JP2011501961A - ストレプトマイセスプロテアーゼ - Google Patents

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Abstract

本発明はストレプトマイセスセリンプロテアーゼを提供する。幾つかの態様において、このプロテアーゼは本発明の野生型ストレプトマイセス１ＡＧ３プロテアーゼに対して少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明は単離された核酸配列、組換え核酸、及びこの組換え核酸を含む宿主細胞も提供する。更に、本発明はストレプトマイセスセリンプロテアーゼを含む洗浄組成物及び他の組成物も提供する。
【選択図】図１

Description

本発明は２００７年１０月３０日に出願された、米国特許出願Ｎｏ．１１／９２９，８１７、タイトル「プトレプトマイセスプロテアーゼ」に対して優先権を主張する。
本発明はストレプトマイセスセリンプロテアーゼを提供する。幾つかの態様において、このプロテアーゼは本発明の野生型ストレプトマイセス１ＡＧ３プロテアーゼに対して少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明は単離された核酸配列、組換え核酸、及びこの組換え核酸を含む宿主細胞も提供する。更に、本発明はストレプトマイセスセリンプロテアーゼを含む洗浄組成物及び他の組成物も提供する。
セリンプロテアーゼは、広範囲の特異性と生物学的機能をもつ酵素群の１の特徴的な種類の下位群（ｓｕｂｇｒｏｕｐ）である（Ｓｔｒｏｕｄ,Ｓｃｉ.Ａｍｅｒ.,１３１：７４-８８［１９７４］参照）。その機能的な多様性にも拘わらず、セリンプロテアーゼの触媒的な作用機構は、少なくとも２種の遺伝子学上別の種（family）の酵素により代表される。１）スブチリシン（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）、及び２）哺乳類キモトリプシンの類縁で相同の細菌セリンプロテアーゼ（例えば、トリプシン）である。これらの２種のセリンプレテアーゼは顕著に類似する触媒機構を示す（例えば、Ｋｒａｕｔ, Ａｎｎ.Ｒｅｖ.Ｂｉｏｃｈｅｍ．,４６：３３１−３５８［１９７７］参照）さらに、一次構造には関連性がないが、これらの２種の酵素の三次構造は、セリン、ヒスチジン及びアスパラギン酸からなる触媒機能をもつ３アミノ酸が触媒トリオを形成している。一方、スブチリシンとキモトリプシンの類縁セリンプロテアーゼ群の両者はアスパラギン酸、ヒスチジン及びセリンを含む触媒機能をもつ３アミノ酸をもつ。スブチリシン類縁のプロテアーゼでは、これらのアミノ酸の相対的配列順序は、アミノ基末端からカルボキシ基末端へ向けて、アスパラギン酸―ヒスチジン−セリンである。しかし、キモトリプシン類縁プロテアーゼでは、相対的な順序は、ヒスチジン−アスパラギン酸−セリンである。多くは、その洗浄剤及び飼料用途における有用性から、多くの研究がスブチリシリンについてなされてきた。種々の用途におけるこれらの酵素の機能に悪い影響を及ぼし得る、不利な環境条件（例えば、酸化剤、キレート剤、極端な温度及び/又はｐＨへの暴露）についても研究が重ねられてきた。それにもかかわらず、これらの悪条件に耐えることができ、かつ本願技術分野で現在知られている活性を保持または改善できる酵素系に対する要求は、本願技術分野において依然残っている。
単離されたセリンプロテアーゼ、及びこれを含む洗浄組成物を提供する。幾つかの態様において、このプロテアーゼは野生型ストレプトマイセス１ＡＧ３（配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）９）と同一である。あるいは、このプロテアーゼは変異体である。幾つかの態様において、このプロテアーゼは野生型ストレプトマイセス１ＡＧ３に対して少なくとも約８０％同一である。幾つかの態様において、この単離されたセリンプロテアーゼはこの野生型ストレプトマイセス１ＡＧ３に対して少なくとも１つのアミノ酸が置換されている。これらの態様のいくつかにおいて、単離されたセリンプロテアーゼは野生型ストレプトマイセス１ＡＧ３よりも基質特異性が変化しており、野生型ストレプトマイセス１ＡＧ３に対して、変異したｐＩ、酸安定性、熱安定性、カゼイン加水分解、ケラチン加水分解、洗浄性能、及び／又はＬＡＳ安定性が改善されている。
この単離されたセリンプロテアーゼをコードする単離核酸配列も提供される。これらの態様において、この単離された核酸はａ）過酷なハイブリダイズ条件下でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８をハイブリダイズする、及び／又はｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に少なくとも７０％同一である。
この単離された核酸を含む組換えポリヌクレオチドも提供される。幾つかの態様において、この組換えポリヌクレオチドは作動可能な結合中に、プロモーターと単離された核酸とを含む。幾つかの態様において、このプロモーターは単離された核酸に対して異種のものである。即ち、野生型ストレプトマイセス１ＡＧ３のプロモーターではない。幾つかの態様において、このプロモーターは野生型ストレプトマイセス１ＡＧ３のプロモーターである。幾つかの追加的な態様において、この組換え核酸は宿主細胞から単離されたセリンプロテアーゼを分泌させる（即ち、この組換え核酸は分泌のための単離されたセリンプロテアーゼを標的とするシグナル配列コード領域を含む）。組換え核酸を含む発現ベクターも提供される。
本発明はこの組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞も提供する。幾つかの態様において、この宿主細胞はバチルス種、ストレプトマイセス種、アスペルギスル種、及びトリコデルマ種から選択される。幾つかの態様において、この組換えポリヌクレオチドはこの細胞の発現ベクター内に存在する。あるいは、この組換えポリヌクレオチドは宿主細胞のゲノム中に存在する。（即ち、宿主細胞のゲノム中に取り込まれている。）幾つかの態様において、この宿主細胞は単離されたセリンプロテアーゼを生成するための方法に用いられる。幾つかの態様において、この方法は単離されたセリンプロテアーゼの生成に好適な条件下で、宿主細胞を培養する工程を含む。幾つかの代替的な態様において、この方法は更に単離されたセリンプロテアーゼを回収する工程も含む。幾つかの態様において、このプロテアーゼは培養培地に分泌される。幾つかの追加的な態様において、この方法は更に培養培地からこのプロテアーゼを回収する工程も含む。
この単離されたセリンプロテアーゼを含む洗浄組成物も提供される。幾つかの態様において、この洗浄組成物は更に、界面活性剤を含む。幾つかの態様において、この界面活性剤はエチレン酸化部分を含むアルキル硫酸ナトリウムである。幾つかの態様において、この洗浄組成物は重量により約０．００１％乃至約０．５％の単離されたセリンプロテアーゼを含む。幾つかの態様において、洗浄組成物はｐＨ調整剤を含み、約３乃至約５の正味ｐＨを有する組成物を提供する。この洗浄組成物は約３乃至約５のｐＨで加水分解する物質を含んでいない。幾つかの好適な態様において、この洗浄組成物は洗濯用洗剤及び／又は食器用洗剤、及び／又は硬表面洗浄組成物として製剤化される。幾つかの態様において、主題のプロテアーゼに加えて、この洗浄組成物は、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、マンナナーゼ、ペクチナーゼ、クチナーゼ、オキシダーゼ、ヘミセルラーゼ、及び／又はセルラーゼから選択される少なくとも１つの追加的な酵素を含む。幾つかの態様において、この洗浄組成物は少なくとも１つの安定性を更に含む。幾つかの好適な態様において、この安定化剤はホウ砂、グリセロール、及び／又は競合インヒビターである。幾つかの態様において、この安定剤はアニオン界面活性剤に対して本発明の単離されたセリンプロテアーゼを安定化する。洗浄組成物は固形、液体、エアロゾル、及び／又はゲルを含むがこれらに限定されない好適な形態で提供される。
本発明の洗浄組成物は、洗浄方法に用いる。幾つかの態様において、この方法は洗浄目的物を洗浄するための洗浄組成物と接触させる。幾つかの態様において、この方法は更に目的物を洗浄及び／又はすすぐ工程も含む。例示的な態様において、この目的物は布（例えば、衣類）、又は食器類（例えば、皿類）である。
本発明はこの単離されたセリンプロテアーゼを含む動物飼料も提供する。
図１は１ＡＧ３遺伝子の構造図である。 図２は１ＡＧ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）由来ポリペプチド配列のアラインメントを提供する。 図３は成熟１ＡＧ３プロテアーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）の成熟型とストレプトグリシン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）のアラインメントを提供する。この図において、活性部位アミラーゼの配列（ｈｉｓ−ａｓｐ−ｓｅｒ）は太字で提供され、特徴的な３つのジスルフィド結合は結合線で示す。 図４は１ＡＧ３プロテアーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）及びＡＳＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）のアラインメントを示す。 図５は１ＡＧ３プロテアーゼの成熟（即ち、触媒ドメイン）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）及びＡＳＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）のアラインメントを提供する。 図６はｐＳＥＡ４ＣＴ−１ＡＧ３発現構築体のマップを示す。 図７は２０℃、ｐＨ８．２における液体洗剤中で試験された１ＡＧ３プロテアーゼに対する投与反曲線を提供する。 図８は３０℃、ｐＨ６．０における液体洗剤中の１ＡＧ３プロテアーゼの投与反応曲線を提供する。
発明の詳細な説明
本発明は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）由来の、新規なプロテアーゼ、これをコードする新規な物質、及びタンパク質分解タンパクを提供する。幾つかの態様において、新たに開示されたストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種から得られたプロテアーゼ組成物、このプロテアーゼをコードしているＤＮＡ、このプロテアーゼをコードしているＤＮＡを含むベクター、このベクターＤＮＡで形質転換された宿主細胞、及びこの宿主細胞により生産された酵素が提供される。本発明の幾つかの態様は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種から得られたプロテアーゼを含む、洗浄組成物（例えば、洗剤）、動物飼料、及び布及び皮製品処理組成物も提供する。代替的な態様において、本発明は本明細書で述べる野生型プロテアーゼ由来の変異プロテアーゼ（即ち、変異体）を提供する。これらの変異プロテアーゼは数多くの製品に使用することができる。
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）はストレプトマイセス科（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）、ストレプトマイセス亜目（Ｓｕｂｏｒｄｅｒ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎｅａｅ）アクチノマイセタレス目（Ｏｒｄｅｒ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）、アクチノバクテリア網（Ｃｌａｓｓ Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）ファミリーのメンバーとしてグラム陽性バクテリアに分類される。ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）は広範囲に分岐した一次菌糸又は基質菌糸及び豊富な気中菌糸として成長し、成熟したときに特徴的な胞子を形成する。ストレプトマイセスは幅広いバリエーションの多くのストレプトマイセス種から分泌されるセリンプロテアーゼである。ストレプトマイセスプロテアーゼのアミノ酸配列は、ストレプトマイセスグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）ストレプトグリシンＣ（Ｓｔｒｅｐｔｏｇｒｉｓｉｎ Ｃ）（信託番号Ｐ５２３２０）；ストレプトマイセス由来（信託番号ＰＣ２０５３）アルカリプロテイナーゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）（ＥＣ３４２１．-）；ストレプトマイセス由来アルカリセリンプロテイナーゼＩ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅI）（信託番号Ｓ３４６７２）；ストレプトマイセスリビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）由来セリンプロテアーゼ（信託番号ＣＡＤ４２０８）；ストレプトマイセスコエリコラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来成熟セリンプロテアーゼＡ３（２）（信託番号ＮＰ_６２５１２９）；ストレプトマイセスアベミチリンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）由来成熟セリンプロテアーゼＭＡ−４６８０（信託番号ＮＰ_８２２１７５）；ストレプトマイセスリイダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）由来セリンプロテアーゼ（信託番号ＣＡＤ４２８０９）；ストレプトマイセスコエリコラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来成熟セリンプロテアーゼ前駆体ＳＡ３（２）（信託番号ＮＰ_６２８８３０）を含む９つの異なるストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種から決定されている。生成された天然のアルカリセリンプロテアーゼは１９，０００の見かけの分子量を有し、ストレプトマイセスグリセウスアルカリフィリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ ｖａｒ． ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ）から単離され、これを含む洗浄組成物が開示されている（例えば、米国特許第５，６４６，０２８号、参照により本明細書に援用）。追加的な株も湖水及び堆積物から単離された。この株は１ＡＧ３株とされた。ウォーターカラム及び堆積物の温度は１９乃至２３℃であり、ｐＨは１０．５であった。この水の電導性は２６．１ｍＳｃｍ−１であった。
本明細書で説明する幾つかのプロテアーゼ酵素は好適な安定性及びタンパク質分解活性を有している。これらの酵素は各種製品に用いられている。例としては、洗剤、動物飼料、布及び皮製品処理剤を含むがこれらに限定されない。本発明はこれらの酵素を生成する手段も提供する。幾つかの態様において、本発明のプロテアーゼは精製、又は相対的に精製されている。
幾つかの態様において、本発明は組換え有機体において本発明のプロテアーゼを生産するのに好適な核酸配列も提供する。幾つかの態様において、組換え生成物は商業的に利用可能な量プロテアーゼを生産する手段を提供する。
別途記載が無い限り、本願発明の実施は、分子生物学、微生物学及び組換えＤＮＡで普通に使用されている従来の技術であり、本願技術分野に含まれる技術を用いている。そのような技術は本願技術分野の技術者に知られ、多くのテキストや参考文献に記載されている。本明細書に記載した全ての特許、特許出願、論文及び出版物は、既述の又はこれ以降に記載するもの両者ともに、引用により本明細書に明確に組み入れられる。
本明細書で別途記載が無い限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本願発明が属する技術分野の通常の技術をもつ者により一般的に理解されているのと同一の意味をもつ。本明細書記載されたものに類似するまたは同等の方法や材料は本願発明の実施に用いることができるが、好ましい方法と材料は本明細書に記載されている。従って、直ぐ後に定義される用語は、全体として本明細書を参照することにより、より十分に明らかにされる。また、本明細書では、単数で記載されていても、文脈が明らかに単数を示す場合のほかは、複数のものを示す。数値の範囲はその範囲を定義する数字を含む。別途記載が無い限り、核酸は、左から右へ、５’から３’の方向へ、アミノ酸配列は左から右へ、アミノ基からカルボキシ基の方向へそれぞれ記載されている。本発明は、記載されている特定の方法論、実験手順及び試薬に限定されず、これらのものが本願発明分野の技術者により、使用される状況により変わり得ることを理解すべきである。
本願発明の実施は、別途記載が無い限り、タンパク質の精製、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術及びタンパク質のアミノ酸配列決定を用いるが、これらは全て本願技術分野の技術に属する。
さらに、本願明細書に記載された見出しは、全体として本明細書を参照することにより得られる発明の種々の側面又は実施態様を限定するものではない。従って、直ぐ後に定義される用語は全体として明細書を参照することにより十分にされる。それにもかかわらず、本発明の理解を促進するために、多くの用語が下記に定義される。米国特許出願Ｎｏ．１０／５７６，３３１に与えられている定義も加えられる。これらの出願は引用により全体が組み入れられる。
Ｉ．定義
本明細書に使用する場合、用語「プロテアーゼ」と「タンパク質分解活性」はペプチド又はペプチド結合をもつ基質を加水分解する能力を示すタンパク質又はペプチドをいう。タンパク質分解活性を測定するために多くの良く知られた方法がある。例えば、タンパク質分解活性は市販されている基質を加水分解するそれぞれのプロテアーゼの能力を分析する比較分析により確認しても良い。プロテアーゼまたはタンパク質分解活性の分析に有用な基質の例は、ジメチルカゼイン（シグマＣ−９８０１）、ウシのコラーゲン（シグマＣ−９８７９）、ウシエラスチン（シグマＥ−１６２５）及びウシのケラチン（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ９０２１１１）があるが、これらに限定されない。これらの基質を利用する色度分析は本願技術分野で良く知られている。（例えば、ＷＯ９９／３４０１１及び米国特許第６，３７６，４５０号参照。両者は引用により本明細書に組み入れられる。）ｐＮＡ分析（例えば、Ｄｅｌ Ｍａｒら、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９９：３１６−３２０［１９７９］参照）は、グラジエント溶出により収集された分画の活性酵素濃度を決定する際にも用いられる。この分析法は、酵素が可溶性の合成基質、コハク酸−アラニン−アラニン−プロリン−フェニルアラニン−p-ニトロアニリド（ｓＡＡＰＦ−ｐＮＡ）を加水分解するときにp-ニトロアニリンが遊離される速度を測定する。加水分解反応から黄色の生成速度は、分光光度計で４１０ｎｍで測定され、かつ活性な酵素濃度に比例する。加えて、２８０ｎｍでの吸光度測定は総タンパク質濃度を決定するために使用できる。活性酵素/総タンパク質比は酵素純度を与える。
本明細書において、「１ＡＧ３」株は、本発明の１つの態様のプロテアーゼを意味する。野生型プロテアーゼは、本明細書で説明するように、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）１ＡＧ３株から単離された。幾つかの態様において、本発明は２５６アミノ酸のポリペプチドを含むプロテアーゼの活性形態を提供する。
「ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）プロテアーゼ相同体」はストレプトマイセス株１ＡＧ３由来の成熟プロテアーゼと実質的に相同なポリヌクレオチド配列及び／又は自然発生プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド配列を有する自然発生プロテアーゼを意味する。これらのプロテアーゼはそのような核酸によりコードされるセリンプロテアーゼの機能的な性質を有している。
本明細書で使用されているように、用語「ＡＳＰプロテアーゼ」、「Ａｓｐプロテアーゼ」と「Ａｓｐ」はＰＣＴ Ｓｅｒ．Ｎｏｓ．ＵＳ０４／３９００６及びＵＳ０４／３９０６６に記載のセリンプロテアーゼをいう。幾つかの好ましい実施態様では、Ａｓｐプロテアーゼは本明細書では、セルロモナス株（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）６９Ｂ４から得られる６９Ｂ４プロテアーゼとして意図されているプロテアーゼである。つまり、好ましい実施態様では、用語「６９Ｂ４プロテアーゼ」は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で与えられているものと実質的に同一のアミノ酸配列をもつセルロモナス株（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ株）６９Ｂ４（ＤＳＭ １６０３５）由来の天然の成熟したプロテアーゼをいう。別の実施態様では、本願発明は、ASPプロテアーゼの一部分を与える。
用語「セルロモナスプロテアーゼ相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）」は、セルロモナス株６９Ｂ４由来の成熟したプロテアーゼと実質的に同一のアミノ酸配列をもつ天然のプロテアーゼ、またはそのような天然のプロテアーゼをコードしたポリヌクレオチド配列であって、そのプロテアーゼがそのような核酸によりコードされたセリンプロテアーゼの機能的特徴を保持しているものをいう。幾つかの実施態様では、これらのプロテアーゼ相同体は「セルロモナディンス（ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｄｉｎｓ）」といわれている。
明細書で使用する場合、用語「ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）１ＡＧ３変異体」、「ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）プロテアーゼ変異体」、及び「１ＡＧ３変異体」は、野生型のストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）１ＡＧ３プロテアーゼと、特にその機能において類似し、しかし野生型のプロテアーゼと配列を異なったものにするアミノ酸配列の突然変異（つまり、置換）をもつプロテアーゼに関して使用されている。
本明細書において、「ＡＳＰ変異体」、「ＡＳＰプロテアーゼ変異体」、及び「９６Ｂプロテアーゼ変異体」の語は、野生型のＡＳＰと、特にその機能において類似し、しかし野生型のプロテアーゼと配列を異なったものにするアミノ酸配列の突然変異（つまり、置換）をもつプロテアーゼに関して使用されている。
本明細書において、「セルロモナス種（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｓｐ）」は、放線細菌綱（Ｃｌａｓｓ Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、放線菌目（Ｏｒｄｅｒ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）、ミクロコッカス亜目（Ｓｕｂｏｒｄｅｒ Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｉｎｅａｅ）、セルロモナス科（Ｆａｍｉｌｙ Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）として分類されるグラム陽性菌である、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属に属する種の全てをいう。セルロモナス属は分類学の再編成を継続して受けていることが知られている。よって、この属は、再編成された種を含むことが予定されている。
本明細書では「ストレプトマイセス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｓｐ）」は、放線細菌綱（Ｃｌａｓｓ Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、放線菌目（Ｏｒｄｅｒ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）、ストレプトマイセス亜目（Ｓｕｂｏｒｄｅｒ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎｅａｅ）、ストレプトマイセス科（Ｆａｍｉｌｙ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）として分類されるグラム陽性菌である、「ストレプトマイセス」属に属する種の全てをいう。ストレプトマイセス属は分類学の再編成を継続して受けていることが知られている。よって、この属は、再編成された種を含むことが予定されている。
本明細書では、「バチルス属（ｇｅｎｕｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ）」は、「バチルス属（ｇｅｎｕｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ）」に属する全ての種を含み、本願技術分野の技術者に知られているところでは、B.スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロテルモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィラス（Ｂ．ａｌｋａｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．クラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ラウタス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）及びＢ．スリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）が含まれるが、これらに限定されない。バチルス属（ｇｅｎｕｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、分類学の再編成を継続して受けていることが知られている。よって、この属は、現在、「ゲオバチルス ステアロテルモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）」と命名されているＢ．ステアロテルモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のような生物種を非限定的に含む再編成された種を含むことが予定されている。酸素存在下で耐性をもつ内胞子の産生、この特徴は、最近命名された、アリシクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アンフィバチルス（Ａｍｐｈｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アネウリニバチルス（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アノキシバチルス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、フィロバチルス（Ｆｉｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、グラシリバチルス（Ｇｒａｃｉｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ハロバチルス（Ｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、サリバチルス（Ｓａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、テルモバチルス（Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ウレバチルス（Ｕｒｅｂａｃｉｌｌｕｓ）及びビルギバチルス（Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ）にもあてはまるが、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の特徴を定めるものと考えられている。
用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、本明細書では相互に入れ替えて使用されているが、どのような長さであれ、ヌクレオチドの重合体であり、リボヌククレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの重合体である。これらの用語は、単鎖の、二重鎖の、又は三重鎖ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＡＮ−ＲＮＡハイブリッド体、又はプリンとピリミジン塩基を含むポリマー又は他の天然の、化学的に、生化学的に修飾された、非天然型又は誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むがこれらに限定されない。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である。遺伝子、遺伝子断片、染色体断片、発現遺伝子標識群（ＥＳＴ）、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボゾーム、ｃＤＮＡ、組換ポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、いずれかの配列の単離されたＤＮＡ、いずれかの配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマー。幾つかの実施態様では、ポリヌクレオチドは修飾されたヌクレオチドを含む。例えば、メチル化されたヌクレオチド及びヌクレオチド類似化合物、ウラシル、他の糖及びフッ化リボースとチオエート（ｔｈｉｏａｔｅ）のような結合基を含む。別の実施態様では、ヌクレオチドの配列はヌクレオチドではない成分により中断される。
本明細書において、「ＤＮＡ構築物」及び「ＤＮＡの軽質転換」の語は宿主細胞又は有機体に配列を導入するために用いるＤＮＡを意味するために互換的に使用される。このＤＮＡはＰＣＲによりｉｎ ｖｉｔｒｏで生成されるか又は当業者に知られている他の好適な方法で生成される。特に好適な態様において、ＤＮＡ構築物は所望の配列を含む（例えば、挿入配列として）。幾つかの態様において、この配列は制御エレメント等（例えば、プロモーター）の付加的なエレメントに作動可能に結合している。更なる好適な態様において、この軽質転換しているＤＮＡは末端に付加している非相同配列を含む（例えば、スタッファー配列又はフランク）。幾つかの態様において、挿入配列の末端を閉じて、軽質転換ＤＮＡが閉鎖環を形成する。この軽質転換は配位野生型であってもよく、変異体又は修飾されていてもよい。幾つかの態様においてＤＮＡ構築物は宿主細胞染色体に相同な配列を含み。他の態様において、このＤＮＡ構築物は非相同配列を含む。一旦ＤＮＡ構築物がｉｎ ｖｉｔｒｏで構築されると、それは、１）異種の配列を宿主細胞の所望の標的配列に挿入するため、及び／又は２）宿主細胞の染色体の領域を変異させるため（即ち、内性の配列を異種の配列で置換る）、及び／又は３）標的遺伝子を欠失させるため、及び／又は４）宿主細胞に組換えプラスミドを導入するために用いられる。
本明細書において、「発現カセット」及び「発現ベクター」の語は、標的細胞内で特定の核酸の転写をさせることができる一連の特定の核酸エレメントで、組み得て的又は合成的に生成された核酸構築物を意味する。この組み換え発現カセットはプラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸フラグメントに取り込まれる。通常、発現ベクターの組換え発現か設置部分は、他の配列の中で、転写される核酸配列及びプロモーターを含む。好適な態様において、発現ベクターは宿主細胞内でヘテロＤＮＡを取り込み発現する能力を有している。多くの真核及び原核発現ベクターが市販されている。好適な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内である。「発現カセット」の語は、「ＤＮＡ構築物」と同じ意味に用いられ、これらの語は同義である。適切な発現ベクターの選択は当業者の知識の範囲内である。
本明細書において、「ベクター」の語は核酸を１つ以上のタイプの細胞に導入するために設計されたポリヌクレオチド構築物を意味する。ベクターはクローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、及びカセット等を含む。幾つかの態様において、このポリヌクレオチド構築物は、適した宿主の中でＤＮＡの発現に影響を与えることができる好適なプロ配列（例えば、分泌等）に作動可能に結合しているプロテアーゼ（例えば、プロテアーゼ前駆体及び成熟プロテアーゼ）をコードするＤＮＡ配列を含む。
本明細書において、「プラスミド」の語は、クローニングベクターとして用いる環状二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ構築体であり、種々の原核及び真核生物内で染色体外自己複製遺伝子要素を形成し、又は他の宿主細胞に組み込むことができるものを意味する。
本明細書において、核酸配列を宿主細胞に導入する意味で用いられる、「導入する」の語は宿主細胞に核酸配列を輸送するのに適した任意の方法を意味する。そのような導入するための方法は、プロトプラスト融合、形質感染、形質変換、結合、及び形質導入を含むがこれらに限定されない（例えば、Ｆｅｒｒａｒｉら、「Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，」ｉｎ Ｈａｒｄｗｏｏｄら偏、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．，５７−７２頁，［１９８９］参照）。
細胞に対して用いる「形質転換された」、「安定に形質転換された」又は「遺伝子導入された」の語は、そのゲノム内に、又は少なくとも２世代にわたり維持されているエピソームプラスミドとして、組み込まれている本発明の異種核酸配列を有する細胞を意味する。
本明細書において、「選択可能マーカーコードヌクレオチド配列」の語は、宿主細胞中で発現することができるヌクレオチド配列を意味し、この選択マーカーの発現は発現された遺伝子を含む細胞を対応する選択因子の存在下で、又は必須栄養素の不存在下で育成させることができる。
本明細書において、「選択マーカー」の語は宿主細胞中で発現することができる核酸（例えば、遺伝子）を意味する。この宿主細胞はベクターを含む宿主細胞の場合も含む。そのような選択マーカーの例としては、構成物質を含むがこれらに限定されない。従って、「選択マーカー」の語は宿主細胞が所望のインカミングＤＮＡを取り込み、又は幾つかの反応が生じる指標を提供する遺伝子を意味する。通常、選択マーカーは遺伝子であり、これは構成物質耐性又は代謝的利点を宿主細胞に与えて、外来ＤＮＡを含む細胞を成長させて、形質転換において任意の外来配列を授与しなかった細胞と区別することができる。「再設計された選択可能マーカー」の語は、形質転換される微生物の染色体上に位置しているものである。再設計された選択可能マーカーは形質転換するＤＮＡ構築体上の選択マーカーとは異なる遺伝子をコードする。選択マーカーは当業者によく知られている。前述のように、マーカーは抗生物質耐性遺伝子である（例えば、ａｍｐＲ；ｐｈｌｅｏＲ；ｓｐｅｃＲ； ｋａｎＲ；ｅｒｙＲ；ｔｅｔ１１；ｃｍｐＲ；及びｎｅｏＲ；例えば、Ｇｕｅｒｏｔ−Ｆｌｅｕｒｙ，Ｇｅｎｅ，１６７：３３５−３３７［１９９５］；Ｐａｌｍｅｒｏｓら、Ｇｅｎｅ ２４７：２５５−２６４［２０００］；及びＴｎｅｕ−Ｃｕｏｔら、Ｇｅｎｅ，２３：３３１−３４１［１９８３］参照）。他のマーカーは、トリプトファン等の栄養要求性及びβグルコシダーゼ等の欠失マーカーである。
本明細書で用いる「プロモーター」の語は、下流遺伝子の転写に直接機能する核酸配列を意味する。プロモーターは通常、所望の遺伝子を発現させる宿主細胞に適したものである。プロモーターと共に、他の転写及び転写調節核酸配列が所与の遺伝子の発現に必要である。通常、転写及び転写調節遺伝子はプロモーター配列、リボゾーム結合部位、転写開始剤及び停止配列及びエンハンサー並びに活性因子配列を含むがこれらに限定されない。
「作動可能に結合する」の語は、複数の核酸配列がお互いに機能的な位置に置かれていることを言う。例えばＤＮＡコード配列がこの配列の転写に影響をするならば、プロモーターは作動可能に結合している。通常「作動可能」とは、結合されるＤＮＡ配列が隣接していることを意味し、分泌リーダーの場合、結合されるＤＮＡが隣接しておりかつ読みとり枠内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは必ずしも連続している必要はない。結合は好適な制限酵素認識部位で連結することにより達成される。そのような部位が存在しない場合、当該技術分野においては合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが用いられる。
本明細書では、用語「遺伝子」は、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ断片）をいい、ポリペプチドをコード化し、個々のコード領域（エキソン）の間の介在配列（イントロン）のほか、コード領域の前と後ろの領域を含む。
本明細書では、「相同遺伝子」は、異なってはいるが、しかし通常類縁の種由来の遺伝子の組（ｐａｉｒ）をいう。これらは、互いに対応し、互いに同一、又は非常に類似している。この用語は、遺伝子重複により分離された遺伝子（例えば、パラロガス遺伝子）のほか、分化（つまり、新しい種の出現）（例えば、オルソロガス遺伝子）により分離された遺伝子を含む。
本明細書において、「オーソログ」及び「オーソロガス遺伝子」の語は、種形成により共通の遺伝子祖先（即ち、相同遺伝子）から進化した、異なる種の遺伝子を意味する。通常、オーソロガスは進化の過程で同じ機能を維持している。オーソロガスの同定は新たに配列決定されたゲノムにおいて、遺伝子の機能を予測することに用いられる。
本明細書において、「パラログ」及び「パラロガス遺伝子」の語はゲノム内の複製に関係する遺伝子を意味する。オーソロガス遺伝子は進化の間に同じ機能を維持しているのに対して、パラロガスは、同じ機能はもとの遺伝子に基づいているものの、新たな機能を獲得している。パラロガス遺伝子の例としては、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、及びトロンビンがあり、これらは全てセリンプロテアーゼであり、同じ種の中で発生する。
本明細書では、「相同性」は、配列の類似又は同一をいい、同一であることが好まれる。この相同性は本願技術分野で知られている標準的技術を用いて決定される。（例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２［１９８１］；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８，４４３［１９７０］；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４［１９８８］；プログラム、例えば、ウィスコンシン遺伝子学ソフトウェアパッケージ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ、また、ＤｅｖｅｒｅｕｘらＮｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１２：３８７−３９５［１９８４］を参照。
本明細書では、「相同配列」は、遺伝子の機能がストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）１ＡＧ３プロテアーゼに基づく遺伝子と本質的に同一であるものである。加えて、相同遺伝子は、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）１ＡＧ３の配列と同一の配列を含む。または、相同配列は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）１ＡＧ３領域に見出される遺伝子の７０から１００％の一致度（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）をもち、及び／またはストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）１ＡＧ３染色体の遺伝子と一致する領域において少なくとも５−１０の遺伝子を有する。他の実施態様では上記の性質のうち１より多くがこの配列にあてはまる。相同配列は、既知の配列一致法（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）により決定される。上記及び下記のとおり、配列を一致させる際に用いられる他の方法もあるが、一般に用いられる一致法は、ＢＬＡＳＴである。
有用なプログラムの１つはＰＩＬＥＵＰである、ＰＩＬＥＵＰは累進的なペアワイズアラインメントを用いて関係する配列のグループから複数の配列アラインメントを形成する。これは、アラインメントの形成に用いたクラスタリング関係を示す系統樹をプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰはＦｅｎｇ及びＤｏｌｉｔｔｌｅ（Ｆｅｎｇ及びＤｏｌｉｔｔｌｅ、ＭｏＩ．ＥｖｏＬ，３５：３５１−３６０［１９８７］）。この方法はＨｉｇｇｉｎｓ及び／又はＳｈｅｒｐの方法に類似している（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ， ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３［１９８９］）。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターはデフォルトギャップウエイト３．００、デフォルトギャップレングス０．１０、及び重量測定されたエンドギャップを含む。
有用なアラインメントの他の例はＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，２１５：４０３−４１０，［１９９０］及びＫａｒｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７［１９９３］）によるＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に好適なＢＡＬＳＴプログラムはＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌら， Ｍｅｔｈ．ＥｎｚｙｍｏＬ，２６６：４６０−４８０［１９９６］参照）。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は幾つかのサーチパラメーターを用いる、これらの大部分はデフォルトパラメーターとして設定されている。調節可能なパラメーターは以下の値で設定されている：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップファンクション＝０．２５、ワードスレッシュホールド（Ｔ）＝１１．ＨＳＰＳ及びＨＳＰＳ２パラメーターは動的な値であり、特定配列の組成及びサーチする所望の配列に対する特定のデータベースの組成に依存してプロテグラム自身により確立される。しかしながら、この値は感度を上げるために調節してもよい。Ａ５のアミノ酸配列同一性の値は整列された領域における「より長い」配列の残基の総数により提供された一致する残基の数により決定される。この「より長い」配列は整列された領域における実残基の大部分である（アラインメントスコアを最大化するために用いたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２により導入されたギャップは無視した）。
用語、「核酸配列同一性パーセント（％）」の語は、開始配列（例えば、所望の配列）の核酸残基と同一な候補配列中のヌクレオチド配列のパーセンテージであると定義される。測定方法は、オーバーラップスパンと１乃至０．１２５のオーバーラップファンクションを有するデフォルトパラメーターを用いるＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＩＮモジュールを用いる。
本明細書において、「ハイブリダーゼーション」の語は核酸のストランドが相補的なストランドに塩基対により結合することであり、当業者に知られている。
核酸配列は、もし２つの配列が特異的に、中乃至高過酷ハイブリダーゼーション条件及び洗浄条件下で他の配列にハイブリダイズするならば、「選択的にハイブリダイズする」と言う。ハイブリダーゼーション条件は複合体又はプローブに結合している融点（Ｔｍ）に基づいている。例えば、「最大過酷条件」はＴｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃低い）で生じる；「高過酷条件」はＴｍの５乃至１０℃下で生じる；「中程度の過酷条件」はプローブのＴｍの宿主細胞１０乃至２０℃下で生じる。機能的には、最大過酷条件はハイブリダーゼーションプローブと厳密に同一であるか、又はほぼ同一である配列を同定するために用いられ、中程度乃至低い過酷ハイブリダーゼーションは相同なポリヌクレオチド配列を同定又は検出するために用いる。
中間過酷及び高過酷条件は、本技術分野でよく知られている。高過酷条件の例としては、５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ、５Ｘデンハード溶液、０．５％ＳＤＳ及び１００μg／ml変性キャリアＤＮＡ中、約４２℃でのハイブリダイゼーションを行い、続いて２ＸＳＳＣ及び０．５%ＳＤＳ中で、室温で２回洗浄し、０．１ＸＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳ中で、更に４２℃で２回洗浄する。中間過酷条件の例としては、２０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５Ｘデンハード溶液、１０％硫酸デキストラン、及び２０ｍｇ/ｍｌ変性切断サケ精子ＤＮＡ中、約３７℃でのハイブリダイゼーションを行い、続いて１ＸＳＳＣで、３７又は５０℃でフィルターを洗浄する。プローブ長さ等の因子に応じて必要であれば、どのように温度及びイオン強度を調整したらよいかということは、当業者が知っている。
ここで用いる「組換え体」は、異種核酸配列の導入により修飾されたもの、又は、そのように修飾された細胞由来の細胞であり、細胞またはベクターに関するものを含む。従って、例えば組換え細胞は、人為的な介入により、所定の遺伝子を発現または発現させない条件下において、当該細胞の天然型（非組換え体）においては通常同一の形態で見ることのできない遺伝子を発現し、または当該細胞の天然遺伝子を異常発現する。「組換え」、（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，ｒｅｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）及び「組み換えられた」核酸の作製は一般的に２以上の核酸断片を組み合わせることであり、この組合せによりキメラ遺伝子が生じる。
好ましい実施態様では、突然変異ＤＮＡ配列群は少なくとも１コドンでのサイトサチュレーション（ｓｉｔｅ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）突然変異により生じる。別の好ましい実施態様では、サイトサチュレーション突然変異は２以上のコドンについて行われる。他の実施態様では、突然変異ＤＮＡ配列は５０％より多く、５５％より多く、６０％より多く、６５％より多く、７０％より多く、７５％より多く、８０％より多く、８５％より多く、９０％より多く、９５％より多く又は９８％より多く野生型の配列と相同性をもつ。別の実施態様では、突然変異ＤＮＡは、例えば、照射、ニトロソグアニジンなどのいずれかの既知の突然変異発生方法を用いて生体内で生じる。所望のＤＮＡ配列はその後単離され、本明細書に記載の方法で使用される。
本明細書において、「標的配列」は宿主細胞ゲノムへ挿入されるインカミング卑劣にとって好ましい配列をコードしている宿主細胞におけるＤＮＡ配列を意味する。幾つかの態様において、この標的配列は、機能的な野生型遺伝子又はオペロンをコードしている。他の態様では、この標的配列は変異遺伝子又はオペロン、あるいは非機能的遺伝子又はオペロンをコードしている。
本明細書において「フランキング配列」の語は意図する配列の上流又は下流のいずれかにある任意の配列を意味する（例えば、遺伝子Ａ−Ｂ−Ｃについて、遺伝子Ｂは遺伝子配列Ａ及びＣに隣接していると言う）。１つの態様において、インカミング配列は両方で相同なボックスによりフランクされている。他の態様において、このインカミング配列及びホモロジーボックスは両方でスタッファー配列によりフランクされている単位を含む。幾つかの態様において、このフランキング配列は一方のみに存在する（３’又は５’末端のいずれか）が、１つの態様において、配列の両側にフランクされている。幾つかの態様において、フランキング配列は片側のみ（３’又は５’末端のいずれか）に存在する、他の態様において、フランキング配列は配列の両側にフランクしている。
本明細書において、「スタファー配列」の語は、ホモロジーボックス（通常ベクター配列）にフランクする追加のＤＮＡを意味する。しかしながら、この語は非相同ＤＮＡ配列も含む。理論により拘束することを意図しないけれども、スタッファー配列はＤＮＡの取り込みを開始するために細胞に非臨界的な標的を提供すると考えられている。
本明細書において、「染色体取込」は、インカミング配列が宿主細胞の染色体に取り込まれる過程を意味する。形質転換ＤＮＡの相同領域は染色体の相同領域に整列する。次いで、ホモロジーボックスの間の配列がダブルクロスオーバーにおけるインカミング配列により置き換えられる（即ち、相同組み換え）。本発明の幾つかの態様において、ＤＮＡ構築体の不活性染色体セグメントの相同領域が、バチルス染色体が本来有しているフランキング相同領域と整列する。次いで、本来有している染色体領域がダブルクロスオーバー（即ち、相同組み換え）により欠失される。
「相同組み換え」の語は、２つのＤＮＡ分子又は１対の染色体の間のＤＮＡフラグメントが同一又は近い同一の核酸配列の部位で交換されることを意味する。１つの態様において、染色体取り込みは相同組換えである。
本明細書では、「相同配列」は、比較のために整列したときに、他の核酸又はポリペプチドに対して少なくとも約１００％、約９９％、約９８％、約９７％、約９６％、約９５％、約９４％、約９３％、約９２％、約９１％、約９０％、約８８％、約８５％、約７５％、又は約７０％同一である核酸又はポリペプチド配列を意味する。幾つかの態様において、相同配列は宿主細胞は約８５％乃至約１００％の配列同一性、他の態様では、約９０％乃至約１００％の配列同一性、及び他の幾つかの態様では、約９５％乃至約１００％の配列同一性を有する。
本明細書において「アミノ酸」の語はペプチド又はタンパク質配列、あるいはそれらの一部分を意味する。「タンパク質」、「ペプチド」、及び「ポリペプチド」の語は互換的に使用される。
本明細書において、「所望のタンパク質」又は「所望のポリペプチド」の語は、所望の及び／又は評価されるタンパク質／ポリペプチドを意味する。幾つかのタンパク質所望のタンパク質は細胞内で発現され、他の態様では、所望のタンパク質は分泌されたポリペプチドである。特定の態様において、これらの酵素は本明細書で説明するセリンプロテアーゼを含む。幾つかの態様において、所望のタンパク質はシグナルペプチドに融合している分泌されたポリペプチドである（即ち、分泌されたタンパク質上に追加のアミラーゼの末端がある）。ほとんど全ての分泌されたタンパク質は膜を横切る前駆体タンパク質のを標的とすること及び輸送において重要な役割を担うアミノ末端の追加的な部分を使用する。このエクステンションは膜輸送の間又はその後にタンパク質分解的に除去される。
本明細書において、「異種タンパク質」の語は宿主細胞中に自然発生的に生じないタンパク質又はポリペプチドを意味する。異種タンパク質の例としては、プロテアーゼを含む加水分解酵等の酵素を含む。幾つかの態様において、このタンパク質をコードしている遺伝子は自然発生遺伝子である。他の態様において、変異及び／又は合成遺伝子が用いられる。
本明細書において、「相同タンパク質」の語は宿主細胞中に自然発生するタンパク質又はポリペプチドを意味する。幾つかの態様において、この細胞はグラム陽性細胞である。他の態様において。この細胞はバチルス宿主細胞である。代替的な態様において、この相同タンパク質は大腸菌、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、トリコデルマ、及びアスペルギウスを含むがこれらに限定されない他の有機体により生産される天然タンパク質である。
本明細書におい、「宿主株」又は「宿主細胞」の語は本発明の幾つかの態様に従って、ＤＮＡを含む発現ベクターとして好適な宿主を意味する。
酵素が対応する野生型細胞で発現されるレベルよりも高いレベルで発現した場合、酵素が「過剰発現」すると言う。
「プロ配列」はプロテアーゼの分泌に必要なシグナル配列及び成熟プロテアーゼの間のアミノ酸配列である。プロ配列の切断が成熟活性プロテアーゼとなる。
「シグナル配列」又は「シグナルペプチド」の語は、タンパク質の成熟又はプレカーサー形態の分泌に関係している核酸及び／又はアミノ酸の任意の配列を意味する。シグナル配列の定義は、タンパク質の分泌の遂行に参加している、タンパク質遺伝子のＮ末端部分によりコードされている全てのアミノ酸配列を含む、機能的なものを意味する。
それらはしばしば、常にではないが、タンパク質のＮ末端部分又は前駆体タンパク質のＮ末端部分へ結合する。このシグナル配列は内性又は外来性のいずれでもよい。このシグナル配列はタンパク質（例えば、プロテアーゼ）に通常関係しているか、又は分泌された他のタンパク質をコードしている遺伝子由来である。１つの例示的なシグナル配列はバチルススブチリススブチリシン由来のシグナル配列の最初の７つのアミノ酸残基がバチルスレンタス由来のスブチリシンのシグナル配列の残りの部分に結合している（ＡＴＣＣ２１５３６）。
タンパク質又はポリペプチドの「成熟」形態の語は、タンパク質又はポリペプチドの最終的な機能形態である。例えば、本発明のプロテアーゼの成熟形態はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９で定義されるアミノ酸配列を少なくとも含む。
タンパク質又はポリペプチドの「前駆体」形態はタンパク質のアミノ末端又はカルボキシ末端に作動可能に結合している配列を有するタンパク質の成熟形態を意味する。この前駆体はこの前駆体のアミノ末端に作動可能に結合している「シグナル」配列を含んでいてもよい。この前駆体は翻訳後処理において含まれる追加的なポリヌクレオチド（例えば、タンパク質又はポリペプチドの成熟形態を切り離したポリスプリットヌクレオチド）も有していてもよい。
「自然発生酵素」の語は天然に見られるものと同じで未修飾のアミノ酸配列を有している酵素を意味する。自然発生酵素は天然酵素、自然発生の酵素、又は特定の微生物中に見られる酵素等を含む。
用語「由来の」と「から得られる」は、問題の生物の株により産生される、または産生され得るプロテアーゼをいうばかりではなく、そのような株から単離されるＤＮＡ配列によりコードされたプロテアーゼ及びそのようなＤＮＡ配列を含む宿主生物内に産生されるプロテアーゼもいう。加えて、この用語は、合成の及び/またはcＤＮＡ起源のＤＮＡ配列によりコードされ、問題のプロテアーゼの同定のための特徴を有すプロテアーゼをいう。例えば、「ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）由来のプロテアーゼ」は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）により天然に産生されるタンパク質分解活性をもつ酵素をいう。またストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）源により産生されるものに類似のセリンプロテアーゼであるが、遺伝子工学の使用によりセリンプロテアーゼをコードする核酸により形質転換された非-ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）生物により産生される酵素もいう。
本定義の範囲では「誘導体」は、この誘導体が野生型酵素、天然の酵素または元の酵素と同様に、類似の目的に有用である限度で、野生型酵素、天然の酵素又は元の酵素で観察される特徴的なタンパク質分解活性を保持している。セリンプロテアーゼの機能的誘導体は、天然の、合成のまたは組換え遺伝子により産生される本願発明のセリンプロテアーゼの一般的特徴をもつペプチド又はペプチド断片を含む。
用語「機能的誘導体」は、セリンプロテアーゼをコードした核酸の機能的特徴をもつ核酸の誘導体をいう。本願発明のセリンプロテアーゼをコードする核酸の機能的誘導体は天然の、合成の又は組換えにより作成された核酸または断片を含み、本願発明のセリンプロテアーゼの特徴をコードしている。本願発明によりセリンプロテアーゼをコードする野生型の核酸には、天然の対立遺伝子や、本願発明の技術分野で既知の遺伝子コードの縮重に基づく相同体を含む。
２個の核酸又はポリヌクレオチド配列について述べる場合、用語「同一」は、２個の配列において、以下の配列比較または分析アルゴリズムの一つを用いて評価するときに最大の一致が得えられるように位置合わせをしたとき同一である残基をいう。
用語「最適の位置合わせ」とは、最高のパーセント同一性スコアを与える位置合わせである。
２個のアミノ酸、ポリヌクレオチド、及び/又は遺伝子配列（適当な場合）に関し「パーセント配列同一性」、「パーセントアミノ酸配列同一性」「パーセント遺伝子配列同一性」及び/又は「パーセント核酸/ポリヌクレオチド配列同一性」とは、これら配列の最適の位置合わせをした場合に、この２個の配列において同一である残基のパーセンテージをいう。従って、８０％アミノ酸配列同一性は２個の最適な位置合わせをされたポリペプチド配列において８０％のアミノ酸が同一であることをいう。
２個の核酸又はポリペプチドについて述べる場合には、用語「実質的に同一」は、従って、標準パラメーターを使用して、プログラムまたはアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ，ＡＬＩＧＮ、ＣＬＵＳＴＡＬ）を用いて対照配列と比較したとき、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を含むポリヌクレオチド、又はポリペプチドをいう。２個のポリペプチドが実質的に同一であることの指標は第１のポリペプチドが第２のポリペプチドと免疫学的に交叉反応をすることである。通常、保存アミノ酸置換により異なるポリペプチドは、免疫学的に交叉反応性である。よって、２個のペプチドが保存アミノ酸置換によってのみ異なる場合には、あるポリペプチドは第２のポリペプチドと実質的に同一である。２個の核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は２個の分子が、厳格な条件（例えば、中程度から高い厳格さの範囲内）で互いにハイブリダイズすることである。
用語「単離された」または「精製された」とは、その元来の環境（例えば、それが、天然のものであるときは、自然環境）から取り出された物質をいう。例えば、物質が天然の又は野生型の生物に存在するときよりも高い濃度である組成物中に存在するとき、または天然のまたは野生型の生物から発現するときに正常には存在しない成分と組み合わされて存在するときは、「精製された」といわれる。例えば、生きている動物に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていない。しかし自然体系において共存する物質のいくつか又は全てから分離された、同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であり得、及び/またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であり得、そしてそのようなベクターまたは組成物がその自然環境の一部でない点において、なお単離されているのである。好ましい実施態様では、例えば、電気泳動ゲルで本来１バンド又は１点を生じる場合、核酸又はタンパク質は精製されているといわれる。
用語「単離された」を、ＤＮＡ配列に関して使用するときは、その自然の遺伝的環境から取り出され、従って他の余分なまたは望ましくないコード配列がなく、遺伝子工学的に調製されたタンパク質産生システム内での使用に適した形体のＤＮＡ配列をいう。このような単離された分子はその自然環境から分離された分子であって、cＤＮＡ及びゲノムのクローンを含む。本願発明の単離されたＤＮＡ分子は、ＤＮＡ分子が元来連結していた他の遺伝子を含まず、しかし、天然の5’及び3’位のプロモーターとターミネーターのような翻訳を受けない領域を含んでも良い。連結した領域の特定は本願分野の通常の技術をもつ者には明らかであるだろう（Ｄｙｎａｎ及びＴｉｊａｎ， Ｎａｔｕｒｅ ３１６：７７４−７８［１９８５］引用）。用語「単離されたＤＮＡ配列」は、「クローン化されたＤＮＡ配列」と言い換えられる。
「単離された」は、タンパク質に関して使用される場合、その本来の環境とは異なる条件で見出されるタンパク質をいう。好ましい形体では、単離されたタンパク質は、実質的に他のタンパク質を含まず、特に他の相同タンパク質を含まない。単離されたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定するとき、純度は１０％より高く、好ましくは純度は２０％より高く、より好ましくは純度は３０％より高い。本願発明の他の特徴は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定するとき、高い純度のタンパク質を含むことである（つまり、純度が４０％より高い、６０％より高い、８０％より高い、９０％より高い、９５％より高い、９７％より高い、乃至９９％より高い）。
本明細書で使用するとき、用語「機能分析」はタンパク質の活性の指標を与える分析を言う。特に好ましい実施態様では、この用語は、タンパク質がその通常の能力範囲において、機能する能力を分析する分析系をいう。例えば、酵素の場合、機能分析は、反応を触媒する酵素の効率の決定を含む。
本明細書では、用語「対象性質（ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｐｅｒｔｙ）」は、変更が行われる予定の初期遺伝子の性質をいう。本願発明では何らかの特定の対象性質に限定することは意図していない。しかし、ある好ましい実施態様では、対象性質は遺伝子産生物の安定性（例えば、変性、タンパク質分解、又は他の分解因子に対する耐性）であり、一方、他の実施態様では産生宿主の産生水準が変えられる。実際、初期遺伝子の如何なる性質も本願発明において用いられると考えられている。
核酸に関する記述において用語「性質」又はそれと文法的に等しい用語は、本明細書では、選択又は検出を受け得る核酸のいずれかの特徴又は属性をいう。これらの性質等は、ポリペプチドへの結合に影響を及ぼす性質、特定の核酸を含む細胞に与えられた性質、遺伝子の転写に影響を及ぼす性質（例えば、プロモーター含量、プロモーター認識、プロモーター調節、エンハンサー機能）、RNA処理に影響を及ぼす性質（例えば、ＲＮＡスプライシング、ＲＮＡ安定性、RNAコンホメーション、転写後の修飾）、翻訳に影響を及ぼす性質（例えば、水準、調節、リボソームタンパク質へのｍ−ＲＮＡの結合、翻訳後の修飾）を含むがこれらに限定されない。例えば、核酸の転写因子、ポリメラーゼ、調節因子の結合部位などは所望の特徴をもたらすようにまたは、好ましくない特徴を特定するよう変え得る。
用語「修飾された配列」と「修飾された遺伝子」は、本明細書では、相互に入れ替えて、天然の核酸配列の欠失、挿入又は中断を含む配列をいうために使用される。幾つかの好ましい実施態様では、修飾された配列の発現産生物は、短縮タンパク質である（例、修飾が配列の欠失又は中断の場合）。幾つかの特に好ましい実施態様では、短縮されたタンパク質は生物学的活性を保持している。別の実施態様では、修飾された配列の発現産生物は延長されたタンパク質である（例えば、核酸配列への挿入を含む修飾）。幾つかの実施態様では、挿入は短縮されたタンパク質を与える（例えば、この挿入が終止コドンとなる場合）。従って、挿入は発現タンパク質として短縮されたタンパク質又は延長されたタンパク質を与えるだろう。
用語「野生型配列」又は「野生型遺伝子」は本明細書では相互に入れ替えて使用され、宿主細胞内に固有の又は天然に存在する配列をいう。幾つかの実施態様では、野生型の配列はタンパク質工学プロジェクトの出発点である目的配列をいう。この野生型配列は相同または異種タンパク質をコードしても良い。相同タンパク質は、宿主細胞が介入を受けずに産生するものである。異種タンパク質は宿主細胞は産生しないが、介入があったときは産生するものである。
本明細書では、用語「抗体」は、免疫グロブリンをいう。抗体は抗体を産生することが望まれているいずれかの種から直接に得られる免疫グロブリンを含むが、これらに限定されない。加えて、本願発明は、修飾された抗体を含む。この用語はまた、完全な抗体が結合するエピトープに結合する能力を保持している抗体の断片もいい、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、抗イディオタイプ（抗-ＩＤ）抗体を含む。抗体のフラグメントは、相補性決定領域（ＣＤＲ）、単一鎖フラグメント可変領域（ｓｃＦｖ）、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むがこれらに限定されない。ポリクローナルとモノクローナル抗体も本願発明に含まれる。抗体はモノクローナル抗体が好ましい
用語「酸化に安定」は、本願発明のタンパク質分解、加水分解、洗浄又は他の処理において一般的な条件、例えば、漂白剤又は酸化剤に暴露または接触するとき、所定の時間、指定した酵素活性を保持する本願発明のプロテアーゼをいう。幾つかの実施態様では、このプロテアーゼは、所定の時間、例えば、少なくとも１分、３分、５分、８分、１２分、１６分、２０分等にわたり、漂白剤又は酸化剤と接触した後、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％タンパク質分解活性を保持する。幾つかの実施態様では、安定性は実施例で記載されたように測定される。
用語「キレート剤に安定」は、本願発明のタンパク質分解、加水分解、洗浄又は他の処理において一般的な条件、例えば、キレート剤に暴露または接触するとき、所定の時間、指定した酵素活性を保持する本願発明のプロテアーゼをいう。幾つかの実施態様では、このプロテアーゼは、所定の期間、例えば、少なくとも１０分、２０分、４０分、６０分、１００分等、キレート剤と接触した後に、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のタンパク質分解活性を保持する。幾つかの実施態様では、キレート剤への安定性は実施例で記載されているように測定される。
用語「熱的安定性」と「熱安定性」は、本願発明のタンパク質分解、加水分解、洗浄又は他の処理において一般的な条件、例えば、温度変化に晒されたとき、所与の時間、特定の温度に暴露された後、指定した酵素活性を保持する本願発明のプロテアーゼをいう。温度変化は温度の上昇又は低下である。幾つかの実施態様では、このプロテアーゼは、所与の時間、例えば、少なくとも６０分、１２０分、１８０分、２４０分、３００分等の間、温度変化にさらされた後、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％タンパク質分解活性を保持する。幾つかの実施態様では、熱安定性は実施例に記載されているように決定される。
酸化、キレート剤、熱的に、及び/又はｐＨに安定なプロテアーゼについて述べるとき、用語「高められた安定性」とは他のセリンプロテアーゼ（例えば、スブチリシンプロテアーゼ）及び/または野生型の酵素と比較して経時的に比較的高く保持されたタンパク質分解活性をいう。
酸化、キレート剤、熱的に、及び/又はｐＨに安定なプロテアーゼについて述べるとき、用語「低下した安定性」は、他のセリンプロテアーゼ（例えば、スブチリシンプロテアーゼ）及び/または野生型の酵素と比較して経時的に比較的低く保持されたタンパク質分解活性をいう。
用語「洗浄活性」は、本願発明のタンパク質分解、加水分解、洗浄又は他の処理において一般的な条件で、プロテアーゼにより達成される洗浄成績をいう。幾つかの実施態様では、洗浄成績は、酵素に感受性のある汚れ、例えば、草、血液、ミルク、卵のタンパク質に関し、標準的洗浄条件をその汚れに適用した後、種々のクロマトグラフ、分光学的又は他の定量的方法により決定されるように、種々の洗浄分析の適用により決定される。分析法の例には、実施例に含まれる方法のほか、ＷＯ９９/３４０１１と米国特許第６，６０５，４５８号（両者ともに引用により本明細書に組み込む）で記載された分析法を含むがこれらに限定はされない。
プロテアーゼについて用語「洗浄有効量」は、特定の洗浄剤組成物において酵素活性の望ましい水準を達成する、すでに明細書で述べたプロテアーゼの量をいう。このような有効量は本願技術分野において通常の技術をもつ者により容易に確認され、使用する特定のプロテアーゼ、洗浄実施態様と、洗浄剤組成物の特定の組成及び液状又は乾燥（例えば、顆粒、塊）組成物が必要とされるかなど、多くの因子に基づく。
用語「洗浄添加物質」は、本明細書で使用するとき、所期の特定の洗浄剤組成と製品形態（例えば、液体、顆粒、粉末、塊、のり、スプレー、錠剤、ゲル又は泡の組成物）について選択された液体、固体又は気体の物質であり、好ましくはその組成物で使用されるプロテアーゼ酵素に悪影響を及ぼさないものである。幾つかの実施態様では、顆粒組成物は「コンパクト」な形態にされ、他方、他の実施態様では、液体組成物は「濃縮」された形態である。
洗浄活性について「向上した活性」は、１回の標準的洗浄サイクル及び/または複数の洗浄サイクルの後、通常の評価により決定されたとき、卵、ミルク、草または血液のような、ある酵素に感受性のある汚れについて、増大した又は大きい洗浄活性をいう。
洗浄活性について用語「低減された性能」は、１回の標準的洗浄サイクルの後、通常の評価により決定されたとき、卵、ミルク、草または血液のような、ある酵素に感受性のある汚れについて、減少したまたは低くされた洗浄活性をいう。
洗浄活性に関し用語「同程度の性能」は、ＯＰＴＩＭＡＳＥ（商標）プロテアーゼ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（商標）プロテアーゼ製品（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）プロテアーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、ＢＰＮ’−変異種（米国特許番号第５，３４，６０６号参照）、ＲＥＬＡＳＥ（商標）、ＤＵＲＡＺＹＭＥ（商標）、ＥＶＥＲＬＡＳＥ（商標）、ＫＡＮＮＡＳＥ（商標）プロテアーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、ＭＡＸＡＣＡＬ（商標）、ＭＡＸＡＰＥＭ（商標）、ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（商標）プロテアーゼ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ、米国特許第５，３４，６０６号、米国特許第５，７００，６７６号、５，９５５，３４０号、６，３１２，９３６号、及び第６，４８２，６２８号も参照）、及びＢ．レンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）変異種プロテアーゼ製品（例えば、ＷＯ９２／２１７６０、ＷＯ９５／２３２２１、及び/又はＷＯ９７／０７７７０に記載された製品）を含み、これらに限定されない、比較対象のスブチリシン（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）プロテアーゼ（例えば、市販のプロテアーゼ）、の洗浄活性の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％をいう。スブチリシンプロテアーゼの変異種の例は、ＢＰＮ’の７６番目、１０１番目、１０３番目、１０４番目、１２０番目、１５９番目、１６７番目、１７０番目、１９４番目、１９５番目、２１７番目、２３２番目、２３５番目、２３６番目、２４５番目、２４８番目及び/または２５２番目に対応する残基の位置で置換、欠失をもつ変異種を含むがこれらに限定されない。洗浄性能は、草、血液又はミルクのような酵素に感受性のある汚れについて、標準的洗浄サイクルを経た後、通常の分光学的又は分析的方法により決定されるような、種々の洗浄分析において、これらスブチリシンプロテアーゼと本願発明のプロテアーゼを比較することにより決定できる。
本明細書では、「低洗剤濃度」系は約８００ｐｐｍ未満の洗剤組成物が洗浄に用いる水に含まれる洗剤を含む。日本の洗剤は、洗浄に用いる水に普通約６６７ｐｐｍの洗剤組成物を含むので、通常は、低洗剤濃度系であると考えられている。
本明細書では、「中程度の洗剤濃度」系は、約８００ｐｐｍと約２０００ｐｐｍの間の洗剤組成物が洗浄用の水に含まれる洗剤を含む。北アメリカの洗剤は、普通約９７５ｐｐｍの洗剤組成物が洗浄用の水に含まれるので、一般的に中程度の洗剤濃度系であると考えられている。ブラジルの洗剤は、洗浄用の水に約１５００ｐｐｍの洗剤組成物を含む。
本明細書では、「高洗剤濃度」系は約２０００ｐｐｍより高濃度の洗剤組成物が洗浄用の水に含まれる洗剤を含む。ヨーロッパの洗剤は一般的に、約３０００−８０００ｐｐｍの洗剤組成物を洗浄用の水に含むので一般的に高洗剤濃度系であると考えられている。
本明細書では、「布地洗浄組成物」は、洗濯用添加剤組成物と汚れた布地（例えば、布、リネン及び他の布製品）の浸漬及び/または前処理での使用に適した組成物とを含む手洗い用及び洗濯機用組成物を含む。
本明細書では、「非布地洗浄組成物」は、皿洗い洗剤組成物、口内洗浄組成物、義歯洗浄組成物、人の体を洗う組成物を含み、これらに限定されない、織物（ｔｅｘｔｉｌｅ,ｆａｂｒｉｃ）でないものの表面を洗浄する組成物を含む。
本明細書の洗浄剤組成物のコンパクトな形態は密度に最も良く反映され、組成に関しては増量用無機塩の量に反映される。増量用無機塩は、粉末形態の洗剤組成物の従来からの成分である。従来の洗剤組成物では、増量用塩は相当量、全組成物の重量の通常、１７乃至３５％で含まれる。他方、コンパクト組成物では増量用塩は組成物の総量に対し１０％をこえない。幾つかの実施態様では、増量用塩は、組成物の重量の１０％を超えない量、より好ましくは５％を超えない量が含まれている。幾つかの実施態様では、増量用無機塩は硫酸塩と塩化物のアルカリ金属とアルカリ土類金属の塩から選ばれる。好ましい増量用塩は硫酸ナトリウムである。
ＩＩ．セリンプロテアーゼ酵素及びセリンプロテアーゼ酵素をコードしている核酸
本発明はプロテアーゼをコードしているアミノ酸配列をコードしている単離ポリヌクレオチドを提供する。幾つかの態様において、このポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、８、及び１１（例えば、基質のペプチド結合の加水分解を触媒する成熟プロテアーゼを含むタンパク質分解活性を有するポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列の少なくとも一部分）で定義されるアミノ酸配列に対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％のアミノ酸同一性を有する及び／又は同一の洗浄条件下で匹敵する又は高められた洗浄能力を示すポリペプチドをコードする。
幾つかの態様において、パーセント同一性（アミノ酸配列、核酸配列、遺伝子配列）は、配列を位置合わせして、２つの位置合わせされた配列の間の一致する残基の数をカウントし、よりも次回配列の長さで割って、１００をかけることにより、２つの分子間の間の配列情報を直接比較して決定される。前述のように、このような解析に用いることができるコンピュータープログラムも用いることができる。ヌクレオチド配列同一性を決定するためのプログラムは、例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを利用するＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＧＡＰプログラムであり、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ （Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）から入手可能である。これらのプログラムは通常製造元により推奨されている規定パラメーターを用いる。これは前述のＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅに説明されている。
配列類似性を決定するために好適なアルゴリズムの例としては、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載のＢＬＡＳＴアルゴリズムがある。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターから公的に利用できる。（<www.ncbi.nim.nih.gov>）そのアルゴリズムは、データベース中の長さＷのワードと共に並べた場合にポジティブ評価の閾値Ｔに適合し、または充足させる照会配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、高得点配列対（ｈｉｇｈ ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐａｉｒｓ（ＨＳＰｓ））をまず同定することを含む。それら最初の隣接ワードのヒットは、それらを含む長いＨＳＰｓを見出すための開始点として働く。累積整列得点（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｃｏｒｅ）ができるだけ増えるように、比較する２つの配列のそれぞれに沿って両方向にワードヒットを展開する。ワードヒットの延長は：累積整列得点が最大達成値より定めた定数Ｘから遠ざかる；累積得点がゼロまたはそれ以下に下がる；または何れかの配列の末端に達する：場合に止まる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、整列の感度および速さを特定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、初期設定として、ワード長（Ｗ）が１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｇ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９））整列（Ｂ）が５０、期待値（Ｅ）が１０、Ｍ’５、Ｎ’−４、および両鎖の比較を用いる。
さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計解析を実施する（例えばＫａｒｌｉｎ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３−５７８７（１９９３） を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによってもたらされる類似性の１つの指標は、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然生じる確率の指標を提供する最小総確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））である。例えば、評価核酸とセルラーゼ核酸との比較における最小総確率が、約０．１より小さく、より好ましくは約０．０１より小さく、さらに最も好ましくは約０．００１よりも小さい場合に、最も好ましくは０．００１よりも小さい場合に、ある核酸が本発明のセルラーゼ核酸に類似するとみなされる。
本発明の幾つかの態様において、配列はＢＬＡＳＴ及びタンパク質翻訳配列ツールを用いて解析される。幾つかの態様において、ベーシックＢＬＡＳＴバージョン２．０を用いた。この選択されたプログラムは「ＢｌａｓｔＸ」であり、選択されたデータベースは「ｎｒ」であった。標準／デフォルトパラメーター値を用いた。
幾つかの態様において、本発明は、本発明の１ＡＧ３プロテアーゼを含む、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で定義されるポリヌクレオチド長さの約１３８９ベースペアを含む。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１において、開始コドン及び停止コドンを太字で示し、予測されるリボゾーム結合部位を下線で示す。本発明の他の態様において、これらのアミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチドは１３６２ベースペア（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の１乃至１３６２）を含む。発現された場合、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸１乃至２５をコードしている（即ち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）シグナル配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヌクレオチド１乃至７５（即ち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、Ｎ末端プロ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の２６乃至１９７のアミノ酸配列をコードしているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヌクレオチド７６乃至５９１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６））、成熟プロテアーゼ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３アミノ酸残基１９８乃至４５３をコードしているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヌクレオチド５９２乃至１３５９）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のアミノ酸残基１乃至２５６）をコードすると考えられている。代替的に、シグナルペプチド、Ｎ末端プロは入れ値、及び成熟セリンプロテアーゼ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９の成熟プロテアーゼのアミノ酸残基に従って番号付けされている。即ち、シグナルペプチドは１９８までから１７３まで、Ｎ末端プロ配列は１乃至１７２残基、成熟セリンプロテアーゼ配列は１乃至２５６．本発明の他の態様において、タンパク質分解活性を有するアミノ酸配列をコードしているこのポリヌクレオチドはシグナルペプチド及び前駆体プロテアーゼをコードしている、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のタンパク質の１乃至１３６２のヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。本発明の他の態様において、アミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチドは前駆体ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）プロテアーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）をコードしているポリヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）の１乃至１２８７のヌクレオチドを配列を含む。更なる態様において、アミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチドは成熟ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）プロテアーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）をコードしているポリヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）の一部分の１乃至７６８ヌクレオチドの配列を含む。これらの配列を以下に提供する。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１はフランキング領域を含む１ＡＧ３完全長ヌクレオチド配列を提供する。
Figure 2011501961
Figure 2011501961
前述の配列において、成熟リボゾーム結合部位を下線で示す。開始及び停止コドンは、太字で示す。以下のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２は１ＡＧ３プロテアーゼ／１ＡＧ３プロテアーゼのオペロンリーディングフレームを示す。
Figure 2011501961
Figure 2011501961
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３は１ＡＧ３プロテアーゼのポリペプチド配列を示す。
Figure 2011501961
前述のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３において、予測されるシグナル配列を二重下線で示す。予測されたプロ配列を一本線の下線で示す。予測される成熟鎖を太字で示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４は１ＡＧ３シグナル配列のポリヌクレオチド配列を提供する。
Figure 2011501961
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（ＭＨＲＲＲＧＡＬＦＡＧＡＶＡＩＡＡＬＴＩＡＡＡＰＡ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のシグナル配列に対応するポリペプチド配列である。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６は１ＡＧ３Ｎ末端プロ配列のポリヌクレオチド配列を示す。
Figure 2011501961
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で定義されるＮ末端プロ配列の対応するポリペプチド配列を提供する。
Figure 2011501961
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８は成熟プロテアーゼ配列をコードしているポリヌクレオチド配列を示す。
Figure 2011501961
以下のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９は成熟１ＡＧ３プロテアーゼのアミノ酸配列を示す。この配列において、触媒トリアドを太字で示す。
Figure 2011501961
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０は１ＡＧ３先駆体プロテアーゼのポリヌクレオチド配列を示す。
Figure 2011501961
以下のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１は１ＡＧ３前駆体プロテアーゼのアミノ酸配列を示す。
Figure 2011501961
以下のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２は１ＡＧ３株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の部分的なポリヌクレオチド配列を示す。
Figure 2011501961
幾つかの追加的な実施態様において、本発明の発明は、コードされたフラグメントがタンパク質分解活性を有している限り、プロテアーゼをコードするＤＮＡのフラグメント又はタンパク質を提供する。本発明の他の態様は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、８、及び１５のポリヌクレオチド配列の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の長さの配列を有するポリヌクレオチドを含む。幾つかの代替的な態様において、これらの長さのフラグメント又はタンパク質は組換えＤＮＡ配列においてＤＮＡ配列のシャッフリングに有用な配列長さの連続的な部分である（例えば、米国特許Ｎｏ．６，１３２，９７０参照）。
発明の別の実施態様は、本明細書に記載のＤＮＡ断片を含むが、これは、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）１ＡＧ３由来の本明細書に記載の成熟したプロテアーゼ酵素、またはタンパク質分解活性をもつその断片をコードするポリヌクレオチドを単離または特定するために使用できるＤＮＡ断片を得る際に、認知された技術に従い使用される。さらに、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に与えられたＤＮＡは他の種、特にストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ） 種からのＤＮＡの相同断片を特定する際に使用される。
加えて、本願発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１から構築されるプライマーまたはプローブまたは、適当な一部またはその断片（例えば、少なくとも約５−２０個または１０−１５個の連続するヌクレオチド）を、遺伝子またはcＤＮＡ由来の核酸をスクリーニングするプローブまたはプライマーとして使用することを含む。幾つかの実施態様では、本願発明はＳＥＱＩＤＮＯ：１中の配列に基づいて、望む長さ（つまり、一般的に長さが１００と１０００塩基の間）のＤＮＡプローブを与える。
幾つかの実施態様では、ＤＮＡフラグメントは電気泳動により単離され、ゲルから切り出され、ゲルの寒天組織から回収される。好ましい実施態様では、この精製されたＤＮＡのフラグメントは、次にラベルされ（例えば、製造業者の指図に従いメガプライム（Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ）ラベリングシステムを用いて）、ＤＮＡ中にＰ３２を組み込む。ラベルされたプローブは所与の時間（例えば、約５分）９５℃まで加熱することにより変性され、すぐに膜とプレハイブリダイゼーション溶液に加えられる。ハイブリダイゼーション反応は、穏やかに振とう又は回転しながら適当な時間、適当な条件（例えば、３７℃で１８時間）下で進行する。この膜は濯ぎを受け（例えば、ＳＳＣ／０．３％ＳＤＳで２度）、次に、穏やかに撹拌しながら適当な洗浄液で洗浄される。望む厳密度は膜（フィルター）が洗浄される条件を反映している。本明細書の幾つかの実施態様では、「低い程度に厳密な」条件とは、２０℃で１５分間、０．２ＸＳＳＣ/０．１％ＳＤＳ溶液で洗浄することを含み、一方、他の実施態様では「中程度の厳密」な条件とは、３７℃で３０分間、０．２ＸＳＳＣ/０．１％ＳＤＳ溶液で洗浄することを含む洗浄作業が加わり、他の実施態様では、「高度に厳密な」条件は、３７℃で４５分間、０．２ＸＳＳＣ/０．１％ＳＤＳ溶液で洗浄することを含む洗浄作業をさらに含み、さらに別の実施態様では、「最高度に厳密な」条件は、３７℃で６０分間、０．２ＸＳＳＣ/０．１％ＳＤＳ溶液で洗浄する作業をさらに含む。従って、本願発明の種々の実施態様は、中程度に、高度に及び/又は最高度に厳密な条件で、ＳＥＱＩＤＮＯ：１又は２に提供されているヌクレオチド配列に由来するプローブへハイブリダイズできるポリヌクレオチドを提供する。
洗浄後、膜は乾燥され、結合したプローブか検出される。Ｐ３２または別の放射性同位元素が、ラベル試薬として使用される場合、結合したプローブはオートラジオグラフィーにより検出される。他のプローブを可視化する他の技術は本願技術分野の技術者に良く知られている。結合したプローブの検出は、核酸配列が望む相同性をもつことを示し、したがって本明細書に記載の、目的とするいずれかの配列との同一性が本願発明に含まれていることを示す。従って、本願発明は、本願発明に含まれるプロテアーゼをコードする核酸を検出する方法を提供するが、これは核酸配列の一部又は全てをゲノム又はｃＤＮＡ由来の他の核酸とハイブリダイズさせることを含む。
上記のように、他の実施態様では、ハイブリダイゼーション条件は、核酸結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づき、以下に説明されるように定義された「厳密度」を与える。「最高度の懸密さ」（ｍａｘｉｍｕｍ ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）は通常、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃下）で起こる。「高度な現密さ」（ｈｉｇｈ ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）はＴｍの下、約５℃から１０℃で起こる。「中程度の厳密さ（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）」は、Ｔｍの下、約１０℃から２０℃で起こる。そして、「低い程度の厳密さ（ｌｏｗ ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）」はＴｍの下、約２０℃から２５℃で起こる。本願の技術分野の技術者に理解されるように、高度な及び/又は最高度に厳密なハイブリダイゼーションは、作業条件がポリヌクレオチド配列相同体又は等価なポリヌクレオチド配列を特定し又は検出するため最適であるように選ばれる。
さらに別の実施態様では、本願発明は本願発明のプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む核酸構造体（つまり、発現ベクター）を提供する。さらに別の実施態様では、本願発明はこれらのベクターの少なくとも１個により形質転換された宿主細胞を提供する。
幾つかの更なる態様において、本発明はシグナル配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）をコードしているポリヌクレオチドを提供する。幾つかの態様において、本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８５、少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。従って、これらの態様において、本発明の発明は中間、高及び／又は最大過酷条件下でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載の核酸配列由来のプローブにハイブリダイズすることができる成熟シグナル配列及びポリヌクレオチドを有する配列を提供する。ここにおいて、このシグナル配列は実質的に本発明のポリヌクレオチドによりコードされるシグナル配列と同じシグナル活性を有している。
幾つかの態様において、シグナル活性は開始物質として、発酵培地にプロテアーゼを分泌する実質的に同じレベルにより示される。例えば、幾つかの態様において、本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のシグナル配列により提供される発酵培地中の分泌されたプロテアーゼレベルの、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５５、又は少なくとも９８％のレベルのプロテアーゼが発酵培地中に分泌される。幾つかの態様において、この分泌されたプロテアーゼレベルはｐＮＡアッセイ（例えば、Ｄｅｌ Ｍａｒ，［１９７９］上記）のようなプロテアーゼ活性解析により評価される。グラム陽性宿主細胞において異種又は相同タンパク質の分泌のレベルを決定するための追加的な方法はタンパク質に特徴とする的なポリクローナル又はモノクローナル抗体の使用を含む。例としては、当業者により知られている酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）がある。
幾つかの更なる態様において、本発明の発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヌクレオチド残基位置１乃至７５及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示すように、シグナルペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヌクレオチド１乃至７５）のアミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチドを提供する。本発明は更に低、中間、高及び／又は最大過酷条件下でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示すヌクレオチド配列にハイブリダイズする核酸配列を含む。しかしながら、これらの配列はこれらの配列と実質的に同じシグナル活性を有する。本発明はそのような全てのポリヌクレオチドを包含する。幾つかの更なる態様において、本発明は本発明の明細書で説明されるヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチドを提供する。
本発明の発明の更なる側面はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３（即ち、シグナル及び前駆体プロテアーゼ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１（即ち、前駆体プロテアーゼ）、及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（即ち、成熟プロテアーゼ）のアミノ酸配列に、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９７％、少なくとも８９％、少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含む。更なる態様において、このポリペプチドは単離されている。本発明の追加的な態様において、このポリペプチドは本発明の明細書で定義されるアミノ酸配列に同一なアミノ酸配列を含む。幾つかの更なる態様において、このポリペプチドは本明細書で定義されるアミノ酸の一部分に同一である。
幾つかの態様において、本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で提供される約４５３アミノ酸長のアミノ酸配列を含む、タンパク質分解活性を有する単離されたポリペプチドを提供する。更なる態様において、本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１で提供される約４２８アミノ酸長のアミノ酸配列を含む、タンパク質分解活性を有するポリペプチドを含む。幾つかの態様において、これらのアミノ酸配列はシグナル配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の１乃至２５アミノ酸）及び前駆体プロテアーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸１乃至４２８）を含む。追加的な態様において、本発明はＮ末端プロ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸１乃至１７２）、成熟プロテアーゼ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９の１乃至２２５６アミノ酸）、を含むポリペプチドを含む。更なる態様において、本発明は前駆体プロテアーゼ配列（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸１乃至４２８）を含むポリペプチドを含む。更なる他の態様において、本発明はアミノ酸（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９の１乃至２５６）を含む成熟プロテアーゼ配列を含む。
更なる態様において、本発明は全体のアミノ酸配列相同性が同定されているストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）を含むがこれらに限定されないバクテリア種由来の前述の配列のアミノ酸配列を含むポリペプチド及び／又はプロテアーゼを提供する。幾つかの態様において、前駆体ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）プロテアーゼのアミノ酸残渣は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）１ＡＧ３プロテアーゼにおける残渣の特定の残基マンナナーゼ部分に相同（即ち、一次構造又は三次構造のいずれかにおいて一対応している）又は異種のいずれかであるならば（即ち、結合、反応、又は化学的に相互作用することができるような同じ又は類似の機能を有する）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）１ＡＧ３の残基に等しい。
幾つかの態様において、一次構造の相同性を確立するために、前駆体プロテアーゼのアミノ酸配列は直接ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）１ＡＧ３成熟プロテアーゼアミノ酸配列を比較され、特に、配列の知られているストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）様プロテアーゼの全て又は大部分の非変異体と区別される保存残基のセットと、比較される。保存残基を位置合わせした後、配列を維持するために必要な挿入及び欠失をさせ、成熟プロテアーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）及びストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）１ＡＧ３プロテアーゼの特定のアミノ酸に対応する残基を決定する。保存残基の位置合わせはそのような残基の１００５を保存する。しかしながら、約７５％より高い又は約４５％程度の保存残基であっても等しい残基を見つけるのに適している。しかしながら、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９の触媒トリアド、Ｈｉｓ３６／Ａｓｐ６４／Ｓｅｒ１４５の保存も維持されている。
例えば、幾つかの態様において、前述のストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）１ＡＧ３及び他のストレプトマイセス種由来プロテアーゼのアミノ酸配列が位置合わせされ、アミノ酸配列間の相同性の最大量を提供する。配列間の比較は各配列に含まれている保存残基の数を提供する。これらは解析されるストレプトマイセスプロテアーゼの前駆体又は成熟体における同定されたアミノ酸の等しい残基位置を確立するために同定及び用いられる。
これらの保存残基は１つ又は他のストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）相同体におけるストレプトマイセス１ＡＧ３プロテアーゼの対応するアミノ酸残基を解明するために用いられる。これらの特例のアミノ酸配列は保存された残基の最大相同性を生成するためにストレプトマイセス１ＡＧ３の配列と整列させられる。このアラインメントにより。この配列及びストレプトマイセス１ＡＧ３の特定の残基の位置がたの微生物（例えば、ストレプトマイセス種）との比較において観察される。従って、触媒トリアドの等しいアミノ酸（例えば、ストレプトマイセス１ＡＧ３プロテアーゼ）が、他のストレプトマイセス種において同定される。本発明の幾つかの態様において、このプロテアーゼ相同体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のＨｉｓ３６／Ａｓｐ６４／Ｓｅｒ１４５に等しい残基を含む。
２つのポリペプチドが実質的に同一な２つのポリペプチドの別な指摘は第一ポリペプチドが第二ポリペプチドに免疫学的に交差反応をすることである。免疫学的交差反応を決定するための方法は従来技術であり、本明細書の実施例でも説明している。通常、保存アミノ酸置換により異なるポリペプチドは免疫学的に交差反応をする。従って、ポリペプチドが実質的に第二ポリペプチドと同一であるには、例えば、２つのポリペプチドが保存置換によってのみ異なる場合である。
本発明は各種源由来のプロテアーゼを包含する。幾つかの態様において、このプロテアーゼはバクテリア由来である。他の態様において、このプロテアーゼは糸状菌から得られる。
本発明の幾つかの他の側面において、ポリヌクレオチドはストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）１ＡＧ３の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子ヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、並びにこれに少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９８％の配列同一性を有するバクテリア由来である。
１ＡＧ３株はストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ファミリーのストレプトマイセスのメンバーに関係している１６ＳｒＲＮＡを有する。この深い関係性はストレプトマイセス１ＡＧ３株の１６Ｓ ｒＲＭＡ遺伝子ヌクレオチド配列とストレプトマイセス９７％の配列相同性を有しているストレプトマイセスソマリエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｏｍａｌｉｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭＡ４０７３８）であると信じられている。
本発明の幾つかの態様において、米国特許出願Ｎｏ．１０／５７６，３３１に記載の６９Ｂ４株である。該文献を参照により本明細書に援用する。
微生物の所与の種内に自然発生する酵素の配列には変異があるけれども、同じ種の微視エラストマー物により生成される特定のタイプの酵素は通常実質的に、基質特異性及び／又は所与の条件（例えば、温度、ｐＨ、水硬度、酸化条件、洗浄条件、及び濃度）下での活性レベル、等が同一である。したがって、本発明の目的のために、ストレプトマイセスの他の株及び種も本発明のストレプトマイセスプロテアーゼを生産し、従って、本発明の発明のプロテアーゼに対する有用な源になり得る。即ち、本発明の明細書に開示するように、ストレプトマイセスの他のメンバーも本発明の発明に用いられる。
幾つかの実施態様では、この発明のタンパク質分解性ポリペプチドは、物理化学的に特徴づけられ、一方、他の実施態様ではそれらはその機能に基づき特徴付けられ、更に他の実施態様では、それらは、両性質を用いて特徴付けられる。物理化学的な特徴づけはＳＤＳ電気泳動、ゲルろ過、アミノ酸組成、質量分析（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＰＦ−ＭＳ、ＬＣ-ＥＳ-ＭＳ/ＭＳ等）、タンパク質の分子量を決定するための沈降、タンパク質のｐＩを決定するため等電点電気泳動、タンパク質のアミノ酸配列を決定するためのアミノ酸配列決定、タンパク質の３次構造を決定するための結晶学的研究、タンパク質にある抗原性エピトープを決定するための抗体結合のような良く知られた技術を利用する。
幾つかの実施態様では、機能的特徴はこのプロテアーゼの分野で技術者に良く知られている技術により決定され、これらの技術はジメチルカゼイン（ＤＭＣ）及び/またはＡＡＰＦ−ｐＮＡのような種々の市販の基質の加水分解を含むがこれに限定されない。機能的特徴づけの好ましい技術はさらに詳細に本明細書中の実施例に、さらに詳細に記載されている。
本発明の幾つかの態様において、このプロテアーゼはＭＡＬＤＩ−ＴＯ−ＭＳにより決定される。約１７乃至約２２ｋＤの分子量、例えば、約１８ｋＤ乃至約１９ｋＤ、例えば、１８７００ダルトン乃至１８８００ダルトン、例えば、約１８７６４ダルトンの分子量を有する。本発明の他の側面において、ＭＡＬＤＩ−ＴＯ−ＭＳにより測定されるプロテアーゼは図３で定義される。
成熟したプロテアーゼは、またＤＭＣのようなタンパク質の分解活性（例えば、ペプチド結合をもつ基質に対する加水分解活性）も示す。別の実施態様では、本願発明のプロテアーゼは、特定の条件で洗浄性能が向上する。本願発明は本明細書に記載されているプロテアーゼ６９Ｂを含むが、幾つかの実施態様では、本願発明のプロテアーゼは、６９Ｂ４のタンパク質分解活性と比較して少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のタンパク質分解活性を示す。幾つかの実施態様では、このプロテアーゼは、同一の条件下、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）（Ｎｏｖｚｙｍｅｓ）またはＰＵＲＡＦＥＣＴ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）の販売名で販売されているプロテアーゼのタンパク質分解活性と比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のタンパク質分解活性を示す。幾つかの実施態様では、本願発明のプロテアーゼは、特定の条件で、同一の条件の６９Ｂ４と比較して、同程度または向上した洗浄性能を示す。幾つかの実施態様では本願発明のプロテアーゼは特定の条件下、同一条件で、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）（Ｎｏｖｚｙｍｅｓ）またはＰＵＲＡＦＥＣＴ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）の販売名で販売されているプロテアーゼと比較して、同程度または向上した洗浄性能を示す。
さらに別の実施態様では、このプロテアーゼ及び/または本願発明のプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドは精製されて提供され（つまり、天然で存在する又は野生型の生物に存在するより高いまたは低い濃度で特定の組成物に存在する）、または天然のまたは野生型の生物から発現するとき正常には存在しない成分と組み合わせて提供される。しかし、本願発明は、いずれかの特定の精製水準のプロテアーゼに限定することを意図していない。なぜならプロテアーゼの純度の種々の範囲で、本願発明のプロテアーゼが適している種々の用途が見出されるからである。
前述のように、主題のプロテアーゼをコードしている組換えポリヌクレオチドも提供される。幾つかの態様において、組換え核酸はプロモーター、主題のプロテアーゼをコードしているコード配列、及びターミネーター配列を、作動可能になるように含んでいる。ここでこの発現カセットは宿主細胞内でプロテアーゼの生成することができる。幾つかの態様において、このプロモーターはコード配列に対して異種である。
幾つかの好適な態様において、組換えポリヌクレオチドは更に主題のタンパク質を直接分泌するためのシグナル配列をコードする。幾つかの好適な態様において、この組換え核酸は組換え核酸を含まない他の細胞に対して組換え核酸を含む細胞の選択に対する選択マーカーを含む。選択マーカーの例としては、抗生物質耐性を提供する選択マーカー（例えば、ハイグロマイシン、ブレモマイシン、クロラムフェニコール、フェロマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、アンピリシン、テトラサイクリン等）を含むがこれらに限定されない。
幾つかの態様において、コード配列は用いられる宿主細胞において、融合タンパク質の発現のためにコドンが最適化されている。多くの細胞において各コドンのコドン使用表は当業者に知られており、又は容易に利用可能であるので（例えば、Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２８：２９２［２０００］）、そのような核酸は既に発現されるべきタンパク質のアミノ酸配列与えると意図されている。
幾つかの態様において、主題の組換え核酸は宿主細胞のゲノム（即ち、核ゲノム）中に存在している（例えば、ゲノムに取り込まれて）。他の態様において、主題の組換え核酸は宿主細胞内で自動的に複製するベクター（例えば、ファージ、プラスミド、ウイスル。又はレトロウイルスベクター）内に存在する。幾つかの態様において、このベクターは宿主細胞中のタンパク質を発現するための発現ベクターである。
シグナル配列、プロモーター、及びターミネーターの選択は用いられる宿主細胞に大きく依存している。前述のように、幾つかの態様において、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）宿主細胞が用いられる。幾つかの態様において、シグナル配列はｃｅｌＡシグナル配列である。幾つかの態様において、このｃｅｌＡシグナル配列はＫｌｕｅｐｆｅｌら（Ｋｌｕｅｐｆｅｌら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１４：７５６−７５９［１９９６］）に記載のようにストレプトマイセスリビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）セルラーゼＡ遺伝子、ＣｅｌＡによりコードされるシグナル配列である。バチルス宿主細胞を用いる他の態様では、このシグナル配列はバチルス宿主細胞の分泌経路内に融合タンパク質を直接分泌する任意のアミノ酸配列である。幾つかの態様において、用いることができるシグナル配列は野生型バチルス細胞から分泌されたタンパク質のシグナル配列を含む。そのようなシグナル配列はαアミラーゼ、プロテアーゼ（例えば、ａｐｒＥ又はスブチリシンＥ）、又はβラクタマーゼ遺伝子によりコードされるシグナル配列を含む。例示的なシグナル配列はバチルスステアロセレモフィリス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスリケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、及びバチルスアミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）を含むがこれらに限定されない任意のバチルス種由来のαアミラーセ遺伝子、スブチリス遺伝子、βラクタマーゼ遺伝子、中性プロテアーゼ遺伝子（例えば、ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）、又はａｐｒｓＡ遺伝子を含む。１つの態様において、このシグナル配列は、バチスルスブチリスのａｐｒＥ遺伝子（例えば、Ｏｌｍｏｓ−Ｓｏｔｏ及びＣｏｎｔｒｅｒａｓ−Ｆｌｏｒｅｓ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６２：３６９−７３［２００３］参照）である。更なるシグナルペプチドはＳｉｍｏｎｅｎ及びＰａｌｖａ（Ｓｉｍｏｎｅｎ ａｎｄ Ｐａｌｖａ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５７：１０９−１３７［１９９３］）に記載されており、当業者に知られている。
バチルス及びストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）宿主細胞に用いるのに好適なプロモーター及びターミネーターは知られており、ａｐｒ（アルカリプロテアーゼ）、 ｎｐｒ（中性プロテアーゼ）、ａｍｙ（α−アミラーゼ）及びβラクタマーゼ遺伝子、並びにバチルススブチリスのレバンスクラーゼ遺伝子、バチルスリケニフォルミスのαアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルスステアロセレモヂリスのマルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、バチルスアミロリケファシエンスのαアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、バチルスリケニフォルミスのペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、バチルススブチリスのｘｙｌＡ及びｘｙ／Ｂ遺伝子、並びにＷＯ９３／１０２４９、ＷＯ９８／０７８４６、及びＷＯ ９９／４３８３５のプロモーター及びターミネーターを含む。ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）宿主細胞に用いる発現カセットはこのプロモーター及びターミネーターを用いて作ることができ、当業者に知られている（例えば、Ｈｏｐｗｏｏｄら， Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ［１９８５］；Ｈｏｐｗｏｏｄら，Ｉｎ Ｂｏｏｔｈ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ（Ｅｄｓ．）Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，［１９８６］ ２５１−２７６ページ；Ｆｏｒｎｗａｌｄら， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ， ８４：２１３０−２１３４［１９８７］；Ｐｕｌｉｄｏら、Ｇｅｎｅ５６：２７７−８２［１９８７］；Ｄｅｈｏｔｔａｙら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６６：３４５−５０［１９８７］）；Ｔａｇｕｃｈｉ，Ｇｅｎｅ８４：２７９−８６［１９８９］；Ｓｃｈｍｉｔｔ−Ｊｏｈｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６：４９３−８ ［１９９２］；Ｍｏｔａｍｅｄｉ，Ｇｅｎｅ１６０：２５−３１［１９９５］、及びＢｉｎｎｉｅ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，１１：２７１−８［１９９７］参照）。幾つかの態様において、Ａ４プロモーターが用いられる（ＷＯ０６／０５４９９７参照、参照により本明細書に援用する）。
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、バチルス、アスペルギルス、トリコデルマ、及び他の宿主細胞における組換えタンパク質の発現のためのベクターシステムは当業者に知られている。任意の好適なベクターを本発明の発明に用いることを意図する。
ＩＩＩ．本発明のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ（例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ））をコードしているポリヌクレオチドの入手
幾つかの態様において、本願発明のプロテアーゼをコードする核酸は本願技術分野で知られている標準的手順により得られる。例えば、クローンＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ「ライブラリー」）、化学合成、ｃＤＮＡクローニング、ＰＣＲ，ゲノムＤＮＡまたはその断片のクローニング、または細菌又は菌類の種のような望む細胞から精製される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら 上記［１９８９］；及びＧｌｏｖｅｒとＨａｍｅｓ（編）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，１、２巻、第２版参照）ポリヌクレオチド配列の合成は、自動合成装置（Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒらＮｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２：６１５９−６１６８［１９８４］参照）の使用を含め本願技術分野では良く知られている（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ とＣａｒｕｔｈｅｒｓ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，２２，：１８５９−１８６２［１９８１］参照）。ＤＮＡ配列も、希望に応じ作ることができ種々の販売業者に注文できる。本明細書にさらに詳細に述べられているように、幾つかの実施態様では、ゲノムＤＮＡ由来の核酸配列はコードする領域に加えて調節領域を含む。
ゲノムＤＮＡ由来の遺伝子の分子クローニングを含む幾つかの実施態様では、ＤＮＡ断片が作成され、そのいくつかは、望む遺伝子の少なくとも一部を含む。幾つかの実施態様では、ＤＮＡは種々の制限酵素を用いて特定の位置で切断される。幾つかの別の実施態様では、ＤＮＡを切断するため、ＤＮＡ分解酵素がマンガン存在下で使用され、またはＤＮＡが物理的に切断される（例えば、超音波処理による）。作成された線状のＤＮＡ断片は次に、アガロース及びポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＰＣＲ及びカラムクロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない標準的方法により、大きさにより分離され、増幅される。
核酸断片が生じたら、プロテアーゼをコードする特定のＤＮＡ断片の同定は多くの方法で達成できよう。例えば、幾つかの実施態様では、１ＡＧ３遺伝子をコードしているタンパク質分解性加水分解酵素をコードするａｓｐ遺伝子またはその特異的ＲＮＡ、または、プローブやプライマーのようなそれらの断片が単離され、ラベルされ、次に本願技術分野の技術者に良く知られているハイブリダイゼーション分析で使用され、生じた遺伝子を検出する（例えば、Ｂｅｎｔｏｎ及びＤａｖｉｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６：１８０［１９７７］参照）。好ましい実施態様では、このプローブと類似する相当の配列を共有するＤＮＡ断片群は、中程度から高度に厳密な条件でハイブリダイズする。
幾つかの好ましい実施態様では、増幅は本願技術分野で知られているように、ＰＣＲを用いて達成される。幾つかの好ましい実施態様では、少なくとも約４個のヌクレオチドと約６０個ものヌクレオチドの核酸配列、（つまり断片）、好ましくは約１２個から３０個のヌクレオチド、及びより好ましくは約２５個のヌクレオチドの核酸配列がＰＣＲプライマーとして、いずれかの適当な組合せで使用される。これら同一の断片はまたハイブリダイゼーション及び生成物検出法でもプローブとして使用される。
幾つかの実施態様では、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーから本願発明の核酸構造体の単離はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３又は８のアミノ酸配列に基づいて調製された縮重したオリゴヌクレオチドプライマー群によるＰＣＲを利用する。これらのプライマーはどのような断片長でも良く、例えば、長さは少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも８個、少なくとも１５個、少なくとも２０個のヌクレオチド長である。本発明の例示的なプローブは、実施例で詳述するように、ＴＴＧＷＨＣＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）及びＧＤＳＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）に対応する配列を含むプライマーを用いる。
上記の点から、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列で、本明細書で提供されるヌクレオチド配列に基づくものが、他の種、特にプロテアーゼ１ＡＧ３により発現されるセリンプロテアーゼ活性をもつ酵素をコードする細菌由来のポリヌクレオチドと同一の又は相同な断片を得るのに有用であると評価されるであろう。
ＩＶ．本発明のセリンプロテアーゼの発現と回収
本願発明のセリンプロテアーゼの発現と回収のいずれの適切な方法も本明細書で使用できる。実際、本願発明の技術分野の技術者は、他の追加の酵素（例えば、プロテアーゼのようなタンパク質分解活性をもつ第２のペプチド、セルラーゼ、マンナナーゼ又はアミラーゼ等）とともに、タンパク質分解活性をもつセルロモナス由来のポリペプチドをクローニングするために適した多くの方法を知っている。所望の追加配列と組み合わせて本願発明の酵素をコードするポリヌクレオチドの少なくとも１個の（例えば、多数の）コピーを宿主細胞の遺伝子又はゲノムに導入するための、多くの方法もまた本技術分野で知られている。
一般に、遺伝子をクローニングし、外因性のプロテアーゼをコードする領域（外因性のコード領域の多数のコピーを含む）を前記遺伝子へ導入する標準的手順はストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ）１ＡＧ３プロテアーゼ誘導体またはその相同体を得る際に使用される。実際に、本願明細書は、実施例を含め、そのように教示している。しかし、本願技術分野で知られている他の方法もまた適当である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら上記（１９８９）；Ａｕｓｂｅｌら、上記［１９９５］；及びＨａｒｗｏｏｄとＣｕｔｔｉｎｇ（編） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，［１９９０］及びＷＯ９６／３４９４６参照）。
幾つかの好ましい実施態様では、本願発明のポリヌクレオチド配列は、適当な発現ベクターの中で発現調節配列にこのポリヌクレオチド配列を機能的に連結することにより発現され、本願技術分野で良く確立されている技術に従い適当な宿主を形質転換するためこの発現ベクターにより使用される。幾つかの実施態様では、本願発明のＤＮＡ配列の発現時に産生されるポリペプチドは、本願技術分野で良く確立された技術に従い種々の方法で細胞培養をする醗酵から単離され、精製される。本願技術分野の技術者は最も適した単離及び精製技術を選ぶことができる。
特に、本願発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む構造体、ベクター、そのようなベクターで形質転換された宿主細胞、そのような宿主細胞で発現されたプロテアーゼ、微生物、（特にミクロコッカス亜目（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｉｎｅａ）に属するもの、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）種を含むがこれらに限定されない）由来のセリンプロテアーゼ酵素を産生する発現方法とシステムを提供する。幾つかの実施態様では、セリンプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドは、セリンプロテアーゼの発現に適した組換え宿主細胞を作成すりために試用される。幾つかの実施態様では、この発現宿主は商業的利用が可能な量でプロテアーゼを産生することができる。米国特許出願第Ｓｅｒ．Ｎｏ．１０／５７６，３３１号にさらに詳細が記載されている。
Ｖ．組換えベクター
先に示したように、幾つかの実施態様では、本願発明は先に述べたポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。幾つかの実施態様では、このプロテアーゼをコードするこの発明のベクター（つまり、構造体）は、ゲノム由来である（例えば、ゲノムのライブラリーを使用し、標準的技術により合成オリゴヌクレオチドのプローブを使用してハイブリダイゼーションによりこのプロテアーゼの全て又は一部をコードするＤＮＡ配列のスクリーニングにより調製される）。幾つかの態様において、このプロテアーゼをコードしているＤＮＡ配列は、実施例に記載のようにストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）１ＡＧ３由来の染色体ＤＮＡを単離して、ＰＣＲによりこの配列を増幅することにより得られる。
代替的な態様において、前記化合物をコードする核酸配列は確立されている標準的な方法を用いて合成により調製することができる（例えば、Ｂｅｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ．Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９−１８６９［１９８１］に記載のｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄｉｔｅ法；又はＭａｔｔｈｅｓ ら、ＥＭＢＯ J., ３：８０１−８０５［１９８４］に記載の方法）。ホスホロアミダイド（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄｉｔｅ）法において、オリゴヌクレオチドが合成される（例えば、自動ＤＮＡ合成機において）、精製、アニール、結合され、及び/又は好適なベクター内でクローニングされる。
追加的な態様において、核酸構築物は混合された合成又はゲノム由来である。幾つかの態様において、標準的な技術により、この構築物は合成又はゲノムＤＮＡのフラグメントの結合により調製される。このフラグメントは核酸構築物全体の各種部分に態様している。
更なる態様において、本発明は本発明のＤＮＡ構築体を少なくとも１つ含むベクターを提供する。幾つかの態様において、本発明は組換えベクターを含む。自動的に複製するベクター、並びに宿主細胞ゲノム内に取り込むベクター（自動複製的又は安定的に）を含む任意の好適なベクターが本発明に用いることができる。即ち、数多くのベクター及び黒ニングに好適な発現カセット、糸状菌（カビ及び酵母）、バクテリア、昆虫、及び植物中での形質転換及び発言は当業者に知られている。通常、ベクター又はカセットは核酸の転写及び翻訳、選択マーカー、及び自動複製又は染色体取り込みを可能ならしめる配列に関する配列を含んでいる。幾つかの態様において、好適なベクターは転写開始の制御に関する遺伝子の５’領域及び転写停止を制御する３’領域のＤＮＡフラグメントを含む。これらの制御領域は、宿主細胞内で選択された制御領域が機能できる限り、宿主細胞に対して相同でもよいし、同一でもよい。
幾つかの態様において、このベクターはＤＮＡのテンスアスペルギスルに必要とされている追加的なセグメントに作動可能に結合している本発明のプロテアーゼをコードしているＤＮＡ配列における発現ベクターである。幾つかの態様において、この発現ベクターはプラスミド又はウイルスＤＮＡでよい。代替的な幾つかの態様では両方のエレメントを含む。例示的なベクターはｐＳＥＡ４Ｃ、ｐＳＥＡＣＴ、及び／又はｐＳＥＡ４ＣＴ、のほかに本明細書の実施例で説明するベクターの全てを含む。そのようなベクターの構築は、本明細書で開示しており、方法は当業者に知られている（例えば、米国特許第６，２８７，８３９号及びＷＯ０２／５０２４５参照）。幾つかの態様において、本明細書で開示するｐＳＥＡ４Ｃは本明細書でのべつポリヌクレオチドを含むベクターの構築に用いることができる（例えば、ｐＳＥＡ４ＣＴ−１ＡＧ３）。即ち、本明細書で開示する全てのベクターが本発明に用いることができる。
幾つかの態様において、転写に必要な追加的なセグメントは、当業者に知られているように、調節システムを含む（例えば、プロモーター、分泌セグメント、インヒビター、グローバルレギュレーター等）。一例としては、選択された宿主細胞において転写活性を示し、宿主細胞と相同又は異種のいずれかのタンパク質をコードしている遺伝子由来の任意のＤＮＡ配列を含む。具体的には、バクテリア細胞に用いるための好適なプロモーターの例としては、バチルスステアロセレモフィリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトース生成アミラーゼ遺伝子、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）（ＢＡＮ）アミラーゼ、バチルススブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルカリプロテアーゼ遺伝子、バチルスクラウジ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）アルカリプロテアーゼ遺伝子、バチルスプミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）キシロシダーゼ遺伝子、バチルスツリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙｌｌｌＡ、及びバチルスリケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）αアミラーゼ遺伝子のプロモーターを含むがこれらに限定されない。追加的なプロモーターは本明細書で説明するように、Ａ４プロモーターを含む。本発明に用いる他のプロモーターはＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃ、ｔｒｐ、又はｔａｃプロモーターのほかに、ファージラムダＰＲ又はＰＬプロモーターを含むがこれらに限定されない。
幾つかの態様において、このプロモーターは前述のプロモーターに対して実質的に同じ活性を有するプロモーター又はセグメントをコードしている遺伝子由来である。本発明は、中間、高、及び／又は最大過酷条件で前述のプロモーターにハイブリダイズする、又は同じプロモーター活性を有してはいないが、前述のプロモーターに少なくとも約加えて９０％同一及び少なくとも９５％同一な核酸配列を含む。幾つかの態様において、このプロモーターはプロモーター及び／又は異種ＤＮＡ（例えば、本発明のプロモーターに加えてタンパク質の酵素）全体の発現をプロモートするために用いる。追加的な態様において、このベクターは少なくとも１つの選択マーカーを含む。
幾つかの態様において、本発明の組換えベクターは宿主細胞中でベクターを複製させるためのＤＮＡ配列を更に含む。バクテリア宿主細胞を含む幾つかの態様において、これらの配列はプラスミド複製に必要な配列の全てを含む（例えば、ｏｒｉ及び／又はｒｅｐ配列）。
幾つかの好適な態様において、シグナル配列（例えば、リーダー配列又はプレ配列）も、本発明のポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に導くために、ベクターに含まれる。幾つかの態様において、分泌シグナル配列は正確なリーディングフレームにおける前駆体タンパク質をコードしているＤＮＡ配列に結合される。プロテアーゼが細胞内に発現されるか、又は分泌されるかにより、本発明のポリヌクレオチド又は発言ベクターは天然のポリヌクレオチドシグナル配列又はバクテリア内（例えば、バチルス、）糸状菌（例えば、トリコデルマ）、他の真核又は原核細胞において昨日するシグナル配列と一緒又はこれらを含まずに、設計される。幾つかの態様において、発現はシグナル配列を完全又は部分的に除去して達成される。
バクテリア細胞からの分泌を含む幾つかの態様において、シグナルペプチドは自然派生シグナルペプチド又はこれらの機能的な部分である。他の態様において、シグナルペプチドは合成ペプチドである。好適なシグナルペプチドはバチルスリケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）αあミラーゼ遺伝子、バチルスクラウジ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）アルカリプロテアーゼ遺伝子、及びバチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）アミラーゼ遺伝子を含むがこれらに限定されない配列を含む。１つのシグナル配列は本明細書で述べる、ストレプトマイセス１ＡＧ３である。従って、幾つかの好適な態様において、このシグナルペプチドは本明細書のプロテアーゼからのシグナルペプチドを含む。このシグナルは１ＡＧ３プロテアーゼ及び／又は異種ＤＮＡ配列（例えば、野生型プロテアーゼ、ＢＰＮ変異プロテアーゼ等の第二プロテアーゼ、ＧＧ３６変異体プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、マンナナーゼ等）の分泌の促進に用いられる。幾つかの態様において、これらの第二酵素は当業者に知られているＤＮＡ配列及び／又はアミノ酸配列によりコードされる（例えば、米国特許第６，４６５，２３５号、６，２８７，８３９号、５，９６５，３８４号、及び５，７９５，７６４号、並びにＷＯ９８／２２５００、ＷＯ９２／０５２４９、ＥＰ０３０５２１６Ｂｌ及びＷＯ９４／２５５７６参照）。更に、幾つかの態様において、このシグナルペプチドは内性配列に作動可能に結合して、内性的にコードされているプロテアーゼを活性化及び／又は分泌する。
本発明のプロテアーゼをコードするＤＮＡ配列、プロテアーゼ及び／又は分泌シグナル配列のそれぞれを結合し、複製のために必要な情報を含む公的なベクターに挿入するに用いる手順は当業者に知られている。前述のように、幾つかの態様において、核酸構築体は特定のプライマーを用いたＰＣＲを用いて調製される。
ＶＩ．宿主細胞
前述のように、幾つかの態様において、本発明は前述のベクターで形質転換した宿主細胞も提供する。幾つかの態様において、宿主細胞に導入された本発明のプロテアーゼをコードしているポリヌクレオチドは相同体である。他の態様において、このポリヌクレオチドは宿主細胞に対して異種である。ポリヌクレオチドが宿主細胞に相同である幾つかの態様において（例えば、宿主細胞により生成される天然プロテアーゼの追加的なコピー）、このポリヌクレオチドは他の相同又は異種プロモーター配列に作動可能に結合している。代替的な態様において、他の分泌シグナル配列及び／又はターミネーター配列も本発明に用いることができる。従って、幾つかの態様において、このポリヌクレオチドＤＮＡ配列は相同ポリペプチド配列、異種生物からの相同ポリペプチド配列、又は合成ポリペプチド配列の複数のコピーを含む。即ち、本発明を特定の宿主細胞及び／又はベクターに限定することを意図しない。
即ち、本発明のＤＮＡ構築体が導入される宿主細胞はバクテリア、糸状菌、及び高等真核生物を含むがこれらに限定されない、本発明のアルカリ性プロテアーゼを生成することができる任意の細胞を含む。
本発明に用いるバクテリア宿主細胞の例としては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、及びセルモビフィダ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）等のグラム陽性バクテリア、例えば、バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルスリケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスレンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルスブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルスステアロデレモフィリス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスクラウジ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、バチスルアミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスコアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルスサーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルスレンタス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、バチルスメガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルスツリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、ストレプトマイセスグリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセスリビダンス（Ｓ． ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセスコエリコラ（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセスアベルミチリス（Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）及びトリコデルマフースカ（Ｔ．ｆｕｓｃａ）、並びに腸内細菌等のグラム陰性バクテリア（例えば、大腸菌）を含むがこれらに限定されない。幾つかの態様において、宿主細胞はバチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルスクラウジ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、及び／又はバチルスリケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）である。追加的な態様において、この宿主細胞はストレプトマイセスリビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）（例えば、ＴＫ２３及び／又はＴＫ２１）である。プロトプラスト形質転換、適合細胞の使用等を含むがこれらに限定されない、当業者に知られているような方法を用いて本発明に用いるバクテリアの形質転換を行うことができる。幾つかの態様において、米国特許第５，２６４，３６６号（参照により本明細書に援用する）記載の方法も本発明に用いることができる。ストレプトマイセスリビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）については、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ａｂ ａｌｏｓらによる方法（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ａｂａｌｏｓら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１４９：１６２３−１６３２［２００３］参照、Ｈｏｐｗｏｏｄら、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｉｎｎｉｓ［ｅｄｓ．］［１９８５］も参照、これらの文献を参照により本明細書に援用する）を用いることができる。もちろん、実施例に記載の方法も本発明に用いることができる。
本発明に用いる糸状菌宿主細胞の例としては、トリコデルマ種及びアルペルギルス種を含むがこれらに限定されない。幾つかの特定の態様において、この宿主細胞はトリコデルマレーシ及び／又はアルペルギルスニガーである。幾つかの態様において、アルペルギルスにおける形質転換及び発言は米国特許第５，３６４，７７０（参照により本明細書に援用）に記載されている。もちろん、実施例に記載の方法も本発明に用いることができる。
幾つかの態様において、特定のプロテアーゼ及びシグナル配列が本発明のプロテアーゼの効率的な形質転換及び発現に必要とされる。従って、バチルス宿主細胞を使用する幾つかの態様において、ａｐｒＥプロモーターが既知のバチルス由来シグナル配列及び他の調節配列と組み合わせて用いられる。アスペルギスルにおける発現を含む幾つかの態様において、ｇｌａＡプロモーターが用いられる。ストレプトマイセス宿主細胞を含む幾つかの態様において、アクチノマイセスミソウリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）を用いる。他の態様では、Ａ４プロモーターを用いる。
Ｅ．ｃｏｌｉ等のバクテリアにおける発現を含む幾つかの態様において、プロテアーゼは細胞質中に、特に不溶性顆粒として（即ち、封入体として）保持される。しかしながら、他の態様において、プロテアーゼはバクテリア分泌配列によりペプラズム空間に誘導される。前述の場合、この細胞は溶解され、顆粒を回収し、変性剤を希釈剤すてプロテアーゼの再折りたたみを行ったあと、回収、変性する。後者の場合、このプロテアーゼは細胞を壊して（例えば、超音波又は浸透圧ショックにより）、ペププラズム空間に内容物を放出して、タンパク質を回収しうることにより、ペリプラズム空間から回収される。
幾つかの態様において、本発明の形質転換された宿主細胞は本発明のプロテアーゼの発現を許容する条件下で好適な培養培地において培養される。その後で得られたプロテアーゼが培地から回収される。好適なサプリメントを含む最小又は複合培地等の宿主細胞の育成に好適な任意の従来の配置を細胞の培養に用いることができる。好適な培地は市販されており、当業者が知る既知のレシピに従って調製することができる。幾つかの態様において、細胞により生成されたプロテアーゼは延伸分離、又はろ過、塩（例えば、硫酸アンモニウム）によるタンパク質様物質又はろ過物の沈殿、クロマトグラフ精製（例えば、イオン交換、ゲルろ過、親和等）を含むがこれらに限定されない従来の歩ホウにより、培養培地から回収される。従って、本発明のプロテアーゼを回収するための任意の方法を用いることができる。即ち、本発明を特定の精製方法に限定することは意図しない。
ＶＩＩ．セリンプロテアーゼ酵素の適用
本明細書にさらに詳細に記載されているように、本願発明のプロテアーゼはある用途に非常に適するようにする重要な特徴を持っている。例えば、本願発明のプロテアーゼは幾つかの従来用いられているプロテアーゼに対して熱的安定性、酸化安定性、及びキレート安定性が向上している。従って、これらのプロテアーゼは洗浄組成物に用いることができる。実際、ある洗浄条件では、このプロテアーゼは現在使用されているスブチリシンプロテアーゼと比較して、同程度または向上した洗浄性能を示す。従って、本願発明の洗浄及び/または酵素組成物は種々の洗浄剤組成物に提供されると考えられている。幾つかの実施態様では、本願発明のプロテアーゼはスブチリシンプロテアーゼ（つまり、現在使用されているプロテアーゼ）と同一の方法で利用されている。従って、本願のプロテアーゼは動物飼料、皮革処理（例えば、なめし剤）、タンパク質加水分解、及び織物産業での用途のほか、種々の洗浄剤組成物に用途がある。
従って、本願発明のプロテアーゼは、多くの産業的用途があり、特に洗浄、殺菌、動物飼料、及び織物/皮革産業に用途がある。幾つかの実施態様では、本願発明のプロテアーゼは、洗剤、研磨剤、漂白剤及び他の従来の成分と組み合わされて、洗濯及び他の洗浄技術、例えば、洗濯洗剤（粉末及び液体）、洗濯用予浸剤、全ての布地漂白剤、自動皿洗機用洗剤（液体及び粉末）、家庭用洗浄剤、特に棒状と液状の石鹸及び排水管洗浄剤等、で有用な種々の新規な組成物洗剤を形成する。加えて、このプロテアーゼは、コンタクトレンズや他の製品を、この洗浄剤組成物の水性溶液と接触させることにより洗浄する用途がある。加えて、これらの天然のプロテアーゼは、例えば、ペプチド加水分解、廃棄物処理、織物産業用途、医療機器洗浄、バイオフィルム除去に、及びタンパク質生産における融合-切断酵素として使用できる。プロテアーゼが、使用条件でその機能を維持する限り、これらの製品群の組成は、本願発明には決定的ではない。幾つかの実施態様では、この組成物は洗浄に効果的な量のプロテアーゼ、またはこのプロテアーゼの酵素剤を含む酵素組成物を、酵素組成物の従来の成分とこの技術分野で認められている量で組み合わせることにより容易に調製される。
本発明のプロテアーゼは特に洗濯用及び食器用を含むがこれらに限定されない洗剤産業に用いることができる。このような製品は酵素を様々な環境ストレス下で持ちルことになる。本発明のプロテアーゼは各種条件下で他の安定性に依存した、高度を用いた多くの従来の使用に対して有利である。
即ち、実際、種々の洗剤の調合、洗浄用の水量、洗浄用の水温、洗浄時間等、洗浄に使用するプロテアーゼが晒される種々の洗浄条件がある。加えて、異なる地域で使用される洗剤組成物は異なる濃度の関係成分を洗浄用の水に溶かす。例えば、ヨーロッパの洗剤は通常、洗浄用の水に約４５００乃至５０００ｐｐｍの洗剤成分を溶かす。一方、日本の洗剤は、通常、約６６７ｐｐｍの洗剤成分を洗浄用の水に溶かす。北アメリカ、特に米国では、洗剤は通常、約９７５ｐｐｍの洗剤成分を洗浄用の水に溶かす。
低洗剤濃度システムは、約８００ｐｐｍ未満の洗剤成分を洗浄用の水に溶かす洗剤を含む。日本の洗剤は、約６６７ｐｐｍの洗剤成分を洗浄用の水に溶かすので、通常低洗剤濃度システムである。
中程度の洗剤濃度は約８００ｐｐｍと約２０００ｐｐｍの間で、洗剤成分を洗浄用の水に溶かす洗剤を含む。北アメリカの洗剤は、約９７５ｐｐｍの洗剤成分を洗浄用の水に溶かすので、一般的に中程度の洗剤濃度システムであると考えられている。ブラジルのものは約１５００ｐｐｍの洗剤成分を洗浄用の水に溶かす。
高洗剤濃度システムは約２０００ｐｐｍより高濃度の洗剤成分が洗浄用の水に溶かす洗剤を含む。ヨーロッパの洗剤は、約４５００乃至５０００ｐｐｍの洗剤成分を洗浄用の水に溶かすので高洗剤濃度システムであると一般的に考えられている。
ラテンアメリカの洗剤は高濃度石鹸水リン酸研磨剤洗剤であり、ラテンアメリカで使用される洗剤の範囲は、１５００ｐｐｍから６０００ｐｐｍの洗剤成分が洗浄用の水に溶けるので、中程度及び高洗剤濃度の両者に属し得る。先に述べたように、ブラジルのものは通常、約１５００ｐｐｍの洗剤成分を洗浄用の水に溶かす。しかし、他のラテンアメリカ諸国に限らず、他の高濃度石鹸水リン酸研磨剤洗剤地域は、約６０００ｐｐｍまでの洗剤成分を洗浄用の水に溶かす高洗剤濃度システムをもつかもしれない。
先に述べたことから、世界中の通常の洗浄溶液の洗剤成分の濃度は、約８００ｐｐｍ未満の洗剤組成物（「低洗剤濃度地域」）、例えば日本では約６６７ｐｐｍ、から約８００ｐｐｍと約２０００ｐｐｍの間（「中程度の洗剤濃度地域」）、例えば米国で約９７５ｐｐｍ、及びブラジルで約１５００ｐｐｍ、さらに約２０００ｐｐｍより高濃度（「高洗剤濃度地域」）、例えば、ヨーロッパで約４５００ｐｐｍから約５０００ｐｐｍ及び高濃度石鹸水リン酸研磨剤洗剤地域で約６０００ｐｐｍ、に及ぶことが明らかである。
通常の洗浄液の濃度は実験的に決定される。例えば、米国では、通常の洗濯機は約６４．４Ｌの容量の洗濯液を保持する。従って、約９７５ｐｐｍの洗剤濃度を洗浄液に得るためには約６２．７９ｇの洗剤組成物６４．４Ｌの洗浄液に加えられなければならない。この量は洗剤に付けられた秤量カップを使用して消費者が洗浄用の水に量り入れる通常の量である。
別の例として、異なった地域では異なる洗濯温度を用いる。日本では洗濯水の温度は通常、ヨーロッパで使用されるよりも通常低い。例えば、北アメリカと日本の洗濯水の温度は１０℃と３０℃の間（例えば、約２０℃）であり得るが、ヨーロッパの洗濯水の温度は通常３０℃と６０℃の間である（例えば、約４０℃）。
別の例として、地域性は、通常、水の硬度の違いを含む。水の硬度は普通、ガロン（ｇａｌｌｏｎ）当たりのＣａ２＋／Ｍｇ２＋を併せたグレイン（ｇｒａｉｎ）により表される。硬度は水に含まれるカルシウム（Ｃａ２＋）とマグネシウム（Ｍｇ２＋）の量の尺度である。米国の大部分の水は硬水であるが、硬度はかわる。中程度の硬水（６０乃至１２０ｐｐｍ）から硬水（１２１乃至１８１ｐｐｍ）は、６０から１８１ｐｐｍ（ｐｐｍのＵＳガロン当たりのグレインへの変換は、１７．１でｐｐｍを割って得られる）の硬度の鉱物を含む。
Figure 2011501961
ヨーロッパの水の硬度は通常、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋総量がガロン当たり１０．５（例えば、１０．５−２０．０）グレインより大きい（例えば、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋総量がガロン当たり約１５グレイン）。北アメリカの水の硬度は通常日本の水の硬度より大きく、ヨーロッパの水の硬度より小さい。例えば、北アメリカの水の硬度は３から１０グレインの間、３乃至８グレイン又は約６グレインでありうる。日本の水の硬度は通常、北アメリカの水の硬度より低く、普通、４より小さく、例えばガロン当たり３グレインのＣａ２＋／Ｍｇ２＋総量である。
従って、幾つかの実施態様では、本願発明は少なくとも一組の洗浄条件（例えば、水温、水の硬度、及び/または洗剤濃度）で驚くべき洗浄性能を示すプロテアーゼを提供する。幾つかの実施態様では、本願発明のプロテアーゼは洗浄性能においてスブチリシンプロテアーゼに匹敵する。幾つかの実施態様では、本願発明のプロテアーゼはスブチリシンプロテアーゼと比較して向上した洗浄性能を示す。従って、本願発明の幾つかの好ましい実施態様では、本明細書に記載のプロテアーゼは、向上した酸化安定性、向上した熱的安定性、及び/または向上したキレート安定性を示す。
幾つかの実施態様では、本願発明はこのプロテアーゼの相同種及び変異種のほか、１ＡＧ３プロテアーゼを提供する。これらのプロテアーゼは布地からタンパク質に基づく汚れを洗浄するためことを望むいずれの用途にも使える。
幾つかの実施態様では、本願発明の洗浄剤組成物は、皿洗いのほか、洗濯用添加物組成物、汚れた布地の前処理での使用に適した組成物、すすぎで加えられる柔軟剤組成物、及び家庭内の硬い表面一般の洗浄作業で使用する組成物を含む手洗い及び機械洗い用洗剤組成物として調合されている。本願技術分野の者は洗浄剤組成物として使用しうる種々の調合についてよく知っている。好ましい実施態様では、本願発明のプロテアーゼは洗剤組成物で、同程度又は向上した性能をもつ（つまり、他のプロテアーゼと比較したとき）。幾つかの実施態様では、洗浄性能は、標準的方法である、タマゴ、草、血液、牛乳等の酵素に感受性のある汚れを用いる種々の洗浄分析において、本願発明のプロテアーゼをスブチリシン（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）プロテアーゼと比較して評価される。実際、本願技術分野の者は、標準的洗浄サイクル条件下、洗浄剤性能を評価するために使用される分光学的及び他の分析的方法を良く知っている。
本願発明に使用される分析はＷＯ９９/３４０１１及び米国特許第６，６０５，４５８号（例えば実施例３を参照）で記載された分析を含むがこれらに限定されない。米国特許第６，６０５，４５８号、実施例３においては、撹拌子を使用した１５０mＬのガラスビーカー中で、ｐＨ１０．５で３．０ｇ／Ｌ洗剤量、１５℃で１５分の洗濯時間、水の硬度６°ｄＨ，１０ｎＭの酵素濃度、５０ｍｌ中に５枚の布地片（ファイ２．５ｃｍ）、試験物質センター、オランダ（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｅｓｔ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｈｏｌｌａｎｄ）のＥＭＰＡ１１７試験物質が使用されている。試験物質に関し反射率「Ｒ」の測定はＭａｃｂｅｔｈ ＣｏｌｏｒＥｙｅ７０００光度計を用いて４６０ｎｍで行われた。その他の方法は本明細書の実施例に記載されている。このように、これらの方法もまた、本願発明で使用されている。
従来の洗浄剤組成物に本発明のプロテアーゼを添加することにより、特に用途が限定されることはない。言い換えれば、ｐＨが本明細書に記載した範囲内にある限り、温度が記載されているプロテアーゼの変性温度より低い限り、その洗剤に適したどのような温度、ｐＨもまた、本願の組成物に適している。加えて、本願発明のプロテアーゼは洗剤を含まない、プロテアーゼのみの、又は研磨剤、安定剤と組み合わされた組成物に使用できる。
洗浄剤組成物又は洗剤において使用する場合、酸化に対する安定性がさらに考慮される。つまり、種々の用途に安定性は求められるが、幾つかの用途では、安定性は、向上し、低下し又はスブチリシンプロテアーゼに匹敵する。幾つかの好ましい実施態様では、酸化安定性は向上することが求められる。本願発明のプロテアーゼのいくつかはそのような用途に特に用いられる。
洗浄剤組成物または洗剤の中で使用されるときは、熱的安定性がさらに考慮される。つまり、種々の用途に安定性は求められるが、幾つかの用途では、安定性は向上し、低下しまたはスブチリシンプロテアーゼに匹敵する。幾つかの好ましい実施態様では、熱的安定性が向上することが望ましい。本願発明のプロテアーゼのいくつかはそのような用途に特に用いられる。
洗浄剤組成物又は洗剤の中で使用される場合、キレート剤に対する安定性がさらに考慮される。つまり、種々の用途に安定性は求められるが、幾つかの用途では、この安定性は
向上し、低下しまたはスブチリシンプロテアーゼに匹敵する。幾つかの好ましい実施態様では、キレート剤安定性は向上することが求められる。本願発明のプロテアーゼのいくつかはそのような用途に特に使用される。
本願発明の幾つかの実施態様では、スブチリシンプロテアーゼと比較したとき異なるｐＨで修飾された酵素活性を示す天然のプロテアーゼが提供される。ｐＨ−活性プロファイルは酵素活性対ｐＨのプロットであり、実施例に記載されているように作成されても良く、及び/または本願発明の技術分野で知られている方法で作成されても良い。幾つかの実施態様では、より広いプロファイル（つまり、比較のスブチリシンプロテアーゼよりｐＨの範囲で高い活性をもつもの）をもつ天然のプロテアーゼを得ることが望ましい。他の実施態様では、この酵素はいずれのｐＨでも有意に高い活性をもたない、またはより鋭いプロファイル（つまり、所与のｐＨでは、スブチリシンプロテアーゼと比較したとき活性が向上し、他の領域では活性が低いもの）をもつ天然の相同体である。つまり、種々の実施態様では、本願発明のプロテアーゼ群は最適なｐＨ及び/またはｐＨ範囲が異なっている。本願発明はいずれか特定のｐＨまたはｐＨ範囲に限定することを意図していない。
本願発明の幾つかの実施態様では、洗浄剤組成物は、１ＡＧ３及び/または本願発明の他のプロテアーゼをこの組成物の重量に対し０．００００１％から１０％の水準で、本願発明のプロテアーゼを含み、この組成物の重量の残部（例えば、９９．９９９％から９０．０％）は、洗浄添加剤を含む。本願発明の他の面では、本願発明の洗浄剤組成物は６９B4と/または他のプロテアーゼを、この組成物の重量に対し０．０００１%から１０％、０．００１％から５％、０．００１％から２％、０．００５％から０．５％の水準で含み、洗浄剤組成物の残部（例えば、重量で９９．９９９９％から９０．０％、９９．９９９％から９８％、９９．９９５％から９９．５％）は洗浄添加剤を含む。
幾つかの実施態様では、好ましい洗浄剤組成物は、本発明のプロテアーゼ調合剤に加え、洗浄性能を与え、及び/または布地を保護する効果を与える1以上の追加の酵素または酵素誘導体を含む。そのような酵素は、他のプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、パーオキシダーゼ、オキシダーゼ（例えば、ラッカーゼ）と/またはマンナナーゼを含むがこれらに限定されない。
アルカリ溶液での使用に適するいずれか他のプロテアーゼは本願発明の組成物で使用される。適当なプロテアーゼは動物、植物または微生物由来のものを含む。特に好ましい実施態様では、微生物のプロテアーゼが使用される。幾つかの実施態様では、化学的にまたは遺伝学的に修飾された突然変異体が含まれる。幾つかの実施態様では、このプロテアーゼはセリンプロテアーゼであり、好ましくはアルカリ性微生物プロテアーゼまたはトリプシン様プロテアーゼである。アルカリ性プロテアーゼの例はスブチリシン類、特にバチルス属由来（例えば、スブチリシン、レンタス、アミロリケファシエンス、スブチリシンカールスベルク、スブチリシン３０９、スブチリシン１４７とスブチリシン１６８）のものである。その他の例は米国特許第 ＲＥ３４，６０６号、５，９５５，３４０号、５，７００，６７６号、６，３１２，９３６号及び６，４８２，６２８号で記載されているこれらの突然変異プロテアーゼを含み、これらの全ては引用により本明細書に含める。その他のプロテアーゼの例は、トリプシン（例えば、ブタまたはウシの）、及びＷＯ８９/０６７２０に記載のヒプロテアーゼを含むがこれらに限定されない。好ましい市販のプロテアーゼ酵素は、ＭＡＸＡＴＡＳＥ（商標）、ＭＡＸＡＣＡＬＴＭ、ＭＡＸＡＰＥＭＴＭ、ＯＰＴＩＣＬＥＡＮ（商標）、ＯＰＴＩＭＡＳＥ（商標）、ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（商標）及びＰＵＲＡＦＥＣＴ（商標）ＯＸＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）の製品名で販売されているもの、ＡＬＣＡＬＡＳＥ（商標）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）、ＰＲＩＭＡＳＥ（商標）、ＤＵＲＡＺＹＭTM、ＲＥＬＡＳＥ（商標）及びＥＳＰＥＲＡＳＥ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ） の製品名で販売されているもの、ＢＬＡＰＴＭ（Ｈｅｎｋｅｌ Ｋｏｍｍａｎｄｉｔｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ａｕｆ Ａｋｉｔｅｎ， Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の製品名で販売されているものを含む。種々のプロテアーゼがＷＯ９５／２３２２１、ＷＯ９２／２１７６０及び米国特許第５，８０１，０３９号、５，３４０、７３５号、５，５００，３６４号、５，８５５，６２５号に記載されている。他のＢＰＮ‘変異種（「ＢＰＮ‘変異種１」と本明細書では記載する）は米国特許第ＲＥ３４，６０６号に記載されている。別のＧＣ３６変異種（「ＧＣ３６変異種１」と本明細書では記載する）は米国特許第５，９５５，３４０号、５，７００，６７６号に記載されている。さらに、ＧＧ-３６変異種は、米国特許第６，３１２，９３６号及び第６，４８２，６２８号に記載されている。本願発明の一面では、本願発明の洗浄剤組成物はこの組成物の重量に対し０．００００１％から１０％までの水準で別のプロテアーゼ酵素を含み、重量に対し９９．９９９％から９０．０％の洗浄添加剤を含む。本願発明の他の実施態様では、本願発明の洗浄剤組成物はまた、この組成物の重量で０．０００１％から１０％、０．００１％から５％、０．００１％から２％、０．００５％から０．５％の水準で６９Ｂ４プロテアーゼ（またはその相同体または変異種）を含み、洗浄剤組成物の残部（例えば、重量で９９．９９９９％から９０．０％、９９．９９９％から９８％、９９．９９５％から９９．５％）は洗浄添加剤を含む。
加えて、アルカリ溶液での使用に適したどのようなリパーゼも本願発明に使用される。適したリパーゼは細菌または菌類に由来するものを含むが、これらに限定されない。化学的にまたは遺伝子学的に修飾された突然変異体は本願発明に含まれる。有用なリパーゼの例は、ヒューミコラ・ラヌギノザ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｅ）リパーゼ（例えば、ＥＰ２５８０６８とＥＰ３０５２１６参照）、リゾムコール・ミヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ（例えば、ＥＰ２３８０２３参照）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）リパーゼ、例えばＣ．アンタークチカリパーゼ（例えば、Ｃ．アンタークチカ（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＡまたはＢ；ＥＰ２１４７１６参照）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）リパーゼ、例えばＰ．アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）と、P．シュードアルカリゲンス（Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）リパーゼ（例えばＥＰ２１８２７２号参照）、Ｐ．セパシア（Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ）リパーゼ（例えばＥＰ３３１３７６号参照）、Ｐ．スタットゼリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ）リパーゼ（ＧＢ１，３７２，０３４号参照）、Ｐ．フルオレセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）リパーゼ、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）リパーゼ（例えば、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）リパーゼ［Ｄａｒｔｏｉｓライブラリー、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１３１：２５３−２６０［１９９３］］）、Ｂ．ステアロテルモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）リパーゼ［例えばＪＰ６４／７４４９９２参照］及びＢ．パミラス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）リパーゼ［例えばＷＯ９１／１６４２２参照］）を含む。
さらに、多くのクローンされたリパーゼが本願発明の幾つかの実施態様で使用される。ペニシリウム・カメンベルチ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）リパーゼ（Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、Ｇｅｎｅ１０３：６１−６７［１９９１］参照）、ゲオトリカム・カンジダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）リパーゼ（Ｓｃｈｉｍａｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０６：３８３−３８８［１９８９］）及び種々のリゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）リパーゼ、例えば、Ｒ．ニベウス（Ｒ．ｎｉｖｅｕｓ）リパーゼ（Ｋｕｇｉｍｉｙａら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：７１６−７１９［１９９２］）及びＲ．オリゼ（Ｒ．ｏｒｙｚａｅ）リパーゼを含むがこれらに限定されない。
他の種類の、クチナーゼ（ｃｕｔｉｎａｓｅ）のような脂肪分解酵素もまた、本願発明の幾つかの実施態様で使用され、シュードモナス・メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）由来のクチナーゼ（ｃｕｔｉｎａｓｅ）（ＷＯ８８／０９３６７参照）、またはフザリウム・ソラニ・ピシ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ）由来のクチナーゼ（ＷＯ９０／０９４４６参照）を含むが、これらに限定されない。
その他の適したリパーゼは、Ｍ１ ＬＩＰＡＳＥ（商標）、ＬＵＭＡ ＦＡＳＴ（商標）及びＬＩＰＯＭＡＸ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）、ＬＩＰＯＬＡＳＥ（商標）とＬＩＰＯＬＡＳＥ（商標）ＵＬＴＲＡ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）及びＬＩＰＡＳＥ Ｐ（商標）「Ａｍａｎｏ」（アマノ薬品株式会社、日本）のような市販のリパーゼを含む。
本願発明の幾つかの実施態様では、本願発明の洗浄組成物はさらに、この組成物の重量に対して０．００００１％から１０％の水準で別のリパーゼを含み、残部は洗浄添加剤である。本願発明の他の面では、本願発明の洗浄組成物は、この組成物の重量に対し０．０００１％から１０％、０．００１％から５％、０．００１％から２％、０．００５％から０．５％の水準でリパーゼも含む。
アルカリ溶液での使用に適したいずれのアミラーゼ（アルファ及び/またはベータ）も、本願発明の幾つかの実施態様で使用される。適したアミラーゼは、細菌又は菌類由来のものを含むがこれらに限定されない。化学的にまたは遺伝学的に修飾された突然変異体が幾つかの実施態様に含まれる。本願発明に使用されるアミラーゼは、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（例えば、ＧＢ１，２９６，８３９参照）から得られるα−アミラーゼを含むがこれに限定されない。本願発明に使用される市販のアミラーゼは、ＤＵＲＡＭＹＬ（商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（商標）、ＦＵＮＧＡＭＹＬ（商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（商標）とＢＡＮＴＭ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）とＲＡＰＩＤＡＳＥ（商標）とＭＡＸＡＭＹＬ（商標）Ｐ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を含むがこれらに限定されない。
本願発明の幾つかの実施態様では、本願発明の洗浄剤組成物は、組成物の重量に対しさらに０．００００１％から１０％の水準で別のアミラーゼを含み、残部は洗浄添加剤である。本願発明の他の面では、本願発明の洗浄剤組成物はまた、組成物の重量に対し０．０００１％から１０％、０．００１％から５％、０．００１％から２％、０．００５％から０．５％の水準でアミラーゼを含む。
アルカリ溶液での使用に適したいずれかのセルラーゼも、本願発明の実施例で使用される。適したセルラーゼは、細菌または菌類由来の物を含むがこれらに限定されない。化学的にまたは遺伝学的に修飾された突然変異体は幾つかの実施態様に含まれる。適したセルラーゼは、ヒューミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）セルラーゼ（米国特許第４，４３５，３０７号参照）を含むがこれに限定されない。特に適したセルラーゼは色を保護する利点をもつセルラーゼである（例えば、ＥＰ０４９５２５７参照）。
本願発明に用途のある市販のセルラーゼは、ＣＥＬＬＵＺＹＭＥ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）とＫＡＣ−５００（Ｂ）ＴＭ（Ｋａｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含むがこれらに限定されない。幾つかの実施態様では、セルラーゼは成熟した野生型または変異セルラーゼの一部又は断片として組み入れられ、Ｎ末端の一部が切断されている（米国特許第５，８７４，２７６号参照）。
幾つかの実施態様では、本願発明の洗浄組成物は、組成物の重量に基づき０．０００１％から１０％の水準でさらに別のセルラーゼを含み、残部は洗浄添加剤である。本願発明の他の面では、本願発明の洗浄剤組成物は、組成物の重量に基づき０．０００１％から１０％、０．００１％から５％、０．００１％から２％、０．００５％から０．５％の水準でセルラーゼをも含む。
洗剤組成物及びまたはアルカリ溶液での使用に適したいずれのマンナナーゼも本願発明で使用される。適したマンナナーゼは細菌または菌類由来のものを含むがこれらに限定されない。化学的にまたは遺伝学的に修飾された突然変異体は幾つかの実施態様に含まれる。本願発明に用途のある種々のマンナナーゼが知られている（米国特許第６，５６６，１１４号、米国特許第６，６０２，８４２号、米国特許第６，４４０，９９１号を参照。これら全ては引用により本明細書に組み入れられる。）
幾つかの実施態様では、本願発明の洗浄剤組成物はさらに組成物の重量に基づき０．００００１％から１０％の水準で別のマンナナーゼを含むことができ、残部は洗浄添加剤である。本願発明の他の面では、本願発明の洗浄剤組成物は、また、組成物の重量に基づき、０．０００１％から１０％、０．００１％から５％、０．００１％から２％、０．００５％から０．５％の水準でマンナナーゼをも含む。
幾つかの実施態様では、ペルオキシダーゼが過酸化水素またはその発生源（例えば、過炭酸塩、過ホウ酸塩、過硫酸塩）と組み合わせて使用される。別の実施態様では、酸化酵素が酸素と組み合わされて使用される。両タイプの酵素は、「溶液漂白」（つまり、洗濯液中で共に洗濯するとき染色された布地から他の布地へ布地の染料が移ることを防ぐ）のために、好ましくは強化剤（例えば、ＷＯ９４/１２６２１及びＷＯ９５/０１４２６参照）とともに使用される。適したペルオキダーゼ/酸化酵素は、植物、細菌または菌類由来のものを含むがこれらに限定されない。化学的または遺伝学的に修飾された突然変異体が幾つかの実施態様に含まれる。
幾つかの実施態様では、本願発明の洗浄剤組成物はさらにペルオキシダーゼ及び/または酸化酵素を、組成物の重量を基準に０．００００１％から１０％の水準でペルオキシダーゼ及び/または酸化酵素を追加して含み、残部は組成物の重量を基準として洗浄添加剤である。本願発明の他の面では、本願発明の他の洗浄剤組成物はまた、組成物の重量を基準に、０．０００１%から１０％、０．００１％から５％、０．００１％から２％、０．００５％から０．５％のペルオキシダーゼ及び/または酸化酵素をも含む。
上述した酵素の混合物は、本明細書含まれ、特に１ＡＧ３酵素、１つ以上の他のプロテアーゼ、少なくとも１つのアミラーゼ、少なくとも１つのリパーゼ、少なくとも１つのマンナナーゼ、及び/または少なくとも1個のセルラーゼからなる混合物が含まれる。実際に、種々のこれらの酵素混合物は本願発明での使用が考慮されている。
種々の水準のプロテアーゼと1以上の別の酵素は両者ともそれぞれ１０％までの範囲であっても良く、洗浄剤組成物の残部は洗浄剤添加剤である。洗浄剤添加剤の種類の選択は、洗浄を受ける表面、製品又は布地、使用時の洗浄条件に適した望ましい形態（例えば、洗剤用）を考慮することにより容易に行われる。
適した洗浄添加剤の例は、界面活性剤、研磨剤、漂白剤、漂白活性剤、漂白触媒、他の酵素、酵素を安定化する系、キーラント（ｃｈｅｌａｎｔ）、漂白蛍光剤（ｏｐｔｉｃａｌ ｂｒｉｇｈｔｅｎｅｒ）、土剥離ポリマー（ｓｏｉｌ ｒｅｌｅａｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒｓ）、染料転移剤（ｄｙｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｇｅｎｔｓ）、懸濁剤（ｄｉｓｐｅｒｓａｎｔ）、発泡抑制剤（ｓｕｄｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ）、染料、香料、色素、増量剤である塩、ヒドロトロープ（ｈｙｄｒｏｔｒｏｐｅ）、光活性化剤、蛍光剤、布地の柔軟剤、加水分解性界面活性剤、保存料、抗酸化剤、抗収縮剤、しわの防止剤、殺菌剤、抗かび剤、カラースペクル（ｃｏｌｏｒｓｐｅｃｋｌｅ）、シルバーケア（ｓｉｌｖｅｒｃａｒｅ）、曇り防止剤（ａｎｔｉ−ｔａｒｎｉｓｈ）及び/または腐食防止剤、アルカリ性供与剤（ａｌｋａｌｉｎｉｔｙ ｓｏｕｒｃｅｓ）、溶解剤、担体、処理助剤、顔料、及びｐＨ調整剤（米国特許第６，６１０，６４２号、６，６０５，４５８号、５，７０５，４６４号、５，７１０、１１５号、５，６９８、５０４号、５，６９５，６７９号、５、６８６、０１４号及び５、６４６、１０１号、これら全ては引用により本明細書に組み入れられる。）特定の洗浄剤組成物の実施態様は下記に詳細に例示されている。
洗浄添加剤が、洗浄剤組成物の中で、本願発明のプロテアーゼと合わせることができない場合、両成分を合わせることが適当であるときまで、洗浄添加剤とプロテアーゼを分離（つまり、互いに接触しない）しておく方法が使用される。そのような分離は本願発明の技術分野（つまり、ゲルキャップ、カプセル化、錠剤、物理的分離など）で知られているいずれか適当な方法を含む。
好ましくは、本明細書に与えられている1以上のプロテアーゼの有効量が、タンパク質性の汚れの除去が必要な種々の表面を洗浄するために有用な組成物中に含まれている。そのような洗浄剤組成物は硬い表面、布地、皿の洗浄のような用途のための洗浄剤組成物を含む。実際、幾つかの実施態様では、本願発明は布地洗浄剤組成物を提供するが、他方、他の実施態様では、本願発明は布地以外の製品の洗浄剤組成物を提供する。特に、本願発明は、また、口の衛生管理（入れ歯洗浄剤組成物のほか、デントリフィス（ｄｅｎｔｒｉｆｉｃｅ）、練歯磨き、口腔洗浄液など）、皮膚、髪の洗浄組成物等の人に適した洗浄剤組成物も提供する。本願発明は、いずれの形態の洗浄剤組成物も含むことが意図されている（つまり、液体、顆粒、塊状、半固体、ゲル、懸濁液、錠剤、カプセルなど）。
例によって、本願発明のプロテアーゼが使用される幾つかの洗浄剤組成物が下記にさらに詳細に述べられている。本願発明の洗浄剤組成物が洗濯機による洗濯での使用に適した組成物として調合されている実施態様においては、本願発明の組成物は、有機ポリマー化合物、漂白剤、他の酵素、発泡抑制剤、懸濁剤、石灰―石鹸懸濁剤、土懸濁（ｓｏｉｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）及び再付着防止剤（及び腐食抑制剤から好ましくは選択される1以上の洗浄添加剤のほか、好ましくは少なくとも1個の界面活性剤と少なくとも1個の研磨剤化合物を含む。幾つかの実施態様では、洗濯組成物は、また柔軟剤（つまり、追加の洗浄添加剤として）も含む。
本願発明の組成物はまた、固体または液体で洗浄剤添加物としても使用される。そのような添加物は従来の洗浄剤組成物の性能を補う及び/または促進することが意図され、洗浄のいずれの段階にも加えることができる。
手洗いによる皿の洗浄に用いられる組成物として調合された実施態様では、本発明の組成物は好ましくは、少なくとも1個の界面活性剤、好ましくは、有機ポリマー化合物、発泡促進剤（ｓｕｄｓ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、第ＩＩ族金属イオン、溶媒、ヒドロトロープス及び他の酵素から選択される少なくとも１の洗浄添加剤が追加される。
幾つかの実施態様では、本明細書の洗濯用洗剤組成物の密度は、２０℃で測定された場合、４００から１２００ｇ/リットルの範囲であり、一方、他の実施態様では、５００から９５０ｇ/リットルの範囲にある。
幾つかの実施態様では、米国特許第６，６０５，４５８号に記載されているような種々の洗浄剤組成物は、本願発明のプロテアーゼとともに使用される。つまり、幾つかの実施態様では、本願発明の少なくとも１のプロテアーゼを含む組成物は、コンパクトな顆粒状布地洗浄剤組成物であり、一方、他の実施態様では、この組成物は色のついた布地の洗濯に有用な顆粒状布地洗浄剤組成物であり、さらに他の実施態様では、この組成物は、洗浄性能を通じて柔軟化する顆粒状布地洗浄剤組成物であり、別の実施態様では、この組成物は過酷な条件に耐える液体布地洗浄組成物である。
幾つかの実施態様では、本願発明の少なくとも１のプロテアーゼを含む組成物は米国特許第６、６１０、６４２号及び米国特許第６，３７６，４５０号で記載されたような布地洗浄剤組成物である。加えて、本願発明のプロテアーゼはヨーロッパ又は日本の洗濯条件で特に有用な顆粒状洗剤組成物に使用される（例えば、米国特許第６，６１０，６４２号参照）。
別の実施態様では、本願発明は、本明細書に記載されている少なくとも1個のプロテアーゼを含む硬い表面の洗浄剤組成物を提供する。つまり、幾つかの実施態様では、少なくとも１の本願発明のプロテアーゼを含む組成物は、米国特許第６，６１０、６４２号、米国特許第６、３７６、４５０号、米国特許第６、３７６、４５０号で記載されているような硬い表面の洗浄剤組成物である。
さらに他の実施態様では、本願発明は本明細書に記載された少なくとも１のプロテアーゼを含む皿洗い洗浄剤組成物を提供する。つまり、幾つかの実施態様では、本願発明の少
なくとも１のプロテアーゼを含む組成物は米国特許第６，３７６，４５０号と米国特許第
６，３７６，４５０号の組成物のような口内衛生用組成物を含む。
さらに他の実施態様では、本願発明は本明細書に記載された少なくとも１のプロテアーゼを含む皿洗い洗浄剤組成物を提供する。つまり、幾つかの実施態様では、本願発明の少なくとも１のプロテアーゼを含む組成物は米国特許第６，３７６，４５０号と米国特許第６，３７６，４５０号の組成物のような口内衛生用組成物を含む。
本組成物と洗浄添加剤の処方と性状は先に述べた米国特許第６，３７６，４５０号、第６，６０５，４５８号に含まれている。米国特許第６，６０５，４５８号と第６，６１０，６４２号は、引用により本明細書に明示的に組み入れられる。さらに他の例は下記の実施例に記載されている。
さらに、本願発明は、プロテアーゼが、本願発明に従い食品又は動物飼料と混合されている点で特徴のある、食品又は動物飼料の組成物と生産方法を提供する。幾つかの実施態様では、プロテアーゼは加工前に乾燥した製品として加えられ、一方、他の実施態様では、加工前又は後に液体として加えられる。乾燥粉末が使用される幾つかの実施態様では、この酵素は、粉にした穀物のような乾燥した担体上に液体として加えられ希釈される。本願発明のプロテアーゼは、米国特許第５，６１２，０５５号、米国特許第５，３１４，６９２号及び米国特許第５，１４７，６４２号で記載されているような動物飼料の成分及び/または添加剤の成分として使用される。これらの特許全ては引用により本明細書に組み入れられる。
本願発明による酵素飼料添加物は、多くの方法で調製するのに適している。例えば、幾つかの実施態様では、酵素混合物を生産するため、適した活性をもつ異なる酵素を単に混合することにより調製される。幾つかの実施態様では、この酵素混合物は、直接に飼料と混合され、一方、他の実施態様では、これは粉砕された小麦粉、トウモロコシ粉、大豆の粉のような穀物加工食品（ｃｅｒｅａｌ）の担体に混合される。これらの酵素が添加された穀物加工食品の担体は、酵素飼料添加剤として用途があるので、本願発明はまた、これらの酵素が添加された担体も含む。
幾つかの別の実施態様では、穀物加工食品の担体（例えば、小麦粉又はトウモロコシの粉）は、適当な活性をもつ酵素群と同時にまたは連続的に混合される。例えば、幾つかの実施態様では、小麦粉である担体は最初にキシラナーゼにより、二番目にプロテアーゼにより噴霧され、そして任意に、β―グルカナーゼにより噴霧される。本願発明は、また、これらの混合された担体が、酵素飼料添加物として使用されるので、これらの混合された担体も含む。好ましい実施態様では、これらの混合された担体は、本願発明の少なくとも１のプロテアーゼを含む。
幾つかの実施態様では、本願発明の飼料添加物は動物飼料と直接に混合される。一方、別の実施態様では、ビタミン飼料添加物、無機物飼料添加物、及び／またはアミノ酸飼料添加物のような1以上の他の飼料添加物と混合される。幾つかの異なる種類の成分を含む得られた飼料添加物は次に適量が飼料と混合される。
幾つかの好ましい実施態様では、本願発明の飼料添加剤は、穀物加工食品の担体を含め、通常、飼料１キログラム当たり０．０１乃至５０ｇで混合され、より好ましくは、０．１乃至１０ｇ／キログラム、最も好ましくは約１ｇ／キログラムで混合される。
別の実施態様では、本願発明の酵素飼料添加剤は、望ましい相対量で望ましい酵素を産生する組換え微生物群の構築を含む。幾つかの実施態様では、これは本願発明の少なくとも１のプロテアーゼをコードする遺伝子のコピー数を増やすこと、及び／またはプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結している適度に強いプロモーターを使用することにより達成される。別の実施態様では、組換え微生物株は、望みに応じ、ある酵素活性（例えば、セルラーゼ、エンドグルカナーゼなど）が削除されている。
他の実施態様では、本願発明により与えられる酵素飼料添加剤は、また少なくとも１つのキシラナーゼ、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、フィターゼ、及び/またはリパーゼを含むがこれらに限定されない他の酵素も含む。幾つかの実施態様では、望ましい活性をもつ酵素は、これらが穀物加工食品の担体と混合される前にキシラナーゼとプロテアーゼと混合され、またはこれらの酵素が穀物加工食品の担体上に同時に又は連続的に混合される。この担体は次に、穀物加工食品を材料とする飼料と混合され、目的の飼料を作る。別の実施態様では、この酵素飼料添加剤は、各酵素の活性をもつ溶液として調製され、次に小球またはマッシュ（ｍａｓｈ）にされた飼料と混合される。
さらに別の実施態様では、この酵素飼料添加剤は、第二の（つまり、異なる）飼料または動物の飲料水に混合することにより動物のえさに混合される。従って、穀物加工食品を材料にする飼料との混合は、本願発明の特に好ましい実施態様ではあるが、本願発明により提供される酵素混合物がそのように混合されることが、必須であるわけではない。１ｇの飼料添加剤当たりのキシラナーゼ活性対１ｇの飼料添加剤当たりのプロテアーゼ活性の比は好ましくは、１：０．００１乃至１，０００、より好ましくは１：０．０１乃至１００、及び最も好ましくは１：０．１乃至１０である。上記に示すように、本願発明により提供される酵素混合物は、好ましくは穀物加工食品を材料とする飼料の調製において飼料添加剤として使用される。
幾つかの実施態様では、穀物加工食品を材料とする飼料は重量で少なくとも２５％の、より好ましくは、重量で少なくとも約３５％の、小麦又はトウモロコシ又は両者の穀物加工食品の組合せを含む。この飼料は更に、プロテアーゼ（つまり、少なくとも本願発明の少なくとも１のプロテアーゼ）を、１ｋｇ当たり１００乃至１００，０００単位のプロテアーゼ活性を飼料が含むような量で含む。
本願発明に与えられている穀物加工食品を材料とする飼料は、本願発明に従い、家禽（例えば、七面鳥、ガチョウ、アヒル、にわとりなど）、家畜（例えば、ブタ、羊、ウシ、ヤギなど）及び愛玩用動物（例えば、馬、犬、猫、ウサギ、ねずみなど）等の種々の動物用の飼料として使用される。この飼料は特に、家禽とブタに、特にブロイラー用にニワトリに適している。
本願発明はまた、本願発明のプロテアーゼのうち少なくとも1つを含む布地の処理用の組成物も与える。幾つかの実施態様では、本願発明の少なくとも１つのプロテアーゼは、絹又は羊毛の処理に適した組成物の成分である（米国再発行 特許第２１６，０３４号、ＥＰ１３４，２６７号、米国特許第４，５３３，３５９号及びＥＰ３４４，２５９号参照）。
加えて、本願発明のプロテアーゼはフィチン酸塩からリンを分離することが望ましい種々の用途に使用される。従って、本願発明は、また、性質が改善された羊毛や動物の毛を生産する方法もまた与える。幾つかの好ましい実施態様では、これらの方法は羊毛、羊毛繊維または動物の毛からなる物質をプラズマ処理やＤｅｌｈｅｙ処理からなる群から選択される工程で前処理する段階と、前処理された羊毛又は動物の毛が、その性質を改善するために効果のある量でタンパク質分解性酵素（例えば、少なくとも本願発明の１のプロテアーゼ）による処理を受ける段階を含む。幾つかの実施態様では、タンパク質分解酵素による処理はプラズマ処理の前に行い、一方、他の実施態様では、プラズマ処理の後に行う。さらに幾つかの実施態様では、それは分離した段階として行われるが、他の実施態様では、羊毛又は動物の毛の洗浄または染色と組み合わせて行われる。別の実施態様では、少なくとも１の界面活性剤及び/または少なくとも１の柔軟剤が、この酵素処理段階に加えられるが、他の実施態様では、界面活性剤及び/または柔軟剤は、羊毛と動物の毛が柔軟化処理を受ける別の段階に加えられる。
幾つかの実施態様では、本願発明の組成物は、羊毛繊維を縮みにくくする方法において使用される（ＪＰ４−３２７２７４参照）。幾つかの実施態様では、本組成物は羊毛繊維を低温プラズマ処理し、続いてブロック-ウレタン樹脂、ポリアミドエポクロロヒドリン樹脂、グリオキシル酸樹脂、エチレンーウレア樹脂またはアクリル樹脂のような、縮みにくい樹脂による処理を受け、次いで柔軟化効果を得るために重量を減量させるタンパク質分解酵素による処理を施すことによる羊毛繊維を縮みにくくする処理法で使用される。幾つかの実施態様では、プラズマ処理段階は低温処理、好ましくはコロナ放電処理又はグロー放電処理である。
幾つかの実施態様では、低温プラズマ処理はガス、好ましくは空気、酸素、窒素、アンモニア、ヘリウム又はアルゴンからなる群から選択されるガスを用いて行われる。従来から、空気が使用されているが、他の示したガスのいずれかを使用することが有利かもしれない。
好ましくは、低温プラズマ処理は約０．１トールと５トールの間の圧力で約２秒から約３００秒、好ましくは約５秒から約１００秒、より好ましくは約５秒から約３０秒行われる。
上記のように、本願発明はＤｅｌｈａｙ処理（例えば、ＤＥ−Ａ−４３３２６９２号参照）のような方法と組み合わせて使用される。この処理では、羊毛は可溶性タングステン酸塩の存在下、過酸化水素の水溶液中で処理を受け、任意に、羊毛の耐フェルト化性を向上させるため合成ポリマーの溶液または懸濁液中で処理を受ける。本法では、羊毛は過酸化水素水溶液中（０．１乃至３５％（ｗ／ｗ）、好ましくは２乃至１０％（ｗ／ｗ））で、２乃至６０％（w/w）、好ましくは８乃至２０％（w/w）の触媒（好ましくは、Ｎａ２ＷＯ４）存在下、そして非イオン性湿潤剤存在下で、処理される。好ましくは、本処理はｐＨ８−１１で、室温で実施される。処理時間は過酸化水素と触媒濃度に依存する。しかし、好ましくは２分またはそれ未満である。酸化処理の後、羊毛は水で濯ぎを受ける。残存過酸化水素の除去のため、そして任意に漂白を追加して行うため、羊毛はさらに還元剤（例えば、亜硫酸塩、ホスホン酸塩等）の酸性溶液で処理を受ける。
幾つかの実施態様では、本酵素処理は約１分から約１２０分の間で行われる。本段階は好ましくは、約２０℃から約６０℃の温度で実施され、より好ましくは約３０℃から約５０℃の間で行われる。または、羊毛は水性の酵素溶液に浸漬されまたは、これを含まされ、従来の温度と圧力、通常約３０秒から約３分で蒸気処理される。幾つかの実施態様では、タンパク質分解酵素処理は、緩衝剤を含みうる酸性、中性またはアルカリ性の溶媒中で行われる。
別の実施態様では、本酵素処理段階は、１以上の従来のアニオン性、非イオン性（例えば、ドバノール（Ｄｏｂａｎｏｌ）；Ｈｅｎｋｅｌ ＡＧ）またはカチオン性の界面活性剤の存在下で行われる。有用な非イオン性界面活性剤の例はドバノール（Ｈｅｎｋｅｌ ＡＧ製）である。さらに別の実施態様では、羊毛または動物の毛は、タンパク質分解性酵素での処理の前または同時に超音波処理を受ける。幾つかの実施態様では、この超音波処理は、約５０℃の温度、約５分で実施される。幾つかの好ましい実施態様では、酵素処理段階で使用されるタンパク質分解性酵素の量は、羊毛または動物の毛の重量に基づいて約０．２ｗ／ｗ％と約１０ｗ／ｗ％の間である。幾つかの実施態様では、酵素処理は、染色、すすぎ、及び/または洗浄槽に単にプロテアーゼを加えることにより、羊毛または動物の毛の染色及び/または洗浄の間に実施される。幾つかの実施態様では酵素処理はプラズマ処理の後に実施され、しかし、他の実施態様では、この２処理が反対の順序で実施される。
従来、羊毛について使用されている柔軟剤は、普通カチオン性柔軟剤で、有機カチオン性柔軟剤またはシリコンをベースとした製品であり、しかし、アニオン性または非イオン性柔軟剤もまた有用である。有用な柔軟剤の例はポリエチレン柔軟剤とシリコン柔軟剤（つまり、ジメチルポリシロキサン（シリコンオイル））、Ｈ−ポリシロキサン、シリコーンエラストマー、アミノ基をもつジメチルポリシロキサン、アミノ基をもつシリコーンエラストマー、エポキシ基をもつジメチルポリシロキサン及び有機カチオン柔軟剤（例えば、アルキル４級アンモニウム誘導体）を含むがこれらに限定されない。
別の実施態様では、本願発明は少なくとも本願発明の１プロテアーゼを含む動物の皮の処理用の組成物を与える。幾つかの実施態様では、本願発明のプロテアーゼはＷＯ０３／００８６５（Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．， Ｔａｅｊｅｏｎ−Ｓｉ，韓国）に記載されているもののような、動物の皮の処理用の組成物に用途がある。他の実施態様では、本願発明は、皮を本願発明のプロテアーゼにより酵素的に処理することを含む、皮をなめし皮とする処理法を提供する（例えば、ＷＯ９６／１１２８５参照）。他の実施態様では、本願発明は本願発明の少なくとも１のプロテアーゼを含む、動物の皮をなめし皮にする処理のための組成物を与える。
皮は普通、塩を加えたまたは乾燥された生の皮の形態でなめし皮工場に受け入れられる。皮をなめし皮にする処理は、浸漬、毛の除去、なめし剤への浸漬からなる工程を含む幾つかの異なる工程を含む。これらの工程は湿式処理の一部であり、ビームハウス（ｂｅａｍｈｏｕｓｅ）で行われる。本願発明のプロテアーゼを用いる酵素処理は皮の処理に含まれる工程中のいつにおいても適用できる。しかし、プロテアーゼは、湿式処理（つまり、浸漬、毛の除去及び/またはなめし剤への浸漬）の間、普通使用される。このように、幾つかの好ましい実施態様では本願発明のプロテアーゼの少なくとも１つによる酵素処理は、湿式処理の工程において行われる。
幾つかの実施態様では、本願発明の浸漬処理は従来の浸漬条件（例えば、ｐＨ６．０乃至１１の範囲のｐＨ）で行われる。幾つかの好ましい実施態様では、この範囲はｐＨ７．０乃至１０．０である。別の実施態様では、この温度は２０乃至３０℃であり、一方、他の実施態様では、２４乃至２８℃の範囲にあることが好ましい。さらに別の実施態様では、反応時間は２乃至２４時間の範囲であり、一方好ましい範囲は４乃至１６時間である。他の実施態様では、界面活性剤及び/または保存剤が、好ましいときには加えられる。
なめし剤への浸漬工程である第二工程はなめし剤を添加することにより始まる。幾つかの実施態様では、酵素処理はなめし剤への浸漬の間に行われる。幾つかの好ましい実施態様では、脱灰（ｄｅｌｉｍｉｎｇ ｐｈａｓｅ）後、酵素処理はなめし剤への浸漬において行われる。幾つかの実施態様では、本願発明のなめし液への浸漬工程は従来の条件（例えば、ｐＨ６．０−９．０の範囲のｐＨ）を用いて行われる。幾つかの実施態様では、ｐＨの範囲は６．０−８．５である。他の実施態様では、温度は２０乃至３０℃の範囲であるが、好ましい実施態様では温度は２５乃至２８℃の範囲である。幾つかの実施態様では、反応時間は２０乃至９０分の範囲であり、他の実施態様では４０乃至８０分の範囲である。皮革を製造する工程は本願発明の技術者に良く知られている（例えば、ＷＯ９４/０６９４２９、ＷＯ９０/１１２１１８９、米国特許第３，８４０、４３３号、ＥＰ５０５９２０，ＧＢ２２３３６６５及び米国特許第３，９８６，９２６号参照。これら全ては引用により本明細書に組み入れられる。）
さらに幾つかの実施態様では、本願発明は、本願発明の少なくとも１個のプロテアーゼを含むなめし剤を提供する。なめし剤はビームハウスの工程、特に皮革の製造工程であるなめし液浸漬工程において使用される化学的に活性な成分を含む試薬または酵素含有剤である。幾つかの実施態様では、本願発明はプロテアーゼと適した添加物を含むなめし剤を提供する。幾つかの実施態様では、試薬は、本願発明の技術分野で知られ、使用されている化学物質、例えば、希釈剤、乳濁剤（ｅｍｕｌｇａｔｏｒ）、脱灰剤及び担体を含むがこれに限定されない。幾つかの実施態様では、本願発明の少なくとも１プロテアーゼを含むなめし剤は、本願発明の技術分野で知られているように処方される（ＧＢ−Ａ２２５０２８９、ＷＯ９６／１１２８５及びＥＰ０７８４７０３参照）。
幾つかの実施態様では、本願発明のなめし剤は、１ｇ当たりのなめし剤に対し０．００００５から０．０１ｇの活性プロテアーゼを含み、他方、他の実施態様では、なめし剤は、１ｇ当たりのなめし剤に対し０．０００２から０．００４ｇの活性プロテアーゼを含む。
このように、本願発明のプロテアーゼは多数の用途と条件で使用される。
本願発明は特許を請求した発明の範囲を限定する意図を伴わない以下の実施例でさらに詳細に説明される。添付した図面は本発明の規格と説明の一部であると考えられることを意図している。引用した全ての引用文献は、引用文献に記載した全てについて、引用により指定されて本明細書に組み入れられる。以下の実施例は、特許を請求した発明を説明するために提供され、限定するためではない。
以下の実施例では、下記の略号を用いる。ＰＩ（プロテイナーゼ 阻害物質、インヒビター）；ｐｐｍ（百万分の一）；Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル）；μＭ（マイクロモル）；ｎＭ（ナノモル）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｇｍ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；μｇ（マイクログラム）； ｐｇ（ピコグラム）；Ｌ（リットル）；ｍｌとｍＬ（ミリリットル）；μｌとμＬ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；Ｕ（単位 ユニット）；Ｖ（ボルト）；MW（分子量）；ｓｅｃ（秒）；ｍｉｎ（ｓ）（分）；ｈ（ｓ）とｈｒ（ｓ）（時間）；℃（摂氏）；ＱＳ（十分な量）；ＮＤ（実施せず）；ＮＡ（適用せず、該当なし）；ｒｐｍ（毎分回転数）；Ｈ２Ｏ（水）；ｄＨ２Ｏ（脱イオン水）；ＨＣｌ（塩酸）；ａａ（アミノ酸）；ｂｐ（塩基対）；ｋｂ （キロ塩基対）；ｋＤ（キロダルトン）；ｃＤＮＡ（相補または相補的ＤＮＡ）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ｓｓＤＮＡ（単鎖ＤＮＡ）；ｄｓＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）；ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド三リン酸）；ＲＮＡ（リボ核酸）；ＭｇＣｌ２（塩化マグネシウム）；ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）；ｗ／ｖ（重量対容積）；ｖ／ｖ（容積対容積）；ｇ（重力）；ＯＤ（光学濃度）；ダルベッコ−リン酸緩衝液（ＤＰＢＳ）；ＳＯＣ（２％バクト−トリプトン，０．５％バクト−酵母エキス，１０ｍＭ ＮａＣｌ，２．５ｍＭ ＫＣｌ）；Ｔｅｒｒｉｆｉｃ培地（ＴＢ；１２ｇ／ｌバクト−トリプトン，２４ ｇ／ｌ グリセロール，２．３１ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４，および１２．５４ｇ／ｌ Ｋ２ＨＰＯ４）；ＯＤ２８０（２８０ｎｍでの光学濃度）；ＯＤ６００（６００ｎｍでの光学濃度）；Ａ４０５（４０５ｎｍでの吸光度）；Ｖｍａｘ（酵素による触媒反応の最大初期反応速度）；ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）；ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水［１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ７．２］）；ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．２５％ ＴＷＥＥＮ（商標）２０）；ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）；ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）；ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）；ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）；Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）；ＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ−［２−エタンスルホン酸］）；ＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水）；Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン−塩酸塩）； Ｔｒｉｃｉｎｅ（Ｎ−［トリス−（ヒドロキシメチル）−メチル］−グリシン）；ＣＨＥＳ（２−（Ｎ−シクロ−ヘキシルアミノ）エタンスルホン酸）；ＴＡＰＳ（３−｛［トリス−（ヒドロキシメチル）−メチル］−アミノ｝−プロパンスルホン酸）；ＣＡＰＳ（３−（シクロ−ヘキシルアミノ）−プロパン−スルホン酸；ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）；ＤＴＴ（ｌ，４−ジチオ−ＤＬ−トレイトール）；ＳＡ（シナピン酸（ｓ，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ桂皮酸）；ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）；ＧｌｕｔとＧＳＨ（還元グルタチオン）；ＧＳＳＧ（酸化グルタチオン）；ＴＣＥＰ（トリス［２−カルボキシエチル］ホスフィン）；Ｃｉ（キュリー）；ｍＣｉ（ミリキュリー）；μＣｉ（マイクロキュリー）；ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）；ＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相高圧液体クロマトグラフィー）；ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析法）；Ｔｓ（トシル）；Ｂｎ（ベンジル）；Ｐｈ（フェニル）；Ｍｓ（メシル）；Ｅｔ（エチル）；Ｍｅ（メチル）；Ｔａｑ（好熱菌ＤＮＡポリメラーゼ）；Ｋｌｅｎｏｗ（ＤＮＡポリメラーゼI ラージ（クレノー）フラグメント）；ＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）；ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）；ｂｌａ（β−ラクタマーゼまたは抗アンピシリン遺伝子）；ＨＤＬ（高密度液体）；ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社，Ｒｅｎｏ，ネバダ）；Ｂａｓｅｃｌｅａｒ（Ｂａｓｅｃｌｅａｒ ＢＶ，Ｉｎｃ．，Ｌｅｉｄｅｎ，オランダ）；ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，マサチューセッツ）；ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ社，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，カリフォルニア）；Ａｒｇｏ（Ａｒｇｏ ＢｉｏＡｎａｌｙｔｉｃａ社，Ｍｏｒｒｉｓ Ｐｌａｉｎｓ，ニュージャージ）；Ｓｅｉｔｚ ＥＫＳ（ＳｅｉｔｚＳｃｈｅｎｋ Ｆｉｌｔｅｒｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ社，Ｂａｄ Ｋｒｅｕｚｎａｃｈ，ドイツ）；Ｐａｌｌ（Ｐａｌｌ社，Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ，ニューヨーク）；ＥＭＰＡ Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｉｅｎ ＡＧ（ＥＭＰＡ Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｉｅｎ ＡＧ社，Ｓｔ． Ｇａｌｌｅｎ−Ｗｉｎｋｅｌｎ，スイス）；Ｗａｒｗｉｃｋ Ｅｑｕｅｓｔ（Ｗａｒｗｉｃｋ Ｅｑｕｅｓｔ Ｌｉｍｉｔｅｄ社，Ｄｕｒｈａｍ，イギリス）；Ｍｉｎｏｌｔａ（コニカミノルタ社，日本）；Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｔｅｓｔｉｎｇ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｃｏ，Ｉｎｃ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ニュージャージ）；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ Ｒａｎｃｈｏ，カリフォルニア）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，テキサス）；Ａｃｃｅｌｒｙｓ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．、 Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，カリフォルニア）；Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｃｏｒｐ．，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，カナダ）；Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃｏ．，Ｅｄｉｓｏｎ，ニュージャージ）；ＣＦＴ（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｅｓｔ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社，Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，オランダ）；Ｐｒｏｃｔｅｒ＆Ｇａｍｂｌｅ（Ｐｒｏｃｔｅｒ＆Ｇａｍｂｌｅ，Ｉｎｃ．，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，オハイオ）；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社, Ｃｈａｌｆｏｎｔ Ｓｔ．Ｇｉｌｅｓ，イギリス）；ＤＮＡ２．０（ＤＮＡ２．０社，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，カリフォルニア）；ＯＸＯＩＤ（Ｏｘｏｉｄ社，Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ，Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，イギリス）；Ｍｅｇａｚｙｍｅ（ＭｅｇａｚｙｍｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｒｅｌａｎｄ Ｌｔｄ，Ｂｒａｙ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｐａｒｋ，Ｂｒａｙ，Ｃｏ．，Ｗｉｃｋｌｏｗ，アイルランド）；Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ Ｏｙ，Ｅｓｐｏｏ，フィンランド）；Ｋｅｌｃｏ（ＣＰ Ｋｅｌｃｏ社，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，デラウエア）；Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ニューヨーク）；ＮＥＮ（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社，Ｂｏｓｔｏｎ，マサチューセッツ）；Ｐｈａｒｍａ ＡＳ（Ｐｈａｒｍａ ＡＳ社，Ｏｓｌｏ，ノルーウェイ）；Ｄｙｎａｌ（Ｄｙｎａｌ社，Ｏｓｌｏ，ノルーウェイ）；Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，テキサス）；ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ社，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ, メリーランド）；Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ,ニューヨーク）；Ｓｉｇｍａ （Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ミズーリ）；Ｐｈａｒｍａｃｉａ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ニュージャージ）；ＮＣＢＩ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，カリフォルニア）；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓおよび／またはＣｌｏｎｔｅｃｈ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，カリフォルニア）；Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社，Ａｌａｍｅｄａ，カリフォルニア）；ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ（ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ社，Ｈｉｇｈ Ｐｏｉｎｔ，ノースカロライナ）；Ｏｌｉｇｏｓ Ｅｔｃ （Ｏｌｉｇｏｓ Ｅｔｃ．Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｓｏｎｖｉｌｌｅ，オレゴン）；Ｂａｃｈｅｍ（Ｂａｃｈｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．，Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ，ペンシルベニア）；Ｄｉｆｃｏ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ミシガン）；Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ社，Ｈｅｍｄｏｎ，ヴァージニア）；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，カリフォルニア）；Ｏｘｏｉｄ（Ｏｘｏｉｄ Ｉｎｃ．，Ｏｇｄｅｎｓｂｕｒｇ，ニューヨーク）；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ニュージャージ）；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬまたはＧｉｂｃｏ ＢＲＬ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社，Ｇａｉｔｈ ｅｒｓｂｕｒｇ，メリ−ランド）；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，マサチューセッツ）；Ｂｉｏ−Ｒａｄ （Ｂｉｏ−Ｒａｄ社，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，カリフォルニア）；ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，カリフォルニア）；ＮＥＢ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，マサチューセッツ）；Ｓｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ミズーリ）；Ｐｉｅｒｃｅ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，イリノイ）；Ｔａｋａｒａ（タカラバイオ社，大津，日本）；Ｒｏｃｈｅ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ社，Ｂａｓｅｌ，スイス）；ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ社，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ニュージャージ）；Ｑｉａｇｅｎ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，カリフォルニア）；Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｉｎｔｌ．，Ｓａｃｏ，メイン）；Ａｐｔａｇｅｎ（Ａｐｔａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ヴァージニア）；Ｓｏｒｖａｌｌ（Ｓｏｒｖａｌｌブランドの製品，Ｋｅｎｄｒｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製，Ａｓｈｅｖｉｌｌｅ，ノースカロライナ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ, Ｃｏｒｐ．社，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，カリフォルニア）；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ミネソタ）；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ社，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，カリフォルニア）；Ｍａｒｓｈ（Ｍａｒｓｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ニューヨーク）；Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｇｅｎｅａｒｔ ＧｍｂＨ社，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，ドイツ）；Ｂｉｏ−Ｔｅｋ（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，バーモント）；Ｂｉａｃｏｒｅ（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ニュージャージ）；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社，Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ニュージャージ）；ＳｙｎＰｅｐ（ＳｙｎＰｅｐ社，Ｄｕｂｌｉｎ，カリフォルニア）；Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅブランドの製品；Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．社製，Ｒｉｎｇｏｅｓ，ニュージャージ）；Ｗａｔｅｒｓ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，マサチューセッツ）；Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ社，Ｂｏ
ｓｔｏｎ，マサチューセッツ）；Ｄｉｏｎｅｘ（Ｄｉｏｎｅｘ，Ｃｏｒｐ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，カリフォルニア）；Ｍｏｎｓａｎｔｏ（Ｍｏｎｓａｎｔｏ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ミズーリ）；Ｗｉｎｔｅｒｓｈａｌｌ（Ｗｉｎｔｅｒｓｈａｌｌ ＡＧ，Ｋａｓｓｅｌ，ドイツ）；ＢＡＳＦ（ＢＡＳＦ Ｃｏ．社，Ｆｌｏｒｈａｍ Ｐａｒｋ，ニュージャージ）；Ｈｕｎｔｓｍａｎ（Ｈｕｎｔｓｍａｎ Ｐｅｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，ユタ）；Ｅｎｉｃｈｅｍ（Ｅｎｉｃｈｅｍ Ｉｂｅｒｉｃａ社，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，スペイン）；Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ社，Ｂｕｃｈｓ，スイス）；Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ （Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ，ＮＶ社，Ｄｅｌｆｔ，オランダ）；Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｄｌａｎｄ，ミシガン）；および、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ （Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ， Ｉｎｃ．，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ワシントン）。
以下の幾つかの実施例において各種洗剤が開示される。以下の表はこれらの洗剤に用いられる成分の幾つかの定義を提供する。
洗剤の定義
ＬＡＳ：直鎖Ｃ１１−Ｃ１３アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム
ＴＡＳ：獣脂アルキル硫酸ナトリウム
ＣｘｙＡＳ：Ｃ１ｘ−Ｃｙアルキル硫酸ナトリウム
ＣｘｙＥｚ：平均ｚモルのエチレンオキサイドで濃縮された主にＣ１ｘ−Ｃ１ｙ直鎖１級アルコール
ＣｘｙＡＥｚＳ：平均ｚモルのエチレンオキサイドで濃縮されたＣ１ｘ−Ｃ１ｙアルキル硫酸ナトリウム。実施例における追加的な分子名
非イオン性（界面活性剤）：エトキシ化／プロポキシル化脂肪アルコール（例えば、Ｐｌｕｒａｆａｃ ＬＦ４０４）、平均エトキシ化度３．８及び平均プロポキシ化度４．５のアルコール。
ＱＡＳ：Ｒ２＝Ｃ１２−Ｃ１４である、Ｒ２．Ｎ＋（ＣＨ３）２（Ｃ２Ｈ４ＯＨ）
ケイ酸塩：アモルファスケイ酸ナトリウム（ＳｉＯ２：Ｎａ２Ｏ比＝１．６−３．２：１）
メタケイ酸塩：メタケイ酸ナトリウム（ＳｉＯ２：Ｎａ２Ｏ比＝１．０）
ＺｅｏｌｉｔｅＡ：Ｎａ１２（Ａｌ２Ｏ２ＳｉＯ１２）１２・２７Ｈ２Ｏの式を有する水和ケイ酸アルミニウム
ＳＫＳ−６：δ―Ｎａ２Ｓｉ２Ｏ５の式の結晶性層状シリケート
硫酸塩：無水硫酸ナトリウム
ＳＴＰＰ：トリポリリン酸ナトリウム
ＭＡ／ＡＡ：約７０，０００乃至８０，０００の平均分子量の、アクリレート／マレエートの比が４：１のランダムコポリマー
ＡＡ：平均分子量４．５００のポリアクリル酸ナトリウムポリマー
ポリカルボン酸：アクリレート、マレエート、及びメタアクリレート等のカルボン酸モノマーの混合物のコポリマーであって、２，００乃至８０，０００の範囲のＭＷを有し、ＢＡＳＦ（アクリル酸のコポリマー、分子量４，５００）よりＳｏｋｏｌａｎとして販売されている。
ＢＢ１：３−（３，４−ジヒドロイソクイオリム）プロパンスルホネート
ＢＢ２：１−（３，４−ジヒドロクイオリニウム）−デカン−２−スルフェート
ＰＢ１：過炭酸ナトリウム一水和物
ＰＢ４：式ＮａＢＯ３・４Ｈ２Ｏの過炭酸ナトリウム四水和物
過炭酸：式２ＮａＣＯ３・３Ｈ２Ｏ２の過炭酸ナトリウム
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＮＯＢＳ：ナトリウム塩の形態のノナノイルオキシベンゼンスルホネート
ＤＴＰＡ：ジエチレントリアミン五酢酸
ＨＥＤＰ：１，１−ヒドロキシエタンジホスホン酸
ＤＥＴＰＭＰ：Ｄｅｑｕｅｓｔ２０６０の商標で販売されているジエチルトリアミンペンタ（メチレン）ホスホネート
ＥＤＤＳ：ナトリウム塩の形態のエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ‘−ジコハク酸（Ｓ，Ｓ）異性体
ジアミン：ジメチルアミノプロピルアミン；１，６−ヘザンジアミン；１，３−プロパンジアミン；２−メチル−１，５−ペンタンジアミン；１，３−ペンタンジアミン；１−メチル−ジアミノプロパン
ＤＥＴＢＣＨＤ：１．１２−ジエチル１，５，８，１２−テトラアザビシクロ［６，６，２］ヘキサデカンジクロライド，Ｍｎ（ＩＩ）塩
ＰＡＡＣ：ペンタアミンアセテートコバルト（ＩＩＩ）塩
パラフィン：ＷｉｎｔｅｒｓｈａｌｌによりＷｉｎｏｇ７０として販売されているパラフィンオイル
パラフィンスルホネート：スルホネート基で置換された水素原子を幾つか含むパラフィンオイルを又はワックス
アルドースオキシダーゼ：ノボザイムＡ／Ｓによるアルドースオキシダーゼの商標で販売されているオキシダーゼ酵素
ガラクトースオキシダーゼ：シグマから販売のガラクトースオキシダーゼ
プロテアーゼ：ノボノルディスクＡ／ＳによりＳａｖｉｎａｓｅ、Ａｌｃａｌａｓｅ、Ｅｖｅｒｌａｓｅの商標で販売されているもの及びジェネンコアインターナショナル・インクから販売されている以下のもの：「プロテアーゼＡ」ＵＳＲＥ３４．６０６、図１Ａ、１Ｂ、及び７、並びにカラム１１、１１乃至３７行目に記載；「プロテアーゼＢ」ＵＳ５，９５５，３４０及びＵＳ５，７００，６７０の図１Ａ、１Ｂ、及び５、並びに表１に記載；「プロテアーゼＣ」ＵＳ６，３１２，９３６及びＵＳ６，４８２，６２８、図１−３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）及びカラム２５、１２行に記載；「プロテアーゼＤ」ＷＯ９９／２０７２３に記載の１０１Ｇ／１０３Ａ／１０４Ｉ／１５９Ｄ／２３２Ｖ／２３６Ｈ／２４５Ｒ／２４８Ｄ／２５２Ｋ（ＢＰＮ配列位置）の変異体
アミラーゼ：ジェネンコアより販売のＷＯ９４／１８３１４、ＷＯ９６／０５２９５に記載のＰｕｒａｆｅｃｔ（商標）ＯｘＡｍの商標で販売されているもの、ノボザイムＡ／ＳのＮａｔａｌａｓｅ（商標）、Ｔｅｒｍａｎｙｌ（商標）、Ｆｕｎｇａｍｙｌ（商標）、及びＤｕｒａｍｙｌ（商標）
セルラーゼ：ノボザイムによるＣａｒｅｚｙｍｅ、ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ、及び／又はＥｎｄｏｌａｓｅの商標で販売されているセルロース分解酵素
ペクチナーゼ：ノボザイムＡ／ＳのＰｅｃｔａｗａｙ（商標）及びＰｅｃｔａｗａｙ（商標）
ＰＶＰ：平均分子量６０，０００のポリビニルピロリドン
ＰＶＮＯ：平均分子量５０，０００のポリビニルピリジン−Ｎ−オキサイド
ＰＶＰＶ１：平均分子量２０，０００のビニルイミダゾール及びビニルピロリドンのコポリマー
光沢剤１：ジソディウム４，４’−ビス（２−ヌルホスチイル）ビフェニル
シリコン消泡剤：シロキサン−オキシアルキレンコポリマー分散剤として含むポリジメチルシロキサン発泡調整剤、発泡剤対分散剤の比は１０：１乃至１００：１
泡抑制剤：１２％シリコン／シリカ、１３％ステアリルアルコール、７０％スターチ、下流形状
ＳＲＰ１：アニオン的にエンドキャップポリエステル
ＰＥＧＸ：分子量Ｘのポリエチレングリコール
ＰＶＰＫ６０（商標）：平均分子量１６０，０００ビニルポリピロリドンホモポリマー
Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ（商標）：ＥＤ−２００１：Ｈｕｎｓｔｍａｎより販売のキャップポリエチレングリコール
Ｉｓａｃｈｅｍ（商標）ＡＳ：Ｅｎｉｃｈｅｍより販売の分岐アルコールアルキルサウルホネート
ＭＭＥＰＥＧ（２０００）：Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧより販売のモノメチルエーテルポリエチレングリコール（ＭＷ２０００）
ＤＳ３２２５Ｃ：ダウコーニングより販売のシリコンオイルとシリカの混合物のシリコン消泡剤
ＴＥＰＥＡ：テトラエチルペンタアミンエトキシレート
ＢＴＡ：ベンゾトリアゾール
ベタイン：（ＣＨ３）２Ｎ＋ＣＨ２ＣＯＯ−
糖：工業用Ｄ−グルコ又は食品グレードシュガー
ＣＦＡＡ：Ｃ１２−Ｃ１４アルキルＮ−メチルグルカミド
ＴＰＫＦＡ：Ｃ１２−Ｃ１４
クレイ：一般式Ａｌ２Ｏ３ＳｉＯ２・ｘＨ２Ｏの水和ケイ酸アルミニウム、タイプ：カオリナイト、モントモリロナイト、アタプルガイト、リライト、ベントナイト、ハロサイト、
ｐＨ：２０℃の蒸留水中１％溶液として測定

実施例１
微生物株の単離及び培養
この実施例では、ストレプトマイセス１ＡＧ３の単離及び培養を説明する。単離培地はリファンピシリンン選択圧力を用いてアルカリ土壌抽出物として用いた。土壌抽出物培地を以下のように調製した。
溶液Ａ
土１ｋｇを１リットルの水に懸濁して、２０分間、１２０度で滅菌した。室温まで冷却して、上清をガラスフィルターでろ過して透明なろ過物を得た。土壌の残りを２回、１００ｍｌと１００ｍｌの脱イオン水で洗浄し、水を足して１リットルにした。
溶液Ｂ
ＮａＣｌ ８０ｇ／Ｌ
Ｎａ２ＣＯ３ ２０ｇ／Ｌ
１２０℃で２０分混合する。
リファンピシンストック溶液
リファンピシン（シグマ Ｒ３５０１）５０ｍｇ／ｍｌをＤＭＳＯに溶解し、２０μｍの膜でろ過滅菌した。
初めに、２０ｇのアガーを５００ｍｌの溶液Ａに添加して、この溶液を１２０℃、２０分で滅菌した。次いで、５００ｍｌの溶液Ａを５００ｍｌの溶液Ｂと混合して、６０℃に冷却した。リファインピシンを最終濃度が５０μｇ／ｍｌになるように添加した。このアガー混合物をペプチド取皿に注ぎ、微生物を接種するまでポリエチレンバッグに封入し４０℃で貯蔵した。
湖沼堆積物及び水を溶液Ｂと１：１で混合して、強く撹拌した。沈殿の後、上清を連続希釈して、リファンピシンを含む、ｐＨ１０の土壌抽出アガーで平板培養した。このプレートを３０℃で、数週間、湿ったペーパータオルを裏打ちした厳格に密閉されたプラスチックブックスで、湿度を維持し、蒸発が起こらないように、インキュベートした。このプレートを定期的に立体顕微鏡で観察した。これらの観察の間に観察された糸状菌のコロニーを採取し、新たな培地に接種した。
実施例２
１６ＳｒＲＮＡ配列決定による、１ＡＧ３株の特徴付け
この実施例では、１６ＳｒＲＮＡ配列決定による、１ＡＧ３株の特徴付けを説明する。以下のようにして、１６ＳｒＲＮＡの初めの５００ベースペアを含む染色体ＤＮＡフラクションをＰＣＲにより得た。このフラグメントのヌクレオチド配列を決定した。幾つかのプライマーを合成及び配列決定に用いた。
プライマー
Figure 2011501961
ＰＣＲプロトコル
１０μＬのＰｗｏ緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、８０．５μＬの脱イオン水、２μＬのｄＮＴＰｓ、１μＬの各プライマー（１０μｇ／μＬ）、０．５μＬＰｗｏポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の反応混合物を５００μＬのエッペンドルフチューブに入れた。
ＰＣＲの条件は、９５℃、４５秒、次に５５℃で４０秒、次に７２℃で２分を２５サイクル行った。ＰＣＲフラグメントをアガロースゲル電気泳動で精製して、次いで、ＱＩＡくいｃｋ（商標）ゲル抽出キット（キアゲン）を用いて、製造元の説明書に従い、ゲルから切断して単離した。本明細書におけるストレプトマイセス１ＡＧ３株の部分的な１６ＳｒＲＮＡ遺伝子は以下の配列を有していた。
Figure 2011501961
ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）におけるＢｌａｓｔｉｎサーチによれば、１ＡＧ３株の最も近い株はストレプトマイセスソマリエンシス（Ｓ．ｓｏｍａｌｉｅｎｓｉｓ）で、４３４ｃｐの塩基が重複し、９７％の同一性が確認された。このことは、１ＡＧ３が十中八九、ストレプトマイセスであることを示している。
実施例３
アルカリ性ストレプトマイセス株１ＡＧ３に存在する新規なプロテアーゼの部分的な遺伝子配列の同定
この実施例では、ストレプトマイセス１ＡＧ３プロテアーゼ遺伝子の部分的に新規な配列を同定するための方法及び組成物を説明する。変質プライマー、ストレプトマイセスＰｒｏｃ＿ＦＷ及びストレプトマイセスＰｒｏｃ＿ＲＶを有するＰＣＲを天然の単離されたストレプトマイセス１ＡＧ３の染色体ＤＮＡを用いて行った。ＰＣＲの結果、「ストレプトグリシス」として知られている、タンパク質に似た新規なプロテアーゼをコードしているＤＮＡフラグメントを得た。
このＰＣＲ法は以下の変性プライマーセットを用いた。
Figure 2011501961
製造元の説明書に従って、精度の高いＴａｑポリメラーゼ（インビトロジェン）で熱サイクラーを用いてＰＣＲを行った（アニーリング温度、５０℃）。ストレプトマイセス１ＡＧ３株のゲノムＤＮＡをＫｉｅｓｅｒら（Ｋｉｅｓｅｒら，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ［２０００］）に記載のように単離して、ＰＣＲのテンプレートとして用いた。ＰＣＲでは約４００ｂｐのフラグメントが得られ、ＤＮＡ配列決定（ＳｅｒｖｉｃｅＸＳ）ではこのＤＮＡフラグメントがたのセリンプロテアーゼに似たタンパク質をコードすることがわかった。この１ＡＧ３プロテアーゼの部分的なヌクレオチド配列を以下に示す。変性ＦＷプライマーを下線で示す。ＲＶプライマーは見つからなかった。この試験の最後に十分な配列情報がなかったためであると考えられる。
Figure 2011501961
以下の配列は、１ＡＧ３プロテアーゼの部分的（翻訳された）アミノ酸配列である。
ＲＣＳＬＧＦＰＶＲＲＧＴＱＡＧＦＡＴＡＧＨＣＧＲＶＧＴＴＴＲＧＦＮＱＶＡＱＧＴＦＱＧＳＩＦＰＧＲＤＭＧＷＶＡＶＮＳＮＷＮＴＴＰＦＶＲＧＱＧＧＡＮＶＴＶＡＧＳＱＱＡＰＶＧＳＳＶＣＲＳＧＳＴＴＧＷＨＣＧＴＩＱＱＨＮＴＳＶＲＹＰＥＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）
実施例４
１ＡＧ３プロテアーゼの完全遺伝子及びタンパク質配列の解明
この実施例では、１ＡＧ３プロテアーゼ全体の遺伝子及びタンパク質配列の解明を行った。これらの実験において、インバースＰＣＲ法を新規なストレプトマイセス１ＡＧ３の染色体ＤＮＡについて行って、アルカリ性ストレプトマイセス１ＡＧ３株からの完全長さ１ＡＧ３プロテアーゼを単離してクローンした。実施例３で説明したストレプトマイセス１ＡＧ３株のプロテアーゼの約４００ｂｐフラグメントのＤＮＡ配列に基づいて、新規なＤＮＡプライマーを設計した。
Figure 2011501961
アルカリ性ストレプトマイセス１ＡＧ３株の染色体ＤＮＡは制限酵素、ＡｐａＩ、ＢａｍｉＨＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＫｐｎＩ、ＮａｒＩ、ＮｃｏＩ、ＮｈｅＩ、ＰｖｕＩ、ＳａｌＩ 又はＳｓｔＩＩで消化して、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キット（キアゲン、カタログ＃２８１０６）で精製して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（インビトロジェン）を用いて製造元に説明書に従って、自己結合した。結合した混合物をキアゲンＰＣＲ精製キットを用いて生成し、ＮｃｏＩ、ＮａｒＩ、ＢｓｓＨＩＩ、又はＳａｌＩで消化したＤＮＡフラグメントをもちいて、１ＡＧ３ｐｒｏｔ＿ＲＶ及び１ＡＧ３ｐｒｏｔ＿ＦＷプライマーでＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ生成物は約０．６乃至２．５ｋｂであった。ＰＣＲを製造元の説明書に従って、精度の高いＴａｑポリメラーゼ（インビトロジェン）で熱サイクラーを用いて（アニーリング温度、５５℃、３５サイクル）。ＤＮＡ配列解析（ＢａｓｅＣｌｅａｒ、オランダ）このＤＮＡフラグメントがストレプトマイセスグリセス由来のストレプトグリシン様タンパク質遺伝子の主要な部分をカバーしていることを明らかにした。
１ＡＧ３プロテアーゼ遺伝子の完全な配列は、ｌＡＧ３−ｕｐｌ（５’−ＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＣＧＡＣＣＡＧＣＴＣＧＧＣＧＧＴＣＴＣ−３’；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）及びｌＡＧ３−ｕｐ２（５’−ＴＧＧＴＣＣＡＧＧＡＡＣＣＧＧＣＧＡＡＧＧＴＧＴＣ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）のプライマーを用いた同じＰＣＲ手順で、追加的な配列解析反応（ＢａｓｅＣｌｅａｒ）を行った。これらのプライマーを用いた配列解析は１３６２ｂｐの１ＡＧ３プロテアーゼ遺伝子の完全な配列を示した。この配列を以下に示す。
Figure 2011501961
Figure 2011501961
以上の配列において、リボゾーム結合部位を下線で示す。開始及び停止コドンを太字で示す。（予測される）シグナル配列をイタリックで示す。（予測される）Ｎ末端プロ配列を二重下線で示す。及び成熟プロテアーゼ配列を波線で示す。
Figure 2011501961
前述の配列において、シグナルペプチドは二重下線で示す。（予測される）プロ配列は下線で示す。成熟鎖は太字で示す。
１ＡＧ３プロテアーゼの分子量（ＭＷ）は既知のＬＣマス法で決定した。１ＡＧ３株の測定されたＭＷ（ＬＣ−ＭＳによる。以下のクロマトグラム及びスペクトルを参照。）２１２６１ダルトンであった。このＭＷは２１２５０と計算されている１ＡＧ３配列の４９位乃至２６５位と一致している。
実施例５
ストレプトマイセスリビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）における１ＡＧ３プロテアーゼ遺伝子のクローニング及び発現
この試験では、１ＡＧ３プロテアーゼのクローニング及び発現を説明する。この実施例はタンパク質分解活性を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含むプラスミド及びストレプトマイセスリビダンス宿主細胞の形質転換のためにベクターの使用を説明する。本明細書で用いる形質転換の方法は当業者に知られている（例えば、米国特許第６，２８７．８３９号及びＷＯ０２／５０２４５参照、参照により本明細書に援用）。
これらの発現に用いたベクター（即ち、プラスミド）はアルカリ性ストレプトマイセス１Ｇ３株から得られた本発明のプロテアーゼをコードしているポリヌクレオチドを含む。このプラスミドをストレプトマイセスリビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）の形質転換に用いた。最終的なプラスミドベクターは「ｐＳＥＡ４ＣＴ−１ＡＧ３」と命名された。前述のように、ｐＳＥＡ４ＣＴ−１ＡＧ３の構築にはｐＳＥＡ４ＣＴプラスミドベクターを用いた。ストレプトマイセス１ＡＧ３プロテアーゼ（１ＡＧ３）をコードしている構造遺伝子に結合しているアスペルギルスニガー（「Ａ４」）調節配列をこれらのプロテアーゼの発現に用いた。ストレプトマイセスＣｅｌＡシグナル配列、１ＡＧ３プロ配列、及び１ＡＧ３成熟プロテアーゼ配列を含むＤＮＡフラグメントを、当業者にＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとして知られているＰＣＲ技術により構築した。ｐＳＥＡＣＴにおけるストレプトマイセス１ＡＧ３プロテアーゼ（１ＡＧ３）のクローニングのためのポリヌクレオチドプライマーはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に基づいている。フォワードプライマー及びリバースプライマーを以下に示す。
Figure 2011501961
ＰＣＲを製造元の説明書に従って、精度の高いＴａｑポリメラーゼ（インビトロジェン）で熱サイクラーを用いて（アニーリング温度、５５℃、２８サイクル）。得られたＰＣＲフラグメントはＢａｍＨＩ及びＮｈｅＩの制限酵素で消化し、ｐＳＥＡ４ＣＴプラスミドをＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ制限酵素で消化した。消化した１ＡＧ３ＰＣＲ生成物とプラスミドＤＮＡフラグメントをキアゲンＰＣＲ精製キット（キアゲン、カタログ＃２８１０６）で精製した。１ＡＧ３プロテアーゼフラグメントを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼキット（インビトロジェン）を用いて製造元の説明書に従って、ｐＳＥＡ４ＣＴプラスミドの中でクローンし、ｐＳＥＡ４ＣＴ−１ＡＧ３プラスミドを生成した。
ストレプトマイセスリビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２３の宿主細胞を前述の実施例で説明した方法を用いて（即ち、Ｈｏｐｗｏｏｄらの方法を用いて）、ｐＳＥＡ４ＣＴ−１ＡＧ３プラスミドベクターで形質転換した。
形質転換された培地をＴＳ＊培地中で３つの形質転換を提供するために行った。ＴＳ＊培地の組成は、１リットル当たり、１６グラムのトリプシン、４グラムのソイトン（ディフコ）、２０グラムのカゼインヒドロリアーゼ（メルク）、１０グラムのＫ２ＨＰＯ４、１５グラムのグルコース、０．６グラムのＢａｓｉｌｄｏｎ消泡剤を含み、ｐＨ７．０であった。インキュベーション条件は、３０℃、２５０ｒｐｍ（ＩｎｆｏｓＨＴ）であった。各種経過時に、発酵ブロスのサンプルを採取して解析した。この実験の目的のために、スキムミルク手順を用いて、クローニングを確実にした。この試験において、３０μＬの振とうフラスコ上清を採取して穴の開いたスキムミルクアガープレート上に接種して、３７℃でインキュベートした。
インキュベートしたプレートをタンパク質分解酵素の発現を示す透明な領域（ハロ）の生成のために一晩インキュベーションした後に、視認で確認した。この実験の目的のためにこのサンプルはプロテアーゼ活性及び分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）についてもアッセイされた。発酵の終了時に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより完全長プロテアーゼが観察された。発酵ブロスのサンプルを以下のようにアッセイした。１０μＬの希釈された上清を収集し、１９０μＬのＡＡＰＦ基質溶液（濃度１ｍｇ／ｍｌ、０．１Ｍトリス／０．００５％ＴＷＥＥＮ（商標）−８０、ｐＨ８．６）。
ｐ−ニトロアニリンの放出に伴う４１０ｎｍの吸光度の増加速度が観察された（２５℃）。３つのクローンのアッセイ結果を以下の表５．１に示す。
Figure 2011501961
これらの結果は明らかに、ストレプトマイセス１ＡＧ３由来のポリヌクレオチドが加水分解活性を有するポリペプチドをコードしており、ストレプトマイセスリビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）で発現したことを示す。
実施例６
他のプロテアーゼに対する１ＡＧ３プロテアーゼの関係
この実施例では、１ＡＧ３プロテアーゼと他のプロテアーゼとの間の関係を決定するために用いた実験を説明する。Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔにおける１ＡＧ３ポリペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）のＢＬＡＳＴサーチはストレプトマイセスグリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）由来のストレプトグリシンＣ（ＳＧＰＣ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）が５９．７％の最も近い既知の相同性、及び６８．０％の同一性を有することを示した。このことは図２のアラインメントに示されている。成熟プロテアーゼ配列（即ち、触媒ドメイン）のみが比較された場合、１ＡＧ３プロテアーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）とＳＧＰＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）の同一性は７４．２％になり、８０．１％の相同性が図３に提供されている。これらの図において、活性部位アミノ酸配列ｈｉｓ−ａｓｐ−ｓｅｒは太字で示され、特徴的な３つのジスルフィド架橋は連結線で示す。
１ＡＧ３プロテアーゼ及びセルロモナス６９Ｂ４（ＡＳＰ）プロテアーゼはオーソロガスである。しかしながら、１ＡＧ３プロテアーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）とＡＳＰプロテアーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）の配列アラインメントはこれらの同一性が３９．６％と低いことを示した。相同性は４９．６％であり、図４に示す。これらのプロテアーゼの成熟タンパク質（触媒）のみを比較した場合、１ＡＧ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）対ＡＳＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）の同一性は４４．１％に増加した、相同性は５３．１％であった。図５に示す。従って、この結果は１ＡＧ３はＡＳＰに対して５０％より高い相同性を有することを示している。更に、１ＡＧ３はＡＳＰより大きな分子量を有する。更に、１ＡＧ３の等電点はＡＳＰより低いことも示された。
実施例７
液体洗剤中の１ＡＧ３プロテアーゼのマイクロスウォッチ洗浄
この実施例では、１ＡＧ３プロテアーゼの洗浄性能をＢＭＩ（血液、ミルク、インク）−マイクロスウォッチ試験を用いて決定した。
洗浄性能の決定
このマイクロスウォッチ試験のために、インキュベーター（Ｉｎｎｏｖａ ４３３０ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ，Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）をそれぞれ２０℃と３０℃で用いた。血液−ミルク−インクで汚れをつけた布見本（ＭＥＰＡ１１６）をＣＦＴより入手し、室温で３０分間、０．３％過酸化水素水に曝して乾燥させた。６．５ｍｍ直径の円を汚れた布見本から切り出し、１つのウェルあたりに１つ、垂直において、９６ウェルのマイクロタイタープレートに置いた。
実施例５で説明した形質転換培地から得られたプロテアーゼサンプルを１０ｍＭのＮａＣｌ０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）（シグマ、Ｐ−１７５４）で希釈して、５乃至６０μｇ／ｍｌ（タンパク質）の所望の濃度にして、アッセイに用いた。
洗剤溶液
漂白剤と酵素を含まない１．６ｇの液体洗剤を１Ｌの脱イオン水を用いて調製し、カルシウムとマグネシウムをこの溶液に添加して、最終硬度が１ガロン当たり６グレイン（即ち、北アメリカ条件）になるように調整した。洗剤溶液Ｉを４ＮのＮａＯＨでｐＨ６．０に調節し、洗剤溶液ＩＩを５ｍＭのＨｅｐｅｓ及び４ＮのＮａＯＨでｐＨ８．２にした。
試験方法
インキュベーターを所望の温度に設定した：２０℃は低い温度条件（洗剤溶液ＩＩ）及び３０℃は低いｐＨ（洗剤溶液Ｉ）条件である。調製され予め切断されたマイクロスウォッチを９６ウェルのＭＴＰのそれぞれに、前述のように入れた。それぞれの洗剤溶液１９０μＬをそれぞれのウェルに添加した。その後、１０μＬの予め希釈された酵素溶液を各ウェルに添加して、最終濃度が。２５乃至３．０μｇ／ｍｌになるようにした（総容量は２００μｌ／ウェルである）。このＭＴＰを漏れないようにシールをして、２０℃（低い温度洗剤溶液ＩＩ）又は３０℃（低いｐＨ洗剤溶液Ｉ）に設定した、インキュベーター／シェカーに固定して、３５０ｒｐｍで１時間振とうさせた。インキュベーションの後、１００μＬの反応溶液を各ウェルから除去し、新鮮なマイクロプレートに置いた（Ｃｏｓｔａｒ ９０１７、コーニング社、ニューヨーク、ＵＳＡ）。マイクロタイターリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ３４０、モレキュラーデバイス）上で、４０５ｎｍでの吸光度を測定し、ブランクの対照（即ち、酵素サンプルの入っていないがマクロスウォッチと洗剤が入っているウェル）と比較した。
ＢＭＩ洗浄性能の計算
１ＡＧ３プロテアーゼについての４０５ｎｍの吸光度で表される濃度反応曲線の結果（１ウェル当りのｐｐｍ）は、図７及び８に示した。
実施例８
布洗浄用液体洗浄組成物
この実施例は本発明に関して用いられる液体洗浄組成物を提供する。これらの組成物は、特に、おしゃれ着洗いの洗浄用製品のほかに、日本の洗浄条件に用いることを意図する。表８−１に好適な組成物を記載する。しかしながら、本発明をこの特定の組成物に限定することは意図しない。任意の他の好適な組成物も本発明に用いることができる。
Figure 2011501961
実施例９
液体食器洗浄組成物
この実施例は本発明に関して用いられる食器用洗浄組成物を提供する。これらの組成物は、特に日本の洗浄条件に用いることを意図する。表９−１に好適な組成物を記載する。しかしながら、本発明をこの特定の組成物に限定することは意図しない。任意の他の好適な組成物も本発明に用いることができる。
Figure 2011501961
実施例１０
液体洗浄組成物
本発明のプロテアーゼは洗浄組成物に用いる。例えば、本発明にもとづいて、特に日本製の洗浄機の洗浄条件下で洗浄される布洗浄用組成物が調製される。幾つかの態様において、以下の表１０−１に示す組成物を含む。特に定義しない限り、この表及び以下の実施例の表における「プロテアーゼ」は本発明の１ＡＧ３プロテアーゼである。
Figure 2011501961
実施例１１
顆粒洗浄組成物
この実施例では、本発明に用いられる顆粒洗浄組成物を提供する。以下の表は好適な組成物を提供する。しかしながら、本発明をこの特定の組成物に限定することは意図しない。任意の他の好適な組成物も本発明に用いることができる。
Figure 2011501961
以下の洗濯用洗剤組成物はヨーロッパ製洗濯機洗浄条件で用いることを意図する。
Figure 2011501961
実施例１２
洗剤
この実施例では、１ＡＧ３及び／又は１ＡＧ３変異体と一緒に用いる各種洗剤を記載する。このセクションで用いる試験方法は本発明のパラメーターのそれぞれの値を決定するために用いることは理解されるであろう。
例示的な洗浄組成物において、特に定義しない限り、酵素レベルは組成物総重量に基づく精製酵素で表される。洗剤の成分は組成物の総重量で表される。
以下の表（表１２−１）は調製された液体洗濯用洗浄組成物である。
Figure 2011501961
以下の表（表１２−２）は調製された食器用洗浄組成物である。
Figure 2011501961
表１２−３は調製された液体食器洗浄機用洗剤である。
Figure 2011501961
表１２−４は顆粒又はタブレット形状に調製された洗濯用洗剤である。
Figure 2011501961
表１２−５は調製された液体洗濯用洗剤である。
Figure 2011501961
表１２−６は調製された高密度食器用洗剤である。
Figure 2011501961
表１２−７は標準的な１２ハードロータープレスを用いて１３ＫＮ／ｃｍ２の圧力で顆粒食器用洗剤を圧縮して調製した本発明の洗浄組成物である。
Figure 2011501961
表１２−８は調製された本発明の液体硬表面洗浄組成物を提供する。
Figure 2011501961
もちろん、これらの開示された態様の各種変更が可能であることは理解されるであろう。それゆえ、前述の詳細な説明は均等物を含む以下の特許請求の範囲に関連していることが理解されるであろう。
実施例１３
１ＡＧ３を含む動物飼料組成物
本発明は１ＡＧ３及び／又は１ＡＧ３変異体を含む動物飼料組成物も提供する。この実施例において、好適な鶏用飼料が提供される。しかしながら、本発明をこの特定の態様に限定することを意図するものではなく、本発明のプロテアーゼは他の多くの動物用飼料に用いることができる。更に、本発明の飼料は愛玩用動物（例えば、犬、猫、馬、げっ歯類）のほかに家畜（ウシ、ブタ、ヒツジ等）を含む他の動物にも用いることができる。以下の表はマッシュ、即ち、３週齢までの七面鳥に与えるためのメイズベースの給餌開始飼料である。
Figure 2011501961
幾つかの実施態様では、この飼料調合物は本願発明の種々の濃度のプロテアーゼ（例えば、２，０００単位/kg、４，０００単位/kg及び６，０００単位/kg）が加えられている。
明細書に記載された全ての特許と刊行物は、発明の属する技術分野の技術者の水準を示す。全ての特許と刊行物は、各個の刊行物が、特定されかつ個別に引用により組み込まれる場合と同程度に引用により本明細書に組み入れられる。
本願発明の好ましい実施態様を述べたので、本願発明の技術分野の通常の技術者には、開示された実施例に種々の変更が行われることができることが明らかであろう。そしてそのような変更は本願発明の範囲内にあることを意図している。
本願発明の技術者は、本願発明が対象物を扱い、対象物が固有に備えているもののほか、記述された目的と利点を得るに十分に適していることが分かるであろう。本明細書に記載された組成物と方法は好ましい実施態様の代表、典型であり、本発明の範囲に関し限定することは意図していない。発明の範囲と本質から逸脱せず本明細書に開示されている発明に種々の置換と変更が行われ得ることは、本願発明の技術分野の技術者には容易に明らかである。
本明細書に説明のため述べられた発明は、本明細書に特定して開示されていないいずれの発明特定事項、限定もない条件で実施できる。使用された用語及び表現は記述のための用語として使用されており、限定のためではなく、かつそのような用語と表現の使用は、明らかにされかつ述べられた特徴と等価なものまたはその一部と等価なものを排除する意図はなく、むしろ、特許を請求する発明の範囲内で種々の変更が可能であることが認識される。従って、本願発明は好ましい実施態様と任意の特徴により具体的に開示されているが、本明細書に開示された概念の修飾、変更は本願発明の技術分野の技術者に委ねられ、且つそのような修飾と変更が、添付の特許請求により定義されている発明の範囲内にあることが理解されるべきである。
本発明は本明細書に広く、属に関して述べられてきた。属の開示の範囲内にあるより狭い範囲の種及び属より下位の分類のそれぞれもまた本発明の一部を形成する。これには、除外されるものが本明細書で特定して記載されていたか否かに拘らず、当該属からいずれかのものを除外する条件または否定的限定（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ）を付した発明についての属に関する記述が含まれる。

Claims (32)

  1. 配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）９の野生型ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）１ＡＧ３プロテアーゼに少なくとも約８０％同一なアミノ酸配列を含む単離されたセリンプロテアーゼ。
  2. 前記単離されたセリンプロテアーゼが前記野生型ストレプトマイセス１ＡＧ３プロテアーゼに対して少なくとも約９５％同一である、請求項１の単離されたセリンプロテアーゼ。
  3. 前記単離されたセリンプロテアーゼが野生型ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）１ＡＧ３プロテアーゼの配列を含む、請求項１の単離されたセリンプロテアーゼ。
  4. 前記単離されたセリンプロテアーゼが前記野生型ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）１ＡＧ３プロテアーゼに対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１の単離されたプロテアーゼ。
  5. 請求項１の単離されたセリンプロテアーゼをコードしている単離された核酸。
  6. 前記核酸がａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に過酷な条件でハイブリダイズする、及び／又はｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に少なくとも約７０％同一な核酸配列を有する、請求項５の単離された核酸。
  7. プロモーター及び請求項６の単離された核酸が作動可能に結合するように含まれている、組換えポリヌクレオチド。
  8. 前記組み換えポリヌクレオチドが、宿主細胞から前記単離されたセリンプロテアーゼの分泌を提供する、請求項７の組換えポリヌクレオチド。
  9. 請求項７の組換えポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  10. 請求項７の組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
  11. 前記宿主細胞がバチルス種、ストレプトマイセス種、アスペルギルス種、及びトリコデルマ種から選択される、請求項１０の宿主細胞。
  12. 前記組換えポリヌクレオチドが前記宿主細胞のゲノム中に存在する、請求項１０の宿主細胞。
  13. 前記単離されたセリンプロテアーゼの生成に好適な条件下で請求項１０の宿主細胞を培養する工程を含む、単離されたセリンプロテアーゼを生成する方法。
  14. 前記単離されたセリンプロテアーゼを回収する工程を更に含む、請求項１３の方法。
  15. 請求項１の単離されたセリンプロテアーゼを含む洗浄組成物。
  16. 前記洗浄組成物がさらに界面活性剤を含む、請求項１５の洗浄組成物。
  17. 前記界面活性剤がエチレンオキサイド部分を含むアルキル硫酸ナトリウムである、請求項１６の洗浄組成物。
  18. 前記単離されたセリンプロテアーゼを重量により約０．００１％乃至約０．５％含む、請求項１５の洗浄組成物。
  19. 前記組成物がｐＨ調整剤の十分量を含み、約３乃至５の正味のｐＨを組成物に提供し、前記組成物が約３乃至５のｐＨで加水分解する物質を実質的に含まない、請求項１５の洗浄組成物。
  20. 前記洗浄組成物が洗濯用洗剤として製剤化される、請求項１５の洗浄組成物。
  21. 前記洗浄組成物が食器用洗剤として製剤化される、請求項１５の洗浄組成物。
  22. 更に、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、マンナナーゼ、ペクチナーゼ、クチナーゼ、オキシダーゼ、ヘミセルラーゼ、及びセルラーゼから選択される追加的な酵素を含む、セルロース１５の洗浄組成物。
  23. 更に、安定剤を含む、請求項１５の洗浄組成物。
  24. 前記安定剤が硼砂、グリセロール、及び競合抑制剤からなる群より選択される、請求項２３の洗浄組成物。
  25. 前記競合抑制剤が前記単離されたセリンプロテアーゼをアニオン界面活性剤から保護する、請求項２４の洗浄組成物。
  26. 前記洗浄組成物が固形組成物である、請求項１５の洗浄組成物。
  27. 前記洗浄組成物が液体組成物である、請求項１８の洗浄組成物。
  28. 目的物を洗浄するのに好適に条件下で、請求項１５の洗浄組成物と目的物を接触させる工程を含む、洗浄方法。
  29. 前記方法が洗浄及び／又はすすぎ工程を更に含む、請求項２８の方法。
  30. 前記目的物が布製品である、請求項２８の方法。
  31. 前記目的物が食器である、請求項２８の方法。
  32. 請求項１の単離されたセリンプロテアーゼを含む動物用飼料。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015519451A (ja) * 2012-05-30 2015-07-09 クラリアント・ファイナンス・（ビーブイアイ）・リミテッド 界面活性剤溶液中における低温安定剤としてのｎ−メチル−ｎ−アシルグルカミンの使用
JP2021526181A (ja) * 2018-06-07 2021-09-30 エコラボ ユーエスエー インコーポレイティド 酵素による深鍋および平鍋用洗剤
WO2022044721A1 (ja) * 2020-08-24 2022-03-03 花王株式会社 衣料用液体洗浄剤組成物

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE602004007766T2 (de) * 2003-02-07 2008-06-05 Novozymes A/S Proteasen
US7892808B2 (en) * 2003-10-10 2011-02-22 Norozymes A/S Protease variants
EP2258838A1 (en) 2004-06-21 2010-12-08 Novozymes A/S Nocardiopsis proteases
CN102533833A (zh) * 2011-10-20 2012-07-04 上海交通大学 链霉菌表达质粒的构建方法及角蛋白酶的生产方法
EP2607469A1 (en) 2011-12-20 2013-06-26 Unilever PLC Liquid detergent with protease and lipase
EP2807254B1 (en) 2012-01-26 2017-08-02 Novozymes A/S Use of polypeptides having protease activity in animal feed and detergents
RU2507212C3 (ru) * 2012-03-28 2022-05-04 Общество С Ограниченной Ответственностью "Айвикс" Способ получения рекомбинантного пептида и полученный пептид
CN104394708A (zh) 2012-06-20 2015-03-04 诺维信公司 具有蛋白酶活性的多肽在动物饲料和洗涤剂中的用途
MX2015010078A (es) 2013-02-06 2016-01-25 Novozymes As Uso de polipeptidos con actividad proteasa en alimentos para animales.
WO2015066669A1 (en) 2013-11-04 2015-05-07 Danisco Us Inc. Proteases in corn processing
WO2015066667A1 (en) 2013-11-04 2015-05-07 Danisco Us Inc. Proteases in wheat processing
AU2017240069B2 (en) 2016-03-31 2024-03-07 Gojo Industries, Inc. Sanitizer composition with probiotic/prebiotic active ingredient
CA3018865A1 (en) 2016-03-31 2017-10-05 Gojo Industries, Inc. Antimicrobial peptide stimulating cleansing composition
EP3487874A1 (en) * 2016-07-20 2019-05-29 Westfälische Wilhelms-Universität Münster Complex-specific standardization of immunological methods for the quantification of s100a12
RU2626002C1 (ru) 2016-10-24 2017-07-21 Общество С Ограниченной Ответственностью "Айвикс" Новая группа пептидов для лечения женской сексуальной дисфункции
CA3043748A1 (en) 2016-11-23 2018-05-31 Gojo Industries, Inc. Sanitizer composition with probiotic/prebiotic active ingredient
KR102613549B1 (ko) * 2021-03-12 2023-12-13 씨제이제일제당 주식회사 신규 세린 프로테아제 변이체

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007515164A (ja) * 2003-11-19 2007-06-14 ジェネンコー・インターナショナル・インク セリンプロテアーゼ、セリン酵素をコードする核酸、およびこれらを取り込んだベクターおよび宿主細胞

Family Cites Families (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB250289A (en) 1924-11-10 1926-04-12 Markus Brutzkus Process for obtaining water gas from liquid hydrocarbons
US3840433A (en) 1968-09-23 1974-10-08 Novo Terapeutisk Labor As Dehairing of leather
GB1296839A (ja) 1969-05-29 1972-11-22
GB1372034A (en) 1970-12-31 1974-10-30 Unilever Ltd Detergent compositions
ES421535A1 (es) 1973-01-13 1976-06-16 Roehm Gmbh Procedimiento para la preparacion de pellejos dispuestos para curtir a partir de cuero y pieles de origen animal.
US4141680A (en) 1973-11-14 1979-02-27 Monsanto Company Rotary stretch blow molding apparatus
DK187280A (da) 1980-04-30 1981-10-31 Novo Industri As Ruhedsreducerende middel til et fuldvaskemiddel fuldvaskemiddel og fuldvaskemetode
JPS58144105A (ja) 1982-02-12 1983-08-27 Kurabo Ind Ltd スケ−ル除去獣毛繊維の製法
US4760025A (en) 1984-05-29 1988-07-26 Genencor, Inc. Modified enzymes and methods for making same
US5972682A (en) 1984-05-29 1999-10-26 Genencor International, Inc. Enzymatically active modified subtilisins
US5763257A (en) 1984-05-29 1998-06-09 Genencor International, Inc. Modified subtilisins having amino acid alterations
US5264366A (en) 1984-05-29 1993-11-23 Genencor, Inc. Protease deficient bacillus
DK154572C (da) 1985-08-07 1989-04-24 Novo Industri As Enzymatisk detergentadditiv, detergent og fremgangsmaade til vask af tekstiler
JPH0697997B2 (ja) 1985-08-09 1994-12-07 ギスト ブロカデス ナ−ムロ−ゼ フエンノ−トチヤツプ 新規の酵素的洗浄剤添加物
US5364770A (en) 1985-08-29 1994-11-15 Genencor International Inc. Heterologous polypeptides expressed in aspergillus
DK122686D0 (da) 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
US5766912A (en) 1986-03-17 1998-06-16 Novo Nordisk A/S Humicola lipase produced in aspergillus
US4810414A (en) 1986-08-29 1989-03-07 Novo Industri A/S Enzymatic detergent additive
DE3851875T2 (de) 1987-05-29 1995-04-13 Genencor Int Cutinase haltige reinigungsmittelzusammensetzungen.
US5314692A (en) 1987-08-24 1994-05-24 Cultor Ltd. Enzyme premix for feed and method
ES2076939T3 (es) 1987-08-28 1995-11-16 Novo Nordisk As Lipasa recombinante de humicola y procedimiento para la produccion de lipasas recombinantes de humicola.
JPS6474992A (en) 1987-09-16 1989-03-20 Fuji Oil Co Ltd Dna sequence, plasmid and production of lipase
EP0471265B1 (en) 1988-01-07 1995-10-25 Novo Nordisk A/S Specific protease
JP3079276B2 (ja) 1988-02-28 2000-08-21 天野製薬株式会社 組換え体ｄｎａ、それを含むシュードモナス属菌及びそれを用いたリパーゼの製造法
DE3841152A1 (de) 1988-12-07 1990-06-13 Hoechst Ag Verwendung von bakterienlysierendem enzymprodukt als zusatzstoff zur verbesserung der futterverwertung in der tierproduktion
WO1990009446A1 (en) 1989-02-17 1990-08-23 Plant Genetic Systems N.V. Cutinase
DE3922748B4 (de) 1989-07-11 2006-01-05 Röhm GmbH & Co. KG Enzymatisches Weichverfahren
KR100236540B1 (ko) 1990-04-14 2000-01-15 레클로우크스 라우에르 알카리성 바실러스-리파제, 이를 코-딩하는 dna 서열 및 리파제를 생산하는 바실러스 균주
KR930702514A (ko) 1990-09-13 1993-09-09 안네 제케르 리파제 변체
DE4035839A1 (de) 1990-11-10 1992-05-14 Roehm Gmbh Protease als wirkenzym enthaltende, tensidfreie feste enzympraeparate
ATE219136T1 (de) 1991-01-16 2002-06-15 Procter & Gamble Kompakte waschmittelzusammensetzungen mit hochaktiven cellulasen
CZ285164B6 (cs) 1991-03-26 1999-05-12 Röhm Gmbh Způsob výroby holin, připravených k vyčinění
JP2905311B2 (ja) 1991-04-24 1999-06-14 ユニチカ株式会社 獣毛繊維製品の防縮加工方法
US5340735A (en) 1991-05-29 1994-08-23 Cognis, Inc. Bacillus lentus alkaline protease variants with increased stability
US5646028A (en) 1991-06-18 1997-07-08 The Clorox Company Alkaline serine protease streptomyces griseus var. alkaliphus having enhanced stability against urea or guanidine
ATE257517T1 (de) * 1991-08-30 2004-01-15 Vertex Pharma Interleukin 1-beta protease und ihre inhibitoren
ATE248223T1 (de) 1991-11-14 2003-09-15 Novozymes As Ein bacillus-promotor, der von dem alpha-amylase- promotor einer variante des bacillus licheniformis abstammt
EP0639222A1 (en) * 1992-05-08 1995-02-22 The Procter & Gamble Company Granular detergent compositions with lipase
KR100303620B1 (ko) 1992-12-01 2001-11-22 피아 스타르 효소반응의증강법
AU6029894A (en) 1993-01-18 1994-08-15 Procter & Gamble Company, The Machine dishwashing detergent compositions
ATE175235T1 (de) 1993-02-11 1999-01-15 Genencor Int Oxidativ stabile alpha-amylase
DK48693D0 (da) 1993-04-30 1993-04-30 Novo Nordisk As Enzym
GB9313025D0 (en) 1993-06-24 1993-08-11 Macawber Ltd Simon Pneumatic conveying systems
DK77393D0 (da) 1993-06-29 1993-06-29 Novo Nordisk As Aktivering af enzymer
US5698504A (en) 1993-07-01 1997-12-16 The Procter & Gamble Company Machine dishwashing composition containing oxygen bleach and paraffin oil and benzotriazole compound silver tarnishing inhibitors
DE4332692C1 (de) 1993-09-25 1994-07-28 Deutsches Wollforschinst Verfahren zur Druckvorbehandlung und/oder Filzfreiausrüstung von Wolle
US5861271A (en) 1993-12-17 1999-01-19 Fowler; Timothy Cellulase enzymes and systems for their expressions
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
ES2364774T3 (es) 1994-02-24 2011-09-14 HENKEL AG &amp; CO. KGAA Enzimas mejoradas y detergentes que las contienen.
ES2302330T3 (es) 1994-02-24 2008-07-01 Henkel Kommanditgesellschaft Auf Aktien Enzimas mejoradas y detergentes que las contienen.
US5691295A (en) 1995-01-17 1997-11-25 Cognis Gesellschaft Fuer Biotechnologie Mbh Detergent compositions
US5686014A (en) 1994-04-07 1997-11-11 The Procter & Gamble Company Bleach compositions comprising manganese-containing bleach catalysts
ATE222286T1 (de) 1994-06-17 2002-08-15 Genencor Int Reinigungsverfahren mit pflanzenzellwände abbauendes hemicellulase enzym enthaltender zusammensetzung und deren verwendung in reinigungsverfahren
GB2294268A (en) 1994-07-07 1996-04-24 Procter & Gamble Bleaching composition for dishwasher use
BR9508582A (pt) 1994-08-11 1998-06-02 Genencor Int Composição limpadora contendo agente alvejante
GB9416841D0 (en) 1994-08-19 1994-10-12 Finnfeeds Int Ltd An enzyme feed additive and animal feed including it
US5660982A (en) 1994-10-04 1997-08-26 Tryggvason; Karl Laminin chains: diagnostic uses
EP0784706B1 (en) 1994-10-07 1999-12-01 Novo Nordisk A/S A method for processing of hides or skins into leather, comprising enzymatic treatment of the hide or skin with a trypsin acting microbial protease
WO1996017921A1 (en) 1994-12-09 1996-06-13 The Procter & Gamble Company Automatic dishwashing composition containing particles of diacyl peroxides
ATE429490T1 (de) 1995-05-05 2009-05-15 Novozymes As Protease-varianten und verbindungen
BR9609284A (pt) 1995-06-16 1999-05-11 Procter & Gamble Composições para lavar louça em máquina automática compreendendo catalisadores de cobalto
DE19530816A1 (de) 1995-08-23 1997-02-27 Cognis Bio Umwelt Verwendung von mutierter Subtilisin-Protease in kosmetischen Produkten
CN1243827C (zh) 1996-08-23 2006-03-01 彼得·鲁戴尔·简森 选定生物体的人工启动子文库和得自这种文库的启动子
WO1998022500A2 (en) 1996-11-21 1998-05-28 Cor Therapeutics, Inc. Modulation of interactions between myosin and integrins
EP0988367A1 (en) * 1997-06-04 2000-03-29 The Procter & Gamble Company Mixed protease enzyme systems for cleaning protein based soils and compositions incorporating same
AR016969A1 (es) 1997-10-23 2001-08-01 Procter & Gamble VARIANTE DE PROTEASA, ADN, VECTOR DE EXPRESIoN, MICROORGANISMO HUESPED, COMPOSICIoN DE LIMPIEZA, ALIMENTO PARA ANIMALES Y COMPOSICIoN PARA TRATAR UN TEXTIL
RU2252254C2 (ru) * 1997-10-23 2005-05-20 Джененкор Интернэшнл, Инк. Вариант субтилизина bacillus (варианты), кодирующая его днк, экспрессирующий вектор и очищающая композиция
US6287839B1 (en) 1997-11-19 2001-09-11 Genencor International, Inc. Cellulase producing actinomycetes, cellulase produced therefrom and method of producing same
US6562612B2 (en) 1997-11-19 2003-05-13 Genencor International, Inc. Cellulase producing actinomycetes, cellulase produced therefrom and method of producing same
EP1032655B1 (en) 1997-11-21 2005-06-29 Novozymes A/S Protease variants and compositions
WO1999034011A2 (en) 1997-12-24 1999-07-08 Genencor International, Inc. Method of assaying for a preferred enzyme and/or detergent
US5955310A (en) 1998-02-26 1999-09-21 Novo Nordisk Biotech, Inc. Methods for producing a polypeptide in a bacillus cell
CN100497614C (zh) 1998-06-10 2009-06-10 诺沃奇梅兹有限公司 甘露聚糖酶
US6376450B1 (en) 1998-10-23 2002-04-23 Chanchal Kumar Ghosh Cleaning compositions containing multiply-substituted protease variants
CN1260394A (zh) * 1999-10-21 2000-07-19 中国医学科学院医药生物技术研究所 新型纤溶酶cgw－3及其制备方法
US6440991B1 (en) 2000-10-02 2002-08-27 Wyeth Ethers of 7-desmethlrapamycin
CA2442710A1 (en) 2001-03-27 2003-01-03 Human Genome Sciences, Inc. Human secreted proteins
US7344875B2 (en) * 2003-07-01 2008-03-18 Microbial Chemistry Research Foundation Streptomyces strain that decomposes proteins recalcitrant to proteolysis
DE102004017141A1 (de) 2004-04-01 2005-12-01 Bergische Universität Wuppertal Neue Gene aus Biosynthese Genclustern zur Synthese von Aminoglycosid-Antibiotika sowie damit herstellbare neue Aminoglycosid-Antibiotika
DK1819818T3 (da) 2004-11-18 2013-05-06 Genencor Int Aspergillus niger-promoter til ekspression af gener i værtsceller

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007515164A (ja) * 2003-11-19 2007-06-14 ジェネンコー・インターナショナル・インク セリンプロテアーゼ、セリン酵素をコードする核酸、およびこれらを取り込んだベクターおよび宿主細胞

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6011046079; Ｓａｍｂｒｏｏｋ　＆　Ｒｕｓｓｅｌｌ，"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ"，３ｒｄ．　Ｅｄ．，２００１，Ｖｏｌ．２，１０．４７ *
JPN6012034423; Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　１９９４，　２６９（３１），　ｐｐ．２０１６７-２０１７１ *
JPN6012034424; Ｃａｎ．　Ｊ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　２００７　Ｆｅｂ，　５３（２），　ｐｐ．１８６-１９５ *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015519451A (ja) * 2012-05-30 2015-07-09 クラリアント・ファイナンス・（ビーブイアイ）・リミテッド 界面活性剤溶液中における低温安定剤としてのｎ−メチル−ｎ−アシルグルカミンの使用
JP2021526181A (ja) * 2018-06-07 2021-09-30 エコラボ ユーエスエー インコーポレイティド 酵素による深鍋および平鍋用洗剤
JP2023026447A (ja) * 2018-06-07 2023-02-24 エコラボ ユーエスエー インコーポレイティド 酵素による深鍋および平鍋用洗剤
WO2022044721A1 (ja) * 2020-08-24 2022-03-03 花王株式会社 衣料用液体洗浄剤組成物

Also Published As

Publication number Publication date
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