acggctgtgt attattgtgc gaaagatgga 300
tatagtctct acgggaagga ctactttgac tattggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 210
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 210
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asp Asp Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Thr Met Val Tyr
65 70 75 80
Leu His Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Gly Tyr Ser Leu Tyr Gly Lys Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 211
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 211
ggattcacct tcagtagata tgcc 24
<210> 212
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 212
Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Ala
1 5
<210> 213
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 213
atatcatatg atggagatga taaa 24
<210> 214
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 214
Ile Ser Tyr Asp Gly Asp Asp Lys
1 5
<210> 215
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 215
gcgaaagatg gatatagtct ctacgggaag gactactttg actat 45
<210> 216
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 216
Ala Lys Asp Gly Tyr Ser Leu Tyr Gly Lys Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 217
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 217
gaaattgtgt tgacacagtc tccaggcacc ctgcctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtattacc aacagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctgaccagg ctcccagact cctcatctat ggtgcgtcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtga gtctgggaca gactttactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatgtta ggtcaccgtg gacgttcggc 300
caagggacca aggtggaaat caaa 324
<210> 218
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 218
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Pro Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Thr Asn Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Glu Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Val Arg Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 219
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 219
cagagtatta ccaacagcta c 21
<210> 220
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 220
Gln Ser Ile Thr Asn Ser Tyr
1 5
<210> 221
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 221
ggtgcgtcc 9
<210> 222
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 222
Gly Ala Ser
1
<210> 223
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 223
cagcagtatg ttaggtcacc gtggacg 27
<210> 224
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 224
Gln Gln Tyr Val Arg Ser Pro Trp Thr
1 5
<210> 225
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 225
caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cctcggagac cctgtccctc 60
acctgcgttg tctatggtga gtctttcggt aattaccatt ggaattggat ccgccagtcc 120
ccagggaagc ggctggagtg gattggggaa atcaatcaaa atggacacac caattacaac 180
ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtggacacgt ccaagatcca attttccctg 240
agactgaact ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt tctgtgcgag aggccataac 300
tacgtaaatt cctacttcgg tttggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 226
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 226
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Tyr Gly Glu Ser Phe Gly Asn Tyr
20 25 30
His Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Gln Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Ile Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Gly His Asn Tyr Val Asn Ser Tyr Phe Gly Leu Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 227
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 227
ggtgagtctt tcggtaatta ccat 24
<210> 228
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 228
Gly Glu Ser Phe Gly Asn Tyr His
1 5
<210> 229
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 229
atcaatcaaa atggacacac c 21
<210> 230
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 230
Ile Asn Gln Asn Gly His Thr
1 5
<210> 231
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 231
gcgagaggcc ataactacgt aaattcctac ttcggtttgg acgtc 45
<210> 232
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 232
Ala Arg Gly His Asn Tyr Val Asn Ser Tyr Phe Gly Leu Asp Val
1 5 10 15
<210> 233
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 233
gaaattgtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca ggaccagtca gagtgtaagc atcagcttag cctggtacca gcggaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctttggt tcatccacca gggccactgg tgtcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tataataact ggccgtacac ttttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 234
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 234
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Thr Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Gly Ser Ser Thr Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 235
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 235
cagagtgtaa gcatcagc 18
<210> 236
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 236
Gln Ser Val Ser Ile Ser
1 5
<210> 237
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 237
ggttcatcc 9
<210> 238
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 238
Gly Ser Ser
1
<210> 239
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 239
cagcagtata ataactggcc gtacact 27
<210> 240
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 240
Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Tyr Thr
1 5
<210> 241
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 241
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggata caccttcgcc gcccactata tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaacactt acactggtgg cacaaactat 180
gggcagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcac cacagcctac 240
atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgttt attactgtgc gcgagatcgg 300
cggaactgga acttcgtctt tgaatattgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360
<210> 242
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 242
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Ala His
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Gly Thr Asn Tyr Gly Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Arg Asn Trp Asn Phe Val Phe Glu Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 243
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 243
ggatacacct tcgccgccca ctat 24
<210> 244
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 244
Gly Tyr Thr Phe Ala Ala His Tyr
1 5
<210> 245
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 245
atcaacactt acactggtgg caca 24
<210> 246
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 246
Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Gly Thr
1 5
<210> 247
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 247
gcgcgagatc ggcggaactg gaacttcgtc tttgaatat 39
<210> 248
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 248
Ala Arg Asp Arg Arg Asn Trp Asn Phe Val Phe Glu Tyr
1 5 10
<210> 249
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 249
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcagttgcc gggcaagtca gaacattaag aactatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaaactcct gatctatgaa gcatctaatt tgcaaagtgg ggccccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctggaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttttagta ttccgtggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 250
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 250
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Lys Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Glu Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Ala Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Ser Ile Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 251
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 251
cagaacatta agaactat 18
<210> 252
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 252
Gln Asn Ile Lys Asn Tyr
1 5
<210> 253
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 253
gaagcatct 9
<210> 254
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 254
Glu Ala Ser
1
<210> 255
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 255
caacagagtt ttagtattcc gtggacg 27
<210> 256
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 256
Gln Gln Ser Phe Ser Ile Pro Trp Thr
1 5
<210> 257
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 257
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgaa gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggata caccttcatc gcctactatt tacactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggattg ctcaaccctt atactggtgg ctcatactat 180
acacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcga cacagcctac 240
atggaactga acagtctgag atctgacgac acggccatct attactgtgc gagagataag 300
aggagctact acatccctta tgcttttgaa atctggggcc aagggacaat ggtcaccgtc 360
tcttca 366
<210> 258
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 258
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ala Tyr
20 25 30
Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Leu Asn Pro Tyr Thr Gly Gly Ser Tyr Tyr Thr Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Lys Arg Ser Tyr Tyr Ile Pro Tyr Ala Phe Glu Ile Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 259
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 259
ggatacacct tcatcgccta ctat 24
<210> 260
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 260
Gly Tyr Thr Phe Ile Ala Tyr Tyr
1 5
<210> 261
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 261
ctcaaccctt atactggtgg ctca 24
<210> 262
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 262
Leu Asn Pro Tyr Thr Gly Gly Ser
1 5
<210> 263
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 263
gcgagagata agaggagcta ctacatccct tatgcttttg aaatc 45
<210> 264
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 264
Ala Arg Asp Lys Arg Ser Tyr Tyr Ile Pro Tyr Ala Phe Glu Ile
1 5 10 15
<210> 265
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 265
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccgtca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctccgat caccttcggc 300
caagggacac gactggagat taaa 324
<210> 266
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 266
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 267
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 267
cagagcatta gcagctat 18
<210> 268
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 268
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 269
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 269
gctgcatcc 9
<210> 270
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 270
Ala Ala Ser
1
<210> 271
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 271
caacagagtt acagtacccc tccgatcacc 30
<210> 272
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 272
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Ile Thr
1 5 10
<210> 273
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 273
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggttcagc ctggggtgtc cctgagactc 60
tcctgtgtag cctctggatt cacctttagc aattatgaca taacctggat ccgccagatt 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaaga atcagtggta gtggtggaag tacatatttc 180
gcagactccg tgaagggtcg gttcatcatc tccagagaca attccaaaaa tacggtgtat 240
atgcaaatga acagtttgag agccgaagac tcggccgtat attactgtgc gagaagagat 300
tccgtcttat ttagtatgaa cagttggctc gacccctggg gccagggaac cctggtcacc 360
gtctcctca 369
<210> 274
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 274
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Val
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Asp Ile Thr Trp Ile Arg Gln Ile Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Phe Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Ser Val Leu Phe Ser Met Asn Ser Trp Leu Asp Pro
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 275
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 275
ggattcacct ttagcaatta tgac 24
<210> 276
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 276
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Asp
1 5
<210> 277
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 277
atcagtggta gtggtggaag taca 24
<210> 278
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 278
Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 279
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 279
gcgagaagag attccgtctt atttagtatg aacagttggc tcgacccc 48
<210> 280
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 280
Ala Arg Arg Asp Ser Val Leu Phe Ser Met Asn Ser Trp Leu Asp Pro
1 5 10 15
<210> 281
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 281
gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60
tcctgttcgg gatctggata caggtttacc aactactgga tcgcctgggt gcgccagatg 120
cccgggaaag gcctggagtg gatgggtctc attcatcctg atgactctga tattagatac 180
agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccttt tcagtcgaca agtccatcaa caccgcctac 240
ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtac gcgacaagac 300
ggaatactat ggtctcataa tgcctggttc gacccctggg gccagggaac cctggtcacc 360
gtctcctca 369
<210> 282
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 282
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Ser Gly Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile His Pro Asp Asp Ser Asp Ile Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Phe Ser Val Asp Lys Ser Ile Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gln Asp Gly Ile Leu Trp Ser His Asn Ala Trp Phe Asp Pro
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 283
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 283
ggatacaggt ttaccaacta ctgg 24
<210> 284
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 284
Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Tyr Trp
1 5
<210> 285
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 285
attcatcctg atgactctga tatt 24
<210> 286
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 286
Ile His Pro Asp Asp Ser Asp Ile
1 5
<210> 287
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 287
acgcgacaag acggaatact atggtctcat aatgcctggt tcgacccc 48
<210> 288
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 288
Thr Arg Gln Asp Gly Ile Leu Trp Ser His Asn Ala Trp Phe Asp Pro
1 5 10 15
<210> 289
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 289
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cctctggata caccttcatt agttacaata tcttctgggt gcgacaggcc 120
actggtcagg gccttgattg gatgggatgg atgaacccct tcagaaataa cgcaggttat 180
gcacagaagt ttcagggcag agtcaccgtg acctgggaca cctccatcag cacagcctac 240
atggaactgt ccagcctgag ctctgaggac acggccatat attactgtgc gagagaacat 300
ggcagtagct ggggcttctt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360
<210> 290
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 290
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr
20 25 30
Asn Ile Phe Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Asp Trp Met
35 40 45
Gly Trp Met Asn Pro Phe Arg Asn Asn Ala Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Val Thr Trp Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Ser Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu His Gly Ser Ser Trp Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 291
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 291
ggatacacct tcattagtta caat 24
<210> 292
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 292
Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr Asn
1 5
<210> 293
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 293
atgaacccct tcagaaataa cgca 24
<210> 294
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 294
Met Asn Pro Phe Arg Asn Asn Ala
1 5
<210> 295
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 295
gcgagagaac atggcagtag ctggggcttc tttgactac 39
<210> 296
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 296
Ala Arg Glu His Gly Ser Ser Trp Gly Phe Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 297
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 297
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccttg gacgttcggc 300
caagggacca aggtggaaat caaa 324
<210> 298
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 298
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 299
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 299
cagagtgtta gcagcagcta c 21
<210> 300
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 300
Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr
1 5
<210> 301
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 301
ggtgcatcc 9
<210> 302
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 302
Gly Ala Ser
1
<210> 303
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 303
cagcagtatg gtagctcacc ttggacg 27
<210> 304
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 304
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr
1 5
<210> 305
<211> 483
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Bet v1
<400> 305
atgggtgtgt ttaattatga gactgagacc acctctgtta tcccagcagc tcgactgttc 60
aaggccttta tccttgatgg cgataacctc tttccaaagg ttgcacccca agccattagc 120
agtgttgaaa acattgaagg aaatggaggg cctggaacca ttaagaagat cagctttccc 180
gaaggcctcc ctttcaagta cgtgaaggac agagttgatg aggtggacca cacaaacttc 240
aaatacaatt acagcgtgat cgagggcggt cccataggcg acacattgga gaagatctcc 300
aacgagataa agatagtggc aacccctgat ggaggatcca tcttgaagat cagcaacaag 360
taccacacca aaggtgacca tgaggtgaag gcagagcagg ttaaggcaag taaagaaatg 420
ggcgagacac ttttgagggc cgttgagagc tacctcttgg cacactccga tgcctacaac 480
taa 483
<210> 306
<211> 160
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Bet v1（寄存编号CAB02159中的M1-N160）
<400> 306
Met Gly Val Phe Asn Tyr Glu Thr Glu Thr Thr Ser Val Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ala Arg Leu Phe Lys Ala Phe Ile Leu Asp Gly Asp Asn Leu Phe Pro
20 25 30
Lys Val Ala Pro Gln Ala Ile Ser Ser Val Glu Asn Ile Glu Gly Asn
35 40 45
Gly Gly Pro Gly Thr Ile Lys Lys Ile Ser Phe Pro Glu Gly Leu Pro
50 55 60
Phe Lys Tyr Val Lys Asp Arg Val Asp Glu Val Asp His Thr Asn Phe
65 70 75 80
Lys Tyr Asn Tyr Ser Val Ile Glu Gly Gly Pro Ile Gly Asp Thr Leu
85 90 95
Glu Lys Ile Ser Asn Glu Ile Lys Ile Val Ala Thr Pro Asp Gly Gly
100 105 110
Ser Ile Leu Lys Ile Ser Asn Lys Tyr His Thr Lys Gly Asp His Glu
115 120 125
Val Lys Ala Glu Gln Val Lys Ala Ser Lys Glu Met Gly Glu Thr Leu
130 135 140
Leu Arg Ala Val Glu Ser Tyr Leu Leu Ala His Ser Asp Ala Tyr Asn
145 150 155 160
<210> 307
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Bet v1的氨基酸23-43
<400> 307
Phe Ile Leu Asp Gly Asp Asn Leu Phe Pro Lys Val Ala Pro Gln Ala
1 5 10 15
Ile Ser Ser Val Glu
20
<210> 308
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Bet v1的氨基酸44-56
<400> 308
Asn Ile Glu Gly Asn Gly Gly Pro Gly Thr Ile Lys Lys
1 5 10
<210> 309
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Bet v1的氨基酸2-19
<400> 309
Gly Val Phe Asn Tyr Glu Thr Glu Thr Thr Ser Val Ile Pro Ala Ala
1 5 10 15
Arg Leu
<210> 310
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Bet v1的氨基酸57-70
<400> 310
Ile Ser Phe Pro Glu Gly Leu Pro Phe Lys Tyr Val Lys Asp
1 5 10
<210> 311
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Bet v1的氨基酸81-89
<400> 311
Lys Tyr Asn Tyr Ser Val Ile Glu Gly
1 5
<210> 312
<211> 187
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 带有Myc-Myc六组氨酸标签的突变Bet v 1-MMH w S85A
（1-159：Bet v1（寄存编号CAB02159的G2-N160）
<400> 312
Gly Val Phe Asn Tyr Glu Thr Glu Thr Thr Ser Val Ile Pro Ala Ala
1 5 10 15
Arg Leu Phe Lys Ala Phe Ile Leu Asp Gly Asp Asn Leu Phe Pro Lys
20 25 30
Val Ala Pro Gln Ala Ile Ser Ser Val Glu Asn Ile Glu Gly Asn Gly
35 40 45
Gly Pro Gly Thr Ile Lys Lys Ile Ser Phe Pro Glu Gly Leu Pro Phe
50 55 60
Lys Tyr Val Lys Asp Arg Val Asp Glu Val Asp His Thr Asn Phe Lys
65 70 75 80
Tyr Asn Tyr Ala Val Ile Glu Gly Gly Pro Ile Gly Asp Thr Leu Glu
85 90 95
Lys Ile Ser Asn Glu Ile Lys Ile Val Ala Thr Pro Asp Gly Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Lys Ile Ser Asn Lys Tyr His Thr Lys Gly Asp His Glu Val
115 120 125
Lys Ala Glu Gln Val Lys Ala Ser Lys Glu Met Gly Glu Thr Leu Leu
130 135 140
Arg Ala Val Glu Ser Tyr Leu Leu Ala His Ser Asp Ala Tyr Asn Glu
145 150 155 160
Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly Glu Gln Lys Leu Ile
165 170 175
Ser Glu Glu Asp Leu His His His His His His
180 185
<210> 313
<211> 413
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hFceR1α-mFc
<400> 313
Val Pro Gln Lys Pro Lys Val Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile
1 5 10 15
Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe
20 25 30
Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu
35 40 45
Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly
50 55 60
Glu Tyr Lys Cys Gln His Gln Gln Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Val
85 90 95
Val Met Glu Gly Gln Pro Leu Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn
100 105 110
Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys
115 120 125
Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu
130 135 140
Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys Thr Gly Lys Val Trp Gln Leu Asp Tyr
145 150 155 160
Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile Thr Val Ile Lys Ala Pro Arg Glu Lys
165 170 175
Tyr Trp Leu Gln Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro
180 185 190
Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile
195 200 205
Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile
210 215 220
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln
225 230 235 240
Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln
245 250 255
Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu
260 265 270
Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys
275 280 285
Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
290 295 300
Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro
305 310 315 320
Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr
325 330 335
Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys
340 345 350
Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
355 360 365
Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val
370 375 380
Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn
385 390 395 400
His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
405 410
<210> 314
<211> 160
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自Uniprot: P15494的Bet v 1氨基酸序列
<400> 314
Met Gly Val Phe Asn Tyr Glu Thr Glu Thr Thr Ser Val Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ala Arg Leu Phe Lys Ala Phe Ile Leu Asp Gly Asp Asn Leu Phe Pro
20 25 30
Lys Val Ala Pro Gln Ala Ile Ser Ser Val Glu Asn Ile Glu Gly Asn
35 40 45
Gly Gly Pro Gly Thr Ile Lys Lys Ile Ser Phe Pro Glu Gly Phe Pro
50 55 60
Phe Lys Tyr Val Lys Asp Arg Val Asp Glu Val Asp His Thr Asn Phe
65 70 75 80
Lys Tyr Asn Tyr Ser Val Ile Glu Gly Gly Pro Ile Gly Asp Thr Leu
85 90 95
Glu Lys Ile Ser Asn Glu Ile Lys Ile Val Ala Thr Pro Asp Gly Gly
100 105 110
Ser Ile Leu Lys Ile Ser Asn Lys Tyr His Thr Lys Gly Asp His Glu
115 120 125
Val Lys Ala Glu Gln Val Lys Ala Ser Lys Glu Met Gly Glu Thr Leu
130 135 140
Leu Arg Ala Val Glu Ser Tyr Leu Leu Ala His Ser Asp Ala Tyr Asn
145 150 155 160
<210> 315
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Bet v1的氨基酸81-96
<400> 315
Lys Tyr Asn Tyr Ser Val Ile Glu Gly Gly Pro Ile Gly Asp Thr Leu
1 5 10 15
<210> 316
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H4H17038P2 HC
<400> 316
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Ser Asp Ser Ser Ser Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ala Ile Gly Ser Thr Ser Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 317
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H4H17038P2 LC
<400> 317
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 318
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H4H16987P HC
<400> 318
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Phe Ser Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg His Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg His Ser Asn Trp Asn Phe Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 319
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H4H16987P LC
<400> 319
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Phe Asp Thr Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 320
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H4H16992P HC
<400> 320
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Asn Tyr
20 25 30
Phe Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Asn Met Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Gly Ser Tyr Tyr Tyr Gly Val Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
225 230 235 240
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
245 250 255
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
260 265 270
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
275 280 285
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
290 295 300
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
305 310 315 320
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
325 330 335
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
340 345 350
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
355 360 365
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
370 375 380
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
385 390 395 400
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
405 410 415
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
420 425 430
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 321
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H4H16992P LC
<400> 321
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Lys Ser Phe
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Pro Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Arg Asn Asn Trp Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 322
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H4H17082P2 HC
<400> 322
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr
20 25 30
Asn Ile Phe Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Asp Trp Met
35 40 45
Gly Trp Met Asn Pro Phe Arg Asn Asn Ala Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Val Thr Trp Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Ser Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu His Gly Ser Ser Trp Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 323
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H4H17082P2 LC
<400> 323
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215

Claims (70)

1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其结合至天然Bet v 1或桦树花粉提取物(BPE)，其中所述抗体或其片段包含：
三个重链CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，所述重链CDR包含于选自下组的任一重链可变区(HCVR)序列内：SEQ ID NO:146、290、98、114、2、18、34、50、66、82、130、162、178、194、210、226、242、258、274及282、或与其具有至少90％序列同一性的基本上类似的序列；或
三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，所述轻链CDR包含于选自下组的任一轻链可变区(LCVR)序列内：SEQ ID NO:154、298、106、122、10、26、42、58、74、90、138、170、186、202、218、234、250及266、或与其具有至少90％序列同一性的基本上类似的序列。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段还展现以下特征中的一种或多种：
(a)是全人单克隆抗体；
(b)如通过表面等离子体共振所测量，以等于或小于10-8M的KD结合至Bet v1；
(c)结合至选自下组的Bet v 1氨基酸序列片段：SEQ ID NO:307、308、309、310及311；或
(d)抑制天然Bet v 1、垂枝桦BPE、河桦BPE或杨叶桦BPE与过敏原特异性IgE的结合。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含三个重链CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，所述重链CDR包含于选自下组的任一重链可变区(HCVR)序列内：SEQ ID NO:146、290、98、114、2、18、34、50、66、82、130、162、178、194、210、226、242、258、274及282；以及三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，所述三个轻链CDR包含于选自下组的任一轻链可变区(LCVR)序列内：SEQ ID NO:154、298、106、122、10、26、42、58、74、90、138、170、186、202、218、234、250及266。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含具有选自下组的氨基酸序列的HCVR：SEQ ID NO:146、290、98、114、2、18、34、50、66、82、130、162、178、194、210、226、242、258、274及282。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含具有选自下组的氨基酸序列的LCVR：SEQ ID NO:154、298、106、122、10、26、42、58、74、90、138、170、186、202、218、234、250及266。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含：(a)具有选自下组的氨基酸序列的HCVR：SEQ ID NO:146、290、98、114、2、18、34、50、66、82、130、162、178、194、210、226、242、258、274及282；和(b)具有选自下组的氨基酸序列的LCVR：SEQ ID NO:154、298、106、122、10、26、42、58、74、90、138、170、186、202、218、234、250及266。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：
(a)具有选自下组的氨基酸序列的HCDR1结构域：SEQ ID NO:148、292、100、116、4、20、36、52、68、84、132、164、180、196、212、228、244、260、276及284；
(b)具有选自下组的氨基酸序列的HCDR2结构域：SEQ ID NO:150、294、102、118、6、22、38、54、70、86、134、166、182、198、214、230、246、262、278及286；
(c)具有选自下组的氨基酸序列的HCDR3结构域：SEQ ID NO:152、296、104、120、8、24、40、56、72、88、136、168、184、200、216、232、248、264、280及288；
(d)具有选自下组的氨基酸序列的LCDR1结构域：SEQ ID NO:156、300、108、124、12、28、44、60、76、92、140、172、188、204、220、236、252及268；
(e)具有选自下组的氨基酸序列的LCDR2结构域：SEQ ID NO:158、302、110、126、14、30、46、62、78、94、142、174、190、206、222、238、254及270；以及
(f)具有选自下组的氨基酸序列的LCDR3结构域：SEQ ID NO:160、304、112、128、16、32、48、64、80、96、144、176、192、208、224、240、256及272。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的分离的人单克隆抗体或抗原结合片段，其包含选自下组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO:146/154、290/298、98/106、114/122、2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、130/138、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/266及282/266。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段与选自下组的氨基酸序列的至少一个相互作用：在SEQ ID NO:306的约23位至约43位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约44位至约69位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约2位至约19位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约57位至约70位范围内的氨基酸残基；和在SEQ ID NO:306的约81位至约96位范围内的氨基酸残基。
10.根据权利要求9所述的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段与在SEQ ID NO:306的约23位至约44位范围内的氨基酸残基相互作用。
11.根据权利要求10所述的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段与在SEQ ID NO:306的约23位至约43位范围内的氨基酸残基相互作用。
12.根据权利要求9所述的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段与在SEQ ID NO:306的约44位至约70位范围内的氨基酸残基相互作用。
13.根据权利要求12所述的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段与在SEQ ID NO:306的约44位至约56位范围内的氨基酸残基相互作用。
14.根据权利要求9所述的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段与在SEQ ID NO:306的约2位至约19位范围内的氨基酸残基相互作用。
15.根据权利要求9所述的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段与在SEQ ID NO:306的约57位至约70位范围内的氨基酸残基相互作用。
16.根据权利要求15所述的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段与在SEQ ID NO:306的约57位至约66位范围内的氨基酸残基相互作用。
17.根据权利要求9所述的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段与在SEQ ID NO:306的约81位至约96位范围内的氨基酸残基相互作用。
18.根据权利要求17所述的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段与在SEQ ID NO:306的约81位至约89位范围内的氨基酸残基相互作用。
19.根据权利要求1至9中任一项所述的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段与选自下组的氨基酸序列的至少一个相互作用：SEQ ID NO:307、308、309、310及311。
20.根据权利要求9至19中任一项所述的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有选自下组的HCVR/LCVR序列对：SEQ ID NO:146/154、290/298、98/106及114/122。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与参照抗体竞争结合天然Bet v 1或BPE，所述参照抗体包含选自下组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO:146/154、290/298、98/106、114/122、2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、130/138、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/266及282/266。
22.根据权利要求1至20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合至Bet v 1上参照抗体所结合的相同的表位，所述参照抗体包含选自下组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO:146/154、290/298、98/106、114/122、2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、130/138、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/266及282/266。
23.一种药物组合物，其包括治疗有效量的一种或多种根据权利要求1至22中任一项所述的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。
24.根据权利要求23所述的药物组合物，其包括：
a)分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO:146所示氨基酸序列的HCVR和具有SEQ ID NO:154所示氨基酸序列的LCVR；和
b)一种或多种分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含具有选自SEQ ID NO:290、98和114的氨基酸序列的HCVR；以及具有选自SEQ ID NO:298、106和122的氨基酸序列的LCVR。
25.根据权利要求23所述的药物组合物，其包括：
a)包含具有SEQ ID NO:146所示氨基酸序列的HCVR以及具有SEQ ID NO:154所示氨基酸序列的LCVR的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段；和
b)包含具有SEQ ID NO:290所示氨基酸序列的HCVR以及具有SEQ ID NO:298所示氨基酸序列的LCVR的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段。
26.根据权利要求23所述的药物组合物，其包括：
a)包含具有SEQ ID NO:146所示氨基酸序列的HCVR以及具有SEQ ID NO:154所示氨基酸序列的LCVR的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段；
b)包含具有SEQ ID NO:290所示氨基酸序列的HCVR以及具有SEQ ID NO:298所示氨基酸序列的LCVR的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段；和
c)包含具有SEQ ID NO:98所示氨基酸序列的HCVR以及具有SEQ ID NO:106所示氨基酸序列的LCVR的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段。
27.根据权利要求23所述的药物组合物，其包括三种分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述人抗体或其抗原结合片段包含分别由SEQ ID NO:148/150/152/156/158/160、292/294/296/300/302/314和100/102/104/108/110/112所示的HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3氨基酸序列组合。
28.根据权利要求23所述的药物组合物，其包括四种分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述人抗体或其抗原结合片段包含分别由SEQ ID NO:148/150/152/156/158/160、292/294/296/300/302/314、100/102/104/108/110/112和116/118/120/124/126/128所示的HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3氨基酸序列组合。
29.根据权利要求23所述的药物组合物，其包括三种分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述人抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:146/154、290/298和98/106所示的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
30.根据权利要求23所述的药物组合物，其包括四种分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述人抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:146/154、290/298、98/106及114/122所示的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
31.一种药物组合物，其包括治疗有效量的结合至Bet v 1的第一分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述第一抗体或其片段与在SEQ ID NO:306的约23位至约44位范围内的氨基酸残基相互作用；和结合至Bet v 1的第二分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗体或其片段与在SEQ ID NO:306的约44位至约69位范围内的氨基酸残基相互作用；以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。
32.根据权利要求30所述的药物组合物，其中所述第一抗体或其片段与在SEQ ID NO:306的约23位至约43位范围内的氨基酸残基相互作用，并且其中所述第二抗体或其片段与在SEQ ID NO:306的约44至位约56位范围内的氨基酸残基相互作用。
33.根据权利要求30所述的药物组合物，其中所述第一抗体或其片段与SEQ ID NO:307所示的氨基酸序列相互作用。
34.根据权利要求30所述的药物组合物，其中所述第二抗体或其片段与SEQ ID NO:308所示的氨基酸序列相互作用。
35.一种药物组合物，其包括治疗有效量的结合至Bet v 1的第一分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，和结合至Bet v 1的一种或多种其他分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂，其中所述第一抗体或其片段与选自下组的氨基酸序列的至少一个相互作用：在SEQ ID NO:306的约23位至约43位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约44位至约56位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约2位至约19位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约57位至约70位范围内的氨基酸残基；和SEQ ID NO:306的约81位至约89位范围内的氨基酸残基。
36.根据权利要求35所述的药物组合物，其中所述一种或多种其他分离的人单克隆抗体或其片段与选自下组的氨基酸序列的至少一个相互作用：在SEQ ID NO:306的约23位至约43位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约44位至约56位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约2位至约19位范围内的氨基酸残基；在SEQ ID NO:306的约57位至约70位范围内的氨基酸残基；和在SEQ ID NO:306的约81位至约89位范围内的氨基酸残基，并且其中所述一种或多种其他分离的人单克隆抗体中的至少一种与不同于所述第一分离的人单克隆抗体的氨基酸序列相互作用。
37.根据权利要求35所述的药物组合物，其中所述第一抗体或其片段与SEQ ID NO:307所示的氨基酸序列相互作用，并且其中所述一种或多种其他抗体或其片段与选自下组的氨基酸序列相互作用：SEQ ID NO:308、309、310及311。
38.一种核酸分子，其编码根据权利要求1至20中任一项所述的结合至天然Bet v 1或BPE的人单克隆抗体或其片段。
39.一种表达载体，其包含根据权利要求38所述的编码结合至Bet v 1的人单克隆抗体或其片段的核酸分子。
40.一种宿主细胞，其含有根据权利要求38所述的表达载体。
41.一种防止或减少与天然Bet v 1、垂枝桦BPE、河桦BPE或杨叶桦BPE致敏作用相关的肥大细胞脱粒或阻止相关嗜碱性粒细胞活化的方法，所述方法包括向有需要的患者施用根据权利要求23所述的药物组合物。
42.一种治疗表现有针对壳斗目植物蛋白质、壳斗目植物相关过敏原、桦树花粉或其提取物、或Bet v 1蛋白质的敏感性或过敏反应的患者，或治疗与针对壳斗目植物蛋白质、壳斗目植物相关过敏原、桦树花粉或其提取物、或Bet v 1蛋白质的敏感性或过敏反应相关的至少一种症状或并发症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的一种或多种根据权利要求1-22中任一项所述的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段；或根据权利要求23-37中任一项所述的包括有效量的一种或多种分离的人单克隆抗体或其片段的药物组合物，其中在施用一种或多种所述结合Bet v 1的分离的人单克隆抗体或其片段之后，或在施用包括了前述抗体中的任一种或多种的组合物之后，所述针对壳斗目植物蛋白质、壳斗目植物相关过敏原、桦树花粉或其提取物、或Bet v 1蛋白质的敏感性或过敏反应得到预防，或其严重程度降低和/或持续时间减少，或与所述针对壳斗目植物蛋白质、壳斗目植物相关过敏原、桦树花粉或其提取物、或Bet v 1蛋白质的敏感性或过敏反应相关的至少一种症状或并发症得到预防或改善，或所述针对壳斗目植物蛋白质、壳斗目植物相关过敏原、桦树花粉或其提取物、或Bet v 1蛋白质的敏感性或过敏反应的频率降低和/或持续时间减少、或严重程度降低。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述桦树花粉提取物(BPE)选自下组：天然Bet v1、垂枝桦BPE、河桦BPE及杨叶桦BPE。
44.根据权利要求42所述的方法，其还包括施用有效量的可用于减轻针对壳斗目植物蛋白质、壳斗目植物相关过敏原、桦树花粉或其提取物、或Bet v 1蛋白质的过敏反应的第二治疗剂。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述第二治疗剂选自下组：皮质类固醇、支气管扩张剂、抗组胺剂、肾上腺素、解充血剂、另一种不同的抗Bet v 1抗体及肽疫苗。
46.根据权利要求42所述的方法，其还包括刚好用所述抗体或其片段或包括了所述抗体的所述药物组合物治疗所述患者之后或同时，用过敏原特异性免疫疗法(SIT)方案治疗所述患者。
47.根据权利要求42至46中任一项所述的方法，其中所述治疗使得所述患者在暴露于壳斗目植物蛋白质、桦树花粉或其提取物、或Bet v 1蛋白质之后引起的过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、过敏性哮喘或全身性过敏反应减轻。
48.根据权利要求23至37中任一项所述的药物组合物，其用于治疗表现有针对壳斗目植物蛋白质、壳斗目植物相关过敏原、桦树花粉或其提取物、或Bet v 1蛋白质的敏感性或过敏反应的患者，或用于治疗与针对壳斗目植物蛋白质、壳斗目植物相关过敏原、桦树花粉或其提取物、或Bet v 1蛋白质的敏感性或过敏反应相关的至少一种症状或并发症，其中所述针对壳斗目植物蛋白质、壳斗目植物相关过敏原、桦树花粉或其提取物、或Bet v 1蛋白质的敏感性或过敏反应得到预防，或其严重程度降低和/或持续时间减少，或与所述针对壳斗目植物蛋白质、壳斗目植物相关过敏原、桦树花粉或其提取物、或Bet v 1蛋白质的敏感性或过敏反应相关的至少一种症状或并发症得到预防或改善，或所述针对壳斗目植物蛋白质、壳斗目植物相关过敏原、桦树花粉或其提取物、或Bet v 1蛋白质的敏感性或过敏反应的频率降低和/或持续时间减少、或严重程度降低。
49.根据权利要求48所述的药物组合物，其中所述桦树花粉提取物选自下组：天然Betv1、垂枝桦BPE、河桦BPE及杨叶桦BPE。
50.权利要求23至37中任一项所述的药物组合物在制备用于治疗表现有针对壳斗目植物蛋白质、壳斗目植物相关过敏原、桦树花粉或其提取物、或Bet v 1蛋白质的敏感性或过敏反应的患者，或治疗与针对壳斗目植物蛋白质、壳斗目植物相关过敏原、桦树花粉或其提取物、或Bet v 1蛋白质的敏感性或过敏反应相关的至少一种症状或并发症的药物中的用途，其中所述针对壳斗目植物蛋白质、壳斗目植物相关过敏原、桦树花粉或其提取物、或Betv 1蛋白质的敏感性或过敏反应得到预防，或其严重程度降低和/或持续时间减少，或与所述针对壳斗目植物蛋白质、壳斗目植物相关过敏原、桦树花粉或其提取物、或Bet v 1蛋白质的敏感性或过敏反应相关的至少一种症状或并发症得到预防或改善，或所述针对壳斗目植物蛋白质、壳斗目植物相关过敏原、桦树花粉或其提取物、或Bet v 1蛋白质的敏感性或过敏反应的频率降低和/或持续时间减少、或严重程度降低。
51.根据权利要求50所述的药物组合物的用途，其中所述桦树花粉提取物选自下组：天然Bet v 1、垂枝桦BPE、河桦BPE及杨叶桦BPE。
52.权利要求23至37中任一项所述的药物组合物的用途，其中所述组合物是与可用于减轻针对壳斗目植物蛋白质、壳斗目植物相关过敏原、桦树花粉或其提取物、或Bet v 1蛋白质的过敏反应的第二治疗剂组合施用。
53.根据权利要求52所述的药物组合物的用途，其中所述桦树花粉提取物选自下组：天然Bet v 1、垂枝桦BPE、河桦BPE及杨叶桦BPE。
54.根据权利要求52所述的药物组合物的用途，其中所述第二治疗剂选自皮质类固醇、支气管扩张剂、抗组胺剂、肾上腺素、解充血剂、另一种不同的抗Bet v 1抗体及肽疫苗。
55.一种治疗表现有针对一种或多种壳斗目植物过敏原的敏感性或过敏反应的患者，或治疗与针对一种或多种壳斗目植物过敏原的敏感性或过敏反应相关的至少一种症状或并发症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的一种或多种根据权利要求1-22中任一项所述的结合Bet v 1的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段；或根据权利要求23-37任一项所述的包括有效量的一种或多种结合至Bet v 1的分离的人单克隆抗体或其片段的药物组合物，其中在施用所述一种或多种结合Bet v 1的分离的人单克隆抗体或其片段之后，或在施用包括了前述抗体中的任一种或多种的组合物之后，所述针对壳斗目植物过敏原的敏感性或过敏反应得到预防，或其严重程度降低和/或持续时间减少，或与所述针对壳斗目植物过敏原的敏感性或过敏反应相关的至少一种症状或并发症得到预防或改善，或所述针对壳斗目植物过敏原的敏感性或过敏反应的频率降低和/或持续时间减少、或严重程度降低。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述一种或多种壳斗目植物过敏原选自下组：Bet v 1、Aln g1、Cor a1、Car b1和Que a1。
57.一种结合至Bet v 1的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与一种或多种选自下组的过敏原交叉反应：Aln g1、Cor a1、Car b1、Que a1、Api g2、Api g1、Dau c1、Mal d1、Ost c1、Fag s1和Cas s1。
58.根据权利要求57所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与一种或多种选自下组的过敏原交叉反应：Aln g1、Mal d1、Api g1、Car b1和Cor a1。
59.根据权利要求57所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以等于或小于10-8M的KD结合至Bet v 1，所述KD是通过表面等离子体共振测量。
60.一种药物组合物，其包括治疗有效量的一种或多种根据权利要求57至59中任一项所述的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。
61.一种增强过敏原特异性免疫疗法(SIT)方案的功效和/或安全性的方法，所述方法包括在即将施用所述SIT方案之前或同时，向有需要的患者施用有效量的一种或多种根据权利要求1-22中任一项所述的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段；或根据权利要求23-37中任一项所述的包括有效量的一种或多种分离的人单克隆抗体或其片段的药物组合物，其中针对所述SIT方案的过敏反应的严重程度减轻。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述SIT方案包括剂量递增阶段，随后是维持阶段。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述SIT方案是紧急SIT方案。
64.根据权利要求1或21所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述BPE是从垂枝桦、河桦或杨叶桦获得。
65.一种药物组合物，其包括治疗有效量的至少两种结合至天然Bet v 1或BPE的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂，其中所述至少两种抗体并不竞争结合天然Bet v 1或BPE。
66.根据权利要求65所述的药物组合物，其包括治疗有效量的至少三种结合至天然Betv1或BPE的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述至少三种抗体并不竞争结合天然Bet v 1或BPE。
67.根据权利要求65所述的药物组合物，其包括治疗有效量的至少四种结合至天然Betv1或BPE的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述至少四种抗体并不竞争结合天然Bet v 1或BPE。
68.根据权利要求65所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ IDNO:146/154和290/298所示的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
69.根据权利要求66所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ IDNO:146/154、290/298和98/106所示的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
70.根据权利要求67所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ IDNO:146/154、290/298、98/106和114/122所示的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
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