JP2008528050A - Ｐｙｙアゴニストおよびその使用 - Google Patents

Ｐｙｙアゴニストおよびその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、ＰＹＹ３−３６変異体およびそのＰＥＧ化誘導体、ならびにＮＰＹ Ｙ２受容体アゴニストによって調節される状態の治療に有用な組成物および方法を提供する。

Description

発明の分野
本発明は、ＰＹＹアゴニスト、より詳細には、ＰＹＹ３−３６変異体、そしてＰＹＹ３−３６およびＰＹＹ３−３６変異体のＰＥＧ化誘導体、こうしたアゴニストを含有する組成物、こうしたＰＹＹアゴニストをコードする単離核酸、ならびに肥満およびその併存疾患の治療におけるこうしたアゴニストまたは組成物の使用、あるいは哺乳動物において、食欲、食物摂取またはカロリー摂取を減少させるためのこうしたアゴニストまたは組成物の使用に関する。
発明の背景
肥満は、患者数が増加しつつあり、そして関連する健康上のリスクがあることから、大きな公衆衛生上の懸念である。さらに、肥満は、運動性が制限され、そして肉体の耐久力が減少することを通じて、それとともに社会的に、アカデミックで、そして職業で差別があることを通じて、人の生活の質を侵しうる。
肥満および過剰体重であることは、一般的に、体格指数（ＢＭＩ）によって定義され、これは総体脂肪と相関し、そして特定の疾患のリスクの測定値として働く。ＢＭＩは、メートルで表した身長の二乗によって、キログラムで表した体重を割ることにより、計算される（ｋｇ／ｍ２）。過剰体重は、典型的には、２５〜２９．９ｋｇ／ｍ２のＢＭＩと定義され、そして肥満は、典型的には、３０ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩとして定義される。例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｒｔ， Ｌｕｎｇ， ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔ ａｎｄ Ｏｂｅｓｉｔｙ ｉｎ Ａｄｕｌｔｓ， Ｔｈｅ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ： Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ． ９８−４０８３（１９９８）を参照されたい。
最近の研究によって、肥満およびそれに関連する健康上のリスクは、成人に限定されず、驚くべき度合いまで、小児および青年を侵していることが見出された。米国疾病管理センターによると、過剰体重と定義される小児および青年の割合は、１９７０年代初期以降２倍以上になってきており、そして約１５％の小児および青年が、現在、過剰体重である。高コレステロールおよび高血圧などの心臓疾患のリスク要因は、類似の年齢の正常体重被験者に比較して、過剰体重の小児および青年では、増加した頻度で発生する。また、以前は成人病と見なされていた２型糖尿病が、小児および青年で劇的に増加してきている。過剰体重状態および肥満は、２型糖尿病と緊密に関連している。過剰体重の青年は、過剰体重または肥満の成人になる７０％の可能性を有すると、近年、概算されている。少なくとも一方の親が過剰体重または肥満であると、可能性は、約８０％に増加する。過剰体重であることの最も差し迫った結果は、子ども達自身が認識するように、社会的差別である。
過剰体重または肥満の個体は、高血圧、異常脂質血症、２型（非インスリン依存性）糖尿病、インスリン抵抗性、グルコース不耐性、高インスリン血症、冠動脈心疾患、狭心症、うっ血性心不全、脳卒中、胆石、胆嚢炎、胆石症、通風、変形性関節症、閉塞性睡眠時無呼吸および呼吸困難、胆嚢疾患、特定の型の癌（例えば子宮内膜癌、乳癌、前立腺癌、および結腸癌）および精神障害（抑うつ、摂食障害、歪んだ身体イメージおよび低い自尊心など）などの病気のリスクが増加している。肥満は健康に負の影響をもたらすため、肥満は、米国において、予防可能な死亡のうち、２番目に多い原因となっており、そして社会に対して大きな経済的および心理社会的影響を与える。ＭｃＧｉｎｎｉｓ Ｍ， Ｆｏｅｇｅ ＷＨ．， “Ａｃｔｕａｌ Ｃａｕｓｅｓ ｏｆ Ｄｅａｔｈ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ，” ＪＡＭＡ ２７０：２２０７−１２， １９９３を参照されたい。
肥満は、現在、それに関連する健康上のリスクを減少させる治療を必要とする、慢性疾患として認識されている。体重減少は、重要な治療の所産であるが、肥満管理の主なゴールの１つは、心臓血管値および代謝値を改善して、肥満に関連する罹患率および死亡率を減少させることである。５〜１０％の体重減少は、血液グルコース、血圧、および脂質濃度などの代謝値を実質的に改善しうることが示されてきている。したがって、体重の５〜１０％の減少は、罹患率および死亡率を減少させうると考えられる。
肥満を管理するため、現在利用可能な処方薬剤は、一般的に、オーリスタットの場合のように、食餌脂肪吸収を減少させることによって、あるいはシブトラミンで見られるように、食物摂取を減少させることにより、そして／またはエネルギー消費を増加させることにより、エネルギー欠損を生成することによって、体重を減少させる。現在入手可能な抗肥満剤の代替物の検索には、いくつかの道が取られてきており、このうちの１つは、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）などの、飽満の調節に関連付けられてきている、特定の腸ペプチドに重点を置いてきている。
ＰＹＹは、ホルモンの膵臓ポリペプチド（ＰＰ）ファミリーのメンバーである（ＰＰおよびニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）とともに）。他のファミリーメンバーと同様、ＰＹＹは、Ｃ末端がアミド化された３６アミノ酸ペプチドである。該ペプチドは、腸管内分泌ペプチドであり、元来、ブタの腸から単離され（ＴａｔｅｍｏｔｏおよびＭｕｔｔ， Ｎａｔｕｒｅ ２８５：４１７−４１８， １９８０）そして続いて、末梢投与後、ラットにおいて、高脂肪食摂取を減少させ（Ｏｋａｄａら， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １８０， １９９３）、そして末梢投与後、マウスにおいて、体重減少を引き起こす（ＭｏｒｌｅｙおよびＦｌｏｏｄ， Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ４１：２１５７−２１６５， １９８７）と報告された。ＰＹＹの多数の貯蔵分子型および循環分子型が存在することが知られる（Ｃｈｅｎら， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８７：１３３２−１３３８， １９８４；およびＲｏｄｄｙら， Ｒｅｇｕｌ Ｐｅｐｔ １８：２０１−２１２， １９８７）。１つのこうした型、ＰＹＹ３−３６は、ヒト結腸粘膜抽出物から単離され（Ｅｂｅｒｌｅｉｎら， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ １０：７９７−８０３， １９８９）、そしてヒト食後血漿における主なＰＹＹの型であることが見出された（Ｇｒａｎｄｔら， Ｒｅｇｕｌ． Ｐｅｐｔ． ５１：１５１−１５９， １９９４）。ＰＹＹ３−３６は、高親和性ＮＰＹ Ｙ２受容体（Ｙ２Ｒ）選択的アゴニストであることが報告されている（Ｋｅｉｒｅら， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｇａｓｒｏｉｎｔｅｓｔ． Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２７９：Ｇ１２６−Ｇ１３１， ２０００）。ＰＹＹ３−３６を末梢投与すると、ラットでは食物摂取および体重増加が顕著に減少し、ヒトでは食欲および食物摂取が減少し、そしてマウスでは食物摂取が減少するが、Ｙ２Ｒヌルマウスでは減少しないことが報告されており、食物摂取効果がＹ２Ｒを必要とすることが示唆されると述べられた。ヒトの研究において、ＰＹＹ３−３６を注入すると、食欲が有意に減少し、そして食物摂取が２４時間に渡って３３％減少することが見出された。ＰＹＹ３−３６の通常の食後循環濃度まで該ペプチドを注入すると、１５分以内にＰＹＹ３−３６のピーク血清レベルに到達し、その後、３０分以内に基底レベルに迅速に減少した。ＰＹＹ３−３６注入後１２時間の期間には、食物摂取の有意な阻害があったが、１２時間〜２４時間の期間には、食物摂取に本質的に影響はなかった。ラットの研究において、ＰＹＹ３−３６をＩＰで反復投与すると（毎日２回７日間の注射）、累積食物摂取が減少した（Ｂａｔｔｅｒｈａｍら， Ｎａｔｕｒｅ ４１８：６５０−６５４， ２００２）。
ポリペプチドに基づく薬剤は、しばしば、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を延長させるため、ポリエチレングリコールなどのポリマーに共有結合される。しかし、これはしばしば、生物学的活性または薬理学的活性の大幅な損失を導く（Ｓｈｅｃｈｔｅｒら， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５７９：２４３９−２４４４， ２００５； ＦｕｅｒｔｅｇｅｓおよびＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉ， Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ １１：１３９−１４８， １９９０； Ｋａｔｒｅ， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ． Ｓｙｓ． １０：９１−１１４， １９９３； ＢａｉｌｏｎおよびＢｅｒｔｈｏｌｄ， Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． Ｔｅｃｈｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １：３５２−３５６， １９９６； Ｎｕｃｃｉら， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ． ６， １９９１； Ｄｅｌｇａｄｏ， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖ． Ｔｈｅｒ． Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ． ９：２４９−３０４， １９９２； Ｆｕｎｇら， Ｐｏｌｙｍ． Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ ３８：５６５−５６６， １９９７； Ｒｅｄｄｙ， Ａｎｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ． ３４：９１５−９２３， ２０００； Ｖｅｒｏｎｅｓｅ， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２２：４０５−４１７， ２００１）。例えば、Ｓｈｅｃｈｔｅｒら、上記は、安定な結合の形成を通じた標準的化学反応によるＰＹＹ３−３６の４０ｋＤ ＰＥＧ化（４０ｋＤ ＰＥＧ−ＰＹＹ３−３６）が、マウスを用いた食物摂取研究において、その完全な不活性化を導いたことを報告した。（ｓ．ｃ．注射）。しかし、彼らはまた、ＰＹＹ３−３６の可逆的ＰＥＧ化（４０ｋＤ ＰＥＧ−ＦＭＳ−ＰＹＹ３−３６）が、機能的半減期の８倍の増加を生じた（２４時間対３時間）こともまた報告した。ＰＣＴ特許出願第ＷＯ ２００４／０８９２７９号および第ＷＯ ０３／０２６５９１号もまた、参照されたい。
発明の概要
本発明は、ＰＹＹ３−３６の変異体であるＰＹＹアゴニストに関する。
本発明の１つの側面において、ＰＹＹアゴニストは、残基１０（グルタミン酸）または残基１１（アスパラギン酸）が、システイン、リジン、セリン、スレオニン、チロシン、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの親水性ポリマーとコンジュゲート化可能な官能性、例えばケト、チオール、ヒドロキシル、カルボキシル、または未結合（ｆｒｅｅ）アミノ官能性を有する非天然アミノ酸からなる群より選択されるアミノ酸「Ｘ」で置換されている、哺乳動物ＰＰＹ３−３６の変異体であり、こうした変異体は、それぞれ、（Ｅ１０Ｘ）ＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｘ）ＰＹＹ３−３６と名付けられる。
残基「Ｘ」は、好ましくはシステインであり、そしてしたがって対応する変異体は、（Ｅ１０Ｃ）ＰＹＹ３−３６および（Ｄ１１Ｃ）ＰＹＹ３−３６である。
本発明の好ましい態様において、ＰＹＹアゴニストは、ヒトＰＹＹ３−３６（ｈＰＹＹ３−３６）、イヌＰＹＹ３−３６、ネコＰＹＹ３−３６またはウマＰＹＹ３−３６であり、より好ましくはｈＰＹＹ３−３６である。
本発明の好ましい態様において、ＰＹＹアゴニストは、アミノ酸配列ＩＫＰＥＡＰＧＣＤＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬＶＴＲＱＲＹ−ＮＨ２［配列番号３］を有するポリペプチド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６、またはその薬学的に許容しうる塩である。
さらなる好ましい態様において、ＰＹＹアゴニストは、アミノ酸配列ＩＫＰＥＡＰＧＥＣＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬＶＴＲＱＲＹ−ＮＨ２［配列番号４］を有するポリペプチド（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６、またはその薬学的に許容しうる塩である。
最も好ましくは、アゴニストは、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６である。
本発明のＰＹＹアゴニストは、好ましくは、親水性ポリマー、好ましくはＰＥＧとコンジュゲート化される。アゴニストは、好ましくはモノＰＥＧ化され、すなわちＰＥＧに対するアゴニストの比は約１：１であり、ＰＥＧは、（Ｅ１０Ｘ）ＰＹＹ３−３６および（Ｄ１１Ｘ）ＰＹＹ３−３６中の「Ｘ」のケト、チオール、ヒドロキシル、カルボキシル、または未結合アミノ官能性などのコンジュゲート化可能官能性で付着している。ＰＥＧは、直鎖、分枝鎖、またはペンダントであってもよく；より好ましくは、直鎖または分枝鎖であり；最も好ましくは、直鎖である。
直鎖ＰＥＧにおいて、ＰＥＧの一方の末端は、ＰＥＧをアゴニストにカップリングする条件下で不活性な基、例えばエーテル基、好ましくはメトキシ基によってキャップ化されている。この方式で（メトキシ基で）末端処理されたＰＥＧは、一般的にｍＰＥＧと称される。他方の末端は、ＰＹＹアゴニストとのカップリングのために活性化されている。同様に、本発明で有用な分枝鎖ＰＥＧは、１つを除いてすべての末端がエーテル・キャップ化されており、そして非エーテル・キャップ化末端は、カップリングのために活性化されている。１つの態様において、（Ｅ１０Ｘ）ＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｘ）ＰＹＹ３−３６中のアミノ酸Ｘのコンジュゲート化可能な官能性と反応性である官能基にＰＥＧを連結するリンカー部分（「Ｌ」）で、ＰＥＧの非エーテル・キャップ化末端をキャップ化して、Ｘのコンジュゲート化可能な官能性に共有結合しているＰＥＧを有するコンジュゲートを産生する。さらなる態様において、ＰＥＧは、リンカー部分を包含せずに、直接、反応基に付着する。こうしたＰＥＧは、しばしば、「リンカーレス」ＰＥＧと呼ばれる。
（Ｅ１０Ｃ）ＰＹＹ３−３６および（Ｄ１１Ｃ）ＰＹＹ３−３６ポリペプチドに関しては、ＰＥＧの非エーテル・キャップ化末端は、好ましくは、システイン残基のチオールと反応するであろうマレイミドまたは他の基にＰＥＧを連結するリンカーに付着して、システイン・チオール基に共有結合したＰＥＧを有するコンジュゲートを産生する。
（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６とともに使用するのに適した反応性ＰＥＧには、式
Figure 2008528050
のＰＥＧが含まれる。
好ましくは、ＰＥＧは、リンカー部分−Ｌ−が含まれる、上に示すｍＰＥＧマレイミドである。リンカーレスＰＥＧマレイミドもまた、本発明で、特に、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ＰＹＹ３−３６とともに使用するのに適している。こうしたリンカーレスＰＥＧマレイミドは、ＧｏｏｄｓｏｎおよびＫａｔｒｅ， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：３４３−３４６， １９９０に記載されるように調製可能である。
（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ＰＹＹ３−３６ポリペプチドと、上に示すｍＰＥＧのカップリングから生じるコンジュゲートを、以下の式に示し、式中、−ＳＲは、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ＰＹＹ３−３６ポリペプチドであり、ここでＳはシステイン・チオール基のイオウ原子である：
Figure 2008528050
リンカー−Ｌ−は、単に、ＰＥＧを反応性官能基に連結するように働き、そしてしたがって、特に限定されるわけではないが、好ましくは、エステル結合、ウレタン結合、アミド結合、エーテル結合、カーボネート結合、または第２級アミノ基を含有するアルキレン基が含まれる。
好ましい態様において、特に直鎖ＰＥＧに関して、リンカーは、式
−Ｏ（ＣＨ２）ｐＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｒ−
の基であり、ここでｐは、１〜６の整数、好ましくは１〜３、より好ましくは２または３、最も好ましくは３であり、そしてｒは、１〜６の整数、好ましくは１〜３、より好ましくは２または３、最も好ましくは２である。
好ましいリンカーは、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２−基である。
別の好ましい態様において、特に分枝鎖ＰＥＧに関して、リンカーは、式
−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｓ−
の基であり、ここでｓは、１〜６の整数、好ましくは１〜３、より好ましくは２または３、最も好ましくは２である。
好ましいリンカーは、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２−基である。
ＰＥＧは、直鎖あるいは非直鎖、例えば分枝鎖またはペンダントであってもよい。好ましくは、ＰＥＧは直鎖または分枝鎖、好ましくは直鎖または分枝鎖ｍＰＥＧマレイミドである。グリセロール分枝鎖ｍＰＥＧマレイミドが、好ましい分枝鎖ＰＥＧである。好ましくは、ＰＥＧは直鎖ｍＰＥＧマレイミドである。ＰＥＧは、約１ｋＤ〜約５０ｋＤの範囲内の平均分子量を持たなければならない。好ましくは、平均分子量は、約５ｋＤ〜約４５ｋＤの範囲内；より好ましくは、約１０〜１２ｋＤから約４０〜４５ｋＤ、または約２０ｋＤから約４０〜４５ｋＤの範囲内である。特に関心が持たれるのは、式１に示すような、約２０または約３０ｋＤの平均分子量を有する直鎖ｍＰＥＧである。式２のグリセロール分枝ｍＰＥＧもまた関心が持たれ、そしてこれは、好ましくは約２０ｋＤまたは約４３ｋＤの平均分子量を有する。
（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ＰＹＹ３−３６のシステイン・チオール基とのコンジュゲート化のために適切に活性化されている、好ましいＰＥＧは、式１および２の化合物である。式１の直鎖ｍＰＥＧにおいて、ｎは、約１７５〜８００の範囲内の整数であり；好ましくは、約３７５〜５２５または約６００〜７５０、あるいは約４２５〜４７５または約６５０〜７００、あるいは約４３７〜４６３または６７５〜７００の範囲内の整数である。式２のグリセロール分枝鎖ｍＰＥＧにおいて、各ｍは、およそ同じであり、そして約１５０〜５００の範囲内の整数であり；好ましくは、約１６０〜２８５または約４００〜５２５、あるいは約２００〜２５０または４５０〜５００の範囲内の整数である。
Figure 2008528050
ペプチドアミノ酸側鎖におけるターゲット官能性、例えばケト、チオール、ヒドロキシル、カルボキシル、または未結合アミノ官能性とのコンジュゲート化のために適切に活性化されている、非常に多様なＰＥＧが、いくつかの供給者から、例えばＮＯＦ社、日本・東京、またはＮｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社、アラバマ州ハンツビルから商業的に入手可能である。
本発明の別の側面は、本ＰＹＹ３−３６変異体およびポリエチレングリコールのコンジュゲートに関する。
１つの態様において、コンジュゲートは、式３
Figure 2008528050
式中、ｍＰＥＧ部分は直鎖または分枝鎖であり、そして約１ｋＤ〜５０ｋＤ、好ましくは５ｋＤ〜約４５ｋＤ、より好ましくは約１０ｋＤまたは１２ｋＤ〜約４０または４５ｋＤ、あるいは約２０ｋＤ〜約４０ｋＤまたは４５ｋＤの範囲内の平均分子量を有し、
Ｌは、式
−Ｏ（ＣＨ２）ｐＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｒ−
の基であり、ここでｐは、１〜６の整数；好ましくは１〜３；より好ましくは２または３；最も好ましくは３であり；（以下の式４に示すとおり）；そしてｒは、１〜６の整数；好ましくは１〜３；より好ましくは２または３、最も好ましくは２であるか；
あるいはＬは、式
−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｓ−
の基であり、ここでｓは、１〜６の整数；好ましくは１〜３；より好ましくは２または３；最も好ましくは２である；そして
−ＳＲは、ポリペプチド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６であり、ここでＳはシステイン・チオール基のイオウ原子である
の化合物である。
本発明の好ましい態様は、式４
Figure 2008528050
式中、ｎは、約１７５〜８００の範囲内の整数であり；好ましくは、約３７５〜５２５または約６００〜７５０、あるいは約４３７〜４６３または約６７５〜７００の範囲内の整数であり；そして−ＳＲはポリペプチド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６であり、ここでＳはシステイン・チオール基のイオウ原子である
の直鎖ｍＰＥＧ−ＰＹＹ３−３６変異体コンジュゲート；あるいはその薬学的に許容しうる塩である。好ましくは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ部分は、約２０ｋＤまたは３０ｋＤの平均分子量を有する。−ＳＲがポリペプチド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６であるコンジュゲートに特に関心が持たれる。
本発明のさらなる側面は、ＰＥＧ部分が分枝鎖であるコンジュゲートに関する。このカテゴリーの好ましいコンジュゲートは、グリセロール分枝鎖ＰＥＧ部分を含む。特に興味深いのは、式５
Figure 2008528050
式中、各ｍはほぼ同じであり、そして約１５０〜５５０の範囲内の整数であり；好ましくは、約１６０〜２８５または約４００〜５２５、あるいは約２００〜２５０または約４５０〜５００の範囲内の整数であり、そして−ＳＲは（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ポリペプチドであり、ここでＳはシステイン・チオール基のイオウ原子である
のコンジュゲート；あるいはその薬学的に許容しうる塩である。好ましくは、各（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ部分は、約９〜１１ｋＤまたは約２０〜２２ｋＤの範囲内の平均分子量を有する。好ましくは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ部分を合わせた平均分子量は、約２０ｋＤまたは約４３ｋＤである。−ＳＲがポリペプチド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６であるコンジュゲートに特に関心が持たれる。
本発明はまた、配列番号３または配列番号４に示すようなアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体も提供する。本発明のこの側面の１つの態様において、ポリペプチドは、システイン残基でＰＥＧ化されている。
さらに、本発明は、本発明のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を提供し、好ましくは、これらは、配列番号３および配列番号４をコードする。
本発明の別の態様において、本発明のＰＹＹアゴニストおよび薬学的に許容しうるキャリアーを含む、薬剤組成物を提供する。さらなる態様において、組成物はまた、組成物の主な適応症または主な適応症の併存疾患の治療において有用な剤でありうる、少なくとも１つのさらなる薬学的剤も含む。さらなる薬学的剤は、好ましくは抗肥満剤である。組成物は、好ましくは、療法的有効量の本発明のＰＹＹアゴニスト、または療法的有効量の本発明のＰＹＹアゴニストおよびさらなる薬学的剤の組み合わせを含む。
やはり提供するのは、哺乳動物において、Ｙ２Ｒアゴニストによって調節される疾患、状態または障害を治療する方法であって、こうした治療が必要な哺乳動物に、療法的有効量の本発明のＰＹＹアゴニストを末梢投与することを含む、前記方法である。本発明のＰＹＹアゴニストは、単独で、あるいは疾患、状態もしくは障害、または疾患、状態もしくは障害の併存疾患の治療に有用な少なくとも１つのさらなる薬学的剤と組み合わせて使用可能である。哺乳動物において、Ｙ２Ｒアゴニストによって調節される疾患、状態、または障害には、肥満および過剰体重が含まれる。こうした疾患、状態、または障害の併存疾患は、こうした疾患、状態、または障害の治療によって、偶発的に改善する可能性が高い。さらに提供するのは、肥満の治療が必要な哺乳動物において、肥満を治療する方法であって、療法的有効量の本発明のＰＹＹアゴニストを哺乳動物に末梢投与することを含む、前記方法である。
やはり提供するのは、哺乳動物において、体重を減少させるかまたは体重損失を促進する（体重増加を予防するかまたは阻害することを含む）方法であって、体重を管理するかまたは体重を減少させる量の本発明のＰＹＹアゴニストを哺乳動物に末梢投与することを含む、前記方法である。
やはり提供するのは、哺乳動物において、食物摂取を減少させる方法であって、食物摂取を減少させる量の本発明のＰＹＹアゴニストを哺乳動物に末梢投与することを含む、前記方法である。
やはり提供するのは、哺乳動物において、飽満を誘導する方法であって、飽満を誘導する量の本発明のＰＹＹアゴニストを哺乳動物に末梢投与することを含む、前記方法である。
やはり提供するのは、哺乳動物において、カロリー摂取を減少させる方法であって、カロリー摂取を減少させる量の本発明のＰＹＹアゴニストを哺乳動物に末梢投与することを含む、前記方法である。ＰＹＹアゴニストを、単独で、または少なくとも１つのさらなる薬学的剤、好ましくは抗肥満剤と組み合わせて投与可能である。
本明細書および付随する請求項記載の方法各々において、ＰＹＹアゴニストを、単独で、または少なくとも１つのさらなる薬学的剤、好ましくは抗肥満剤と組み合わせて使用可能である。
本ＰＹＹアゴニストおよび該アゴニストを含有する組成物はまた、本明細書に言及する療法的適用のための薬剤製造にも有用である。
定義および略語
句「薬学的に許容しうる」は、物質または組成物が、配合物を構成する他の成分、および／または該配合物で治療されている哺乳動物と、化学的および／または毒物学的に適合していなければならないことを意味する。
用語「ＰＹＹアゴニスト」は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＰＹＹ、好ましくはＰＹＹ３−３６によって誘発される効果の１以上を誘発する、任意の化合物を意味する。
句「療法的有効量」は、治療前にまたはビヒクル治療群において決定された適切な対照値に対して、カロリー摂取を減少させ、体重を減少させ、そして／または体脂肪を減少させる、本発明のＰＹＹアゴニストの量を意味する。
用語「哺乳動物」は、ヒト、ならびに哺乳動物綱中のホメオスタシス機構を所持する動物界の他の温血動物メンバーすべて、例えば、コンパニオン哺乳動物、動物園の哺乳動物および食料源哺乳動物を意味する。コンパニオン哺乳動物のいくつかの例は、イヌ科動物（例えばイヌ）、ネコ科動物（例えばネコ）およびウマであり；食料源哺乳動物のいくつかの例は、ブタ、ウシ、ヒツジ等である。好ましくは、哺乳動物は、ヒトまたはコンパニオン哺乳動物である。最も好ましくは、哺乳動物は、男性または女性のヒトである。
用語「治療すること」、「治療する」、または「治療」は、防止的、すなわち予防的および緩和的治療の両方を含む。
用語「末梢投与」は、中枢神経系外部の投与を意味する。末梢投与には、脳への直接投与は含まれない。末梢投与には、限定されるわけではないが、静脈内、筋内、皮下、吸入、経口、舌下、溶腸、直腸、経皮、または鼻内投与が含まれる。
本発明で使用するのに適した非天然アミノ酸は、典型的には、２０の天然存在アミノ酸以外の、以下の式を有する任意のアミノ酸であり（ＣａｎｔｏｒおよびＳｈｉｍｍｅｌ， Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｐａｒｔ １， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｓｏｎｓ， サンフランシスコ， ４２−４３， １９８０）、式中、Ｒ１は、ケト、チオール、カルボキシル、ヒドロキシル、または本明細書にその全体が援用される米国特許公報第２００５／０２０８５３６号に開示されるものなどの未結合アミノ官能性を含む、任意の置換基である。
Figure 2008528050
こうした非天然アミノ酸には、例えば、チオチロシン、オルニチン、３−メルカプトフェニルアラニン、３−または４−アミノフェニルアラニン、３−または４−アセチルフェニルアラニン、２−または３−ヒドロキシフェニルアラニン（ｏ−またはｍ−チロシン）、ヒドロキシメチルグリシン、アミノエチルグリシン、１−メチル−１−メルカプトエチルグリシン、アミノエチルチオエチルグリシンおよびメルカプトエチルグリシンが含まれる。本発明で有用な非天然アミノ酸の多くは、商業的に入手可能である。他のものは、当該技術分野に知られる方法によって調製可能である。例えば、チオチロシンは、本明細書に援用される、Ｌｕら， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１９：７１７３−７１８０， １９９７に記載される方法によって調製可能である。
用語「ヒトＰＹＹ」または「ｈＰＹＹ」は、以下のアミノ酸配列：
ＹＰＩＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬＶＴＲＱＲＹ−ＮＨ２ ［配列番号１］
を有する３６アミノ酸のＣ末端アミド化ポリペプチドを意味する。
用語「ｈＰＹＹ３−３６」は、以下のアミノ酸配列：
ＩＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬＶＴＲＱＲＹ−ＮＨ２ ［配列番号２］
を有するＣ末端３４量体ｈＰＹＹを意味する。
用語「（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６」は、ｈＰＹＹの残基１０のグルタミン酸がシステイン残基で置換されており、そして以下のアミノ酸配列：
ＩＫＰＥＡＰＧＣＤＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬＶＴＲＱＲＹ−ＮＨ２ ［配列番号３］
を有する、Ｃ末端３４量体ｈＰＹＹを意味する。
用語「（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６」は、ｈＰＹＹの残基１１のアスパラギン酸がシステイン残基で置換されており、そして以下のアミノ酸配列：
ＩＫＰＥＡＰＧＥＣＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬＶＴＲＱＲＹ−ＮＨ２ ［配列番号４］
を有する、Ｃ末端３４量体ｈＰＹＹを意味する。
発明の詳細な説明
本発明は、ＰＹＹ３−３６の変異体およびそのＰＥＧ化コンジュゲートであるＰＹＹアゴニストであって、限定されるわけではないが、クリアランス速度の減少、血漿存在期間の増加、ｉｎ ｖｉｖｏ活性の延長、強度の増加、安定性の増加、可溶性の改善、および抗原性の減少から選択される、少なくとも１つの改善された化学的または生理学的特性を有しうる、前記ＰＹＹアゴニストに関する。
本発明の好ましいＰＹＹ３−３６変異体は、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６である。別の好ましい変異体は、（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６である。本発明のこれらおよび他の変異体を、以下にそして本明細書中の実施例に記載するように、合成的に、そして組換えおよび他の手段によって、または類似の方法によって、産生してもよい。
上に列挙する置換（例えばＥ１０ＣおよびＤ１１Ｃ）に加えて、本発明のＰＹＹアゴニストにはまた、他のアミノ酸位での１以上の保存的アミノ酸置換もまた含まれてもよい。例えば、以下の表にしたがって、保存的置換を行ってもよい。脂肪族非極性、極性非荷電、および極性荷電アミノ酸を、それぞれ、非極性、極性非荷電、または極性荷電アミノ酸である別の脂肪族アミノ酸に対して置換してもよい。好ましくは、こうした置換は、以下の表の第３列の同じ行のアミノ酸間で起こる。保存的アミノ酸置換はまた、以下の表に列挙するような芳香族アミノ酸間で行われてもよい。
Figure 2008528050
合成的産生
当該技術分野で知られる標準的ペプチド合成技術を用いて、例えばｔＢｏｃまたはＦｍｏｃ化学を用い、自動的ペプチド合成装置（例えばモデル４３３Ａ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて行われる固相ペプチド合成によって、本発明のＰＹＹ３−３６変異体、例えば（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６および（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６を調製してもよい。利用可能な多くのペプチド合成技術の要約は、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ 第２版（Ｓｔｅｗａｒｔ， Ｊ．Ｍ．およびＹｏｕｎｇ， Ｊ．Ｄ．， Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ， イリノイ州ロックフォード， １９８４）に見出されうる。また、書籍、Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｂｕｒｇｅｓｓ， Ｋ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ニューヨーク州ニューヨーク， ２０００）および文献、Ｅｎｇｅｌｓら， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔｌ． Ｅｄ． ２８：７１６−３４， １９８９もまた参照されたい。上記参考文献はすべて、本明細書に援用される。
好ましくは、本発明のＰＹＹ３−３６変異体をＰＥＧとコンジュゲート化する。ＰＥＧ化反応と呼ばれるコンジュゲート化反応は、歴史的に、ポリマーのモル過剰で、そしてポリマーがタンパク質に付着する場所にかかわらず、溶液中で行われた。しかし、こうした一般的技術は、典型的には、十分な生物活性を保持しながら、非抗原性ポリマーに生物活性タンパク質をコンジュゲート化するのに不適切であることが立証されてきている。ＰＥＧ化後、ＰＹＹ３−３６アゴニスト変異体の生物活性を維持する１つの方法は、カップリング・プロセスにおいて、ターゲット受容体へのアゴニストの結合と関連する、変異体のいかなる反応性の基のコンジュゲート化も実質的に回避することである。本発明の側面は、高レベルの活性を保持するため、受容体結合部位（単数または複数）に実質的に干渉しない、特定の反応性部位で、本発明のＰＹＹ３−３６変異体アゴニストにポリエチレングリコールをコンジュゲート化するプロセスを提供することである。本発明の別の側面は、ＰＹＹ３−３６内に反応性残基を挿入して、活性改変が限られている、ポリエチレングリコールとのコンジュゲート化用のアゴニスト変異体を提供することである。
活性化されたＰＥＧと生物学的活性物質のコンジュゲート化反応において、一般的に採用されるいかなる適切な条件下で、共有結合を通じた化学修飾を行ってもよい。比較的穏やかな条件下で、コンジュゲート化反応を行って、ＰＹＹ３−３６変異体アゴニストの不活性化を回避する。穏やかな条件には、約３〜１０の範囲内の反応溶液のｐＨ、および約０℃〜４０℃の範囲内の反応温度を維持することが含まれる。ＰＥＧ化条件下で、活性化されたＰＥＧと反応性であるＰＹＹ３−３６変異体中の非ターゲット官能性は、好ましくは、ターゲット官能性でのＰＥＧ化後に除去可能な適切な保護基で保護される。ＰＥＧアルデヒドまたはＰＥＧスクシンイミドなどの試薬を用いた未結合アミノ基のＰＥＧ化において、約３〜１０、好ましくは約４〜７．５の範囲内のｐＨが、典型的には維持される。好ましくは、適切な緩衝液（ｐＨ３〜１０）、例えば、リン酸、ＭＥＳ、クエン酸、酢酸、コハク酸またはＨＥＰＥＳ緩衝液中、約４℃〜４０℃の範囲内の温度で、約１〜４８時間、カップリング反応を行う。ＰＥＧマレイミド、ＰＥＧビニルスルホンまたはＰＥＧオルトピリジルジスルフィドなどの試薬を用いて、チオール基をＰＥＧ化する際、好ましくは、約４〜８の範囲内のｐＨが維持される。ＰＥＧアミンは、例えばｐ−アセチルフェニルアラニンにおける、ケト基のＰＥＧ化の際に有用であり、そしてＰｉｌｌａｉら， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ４５：５３６４−５３７０， １９８０に記載されるように調製可能である。
本発明のコンジュゲート化反応は、典型的には、所望のモノＰＥＧ化ＰＹＹ３−３６変異体ならびに反応していないＰＹＹ３−３６変異体ペプチド、反応していないＰＥＧを含有し、そして通常は高分子量種を約２０％未満含有し、これには、１より多いＰＥＧ鎖および／または凝集した種を含有するコンジュゲートが含まれていてもよい。反応していない種および高分子量種を取り除いた後、主としてモノＰＥＧ化されたＰＹＹ３−３６変異体を含有する組成物を回収する。コンジュゲートにはしばしば単一ポリマー鎖が含まれることを考慮すると、コンジュゲートは実質的に均質である。
透析、塩析、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ゲルクロマトグラフィーおよび電気泳動などの、タンパク質精製に典型的に用いられる慣用法によって、反応混合物から、所望のＰＥＧ−ＰＹＹ３−３６変異体コンジュゲートを精製してもよい。反応していないＰＥＧまたは反応していないＰＹＹ３−３６変異体のいずれを取り除く際でも、イオン交換クロマトグラフィーが特に有効である。脱アミド化を回避するため、約４〜約１０、好ましくは８未満のｐＨを有する緩衝溶液中に、混合された種を含有する反応混合物を入れることによって、所望のＰＥＧ−変異体コンジュゲートの分離を達成してもよい。緩衝溶液は、好ましくは、限定されるわけではないが、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４、ＮａＨＣＯ３、ＮａＢＯ４およびＣＨ３ＣＯ２Ｎａから選択される１以上の緩衝塩を含有する。
ＰＥＧ化反応で用いられる緩衝系が分離プロセスで用いられるものと異なる場合、ＰＥＧ化反応混合物を緩衝剤交換／ダイアフィルトレーションに供するか、または十分な量の初期分離緩衝液で希釈する。
好ましくは、イオン交換クロマトグラフィー媒体を用いてコンジュゲートを分画して、所望の種を含有するプールにする。こうした媒体は、幾分予測可能な方式で変化する、荷電の相違を介して、ＰＥＧ−ＰＹＹ３−３６変異体コンジュゲートに選択的に結合可能である。例えば、ＰＥＧの存在によって損なわれないカラム支持体との相互作用のために利用可能な、ペプチド表面上の利用可能な荷電基の数によって、ＰＹＹ３−３６変異体の表面荷電が決定される。これらの荷電基は、典型的には、ＰＥＧポリマーの潜在的付着点として働く。したがって、ＰＥＧ−ＰＹＹ３−３６変異体コンジュゲートは、存在する他の種とは異なる荷電を有し、選択的単離が可能になるであろう。
イオン交換樹脂は、本発明のＰＥＧ−ＰＹＹ３−３６変異体コンジュゲートの精製に特に好ましい。本発明の精製法において、スルホプロピル樹脂などの陽イオン交換樹脂を用いる。本発明とともに用いるのに適している、陽イオン交換樹脂の限定されないリストには、ＳＰ−ｈｉｔｒａｐ（登録商標）、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（登録商標）およびＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ファーストフローが含まれる。他の適切な陽イオン交換樹脂、例えばＳおよびＣＭ樹脂もまた、使用可能である。
好ましくは、陽イオン交換樹脂をカラム内に充填し、そして慣用的手段によって平衡化する。ＰＥＧコンジュゲート化ＰＹＹ３−３６変異体の溶液と同じｐＨおよび浸透圧を有する緩衝液を用いる。溶出緩衝液は、好ましくは、限定されるわけではないが、ＣＨ３ＣＯ２Ｎａ、ＨＥＰＥＳ、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４、ＮａＨＣＯ３、ＮａＢＯ４、および（ＮＨ４）２ＣＯ３から選択される１以上の塩を含有する。次いで、コンジュゲート含有溶液をカラム上に吸着させると、未反応ＰＥＧおよびいくつかの高分子量種は保持されない。装填完了後、塩濃度を増加させる溶出緩衝液の勾配フローをカラムに適用して、ＰＥＧコンジュゲート化ＰＹＹ３−３６変異体の所望の分画を溶出させる。溶出され、プールされる分画は、好ましくは、陽イオン交換分離工程後の均質なポリマーコンジュゲートに限られる。次いで、慣用的技術によって、コンジュゲート化されていないＰＹＹ３−３６変異体種をカラムから洗浄してもよい。所望の場合、モノＰＥＧ化および多ＰＥＧ化ＰＹＹ３−３６変異体種ならびにより高分子量の種を、さらなるイオン交換クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーを介して、互いに、さらに分離してもよい。
直線勾配の代わりに、濃度が増加する多重アイソクラチック工程を利用する技術を用いてもよい。濃度が増加する多重アイソクラチック溶出工程は、多重ＰＥＧ化／凝集コンジュゲートの連続溶出、および次いでモノＰＥＧ化ＰＹＹ３−３６変異体コンジュゲートを生じるであろう。ｐＨ勾配に基づく溶出技術もまた、使用可能である。溶出の温度範囲は、一般的に、約４℃〜約２５℃の間である。２８０ｎｍのＵＶ吸光によって、ＰＥＧ−ＰＹＹ３−３６変異体の溶出を監視する。単純な時間溶出プロフィールを通じて、分画収集を達成してもよい。
組換え発現
核酸分子
（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ポリペプチドをコードする核酸分子は、以下の核酸配列の１つを含んでもよい（Ｅ１０Ｃ置換のためのコドン突然変異を下線で示す）：
ａｔｃａａａｃｃｃｇａｇｇｃｔｃｃｃｇｇｃｔｇｔｇａｃｇｃｃｔｃｇｃｃｇｇａｇｇａｇｃｔｇａａｃｃｇｃｔａｃｔａｃｇｃｃｔｃｃｃｔｇｃｇｃｃａｃｔａｃｃｔｃａａｃｃｔｇｇｔｃａｃｃｃｇｇｃａｇｃｇｇｔａｔ（配列番号５）；または
ａｔｃａａａｃｃｃｇａｇｇｃｔｃｃｃｇｇｃｔｇｃｇａｃｇｃｃｔｃｇｃｃｇｇａｇｇａｇｃｔｇａａｃｃｇｃｔａｃｔａｃｇｃｃｔｃｃｃｔｇｃｇｃｃａｃｔａｃｃｔｃａａｃｃｔｇｇｔｃａｃｃｃｇｇｃａｇｃｇｇｔａｔ（配列番号６）。
（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ポリペプチドをコードする核酸分子は、以下の核酸配列の１つを含んでもよい（Ｄ１１Ｃ置換のためのコドン突然変異を下線で示す）：
ａｔｃａａａｃｃｃｇａｇｇｃｔｃｃｃｇｇｃｇａａｔｇｔｇｃｃｔｃｇｃｃｇｇａｇｇａｇｃｔｇａａｃｃｇｃｔａｃｔａｃｇｃｃｔｃｃｃｔｇｃｇｃｃａｃｔａｃｃｔｃａａｃｃｔｇｇｔｃａｃｃｃｇｇｃａｇｃｇｇｔａｔ（配列番号７）；または
ａｔｃａａａｃｃｃｇａｇｇｃｔｃｃｃｇｇｃｇａａｔｇｃｇｃｃｔｃｇｃｃｇｇａｇｇａｇｃｔｇａａｃｃｇｃｔａｃｔａｃｇｃｃｔｃｃｃｔｇｃｇｃｃａｃｔａｃｃｔｃａａｃｃｔｇｇｔｃａｃｃｃｇｇｃａｇｃｇｇｔａｔ（配列番号８）。
これらの配列にはまた、Ｃ末端に停止コドン（例えばｔｇａ、ｔａａ、ｔａｇ）も含まれてもよいし、そして限定なしに、化学的合成、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリースクリーニングから得られる野生型ｈＰＹＹポリヌクレオチド配列の遺伝子突然変異、発現ライブラリースクリーニング、および／またはｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を含む多様な方法で、これらの配列を容易に得ることも可能である。プライマー（単数または複数）が望ましい点突然変異を有する、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ増幅、または他の適切な方法を用いて、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６および（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６変異体をコードする核酸分子を産生してもよい。本明細書記載の組換えＤＮＡ法および突然変異誘発法は、一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９）およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら監修， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ．およびＷｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ １９９４）に示されるものである。別の非天然存在アミノ酸が、Ｅ１０またはＤ１１を置換することが望ましい場合、例えば、本明細書に援用される米国特許出願公報第２００５／０２０８５３６号に開示されるような方法を用いて、こうしたペプチドを組換え的に発現してもよい。
発現されたタンパク質の特性に基づく陽性クローンの検出を使用する発現クローニングによって、ｈＰＹＹのアミノ酸配列をコードする核酸ポリヌクレオチドを同定してもよい。典型的には、宿主細胞表面上に発現され、そしてディスプレイされる、クローニングされたタンパク質に対する、抗体または他の結合性パートナー（例えば受容体またはリガンド）の結合によって核酸ライブラリーをスクリーニングする。抗体または結合性パートナーを検出可能標識で修飾して、所望のクローンを発現している細胞を同定する。
以下に示す説明にしたがって行う組換え発現技術にしたがって、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６および（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６をコードするポリヌクレオチドを産生して、そしてコードされるポリペプチドを発現してもよい。例えば、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６変異体のアミノ酸配列をコードする核酸配列を、適切なベクター内に挿入することによって、当業者は、容易に、所望のヌクレオチド配列を多量に産生可能である。次いで、該配列を用いて、検出プローブまたは増幅プライマーを生成してもよい。あるいは、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを、発現ベクターに挿入してもよい。発現ベクターを適切な宿主に導入することによって、コードされる（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６変異体を多量に産生可能である。
適切な核酸配列を得るための別な方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。この方法において、酵素、逆転写酵素を用いて、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡまたは総ＲＮＡから、ｃＤＮＡを調製する。次いで、典型的には、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６変異体のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの２つの離れた領域に相補的である、２つのプライマーを、Ｔａｑポリメラーゼなどのポリメラーゼと一緒に、ｃＤＮＡに添加し、そして該ポリメラーゼが２つのプライマー間のｃＤＮＡ領域を増幅する。
（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６変異体のアミノ酸配列をコードする核酸分子を調製する別の手段は、Ｅｎｇｅｌｓら， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔｌ． Ｅｄ． ２８：７１６−３４， １９８９に記載されるものなど、当業者に周知の方法を用いた化学合成である。これらの方法には、核酸合成のための、ホスホトリエステル法、ホスホロアミダイト法、およびＨ−ホスホネート法が含まれる。こうした化学合成のための好ましい方法は、標準的ホスホロアミダイト化学を用いた、ポリマーが補助する合成である。典型的には、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６のアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、長さ約１００ヌクレオチドであろう。約１００ヌクレオチドより大きい核酸を、これらの方法を用いて、いくつかの断片として合成可能である。次いで、断片を一緒に連結して、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６遺伝子の全長ヌクレオチド配列を形成してもよい。
ポリペプチドのアミノ末端をコードするＤＮＡ断片は、ＡＴＧを有してもよく、ＡＴＧはメチオニン残基をコードする。このメチオニンは、宿主細胞において産生されるポリペプチドが、その細胞から分泌されるように設計されているかどうかに応じて、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（ＤＩＩＣ）ＬＰ４４３−３６の成熟型上に存在しても、またはしなくてもよい。イソロイシンをコードするコドンもまた、出発部位として使用可能である。当業者に知られる他の方法もまた、使用可能である。特定の態様において、所定の宿主細胞において、核酸変異体は、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６の最適な発現のために改変されているコドンを含有する。特定のコドン改変は、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６、および発現のために選択した宿主細胞に応じるであろう。多様な方法によって、例えば、所定の宿主細胞において、高発現される遺伝子で使用が好まれるコドンを選択することによって、こうした「コドン最適化」を行ってもよい。高発現される細菌遺伝子のコドン優先性に関する、「Ｅｃｏ＿ｈｉｇｈ．Ｃｏｄ」などのコドン頻度表を取り込むコンピュータアルゴリズムが使用可能であり、そしてこうしたアルゴリズムは、ウィスコンシン大学パッケージ、バージョン９．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、ウィスコンシン州マディソン）によって提供される。他の有用なコドン頻度表には、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｌｏｗ．ｃｏｄ」、「Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｈｕｍａｎ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｍａｉｚｅ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、および「Ｙｅａｓｔ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」が含まれる。
ベクターおよび宿主細胞
標準的連結技術を用いて、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６のアミノ酸配列をコードする核酸分子を、適切な発現ベクター内に挿入する。典型的には、使用する特定の宿主細胞において機能するように、ベクターを選択する（すなわち、遺伝子の増幅および／または遺伝子の発現が起こりうるように、ベクターが宿主細胞機構と適合する）。（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６のアミノ酸配列をコードする核酸分子を、原核、酵母、昆虫（バキュロウイルス系）および／または真核宿主細胞において、増幅／発現してもよい。発現ベクターの概説に関しては、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ．， ｖｏｌ． １８５（Ｄ． Ｖ． Ｇｏｅｄｄｅｌ監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９０）を参照されたい。
典型的には、いかなる宿主細胞で用いられる発現ベクターも、プラスミドを維持するための配列、ならびに外因性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を含有するであろう。こうした配列は、特定の態様において、集合的に「隣接配列」と呼ばれ、典型的には、以下のヌクレオチド配列：プロモーター、１以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナーおよびアクセプター・スプライス部位を含有する完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現しようとするポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択可能マーカー要素の１以上を含むであろう。これらの配列各々を以下に論じる。
場合によって、ベクターは、「タグ」コード配列；すなわち（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６コード配列の５’端または３’端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含有してもよく；オリゴヌクレオチド配列は、ポリＨｉｓ（ヘキサＨｉｓなど）、あるいは商業的に入手可能な抗体が存在する、ＦＬＡＧ、ＨＡ（インフルエンザウイルス赤血球凝集素）、またはｍｙｃなどの別の「タグ」をコードする。典型的には、ポリペプチドの発現に際して、このタグをポリペプチドに融合し、そしてこのタグは、宿主細胞からの（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６のアフィニティー精製のための手段として働きうる。例えば、アフィニティーマトリックスとして、タグに対する抗体を用いるカラム・クロマトグラフィーによって、アフィニティー精製を達成してもよい。場合によって、続いて、切断のための特定のペプチダーゼ、例えば配列番号３〜４に示すようなアミノ酸配列の１つの上流であるＦＬＡＧタグ配列の３’のエンテロキナーゼ消化を用いるなどの多様な手段によって、精製（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６から、タグを除去してもよい。
隣接配列は同種（すなわち、宿主細胞と同じ種および／または株由来）、異種（すなわち宿主細胞種または株以外の種由来）、ハイブリッド（すなわち１より多い供給源由来の隣接配列の組み合わせ）、または合成であってもよいし、あるいは隣接配列は、通常、ｈＰＹＹ３−３６発現を制御するように機能する天然配列であってもよい。隣接配列供給源は、隣接配列が宿主細胞機構において機能し、そして該機構によって活性化可能である限り、いかなる原核または真核生物、いかなる脊椎または無脊椎生物、またはいかなる植物であってもよい。
当該技術分野に周知のいくつかの方法のいずれかによって、有用な隣接配列を得てもよい。典型的には、ＰＹＹ遺伝子隣接配列以外の、本明細書で有用な隣接配列は、マッピングによって、そして／または制限エンドヌクレアーゼ消化によって、先に同定されてきているであろうし、そしてしたがって、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて、適切な組織供給源から単離可能である。いくつかの場合、隣接配列の全長ヌクレオチド配列が既知でありうる。この場合、核酸合成またはクローニングのため、本明細書記載の方法を用いて、隣接配列を合成してもよい。
隣接配列のすべてまたは一部のみが既知である場合、ＰＣＲを用いて、そして／または適切なオリゴヌクレオチドおよび／または同じ種もしくは別の種の隣接配列断片でゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、隣接配列を得てもよい。隣接配列が未知である場合、例えばコード配列または別の単数もしくは複数の遺伝子さえ含有してもよい、ＤＮＡのより大きいピースから、隣接配列を含有するＤＮＡ断片を単離してもよい。制限エンドヌクレアーゼ消化で、適切なＤＮＡ断片を産生して、その後、アガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラム・クロマトグラフィー（カリフォルニア州チャツワース）、または当業者に知られる他の方法を用いた単離によって単離を達成してもよい。この目的を達成するのに適した酵素の選択は、当業者には容易に明らかであろう。
複製起点は、典型的には、商業的に購入した原核発現ベクターの一部であり、そして起点は、宿主細胞におけるベクターの増幅を援助する。ベクターの特定のコピー数への増幅は、いくつかの場合、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６の最適な発現に重要でありうる。選択したベクターが、複製起点部位を含有しない場合、既知の配列に基づいて化学的に合成し、そしてベクター内に連結してもよい。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ビバリー）由来の複製起点は、大部分のグラム陰性細菌に適しており、そして哺乳動物細胞におけるクローニングベクターには、多様な起点（例えばＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、またはＨＰＶもしくはＢＰＶなどのパピローマウイルス）が有用である。一般的に、複製起点構成要素は、哺乳動物発現ベクターには必要ではない（例えば、ＳＶ４０起点は、しばしば、ただ、初期プロモーターを含有するために用いられる）。
転写終結配列は、典型的には、ポリペプチドコード領域の３’端に位置し、そして転写を終結させるように働く。通常、原核細胞における転写終結配列は、Ｇ−Ｃリッチ断片に続いて、ポリＴ配列である。配列はライブラリーから容易にクローニングされるか、またはベクターの一部として商業的に購入されさえするが、また、本明細書記載のものなどの核酸合成法を用いて、容易に合成可能でもある。
選択可能マーカー遺伝子要素は、選択培地中で増殖する宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えばアンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシンに対する耐性を、原核宿主細胞に与えるか；（ｂ）細胞の栄養要求欠損を補完するか；あるいは（ｃ）複合培地から入手可能でない必須栄養素を供給する、タンパク質をコードする。好ましい選択可能マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびテトラサイクリン耐性遺伝子である。原核および真核宿主細胞における選択のため、ネオマイシン耐性遺伝子もまた使用可能である。
他の選択遺伝子を用いて、発現しようとする遺伝子を増幅してもよい。増幅は、増殖に必須のタンパク質の産生のためにより大きい需要がある遺伝子が、組換え細胞の続く世代の染色体内でタンデムに反復されるプロセスである。哺乳動物細胞に適した選択可能マーカーの例には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびチミジンキナーゼが含まれる。哺乳動物細胞形質転換体を選択圧下に置き、この選択圧下では、ベクターに存在する選択遺伝子のおかげで、形質転換体のみが生存するようユニークに適応している。培地中の選択剤の濃度が連続して変化する条件下で形質転換細胞を培養することによって、選択圧を課し、それによって、選択遺伝子、および（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６をコードするＤＮＡの両方の増幅を導く。その結果、増幅されたＤＮＡから、増加した量の（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６が合成される。
リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、そしてシャイン−ダルガノ配列（原核生物）またはコザック配列（真核生物）によって特徴付けられる。この要素は、典型的にはプロモーターの３’に、そして発現しようとする（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６のコード配列の５’に位置する。シャイン−ダルガノ配列は、多様であるが、典型的にはポリプリン（すなわちＡ−Ｇを高含量で有する）である。多くのシャイン−ダルガノ配列が同定されてきており、その各々が、本明細書に示す方法を用いて容易に合成可能であり、そして原核ベクター中で使用可能である。
リーダー配列、またはシグナル配列を用いて、宿主細胞外に（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６を導くことも可能である。典型的には、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列を、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６核酸分子のコード領域内に配置するか、あるいは（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６コード領域の５’端に直接配置する。多くのシグナル配列が同定されてきており、そして選択した宿主細胞で機能するもののいずれを、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６核酸分子と組み合わせて使用してもよい。したがって、シグナル配列は、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６核酸分子に対して同種（天然存在）であってもまたは異種であってもよい。さらに、本明細書記載の方法を用いて、シグナル配列を化学的に合成してもよい。大部分の場合、シグナルペプチドの存在を介した、宿主細胞からの（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６の分泌は、分泌された（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６からのシグナルペプチドの除去を生じるであろう。シグナル配列は、ベクターの構成要素であってもよいし、あるいはベクターに挿入された（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６核酸分子の一部であってもよい。
天然ｈＰＹＹ３−３６シグナル配列をコードするヌクレオチド配列を、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６コード領域に連結するか、あるいは異種シグナル配列をコードするヌクレオチド配列を、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６コード領域に連結してもよい。選択する異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識され、そしてプロセシングされる、すなわちシグナルペプチダーゼによって切断されるものでなければならない。天然ｈＰＹＹシグナル配列を認識せず、そしてプロセシングしない原核宿主細胞の場合は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、または熱安定性内毒素ＩＩリーダーの群から選択した原核シグナル配列によって、シグナル配列を置換する。酵素分泌の場合、酵素インベルターゼ、アルファ因子、または酸ホスファターゼ・リーダーによって、天然ｈＰＹＹシグナル配列を置換してもよい。哺乳動物細胞発現においては、天然シグナル配列で十分であるが、他の哺乳動物シグナル配列が適切でありうる。
多くの場合、核酸分子の転写は、ベクター中の１以上のイントロンの存在によって増加し；これは、真核宿主細胞、特に哺乳動物宿主細胞でポリペプチドを産生する場合、特に当てはまる。用いるイントロンは、用いる遺伝子が全長ゲノム配列またはその断片である場合は特に、ｈＰＹＹ遺伝子内に天然に存在するものであってもよい。（大部分のｃＤＮＡの場合のように）イントロンが遺伝子内に天然に存在しない場合、イントロンを別の供給源から得てもよい。イントロンは有効であるためには転写されなければならないため、一般的に、隣接配列およびｈＰＹＹ遺伝子に対するイントロンの位置が重要である。したがって、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６をコードするｃＤＮＡ分子が転写される際、イントロンの好ましい位置は、転写開始部位の３’であり、そしてポリＡ転写終結配列の５’である。好ましくは、単数または複数のイントロンは、イントロンがコード配列を中断しないように、ｃＤＮＡの一方の側または他方の側（すなわち５’または３’）に位置するであろう。挿入しようとする宿主細胞に適合するという条件で、ウイルス、原核および真核（植物または動物）生物を含む、いかなる供給源由来のいかなるイントロンを用いてもよい。本明細書にやはり含まれるのは合成イントロンである。場合によって、ベクター中で、１より多いイントロンを用いてもよい。
発現およびクローニングベクターは、典型的には、宿主生物によって認識され、そして（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６をコードする分子に機能可能であるように連結されたプロモーターを含有するであろう。プロモーターは、構造遺伝子（一般的に約１００〜１０００ｂｐ以内）の開始コドンの上流（すなわち５’）に位置する転写されない配列であり、構造遺伝子の転写を制御する。プロモーターは、慣用的には、２つの種類：誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターの一方に分類される。誘導性プロモーターは、栄養素の存在または非存在、あるいは温度の変化などの培養条件の何らかの変化に応じて、制御下にあるＤＮＡからの転写レベル増加を開始する。一方、構成的プロモーターは、継続的な遺伝子産物産生を開始し；すなわち遺伝子発現に対してはほとんどまたはまったく制御がない。多様な潜在的宿主細胞によって認識される、多数のプロモーターが周知である。制限酵素消化によって供給源ＤＮＡからプロモーターを除去し、そしてベクター内に所望のプロモーター配列を挿入することによって、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６をコードするＤＮＡに、適切なプロモーターを機能可能であるように連結する。天然ｈＰＹＹ３−３６プロモーター配列を用いて、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６核酸分子の増幅および／または発現を指示してもよい。しかし、異種プロモーターが、天然プロモーターに比較して、より多い転写を可能にし、そしてより高収率の発現タンパク質を可能にするならば、そして使用のために選択されている宿主細胞系と適合するならば、異種プロモーターが好ましい。
原核宿主での使用に適したプロモーターには、ベータ−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系；大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）Ｔ７誘導性ＲＮＡポリメラーゼ；アルカリホスファターゼ；トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系；およびｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが含まれる。他の既知の細菌プロモーターもまた適切である。それらの配列は公開されており、そのため、必要に応じて、リンカーまたはアダプターを用いて任意の有用な制限部位を供給し、当業者がこれらの配列を連結して所望のＤＮＡ配列にすることが可能である。
酵母宿主で使用するのに適したプロモーターもまた、当該技術分野に周知である。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターとともに好適に用いられる。哺乳動物宿主細胞で使用するのに適したプロモーターが周知であり、そしてこれらには、限定されるわけではないが、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシ・パピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはサルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られるものが含まれる。他の適切な哺乳動物プロモーターには、異種哺乳動物プロモーター、例えば熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーターが含まれる。
（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６の発現を制御する際に関心が持たれうる、さらなるプロモーターには、限定されるわけではないが：ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｍｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−１０， １９８１）；ＣＭＶプロモーター；ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復配列に含有されるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら， Ｃｅｌｌ ２２：７８７−９７， １９８０）；ヘルペス・チミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７８：１４４４−４５， １９８１）；メタロチオネイン遺伝子の制御配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら， Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２， １９８２）；ベータ−ラクタマーゼプロモーターなどの原核発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７５：３７２７−３１， １９７８）；またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８０：２１−２５， １９８３）が含まれる。
エンハンサー配列をベクター内に挿入して、より高次の真核生物における（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６をコードするＤＮＡの転写を増加させてもよい。エンハンサーは、ＤＮＡのシス作用要素であり、通常、長さ約１０〜３００ｂｐで、プロモーターに対して転写を増加させるように作用する。エンハンサーは、比較的、配向および位置独立性である。エンハンサーは、転写単位に対して、５’および３’で見出されている。哺乳動物遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサー配列が知られる（例えばグロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ−フェトプロテインおよびインスリン）。しかし、典型的には、ウイルス由来のエンハンサーを用いるであろう。ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーは、真核生物プロモーターの活性化のための例示的な増進要素である。エンハンサーを、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６コード核酸分子の５’または３’の位で、ベクター内にスプライシングしてもよいが、典型的には、エンハンサーはプロモーターの５’の部位に位置する。
商業的に入手可能なベクターなどの出発ベクターから、発現ベクターを構築してもよい。こうしたベクターは、所望の隣接配列をすべて含有してもまたしなくてもよい。本明細書記載の隣接配列の１以上が、すでにベクターに存在しているのではない場合、これらを個々に得て、そしてベクター内に連結してもよい。各隣接配列を得るための方法は、当業者に周知である。
好ましいベクターは、細菌、昆虫、および哺乳動物宿主細胞と適合するものである。こうしたベクターには、とりわけ、ｐＣＲＩＩ、ｐＣＲ３、およびｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）、ｐＥＴ１５（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州マディソン）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト）、ｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃＩＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＳＲ−アルファ（ＰＣＴ出願公報第ＷＯ ９０／１４３６３号）ならびにｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、ニューヨーク州グランドアイランド）が含まれる。
さらなる適切なベクターには、限定されるわけではないが、コスミド、プラスミド、または修飾ウイルスが含まれるが、ベクター系が、選択した宿主細胞と適合しなければならないことが認識されるであろう。こうしたベクターには、限定されるわけではないが、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド誘導体（ＣｏｌＥ１に基づく高コピー数ファージミド、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｔａｑ増幅されたＰＣＲ産物をクローニングするために設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（例えばＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡクローニング（登録商標）キット、ＰＣＲ２．１（登録商標）プラスミド誘導体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などのプラスミド、およびバキュロウイルス発現系（ｐＢａｃＰＡＫプラスミド誘導体、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などの哺乳動物、酵母またはウイルスベクターが含まれる。
ベクターが構築され、そして（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ポリペプチドをコードする核酸分子がベクターの適切な部位内に挿入された後、増幅および／またはポリペプチド発現のため、完成したベクターを適切な宿主細胞内に挿入してもよい。トランスフェクション、感染、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン法、または他の既知の技術などの方法を含む、周知の方法によって、選択した宿主細胞内への（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ポリペプチドの発現ベクターの形質転換を達成してもよい。選択する方法は、部分的に、用いようとする宿主細胞の種類に関連するであろう。これらの方法および他の適切な方法が当業者に周知であり、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記に示される。
宿主細胞は、原核宿主細胞（大腸菌など）または真核宿主細胞（酵母、昆虫、または脊椎動物細胞など）であってもよい。宿主細胞を、適切な条件下で培養すると、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ポリペプチドが合成され、これを続いて、培地から収集する（宿主細胞がポリペプチドを培地内に分泌する場合）か、またはポリペプチドを産生する宿主細胞から直接収集してもよい（ポリペプチドが分泌されない場合）。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性のために望ましいかまたは必要であるポリペプチド修飾（グリコシル化またはリン酸化など）および生物学的活性分子へのフォールディングの容易さなどの多様な要因に応じるであろう。
いくつかの適切な宿主細胞が当該技術分野に知られ、そして多くが、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、バージニア州マナサスから入手可能である。例には、限定されるわけではないが、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＨＯ ＤＨＦＲ（−）細胞（Ｕｒｌａｕｂら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９７：４２１６−２０， １９８０）、ヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３または２９３Ｔ細胞、あるいは３Ｔ３細胞が含まれる。形質転換、培養、増幅、スクリーニング、産物産生、および精製に適した哺乳動物宿主細胞および方法の選択が、当該技術分野に知られる。他の適切な哺乳動物細胞株はサルＣＯＳ−１およびＣＯＳ−７細胞株、ならびにＣＶ−１細胞株である。さらなる例示的な哺乳動物宿主細胞には、形質転換された細胞株を含む、霊長類細胞株およびげっ歯類細胞株が含まれる。正常二倍体細胞、初代組織のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養由来の細胞株ならびに初代外植片もまた、適切である。候補細胞は、選択遺伝子において、遺伝型的に欠損していてもよいし、または優性に作用する選択遺伝子を含有してもよい。他の適切な哺乳動物細胞株には、限定されるわけではないが、マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓ、Ｂａｌｂ−ｃまたはＮＩＨマウス由来の３Ｔ３株、ＢＨＫまたはＨａＫハムスター細胞株が含まれる。これらの細胞株は各々、タンパク質発現の当業者によって知られ、そしてこうした当業者に対して入手可能である。
適切な宿主細胞として同様に有用なのは、細菌細胞である。例えば、大腸菌の多様な株（例えばＨＢ１０１、ＤＨ５α、ＤＨ１０、およびＭＣ１０６１）が、バイオテクノロジー分野において、宿主細胞として周知である。枯草菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、他のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、およびストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種の多様な株もまた、本方法で使用可能である。
当業者に知られる酵母細胞の多くの株もまた、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６および（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ポリペプチドの発現のための宿主細胞として、利用可能である。好ましい酵母細胞には、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓａｅ）およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）が含まれる。
さらに、望ましい場合、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６および（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６の発現のために、昆虫細胞系を利用してもよい。こうした系は、例えば、Ｋｉｔｔｓら， １９９３， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：８１０−１７；Ｌｕｃｋｌｏｗ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４：５６４−７２， １９９３；およびＬｕｃｋｌｏｗら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６７：４５６６−７９， １９９３に記載される。好ましい昆虫細胞は、Ｓｆ−９およびＨｉ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６および（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ポリペプチド産生
当業者に周知の標準的培地を用いて、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６発現ベクターを含む宿主細胞株を培養してもよい。培地は通常、細胞の増殖および生存に必要なすべての栄養素を含有するであろう。大腸菌細胞を培養するのに適した培地には、例えばルリア・ブロス（ＬＢ）および／またはテリフィック・ブロス（ＴＢ）が含まれる。真核細胞を培養するのに適した培地には、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地１６４０（ＲＰＭＩ １６４０）、最小必須培地（ＭＥＭ）および／またはダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）が含まれ、これらにはすべて、培養中の特定の細胞株の必要に応じて、血清および／または増殖因子を補ってもよい。昆虫培養に適した培地は、必要に応じて、イーストレート、ラクトアルブミン加水分解物、および／またはウシ胎児血清を補ったグレース培地である。
典型的には、トランスフェクションまたは形質転換された細胞の選択的増殖に有用な抗生物質または他の化合物を、補充物として培地に添加する。用いるべき化合物は、宿主細胞を形質転換するプラスミド上に存在する選択可能マーカー要素によって決定されるであろう。例えば、選択可能マーカー要素がカナマイシン耐性である場合、培地に添加される化合物は、カナマイシンであろう。選択的増殖のための他の化合物には、アンピシリン、テトラサイクリン、およびネオマイシンが含まれる。
当該技術分野に知られる標準法を用いて、宿主細胞によって産生される（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ポリペプチドの量を評価してもよい。こうした方法には、限定なしに、ウェスタンブロット分析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分離、免疫沈降、および／またはＤＮＡ結合ゲルシフトアッセイなどの活性アッセイが含まれる。
（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６が、宿主細胞株から分泌されるように設計されている場合、ポリペプチドの大部分は、細胞培地中に見られうる。しかし、ポリペプチドが宿主細胞から分泌されない場合、ポリペプチドは細胞質および／または核（真核宿主細胞の場合）に、あるいは細胞質ゾル（グラム陰性細菌宿主細胞の場合）に存在するであろう。
宿主細胞細胞質および／または核（真核宿主細胞の場合）に、あるいは細胞質ゾル（細菌宿主細胞の場合）に位置した（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６の場合、当業者に知られるいかなる標準的技術を用いて、宿主細胞から細胞内物質（グラム陰性細菌の場合の封入体を含む）を抽出してもよい。例えば、フレンチプレス、ホモジナイズ、および／または超音波処理によって、宿主細胞を溶解して、周辺質／細胞質の内容物を放出させて、その後、遠心分離してもよい。
（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６が、細胞質中で封入体を形成している場合、封入体は、しばしば、細胞膜の内側および／または外側に結合可能であり、そしてしたがって、遠心分離後のペレット物質中に、主に見られるであろう。次いで、ペレット物質を、極端なｐＨで、あるいは、アルカリｐＨではジチオスレイトール、または酸性ｐＨではトリスカルボキシメチルホスフィンなどの還元剤の存在下で、界面活性剤、グアニジン、グアニジン誘導体、尿素または尿素誘導体などのカオトロピック剤で処理してもよい。次いで、ゲル電気泳動、免疫沈降などを用いて、可溶化された（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６を分析してもよい。ポリペプチドを単離することが望ましい場合、本明細書に、そしてＭａｒｓｔｏｎら， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ． １８２：２６４−７５， １９９０に記載されるものなどの標準法を用いて、単離を達成してもよい。
（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６の発現に際して、封入体が、有意な度合いに形成されない場合、ポリペプチドは、細胞ホモジネートの遠心分離後、主に上清中に見られるであろう。本明細書記載のものなどの方法を用いて、上清からポリペプチドをさらに単離してもよい。
多様な技術を用いて、溶液からの（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６の精製を達成してもよい。カルボキシル末端またはアミノ末端いずれかで、ヘキサヒスチジン９などのタグ、あるいはＦＬＡＧ（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．、コネチカット州ニューヘブン）またはｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの他の小ペプチドを含有するように、ポリペプチドが合成されている場合、カラムマトリックスがタグに対して高い親和性を有する、アフィニティーカラムを通じて溶液を通過させることによって、１工程プロセスでポリペプチドを精製可能である。
例えば、ポリヒスチジンは、高親和性および特異性でニッケルに結合する。したがって、精製にニッケルのアフィニティーカラム（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ニッケルカラムなど）を用いてもよい。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ §１０．１１．８（Ａｕｓｕｂｅｌら監修， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ．およびＷｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， １９９３）を参照されたい。
さらに、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ポリペプチドを特異的に認識し、そして該ポリペプチドに結合可能なモノクローナル抗体の使用を通じて、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ポリペプチドを精製してもよい。
（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ポリペプチドが部分的にまたは実質的に混入物質を含まないように、該ポリペプチドを部分的にまたは完全に精製することが好ましい状況において、当業者に知られる標準法を用いてもよい。こうした方法には、限定なしに、電気泳動による分離後の電気溶出、多様な種類のクロマトグラフィー（アフィニティー、イムノアフィニティー、分子ふるい、およびイオン交換）、ＨＰＬＣ、および分取用等電点電気泳動（「Ｉｓｏｐｒｉｍｅ」装置／技術、Ｈｏｅｆｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カリフォルニア州サンフランシスコ）が含まれる。いくつかの場合、２以上の精製技術を組み合わせて、純度増加を達成してもよい。
ポリペプチドを産生するためのいくつかのさらなる方法が当該技術分野に知られ、そしてこの方法を用いて、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６および（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ポリペプチドを産生してもよい。例えば、ｍＲＮＡおよびコードされるペプチドの間の融合タンパク質の産生を記載する、Ｒｏｂｅｒｔｓら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９４：１２２９７−３０３， １９９７を参照されたい。また、Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ３：２６８−７３， １９９９も参照されたい。
ペプチドまたはポリペプチドを産生するためのプロセスはまた、米国特許第５，７６３，１９２号；第５，８１４，４７６号；第５，７２３，３２３号；および第５，８１７，４８３号に記載される。該プロセスは、確率論的（ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ）遺伝子またはその断片を産生し、そして次いで、宿主細胞内に、これらの遺伝子を導入して、この細胞が、該確率論的遺伝子にコードされる１以上のタンパク質を産生することを伴う。次いで、宿主細胞をスクリーニングして、所望の活性を有するペプチドまたはポリペプチドを産生するクローンを同定する。組換えペプチド発現のための他のプロセスが、米国特許第６，１０３，４９５号、第６，２１０，９２５号、第６，６２７，４３８号、および第６，７３７，２５０号に開示される。該プロセスは、大腸菌および大腸菌の一般的な分泌経路を利用する。ペプチドはシグナル配列に融合されて；こうしてペプチドが分泌のためにターゲティングされる。
ペプチドまたはポリペプチドを産生するための別の方法が、ＰＣＴ特許出願公報第ＷＯ ９９／１５６５０号に記載される。遺伝子発見のための遺伝子発現のランダム活性化と称される、公表されたプロセスは、ｉｎ ｓｉｔｕ組換え法による、内因性遺伝子発現の活性化または遺伝子の過剰発現を伴う。例えば、非相同的組換えまたは非正統的組換えによって、遺伝子の発現を活性化することが可能な、ターゲット細胞内への制御配列の組込みによって、内因性遺伝子の発現を活性化するかまたは増加させる。ターゲットＤＮＡをまず、放射線に供し、そして遺伝子プロモーターを挿入する。プロモーターは、最終的に、遺伝子の最前部にブレークを配置し、遺伝子の転写を開始する。これは、所望のペプチドまたはポリペプチドの発現を生じる。
アミド化
ペプチジル−グリシン・アルファ−アミド化モノオキシゲナーゼ（ＰＡＭ）と呼ばれる酵素によって、合成的または組換え的のいずれかで産生されたペプチドのアミド化を達成する。細菌発現系を用いて（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ペプチドを組換え的に産生する場合、組換えＰＡＭ酵素を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ反応によって、ペプチドをＣ末端アミド化することができる。ＰＡＭ酵素供給源、その産生および精製法、ならびに（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ペプチドをアミド化するために使用可能な方法は、例えば、米国特許第４，７０８，９３４号、第５，７８９，２３４号、および第６，３１９，６８５号に記載される。
選択的（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ ３−３６ および（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ ３−３６ 抗体
システイン置換部位でのＰＥＧ化を伴うまたは伴わない（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ポリペプチドに特異的に結合するが、天然ｈＰＹＹ３−３６に選択的に結合しない抗体および抗体断片が、本発明の範囲内にある。抗体は、単一特異的ポリクローナルを含むポリクローナル；モノクローナル；組換え；キメラ；ＣＤＲ移植などのヒト化；ヒト；一本鎖；および／または二重特異性；ならびにその断片；変異体；または誘導体であってもよい。抗体断片には、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ポリペプチド上のエピトープに結合する抗体部分が含まれる。こうした断片の例には、全長抗体の酵素的切断によって生成されるＦａｂおよびＦ（ａｂ’）断片が含まれる。他の結合断片には、抗体可変領域をコードする核酸配列を含有する組換えプラスミドの発現など、組換えＤＮＡ技術によって生成されるものが含まれる。
（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ポリペプチドに向けられるポリクローナル抗体は、一般的に、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ポリペプチドおよびアジュバントの多数回のＳＣまたはＩＰ注射によって、動物（例えばウサギまたはマウス）において産生される。免疫しようとする種において免疫原性であるキャリアータンパク質、例えばキーホール・リンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）・ヘモシアニン、血清アルブミン、ウシ・サイログロブリン、またはダイズ・トリプシン阻害因子に、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ポリペプチドをコンジュゲート化することが有用でありうる。また、ミョウバンなどの凝集剤を用いて、免疫応答を増進する。免疫後、動物から採血し、そして抗（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または抗（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６抗体力価に関して血清をアッセイする。
培養中の連続細胞株によって、抗体分子の産生を提供する方法いずれかを用いて、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ポリペプチドに向けられるモノクローナル抗体を産生する。モノクローナル抗体を調製するのに適した方法の例には、Ｋｏｈｌｅｒら， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−９７， １９７５のハイブリドーマ法、およびヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３３：３００１， １９８４； Ｂｒｏｄｅｕｒら， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， １９８７）が含まれる。やはり本発明が提供するのは、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ポリペプチドと反応性であるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株である。
競合的阻害によって、モノクローナル抗体特異性および親和性を決定するのに好ましい方法は、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， １９８９）； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （Ｃｏｌｌｉｇａｎら監修， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．およびＷｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， １９９３）；およびＭｕｌｌｅｒ， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ９２：５８９−６０１， １９８８に見出されうる。
本発明のキメラ抗体は、個々のＨおよび／またはＬ免疫グロブリン鎖を含んでもよい。好ましいキメラＨ鎖は、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ポリペプチドに特異的な非ヒト抗体のＨ鎖由来の抗原結合性領域を含み、該領域がＣＨ１またはＣＨ２などのヒトＨ鎖Ｃ領域（ＣＨ）の少なくとも一部に連結している。好ましいキメラＬ鎖は、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ポリペプチドに特異的な非ヒト抗体のＬ鎖由来の抗原結合性領域を含み、該領域がヒトＬ鎖Ｃ領域（ＣＬ）の少なくとも一部に連結している。キメラ抗体およびその産生法が当該技術分野に知られる。Ｃａｂｉｌｌｙら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８１：３２７３−７７， １９８４； Ｍｏｒｒｉｓｏｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８１：６８５１−５５， １９８４； Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら， Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３−４６， １９８４； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８−７０， １９８５； Ｌｉｕら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８４：３４３９−４３， １９８７；ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上記を参照されたい。
同じかまたは異なる可変領域結合特異性のキメラＨ鎖およびＬ鎖を有する選択的結合剤もまた、当該技術分野に知られる方法にしたがって、個々のポリペプチド鎖の適切な会合によって、調製可能である。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら監修， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ．およびＷｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， １９９４）ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上記を参照されたい。このアプローチを用いて、キメラＨ鎖（またはその誘導体）を発現する宿主細胞を、キメラＬ鎖（またはその誘導体）を発現する宿主細胞と別個に培養し、そして免疫グロブリン鎖を別個に回収して、そして次いで会合させる。あるいは、宿主細胞を共培養して、そして培地中で鎖を自発的に会合させて、その後、集合した免疫グロブリンを回収する。
別の態様において、本発明のモノクローナル抗体は、「ヒト化」抗体である。非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該技術分野に周知である。米国特許第５，５８５，０８９号および第５，６９３，７６２号を参照されたい。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１以上のアミノ酸残基を有する。例えば、当該技術分野に記載される方法（Ｊｏｎｅｓら， １９８６， Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−２５； Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら， １９９８， Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−２７； Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−３６）を用いて、げっ歯類の相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部で、ヒト抗体の対応する領域を置換することによって、ヒト化を行ってもよい。
モノクローナル抗体の生成をバイパスする、抗体分子の抗原結合性領域（すなわちＦａｂまたは可変領域断片）の組換えＤＮＡバージョンを生成するための技術が、本発明の範囲内に含まれる。この技術において、免疫動物より採取した免疫系細胞から、抗体特異的メッセンジャーＲＮＡ分子を抽出し、そしてｃＤＮＡに転写してもよい。次いで、ｃＤＮＡを細菌発現系にクローニングする。本発明の実施に適した、こうした技術の一例は、発現されたＦａｂタンパク質を周辺質腔（細菌細胞膜および細胞壁の間）に移動させるかまたは分泌させるリーダー配列を有するバクテリオファージ・ラムダ・ベクター系を用いる。多数の機能性Ｆａｂ断片を迅速に生成し、そして抗原に結合するものに関してスクリーニングすることも可能である。こうした（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６結合性分子（（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ポリペプチドに対する特異性を持つＦａｂ断片）は、本明細書において、用語「抗体」内に特に含まれる。
やはり本発明の範囲内にあるのは、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的活性（ヒト補体を活性化し、そして抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を仲介する能力など）のヒト抗体分子由来の遺伝子と一緒にスプライシングすることによる、キメラ抗体の産生のために開発された技術である。Ｍｏｒｒｉｓｏｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８１：６８５１−５５， １９８４； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら， Ｎａｔｕｒｅ， ３１２：６０４−０８， １９８４。この技術によって産生された抗体などの選択的結合剤が、本発明の範囲内である。
本発明が、マウスまたはラットのモノクローナル抗体に限定されないことが認識されるであろう；実際、ヒト抗体を用いてもよい。ヒト・ハイブリドーマを用いることによって、こうした抗体を得てもよい。（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ポリペプチドに結合する完全ヒト抗体は、したがって、本発明に含まれる。内因性免疫グロブリン産生の非存在下で、ヒト抗体のレパートリーを産生可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６抗原（場合によってキャリアーにコンジュゲート化される）で免疫することによって、こうした抗体を産生する。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０：２５５１−５５， １９９３； Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら， Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−５８， １９９３； Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら， Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ． ７：３３−４０， １９９３を参照されたい。
やはり本発明に含まれるのは、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ポリペプチドに結合するヒト抗体である。内因性免疫グロブリン産生の非存在下で、ヒト抗体のレパートリーを産生可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を用いると、場合によってキャリアーにコンジュゲート化された、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ポリペプチド抗原（すなわち少なくとも６つの隣接アミノ酸を有する）で免疫することによって、こうした抗体が産生される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら， １９９３ 上記； Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら， Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−５８， １９９３； Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら， １９９３、上記を参照されたい。１つの方法において、重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードする内因性遺伝子座を無能力化し、そしてそのゲノム内にヒト重鎖および軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座を挿入することによって、こうしたトランスジェニック動物を産生する。次いで、部分的に修飾された動物、すなわち、完全装備の修飾より少ない修飾を有する動物を交雑させて、所望の免疫系修飾すべてを有する動物を得る。免疫原を投与した際、これらのトランスジェニック動物は、これらの抗原に対して免疫特異的である可変領域を含めて、（例えばネズミではなく）ヒト・アミノ酸配列を持つ抗体を産生する。ＰＣＴ特許出願公報第ＷＯ ９６／３３７３５号および第ＷＯ ９４／０２６０２号を参照されたい。さらなる方法が、米国特許第５，５４５，８０７号、ＰＣＴ特許出願公報第ＷＯ ９１／１０７４１号および第ＷＯ ９０／０４０３６号に、そしてＥＰ特許第０ ５４６ ０７３ Ｂ１号およびＰＣＴ特許出願公報第ＷＯ ９２／０３９１８号に記載される。また、本明細書に記載するように、宿主細胞における組換えＤＮＡの発現によって、またはハイブリドーマ細胞における発現によって、ヒト抗体を産生してもよい。
別の態様において、また、ヒト抗体をファージ・ディスプレイ・ライブラリーから産生してもよい（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２７：３８１， １９９１； Ｍａｒｋｓら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：５８１， １９９１）。これらのプロセスは、線維性バクテリオファージ表面上に抗体レパートリーをディスプレイさせ、そして続いて、選択した抗原への結合によって、ファージを選択することを通じて、免疫選択を模倣する。１つのこうした技術が、ＰＣＴ特許出願公報第ＷＯ ９９／１０４９４号に記載され、これはこうしたアプローチを用いた、ＭＰＬ−およびｍｓｋ−受容体に対する、高親和性および機能性のアゴニスト性抗体の単離を記載する。
キメラ、ＣＤＲ移植、およびヒト化抗体は、典型的には組換え法によって産生される。本明細書に記載しそして当該技術分野に知られる材料および方法を用いて、抗体をコードする核酸を宿主細胞内に導入し、そして発現する。好ましい態様において、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物宿主細胞において、抗体を産生する。本明細書に記載するように、宿主細胞における組換えＤＮＡの発現によって、またはハイブリドーマ細胞における発現によって、モノクローナル（例えばヒト）抗体を産生してもよい。
（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６および（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ポリペプチドの検出および定量化のため、ならびにポリペプチド精製のため、競合的結合アッセイ、直接および間接的サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイ（Ｓｏｌａ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １４７−１５８（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９８７））などのいかなる既知のアッセイ法で、本発明の抗（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６および抗（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６抗体を使用してもよい。抗体は、使用しているアッセイ法に適した親和性で、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ポリペプチドに結合するであろう。
本発明の方法側面で使用するため、本発明のＰＹＹアゴニストを、薬学的に許容しうる酸付加塩の形で提供してもよい。本化合物の薬学的に許容しうる代表的な酸付加塩には、塩酸塩、臭化水素酸、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、過リン酸塩、イソニコチン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、パントテン酸塩、重酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンティシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、サッカラート塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、パモ酸塩、パルミチン酸塩、マロン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリル酸塩、リンゴ酸塩、ホウ酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、ナフチル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、およびラウリルスルホン酸塩等が含まれる。非ＰＥＧ化変異体がＰＥＧ−ＰＹＹ３−３６変異体コンジュゲートの調製において、中間体として使用される予定である場合、該変異体の塩は薬学的に許容可能でなくてもよい。
本発明のＰＹＹアゴニストは、一般的に、薬剤組成物の形で投与されるであろう。薬剤組成物は、例えば、経口投与（例えば錠剤、カプセル、丸剤、粉末、溶液、懸濁物）、非経口注射（例えば無菌溶液、懸濁物またはエマルジョン）、鼻内投与（例えばエアロゾル滴など）、結腸投与（例えば座薬）または経皮投与（例えばパッチ）に適した型であってもよい。薬剤組成物は、正確な投薬量の単回投与に適した単位投薬型であってもよい。薬剤組成物には、慣用的な薬学的キャリアーおよび活性成分としての本発明のＰＹＹアゴニストが含まれるであろう。さらに、他の薬学的剤、アジュバント等が含まれてもよい。
生物活性ペプチドの多様な薬剤組成物を調製する方法が、薬剤科学業に周知である。例えば、米国特許出願公報第２００５／０００９７４８号（経口投与に関する）；ならびに第２００４／０１５７７７７号、第２００５／０００２９２７号および第２００５／０２１５４７５号（経粘膜投与、例えば鼻内または頬側投与に関する）を参照されたい。また、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ， メリーランド州ボルチモア， 第２０版 ２０００も参照されたい。
本発明のＰＹＹアゴニストを、本明細書記載の疾患状態または状態の治療のための他の薬学的剤と組み合わせて用いてもよい。したがって、本発明の化合物を、他の薬学的剤と組み合わせて投与することを含む治療法もまた、本発明によって提供される。
本発明のＰＹＹアゴニストと組み合わせて使用してもよい、適切な薬学的剤には、カンナビノイド−１（ＣＢ−１）アンタゴニスト（リモナバントなど）、１１β−ヒドロキシステロイド脱水素酵素−１（１型１１β−ＨＳＤ）阻害剤、ＭＣＲ−４アゴニスト、コレシストキニン−Ａ（ＣＣＫ−Ａ）アゴニスト、モノアミン再取り込み阻害剤（シブトラミンなど）、交感神経刺激剤、β３アドレナリン受容体アゴニスト、ドーパミン受容体アゴニスト（ブロモクリプチンなど）、メラニン形成細胞刺激ホルモン受容体類似体、５ＨＴ２ｃ受容体アゴニスト、メラニン濃縮ホルモンアンタゴニスト、レプチン、レプチン類似体、レプチン受容体アゴニスト、ガラニン・アンタゴニスト、リパーゼ阻害剤（テトラヒドロリプスタチン、すなわちオーリスタットなど）、食欲低下剤（ボンベシン・アゴニストなど）、ニューロペプチド−Ｙ受容体アンタゴニスト（例えばＮＰＹ Ｙ５受容体アンタゴニスト）、甲状腺ホルモン様剤、デヒドロエピアンドロステロンまたはその類似体、グルココルチコイド受容体アゴニストまたはアンタゴニスト、オレキシン受容体アンタゴニスト、グルカゴン様ペプチド−１受容体アゴニスト、毛様体神経栄養因子（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．， ニューヨーク州タリータウンおよびＰｒｏｃｔｅｒ ＆ Ｇａｍｂｌｅ Ｃｏｍｐａｎｙ， オハイオ州シンシナティから入手可能なＡｘｏｋｉｎｅＴＭなど）、ヒト・アグーチ関連タンパク質（ＡＧＲＰ）阻害剤、グレリン受容体アンタゴニスト、ヒスタミン３受容体アンタゴニストまたは逆作用剤、ニューロメジンＵ受容体アゴニスト、ＭＴＰ／アポＢ阻害剤（例えばダーロタピド（ｄｉｒｌｏｔａｐｉｄｅ）などの腸選択的ＭＴＰ阻害剤）等などの、他の抗肥満剤が含まれる。
本発明のＰＹＹアゴニストと組み合わせて使用するのに好ましい抗肥満剤には、ＣＢ−１受容体アンタゴニスト、腸選択的ＭＴＰ阻害剤、ＣＣＫａアゴニスト、５ＨＴ２ｃ受容体アゴニスト、ＮＰＹ Ｙ５受容体アンタゴニスト、オーリスタット、およびシブトラミンが含まれる。本発明の方法で使用するのに好ましいＣＢ−１受容体アンタゴニストには：Ｓａｎｏｆｉ−Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏから入手可能であるし、また米国特許第５，６２４，９４１号に記載されるように調製可能なリモナバント（商品名ＡｃｏｍｐｌｉａＴＭの下でも知られるＳＲ１４１７１６Ａ）；ＴｏｃｒｉｓＴＭ、ミズーリ州エリスビルから入手可能である、Ｎ−（ピペリジン−１−イル）−１−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−ヨードフェニル）−４−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボキサミド（ＡＭ２５１）；米国特許第６，６４５，９８５号に記載されるように調製可能な［５−（４−ブロモフェニル）−１−（２，４−ジクロロ−フェニル）−４−エチル−Ｎ−（１−ピペリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボキサミド］（ＳＲ１４７７７８）；ＰＣＴ特許出願公報第ＷＯ ０３／０７５６６０号に記載されるように調製可能なＮ−（ピペリジン−１−イル）−４，５−ジフェニル−１−メチルイミダゾール−２−カルボキサミド、Ｎ−（ピペリジン−１−イル）−４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−クロロフェニル）−１−メチルイミダゾール−２−カルボキサミド、Ｎ−（ピペリジン−１−イル）−４，５−ジ−（４−メチルフェニル）−１−メチルイミダゾール−２−カルボキサミド、Ｎ−シクロヘキシル−４，５−ジ−（４−メチルフェニル）−１−メチルイミダゾール−２−カルボキサミド、Ｎ−（シクロヘキシル）−４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−クロロフェニル）−１−メチルイミダゾール−２−カルボキサミド、およびＮ−（フェニル）−４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−クロロフェニル）−１−メチルイミダゾール−２−カルボキサミド；米国特許出願公報第２００４／００９２５２０号に記載されるように調製可能な１−［９−（４−クロロ−フェニル）−８−（２−クロロ−フェニル）−９Ｈ−プリン−６−イル］−４−エチルアミノ−ピペリジン−４−カルボン酸アミドの塩酸塩、メシル酸塩およびベシル酸塩；米国特許出願公報第２００４／０１５７８３９号に記載されるように調製可能な１−［７−（２−クロロ−フェニル）−８−（４−クロロ−フェニル）−２−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］［１，３，５］トリアジン−４−イル］−３−エチルアミノ−アゼチジン−３−カルボン酸アミドおよび１−［７−（２−クロロ−フェニル）−８−（４−クロロ−フェニル）−２−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］［１，３，５］トリアジン−４−イル］−３−メチルアミノ−アゼチジン−３−カルボン酸アミド；米国特許出願公報第２００４／０２１４８５５号に記載されるように調製可能な３−（４−クロロ−フェニル）−２−（２−クロロ−フェニル）−６−（２，２−ジフルオロ−プロピル）−２，４，５，６−テトラヒドロ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリジン−７−オン；米国特許出願公報第２００５／０１０１５９２号に記載されるように調製可能な３−（４−クロロ−フェニル）−２−（２−クロロ−フェニル）−７−（２，２−ジフルオロ−プロピル）−６，７−ジヒドロ−２Ｈ，５Ｈ−４−オキサ−１，２，７−トリアザ−アズレン−８−オン；米国特許出願公報第２００４／０２１４８３８号に記載されるように調製可能な２−（２−クロロ−フェニル）−６−（２，２，２−トリフルオロ−エチル）−３−（４−トリフルオロメチル−フェニル）−２，６−ジヒドロ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；ＰＣＴ特許出願公報第ＷＯ ０２／０７６９４９号に記載されるように調製可能な（Ｓ）−４−クロロ−Ｎ−｛［３−（４−クロロ−フェニル）−４−フェニル−４，５−ジヒドロ−ピラゾール−１−イル］−メチルアミノ−メチレン｝−ベンゼンスルホンアミド（ＳＬＶ−３１９）および（Ｓ）−Ｎ−｛［３−（４−クロロ−フェニル）−４−フェニル−４，５−ジヒドロ−ピラゾール−１−イル］−メチルアミノ−メチレン｝−４−トリフルオロメチル−ベンゼンスルホンアミド（ＳＬＶ−３２６）；米国特許第６，４３２，９８４号に記載されるように調製可能なＮ−ピペリジノ−５−（４−ブロモフェニル）−１−（２，４−ジクロロフェニル）−４−エチルピラゾール−３−カルボキサミド；米国特許第６，５１８，２６４号に記載されるように調製可能な１−［ビス−（４−クロロ−フェニル）−メチル］−３−［（３，５−ジフルオロ−フェニル）−メタンスルホニル−メチレン］−アゼチジン；ＰＣＴ特許出願公報第ＷＯ ０４／０４８３１７号に記載されるように調製可能な２−（５−（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イルオキシ）−Ｎ−（４−（４−クロロフェニル）−３−（３−シアノフェニル）ブタン−２−イル）−２−メチルプロパンアミド；米国特許第５，７４７，５２４号に記載されるように調製可能な４−｛［６−メトキシ−２−（４−メトキシフェニル）−１−ベンゾフラン−３−イル］カルボニル｝ベンゾニトリル（ＬＹ−３２０１３５）；第ＷＯ ０４／０１３１２０号に記載されるように調製可能な１−［２−（２，４−ジクロロフェニル）−２−（４−フルオロフェニル）−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−スルホニル］−ピペリジン；ならびにＰＣＴ特許出願公報第ＷＯ ０４／０１２６７１号に記載されるように調製可能な［３−アミノ−５−（４−クロロフェニル）−６−（２，４−ジクロロフェニル）−フロ［２，３−ｂ］ピリジン−２−イル］−フェニル−メタノンが含まれる。
本発明の組み合わせ、薬剤組成物、および方法で使用するのに好ましい腸作用性ＭＴＰ阻害剤には、どちらも米国特許第６，７２０，３５１号に記載される方法を用いて調製可能なダーロタピド（dirlotapide）（（Ｓ）−Ｎ−｛２−［ベンジル（メチル）アミノ］−２−オキソ−１−フェニルエチル｝−１−メチル−５−［４’−（トリフルオロメチル）［１，１’−ビフェニル］−２−カルボキサミド］−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）および１−メチル−５−［（４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−２−カルボニル）−アミノ］−１Ｈ−インドール−２−カルボン酸（カルバモイル−フェニル−メチル）−アミド；すべて米国特許出願公報第２００５／０２３４０９９Ａ１号に記載されるように調製可能な（Ｓ）−２−［（４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−２−カルボニル）−アミノ］−キノリン−６−カルボン酸（ペンチルカルバモイル−フェニル−メチル）−アミド、（Ｓ）−２−［（４’−ｔｅｒｔ−ブチル−ビフェニル−２−カルボニル）−アミノ］−キノリン−６−カルボン酸｛［（４−フルオロ−ベンジル）−メチル−カルバモイル］−フェニル−メチル｝−アミド、および（Ｓ）−２−［（４’−ｔｅｒｔ−ブチル−ビフェニル−２−カルボニル）−アミノ］−キノリン−６−カルボン酸［（４−フルオロ−ベンジルカルバモイル）−フェニル−メチル］−アミド、米国特許第５，５２１，１８６号および第５，９２９，０７５号に記載されるように調製可能な（−）−４−［４−［４−［４−［［（２Ｓ，４Ｒ）−２−（４−クロロフェニル）−２−［［（４−メチル−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イル）スルファニル］メチル−１，３−ジオキソラン−４−イル］メトキシ］フェニル］ピペラジン−１−イル］フェニル］−２−（１Ｒ）−１−メチルプロピル］−２，４−ジヒドロ−３Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−オン（ミトラタピド（Mitratapide）またはＲ１０３７５７としてもまた知られる）；ならびに米国特許第６，２６５，４３１号に記載されるように調製可能なインプリタピド（implitapide）（ＢＡＹ １３−９９５２）が含まれる。最も好ましいのは、ダーロタピド、ミトラタピド、（Ｓ）−２−［（４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−２−カルボニル）−アミノ］−キノリン−６−カルボン酸（ペンチルカルバモイル−フェニル−メチル）−アミド、（Ｓ）−２−［（４’−ｔｅｒｔ−ブチル−ビフェニル−２−カルボニル）−アミノ］−キノリン−６−カルボン酸｛［（４−フルオロ−ベンジル）−メチル−カルバモイル］−フェニル−メチル｝−アミド、または（Ｓ）−２−［（４’−ｔｅｒｔ−ブチル−ビフェニル−２−カルボニル）−アミノ］−キノリン−６−カルボン酸［（４−フルオロ−ベンジルカルバモイル）−フェニル−メチル］−アミドである。好ましいＮＰＹ Ｙ５受容体アンタゴニストには：米国特許出願公報第２００２／０１５１４５６号に記載されるように調製可能な２−オキソ−Ｎ−（５−フェニルピラジニル）スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），４’−ピペリジン］−１’−カルボキサミド；ならびにすべてＰＣＴ特許出願公報第ＷＯ ０３／０８２１９０号に記載されるように調製可能な３−オキソ−Ｎ−（５−フェニル−２−ピラジニル）−スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），４’−ピペリジン］−１’−カルボキサミド；３−オキソ−Ｎ−（７−トリフルオロメチルピリド［３，２−ｂ］ピリジン−２−イル）−スピロ−［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），４’−ピペリジン］−１’−カルボキサミド；Ｎ−［５−（３−フルオロフェニル）−２−ピリミジニル］−３−オキソスピロ−［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），［４’−ピペリジン］−１’−カルボキサミド；トランス−３’−オキソ−Ｎ−（５−フェニル−２−ピリミジニル）］スピロ［シクロヘキサン−１，１’（３’Ｈ）−イソベンゾフラン］−４−カルボキサミド；トランス−３’−オキソ−Ｎ−［１−（３−キノリル）−４−イミダゾリル］スピロ［シクロヘキサン−１，１’（３’Ｈ）−イソベンゾフラン］−４−カルボキサミド；トランス−３−オキソ−Ｎ−（５−フェニル−２−ピラジニル）スピロ［４−アザイソ−ベンゾフラン−１（３Ｈ），１’−シクロヘキサン］−４’−カルボキサミド；トランス−Ｎ−［５−（３−フルオロフェニル）−２−ピリミジニル］−３−オキソスピロ［５−アザイソベンゾフラン−１（３Ｈ），１’−シクロヘキサン］−４’−カルボキサミド；トランス−Ｎ−［５−（２−フルオロフェニル）−２−ピリミジニル］−３−オキソスピロ［５−アザイソベンゾフラン−１（３Ｈ），１’−シクロヘキサン］−４’−カルボキサミド；トランス−Ｎ−［１−（３，５−ジフルオロフェニル）−４−イミダゾリル］−３−オキソスピロ［７−アザイソベンゾフラン−１（３Ｈ），１’−シクロヘキサン］−４’−カルボキサミド；トランス−３−オキソ−Ｎ−（１−フェニル−４−ピラゾリル）スピロ［４−アザイソベンゾフラン−１（３Ｈ），１’−シクロヘキサン］−４’−カルボキサミド；トランス−Ｎ−［１−（２−フルオロフェニル）−３−ピラゾリル］−３−オキソスピロ［６−アザイソベンゾフラン−１（３Ｈ），１’−シクロヘキサン］−４’−カルボキサミド；トランス−３−オキソ−Ｎ−（ｌ−フェニル−３−ピラゾリル）スピロ［６−アザイソベンゾフラン−１（３Ｈ），１’−シクロヘキサン］−４’−カルボキサミド；およびトランス−３−オキソ−Ｎ−（２−フェニル−１，２，３−トリアゾール−４−イル）スピロ［６−アザイソベンゾフラン−１（３Ｈ），１’−シクロヘキサン］−４’−カルボキサミド；ならびに薬学的に許容しうる塩およびエステルが含まれる。上に列挙する米国特許および公報は、引用により本明細書に援用される。
本発明の方法側面において、本発明のＰＹＹアゴニストは、単独でまたは１以上の他の薬学的剤と組み合わせて、当該技術分野に知られる末梢投与の任意の慣用法と別個にまたは一緒に、被験者に末梢投与される。したがって、ＰＹＹアゴニストまたは組み合わせを、被験者に非経口的に（例えば静脈内、腹腔内、筋内または皮下）、鼻内、経口、舌下、頬側で、吸入によって（例えばエアロゾルによって）、直腸（例えば座薬によって）または経皮で投与してもよい。非経口投与が好ましい投与法であり、そして皮下投与が好ましい非経口投与法である。
非経口注射に適した組成物には、一般的に、薬学的に許容しうる無菌水性または非水性溶液、分散物、懸濁物、またはエマルジョン、および無菌注射可能溶液または分散物にする再構成用の無菌粉末が含まれる。適切な水性および非水性キャリアーまたは希釈剤（溶媒およびビヒクルを含む）の例には、水、エタノール、ポリオール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール等）、その適切な混合物、オリーブ油などの植物油を含むトリグリセリド、およびオレイン酸エチルなどの注射可能有機エステルが含まれる。
非経口注射のためのこれらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、可溶化剤、乳化剤、および分散剤などの賦形剤も含有する。多様な抗細菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等で、組成物の微生物混入の防止を達成してもよい。例えば、糖、塩化ナトリウム等の等張剤を含むことが望ましい可能性もある。吸収を遅延させることが可能な剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によって、注射可能薬剤組成物の延長された吸収を引き起こしてもよい。
本発明のＰＹＹアゴニストは、投与様式、被験者の年齢および体重、治療中の疾患、状態または障害の重症度、および投与しているＰＹＹアゴニストの薬理学的活性を含む、いくつかの要因に応じて、多様な投薬量で、被験者に投与されるであろう。特定の患者に関する投薬量範囲および最適投薬量の決定は、十分に、当該技術分野の通常の技術の範囲内である。
非経口投与のため、非ＰＥＧ化変異体に基づく投薬措置において、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ／用量の範囲内の投薬量レベルで、本発明のＰＹＹアゴニストをヒト被験者に投与してもよい。例えば、３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６に関しては、非経口投薬レベルは、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６に基づく投薬措置において、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ／用量の範囲内、好ましくは約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１．０ｍｇ／ｋｇ／用量の範囲内、あるいは約０．０５または０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１．０ｍｇ／ｋｇ／用量、あるいは約０．０５または０．１ｍｇ／ｋｇ〜約０．３または０．５ｍｇ／ｋｇ／用量の範囲内であろう。例えば、約３４０２４Ｄａ（３０ｋＤａ ＰＥＧに加えて、非ＰＥＧ化ペプチドの分子量４０２４）の分子量を有する３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ の８５ｍｇの用量は、非ＰＥＧ化（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６に基づいた際の１０ｍｇと同等である。投薬措置は、毎日１以上の用量であってもよく、好ましくは食前であり、あるいは特に３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または２０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６を用いると、毎週２または３回、あるいは週１回、あるいは１０〜１４日ごとに１回の投薬措置が好ましい。
本発明の態様は、以下の実施例に例示される。しかし、一般の当業者には、その他の変形が知られるか、または本開示および付随する請求項に鑑みて明らかであろうため、本発明の態様は、これらの実施例の特定の詳細に限定されないことが理解されるものとする。本明細書に引用するすべての参考文献は、本明細書に援用される。
実施例
実施例１
直鎖３０Ｋおよび２０Ｋ ｍＰＥＧおよび２０Ｋマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ ３−３６
本実施例は、残基１０に付着したｍＰＥＧ（３０Ｋまたは２０Ｋ）を伴う実質的に均質なモノＰＥＧ化（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６の調製を提供する。
（ａ）（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ ３−３６ の調製
自動化ペプチド合成装置（モデル４３３Ａ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）を用い、２−（１Ｈ−ベンゾトリゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）活性化（Ｆａｓｔｍｏｃ、０．１５ｍｍｏｌサイクル）でのＦｍｏｃ戦略を用いた固相法によって、（Ｅ１０Ｃ）ＰＹＹ３−３６を合成した。用いた側鎖保護基は、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＨｉｓにはＴｒｔ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＴｙｒにはｔＢｕ；ＬｙｓにはＢｏｃ；ＡｓｐおよびＧｌｕにはＯｔＢｕ；そしてＡｒｇにはＰｂｆであった。９ｍｌのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、０．５ｇのフェノール、０．５ｍｌのＨ２Ｏ、０．５ｍｌのチオアニソールおよび０．２５ｍｌの１，２エタンジチオールの混合物を用いて、室温で４時間、ペプチド−樹脂の切断を完了した。氷冷エチルエーテル中でペプチドを沈殿させ、そしてエチルエーテルで洗浄し、ＤＭＳＯ中で溶解して、そして流速８０ｍｌ／分で、３０分間の１００％溶媒Ａ：０％溶媒Ｂから７０％溶媒Ａ：３０％溶媒Ｂの直線勾配を用いて、Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａｐａｋ Ｃ１８、１５ｕｍ、１００A、５０ｘ３００ｍｍＩＤカラム（カタログ番号ＷＡＴ０１１８０１、Ｗａｔｅｒｓ、マサチューセッツ州ミルフォード）上、逆相ＨＰＬＣによって精製した。溶媒Ａは、０．１％ ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）水溶液である。溶媒Ｂは、アセトニトリル中の０．１％ ＴＦＡ溶液である。ＥＳＩ−ＭＳによって精製ペプチドの分子量を確認し（Ｍ平均＝４０２４）、そして逆相ＨＰＬＣによって純度を評価した（図１）。
（ｂ）直鎖３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ ３−３６ の調製
およそ３０，０００ＭＷの直鎖ｍＰＥＧマレイミド試薬（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ ＭＥ−３００ＭＡ、ＮＯＦ社、日本・東京）を、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６に、残基１０のシステインのスルフヒドリル基上で選択的にカップリングした。２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ミズーリ州セントルイス）ｐＨ７．０、あるいは２０ｍＭ酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ミズーリ州セントルイス）ｐＨ４．５中に溶解した直鎖３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミドに、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ペプチドを直接添加して、１ｍｇ／ｍｌペプチド濃度および約１：１の相対的ｍＰＥＧ：（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６モル比を生じることによって、該マレイミドを該ペプチドと直ちに反応させた。暗所中、室温で０．５〜２４時間、反応を行った。陽イオン交換クロマトグラフィー上で直ちに精製するため、２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．５中に希釈することによって、ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０中の反応を停止した。２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５中の反応は陽イオン交換クロマトグラフィー上に直接装填した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって反応産物を評価した（図２）。
（ｃ）直鎖３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ ３−３６ の精製
単回イオン交換クロマトグラフィー工程を用いて、反応混合物から＞９５％に、ＰＥＧ化（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６種を精製した。陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、非修飾（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６およびより大きい分子量種からモノＰＥＧ化（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６を精製した。上述のような、典型的な直鎖３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６反応混合物（１０ｍｇタンパク質）を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５（緩衝液Ａ）中で平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｔｒａｐカラム（５ｍｌ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）上で分画した。反応混合物を緩衝液Ａで７倍希釈し、そして流速２．５ｍｌ／分でカラム上に装填した。５〜１０カラム体積の緩衝液Ａでカラムを洗浄した。続いて、２０カラム体積の０〜１００ｍＭの直線ＮａＣｌ勾配で、カラムから、多様な（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６種を溶出させた。２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０）によって、溶離液を監視し、そして適切なサイズの分画を収集した。（登録商標）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した際のＰＥＧ化の度合いに応じて分画をプールした（図３）。次いで、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ ３濃縮装置（Ａｍｉｃｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、マサチューセッツ州ノースボロー）中、あるいはＶｉｖａｓｐｉｎ １０Ｋ濃縮装置（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｇｒｏｕｐ、ドイツ・ハノーバー）を用いて、精製プールを０．５〜５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。ＲＰ ＨＰＬＣピーク面積をＰＹＹ３−３６標準曲線（未提示）に比較することによって、精製プールのタンパク質濃度を決定するか、あるいは実験的に得た消光係数を用いて、２８０ｎｍの吸光度によって、精製プールの濃度を決定した。図６に示すように、ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて、ＰＥＧ化（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６の精製プールのプロフィールを描いた。
（ｄ）直鎖２０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ ３−３６ の調製
およそ２０，０００ＭＷの直鎖ｍＰＥＧマレイミド試薬（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ ＭＥ−２００ＭＡ、ＮＯＦ社）を、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６に、残基１０のシステインのスルフヒドリル基上で選択的にカップリングした。２０ｍＭ酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ミズーリ州セントルイス）ｐＨ４．５中に溶解した直鎖２０Ｋ ｍＰＥＧマレイミドに、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ペプチドを直接添加して、１ｍｇ／ｍｌペプチド濃度および約１．３：１の相対的ｍＰＥＧ：（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６モル比を生じることによって、該マレイミドを該ペプチドと直ちに反応させた。暗所中、室温で６０分間、その後、４℃で１６時間、反応を行った。２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５中の反応を陽イオン交換クロマトグラフィー上に直接装填した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって反応産物を評価した。
（ｅ）直鎖２０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ ３−３６ の精製
単回イオン交換クロマトグラフィー工程を用いて、反応混合物から＞９５％に、ＰＥＧ化（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６種を精製した。陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、未結合ＰＥＧ、非修飾（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６およびより大きい分子量種からモノＰＥＧ化（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６を分離した。上述のような、典型的な直鎖２０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６反応混合物（２０ｍｇタンパク質）を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５（緩衝液Ａ）中で平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｔｒａｐカラム（５ｍｌ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で分画した。反応混合物を流速１．０ｍｌ／分でカラム上に装填した。流速２．５ｍｌ／分、４カラム体積の緩衝液Ａでカラムを洗浄した。続いて、流速２．５ｍｌ／分、２５カラム体積の０〜２００ｍＭの直線ＮａＣｌ勾配で、カラムから、多様な（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６種を溶出させた。２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０）によって、溶離液を監視し、そして適切なサイズの分画を収集した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって評価した際のＰＥＧ化の度合いに応じて分画をプールした。次いで、Ｖｉｖａｓｐｉｎ １０Ｋ濃縮装置（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｇｒｏｕｐ）を用いて、精製プールを０．５〜５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。実験的に得た消光係数を用いて、２８０ｎｍの吸光度によって、精製プールのタンパク質濃度を決定した。精製モノ２０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６の総プロセス収率は、３８％であった。ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて、モノ２０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６の精製プールが９６％純粋であると決定された。
実施例２
直鎖３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ ３−３６
本実施例は、残基１１に付着したｍＰＥＧを伴う実質的に均質なモノＰＥＧ化（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６の調製を示す。
（ａ）（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ ３−３６ の調製
自動化ペプチド合成装置（モデル４３３Ａ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）を用い、２−（１Ｈ−ベンゾトリゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）活性化（Ｆａｓｔｍｏｃ、０．１５ｍｍｏｌサイクル）でのＦｍｏｃ戦略を用いた固相法によって、（Ｄ１１Ｃ）ＰＹＹ３−３６を合成した。用いた側鎖保護基は、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＨｉｓにはＴｒｔ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＴｙｒにはｔＢｕ；ＬｙｓにはＢｏｃ；ＡｓｐおよびＧｌｕにはＯｔＢｕ；そしてＡｒｇにはＰｂｆであった。９ｍｌのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、０．５ｇのフェノール、０．５ｍｌのＨ２Ｏ、０．５ｍｌのチオアニソールおよび０．２５ｍｌの１，２エタンジチオールの混合物を用いて、室温で４時間、ペプチド−樹脂の切断を完了した。氷冷エチルエーテル中でペプチドを沈殿させ、そしてエチルエーテルで洗浄し、ＤＭＳＯ中で溶解して、そして流速８０ｍｌ／分で、３０分間の１００％溶媒Ａ：０％溶媒Ｂから７０％溶媒Ａ：３０％溶媒Ｂの直線勾配を用いて、Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａｐａｋ Ｃ１８、１５ｕｍ、１００A、５０ｘ３００ｍｍＩＤカラム（カタログ番号ＷＡＴ０１１８０１、Ｗａｔｅｒｓ、マサチューセッツ州ミルフォード）上、逆相ＨＰＬＣによって精製した。溶媒Ａは、０．１％ ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）水溶液である。溶媒Ｂは、アセトニトリル中の０．１％ ＴＦＡ溶液である。ＥＳＩ−ＭＳによって精製ペプチドの分子量を確認し（Ｍ平均＝４０３８）、そして逆相ＨＰＬＣによって純度を評価した（図４）。
（ｂ）直鎖３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ ３−３６ の調製
およそ３０，０００ＭＷの直鎖ｍＰＥＧマレイミド試薬（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ ＭＥ−３００ＭＡ、ＮＯＦ社、日本・東京）を、（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６に、残基１１のシステインのスルフヒドリル基上で選択的にカップリングした。２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ミズーリ州セントルイス）ｐＨ７．０中に溶解した直鎖３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミドに、（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ペプチドを直接添加して、１ｍｇ／ｍｌペプチド濃度および約１：１の相対的ｍＰＥＧ：（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６モル比を生じることによって、該マレイミドを該ペプチドと直ちに反応させた。暗所中、室温で０．５〜２４時間、反応を行った。陽イオン交換クロマトグラフィー上で直ちに精製するため、２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．５中に希釈することによって、反応を停止した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって反応産物を評価した（図５）。
あるいは、上述のように直鎖３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミドをＨＥＰＥＳ中に溶解する代わりに、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ミズーリ州セントルイス）、ｐＨ４．５中に溶解し、そして、（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ペプチドを直接添加して、１ｍｇ／ｍｌペプチド濃度および約１：１の相対的ｍＰＥＧ：（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６モル比を生じることによって、該マレイミドを該ペプチドと直ちに反応させる。暗所中、室温で０．５〜２４時間、反応を行う。反応を直接、陽イオン交換クロマトグラフィー上に装填する。反応産物をＳＥＣ−ＨＰＬＣによって評価する。
（ｃ）直鎖３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ ３−３６ の精製
単回イオン交換クロマトグラフィー工程を用いて、反応混合物から＞９５％に、ＰＥＧ化（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６種を精製した。陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、非修飾（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６およびより大きい分子量種からモノＰＥＧ化（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６を精製した。上述のような、典型的な直鎖３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６反応混合物（１０ｍｇタンパク質）を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５（緩衝液Ａ）中で平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｔｒａｐカラム（５ｍｌ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）上で分画した。ｐＨ７．０の反応混合物を緩衝液Ａで７倍希釈し、そして流速２．５ｍｌ／分でカラム上に装填した。５〜１０カラム体積の緩衝液Ａでカラムを洗浄した。続いて、２０カラム体積の０〜１００ｍＭの直線ＮａＣｌ勾配で、カラムから、多様な（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６種を溶出させた。２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０）によって、溶離液を監視し、そして適切なサイズの分画を収集した。ＳＥＣ ＨＰＬＣによって評価した際のＰＥＧ化の度合いに応じて分画をプールした。次いで、Ｖｉｖａｓｐｉｎ １０Ｋ濃縮装置（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｇｒｏｕｐ）中で、精製プールを０．５〜５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。ＲＰ ＨＰＬＣピーク面積をＰＹＹ３−３６標準曲線（未提示）に比較することによって、精製プールのタンパク質濃度を決定した。図７に示すように、ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて、ＰＥＧ化（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６の精製プールのプロフィールを描いた。
あるいは、上記（ｂ）からのｐＨ４．５の反応物を、流速２．５ｍｌ／分で、カラム上に直接装填して、そして実験的に得た消光係数を用いて、２８０ｎｍの吸光度によって、精製プールの濃度を決定する。
実施例３
分枝鎖４３Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ ３−３６
本実施例は、残基１０に付着したｍＰＥＧを伴う実質的に均質なモノＰＥＧ化（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６の調製を示す。
（ａ）分枝鎖４３Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ ３−３６ の調製
およそ４３，０００ＭＷの分枝鎖ｍＰＥＧマレイミド試薬（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ ＧＬ２−４００ＭＡ、ＮＯＦ社、日本・東京）を、実施例１（ａ）に記載するように調製した（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６に、残基１０のシステインのスルフヒドリル基上で選択的にカップリングした。
２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ミズーリ州セントルイス）、ｐＨ７．０中に溶解した分枝鎖４３Ｋ ｍＰＥＧマレイミドに、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ペプチドを直接添加して、１ｍｇ／ｍｌペプチド濃度および約１：１の相対的ｍＰＥＧ：（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６モル比を生じることによって、該マレイミドを該ペプチドと直ちに反応させた。暗所中、室温で０．５〜２４時間、反応を行った。陽イオン交換クロマトグラフィー上で直ちに精製するため、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５中に希釈することによって、ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０中の反応を停止した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって反応産物を評価した（図８）。
あるいは、分枝鎖４３Ｋ ｍＰＥＧマレイミドを２０ｍＭ酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ミズーリ州セントルイス）、ｐＨ４．５中に溶解し、そして、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ペプチドを直接添加して、１ｍｇ／ｍｌペプチド濃度および約１：１の相対的ｍＰＥＧ：（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６モル比を生じることによって、該マレイミドを該ペプチドと直ちに反応させる。反応を直接、陽イオン交換クロマトグラフィー上に装填する。
（ｂ）モノＰＥＧ化分枝鎖４３Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ ３−３６ の精製
単回陽イオン交換クロマトグラフィー工程を用いて、非修飾（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６およびより大きい分子量種からモノＰＥＧ化分枝鎖４３Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６種を分離した。上述のような、典型的な分枝鎖４３Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６反応混合物（１０ｍｇタンパク質）を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５（緩衝液Ａ）中で平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｔｒａｐカラム（５ｍｌ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で分画した。ｐＨ７．０の反応混合物を緩衝液Ａで１０倍希釈し、そして流速２．５ｍｌ／分でカラム上に装填した。５〜１０カラム体積の緩衝液Ａでカラムを洗浄した。続いて、２０カラム体積の０〜１００ｍＭの直線ＮａＣｌ勾配で、カラムから、多様な（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６種を溶出させた。２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０）によって、溶離液を監視し、そして適切なサイズの分画を収集した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって評価した際のＰＥＧ化の度合いに応じて分画をプールした。次いで、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ ３濃縮装置（Ａｍｉｃｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）中、あるいはＶｉｖａｓｐｉｎ １０Ｋ濃縮装置（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｇｒｏｕｐ）を用いて、精製プールを０．５〜５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。アミノ酸分析によって、精製プールのタンパク質濃度を定量化した。図９に示すように、ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて、モノＰＥＧ化分枝鎖４３Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６の精製プールのプロフィールを描いた。
あるいは、ＲＰ ＨＰＬＣピーク面積をＰＹＹ３−３６標準曲線（未提示）に比較することによって、タンパク質濃度を決定するか、あるいは実験的に得た消光係数を用いて、２８０ｎｍの吸光度によって、タンパク質濃度を決定する。
実施例４
本実施例は、残基１０で付着した直鎖１２ｋＤ ｍＰＥＧまたは分枝鎖２０ｋＤ ｍＰＥＧを伴う、実質的に均質なモノＰＥＧ化（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６の調製、ならびに残基１１で付着した直鎖２０ｋＤ ｍＰＥＧ、直鎖１２ｋＤ ｍＰＥＧ、または分枝鎖２０ｋＤ ｍＰＥＧを伴う、実質的に均質なモノＰＥＧ化（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６の意図される調製を意図する。
（ａ）直鎖１２Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ ３−３６ の調製
およそ１２，０００ＭＷ）の直鎖ｍＰＥＧマレイミド試薬（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ ＭＥ−１２０ＭＡ、ＮＯＦ社を、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６に、残基１０のシステインのスルフヒドリル基上で選択的にカップリングする。２０ｍＭ酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）ｐＨ４．５中に溶解した、直鎖１２Ｋ ｍＰＥＧマレイミドに、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ペプチドを直接添加して、１ｍｇ／ｍｌペプチド濃度および約１：１の相対的ｍＰＥＧ：（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６モル比を生じることによって、該マレイミドを該ペプチドと直ちに反応させる。暗所中、室温で０．５〜２４時間、反応を行う。２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５中の反応を陽イオン交換クロマトグラフィー上に直接装填する。ＳＥＣ−ＨＰＬＣまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって反応産物を評価する。
（ｂ）直鎖１２Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ ３−３６ の精製
単回イオン交換クロマトグラフィー工程を用いて、反応混合物から＞９５％に、ＰＥＧ化（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６種を精製する。陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、未結合ＰＥＧ、非修飾（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６およびより大きい分子量種からモノＰＥＧ化（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６を分離する。上述のような、典型的な直鎖１２Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６反応混合物（１０ｍｇタンパク質）を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５（緩衝液Ａ）中で平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｔｒａｐカラム（５ｍｌ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で分画する。反応混合物を流速１．０ｍｌ／分でカラム上に装填する。流速２．５ｍｌ／分、４カラム体積の緩衝液Ａでカラムを洗浄する。続いて、流速２．５ｍｌ／分、２５カラム体積の０〜２００ｍＭの直線ＮａＣｌ勾配で、カラムから、多様な（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６種を溶出させる。２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０）によって、溶離液を監視し、そして適切なサイズの分画を収集する。ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって評価した際のＰＥＧ化の度合いに応じて分画をプールする。次いで、Ｖｉｖａｓｐｉｎ １０Ｋ濃縮装置（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｇｒｏｕｐ）を用いて、精製プールを０．５〜５ｍｇ／ｍｌに濃縮する。実験的に得た消光係数を用いて、２８０ｎｍの吸光度によって、精製プールのタンパク質濃度を決定する。ＳＥＣ−ＨＰＬＣまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、１２Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６の精製プールのプロフィールを描く。
（ｃ）分枝鎖２０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ ３−３６ の調製
およそ２０，０００ＭＷの分枝鎖ｍＰＥＧマレイミド試薬（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ ＧＬ２−２００ＭＡ、ＮＯＦ社）を、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６に、残基１０のシステインのスルフヒドリル基上で選択的にカップリングする。２０ｍＭ酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ミズーリ州セントルイス）ｐＨ４．５中に溶解した分枝鎖２０Ｋ ｍＰＥＧマレイミドに、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ペプチドを直接添加して、１ｍｇ／ｍｌペプチド濃度および約１：１の相対的ｍＰＥＧ：（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６モル比を生じることによって、該マレイミドを該ペプチドと直ちに反応させる。暗所中、室温で０．５〜２４時間、反応を行う。２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５中の反応を陽イオン交換クロマトグラフィー上に直接装填する。ＳＥＣ−ＨＰＬＣまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって反応産物を評価する。
（ｄ）分枝鎖２０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ ３−３６ の精製
単回イオン交換クロマトグラフィー工程を用いて、反応混合物から＞９５％に、ＰＥＧ化（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６種を精製する。陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、未結合ＰＥＧ、非修飾（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６およびより大きい分子量種からモノＰＥＧ化（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６を分離する。上述のような、典型的な分枝鎖２０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６反応混合物（１０ｍｇタンパク質）を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５（緩衝液Ａ）中で平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｔｒａｐカラム（５ｍｌ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で分画する。反応混合物を流速１．０ｍｌ／分でカラム上に装填する。流速２．５ｍｌ／分、４カラム体積の緩衝液Ａでカラムを洗浄する。続いて、流速２．５ｍｌ／分、２５カラム体積の０〜２００ｍＭの直線ＮａＣｌ勾配で、カラムから、多様な（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６種を溶出させる。２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０）によって、溶離液を監視し、そして適切なサイズの分画を収集する。ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって評価した際のＰＥＧ化の度合いに応じて分画をプールする。次いで、Ｖｉｖａｓｐｉｎ １０Ｋ濃縮装置（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｇｒｏｕｐ）を用いて、精製プールを０．５〜５ｍｇ／ｍｌに濃縮する。実験的に得た消光係数を用いて、２８０ｎｍの吸光度によって、精製プールのタンパク質濃度を決定する。ＳＥＣ−ＨＰＬＣまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、分枝鎖２０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６の精製プールのプロフィールを描く。
（ｅ）直鎖２０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ ３−３６ の調製
およそ２０，０００ＭＷの直鎖ｍＰＥＧマレイミド試薬（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ ＭＥ−２００ＭＡ、ＮＯＦ社）を、（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６に、残基１１のシステインのスルフヒドリル基上で選択的にカップリングする。２０ｍＭ酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）ｐＨ４．５中に溶解した、直鎖２０Ｋ ｍＰＥＧマレイミドに、（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ペプチドを直接添加して、１ｍｇ／ｍｌペプチド濃度および約１：１の相対的ｍＰＥＧ：（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６モル比を生じることによって、該マレイミドを該ペプチドと直ちに反応させる。暗所中、室温で０．５〜２４時間、反応を行う。２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５中の反応を陽イオン交換クロマトグラフィー上に直接装填する。ＳＥＣ−ＨＰＬＣまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって反応産物を評価する。
（ｆ）直鎖２０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ ３−３６ の精製
単回イオン交換クロマトグラフィー工程を用いて、反応混合物から＞９５％に、ＰＥＧ化（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６種を精製する。陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、未結合ＰＥＧ、非修飾（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６およびより大きい分子量種からモノＰＥＧ化（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６を分離する。上述のような、典型的な直鎖２０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６反応混合物（１０ｍｇタンパク質）を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５（緩衝液Ａ）中で平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｔｒａｐカラム（５ｍｌ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で分画する。反応混合物を流速１．０ｍｌ／分でカラム上に装填する。流速２．５ｍｌ／分、４カラム体積の緩衝液Ａでカラムを洗浄する。続いて、流速２．５ｍｌ／分、２５カラム体積の０〜２００ｍＭの直線ＮａＣｌ勾配で、カラムから、多様な（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６種を溶出させる。２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０）によって、溶離液を監視し、そして適切なサイズの分画を収集する。ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって評価した際のＰＥＧ化の度合いに応じて分画をプールする。次いで、Ｖｉｖａｓｐｉｎ １０Ｋ濃縮装置（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｇｒｏｕｐ）を用いて、精製プールを０．５〜５ｍｇ／ｍｌに濃縮する。実験的に得た消光係数を用いて、２８０ｎｍの吸光度によって、精製プールのタンパク質濃度を決定する。ＳＥＣ−ＨＰＬＣまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、２０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６の精製プールのプロフィールを描く。
（ｇ）直鎖１２Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ ３−３６ の調製
およそ１２，０００ＭＷ）の直鎖ｍＰＥＧマレイミド試薬（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ ＭＥ−１２０ＭＡ、ＮＯＦ社を、（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６に、残基１０のシステインのスルフヒドリル基上で選択的にカップリングする。２０ｍＭ酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ミズーリ州セントルイス）ｐＨ４．５中に溶解した直鎖１２Ｋ ｍＰＥＧマレイミドに、（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ペプチドを直接添加して、１ｍｇ／ｍｌペプチド濃度および約１：１の相対的ｍＰＥＧ：（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６モル比を生じることによって、該マレイミドを該ペプチドと直ちに反応させる。暗所中、室温で０．５〜２４時間、反応を行う。２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５中の反応を陽イオン交換クロマトグラフィー上に直接装填する。ＳＥＣ−ＨＰＬＣまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって反応産物を評価する。
（ｈ）直鎖１２Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ ３−３６ の精製
単回イオン交換クロマトグラフィー工程を用いて、反応混合物から＞９５％に、ＰＥＧ化（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６種を精製する。陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、未結合ＰＥＧ、非修飾（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６およびより大きい分子量種からモノＰＥＧ化（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６を分離する。上述のような、典型的な直鎖１２Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６反応混合物（１０ｍｇタンパク質）を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５（緩衝液Ａ）中で平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｔｒａｐカラム（５ｍｌ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で分画する。反応混合物を流速１．０ｍｌ／分でカラム上に装填する。流速２．５ｍｌ／分、４カラム体積の緩衝液Ａでカラムを洗浄する。続いて、流速２．５ｍｌ／分、２５カラム体積の０〜２００ｍＭの直線ＮａＣｌ勾配で、カラムから、多様な（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６種を溶出させる。２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０）によって、溶離液を監視し、そして適切なサイズの分画を収集する。ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって評価した際のＰＥＧ化の度合いに応じて分画をプールする。次いで、Ｖｉｖａｓｐｉｎ １０Ｋ濃縮装置（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｇｒｏｕｐ）を用いて、精製プールを０．５〜５ｍｇ／ｍｌに濃縮する。実験的に得た消光係数を用いて、２８０ｎｍの吸光度によって、精製プールのタンパク質濃度を決定する。ＳＥＣ−ＨＰＬＣまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、１２Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６の精製プールのプロフィールを描く。
（ｉ）分枝鎖２０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ ３−３６ の調製
およそ２０，０００ＭＷの分枝鎖ｍＰＥＧマレイミド試薬（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ ＧＬ２−２００ＭＡ、ＮＯＦ社）を、（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６に、残基１０のシステインのスルフヒドリル基上で選択的にカップリングする。２０ｍＭ酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ミズーリ州セントルイス）ｐＨ４．５中に溶解した分枝鎖２０Ｋ ｍＰＥＧマレイミドに、（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ペプチドを直接添加して、１ｍｇ／ｍｌペプチド濃度および約１：１の相対的ｍＰＥＧ：（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６モル比を生じることによって、該マレイミドを該ペプチドと直ちに反応させる。暗所中、室温で０．５〜２４時間、反応を行う。２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５中の反応を陽イオン交換クロマトグラフィー上に直接装填する。ＳＥＣ−ＨＰＬＣまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって反応産物を評価する。
（ｊ）分枝鎖２０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ ３−３６ の精製
単回イオン交換クロマトグラフィー工程を用いて、反応混合物から＞９５％に、ＰＥＧ化（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６種を精製する。陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、未結合ＰＥＧ、非修飾（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６およびより大きい分子量種からモノＰＥＧ化（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６を分離する。上述のような、典型的な分枝鎖２０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６反応混合物（１０ｍｇタンパク質）を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５（緩衝液Ａ）中で平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｔｒａｐカラム（５ｍｌ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で分画する。反応混合物を流速１．０ｍｌ／分でカラム上に装填する。流速２．５ｍｌ／分、４カラム体積の緩衝液Ａでカラムを洗浄する。続いて、流速２．５ｍｌ／分、２５カラム体積の０〜２００ｍＭの直線ＮａＣｌ勾配で、カラムから、多様な（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６種を溶出させる。２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０）によって、溶離液を監視し、そして適切なサイズの分画を収集する。ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって評価した際のＰＥＧ化の度合いに応じて分画をプールする。次いで、Ｖｉｖａｓｐｉｎ １０Ｋ濃縮装置（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｇｒｏｕｐ）を用いて、精製プールを０．５〜５ｍｇ／ｍｌに濃縮する。実験的に得た消光係数を用いて、２８０ｎｍの吸光度によって、精製プールのタンパク質濃度を決定する。ＳＥＣ−ＨＰＬＣまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、分枝鎖２０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６の精製プールのプロフィールを描く。
実施例５
生化学的性質決定
エレクトロスプレー質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびＳＥＣ ＨＰＬＣおよびＲＰ ＨＰＬＣを含む多様な生化学的方法によって、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６、（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６、ならびに（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６および（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６のＰＥＧ化型を、それぞれ、性質決定した。
（Ａ）ポジティブモードの１１００シリーズのＬＣ／ＭＳＤエレクトロスプレー質量分析装置（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州パロアルト）上、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）を行った（実施例１（ａ）、２（ａ））。
（Ｂ）３分間の１００％溶媒Ａ、０％溶媒Ｂから９５％溶媒Ａ、５％溶媒Ｂ、次いで、１２分間の９５％溶媒Ａ、５％溶媒Ｂから５０％溶媒Ａ、５０％溶媒Ｂへの直線勾配を用い、１．５ｍｌ／分の速度で、ＺＯＲＢＡＸ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ−Ｃ８、４．６ｘ１５０ｍｍ、５ｍｍカラム（カタログ番号９９３９６７−９０６、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州パロアルト）上で、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ペプチドの分析のため、逆相クロマトグラフィーを行った（図１および４）（実施例１（ａ））。溶媒Ａは、０．１％ ＴＦＡ水溶液である。溶媒Ｂは、アセトニトリル中の０．１％ ＴＦＡ溶液である。
４８分間の８０％溶媒Ａ、２０％溶媒Ｂから４０％溶媒Ａ、６０％溶媒Ｂの直線勾配を用い、０．２ｍｌ／分の流速で、Ｖｙｄａｃ Ｃ１８（２．１ｘ２５０ｍｍ）カラム（カタログ番号２１８ＭＳ５５２、Ｖｙｄａｃ、カリフォルニア州ヘスペリア）上、ＰＥＧ化（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６および（Ｄ１１Ｃ）ＰＹＹ３−３６（未提示）の定量化のための逆相クロマトグラフィーを行った。（実施例１Ｃ、２Ｃ）。溶媒Ａは、０．１％ ＴＦＡ水溶液である。溶媒Ｂは、アセトニトリル中の０．０８５％ ＴＦＡ溶液である。
（Ｃ）サイズ排除高性能液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）
非変性ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６いずれかと、直鎖３０Ｋまたは分枝鎖４３Ｋ ｍＰＥＧの反応混合物、その陽イオン交換精製プール、および最終精製産物を評価した（実施例１（ｂ）および（ｃ）、２（ｂ）および（ｃ））。Ｓｈｏｄｅｘ ＫＷ８０４またはＴＳＫ Ｇ４０００ＰＷＸＬ（Ｔｏｓｏｈａａｓ）を用い、２０ｍＭリン酸、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中、流速１．０ｍｌ／分で、分析的非変性ＳＥＣ−ＨＰＬＣを行った（場合によって、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ７．８ｍｍＸ３０ｃｍ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）。ＰＥＧ化は、タンパク質の流体力学的体積を非常に増加させ、より早い保持時間へのシフトを生じた。３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミドに（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６を加えた反応混合物では、残渣非修飾（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６に対応する小さいピークが観察されるとともに、ＰＥＧ化ペプチド種に対応する新規ピークが観察された（図２）。３０Ｋ ｍＰＥＧ（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６および分枝鎖４３Ｋ ｍＰＥＧ（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６反応混合物中に、新規種が観察され、非修飾（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６は、非常にわずかしか残っていなかった（図５および８）。ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーによって、これらのＰＥＧ化および非ＰＥＧ化種を分画し、そして続いて、生じた精製モノｍＰＥＧ（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６およびｍＰＥＧ（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６種が、非変性ＳＥＣ上の単一ピークとして、＞９５％純度で溶出したことが示された（図６、７および９）。ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー工程は、未結合ｍＰＥＧ、（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６およびより大きい分子量の種を、モノＰＥＧ化直鎖３０Ｋおよび分枝鎖４３Ｋ ｍＰＥＧ（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６またはｍＰＥＧ（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６から効果的に取り除いた。
（Ｄ）ＳＤＳ ＰＡＧＥ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（実施例１（ｃ））もまた用いて、反応物、陽イオン交換精製分画（図３）、および最終精製産物を評価した。還元条件下および非還元条件下で、１ｍｍ厚の１０−ＮｕＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）上、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、そしてＮｏｖｅｘ Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ＣｏｏｍａｓｓｉｅＴＭ Ｇ−２５０染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）を用いて染色した。
生物学的アッセイ
慣用的アッセイにおいて、そして以下に記載するｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイにおいて、アゴニストの活性によって、哺乳動物（特にヒト）の体重増加の減少および肥満治療における、薬学的活性剤としての本発明のＰＹＹアゴニストの有用性を立証してもよい。こうしたアッセイはまた、本発明のＰＹＹアゴニストの活性を、既知の化合物の活性と比較しうる手段も提供する。
食物摂取（Ｆｏｏｄ Ｉｎｔａｋｅ）研究
絶食が誘導する再摂食アッセイ：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、メイン州バーハーバー）を、ケージあたり２匹ずつ飼育した。１２：１２明期：暗期の周期（５：００ＡＭ点灯、５：００ＰＭ消灯）で飼育し、ペレットＲＭＨ３０００ Ｐｕｒｉｎａげっ歯類飼料（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ， Ｉｎｃ．ニュージャージー州ニューブルンスウィック）を与え、そして自由に水を飲ませた。マウスは、７〜８週齢で到着し、そして研究前に最低１０日間順応させた。研究当日、マウスは９〜１２週齢であった。研究開始前日、新鮮な寝床で、そして食物がないが、水には自由にアクセスできるケージにマウスを入れた。マウスを一晩（２０〜２４時間）絶食させた。研究当日、マウスにＩＰ注射を投与し（用量体積＝５ｍｌ／ｋｇ）、ケージに戻し、そしてあらかじめ重量を測定した食物を、ケージに直ちに入れた。用いた投薬ビヒクルは、２０ｍＭ酢酸Ｎａ、ｐＨ４．５、５０ｍＭ ＮａＣｌであり、そしてＰＥＧ化を伴わない活性ＰＹＹ実体に関して、用量を計算した。ビヒクル対照、３つの用量（０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、および１．０ｍｇ／ｋｇ）の天然ＰＹＹ、３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６、および４３Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６を試験した。投薬２時間後、４時間後、６時間後、および２４時間後に、食物の重量を再度測定した。こぼれたものに関して寝床をチェックし、この重量を測定し、そして計算に含めた。出発食物重量から各時点の食物重量を減じることによって、累積食物摂取を計算した。（ＦＩ処置−ＦＩビヒクル）／ＦＩビヒクル＊１００によって、阻害パーセント（％）を計算した。
図１０は、天然ＰＹＹ３−３６（図１０Ａ）および３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６（図１０Ｂ）の３つの用量をＩＰ注射した後の、６時間の累積摂取を示す。天然ＰＹＹ３−３６および３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６はどちらも、６時間の経過に渡って、累積食物摂取の用量依存性減少を示した。
４３Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６もまた、６時間（図１１Ａ）および２４時間（図１１Ｂ）の累積食物摂取の用量依存性減少を生じた。しかし４３Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６が累積食物摂取を減少させる効果は、６時間後および２４時間後の両方で、同じ用量（０．１ｍｇ／ｋｇ）の３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６によって示されるものほど大きくはなかった。
また、０．１ｍｇ／ｋｇ（ＳＣ）の注射後、絶食が誘導する再摂食に対する３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６の効果を、３０Ｋマレイミド（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６の効果にも比較した。３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ポリペプチドは、以下の表に示すように、２４時間の時間経過全体で、累積食物摂取（ＦＩ）減少を引き起こしたが、効果は、３０Ｋマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６に関して観察されたものほど大きくはなかった。
Figure 2008528050
直鎖２０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６の効果を、３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６に比較した（どちらも実施例１）。０．１ｍｇ／ｋｇ（ＩＰ）の用量を雄マウスに注射する１つの研究において、結果は、以下の表におけるとおりである。
Figure 2008528050
同様に、０．１ｍｇ／ｋｇ用量（ＳＣ）後、直鎖２０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６と３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６の摂食効果を比較する第二の研究において、結果は、以下の表におけるとおりである。
Figure 2008528050
ＳＣ注射後の血漿ＰＹＹ濃度は以下のとおりであった。
Figure 2008528050
自発的食物摂取アッセイ：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を個々に飼育し、そして研究前に２週間順応させた。これらを１２／１２明期／暗期の周期に維持し、粉末飼料を自由に摂食させ、そして水に自由にアクセスさせた。投薬前日、マウスを食物摂取チャンバーにいれ、そして１日順応させた。翌日、消灯直前（４：００ＰＭ）、マウスにＩＰまたは皮下（ＳＣ）注射を投与した。全時間経過に渡って、食物摂取を１０分間隔で自動的に監視し、そして体重を毎日測定した。天然ＰＹＹ３−３６および３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６のＩＰ注射に関して（図１２）、そして天然ＰＹＹ３−３６および３０Ｋ ＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６のＳＣ注射に関して（図１３）、結果を示す。天然ＰＹＹ３−３６および３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６両方が、ビヒクル処置マウスに比較した際、累積食物摂取の即時減少を生じたが、３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６によって引き起こされた食物摂取減少効果は、天然ＰＹＹ３−３６によって引き起こされた効果より、はるかにより長い期間であった。より長く続く食物摂取効果と合わせて、３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６はまた、単回注射（０．１ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）後、持続する血漿曝露も示した（図１４）。天然ＰＹＹ３−３６が、１６ｍｌ／分／ｋｇのクリアランス速度および３８ｎＭのＣｍａｘを有する一方、３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６は、０．２ｍｌ／分／ｋｇのクリアランス速度および２６７ｎＭのＣｍａｘを有した。ｈＰＹＹラジオイムノアッセイキット（Ｌｉｎｃｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．、ミズーリ州セントルイス）を用いて、マウスにおける血漿ＰＹＹ値を測定した。
ｏｂ／ｏｂマウスでのミニポンプアッセイ：８〜９週齢の雄ｏｂ／ｏｂマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（ｎ＝２６）を正常飼料で飼育し、そしてビヒクル（生理食塩水）、ＰＹＹ３−３６（０．１ｍｇ／ｋｇ／日）、または３０Ｋ ＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６（０．０３ｍｇ／ｋｇ／日）のいずれかを投与する、１４日間の浸透圧ミニポンプ（Ａｌｚａ社、カリフォルニア州マウンテンビュー）を移植した。食物重量および体重を毎日測定した。体脂肪組成を第０日および第１３日に決定した。研究終了時に血液試料を採取した。これらの群に関して、食物摂取、体重、または体脂肪組成に有意な相違はなかった。先に記載されるようなラジオイムノアッセイによって、研究終了時に血漿ＰＹＹを測定した。天然ＰＹＹ３−３６処置群において、血漿ＰＹＹレベルは１５±２ｎｇ／ｍｌと測定され；３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６処置群では、血漿ＰＹＹレベルは１３２±２２ｎｇ／ｍｌであった。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合研究
リガンド結合に関するＳＰＡ：
リガンド結合に関するＳＰＡは、Ｙ２受容体からの放射標識ＰＹＹの競合的置換を測定し、そしてＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（カタログ番号ＲＰＮＱ ００８５）から得られるレクチン、小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）でコーティングされた、シンチラント含有微小球体（ＳＰＡビーズ）を利用する。５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）、１４５ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭグルコース、０．１％ ＢＳＡ、５％ ＤＭＳＯおよびＲｏｃｈｅプロテアーゼ阻害剤で構成される細胞採取緩衝液を用いて、表面上にＹ２受容体を発現するＫＡＮ−ＴＳヒト神経芽細胞腫細胞（Ｆｕｈｌｅｎｄｏｒｆら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７：１８２−１８６， １９９０）を調製した。５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．０２５％（ｗ／ｖ）バシトラシンおよび０．０２５％アジ化ナトリウムで構成されるアッセイ緩衝液中、５０，０００細胞／ウェル、１２５Ｉ−ＰＹＹ（４０，０００ｃｐｍ／ウェル）およびＳＰＡビーズ（０．５ｍｇ／ウェル）を用い、９６ウェル形式中、３つ組で、ＳＰＡアッセイを行った。多様な濃度（０．０３２〜５００ｎＭ）の試験リガンドをアッセイ混合物に添加し、次いでこれを振盪しながら、室温で１６〜２４時間インキュベーションした。プレートを１時間放置し、そして次いでＭｉｃｒｏＢｅｔａ（登録商標）Ｔｒｉｌｕｘ検出装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、マサチューセッツ州ボストン）を用いて計測した。実施例１のｈＰＹＹ３−３６および３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６に関する結果を図１５に示す。
ＮＰＹ Ｙ２Ｒ受容体でのＧＴＰγ［ ３５ Ｓ］結合アッセイ
機能アッセイは、ＮＥＮ Ｆｌａｓｈｐｌａｔｅｓ（９６ウェル形式）で行うＧＴＰγ［３５Ｓ］結合アッセイである。Ｂａｓｓら， Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍ． ５０：７０９−７１５， １９９０に記載されるように、ＫＡＮ−ＴＳ細胞から膜を調製した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｈｃｌ、ｐＨ７．４、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ ＥＧＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５μＭ ＧＤＰ、０．１％ウシ血清アルブミン、および以下のプロテアーゼ阻害剤：１００μｇ／ｍｌのバシトラシン、１００μｇ／ｍｌのベンズアミジン、５μｇ／ｍｌのアプロチニン、５μｇ／ｍｌのロイペプチンで構成されるアッセイ緩衝液中、１００ｐＭ ＧＴＰγ［３５Ｓ］およびウェルあたり１０μｇの膜を用いて、２つ組で、９６ウェルＦｌａｓｈＰｌａｔｅＴＭ形式において、ＧＴＰγ［３５Ｓ］結合アッセイを行った。次いで、アッセイ混合物を、増加する濃度の試験化合物（６点濃度曲線；１０−１２Ｍ〜１０−５Ｍの範囲内のｌｏｇ希釈）と３０℃で６０分間インキュベーションした。次いで、ＦｌａｓｈＰｌａｔｅｓＴＭを、２０００Ｘｇで１０分間遠心分離した。次いで、ＭｉｃｒｏｂｅｔａＴＭ検出装置を用いて、ＧＴＰγ［３５Ｓ］結合刺激を定量化した。ＧｒａｐｈｐａｄによるＰｒｉｓｍを用いて、ＥＣ５０および固有活性計算を行った。実施例１のｈＰＹＹ３−３６および３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６に関する結果を図１６に示す。実施例１の３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６および２０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６のＥＣ５０値は匹敵した（例えば、同じアッセイで測定した際、４．３ｎＭおよび４．６ｎＭ）。
図１は、Ｚｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ−Ｃ８カラム上の精製（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ペプチドの逆相ＨＰＬＣ出力記録である。 図２は、Ｓｈｏｄｅｘ ８０４ ＳＥＣカラム上の、直鎖３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミドに（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６を加えた反応混合物のサイズ排除ＨＰＬＣ出力記録である。 図３は、直鎖３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６のＳＰ Ｈｉｔｒａｐ精製由来の分画のＳＤＳ ＰＡＧＥの写真である。ＭＷ＝分子量標準；Ｌ＝カラム装填物；ＦＴ＝フロースルー；４〜２３＝溶出分画。 図４は、Ｚｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ−Ｃ８カラム上の精製（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ペプチドの逆相ＨＰＬＣ出力記録である。 図５は、Ｓｈｏｄｅｘ ８０４ ＳＥＣカラム上の、直鎖３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミドに（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６を加えた反応混合物のサイズ排除ＨＰＬＣ出力記録である。 図６は、Ｓｈｏｄｅｘ ８０４ ＳＥＣカラム上の精製直鎖３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６産物の溶出プロフィールを示す、サイズ排除ＨＰＬＣ出力記録である。 図７は、Ｓｈｏｄｅｘ ８０４ ＳＥＣカラム上の精製直鎖３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６産物の溶出プロフィールを示す、サイズ排除ＨＰＬＣ出力記録である。 図８は、Ｓｈｏｄｅｘ ８０４ ＳＥＣカラム上の、グリセロール分枝鎖４３Ｋ ｍＰＥＧマレイミドに（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６を加えた反応混合物のサイズ排除ＨＰＬＣ出力記録である。 図９は、Ｓｈｏｄｅｘ ８０４ ＳＥＣカラム上の精製グリセロール分枝鎖４３Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６産物の溶出プロフィールを示す、サイズ排除ＨＰＬＣ出力記録である。 図１０は、腹腔内（ＩＰ）注射後の絶食マウスにおける累積食物摂取の阻害のグラフである。図１０Ａは、ビヒクル群に比較した際の、天然ＰＹＹ３−３６の用量効果を示す。図１０Ｂは、直鎖３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６の用量効果を示す。 図１１は、ビヒクルおよび直鎖３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ＰＹＹ３−３６に比較した際の、グリセロール分枝鎖４３Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ＰＹＹ３−３６の、絶食マウスにおけるＩＰ注射の食物摂取効果を示す。図１１Ａは、注射後６時間に渡る反応を示す線グラフである。図１１Ｂは、注射後２４時間に渡る効果を比較する棒グラフである。 図１２は、ビヒクル、ＰＹＹ３−３６、および直鎖３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ＰＹＹ３−３６のＩＰ注射の、自発的に給餌させたマウスに対する効果を示す。図１２Ａは、食物摂取に対する効果を示し、そして図１２Ｂは、体重に対する効果を示す。 図１３は、ビヒクル、ＰＹＹ３−３６、および直鎖３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６の皮下（ＳＣ）注射の、自発的に給餌させたマウスに対する効果を示す。図１３Ａは、食物摂取に対する効果を示し、そして図１３Ｂは、体重に対する効果を示す。 図１４は、０．１ｍｇ／ｋｇ ＩＰ注射後のマウスにおける、ＰＹＹに対する血漿曝露を示す。図１４Ａは、ｈＰＹＹ３−３６の注射後の血漿ＰＹＹレベルを示し、そして図１４Ｂは、直鎖３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６の注射後の血漿ＰＹＹレベルを示す。 図１５は、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）由来のＰＹＹ３−３６または直鎖３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ＰＹＹ３−３６に関する濃度反応曲線のグラフであり、この中で、リガンドは、ＫＡＮ−ＴＳ細胞上に発現されたＹ２Ｒへの結合に関して、１２５Ｉ−ＰＹＹ１−３６と競合する。 図１６は、ＫＡＮ−ＴＳ膜上に発現されたＹ２ＲとのＧＴＰガンマ［３５Ｓ］の結合アッセイに由来するＰＹＹ３−３６または直鎖３０Ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ＰＹＹ３−３６に関する濃度反応曲線のグラフである。

Claims (28)

  1. アミノ酸配列ＩＫＰＥＡＰＧＣＤＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬＶＴＲＱＲＹ−ＮＨ２［配列番号３］を有するポリペプチド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６またはその薬学的に許容しうる塩。
  2. アミノ酸配列ＩＫＰＥＡＰＧＥＣＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬＶＴＲＱＲＹ−ＮＨ２［配列番号４］を有するポリペプチド（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６またはその薬学的に許容しうる塩。
  3. ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリペプチド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６を含むコンジュゲート。
  4. 式３
    Figure 2008528050
     式中、ＰＥＧはメトキシＰＥＧであり、そして直鎖または分枝鎖であり、そして約１ｋＤ〜５０ｋＤの範囲内の平均分子量を有し、
    Ｌは、式
    −Ｏ（ＣＨ２）ｐＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｒ−
    の基であり、ここで各ｐおよびｒは、独立に１〜６の整数であるか、
    またはＬは、式
    −ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｓ−
    の基であり、ここでｓは１〜６の整数である、そして
    −ＳＲは、ポリペプチド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６または（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６であり、ここでＳはシステイン・チオール基のイオウ原子である
    を有する、請求項３のコンジュゲート。
  5. ｍＰＥＧが直鎖である、請求項４のコンジュゲート。
  6. 式４
    Figure 2008528050
     式中、ｎは約６００〜７５０の範囲内の整数であり、そして−ＳＲはポリペプチド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６であり、ここでＳはシステイン・チオール基のイオウ原子である
    を有する、請求項５のコンジュゲート。
  7. （ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ部分が、約３０ｋＤの平均分子量を有する、請求項６のコンジュゲート。
  8. 式４
    Figure 2008528050
     式中、ｎは約３７５〜５２５の範囲内の整数であり、そして−ＳＲはポリペプチド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６であり、ここでＳはシステイン・チオール基のイオウ原子である
    を有する、請求項５のコンジュゲート。
  9. （ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ部分が、約２０ｋＤの平均分子量を有する、請求項８のコンジュゲート。
  10. 式４
    Figure 2008528050
     式中、ｎは約６００〜７５０の範囲内の整数であり、そして−ＳＲはポリペプチド（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６であり、ここでＳはシステイン・チオール基のイオウ原子である
    を有する、請求項５のコンジュゲート。
  11. （ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ部分が、約３０ｋＤの平均分子量を有する、請求項１０のコンジュゲート。
  12. ｍＰＥＧが分枝鎖である、請求項４のコンジュゲート。
  13. ｍＰＥＧがグリセロール分枝鎖である、請求項１２のコンジュゲート。
  14. 式５
    Figure 2008528050
     式中、各ｍはほぼ同じであり、そして約４５０〜５００の範囲内の整数であり、そして−ＳＲは（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ポリペプチドであり、ここでＳはシステイン・チオール基のイオウ原子である
    を有する、請求項１３のコンジュゲート。
  15. 各（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ部分が、約２０ｋＤ〜２２ｋＤの範囲内の平均分子量を有する、請求項１４のコンジュゲート。
  16. 式５
    Figure 2008528050
     式中、各ｍは同じであり、そして約４５０〜５００の範囲内の整数であり、そして−ＳＲは（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ポリペプチドであり、ここでＳはシステイン・チオール基のイオウ原子である
    を有する、請求項１３のコンジュゲート。
  17. 各（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ部分が、約２０ｋＤ〜２２ｋＤの範囲内の平均分子量を有する、請求項１６のコンジュゲート。
  18. 式５
    Figure 2008528050
     式中、各ｍはほぼ同じであり、そして−ＳＲは（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ポリペプチドであり、ここでＳはシステイン・チオール基のイオウ原子である
    を有する、グリセロール分枝鎖４３ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｅ１０Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６コンジュゲート、またはその薬学的に許容しうる塩。
  19. 式５
    Figure 2008528050
     式中、各ｍはほぼ同じであり、そして−ＳＲは（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６ポリペプチドであり、ここでＳはシステイン・チオール基のイオウ原子である
    を有する、グリセロール分枝鎖４３ｋ ｍＰＥＧマレイミド（Ｄ１１Ｃ）ｈＰＹＹ３−３６コンジュゲート、またはその薬学的に許容しうる塩。
  20. 請求項１もしくは２のポリペプチドまたは請求項３〜１９のいずれか１項のコンジュゲート、あるいはその薬学的に許容しうる塩、および薬学的に許容しうるキャリアーを含む、薬剤組成物。
  21. 抗肥満剤である第二の剤をさらに含む、請求項２０の薬剤組成物。
  22. 肥満または過剰体重である状態を治療する必要がある哺乳動物において、肥満または過剰体重である状態を治療する方法であって、請求項１もしくは２のポリペプチドまたは請求項３〜１９のいずれか１項のコンジュゲート、あるいはその薬学的に許容しうる塩の療法的有効量を哺乳動物に末梢投与することを含む、前記方法。
  23. 哺乳動物において、体重増加を阻害するか、食物摂取を減少させるかまたはカロリー摂取を減少させる方法であって、請求項１もしくは２のポリペプチドまたは請求項３〜１９のいずれか１項のコンジュゲート、あるいはその薬学的に許容しうる塩の療法的有効量を哺乳動物に末梢投与することを含む、前記方法。
  24. ポリペプチド、コンジュゲートまたは塩を、抗肥満剤である第二の剤と組み合わせて投与する、請求項２２または２３の方法。
  25. 哺乳動物において、肥満または過剰体重である状態を治療するか、あるいは哺乳動物において、体重増加を阻害するか、食物摂取を減少させるかまたはカロリー摂取を減少させるための薬剤製造における、請求項１もしくは２のポリペプチドまたは請求項３〜１９のいずれか１項のコンジュゲート、あるいはその薬学的に許容しうる塩の使用。
  26. 請求項１または２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  27. 配列番号３または配列番号４に示すようなアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する、モノクローナル抗体。
  28. 前記ポリペプチドがシステイン残基でＰＥＧ化されている、請求項２７のモノクローナル抗体。
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