DE69933485T2

DE69933485T2 - Verfahren zur Stabilisierung von Alaninaminotransferase und die entsprechenden Zusammensetzungen

Info

Publication number: DE69933485T2
Application number: DE69933485T
Authority: DE
Inventors: c/o Int. Reagents Corp. Toshiyuki Kobe-shi Baba; c/o Int. Reagents Corp. Hiromasa Kobe-shi Tabata; c/o Int. Reagents Corp. Katashi Kobe-shi Nagamatsu; c/o Int. Reagents Corp. Yoshifumi Kobe-shi Watazu; c/o Int. Reagents Corp. Ryoji Kobe-shi Aoki
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 1998-04-24
Filing date: 1999-04-23
Publication date: 2007-01-11
Anticipated expiration: 2019-04-24
Also published as: EP1136550B1; DE69933796D1; EP1508616B1; JP4382986B2; EP1136550A4; ATE343631T1; DE69933485D1; EP1136550A1; EP1508616A1; ATE284956T1; DE69922696D1; ATE341618T1; JP2009232868A; EP1508617B1; JP4383522B2; WO1999055850A1; DE69933796T2; EP1508617A1; DE69922696T2

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Stabilisieren eines Enzyms, das in einem Medium enthalten ist, und eine Enzymzusammensetzung im Hinblick auf eine Kontrollsubstanz. Die Kontrollsubstanz wird verwendet, um die folgenden Funktionen zu erfüllen, d.h. als Kontrollsubstanz werden solche verwendet, die eine bestimmte Menge an Enzym als Komponente enthalten und in einem Test zur Messung der Menge des Enzyms, das im menschlichen Blut enthalten ist, einem Analysator zugeführt werden, wobei der Analysator untersucht, ob ein genauer Wert des Enzyms bestimmt werden kann oder nicht. Alternativ wird vorzugsweise vorher der numerische Meßwert der Kontrollsubstanz erhalten, wodurch die genaue Menge des Enzyms aus dem Meßwert, der in einer Probe enthalten ist, durch Proportionieren erhalten wird.
Stand der Technik
Alanin-Aminotransferase EC 2.6.1.2 (nachstehend mit ALT abgekürzt) ist ein Enzym, das in der Lage ist, Glutaminsäure und Brenztraubensäure aus Alanin und α-Ketoglutarsäure zu bilden, und ist hauptsächlich in der Leber, den Nieren und dem Herzen vorhanden, und ist ein nützlicher Indikator für klinische Diagnosen ähnlich wie AST.
In einem üblichen Test, der durchgeführt wird, um die Menge an ALT im Blut zu messen, wird die Kontrollsubstanz häufig verwendet.
Demgemäß ist die Handhabung der Kontrollsubstanz wichtig, um die Stabilität und Zuverlässigkeit eines Testwerts in einem üblichen Test zu gewährleisten, und einen klinischen Versuch durchzuführen, bei dem eine genaue Technik auf hohem Niveau erforderlich ist. Wenn beispielsweise der Meßwert von ALT, das im menschlichen Blut enthalten ist, bestimmt wird, wird eine ALT-haltige Kontrollsubstanz verwendet. Es ist jedoch erforderlich, die Enzymaktivität von ALT als ein instabiles Enzym, das in der Kontrollsubstanz enthalten ist, ausreichend zu stabilisieren, um die oben beschriebenen Funktionen der Kontrollsubstanz ausreichend zu erfüllen.
Unter diesem Gesichtspunkt wird der Stand der Technik mit dem Gegenstand der Stabilisierung des Enzyms, das in der Kontrollsubstanz enthalten ist, in der ungeprüften Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. Sho 55-141194, in der ungeprüften Patentanmeldung (Kokai) Nr. Sho 56-148291 und der ungeprüften Patentanmeldung (Kokai) Nr. Sho 57-45453 beschrieben. In diesem Stand der Technik werden Ethylenglykol, Saccharose oder Glycerin als Stabilisatoren verwendet.
Die Stabilisierung des Enzyms unter Verwendung einer Aminosäure wurde bisher von Harold L. Segal et al. (Biochemical and Biophysical Research Communications, Bd. 30 (1), Seiten 63–68, 1968) untersucht.
Obgleich auch über die Verwendung einer Aminosäure berichtet wurde, um die Trübung der Kontrollsubstanzen zu verringern, wird erwähnt, daß die Aminosäure die Denaturierung des Proteins in jedem Fall verhindern kann.
Ein herkömmlicher Stabilisator, wie beispielsweise Ethylenglykol, Saccharose oder Glycerin, muß in hoher Konzentration verwendet werden, damit der Stabilisator seine Wirkung zeigt. D.h., die Konzentration von Ethylenglykol und Glycerin muß erhöht werden, beispielsweise auf 5 mol/l und 3,3 mol/l, während Saccharose in einem Anteil im Bereich von 1 bis 10% zugegeben werden muß. Dadurch hat die Kontrollsubstanz selbst eine hohe spezifische Dichte und/oder hohe Viskosität, was zu dem Problem führt, daß die Kontrollsubstanz, die als Parameter dient, physikalische Eigenschaften aufweist, die sich von denen des menschlichen Serums unterscheiden. Ein solches Problem führt zu einem Zustand, wo ein der Kontrollsubstanz selbst innewohnender Zweck nicht erreicht werden kann, und beispielsweise ein Faktor erzeugt wird, der Unterschiede in den Meßwerten zwischen verschiedenen Arten der neuesten automatischen Analysatoren und Ausstattungen hervorruft, wenn die Kontrollsubstanz in den Analysator gegeben wird, da sich die Genauigkeit der Probennahme von der des normalen menschlichen Serums unterscheidet (Japan Clinical Chemistry Society, Scientific Liaison Committee, Clinical Chemistry, Bd. 25 (2), Seiten 135–148, 1996).
Beschreibung der Erfindung
Um die oben genannten Probleme zu lösen, haben die Erfinder im Hinblick auf Faktoren, die beispielsweise die Rolle der Aminosäure hinsichtlich der Trübung der Kontrollsubstanzen und der Denaturierung des Proteins erfüllen müssen, intensive Untersuchungen durchgeführt. Im Ergebnis haben sie festgestellt, daß Valin insbesondere das Enzym ALT stabilisiert, das in der Kontrollsubstanz enthalten ist, wodurch das Verfahren zum Stabilisieren eines Enzyms und einer Enzymzusammensetzung der vorliegenden Erfindung vervollständigt wurde.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Stabilisieren von Alanin-Aminotransferase in mindestens einem Medium, das aus der Gruppe bestehend aus Serum und Puffer ausgewählt wird, und das die Zugabe von Valin zum Medium umfaßt, bereit.
Die Valinkonzentration liegt vorzugsweise im Bereich von 0,5 bis 100 mmol/l.
Das Serum oder der Puffer ist vorzugsweise ein Puffer, der ein lösliches Protein enthält.
Das lösliche Protein ist vorzugsweise mindestens ein lösliches Protein, das aus der Gruppe bestehend aus Albumin und Gelatine ausgewählt wird.
Vorzugsweise ist das lösliche Protein Albumin in einer Konzentration im Bereich von 0,5 bis 15 Gew.-%/Vol.-% oder Gelatine in einer Konzentration im Bereich von 0,5 bis 15 Gew.-%/Vol.-% vorhanden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Enzymzusammensetzung bereit, die mindestens ein Medium umfaßt, das aus der Gruppe bestehend aus Serum und Puffer, Alanin-Aminotransferase und Valin ausgewählt wird.
In der obigen Beschreibung bedeutet das Medium eine Mutterlauge, wie beispielsweise ein Lösungsmittel oder ein Dispersionsmedium, im dem das Enzym und der Stabilisator gelöst oder dispergiert sind, und die, die durch Auflösen oder Dispergieren des Enzyms und des Stabilisators im Medium hergestellt werden, können als Kontrollsubstanz verwendet werden. In dem Fall, in dem der Gegenstand, der getestet werden soll, im humane Serum enthalten ist, wird vorzugsweise humanes Serum oder Vergleichbares, das durch das Behandeln des humanen Serums hergestellt wurde, vorzugsweise als Medium für die Kontrollsubstanz verwendet. D.h., es ist bevorzugt, als Medium diejenigen auszuwählen, die Eigenschaften aufweisen, die denen des Gegenstands, der untersucht werden soll, gleichen.
Als Medium kann beispielsweise Serum und Puffer verwendet werden. Das Serum bedeutet humanes Serum, ein Serum anderer Tiere oder behandelte Seren im weitesten Sinne. Das Serum und der Puffer können ein Puffer sein, der eine lösliche Proteinlösung enthält. Nachstehend wird Aspartat-Aminotransferase als AST abgekürzt, während Alanin-Aminotransferase als ALT abgekürzt wird.
Valin als Stabilisator zum Stabilisieren von ALT wird allein verwendet.
Bei den oben beschriebenen Merkmalen, können diejenigen, die ALT als Enzym im Medium enthalten, als Kontrollsubstanz verwendet werden, normalerweise dann, wenn die Menge als ALT, die im menschlichen Blut enthalten ist, gemessen wird.
Die Herkunft von ALT, das in die Kontrollsubstanz eingebracht werden soll, schließt eine biologische Substanz ein, ist aber auf diese nicht spezifisch eingeschränkt, wie beispielsweise Rinderherz, Schweineherz, menschliches Herz, Serum, rote Blutzellen und Urin, diejenigen, die durch Kultivieren humaner Zellen hergestellt werden, oder diejenigen, die durch Kultivieren einer Onkogenzelle, in die ein vom Menschen abstammendes Gen, eingebaut ist, hergestellt werden. In diesem Fall wird der Gehalt von ALT in einem Bereich von 5 bis 1000 U/l und vorzugsweise 30 bis 500 U/l eingestellt.
Wenn bei den oben beschriebenen Merkmalen das Medium ein Puffer ist, kann beispielsweise ein durch Auflösen von Rinderserumalbumin hergestellter BES-Puffer verwendet werden. Es können jedoch die verwendet werden, die durch Auflösen von verschiedenen Substanzen in Puffern hergestellt werden, um chemisch oder physikalisch vergleichbare Eigenschaften aufzuweisen, die in Art und Beschaffenheit dem zu untersuchenden Gegenstand entsprechen (genauer gesagt ein Medium des Gegenstands, der untersucht werden soll), der mit einem Untersuchungsgerät tatsächlich untersucht wird. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch einen solchen Fall.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Puffer umfaßt beispielsweise Amine und Good's-Puffer, deren pH-Wert entsprechend innerhalb eines Bereichs von 6,0 bis 8,5 eingestellt werden kann; und biochemische Puffer, wie beispielsweise Zitronensäure-Natriumdiphosphat-Puffer, Salzsäure-Natriumveronal-Natriumacetat- Puffer, Kaliummonophosphat-Natriumdiphosphat-Puffer, Kaliummonphosphat-Borat-Puffer, Kaliummonophosphat-Natriumhydroxid-Puffer, Salzsäure-Collidin-Puffer, Salzsäure-Natriumveronal-Puffer, Salzsäure-Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Puffer, Salzsäure-Borat-Puffer, Borsäure-Natriumcarbonat-Puffer, Borsäure-Borat-Puffer, Salzsäure-Amino-methylpropandiol-Puffer, Ammoniumchlorid-Ammoniak-Puffer, Glycin-Natriumhydroxid-Puffer, Borsäure-Natriumhydroxid-Puffer, Salzsäure-Natriumdimethylglycin-Puffer, Borat-Natriumhydroxid-Puffer, Borat-Natriumcarbonat-Puffer, Sörensen-Puffer, Glycin-Natriumchlorid-Salzsäure-Puffer, Natriumdicitrat-Salzsäure-Puffer, Natriumdiacetat-Natriu-hydroxid-Puffer, Borat-Natriumhydrochlorid-Puffer, Michaerlis-Puffer, Natriumveronal-Natriumactet-Salzsäure-Puffer, Clark-Lub's-Puffer, Borsäure-Kalium-hydrochlorid-Natriumhydroxid-Puffer, Atkins-Pantin-Puffer, Palitzsch-Puffer, Kolthoff-Puffer, Mcllvaine-Puffer, Hasting-Sendroy-Puffer, Britton-Robinsosn-Puffer, Maleat-Puffer, Tris-Maleat-Puffer, Veronal-Puffer und Veronal-Acetat-Puffer. Puffer, die sich von diesen Puffern unterscheiden, können auch verwendet werden, solange sie eine Pufferkapazität bei einem pH-Wert haben, der innerhalb eines Bereichs von 6,0 bis 8,5 liegt.
Der organische Aminpuffer umfaßt beispielsweise Diethanolaminpuffer, 2-Ethylamino-ethanolpuffer, 2-Amino-2-methyl-1-propanol und N-Methyl-D-glucamin.
Der Good's-Puffer umfaßt beispielsweise MES (2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure)-Puffer, Bis-Tris (Bis(2-hydroxyethyl)imino-tris(hydroxymethyl)methan)-Puffer, ADA (N-(2-Acetamido)iminodiessigsäure)-Puffer PIPES (Piperazin-N-N'-bis(2-ethansulfonsäure)-Puffer, ACES (N-(2-Acetamido)-2-aminosulfonsäure)-Puffer, MOPSO (3-(N-Morpholino)-2-hydroxypropansulfonsäure)-Puffer, BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure)-Puffer, MOPS (3-(N-Morpholino)propansulfonsäure)-Puffer, TES (N-Tris(hydroxymethyl)-methyl-2-aminoethansulfonsäure)-Puffer, HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure)-Puffer, DIPSO (3-[N,N-Bis(2-hydroxyethyl)amino]-2-hydroxypropansulfonsäure)-Puffer, TAPSO (N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-hydroxy-3-aminopropansulfonsäure)-Puffer, POPSO (Piperazin-N.N'-bis(2-hydroxypropansulfonsäure)-Puffer, HEPPSO (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2-hydroxypropan-3-sulfonsäure)-Puffer, EPPS (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-3-propansulfonsäure, anderen Name: HEPPS)-Puffer, Tricin (Tris(hydroxymethyl)methylglycin)-Puffer, Bicin (N,N-Bis(2-hydroxyethylgylcin)-Puffer, TAPS (N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropansulfonsäure)-Puffer, CHES (2-(Cyclohexylamino)ethansulfonsäure)-Puffer, CAPSO (3-N-Cyclohexylamino-2-hydroxypropansulfonsäure)-Puffer und CAPS (3-Cyclohexylaminopropansulfonsäure)-Puffer.
Bei Verwendung des organischen Aminpuffers kann dieser als wässeriges Medium verwendet werden, dessen Konzentration auf einen Bereich von 20 mM bis 2 M, vorzugsweise 20 mM bis 1 M, und noch bevorzugter 20 mM bis 500 mM eingestellt wird. Das bevorzugte wässerige Medium ist speziell gereinigtes Wasser, und Coenzyme, lösliche Salze, Tenside, Stabilisatoren und antiseptische Mittel können auch entsprechend enthalten sein.
Bei Verwendung des Good's-Puffers oder biochemischen Puffers kann dieser nach Einstellen der Konzentration innerhalb eines Bereichs von 20 mM bis 1 M, vorzugsweise 20 mM bis 500 mM, und noch bevorzugter 20 mM bis 300 mM verwendet werden.
Wenn bei den oben beschriebenen Merkmalen das Medium eine lösliche Proteinlösung ist, umfaßt die lösliche Proteinlösung wässerige Lösungen aus BSA, humanem Serumalbumin (HSA) und Gelatine, und diese wässerigen Lösungen können allein oder in Kombination verwendet werden. In diesem Fall liegt die Konzentration von Albumin und Gelatine jeweils im Bereich von 0,5 bis 15 Gew.-%/Vol.-%. Wenn das Medium Serum ist, können die Puffer, die oben beschrieben wurden, auch entsprechend verwendet werden.
Valin wird nicht in einer großen Menge zugegeben, so daß die erhaltenen Kontrollsubstanzen weder eine hohe spezifische Dichte, noch eine hohe Viskosität aufweisen.
Der Gehalt an Valin wird vorzugsweise innerhalb eines Bereichs von 0,5 bis 100 mmol/l eingestellt. Noch bevorzugter wird der Gehalt an Valin innerhalb eines Bereichs von 10 bis 20 mmol/l eingestellt. Es wird ermöglicht, einen guten Stabilisationseffekt auszuüben und physikalische und chemische Eigenschaften zu erhalten, die ähnlich den Eigenschaften des Serums sind, das als Gegenstand untersucht werden soll, sofern der Gehalt innerhalb des obigen Bereichs eingestellt wird.
Es wird ermöglicht, einen guten Stabilisationseffekt auszuüben, und physikalische und chemische Eigenschaften zu erhalten, die eine Ähnlichkeit mit denen des Serums als zu untersuchendem Gegenstand aufweisen, indem jeder Gehalt innerhalb des genannten Bereichs eingestellt wird. Somit wird es möglich, die physikalischen und chemischen Eigenschaften der Kontrollsubstanz kontinuierlich denen des Serums als Gegenstand, der untersucht werden soll, anzupassen, die Stabilität zu gewährleisten, die Zuverlässigkeit der erhaltenen Daten zu erhalten und einen Unterschied zwischen den Apparaturen, mit denen die Untersuchung durchgeführt wird, aufzuheben.
Nach dem ALT-Stabilisierungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird es möglich, die Denaturierung zu inhibieren und dabei ALT in einem Medium durch Zugabe von Valin zu stabilisieren.
Es wird auch möglich, ALT mit Hilfe des Stabilisators zu stabilisieren, und stabile und genau aufgezeichnete Daten bei der Untersuchung, deren Gegenstand, der untersucht werden soll, ALT ist, zu erhalten. Bei Verwendung von Valin als Stabilisator von ALT kann insbesondere dieses Enzym durch einen kleinen Gehalt an Valin ausreichend stabilisiert werden.
Nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Stabilisieren von ALT wird es möglich, die Kontrollsubstanz zu verwenden, wobei ALT sowie Valin als dessen Stabilisator in das Serum als Medium zugegeben wurden, und es unter einer guten Umgebung nachzuweisen, die physikalisch und chemisch ähnlich ist, wenn ALT im Serum enthalten ist, unter Verwendung des Mediums als Serum nachgewiesen wird.
In gleicher Weise kann ALT mit Valin als Stabilisator in einem stabilen Medium, wie beispielsweise Puffer, unter Verwendung des Mediums als Puffer stabilisiert werden. Selbstverständlich wird eine Kontrollsubstanz mit physikalischen und chemischen Eigenschaften, die denen des Gegenstands, der untersucht werden soll (Lösungsmittel), vergleichbar sein, durch optionales Auflösen verschiedener Komponenten im Puffer erhalten.
Im Verfahren zum Stabilisieren von ALT gemäß der vorliegenden Erfindung kann ALT unter Verwendung von Valin zufriedenstellend stabilisiert werden, indem der Valingehalt im Bereich von 0,5 bis 100 mmol/l eingestellt wird.
Bei dem Verfahren zum Stabilisieren von ALT nach der vorliegenden Erfindung kann in dem Fall, in dem das Serum oder der Puffer ein Puffer mit einem löslichen Protein ist, ALT durch Valin als Stabilisator zufriedenstellend stabilisiert werden.
In dem Fall, in dem das lösliche Protein mindestens ein lösliches Protein ist, das aus der Gruppe bestehend aus Albumin und Gelatine ausgewählt wird, kann ALT durch Valin als Stabilisator in einem Puffer mit Albumin oder Gelatine stabilisiert werden. In diesem Fall kann ALT vorzugsweise stabilisiert werden, wenn die Konzentration an Albumin bzw. Gelatine innerhalb eines Bereichs von 0,5 bis 15 Gew.-%/Vol.-% liegt.
Gemäß der Enzymzusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann eine Enzymzusammensetzung zur Verfügung gestellt werden, die nicht leicht das Denaturieren von ALT hervorruft und in einem stabilen Zustand vorliegt, indem ALT und Valin in mindestens einem Medium, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Serum und Puffer, enthalten sind. Somit ist es möglich, stabile und genau aufgezeichnete Daten zu erhalten, indem eine solche Enzymzusammensetzung als Kontrollsubstanz in der Untersuchung verwendet wird, in der das untersuchende Objekt ALT ist.
Beste Ausführungsform zur Durchführung der Erfindung
Beispiele für die Herstellung einer Kontrollsubstanz, die Valin als Stabilisator und ALT als Enzymkomponente gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen, werden nun beschrieben.
Unter Verwendung von humanem Serum (hergestellt von TORINA CO. (Schweiz)) wird ein endogenes Enzym devitalisiert, indem vorher eine Wärmebehandlung bei 56°C über 4 Stunden, und dann durch Filtration unter Verwendung eine Membranfilters von 0,2 μm Porengröße (die so erhaltene Lösung wird als humanes Basisserum bezeichnet) sterilisiert. Beispielsweise werden 10 mmol/l Valin in diesem humanen Basisserum (Medium) gelöst und eine bestimmte Menge ALT wird auch darin gelöst, wodurch es möglich wird, eine Kontrollsubstanz mit Valin als Stabilisator und ALT zu erhalten.
In gleicher Weise werden Beispiele zur Herstellung einer Kontrollsubstanz, die Valin als Stabilisator, ALT als Enzymkomponente und eine Puffer als Medium gemäß der vorliegenden Erfindung enthält, nun beschrieben.
Rinderserumalbumin mit 3 Gew.-%/Vol.-% (hergestellt von INTERGEN CO. (USA)) wird in einem BES-Puffer (20 mmol/l) gegeben und dann durch Filtration (pH 7,4, die so erhaltene Lösung wird als BSA-Basis bezeichnet) sterilisiert. Beispielsweise werden 10 mmol/l Valin in dieser BSA-Basis aufgelöst, und eine bestimmte Menge ALT wird auch darin gelöst, wodurch es möglich wird, eine Kontrollsubstanz mit Valin als Stabilisator und ALT im Puffermedium zu erhalten.
Weiterhin liegt die Kontrollsubstanz, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wird, zur herkömmlichen Verwendung im flüssigen Zustand vor, kann aber auch in einem anderen Zustand als dem flüssigen Zustand vorliegen, wie beispielsweise als gefriergetrocknetes Produkt, kalt gelagertes Produkt und gefrorenes flüssiges Produkt.
Beispiele
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung weiter, aber die vorliegende Erfindung wird durch die Beispiele nicht eingeschränkt.
Beispiel 1
Bestimmung des Stabilisierungseffektes verschiedener Aminosäuren auf ALT in der Kontrollsubstanz
Unter Verwendung des humanen Basisserums und einer BSA-Basis als Medium wurden Kontrollsubstanzen hergestellt, indem jeweils als Stabilisator keine Aminosäure, Valin (10 mmol/l) als Aminosäure, Prolin (10 mmol/l) oder eine andere Aminosäure (10 mmol/l, im Falle des Tyrosins 1 mmol/l) zu den jeweiligen Medien gegeben wurde, und dann als Enzym ALT (etwa 100 U/l) gegeben wurde.
Die so erhaltenen, jeweiligen Kontrollsubstanzen wurden bei 45°C 4 Tage gelagert und die Restaktivität von ALT, das in den jeweiligen Kontrollsubstanzen enthalten war, wurde gemessen.
Das hier verwendete ALT ist ALT, das von einer humanen Rekombinante eines Lebergens (nachfolgend als r-ALT bezeichnet) abstammt, und von ASAHI CHEMICALS INDUSTRIES CO., LTD (Herstellungsnummer T-71) hergestellt wird. Weiterhin wurde das hier verwendete humane Basisserum, das hergestellt wurde, indem das humane Serum bei 56°C 4 Stunden einer Wärmebehandlung unterworfen wurde, wodurch ein endogenes Enzym devitalisiert wurde, und anschließend durch Filtration und unter Verwendung eines Membranfilters von 0,2 μm Porendurchmesser sterilisiert wird. Das hier verwendete BSA-Basis ist BES-Puffer (20 mmol/l) mit 3 Gew.-%/Vol.-% BSA.
Im Hinblick auf die Restaktivität von ALT wurde diese unter Verwendung des ALT-Reagens L "KOKUSAI", hergestellt von INTERNATIONAL REAGENTS CORPORATION gemessen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist, zeigte Valin eine bevorzugten Stabilitätseffekt gegenüber ALT.
Beispiel 2
Feststellung des Stabilisierungseffekts von Valin auf ALT in der Kontrollsubstanz Valin und r-ALT wurden zu einem humanen Basisserum und einer BSA-Basis in der Konzentration von etwa 100 U/l gegeben, und nach Lagerung bei 45°C über 4 Tage wurde die Restaktivität gemessen. Die Messung der Aktivität von ALT wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
Aus Tabelle 2 ist ersichtlich, daß die Restaktivität von ALT 32% in dem Fall betrug, wenn kein Valin zur BSA-Basis gegeben wurde, während die Restaktivität von ALT 38% betrug, wenn 0,5 mmol/l Valin zugegeben wurden, was somit die Stabilität verbessert. Die Restaktivität von ALT betrug 62%, wenn die Konzentration an Valin 10 mmol/l betrug, während die Restaktivität von ALT 65% betrug, wenn die Konzentration an Valin 20 mmol/l betrug. Weiterhin betrug die Restaktivität von ALT 65%, wenn die Konzentration von Valin 100 mmol/l betrug.
In gleicher Weise betrug die Restaktivität von ALT 20% in dem Fall, in dem kein Valin zu dem humanen Basisserum gegeben wurde, während die Restaktivität von ALT 28% betrug, wenn 0,5 mmol/l Valin zugegeben wurde, was somit die Stabilität verbesserte. Die Restaktivität von ALT betrug 55%, wenn die Konzentration von Valin 10 mmol/l betrug, während die Restaktivität von ALT 56%, wenn die Konzentration von Valin 20 mmol/l betrug. Weiterhin betrug die Restaktivität von ALT 55%, wenn die Konzentration an Valin 100 mmol/l betrug.
Aus der obigen Beschreibung ist ersichtlich, daß die Konzentration von Valin vorzugsweise im Bereich von 0,5 bis 100 mmol/l, und noch bevorzugter 10 bis 20 mmol/l eingestellt wird.
Industrielle Anwendbarkeit
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Stabilisieren eines Enzyms und einer Enzymzusammensetzung betreffen eine Kontrollsubstanz, die in medizinischen Untersuchungen verwendet wird, und sind in der Lage, ALT, das im Serum, in einem Puffer oder in einem Medium, wie beispielsweise einer löslichen Proteinlösung enthalten ist, ausreichend zu stabilisieren. Somit ist die vorliegende Erfindung industriell anwendbar, indem ein Verfahren und ein Material zu Erhalten von genauen und beständigen Untersuchungsdaten auf dem Gebiet der medizinischen klinischen Untersuchung zur Verfügung gestellt wird.

Claims

Verfahren zur Stabilisierung einer Alanin-Aaminotransferase in wenigstens einem Medium ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Serum und Puffer, das Verfahren umfaßt die Zugabe von Valin zu dem Medium.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Konzentration des Valins innerhalb eines Bereichs von 0,5 bis 100 mmol/l liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Puffer ein Puffer ist, der ein lösliches Protein enthält.
Verfahren nach Anspruch 3, bei dem das lösliche Protein wenigstens ein lösliches Protein ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Albumin und Gelatine.
Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die Konzentration des Albumins innerhalb eines Bereichs von 0,5 bis 15 Gewicht-/Volumen-% liegt.
Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die Konzentration der Gelatine innerhalb eines Bereichs von 0,5 bis 15 Gewicht-/Volumen-% liegt.
Enzymzusammensetzung umfassend wenigstens ein Medium ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Serum und Puffer, einer Alanin-Aminotransferase und Valin.
Enzymzusammensetzung nach Anspruch 7, bei der die Konzentration des Valins innerhalb eines Bereichs von 0,5 bis 100 mmol/l liegt.
Enzymzusammensetzung nach Anspruch 7, bei der der Puffer eine Puffer ist, der lösliches Protein enthält.
Enzymzusammensetzung nach Anspruch 9, bei der das lösliche Protein wenigstens ein lösliches Protein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Albumin und Gelatine ist.
Enzymzusammensetzung nach Anspruch 10, bei der die Konzentration des Albumins innerhalb eines Bereichs von 0,5 bis 15 Gewicht-/Volumen-% liegt.
Enzymzusammensetzung nach Anspruch 10, bei der die Konzentration der Gelatine innerhalb eines Bereichs von 0,5 bis 15 Gewicht-/Volumen-% liegt.