JP4383522B2 - アラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法及び酵素組成物 - Google Patents

Description

本発明は、コントロール物質等において、媒体中に含まれる酵素を安定化する方法及び酵素組成物に関する。前記コントロール物質は、例えば人の血液中に含まれる酵素の量を検出する検査等において、一定量の酵素を成分として含有させたものをコントロール物質として用い、このコントロール物質を検出装置にかけることで、その検出装置が酵素等の正しい値を検出できる状態にあるか否かを検証し、或いはコントロール物質の検出数値を予め得ておくことで、実際の被検査体において得られた検出数値から正確な酵素の量を比例配分等によって得るのに用いられている。

アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（Ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｏｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ＥＣ ２．６．１．１、以下ＡＳＴと略す）は、アスパラギン酸及びα−ケトグルタル酸からグルタミン酸及びオキザロ酢酸を生成する酵素で、心臓、肝臓、骨格筋に多く存在し、急性肝炎、慢性肝炎、心筋梗塞などの診断に有用な指標になる。
また、アラニンアミノトランスフェラーゼ（Ａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ＥＣ ２．６．１．２、以下ＡＬＴと略す）はアラニン及びα−ケトグルタル酸からグルタミン酸及びピルビン酸を生成する酵素で、肝臓、腎臓、心臓に多く存在し、ＡＳＴと同様に臨床診断に有用な指標である。
これらＡＳＴ及びＡＬＴの血液中に含まれる量を検出するために行われる日常検査等においては、コントロール物質を用いて行う場合が多い。
従ってコントロール物質は、日常的な検査における検査値の安定性や信頼性を保証する上で、また精密且つ高度な技術が要求される臨床試験を行う上で、その取り扱いが重要となってきている。例えば、人の血液中に含まれるＡＳＴやＡＬＴの数値を検出する場合には、ＡＳＴやＡＬＴを含有させたコントロール物質を用いることになるが、上記したコントロール物質の役割を十分に果たすためには、コントロール物質に含有させた不安定な酵素であるＡＳＴやＡＬＴの酵素活性を十分に安定化させる必要がある。

このような観点から、コントロール物質中に含有せられた酵素の安定化を図る従来技術が、特開昭５５−１４１１９４号公報、特開昭５６−１４８２９１号公報、特開昭５７−４５４５３号公報等に開示されている。これらの従来技術においては、安定化成分として、エチレングリコール、ショ糖或いはグリセリンなどが用いられている。
また、アミノ酸を用いた酵素の安定化については、ハロルド等（Ｈａｒｏｌｄ Ｌ．Ｓｅｇａｌ ｅｔ．ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｖｏｌ．３０（１）， Ｐ．６３〜６８， １９６８）に代表されるように、過去から研究されてきた。
更に、コントロール物質の濁度を減少させるためにアミノ酸を用いた報告もあるが、何れにせよアミノ酸は蛋白質の変性を防ぐことができると考えられている。

特開昭５５−１４１１９４号公報 特開昭５６−１４８２９１号公報 特開昭５７−４５４５３号公報

Ｈａｒｏｌｄ Ｌ．Ｓｅｇａｌ ｅｔ．ａｌ．「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．１）」Ｐ．６３〜６８ １９６８年

しかしながら、上記エチレングリコール、ショ糖或いはグリセリン等の従来の安定化剤においては、その効果を発揮させるためには高濃度にする必要があった。即ち、エチレングリコールでは５ｍｏｌ／Ｌ程度、グリセリンでは３．３ｍｏｌ／Ｌ程度と添加濃度が高くなり、またショ糖では１〜１０％添加する必要が生じるため、コントロール物質そのものが高比重且つ／または高粘性となり、パラメータとなるべきコントロール物質がヒト血清とは異なる物理的性質を持つといった問題が生じたのである。そしてこのような問題は、コントロール物質を近年の自動分析機に適用した場合に、サンプリングの精度が通常のヒト血清と異なることから機種間或いは施設間で測定値に差異が生じるという要因となって現れる等、コントロール物質本来の目的を達成できない状況を生じせしめている（日本臨床化学会、学術連絡委員会、臨床化学Ｖｏｌ．２５（２）， Ｐ．１３５〜１４８， １９９６）。

発明の開示
そこで本発明者らは、このような問題を解決すべく、コントロール物質の濁度や蛋白質の変性に対して果たすアミノ酸の役割等の事実を出発点として、鋭意研究を重ねた結果、コントロール物質等に含まれる、特にＡＳＴ、ＡＬＴの酵素を安定化させるものとして、特にバリン、プロリンが当該酵素を安定化させることを見出し、本発明のアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法及び酵素組成物を完成するに至った。

即ち本発明のアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法の第１の特徴は、血清及び緩衝液からなる群より選ばれる少なくとも１種の媒体中に、アラニンアミノトランスフェラーゼを安定化する安定化成分として、バリンを含有させることである。
また本発明のアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法の第２の特徴は、上記第１の特徴に加えて、バリンの含有量を０．５〜１００ｍｍｏｌ／Ｌとすることである。
また本発明のアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法の第３の特徴は、上記第１の特徴に加えて、安定化成分としてプロリンをさらに含有させることである。
また本発明のアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法の第４の特徴は、上記第３の特徴に加えて、バリンの含有量が５〜２０ｍｍｏｌ／Ｌであり、プロリンの含有量が１０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであることである。
また本発明のアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法の第５の特徴は、上記第１〜第４の何れかの特徴に加えて、血清または緩衝液が、可溶性蛋白質を含む緩衝液であることである。
また本発明のアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法の第６の特徴は、上記第５の特徴に加えて、可溶性蛋白質がアルブミン及びゼラチンからなる群より選ばれる少なくとも１種の可溶性蛋白質であることである。
また本発明のアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法の第７の特徴は、上記第６の特徴に加えて、アルブミンの濃度は０．５〜１５重量％であることである。
また本発明のアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法の第８の特徴は、上記第６の特徴に加えて、ゼラチンの濃度は０．５〜１５重量％であることである。
また本発明の酵素組成物は、血清及び緩衝液からなる群より選ばれる少なくとも１種の媒体に対して、アラニンアミノトランスフェラーゼと、バリンとが含有せられていることを第９の特徴としている。
また本発明の酵素組成物の特徴は、上記第９の特徴に加えて、プロリンをさらに含有させることである。

上記において、媒体は、酵素や安定化成分を溶かし或いは分散させる溶媒や分散媒等の母相或いは母材をいい、媒体に酵素と安定化成分を溶かし或いは分散させたものをコントロール物質として用いることができる。コントロール物質の媒体としては、例えば検出対象がヒト血清中に含まれるものである場合には、コントロール物質の媒体もヒト血清、或いはそれに処理を加えた類似のものを用いるのが好ましい。即ち、検査対象物に近い性質のものをコントロール物質の媒体として選ぶのが好ましい。
前記媒体としては、血清や緩衝液を用いることができる。血清とは、広い意味において、ヒト血清やその他の動物の血清、或いはそれらに処理を加えたものとする。前記血清や緩衝液は、可溶性蛋白質溶液を含む緩衝液とすることができる。以下、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをＡＳＴ、アラニンアミノトランスフェラーゼをＡＬＴと略す。
上記ＡＳＴやＡＬＴを安定化する安定化成分としてのバリン、プロリンは、バリン単独で用いる場合、プロリン単独で用いる場合及びバリンとプロリンの両方を組み合わせて用いる場合の３つの場合がある。ただし、これらの安定化成分は、ＡＳＴ、ＡＬＴの各単独或いは両組み合わせを安定化するのに用いられて、良好な効果を発揮するのは勿論である。が、他の酵素に対する安定化成分として用いる場合も本発明の範囲内である。またプロリンをＡＬＴ安定化に単独で用いる場合は、１００ｍｍｏｌ／Ｌを超える量でプロリンの量を用いるのが好ましい。
また上記の特徴において、媒体中に酵素としてＡＳＴを含ませたものは、コントロール物質として、典型的には、人の血液中に含まれるＡＳＴ量を検出する場合に用いることができる。また媒体に酵素としてＡＬＴを含ませたものは、コントロール物質として、典型的には、人の血液中に含まれるＡＬＴの量を検出する場合に用いられる。
コントロール物質に含ませるＡＳＴ、ＡＬＴの起源は特に限定しないが、例えばウシ心臓、ブタ心臓、ヒト心臓、血清、赤血球、尿等の生体材料、さらにヒト細胞を培養したもの、或いはヒト由来遺伝子を組み込んだ形質転換体を培養することにより得ることができる。この場合ＡＳＴ、ＡＬＴの含有量は、それぞれ５〜１０００Ｕ／Ｌとする。が、好ましくは３０〜５００Ｕ／Ｌとする。
上記特徴において、媒体が血清である場合には、コントロール物質は、その血清に酵素と安定化成分としてのアミノ酸を含有している。
また上記特徴において、媒体が緩衝液である場合としては、例えばウシ血清アルブミンを溶かしたＢＥＳ緩衝液を用いることができる。が、実際に検査装置にかけられる検査対象物（厳密には検査対象物の媒体）の種類や状態に対応して、物理的に或いは化学的に似た性質を持つようにするため、種々の物質を緩衝液に溶解したものを用いることができる。本発明はこの様な場合も含むものとする。

前記本発明で用いられる緩衝液としては、例えば、ｐＨ６〜ｐＨ８．５の間に適宜に調整できる有機アミン系緩衝液、グッド緩衝液やその他に、クエン酸−第２リン酸ナトリウム系、塩酸−ベロナールナトリウム−酢酸ナトリウム系、第１リン酸カリウム−第２リン酸ナトリウム系、第１リン酸カリウム−ホウ砂系、第１リン酸カリウム−水酸化ナトリウム系、塩酸−コリジン系、塩酸−ベロナールナトリウム系、塩酸−トリスアミノメタン系、塩酸−ホウ砂系、ホウ酸−炭酸ナトリウム系、ホウ酸−ホウ砂系、塩酸−アミノメチルプロパンジオール系、塩化アンモニウム−アンモニア系、グリシン−水酸化ナトリウム系、ホウ酸−水酸化ナトリウム系、塩酸−ジメチルグリシンナトリウム系、ホウ砂−水酸化ナトリウム系、ホウ砂−炭酸ナトリウム系、セーレンセン緩衝液、グリシン−塩化ナトリウム−塩酸系、第２クエン酸ナトリウム−塩酸系、第２クエン酸ナトリウム−水酸化ナトリウム系、ホウ砂−塩酸ナトリウム系、ミカエリス緩衝液、ベロナールナトリウム−酢酸ナトリウム−塩酸系、クラーク−ルブス緩衝液、ホウ酸−塩酸カリウム−水酸化ナトリウム系、アトキンス−パルチン緩衝液、パリティッシュ緩衝液、コルトホフ緩衝液、マックイルべイン緩衝液、ハスチング−センドロイ緩衝液、プリトン−ロビンソン緩衝液、マイレン酸塩緩衝液、トリス−マイレン酸塩緩衝液、ベロナール緩衝液、ベロナール−酢酸塩緩衝液等の生化学用緩衝液がある。これらの緩衝液以外であっても、ｐＨ６〜８．５で緩衝能を有するものであれば何ら限定されない。

また前記有機アミン系緩衝液としては、例えば、ジエタノールアミン緩衝液、２−エチルアミノエタノール緩衝液、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン等が挙げられる。

更に前記グッド緩衝液としては、例えば、ＭＥＳ（２−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｉｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｉｍｉｎｏｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈａｎｅ）緩衝液、ＡＤＡ（Ｎ−（２−Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＰＩＰＥＳ（Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ，Ｎ’−ｂｉｓ（２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＡＣＥＳ（Ｎ−（２−Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＭＯＰＳＯ（３−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＴＥＳ（Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’−２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＤＩＰＳＯ（３−［Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ］−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＴＡＰＳＯ（Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＰＯＰＳＯ（Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ，Ｎ’−ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ−２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅ−３−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＥＰＰＳ（Ｎ−２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’−３−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ、別名ＨＥＰＰＳ）緩衝液、Ｔｒｉｃｉｎｅ（Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）緩衝液、Ｂｉｃｉｎｅ（Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｇｌｙｃｉｎｅ）緩衝液、ＴＡＰＳ（Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＣＨＥＳ（２−（Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＣＡＰＳＯ（３−Ｎ−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＣＡＰＳ（３−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液等が挙げられる。

前記有機アミン系緩衝液を用いる場合は、２０ｍＭ〜２Ｍの濃度、好ましくは２０ｍＭ〜１Ｍの濃度、最適には２０ｍＭ〜５００ｍＭの濃度に調整した水性媒体として用いれば良い。また、好適な水性媒体としては水、具体的には精製水が挙げられ、適宜に補酵素、可溶性塩類、界面活性剤、安定化剤や防腐剤などを含有しても良い。
また前記グッド緩衝液または生化学用緩衝液を用いる場合は、２０ｍＭ〜１Ｍの濃度、好ましくは２０ｍＭ〜５００ｍＭの濃度、最適には２０ｍＭ〜３００ｍＭの濃度に調整して用いれば良い。
上記特徴において、媒体が可溶性蛋白質溶液である場合としては、ＢＳＡ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ゼラチン等の水溶液があげられるが、これらを１種または２種以上組み合わせて使用することができる。この場合、アルブミンとゼラチンの濃度は、それぞれ０．５〜１５重量％が好ましい。更に、媒体が血清である場合でも上記緩衝液を適時用いることができる。
上記したバリン或いはプロリンを用いて酵素の安定化を図る場合には、多量のバリン、プロリンを溶媒に添加することなく、低濃度で、よってコントロール物質が高比重、高粘性となることなく、酵素の安定化を図ることができる。さらにバリン、プロリンはＡＳＴ、ＡＬＴ以外の酵素、例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）（ＥＣ．３．１．３．１）、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）（ＥＣ．２．７．３．２）、乳酸デヒトロゲナーゼ（ＬＤＨ）（ＥＣ．１．１．１．２７）、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−ＧＴＰ）（ＥＣ．２．３．２．２）の安定化に負の影響を及ぼすものではなかった。尚、前記各酵素の添加量は、ＡＬＰが９〜６５００Ｕ／Ｌ、特に好ましくは４５〜１３００Ｕ／Ｌ、ＣＫが６〜４０００Ｕ／Ｌ、特に好ましくは３０〜８００Ｕ／Ｌ、ＬＤＨが８〜４０００Ｕ／Ｌ、特に好ましくは４０〜８００Ｕ／Ｌ、γ−ＧＴＰが２〜１２００Ｕ／Ｌ、特に好ましくは１０〜８００Ｕ／Ｌとすることができる。
前記バリン、プロリンをＡＳＴとＡＬＴからなる群より選ばれる少なくとも１種の酵素を含むコントロール物質の安定化成分として用いる場合、バリン単独の場合の含有量は０．５〜１００ｍｍｏｌ／Ｌとする。そしてより好ましくは、バリンの含有量を１０〜２０ｍｍｏｌ／Ｌとする。このような範囲とすることで安定化の効果が良好で、しかも物理的化学的性質も検査対象である血清と近いものとすることができる。

プロリン単独の場合の含有量は０．５〜５００ｍｍｏｌ／Ｌとする。そしてより好ましくは、プロリンの含有量を１００〜５００ｍｍｏｌ／Ｌとする。但しＡＬＴの安定化（ＡＳＴを含まない場合）のためにプロリンを単独で用いる場合は、１００ｍｍｏｌ／Ｌを超える量のプロリンを含有させるのが好ましく、より好ましくは２００〜５００ｍｍｏｌ／Ｌで、最適には３００〜５００ｍｍｏｌ／Ｌである。
またバリンとプロリンを組み合わせる場合の含有量は、バリンは５〜２０ｍｍｏｌ／Ｌ、プロリンは１０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌとし、組み合わせられた総量は１５〜５２０ｍｍｏｌ／Ｌとする。

以上のような範囲の含有量とすることで、安定化の効果が良好で、しかも物理的、化学的性質も検査対象である血清と近いものにすることができる。よって得られるコントロール物質の物理的、化学的性質を常に検査対象である血清に近似させ、且つ安定性を確保することができ、得られたデータの値の信頼性を得ることができると共に、検査を行う施設間等での差異を無くすことができる。

上記本発明の特徴によるアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法によれば、バリンの含有により媒体中のＡＬＴの変性を抑制し、安定化させることが可能となる。
またＡＬＴを安定化成分により安定化させることが可能となり、ＡＬＴを検出対象とする検査等において、安定した正確な検出データを得ることが可能となった。特に、ＡＬＴに対して、バリンを安定化成分として用いることで、バリンの少ない含有量でもってＡＬＴの安定化を十分に図ることができる。
また上記本発明の特徴によるアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法によれば、媒体を血清とすることで、血清中に含まれるＡＬＴの検出を行う場合、媒体である血清の中にＡＬＴとその安定化成分であるバリンを一緒に加えたコントロール物質等を用いることができ、物理的、化学的に似た良好な環境下での検出が可能となる。
同様に、媒体を緩衝液とすることで、緩衝液という安定した媒体中において、ＡＬＴを安定化成分であるバリンにより安定化させることができる。勿論、緩衝液には必要に応じて種々の成分を溶解させることで、検査対象物質（溶媒）と類似の物理的、化学的性質を有するコントロール物質を提供することができる。
また上記本発明の特徴によるアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法において、バリンの含有量を０．５〜１００ｍｍｏｌ／Ｌとすることで、ＡＬＴの良好な安定化を図ることができる。
また上記本発明の特徴によるアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法において、安定化成分としてプロリンをさらに含有させることで、ＡＬＴの良好な安定化を図ることができる。
また上記本発明の特徴によるアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法において、バリンの含有量が５〜２０ｍｍｌ／Ｌであり、プロリンの含有量が１０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであることで、ＡＬＴの良好な安定化を図ることができる。
また上記本発明の特徴によるアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法において、血清または緩衝液が可溶性蛋白質を含む緩衝液である場合には、該可溶性蛋白質を含む緩衝液中であっても、ＡＬＴを安定化成分であるバリン等により安定化させることができる。
更に前記可溶性蛋白質がアルブミン及びゼラチンからなる群より選ばれる少なくとも１種の可溶性蛋白質である場合には、アルブミンやゼラチンを含む緩衝液中においても、ＡＬＴを安定化成分であるバリン等により安定化させることができる。この場合、アルブミンとゼラチンの濃度が、それぞれ０．５〜１５重量％である場合に好ましくＡＬＴを安定化させることができる。
また上記本発明の酵素組成物によれば、血清及び緩衝液からなる群より選ばれる少なくとも１種の媒体に対して、ＡＬＴと、バリンとが含有せられていることで、ＡＬＴが容易に変性せずに、安定した状態で存在することができる酵素組成物を提供することができる。よってこのような酵素組成物をコントロール物質として、ＡＬＴを検出対象とする検査等に用いることで、安定した正確な検出データを得ることが可能となる。

本発明の方法により、バリン、プロリンを安定化成分とし、ＡＳＴやＡＬＴを酵素成分としたコントロール血清の製造の例を説明する。
ヒト血清（トリナ社製（スイス国））を用い、これを予め５６℃で４時間熱処理することにより、内因性の酵素を失活させた後、０．２μｍのメンブランフィルターで除菌濾過する（これをヒト血清ベースと称する。）。このヒト血清ベース（媒体）に、例えば１０ｍｍｏｌ／Ｌのバリンを溶解し、更にＡＳＴ又はＡＬＴを一定量溶解することで、バリンを安定化成分としたＡＳＴ又はＡＬＴを含むコントロール血清を得ることができる。
また前記ヒト血清ベースに、例えば３００ｍｍｏｌ／Ｌのプロリンを溶解し、更にＡＳＴ又はＡＬＴを一定量溶解することで、プロリンを安定化成分としたＡＳＴ又はＡＬＴを含むコントロール血清を得ることができる。

同様に本発明の方法により、バリン、プロリンを安定化成分とし、ＡＳＴやＡＬＴを酵素成分とし、緩衝液を媒体としたコントロール物質の製造の例を説明する。
２０ｍｍｏｌ／ＬのＢＥＳ緩衝液に、ウシ血清アルブミン（インタージエン社製（アメリカ））を３％含有させ、これを除菌濾過する（ｐＨ７．４、これをＢＳＡベースとする）。このＢＳＡベースに、例えば１０ｍｍｏｌ／Ｌのバリンを溶解し、更にＡＳＴ又はＡＬＴを一定量溶解することで、緩衝液媒体中にバリンを安定化成分とし、ＡＳＴ、ＡＬＴを含むコントロール物質を得ることができた。

また前記ＢＳＡベースに、例えば３００ｍｍｏｌ／Ｌのプロリンを溶解し、更にＡＳＴ又はＡＬＴを一定量溶解することで、緩衝液媒体中にプロリンを安定化成分とし、ＡＳＴ、ＡＬＴを含むコントロール物質を得ることができる。
尚、本発明の方法を用いて得られるコントロール物質は通常の使用時において液体であるが、保存状態としては、凍結乾燥品、冷凍保存品、凍結液状品等、液体以外の状態であってもよい。

以下、本発明の実施例を説明する。が、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１
コントロール物質中のＡＳＴ又はＡＬＴに対する各種アミノ酸の安定化効果の確認
媒体としてヒト血清ベースとＢＳＡベースをそれぞれ用い、それらの各媒体に対して安定化成分として、アミノ酸無添加のもの、アミノ酸としてバリンを１０ｍｍｏｌ／Ｌ加えたもの、プロリンを１０ｍｍｏｌ／Ｌ加えたもの、その他のアミノ酸を１０ｍｍｏｌ／Ｌ加えたものを作り（但し、チロシンは１ｍｍｏｌ／Ｌ）、さらにそれらに対して、酵素としてＡＳＴを約１００Ｕ／Ｌになるように加え、また酵素としてＡＬＴを約１００Ｕ／Ｌになるように加えて、コントロール物質を作製した。
そして得られた各コントロール物質を４５℃で４日間保持し、各コントロール物質に含まれるＡＳＴとＡＬＴの残存活性を測定した。
尚、使用するＡＳＴは旭化成工業株式会社製（製造番号Ｔ−７０）のヒト肝遺伝子組換体由来のもの（以下、ｒ−ＡＳＴと称す）を用いた。また、ＡＬＴは旭化成工業株式会社製（製造番号Ｔ−７１）のヒト肝遺伝子組換体由来のもの（以下、ｒ−ＡＬＴと略す）を用いた。また使用するヒト血清ベースは、ヒト血清を予め５６℃で４時間熱処理して内因性の酵素を失活させた後、０．２μｍのメンブランフィルターで除菌濾過したものを用いた。また使用するＢＳＡベースは、３％ＢＳＡ含有の２０ｍｍｏｌ／ＬのＢＥＳ緩衝液を用いた。
ＡＳＴとＡＬＴの残存活性の測定は、ＡＳＴについては国際試薬株式会社製のＡＳＴ試薬・Ｌ「コクサイ」を用いて測定した。またＡＬＴについては国際試薬株式会社製のＡＬＴ試薬・Ｌ「コクサイ」を用いて測定した。
結果を表１に示す。
表１から明らかなように、バリンとプロリンがＡＳＴ、ＡＬＴに対して好ましい安定化効果を示した。

実施例２
コントロール物質中のＡＳＴ又はＡＬＴに対するバリンの安定化効果の確認
ヒト血清ベース、ＢＳＡベースにバリン及びｒ−ＡＳＴ、ｒ−ＡＬＴを約１００Ｕ／Ｌになるように加え、４５℃で４日間保持し、残存活性を測定した。ＡＳＴ、ＡＬＴの活性測定は実施例１と同様に行った。
結果を表２に示す。
表２から明らかなように、ＢＳＡベースでは、バリン無添加の場合のＡＳＴ、ＡＬＴの残存率はそれぞれ５３％、３２％であるのに対して、バリンを０．５ｍｍｏｌ／Ｌ添加することによりＡＳＴ、ＡＬＴの残存率がそれぞれ６５％、３８％となり安定性が向上した。またバリン濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌの場合におけるＡＳＴ、ＡＬＴの残存率は、それぞれ８５％、６２％であり、バリン濃度が２０ｍｍｏｌ／Ｌの場合におけるＡＳＴ、ＡＬＴの残存率は、それぞれ８２％、６５％であり、更にバリン濃度が１００ｍｍｏｌ／Ｌの場合におけるＡＳＴ、ＡＬＴの残存率は、それぞれ８２％、６５％であった。
またヒト血清ベースでも、同様にバリン無添加の場合のＡＳＴ、ＡＬＴの残存率はそれぞれ４１％、２０％であったが、バリンを０．５ｍｍｏｌ／Ｌ添加することによりＡＳＴ、ＡＬＴの残存率それぞれ４７％、２８％となり安定性が向上した。またバリン濃度が１０ｍｍｏｌ／ＬのときのＡＳＴ、ＡＬＴの残存率は、それぞれ７１％、５５％であり、バリン濃度が２０ｍｍｏｌ／Ｌの場合におけるＡＳＴ、ＡＬＴの残存率は、それぞれ７３％、５６％であり、更にバリン濃度が１００ｍｍｏｌ／Ｌの場合におけるＡＳＴ、ＡＬＴの残存率は、それぞれ７２％、５５％であった。
以上よりバリンの濃度は０．５〜１００ｍｍｏｌ／Ｌとするのが良く、より好ましくは１０〜２０ｍｍｏｌ／Ｌとするのがよいことが判った。

実施例３
コントロール物質中のＡＳＴ又はＡＬＴに対するプロリンの安定化効果の確認
媒体としてヒト血清ベースとＢＳＡベースをそれぞれ用い、それらの各媒体に対して安定化成分として、プロリン無添加のもの、プロリンをそれぞれ０．５、１０、１００、３００、５００ｍｍｏｌ／Ｌ加えたものを作り、さらにそれらに対して、酵素としてｒ−ＡＳＴを約１００Ｕ／Ｌになるように加え、また酵素としてｒ−ＡＬＴを約１００Ｕ／Ｌになるように加えて、コントロール物質を作製した。そして得られた各コントロール物質を４５℃で４日間保持し、各コントロール物質に含まれるＡＳＴとＡＬＴの残存活性を測定した。ＡＳＴ、ＡＬＴの活性測定は実施例１と同様に操作を行った。その結果を表３に示す。
表３から明らかなように、ＢＳＡベースでは、プロリン無添加の場合にＡＳＴ、ＡＬＴの残存率がそれぞれ５３％、３２％であるのに対して、プロリンを０．５ｍｍｏｌ／Ｌ添加することによりＡＳＴ、ＡＬＴの残存率がそれぞれ６０％、４１％となり、安定性が向上した。プロリンを１００ｍｍｏｌ／Ｌ添加することにより、ＡＳＴ、ＡＬＴの残存率がそれぞれ７４％、６９％となり、プロリン濃度が３００ｍｍｏｌ／Ｌの場合のＡＳＴ、ＡＬＴの残存率は、それぞれ８４％、８４％であり、更にプロリン濃度が５００ｍｍｏｌ／Ｌの場合のＡＳＴ、ＡＬＴの残存率は、それぞれ８４％、８５％であった。
またヒト血清ベースでも同様にＡＳＴ、ＡＬＴのプロリン無添加のときの残存率は、それぞれ４１％、２０％であったが、プロリンを０．５ｍｍｏｌ／Ｌ添加することによりＡＳＴ、ＡＬＴの残存率がそれぞれ４９％、３４％となり安定が向上した。またプロリンを１００ｍｍｏｌ／Ｌ添加することにより、ＡＳＴ、ＡＬＴの残存率がそれぞれ６７％、６５％となり、プロリンを３００ｍｍｏｌ／Ｌ添加することによりＡＳＴ、ＡＬＴの残存率がそれぞれ８２％、８３％となり、更にプロリン濃度が５００ｍｍｏｌ／Ｌの場合の時のＡＳＴ、ＡＬＴの残存率は、それぞれ８５％、８８％であった。
以上よりプロリンの濃度は０．５〜５００ｍｍｏｌ／Ｌとするのが良く、より好ましくは１００〜５００ｍｍｏｌ／Ｌとするのがよいことが判った。特にＡＬＴの安定化に対するプロリンの濃度については、１００ｍｍｏｌ／Ｌを超え２．５ｍｏｌ／Ｌまでの濃度で適宜使用するのが好ましく、最適には３００〜５００ｍｍｏｌ／Ｌとするのがよいことが判った。

実施例４
コントロール物質中のＡＳＴ、ＡＬＴに対するバリンとプロリンを組み合わせたときの安定化効果の確認
ヒト血清ベースにバリン、プロリン及びｒ−ＡＳＴ、ｒ−ＡＬＴを約１００Ｕ／Ｌになるように加え、４５℃で４日間保存し、残存活性を測定した。ＡＳＴ、ＡＬＴの活性測定は実施例１と同様に操作を行った。その結果を表４に示す。
表４で明らかなように、アミノ酸無添加の場合のＡＳＴの残存率が４１％であり、これに対してバリンを単独で５ｍｍｏｌ／Ｌ添加したときの残存率が５２％で、プロリンを単独で１０ｍｍｏｌ／Ｌ添加したときの残存率は５４％となり、更にバリンを５ｍｍｏｌ／Ｌとプロリンを１０ｍｍｏｌ／Ｌ添加したときの残存率は６６％となり、それぞれのアミノ酸を単独で用いた場合より安定性が向上した。
また、アミノ酸無添加の場合のＡＬＴの残存率は２０％であったが、バリンを単独で５ｍｍｏｌ／Ｌ添加した場合の残存率は３３％、プロリンを単独で１０ｍｍｏｌ／Ｌ添加した場合の残存率は４３％となり、更にバリンを５ｍｍｏｌ／Ｌとプロリンを１０ｍｍｏｌ／Ｌ添加したときの残存率は５４％となり、それぞれのアミノ酸を単独で用いた場合より安定化が向上した。
またバリンを２０ｍｍｏｌ／Ｌに対してプロリンを１０ｍｍｏｌ／Ｌとして組み合わせた場合のＡＳＴの残存率は７８％で、ＡＬＴの残存率は７９％、バリンを２０ｍｍｏｌ／Ｌに対してプロリンを１００ｍｍｏｌ／Ｌとして組み合わせた場合のＡＳＴの残存率は８４％で、ＡＬＴの残存率は８５％、バリンを２０ｍｍｏｌ／Ｌに対してプロリンを３００ｍｍｏｌ／Ｌとして組み合わせた場合のＡＳＴの残存率は９０％で、ＡＬＴの残存率は９２％、バリンを２０ｍｍｏｌ／Ｌに対してプロリンを５００ｍｍｏｌ／Ｌとして組み合わせた場合のＡＳＴの残存率は９４％で、ＡＬＴの残存率は９４％であった。
以上よりバリンとプロリンとを組み合わせて用いる場合には、バリンを５〜２０ｍｍｏｌ／Ｌ、プロリンを１０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌとするのがよく、組み合わせられた総量が１５〜５２０ｍｍｏｌ／Ｌとするのがよいことが判った。またこの濃度では、比重、粘度等はヒト血清に近似したものであった。

実施例５
起源の異なるＡＳＴ、ＡＬＴに対するバリン、プロリンの安定化効果の確認
ヒト血清ベースに安定化成分としてバリンを１０ｍｍｏｌ／Ｌ、プロリンを３００ｍｍｏｌ／Ｌ含有させたもの、及び含有させないものを作り、これらに対して起源の異なる幾つかのＡＳＴ、ＡＬＴをそれぞれ約１００Ｕ／Ｌになるように加え、コントロール物質を作製した。各コントロール物質を４５℃で４日間保存し、残存活性を測定した、ＡＳＴ、ＡＬＴの活性測定は実施例１と同様に操作を行った。その結果を表５に示す。
表５から明らかなように、各種起源の異なるＡＳＴ、ＡＬＴに対してもバリン、プロリンによる安定化効果があることがわかった。

本発明の酵素の安定化方法及び酵素組成物は、医療検査に用いられるコントロール物質に関わるものであり、血清中や緩衝液中或いは可溶性蛋白質溶液等の媒体中に含有せられるＡＳＴやＡＬＴを十分に安定化させることから、医療の臨床検査分野において正確で安定した検査値を得るための方法、或いは材料を提供することで、産業上の利用可能性がある。

Claims (10)

1. 血清及び緩衝液からなる群より選ばれる少なくとも１種の媒体中に、アラニンアミノトランスフェラーゼを安定化する安定化成分として、バリンを含有させることを特徴とするアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法。
2. バリンの含有量が０．５〜１００ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項１に記載のアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法。
3. 安定化成分としてプロリンをさらに含有させることを特徴とする請求項１に記載のアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法。
4. バリンの含有量が５〜２０ｍｍｏｌ／Ｌであり、プロリンの含有量が１０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項３に記載のアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法。
5. 血清または緩衝液が、可溶性蛋白質を含む緩衝液であることを特徴とする請求項１〜４の何れかに記載のアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法。
6. 可溶性蛋白質がアルブミン及びゼラチンからなる群より選ばれる少なくとも１種の可溶性蛋白質であることを特徴とする請求項５に記載のアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法。
7. アルブミンの濃度は０．５〜１５重量％であることを特徴とする請求項６に記載のアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法。
8. ゼラチンの濃度は０．５〜１５重量％であることを特徴とする請求項６に記載のアラニンアミノトランスフェラーゼの安定化方法。
9. 血清及び緩衝液からなる群より選ばれる少なくとも１種の媒体に対して、アラニンアミノトランスフェラーゼと、バリンとが含有せられていることを特徴とする酵素組成物。
10. プロリンをさらに含有させることを特徴とする請求項９に記載の酵素組成物。