JP2009232868A - アラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法及び酵素組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】血清及び緩衝液からなる群より選ばれる少なくとも1種の媒体中に、アラニンアミノトランスフェラーゼを安定化する安定化成分として、バリンを含有させるアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法である。また血清及び緩衝液からなる群より選ばれる少なくとも1種の媒体に対して、アラニンアミノトランスフェラーゼとバリンとを含有させて酵素組成物とする。
【選択図】 なし
Description
また、アラニンアミノトランスフェラーゼ(Alanine aminotransferase EC 2.6.1.2、以下ALTと略す)はアラニン及びα−ケトグルタル酸からグルタミン酸及びピルビン酸を生成する酵素で、肝臓、腎臓、心臓に多く存在し、ASTと同様に臨床診断に有用な指標である。
これらAST及びALTの血液中に含まれる量を検出するために行われる日常検査等においては、コントロール物質を用いて行う場合が多い。
従ってコントロール物質は、日常的な検査における検査値の安定性や信頼性を保証する上で、また精密且つ高度な技術が要求される臨床試験を行う上で、その取り扱いが重要となってきている。例えば、人の血液中に含まれるASTやALTの数値を検出する場合には、ASTやALTを含有させたコントロール物質を用いることになるが、上記したコントロール物質の役割を十分に果たすためには、コントロール物質に含有させた不安定な酵素であるASTやALTの酵素活性を十分に安定化させる必要がある。
また、アミノ酸を用いた酵素の安定化については、ハロルド等(Harold L.Segal et.al. Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol.30(1), P.63〜68, 1968)に代表されるように、過去から研究されてきた。
更に、コントロール物質の濁度を減少させるためにアミノ酸を用いた報告もあるが、何れにせよアミノ酸は蛋白質の変性を防ぐことができると考えられている。
そこで本発明者らは、このような問題を解決すべく、コントロール物質の濁度や蛋白質の変性に対して果たすアミノ酸の役割等の事実を出発点として、鋭意研究を重ねた結果、コントロール物質等に含まれる、特にAST、ALTの酵素を安定化させるものとして、特にバリン、プロリンが当該酵素を安定化させることを見出し、本発明のアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法及び酵素組成物を完成するに至った。
また本発明のアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法の第2の特徴は、上記第1の特徴に加えて、バリンの含有量を0.5〜100mmol/Lとすることである。
また本発明のアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法の第3の特徴は、上記第1の特徴に加えて、安定化成分としてプロリンをさらに含有させることである。
また本発明のアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法の第4の特徴は、上記第3の特徴に加えて、バリンの含有量が5〜20mmol/Lであり、プロリンの含有量が10〜500mmol/Lであることである。
また本発明のアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法の第5の特徴は、上記第1〜第4の何れかの特徴に加えて、血清または緩衝液が、可溶性蛋白質を含む緩衝液であることである。
また本発明のアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法の第6の特徴は、上記第5の特徴に加えて、可溶性蛋白質がアルブミン及びゼラチンからなる群より選ばれる少なくとも1種の可溶性蛋白質であることである。
また本発明のアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法の第7の特徴は、上記第6の特徴に加えて、アルブミンの濃度は0.5〜15重量%であることである。
また本発明のアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法の第8の特徴は、上記第6の特徴に加えて、ゼラチンの濃度は0.5〜15重量%であることである。
また本発明の酵素組成物は、血清及び緩衝液からなる群より選ばれる少なくとも1種の媒体に対して、アラニンアミノトランスフェラーゼと、バリンとが含有せられていることを第9の特徴としている。
また本発明の酵素組成物の特徴は、上記第9の特徴に加えて、プロリンをさらに含有させることである。
前記媒体としては、血清や緩衝液を用いることができる。血清とは、広い意味において、ヒト血清やその他の動物の血清、或いはそれらに処理を加えたものとする。前記血清や緩衝液は、可溶性蛋白質溶液を含む緩衝液とすることができる。以下、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをAST、アラニンアミノトランスフェラーゼをALTと略す。
上記ASTやALTを安定化する安定化成分としてのバリン、プロリンは、バリン単独で用いる場合、プロリン単独で用いる場合及びバリンとプロリンの両方を組み合わせて用いる場合の3つの場合がある。ただし、これらの安定化成分は、AST、ALTの各単独或いは両組み合わせを安定化するのに用いられて、良好な効果を発揮するのは勿論である。が、他の酵素に対する安定化成分として用いる場合も本発明の範囲内である。またプロリンをALT安定化に単独で用いる場合は、100mmol/Lを超える量でプロリンの量を用いるのが好ましい。
また上記の特徴において、媒体中に酵素としてASTを含ませたものは、コントロール物質として、典型的には、人の血液中に含まれるAST量を検出する場合に用いることができる。また媒体に酵素としてALTを含ませたものは、コントロール物質として、典型的には、人の血液中に含まれるALTの量を検出する場合に用いられる。
コントロール物質に含ませるAST、ALTの起源は特に限定しないが、例えばウシ心臓、ブタ心臓、ヒト心臓、血清、赤血球、尿等の生体材料、さらにヒト細胞を培養したもの、或いはヒト由来遺伝子を組み込んだ形質転換体を培養することにより得ることができる。この場合AST、ALTの含有量は、それぞれ5〜1000U/Lとする。が、好ましくは30〜500U/Lとする。
上記特徴において、媒体が血清である場合には、コントロール物質は、その血清に酵素と安定化成分としてのアミノ酸を含有している。
また上記特徴において、媒体が緩衝液である場合としては、例えばウシ血清アルブミンを溶かしたBES緩衝液を用いることができる。が、実際に検査装置にかけられる検査対象物(厳密には検査対象物の媒体)の種類や状態に対応して、物理的に或いは化学的に似た性質を持つようにするため、種々の物質を緩衝液に溶解したものを用いることができる。本発明はこの様な場合も含むものとする。
また前記グッド緩衝液または生化学用緩衝液を用いる場合は、20mM〜1Mの濃度、好ましくは20mM〜500mMの濃度、最適には20mM〜300mMの濃度に調整して用いれば良い。
上記特徴において、媒体が可溶性蛋白質溶液である場合としては、BSA、ヒト血清アルブミン(HSA)、ゼラチン等の水溶液があげられるが、これらを1種または2種以上組み合わせて使用することができる。この場合、アルブミンとゼラチンの濃度は、それぞれ0.5〜15重量%が好ましい。更に、媒体が血清である場合でも上記緩衝液を適時用いることができる。
上記したバリン或いはプロリンを用いて酵素の安定化を図る場合には、多量のバリン、プロリンを溶媒に添加することなく、低濃度で、よってコントロール物質が高比重、高粘性となることなく、酵素の安定化を図ることができる。さらにバリン、プロリンはAST、ALT以外の酵素、例えば、アルカリホスファターゼ(ALP)(EC.3.1.3.1)、クレアチンキナーゼ(CK)(EC.2.7.3.2)、乳酸デヒトロゲナーゼ(LDH)(EC.1.1.1.27)、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ(γ−GTP)(EC.2.3.2.2)の安定化に負の影響を及ぼすものではなかった。尚、前記各酵素の添加量は、ALPが9〜6500U/L、特に好ましくは45〜1300U/L、CKが6〜4000U/L、特に好ましくは30〜800U/L、LDHが8〜4000U/L、特に好ましくは40〜800U/L、γ−GTPが2〜1200U/L、特に好ましくは10〜800U/Lとすることができる。
前記バリン、プロリンをASTとALTからなる群より選ばれる少なくとも1種の酵素を含むコントロール物質の安定化成分として用いる場合、バリン単独の場合の含有量は0.5〜100mmol/Lとする。そしてより好ましくは、バリンの含有量を10〜20mmol/Lとする。このような範囲とすることで安定化の効果が良好で、しかも物理的化学的性質も検査対象である血清と近いものとすることができる。
またバリンとプロリンを組み合わせる場合の含有量は、バリンは5〜20mmol/L、プロリンは10〜500mmol/Lとし、組み合わせられた総量は15〜520mmol/Lとする。
またALTを安定化成分により安定化させることが可能となり、ALTを検出対象とする検査等において、安定した正確な検出データを得ることが可能となった。特に、ALTに対して、バリンを安定化成分として用いることで、バリンの少ない含有量でもってALTの安定化を十分に図ることができる。
また上記本発明の特徴によるアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法によれば、媒体を血清とすることで、血清中に含まれるALTの検出を行う場合、媒体である血清の中にALTとその安定化成分であるバリンを一緒に加えたコントロール物質等を用いることができ、物理的、化学的に似た良好な環境下での検出が可能となる。
同様に、媒体を緩衝液とすることで、緩衝液という安定した媒体中において、ALTを安定化成分であるバリンにより安定化させることができる。勿論、緩衝液には必要に応じて種々の成分を溶解させることで、検査対象物質(溶媒)と類似の物理的、化学的性質を有するコントロール物質を提供することができる。
また上記本発明の特徴によるアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法において、バリンの含有量を0.5〜100mmol/Lとすることで、ALTの良好な安定化を図ることができる。
また上記本発明の特徴によるアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法において、安定化成分としてプロリンをさらに含有させることで、ALTの良好な安定化を図ることができる。
また上記本発明の特徴によるアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法において、バリンの含有量が5〜20mml/Lであり、プロリンの含有量が10〜500mmol/Lであることで、ALTの良好な安定化を図ることができる。
また上記本発明の特徴によるアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法において、血清または緩衝液が可溶性蛋白質を含む緩衝液である場合には、該可溶性蛋白質を含む緩衝液中であっても、ALTを安定化成分であるバリン等により安定化させることができる。
更に前記可溶性蛋白質がアルブミン及びゼラチンからなる群より選ばれる少なくとも1種の可溶性蛋白質である場合には、アルブミンやゼラチンを含む緩衝液中においても、ALTを安定化成分であるバリン等により安定化させることができる。この場合、アルブミンとゼラチンの濃度が、それぞれ0.5〜15重量%である場合に好ましくALTを安定化させることができる。
また上記本発明の酵素組成物によれば、血清及び緩衝液からなる群より選ばれる少なくとも1種の媒体に対して、ALTと、バリンとが含有せられていることで、ALTが容易に変性せずに、安定した状態で存在することができる酵素組成物を提供することができる。よってこのような酵素組成物をコントロール物質として、ALTを検出対象とする検査等に用いることで、安定した正確な検出データを得ることが可能となる。
ヒト血清(トリナ社製(スイス国))を用い、これを予め56℃で4時間熱処理することにより、内因性の酵素を失活させた後、0.2μmのメンブランフィルターで除菌濾過する(これをヒト血清ベースと称する。)。このヒト血清ベース(媒体)に、例えば10mmol/Lのバリンを溶解し、更にAST又はALTを一定量溶解することで、バリンを安定化成分としたAST又はALTを含むコントロール血清を得ることができる。
また前記ヒト血清ベースに、例えば300mmol/Lのプロリンを溶解し、更にAST又はALTを一定量溶解することで、プロリンを安定化成分としたAST又はALTを含むコントロール血清を得ることができる。
20mmol/LのBES緩衝液に、ウシ血清アルブミン(インタージエン社製(アメリカ))を3%含有させ、これを除菌濾過する(pH7.4、これをBSAベースとする)。このBSAベースに、例えば10mmol/Lのバリンを溶解し、更にAST又はALTを一定量溶解することで、緩衝液媒体中にバリンを安定化成分とし、AST、ALTを含むコントロール物質を得ることができた。
尚、本発明の方法を用いて得られるコントロール物質は通常の使用時において液体であるが、保存状態としては、凍結乾燥品、冷凍保存品、凍結液状品等、液体以外の状態であってもよい。
実施例1
コントロール物質中のAST又はALTに対する各種アミノ酸の安定化効果の確認
媒体としてヒト血清ベースとBSAベースをそれぞれ用い、それらの各媒体に対して安定化成分として、アミノ酸無添加のもの、アミノ酸としてバリンを10mmol/L加えたもの、プロリンを10mmol/L加えたもの、その他のアミノ酸を10mmol/L加えたものを作り(但し、チロシンは1mmol/L)、さらにそれらに対して、酵素としてASTを約100U/Lになるように加え、また酵素としてALTを約100U/Lになるように加えて、コントロール物質を作製した。
そして得られた各コントロール物質を45℃で4日間保持し、各コントロール物質に含まれるASTとALTの残存活性を測定した。
尚、使用するASTは旭化成工業株式会社製(製造番号T−70)のヒト肝遺伝子組換体由来のもの(以下、r−ASTと称す)を用いた。また、ALTは旭化成工業株式会社製(製造番号T−71)のヒト肝遺伝子組換体由来のもの(以下、r−ALTと略す)を用いた。また使用するヒト血清ベースは、ヒト血清を予め56℃で4時間熱処理して内因性の酵素を失活させた後、0.2μmのメンブランフィルターで除菌濾過したものを用いた。また使用するBSAベースは、3%BSA含有の20mmol/LのBES緩衝液を用いた。
ASTとALTの残存活性の測定は、ASTについては国際試薬株式会社製のAST試薬・L「コクサイ」を用いて測定した。またALTについては国際試薬株式会社製のALT試薬・L「コクサイ」を用いて測定した。
結果を表1に示す。
表1から明らかなように、バリンとプロリンがAST、ALTに対して好ましい安定化効果を示した。
コントロール物質中のAST又はALTに対するバリンの安定化効果の確認
ヒト血清ベース、BSAベースにバリン及びr−AST、r−ALTを約100U/Lになるように加え、45℃で4日間保持し、残存活性を測定した。AST、ALTの活性測定は実施例1と同様に行った。
結果を表2に示す。
表2から明らかなように、BSAベースでは、バリン無添加の場合のAST、ALTの残存率はそれぞれ53%、32%であるのに対して、バリンを0.5mmol/L添加することによりAST、ALTの残存率がそれぞれ65%、38%となり安定性が向上した。またバリン濃度が10mmol/Lの場合におけるAST、ALTの残存率は、それぞれ85%、62%であり、バリン濃度が20mmol/Lの場合におけるAST、ALTの残存率は、それぞれ82%、65%であり、更にバリン濃度が100mmol/Lの場合におけるAST、ALTの残存率は、それぞれ82%、65%であった。
またヒト血清ベースでも、同様にバリン無添加の場合のAST、ALTの残存率はそれぞれ41%、20%であったが、バリンを0.5mmol/L添加することによりAST、ALTの残存率それぞれ47%、28%となり安定性が向上した。またバリン濃度が10mmol/LのときのAST、ALTの残存率は、それぞれ71%、55%であり、バリン濃度が20mmol/Lの場合におけるAST、ALTの残存率は、それぞれ73%、56%であり、更にバリン濃度が100mmol/Lの場合におけるAST、ALTの残存率は、それぞれ72%、55%であった。
以上よりバリンの濃度は0.5〜100mmol/Lとするのが良く、より好ましくは10〜20mmol/Lとするのがよいことが判った。
コントロール物質中のAST又はALTに対するプロリンの安定化効果の確認
媒体としてヒト血清ベースとBSAベースをそれぞれ用い、それらの各媒体に対して安定化成分として、プロリン無添加のもの、プロリンをそれぞれ0.5、10、100、300、500mmol/L加えたものを作り、さらにそれらに対して、酵素としてr−ASTを約100U/Lになるように加え、また酵素としてr−ALTを約100U/Lになるように加えて、コントロール物質を作製した。そして得られた各コントロール物質を45℃で4日間保持し、各コントロール物質に含まれるASTとALTの残存活性を測定した。AST、ALTの活性測定は実施例1と同様に操作を行った。その結果を表3に示す。
表3から明らかなように、BSAベースでは、プロリン無添加の場合にAST、ALTの残存率がそれぞれ53%、32%であるのに対して、プロリンを0.5mmol/L添加することによりAST、ALTの残存率がそれぞれ60%、41%となり、安定性が向上した。プロリンを100mmol/L添加することにより、AST、ALTの残存率がそれぞれ74%、69%となり、プロリン濃度が300mmol/Lの場合のAST、ALTの残存率は、それぞれ84%、84%であり、更にプロリン濃度が500mmol/Lの場合のAST、ALTの残存率は、それぞれ84%、85%であった。
またヒト血清ベースでも同様にAST、ALTのプロリン無添加のときの残存率は、それぞれ41%、20%であったが、プロリンを0.5mmol/L添加することによりAST、ALTの残存率がそれぞれ49%、34%となり安定が向上した。またプロリンを100mmol/L添加することにより、AST、ALTの残存率がそれぞれ67%、65%となり、プロリンを300mmol/L添加することによりAST、ALTの残存率がそれぞれ82%、83%となり、更にプロリン濃度が500mmol/Lの場合の時のAST、ALTの残存率は、それぞれ85%、88%であった。
以上よりプロリンの濃度は0.5〜500mmol/Lとするのが良く、より好ましくは100〜500mmol/Lとするのがよいことが判った。特にALTの安定化に対するプロリンの濃度については、100mmol/Lを超え2.5mol/Lまでの濃度で適宜使用するのが好ましく、最適には300〜500mmol/Lとするのがよいことが判った。
コントロール物質中のAST、ALTに対するバリンとプロリンを組み合わせたときの安定化効果の確認
ヒト血清ベースにバリン、プロリン及びr−AST、r−ALTを約100U/Lになるように加え、45℃で4日間保存し、残存活性を測定した。AST、ALTの活性測定は実施例1と同様に操作を行った。その結果を表4に示す。
表4で明らかなように、アミノ酸無添加の場合のASTの残存率が41%であり、これに対してバリンを単独で5mmol/L添加したときの残存率が52%で、プロリンを単独で10mmol/L添加したときの残存率は54%となり、更にバリンを5mmol/Lとプロリンを10mmol/L添加したときの残存率は66%となり、それぞれのアミノ酸を単独で用いた場合より安定性が向上した。
また、アミノ酸無添加の場合のALTの残存率は20%であったが、バリンを単独で5mmol/L添加した場合の残存率は33%、プロリンを単独で10mmol/L添加した場合の残存率は43%となり、更にバリンを5mmol/Lとプロリンを10mmol/L添加したときの残存率は54%となり、それぞれのアミノ酸を単独で用いた場合より安定化が向上した。
またバリンを20mmol/Lに対してプロリンを10mmol/Lとして組み合わせた場合のASTの残存率は78%で、ALTの残存率は79%、バリンを20mmol/Lに対してプロリンを100mmol/Lとして組み合わせた場合のASTの残存率は84%で、ALTの残存率は85%、バリンを20mmol/Lに対してプロリンを300mmol/Lとして組み合わせた場合のASTの残存率は90%で、ALTの残存率は92%、バリンを20mmol/Lに対してプロリンを500mmol/Lとして組み合わせた場合のASTの残存率は94%で、ALTの残存率は94%であった。
以上よりバリンとプロリンとを組み合わせて用いる場合には、バリンを5〜20mmol/L、プロリンを10〜500mmol/Lとするのがよく、組み合わせられた総量が15〜520mmol/Lとするのがよいことが判った。またこの濃度では、比重、粘度等はヒト血清に近似したものであった。
起源の異なるAST、ALTに対するバリン、プロリンの安定化効果の確認
ヒト血清ベースに安定化成分としてバリンを10mmol/L、プロリンを300mmol/L含有させたもの、及び含有させないものを作り、これらに対して起源の異なる幾つかのAST、ALTをそれぞれ約100U/Lになるように加え、コントロール物質を作製した。各コントロール物質を45℃で4日間保存し、残存活性を測定した、AST、ALTの活性測定は実施例1と同様に操作を行った。その結果を表5に示す。
表5から明らかなように、各種起源の異なるAST、ALTに対してもバリン、プロリンによる安定化効果があることがわかった。
Claims (10)
- 血清及び緩衝液からなる群より選ばれる少なくとも1種の媒体中に、アラニンアミノトランスフェラーゼを安定化する安定化成分として、バリンを含有させることを特徴とするアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法。
- バリンの含有量が0.5〜100mmol/Lであることを特徴とする請求項1に記載のアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法。
- 安定化成分としてプロリンをさらに含有させることを特徴とする請求項1に記載のアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法。
- バリンの含有量が5〜20mmol/Lであり、プロリンの含有量が10〜500mmol/Lであることを特徴とする請求項3に記載のアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法。
- 血清または緩衝液が、可溶性蛋白質を含む緩衝液であることを特徴とする請求項1〜4の何れかに記載のアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法。
- 可溶性蛋白質がアルブミン及びゼラチンからなる群より選ばれる少なくとも1種の可溶性蛋白質であることを特徴とする請求項5に記載のアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法。
- アルブミンの濃度は0.5〜15重量%であることを特徴とする請求項6に記載のアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法。
- ゼラチンの濃度は0.5〜15重量%であることを特徴とする請求項6に記載のアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法。
- 血清及び緩衝液からなる群より選ばれる少なくとも1種の媒体に対して、アラニンアミノトランスフェラーゼと、バリンとが含有せられていることを特徴とする酵素組成物。
- プロリンをさらに含有させることを特徴とする請求項9に記載の酵素組成物。
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