CN105039495A - 一种3α-HSD试剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种3α-HSD试剂，所述试剂的组成成分包括：3α-HSD、表面活性剂、缓冲液和稳定剂；所述缓冲液选自2-(环己胺)乙磺酸、3-(环己胺)-1-丙磺酸、3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸、N-三(羟甲基)-3-氨基丙烷磺酸、3-三羟甲基甲胺-2-羟基丙磺酸和三乙醇胺所组成的组中的一种。本发明所提供试剂在2-8℃开盖使用状态下的稳定时间可以达到15-30天；在2-8℃密闭避光存储条件下的稳定时间可以达到10-15个月。
Description
技术领域
本发明涉及生化检测领域，具体的，涉及一种3α-HSD试剂及其制备方法和应用。
背景技术
3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD，EC.1.1.1.50)，是睾酮假单胞菌(comamonaspseudomonastestosteroni,CPT)产生一种类固醇脱氢酶。它可作用于多种类固醇基质，可逆地催化C19-27类固醇3位羟基/酮基的氧化还原反应。3α-HSD由225个氨基酸组成,分子量为26.4KD。3α-HSD应用到体外诊断试剂中，作为工具酶发挥其催化作用。例如，在总胆汁酸测定技术中，3α-HSD可以与Thio-NAD一起特异性氧化胆汁酸，生成3-酮类固醇和还原性辅酶(NADH)又生成胆汁酸和氧化型辅酶(NAD)每一次循环比原来的反应提高一倍的灵敏度，如此往复循环，从而放大微量的胆汁酸，产生大量的水溶性非染料的硫代还原型辅酶(Thio-NADH)，最后测定生成的Thio-NADH的吸光度变化，测得总胆汁酸的含量。此外，在环境中众多类固醇激素物质的刺激下，睾酮假单胞菌大量表达3α-HSD，通过多酶的氧化甾核的复杂代谢途径，完全消化这类底物，因此3α-HSD在这些危害大的稳定化合物的生物修复中起重要作用。
现有的3α-HSD试剂溶液一般由三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲液、3α-HSD、EDTA.2Na和二价离子(MgCl2、CaCL2)等组成，其在实际应用中存在稳定时间较短的缺陷：在2-8℃开盖使用状态，测定结果准确性降低；在2-8℃密闭避光保存过程中，随着放置时间的延长，试剂颜色由无色逐渐变为红色，试剂在稳定性方面的这种缺陷，使得测定结果准确性降低，也造成原料的浪费，不能满足检测的要求。
因此有必要提供一种新的、稳定性高的3α-HSD溶液，以满足实际应用的要求。
发明内容
本发明的目的在于克服现有的3α-HSD试剂存在的稳定时间短的缺陷，提供一种在2-8℃开盖使用状态下和在2-8℃密闭避光存储过程中的持续稳定的3α-HSD试剂。
为达到以上目的，本发明提供了一种3α-HSD试剂，所述试剂的组成成分包括：
3α-HSD、表面活性剂、缓冲液和稳定剂；所述缓冲液选自2-(环己胺)乙磺酸、3-(环己胺)-1-丙磺酸、3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸、N-三(羟甲基)-3-氨基丙烷磺酸、3-三羟甲基甲胺-2-羟基丙磺酸和三乙醇胺中的一种。
可选的，所述表面活性剂选自由聚氧乙烯十二烷基醚、聚乙二醇对异辛基苯基醚、聚乙二醇单月桂酸酯、4-壬基苯基-聚乙二醇、烷基聚烯烃基乙二醇醚和烷基聚乙烯乙二醇醚所组成的组中的一种或两种。
可选的，所述稳定剂选自半胱氨酸、L-还原型谷胱甘肽、L-氧化型谷胱甘肽、L-氧化型谷胱甘肽二钠盐和牛血清白蛋白所组成的组中的一种。
可选的，在所述试剂中，3α-HSD的浓度为0.5-100KU/L，优选为5-20KU/L；缓冲液的终浓度为5-500mmol/L，优选为10-100mmol/L；表面活性剂的浓度以质量体积百分含量计为0.05-20％(w/v)，优选为1-15％(w/v)；稳定剂的浓度为1-20g/L，优选为3-15mmol/L。
可选的，所述缓冲液的缓冲容量为0.05-1mol/L。
可选的，所述3α-HSD试剂的pH为8.0-9.5。
可选的，所述缓冲液为N-三(羟甲基)-3-氨基丙烷磺酸，所述稳定剂为L-还原型谷胱甘肽和L-氧化型谷胱甘肽中的至少一种，所述表面活性剂为聚氧乙烯十二烷基醚(EMULGEN109P)和聚乙二醇对异辛基苯基醚(曲拉通TX-100)中的至少一种。
本发明还提供了所述3α-HSD试剂的制备方法：将缓冲液、表面活性剂、稳定剂、3α-HSD依次加入到混合容器中进行分步混合，得到均匀的稳定相。
本发明还提供了所述3α-HSD试剂的应用，包括制备总胆汁酸测定试剂和酶体外定向分子进化技术的研究。
通过上述技术方案，本发明所提供的3α-HSD试剂在2-8℃开盖使用状态下的稳定时间可以达到15-30天；在2-8℃密闭避光存储过程中的稳定时间可以达到10-15个月。
具体实施方式
下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
本发明提供了一种3α-HSD试剂，所述试剂的组成成分包括：
3α-HSD、表面活性剂、缓冲液和稳定剂；所述缓冲液选自2-(环己胺)乙磺酸缓冲液、3-(环己胺)-1-丙磺酸缓冲液、3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)-3-氨基丙烷磺酸缓冲液、3-三羟甲基甲胺-2-羟基丙磺酸缓冲液和三乙醇胺缓冲液中的一种。
其中，3α-HSD、表面活性剂和稳定剂均溶解于缓冲液中形成稳定且均一的溶液。
在本发明中，所述缓冲液的终浓度表示利用3α-HSD、表面活性剂、缓冲液和稳定剂等组分配制所述试剂后，试剂中起缓冲作用的有效成分的终浓度，例如，当所述缓冲液为N-三(羟甲基)-3-氨基丙烷磺酸时，缓冲液的终浓度表示配制获得的试剂中N-三(羟甲基)-3-氨基丙烷磺酸的浓度。当缓冲液由两种或两种以上有效成分组成时，缓冲液的终浓度指代几种有效成分的总浓度。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液的缓冲容量为0.05-1mol/L。为了获得更好的稳定效果，缓冲液优选为N-三(羟甲基)-3-氨基丙烷磺酸(TAPS)或3-(环己胺)-1-丙磺酸(CAPS)。
可选的，所述试剂的pH为8.0-9.5，优选的，为了获得更好的试剂稳定效果，所述试剂的pH为9.0-9.5。
在本发明中，所述表面活性剂选自由聚氧乙烯十二烷基醚、聚乙二醇对异辛基苯基醚、聚乙二醇单月桂酸酯、4-壬基苯基-聚乙二醇、烷基聚烯烃基乙二醇醚系列和烷基聚乙烯乙二醇醚所组成的组中的一种或两种。优选的，所述表面活性剂为聚氧乙烯十二烷基醚(EMULGEN109P)和/或聚乙二醇对异辛基苯基醚(曲拉通TX-100)。
其中，在本发明的一种实施方式中，所述烷基聚烯烃基乙二醇醚指代脂肪醇环氧乙烷-环氧丙烷的加成物，如PROPETAL100。
可选的，所述稳定剂选自由半胱氨酸、L-还原型谷胱甘肽、L-氧化型谷胱甘肽、L-氧化型谷胱甘肽二钠盐和牛血清白蛋白所组成的组中的一种。优选的，为了获得最佳的稳定效果，所述稳定剂选自L-还原型谷胱甘肽和L-氧化型谷胱甘肽中的至少一种。
可选的，在所述试剂中，3α-HSD的浓度为0.5-100KU/L，优选为5-20KU/L；缓冲液的终浓度为5-500mmol/L，优选为10-100mmol/L；表面活性剂的浓度为0.05-20％(w/v)，优选为1-15％(w/v)；稳定剂的浓度为1-20g/L，优选为3-15g/L。
在本发明的一种优选的实施方式中，所述缓冲液为N-三(羟甲基)-3-氨基丙烷磺酸(TAPS)缓冲液，所述稳定剂为L-还原型谷胱甘肽、L-氧化型谷胱甘肽和牛血清白蛋白中的至少一种，表面活性剂为聚氧乙烯十二烷基醚(EMULGEN109P)和聚乙二醇对异辛基苯基醚(曲拉通TX-100)中的至少一种。
可选的，所述试剂还包括防腐剂NaN3和Proclin300，所述防腐剂的浓度可以为0.1-2g/L；所述防腐剂可以为NaN3，当所述防腐剂为NaN3时，其浓度为0.1-2g/L。
本发明还提供了所述3α-HSD试剂的制备方法：将上述缓冲液中的一种、表面活性剂中的至少一种、稳定剂中的至少一种及3α-HSD的浓度，按照缓冲液、表面活性剂、稳定剂、3α-HSD的顺序，依次混合，得到均匀的稳定相。优选通过搅拌使混合更加均匀。所述制备过程可以在室温的条件下进行。
本发明还提供了所述3α-HSD试剂的应用。所述应用包括利用本发明所提供的试剂，以3α-HSD作为工具酶，检测血中总胆汁酸含量，也可应用于酶体外定向分子进化技术的研究中；优选的，所述应用为制备总胆汁酸测定试剂。
在本发明的一种优选的实施方式中，当将所述试剂应用于总胆汁酸测定试剂时，缓冲液为pH8.5的N-三(羟甲基)-3-氨基丙烷磺酸缓冲液；稳定剂为L-还原型谷胱甘肽；表面活性剂为聚氧乙烯十二烷基醚(EMULGEN109P)。
下面通过实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1-21
按照表1列出的组分含量制备3α-HSD试剂，分别得到3α-HSD试剂1-21。
制备方法为：将上述缓冲液中的一种、表面活性剂中的至少一种、稳定剂中的至少一种及3α-HSD按照缓冲液、表面活性剂、稳定剂、3α-HSD的顺序，依次混合，得到均匀的稳定相。
表1
实施例1-21中，各组分的具体选择如下：
实施例1-17和21中，缓冲液为pH8.5的N-三(羟甲基)-3-氨基丙烷磺酸缓冲液，稳定剂为L-还原型谷胱甘肽；表面活性剂为聚氧乙烯十二烷基醚(EMULGEN109P)。
实施例18中，缓冲液为3-(环己胺)-1-丙磺酸(CAPS)，稳定剂为L-还原型谷胱甘肽；表面活性剂为聚氧乙烯十二烷基醚(EMULGEN109P)。
实施例19中，pH8.5的N-三(羟甲基)-3-氨基丙烷磺酸缓冲液，稳定剂为L-氧化型谷胱甘肽，表面活性剂为聚氧乙烯十二烷基醚(EMULGEN109P)。
实施例20中，缓冲液为pH8.5的N-三(羟甲基)-3-氨基丙烷磺酸缓冲液，稳定剂为L-谷胱甘肽；表面活性剂为聚乙二醇对异辛基苯基醚(曲拉通TX-100)。
实施例1-20中，添加NaN3作为防腐剂。
对比例1
按照与实施例1相同的方法制备3α-HSD试剂，不同的是，将缓冲液替换为三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)，得到3α-HSD试剂22。
对比例2
按照与实施例1相同的方法制备3α-HSD试剂，不同的是，将表面活性剂替换为TWEEN80，得到3α-HSD试剂23。
对比例3
按照实施例1相同的方法制备3α-HSD试剂，不同的是，将稳定剂替换为EDTA.2Na，得到3α-HSD试剂24。
测试例1
本测试例测定3α-HSD试剂1-24的稳定性。测试3α-HSD试剂1-24在8℃开盖使用状态下的稳定时间以及在8℃度密闭避光存储条件下的稳定时间，结果列于表2。
稳定时间的评价方法为:8℃开盖使用状态下,30天之内，每天测定质控品；计算每次测定结果与初期测定结果的相对偏差。8℃度密闭避光存储条件下，在15个月的保存期内，每1个月测定质控品；计算每次测定结果与初期测定结果的相对偏差。
表2
实施例22
实施例22用于说明实施例1中制备的3α-HSD试剂1在总胆汁酸测定中的应用。
1)试剂配制：在试剂1中加入终浓度为6g/L的NADH即为总胆汁酸测定试剂B，同时配制中国专利申请CN1378077A实施例1中提供的试剂B作为比对试剂；按照表3所示，配制总胆汁酸测定试剂A。
表3：
| 成份 | 用量 |
| Thio-NAD | 0.85g/L |
| pH3.82-N-吗啡乙磺酸(MES)缓冲液 | 10mM |
| Brij35 | 5％ |
| EDTA.2Na | 0.5mM |
| 草氨酸钠 | 2mM |
2)总胆汁酸试剂检测方法：采用具有双试剂功能的自动生化分析仪(光径1cm、测试温度37℃、主波长405nm、副波长660nm)，按照样本：试剂A：试剂B＝3μL：210μL：70μL的方式加样，加入试剂B1分钟后，读取2～4分钟的吸光度值，测定质控品。
3)测试时间和稳定性评价方式：试剂8℃开盖使用状态下,30天之内，每天测定质控品；计算每次测定结果与初期测定结果的相对偏差，相对偏差小于±15％判定为稳定。试剂8℃度密闭避光存储过程中，在15个月的保存期内，每月测定；计算每次测定结果与初期测定结果的相对偏差，相对偏差小于±15％判定为稳定。
4)测定结果列于表4
表4
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种3α-HSD试剂，其特征在于，所述试剂的组成成分包括：3α-HSD、表面活性剂、缓冲液和稳定剂；所述缓冲液选自2-(环己胺)乙磺酸、3-(环己胺)-1-丙磺酸、3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸、N-三(羟甲基)-3-氨基丙烷磺酸、3-三羟甲基甲胺-2-羟基丙磺酸和三乙醇胺所组成的组中的一种。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述表面活性剂选自由聚氧乙烯十二烷基醚、聚乙二醇对异辛基苯基醚、聚乙二醇单月桂酸酯、4-壬基苯基-聚乙二醇、烷基聚烯烃基乙二醇醚和烷基聚乙烯乙二醇醚所组成的组中的一种或两种。
3.根据权利要求1或2所述的试剂，其特征在于，所述稳定剂选自半胱氨酸、L-还原型谷胱甘肽、L-氧化型谷胱甘肽、L-氧化型谷胱甘肽二钠盐和牛血清白蛋白所组成的组中的一种。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的试剂，其特征在于，在所述试剂中，3α-HSD的浓度为0.5-100KU/L，优选为5-20KU/L；缓冲液的终浓度为5-500mmol/L，优选为10-100mmol/L；表面活性剂的浓度以质量体积百分含量计为0.05-20％，优选为1-15％；稳定剂的浓度为1-20g/L，优选为3-15g/L。
5.根据权利要求4所述的试剂，其特征在于，所述缓冲液的缓冲容量为0.05-1mol/L。
6.根据权利要求1、2和5中任意一项所述的试剂，其特征在于，所述3α-HSD试剂的pH为8.0-9.5。
7.根据权利要求6所述的试剂，其特征在于，所述缓冲液为N-三(羟甲基)-3-氨基丙烷磺酸，所述稳定剂为L-还原型谷胱甘肽和L-氧化型谷胱甘肽中的至少一种，所述表面活性剂为聚氧乙烯十二烷基醚和聚乙二醇对异辛基苯基醚中的至少一种。
8.根据权利要求1、2、5和7中任意一项所述的试剂还包括防腐剂NaN3和Proclin300。
9.权利要求1-8中任意一项所述的试剂的制备方法：
其特征在于，将缓冲液、表面活性剂、稳定剂、3α-HSD依次加入到混合容器中进行分步混合，得到均匀的稳定相。
10.权利要求1-7中任意一项所述的试剂的应用，包括制备总胆汁酸测定试剂和酶体外定向分子进化技术的研究。
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