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Description
1.細胞培養製品
図1を参照すると、培養細胞のための製品100の概略図が示されている。製品100は、表面15を有する細胞培養基板またはベース材料基板10を備えている。合成ポリマーコーティング層20は細胞培養基板またはベース材料10の表面15の上に配置される。図示しないが、合成ポリマーコーティング20は、細胞培養基板またはベース材料10の一部に配置されうることが理解されよう。細胞培養基板またはベース材料10は培養細胞に適切な任意の材料であって差し支えなく、セラミック物質、ガラス、プラスチック、ポリマーまたは共重合体、それらの任意の組合せ、または、1つの材料の、もう1つの材料の上へのコーティングが挙げられる。これらのベース材料10としては、ソーダ石灰ガラス、パイレックス(登録商標)・ガラス、バイコールガラス、石英ガラスなどのガラス材料;ケイ素;ポリ(塩化ビニル)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(酢酸ビニル−無水マレイン酸)、ポリ(ジメチルシロキサン)モノメタクリレート、環状オレフィンポリマー、フッ化炭素ポリマー、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンイミンなどの樹枝状ポリマーを含めたプラスチックまたはポリマー;ポリ(酢酸ビニル−無水マレイン酸共重合体)、ポリ(スチレン−無水マレイン酸共重合体),ポリ(エチレン−アクリル酸共重合体)またはこれらの誘導体などの共重合体が挙げられる。
図1を参照すると、培養細胞のための製品100の概略図が示されている。製品100は、表面15を有する細胞培養基板またはベース材料基板10を備えている。合成ポリマーコーティング層20は細胞培養基板またはベース材料10の表面15の上に配置される。図示しないが、合成ポリマーコーティング20は、細胞培養基板またはベース材料10の一部に配置されうることが理解されよう。細胞培養基板またはベース材料10は培養細胞に適切な任意の材料であって差し支えなく、セラミック物質、ガラス、プラスチック、ポリマーまたは共重合体、それらの任意の組合せ、または、1つの材料の、もう1つの材料の上へのコーティングが挙げられる。これらのベース材料10としては、ソーダ石灰ガラス、パイレックス(登録商標)・ガラス、バイコールガラス、石英ガラスなどのガラス材料;ケイ素;ポリ(塩化ビニル)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(酢酸ビニル−無水マレイン酸)、ポリ(ジメチルシロキサン)モノメタクリレート、環状オレフィンポリマー、フッ化炭素ポリマー、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンイミンなどの樹枝状ポリマーを含めたプラスチックまたはポリマー;ポリ(酢酸ビニル−無水マレイン酸共重合体)、ポリ(スチレン−無水マレイン酸共重合体),ポリ(エチレン−アクリル酸共重合体)またはこれらの誘導体などの共重合体が挙げられる。
図1Bに示すように、中間層30は、細胞培養基板またはベース材料10の表面15と合成ポリマーコーティング20との間に配置されうる。中間層30は、コーティング20の基板10への結合を向上させるように構成され、モノマーの拡散を促進し、細胞培養表面またはベース材料10のコーティングされていない非付着性の部分を、コーティングした領域の細胞増殖を促し、モノマーまたは溶媒に適合する基板を提供するようにし、ここで、モノマーまたは溶媒はベース材料10に不適合であり、必要に応じて、例えばパターン印刷などを通じて、地形的特徴を提供する。例えば、基板10がガラス基板の場合には、ガラス基板の表面をエポキシコーティングで処理することが望ましいであろう。さまざまなポリマーベース材料10では、ポリアミド、ポリイミド、ポリプロピレン、ポリエチレン、またはポリ(メタ)アクリレートの中間層30を提供することが望ましいであろう。図には示していないが、合成ポリマーコーティング20は、中間層30の一部に配置されうることが理解されよう。中間層30はベース材料10の一部に配置されうることも理解されよう。
ポリペプチド70は、合成ポリマー層20と任意の密度、好ましくは所望の目的のための細胞の培養を支持するのに適切な密度で共役して差し支えない。例えば、ポリペプチド70は、約1pmol/mm2〜約50pmol/mm2の合成ポリマー層20の表面25の密度で、合成ポリマー層20と共役して差し支えなく、この密度は、合成ポリマー層20で均一にコーティングされた実施の形態における、コーティングされたベース材料基板10の表面15の領域によって評価することができる。例えば、ポリペプチドは、合成ポリマー層20の表面が、5pmol/mm2を超える、6pmol/mm2を超える、7pmol/mm2を超える、8pmol/mm2を超える、9pmol/mm2を超える、10pmol/mm2を超える、12pmol/mm2を超える、15pmol/mm2を超える、または20pmol/mm2を超える密度で存在しうる。存在するポリペプチド70の量は、合成ポリマー層20の組成、合成ポリマー層20の厚さ、およびポリペプチド70自体の性質に応じて非常に変化しうることも理解されよう。
さまざまな実施の形態では、ベース材料10の表面15は、表面15に望ましい特性または特徴を与えるように、物理的または化学的に処理される。例えばおよび以下に論述するように、表面15はコロナ処理またはプラズマ処理されうる。真空プラズマまたは大気圧プラズマの例としては、高周波RFおよび1次および2次の両方のマイクロ波プラズマ、誘電体バリア放電、および、空気、酸素、窒素、アルゴン、二酸化炭素、酸化窒素、または水蒸気を含めた分子ガスまたは混合ガス中で発生するコロナ放電が挙げられる。
合成ポリマーコーティング層20は、中間層30またはベース材料10に配置されるか否かにかかわらず、下地基板を均一にコーティングすることが好ましい。「均一にコーティングする」とは、例えば培養プレートのウェル表面など、所定の領域における層20が、約5nm以上の厚さで、その領域を完全にコーティングすることを意味する。複数の実施の形態では、均一にコーティングした表面の厚さは表面上で変化しうるが、下地層(中間層30またはベース材料10のいずれか)が曝露される均一にコーティングした表面領域は存在しない。均一ではない表面上での細胞応答は、均一な表面上での細胞応答よりも変化し易い傾向にある。
非常に多くの実施の形態において、製品100は、ペトリ皿、マルチウェルプレート、スライド、フラスコ、多層フラスコ、ビーズ、バイオリアクター、袋およびビーカーまたは細胞培養に適切な表面を有する他の製品など、従来の細胞培養製品である。図2を参照すると、ベース材料10から形成される製品100は、1つ以上のウェル50を含みうる。ウェル50は、側壁55および表面15を備える。合成ポリマーコーティング20は、表面15上に配置されうる(もしくは、図1に関して上述したように、1つ以上の中間層30が表面15および合成ポリマーコーティング20の間に配置されてもよい)。図には示していないが、側壁55は、合成ポリマー層20でコーティングされて差し支えないことが理解されよう。ウェルは、例証する目的で図2に示されているが、合成ポリマー層20は細胞培養に適切な任意の表面上に存在して差し支えないことが理解されよう。
複数の実施の形態では、合成ポリマー層は膨潤性の(メタ)アクリレート(SA)層でありうる。さまざまな実施の形態では、合成ポリマー層は細胞培養製品の表面に付着しうる。本開示の目的では、「付着する」とは、合成ポリマー層が、水性培地への曝露を含めた正常な細胞培養条件に曝露する際にベース材料から剥離しないように、ベース材料または基板上にコーティングまたは積層することを意味する。合成ポリマー層は、共有結合性または非共有結合性の相互作用を介して基板に付着させて差し支えない。合成のSA表面を基板と結び付けうる非共有結合性の相互作用の例としては、化学吸着、水素結合、表面の相互浸透、イオン結合、ファン・デル・ワールス力、疎水性相互作用、双極子間相互作用、機械的インターロック、およびそれらの組合せが挙げられる。
図3に示す方法には、任意の適切な溶媒を使用して差し支えない。さまざまな実施の形態では、溶媒は揮発性溶媒である。本明細書では、揮発性溶媒は、約120℃未満、約100℃未満、約90℃未満、または約85℃未満の沸点を有する溶媒である。例えば、揮発性溶媒は、約34℃〜約120℃、約50℃〜約100℃、または約70℃〜約85℃の沸点を有しうる。揮発性溶媒の例としては、アセトン、メタノール、酢酸エチル、エタノール、ブタノン、アセトニトリル、2−プロパノール,および2−ブタノールが挙げられる。揮発性溶媒は、室温で容易に蒸発でき、合成ポリマー表面の生成に用いるモノマーに適合可能であり、フリーラジカル重合を妨げず、かつ、培養する細胞に対して非毒性であることが好ましい。揮発性溶媒は、ジメチルホルムアミドまたはジメチルスルホキシドなど、非揮発性成分を含んでいてもよい。揮発性溶媒が非揮発性成分を含む場合には、非揮発性成分は約10重量%未満の量に抑えることが好ましい。本明細書に記載される方法に従って用いられる溶媒は、培養製品100のベース材料10に対して貧溶媒であることが好ましい。
適切な種類の揮発性溶媒の代表的な例は、エタノール溶媒である。本明細書では「エタノール溶媒」とは、約75%を超えるエタノールを有する溶媒を意味する。例えば、エタノール溶媒は、80%を超える、90%を超える、95%を超える、97%を超える、または99%を超える、エタノールを含みうる。さまざまな実施の形態では、エタノール溶媒は、実質的にエタノールからなる。一部の実施の形態では、エタノール溶媒は、実質的に、エタノールおよび水からなる。エタノール溶媒の使用は、溶媒を使用しない場合よりも、1つ以上の利点をもたらしうる。例えば、エタノール溶媒の使用は、モノマーの粘度を低減し、製剤過程における自動計装の使用を可能にする。効率は、溶媒を使用しない場合と比較して10倍も増大しており、高スループット材料スクリーニングを可能にした。エタノール溶媒の使用は、モノマーの拡散を促進し、自動化液体操作機器を使用して、小さいまたは大きい表面積のための、薄く、均一なコーティングを達成し、コーティング効率を向上させる。エタノール溶媒の使用はまた、コーティング方法に使用するモノマーの量も軽減し、最終的なコーティング厚さを低下させる。これは、モノマーの消費を軽減することによって、費用も軽減できると同時に、培養培地と接触した後、重合および膨潤する間のコーティングにおける応力も軽減し、最終的にはコーティングの剥離を低減する。エタノール溶媒は生物医学的および薬学的方法に用いられていることから、他の溶媒と比較して、エタノール溶媒は、治療用の細胞または組織のための細胞培養製品の製造にとって安全である可能性が高い。さらには、エタノール溶媒は、米国薬局方の規格グレードで市販されており、極真空または加熱などの厳しい条件を用いずに、コーティング処理の間に蒸発または別の方法で除去し易く、大多数の(メタ)アクリレート・モノマーにとって良好な溶媒であると同時に、細胞培養製品のベース材料に用いられる多くのポリマーにとって貧溶媒である。加えて、エタノールはフリーラジカル重合の際に比較的不活性であるように思われる。したがって、コーティングのその後の重合におけるエタノール溶媒の副次的な悪影響は最小限に抑えられることが分かっている。2−プロパノール溶媒はエタノール溶媒の上記利点の多くを共有する。
さまざまな実施の形態では、合成ポリマー表面20は、ベース材料10の表面15上に1種類以上のモノマーを堆積することによって生成され、次いで、1種類以上のモノマーをその場(in situ)重合する。これらの実施の形態では、ベース材料10は、本明細書では「基板」と称され、その上に合成ポリマー材料20が堆積する。合成ポリマー表面20は、共有結合性または非共有結合性の相互作用を介してベース材料表面15と結合しうる。合成ポリマー表面を基板と結合しうる非共有結合性の相互作用の例としては、化学吸着、水素結合、表面の相互浸透、イオン結合、ファン・デル・ワールス力、疎水性相互作用、双極子間相互作用、機械的インターロック、およびそれらの組合せが挙げられる。
さまざまな実施の形態では、合成ポリマー表面20は、直接または1つ以上の追加の中間層(図示せず)を介して、共有結合性または非共有結合性の相互作用を介してベース材料10と結合する中間層30の表面上に堆積する。これらの実施の形態では、中間層30は、本明細書では、その上に合成ポリマー表面20が堆積する「基板」と称されよう。
さまざまな実施の形態では、ベース材料10の表面15は処理を受ける。表面15は、合成ポリマー表面10のベース材料表面15への結合の向上、ベース材料表面15上におけるモノマーの拡散の促進などを目的として、処理されうる。当然ながら、ベース材料10も、中間層30と同様の目的で処理されうる。さまざまな実施の形態では、表面は、コロナ処理またはプラズマ処理される。これらの処理から得られる高い表面エネルギーは、モノマーの拡散および均一コーティングを促進しうる。
重合後にさまざまな物理的性質をもたらす、さまざまなモノマーを対照とするように、一連のモノマー製剤を選択した。高度に架橋したポリマーのための製剤には、TEGDA、GDMA、およびBDMAを含めた。膨潤性の(メタ)アクリレートポリマーのための製剤はSA02であった。これらの製剤を表6に示す。12種類の選択溶媒における4つの製剤の溶解性を表7に記載する。結果は、ヘキサンおよび水は、高度に架橋した(メタ)アクリルポリマーとなる製剤にとって適切ではないが、一方、エチルエーテルおよびヘキサンは膨潤性の(メタ)アクリレート製剤にとって適切ではないことを示唆した。ヘキサンを除くすべての溶媒はまた細胞培養容器のベース材料として用いられる環状オレフィン共重合体に関して不活性であった。
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