JP2020115112A - 試料中の総タンパク質測定試薬及びその安定化方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、特に、化学、生命科学、分析化学及び臨床検査等の分野において有用なものである。
例えば、試料を銅イオンを含有する試薬(第1試薬)と反応させた後にアルカリ性の試薬(第2試薬)と反応させ、銅イオンと試料中のタンパク質との錯体を形成させ発色させる方法や(特許文献1参照。)、試料をアルカリ性の試薬(第1試薬)と混合した後に銅イオンを含有する試薬(第2試薬)と反応させ、銅イオンと試料中のタンパク質との錯体を形成させ発色させる方法等が提案されている(特許文献2参照。)。
この自動分析装置の試薬保冷庫に置かれた試薬群は、これらの容器に収容された試薬を使いきるまで、1〜2週間以上、長い場合には1カ月程、開封状態のまま空気に触れた状態で使用される。
このため、このようなpHの低下した試薬を使用して、試料中の総タンパク質を測定した場合には、使用開始時に比べて測定値が低下してしまうという問題点があった。
このように、正確な測定値が得られなくなることは、疾病の診断を誤らせることにもつながる重大な問題であり、その解決が望まれていた。
(1) pH3〜13の第1試薬、及び銅イオンを含むアルカリ性の第2試薬からなる、試料中の総タンパク質測定試薬であって、水酸化リチウムを含有することを特徴とする総タンパク質測定試薬。
(2) 水酸化リチウムが第2試薬に含まれる、前記(1)記載の総タンパク質測定試薬。
(3) pH3〜13の第1試薬、及び銅イオンを含むアルカリ性の第2試薬からなる試料中の総タンパク質測定試薬に、水酸化リチウムを含有させることを特徴とする、総タンパク質測定試薬の安定化方法。
(4) 水酸化リチウムを第2試薬に含有させる、前記(3)記載の総タンパク質測定試薬の安定化方法。
また、本発明の総タンパク質測定試薬の安定化方法は、長期間正確な測定値を得ることができる方法である。
そして、これにより、疾患の診断等の場において、誤差を含まない、かつ正確な総タンパク質の測定値を提供することができるものである。
本発明は、pH3〜13の第1試薬、及び銅イオンを含むアルカリ性の第2試薬からなる、試料中の総タンパク質測定試薬であって、水酸化リチウムを含有することを特徴とする、総タンパク質測定試薬である。
本発明の総タンパク質測定試薬の第1試薬は、pH3〜13の第1試薬である。また、本発明の第1試薬のpHは、pH3〜7の範囲にあることが好ましい。
また、前記のpH範囲となるように使用する緩衝剤としては、前記のpH範囲に緩衝能がある従来公知の緩衝剤を適宜使用することができる。
このような緩衝剤として使用できるものとしては、例えば、リン酸、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、イミダゾール、グリシルグリシン、MES、Bis−Tris、ADA、ACES、Bis−Trisプロパン、PIPES、MOPSO、MOPS、BES、HEPES、TES、DIPSO、TAPSO、POPSO、HEPPS、HEPPSO、Tricine、Bicine、若しくはTAPS又はこれらの塩等の各緩衝剤を挙げることができる。
ここで、酸化剤としては、例えば、フェリシアン化物、フェロシアン化物、硝酸塩、亜硝酸塩、過ヨウ素酸塩、過硫酸塩等を用いることができる。
本発明の総タンパク質測定試薬の第2試薬は、銅イオンを含有するアルカリ性のものである。
本発明において銅イオンとしては、Cu2+等を挙げることができる。本発明の総タンパク質測定試薬の第2試薬には、この銅イオンを含有させる。
この銅イオンを含有させることであるが、例えば、硫酸銅、塩化銅、硝酸銅、EDTA銅等の銅塩を含有させることにより達成できる。
この銅イオンの濃度は、第2試薬中において、4〜300mMの範囲にあることが好ましく、20〜150mMの範囲が特に好ましい。
また、この銅イオンの濃度は、試料、第1試薬及び第2試薬を混合した最終反応液中において、1〜100mMの範囲にあることが好ましく、5〜50mMの範囲が特に好ましい。
本発明の総タンパク質測定試薬の第2試薬は、アルカリ性のものである。
なお、本発明の総タンパク質測定試薬は、アルカリ性下で銅イオンと試料中のタンパク質との錯体を形成させ発色させるビウレット反応を利用した測定試薬であり、本発明の測定試薬の第1試薬はpH3〜13のものであるので、第2試薬のpHは、試料と第1試薬と第2試薬を混合させた最終反応液のpHが、ビウレット反応を起こすようなpH範囲にする必要がある。通常、ビウレット反応はpH13以上で起こるものであるので、本発明の試料中の総タンパク質測定試薬の第2試薬は、pH13以上とするのが好ましい。
また、本発明の総タンパク質測定試薬の第2試薬を前記のpH範囲に調整する場合は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化カリウム等の塩基性物質等を水等の水系溶媒に溶解する等により行うことができる。なお、本発明においては、測定試薬に水酸化リチウムを含有させるため、この水酸化リチウムをpHの調整に使用することが可能である。
さらに、前記のpH範囲となるように使用する緩衝剤としては、前記のpH範囲に緩衝能がある従来公知の緩衝剤を適宜使用することができる。
このような緩衝剤として使用できるものとしては、例えば、リン酸、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、イミダゾール、グリシルグリシン、MES、Bis−Tris、ADA、ACES、Bis−Trisプロパン、PIPES、MOPSO、MOPS、BES、HEPES、TES、DIPSO、TAPSO、POPSO、HEPPS、HEPPSO、Tricine、Bicine、TAPS、CHES、CAPSO、若しくはCAPS又はこれらの塩等の各緩衝剤を挙げることができる。
また、本発明の総タンパク質測定試薬の第2試薬には、銅イオンにキレート能力を持つ物質を含有させてもよい。ここで、銅イオンにキレート能力を持つ物質は、アルカリ性下で銅イオンにキレート能力を持つ物質であれば、最終反応液中でも銅水酸化物が生じず安定的に測定が行えるので好適である。
ここで、アルカリ性下で銅イオンにキレート能力を持つ物質としては、例えば、酒石酸、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ジアミノシクロヘキサン四酢酸(CyDTA)、ジヒドロキシエチルグリシン(DHEG)、エチレンジアミン二酢酸(EDDA)、グリコールエーテルジアミン四酢酸(GEDTA)、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸(HIDA)、イミノ二酢酸(IDA)、ニトリロ三酢酸(NTA)、若しくはニトリロ三プロピオン酸(NTP)又はその塩等を挙げることができる。
本発明の総タンパク質測定試薬は、水酸化リチウムを含有する。本発明において、水酸化リチウムとしては、水酸化リチウム又はその水和物を挙げることができる。
また、この水酸化リチウムの濃度は、試料、第1試薬及び第2試薬を混合した最終反応液中において、150〜2000mMの範囲にあることが好ましく、400〜1600mMの範囲が特に好ましい。
なお、この水酸化リチウムは、混合後の最終反応液中の濃度が上記濃度範囲に入るのであれば、第1試薬又は第2試薬のいずれに含有させてもよく、第1試薬と第2試薬の両方に含有させてもよいが、第2試薬に含有させることが好ましい。
なお、本発明において、水酸化リチウムを第2試薬に含有させる場合、第2試薬のpHをアルカリ性に調整するために、水酸化リチウムに加えて、さらに水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の塩基性物質を含有させることもできる。
また、この場合、水酸化リチウムの濃度を、塩基性物質(水酸化リチウム、水酸化ナトリウム及び/又は水酸化カリウム)の合計濃度の40%以上となるように調整することが好ましい。
本発明の総タンパク質測定試薬において、第1試薬及び/又は第2試薬には前記の成分の他に、公知の防腐剤、安定化剤、又は界面活性剤等を必要に応じて適宜使用することができる。
本発明の総タンパク質測定試薬においては、第1試薬、第2試薬、又は第1試薬と第2試薬の両方が、溶液よりなる試薬、すなわち液状試薬である場合に好適である。
特に、第1試薬及び第2試薬が液状試薬である場合に好適である。
本発明において、試料とは、試料中の総タンパク質濃度の測定を行おうとするもののことであり、このようなものであれば特に限定されない。
このような試料としては、例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、汗等の体液、ヒト若しくは動物の腎臓、心臓、肺、脳等の臓器等の抽出液;骨格筋、骨髄、皮膚、又は神経組織等の抽出液;毛髪等の抽出液、ヒト又は動物の糞便の抽出液又は懸濁液;細胞の抽出液等が挙げられる。
本発明の総タンパク質測定試薬の安定化方法は、pH3〜13の第1試薬、及び銅イオンを含むアルカリ性の第2試薬からなる試料中の総タンパク質測定試薬に、水酸化リチウムを含有させることを特徴とするものである。
各種塩基性物質を総タンパク質測定試薬に含有させた場合のpHの低下に対する効果を確認した。
(1) 第1試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、pHを5.8(20℃)に調整し、総タンパク質測定試薬の第1試薬を調製した。
クエン酸1水和物 45mM
L−酒石酸 300mM
界面活性剤 0.01%
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、総タンパク質測定試薬の第2試薬Aを調製した。
硫酸銅5水和物 40mM
酒石酸ナトリウムカリウム(4水塩) 360mM
水酸化リチウム1水和物 732mM
水酸化ナトリウム 732mM
水酸化カリウム 1647mM
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、総タンパク質測定試薬の第2試薬Bを調製した。
硫酸銅5水和物 40mM
酒石酸ナトリウムカリウム(4水塩) 360mM
水酸化リチウム1水和物 1281mM
水酸化ナトリウム 563mM
水酸化カリウム 1267mM
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、総タンパク質測定試薬の第2試薬Cを調製した。
硫酸銅5水和物 40mM
酒石酸ナトリウムカリウム(4水塩) 360mM
水酸化リチウム1水和物 563mM
水酸化ナトリウム 1281mM
水酸化カリウム 1267mM
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、総タンパク質測定試薬の第2試薬Dを調製した。
硫酸銅5水和物 40mM
酒石酸ナトリウムカリウム(4水塩) 360mM
水酸化リチウム1水和物 563mM
水酸化ナトリウム 563mM
水酸化カリウム 1985mM
試料として、市販標準血清である「TP/ALB標準血清」(販売元:株式会社シノテスト)を使用した。
前記2の試料中の総タンパク質濃度を、前記1で調製した第1試薬及び第2試薬Aにて測定した。
総タンパク質濃度の測定は、7180形汎用自動分析装置(販売元:株式会社日立ハイテクノロジーズ)にて行い、試料3.8μLに前記1の(1)で調製した第1試薬150μLを添加して、混和後37℃で5分間反応させた後、前記1の(2)で調製した本発明・第2試薬A75μLを添加し、37℃で5分間反応させた。第1試薬添加後270.1秒目(16ポイント目)と第2試薬添加後308.4秒目(34ポイント目)の主波長546nm及び副波長700nmにおける吸光度を測定し、その差を求めた。
また、第2試薬に0、1.5、3、4.5及び6Nの塩酸を添加することによってpHを下げた場合の試料の測定値の変動を確認した。また、塩酸を添加した第2試薬のpHをそれぞれ測定した。
さらに、第2試薬を前記1の(3)〜(5)で調製した第2試薬B〜Dに変えて同様に測定を行った。
前記3の測定結果を図1に示した。なお、この図1において、横軸は「pH差」(1.5、3、4.5及び6Nの塩酸を添加した際のpHからそれぞれ、塩酸添加なし(0)のpHを差し引いたpH差)を示し、縦軸は「吸光度差」(単位:吸光度×10000)を示す。
すなわち、pHの低下に対する吸光度の変化量を小さくする効果があるのは、第2試薬中の水酸化リチウムであることが示唆された。
各種塩基性物質を総タンパク質測定試薬に含有させた場合のpHの低下に対する効果を確認した。
(1) 第1試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、pHを5.8(20℃)に調整し、総タンパク質測定試薬の第1試薬を調製した。
クエン酸1水和物 45mM
L−酒石酸 100mM
界面活性剤 0.01%
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、総タンパク質測定試薬の第2試薬Eを調製した。
硫酸銅5水和物 40mM
酒石酸ナトリウムカリウム(4水塩) 360mM
水酸化リチウム1水和物 2500mM
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、総タンパク質測定試薬の第2試薬Fを調製した。
硫酸銅5水和物 40mM
酒石酸ナトリウムカリウム(4水塩) 360mM
水酸化ナトリウム 2500mM
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、総タンパク質測定試薬の第2試薬Gを調製した。
硫酸銅5水和物 40mM
酒石酸ナトリウムカリウム(4水塩) 360mM
水酸化カリウム 2500mM
試料として、市販標準血清である「TP/ALB標準血清」(販売元:株式会社シノテスト)を使用した。
前記2の試料中の総タンパク質濃度を、前記1で調製した第1試薬及び第2試薬Eにて測定した。
総タンパク質濃度の測定は、7180形汎用自動分析装置(販売元:株式会社日立ハイテクノロジーズ)にて参考例1の3と同様にして行った。
また、第2試薬に0、1.5、3、4.5及び6Nの塩酸を添加することによってpHを下げた場合の試料の測定値の変動を確認した。また、各濃度の塩酸を添加した第2試薬のpHをそれぞれ測定した。
さらに、第2試薬を前記1の(3)及び(4)で調製した第2試薬F及びGに変えて同様に測定を行った。
前記3の測定結果を図2に示した。なお、この図2において、横軸は「pH差」(0、1.5、3、4.5及び6Nの塩酸を添加した際のpHからそれぞれ、塩酸添加なし(0)のpHを差し引いたpH差)を示し、縦軸は「吸光度差」(単位:吸光度×10000)を示す。
すなわち、pHの低下に対する吸光度の変化量を小さくする効果があるのは、第2試薬中の水酸化リチウムであることが確認された。
各種塩基性物質を総タンパク質測定試薬に含有させた場合のpHの低下に対する効果を確認した。
(1) 第1試薬の調製
参考例1の1の(1)で調製した第1試薬をそのまま使用した。
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、総タンパク質測定試薬の第2試薬Hを調製した。
硫酸銅5水和物 40mM
酒石酸ナトリウムカリウム(4水塩) 360mM
水酸化リチウム1水和物 563mM
水酸化ナトリウム 563mM
水酸化カリウム 1267mM
前記(2)の第2試薬Hの水酸化リチウム1水和物の濃度を1281mMとすること以外は、前記(2)の試薬成分及び濃度の通りに第2試薬Iの調製を行った。
前記(2)の第2試薬Hの水酸化リチウム1水和物の濃度を1601mMとすること以外は、前記(2)の試薬成分及び濃度の通りに第2試薬Jの調製を行った。
前記(2)の第2試薬Hの水酸化リチウム1水和物の濃度を2002mMとすること以外は、前記(2)の試薬成分及び濃度の通りに第2試薬Kの調製を行った。
試料として、市販標準血清である「TP/ALB標準血清」(販売元:株式会社シノテスト)を使用した。
前記2の試料中の総タンパク質濃度を、前記1で調製した第1試薬及び第2試薬Hにて参考例1の3と同様にして測定を行った。
また、第2試薬に0、1.5、3、4.5及び6Nの塩酸を添加することによってpHを下げた場合の試料の測定値の変動を確認した。また、塩酸を添加した第2試薬のpHをそれぞれ測定した。
さらに、第2試薬を前記1の(3)〜(5)で調製した第2試薬I〜Kに変えて同様に測定を行った。
前記3の測定結果を図3に示した。なお、この図3において、横軸は「pH差」(0、1.5、3、4.5及び6Nの塩酸を添加した際のpHからそれぞれ、塩酸添加なし(0)のpHを差し引いたpH差)を示し、縦軸は「吸光度差」(単位:吸光度×10000)を示す。
本発明の試料中の総タンパク質測定試薬を開封状態で保存し、保存時の安定性の確認を行った。
(1) 第1試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、pHを5.8(20℃)に調整し、総タンパク質測定試薬の第1試薬を調製した。
クエン酸1水和物 45mM
L−酒石酸 300mM
界面活性剤 0.01%
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、総タンパク質測定試薬の第2試薬(本発明・第2試薬a)を調製した。
硫酸銅5水和物 40mM
酒石酸ナトリウムカリウム(4水塩) 360mM
水酸化リチウム1水和物 1600mM
水酸化ナトリウム 563mM
水酸化カリウム 1267mM
前記(2)の本発明・第2試薬aの水酸化リチウム1水和物の濃度を2000mMとすること以外は、前記(2)の試薬成分及び濃度の通りに本発明・第2試薬bの調製を行った。
前記(2)の本発明・第2試薬aの水酸化リチウム1水和物の濃度を563mMとすること以外は、前記(2)の試薬成分及び濃度の通りに対照・第2試薬の調製を行った。
試料として、市販標準血清である「TP/ALB標準血清」(販売元:株式会社シノテスト)を使用した。
前記2の試料中の総タンパク質濃度を、前記1で調製した第1試薬及び本発明・第2試薬aにて参考例1の3と同様にして測定を行った。
また、試薬ボトルの蓋を開けた状態で、自動分析装置の試薬庫に静置し、保存開始時(0日)、7日後、15日後、21日後、28日後、及び35日後の試料の測定値の変動を確認した。
さらに、第2試薬を前記1の(3)及び(4)で調製した本発明・第2試薬b及び対照・第2試薬に変えて同様に測定を行った。
前記3の測定結果を表4及び図3に示した。なお、表4に示した値は、測定で得られた吸光度差を10,000倍した値であり、カッコ内の数値はその測定値の保存開始時(0日)の測定値に対する相対比率を表したものである。また、この図3において、横軸は「保存期間(日)」を示し、縦軸は「相対比率」を示す。
Claims (4)
- pH3〜13の第1試薬、及び銅イオンを含むアルカリ性の第2試薬からなる、試料中の総タンパク質測定試薬であって、水酸化リチウムを含有することを特徴とする総タンパク質測定試薬。
- 水酸化リチウムが第2試薬に含まれる、請求項1記載の総タンパク質測定試薬。
- pH3〜13の第1試薬、及び銅イオンを含むアルカリ性の第2試薬からなる試料中の総タンパク質測定試薬に、水酸化リチウムを含有させることを特徴とする、総タンパク質測定試薬の安定化方法。
- 水酸化リチウムを第2試薬に含有させる、請求項3記載の総タンパク質測定試薬の安定化方法。
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