JP2002284775A - 溶液状態のアスコルビン酸又はその塩の安定化方法、アスコルビン酸又はその塩を存在させた溶液、及び試料中の測定対象物質の測定試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】溶液状態でのアスコルビン酸又はその塩を安定
化させる方法、安定化されたアスコルビン酸又はその塩
を含有する溶液、及びこの溶液を還元剤溶液として使用
した試料中の鉄、ＵＩＢＣ又は銅の測定試薬を提供す
る。 【構成】アスコルビン酸又はその塩を含有する溶液にヒ
ドロキシルアミン塩及び／又は亜二チオン酸塩を存在さ
せる、溶液状態のアスコルビン酸又はその塩の安定化方
法。アスコルビン酸又はその塩とともにヒドロキシルア
ミン塩及び／又は亜二チオン酸塩を存在させた溶液。及
びアスコルビン酸又はその塩とともにヒドロキシルアミ
ン塩及び／又は亜二チオン酸塩を存在させた溶液を還元
剤溶液として用いる、試料中の測定対象物質の測定試
薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、溶液状態のアスコ
ルビン酸又はその塩を安定化させる方法、安定化された
アスコルビン酸を含有する溶液、及びこの溶液を還元剤
溶液として使用する試料中の測定対象物質の測定試薬に
関する。本発明は、特に、化学、生命科学、分析化学及
び臨床検査等の分野において有用なものである。

【０００２】

【従来の技術】アスコルビン酸、即ちビタミンＣは、抗
壊血病活性を持つ水溶性ビタミンで抗壊血病因子であ
る。このアスコルビン酸は、人の体内では合成できない
ため、通常は野菜や果物等から摂取している。また、ア
スコルビン酸は、ビタミン類の中では最も大量に必要と
されるもので、その所要量は１日５０ｍｇとされてお
り、古くから医薬品として使用されている。また、最近
では健康志向により、栄養補助食品や飲料にアスコルビ
ン酸を使用したり、アスコルビン酸の強い還元力を利用
した酸化防止剤や鮮度保持剤として食品に添加されるこ
とも多い。

【０００３】また、このアスコルビン酸は、臨床検査の
分野においては、試料中の鉄、不飽和鉄結合能又は銅等
の測定における還元剤等として広く使用されている。

【０００４】鉄は、人体内に約４．２ｇ存在しており、
これらの鉄はその約２／３が赤血球内の血色素鉄として
存在し、残りの約１／３が貯蔵鉄として、肝臓、脾臓、
骨髄等の組織に存在する。血清中の鉄は、ごく微量（３
〜４ｍｇ）であり、そのほとんど全てが、β１−グロブ
リンに属するトランスフェリンと結合して存在してい
る。このトランスフェリンの１分子には、２分子の鉄イ
オンが結合できる。トランスフェリンの約１／３が鉄に
よって飽和されており、残りの約２／３は鉄が結合して
いない不飽和の状態で存在している。この鉄が結合して
いない不飽和のトランスフェリンに結合することのでき
る鉄量を不飽和鉄結合能（以下、ＵＩＢＣと略す。）と
呼び、血清鉄とＵＩＢＣの和を総鉄結合能（以下、ＴＩ
ＢＣと略す。）と呼んでおり、「ＴＩＢＣ＝血清鉄＋Ｕ
ＩＢＣ」という関係が成り立っている。これら血清鉄、
ＵＩＢＣ及びＴＩＢＣは、臨床面において鉄欠乏性貧
血、鉄芽球性貧血、再生不良性貧血、真性多血症、ヘモ
クロマトーシス等の血液疾患、急性肝炎、慢性肝炎、肝
硬変症等の肝疾患、慢性炎症・感染症等の各種疾患と関
係があり、その測定は臨床上極めて重要とされている。

【０００５】現在、鉄の測定方法として広く使用されて
いる方法は、キレート発色剤と鉄とを結合させて、この
キレート発色剤が鉄と結合することにより生じる吸収ス
ペクトルの変化、色調の変化などを吸光度を測ることに
より測定する方法である。また、ＵＩＢＣの測定方法と
して広く用いられている方法は、血清にあらかじめ既知
過剰量の鉄を添加してトランスフェリンを鉄で飽和させ
た後、トランスフェリンに結合せずに残存した鉄とキレ
ート発色剤とを結合させて、このキレート発色剤が鉄と
結合することにより生じる吸収スペクトルの変化、色調
の変化などを吸光度を測ることにより測定し、これを添
加した鉄量から差し引くことによりＵＩＢＣを測定する
方法である。ここで使用されるキレート発色剤は、その
ほとんどが三価の鉄とは反応しないため、還元剤を用い
て三価の鉄を二価の鉄に還元する必要がある。

【０００６】また、銅は、人体内に約１００〜１５０ｍ
ｇ存在しており、血清中の銅は、その約９５％がα２−
グロブリンに属するセルロプラスミンに結合し、残りの
数％がアルブミン等のアミノ酸に結合した形で存在して
いる。血清銅とセルロプラスミン濃度との間には、高い
相関関係があることが分かっており、セルロプラスミン
の欠損によるウィルソン病の診断に用いられている。ま
た、閉塞性黄疸、原発性胆汁性肝硬変、急性肝炎、白血
病、多発性骨髄腫、悪性腫瘍、メンケス病等の各種疾患
とも関係があり、その測定は臨床上極めて重要とされて
いる。

【０００７】現在、銅の測定方法として広く使用されて
いる方法は、血清中のセルロプラスミンに結合していた
二価の銅を還元剤により一価の銅にすることにより遊離
させ、この一価の銅とキレート発色剤とを結合させて、
このキレート発色剤が一価の銅と結合することにより生
じる吸収スペクトルの変化、色調の変化などを吸光度を
測ることにより測定する方法である。

【０００８】上記の鉄、ＵＩＢＣ又は銅の測定におい
て、使用される還元剤としては、チオグリコール酸、ア
スコルビン酸又はその塩、ピロ亜硫酸塩、塩酸ヒドロキ
シルアミン等が知られており、悪臭が無いことや、十分
な還元力を持つという理由から、アスコルビン酸又はそ
の塩が最も広く使用されている。

【０００９】また、最近の臨床検査においては、より一
層の簡便化を図るために、従来の凍結乾燥品の試薬から
液状試薬へと試薬形態の変更が行われている。しかしな
がら、現在還元剤として使用されているアスコルビン酸
又はその塩は、粉末状態では比較的安定しているが、酸
化されやすく溶液状態での安定性が極めて悪いため、溶
液状態で長期間保存するのは困難であり、更に還元され
やすいキレート発色剤との共存下での安定化は極めて困
難であった。これらの理由から、アスコルビン酸又はそ
の塩を還元剤として用いている、鉄、ＵＩＢＣ又は銅を
測定するための試薬は、その性能を長期間維持すること
が困難であった。

【００１０】この溶液状態でのアスコルビン酸又はその
塩を安定化する方法として、従来より、メタリン酸を使
用する方法、縮合リン酸塩類を使用する方法、環状トリ
メタリン酸塩を使用する方法（特開昭５６−１５６２７
２号公報）や、アスコルビン酸誘導体と酵素を使用する
方法（特開昭６２−３２３６４号公報）等が提案されて
いるが、その効果が必ずしも十分ではなかったり、又は
コストがかかるものであった。更に、最近、溶液状態で
のアスコルビン酸又はその塩を安定化する方法として、
ピロ亜硫酸塩を使用する方法（特開平６−２４７８５５
号公報）が提案されている。しかしながら、このピロ亜
硫酸塩は、アスコルビン酸又はその塩の安定化効果は十
分であるが、近傍の試薬に悪影響を及ぼすことが最近言
われ始めてきている。すなわち、試薬に含まれるアスコ
ルビン酸又はその塩の安定化剤としてのピロ亜硫酸塩が
気化し、その近傍の試薬に溶け込むことにより、ペルオ
キシダーゼによる発色反応の遅延又は阻害が生じ、測定
に用いることができなくなるということが言われてい
る。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】前記のように、アスコ
ルビン酸又はその塩は、酸化されやすく溶液状態での安
定性が極めて悪いため、溶液状態で長期間保存するのは
困難であり、更にアスコルビン酸又はその塩を還元剤と
して使用した試薬の場合、還元されやすいキレート発色
剤との共存下でのアスコルビン酸又はその塩の安定化は
極めて困難であり、試薬としての性能を長期間維持する
ことが困難であった。また、従来よりアスコルビン酸又
はその塩の安定化剤として用いられてきたものの中に
は、近傍の試薬に溶け込むことにより、ペルオキシダー
ゼ発色反応の遅延又は阻害が生じ、測定に用いることが
できなくなってしまうものもあった。よって、本発明の
課題は、溶液状態でのアスコルビン酸又はその塩を安定
化させる方法と、安定化されたアスコルビン酸又はその
塩を含有する溶液、及びこの溶液を還元剤溶液として使
用した試料中の鉄、ＵＩＢＣ又は銅の測定試薬を提供す
ることである。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の問
題点の解決を目指して鋭意検討を行った結果、アスコル
ビン酸又はその塩を含有する溶液にヒドロキシルアミン
塩及び／又は亜二チオン酸塩を存在させた場合に、溶液
状態のアスコルビン酸又はその塩を安定化できることを
見出し、本発明を完成するに至った。

【００１３】すなわち本発明は、アスコルビン酸又はそ
の塩を含有する溶液にヒドロキシルアミン塩及び／又は
亜二チオン酸塩を存在させる、溶液状態のアスコルビン
酸又はその塩の安定化方法である。

【００１４】また本発明は、アスコルビン酸又はその塩
とともにヒドロキシルアミン塩及び／又は亜二チオン酸
塩を存在させた溶液である。また、本発明の溶液におい
ては、ヒドロキシルアミン塩及び／又は亜二チオン酸塩
が、アスコルビン酸又はその塩の安定化のために含有さ
れたものであることが好ましい。また、本発明の溶液に
おいては、この溶液が試料中の測定対象物質の測定試薬
であることが好ましい。

【００１５】更に、本発明は、アスコルビン酸又はその
塩とともにヒドロキシルアミン塩及び／又は亜二チオン
酸塩を存在させた溶液を還元剤溶液として用いる、試料
中の測定対象物質の測定試薬である。また、本発明の測
定試薬においては、測定対象物質が鉄、不飽和鉄結合能
又は銅であることが好ましい。

【００１６】また、本発明の安定化方法、溶液、及び測
定試薬においては、ヒドロキシルアミン塩が塩酸ヒドロ
キシルアミンであり、及び／又は亜二チオン酸塩が亜二
チオン酸ナトリウムであることが好ましい。

【００１７】

【発明の実施の形態】〔１〕アスコルビン酸又はその塩
を含有する溶液 本発明においては、アスコルビン酸又はその塩を含有す
る溶液にヒドロキシルアミン塩及び／又は亜二チオン酸
塩を存在させることにより、溶液状態のアスコルビン酸
又はその塩を安定化することができる。

【００１８】（１）ヒドロキシルアミン塩 本発明に用いられるヒドロキシルアミンの塩としては、
例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩等を挙げることができ
る。このようなヒドロキシルアミン塩の例としては、塩
酸ヒドロキシルアミン、硫酸ヒドロキシルアミン、硝酸
ヒドロキシルアミン等を挙げることができる。本発明に
おいては、塩酸ヒドロキシルアミンを用いることが好ま
しい。また、ヒドロキシルアミン塩の濃度は、溶液に含
有するアスコルビン酸又はその塩の濃度等によって最適
濃度は異なるが、０．１〜１００ｍＭの範囲にあること
が好ましく、２〜５０ｍＭの範囲が特に好ましい。

【００１９】（２）亜二チオン酸塩 本発明に用いられる亜二チオン酸の塩としては、例え
ば、リチウム、カリウム、ナトリウム等のアルカリ金属
塩、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属
塩、アンモニウム塩等を挙げることができる。このよう
な亜二チオン酸塩の例としては、亜二チオン酸リチウ
ム、亜二チオン酸カリウム、亜二チオン酸ナトリウム、
亜二チオン酸マグネシウム、亜二チオン酸カルシウム等
を挙げることができる。本発明においては、亜二チオン
酸ナトリウムを用いることが好ましい。また、亜二チオ
ン酸塩の濃度は、溶液に含有するアスコルビン酸又はそ
の塩の濃度等によって最適濃度は異なるが、０．１〜１
００ｍＭの範囲にあることが好ましく、２〜５０ｍＭの
範囲が特に好ましい。

【００２０】（２）溶液のｐＨ 本発明のアスコルビン酸又はその塩を含有する溶液のｐ
Ｈは、ｐＨ２〜８の範囲が好ましく、ｐＨ２〜５の範囲
が特に好ましい。また、前記のｐＨ範囲となるように用
いる緩衝液としては、前記のｐＨ範囲に緩衝能がある従
来公知の緩衝液を適宜使用することができる。例えば、
トリス緩衝液、モノエタノールアミン緩衝液、ホウ酸緩
衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、又は水酸化ナトリウ
ム緩衝液等の緩衝液を挙げることができる。

【００２１】（３）その他の構成成分 本発明のアスコルビン酸又はその塩を含有する溶液中に
は、ヒドロキシルアミン塩及び／又は亜二チオン酸塩の
他に、公知の防腐剤、界面活性剤等を必要に応じて適宜
含有させることができる。なお、本発明において、溶液
状態でのアスコルビン酸又はその塩を安定化するために
は、アスコルビン酸又はその塩を含有する溶液に、ヒド
ロキシルアミン塩及び／又は亜二チオン酸塩を存在させ
るだけでよく、それ以外の操作は特に必要ない。

【００２２】（４）試料中の測定対象物質の測定試薬 本発明のアスコルビン酸又はその塩を含有する溶液は、
試料中の測定対象物質の測定試薬であってもよい。この
測定試薬においても、アスコルビン酸又はその塩ととも
にヒドロキシルアミン塩及び／又は亜二チオン酸塩を存
在させればよい。

【００２３】〔２〕還元剤溶液を用いる試料中の測定対
象物質の測定試薬 本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬においては、
還元剤として使用されるアスコルビン酸又はその塩の安
定化のために、アスコルビン酸又はその塩を含有する還
元剤溶液中にヒドロキシルアミン塩及び／又は亜二チオ
ン酸塩を存在させる。ここで、ヒドロキシルアミン塩の
濃度としては、アスコルビン酸又はその塩の濃度等によ
って最適濃度は異なるが、還元剤溶液中において、０．
１〜１００ｍＭの範囲にあることが好ましく、２〜５０
ｍＭの範囲が特に好ましい。また、亜二チオン酸塩の濃
度としては、アスコルビン酸又はその塩の濃度等によっ
て最適濃度は異なるが、還元剤溶液中において、０．１
〜１００ｍＭの範囲にあることが好ましく、２〜５０ｍ
Ｍの範囲が特に好ましい。

【００２４】更に、本発明の試料中の測定対象物質の測
定試薬においては、アスコルビン酸又はその塩を含有す
る還元剤溶液中に、ヒドロキシルアミン塩及び／又は亜
二チオン酸塩を存在させる以外は、従来より公知の試料
中の測定対象物質を測定する試薬に従えばよい。例え
ば、適当な緩衝液にアスコルビン酸又はその塩、並びに
ヒドロキシルアミン塩及び／又は亜二チオン酸塩を添加
するとともに、防腐剤、界面活性剤等を必要に応じて適
宜添加して還元剤溶液を調製する。また、この本発明の
試料中の測定対象物質の測定試薬においては、測定対象
物質が鉄、不飽和鉄結合能、又は銅である場合に好適で
ある。例えば、試料中の鉄の測定においては、前記還元
剤溶液と試料とを混合し、更にキレート発色剤を含有す
る試薬を添加した後、キレート発色剤と鉄とを結合させ
て、このキレート発色剤が鉄と結合することにより生じ
る吸収スペクトルの変化、色調の変化などを吸光度を測
ることにより測定することができる。また、測定は、レ
ートアッセイ法及びエンドポイント法のいずれの方法で
も行うことができる。なお、この本発明の試料中の測定
対象物質の測定試薬は、１試薬系で構成してもよく、又
は２試薬系等の多試薬系で構成してもよく、用手法でも
自動分析装置を用いた測定にも使用できる。

【００２５】また、これまでにヒドロキシルアミン塩及
び／又は亜二チオン酸塩が鉄、不飽和鉄結合能等の測定
試薬における還元剤として用いられた例はあるが、この
ヒドロキシルアミン塩及び／又は亜二チオン酸塩が、ア
スコルビン酸又はその塩を含有する溶液を還元剤溶液と
して用いる鉄、不飽和鉄結合能等の測定試薬において、
この還元剤溶液の安定化に寄与するということは、全く
意外なことであった。

【００２６】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明はこの実施例により限定されるものではな
い。

【００２７】〔実施例１〕 （亜二チオン酸ナトリウムによるアスコルビン酸含有溶
液の安定化効果の確認）亜二チオン酸ナトリウムをアス
コルビン酸含有溶液に存在させた場合の溶液状態のアス
コルビン酸の安定化効果を確かめた。

【００２８】（１）アスコルビン酸含有溶液の調製 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水
に溶解し、ｐＨを４．８（２０℃）に調整し、亜二チオ
ン酸ナトリウム濃度が異なる５種類のアスコルビン酸含
有溶液を調製した。

【００２９】アスコルビン酸 ４．５ｍＭ 亜二チオン酸ナトリウム０ｍＭ、０．３６ｍＭ、０．７
２ｍＭ、１．４４ｍＭ、又は２．８７ｍＭ コハク酸 ２００ｍＭ

【００３０】（２）アスコルビン酸含有溶液の保存 上記（１）で調製した５種類のアスコルビン酸含有溶液
を２５℃で３０日間保存した。

【００３１】（２）アスコルビン酸の測定 保存開始時及び保存１日後、２日後、３日後、８日後、
１５日後、２２日後、並びに３０日後に、５種類のアス
コルビン酸含有溶液の各々のアスコルビン酸の吸光度を
測定した。アスコルビン酸の測定は、前記アスコルビン
酸含有溶液を０．１Ｎ塩酸で４１倍希釈し、２４２ｎｍ
における吸光度を測定することにより行った。

【００３２】（３）測定結果 アスコルビン酸の測定結果を表１に示した。

【００３３】

【表１】

【００３４】表１から明らかなように、アスコルビン酸
含有溶液に亜二チオン酸ナトリウムを存在させていない
もの（０ｍＭ）は、保存日数の経過に従ってアスコルビ
ン酸の吸光度が低下しており、保存開始時のアスコルビ
ン酸の吸光度を１００％とした場合に、保存３日後で３
９．４％に、保存８日後では、４．７％にまで低下して
いることが分かる。また、保存２２日後以降では、吸光
度が極めて低値となったので、測定不能と判断して以降
の測定を打ち切った。これに対して、亜二チオン酸ナト
リウムをアスコルビン酸含有溶液に存在させたものはい
ずれも、保存３日後では保存開始時と比べて殆ど変化し
ておらず、保存８日後でも、残存アスコルビン酸の吸光
度は約９０％であった。また、亜二チオン酸ナトリウム
濃度が０．３６ｍＭ、０．７２ｍＭ、１．４４ｍＭ、
２．８７ｍＭの場合の残存アスコルビン酸の吸光度は、
保存１５日後では、各々７１．１％、８１．５％、８
６．９％、８６．０％となっており、保存２２日後でも
各々４２．４％、６０．０％、７９．８％、８０．８％
となっている。更に、亜二チオン酸ナトリウム濃度が
１．４４ｍＭ、２．８７ｍＭの場合は、保存３０日後で
も残存アスコルビン酸の吸光度は、各々６２．８％、７
３．７％となっており、亜二チオン酸ナトリウムを存在
させない場合に比べて残存率が著しく向上していること
が分かる。このように、アスコルビン酸含有溶液に亜二
チオン酸ナトリウムを存在させることにより、溶液状態
のアスコルビン酸を安定化できることが分かる。

【００３５】〔実施例２〕 （塩酸ヒドロキシルアミンによるアスコルビン酸含有溶
液の安定化効果の確認）塩酸ヒドロキシルアミンをアス
コルビン酸含有溶液に存在させた場合の溶液状態のアス
コルビン酸の安定化効果を確かめた。

【００３６】（１）アスコルビン酸含有溶液の調製 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水
に溶解し、ｐＨを３．７（２０℃）に調整し、塩酸ヒド
ロキシルアミン濃度が異なる３種類のアスコルビン酸含
有溶液を調製した。

【００３７】アスコルビン酸 ４．５ｍＭ 塩酸ヒドロキシルアミン２ｍＭ、８ｍＭ、又は１６ｍＭ 酢酸緩衝液 １００ｍＭ

【００３８】（２）アスコルビン酸含有溶液の保存 上記（１）で調製した３種類のアスコルビン酸含有溶液
を１０℃及び２５℃で１８０日間保存した。

【００３９】（３）アスコルビン酸の測定 保存開始時及び保存３０日後、１２０日後、１８０日後
に、３種類のアスコルビン酸含有溶液の各々のアスコル
ビン酸の吸光度を実施例１と同様の方法で測定した。

【００４０】（４）測定結果 アスコルビン酸の吸光度の測定結果を表２に示した。

【００４１】

【表２】

【００４２】実施例１で示したように、安定化剤を存在
させていない溶液状態のアスコルビン酸は、保存日数の
経過に従って、アスコルビン酸の吸光度が低下してお
り、２５℃での保存３日後で３９．４％に、保存８日後
では、４．７％にまで低下してしまう。これに対して、
表２から明らかなように、塩酸ヒドロキシルアミンをア
スコルビン酸含有溶液に存在させたものを１０℃で保存
した場合にはいずれも、保存３０日後でも、保存開始時
と比べて殆ど変化していない。更に、保存１２０日後で
も、塩酸ヒドロキシルアミン濃度が２ｍＭ、８ｍＭ、１
６ｍＭの場合の残存アスコルビン酸の吸光度は各々７
１．１％、７１．５％、７５．８％となっており、保存
１８０日後での残存アスコルビン酸の吸光度は各々５
８．７％、６６．７％、６６．９％であり、塩酸ヒドロ
キシルアミン濃度の増加に従って残存率が向上している
ことが分かる。また、２５℃で保存した場合は、保存３
０日後でも、塩酸ヒドロキシルアミン濃度が２ｍＭ、８
ｍＭ、１６ｍＭの場合の残存アスコルビン酸の吸光度は
各々７５．２％、７５．６％、７１．０％となってい
る。更に、塩酸ヒドロキシルアミン濃度が８ｍＭ及び１
６ｍＭの場合の残存アスコルビン酸の吸光度は、保存１
２０日後でも各々２７．６％、３８．７％となってお
り、また、塩酸ヒドロキシルアミン濃度が１６ｍＭの場
合には、保存１８０日後でも、残存アスコルビン酸の吸
光度は２１．８％となっており、これよりも、塩酸ヒド
ロキシルアミン濃度の増加に従って残存率が向上してい
ることが分かる。このように、アスコルビン酸含有溶液
に塩酸ヒドロキシルアミンを存在させることにより、溶
液状態のアスコルビン酸を安定化できることが分かる。

【００４３】〔実施例３〕 （試料中の鉄の測定）試料中の鉄の測定において、アス
コルビン酸とともに塩酸ヒドロキシルアミンを存在させ
た溶液を還元剤溶液として使用して試料中の鉄を測定し
た。

【００４４】（１）試薬の調製 アスコルビン酸含有溶液〔還元剤溶液〕（鉄測定用第
１試薬）の調製 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水
に溶解し、ｐＨを３．７（２０℃）に調整し、塩酸ヒド
ロキシルアミン濃度が異なる５種類のアスコルビン酸含
有溶液（鉄測定用第１試薬）を調製した。

【００４５】アスコルビン酸 １３ｍＭ 塩酸ヒドロキシルアミン ０ｍＭ、０．８ｍＭ、１．６
ｍＭ、８ｍＭ、又は１６ｍＭ 酢酸緩衝液 １００ｍＭ

【００４６】鉄測定用第２試薬の調製 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水
に溶解し、ｐＨ８．０（２０℃）に調整し、鉄測定用第
２試薬を調製した。

【００４７】２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−
スルホプロピルアミノ）−フェノール ０．５ｍＭ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５００ｍＭ

【００４８】（２）試料の作製 トランスフェリン添加試料〔試料１〕 プール血清に、鉄として約２００μｇ／ｄＬ相当量のト
ランスフェリンを添加し、トランスフェリン添加試料と
した。 血清試料〔試料２〕

【００４９】（３）試料中の鉄の測定 前記（２）で作製した２種類の試料中の鉄を、前記
（１）で調製した鉄測定用第１試薬及び鉄測定用第２試
薬にて測定した。

【００５０】鉄の測定は、日立製作所社製７１７０形自
動分析装置にて行い、試料２０μＬを鉄測定用第１試薬
２００μＬに添加して、混和後３７℃で５分間反応させ
た後、鉄測定用第２試薬８０μＬを添加し、３７℃で５
分間反応させた。主波長６００ｎｍ及び副波長７５０ｎ
ｍにおける吸光度を測定した。また、試料の代わりに２
００μｇ／ｄＬの鉄標準液を用いて同様に測定を行い、
純水を試料とした時の吸光度を試薬盲検値として鉄の値
を求めた。

【００５１】（４）測定結果 鉄の測定結果を表３に示した。

【００５２】

【表３】

【００５３】表３から明らかなように、塩酸ヒドロキシ
ルアミンを存在させたアスコルビン酸含有溶液を還元剤
溶液として使用して試料中の鉄を測定した場合と、塩酸
ヒドロキシルアミン無添加（０ｍＭ）の場合とを比較す
ると、測定値に差は見られないことが分かる。このこと
により、塩酸ヒドロキシルアミンを測定系に添加して
も、試料中の鉄の測定値に影響を与えないことが確かめ
られた。

【００５４】〔実施例４〕 （ペルオキシダーゼ発色系試薬への影響）ピロ亜硫酸カ
リウム含有試薬、塩酸ヒドロキシルアミン含有試薬、又
は亜二チオン酸ナトリウム含有試薬を各々近傍に置いた
場合の尿酸測定試薬の発色反応への影響を確認した。

【００５５】（１）試薬の調製 本発明・塩酸ヒドロキシルアミン含有試薬の調製 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水
に溶解し、ｐＨを３．７（２０℃）に調製した。

【００５６】アスコルビン酸 １３ｍＭ 塩酸ヒドロキシルアミン ８ｍＭ 酢酸緩衝液 １００ｍＭ

【００５７】本発明・亜二チオン酸ナトリウム含有試
薬の調製 前記の本発明・塩酸ヒドロキシルアミン含有試薬の塩
酸ヒドロキシルアミンを亜二チオン酸ナトリウムに変え
ること以外は、前記の試薬成分及び濃度で本発明・亜
二チオン酸ナトリウム含有試薬の調製を行った。

【００５８】対照・ピロ亜硫酸カリウム含有試薬の調
製 前記の本発明・塩酸ヒドロキシルアミン含有試薬の塩
酸ヒドロキシルアミンをピロ亜硫酸カリウムに変えるこ
と以外は、前記の試薬成分及び濃度で対照・ピロ亜硫
酸カリウム含有試薬の調製を行った。

【００５９】尿酸測定用第１試薬の調製 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水
に溶解し、ｐＨ７．０（２０℃）に調整し、尿酸測定用
第１試薬を調製した。

【００６０】３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン
酸［ＭＯＰＳ］ ５０ｍＭ Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）−ｍ−トルイジンナトリウム［ＴＯＯＳ］ ２．３
ｍＭ ペルオキシダーゼ（西洋ワサビ由来） １，０００Ｕ／
Ｌ アスコルビン酸オキシダーゼ １，５００Ｕ／Ｌ

【００６１】尿酸測定用第２試薬の調製 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水
に溶解し、ｐＨ７．０（２０℃）に調整し、尿酸測定用
第２試薬を調製した。

【００６２】３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン
酸［ＭＯＰＳ］ ５０ｍＭ ４−アミノアンチピリン １．５ｍＭ ウリカーゼ ８００Ｕ／Ｌ

【００６３】（２）試薬の保存 上記（１）で調製した、本発明・塩酸ヒドロキシルアミ
ン含有試薬、本発明・亜二チオン酸ナトリウム含有試
薬、対照・ピロ亜硫酸カリウム含有試薬、尿酸測定用第
１試薬を、図１のようにそれぞれ試験管（容量１０ｍ
Ｌ、長さ１０５ｍｍ、内径１３ｍｍ）に充填し、下記の
組み合わせでビニール袋（１３５ｍｍ×８５ｍｍ；チャ
ック付き）に入れ、チャックを閉めて密封し、４℃の冷
蔵庫内にて２日間保存した。なお、各試験管の口に栓は
しなかった。 ａ）本発明・塩酸ヒドロキシルアミン含有試薬及び尿酸
測定用第１試薬 ｂ）本発明・亜二チオン酸ナトリウム含有試薬及び尿酸
測定用第１試薬 ｃ）対照・ピロ亜硫酸カリウム含有試薬及び尿酸測定用
第１試薬

【００６４】（３）保存した試薬の安定性の確認 保存２日後の前記ａ）、ｂ）及びｃ）の尿酸測定用第１
試薬並びに前記（１）で調製した尿酸測定用第２試薬に
て、試料中の尿酸を測定した。また、比較例として、前
記（２）の操作を行っていない尿酸測定用第１試薬及び
尿酸測定用第２試薬を用いて同様に試料中の尿酸を測定
した。

【００６５】試料中の尿酸の測定は、日立製作所社製７
１５０形自動分析装置にて行い、１５ｍｇ／ｄＬの尿酸
標準液５μＬを試料として、尿酸測定用第１試薬３２０
μＬに添加して、混和後３７℃で５分間反応させた後、
尿酸測定用第２試薬８０μＬを添加し、３７℃で５分間
反応させた。主波長６００ｎｍ及び副波長７００ｎｍに
おける吸光度を測定した。

【００６６】（４）測定結果 尿酸の測定結果を表４に示した。

【００６７】

【表４】

【００６８】表４から明らかなように、対照・ピロ亜硫
酸カリウム含有試薬を近傍に置いて保存したｃ）の尿酸
測定用第１試薬を使用して試料中の尿酸を測定したもの
では、比較例の尿酸標準液の測定値（吸光度）を１００
％とした場合、その測定値（吸光度）は１６．８％にま
で低下してしまっていることが分かる。これに対して、
本発明・塩酸ヒドロキシルアミン含有試薬を近傍に置い
て保存したａ）の尿酸測定用第１試薬を使用して試料中
の尿酸を測定したものでは、尿酸標準液の測定値（吸光
度）に変化は見られていない。また、本発明・亜二チオ
ン酸ナトリウム含有試薬を近傍に置いて保存したｂ）の
尿酸測定用第１試薬を使用して試料中の尿酸を測定した
ものでも、４９．７％までの低下にとどまっている。こ
のことにより、ピロ亜硫酸カリウムを存在させたアスコ
ルビン酸含有試薬は、ペルオキシダーゼ発色反応に影響
を与えていることが分かる。これに対して、塩酸ヒドロ
キシルアミン又は亜二チオン酸ナトリウムを存在させた
アスコルビン酸含有試薬は、ペルオキシダーゼ発色系試
薬の近傍に置いて測定を行っても、ペルオキシダーゼ発
色反応に影響を与えず、正確な尿酸測定値を得られるこ
とが確かめられた。

【００６９】

【発明の効果】本発明はいずれも、アスコルビン酸又は
その塩を含有する溶液に塩酸ヒドロキシルアミン及び／
又は亜二チオン酸ナトリウムを存在させることにより、
溶液状態でのアスコルビン酸又はその塩を長期間安定化
することができるものである。また、本発明の安定化さ
れたアスコルビン酸含有溶液を試料中の測定対象物質の
測定試薬として用いることにより、試料中の測定対象物
質を正確に測定することができるものである。また、本
発明の安定化されたアスコルビン酸含有溶液、又は本発
明の試料中の測定対象物質の測定試薬をペルオキシダー
ゼ発色系試薬の近傍に置いた場合でも、ペルオキシダー
ゼ発色反応に影響を与えず、このペルオキシダーゼ発色
系試薬において正確な測定を行うことができるものであ
る。そして、これらにより、疾患の診断等の場におい
て、誤差を含まない、かつ正確な測定対象物質の測定値
を提供することができるものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】ペルオキシダーゼ発色系試薬への影響確認のた
めの試薬の保存方法を示した図である。

フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G045 BB01 BB41 BB51 BB54 DA01 DB11 DB13 FA29 FB01 GC10 4C037 LA04

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アスコルビン酸又はその塩を含有する溶
   液にヒドロキシルアミン塩及び／又は亜二チオン酸塩を
   存在させる、溶液状態のアスコルビン酸又はその塩の安
   定化方法。
2. 【請求項２】 ヒドロキシルアミン塩が塩酸ヒドロキシ
   ルアミンである、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 亜二チオン酸塩が亜二チオン酸ナトリウ
   ムである、請求項１又は請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 アスコルビン酸又はその塩とともにヒド
   ロキシルアミン塩及び／又は亜二チオン酸塩を存在させ
   た溶液。
5. 【請求項５】 ヒドロキシルアミン塩が塩酸ヒドロキシ
   ルアミンである、請求項４に記載の溶液。
6. 【請求項６】 亜二チオン酸塩が亜二チオン酸ナトリウ
   ムである、請求項４又は請求項５に記載の溶液。
7. 【請求項７】 ヒドロキシルアミン塩及び／又は亜二チ
   オン酸塩が、アスコルビン酸又はその塩の安定化のため
   に含有されたものである、請求項４〜請求項６に記載の
   溶液。
8. 【請求項８】 溶液が試料中の測定対象物質の測定試薬
   である、請求項４〜請求項７のいずれか一項に記載の溶
   液。
9. 【請求項９】 アスコルビン酸又はその塩とともにヒド
   ロキシルアミン塩及び／又は亜二チオン酸塩を存在させ
   た溶液を還元剤溶液として用いる、試料中の測定対象物
   質の測定試薬。
10. 【請求項１０】 ヒドロキシルアミン塩が塩酸ヒドロキ
    シルアミンである、請求項９に記載の測定試薬。
11. 【請求項１１】 亜二チオン酸塩が亜二チオン酸ナトリ
    ウムである、請求項９又は請求項１０に記載の測定試
    薬。
12. 【請求項１２】 測定対象物質が鉄、不飽相鉄結合能又
    は銅である、請求項９〜請求項１１のいずれか一項に記
    載の測定試薬。