ES2322293T3 - Agonistas de pyy y usos de los mismos. - Google Patents
Agonistas de pyy y usos de los mismos. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2322293T3 ES2322293T3 ES06710361T ES06710361T ES2322293T3 ES 2322293 T3 ES2322293 T3 ES 2322293T3 ES 06710361 T ES06710361 T ES 06710361T ES 06710361 T ES06710361 T ES 06710361T ES 2322293 T3 ES2322293 T3 ES 2322293T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- hpyy
- baselineskip
- polypeptide
- conjugate
- mpeg
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Immunology (AREA)
- Child & Adolescent Psychology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
El polipéptido (E10C)hPYY 3-36,que tiene la secuencia de aminoácidos IKPEAPGCDASPEELNRYYASLRHYL NLVTRQRY-NH2 [SEQ ID N.º: 3], o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Description
Agonistas de PYY y usos de los mismos.
La presente invención se refiere a agonistas de
PYY, más particularmente a variantes de PYY_{3-36}
y a derivados pegilados de PYY_{3-36} y variantes
de PYY_{3-36}, a composiciones que contienen tales
agonistas, ácidos nucleicos aislados que codifican tales agonistas
de PYY, y al uso de tales agonistas o composiciones en el
tratamiento de obesidad y co-morbilidades de la
misma, o para disminuir el apetito, toma de comida, o toma calórica
en un mamífero.
La obesidad es de gran interés para la salud
pública principal debido a su prevalencia incremental y los riesgos
para la salud asociados. Además, la obesidad puede afectar a la
calidad de vida de las personas a través de movilidad limitada y
resistencia física limitada, así como a través de discriminación
social, académica y laboral.
La obesidad y el sobrepeso se describen
generalmente por el índice de masa corporal (BMI), que se
correlaciona con la grasa corporal total y sirve como medida del
riesgo de ciertas enfermedades. El BMI se calcula dividiendo el
peso, en kilogramos, por altura, en metros al cuadrado (kg/m^{2}).
El sobrepeso se describe típicamente como un BMI de
25-29,9 kg/m^{2}, y la obesidad se define
típicamente como un BMI de 30 kg/m^{2} o más alto. Véase, por
ejemplo, Nacional Heart, Lung, and Blood Institute, Clinical
Guidelines on the Identification, Evaluation, and Treatment of
Overweight and Obesity in Adults, the Evidence Report, Washington,
DC: U.S. Department of Health and Human Services, NIH publication
n.º: 98-4083 (1998).
Estudios recientes han encontrado que la
obesidad y sus riesgos para la salud asociados no se limitan a los
adultos, sino que afectan también a los niños y adolescentes en un
nivel sorprendente. De acuerdo con el Centro de Control de
Enfermedades, el porcentaje de niños y adolescentes los cuales son
definidos como demasiado gordos se ha doblado desde principios de
los 70, y aproximadamente el 15 por cientos de los niños y
adolescentes están en la actualidad demasiado gordos. Factores de
riesgo de enfermedad cardiaca, tales como colesterol alto y presión
sanguínea alta, se dan con frecuencia incrementada en niños y
adolescentes con sobrepeso en comparación con sujetos de peso
normal de una edad similar. Además, la diabetes de tipo 2,
previamente considerada como una enfermedad de adultos, se ha
incrementado espectacularmente en niños y adolescentes. Las
condiciones de sobrepeso y obesidad están muy ligadas a la diabetes
de tipo 2. Se ha estimado recientemente que los adolescentes con
sobrepeso tienen una posibilidad del 70% de llegar a ser adultos con
sobrepeso u obesidad. La probabilidad se incrementa a
aproximadamente el 80% si al menos uno de los padres está demasiado
gordo u obeso. La consecuencia más inmediata de ser demasiado gordo
como se percibe por los propios niños es discriminación social.
Los individuos demasiado gordos u obesos tienen
riesgo incrementado de achaques, tales como hipertensión,
dislipidemia, diabetes de tipo 2 (no dependiente de insulina),
resistencia a insulina, intolerancia a glucosa, hiperinsulinemia,
enfermedad coronaria cardiaca, angina de pecho, fallo cardíaco
congestivo, apoplejía, cálculos biliares, colecistitis,
colelitiasis, gota, osteoartritis, apnea del sueño obstructiva y
problemas respiratorios, enfermedad de la vesícula biliar, ciertas
formas de cáncer (por ejemplo, endometrial, de mama, de próstata, y
de colon) y trastornos fisiológicos (tales como depresión,
trastornos de la alimentación, imagen distorsionada del cuerpo y
baja autoestima). Las consecuencias negativas para la salud de la
obesidad la hacen la segunda causa líder de muerte prevenible en
los Estados Unidos y transmiten un efecto económico y psicosocial
significativo a la sociedad. Véase, McGinnis M., Foege WH.,
"Actual Causes of Death in the United States", JAMA 270:
2207-12, 1993.
La obesidad se reconoce en la actualidad como
una enfermedad crónica que requiere tratamiento para reducir sus
riesgos para la salud asociados. Aunque la pérdida de peso es un
resultado importante del tratamiento, una de las principales metas
de la gestión de la obesidad es mejorar los valores cardiovasculares
y metabólicos para reducir la morbilidad y la mortalidad
relacionadas con la obesidad. Se ha mostrado que la pérdida el
5-10% del peso corporal puede mejorar
significativamente los valores metabólicos, tales como glucosa en
sangre, presión sanguínea, y concentraciones lipídicas. Así, se
cree que una reducción del 5-10% en peso corporal
puede reducir morbilidad y
mortalidad.
mortalidad.
Los fármacos de prescripción disponibles
actualmente para gestionar la obesidad reducen generalmente el peso
disminuyendo la absorción de grasa de la dieta, como con orlistat, o
creando un déficit de energía reduciendo la toma de comida y/o
incrementando el gasto de energía, como se ve con sibrutramina. La
búsqueda de alternativas para agentes antiobesidad actualmente
disponibles ha tomado varios caminos uno de los cuales se ha
centrado en ciertos péptidos intestinales que se han implicado en
modular la saciedad tales como el péptido YY (PYY).
PYY es un miembro de la familia de hormonas de
polipéptidos pancreáticos (PP) (junto con PP y neuropéptido Y
(NPY)). Así como sucede con los otros miembros de la familia, PYY es
un péptido de 36 aminoácidos, amidado de forma terminal. Es un
péptido endocrino intestinal que se aisló inicialmente a partir de
intestino porcino (Tatemoto y Mutt, Nature 285:
417-418, 1980) y se mostró subsiguientemente que
reduce la toma de comida alta en grasas en ratas después de
administración periférica (Morley y Flood, Life Sciences 41:
2157-2165, 1987). Se sabe que existen múltiples
formas moleculares almacenadas y circulantes de PYY (Chen y col.,
Gastroenterology 87: 1332-1338, 1984; y Roddy, y
col., Regul Pept 18: 201-212, 1987). Una forma tal,
PYY_{3-36}, se aisló a partir de extractos
mucosales colónicos humanos (Eberlein y col., Peptides 10:
797-803, 1989), y se encontró que es la forma
predominante de PYY en plasma postprandial humano (Grandt y col.,
Regul. Pept. 51: 151-159, 1994). Se ha mostrado que
PYY_{3-36} es un agonista selectivo de receptor Y2
(YR2) de NPY de alta afinidad (Keire y col., Am. Physiol.
Gastrointest. Liver Physiol. 279: G126-G131, 2000).
Se ha mostrado que la administración periférica de
PYY_{3-36} reduce marcadamente la toma de comida y
la ganancia de peso en ratas, el apetito y la toma de comida en
humanos, y produce disminución de toma de comida en ratones, pero no
en ratones Y2R-nulos, lo que se dijo que sugiere
que el efecto de toma de comida requiere el Y2R. En estudios de
humanos, se encontró que la infusión de
PYY_{3-36} disminuyó significativamente el apetito
y redujo significativamente la toma de comida en el 33% durante 24
horas. La infusión de PYY_{3-36} para alcanzar las
concentraciones circulatorias post-prandiales
normales del péptido condujo a niveles séricos de pico de
PYY_{3-36} en 15 minutos, seguidos por un declive
rápido a niveles basales en 30 minutos. Se mostró que hubo
inhibición significativa en el periodo de 12 horas tras la infusión
de PYY_{3-36}, pero no hubo esencialmente ningún
efecto en toma de comida en el periodo de 12 horas a 24 horas. En
un estudio de ratas, la administración repetida de
PYY_{3-38} intraperitoneal (inyecciones dos veces
diariamente durante 7 días) redujo la toma acumulativa de comida
(Batterham, y col., Nature 418: 650-654, 2002).
Los fármacos basados en polipéptidos están
frecuentemente unidos covalentemente a polímeros tales como
polietilenoglicoles para prolongar su semivida in vivo. Sin
embargo, esto conduce frecuentemente a pérdida drástica de actividad
biológica o farmacológica (Shechter y col., FEBS Letters 579:
2439-2444, 2005; Fuergetes y Abuchowski, J. Control
Release 11: 139-148, 1990; Katre, Adv. Drug. Del.
Sys. 10: 91-114, 1993; Bailon y Berthold. Pharm.
Sci. Technol. Today 1:352-356, 1996; Nucci y col.,
Avd. Drug. Delivery Rev. 6, 1991; Delgado y col., Critical Rev.
Ther. Drug Carrier Syst. 9: 249-304, 1992; Fung y
col., Polym. Preprints 38: 565-566, 1997; Reddy,
Ann. Pharmacother. 34: 915-923, 2000; Veronese,
Biomaterials 22: 405-417, 2001). Por ejemplo,
Shechter y col, supra, comunicaron que la pegilación de 40
KD de PYY_{3-36} mediante química estándar, a
través de formación de un enlace estable (PEG de 40
KD-PYY_{3-36}), condujo a su
inactivación completa en estudios de toma de comida con ratones
(inyección subcutánea). Ellos comunicaron también, sin embargo, que
la pegilación reversible de PYY_{3-36} (PEG de 40
kD-FMS-PYY_{3-36})
dio como resultado un incremento de ocho veces en la semivida
funcional (24 horas frente a 3 horas). Véanse también Solicitudes de
Patente PCT N.^{os}: WO 2004/089279 y WO 03/026591.
La presente invención se refiere a agonistas de
PYY que son variantes de PYY_{3-36}.
En un aspecto de la presente invención el
agonista de PYY es una variante de un PYY_{3-36}
humano en el que el residuo 10 (ácido glutámico) o el residuo 11
(ácido aspártico) se ha reemplazado con cisteína, que tiene una
funcionalidad que es conjugable con un polímero hidrófilo tal como
polietilenoglicol (PEG).
Las variantes correspondientes son, por lo
tanto, (E10C)PYY_{3-36} y
(D11C)PYY_{3-36}.
En una realización preferida de la invención, el
agonista de PYY es el polipéptido
(E10C)hPYY_{3-36}, que tiene la secuencia
de aminoácidos
IKPEAPGCDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH_{2} [SEQ ID
N.º: 3], o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En una realización preferida, el agonista de PYY
es el polipéptido (D11C)hPYY_{3-36} que
tiene la secuencia de aminoácidos
IKPEAPGECASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH_{2} [SEQ ID
N.º: 4], o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Lo más preferiblemente, el agonista es
(E10C)hPYY_{3-36}.
El agonista de PYY de la invención está
preferiblemente conjugado con un polímero hidrófilo, preferiblemente
un PEG. El agonista está preferiblemente monopegilado, es decir la
razón de agonista a PEG es aproximadamente 1:1, que se une a la
funcionalidad conjugable.
El PEG puede ser lineal, ramificado, o colgante;
más preferiblemente, lineal o ramificado; lo más preferiblemente,
lineal.
En los PEG lineales, un extremo del PGE está
tapado por un grupo que es inerte bajo las condiciones de acoplar
el PGE al agonista, por ejemplo, un grupo éter, preferiblemente un
grupo metoxi. Los PEG terminados de esta manera (con un grupo
metoxi) se refieren comúnmente como mPEG. El otro extremo está
activado para acoplarse con los agonistas de PYY. De forma similar,
con PEG ramificados útiles en la presente invención, todos los
extremos menos uno están tapados con éter, y el extremo no tapado
con éter se activa por acoplamiento. En una realización el extremo
no tapado con éter del PEG está tapado con un resto de engarce
("L") que une el PEG a un grupo funcional que es reactivo con
la funcionalidad conjugable del aminoácido cisteína para producir
un conjugado que tiene el PEG unido covalentemente a la
funcionalidad conjugable del mismo. En una realización adicional el
PEG se une directamente al grupo reactivo, sin inclusión de un resto
de engarce. Tales PEG se llaman frecuentemente PEG
"sin engarce".
"sin engarce".
\newpage
Para los polipéptidos
(E10C)hPYY_{3-36} y
(D11C)hPYY_{3-36}, el extremo no tapado con
éter del PEG está preferiblemente unido a un engarce que une el PEG
a una maleimida u otro grupo que reaccionará con el tiol del
residuo de cisteína para producir un conjugado que tiene el PEG
unido covalentemente al grupo tiol de cisteína. PEG reactivos
adecuados para usar con (E10C)hPYY_{3-36} o
(D11C)hPYY_{3-36} incluyen PEG de las
fórmulas
\vskip1.000000\baselineskip
mPEG-SO_{2}CH=CH_{2},
mPEG-HN-COCH_{2}l
y
\vskip1.000000\baselineskip
Preferiblemente, El PEG es la maleimida de mPEG
representada anteriormente que incluye un resto de engarce -L-. Las
maleimidas de PEG sin engarce son también adecuadas para usar en la
presente invención, particularmente con
(E10C)hPYY_{3-36} o
(D11C)hPYY_{3-36}. Tales maleimidas de PEG
sin engarce se pueden preparar como se describe en Goodson y Catre,
Bio/Technology 8: 343-346, 1990.
Los conjugados producidos a partir de acoplar
los polipéptidos (E10C)hPYY_{3-36} o
(D11C)PYY_{3-36} con los mPEG mostrados
anteriormente se representan en las siguientes fórmulas, en las que
-SR es el polipéptido (E10C)hPYY_{3-36} o
(D11C)PYY_{3-36} en el que el S es átomo de
azufre del grupo tiol de cisteína:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
mPEG-SO_{2}CH_{2}CH_{2}SR,
mPEG-HN-COCH_{2}SR
y mPEG-S-SR.
El engarce -L- sirve simplemente para unir el
PEG al grupo reactivo funcional y por lo tanto no está limitado
particularmente, pero, preferiblemente, incluye un grupo alquileno
que contiene un enlace éster, un enlace uretano, un enlace amida,
un enlace éster, un enlace carbonato, o un grupo amino
secundario.
En una realización preferida, particularmente
para PEG lineales, el engarce es un grupo de la fórmula
-O(CH_{2})_{p}NHC(O)(CH_{2})_{r}-
en el que p es un número entero de
1 a 6, preferiblemente, 1 a 3, más preferiblemente, 2 ó 3, lo más
preferiblemente, 3, y r es un número entero de 1 a 6,
preferiblemente, 1 a 3, más preferiblemente, 2 ó 3, lo más
preferiblemente,
2.
Un engarce preferido es el grupo
-CH_{2}CH_{2}CH_{2}NHCOCH_{2}CH_{2}-.
En otra realización preferida, particularmente
para PEG ramificados, el engarce es un grupo de la fórmula
-NHC(O)(CH_{2})_{s}-
en el que s es un número entero de
1 a 6, preferiblemente, 1 a 3, más preferiblemente, 2 ó 3, lo más
preferiblemente,
2.
Un engarce preferido es el grupo
-NHC(O)CH_{2}CH_{2}-.
El PEG puede ser lineal o no lineal, por
ejemplo, ramificado o colgante. Preferiblemente, el PEG es lineal o
ramificado, preferiblemente, una maleimida de mPEG lineal o
ramificado. La maleimida de mPEG de glicerol ramificado es un PEG
ramificado preferido. Preferiblemente, el PEG es una maleimida de
mPEG lineal. El PEG tendría un peso-peso molecular
promedio en el intervalo de aproximadamente 1 kD a aproximadamente
50 kD. Preferiblemente, el peso molecular promedio está en el
intervalo de aproximadamente 5 kD a aproximadamente 45 kD; más
preferiblemente, aproximadamente 10-12 kD a
aproximadamente 40-45 kD, o aproximadamente 20 kD a
aproximadamente 40-45 kD. De particular interés es
un PEG lineal, tal como aquel mostrado en fórmula 1, que tiene un
peso-peso molecular promedio de aproximadamente 20
kD a aproximadamente 30 kD. El glicerol-mPEG
ramificado de fórmula 2, es también de interés y, preferiblemente,
tiene un peso-peso molecular promedio de
aproximadamente 20 kD o de aproximadamente 43 kD.
Los PEG preferidos, aproximadamente activados
para conjugación con el grupo tiol de cisteína de
(E10C)hPYY_{3-36} o
(D11C)hPYY_{3-36}, son los compuestos de
fórmulas 1 y 2. En el mPEG lineal de fórmula 1, n es un número
entero en el intervalo de aproximadamente 175 a 80; preferiblemente
aproximadamente 375 a 525 o aproximadamente 600 a 750, o
aproximadamente 425 a 475, o aproximadamente 650 a 700, o
aproximadamente 437 a 463 o 675 a 700. En el
glicerol-mPEG ramificado de fórmula 2, cada m es
aproximadamente la misma y es un número entero en el intervalo de
aproximadamente 150 a 500; preferiblemente, aproximadamente 160 a
285 o aproximadamente 499 a 525, o aproximadamente 200 a 250 o 450
a 500.
Una amplia variedad de PEG, activados
aproximadamente para conjugación con funcionalidades objetivo en la
cadena lateral de aminoácidos peptídicos, por ejemplo
funcionalidades ceto, tiol, carboxilo, o funcionalidades amino
libres, están comercialmente disponibles a partir de un número de
suministradores, por ejemplo, a partir de NOF Corporation, Tokio,
Japón, o Nektar Therapeutics Corporation, Hutsville, AL.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a conjugados de las presentes variantes de
PYY_{3-36} y a polietilenoglicol.
En una realización el conjugado es un compuesto
de fórmula 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que el resto mPEG es lineal o
ramificado y tiene un peso-peso molecular promedio
en el intervalo de aproximadamente 1 kD a aproximadamente 50 kD,
preferiblemente, 5 kD a aproximadamente 45 kD, más preferiblemente,
aproximadamente 10 kD o 12 kD a aproximadamente 40 ó 45 kD, o
aproximadamente 20 kD a aproximadamente 40 kD o 45
kD,
L es un grupo de la fórmula
-O(CH_{2})_{p}NHC(O)(CH_{2})_{r}-
en la que p es un número entero de
1 a 6; preferiblemente 1 a 3; más preferiblemente, 2 ó 3, lo más
preferiblemente, 3; (como se representa en la fórmula 4 más
adelante); y r es un número entero de 1 a 6; preferiblemente, 1 a
3; más preferiblemente, 2 ó 3, lo más preferiblemente; 2; o L es un
grupo de la
fórmula
-NHC(O)(CH_{2})_{s}-
en la que s es un número entero de
1 a 6, preferiblemente 1 a 3; más preferiblemente, 2 ó 3, lo más
preferiblemente 2; y -SR es el polipéptido
(E10C)hPYY_{3-36} o
(D11C)hPYY_{3-36} en el que S es el átomo
de azufre del grupo tiol de la
cisteína.
Una realización preferida de la invención es el
conjugado variante mPEG-PYY_{3-36}
de fórmula 4:
en la que n es un número entero en
el intervalo de aproximadamente 175 a 800; preferiblemente,
aproximadamente 375 a 525 o aproximadamente 600 a 750, o
aproximadamente 437 a 463 o aproximadamente 675 a 750; y -SR es el
polipéptido (E10C)hPYY_{3-36} o
(D11C)hPYY_{3-36} en el que S es el átomo
de azufre del grupo tiol de cisteína; o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo. Preferiblemente, el resto
(CH_{2}CH_{2}O)_{n} tiene un peso-peso
molecular promedio de aproximadamente 20 kD ó 30 kD. El conjugado en
el que -SR es el polipéptido
(E10C)hPYY_{3-36} es de interés
particular.
Un aspecto adicional de la invención se refiere
a conjugados en los que el resto de PEG está ramificado. Conjugados
preferidos en esta categoría comprenden un resto de PEG de glicerol
ramificado. De interés particular es el conjugado de fórmula 5
en el que cada m es aproximadamente
el mismo y es un número entero en el intervalo de aproximadamente
150 a 550; preferiblemente, aproximadamente 160 a 285 o
aproximadamente 400 a 525, o aproximadamente 200 a 250 o
aproximadamente 450 a 500, y -SR es el polipéptido
(E10C)hPYY_{3-36} o
(D11C)hPYY_{3-36} en el que S es el átomo
de azufre del grupo tiol de cisteína; o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo. Preferiblemente, cada resto
(CH_{2}CH_{2}O)_{m}
tiene un peso-peso molecular promedio en el intervalo de aproximadamente 9-11 kD o aproximadamente 20-22 kD. Preferiblemente, el peso-peso molecular promedio combinado de los restos (CH_{2}CH_{2}O)_{m} es de aproximadamente 20 kD o de aproximadamente 43 kD. El conjugado en el que -SR es el polipéptido (E10C)hPYY_{3-36} es de interés particular.
tiene un peso-peso molecular promedio en el intervalo de aproximadamente 9-11 kD o aproximadamente 20-22 kD. Preferiblemente, el peso-peso molecular promedio combinado de los restos (CH_{2}CH_{2}O)_{m} es de aproximadamente 20 kD o de aproximadamente 43 kD. El conjugado en el que -SR es el polipéptido (E10C)hPYY_{3-36} es de interés particular.
La presente invención también proporciona un
anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un polipéptido
que comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID
N.º: 3 o SEQ ID N.º: 4. En una realización de este aspecto de la
invención el polipéptido está pegilado en el residuo de
cisteína.
Además, la presente invención proporciona
secuencias de polinucleótidos que codifican las secuencias
polipeptídicas de la invención, preferiblemente, codifican SEQ ID
N.º: 3 o SEQ ID N.º: 4.
En otra realización de la invención, se
proporciona una composición farmacéutica que comprende un agonista
de PYY de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente
aceptable. En una realización adicional, la composición también
comprende al menos un agente farmacéutico adicional, que puede ser
un agente útil en el tratamiento de la indicación principal para la
composición o una co-morbilidad de la indicación
principal. El agente farmacéutico adicional es preferiblemente un
agente antiobesidad. La composición comprende preferiblemente una
cantidad terapéuticamente efectiva de un agonista de PYY de la
invención y una cantidad farmacéutica adicional.
También se proporciona el uso de los presentes
compuestos en la preparación de un medicamento para usarse en un
procedimiento de tratar una enfermedad, afección o trastorno
modulado por un agonista de Y2R en mamíferos, que comprende
administrar periféricamente a un mamífero en necesidad de tal
tratamiento una cantidad terapéuticamente efectiva de un agonista
de PYY de la invención. El agonista de PYY de la invención puede
usarse sólo o en combinación con al menos un agente farmacéutico
adicional que es útil en el tratamiento de la enfermedad, afección
o trastorno o de una co-morbilidad de la enfermedad,
afección o trastorno. Enfermedades, afecciones o trastornos
modulados por un agonista de YR2 en mamíferos incluyen obesidad y
sobrepeso. Las co-morbilidades de dichas
enfermedades, afecciones o trastornos probablemente se mejorarían a
propósito mediante tratamiento de tales enfermedades, afecciones o
trastornos. Se proporciona adicionalmente el uso de los presentes
compuestos en la preparación de un medicamento para usarse en un
procedimiento de tratar obesidad en un mamífero en necesidad de tal
tratamiento, que comprende administrar periféricamente a un mamífero
una cantidad terapéuticamente efectiva de un agonista de PYY de la
presente invención.
También se proporciona un procedimiento de
reducir peso o de promover pérdida de peso (incluyendo impedir o
inhibir ganancia de peso) en un mamífero que comprende administrar
periféricamente al mamífero una cantidad controladora de peso o
reductora de peso de un agonista de PYY de la presente
invención.
También se proporciona un procedimiento de
reducir toma de comida en un mamífero que comprende administrar
periféricamente al mamífero una cantidad reductora de toma de comida
de un agonista de PYY de la invención.
También se proporciona un procedimiento de
inducir saciedad en un mamífero que comprende administrar
periféricamente al mamífero una cantidad inductora de saciedad de
un agonista de PYY de la invención.
También se proporciona un procedimiento de
reducir toma calórica en un mamífero que comprende administrar
periféricamente al mamífero una cantidad reductora de toma calórica
de un agonista de PYY de la invención. El agonista de PYY se puede
administrar sólo o en combinación con al menos un agente
farmacéutico adicional, preferiblemente, un agente
antiobesidad.
En cada uno de los procedimientos descritos en
el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, el
agonista de PYY puede administrarse solo o en combinación con al
menos un agente farmacéutico adicional, preferiblemente, un agente
antiobesidad.
Los presentes agonistas de PYY y las
composiciones que los contienen son también útiles en la fabricación
de un medicamento para las solicitudes terapéuticas mencionadas en
el presente documento.
\vskip1.000000\baselineskip
La frase "farmacéuticamente aceptable"
significa que la sustancia o composición debe ser químicamente
compatible y/o toxicológicamente compatible con los otros
ingredientes que comprenden una formulación, y/o con el mamífero
que está tratándose con la misma.
El término "agonista de PYY" quiere decir
cualquier compuesto que facilita uno o más de los efectos
facilitados por hPYY_{3-36}, in vivo o
in vitro.
La frase "cantidad terapéuticamente
efectiva" quiere decir una cantidad de agonista de PYY de la
presente invención que reduce la toma calórica, reduce el peso
corporal y/o reduce la grasa corporal con respecto a los valores de
control apropiados determinados antes del tratamiento o determinados
en un grupo tratado con vehículo.
El término "mamífero" quiere decir seres
humanos así como todos los otros miembros de sangre caliente del
reino animal poseedores de un mecanismo homeostático en la clase
Mammalia, por ejemplo, mamíferos de compañía, mamíferos de zoo y
mamíferos fuente de comida. Algunos ejemplos de mamíferos de
compañía son cánidos (por ejemplo, perros), félidos (por ejemplo,
gatos) y caballos; algunos ejemplos de mamíferos fuente de comida
son cerdos, ganado vacuno, ovejas y similares. Preferiblemente, el
mamífero es un ser humano o un mamífero de compañía. Más
preferiblemente, el mamífero es un ser humano, macho o hembra.
Los términos "tratando", "tratar", o
"tratamiento" abarcan tanto tratamiento preventivo, es decir,
profiláctico, como tratamiento paliativo.
El término "administración periférica"
quiere decir administración fuera del sistema nervioso central. La
administración periférica no incluye administración directa al
cerebro. La administración periférica incluye, pero no se limita a
administración intravascular, intramuscular, subcutánea, de
inhalación, oral, sublingual, enteral, transdérmica, o
intranasal.
El término "PYY humano" o "hPYY"
quiere decir el polipéptido amidado en extremo
C-terminal de 36 aminoácidos que tiene la siguiente
secuencia de aminoácidos:
- YPIKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH_{2}
- [SEC ID N.º: 1]
El término "hPYY_{3-36}"
quiere decir el hPYY 34-mero de extremo
C-terminal que tiene la siguiente secuencia de
aminoácidos:
- IK-PEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH_{2}
- [SEC ID N.º: 2].
El término
"(E10C)hPYY_{3-36}" quiere decir el
hPYY 34-mero de extremo C-terminal
en el que el residuo 10 de ácido glutámico de hPYY está reemplazado
por un residuo de cisteína, y que tiene la siguiente secuencia de
aminoácidos:
- IKPEAPGCDASPEELNRYYASL-RHYLNLVTRQR-NH_{2}
- [SEC ID N.º: 3].
El término
"(D11C)hPYY_{3-36}" quiere decir el el
hPYY 34-mero de extremo C-terminal
en el que el residuo 11 de ácido aspártico de hPYY está reemplazado
por un residuo de cisteína, y que tiene la siguiente secuencia de
aminoácidos:
- IKPEAPGECASPEELNRYYASL-RHYLNLVTRQRY-NH_{2}
- [SEC ID N.º: 4].
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 1 es un trazado de HPLC en fase
reversa del péptido (E10C)hPYY_{3-36}
purificado en una columna Zorbax Eclipse
XDB-C8.
La figura 2 es un trazado de HPLC de exclusión
por tamaño de la mezcla de reacción de maleimida de mPEG de 30 K
lineal más (E10C)hPYY_{3-36} en una columna
Shodex 804 SEC.
La figura 3 es una foto de SDS PAGE de
fracciones de purificación HP Hitrap de maleimida de mPEG de 30 K
(E10C)hPYY_{3-36} lineal. PM = estándares
de pesos moleculares; L = carga de columna; FT = flujo a través;
4-23 = fracciones de elución.
La figura 4 es un trazado de HPLC en fase
reversa del péptido (D11C)hPYY_{3-36}
purificado en una columna Zorbax Eclipse
XDB-C8.
La figura 5 es un trazado de HPLC de exclusión
por tamaño de la mezcla de reacción de maleimida de mPEG de 30 K
más (D11C)hPYY_{3-36} en una columna Shodex
804 SEC.
La figura 6 es un trazado de HPLC de exclusión
por tamaño que muestra el perfil de elución del producto de
maleimida de mPEG de 30 K (E10C)hPYY_{3-36}
lineal purificado en una columna Shodex 804 SEC.
La figura 7 es un trazado de HPLC de exclusión
por tamaño que muestra el perfil de elución del producto de
maleimida de mPEG de 30 K (D11C)hPYY_{3-36}
lineal en una columna Shodex 804 SEC.
La figura 8 es un trazado de HPLC de exclusión
por tamaño de la mezcla de reacción de
glicerol-maleimida de mPEG de 43 K ramificado más
(E10C)hPYY_{3-36} en una columna Shodex 804
SEC.
La figura 9 es un trazado de HPLC de exclusión
por tamaño que muestra el perfil de elución del producto de
glicerol-maleimida de mPEG de 43 K ramificado
(E10C)hPYY_{3-36} purificado en una columna
Shodex 804 SEC.
La figura 10 es una gráfica de inhibición de
toma de alimento acumulativa en ratones sometidos a ayuno tras
inyección intraperitoneal (IP).
La figura 10A muestra el efecto de dosis de
PYY_{3-36} nativo en comparación con el grupo de
vehículo. La figura 10B muestra el efecto de dosis de maleimida de
mPEG de 30 K (E10C)hPYY_{3-36} lineal.
La figura 11 muestra el efecto de toma de comida
de inyección IP en ratones sometidos a ayuno de
glicerol-maleimida de mPEG de 43 K ramificado
(E10C)hPYY_{3-36} en comparación con el
vehículo y maleimida de mPEG de 30 K lineal
(E10C)hPYY_{3-36}. La figura 11A es una
gráfica de líneas que muestra la respuesta durante 6 horas tras la
inyección. La figura 11B es una gráfica de barras que compara los
efectos durante 24 horas tras la inyección.
La figura 12 muestra los efectos de inyección IP
de vehículo, PYY_{3-36}, y maleimida de mPEG de 30
K lineal (E10C)hPYY_{3-36} en ratones
alimentados espontáneamente. La figura 12A muestra el efecto en toma
de comida, y la figura 12B muestra el efecto en peso corporal.
La figura 13 muestra los efectos de inyección
subcutánea (SC) de vehículo, PYY_{3-36}, y
maleimida de mPEG de 30 K lineal
(E10C)hPYY_{3-36} en ratones alimentados
espontáneamente. La figura 13A muestra el efecto en toma de comida,
y la figura 13B muestra el efecto en peso corporal.
La figura 14 muestra exposición de plasma a PYY
en ratones tras inyección IP de 0,1 mg/kg. La figura 14A manifiesta
los niveles de PYY en plasma tras la inyección de
hPYY_{3-36} y la figura 14B manifiesta los niveles
de PYY en plasma tras la inyección de maleimida de mPEG de 30 K
lineal (E10C)hPYY_{3-36}.
La figura 15 es una gráfica de curvas de
respuesta a concentración para PYY_{3-36} o para
maleimida de mPEG de 30 K lineal
(E10C)hPYY_{3-36} de Ensayo de Proximidad
de Centelleo (SPA), en el que los ligandos compiten con
^{125}I-PYY_{1-36} para unirse
al YR2 expresado en células KAN-TS.
La figura 16 es una gráfica de curvas de
respuesta a concentración para PYY_{3-36} o para
maleimida de mPEG de 30 K lineal
(E10C)hPYY_{3-36} de Ensayo de Unión de
GTPgamma[^{35}S] con Y2R expresado en membranas
KAN-TS.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere a agonistas de
PYY que son variantes de hPYY_{3-36} y conjugados
pegilados de los mismos, que pueden tener al menos una propiedad
química o fisiológica seleccionada de, pero no limitada a,
velocidad de eliminación disminuida, duración de residencia en
plasma incrementada, actividad in vivo prolongada, potencia
incrementada, estabilidad incrementada, solubilidad mejorada, y
antigenicidad disminuida.
Una variante de PYY_{3-36}
preferida de la invención es
(E10C)hPYY_{3-36}. Otra variante preferida
es (D11C)hPYY_{3-36}. Estas variantes de
la invención se pueden producir sintéticamente y mediante medios
recombinantes y otros medios, como se describe más adelante y en
los ejemplos en el presente documento o mediante procedimientos
análo-
gos.
gos.
\vskip1.000000\baselineskip
Las variantes de PYY_{3-36} de
esta invención, por ejemplo,
(E10C)hPYY_{3-36} y
(D11C)hPYY_{3-36}, se pueden preparar
usando técnicas de síntesis de péptidos estándar conocidas en la
técnica, por ejemplo, mediante síntesis de péptidos de fase sólida
llevada a cabo con un sintetizador de péptidos automático (por
ejemplo, modelo 433A; Applied Biosystems, Foster City, CA) usando
química de tBoc o Fmoc. Un sumario de las muchas técnicas de
síntesis de péptidos disponibles se puede encontrar en Solid Phase
Peptide Synthesis 2ª edición (Stewart, J.M. y Young, J.D., Pierce
Chemical Company, Rockford, IL, 1984). Véase también el libro
Solid-phase Organic Synthesis (Burgess, K., John
Wiley & Sons, Nueva York, NY, 2000) y el artículo Engels y col.,
Angew. Chem. Intl. Ed. 28: 716-34, 1989. Todas las
referencias anteriores se incorporan en el presente documento
mediante referen-
cia.
cia.
Las variantes PYY_{3-36} de la
invención están preferiblemente conjugadas con un PEG. Las
reacciones de conjugación, referidas como reacciones de pegilación,
se llevaron a cabo históricamente en solución con exceso molar de
polímero y sin considerar a donde se uniría el polímero a la
proteína. Tales técnicas generales, sin embargo, se han demostrado
inadecuadas típicamente para conjugar proteínas bioactivas a
polímeros no antigénicos reteniendo mientras bioactividad
suficiente. Una manera de mantener la bioactividad de la variante de
agonista de PYY_{3-36} después de pegilación es
evitar sustancialmente, en el proceso de acoplamiento, la
conjugación de cualesquiera grupos reactivos de la variante que
estén asociados con unión del agonista al receptor objetivo. Un
aspecto de la presente invención es proporcionar un procedimiento de
conjugar un polietilenoglicol a un agonista de variante de
PYY_{3-36} de la invención en sitios reactivos
específicos que no interfieran sustancialmente con sitio(s)
de unión al receptor con el fin de retener niveles altos de
actividad. Otro aspecto de esta invención es la inserción de
residuos reactivos dentro de PYY_{3-36} para
proporcionar las variantes de agonistas del mismo para conjugación
con un polietilenoglicol con alteración limitada de actividad.
La modificación química a través de un enlace
covalente puede llevarse a cabo bajo cualesquiera condiciones
adecuadas generalmente adoptadas en una reacción de conjugación de
una sustancia biológicamente activa con un PEG activado. La
reacción de conjugación se lleva a cabo bajo condiciones
relativamente suaves para evitar inactivar el agonista de variante
de PYY_{3-36}. Las condiciones suaves incluyen
mantener el pH de la solución de reacción en el intervalo de
aproximadamente 3 a 10, y las temperaturas de reacción en el
intervalo de aproximadamente 0º a 40ºC. Las funcionalidades no
objetivo en las variantes de PYY_{3-36} que son
reactivas con el PEG activado bajo las condiciones de pegilación
están preferiblemente protegidas con un grupo protector apropiado
que es retirable después de pegilación en la funcionalidad
objetivo. En pegilar grupos amino libres con reactivos tales como
aldehídos de PEG o succinimidas de PEG, se mantiene típicamente un
pH en el intervalo de aproximadamente 3 a 10, preferiblemente
aproximadamente 4 a 7,5. La reacción de acoplamiento se lleva a cabo
preferiblemente en un tampón adecuado (pH 3 a 10), por ejemplo,
fosfato. MES, citrato, acetato, succinato o HEPES, durante
aproximadamente 1 a 48 horas a una temperatura en el intervalo de 4º
a 40ºC. En pegilar grupos tiol usando reactivos tales como
maleimidas de PEG, vinilsulfonas de PEG u ortopiridildisulfuros de
PEG, se mantiene preferiblemente un pH en el intervalo de
aproximadamente 4 a 8. Las aminas de PEG son útiles en la pegilación
de grupos ceto, por ejemplo, en
p-acetilfenilalanina y se pueden preparar como se
describe por Pillai y col., J. Org. Chem. 45:
5364-5370,
1980.
1980.
Las reacciones de conjugación de la presente
invención proporcionan típicamente una mezcla de reacción o de
reserva que contiene la variante de PYY_{3-36}
monopegilado deseada así como el péptido variante de
PYY_{3-36} no reaccionado, el PEG no reaccionado,
y usualmente menos que aproximadamente el 20% de especies de peso
molecular alto, que pueden incluir conjugados que contienen más de
una hebra de PEG y/o especies agregadas. Después de que las
especies no reaccionadas y las especies de alto peso molecular se
han retirado, se recuperan las composiciones que contienen
principalmente variantes de PYY_{3-36}
monopegiladas. Dado que los conjugados incluyen a menudo una hebra
de polímero única, los conjugados son sustancialmente
homogéneos.
El conjugado de variante de
PEG-PYY_{3-36} deseado se puede
purificar a partir de la mezcla de reacción mediante procedimientos
convencionales usados típicamente para la purificación de proteínas,
tales como diálisis, precipitación de una proteína por saturación
de la solución con sales neutras, ultrafiltración, cromatografía de
intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba (HIC),
cromatografía en gel y electroforesis. La cromatografía de
intercambio iónico es particularmente efectiva en eliminar cualquier
PEG no reaccionado o variante de PYY_{3-36} no
reaccionada. La separación del conjugado de la variante de PEG
deseada se puede llevar a cabo situando la mezcla de reacción que
contiene las especies mezcladas en una solución tampón que tiene un
pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 10, preferiblemente, más
bajo de 8 para evitar desamidación. La solución tampón contiene
preferiblemente una o dos sales tampón seleccionadas de, pero no
limitadas a, KCl, NaCl, K_{2}HPO_{4}, KH_{2}PO_{4},
Na_{2}HPO_{4}, NaH_{2}PO_{4}, NaHCO_{3}, NaBO_{4} y
CH_{3}CO_{2}Na.
\newpage
Si el sistema de tampón usado en la reacción de
pegilación es diferente del que se usa en el procedimiento de
separación, la mezcla de reacción de pegilación está sometida a
intercambio de tampón/diafiltración o se diluye con una cantidad
suficiente del tampón de separación inicial.
El fraccionamiento de los conjugados dentro de
una reserva que contiene las especies deseadas se lleva
preferiblemente a cabo usando un medio de cromatografía de
intercambio iónico. Tales medios son capaces de unir selectivamente
conjugados de variantes de
PEG-PYY_{3-36} por medio de
diferencias en carga, que pueden variar en una manera un tanto
predecible. Por ejemplo, la carga de superficie de una variante de
PEG-PYY_{3-36} está determinada
por el número de grupos cargados disponibles en la superficie del
péptido que están disponibles para interacción con el soporte de
columna no comprometido por la presencia de PEG. Por lo tanto, los
conjugados de variantes de
PEG-PYY_{3-36} tendrán una carga
diferente de las otras especies presentes para permitir aislamiento
selecti-
vo.
vo.
Las resinas de intercambio iónico se prefieren
especialmente para purificación de los conjugados de variantes de
PEG-PYY_{3-36} presentes. Las
resinas de intercambio catiónico tales como resinas de sulfopropilo
se usan en el procedimiento de purificación de la presente
invención. Una lista no limitante de resinas de intercambio iónico
adecuadas para usar con la presente invención incluye
SP-hitrap®, SP Sepharosa HP® y SP Sepharosa HP® de
flujo rápido. Otras resinas de intercambio catiónico adecuadas, por
ejemplo resinas S y resinas CM, se pueden usar
también.
también.
La resina de intercambio catiónico está
empaquetada preferiblemente en una columna y equilibrada mediante
medios convencionales. Se usa un tampón que tiene el mismo pH y la
misma osmolaridad que la solución de la variante de
PEG-PYY_{3-36} conjugada con PEG.
El tampón de elución contiene preferiblemente una o más sales
seleccionadas de, pero no limitadas a, CH_{3}CO_{2}Na, HEPES,
KCl, NaCl, K_{2}HPO_{4}, KH_{2}PO_{4}, Na_{2}HPO_{4},
NaH_{2}PO_{4}, NaHCO_{3}, NaBO_{4}, y
(NH_{4})CO_{3}. La solución que contiene conjugado se
adsorbe después sobre la columna, con PEG no reaccionado y algunas
especies de peso molecular alto que no se retienen. En la
completación de la carga, un flujo de gradiente de un tampón de
elución con concentraciones de sal incrementales se aplica a la
columna para eluir la fracción deseada de variante de
PEG-PYY_{3-36} conjugada con PEG.
Las fracciones eluidas, almacenadas están preferiblemente limitadas
a conjugados de polímero uniforme después de la etapa de separación
de intercambio catiónico. Cualesquiera especies de variantes de
PYY_{3-36} no conjugadas pueden lavarse después de
la columna mediante técnicas convencionales. Si se desea, especies
de variantes de PYY_{3-36} monopegiladas y
pegiladas de forma múltiple y especies de peso molecular más amplio
se puede separar adicionalmente unas de otras por medio de
cromatografía de intercambio iónico adicional o por medio de
cromatografía de exclusión por tamaño.
Se pueden usar técnicas que utilizan etapas
isocráticas múltiples de concentración incremental en lugar de un
gradiente lineal. Etapas de elución isocrática múltiple de
concentración incremental darán como resultado la elución
secuencial de multipegilado/agregado y después de conjugados de
variantes de PYY_{3-36} monopegiladas. Se pueden
usar también las técnicas de elución en base a gradientes de pH. El
intervalo de temperatura para elución está generalmente entre
aproximadamente 4ºC y aproximadamente 25ºC. La elución de la
variante de PEG-PYY_{3-36} se
somete a seguimiento por la absorbancia UV a 280 nm. La recogida de
fracción se puede lograr a través de perfiles de elución temporales
simples.
\vskip1.000000\baselineskip
Las moléculas de ácido nucleico que codifican un
polipéptido (E10C)PYY_{3-36} pueden
comprender una de las siguientes secuencias de ácido nucleico (la
mutación de codón para sustitución E10C está subrayada):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Las moléculas de ácido nucleico que codifican un
polipéptido (D11C)hPYY_{3-36} pueden
comprender una de las siguientes secuencias de ácidos nucleicos (la
mutación de codón para sustitución D11Cc está subrayada):
Estas secuencias pueden incluir también un codón
de parada (por ejemplo, tga, taa, tag) en el extremo
C-terminal, y se pueden obtener fácilmente en una
diversidad de maneras incluyendo, sin limitación, síntesis química,
mutación genética de las secuencias de polinucleótido hPYY de tipo
salvaje obtenidas a partir de biblioteca de ADNc o de biblioteca de
material genómico, rastreo de biblioteca de expresión, y/o
amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de
ADNc. Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican las variantes
(E10C)hPYY_{3} y
(D11C)hPYY_{3-36} se pueden producir usando
mutagénesis dirigida a sitio, amplificación por PCR, u otros
procedimientos apropiados, donde el/los cebador(es)
tiene(n) las mutaciones puntuales deseadas. Los
procedimientos de ADN recombinante y los procedimientos de
mutagénesis descritos en el presente documento son generalmente
aquellos expuestos en Sambrook y col., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) y en
Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y col., eds., Green
Publishers Inc. y Wiley and Sons 1994). Se desearía que otro
aminoácido que no se dé en la naturaleza esté sustituido por E10 o
D11, tal como un péptido puede expresarse recombinantemente usando
procedimientos como se describen en, por ejemplo, la Publicación de
Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.º: 2005/02085536,
incorporada en el presente documento mediante referencia.
Los polinucleótidos de ácidos nucleicos que
codifican la secuencia de aminoácidos de hPYY pueden identificarse
mediante clonación de expresión que emplea la detección de clones
positivos en base a una propiedad de la proteína expresada.
Típicamente, las librerías de ácidos nucleicos se rastrean por la
unión de un anticuerpo u otro compañero de unión (por ejemplo,
receptor o ligando) a proteínas clonadas que se expresan y exhiben
en una superficie de célula huésped. El anticuerpo o socio de unión
se modifica con una marca detectable para identificar aquellas
células que expresan el clon deseado.
Las técnicas de expresión recombinante dirigidas
de acuerdo con las descripciones expuestas más adelante pueden
continuarse para producir los (E10C)hPYY_{3} y
(D11C)hPYY_{3-36} que codifican
polinucleótidos y para expresar los polipéptidos codificados. Por
ejemplo, insertando una secuencia de ácido nucleico que codifica la
secuencia de aminoácido de una variante de (E10C)hPYY_{3} o
de una variante de (D11C)hPYY_{3-36} dentro
de un vector apropiado, alguien experto en la técnica puede
producir fácilmente cantidades grandes de la secuencia de
nucleótidos deseada. Las secuencias se pueden usar también para
generar sondas de detección o cebadores de amplificación.
Alternativamente, un polinucleótido que codifica la secuencia de
aminoácidos de un polipéptido de (E10C)hPYY_{3} o de un
polipéptido de (D11C)hPYY_{3-36} puede
insertarse dentro de un vector de expresión. Introduciendo el
vector de expresión dentro de un huésped apropiado, la variante de
(E10C)hPYY_{3} o de
(D11C)hPYY_{3-36} se puede producir en
grandes cantidades.
Otro procedimiento para obtener una secuencia de
ácidos nucleicos adecuada es la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR). En este procedimiento, el ADNc se prepara a partir de
poli(A) +ARN de ARN total usando la enzima transcriptasa
reversa. Dos cebadores, típicamente complementarios a dos regiones
separadas de ADNc que codifican la secuencia de aminoácidos de una
variante de (E10C)PYY_{3} o de una variante de
(D11C)hPYY_{3-36}, se añaden después al
ADNc junto con una polimerasa tal como polimerasa Taq, y la
polimerasa amplifica la región de ADNc entre los dos cebadores.
Otro medio de preparar una molécula de ácido
nucleico que codifique la secuencia de aminoácidos de una variante
de (E10C)hPYY_{3} o de una variante de
(D11C)hPYY_{3-36} es la síntesis química
usando procedimientos bien conocidos por los trabajadores expertos
tales como aquellos descritos por Engels y col., Angew. Chem. Intl.
Ed. 28: 716-34, 1989. Estos procedimientos incluyen
los procedimientos de fosfotriéster, fosforamidina, y
H-fosfonato para síntesis de ácidos nucleicos. Un
procedimiento preferido para tal síntesis química es síntesis
mantenida por polímero usando química de fosforamidita estándar.
Típicamente, el ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de un
(E10C)PYY_{3} será de aproximadamente mil nucleótidos de
longitud. Los ácidos nucleicos mayores que aproximadamente 100
nucleótidos se pueden sintetizar como varios fragmentos usando estos
procedimientos. Los fragmentos pueden ligarse conjuntamente después
para formar la secuencia de nucleótidos de longitud total de un gen
(E10C)PYY_{3-36}.
El fragmento de ADN que codifica el extremo
aminoterminal del polipéptido puede tener un ATG, que codifica un
residuo de metionina. Esta metionina puede estar presente o puede no
estar presente en la forma madura de la
(E10C)PYY_{3-36} o de la
(DIIC)LP443-36, dependiendo de si el
polipéptido producido en la célula huésped está diseñado para
segregarse a partir de esa célula. El codón que codifica isoleucina
puede usarse también como un sitio de partida. Pueden usarse
también otros procedimientos conocidos por el trabajador experto.
En ciertas realizaciones, las variantes de ácido nucleico contienen
codones que se han alterado para expresión óptima de un
(E10C)hPYY_{3-36} o de un
(D11C)hPYY_{3-36} en una célula huésped
dada. Las alteraciones de codón particulares dependerán del
(E10C)hPYY_{3-36} o del
(D11C)hPYY_{3-36} y de la célula huésped
seleccionada para expresión. Tal "optimización de codón" se
puede llevar a cabo mediante una diversidad de procedimientos, por
ejemplo, seleccionado codones que se prefieren para usar en genes
altamente expresados en una célula huésped dada. Se pueden usar
algoritmos de computadora que incorporan tablas de frecuencia de
codones tales como "Eco_high.Cod" para preferencia de codones
de genes bacterianos altamente expresados y se proporcionan por la
Versión 9.0 del Paquete de Universidad de Wisconsin (Genetics
Computer Group, Madison, Wis.). Otras tablas de frecuencia de
codones útiles incluyen "Celegans_high.cod",
"Celegans_low.cod", "Drosophila-high.cod",
"Human-high.cod", "Maize_high.cod", y
"Yeast_highcod".
Una molécula de aminoácidos que codifica la
secuencia de aminoácidos de un
(E10C)hPYY_{3-36} o de un
(D11C)hPYY_{3-36} se inserta dentro de un
vector de expresión apropiado usando técnicas de ligazón estándar.
El vector se selecciona típicamente para ser funcional en la célula
huésped particular empleada (es decir, el vector es compatible con
la maquinaria de célula huésped tal que puede darse la amplificación
del gen y/o la expresión del gen). Una molécula de ácido nucleico
que codifica la secuencia de aminoácidos de un
(E10C)hPYY_{3-36} o de un
(D11C)hPYY_{3-36} puede
amplificarse/expresarse en células huésped procariotas, de
levaduras, de insectos (sistemas de baculovirus) y/o en células
huésped eucariotas. Para una revisión de vectores de expresión,
véase Meth. Enz., vol. 185 (D. V. Goeddel, ed., Academia Press,
1990).
Típicamente, los vectores de expresión usados en
cualquiera de las células huésped contendrán secuencias para
mantenimiento de plásmidos y para clonación y expresión de
secuencias de nucleótidos exógenas. Tales secuencias, referidas
colectivamente como "secuencias flanqueantes" en ciertas
realizaciones incluirán típicamente una o más de las siguientes
secuencias de nucleótidos: un promotor, una o más secuencias
potenciadoras, un origen de replicación, una secuencia de
terminación transcripcional, una secuencia intrónica completa que
contiene un sitio de ayuste donante y aceptor, una secuencia que
codifica una secuencia líder para secreción polipeptídica, un sitio
de unión a ribosoma, una secuencia de poliadenilación, una región de
poliengarce para insertar el ácido nucleico que codifica el
polipéptido a expresarse, y un elemento marcador seleccionable. Cada
una de estas secuencias se discute más adelante.
Opcionalmente, el vector contiene una secuencia
codificadora de "marca", es decir, una molécula de
oligonucleótido localizada en el extremo 5' o 3' de la secuencia
codificante del (E10C)hPYY_{3-36} o del
(D11C)hPYY_{3-36}; la secuencia de
oligonucleótidos codifica poliHis (tal como hexaHis), u otra
"marca" tal como FLAG, HA (virus influenza hemaglutinina), o
myc para la que existan anticuerpos comercialmente disponibles. Esta
marca está típicamente condensada al polipéptido tras expresión del
polipéptido, y puede servir como un medio para purificación por
afinidad del (E10C)hPYY_{3-36} o el
(D11C)hPYY_{3-36} de la célula huésped. La
purificación de afinidad se puede llevar a cabo, por ejemplo,
mediante cromatografía en columna usando anticuerpos contra la marca
como una matriz de afinidad. Opcionalmente, la marca se puede
retirar subsiguientemente de los
(E10C)hPYY_{3-36} o
(D11C)hPYY_{3-36} purificados mediante
diversos medios tales como usar ciertas peptidasas para escisión,
por ejemplo, digestión por enteroquinasa 3' de una secuencia de
marca FLAG que está anteriormente en la cadena de una de las
secuencias de aminoácidos que se muestran en las SEQ ID N.^{os}.:
3-4.
Las secuencias flanqueantes pueden ser homólogas
(es decir, de la misma especie y/o cepa que la célula huésped),
heterólogas (es decir, de una especie distinta que la especie o cepa
de células huésped), híbridas (es decir, una combinación de
secuencias flanqueantes a partir de más de una fuente), o
sintéticas, o las secuencias flanqueantes pueden ser secuencias
nativas que funcionan normalmente para regular expresión de
hPYY_{3-36}. La fuente de una secuencia
flanqueante puede ser cualquier organismo procariota o eucariota,
cualquier organismo vertebrado o invertebrado, o cualquier planta,
dado que la secuencia flanqueante es funcional en, y puede
activarse por, la maquinaria de la célula huésped.
Las secuencias de flanqueo útiles se pueden
obtener mediante cualquiera de varios procedimientos bien conocidos
en la técnica. Típicamente, las secuencias flanqueantes útiles en el
presente documento, distintas de las secuencias flanqueantes de
genes PYY, se habrán identificado previamente mapeando y/o mediante
digestión con endonucleasas de restricción y pueden así aislarse a
partir de la fuente de tejidos apropiada usando las endonucleasas
de restricción apropiadas. En algunos casos, la secuencia de
nucleótidos total de una secuencia flanqueante puede conocerse.
Aquí, la secuencia flanqueante se puede sintetizar usando los
procedimientos descritos en el presente documento para síntesis de
ácidos nucleicos o clonación de ácidos nucleicos.
Donde se conoce toda o sólo una porción de la
secuencia flanqueante, ella puede obtenerse usando PCR y/o
rastreando una biblioteca genómica con un oligoneuclótido adecuado
y/o fragmento de secuencia flanqueante de la misma o de otras
especies. Donde la secuencia flanqueante no se conoce, se puede
aislar un fragmento de ADN que contenga una secuencia flanqueante a
partir de una pieza más grande de ADN que puede contener, por
ejemplo, una secuencia codificante o incluso otro gen u otros
genes. El aislamiento puede llevarse a cabo mediante digestión con
endonucleasas de restricción para producir el fragmento de ADN
apropiado seguido por aislamiento usando purificación de gel de
agarosa, Cromatografía en columna de Quiagen® (Chatsworth, CA), u
otros procedimientos conocidos por el trabajador experto. La
selección de enzimas adecuadas para logar este propósito será
fácilmente patente para alguien de habilidad en la técnica.
Un origen de replicación es típicamente una
parte de aquellos vectores de expresión procariotas comprados
comercialmente, y el origen ayuda en la amplificación del vector en
una célula huésped. La amplificación del vector a cierto número de
copias puede, en algunos casos, ser importante para la expresión
óptima de un (E10C)hPYY_{3-36} o un
(D11C)hPYY_{3-36}. Si el vector de elección
no contiene un sitio de origen de replicación, se puede sintetizar
químicamente uno en base a una secuencia conocida, y ligarse en el
vector. Por ejemplo, el origen de replicación del plásmido pBR322
(New England Biolabs, Beverly, MA) es adecuado para la mayoría de
las bacterias gram-negativas y diversos orígenes
(por ejemplo, SV40, polioma, adenovirus, virus de la estomatitis
vesicular (VS), o papilomavirus tales como HPV o BPV) son útiles
para clonar vectores en células de mamífero. Generalmente, el
componente del origen de replicación no es necesario para vectores
de expresión de mamíferos (por ejemplo, el origen de SV40 se usa a
menudo sólo porque contiene el promotor temprano).
Una secuencia de terminación de la transcripción
se localiza típicamente 3' con respecto al final de una región
codificante de polipéptido y sirve para terminar la transcripción.
Usualmente, una secuencia de terminación de la transcripción en
células procariotas es un fragmento rico en G-C
seguido por una secuencia de poli-T. Mientras que
la secuencia se clona fácilmente a partir de una biblioteca o
incluso se compra comercialmente como parte de un vector, se puede
también sintetizar fácilmente usando procedimientos para síntesis de
ácidos nucleicos tales como aquellos descritos en el presente
documento.
Un elemento de genes marcadores seleccionables
codifica una proteína necesaria para la supervivencia y crecimiento
de una célula huésped cultivada en un medio de cultivo selectivo.
Los genes marcadores de selección típicos codifican proteínas que
(a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por
ejemplo ampicilina, tetraciclina, o kanamicina para células huésped
procariotas; (b) complementan deficiencias autotróficas de la
célula; o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles de los
medios del complejo. Los marcadores seleccionables preferidos son
el gen de resistencia a kanamicina, el gen de resistencia a
ampicilina, y el gen de resistencia a tetraciclina. Se puede usar
también un gen de resistencia a neomicina para selección en células
procariotas y eucariotas.
Se pueden usar otros genes de selección para
amplificar el gen que se expresará. La amplificación es el
procedimiento en el que los genes que están en mayor demanda para
la producción de una proteína crítica para el crecimiento se
reiteran en tándem dentro de los cromosomas de generaciones
sucesivas de células recombinantes. Ejemplos de marcadores
seleccionables adecuados para células de mamíferos incluyen
dihidrofolato reductasa (DHFR) y timidina quinasa. Los
transformantes de células de mamífero se sitúan bajo presión de
selección en la que sólo los transformantes están únicamente
adaptados para sobrevivir en virtud del gen de selección presente
en el vector. La presión de selección se impone cultivando las
células transformadas bajo condiciones en las que la concentración
de agente de selección en el medio se cambia sucesivamente,
conduciendo de este modo a la amplificación tanto de los genes de
selección como del ADN que codifica un
(E10C)hPYY_{3-36} o un
(D11C)hPYY_{3-36}. Como un resultado, las
cantidades incrementadas de
(E10C)hPYY_{3-36} o de
(D11C)hPYY_{3-36} se sintetizan a partir
del ADN
amplificado.
amplificado.
Un sitio de unión a ribosomas es usualmente
necesario para iniciación de la traducción de ARNm y se caracteriza
por una secuencia de Shine-Dalgarno (procariotas) o
por una secuencia de Kozak (eucariotas). El elemento está
típicamente localizado 3' respecto del promotor y 5' respecto de la
secuencia codificante de un
(E10C)hPYY_{3-36} o un
(D11C)hPYY_{3-36} a expresarse. La
secuencia de Shine-Dalgarno se varía pero es
típicamente una polipurina (es decir, que tiene un alto contenido
en A-G). Se han identificado muchas secuencias de
Shine-Dalgarno cada una de las cuales se puede
sintetizar fácilmente usando procedimientos expuestos en el presente
documento y usados en un vector procariota.
Una secuencia líder, o secuencia señal, se puede
usar para dirigir un (E10C)hPYY_{3-36} o un
(D11C)hPYY_{3-36} fuera de la célula
huésped. Típicamente, una secuencia de nucleótidos que codifica la
secuencia señal se coloca en la región codificante de la molécula
de ácido nucleico de (E10C)hPYY_{3-36} o de
la molécula de ácido nucleico de
(D11C)hPYY_{3-36}, o directamente en el
extremo 5' de una región codificante de
(E10C)hPYY_{3-36} o de un
(D11C)hPYY_{3-36}. Se han identificado
muchas secuencias señal, y cualquiera de aquellas que son
funcionales en la célula huésped seleccionada se puede usar en
conjunción con una molécula de ácido nucleico de
(E10C)hPYY_{3-36} o de
(D11C)hPYY_{3-36}. Por lo tanto, una
secuencia señal puede ser homóloga (que se da en la naturaleza) o
heteróloga a la molécula de ácido nucleico de
(E10C)hPYY_{3-36} o de
(D11C)hPYY_{3-36}. Adicionalmente, una
secuencia señal puede sintetizarse químicamente usando
procedimientos descritos en el presente documento. En la mayoría de
los casos, la secreción de un
(E10C)hPYY_{3-36} o de un
(D11C)hPYY_{3-36} a partir de la célula
huésped por medio de la presencia de un péptido señal dará como
resultado la eliminación del péptido señal del
(E10C)hPYY_{3-36} o del
(D11C)hPYY_{3-36} secretado. La secuencia
señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte de
una molécula de ácido nucleico de
(E10C)hPYY_{3-36} o de una molécula de
ácido nucleico de (D11C)hPYY_{3-36}. que se
inserta en el
vector.
vector.
Una secuencia de nucleótidos que codifica una
secuencia señal de hPYY_{3-36} nativa puede unirse
a una región codificante de un
(E10C)hPYY_{3-36} o de un
(D11C)hPYY_{3-36} o una secuencia de
nucleótidos que codifica una secuencia señal heteróloga puede
unirse a una región codificante de un
(E10C)hPYY_{3-36} o de un
(D11C)hPYY_{3-36}. La secuencia señal
heteróloga seleccionada sería una que se reconoce y se procesa, es
decir, se escinde mediante una peptidasa señal, por la célula
huésped. Para las células huésped procariotas que no reconocen ni
procesan la secuencia señal de hPYY nativa, la secuencia señal se
sustituye por una secuencia señal procariota seleccionada, por
ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, la penicilinasa, o las
secuencias líderes de enterotoxina II estable frente al calor. Para
secreción de levaduras, la secuencia señal de hPYY nativa se puede
sustituir por las secuencias líder de invertasa, de factor alfa, o
de fosfatasa ácida de levaduras. En la expresión de células de
mamífero, la secuencia señal nativa es satisfactoria, aunque pueden
ser adecuadas otras secuencias señal.
En muchos casos, la transcripción de una
molécula de ácido nucleico se incrementa por la presencia de uno o
más intrones en el vector; esto es particularmente cierto donde se
produce un polipéptido en células huésped eucariotas, especialmente
células huésped de mamífero. Los intrones usados pueden darse en la
naturaleza dentro del gen hPPY especialmente donde el gen usado es
una secuencia genómica de longitud total o un fragmento de la
misma. Donde el intrón no se da en la naturaleza dentro del gen
(como para la mayoría de los ADNc), el intrón se puede obtener de
otra fuente. La posición del intrón con respecto a las secuencias
flanqueantes y al gen hPYY es generalmente importante, ya que el
intrón debe transcribirse para ser efectivo. Así, cuando una
molécula de ADNc que codifica un
(E10C)hPYY_{3-36} o un
(D11C)hPYY_{3-36} se está transcribiendo,
la posición preferida para el intrón es 3' con respecto al sitio de
iniciación de la transcripción y 5' con respecto a la secuencia de
terminación de transcripción de poli-A.
Preferiblemente, el intrón o los intrones se localizarán en un lado
o el otro (es decir, 5' o 3') del ADNc tal que no
interrumpa(n) la secuencia codificante. Cualquier intrón de
cualquier fuente, incluyendo organismos virales, procariotas y
eucariotas (plantas o animales), se puede usar, dado que ello es
compatible con la célula huésped dentro de la cual se inserta.
También están incluidos en el presente documento intrones
sintéticos. Opcionalmente, se puede usar más de un intrón en
el
vector.
vector.
Los vectores de expresión y de clonación
contendrán típicamente un promotor que se reconoce por el organismo
huésped y se une operativamente a la molécula que codifica el
(E10C)hPYY_{3-36} o el
(D11C)hPYY_{3-36}. Los promotores son
secuencias no transcritas localizadas anteriormente en la cadena (es
decir, 5') al codón de partida de un gen estructural (generalmente
con aproximadamente 100 a 1000 pb) que controlan la transcripción
del gen estructural. Los promotores se agrupan convencionalmente en
una de dos clases: promotores inducibles y promotores
constitutivos. Los promotores inducibles inician niveles
incrementados de transcripción de DNA bajo su control en respuesta
a algún cambio en cuestiones de cultivo, tales como la presencia o
ausencia de un nutriente o un cambio en temperatura. Los promotores
constitutivos, por otro lado, inician producción de productos
génicos continua; es decir, hay poco o ningún control sobre la
expresión génica. Se conocen bien un gran número de promotores,
reconocidos por una diversidad de células huésped potenciales. Un
promotor adecuado está operativamente unido al DNA que codifica
(E10C)hPYY_{3-36} o
(D11C)hPYY_{3-36} eliminando el promotor
del DNA fuente mediante digestión por enzimas de restricción e
insertando la secuencia del promotor deseado dentro del vector. La
secuencia promotora de hPYY nativa se puede usar para dirigir
amplificación y/o expresión de una molécula de ácido nucleico de
(E10C)hPYY_{3-36} o de
(D11C)hPYY_{3-36}. Sin embargo, se prefiere
un promotor heterólogo, si ello permite mayor transcripción y
niveles más altos de la proteína expresada en comparación con el
promotor nativo, y si ello es compatible con el sistema de células
huésped que se ha seleccionado para usar.
Los promotores adecuados para usar con huéspedes
procariotas incluyen los sistemas de promotor de
beta-lactamasa y de promotor de lactosa; ARN
polimerasa inducible por E. coli T7; fosfatasa alcalina; un
sistema promotor de triptófano (trp); y promotores híbridos tales
como el promotor tac. Otros promotores bacterianos conocidos son
también adecuados. Sus secuencias se han publicado, permitiendo de
este modo a alguien experto en la técnica ligarlas a la secuencia
de DNA deseada, usando engarces o adaptadores según se necesite para
suministrar cualesquiera sitios de restricción útiles.
Se conocen bien en la técnica los promotores
adecuados para usar con huésped de levaduras. Los potenciadores de
levaduras se usan ventajosamente con promotores de levaduras. Los
promotores adecuados para usar con células huésped de mamífero se
conocen bien e incluyen, pero no se limitan a, aquellos obtenidos de
los genomas de virus tales como virus del polioma, virus de la
diftero-viruela aviar, adenovirus (tal como
adenovirus 2), papilomavirus bovino, virus del sarcoma aviar,
citomegalovirus, retrovirus, virus de la hepatitis B y más
preferiblemente virus del simio 40 (SV40). Otros promotores de
mamíferos adecuados incluyen promotores de mamíferos heterólogos,
por ejemplo, promotores de choque térmico y el promotor de
actina.
Los promotores adicionales que pueden ser de
interés en controlar la expresión de
(E10C)hPYY_{3-36} o
(D11C)hPYY_{3-36} incluyen, pero no se
limitan a: la región promotora temprana de SV40 (Bemoist y Chambon,
Nature 290: 304-10, 1981); el promotor de CMV; el
promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus del
sarcoma de Rous (Yamamoto y col., Cell 22: 787-97,
1980); promotor de timidina quinasa de herpes (Wagner y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. EE.UU. 78: 1444-45, 1981); las
secuencias reguladoras del gen de la metalotioneína (Brinster y
col., Nature 296: 39-42, 1982); vectores de
expresión procariota tales como el promotor de la
beta-lactamasa (Villa-Kamaroff y
col., Proc. Natl. Acad. Sci, EE.UU. 75: 3727-31,
1978); o el promotor tac (DeBoer y col., Proc. Natl. Acad. Sci.
EE.UU., 80: 21-25, 1983).
Se puede insertar una secuencia potenciadora
dentro del vector para incrementar la transcripción en eucariotas
superiores de un DNA que codifica un
(E10C)hPYY_{3-36} o un
(D11C)hPYY_{3-36}. Los potenciadores son
elementos que actúan en cis de DNA, usualmente de aproximadamente
10-300 pb en longitud, que actúan en el promotor
para incrementar transcripción. Los potenciadores son relativamente
independientes de orientación y de posición. Se han encontrado 5' y
3' con respecto a la unidad de transcripción. Se conocen varias
secuencias potenciadoras disponibles a partir de genes de mamíferos
(por ejemplo, globina, elastasa, albúmina, proteína fetal alfa e
insulina). Típicamente, sin embargo, se usará un potenciador de un
virus. El potenciador de SV40, el promotor temprano de
citomegalovirus, el potenciador de polioma, y los potenciadores de
adenovirus son elementos de potenciación ejemplares para la
activación de promotores eucariotas. Mientras que un potenciador
puede ayustarse dentro del vector a un posición 5' o 3' con
respecto a una molécula de ácido nucleico que codifica
(E10C)hPYY_{3-36} o
(D11C)hPYY_{3-36}, se localiza típicamente
en un sitio 5' respecto al promotor.
Se pueden construir los vectores de expresión a
partir de un vector de partida tal como un vector comercialmente
disponible. Tales vectores pueden contener o pueden no contener
todas las secuencias flanqueantes deseadas. Donde una o más de las
secuencias flanqueantes descritas en el presente documento no están
ya presentes en el vector, se pueden obtener individualmente y
ligarse en el vector. Los procedimientos usados para obtener cada
una de las secuencias flanqueantes se conocen bien por alguien
experto en la técnica.
Los vectores preferidos son aquellos que son
compatibles con células huésped bacterianas, de insectos y de
mamíferos. Tales vectores incluyen, entre otras, pCRI, pCR3, y
pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), pBSII (Stratagene, La Jolla,
CA), pET15 (Novagen, Madison, WI), pGEX (Pharmacia Biotech,
Piscataway, NJ), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto,
CA), pETL (BlueBacII, Invitrogen), pDSR-alfa
(Publicación de Solicitud PCT N.º: WO 90/14363) y pFastBacDual
(Gibco-BRL, Grand Island, Nueva York).
Los vectores adecuados adicionales incluyen,
pero no se limitan a, cósmidos, plásmidos, o virus modificados,
pero se apreciará que el sistema vector debe ser compatible con la
célula huésped seleccionada. Tales vectores incluyen, pero no se
limitan a, plásmidos tales como derivados de plásmido Bluescript®
(un fagémido basado en CoIE1 de alto número de copias, Stratagene),
plásmidos de clonación de PCR diseñados para clonar productos de
PCR amplificados por Taq (por ejemplo, kit de Clonación® TOPO TA®,
derivados de plásmido PCR2.1®, Invitrogen), y vectores de
mamíferos, de levaduras o de virus tales como un sistema de
expresión de baculovirus (derivados de plásmido pBacPAK,
Clontech).
Después de que el vector se ha construido y de
que una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido
(E10C)hPYY_{3-36} o
(D11C)hPYY_{3-36} se ha insertado dentro
del sitio apropiado del vector, se puede insertar el vector
completado dentro de una célula huésped adecuada para amplificación
y/o para expresión polipeptídica. Se puede llevar a cabo la
transformación de un vector de expresión para un polipéptido
(E10C)hPYY_{3-36} o
(D11C)hPYY_{3-36} dentro de una célula
huésped seleccionada mediante procedimientos bien conocidos que
incluyen procedimientos tales como transfección, infección,
electroporación, microinyección, lipofección, procedimiento de
DEAE-dextrano, u otras técnicas producidas. El
procedimiento seleccionado será en parte una función del tipo de la
célula huésped a usarse. Estos procedimientos y otros procedimientos
adecuados se conocen bien por el trabajador experto, y se exponen,
por ejemplo, en Sambrock y col., supra.
Las células huésped pueden ser células huésped
procariotas (tales como E. coli) o células huésped eucariotas
(tales como células de levaduras, de insectos y de vertebrados). La
célula huésped, cuando se cultiva bajo condiciones apropiadas,
sintetiza un polipéptido (E10C)hPYY_{3-36}
o (D11C)hPYY_{3-36} que puede recogerse
subsiguientemente a partir del medio de cultivo (si la célula
huésped lo segrega dentro del medio) o directamente a partir de la
célula huésped que lo produce (si ello no se segrega). La selección
de una célula huésped apropiada dependerá de diversos factores,
tales como niveles de expresión deseados, modificaciones
polipeptídicas que son deseables o necesarias para actividad (tales
como glicosilación o fosforilación) y facilidad de plegamiento
dentro de una molécula activa biológicamente.
Se conocen un número de células huésped
adecuadas y muchas están disponibles a partir de la American Type
Culture Collection (ATCC), Manassas, Va. Los ejemplos incluyen, pero
no se limitan a, células de mamíferos, tales como células de ovario
de hámster chino (CHO), células de CHO DHFR(-) (Urlaub y col, Proc.
Natl. Acad. Sci. EE.UU. 97: 4216-20, 1980), células
de riñón embrionario humano (HEK) 293 o células 293T, o células 3T3.
Se conocen en la técnica la selección de células huésped de
mamíferos adecuadas y procedimientos para transformación, cultivo,
amplificación, rastreo, producción de producto, y purificación.
Otras líneas celulares de mamíferos adecuadas son líneas celulares
COS-1 y COS-7 de mono, y la línea
celular CV-1. Células huésped de mamíferos
ejemplares adicionales incluyen líneas celulares de primates y
líneas celulares de roedores, incluyendo líneas celulares
transformadas. Son también adecuadas líneas celulares diploides
normales, cepas celulares derivadas de cultivo in vitro de
tejido primario, así como explantes primarios. Las células
candidatas pueden ser genotípicamente deficientes en los genes de
selección, o pueden contener un gen de selección que actúe de forma
dominante. Otras líneas celulares de mamíferos adecuadas incluyen,
pero no se limitan a, células NA2 de neuroblastoma de ratón, HeLa,
células L-929 de ratón, líneas 3T3 derivadas de
líneas celulares de ratones Swiss, Balb-c o NIH,
líneas celulares de hamsters BHK o HaK. Cada una de estas líneas
celulares se conoce por y está disponible para aquellos expertos en
la técnica de expresión de
proteínas.
proteínas.
Las células bacterianas son útiles de forma
similar como células huésped adecuadas. Por ejemplo, las diversas
cepas de E. coli (por ejemplo, HB101, DH5a, DH10, y MC1061)
se conocen bien como células huésped en el campo de la
biotecnología. Se pueden emplear diversas cepas de B.
subtilis, Pseudomonas spp., otros Bacillus spp.,
y Streptomyces spp. en este procedimiento.
Muchas cepas de células de levaduras conocidas
para aquellos expertos en la técnica también están disponibles como
células huésped para la expresión de los polipéptidos
(E10C)hPYY_{3-36} y
(D11C)hPYY_{3-36}. Las células de
levaduras preferidas incluyen, por ejemplo, Saccharomyces
cerevisiae y Pichia pastoris.
Adicionalmente, donde se desee, se pueden
utilizar sistemas de células de insectos para la expresión de
(E10C)hPYY_{3-36} y
(D11C)hPYY_{3-36}. Tales sistemas se
describen, por ejemplo, en Kitts y col., 1993, Biotechniques 14:
810-17; Lucklow, Curr. Opin. Biotechnol. 4:
564-72, 1993; y Lucklow y col., J. Virol., 67:
4566-79, 1993. Las células de insecto preferidas
son Sf-9 y Hi5 (Invitrogen).
\vskip1.000000\baselineskip
Una línea celular huésped que comprende un
vector de expresión de (E10C)hPYY_{3-36} o
de (D11C)hPYY_{3-36} se puede cultivar
usando medios estándar bien conocidos por el trabajador experto. Los
medios contendrán usualmente todos los nutrientes necesarios para
el crecimiento y supervivencia de las células. Los medios adecuados
para cultivar células de E. coli incluyen, por ejemplo,
Caldo de Luria (LB) y/o Caldo Terrific (TB). Los medios adecuados
para cultivar células eucariotas incluyen medio del Roswell Park
Memorial Institute 1640 (RPMI 1640), Medio Esencial Mínimo (MEM)
y/o Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), todos los cuales
pueden estar suplementados con suero y/o factores de crecimiento
según sea necesario para la línea celular particular que se esté
cultivando. Un medio adecuado para cultivos de insectos es medio de
Grace suplementado con yeastolato, hidrolisato de lactoalbúmina,
y/o suero de ternera fetal, según sea necesario.
Típicamente, se añade un antibiótico u otro
compuesto útil para crecimiento selectivo de células transfectadas
o transformadas como un suplemento a los medios. El compuesto a
usarse estará establecido por el elemento marcador seleccionable
presente en el plásmido con el que se transformó la célula huésped.
Por ejemplo, donde el elemento marcado seleccionable es resistencia
a kanamicina, el compuesto añadido al medio de cultivo será
kanamicina. Otros compuestos para crecimiento selectivo incluyen
ampicilina, tetraciclina, y neomicina.
La cantidad de un polipéptido
(E10C)hPYY_{3-36} o
(D11C)hPYY_{3-36} producido por una célula
huésped se puede evaluar usando procedimientos estándar conocidos
en la técnica. Tales procedimientos incluyen, sin limitación,
separación por análisis de bandas de Western, electroforesis de gel
de SDS-poliacrilamida, electroforesis de gel no
desnaturalizante, separación por Cromatografía Líquida de Alta
Resolución (HPLC), inmunoprecipitación, y/o ensayos de actividad
tales como ensayos de cambio de gel de unión a ADN.
Si se ha diseñado un
(E10C)hPYY_{3-36} o un
(D11C)hPYY_{3-36} para segregarse a partir
de la línea celular huésped, la mayoría del polipéptido puede
encontrarse en el medio de cultivo celular. Si, sin embargo, el
polipéptido no se segrega a partir de las células huésped, estará
presente en el citoplasma y/o en el núcleo (para células huésped
eucariotas) o en el citosol (para células huésped bacterias gram
negativas).
Para un
(E10C)hPYY_{3-36} o
(D11C)hPYY_{3-36} situado en el citoplasma
celular y/o en el núcleo (para células huésped eucariotas) o en el
citosol (para células huésped bacterianas), el material intracelular
(incluyendo cuerpos de inclusión para bacterias
gram-negativas) se puede extraer a partir de la
célula huésped usando cualquier técnica estándar conocida por el
trabajador experto. Por ejemplo, las células huésped pueden lisarse
para liberar los contenidos del periplasma/citoplasma mediante
prensa francesa, homogeneización, y/o sonicación, seguida por
centrifuga-
ción.
ción.
Si un (E10C)hPYY_{3-36}
o (D11C)hPYY_{3-36} ha formado cuerpos de
inclusión en el citosol, los cuerpos de inclusión pueden unirse
también a las membranas celulares interna y/o externa y así se
encontrarán principalmente en el material de sedimento después de
la centrifugación. El material de sedimento se puede tratar después
a pH extremos o con un agente caotrópico tal como un detergente,
guanidina, derivados de guanidina, urea, o derivados de urea en
presencia de un agente reductor tal como ditiotreitol a pH alcalino
o tris carboxietilfosfina a pH ácido para liberar, romper aparte, y
solubilizar los cuerpos de inclusión. El
(E10C)hPYY_{3-36} o
(D11C)hPYY_{3-36} solubilizado puede
analizarse después usando electroforesis, inmunoprecipitación, o
similares. Si se desea aislar el polipéptido, el aislamiento se
puede llevar a cabo usando procedimientos estándar tales como
aquellos descritos en el presente documento y en Marston y col.,
Meth. Enz. 182: 264-75, 1990.
Si los cuerpos de inclusión no se forman a un
grado significativo tras expresión de un
(E10C)hPYY_{3-36} o un
(D11C)hPYY_{3-36}, después el polipéptido
se encontrará principalmente en el sobrenadante después de
centrifugación del homogenado celular. El polipéptido puede aislarse
adicionalmente del sobrenadante usando procedimientos tales como
aquellos descritos en el presente documento.
La purificación de un
(E10C)hPYY_{3-36} o un
(D11C)hPYY_{3-36} a partir de la solución
se puede llevar a cabo usando una diversidad de técnicas. Si el
polipéptido se ha sintetizado de tal forma que contenga una marca
tal como Hexahistidina 9 u otro péptido pequeño tal como FLAG
(Eastman Kodak Co, New Haven, CT) o myc (Invitrogen) bien en su
extremo carboxilo o bien en su extremo amino, se puede purificar en
un proceso de una etapa haciendo pasar a la solución a través de
una columna de afinidad donde la matriz de columna tiene una alta
afinidad por la
marca.
marca.
Por ejemplo, la polihistidina se une con gran
afinidad y específicamente al níquel. Así, se puede usar para
purificación una columna de afinidad de níquel (tal como las
columnas de níquel de Quiagen®). Véase, por ejemplo, Current
Protocols in Molecular Biology 10.11.8 (Ausubel y col., eds., Green
Publishers Inc. y Wiley and Sons, 1993).
Adicionalmente, se puede purificar un
polipéptido (E10C)hPYY_{3-36} o
(D11C)hPYY_{3-36} a través del uso de un
anticuerpo monoclonal que es capaz de reconocerse específicamente y
unirse a un polipéptido (E10C)hPYY_{3-36}
o (D11C)hPYY_{3-36}.
En situaciones donde es preferible purificar
parcial o completamente un polipéptido
(E10C)hPYY_{3-36} o
(D11C)hPYY_{3-36} de tal forma que esté
parcialmente o totalmente libre de contaminantes, se pueden usar
procedimientos estándar conocidos por aquellos expertos en la
técnica. Tales procedimientos incluyen, sin limitación, separación
por electroforesis seguida por electroelución, diversos tipos de
cromatografía (afinidad, inmunoafinidad, tamiz molecular, e
intercambio iónico), HPLC, y enfoque isoeléctrico preparativo
("Isoprime" machina/technique, Hoefer Scientific, San
Francisco, CA). En algunos casos, se pueden combinar dos o más
técnicas de purificación para lograr pureza incrementada.
Se conocen en la técnica un número de
procedimientos adicionales para producir polipéptidos, y los
procedimientos se pueden usar para producir polipéptidos
(E10C)hPYY_{3-36} y
(D11C)hPYY_{3-36}. Véase, por ejemplo,
Roberts y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 94:
12297-303, 1997, que describe la producción de
proteínas de fusión entre un ARNm y su péptido codificado. Véase
también, Roberts Curr. Opin. Chem. Biol. 3: 268-73,
1999.
Los procedimientos para producir péptidos o
polipéptidos se describen también en las Patentes de los Estados
Unidos N.º: 5.763.192; 5.814.476; 5.723.323; y 5.817.483. Los
procedimientos implican producir genes estocásticos o fragmentos de
los mismos, y después introducir estos genes dentro de células
huésped que producen una o más proteínas codificadas por los genes
estocásticos. Las células huéspedes se rastrean también para
identificar aquellos clones que producen péptidos o polipéptidos
que tienen la actividad deseada. Se describen otros procedimientos
para expresión de péptidos recombinantes en las Patentes de los
Estados Unidos N.^{os}: 6.103.495, 6.210.925, 6.627.438, y
6.737.250. Los procedimientos utilizan E. coli y la ruta
secretora general de E. coli. El péptido se condensa a una
secuencia señal; así, el péptido se marca para secreción.
Se describe otro procedimiento para producir
péptidos o polipéptidos en Publicación de Solicitud de Patente PCT
N.º: WO 99/15650. El procedimiento publicado, llamado activación
aleatoria de expresión génica para el descubrimiento de genes,
implica la activación de expresión de genes endógenos o la
sobreexpresión de un gen mediante procedimientos de recombinación
in situ. Por ejemplo, la expresión de un gen endógeno se
activa o incrementa integrando una secuencia reguladora en la
célula objetivo que es capaz de activar expresión del gen mediante
recombinación no homóloga o ilegítima. El ADN objetivo se somete
primero a radiación, y se inserta un promotor genético. El promotor
eventualmente localiza una rotura en la parte delantera de un gen,
iniciando la transcripción de un gen. Esto da como resultado la
expresión del péptido o polipéptido deseado.
\vskip1.000000\baselineskip
La amidación de un péptido, producida bien
sintéticamente o bien recombinantemente, se lleva a cabo mediante
una enzima llamada monooxigenasa de amidación en alfa
depeptidil-glicina (PAM). Cuando se producen
péptidos (E10C)hPYY_{3-36} o
(D11C)hPYY_{3-36} recombinantemente usando
un sistema de expresión bacteriana, los péptidos pueden amidarse en
su extremo C-terminal mediante una reacción in
vitro usando enzima PAM recombinante. La fuente de enzima PAM,
los procedimientos de producción y purificación, y los
procedimientos que se pueden usar para amidar péptidos
(E10C)hPYY_{3-36} o
(D11C)hPYY_{3-36} se describen, por
ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos N.^{os}:
4.708,934, 5.789.234, y 6.319.685.
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo que
unen especialmente polipéptidos
(E10C)hPYY_{3-36} o
(D11C)hPYY_{3-36}, con o sin pegilación en
el sitio de sustitución de cisteína (como se describe en el presente
documento), pero no unen selectivamente
hPYY_{3-36} nativo, están dentro del alcance de la
presente invención. Los anticuerpos pueden ser policlonales,
incluyendo policlonales monoespecíficos, monoclonales,
recombinantes; quiméricos, humanizados, tales como injertados en
CDR; humanos; de cadena única; y/o biespecíficos; así como
fragmentos; variantes; o derivados de los mismos. Los fragmentos de
anticuerpo incluyen aquellas partes del anticuerpo que se unen a un
epitope en el polipéptido (E10C)hPYY_{3-36}
o (D11C)hPYY_{3-36}. Ejemplos de tales
fragmentos incluyen fragmentos Fab y F(ab') generados por
escisión enzimática de anticuerpos de longitud total. Otros
fragmentos de unión incluyen aquellos generados mediante técnicas de
ADN recombinante, tales como la expresión de plásmidos
recombinantes que contienen secuencias de ácidos nucleicos
recombinantes que codifican regiones de anticuerpos variables.
Los anticuerpos policlonales dirigidos hacia un
polipéptido (E10C)hPYY_{3-36} o
(D11C)hPYY_{3-36} generalmente se producen
en animales (por ejemplo, conejos o ratones) por medio de múltiples
inyecciones SC o IP de polipéptido
(E10C)hPYY_{3-36} o
(D11C)hPYY_{3-36} y un coadyuvante. Ello
puede ser útil para conjugar un polipéptido
(E10C)hPYY_{3-36} o un polipéptido
(D11C)hPYY_{3-36} a una proteína
transportadora que es inmunógena en las especies a inmunizarse,
tales como hemocianina de lapa de California, seroalbúmina,
tiroglobulina bovina, o inhibidor de tripsina de soja. Además, los
agentes de agregación tales como alumbre se usan para potenciar la
respuesta inmune. Después de la inmunización, los animales se
sangraron y el suero se sometió a ensayo para valorar anticuerpo
anti-(E10C)hPYY_{3-36} o
anti-(D11C)hPYY_{3-36}.
Los anticuerpos monoclonales dirigidos hacia
polipéptidos (E10C)hPYY_{3-36} o
(D11C)hPYY_{3-36} se producen usando
cualquier procedimiento que mantenga la producción de moléculas de
anticuerpos por líneas celulares continuas en cultivo. Ejemplos de
procedimientos adecuados para preparar anticuerpos monoclonales
incluyen los procedimientos de hibridoma de Kohler y col., Nature
256: 495-97, 1975, y el procedimiento de hibridoma
de células B humanas (Kozbor, J. Immunol. 133: 3001, 1984; Brodeur y
col., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,
51-63 (Marcel Dekker, Inc., 1987). También se
proporcionan por la invención líneas celulares de hibridoma que
producen anticuerpos monoclonales reactivos con polipéptidos
(E10C)hPYY_{3-36} o
(D11C)hPYY_{3-36}.
Los procedimientos preferidos para determinar
especificidad y afinidad de anticuerpos monoclonales mediante
inhibición competitiva se pueden encontrar en Harlow y Lane,
Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratories,
1989); Current Protocols in Immunology (Colligan y col., eds.,
Greene Publishing Assoc. y Wiley Interscience, 1993); y Muller,
Meth. Enzymol. 92: 589-601, 1988.
Los anticuerpos quiméricos de la presente
invención pueden comprender cadenas de inmunoglobulina H y/o L
únicas. Una cadena H quimérica preferida comprende una región de
unión a antígeno derivada de la cadena H de un anticuerpo no humano
específico para un polipéptido
(E10C)hPYY_{3-36} o
(D11C)hPYY_{3-36} que está unido a al menos
una parte de la región C de la cadena L humana (C_{H}), tal como
CH_{1} o CH_{2}. Una cadena L quimérica preferida comprende una
región de unión a antígeno derivada de la cadena L de un anticuerpo
no humano específico para un polipéptido
(E10C)hPYY_{3-36} o
(D11C)hPYY_{3-36} que está unido a al menos
una parte de la región C de la cadena L humana (C_{L}). Los
anticuerpos quiméricos y los procedimientos para su producción se
conocen en la técnica. Véase Cabilly y col., Proc. Natl. Acad. Sci.
EE.UU. 81:3273-77, 1984; Morrison y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. EE.UU. 81: 6851-55, 1984 Boulianne
y col., Nature 312: 643-46, 1984; Neuberger y col.,
Nature 314: 268-70, 1985; Liu y col., Proc. Natl.
Acad. Sic. EE.UU. 84: 3439-43, 1987; y Harlow y
Lane, supra.
Los agentes de unión selectivos que tienen
cadenas H quiméricas y cadenas L quiméricas de la misma o diferente
especificidad de unión a región variable se pueden preparar también
mediante asociación apropiada de las cadenas polipeptídicas
individuales, de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica.
Véanse, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology
(Ausubel y col., eds., Green Publishers Inc. y Wiley and Sons, 1994)
y Harlow y Lane, supra. Usando esta aproximación, las
células huésped que expresan cadenas quiméricas H (o sus derivados)
se cultivan por separado de las células huésped que expresan cadenas
L quiméricas (o sus derivados), y las cadenas de inmunoglobulinas
se recuperan por separado y después se asocian. Alternativamente,
las células huésped pueden co-cultivarse y las
cadenas dejarse asociar espontáneamente en el medio de cultivo,
seguido por recuperación de la inmunoglobulina ensamblada.
En otra realización, un anticuerpo monoclonal de
la invención es un anticuerpo "humanizado". Se conocen bien en
la técnica procedimientos para humanizar los anticuerpos no humanos.
Véanse las Patentes de los Estados Unidos N.^{os}: 5.585.089 y
5.693.762. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más
residuos de aminoácidos introducidos dentro de él a partir de una
fuente que no es humana. Las humanización se puede llevar a cabo,
por ejemplo, usando los procedimientos descritos en la técnica
(Jones y col., 1986, Nature 321: 522-25; Riechmann
y col., 1988, Nature 332: 323-27; Verhoeyen y col.,
1988, Science 239: 1534-36), sustituyendo al menos
una parte de una región determinante de complementariedad de
roedores (CDR) para las regiones correspondientes de un anticuerpo
humano.
Las técnicas para crear versiones de ADN
recombinante de las regiones de unión a antígeno de las moléculas
de anticuerpo (es decir, Fab o fragmentos de región variable) que
evitan la generación de anticuerpos monoclonales están comprendidas
dentro del alcance de la presente invención. En esta técnica, se
extraen moléculas de ARN mensajero específicas de anticuerpos de
células del sistema inmune tomadas a partir de un animal inmunizado
y transcritas en ADNc. El ADNc se clona después dentro de un sistema
de expresión bacteriano. Un ejemplo de una técnica tal adecuada
para la práctica de esta invención usa un sistema de vector de
bacteriófago lambda que tiene una secuencia líder que causa que la
proteína Fab expresada migre al espacio periplásmico (entre la
membrana celular bacteriana y la pared celular) o que sea secretada.
Alguien puede generar rápidamente y rastrear números grandes de
fragmentos de Fab funcionales para aquellos que unen el antígeno.
Tales moléculas de unión a
(E10C)hPYY_{3-36} o a
(D11C)hPYY_{3-36} (fragmentos Fab con
especificidad para polipéptidos
(E10C)hPYY_{3-36} o
(D11C)hPYY_{3-36} están específicamente
comprendidos dentro del término "anticuerpo" como se usa en el
presente documento.
También están dentro del alcance de la invención
técnicas desarrolladas para la producción de anticuerpos quiméricos
ayustando los genes a partir de una molécula de anticuerpos de ratón
de especificidad de antígenos apropiada conjuntamente con genes de
una molécula de anticuerpo humana de actividad biológica apropiada
(tal como la capacidad para activar complemento humano y mediar
citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC)). Morrison y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 81: 6851-55,
1984: Neuberger y col., Nature, 312: 604-08, 1984.
Los agentes de unión selectivos tales como anticuerpos producidos
por esta técnica están dentro del alcance de la
invención.
invención.
Se apreciará que la invención no se limita a
anticuerpos monoclonales de ratón o rata; de hecho, se pueden usar
anticuerpos humanos. Tales anticuerpos se pueden obtener usando
hibridomas humanos. Los anticuerpos totalmente humanos que unen
polipéptidos (E10C)hPYY_{3-36} o
(D11C)hPYY_{3-36} están de esta manera
comprendidos por la invención. Tales anticuerpos se produjeron
inmunizando con un antígeno
(E10C)hPYY_{3-36} o
(D11C)hPYY_{3-36} (opcionalmente conjugado
con un vehículo) animales transgénicos (por ejemplo, ratones)
capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos en
ausencia de producción de inmunoglobulinas endógena. Véanse, por
ejemplo Jakobovits y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90:
2551-55; Jakobovits y col., Nature 362:
255-58, 1993; Bruggemann y col., Year in Immuno. 7:
33-40, 1993.
También están comprendidos dentro de la
invención anticuerpos humanos que unen polipéptidos
(E10C)hPYY_{3-36} o
(D11C)hPYY_{3-36}. Usando animales
transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces de producir un
repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de producción de
inmunoglobulinas endógena tales anticuerpos se producen mediante
inmunización con antígeno de polipéptido
(E10C)hPYY_{3-36} o
(D11C)hPYY_{3-36} (es decir, que tienen al
menos 6 aminoácidos contiguos), opcionalmente conjugados a un
transportador. Véanse, por ejemplo, Jakobovits y col., 1993
supra; Jakobovits y col., Nature 362: 255-58,
1993; Bruggermann y col., 1993, supra. En un procedimiento,
tales animales transgénicos se producen incapacitando a los loci
endógenos que codifican las cadenas de inmunoglobulinas pesadas y
ligeras en éstos, e insertando los loci que codifican las proteínas
de las cadenas de inmunoglobulinas pesadas y ligeras humanas dentro
del genoma de los mismos. Los animales parcialmente modificados, es
decir, aquellos que tienen menos del complemento total de
modificaciones, se reproducen de forma cruzada después para obtener
un animal que tenga todas las modificaciones del sistema inmune
deseadas. Cuando se administra un inmunógeno, estos animales
transgénicos producen anticuerpos con secuencias aminoácidicas
humanas (más que, por ejemplo, con murinas), incluyendo regiones
variables que son inmunoespecíficas para estos antígenos. Véanse
Publicaciones de Solicitudes de Patentes PCT N.^{os}: WO 96/33735
y WO 94/02602. Los procedimientos adicionales se describen en la
Patente de los Estados Unidos N.º: 5.545.807, las Publicaciones de
Solicitudes de Patentes PCT N.^{os}: WO 91/10741 y WO 90/04036, y
en la Patente EP N.º: 0 546 073 B1 y la Publicación de Solicitud de
Patente PCT N.º: WO 92/03918. Los anticuerpos humanos se pueden
producir también mediante la expresión de ADN recombinante en
células huésped o mediante la expresión en células de hibridoma
como se describe en el presente documento.
En una realización alternativa, los anticuerpos
humanos se pueden producir también a partir de bibliotecas
presentadas en fagos (Hogenboom y col., J. Mol. Biol. 227: 381,
1991; Marks y col., J. Mol. Biol. 222: 581, 1991). Estos
procedimientos imitan la selección inmune a través de la
presentación de repertorios de anticuerpos en la superficie de
bacteriófagos filamentosos, y de la selección subsiguiente de fagos
por su unión a un antígeno de elección. Se describe una técnica tal
en la Publicación de Solicitud de Patente N.º: WO 99/10494, que
describe el aislamiento de afinidad alta y anticuerpos agonistas
funcionales para los receptores de MPL y de msk usando una
aproximación tal.
Los anticuerpos quiméricos, injertados en CDR, y
humanizados se producen típicamente mediante procedimientos
recombinantes. Los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos se
introducen dentro de células huésped y se expresan usando
materiales y procedimientos descritos en el presente documento y
conocidos en la técnica. En una realización preferida, los
anticuerpos se producen en células huésped de mamíferos, tales como
células CHO. Se pueden producir anticuerpos monoclonales (por
ejemplo, humanos) mediante la expresión de ADN recombinante en
células huésped o mediante la expresión en células de hibridoma como
se describen en el presente documento.
Los anticuerpos
anti-(E10C)hPYY_{3-36} y
anti-(D11C)hPYY_{3-36} de la invención se
pueden emplear en cualquier procedimiento de ensayo conocido, tal
como ensayos de unión competitiva, ensayos de sándwich directos e
indirectos, y ensayos de inmunoprecipitación (Sola, Monoclonal
Antibodies: A Manual of Techniques, 147-158 (CRC
Press, Inc., 1987) para la detección y la cuantificación de
polipéptidos (E10C)hPYY_{3-36} y
(D11C)hPYY_{3-36}, así como de
purificación polipeptídica. Los anticuerpos unirán polipéptidos
(E10C)hPYY_{3-36} o
(D11C)hPYY_{3-36} con una afinidad que es
apropiada para el procedimiento de ensayo empleándose.
Los agonistas de PYY de la invención se pueden
proporcionar en forma de sales de adición ácida farmacéuticamente
aceptables para usar en el aspecto de procedimiento de la invención.
Las sales de adición ácida farmacéuticamente aceptables
representativas de los presentes compuestos incluyen sales
clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, nitrato, sulfato, bisulfato,
fosfato, fosfato ácido, isonicotinato, acetato, lactato, salicilato,
citrato, citrato ácido, tartrato, pantotenato, bitartrato,
ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato,
glucuronato, sacarato, formiato, benzoato, glutamato,
metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato,
p-toluenosulfonato, pamoato, palmitato, malonato,
estearato, laurato, malato, borato, hexafluorofosfato, naftilato,
glucoheptonato, lactobionato y laurilsulfonato y similares. Las
sales de las variantes no pegiladas no necesitan ser
farmacéuticamente aceptables donde la variante está para usarse
como un intermedio en la preparación del conjugado de la variante
PEG-PYY_{3-36}.
Los agonistas PYY de la presente invención se
administrarán generalmente en la forma de una composición
farmacéutica. La composición farmacéutica puede, por ejemplo, estar
en una forma adecuada para administración oral (por ejemplo, un
comprimido, cápsula, píldora, polvo, solución, suspensión) para
inyección parenteral (por ejemplo, una solución estéril, suspensión
o emulsión), para administración intranasal (por ejemplo, unas gotas
de aerosol, etc.), para administración rectal (por ejemplo, un
supositorio) o para transdérmica (por ejemplo, un parche). La
composición farmacéutica puede estar en formas de dosificación
unitarias adecuadas para administración única de dosis precisas. La
composición farmacéutica incluirá un vehículo farmacéutico
convencional y un agonista de PYY de la invención como un
ingrediente activo. Además, puede incluir otros agentes
farmacéuticos, coadyuvantes, etc.
Se conocen bien procedimientos de preparar
diversas composiciones farmacéuticas de péptidos bioactivos en la
técnica de las ciencias farmacéuticas. Por ejemplo, véanse
Publicación de Solicitud de Patente de los EE.UU. N.º: 2005/0009748
(para administración oral); y 2004/0157777, 2005/0002927 y
2005/0215475 (para administración transmucosal, por ejemplo,
administración intranasal o bucal). Véase también Remington: The
Practice of Pharmacy, Lippincott Williams and Wilkins, Baltimore,
MD, 20ª edición 2000.
Los agonistas de PYY de esta invención se pueden
usar en conjunción con otros agentes farmacéuticos para el
tratamiento de los estados morbosos o afecciones descritas en el
presente documento. Por lo tanto los procedimientos de tratamiento
que incluyen administrar compuestos de la presente invención en
combinación con otros agentes farmacéuticos se proporcionan también
por la presente invención.
Los agentes farmacéuticos adecuados que se
pueden usar en combinación con los agonistas de PYY de la presente
invención incluyen otros agentes antiobesidad tales como
antagonistas de cannabinoide-1
(CB-1) (tales como rimonabant), inhibidores de
11\beta-hidroxi esteroide
deshidrogenasa-1 (11\beta-HSD tipo
1), agonistas de MCR-4, agonistas de
colecistoquinina-A (CCK-A),
inhibidores de recaptación de monoamina (tales como sibutramina),
agentes simpatomiméticos, agonistas de receptor \beta_{3}
adrenérgico, agonistas de receptor de dopamina (tales como
bromocriptina), análogos de receptor de hormonas estimuladoras de
melanocitos, agonistas de receptor 5HT2c, antagonistas de hormonas
de concentración de melanina, leptina, análogos de leptina,
agonistas de receptores de leptina, antagonistas de galanina,
inhibidores de lipasas (tales como tetrahidrolipstatina, es decir
orlistat), agentes anoréxicos (tales como agonista de bombesina),
antagonistas de receptor de neuropéptido Y (por ejemplo,
antagonistas de receptor Y5 de NPY), agentes tiromiméticos,
dehidroepiandrosterona o un análogo de la misma, agonistas o
antagonistas de receptor de glucocorticoides, antagonistas de
receptor de orexina, agonistas de receptor de péptido 1 similar a
glucagón, factores neurotróficos ciliares (tales como Axokina^{TM}
disponible a partir de Regeneron Pharmaceuticals, Inc., Tarrytown,
NY y Procter & Gamble Company, Cincinnati, OH), inhibidores de
proteína relacionada con el agutí humana (AGRP), antagonistas de
receptor de grelina, antagonistas o agonistas inversos de receptor
de histamina 3, agonistas de receptor de neuromedina U, inhibidores
de MTP/ApoB (por ejemplo, inhibidores de MTP selectivos de
intestino, tales como dirlotapida) y similares.
Los agentes antiobesidad preferidos para usar en
combinación con los agonistas PYY de la presente invención incluyen
antagonistas de receptor CB-1, inhibidores de MTP
selectivos de intestino, agonistas de CCKa, agonistas de receptor
de 5HT2c, antagonistas de receptor Y5 de NPY, orlistat, y
sibutramina. Los antagonistas de receptor de CB-1
preferidos para usar en los procedimientos de la presente invención
incluyen: rimonabant (SR141716A también conocido bajo el nombre
comercial Acomplia^{TM}) está disponible a partir de
Sanofi-Synthelabo o se puede preparar como se
describe en la Patente de los Estados Unidos N.º: 5.624.941;
N-(piperidin-1-il)-1-(2,4-diclorofenil)-5-(4-yodofenil)-4-metil-1H-pirazol-3-carboxamida
(AM251) está disponible a partir de Tocris^{TM}, Ellisville, MO;
[5-(4-bromofenil)-1-(2,4-dicloro-fenil)-4-etil-N-(1-piperidinil)-1H-pirazol-3-carboxamida)
(SR147778) que se puede preparar como se describe en la Patente de
los Estados Unidos N.º: 6.645.985;
N-(piperidin-1-il)-4,5-difenil-1-metilimidazol-2-carboxamida,
N-(piperidin-1-il)-4-(2,4-diclorofenil)-5-(4-clorofenil)-1-metilimidazol-2-carboxamida,
N-(piperidin-1-il)-4,5-di-(4-metilfenil)-1-metilimidazol-2-carboxamida,
N-ciclohexil-4,5-di-(4-metilfenil)-1-metilimidazol-2-carboxamida,
N-(ciclohexil)-4-(2,4-diclorofenil)-5-(4-clorofenil)-1-metilimidazol-2-carboxamida,
y
N-(fenil)-4-(2,4-diclorofenil)-5-(4-clorofenil)-1-metilimidazol-2-carboxamida
que se puede preparar como se describe en la Publicación de
Solicitud de Patente PCT N.º: WO 03/075660; las sales clorhidrato,
mesilato y besilato de la amida del ácido
1-[9-(4-cloro-fenil)-8-(2-cloro-fenil)-9H-piridin-6-il]-4-etilamino-piperidina-4-carboxílico
que se pueden preparar como se describe en la Publicación de
Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.º: 2004/0092520; amida
del ácido
1-[7-(2-cloro-fenil)-8-(4-clorofenil)-2-metil-pirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-il]-3-etil-amino-acetidina-3-carboxílico
y amida del ácido
1-[7-(2-clorofenil)-8-(4-clorofenil)-2-metil-pirazolo[1,5-a][1,3,5]triazin-4-il]-3-metilamino-acetidina-3-carboxílico
que se pueden preparar como se describe en la Publicación de
Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.º: 2004/0157839;
3-(4-cloro-fenil)-2-(2-cloro-fenil)-6-(2,2-difluoro-propil)-2,4,5,6-tetrahidro-pirazolo[3,4-c]piridin-7-ona
que se puede preparar como se describe en la Publicación de
Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.º: 2004/0214855;
3-(4-cloro-fenil)-7-(2,2-difluoro-propil)-6,7-dihidro-2H,5H-4-oxa-1,2,7-triaza-azulen-8-ona
que se puede preparar como se describe en la Publicación de
Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.º: 2005/0101592;
2-(2-cloro-fenil)-6-(2,2,2-trifluoroetil)-3-(4-trifluorometil-fenil)-2,6-dihidro-pirazolo[4,3-d]pirimidin-7-ona
que se puede preparar como se describe en la Publicación de
Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.º: 2004/0214838;
(S)-4-cloro-N-{[3-(4-cloro-fenil)-4-fenil-4,5-dihidro-pirazol-1-il]-metilamino-metileno}-bencenosulfonamida
(SLV-319) y
(S)-N-{[3-(4-clorofenil)-4-fenil-4,5-dihidro-pirazol-1-il]-metilamino-metileno}-4-trifluorometil-bencenosulfonamida
(SLV-326) que se pueden preparar como se describe
en la Publicación de Solicitud de Patente PCT N.º: WO 02/076949;
N-piperidino-5-(4-bromofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4-etilpirazona-3-carboxamida
que se puede preparar como se describe en la Patente de los Estados
Unidos N.º: 6.432.984;
1-[bis-(4-cloro-fenil)-metil]-3-[(3,5-difluoro-fenil)-metanosulfonil-metileno]-acetidina
que se puede preparar como se describe en la Publicación de
Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.º: 6.518.264;
2-(5-(trifluorometil)piridin-2-iloxi)-N-(4-(4-clorofenil)-3-(3-cianofenil)butan-2-il)-2-metilpropanamida
que se puede preparar como se describe en la Publicación de
Solicitud de Patente PCT N.º: WO 04/048317;
4-{[6-metoxi-2-(4-metoxiofenil)-1-benzofuran-3-il]carbonil}benzonitrilo
(LY-320135) que se puede preparar como se describe
en la Patente de los Estados Unidos N.º: 5.747.524;
1-[2-(2,4-diclorofenil)-2-(4-fluorofenil)-benzo[1,3]dioxol-5-sulfonil]-piperidina
que se puede preparar como se describe en WO 04/013120; y
[3-amino-5-(4-clorofenil)-6-(2,4-diclorofenil)-furo[2,3-b]piridin-2-il]-fenil-metanona
que se puede preparar como se describe en la Publicación de
Solicitud de Patente PCT N.º: WO 04/012671.
Los inhibidores de MTP de acción intestinal
preferidos para usar en las combinaciones, composiciones
farmacéuticas, y procedimientos de la invención incluyen
dirlotapida
((S)-N-{2-bencil(metil)amino]-2-oxo-1-feniletil}-1-metil)-5-{4'-(trifluorometil)[1,1'-bifenil)]-2-carboxamido]-1H-indol-2-carboxamida)
y
(carbamoil-fenil-metil)-amida
del ácido
1-(metil)-5-[(4'-trifluorometil-bifenil-2-carbonil)amino]-1H-indol-2-carboxílico
que se pueden preparar ambos usando procedimientos descritos en la
Patente de los Estados Unidos N.º: 6.720.351;
(pentilcarbamoil-fenil-metil)-amida
del ácido
(S)-2-[(4'-trifluorometil-bifenil-2-carbonil)-amino]-quinolina-6-carboxílico,
{[(4-fluoro-benil)-metil-carbamoil]-fenil-metil}-amida
del ácido
(S)-2-[(4'-terc-butil-bifenil-2-carbonil-)-amino]-quinolina-6-carboxílico,
y
[(4-fluoro-bencilcarbamoilo)-fenil-metil]-amida
del ácido
(S)-2-[(4'-terc-butil-bifenil-2-carbonil-)-amino]-quinolina-6-carboxílico
que pueden prepararse todos como se describe en la Publicación de
Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.º: 2005/0234099A1,
(-)-4-[4-(4-[4-[[(2S,4R)-2-(4-clorofenil)-2-[[(4-metil-4H-1,2,4-triazol-3-il)sulfanil]metil-1,3-dioxolan-4-il]metoxi]fenil]piperazin-1-il]fenil]-2-(1R)-1-metilpropill]-2,4-dihidro-3H-1,2,4-triazol-3-ona
(también conocida como Mitratapida o R103757) que se puede preparar
como se describe en las Patentes de los Estados Unidos N.^{os}:
5.521.186 y 5-929.075; e implitapida (BAY
13-9952) que se puede preparar como se describe en
la Patente de los Estados Unidos N.º: 6.265.431. La más preferida es
dirlotapida, mitratamida,
(S)-2-(pentilcarbamoil-fenil-metil)-amida
del ácido
(S)-2-[(4'-trifluorometil-bifenil-2-carbonil)-amino]-quinolina-6-carboxílico,
[(4-fluoro-bencil)-metil-carbamoil]-fenil-metil}-amida
del ácido
(S)-2-[(4'-terc-butil-bifenil-2-carbonil-)-amino]-quinolina-6-carboxílico,
o
[(4-fluoro-bencilcarbamoilo)-fenil-metil]-amida
del ácido
(S)-2-[(4'-terc-butil-bifenil-2-carbonil-)-amino]-quinolina-6-carboxílico.
El antagonista de receptor de NPY Y5 preferido incluye:
2-oxo-N-(5-fenilpirazinil)espiro[isobenzofuran-1(3H),4'-piperidina]-1'-carboxamida
que se puede preparar como se describe en la Publicación de
Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.º: 2002/0151456, y
3-oxo-N-(5-fenil-2-pirazinil)-espiro[isobenzofuran-1-(3H),4-piperidina-1'-carboxamida;
3-oxo-N-(7-trifluorometilpirido[3,2-b]piridin-2-il)-espiro[isobenzofuran-1-(3H),4-piperidina-1'-carboxamida;
N-[5-(3-fluorofenil)-2-pirimidinil]-3-oxoespiro-[isobenzofuran-1(3H),-[4'-piperidina]-1'-carboxamida;
trans-3'-oxo-N-(5-fenil-2-pirimidinil)]espiro[ciclohexano-1,1'(3'H)-isobenzofuran]-4-carboxamida;
trans-3'-oxo-N-[1-(3-quinolil)-4-imidazolil]espiro[ciclohexano-1,1'(3'H)-isobenzofuran]-4-carboxamida;
trans-3'-oxo-N-(5-fenil-2-pirazinil)espiro[4-azaiso-benzofuran-1(3H),1'-ciclohexano]-4'-carboxamida; trans-N-[5-
(3-fluorofenil)-2-pirimidinil]-3-oxospiro[5-azaisobenzofuran-1(3H),1'-ciclohexano]-4'-carboxamida; trans-N-[5-(2-fluorofenil)-2-pirimidinil]-3-oxospiro[5-azaisobenzofuran-1(3H),1'-ciclohexano]-4'-carboxamida; trans-N-[1-(3,5-
difluorofenil)-4-imidazinil]-3-oxoespiro[7-azaisobenzofuran-1(3H),1'-ciclohexano]-4'-carboxamida; trans-3'-oxo-N-(1-fenil-4-pirazolil)espiro[4-azaisobenzofuran-1(3H),1'-ciclohexano]-4'-carboxamida; trans-N-[1-(2-fluorofenil)-3-
pirazolil]-3-oxospiro[6-azaisobenzofuran-1(3H),1'-ciclohexano]-4'-carboxamida; trans-3'-oxo-N-(1-fenil-3-pirazo-
lil)espiro[6-azaisobenzofuran-1(3H),1'-ciclohexano]-4'-carboxamida; y trans-3'-oxo-N-(2-fenil-1,2,3-triazol-4-il)espiro[6-azaisobenzofuran-1(3H),1'-ciclohexano]-4'-carboxamida, todo lo cual se puede preparar como se describe en la Publicación de Solicitud de Patente PCT N.º: WO 03/082190; y sales y ésteres farmacéuticamente aceptables de los mismos.
trans-3'-oxo-N-(5-fenil-2-pirazinil)espiro[4-azaiso-benzofuran-1(3H),1'-ciclohexano]-4'-carboxamida; trans-N-[5-
(3-fluorofenil)-2-pirimidinil]-3-oxospiro[5-azaisobenzofuran-1(3H),1'-ciclohexano]-4'-carboxamida; trans-N-[5-(2-fluorofenil)-2-pirimidinil]-3-oxospiro[5-azaisobenzofuran-1(3H),1'-ciclohexano]-4'-carboxamida; trans-N-[1-(3,5-
difluorofenil)-4-imidazinil]-3-oxoespiro[7-azaisobenzofuran-1(3H),1'-ciclohexano]-4'-carboxamida; trans-3'-oxo-N-(1-fenil-4-pirazolil)espiro[4-azaisobenzofuran-1(3H),1'-ciclohexano]-4'-carboxamida; trans-N-[1-(2-fluorofenil)-3-
pirazolil]-3-oxospiro[6-azaisobenzofuran-1(3H),1'-ciclohexano]-4'-carboxamida; trans-3'-oxo-N-(1-fenil-3-pirazo-
lil)espiro[6-azaisobenzofuran-1(3H),1'-ciclohexano]-4'-carboxamida; y trans-3'-oxo-N-(2-fenil-1,2,3-triazol-4-il)espiro[6-azaisobenzofuran-1(3H),1'-ciclohexano]-4'-carboxamida, todo lo cual se puede preparar como se describe en la Publicación de Solicitud de Patente PCT N.º: WO 03/082190; y sales y ésteres farmacéuticamente aceptables de los mismos.
En el aspecto de los procedimientos de la
invención, un agonista de PYY de la invención, solo o en combinación
con uno o más agentes farmacéuticos, se administra periféricamente
a un sujeto por separado o conjuntamente en cualquiera de los
procedimientos convencionales de administración periférica conocidos
en la técnica. De acuerdo con ello, el agonista de PYY o la
combinación de PYY se puede administrar a un sujeto parenteralmente
(por ejemplo, intravenosamente, intraperitonealmente,
intramuscularmente, o subcutáneamente), intranasalmente, oralmente,
sublingualmente, bucalmente, mediante inhalación (por ejemplo,
mediante aerosol), rectalmente (por ejemplo, mediante supositorios)
o transdérmicamente. La administración parenteral es un
procedimiento preferido de administración, y la administración
subcutánea es un procedimiento de administración parenteral.
Las composiciones adecuadas para inyección
parenteral incluyen generalmente soluciones, dispersiones,
suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas estériles
farmacéuticamente aceptables, y los polvos estériles para la
reconstitución en soluciones o dispersiones estériles inyectables.
Ejemplos de vehículos o diluyentes acuosos o no acuosos adecuados
(incluyendo disolventes y vehículos), incluyen agua, etanol,
polioles (propilenoglicol, polietilenoglicol, glicerol, y
similares), mezclas adecuadas de los mismos, triglicéridos
incluyendo aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres
orgánicos inyectables tales como oleato de etilo.
Estas composiciones para inyección parenteral
pueden contener también excipientes tales como agentes preservantes,
humectantes, solubilizantres, emulsionantes, y dispersantes. La
prevención de la contaminación con microorganismos de las
composiciones se puede llevar a cabo con diversos agentes
antibacterianos y anifúngicos, por ejemplo, parabenos,
clorobutanol, fenol, ácido sórbico, y similares. Puede ser también
deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, cloruro
de sodio, y similares. Se puede dar lugar a la absorción prolongada
de composiciones farmacéuticas inyectables mediante el uso de
agentes capaces de retardar la absorción, por ejemplo, monoestearato
de aluminio y gelatina.
Los agonistas de PPY de la presente invención se
administrarán a un sujeto a una dosificación que varía dependiendo
de un número de factores, incluyendo el modo de administración, la
edad y peso del sujeto, la gravedad de la enfermedad, la afección o
el trastorno que se está tratando, y la actividad farmacológica del
agonista de PYY administrándose. La determinación de los intervalos
de dosificación y las dosificaciones óptimas para un paciente
particular está bien dentro de la habilidad ordinaria en la
técnica.
Para administración parenteral, los agonistas de
PYY de la presente invención se pueden administrar a un sujeto
humano a niveles de dosificación en el intervalo de aproximadamente
0,01 \mug/kg a aproximadamente 10 mg/kg/dosis en un régimen de
dosificación en una base variante no pegilada. Por ejemplo, para la
maleimida de mPEG de 30 K
(E10C)hPYY_{3-36}, el nivel de dosificación
parenteral estaría en el intervalo de aproximadamente 0,01
\mug/kg a aproximadamente 10 mg/kg/dosis en un régimen de
dosificación en una base de
(E10C)hPYY_{3-36}, preferiblemente en el
intervalo de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 1,0
mg/kg/dosis, o aproximadamente 0,05 mg/kg o 0,1 mg/kg a
aproximadamente 1,0 mg/kg/dosis, o aproximadamente 0,05 mg/kg o 0,1
mg/kg a aproximadamente 0,3 ó 0,5 mg/kg/dosis. Por ejemplo, una
dosis de 85 mg de maleimida de mPEG de 30 K
(E10C)hPYY_{3-36}, que tiene un peso
molecular de aproximadamente 34024 Da (PEG de 30 KDa más 4024, el
peso molecular del péptido no pegilado), es equivalente a 10 mg en
una base de (E10C)hPYY_{3-36}, no pegilado.
El régimen de dosificación puede ser de una o más dosis
diariamente, preferiblemente antes de una comida, o, particularmente
con la maleimida de mPEG de 30 K
(E10C)hPYY_{3-36} o con la maleimida de
mPEG de 20 K (E10C)hPYY_{3-36}, se prefiere
un régimen de dosificación de 2 ó 3 veces a la semana o una vez
semanalmente o una vez cada 10-14 días.
Las realizaciones de la presente invención se
ilustran por los siguientes ejemplos. Se entenderá, sin embargo,
que las realizaciones de la invención no se limitan a detalles
específicos de estos ejemplos, ya que se conocerán otras
variaciones de los mismos, o serán patentes a la luz de la
descripción actual y la reivindicaciones adjuntas, para alguien de
habilidad ordinaria en la técnica. Todas las referencias citadas en
el presente documento se incorporan por la presente mediante
referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Este ejemplo proporciona la preparación de
(E10C)hPYY_{3-36} monopegilado
sustancialmente homogéneo con mPEG (30 K o 20 K) unido al residuo
10.
Se sintetizó
(E10C)hPYY_{3-36} mediante procedimiento en
fase sólida usando estrategia de Fmoc con activación de
hexafluorofosfato de
2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio/HBTU)
(Fastmoc, ciclos de 0,15 mmol) usando un sintetizador de péptidos
automático (modelo 433A; Applied Biosystems, Foster City, CA). Los
grupos de protección de cadena lateral fueron Trt para Asn, Gln,
Cys y His; tBu para Ser, Thr, y Tyr; Boc para Lys; OtBu para Asp y
Glu; y Pbf para Arg. La escisión de péptido-resina
se completó con una mezcla de 9 ml de ácido trifluoroacético (TFA),
0,5 g de fenol, 0,5 ml de H_{2}O, 0,5 ml de tioanisol y 0,25 ml de
1,2-etanoditiol a temperatura ambiente durante 4
horas. Se precipitó péptido en éter etílico enfriado en hielo, y se
lavó con éter etílico, se disolvió en DMSO y se purificó mediante
HPLC en fase reversa en un Waters Deltapak C18, 15 \mum, 100
\ring{A}, columna ID de 50 x 300 mm (número de catálogo WAT011801,
Waters, Milford, MA) usando un gradiente lineal desde Disolvente A
al 100%: Disolvente B al 0% hasta Disolvente A al 70%: Disolvente B
al 30% en 30 minutos a una velocidad de flujo de 80 ml/minuto. El
Disolvente A es una solución de TFA (ácido trifluoroacético) al
0,1% acuoso. El Disolvente B es una solución de TFA al 0,1% en
acetonitrilo. La masa molecular del péptido purificado se confirmó
mediante ESI-EM (M_{Avg} = 4020), y la pureza se
valoró mediante HPLC en fase reversa (figura 1).
El reactivo de maleimida de mPEG lineal de
aproximadamente 30.000 de masa molecular (Sunbright
ME-300MA, NOF Corporation, Tokio, Japón) se acopló
selectivamente a (E10C)hPYY_{3-36} en el
grupo sulfhidrilo de la cisteína en el residuo 10. La maleimida de
mPEG de 30 K lineal, disuelta en HEPES 20 mM (Sigma Chemical, San
Luis, MO) pH 7,0, o, alternativamente, acetato de sodio 20 mM
(Sigma Chemical, San Luis, MO) pH 4,5, se hizo reaccionar
inmediatamente con péptido
(E10C)hPYY_{3-36} mediante adición directa
de péptido proporcionando una concentración de péptido de 1 mg/ml y
una razón molar de mPEG:(E10C)hPYY_{3-36}
relativa de aproximadamente 1:1. Se llevaron a cabo reacciones en
la oscuridad a temperatura ambiente durante 0,5-24
horas. Las reacciones en HEPES a pH 7,0 se detuvieron por dilución
en acetato de sodio 20 mM pH 4,5, para purificación inmediata en
cromatografía de intercambio catiónico. Se cargaron reacciones en
acetato de sodio 20 mM, pH 4,5, directamente sobre cromatografía de
intercambio catiónico. Los productos de reacción se valoraron
mediante SEC-HPLC (figura 2).
La especie de
(E10C)hPYY_{3-36} pegilada se purificó a
partir de la mezcla de reacción a >95% usando una etapa de
cromatografía de intercambio iónico única. Se purificó
(E10C)hPYY_{3-36} monopegilado a partir de
(E10C)hPYY_{3-36} no modificado y especies
de peso molecular mayor usando cromatografía de intercambio
catiónico. Una mezcla típica de reacción de maleimida de mPEG de 30
K lineal (E10C)hPYY_{3-36} (10 mg de
proteína), como se describe anteriormente, se fraccionó en una
columna Hitrap de SP-Sefarosa (5 ml) (Amersham
Pharmacia Biotech, GE Healthcare, Piscataway, NJ) equilibrada en
acetato de sodio 20 mM, pH 4,5 (Tampón A). La mezcla de reacción se
diluyó 7X con tampón A y se cargó sobre la columna a una velocidad
de flujo de 2,5 ml/min. La columna se lavó con 5-10
volúmenes de columna de tampón A. Subsiguientemente, las diversas
especies de (E10C)hPYY_{3-36} se eluyeron
a partir de la columna en 20 volúmenes de columna de un gradiente de
NaCl lineal de 0-100 mM. El eluyente se sometió a
seguimiento por la absorbancia a 280 nm (A_{280}) y se recogieron
fracciones de tamaño apropiado. Las fracciones se almacenaron hasta
el grado de pegilación, según se valoró mediante
®SDS-PAGE (figura 3). La reserva purificada se
concentró después a 0,5-5 mg/ml en un concentrador
Centriprep 3 (Amicon Technology Corporation, Northboroug, MA) o,
alternativamente, usando un concentrador de Vivaspin 10 K
(Vivasience Sartorius Group, Hannover, Alemania). Se determinó la
concentración de proteínas de la reserva purificada comparando el
área del pico de HPLC RP para una curva estándar de
PYY_{3-36} (no mostrada) o, alternativamente, la
concentración de una reserva purificada se determinó por la
absorbancia a 280 nm usando un coeficiente de extinción derivado
experimentalmente. Una reserva purificada de
(E10C)hPYY_{3-36} pegilado se perfiló
usando SEC-HPLC como se muestra en la figura 6.
El reactivo de maleimida de mPEG lineal de
aproximadamente 20.000 de masa molecular (Sunbright
ME-300MA, NOF Corporation) se acopló de forma
selectiva a (E10C)hPYY_{3-36} en el grupo
sulfhidrilo de la cisteína en el residuo 10. La maleimida de mPEG
de 20 K lineal, disuelta en acetato de sodio 20 mM (Sigma Chemical,
San Luis, MO) pH 4,5, se hizo reaccionar inmediatamente con péptido
(E10C)hPYY_{3-36} mediante adición directa
de péptido proporcionando una concentración de péptido de 1 mg/ml y
una razón molar de mPEG:(E10C)hPYY_{3-36}
relativa de aproximadamente 1,3:1. Las reacciones se llevaron a cabo
en la oscuridad a temperatura ambiente durante 60 minutos seguidos
por 16 horas a 4ºC. Las reacciones en acetato de sodio 20 mM, pH
4,5, se cargaron directamente sobre cromatografía de intercambio
catiónico. Los productos de reacción se valoraron mediante
SEC-HPLC.
La especie de
(E10C)hPYY_{3-36} pegilada se purificó a
partir de la mezcla de reacción a >95% usando una etapa de
cromatografía de intercambio iónico única. Se separó
(E10C)hPYY_{3-36} monopegilado a partir de
(E10C)hPYY_{3-36} no modificado, libre de
PEG y especies de peso molecular mayor usando cromatografía de
intercambio catiónico. Una maleimida de PEG de 20 K lineal
(E10C)hPYY_{3-36} típica (20 mg de
proteína), como se describe anteriormente, se fraccionó en una
columna Hitrap de SP-Sefarosa (5 ml) (Amersham
Pharmacia Biotech, GE Healthcare) equilibrada en acetato de sodio
20 mM, pH 4,5 (Tampón A). La mezcla de reacción se cargó sobre la
columna a una velocidad de flujo de 1,0 ml/minuto. La columna se
lavó con 4 volúmenes de columna de tampón A a una velocidad de
flujo de 2,5 ml/minuto. Subsiguientemente, las diversas especies de
(E10C)hPYY_{3-36} se eluyeron a partir de
la columna en 25 volúmenes de columna de un gradiente de NaCl lineal
de 0-200 mM a una velocidad de flujo de 2,5
ml/minuto. El eluyente se sometió a seguimiento por la absorbancia a
280 nm (A_{280}) y se recogieron fracciones de tamaño apropiado.
Las fracciones se almacenaron hasta el grado de pegilación, según
se valoró mediante SEC-HPLC. La reserva purificada
se concentró después a 0,5-5 mg/ml usando un
concentrador de Vivaspin 10 K (Vivasience Sartorius Group). Se
determinó la concentración de proteínas de la reserva purificada
por la absorbancia a 280 nm usando un coeficiente de extinción
derivado experimentalmente. El rendimiento del proceso total de
maleimida de mPEG de 20 K (E10C)hPYY_{3-36}
fue el 38%. La reserva purificada de maleimida de mPEG de 20 K
(E10C)hPYY_{3-36} se determinó que estaba
pura al 96% usando SEQ-HPLC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Este ejemplo demuestra la preparación de
(D11C)hPYY_{3-36} monopegilado
sustancialmente homogéneo con mPEG unido en el residuo 11.
Se sintetizó
(D11C)hPYY_{3-36} mediante procedimiento en
fase sólida usando estrategia de Fmoc con activación de
hexafluorofosfato de
2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio/HBTU)
(Fastmoc, ciclos de 0,15 mmol) usando un sintetizador de péptidos
automático (modelo 433A; Applied Biosystems, Foster City, CA). Los
grupos de protección de cadena lateral fueron Trt para Asn, Gln,
Cys y His; tBu para Ser, Thr, y Tyr; Boc para Lys; OtBu para Asp y
Glu; y Pbf para Arg. La escisión de péptido-resina
se completó con una mezcla de 9 ml de ácido trifluoroacético (TFA),
0,5 g de fenol, 0,5 ml de H_{2}O, 0,5 ml de tioanisol y 0,25 ml de
1,2-etanoditiol a temperatura ambiente durante 4
horas. Se precipitó péptido en éter etílico enfriado en hielo, y se
lavó con éter etílico, se disolvió en DMSO y se purificó mediante
HPLC en fase reversa en un Waters Deltapak C18, 15 \mum, 100
\ring{A}, columna ID de 50 x 300 mm (número de catálogo WAT011801,
Waters, Milford, MA) usando un gradiente lineal desde Disolvente A
al 100%: Disolvente B al 0% hasta Disolvente A al 70%: Disolvente B
al 30% en 30 minutos a una velocidad de flujo de 80 ml/minuto. El
Disolvente A es una solución de TFA (ácido trifluoroacético) al
0,1% acuoso. El Disolvente B es una solución de TFA al 0,1% en
acetonitrilo. La masa molecular del péptido purificado se confirmó
mediante ESI-EM (M_{Avg} = 4038), y la pureza se
valoró mediante HPLC en fase reversa (figura 4).
El reactivo de maleimida de mPEG lineal de
aproximadamente 30.000 de masa molecular (Sunbright
ME-300MA, NOF Corporation, Tokio, Japón) se acopló
selectivamente a (D11C)hPYY_{3-36} en el
grupo sulfhidrilo de la cisteína en el residuo 11. La maleimida de
mPEG de 30 K lineal, disuelto en HEPES 20 mM (Sigma Chemical, San
Luis, MO) pH 7,0 se hizo reaccionar inmediatamente con péptido
(D11C)hPYY_{3-36} mediante adición directa
de péptido proporcionando una concentración de péptido de 1 mg/ml y
una razón molar de mPEG:(D11C)hPYY_{3-36}
relativa de aproximadamente 1:1. Se llevaron a cabo reacciones en
la oscuridad a temperatura ambiente durante 0,5-24
horas. Las reacciones se detuvieron por dilución en acetato de sodio
20 mM pH 4,5, para purificación inmediata en cromatografía de
intercambio catiónico. Los productos de reacción se valoraron
mediante SEC-HPLC (figura 5).
Alternativamente, en vez de disolver la
maleimida de mPEG de 30 K lineal en HEPES como se describe
anteriormente, se disuelve en acetato de sodio 20 mM (Sigma
Chemical, San Luis, MO), pH 4,5, y se hace reaccionar inmediatamente
con péptido (D11C)hPYY_{3-36} mediante
adición directa de péptido proporcionando una concentración de
péptido de 1 mg/ml y una razón molar de
mPEG:(D11C)hPYY_{3-36} relativa de
aproximadamente 1:1. Se llevaron a cabo reacciones en la oscuridad
a temperatura ambiente durante 0,5-24 horas. Las
reacciones se cargaron directamente en cromatografía de intercambio
catiónico. Los productos de reacción se valoraron mediante
SEC-HPLC.
La especie de
(D11C)hPYY_{3-36} pegilada se purificó a
partir de la mezcla de reacción a >95% usando una etapa de
cromatografía de intercambio iónico única. Se purificó
(D11C)hPYY_{3-36} monopegilado a partir de
(D11C)hPYY_{3-36} no modificado y especies
de peso molecular mayor usando cromatografía de intercambio
catiónico. Una mezcla típica de reacción de maleimida de mPEG de 30
K (D11C)hPYY_{3-36} lineal (10 mg de
proteína), como se describe anteriormente, se fraccionó en una
columna Hitrap de SP-Sefarosa (5 ml) (Amersham
Pharmacia Biotech, GE Healthcare, Piscataway, NJ) equilibrada en
acetato de sodio 20 mM, pH 4,5 (Tampón A). Las mezclas de reacción
a pH 7,0 se diluyeron 7X con tampón A y se cargaron sobre la columna
a una velocidad de flujo de 2,5 ml/min. La columna se lavó con
5-10 volúmenes de columna de tampón A.
Subsiguientemente, las diversas especies de
(D11C)hPYY_{3-36} se eluyeron a partir de
la columna en 20 volúmenes de columna de un gradiente de NaCl
lineal de 0-100 mM. El eluyente se sometió a
seguimiento por la absorbancia a 280 nm (A_{280}) y se recogieron
fracciones de tamaño apropiado. Las fracciones se almacenaron hasta
el grado de pegilación, según se valoró mediante
SEC-HPLC. La reserva purificada se concentró después
a 0,5-5 mg/ml en un concentrador Vivaspin 10 K
(Vivasience Sartorius Group). Se determinó la concentración de
proteínas de la reserva purificada comparando el área de pico de
HPLC RP con una curva estándar de PYY_{3-36} (no
mostrada). Una reserva purificada de
(D11C)hPYY_{3-36} se perfiló usando
SEC-HPLC como se muestra en la figura 7.
Alternativamente, las reacciones a pH 4,5, de
(b) anteriormente, se cargan directamente sobre la columna a una
velocidad de flujo de 2,5 ml/minuto y se determina una concentración
de la reserva purificada por la absorbancia a 280 nm usando un
coeficiente de extinción derivado experimentalmente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Este ejemplo proporciona la preparación de
(E10C)hPYY_{3-36} monopegilado
sustancialmente homogéneo con mPEG unido al residuo 10.
El reactivo de maleimida de mPEG ramificado de
aproximadamente 43.000 de peso molecular (Sunbright
GL2-400MA, NOF Corporation, Tokio, Japón) se acopló
selectivamente a (E10C)hPYY_{3-36},
preparado como se describe en el Ejemplo 1(a), en el grupo
sulfhidrilo de la cisteína en el residuo 10.
La maleimida de mPEG ramificado de 43 K,
disuelta en HEPES 20 mM (Sigma Chemical, San Luis, MO), pH 7, se
hizo reaccionar inmediatamente con péptido
(E10C)hPYY_{3-36} mediante adición directa
del péptido proporcionando una concentración de péptido de 1 mg/ml
y una razón molar de mPEG:(E10C)hPYY_{3-36}
relativa de aproximadamente 1:1. Se llevaron a cabo reacciones en
la oscuridad a temperatura ambiente durante 0,5-24
horas. Las reacciones en HEPES a pH 7,0 se detuvieron mediante
dilución en acetato de sodio 20 mM, pH 4,5, para purificación
inmediata en cromatografía de intercambio catiónico. Los productos
de reacción se valoraron mediante SEC-HPLC (figura
8).
Alternativamente, maleimida de mPEG ramificado
de 43 K, se disuelve en acetato de sodio 20 mM (Sigma Chemical, San
Luis, MO), pH 4,5, y se hace reaccionar inmediatamente con péptido
(E10C)hPYY_{3-36} mediante adición directa
de péptido proporcionando una concentración de péptido de 1 mg/ml y
una razón molar de mPEG:(E10C)hPYY_{3-36}
relativa de aproximadamente 1:1. Las reacciones se cargaron
directamente en cromatografía de intercambio catiónico.
La especie maleimida de mPEG de 43 K ramificado
(E10C)hPYY_{3-36} monopegilada se separó de
E10C)hPYY_{3-36} no modificada y de
especies de peso molecular mayor usando una etapa de cromatografía
de intercambio catiónico único. Una típica mezcla de reacción de
maleimida de mPEG de 43 K ramificado
(E10C)hPYY_{3-36} monopegilada (10 mg de
proteína) como se describe anteriormente, se fraccionó en una
columna Hitrap de SP-Sefarosa (5 ml) (Amersham
Pharmacia Biotech, GE Healthcare) equilibrada en acetato de sodio 20
mM, pH 4,5 (Tampón A). Las mezclas de reacción a pH 7,0 se
diluyeron 10X con tampón A y se cargaron sobre la columna a una
velocidad de flujo de 2,5 ml/min. La columna se lavó con
5-10 volúmenes de columna de tampón A.
Subsiguientemente, las diversas especies de
(E10C)hPYY_{3-36} se eluyeron a partir de
la columna en 20 volúmenes de columna de un gradiente de NaCl
lineal de 0-100 mM. El eluyente se sometió a
seguimiento por la absorbancia a 280 nm (A_{280}) y se recogieron
fracciones de tamaño apropiado. Las fracciones se almacenaron hasta
el grado de pegilación, según se valoró mediante
SEC-HPLC. La reserva purificada se concentró después
a 0,5-5 mg/ml en un concentrador Centriprep 3
(Amicon Technology Corporation) o, alternativamente, usando un
concentrador Vivaspin 10 K (Vivasience Sartorius Group). La
concentración de proteínas de la reserva purificada se cuantificó
mediante análisis de aminoácidos. Una reserva purificada de
(E10C)hPYY_{3-36} se perfiló usando
SEC-HPLC como se muestra en la figura 9.
Alternativamente, la concentración de proteínas
se determina comparando el área de pico de RP HPLC con una curva
estándar de PYY_{3-36} (no mostrada) o por la
absorbancia a 280 nm usando un coeficiente de extinción derivado
experimentalmente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Este ejemplo contempla la preparación de
(E10C)hPYY_{3-36} monopegilada
sustancialmente homogénea con mPEG de 12 kD, o mPEG de 20 kD
ramificado, unida al residuo 10, y la preparación contemplada de
(D11C)hPYY_{3-36} monopegilado
sustancialmente homogéneo con mPEG de 20 kD lineal, mPEG de 12 kD
lineal, o mPEG de 20 kD ramificado, unido a residuo 11.
El reactivo de maleimida de mPEG lineal de
aproximadamente 12.000 de masa molecular (Sunbright
ME-300MA, NOF Corporation) se acopla selectivamente
a (E10C)hPYY_{3-36} en el grupo sulfhidrilo
de la cisteína en el residuo 10. La maleimida de mPEG de 12 K
lineal, disuelta en acetato de sodio 20 mM (Sigma Chemical) pH 4,5,
se hace reaccionar inmediatamente con péptido
(E10C)hPYY_{3-36} mediante adición directa
del péptido proporcionando una concentración de péptido de 1 mg/ml
y una razón molar de mPEG:(E10C)hPYY_{3-36}
relativa de aproximadamente 1:1. Se llevan a cabo reacciones en la
oscuridad a temperatura ambiente durante 0,5 a 24 horas. Las
reacciones en acetato de sodio 20 mM, pH 4,5, se cargan
directamente en cromatografía de intercambio catiónico. Los
productos de reacción se valoran mediante SEC-HPLC
o SDS-PAGE.
La especie de
(E10C)hPYY_{3-36} pegilado se purifica a
partir de la mezcla de reacción a >95% usando una etapa de
cromatografía de intercambio iónico única. El
(E10C)hPYY_{3-36} monopegilado se separa de
PEG libre, (E10C)hPYY_{3-36} no modificado
y especies de peso molecular mayor usando una cromatografía de
intercambio catiónico. Una típica mezcla de reacción de maleimida
de mPEG de 12 K lineal (E10C)hPYY_{3-36}
(10 mg de proteína) como se describe anteriormente, se fracciona en
una columna Hitrap de SP-Sefarosa (5 ml) (Amersham
Pharmacia Biotech, GE Healthcare) equilibrada en acetato de sodio 20
mM, pH 4,5 (Tampón A). La mezcla de reacción se carga en la columna
a una velocidad de flujo de 1,0 ml/min. La columna se lava con 4
volúmenes de columna de tampón A a una velocidad de flujo de 2,5
ml/min. Subsiguientemente, las diversas especies de
(E10C)hPYY_{3-36} se eluyen a partir de la
columna en 25 volúmenes de columna de un gradiente de NaCl lineal de
0-200 mM a una velocidad de flujo de 2,5 ml/min. El
eluyente se somete a seguimiento por la absorbancia a 280 nm
(A_{280}) y se recogen fracciones de tamaño apropiado. Las
fracciones se almacenan hasta el grado de pegilación, según se
valora mediante SEC-HPLC. La reserva purificada se
concentra después a 0,5-5 mg/ml usando un
concentrador Vivaspin 10 K (Vivascience Sartorius Group). La
concentración de proteína de la reserva purificada se determina por
la absorbancia a 280 nm usando un coeficiente de extinción derivado
experimentalmente. Una reserva purificada de maleimida de mPEG de
(E10C)hPYY_{3-36} de 12 K se perfila usando
SEC-HPLC o SDS-PAGE.
El reactivo de maleimida de mPEG ramificado de
aproximadamente 20.000 de peso molecular (Sunbright
GL2-40MA, NOF Corporation) se acopla selectivamente
a (E10C)hPYY_{3-36} en el grupo sulfhidrilo
de la cisteína en el residuo 10. La maleimida de mPEG de 20 K
ramificado, disuelta en acetato de sodio 20 mM (Sigma Chemical, San
Luis, MO), pH 4,5, se hace reaccionar inmediatamente con péptido
(E10C)hPYY_{3-36} mediante adición directa
de péptido proporcionando una concentración de péptido de 1 mg/ml y
una razón molar de mPEG:(E10C)hPYY_{3-36}
relativa de aproximadamente 1:1. Se llevan a cabo reacciones en la
oscuridad a temperatura ambiente durante 0,5 a 24 horas. Las
reacciones en acetato de sodio 20 mM, pH 4,5, se cargan directamente
en cromatografía de intercambio catiónico. Los productos de
reacción se valoran mediante SEC-HPLC o
SDS-PAGE.
La especie de
(E10C)hPYY_{3-36} pegilado se purifica a
partir de la mezcla de reacción a >95% usando una etapa de
cromatografía de intercambio iónico única. El
(E10C)hPYY_{3-36} monopegilado se separa de
PEG libre, (E10C)hPYY_{3-36} no modificado
y especies de peso molecular mayor usando una cromatografía de
intercambio catiónico. Una típica mezcla de reacción de maleimida
de mPEG de 20 K ramificado
(E10C)hPYY_{3-36} (10 mg de proteína) como
se describe anteriormente, se fracciona en una columna Hitrap de
SP-Sefarosa (5 ml) (Amersham Pharmacia Biotech, GE
Healthcare) equilibrada en acetato de sodio 20 mM, pH 4,5 (Tampón
A). La mezcla de reacción se carga en la columna a una velocidad de
flujo de 1,0 ml/min. La columna se lava con 4 volúmenes de columna
de tampón A a una velocidad de flujo de 2,5 ml/min.
Subsiguientemente, las diversas especies de
(E10C)hPYY_{3-36} se eluyen a partir de la
columna en 25 volúmenes de columna de un gradiente de NaCl lineal de
0-200 mM a una velocidad de flujo de 2,5 ml/min. El
eluyente se somete a seguimiento por la absorbancia a 280 nm
(A_{280}) y se recogen fracciones de tamaño apropiado. Las
fracciones se almacenan hasta el grado de pegilación, según se
valora mediante SEC-HPLC. La reserva purificada se
concentra después a 0,5-5 mg/ml usando un
concentrador Vivaspin 10 K (Vivascience Sartorius Group). La
concentración de proteína de la reserva purificada se determina por
la absorbancia a 280 nm usando un coeficiente de extinción derivado
experimentalmente. Una reserva purificada de maleimida de mPEG de
(E10C)hPYY_{3-36} de 20 K ramificado se
perfila usando SEC-HPLC o
SDS-PAGE.
El reactivo de maleimida de mPEG lineal de
aproximadamente 20.000 de peso molecular (Sunbright
ME-200MA, NOF Corporation) se acopla selectivamente
a (D11C)hPYY_{3-36} en el grupo sulfhidrilo
de la cisteína en el residuo 11. La maleimida de mPEG de 20 K
lineal, disuelta en acetato de sodio 20 mM (Sigma Chemical), pH 4,5,
se hace reaccionar inmediatamente con péptido
(D11C)hPYY_{3-36} mediante adición directa
de péptido proporcionando una concentración de péptido de 1 mg/ml y
una razón molar de mPEG: (D11C)hPYY_{3-36}
relativa de aproximadamente 1:1. Se llevan a cabo reacciones en la
oscuridad a temperatura ambiente durante 0,5 a 24 horas. Las
reacciones en acetato de sodio 20 mM, pH 4,5, se cargan
directamente en cromatografía de intercambio catiónico. Los
productos de reacción se valoran mediante SEC-HPLC
o SDS-PAGE.
La especie de
(D11C)hPYY_{3-36} pegilado se purifica a
partir de la mezcla de reacción a >95% usando una etapa de
cromatografía de intercambio iónico única. El
(D11C)hPYY_{3-36} monopegilado se separa de
PEG libre, (D11C)hPYY_{3-36} no modificado
y de especies de peso molecular mayor usando una cromatografía de
intercambio catiónico. Una típica mezcla de reacción de maleimida de
mPEG de 20 K ramificado (D11C)hPYY_{3-36}
(10 mg de proteína) como se describe anteriormente, se fracciona en
una columna Hitrap de SP-Sefarosa (5 ml) (Amersham
Pharmacia Biotech, GE Healthcare) equilibrada en acetato de sodio 20
mM, pH 4,5 (Tampón A). La mezcla de reacción se carga en la columna
a una velocidad de flujo de 1,0 ml/min. La columna se lava con 4
volúmenes de columna de tampón A a una velocidad de flujo de 2,5
ml/min. Subsiguientemente, las diversas especies de
(D11C)hPYY_{3-36} se eluyen a partir de la
columna en 25 volúmenes de columna de un gradiente de NaCl lineal
de 0-200 mM a una velocidad de flujo de 2,5 ml/min.
El eluyente se somete a seguimiento por la absorbancia a 280 nm
(A_{280}) y se recogen fracciones de tamaño apropiado. Las
fracciones se almacenan hasta el grado de pegilación, según se
valora mediante SEC-HPLC. La reserva purificada se
concentra después a 0,5-5 mg/ml usando un
concentrador Vivaspin 10 K (Vivascience Sartorius Group). La
concentración de proteína de la reserva purificada se determina por
la absorbancia a 280 nm usando un coeficiente de extinción derivado
experimentalmente. Una reserva purificada de maleimida de mPEG de
20 K de (D11C)hPYY_{3-36} se perfila usando
SEC-HPLC o SDS-PAGE.
El reactivo de maleimida de mPEG lineal de
aproximadamente 12.000 de peso molecular (Sunbright
ME-120MA, NOF Corporation) se acopla selectivamente
a (D11C)hPYY_{3-36} en el grupo sulfhidrilo
de la cisteína en el residuo 10. La maleimida de mPEG de 12 K
lineal, disuelta en acetato de sodio 20 mM (Sigma Chemical, San
Luis, MO), pH 4,5, se hace reaccionar inmediatamente con péptido
(D11C)hPYY_{3-36} mediante adición directa
de péptido proporcionando una concentración de péptido de 1 mg/ml y
una razón molar de mPEG:(D11C)hPYY_{3-36}
relativa de aproximadamente 1:1. Se llevan a cabo reacciones en la
oscuridad a temperatura ambiente durante 0,5 a 24 horas. Las
reacciones en acetato de sodio 20 mM, pH 4,5, se cargan directamente
en cromatografía de intercambio catiónico. Los productos de
reacción se valoran mediante SEC-HPLC o
SDS-PAGE.
La especie de
(D11C)hPYY_{3-36} pegilado se purifica a
partir de la mezcla de reacción a >95% usando una etapa de
cromatografía de intercambio iónico única. El
(D11C)hPYY_{3-36} monopegilado se separa de
PEG libre, (D11C)hPYY_{3-36} no modificado
y especies de peso molecular mayor usando una cromatografía de
intercambio catiónico. Una típica mezcla de reacción de maleimida
de mPEG de 12 K lineal (D11C)hPYY_{3-36}
(10 mg de proteína), como se describe anteriormente, se fracciona
en una columna Hitrap de SP-Sefarosa (5 ml)
(Amersham Pharmacia Biotech, GE Healthcare) equilibrada en acetato
de sodio 20 mM, pH 4,5 (Tampón A). La mezcla de reacción se carga
en la columna a una velocidad de flujo de 1,0 ml/min. La columna se
lava con 4 volúmenes de columna de tampón A a una velocidad de
flujo de 2,5 ml/min. Subsiguientemente, las diversas especies de
(D11C)hPYY_{3-36} se eluyen a partir de la
columna en 25 volúmenes de columna de un gradiente de NaCl lineal de
0-200 mM a una velocidad de flujo de 2,5 ml/min. El
eluyente se somete a seguimiento por la absorbancia a 280 nm
(A_{280}) y se recogen fracciones de tamaño apropiado. Las
fracciones se almacenan hasta el grado de pegilación, según se
valora mediante SEC-HPLC. La reserva purificada se
concentra después a 0,5-5 mg/ml usando un
concentrador Vivaspin 10 K (Vivascience Sartorius Group). La
concentración de proteína de la reserva purificada se determina por
la absorbancia a 280 nm usando un coeficiente de extinción derivado
experimentalmente. Una reserva purificada de maleimida de mPEG de
(D11C)hPYY_{3-36} de 12 K se perfila usando
SEC-HPLC o SDS-PAGE.
El reactivo de maleimida de mPEG ramificado de
aproximadamente 20.000 de peso molecular (Sunbright
GL2-200MA, NOF Corporation) se acopla
selectivamente a (D11C)hPYY_{3-36} en el
grupo sulfhidrilo de la cisteína en el residuo 10. La maleimida de
mPEG de 20 K ramificado, disuelta en acetato de sodio 20 mM (Sigma
Chemical, San Luis, MO), pH 4,5, se hace reaccionar inmediatamente
con péptido (D11C)hPYY_{3-36} mediante
adición directa de péptido proporcionando una concentración de
péptido de 1 mg/ml y una razón molar de
mPEG:(D11C)hPYY_{3-36} relativa de
aproximadamente 1:1. Se llevan a cabo reacciones en la oscuridad a
temperatura ambiente durante 0,5 a 24 horas. Las reacciones en
acetato de sodio 20 mM, pH 4,5, se cargan directamente en
cromatografía de intercambio catiónico. Los productos de reacción
se valoran mediante SEC-HPLC o
SDS-PAGE.
La especie de
(D11C)hPYY_{3-36} pegilado se purifica a
partir de la mezcla de reacción a >95% usando una etapa de
cromatografía de intercambio iónico única. El
(D11C)hPYY_{3-36} monopegilado se separa de
PEG libre, (D11C)hPYY_{3-36} no modificado
y especies de peso molecular mayor usando una cromatografía de
intercambio catiónico. Una típica mezcla de reacción de maleimida
de mPEG de 20 K ramificado
(D11C)hPYY_{3-36} (10 mg de proteína),
como se describe anteriormente, se fracciona en una columna Hitrap
de SP-Sefarosa (5 ml) (Amersham Pharmacia Biotech,
GE Healthcare) equilibrada en acetato de sodio 20 mM, pH 4,5 (Tampón
A). La mezcla de reacción se carga en la columna a una velocidad de
flujo de 1,0 ml/min. La columna se lava con 4 volúmenes de columna
de tampón A a una velocidad de flujo de 2,5 ml/min.
Subsiguientemente, las diversas especies de
(D11C)hPYY_{3-36} se eluyen a partir de la
columna en 25 volúmenes de columna de un gradiente de NaCl lineal de
0-200 mM a una velocidad de flujo de 2,5 ml/min. El
eluyente se somete a seguimiento por la absorbancia a 280 nm
(A_{280}) y se recogen fracciones de tamaño apropiado. Las
fracciones se almacenan hasta el grado de pegilación, según se
valora mediante SEC-HPLC. La reserva purificada se
concentra después a 0,5-5 mg/ml usando un
concentrador Vivaspin 10 K (Vivascience Sartorius Group). La
concentración de proteína de la reserva purificada se determina por
la absorbancia a 280 nm usando un coeficiente de extinción derivado
experimentalmente. Una reserva purificada de maleimida de mPEG de
(D11C)hPYY_{3-36} de 20 K se perfila usando
SEC-HPLC o SDS-PAGE.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
(E10C)hPYY_{3-36},
(D11C)hPYY_{3-36} y formas pegiladas de
(E10C)hPYY_{3-36} y
(D11C)hPYY_{3-36} se caracterizaron
mediante diversos procedimientos bioquímicos incluyendo
Espectrometría de Masas de Electropulverización
(ESI-EM), SDS-PAGE, y SEC HPLC y RP
HPLC, respectivamente.
(A) Se llevó a cabo espectrometría de masas de
ionización por electropulverización (ESI-EM) en un
espectrómetro de masas por electropulverización LC/MSD de serie
1100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) en el modo positivo.
(Ejemplo 1(a), 2(a)).
(B) Se llevó a cabo cromatografía en fase
reversa para análisis de péptido
(E10C)hPYY_{3-36} (figuras 1 y 4) en una
columna de 5 mm, ZORBAX Eclipse XDB-C8, 4,6 x 150 mm
(número de catálogo 993967-906, Agilent
Technologies, Palo Alto, CA) usando un gradiente lineal desde
disolvente A al 100%, disolvente B al 0% hasta disolvente A al 95%,
disolvente B al 5% en tres minutos, después desde disolvente A al
95%, disolvente B al 5% hasta disolvente A al 50%, disolvente B al
50% en 12 minutos a una velocidad de 1,5 ml/minuto (ejemplo
1(a)). El disolvente A es una solución de TFA al 0,1%
acuosa. El disolvente B es solución de TFA al 0,1 en
acetonitrilo.
La cromatografía en fase reversa para la
cuantificación de (E10C)hPYY_{3-36} y
(D11C)hPYY_{3-36} (no mostrada) se llevó a
cabo sobre una columna de Vydac, C18 (2,1 x 2590 mm) (número de
catálogo 218MS552, Vydac, Hesperia, CA) usando un gradiente lineal
desde disolvente A al 80%, disolvente B al 20% a hasta disolvente A
al 40%, disolvente B al 60% en 48 minutos a una velocidad de 0,2
ml/minuto. (ejemplo 1C, 2C). El disolvente A es una solución de TFA
al 0,1%, acuosa. El disolvente B es una solución de TFA al 0,085% en
acetonitrilo.
Las mezclas de reacción de mPEG de 30 K lineal o
de mPEG 43 K ramificado bien con
(E10C)hPYY_{3-36} o bien con
(D11C)hPYY_{3-36}, sus reservas de
purificación de intercambio catiónico, y los productos finales
purificados se valoraron usando SEC-HPLC no
desnaturalizante (Ejemplo 1(b) y (c), 2(b) y (c)). Se
llevó a cabo SEC-HPLC no desnaturalizante analítico
usando un Shodex KW804 o TSK G4000PWXL (Tosohaas) en fosfato 20 mM
pH 7,4, NaCl 150 mM, a una velocidad de flujo de 1,0 ml/minuto
(opcionalmente Superdex 200 7,8 mm X 30 cm, Amersham Bioscience,
Piscataway, NJ). La pegilación incrementa grandemente el volumen
hidrodinámico de la proteína dando como resultado un cambio a un
tiempo de retención más temprano. En las mezclas de reacción de
maleimida de mPEG de 30 K más
(E10C)hPYY_{3-36}, se observó un pico
pequeño que corresponde a (E10C)hPYY_{3-36}
residual no modificado, así como nuevos picos correspondientes a
especies de péptidos pegiladas (figura 2). Se observaron nuevas
especies en las mezclas de reacción mPEG de 30 K
(D11C)hPYY_{3-36} y mPEG de 43 K ramificado
(E10C)hPYY_{3-36} con resto muy pequeño no
modificado de (D11C)hPYY_{3-36} o de
(E10C)hPYY_{3-36} (figura 5 y 8). Estas
especies pegiladas y no pegiladas se fraccionaron mediante
cromatografía en SP-Sefarosa, y las especies
resultantes purificadas mono mPEG
(E10C)hPYY_{3-36} y mPEG
(D11C)hPYY_{3-36} se mostraron
subsiguientemente eluyendo como un pico único en SEC no
desnaturalizante > 95% de pureza, (figuras 6, 7, y 9). La etapa
de cromatografía de SP-Sefarosa retiró de forma
efectiva mPEG libre, (E10C)hPYY_{3-36}
libre o mPEG (D11C)hPYY_{3-36} libre y
especies de peso molecular mayor a partir del mPEG de 30 K lineal
(E10C)hPYY_{3-36} monopegilado y de 43 K
ramificado monopegilado o mPEG
(D11C)hPYY_{3-36}.
Se usó también SDS-PAGE (ejemplo
1 (c)) también para valorar la reacción, fracciones de purificación
de intercambio catiónico (figura 3), y productos finales
purificados. SDS-PAGE se llevó a cabo en geles de
10-NuPAGE de 1 mm de grosor (Invitrogen, Carlsbad,
CA) bajo condiciones reductoras y no reductoras y se tiñó usando un
kit de tinción de Novex Colloidal Coomassie^{TM}
G-250 (Invitrogen, Carlsbad, CA).
\vskip1.000000\baselineskip
La utilidad de los agonistas PYY de la presente
invención como agentes farmacéuticamente activos en la reducción de
ganancia de peso y de tratamiento de obesidad en mamíferos
(particularmente seres humanos), puede demostrarse mediante la
actividad del agonista en ensayos convencionales y en los ensayos
in vitro e in vivo descritos más adelante. Tales
ensayos también proporcionan un medio a través del que las
actividades de los presentes agonistas PYY pueden compararse con
las actividades de los compuestos conocidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo de realimentación de inducida por
ayuno: se albergaron ratones machos C57BL/6J (The Jackson
Laboratory, Bar Harbor, ME) a 2 por jaula. Se mantuvieron en un
ciclo de luz:oscuridad de 12:12 (las luces se encendían a las 5:00
AM, las luces se apagaban a las 5: PM), se alimentaron con pienso
para roedores de Purina RMH3000 en forma de pellas (Research Diets,
Inc., New Brunswick, NJ) y se les permitió el agua a voluntad. Los
ratones llegaron a las 7-8 semanas de edad y se
aclimataron un mínimo de 10 días antes del estudio. En el día del
estudio los ratones eran de 9-12 semanas de edad. El
día antes de empezar el estudio, los ratones se situaron en jaulas
con lechos recientes y sin comida, pero se les permitió acceso libre
a agua. Se dejaron en ayunas durante toda una noche
(20-24 horas). El día del estudio, se administraron
dosis por inyección IP a los ratones (volumen de dosis = 5 ml/kg),
se les devolvió a su jaula, y la comida previamente pesada se situó
inmediatamente en la jaula. El vehículo de administración de dosis
usado fue acetato de Na 20 mM, pH 4,5, NaCl 50 mM y la dosis se
calculó para la entidad de PYY activa sin pegilación. Se pusieron a
prueba el control de vehículo, el PYY nativo, la maleimida de mPEG
de 30 K (D11C)hPYY_{3-36}, y la maleimida
de mPEG de 43 K (D11C)hPYY_{3-36} en tres
dosis (0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, y 1,0 mg/kg). La comida se volvió a
pesar a las 2, 4, 6, y 24 horas tras la administración de dosis. El
lecho se examino en busca de vertidos, que se pesaron e incluyeron
en los cálculos. La toma de comida acumulativa se calculó
sustrayendo el peso de la comida en cada punto temporal a partir
del peso de comida inicial. Se calculó el porcentaje (%) de
inhibición mediante
(Fl_{tratamiento} - Fl_{\text{vehículo}})/Fl_{\text{vehículo}} \cdot 100.
(Fl_{tratamiento} - Fl_{\text{vehículo}})/Fl_{\text{vehículo}} \cdot 100.
La figura 10 muestra la toma acumulativa a las 6
horas tras las tres dosis de la inyección intraperitoneal de
PYY_{3-36} nativa (figura 10A) y de la maleimida
de mPEG de 30 K (E10C)hPYY_{3-36} (figura
10B). Tanto la PYY_{3-36} nativa como la
maleimida de mPEG de 30 K (E10C)hPYY_{3-36}
demostraron una disminución dependiente de dosis en la toma de
comida acumulativa durante el curso de 6 horas.
La maleimida de mPEG de 43 K
(D11C)hPYY_{3-36} también produjo una
disminución dependiente de dosis en toma de comida acumulativa en 6
horas (figura 11A) y en toma de comida acumulativa en 24 horas
(figura 11B). Sin embargo, el efecto de maleimida de mPEG de 43 K
(D11C)hPYY_{3-36} para reducir el efecto de
la toma de comida acumulativa no fue tan grande como aquel
demostrado por la maleimida de mPEG de 30 K
(E10C)hPYY_{3-36} a la misma dosis (0,1
mg/kg) tanto después de 6 horas como después de 24 horas.
Los efectos de maleimida de mPEG de 30 K
(E10C)hPYY_{3-36} en realimentación
inducida por ayuno tras inyección de 0,1 mg/kg (SC) se compararon
también a los efectos de maleimida de
(E10C)hPYY_{3-36} de 30 K. Mientras que el
polipéptido maleimida de mPEG
(D11C)hPYY_{3-36} de 30 K causó toma de
comida acumulativa reducida (FI) durante el curso temporal de 24
horas, como se muestra en la tabla más adelante, el efecto no fue
tan grande como aquel observado para la maleimida de
(E10C)hPYY_{3-36} de 30 K.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los efectos de la maleimida de mPEG de 20 K
lineal (E10C)hPYY_{3-36} se compararon con
maleimida de mPEG de 30 K
(E10C)hPYY_{3-36} (ambas del ejemplo 1). En
un estudio en el que se inyectó una dosis de 0,1 mg/kg (IP) en
ratones mechos, los resultados son como sigue en la tabla a
continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
De forma similar, en un segundo estudio
comparando los efectos en la alimentación de maleimida de mPEG
(E10C)hPYY_{3-36} de 20 K lineal y
maleimida de mPEG (E10C)hPYY_{3-36} de 30 K
lineal, tras una dosis de 0,1 mg/kg (SC), los resultados son como
sigue en la tabla a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo de toma de comida espontánea:
ratones machos C57BL/6J (The Jackson Laboratory) se alojaron
individualmente y se les permitió 2 semanas de aclimatación antes
del estudio. Se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad 12/12, se
alimentaron con pienso en polvo a voluntad, y se les permitió el
acceso libre a agua. En el día antes de la administración de dosis,
los ratones se situaron en cámaras de toma de comida, y se les
permitió 1 día de aclimatación. El día siguiente, se administró
dosis a los ratones con inyección IP o subcutánea (SC) justo antes
de que se apagaran las luces (4:00 PM). La toma de comida se sometió
a seguimiento automáticamente a intervalos de 10 minutos a lo largo
del transcurso del tiempo completo y los pesos corporales se
midieron diariamente. Los resultados se muestran para inyección IP
de PYY_{3-36} nativo y de la maleimida de mPEG de
30 K (E10C)hPYY_{3-36} (figura 12) y para
inyección SC de PYY_{3-36} nativo y la mPEG de 30
K (E10C)hPYY_{3-36} (figura 13). Mientras
que tanto la PYY_{3-36} nativa como la maleimida
de mPEG (E10C)hPYY_{3-36} de 30 K
produjeron una reducción inmediata en toma de comida acumulativa en
comparación con los ratones tratados con vehículo, el efecto de
toma de comida reducida causado por la maleimida de mPEG de 30 K
(E10C)hPYY_{3-36} fue de duración mucho
más larga que el efecto causado por la PYY_{3-36}
nativa. Acoplado a un efecto de toma de comida más duradero, la
maleimida de mPEG de 30 K (E10C)hPYY_{3-36}
también demostró una exposición de plasma prolongada tras la
inyección individual (0,1 mg/kg, IP) (figura 14). Mientras que la
PYY_{3-36} nativa tuvo una velocidad de
eliminación de 16 ml/min/kg y una C_{máx.} de 38 nM, la maleimida
de mPEG de 30 K (E10C)hPYY_{3-36} tuvo una
velocidad de 0,2 ml/min/kg y C_{máx.} de 267 nM. Los valores de
PYY de plasma se midieron en ratones usando un kit de
radioinmunoensayo de hPYY (Linco Research, Inc., San Luis, MO).
Ensayo de mini-bombas con
ratones ob/ob: se mantuvieron ratones ob/ob machos (The Jackson
Laboratory), de 8-9 semanas de edad (n = 26), en
pienso normal y se implantaron con mini-bombas
osmóticas 14 días (Alza Corp., Mountain View, CA) que administraron
bien vehículo (solución salina), bien PYY_{3-36}
(0,1 mg/kg/día), o bien maleimida de mPEG de 30 K
(E10C)hPYY_{3-36} (0,03 mg/kg/día). Los
pesos de la comida y los pesos corporales se midieron diariamente.
La composición grasa del cuerpo se determinó en el día 0 y el día
13. Las muestras de sangre se tomaron al final del estudio. No hubo
ninguna diferencia significativa en toma de comida, peso corporal,
o composición de grasa corporal de estos grupos. El PYY de plasma se
determinó a la terminación del estudio mediante radioinmunoensayo
como se describió previamente. En el grupo tratado con
PYY_{3-36} nativo, los niveles de PYY de plasma
se midieron a 15 \pm 2 ng/ml; en el grupo tratado con maleimida de
mPEG de 30 K (E10C)hPYY_{3-36}, los
niveles de PYY de plasma fueron 132 \pm 22 ng/ml.
El SPA para unión a ligando mide el
desplazamiento competitivo de PYY marcado radiactivamente a partir
de receptores de Y2 y utiliza microesferas que contienen
centelleante (perlas de SPA) recubiertas con aglutinina de germen
de trigo (WGA) de lectina obtenida de Amersham Biosciences (número
de catálogo RPNQ 0085). Se prepararon suspensiones de células de
neuroblastoma humano KAN-TS que expresan receptores
Y2 en su superficie (Fuhlendorf y col., Proc. Natl. Acad. Sci.
EE.UU., 87: 182-186, 1990) usando un tampón de
recogida de células compuesto de tampón de Hepes 50 mM (pH 7,4),
NaCl 145 mM, CaCl_{2} 2,5 mM, MgCl_{2} 1 mM, glucosa 10 mM, BSA
al 0,1%, DMSO al 5% e inhibidores de proteasa de Roche. Los ensayos
de SPA se llevaron a cabo en formato de 96 pocillos en usar por
triplicado 50.000 células/pocillo, ^{125}I-PYY
(40.000 cpm/pocillo) y perlas de SPA (0,5 mg/pocillo) en tampón de
ensayo compuesto de tampón de Hepes 50 mM, pH 7,4, MgCl_{2} 1 mM,
CaCl_{2} 2,5 mM, BSA al 0,1% (p/v), bacitracina al 0,025% (p/v) y
azida de sodio al 0,025%. Se añadieron los ligandos de prueba a
diversas concentraciones (0,032 a 50 nM) a la mezcla de ensayo que
se incubó después durante 16-24 h a temperatura
ambiente, agitando mientras. Las placas se dejaron en reposo durante
una hora y después se contaron usando un detector de Trilux
MicroBeta® (Perkin Elmer, Boston, MA). Los resultados para
hPYY_{3-36} y la maleimida de mPEG de 30 K
(E10C)hPYY_{3-36} del ejemplo 1 se muestran
en la figura 15.
El ensayo funcional es un ensayo de unión de
GTP\gamma[^{35}S] que funciona en placas de centelleo de
NEN (formato de 96 pocillos). Las membranas se prepararon a partir
de células KAN-TS como se describe en Bass y col.,
Mol. Pharm. 50: 709-715, 1990. Los ensayos de unión
de GTP\gamma[^{35}S] se llevaron a cabo en un formato
FlashPlate^{TM} de 96 pocillos por duplicado usando
GTP\gamma[^{35}S] 100 pM y 10 \mug de membrana por
pocillo en tampón de ensayo compuesto de Tris HCl 50 mM, pH 7,4,
MgCl_{2} 3 mM, pH 7,4, MgCl_{2} 10 mM, EGTA 20 mM, NaCl 100 mM,
GDP 5 \muM, seroalbúmina bovina al 0,1% y los siguientes
inhibidores de proteasa: bacitracina 100 \mug/ml, benzamidina 100
\mug/ml, aprotinina 5 \mug/ml, leupeptina 5 \mug/ml. La
mezcla de ensayo se incubó después con concentraciones crecientes de
compuesto de prueba (curva de concentración de 6 puntos; diluciones
logarítmicas en el intervalo de 10^{-12} M a 10^{-15} M) durante
60 minutos a 30ºC. Las FlashPlates^{TM} se centrifugaron después
a 2000 X g durante 10 minutos. La estimulación de unión de
GTP\gamma[^{35}S] se cuantificó después usando un
detector Microbeta^{TM}. Los cálculos de CE_{50} y de actividad
intrínseca se calcularon usando Prisma mediante Graphpad. Los
resultados para hPYY_{3-36} y la maleimida de
mPEG de 30 K (E10C)hPYY_{3-36} del ejemplo
1 se muestran en la figura 16. Los valores de CE_{50} para la
maleimida de mPEG de 30 K (E10C)hPYY_{3-36}
y para la maleimida de mPEG de 20 K
(E10C)hPYY_{3-36} del ejemplo 1 fueron
comparables (por ejemplo, 4,3 nM y 4,6 nM cuando se midieron en el
mismo ensayo).
<110> PFIZER PRODUCTS INC.
\hskip1cmSummers, Neena L.
\hskip1cmFinn, Rory F.
\hskip1cmSiegel, Ned R.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> AGONISTAS DE PPY Y USOS DE LOS
MISMOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PC32768B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> Documento US 60/650.366
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
4-2-2005
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> Documento US 60/733.656
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
4-11-2005
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
Claims (23)
1. El polipéptido
(E10C)hPYY_{3-36},_{ }que tiene la
secuencia de aminoácidos IKPEAPGCDASPEELNRYYASLRHYL
NLVTRQRY-NH_{2} [SEQ ID N.º: 3], o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
NLVTRQRY-NH_{2} [SEQ ID N.º: 3], o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
2. El polipéptido
(D11C)hPYY_{3-36} que tiene la secuencia de
aminoácidos IKPEAPGECASPEELNRYYASLRHYL
NLVTRQRY-NH_{2} [SEQ ID N.º: 4], o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
NLVTRQRY-NH_{2} [SEQ ID N.º: 4], o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
3. Un conjugado que comprende un
polietilenoglicol (PEG) y el polipéptido
(E10C)hPYY_{3-36} o
(D11C)hPYY_{3-36}.
4. El conjugado de la reivindicación 3 que tiene
la fórmula 3
\vskip1.000000\baselineskip
en la que el PEG es metoxi PEG y es
lineal o ramificado y tiene un peso molecular promedio en el
intervalo de aproximadamente 1 kD a 50
kD,
L es un grupo de la fórmula
-O(CH_{2})_{p}NHC(O)(CH_{2})_{r}-
en la que cada uno de p y r es
independientemente un número entero de 1 a
6,
o L es un grupo de la fórmula
-NHC(O)(CH_{2})_{s}-
en la que s es un número entero de
1 a 6,
y
-SR es el polipéptido
(E10C)hPYY_{3-36} o
(D11C)hPYY_{3-36} en el que el S es el
átomo de azufre del grupo tiol de cisteína.
5. El conjugado de la reivindicación 4 en el que
el m PEG es lineal.
6. El conjugado de la reivindicación 5 que tiene
la fórmula 4
en la que n es un número entero en
el intervalo de aproximadamente 600 a 750 y -SR es el polipéptido
(E10C)hPYY_{3-36} en el que el S es el
átomo de azufre del grupo tiol de la
cisteína.
7. El conjugado de la reivindicación 5 que tiene
la fórmula 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que n es un número entero en
el intervalo de aproximadamente 375 a 525 y -SR es el polipéptido
(E10C)hPYY_{3-36} en el que el S es el
átomo de azufre del grupo tiol de la
cisteína.
8. El conjugado de la reivindicación 7 en el que
el resto (OCH_{2}CH_{2})_{n} tiene un peso molecular
promedio de peso de aproximadamente 20 kD.
9. El conjugado de la reivindicación 5 que tiene
la fórmula 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en el que n es un número entero en
el intervalo de aproximadamente 600 a 750 y -SR es el polipéptido
(D11C)hPYY_{3-36} en el que el S es el
átomo de azufre del grupo tiol de
cisteína.
10. El conjugado de la reivindicación 6 o de la
reivindicación 9 en el que el resto (OCH_{2}CH_{2})_{n}
tiene un peso molecular promedio de peso de aproximadamente 30
kD.
11. El conjugado de la reivindicación 4 en el
que el mPEG está ramificado.
12. El conjugado de la reivindicación 11 en el
que el mPEG es un glicerol-ramificado.
\newpage
13. El conjugado de la reivindicación 12 que
tiene la fórmula 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en el que cada m es aproximadamente
el mismo y es un número entero en el intervalo de aproximadamente
450 a 500 y -SR es el polipéptido
(E10C)hPYY_{3-36} en el que el S es el
átomo de azufre del grupo tiol de la
cisteína.
14. El conjugado de la reivindicación 12 que
tiene la fórmula 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en el que cada m es igual y es un
número entero en el intervalo de 450 a 500 y -SR es el polipéptido
(D11C)hPYY_{3-36} en el que el S es el
átomo de azufre del grupo tiol de
cisteína.
15. El conjugado de la reivindicación 13 o de la
reivindicación 14 en el que cada resto
(OCH_{2}CH_{2})_{n} tiene un peso molecular promedio
de peso en el intervalo de aproximadamente 20 kD a 22 kD.
\newpage
16. Un conjugado
glicerol-maleimida de mPEG de 43k ramificado
(E10C)hPYY_{3-36} que tiene la fórmula
5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que cada m es aproximadamente
el mismo y -SR es el polipéptido
(E10C)hPYY_{3-36} en el que el S es el
átomo de azufre del grupo tiol de cisteína, o una sal
farmacéuticamente aceptable del
mismo.
17. Un conjugado
glicerol-maleimida de mPEG de 43k ramificado
(D11C)hPYY_{3-36} que tiene la fórmula
5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que cada m es aproximadamente
el mismo y -SR es el polipéptido
(D11C)hPYY_{3-36} en el que el S es el
átomo de azufre del grupo tiol de cisteína, o una sal
farmacéuticamente aceptable del
mismo.
18. Una composición farmacéutica que comprende
el polipéptido de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2 o el
conjugado de cualesquiera de las reivindicaciones
3-17 o una sal farmacéuticamente aceptable de los
mismos y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
19. La composición farmacéutica de la
reivindicación 18, que comprende adicionalmente un segundo agente
que es un agente antiobesidad.
\newpage
20. El uso del polipéptido de la reivindicación
1 o de la reivindicación 2 o el conjugado de una cualquiera de las
reivindicaciones 3-17 o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo en la elaboración de un medicamento para tratar
obesidad o un estado de sobrepeso en mamíferos, o para inhibición de
la ganancia de peso, reduciendo la toma de comida o reduciendo la
toma calórica en un mamífero.
21. Un polinucleótido que codifica el
polipéptido de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2.
22. Un anticuerpo monoclonal que se une
específicamente a un polipéptido que contiene la secuencia de
aminoácidos como se muestra en SEQ ID N.º: 3 o SEQ ID N.º: 4.
23. El anticuerpo monoclonal de la
reivindicación 22, en el que dicho polipéptido está pegilado en el
residuo de cisteína.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US65036605P | 2005-02-04 | 2005-02-04 | |
| US650366P | 2005-02-04 | ||
| US73365605P | 2005-11-04 | 2005-11-04 | |
| US733656P | 2005-11-04 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2322293T3 true ES2322293T3 (es) | 2009-06-18 |
Family
ID=36175074
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES06710361T Active ES2322293T3 (es) | 2005-02-04 | 2006-01-30 | Agonistas de pyy y usos de los mismos. |
Country Status (33)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US20060178501A1 (es) |
| EP (2) | EP2078729A1 (es) |
| JP (1) | JP4314304B2 (es) |
| KR (1) | KR100892545B1 (es) |
| AP (1) | AP2007004069A0 (es) |
| AR (1) | AR052108A1 (es) |
| AT (1) | ATE426614T1 (es) |
| AU (1) | AU2006211039A1 (es) |
| BR (1) | BRPI0606142A2 (es) |
| CA (1) | CA2596977C (es) |
| CY (1) | CY1109054T1 (es) |
| DE (1) | DE602006005902D1 (es) |
| DK (1) | DK1846445T3 (es) |
| DO (1) | DOP2006000025A (es) |
| EA (1) | EA011882B1 (es) |
| ES (1) | ES2322293T3 (es) |
| GT (1) | GT200600038A (es) |
| HR (1) | HRP20090245T1 (es) |
| IL (1) | IL184324A0 (es) |
| MA (1) | MA29243B1 (es) |
| MX (1) | MX2007009389A (es) |
| NL (2) | NL1031067C2 (es) |
| NO (1) | NO20074498L (es) |
| PA (1) | PA8660701A1 (es) |
| PE (1) | PE20061412A1 (es) |
| PL (1) | PL1846445T3 (es) |
| PT (1) | PT1846445E (es) |
| RS (1) | RS50966B (es) |
| SI (1) | SI1846445T1 (es) |
| TN (1) | TNSN07305A1 (es) |
| TW (1) | TWI310038B (es) |
| UY (1) | UY29357A1 (es) |
| WO (1) | WO2006082517A1 (es) |
Families Citing this family (82)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100989647B1 (ko) | 2001-09-24 | 2010-10-26 | 오레곤 헬스 앤드 사이언스 유니버시티 | 식습관의 변화 |
| US7214660B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-05-08 | Neose Technologies, Inc. | Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin |
| US7173003B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-02-06 | Neose Technologies, Inc. | Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF |
| WO2004099231A2 (en) | 2003-04-09 | 2004-11-18 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods |
| WO2005012484A2 (en) | 2003-07-25 | 2005-02-10 | Neose Technologies, Inc. | Antibody-toxin conjugates |
| US8633157B2 (en) | 2003-11-24 | 2014-01-21 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated erythropoietin |
| US20080305992A1 (en) | 2003-11-24 | 2008-12-11 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated erythropoietin |
| CN101072789B (zh) | 2004-01-08 | 2013-05-15 | 生物种属学股份公司 | 肽的o-连接的糖基化 |
| MXPA06010764A (es) * | 2004-03-23 | 2006-12-15 | Amgen Inc | Metodos y composiciones de proteinas quimicamente modificadas. |
| WO2006010143A2 (en) | 2004-07-13 | 2006-01-26 | Neose Technologies, Inc. | Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1] |
| US20080176790A1 (en) | 2004-10-29 | 2008-07-24 | Defrees Shawn | Remodeling and Glycopegylation of Fibroblast Growth Factor (Fgf) |
| MX2007008229A (es) | 2005-01-10 | 2007-09-11 | Neose Technologies Inc | Factor estimulador de colonias de granulocitos glicopegilado. |
| US9187546B2 (en) | 2005-04-08 | 2015-11-17 | Novo Nordisk A/S | Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants |
| WO2006135930A2 (en) * | 2005-06-13 | 2006-12-21 | Nastech Pharmaceutical Company Inc. | Transmucosal delivery of peptide derivatives |
| US20070105755A1 (en) | 2005-10-26 | 2007-05-10 | Neose Technologies, Inc. | One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides |
| EP2380435B1 (en) * | 2005-08-31 | 2016-05-25 | Kaneka Corporation | Feline-derived erythropoietin and method for production thereof |
| WO2007056191A2 (en) | 2005-11-03 | 2007-05-18 | Neose Technologies, Inc. | Nucleotide sugar purification using membranes |
| WO2007085887A1 (en) * | 2006-01-27 | 2007-08-02 | Pfizer Products Inc. | Pyy agonists and uses thereof |
| EP2049144B8 (en) | 2006-07-21 | 2015-02-18 | ratiopharm GmbH | Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences |
| JP2008069073A (ja) * | 2006-09-12 | 2008-03-27 | Yokohama Tlo Co Ltd | ラクトフェリン複合体及びその製造方法 |
| EP2054521A4 (en) | 2006-10-03 | 2012-12-19 | Novo Nordisk As | METHODS OF PURIFYING CONJUGATES OF POLYPEPTIDES |
| SI2068907T1 (en) | 2006-10-04 | 2018-01-31 | Novo Nordisk A/S | Pegylated sugars and glycopeptides are associated with glycerol |
| TWI428346B (zh) | 2006-12-13 | 2014-03-01 | Imp Innovations Ltd | 新穎化合物及其等對進食行為影響 |
| JP2010523582A (ja) | 2007-04-03 | 2010-07-15 | バイオジェネリクス アクチェンゲゼルシャフト | グリコｐｅｇ化ｇ−ｃｓｆを用いた治療方法 |
| MX2009013259A (es) | 2007-06-12 | 2010-01-25 | Novo Nordisk As | Proceso mejorado para la produccion de azucares de nucleotidos. |
| CN103497247A (zh) | 2008-02-27 | 2014-01-08 | 诺沃—诺迪斯克有限公司 | 缀合的因子viii分子 |
| WO2010016936A1 (en) * | 2008-08-07 | 2010-02-11 | Ipsen Pharma S.A.S. | Pharmaceutical compositions of analogues of glucose-dependent insulinotropic polypeptide |
| CA2742710A1 (en) * | 2008-11-04 | 2010-05-14 | Janssen Pharmaceutica Nv | Crhr2 peptide agonists and uses thereof |
| WO2010067233A1 (en) | 2008-12-08 | 2010-06-17 | Pfizer Inc. | 1,2,4 triazolo [4, 3 -a] [1,5] benzodiazepin-5 (6h) -ones as agonists of the cholecystokinin-1 receptor (cck-ir) |
| EP2389374A1 (en) | 2009-01-20 | 2011-11-30 | Pfizer Inc. | Substituted pyrazinone amides |
| WO2010086820A1 (en) | 2009-02-02 | 2010-08-05 | Pfizer Inc. | 4-amino-5-oxo-7, 8-dihydropyrimido [5,4-f] [1,4] oxazepin-6 (5h) -yl) phenyl derivatives, pharmaceutical compositions and uses thereof |
| WO2010089685A1 (en) | 2009-02-03 | 2010-08-12 | Pfizer Inc. | 4-amino-7,8-dihydropyrido[4,3-d]pyrimidin-5(6h)-one derivatives |
| JP2012516885A (ja) | 2009-02-04 | 2012-07-26 | ファイザー・インク | ４−アミノ−７，８−ジヒドロピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−５（６Ｈ）−オン誘導体 |
| EP2406230A1 (en) | 2009-03-11 | 2012-01-18 | Pfizer Inc. | Substituted indazole amides and their use as glucokinase activators |
| CN102388038B (zh) | 2009-03-11 | 2014-04-23 | 辉瑞大药厂 | 用作葡糖激酶活化剂的苯并呋喃基衍生物 |
| US20120095028A1 (en) | 2009-03-20 | 2012-04-19 | Pfizer Inc. | 3-oxa-7-azabicyclo[3.3.1]nonanes |
| MA33334B1 (fr) | 2009-06-05 | 2012-06-01 | Pfizer | Derives de l-(piperidine-4-yl)-pyrazole servant de modulateurs de gpr 119 |
| CA2772188A1 (en) | 2009-09-23 | 2011-03-31 | Pfizer Inc. | Gpr 119 modulators |
| DK2496583T3 (en) | 2009-11-02 | 2015-02-02 | Pfizer | Dioxa-bicyclo [3.2.1] octane-2,3,4-triol DERIVATIVES |
| US20120225900A1 (en) | 2009-11-10 | 2012-09-06 | Pfizer Inc. | N2-pyrazolospiroketone acetyl-coa carboxylase inhibitors |
| DK2499139T3 (da) | 2009-11-10 | 2014-01-27 | Pfizer | N1-pyrazolospiroketon-acetyl-coa-carboxylasehæmmere |
| WO2011061679A1 (en) | 2009-11-23 | 2011-05-26 | Pfizer Inc. | Imidazo-pyrazoles as gpr119 inhibitors |
| PT2547679E (pt) | 2010-03-19 | 2016-01-27 | Pfizer | Derivados de 2,3-di-hidro-1h-indeno-1-il-2,7-diazaspiro[3.6]nonano e sua utilização como antagonistas ou agonistas inversos do receptor de grelina |
| WO2011158149A1 (en) | 2010-06-18 | 2011-12-22 | Pfizer Inc. | 2-(3,5-disubstitutedphenyl)pyrimidin-4(3h)-one derivatives |
| RS55224B1 (sr) | 2010-09-30 | 2017-02-28 | Pfizer | N1-pirazolospiroketon acetil-coa karboksilaza inhibitori |
| EP2952514A1 (en) | 2010-10-29 | 2015-12-09 | Pfizer Inc | N1/n2-lactam acetyl-coa carboxylase inhibitors |
| KR101506829B1 (ko) | 2010-12-23 | 2015-03-30 | 화이자 인코포레이티드 | 글루카곤 수용체 조절제 |
| AU2012215114B2 (en) | 2011-02-08 | 2016-05-12 | Pfizer Inc. | Glucagon receptor modulator |
| CA2831380C (en) | 2011-04-22 | 2016-04-05 | Pfizer Inc. | Pyrazolospiroketone derivatives for use as acetyl-coa carboxylase inhibitors |
| JP2014520879A (ja) | 2011-07-15 | 2014-08-25 | ファイザー・インク | Ｇｐｒ１１９調節因子 |
| CA2841237C (en) | 2011-07-22 | 2016-05-10 | Pfizer Inc. | Quinolinyl glucagon receptor modulators |
| WO2013030713A1 (en) | 2011-08-31 | 2013-03-07 | Pfizer Inc. | Hexahydropyrano [3,4-d][1,3] thiazin-2-amine compounds |
| AU2013222935B2 (en) | 2012-02-24 | 2016-03-10 | Alteogen Inc. | Modified antibody in which motif comprising cysteine residue is bound, modified antibody-drug conjugate comprising the modified antibody, and production method for same |
| MX2014011373A (es) | 2012-04-06 | 2014-10-14 | Pfizer | Inhibidores de diacilglicerol aciltransferasa 2. |
| US8889730B2 (en) | 2012-04-10 | 2014-11-18 | Pfizer Inc. | Indole and indazole compounds that activate AMPK |
| JP6110937B2 (ja) | 2012-05-04 | 2017-04-05 | ファイザー・インク | ＡＰＰ、ＢＡＣＥ１、およびＢＡＣＥ２の阻害剤としての複素環式置換ヘキサヒドロピラノ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−アミン化合物 |
| US9260455B2 (en) | 2012-09-20 | 2016-02-16 | Pfizer Inc. | Alkyl-substituted hexahydropyrano[3,4-d][1,3]thiazin-2-amine compounds |
| JP2016502978A (ja) | 2012-12-11 | 2016-02-01 | ファイザー・インク | ＢＡＣＥ１の阻害剤としてのヘキサヒドロピラノ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−アミン化合物 |
| JP6162820B2 (ja) | 2012-12-19 | 2017-07-12 | ファイザー・インク | 炭素環式および複素環式置換ヘキサヒドロピラノ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−アミン化合物 |
| CA2897678A1 (en) | 2013-02-13 | 2014-08-21 | Pfizer Inc. | Heteroaryl-substituted hexahydropyrano[3,4-d][1,3]thiazin-2-amine compounds |
| US9233981B1 (en) | 2013-02-15 | 2016-01-12 | Pfizer Inc. | Substituted phenyl hexahydropyrano[3,4-d][1,3]thiazin-2-amine compounds |
| EA201591839A1 (ru) | 2013-05-02 | 2016-05-31 | Глаксосмитклайн Интеллекчуал Проперти Дивелопмент Лимитед | Терапевтические пептиды |
| ES2665153T3 (es) | 2013-10-09 | 2018-04-24 | Pfizer Inc. | Antagonistas del receptor EP3 de prostaglandina |
| CA2928927A1 (en) * | 2013-12-20 | 2015-06-25 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Use of peptidylglycine alpha-amidating monooxigenase (pam) for c-terminal amidation |
| SI3119757T1 (en) | 2014-03-17 | 2018-08-31 | Pfizer Inc. | DIACILGLICEROL-ACILTRANSFERAZE 2 BINDERS FOR THE USE IN THE TREATMENT OF PRECIOUS AND RELATED DISEASES |
| CN106459088A (zh) | 2014-04-10 | 2017-02-22 | 辉瑞公司 | 2‑氨基‑6‑甲基‑4，4a，5，6‑四氢吡喃并[3，4‑d][1，3]噻嗪‑8a(8H)‑基‑1，3‑噻唑‑4‑基酰胺 |
| WO2016092413A1 (en) | 2014-12-10 | 2016-06-16 | Pfizer Inc. | Indole and indazole compounds that activate ampk |
| EP3237401B1 (en) | 2014-12-22 | 2019-03-06 | Pfizer Inc | Antagonists of prostaglandin ep3 receptor |
| WO2016124687A1 (en) * | 2015-02-04 | 2016-08-11 | Novo Nordisk A/S | Selective pyy compounds and uses thereof |
| US11472805B2 (en) | 2015-06-17 | 2022-10-18 | Pfizer, Inc. | Tricyclic compounds and their use as phosphodiesterase inhibitors |
| WO2017051294A1 (en) | 2015-09-24 | 2017-03-30 | Pfizer Inc. | N-[2-(3-amino-2,5-dimethyl-1,1-dioxido-5,6-dihydro-2h-1,2,4-thiadiazin-5-yl)-1,3-thiazol-4-yl] amides useful as bace inhibitors |
| EP3353183A1 (en) | 2015-09-24 | 2018-08-01 | Pfizer Inc | N-[2-(2-amino-6,6-disubstituted-4, 4a, 5, 6-tetrahydropyrano [3,4-d][1,3]thiazin-8a (8h)-yl) -1, 3-thiazol-4-yl]amides |
| EP3353182A1 (en) | 2015-09-24 | 2018-08-01 | Pfizer Inc | Tetrahydropyrano[3,4-d][1,3]oxazin derivatives and their use as bace inhibitors |
| RU2696269C1 (ru) | 2015-12-29 | 2019-08-01 | Пфайзер Инк. | Замещенные 3-азабицикло[3.1.0]гексаны в качестве ингибиторов кетогексокиназы |
| AR109179A1 (es) | 2016-08-19 | 2018-11-07 | Pfizer | Inhibidores de diacilglicerol aciltransferasa 2 |
| US20210171598A1 (en) | 2017-12-01 | 2021-06-10 | University Of Copenhagen | Peptide hormone with one or more o-glycans |
| WO2019210154A1 (en) * | 2018-04-26 | 2019-10-31 | Colorado State University Research Foundation | Methods and compositions for tracking vegetation |
| MA53496A (fr) | 2018-08-31 | 2021-12-08 | Pfizer | Combinaisons pour le traitement de la stéatohépatite non alcoolique (nash)/maladie du foie gras non alcoolique (nafld) et de maladies associées |
| US20220387402A1 (en) | 2019-05-20 | 2022-12-08 | Pfizer Inc. | Combinations comprising benzodioxol as glp-1r agonists for use in the treatment of nash/nafld and related diseases |
| US20240342247A1 (en) * | 2021-07-08 | 2024-10-17 | Gila Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for activating a neural receptor |
| WO2023026180A1 (en) | 2021-08-26 | 2023-03-02 | Pfizer Inc. | Amorphous form of (s)-2-(5-((3-ethoxypyridin-2-yl)oxy)pyridin-3-yl)-n-(tetrahydrofuran-3- yl)pyrimidine-5-carboxamide |
| WO2024118524A1 (en) | 2022-11-28 | 2024-06-06 | Cerevel Therapeutics, Llc | Azaindole compounds and their use as phosphodiesterase inhibitors |
Family Cites Families (145)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US176643A (en) * | 1876-04-25 | Improvement in ironing-tables | ||
| US244041A (en) * | 1881-07-12 | Machine for blocking and shaping hats | ||
| US141985A (en) * | 1873-08-19 | Improvement in sewing-machine tables | ||
| US176630A (en) * | 1876-04-25 | Improvement in wagon-locks | ||
| US2919901A (en) * | 1957-01-25 | 1960-01-05 | Thor Power Tool Co | Drill system with suction |
| US5508815A (en) * | 1981-12-14 | 1996-04-16 | Smart Vcr Limited Partnership | Schedule display system for video recorder programming |
| US4908713A (en) * | 1981-12-14 | 1990-03-13 | Levine Michael R | VCR Programmer |
| US4586158A (en) * | 1983-02-22 | 1986-04-29 | International Business Machines Corp. | Screen management system |
| US6319685B1 (en) | 1984-09-27 | 2001-11-20 | Unigene Laboratories, Inc. | Alpha-amidating enzyme compositions and processes for their production and use |
| US4708934A (en) | 1984-09-27 | 1987-11-24 | Unigene Laboratories, Inc. | α-amidation enzyme |
| US6492107B1 (en) | 1986-11-20 | 2002-12-10 | Stuart Kauffman | Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique |
| EP1186660A3 (fr) | 1985-03-30 | 2002-03-20 | KAUFFMAN, Stuart A. | Procédé d'obtension d'ADN, ARN, peptides, polypeptides ou protéines, par une technique de recombination d'ADN |
| US4821097A (en) * | 1987-03-05 | 1989-04-11 | General Instrument Corporation | Apparatus and method for providing digital audio on the sound carrier of a standard television signal |
| US5789234A (en) | 1987-08-14 | 1998-08-04 | Unigene Laboratories, Inc. | Expression systems for amidating enzyme |
| US4930160A (en) * | 1987-09-02 | 1990-05-29 | Vogel Peter S | Automatic censorship of video programs |
| US4984152A (en) * | 1987-10-06 | 1991-01-08 | Bell Communications Research, Inc. | System for controlling computer processing utilizing a multifunctional cursor with decoupling of pointer and image functionalities in space and time |
| US4827250A (en) * | 1987-10-26 | 1989-05-02 | Tektronix, Inc. | Graphics display system having data transform circuit |
| GB8823869D0 (en) | 1988-10-12 | 1988-11-16 | Medical Res Council | Production of antibodies |
| US4991011A (en) * | 1988-12-23 | 1991-02-05 | Scientific-Atlanta, Inc. | Interactive television terminal with programmable background audio or video |
| US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
| WO1990014363A1 (en) | 1989-05-19 | 1990-11-29 | Amgen Inc. | Metalloproteinase inhibitor |
| US5727060A (en) * | 1989-10-30 | 1998-03-10 | Starsight Telecast, Inc. | Television schedule system |
| WO1991010741A1 (en) | 1990-01-12 | 1991-07-25 | Cell Genesys, Inc. | Generation of xenogeneic antibodies |
| CA2089661C (en) | 1990-08-29 | 2007-04-03 | Nils Lonberg | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
| US5293357A (en) * | 1990-09-10 | 1994-03-08 | The Superguide Corporation | Method and apparatus for controlling a television program recording device |
| US5247347A (en) * | 1991-09-27 | 1993-09-21 | Bell Atlantic Network Services, Inc. | Pstn architecture for video-on-demand services |
| JP2654283B2 (ja) * | 1991-09-30 | 1997-09-17 | 株式会社東芝 | アイコン表示方法 |
| US5317391A (en) * | 1991-11-29 | 1994-05-31 | Scientific-Atlanta, Inc. | Method and apparatus for providing message information to subscribers in a cable television system |
| US5291554A (en) * | 1992-05-28 | 1994-03-01 | Tv Answer, Inc. | Shared-price custom video rentals via interactive TV |
| FR2692575B1 (fr) | 1992-06-23 | 1995-06-30 | Sanofi Elf | Nouveaux derives du pyrazole, procede pour leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
| ES2301158T3 (es) | 1992-07-24 | 2008-06-16 | Amgen Fremont Inc. | Produccion de anticuerpos xenogenicos. |
| JPH06139671A (ja) * | 1992-10-27 | 1994-05-20 | Sony Corp | 記録再生システム |
| JP2721751B2 (ja) * | 1992-10-30 | 1998-03-04 | ジューキ株式会社 | 自動封入封緘装置におけるカッタユニット |
| US5592551A (en) * | 1992-12-01 | 1997-01-07 | Scientific-Atlanta, Inc. | Method and apparatus for providing interactive electronic programming guide |
| US5715515A (en) * | 1992-12-02 | 1998-02-03 | Scientific-Atlanta, Inc. | Method and apparatus for downloading on-screen graphics and captions to a television terminal |
| US5410326A (en) * | 1992-12-04 | 1995-04-25 | Goldstein; Steven W. | Programmable remote control device for interacting with a plurality of remotely controlled devices |
| CA2151456C (en) * | 1992-12-09 | 2004-03-02 | John S. Hendricks | Reprogrammable terminal for suggesting programs offered on a television program delivery system |
| US5600364A (en) * | 1992-12-09 | 1997-02-04 | Discovery Communications, Inc. | Network controller for cable television delivery systems |
| US5483277A (en) * | 1992-12-15 | 1996-01-09 | Alcatel Network Systems | Simplified set-top converter for broadband switched network |
| US5598524A (en) * | 1993-03-03 | 1997-01-28 | Apple Computer, Inc. | Method and apparatus for improved manipulation of data between an application program and the files system on a computer-controlled display system |
| EP0692971A4 (en) * | 1993-03-29 | 1997-11-12 | Univ Cincinnati | PEPTIDE YY ANALOGS AND USES THEREOF |
| US5594509A (en) * | 1993-06-22 | 1997-01-14 | Apple Computer, Inc. | Method and apparatus for audio-visual interface for the display of multiple levels of information on a display |
| US5621456A (en) * | 1993-06-22 | 1997-04-15 | Apple Computer, Inc. | Methods and apparatus for audio-visual interface for the display of multiple program categories |
| US5414455A (en) * | 1993-07-07 | 1995-05-09 | Digital Equipment Corporation | Segmented video on demand system |
| US5410344A (en) * | 1993-09-22 | 1995-04-25 | Arrowsmith Technologies, Inc. | Apparatus and method of selecting video programs based on viewers' preferences |
| US5398071A (en) * | 1993-11-02 | 1995-03-14 | Texas Instruments Incorporated | Film-to-video format detection for digital television |
| US5481542A (en) * | 1993-11-10 | 1996-01-02 | Scientific-Atlanta, Inc. | Interactive information services control system |
| US5422674A (en) * | 1993-12-22 | 1995-06-06 | Digital Equipment Corporation | Remote display of an image by transmitting compressed video frames representing background and overlay portions thereof |
| US5516653A (en) * | 1993-12-28 | 1996-05-14 | Synaptic Pharmaceutical Corporation | DNA encoding a human neuropeptide Y/peptide YY/pancreatic polypeptide receptor (Y4) and uses thereof |
| JPH07244781A (ja) * | 1994-03-07 | 1995-09-19 | C S K Sogo Kenkyusho:Kk | ソフトウェアレンタル方法および装置ならびに流通媒体 |
| US5629732A (en) * | 1994-03-29 | 1997-05-13 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Viewer controllable on-demand multimedia service |
| US5512958A (en) * | 1994-04-29 | 1996-04-30 | Matsushita Electric Corporation Of America | System for controlling the effects of noise in television receivers |
| US5521631A (en) * | 1994-05-25 | 1996-05-28 | Spectravision, Inc. | Interactive digital video services system with store and forward capabilities |
| JP3575063B2 (ja) * | 1994-07-04 | 2004-10-06 | ソニー株式会社 | 再生装置、再生方法 |
| US5596106A (en) | 1994-07-15 | 1997-01-21 | Eli Lilly And Company | Cannabinoid receptor antagonists |
| DE69521374T2 (de) * | 1994-08-24 | 2001-10-11 | Hyundai Electronics America, Milpitas | Videoserver und diesen verwendendes System |
| US5682325A (en) * | 1994-09-12 | 1997-10-28 | Bell Atlantic Network Services, Inc. | Level 1 gateway for video tone networks |
| US5619249A (en) * | 1994-09-14 | 1997-04-08 | Time Warner Entertainment Company, L.P. | Telecasting service for providing video programs on demand with an interactive interface for facilitating viewer selection of video programs |
| DE4435477A1 (de) | 1994-10-04 | 1996-04-11 | Bayer Ag | Cycloalkano-indol- und -azaindol-derivate |
| US5614940A (en) * | 1994-10-21 | 1997-03-25 | Intel Corporation | Method and apparatus for providing broadcast information with indexing |
| US5521186A (en) | 1994-10-27 | 1996-05-28 | Janssen Pharmaceutica N.V. | Apolipoprotein-β synthesis inhibitors |
| DE69519995T2 (de) | 1994-10-27 | 2001-08-23 | Janssen Pharmaceutica Nv | Apolipoprotein-b syntheseinhibitoren |
| US5724521A (en) * | 1994-11-03 | 1998-03-03 | Intel Corporation | Method and apparatus for providing electronic advertisements to end users in a consumer best-fit pricing manner |
| US5623613A (en) * | 1994-11-29 | 1997-04-22 | Microsoft Corporation | System for displaying programming information |
| US5912227A (en) * | 1995-01-27 | 1999-06-15 | North Carolina State University | Method of enhancing nutrient uptake |
| US5619247A (en) * | 1995-02-24 | 1997-04-08 | Smart Vcr Limited Partnership | Stored program pay-per-play |
| US5632681A (en) * | 1995-03-07 | 1997-05-27 | International Business Machines Corporation | Universal electronic video game renting/distributing system |
| US5651010A (en) * | 1995-03-16 | 1997-07-22 | Bell Atlantic Network Services, Inc. | Simultaneous overlapping broadcasting of digital programs |
| CA2761116A1 (en) | 1995-04-27 | 1996-10-31 | Amgen Fremont Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
| US5721829A (en) * | 1995-05-05 | 1998-02-24 | Microsoft Corporation | System for automatic pause/resume of content delivered on a channel in response to switching to and from that channel and resuming so that a portion of the content is repeated |
| US6558708B1 (en) * | 1995-05-17 | 2003-05-06 | Cedars-Sinai Medical Center | Methods for manipulating upper gastrointestinal transit, blood flow, and satiety, and for treating visceral hyperalgesia |
| US5740549A (en) * | 1995-06-12 | 1998-04-14 | Pointcast, Inc. | Information and advertising distribution system and method |
| US5751282A (en) * | 1995-06-13 | 1998-05-12 | Microsoft Corporation | System and method for calling video on demand using an electronic programming guide |
| US5724106A (en) * | 1995-07-17 | 1998-03-03 | Gateway 2000, Inc. | Hand held remote control device with trigger button |
| US5745837A (en) * | 1995-08-25 | 1998-04-28 | Terayon Corporation | Apparatus and method for digital data transmission over a CATV system using an ATM transport protocol and SCDMA |
| US5737028A (en) * | 1995-11-01 | 1998-04-07 | International Business Machines Corporation | Previous channel listing with cursor controlled user interface for television video displays |
| US5919901A (en) * | 1996-04-08 | 1999-07-06 | Bayer Corporation | Neuropeptide Y receptor Y5 and nucleic acid sequences |
| US5721897A (en) * | 1996-04-09 | 1998-02-24 | Rubinstein; Seymour I. | Browse by prompted keyword phrases with an improved user interface |
| US5721827A (en) * | 1996-10-02 | 1998-02-24 | James Logan | System for electrically distributing personalized information |
| DK1809017T3 (da) * | 1996-12-10 | 2014-04-22 | United Video Properties Inc | Internettelevisionsprogramguidesystem |
| US6654933B1 (en) * | 1999-09-21 | 2003-11-25 | Kasenna, Inc. | System and method for media stream indexing |
| HUP0001272A3 (en) | 1997-04-16 | 2012-12-28 | Unigene Lab Inc | Direct expression of peptides into culture media |
| IL121230A (en) * | 1997-07-03 | 2004-05-12 | Nds Ltd | Intelligent electronic program guide |
| US6342220B1 (en) | 1997-08-25 | 2002-01-29 | Genentech, Inc. | Agonist antibodies |
| NZ504185A (en) | 1997-09-26 | 2003-02-28 | Athersys Inc | Expression of endogenous genes by non-homologous recombination of a vector construct with cellular DNA |
| US6046167A (en) * | 1998-03-25 | 2000-04-04 | University Of Cincinnati | Peptide YY analogs |
| US6505348B1 (en) * | 1998-07-29 | 2003-01-07 | Starsight Telecast, Inc. | Multiple interactive electronic program guide system and methods |
| US6360053B1 (en) * | 1998-08-07 | 2002-03-19 | Replaytv, Inc. | Method and apparatus for fast forwarding and rewinding in a video recording device |
| KR100652994B1 (ko) | 1998-09-11 | 2006-11-30 | 아방티 파르마 소시에테 아노님 | 아제티딘 유도체, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 약제 |
| US20020026638A1 (en) * | 2000-08-31 | 2002-02-28 | Eldering Charles A. | Internet-based electronic program guide advertisement insertion method and apparatus |
| FR2789079B3 (fr) | 1999-02-01 | 2001-03-02 | Sanofi Synthelabo | Derive d'acide pyrazolecarboxylique, sa preparation, les compositions pharmaceutiques en contenant |
| DE60045030D1 (de) * | 1999-02-10 | 2010-11-11 | Curis Inc | Peptid yy (pyy) zur behandlung von glukose stoffwechselkrankheiten |
| US7086077B2 (en) * | 1999-04-01 | 2006-08-01 | Sedna Patent Services, Llc | Service rate change method and apparatus |
| US6986156B1 (en) * | 1999-06-11 | 2006-01-10 | Scientific Atlanta, Inc | Systems and methods for adaptive scheduling and dynamic bandwidth resource allocation management in a digital broadband delivery system |
| US7150031B1 (en) * | 2000-06-09 | 2006-12-12 | Scientific-Atlanta, Inc. | System and method for reminders of upcoming rentable media offerings |
| US7010801B1 (en) * | 1999-06-11 | 2006-03-07 | Scientific-Atlanta, Inc. | Video on demand system with parameter-controlled bandwidth deallocation |
| US6832386B1 (en) * | 1999-06-11 | 2004-12-14 | Scientific-Atlanta, Inc. | System and method for allowing a user to quickly navigate within a program guide to an established reference point |
| US7228556B2 (en) * | 1999-12-21 | 2007-06-05 | Tivo Inc. | Distributed, interactive television program guide; system and method |
| US20030030679A1 (en) * | 2000-01-06 | 2003-02-13 | Anuj Kumar Jain | User-definable images in bookmarks |
| CA2403240C (en) * | 2000-03-31 | 2013-12-03 | United Video Properties, Inc. | Interactive media system and method for presenting pause-time content |
| AU2001253042A1 (en) * | 2000-03-31 | 2001-10-15 | Liquid Engines, Inc. | System and method for implementing electronic markets |
| US20020007485A1 (en) * | 2000-04-03 | 2002-01-17 | Rodriguez Arturo A. | Television service enhancements |
| GB0008691D0 (en) * | 2000-04-07 | 2000-05-31 | Post Impressions Systems Ltd | Input and output systems for data processing |
| US7934232B1 (en) * | 2000-05-04 | 2011-04-26 | Jerding Dean F | Navigation paradigm for access to television services |
| US8069259B2 (en) * | 2000-06-09 | 2011-11-29 | Rodriguez Arturo A | Managing removal of media titles from a list |
| US7685520B2 (en) * | 2000-06-22 | 2010-03-23 | Intel Corporation | Electronic programming guide with selectable categories |
| US7962370B2 (en) * | 2000-06-29 | 2011-06-14 | Rodriguez Arturo A | Methods in a media service system for transaction processing |
| JP4356226B2 (ja) * | 2000-09-12 | 2009-11-04 | ソニー株式会社 | サーバ装置、配信システム、配信方法、及び端末装置 |
| US8302127B2 (en) * | 2000-09-25 | 2012-10-30 | Thomson Licensing | System and method for personalized TV |
| ES2261483T3 (es) * | 2000-10-11 | 2006-11-16 | United Video Properties, Inc. | Sistemas y metodos de construccion de listas de medios de usuario. |
| US20020049978A1 (en) * | 2000-10-20 | 2002-04-25 | Rodriguez Arturo A. | System and method for access and placement of media content information items on a screen display with a remote control device |
| US6924291B2 (en) | 2001-01-23 | 2005-08-02 | Merck & Co., Inc. | Process for making spiro isobenzofuranone compounds |
| BR0205602A (pt) | 2001-03-22 | 2003-07-08 | Solvay Pharm Bv | EnantiÈmero possuindo a configuração s na posição-4 dos seu anel pirazol de um composto, composição farmacêutica, método para a preparação de composições farmacêuticas, processo para a preparação de compostos, e, métodos de tratamento de distúrbios que envolvem neurotransmissão canabinóide |
| IL158418A0 (en) | 2001-04-19 | 2004-05-12 | Scripps Research Inst | In vivo incorporation of unnatural amino acids |
| UA75660C2 (en) | 2001-06-28 | 2006-05-15 | Pfizer Prod Inc | Triamide-substituted indoles, benzofuranes and benzothiophenes as inhibitors of microsomal triglyceride transfer protein (mtp) and/or apolipoprotein b (apo b) secretion |
| US8006262B2 (en) * | 2001-06-29 | 2011-08-23 | Rodriguez Arturo A | Graphic user interfaces for purchasable and recordable media (PRM) downloads |
| KR100989647B1 (ko) * | 2001-09-24 | 2010-10-26 | 오레곤 헬스 앤드 사이언스 유니버시티 | 식습관의 변화 |
| US7142590B2 (en) * | 2001-10-11 | 2006-11-28 | Utstarcom Inc. | Method and system for oversubscribing a DSL modem |
| US20030074257A1 (en) * | 2001-10-12 | 2003-04-17 | Michael Saveliev | Method and apparatus for advertising adjacent to a beverage dispenser to facilitate advertising income device placement in high traffic venues |
| US7334251B2 (en) * | 2002-02-11 | 2008-02-19 | Scientific-Atlanta, Inc. | Management of television advertising |
| US20050171161A1 (en) | 2002-03-06 | 2005-08-04 | Fong Tung M. | Method of treatment or prevention of obesity |
| EP1490043A4 (en) | 2002-03-26 | 2007-05-30 | Merck & Co Inc | SPIROCYCLIC AMIDS AS CANNABINOID RECEPTOR MODULATORS |
| BR0313041A (pt) | 2002-07-29 | 2005-06-21 | Hoffmann La Roche | Compostos; composições farmacêuticas; método para o tratamento e/ou profilaxia de doenças que estão associadas à modulação dos receptores de cb1; e uso de compostos |
| US7091216B2 (en) | 2002-08-02 | 2006-08-15 | Merck & Co., Inc. | Substituted furo[2,3-b]pyridine derivatives |
| US7129239B2 (en) | 2002-10-28 | 2006-10-31 | Pfizer Inc. | Purine compounds and uses thereof |
| MY134457A (en) | 2002-11-22 | 2007-12-31 | Merck & Co Inc | Substituted amides |
| JP2006516262A (ja) | 2002-12-17 | 2006-06-29 | ナステック・ファーマシューティカル・カンパニー・インコーポレーテッド | Ｙ２受容体結合ペプチドの粘膜送達促進のための組成物および方法ならびに肥満症の治療法および予防法 |
| US7186692B2 (en) | 2002-12-17 | 2007-03-06 | Nastech Pharmaceutical Company Inc. | Compositions and methods for enhanced mucosal delivery and non-infused administration of Y2 receptor-binding peptides and methods for treating and preventing obesity |
| KR20050089008A (ko) * | 2002-12-18 | 2005-09-07 | 인터내셔널 비지네스 머신즈 코포레이션 | 웹 서비스 제공 시스템, 그것을 위한 서버 장치, 컴퓨터시스템을 웹 서비스 제공 시스템을 위한 서버 장치로서제어하기 위한 제어 방법, 상기 제어 방법을 실행하기 위한프로그램, 및 기록 매체 |
| US7329658B2 (en) | 2003-02-06 | 2008-02-12 | Pfizer Inc | Cannabinoid receptor ligands and uses thereof |
| WO2004089279A2 (en) * | 2003-04-08 | 2004-10-21 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Long-acting derivatives of pyy agonists |
| US7141669B2 (en) | 2003-04-23 | 2006-11-28 | Pfizer Inc. | Cannabiniod receptor ligands and uses thereof |
| US7145012B2 (en) | 2003-04-23 | 2006-12-05 | Pfizer Inc. | Cannabinoid receptor ligands and uses thereof |
| BRPI0411165A (pt) | 2003-05-14 | 2006-07-11 | Emisphere Tech Inc | composição farmacêutica, forma de unidade de dosagem e métodos para preparar seu uso |
| EP1631308B1 (en) | 2003-05-30 | 2013-07-31 | Amylin Pharmaceuticals, LLC | Novel methods and compositions for enhanced transmucosal delivery of peptides and proteins |
| US7274740B2 (en) * | 2003-06-25 | 2007-09-25 | Sharp Laboratories Of America, Inc. | Wireless video transmission system |
| US20050091693A1 (en) * | 2003-10-22 | 2005-04-28 | Rochelle Communications, Inc. | Dual mode set-top box that optimizes the delivery and user selection of audio or video programming over data networks |
| US7151097B2 (en) | 2003-11-07 | 2006-12-19 | Pfizer Inc. | Bicyclic pyrazolyl and imidazolyl compounds and uses thereof |
| GEP20084360B (en) | 2004-02-04 | 2008-04-29 | Pfizer Prod Inc | Substituted quinoline compounds |
| EP1789440A4 (en) * | 2004-02-11 | 2008-03-12 | Amylin Pharmaceuticals Inc | REASONS FOR THE FAMILY OF PANCREATIC POLYPEPTIDES AND POLYPEPTIDES CONTAINING THEM |
| EP1718671A2 (en) * | 2004-02-23 | 2006-11-08 | Rheoscience A/S | Peptide yy analogues |
| US7954129B2 (en) * | 2004-09-24 | 2011-05-31 | Smartvue Corporation | Wireless video surveillance system and method with remote viewing |
| US20060088105A1 (en) * | 2004-10-27 | 2006-04-27 | Bo Shen | Method and system for generating multiple transcoded outputs based on a single input |
| US7620065B2 (en) * | 2005-07-22 | 2009-11-17 | Trellia Networks, Inc. | Mobile connectivity solution |
| US8189472B2 (en) * | 2005-09-07 | 2012-05-29 | Mcdonald James F | Optimizing bandwidth utilization to a subscriber premises |
-
2006
- 2006-01-24 PA PA20068660701A patent/PA8660701A1/es unknown
- 2006-01-27 TW TW095103474A patent/TWI310038B/zh not_active IP Right Cessation
- 2006-01-30 KR KR1020077017974A patent/KR100892545B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2006-01-30 DE DE602006005902T patent/DE602006005902D1/de active Active
- 2006-01-30 EP EP09155624A patent/EP2078729A1/en not_active Withdrawn
- 2006-01-30 EP EP06710361A patent/EP1846445B1/en active Active
- 2006-01-30 SI SI200630252T patent/SI1846445T1/sl unknown
- 2006-01-30 AT AT06710361T patent/ATE426614T1/de not_active IP Right Cessation
- 2006-01-30 ES ES06710361T patent/ES2322293T3/es active Active
- 2006-01-30 EA EA200701439A patent/EA011882B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2006-01-30 WO PCT/IB2006/000270 patent/WO2006082517A1/en active Application Filing
- 2006-01-30 RS RSP-2009/0210A patent/RS50966B/sr unknown
- 2006-01-30 AP AP2007004069A patent/AP2007004069A0/xx unknown
- 2006-01-30 PT PT06710361T patent/PT1846445E/pt unknown
- 2006-01-30 DK DK06710361T patent/DK1846445T3/da active
- 2006-01-30 MX MX2007009389A patent/MX2007009389A/es active IP Right Grant
- 2006-01-30 BR BRPI0606142-7A patent/BRPI0606142A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2006-01-30 AU AU2006211039A patent/AU2006211039A1/en not_active Abandoned
- 2006-01-30 JP JP2007553737A patent/JP4314304B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2006-01-30 CA CA2596977A patent/CA2596977C/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-01-30 PL PL06710361T patent/PL1846445T3/pl unknown
- 2006-02-01 PE PE2006000128A patent/PE20061412A1/es not_active Application Discontinuation
- 2006-02-01 DO DO2006000025A patent/DOP2006000025A/es unknown
- 2006-02-02 UY UY29357A patent/UY29357A1/es not_active Application Discontinuation
- 2006-02-02 GT GT200600038A patent/GT200600038A/es unknown
- 2006-02-02 AR ARP060100377A patent/AR052108A1/es unknown
- 2006-02-03 US US11/347,730 patent/US20060178501A1/en not_active Abandoned
- 2006-02-03 NL NL1031067A patent/NL1031067C2/nl not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-03-01 NL NL1033469A patent/NL1033469C2/nl not_active IP Right Cessation
- 2007-07-01 IL IL184324A patent/IL184324A0/en unknown
- 2007-08-03 MA MA30123A patent/MA29243B1/fr unknown
- 2007-08-03 TN TNP2007000305A patent/TNSN07305A1/fr unknown
- 2007-09-04 NO NO20074498A patent/NO20074498L/no not_active Application Discontinuation
-
2009
- 2009-02-26 US US12/393,259 patent/US20090171071A1/en not_active Abandoned
- 2009-02-26 US US12/393,420 patent/US20090170778A1/en not_active Abandoned
- 2009-04-24 HR HR20090245T patent/HRP20090245T1/xx unknown
- 2009-05-12 CY CY20091100507T patent/CY1109054T1/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2322293T3 (es) | Agonistas de pyy y usos de los mismos. | |
| JP6345216B2 (ja) | オキシントモジュリンと免疫グロブリン断片とを含む結合体及びその用途 | |
| KR102005456B1 (ko) | 신규 글루카곤 유도체 및 이의 지속형 결합체를 포함하는 조성물 | |
| AU2015240806B2 (en) | Conjugates of an IL-15 moiety and a polymer | |
| AU2020202673A1 (en) | Conjugates of an IL-2 moiety and a polymer | |
| EP2970408B1 (en) | Potent and selective inhibitors of nav1.7 | |
| CN103930437A (zh) | Nav1.3和Nav1.7的强效及选择性抑制剂 | |
| JP2005508639A (ja) | Ｇｌｐ−１受容体アゴニストおよびグルカゴン受容体アンタゴニストの双方として作用するペプチドおよびそれらの薬剤学的使用方法 | |
| JP2006506969A (ja) | 下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド（ｐａｃａｐ）受容体（ｖｐａｃ２）アゴニストおよびそれらの薬理学的使用方法 | |
| JP2023024674A (ja) | インスリン受容体との結合力が減少されたインスリンアナログの結合体及びその用途 | |
| WO2015000585A1 (en) | Muteins of cytokines of the gamma-chain receptor family conjugated to a non-protein group | |
| NL1032266C2 (nl) | PYY-agonisten en toepassingen daarvan. | |
| CN101232903A (zh) | 具有延长的血液半衰期的毒素肽 | |
| CN101115770A (zh) | Pyy激动剂及其用途 | |
| AU2023269801A1 (en) | Compositions comprising truncated interleukin-33 and interleukin-2 |