KR20070009554A - 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 활성화 펩티드(ｐａｃａｐ) 수용체 (ｖｐａｃ２) 작용제 및 이의약리학적 사용 방법 - Google Patents

뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 활성화 펩티드(ｐａｃａｐ) 수용체 (ｖｐａｃ２) 작용제 및 이의약리학적 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 VPAC2 수용체의 작용제로서 생체내 기능을 하는 신규한 펩티드를 제공한다. 이들 인슐린 분비촉진제 폴리펩티드는 글루코스 챌린지시 생체내 혈당을 저하시키는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한, 제형에서 안정적이고 반감기가 길다. 본 발명의 펩티드는 내인성 인슐린 분비 감소를 나타내는 환자, 예를 들어 유형 2 당뇨병 환자에 대한 요법을 제공한다. 본 발명은 또한, 치료적 유효량의 펩티드를 특정 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 이러한 포유류의 대사성 질환 치료 방법에 관한 것이다.
인슐린 분비촉진제, 당뇨병 치료, 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 활성화 펩티드 (PACAP) 수용체 (VPAC2) 작용제

Description

뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 활성화 펩티드 (ＰＡＣＡＰ) 수용체 (ＶＰＡＣ２) 작용제 및 이의 약리학적 사용 방법 {PITUITARY ADENYLATE CYCLASE ACTIVATING PEPTIDE (PACAP) RECEPTOR (VPAC2) AGONISTS AND THEIR PHARMACOLOGICAL METHODS OF USE}
본 출원은 2004년 1월 27일자로 출원된 미국 가출원 제60/539,550호 및 2004년 4월 29일자로 출원된 미국 가출원 제60/566,499호 (이들 전문이 본원에 참고로 도입된다)의 이점을 청구하고 있다.
본 발명은 신규하게 확인된 폴리펩티드, 및 이러한 폴리펩티드의 치료적 용도에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명의 폴리펩티드는 췌장성 β-세포로부터의 인슐린 방출을 글루코스-의존적 방식으로 자극함으로써, 대사성 질환, 예를 들어 당뇨병이나 전당뇨병 상태인 내당능 이상 (impaired glucose tolerance)을 앓고 있는 개개인에 대한 치료 선택권을 제공하는데 유용하다.
당뇨병은 특히 당뇨병 환자에게서 혈당치 (blood glucose level)가 상승됨으로써 글루코스 대사 장애를 나타내는 것을 특징으로 한다. 근원적인 결함에 따라 당뇨병을 다음 2 가지 주요 군으로 분류한다: 환자의 췌장에 있는 랑게르한스 섬 내에 인슐린을 생산하는 β-세포가 결핍된 경우에 발병되는 유형 1 당뇨병 또는 인 슐린 의존성 진성 당뇨병 (IDDM); 및 β-세포 기능 장애와 인슐린 작용 상의 변경을 나타내는 환자에게서 발병하는 유형 2 당뇨병 또는 비-인슐린 의존성 진성 당뇨병 (NIDDM).
유형 1 당뇨병 환자는 현재 인슐린으로 치료하고 있지만, 대다수의 유형 2 당뇨병 환자는 β-세포 기능을 자극하는 약제 또는 인슐린에 대한 환자의 조직 민감성을 증강시키는 약제를 이용하여 치료하고 있다. 시간이 지남에 따라 유형 2 당뇨병 대상체의 대략 절반 가량은 이들 약제에 대한 반응을 상실하게 되므로, 이때에는 인슐린 요법을 수행해야만 한다. 유형 2 당뇨병을 치료하기 위해 현재 사용되고 있는 약물은 다음에 기재되어 있다.
알파-글루코시다제 억제제 [예: Precose® (공급처: Bayer Pharmaceuticals Corporation), Voglibose™ (공급처: Takeda Pharmaceuticals Company Limited), 및 Miglitol® (공급처: Bayer Pharmaceuticals Corporation)]은 소화관으로부터의 글루코스 흡수를 지연시킴으로써 식후 혈당 가동역 (可動域)을 감소시킨다. 이들 약물은 약한 수준 내지 적당한 수준으로 발병한 당뇨병 환자에 대한 치료를 제공해주며 안전하다. 그러나, 위장 상의 부작용이 문헌에 보고된 바 있다.
인슐린 감작제 (insulin sensitizer)는 인슐린에 대한 신체 반응을 증강시키는 약물이다. 티오졸리딘디온, 예를 들어 아반디아 (Avandia®) [공급처: GlaxoSmithKline; 로시글리타존 (rosiglitazone)] 및 악토스 (Actos™) [공급처: Takeda Pharmaceuticals Company Limited; 피오글리타존 (pioglitazone)]는 과산화소체 (peroxisome) 증식인자-활성화 수용체 (PPAR) 감마 아유형을 활성화시키고, 자세히 보고된 바 없는 유전자 세트의 활성을 조정한다. 이러한 부류 중의 첫 번째 약물인 레줄린 (Rezulin™) [공급처: Warner-Lambert Company; 트로글리타존 (troglitazone)]은 간 효소 수치 상승과 약물 유도된 간독성으로 인해 사용이 중지되었다. 이와 같이 간에 나타난 효과들은 아반디아® 및 악토스™를 이용한 환자에게서는 상당한 문제점으로 보이지 않는다. 비록 그렇다 할지라도, 치료를 시작한 첫해에는 2개월 마다 간 효소 시험을 수행하고, 그 다음부터는 주기적으로 수행하는 것이 권장된다. 아반디아®와 악토스™는 액체 잔류와 부종과 연관이 있는 것으로 여겨진다. 또 다른 잠재적 부작용은 체중 증가이다. 아반디아®는 울혈성 심부전증에 관한 우려 때문에 인슐린과 함께 사용하도록 지시되지 않는다.
인슐린 분비촉진제 [예: 설포닐우레아 (SFU) 및 ATP-의존성 K+ 채널에 의해 작용하는 기타 약제]는 유형 2 당뇨병을 치료하기 위해 현재 사용되고 있는 또 다른 약물 유형이다. SFU는 약한 수준 내지 적당한 수준의 공복 혈당증을 나타내는 유형 2 당뇨병에 대한 표준 요법이다. SFU는 저혈당증, 체중 증가 및 높은 일차 및 이차 실패율을 유도할 수 있다는 점을 포함하는 한계를 갖는다. 초기에 치료받은 환자의 10 내지 20%가 상당한 치료 효과를 나타내지 못하였다 (일차 실패). SFU를 이용하여 치료한지 6개월 후 치료 효과의 20 내지 30%가 부가적으로 손실되는 것이 이차 실패이다. 상기 치료를 시작한지 5 내지 7년 후에 SFU 반응자 중의 50%에게서 인슐린 치료가 요구된다 [참고: Scheen, et al., Diabetes Res. Clin. Pract. 6: 533-543, 1989].
글루코파아지® (Glucophage®) [공급처: Lipha Corporation; 메트포르민 (metformin) HCl]는 간 내에서의 글루코스 생산을 감소시키고 말초 글루코스 흡수와 활용을 증가시킴으로써 혈당을 저하시키는 비구아니드이다. 상기 약물은 약한 수준 및 적당한 수준으로 병을 앓고 있는 대상체에게서 혈당을 저하시키는데 유효하고, 체중 증가 또는 저혈당증 유도 가능성과 같은 부작용이 없다. 그러나, 글루코파아지®는 위장 장애 및 락트산 산성증을 포함한 수 많은 부작용을 나타낸다. 글루코파아지®는 70세 이상의 당뇨병 환자와 신장 기능이나 간 기능에 있어 장애가 있는 대상체에게는 금기시된다. 최종적으로, 글루코파아지®는 SFU와 유사한 일차 및 이차 실패율을 나타낸다.
인슐린 치료는 식이, 운동 및 경구 약물이 혈당을 적정 수치로 제어하는데 실패한 후에 시행한다. 이러한 치료는 주사제를 이용하고, 저혈당증을 야기시킬 수 있으며 체중 증가를 야기시킨다는 단점을 지니고 있다.
현 치료법과 관련한 문제점 때문에, 유형 2 당뇨병을 치료하기 위한 새로운 요법이 요망된다. 특히, 정상적인 (글루코스-의존성) 인슐린 분비를 유지시키기 위한 새로운 치료법이 요망된다. 이러한 새로운 약물은 다음 특징들을 나타내야 한다: 인슐린 분비를 촉진시키기 위해 글루코스에 의존적이어야 하고 (즉, 상승된 혈당의 존재 하에서만 인슐린 분비를 야기시켜야 함); 일차 및 이차 실패율이 낮아야 하며; 섬 세포 기능을 보존해야 한다. 본원에 기재된 신규 요법을 개발하기 위한 전략은 사이클릭 아데노신 모노포스페이트 (cAMP) 신호 전달 기전과, 인슐린 분비에 대한 그의 효과에 기초한다.
사이클릭 AMP는 인슐린 분비 과정의 주요 조절인자이다. 이러한 신호 전달 분자가 상승하게 되면, 단백질 키나제 A 경로의 활성화 후에 K+ 채널의 폐쇄가 촉진된다. K+ 채널이 폐쇄되면 세포 탈분극이 유발되고, 연속해서 Ca++ 채널이 개방되어, 결국에는 인슐린 과립이 세포외 유출된다. 낮은 글루코스 농도의 부재 하에서는 인슐린 분비에 대한 효과가 존재한다 하더라도 극히 적다 [참고: Weinhaus, et al., Diabetes 47: 1426-1435, 1998]. PACAP (뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 활성화 펩티드), VIP (혈관활성 장 펩티드) 및 GLP-1 (글루카곤-유사 펩티드 1)과 같은 분비 촉진제는 인슐린 분비를 글루코스-의존적 방식으로 조절하기 위해 cAMP 계를 이용하고 있다 [참고: Komatsu, et al., Diabetes 46: 1928-1938, 1997; Filipsson, et al., Diabetes 50: 1959-1969, 2001; Drucker, Endocrinology 142: 521-527, 2001]. cAMP의 상승을 통하여 작동하는 인슐린 분비 촉진제, 예를 들어 GLP-1, VIP, 및 PACAP는 인슐린 방출 이외에도 인슐린 합성을 증강시킬 수 있다 [참고: Skoglund, et al., Diabetes 49: 1156-1164, 2000; Borboni, et al., Endocrinology 140: 5530-5537, 1999].
GLP-1은 식사 후에 장 L-세포로부터 방출되고 인크레틴 (incretin) 호르몬으로서 기능한다 (즉, 이는 췌장성 β-세포로부터의 글루코스-유도된 인슐린 방출을 증강시킨다). 이는 조직 유형에 따라서 글루카곤 유전자에 의해 차별적으로 발현되는 37개 아미노산 펩티드이다. GLP-1을 이용한 경우에, β-세포에서 cAMP 수준 상승에 따른 유리한 효과를 뒷받침 해주는 임상 데이터가 수집되었다. 불충분한 수준으로 (불량하게) 제어된 유형 2 당뇨병 환자에게 GLP-1을 주입하면, 이의 공복 혈당치가 정상 수준으로 되었으며 [참고: Gutniak, et al., New Eng. J. Med. 326: 1316-1322, 1992], 보다 장기간 주입하게 되면 β-세포 기능이 정상인 수준으로 향상되었다 [참고: Rachman, et al., Diabetes 45: 1524-1530, 1996]. 최근에는, GLP-1이 내당능 이상 대상체에게서 글루코스에 반응할 수 있는 β-세포의 능력을 개선시킨다고 보고되었다 [참고: Byrne, et al., Diabetes 47: 1259-1265, 1998]. 그러나, 이들 효과 모두는 해당 펩티드의 반감기가 짧기 때문에 수명이 짧다.
아밀린 파마슈티칼즈 (Amylin Pharmaceuticals)는 (미국산) 독도마뱀 (Gila Monster)에서 최초로 확인된 39개 아미노산 펩티드인 엑센딘 (Exendin)-4 (AC2993)를 이용하여 임상 시험을 수행하였다. 아밀린은 임상 연구 결과, 엑센딘-4를 이용하여 치료한 유형 2 당뇨병 환자의 경우에 혈당 제어가 개선되었다고 보고하였다. 그러나, 상당한 수준의 오심과 구토가 발생하였다.
PACAP는 췌장성 β-세포로부터의 글루코스-의존성 인슐린 분비의 강력한 자극제이다. 3가지 상이한 PACAP 수용체 유형 (PAC1, VPAC1, 및 VPAC2)이 보고되었다 [참고: Harmar, et al., Pharmacol. Reviews 50: 265-270, 1998; Vaudry, et al., Pharmacol. Reviews 52: 269-324, 2000]. PACAP는 어떠한 수용체 선택성도 나타내지 않으므로, 3가지 수용체 모두에서 거의 동등한 수준의 활성과 효력을 지닌다. PAC1은 주로 CNS에서 발견되는 반면, VPAC1과 VPAC2는 보다 광범위하게 분포되어 있다. VPAC1은 CNS 뿐만 아니라 간, 폐 및 장에서 발견된다. VPAC2는 CNS, 췌장, 골격근, 심장, 신장, 지방 조직, 고환 및 위에서 발견된다. 최근의 연구 결과는 VPAC2가 β-세포로부터의 인슐린 분비에 책임이 있다고 주장하고 있다 [ 참고: Inagaki, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2679-2683, 1994; Tsutsumi, et al., Diabetes 51: 1453-1460, 2002]. 이러한 PACAP의 인슐린분비촉진 작용은 GTP 결합성 단백질 Gs에 의해 매개된다. 세포내 cAMP가 축적하게 되면, 이는 [Ca++]를 증가시키는 β-세포 내 비-선택적 양이온 채널을 활성화시키고, 인슐린-함유 분비성 과립의 세포외 유출을 촉진시킨다.
PACAP는 cAMP-매개성 신호 전달 경로를 통하여 작용하는 대사성, 신경내분비성 및 신경전달 물질 펩티드 호르몬 거대군의 가장 신규한 구성원이다 [참고: Arimura, Regul. Peptides 37: 287-303, 1992]. 이러한 생물학적 활성 펩티드는 생합성 전구체로부터 2개의 분자 형태, 즉 38개 아미노산 펩티드 (PACAP-38)로서 및/또는 아미드화 카르복실 말단을 수반한 27개 아미노산 펩티드 (PACAP-27)로서 방출된다 [상기 Arimura 문헌 참고].
가장 고농도의 상기 펩티드 2 가지 형태가 뇌와 고환에서 발견된다 [상기 Arimura 문헌 참고]. 보다 짧은 펩티드 형태인 PACAP-27은 혈관활성 장 폴리펩티드 (VIP)와 68%의 구조적 상동률을 나타낸다. 그러나, PACAP와 VIP가 중추 신경계에 분포한다는 것은 구조적으로 관계가 있는 이들 펩티드가 별개의 신경전달 물질 기능을 지니고 있다는 것을 제안하고 있다 [참고: Koves, et al., Neuroendocrinology 54: 159-169, 1991].
최근의 연구 결과, 생식에 있어서의 특정 역할에서부터 [참고: McArdle, Endocrinology 135: 815-817, 1994] 인슐린 분비를 자극할 수 있는 능력까지 [참고: Yada, et al., J. Biol. Chem. 269: 1290-1293, 1994] PACAP-38의 다양한 생물 학적 효과가 입증되었다. 또한, PACAP는 지질 및 탄수화물 대사의 호르몬성 조절 [참고: Gray, et al., Mol. Endrocrinol. 15: 1739-47, 2001]; 일주기성 (circadian) 기능 [참고: Harmar, et al., Cell 109: 497-508, 2002]; 및 면역계, 성장, 에너지 생체 항상성 및 남성 (수컷) 생식 기능 [참고: Asnicar, et al., Endrocrinol. 143: 3994-4006, 2002]; 식욕 조절 [참고: Tachibana, et al., Neurosci. Lett. 339: 203-206, 2003]; 뿐만 아니라 급성 및 만성 염증 질환, 패혈성 쇽 및 자가면역 질환 (예: 전신성 홍반성 루푸스) [참고: Pozo, Trends Mol. Med. 9: 211-217, 2003]에 있어 특정 역할을 하는 것으로 여겨진다.
혈관활성 장 펩티드 (VIP)는 돼지 (hog) 상부 소장으로부터 처음으로 분리시킨 28개 아미노산 펩티드이다 [참고: Said and Mutt, Science 169: 1217-1218, 1970; 미국 특허 제3,879,371호]. 이러한 펩티드는 헬로데르민 (helodermin), 세크레틴 (secretin), 소마토스타틴 (somatostatin) 및 글루카곤을 포함하는, 구조적으로 관계가 있는 작은 폴리펩티드 계열에 속한다. VIP의 생물학적 효과는 세포내 cAMP 신호 전달 계와 커플링되는 막-결합된 수용체 단백질의 활성화에 의해 매개된다. 이들 수용체는 처음에는 VIP-R1 및 VIP-R2로서 알려졌으나, 나중에 VPAC1 및 VPAC2와 동일한 수용체인 것으로 밝혀졌다. VIP는 VPAC1 및 VPAC2에서 거의 동등한 수준의 활성과 효력을 나타낸다.
인간 폐액 (lung fluid)에서의 VIP의 안정성을 개선시키기 위해, 볼린 (Bolin) 등은 상기 펩티드의 나선 성향을 증강시키고 단백질분해적 분해를 감소시키도록 고안된 일련의 VIP 변이체를 제조하였다 [참고: Bolin et al., Biopolymers 37: 57-66, 1995]. 수용체 결합에 있어 중요하지 않게 관련되는 위치 8, 12, 17, 및 25 내지 28에서의 치환에 초점이 맞춰졌다. 더우기, 나선을 보다 효과적으로 캡핑하고자 하는 희망으로 "GGT" 서열을 VIP 돌연변이 단백질의 C-말단에 표지시켰다. 최종적으로, 나선을 추가로 안정화시키기 위해, 몇 가지 사이클릭 변이체를 합성하였다 [참고: 미국 특허 제5,677,419호]. 이러한 노력들이 수용체 선택성을 향해 이루어진 것은 아니지만, 이로 인해 보다 큰 VPAC2 선택성을 지닌 2개의 유사체가 생성되었다 [참고: Gourlet, et al., Peptides 18: 403-408, 1997; Xia, et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 281: 629-633, 1997].
PACAP, GLP-1, 또는 엑센딘-4의 글루코스-의존성 인슐린 분비촉진제 활성을 지니긴 하지만, 부작용이 훨씬 덜하고 바람직하게는 제형에서 안정적이며 생체내 혈장 반감기가 긴 개선된 펩티드가 요망된다. 이러한 생체내 반감기 상의 개선은 청소율 (제거율)이 감소되면서도 단백질분해에 대한 감수성이 저하된 펩티드로부터 비롯된다. 더우기, 혈장 글루코스 수치를 보다 치밀하게 제어하는 것이 장기간 당뇨병 합병증을 예방할 수 있다. 따라서, 신규한 당뇨병 약물은 환자에 대한 삶의 질을 개선시킬 수 있어야 한다.
발명의 요약
본 발명은 VPAC2 수용체 (VPAC2로서 후술됨)의 작용제로서 생체내 기능을 하고, VPAC2 작용제 활성을 지닌 약제에 의해 개선시킬 수 있는 질병과 질환을 치료하는데 유효한 신규한 폴리펩티드를 제공한다. 바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드는 VPAC1 및 PAC1에서 보다는 VPAC2에서 더 큰 효력을 나타내는 선택적인 VPAC2 작 용제이다. 예를 들어 (이로써 제한되지 않는다), 이들 폴리펩티드는 인슐린 합성과, 글루코스-의존성 방식으로 췌장성 β-세포로부터의 방출 및 후속 혈장 글루코스 감소를 자극한다. 이들 분비촉진제 폴리펩티드는 글루코스 챌린지시 생체내 혈당치를 비히클 대조군 보다 더 낮추는 것으로 밝혀졌다. 더우기, 본 발명의 폴리펩티드는 제형에서 안정적이고, 유도체화된 경우에는 혈장 반감기가 길며 생체내 작용 기간이 길다.
본 발명의 폴리펩티드는 PACAP 또는 VIP와 비교해서 혈장내 및 디펩티딜펩티다제 IV (DPP4)에 의한 단백질분해에 대한 안정성이 개선되었다. VIP와 PACAP27 둘 다 DPP4에 의한 절단에 대해 내성이 있는 것으로 보고되긴 하였지만 [참고: Zhu, et al., J. Biol. Chem 278: 22418-22423, 2003], 도 2a는 이들 펩티드가 보다 긴 시점에서는 절단되는 반면, 본 발명의 펩티드는 시험된 시점에서의 절단에 대해 내성이 있다는 것을 보여준다. 본 발명의 유도체는 생체내 작용 기간이 연장된 것으로 입증되었는데, 이는 유도체화한 경우에 1일 1회 미만, 1주 또는 그 이상 마다 1회 미만의 투약 간격을 뒷받침해준다.
본 발명의 폴리펩티드는, 예를 들어 내인성 인슐린 분비 감소로 인해 비롯된 바와 같은 대사성 질환, 예를 들어 유형 2 당뇨병 환자, 또는 인슐린 분비에 있어 약한 수준의 변경을 나타내는 전당뇨병성 상태인 내당능 이상 환자에 대한 요법을 제공해준다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 임신성 당뇨병, 아이들의 성인 당뇨병 (MODY), 잠재성 성인 자가면역 당뇨병 (LADA), 및 관련 당뇨병성 이상지질혈증 (dyslipidemia) 및 기타 당뇨병 합병증 뿐만 아니라 고혈당증, 고인슐린혈증, 내당 능 이상, 공복 글루코스 장애, 이상지질혈증, 고중성지방혈증, 증후군 X, 및 인슐린 내성을 예방 및/또는 치료하는데 유용할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 또한, 비만의 예방 및/또는 치료 (예를 들어, 식욕과 음식물 섭취 조절), 아테롬성 경화증, 고지질혈증, 고콜레스테롤혈증, 저 HDL 수치, 고혈압, 심혈관계 질환 (아테롬성 경화증, 관상 심장 질환, 관상 동맥 질환 및 고혈압 포함), 뇌혈관계 질환 및 말초 혈관 질환을 예방 및/또는 치료하는데 활용할 수 있고; 루푸스, 다낭성 난소 증후군, 발암 현상, 및 과다형성, 천식, 남성 생식 문제, 궤양, 수면 장애, 지질 및 탄수화물 대사 장애, 일주기성 기능 이상, 성장 장애, 에너지 생체 항상성 장애, 면역 질환 [자가면역 질환 (예: 전신성 홍반성 루푸스) 포함] 뿐만 아니라 급성 및 만성 염증 질환, 패혈성 쇽, 및 본원에서 확인된 기타 질환을 예방 및/또는 치료하는데 활용할 수 있거나, 또는 본원에서 나중에 기재된 바와 같이 다르게 기능할 수 있다.
본 발명의 한 국면은 서열 1 내지 148로 이루어진 군 중에서 선택된 폴리펩티드, 및 상기 열거된 서열의 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 한 가지 이상의 생물학적 기능을 나타내는 그의 단편, 유도체 및 변이체 (집합적으로, 본 발명의 폴리펩티드"로 지칭된다) (이에는 그의 기능적 등가물이 포함된다)이다. 본 발명의 추가의 양태는 서열 1 내지 37 및 서열 112 내지 148로 이루어진 군 중에서 선택된 폴리펩티드, 및 상기 열거된 서열의 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 한 가지 이상의 생물학적 기능을 나타내는 그의 단편, 유도체 및 변이체이다. 본 발명의 또 다른 양태는 서열 1 내지 5 및 서열 112 내지 115로 이루어진 군 중에서 선택된 폴리 펩티드, 및 상기 열거된 서열의 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 한 가지 이상의 생물학적 기능을 나타내는 그의 단편, 유도체 및 변이체이다. 본 발명의 추가 양태는 서열 1 및 112로 이루어진 군 중에서 선택된 폴리펩티드, 및 상기 열거된 서열의 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 한 가지 이상의 생물학적 기능을 나타내는 그의 단편, 유도체 및 변이체이다.
본 발명의 폴리펩티드와 선택적으로 결합하는 항체 및 항체 단편이 또한 제공된다. 이러한 항체는 본 발명의 폴리펩티드를 탐지하는데 유용하고, 당해 분야에 널리 공지된 과정에 의해 확인 및 제조할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 인식하는 폴리클로날 N-말단 IgG 항체 및 모노클로날 C-말단 Fab 항체를 생성시켰다.
본 발명은 또한, 치료적 유효량의 임의의 본 발명의 폴리펩티드 또는 VPAC2에서 활성인 임의의 폴리펩티드, 예를 들어 서열 1 내지 148의 폴리펩티드를 특정 포유류에게 투여하는 것을 포함하여, 이러한 포유류에게서 당뇨병, 당뇨병 관련 질환, 및/또는 본 발명의 폴리펩티드에 의해 영향을 받는 기타 질병 또는 질환, 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드의 VPAC2 작용제 기능에 의해 영향을 받는 기타 질병 또는 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는 방법이 본원에 기재되어 있다.
도 1a 내지 1d는 서열 1 내지 148의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 서열 112 내지 148은 말레이미드 연쇄를 통하여 C-말단 시스테인에서 PEG화시킨 (PEGylated) 펩티드를 지칭한다. PEG는 어떠한 길이일 수도 있는데, 예를 들어 22 kD 선형 PEG 또는 43 kD 분지된 PEG이거나, 또는 그 보다 더 클 수 있다. 도 1e는 관련 펩티드 표준물을 지칭한다.
도 2a 및 2b는 DPP4에 의한 단백질분해적 절단에 대한 VPAC2 유사체의 안정성을 도시한 것이다.
도 3은 VPAC 펩티드로 처리한 세포의 cAMP 반응을 도시한 것이다.
도 4a 및 4b는 펩티드를 탐지하기 위한 샌드위치 ELISA 검정을 도시한 것이다.
도 5a, 5b, 및 5c는 VPAC 펩티드의 약력학적 특성을 나타낸 것이다.
도 6a, 6b, 6c, 및 6d는 생체내 효능을 예시한 것이다.
본 발명은 신규한 폴리펩티드, 및 도 1a 내지 1d의 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 한 가지 이상의 생물학적 기능을 나타내는 그의 단편, 유도체 및 변이체 (집합적으로, 본 발명의 폴리펩티드로 지칭된다)를 제공한다. VPAC2 작용제로서 생체내 기능을 하는 본 발명의 폴리펩티드는 유형 2 당뇨병, 임신성 당뇨병, 아이들의 성인 당뇨병 (MODY) [참고: Herman, et al., Diabetes 43: 40, 1994]; 잠재성 성인 자가면역 당뇨병 (LADA) [참고: Zimmet, et al., Diabetes Med. 11: 299, 1994]을 포함한 당뇨병; 및 관련 당뇨병성 이상지질혈증 및 기타 당뇨병 합병증 뿐만 아니라 고혈당증, 고인슐린혈증, 내당능 이상, 공복 글루코스 장애, 이상지질혈증, 고중성지방혈증, 증후군 X, 및 인슐린 내성과 같은 질병 또는 질환을 예방 및/또는 치료하는데 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드는 비만 (예를 들어, 식욕과 음식물 섭취 조절), 아테롬성 경화증, 고지질혈증, 고콜레스테롤혈증, 저 HDL 수치, 고혈압, 심혈관계 질환 (아테롬성 경화증, 관상 심장 질환, 관상 동맥 질환 및 고혈압 포함), 뇌혈관계 질환 및 말초 혈관 질환을 예방 및/또는 치료하는데 활용할 수 있고; 루푸스, 다낭성 난소 증후군, 발암 현상, 및 과다형성, 천식, 남성 생식 문제 (인간 정자의 운동성 포함), 궤양, 수면 장애, 및 본원에서 확인된 기타 질환을 예방 및/또는 치료하는데 활용할 수 있거나, 또는 본원에서 나중에 기재된 바와 같이 다르게 기능할 수 있다.
더우기, 본 발명의 폴리펩티드는 글루코스-의존성 방식으로 췌장성 β-세포로부터의 인슐린 방출을 자극할 것이다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한, 수성 제형과 비-수성 제형 둘 다에서 안정적이고, 1시간 초과의 혈장 반감기를 나타내는데, 예를 들어 6시간 초과의 혈장 반감기를 나타낸다.
본 발명의 폴리펩티드는 VPAC2 작용제이다. 이들은 VPAC1 및/또는 PAC1에 비해 VPAC2에 대한 선택도가, 예를 들어 10배 이상 더 큰 선택적인 VPAC2 작용제이다. 본 발명의 폴리펩티드는 예를 들어, 유형 2 당뇨병의 치료에 역효과를 나타내는 혈장 글루코스 수치 증가나 울혈을 유도하지 않으면서 글루코스-의존성 방식으로 혈장 내로의 인슐린 방출을 자극한다. 부가적으로, 본 발명의 폴리펩티드는 VPAC2 수용체의 선택적인 작용제이므로, 예를 들어, 위장내 수분 잔류와 같은 불쾌하거나 위험한 부작용, 및/또는 심박수 또는 혈압 증가와 같은 바람직하지 못한 심혈관계 효과에 대해 책임이 있는 기타 수용체에 대항하여 선택적이면서도, 혈장 내로의 인슐린 방출을 증가시켜 준다.
본 발명의 폴리펩티드는 또한, 수성 및 비-수성 제형에서 안정적이다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드는 물 (pH 7 내지 8에서) 또는 비-수성 유기 용매에 용해되는 경우에, 1주 기간에 걸쳐 37 내지 40℃ 하에 10% 미만의 분해를 나타낼 것이다. 더우기, 본 발명의 조성물 및 제형은 본 발명의 폴리펩티드와, 하나 이상의 제약상 허용 가능한 담체, 제약상 허용 가능한 희석제, 및 제약상 허용 가능한 용매를 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 내인성 인슐린 분비 감소 또는 내당능 이상, 예를 들어 유형 2 당뇨병 환자에 대한 요법을 제공한다. 즉, 본 발명의 폴리펩티드는 글루코스-자극된 인슐린 분비를 유지, 개선 및 복원시키는데 사용될 수 있는, 장기간 작용하는 VPAC2 작용제이다. 더우기, VPAC2 수용체의 선택적인 펩티드 작용제는 기타 PACAP 수용체의 비-선택적 활성화와 관련된 부작용을 유발시키지 않으면서도, 췌장에서 글루코스-의존성 인슐린 분비를 증강시킬 것이다.
본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 특정 용어는 다음과 같이 정의되며, 기타 용어들도 도입된 바와 같이 정의될 것이다. 특정의 아미노산에 대한 단일 문자 약어, 이의 상응하는 아미노산, 및 3 문자 약어는 다음과 같다: A, 알라닌 (ala); C, 시스테인 (cys); D, 아스파르트산 (asp); E, 글루탐산 (glu); F, 페닐알라닌 (phe); G, 글리신 (gly); H, 히스티딘 (his); I, 이소루이신 (ile); K, 리신 (lys); L, 루이신 (leu); M, 메티오닌 (met); N, 아스파라긴 (asn); P, 프롤린 (pro); Q, 글루타민 (gln); R, 아르기닌 (arg); S, 세린 (ser); T, 트레오닌 (thr); V, 발린 (val); W, 트립토판 (trp); 및 Y, 티로신 (tyr).
"기능적 등가" 및 "실절적으로 동일한 생물학적 기능 또는 활성"은 각각, 각 폴리펩티드의 생물학적 활성을 동일한 과정에 의해 결정한 경우 생물학적 활성 정도가, 비교되는 해당 폴리펩티드에 의해 나타난 생물학적 활성의 약 30 내지 약 100% 또는 그 이상 이내에 있음을 의미한다. 예를 들어, 도 1의 폴리펩티드와 기능적 등가인 폴리펩티드는 실시예 9의 사이클릭 AMP (cAMP) 신틸레이션 근접성 검정에서 시험한 경우에, 인간 VPAC2 수용체를 발현하는 CHO 세포주에 cAMP를 축적시키는 것으로 입증된 것이다.
도 1의 폴리펩티드를 지칭하는 경우의 용어 "단편", "유도체" 및 "변이체"는 다음에 추가로 기재되는 바와 같이, 이러한 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 보유하고 있는 폴리펩티드의 단편, 유도체 및 변이체를 의미한다.
유사체에는 그 내부에 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 프로-폴리펩티드가 포함된다. 본 발명의 활성 폴리펩티드는 천연, 생체내 과정, 또는 당해 분야에 널리 공지된 과정, 예를 들어 효소적 또는 화학적 절단에 의해 프로-폴리펩티드 분자를 완성시키는 부가의 아미노산으로부터 절단시킬 수 있다. 예를 들어, 28개 아미노산 본래의 펩티드 VIP는 훨씬 더 큰 폴리펩티드로서 천연적으로 발현시킨 다음, 이를 생체 내에서 프로세싱하여 28개 아미노산 활성의 성숙한 펩티드를 방출시킨다.
단편은 본원에 기재된 생체내 모델에서 기재되는 바와 같이, 실질적으로 유사한 기능적 활성을 보유하고 있는 폴리펩티드의 일부이다.
유도체에는 본원에 기재된 기능을 실질적으로 보존하고 있고 부가의 구조와 수반되는 기능을 포함하는 폴리펩티드 (예를 들어, 보다 큰 반감기를 지닌 PEG화 또는 아세틸화 폴리펩티드), 다음에 추가로 기재되는 바와 같이, 보다 큰 반감기, 표적화 특이성 또는 부가 활성, 예를 들어 의도한 표적에 대한 독성 감소를 부여해주는 융합 폴리펩티드에 대한 모든 변형물이 포함된다.
본 발명의 폴리펩티드의 단편, 유도체 또는 변이체는 (i) 아미노산 잔기 중의 하나 이상이 보존적 또는 비-보존적 아미노산 잔기 (바람직하게는, 보존적 아미노산 잔기)로 치환되고, 이와 같이 치환된 아미노산 잔기가 유전 암호에 의해 암호화된 것이거나 암호화된 것이 아닐 수 있는 것이거나, (ii) 아미노산 잔기 중의 하나 이상이 치환체 군을 포함하는 것이거나, (iii) N-말단 아세틸기가 첫 번째 3개의 아미노산 중의 하나 이상에서 또 다른 치환체로 대체되는 것이거나 또는 첫 번째 3개의 아미노산 중의 하나 이상이 보존적 또는 비-보존적 아미노산 잔기 (바람직하게는, 보존적 아미노산 잔기)로 치환되고, 이와 같이 치환된 아미노산 잔기가 단백질분해에 대한 내성을 부여하기 위해 유전 암호에 의해 암호화된 것이거나 암호화된 것이 아닐 수 있는 것이거나, (iv) 성숙한 폴리펩티드를 또 다른 화합물, 예를 들어 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 화합물 (예: 폴리에틸렌글리콜 또는 지방산)과 융합시킨 것이거나, (v) 부가의 아미노산을 성숙한 폴리펩티드, 예를 들어 리더 또는 분비성 서열, 또는 성숙한 폴리펩티드 또는 프로-폴리펩티드 서열을 정제하기 위해 이용되는 서열과 융합시킨 것이거나, 또는 (vi) 폴리펩티드 서열을 보다 큰 폴리펩티드 (예를 들어, 효과 기간을 연장시키기 위한, 인간 알부민, 항체 또는 Fc)와 융합시킨 것일 수 있다. 이러한 단편, 유도체, 및 변이체 및 유사체는 본원의 교시로부터 당업자의 기술 수준 범위 내에 속하는 것으로 간주된다.
본 발명의 유도체는 하나 이상의 예상된, 바람직하게는 비-필수 아미노산 잔기에서 만들어진 보존적 아미노산 치환물 (다음에 추가로 정의됨)을 함유할 수 있다. "비-필수" 아미노산 잔기는 생물학적 활성을 변경시키지 않고서도 특정 단백질의 야생형 서열로부터 변경시킬 수 있는 잔기인 반면, "필수" 아미노산 잔기는 생물학적 활성에 요구되는 것이다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 지닌 아미노산 잔기로 대체시키는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 계열은 당업계에 정의되어 있다. 이들 계열에는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예: 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (예: 아스파르트산, 글루탐산), 전하를 띠지 않는 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예: 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예: 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄를 갖는 아미노산 (예: 트레오닌, 발린, 이소루이신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (예: 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)이 포함된다. 비-보존적 아미노산 치환은 보존적 아미노산 잔기, 또는 보존적 단백질 도메인 내에 상주하는 아미노산 잔기, 예를 들어 잔기 19 및 27 (이러한 잔기는 VPAC2 활성 및/또는 VPAC2 선택성과 같은 단백질 활성에 필수적이다)에 대해서는 이루어지지 않을 것이다. 단편, 또는 생물학적 활성 부분에는 의약으로서의 사용, 항체 생성, 조사용 시약 등에 적합한 폴리펩티드 단편이 포함된다. 단편에는 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열과 충분히 유사하거나 이로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하고 상기 폴리펩티드의 한 가지 이상 활성을 나타내지만, 본원에 기재된 완전한 길이의 폴리펩티드 보다는 적은 수의 아미노산을 포함하는 펩티드가 포함된다. 전형적으로, 생물학적 활성 부분은 본 발명의 폴리펩티드의 한 가지 이상 활성을 나타내는 도메인 또는 모티프를 포함한다. 특정 폴리펩티드의 생물학적 활성 부분은 예를 들어, 길이가 5개 이상 아미노산인 펩티드일 수 있다. 이러한 생물학적 활성 부분은 합성적으로 또는 재조합 기술에 의해 제조할 수 있고, 본원에 기재된 수단에 의해 및/또는 당해 분야에 널리 공지된 수단에 의해 본 발명의 폴리펩티드의 한 가지 이상 기능적 활성에 대해 평가할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 변이체에는 도 1 (a 내지 d) 서열들의 아미노산 서열과 충분히 유사한 아미노산 서열 또는 그의 도메인을 갖는 폴리펩티드가 포함된다. 용어 "충분히 유사한"이란 제1 아미노산 서열이 제2 아미노산 서열에 비해 충분한 수 또는 최소 수의 동일하거나 등가의 아미노산 잔기를 함유하여, 이러한 제1 아미노산 서열과 제2 아미노산 서열이 공통의 구조적 도메인 및/또는 공통의 기능적 활성을 지니는 것을 의미한다. 예를 들어, 약 45% 이상, 약 75 내지 98% 이상, 또는 동일한 공통의 구조적 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 본원에서 충분히 유사한 것으로 규정된다. 예를 들어, 변이체는 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열과 충분히 유사할 수 있다.
변이체에는 돌연변이 유발로 인해 아미노산 서열 면에서 상이한 폴리펩티드가 포함된다. VPAC2 작용제로서 기능하는 변이체는 VPAC2 작용제 활성을 위해, 본 발명의 폴리펩티드의 돌연변이체 (예: 절단 돌연변이체)의 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인(동정)할 수 있다.
더우기, 본 발명의 유도체에는 또 다른 화합물, 예를 들어 폴리펩티드의 반감기를 증가시키고/시키거나 폴리펩티드의 잠재적 면역원성을 저하시키는 화합물 (예: 폴리에틸렌 글리콜, "PEG" 또는 지방산)과 융합시킨 성숙한 폴리펩티드가 포함된다. PEG화의 경우, 본 발명의 폴리펩티드를 PEG에 융합시키는 것은 당업자에게 공지된 모든 수단에 의해 수행할 수 있다. 예를 들어, PEG화는 먼저, 시스테인 돌연변이를 폴리펩티드 내로 도입하여 링커를 제공하고, 이에 기초하여 PEG를 부착시킨 다음, PEG-말레이미드를 이용하여 부위-특이적 유도체화시킴으로써 수행할 수 있다. 한 예로서, 시스테인을 해당 펩티드의 C-말단에 부가할 수 있다 [참고: 예를 들어, Tsutsumi, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (15): 8548-53, 2000; Veronese, Biomaterials 22: 405-417, 2001; Goodsoon & Katre, Bio/Technology 8: 343-346, 1990]. 말레이미드 이외에도, 수 많은 Cys 반응성기가 단백질 가교결합 분야의 숙련인에게 공지되어 있고, 예를 들면 알킬 할라이드 및 비닐 설폰을 사용할 수 있다 [참고: 예를 들어, T. E. Creighton, Proteins, 2nd Ed., 1993]. 또한, PEG를 C-말단 카르복실레이트기, C-말단의 측쇄, 내부 아미노산, 예를 들면 Cys, Lys, Asp 또는 Glu, 또는 유사한 반응성 측쇄 부분을 함유하는 비-천연 아미노산에 직접 부착시킴으로써 도입할 수 있다.
PEG와 펩티드 가교결합기 간의 링커는 다양하게 할 수 있다. 예를 들어, 시판되고 있는 Cys-반응성 40 kDa PEG (mPEG2-MAL; 공급처: Nektar, San Carlos, CA)는 Cys와 접합하기 위해 말레이미드기를 이용하고, 이러한 말레이미드기는 Lys를 함유하는 링커를 통하여 PEG에 부착시킨다. 두 번째 예로서, 시판되고 있는 Cys-반응성 43 kDa PEG (GL2-400MA; 공급처: NOF, Tokyo, Japan)은 Cys와 접합하기 위해 말레이미드기를 이용하고, 이러한 말레이미드기는 이치환된 알칸 링커를 통하여 PEG에 부착시킨다.
본 발명에는 Cys를 가교결합 부위로서 사용하는 것이 예시되어 있지만, 이에 제한되지 않는다. 아미노산에 존재하는 기타 부분, 예를 들어 N-말단 아미노기, C-말단 카르복실레이트, 및 Lys, Arg, Asp, Glu와 같은 아미노산의 측쇄가 공유 변형 및 PEG에 대한 부착에 적합한 부분을 제공해 주는 반응성 기를 제공하는 것은 널리 공지되어 있다. 적합한 가교결합제의 수 많은 예가 당업자에게 공지되어 있다 [참고: 예를 들어, T.E. Creighton, Proteins, 2nd Ed., 1993]. 이러한 가교결합제를 현재, 예를 들어 넥타르 (Nektar) 및 NOF에 의해 판매되고 있는, 아민, 알데히드, 아세탈, 말레이미드, 숙신이미드 및 티올을 함유하는 시판용 PEG 유도체로써 예시되는 바와 같은 (그러나, 이로써 제한되지 않는다) PEG에 연결시킬 수 있다 [참고: 예를 들어, Harris, et al., Clin. Pharmokinet. 40, 539-551, 2001].
본 발명은 또한, 키메라 또는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드는 펩티드 결합 또는 변형된 펩티드 결합 (즉, 펩티드 동배체)에 의해 서로 연결된 아미노산들로 구성될 수 있고, 20개 유전자-암호화된 아미노산 이외의 아미노산을 함유할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 천연 프로세스, 예를 들어 해독후 프로세싱에 의해 변형시킬 수 있거나, 당해 분야에 널리 공지되어 있는 화학적 변형 기술에 의해 변형시킬 수 있다. 이러한 변형은 기본 교과서 및 보다 상세한 모노그래프 (monograph) 뿐만 아니라 연구 문헌에 잘 기재되어 있다. 변형은 펩티드 골격, 아미노산 측쇄, 및 아미노 또는 카르복실 말단을 포함한, 폴리펩티드 내의 어느 곳에서도 일어날 수 있다. 동일한 유형의 변형이 소정의 폴리펩티드 내의 여러 부위에서 동일하거나 다양한 정도로 존재할 수 있다는 것이 인지될 것이다. 또한, 소정의 폴리펩티드는 많은 유형의 변형을 함유할 수 있다. 폴리펩티드는, 예를 들어 유비퀴틴화 (ubiquitination)의 결과로서 분지될 수 있고, 이들 폴리펩티드는 분지화를 수반하거나 수반하지 않는 사이클릭일 수 있다. 사이클릭, 분지된, 및 분지된 사이클릭 폴리펩티드는 해독후 천연 프로세스로부터 비롯될 수 있거나, 또는 합성 방법에 의해 만들어질 수 있다. 변형에는 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 부착, 헴 부분 (heme moiety)의 공유 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스포티딜이노시톨의 공유 부착, 가교결합, 사이클화, 디설파이드 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교결합물의 형성, 시스테인의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 제형화, 감마-카르복실화, 당화, GPI 앵커 (anchor) 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, PEG화, 단백질분해적 프로세싱, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 단백질에 대한 전이-RNA 매개된 아미노산 부가 (예: 아르기닐화), 및 유비퀴틴화가 포함된다 [참고: 예를 들어, Proteins , Structure and Molecular Properties, 2nd ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, ed., Academic Press, New York, pgs. 1-12 (1983); Seifter, et al., Meth. Enzymol 182: 626-646, 1990; Rattan, et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 663: 48-62, 1992].
본 발명의 폴리펩티드에는 도 1a 내지 1d의 폴리펩티드 (서열 1 내지 148) 뿐만 아니라 이들로부터의 서열 내에 비실질적인 (적은 수준의) 변이를 나타내는 서열이 포함된다. "비실질적인 변이"에는 본 발명의 폴리펩티드의 적어도 한 가지 생물학적 기능, 예를 들어 VPAC2 작용제 활성, 선택적인 VPAC2 작용제 활성, 또는 본원에서 입증된 인슐린 분비 활성을 실질적으로 보유하고 있는 모든 서열 부가, 치환 또는 결실 변이체가 포함될 것이다. 이들 기능적 등가물에는 도 1a 내지 1d의 폴리펩티드와 약 90% 이상, 95% 이상, 또는 97% 이상 동일한 폴리펩티드가 포함될 수 있고, 또한 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 지닌 상기 폴리펩티드의 일부가 포함될 수 있다. 그러나, 본원에서 추가로 기재되는 바와 같이 기능적 등가성을 나타내는, 도 1a 내지 1d의 폴리펩티드로부터의 아미노산 서열 내에 비실질적인 변이를 나타내는 모든 폴리펩티드 역시 본 발명에 관한 설명에 포함된다.
당해 분야에 공지된 바와 같이, 두 폴리펩티드 간의 "유사성(율)"은 하나의 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 그의 보존적 아미노산 치환물을 제2 폴리펩티드의 서열과 비교함으로써 결정할 수 있다. 이러한 보존적 치환물에는 상기 기재된 것들 및 문헌 [참고: Dayhoff, The Atlas of Protein Sequence and Structure 5, 1978, 및 Argos, EMBO J. 8: 779-785, 1989]에 기재된 바와 같은 것이 포함된다. 예를 들어, 다음 군 중의 하나에 속하는 아미노산은 보존적 변화를 나타낸다:
- ala, pro, gly, gln, asn, ser, thr;
- cys, ser, tyr, thr;
- val, ile, leu, met, ala, phe;
- lys, arg, his;
- phe, tyr, trp, his; 및
- asp, glu.
본 발명의 폴리펩티드는 화학적 합성 과정의 생성물일 수 있으므로, 본 발명의 분리 또는 정제된 폴리펩티드, 또는 그의 생물학적 활성 부분에는, 화학적으로 합성된 경우에 화학적 전구체 또는 기타 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 분리된 폴리펩티드는 비-폴리펩티드 또는 오염성 물질을 약 30% 미만 (건조 중량 기준) 가질 수 있다. 본 발명의 펩티드를 화학적 합성에 의해 제조하는 경우에는, 이러한 제조물이 화학적 전구체 또는 본 발명이 아닌 화학물질을 약 30 중량% 미만 (건조 중량 기준) 함유할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 다음의 구체적 실시예에 기재되는 바와 같이 편리하게 분리할 수 있다. 정제된 폴리펩티드 제조물은, 예를 들어 순도가 약 70% 이상, 또는 약 85% 내지 약 99%이다. 이러한 제조물의 순도는 당해 분야에 공지된 모든 수단, 예를 들어 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 질량 분광측정법/액체 크로마토그래피에 의해 평가할 수 있다.
당업자의 이해 범주 내의 관련 펩티드 및 화합물 (예: 소분자), 예를 들어 화학적 모방체, 유기-모방체, 또는 펩티드-모방체가 또한 제공된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "모방체", "펩티드 모방체", "펩티드-모방체", "유기-모방체" 및 "화학적 모방체"는 본 발명의 펩티드와 등가의 3차원 배향 내에서의 원자 배열을 지닌 펩티드 유도체, 펩티드 유사체 및 화학적 화합물을 포괄하고자 하는 것이다. 본원에 사용된 바와 같은 "~와 등가의"란, 본 발명의 펩티드의 생물학적 기능을 지니는 특정 원자 및 부분의 동일하거나 충분히 유사한 배열 또는 배향을 가져다 주는 모방 화합물 내의 결합 길이, 결합각 및 배열을 지닌, 해당 펩티드 내에 화학적 부분 또는 특정 원자의 치환물(들)을 갖는 화합물 또는 펩티드를 포괄하고자 하는 것이다. 본 발명의 펩티드 모방체에서는, 화학적 구성성분의 3차원적 배열이 이러한 펩티드 내의 펩티드 주쇄 및 성분 아미노산 측쇄의 3차원적 배열과 구조적 및/또는 기능적으로 등가이며, 이로 인해 상당한 (실질적) 생물학적 활성을 지닌 본 발명의 펩티드의 펩티드-, 유기- 및 화학적 모방체가 생성된다. 이들 용어는, 예를 들어 본원에 의해 참고문헌으로 인용되고 있는 다음 문헌에 예시된 바와 같이 당해 분야에 관한 이해력에 따라서 사용된다: [Fauchere, Adv. Drug Res. 15: 29, 1986]; [Veber & Freidinger, TINS p. 392, 1985]; 및 [Evans, et al., J. Med. Chem. 30: 1229, 1987].
물론, 본 발명의 각 펩티드의 생물학적 활성에 대한 약리작용단 (pharmacophore)이 존재한다. 약리작용단은 생물학적 활성에 대한 구조적 요구 조건의 이상적인 3차원적 정의를 포함하는 것으로서 당해 분야에 인식되고 있다. 펩티드-, 유기- 및 화학적 모방체는 현재 사용되고 있는 컴퓨터 모델링 소프트웨어를 이용하여 각 약리작용단에 맞도록 고안할 수 있다 (컴퓨터 이용 약물 고안). 상기 모방체는 본 발명의 펩티드 내의 치환체 원자로부터의 위치 정보에 기초하여, 구조-기능 분석에 의해 생성될 수 있다.
본 발명에 의해 제공된 바와 같은 펩티드는 당해 분야에 공지된 임의의 화학적 합성 기술, 특히 예를 들어, 시판용 자동화 펩티드 합성기를 사용하는 고체-상 합성 기술에 의해 유리하게 합성할 수 있다. 본 발명의 모방체는 펩티드 합성에 통상적으로 사용되고 있는 고체 상 또는 용액 상 방법에 의해 합성할 수 있다 [참고: 예를 들어, Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-54, 1963; Carpino, Acc. Chem. Res. 6: 191-98, 1973; Birr, Aspects of the Merrifield Peptide Synthesis, Springer-Verlag: Heidelberg, 1978; The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vols. 1, 2, 3, and 5, (Gross & Meinhofer, eds.), Academic Press: New York, 1979; Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, III., 1984; Kent, Ann. Rev. Biochem. 57: 957-89, 1988; and Gregg, et al., Int. J. Peptide Protein Res. 55: 161-214, 1990; 이들 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다].
예를 들어, 고체 상 방법론을 사용할 수 있다. 간략하게 언급하면, N-보호된 C-말단 아미노산 잔기를 불용성 지지체, 예를 들어 디비닐벤젠 가교결합된 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드 수지, 키젤구르 (Kieselguhr)/폴리아미드 (펩신 K), 공극 제어된 유리, 셀룰로스, 폴리프로필렌 막, 아크릴산-피복된 폴리에틸렌 막대 등에 연결시킨다. 연속되는 보호된 아미노산 유도체를 탈보호, 중화 및 커플링시키는 주기를 이용하여, 아미노산 서열에 따라서 C-말단으로부터 아미노산을 연결시킨다. 몇몇 합성 펩티드의 경우에는, 산-민감성 수지를 이용하는 FMOC 전략을 사용할 수 있다. 이와 관련하여 고체 지지체는 각종의 기능성화 형태로 시판중인 디비닐벤젠 가교결합된 폴리스티렌 수지이며, 이에는 클로로메틸 수지, 히드록시메틸 수지, 파라아세트아미도메틸 수지, 벤즈히드릴아민 (BHA) 수지, 4-메틸벤즈히드릴아민 (MBHA) 수지, 옥심 수지, 4-알콕시벤질 알코올 수지 [왕 (Wang) 수지], 4-(2',4'-디메톡시페닐 아미노메틸)-페녹시메틸 수지, 2,4-디메톡시벤즈히드릴-아민 수지, 및 4-(2',4'-디메톡시페닐-FMOC-아미노-메틸)-페녹시아세트아미도노르루이실-MBHA 수지 [링크 (Rink) 아미드 MBHA 수지]가 포함된다. 또한, 경우에 따라 산-민감성 수지가 C-말단 산을 제공한다. 알파 아미노산에 대한 보호기는 염기-불안정한 9-플루오레닐메톡시-카르보닐 (FMOC)이다.
BOC (t-부틸옥시카르보닐) 및 FMOC 기와 화학적으로 상용성인 아미노산의 측쇄 관능기에 적합한 보호기는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. FMOC 화학을 이용하는 경우에는, 다음과 같이 보호된 아미노산 유도체가 바람직하다: FMOC-Cys (Trit), FMOC-Ser (But), FMOC-Asn (Trit), FMOC-Leu, FMOC-Thr (Trit), FMOC-Val, FMOC-Gly, FMOC-Lys (Boc), FMOC-Gln (Trit), FMOC-Glu (OBut), FMOC-His (Trit), FMOC-Tyr (But), FMOC-Arg [PMC (2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설포닐)], FMOC-Arg (BOC)2, FMOC-Pro, 및 FMOC-Trp (BOC). 아미노산 잔기는 당해 분야에 공지된 각종 커플링제와 화학을 이용함으로써 커플링시킬 수 있는데, 예를 들면 DIC (디이소프로필-카르보디이미드), DCC (디시클로헥실카르보디이미드), BOP (벤조트리아졸릴-N-옥시트리스디메틸아미노포스포늄 헥사플루오로포스페이트), PyBOP (벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트), PyBrOP (브로모-트리스-피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트)를 이용하여 직접 커플링시키거나; 실시된 대칭 무수물을 통하여; 활성 에스테르 (예: 펜타플루오로페닐 에스테르)를 통하여; 또는 실시된 HOBt (1-히드록시벤조트리아졸) 활성 에스테르를 통하여 커플링시키거나, FMOC-아미노산 플루오라이드 및 클로라이드를 사용하거나 또는 FMOC-아미노산-N-카르복시 무수물을 사용함으로써 커플링시킬 수 있다. HOBt 또는 HOAt (7-아자히드록시벤즈트리아졸)의 존재 하에 HBTU (2-(1H-벤조트리아졸-1-일),1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트) 또는 HATU (2-(1H-7-아자-벤조트리아졸-1-일),1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트를 이용하여 활성화시키는 것이 바람직하다.
고체 상 방법을 수동으로 수행할 수도 있지만, 시판용 펩티드 합성기 [예: Applied Biosystems 431A 등; 공급처: Applied Biosystems, Foster City, CA] 상에서 자동으로 합성할 수 있다. 전형적인 합성에서는, 제1 (C-말단) 아미노산을 클로로트리틸 수지 상에 적재한다. ABI FastMoc 프로토콜 (공급처: Applied Biosystems)에 따라서 연속적으로 탈보호 [20% 피페리딘/NMP (N-메틸피롤리돈)을 이용함] 및 커플링 주기를 이용하여 펩티드 서열을 생성시킬 수 있다. 아세트산 무수물에 의한 캡핑을 수반하면서 이중 및 삼중 커플링할 수도 있다.
적당한 TFA (트리플루오로아세트산) 함유 소거제로 처리함으로써, 합성 모방체 펩티드를 수지로부터 절단시키고 탈보호시킬 수 있다. 이러한 많은 절단 시약, 예를 들어 시약 K (0.75 g 결정성 페놀, 0.25 mL 에탄디티올, 0.5 mL 티오아니솔, 0.5 mL 탈이온수, 10 mL TFA) 등을 사용할 수 있다. 상기 펩티드는 여과시킴으로써 수지로부터 격리시키고, 에테르 침전시킴으로써 분리시킬 수 있다. 통상적인 방법, 예를 들어 겔 여과 및 역상 HPLC (고 성능 액체 크로마토그래피)에 의해 추가로 정제시킬 수 있다. 본 발명에 따르는 합성 모방체는 제약상 허용 가능한 염, 특히 염기-부가 염 (유기 염기 및 무기 염기의 염 포함) 형태일 수 있다. 산성 아미노산 잔기의 염기-부가 염은 당업자에게 널리 공지된 과정에 따라서 적당한 염기 또는 무기 염기로 펩티드를 처리함으로써 제조할 수 있거나, 또는 적당한 염기를 동결건조시킴으로써 목적하는 염을 직접 수득할 수 있다.
일반적으로, 당업자는 본원에 기재된 바와 같은 펩티드를 각종 화학적 기술에 의해 변형시켜, 변형되지 않은 펩티드와 본질적으로 동일한 활성을 지니고 임의로 기타 바람직한 특성을 지닌 펩티드를 생성시킬 수 있다고 인식할 것이다. 예를 들어, 본 발명의 펩티드의 카르복실산기를 제약상 허용 가능한 양이온의 염 형태로 제공할 수 있다. 이러한 펩티드 내의 아미노기는 제약상 허용 가능한 산 부가염, 예를 들어 HCl, HBr, 아세트산, 벤조산, 톨루엔 설폰산, 말레산, 타르타르산 및 기타 유기 염의 형태일 수 있거나, 또는 이러한 아미노기는 아미드로 전환될 수 있다. 티올은 널리 인식되고 있는 수 많은 보호기 중의 어느 하나, 예를 들면, 아세트아미드기를 이용하여 보호시킬 수 있다. 당업자는 또한, 사이클릭 구조를 본 발명의 펩티드 내로 도입하여, 본래의 결합 입체 배치가 보다 근접하게 위치하도록 하는 방법을 인식할 것이다. 예를 들어, 카르복실 말단 또는 아미노 말단 시스테인 잔기를 펩티드에 부가함으로써, 산화시 펩티드가 디설파이드 결합을 함유함으로써 사이클릭 펩티드를 생성시킬 것이다. 기타 펩티드 사이클화 (고리화) (cyclizing) 방법에는 티오에테르 및 카르복실- 및 아미노-말단 아미드 및 에스테르의 형성 방법이 포함된다.
구체적으로 언급하면, 상응하는 펩티드와 동일하거나 유사한 목적하는 생물학적 활성을 지니지만, 용해도, 안정성, 및 가수분해와 단백질분해에 대한 감수성 측면에서 상기 펩티드 보다 더 바람직한 활성을 지니고 있는 펩티드 유도체 및 유사체를 구축하는데 각종 기술을 이용할 수 있다. 이러한 유도체 및 유사체에는 N-말단 아미노기, C-말단 카르복실기에서 변형되고/되거나 펩티드 내의 하나 이상의 아미도 연쇄를 비-아미도 연쇄로 변화시킨 펩티드가 포함된다. 2 가지 이상의 이러한 변형을 1개의 펩티드 모방체 구조 내에서 커플링할 수 있다고 인지될 것이다 [예를 들어, C-말단 카르복실기에서 변형시키고, -CH2-카르바메이트 연쇄를 펩티드 내의 2개 아미노산 사이에 봉입시킨다].
아미노 말단 변형에는 알킬화, 아세틸화, 카르보벤조일기 부가, 및 숙신이미드기 형성이 포함된다. 구체적으로 언급하면, N-말단 아미노기를 반응시켜 식 RC(O)NH-- [여기서, R은 알킬, 예를 들면 저급 알킬이다]의 아미드기를 형성할 수 있고, 이는 산 할라이드, RC(O)Cl 또는 산 무수물과의 반응에 의해 부가한다. 전형적으로, 이러한 반응은 대략 동몰 또는 과량 (예: 약 5 당량)의 산 할라이드를, 바람직하게는 과량 (예: 약 10 당량)의 3급 아민 (예: 디이소프로필에틸아민)을 함유하는 불활성 희석제 (예: 디클로로메탄) 중에서 펩티드와 접촉시켜 반응 동안 생성된 산을 제거시킴으로써 수행할 수 있다. 그 밖의 반응 조건은 통상적이다 (예: 실온에서 30분). 말단 아미노를 알킬화시켜 저급 알킬 N-치환물을 제공한 다음, 이를 상기 언급된 바와 같이 산 할라이드와 반응시키면, 식 RC(O)NR-의 N-알킬 아미드기가 제공될 것이다. 또 다른 한편, 아미노 말단을 숙신산 무수물과 반응시킴으로써, 이러한 말단을 숙신이미드기에 공유적으로 연결시킬 수 있다. 대략 동몰량 또는 과량의 숙신산 무수물 (예: 약 5 당량)을 사용하고, 볼렌버그 등(Wollenberg et al.), 미국 특허 제4,612,132호 (그의 전문이 본원에 참고로 도입된다)에 기재되는 바와 같이, 말단 아미노기를 당해 분야에 널리 공지된 방법 [이에는 과량 (예: 약 10 당량)의 3급 아민 (예: 디이소프로필에틸아민)을 적합한 불활성 용매 (예: 디클로로메탄) 중에서 사용하는 방법이 포함된다]에 의해 숙신이미드로 전환시킨다. 또한, 숙신산기를 예를 들어, C2- 내지 C6-알킬 또는 --SR 치환체로 치환시킬 수 있으며, 이는 펩티드의 N-말단에 치환된 숙신이미드를 제공해 주는 통상적인 방식으로 제조한다고 이해될 것이다. 이러한 알킬 치환체는 저급 올레핀 (C2- 내지 C6-알킬)을 상기한 볼렌버그 등에 의해 기재된 방식으로 말레산 무수물과 반응시킴으로써 제조할 수 있고, --SR 치환체는 RSH (여기서, R은 상기 정의된 바와 같다)를 말레산 무수물과 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 또 다른 유리한 양태에서는, 아미노 말단을 유도체화하여 벤질옥시카르보닐-NH-- 또는 치환된 벤질옥시카르보닐-NH-- 기를 형성시킬 수 있다. 이러한 유도체는, 예를 들어 3급 아민을 함유하는 적합한 불활성 희석제 (예: 디클로로메탄) 중에서 대략 동량 또는 과량의 벤질옥시카르보닐 클로라이드 (CBZ-Cl), 또는 치환된 CBZ-Cl과 반응시켜, 이 반응 동안 생성된 산을 소거시킴으로써 생성시킬 수 있다. 또 다른 유도체에서는, N-말단이 적합한 불활성 희석제 (디클로로메탄) 중에서 동량 또는 과량 (예: 5 당량)의 R--S(O)2Cl [여기서, R은 알킬, 바람직하게는 저급 알킬이다]과 반응시켜 말단 아민을 설폰아미드로 전환시킴으로써, 설폰아미드기를 포함한다. 예를 들어, 불활성 희석제는 과량 (예: 10 당량)의 3급 아민, 예를 들어 디이소프로필에틸아민을 함유하여, 반응 동안 생성된 산을 소거할 수 있다. 그 밖의 반응 조건은 통상적이다 (예: 실온에서 30분). 카르바메이트 기는 적합한 불활성 희석제 (예: 디클로로메탄) 중에서 동량 또는 과량 (예: 5 당량)의 R--OC(O)Cl 또는 R--OC(O)OC6H4--p--NO2 [여기서, R은 알킬, 바람직하게는 저급 알킬이다]와 반응시켜 말단 아민을 카르바메이트로 전환시킴으로써, 아미노 말단에서 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 불활성 희석제는 과량 (예: 약 10 당량)의 3급 아민, 예를 들어 디이소프로필에틸아민을 함유하여, 반응 동안 생성된 모든 산을 소거할 수 있다. 그 밖의 반응 조건은 통상적이다 (예: 실온에서 30분). 우레아 기는 적합한 불활성 희석제 (예: 디클로로메탄) 중에서 동량 또는 과량 (예: 5 당량)의 R--N=C=O와 반응시켜 말단 아민을 우레아 (즉, RNHC(O)NH--)기 [여기서, R은 상기 정의된 바와 같다]로 전환시킴으로써, 아미노 말단에서 형성시킬 수 있다. 예를 들어, 불활성 희석제는 과량 (예: 약 10 당량)의 3급 아민, 예를 들어 디이소프로필에틸아민을 함유할 수 있다. 그 밖의 반응 조건은 통상적이다 (예: 실온에서 약 30분).
C-말단 카르복실기를 에스테르 [예: --C(O)OR (여기서, R은 알킬, 바람직하게는 저급 알킬이다)]로 대체시킬 수 있는 펩티드 모방체를 제조하는데 있어서, 펩티드 산을 제조하는데 사용되는 수지를 이용할 수 있고, 측쇄 보호된 펩티드를 염기 및 적당한 알코올 (예: 메탄올)로 절단시킬 수 있다. 측쇄 보호기는 불화수소로 처리함으로써 통상적인 방식으로 제거하여 목적하는 에스테르를 수득할 수 있다. C-말단 카르복실기를 아미드 --C(O)NR3R4로 대체시킨 펩티드 모방체를 제조하는데 있어서, 벤즈히드릴아민 수지를 펩티드 합성을 위한 고체 지지체로서 사용한다. 이러한 합성이 완료되면, 상기 지지체로부터 펩티드를 방출시키기 위해 불화수소로 처리하면, 유리 펩티드 아미드 (즉, C-말단이 --C(O)NH2이다)가 직접 생성된다. 또 다른 한편, 지지체로부터 측쇄 보호된 펩티드를 절단시키기 위해 암모니아와의 반응과 커플링된 펩티드 합성 동안 클로로메틸화 수지를 사용하면, 유리 펩티드 아미드가 산출되고, 알킬아민 또는 디알킬아민과 반응시키면, 측쇄 보호된 알킬아미드 또는 디알킬아미드가 산출된다 [즉, C-말단이 --C(O)NRR1 (여기서, R 및 R1은 알킬, 바람직하게는 저급 알킬이다)이다]. 그 다음, 불화수소로 처리함으로써 통상적인 방식으로 측쇄 보호를 제거하여 유리 아미드, 알킬아미드 또는 디알킬아미드를 수득한다.
또 다른 대체 양태에서는, C-말단 카르복실기 또는 C-말단 에스테르를, 이러한 카르복실기 또는 에스테르의 --OH 또는 에스테르 (--OR) 각각을 N-말단 아미노기로 전위시킴으로써 사이클화하도록 유도시켜 사이클릭 펩티드를 형성시킬 수 있다. 예를 들어, 합성 및 절단시켜 펩티드 산을 수득한 후, 유리 산을 예를 들어 메틸렌 클로라이드 (CH2Cl2), 디메틸 포름아미드 (DMF) 또는 이들의 혼합물 중의 적당한 카르복실기 활성화제, 예를 들어 디시클로헥실카보디이미드 (DCC)에 의해 용액 중에서 활성화 에스테르로 전환시킨다. 그 다음, 활성화 에스테르를 N-말단 아민으로 전위시킴으로써 사이클릭 펩티드를 형성시킨다. 당해 분야에 널리 공지된 방법에 따라서 극히 묽은 용액을 사용함으로써, 중합 반응 보다는 오히려 사이클화 (고리화) 반응을 증강시킬 수 있다.
당해 분야에서 인지되는 바와 같고 본 발명에 의해 제공된 바와 같은 펩티드 모방체는 본 발명의 펩티드와 구조적으로 유사하지만, 당해 분야에 공지되어 있고 다음 참고 문헌에 추가로 기재된 방법에 의해, --CH2NH--, --CH2S--, --CH2CH2--, --CH=CH- (시스와 트랜스 이형태체 둘 다로 존재한다), --COCH2--, --CH(OH)CH2--, 및 --CH2SO--로 이루어진 군 중에서 선택된 연쇄에 의해 임의로 대체시킨 하나 이상의 펩티드 연쇄를 갖고 있다: [참고: Spatola, Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, (Weinstein, ed.), Marcel Dekker: New York, p. 267, 1983; Spatola, Peptide Backbone Modifications 1:3, 1983; Morley, Trends Pharm. Sci. pp. 463-468, 1980; Hudson, et al., Int. J. Pept. Prot. Res. 14: 177-185, 1979; Spatola, et al., Life Sci. 38: 1243-1249, 1986; Hann, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I 307-314, 1982; Almquist, et al., J. Med. Chem. 23:1392-1398, 1980; Jennings-White, et al., Tetrahedron Lett. 23: 2533, 1982; Szelke, et al., EP045665A; Holladay, et al., Tetrahedron Lett. 24: 4401-4404, 1983; 및 Hruby, Life Sci. 31: 189-199, 1982] (이들 문헌 각각의 전문이 본원에 참고로 도입된다). 이러한 펩티드 모방체는 폴리펩티드 양태에 비해 상당한 이점을 지닐 수 있는데, 이에는 예를 들어, 생산 비용 면에서 보다 경제적이고, 보다 큰 화학적 안정성을 지니거나 증강된 약리학적 특성 (예: 반감기, 흡수율, 효력, 효능 등)을 지니며, 항원성 저하를 나타내며, 기타 특성을 지니는 것이 포함된다.
본 발명의 펩티드의 모방 유사체는 통상적이거나 합리적인 약물 고안 원리를 이용하여 수득할 수도 있다 [참고: 예를 들어, Andrews, et al., Proc. Alfred Benzon Symp. 28: 145-165, 1990; McPherson, Eur. J. Biochem. 189: 1-24, 1990; Hol, et al., in Molecular Recognition: Chemical and Biochemical Problems, (Roberts, ed.); Royal Society of Chemistry; pp. 84-93, 1989a; Hol, Arzneim-Forsch. 39: 1016-1018, 1989b; Hol, Agnew Chem. Int. Ed. Engl. 25: 767-778, 1986; 이들 문헌 각각의 전문이 본원에 참고로 도입된다].
통상적인 약물 고안 방법에 따르면, 그의 구조가 "본래의" 펩티드 구조와 공통의 속성을 지닌 분자를 무작위로 시험함으로써 목적하는 모방체 분자를 수득할 수 있다. 결합성 분자의 특정한 기 상의 변화로부터 비롯되는 정량적인 기여 정도는, 추정상의 모방체의 생물학적 활성을 펩티드의 활성과 비교하여 측정함으로써 결정할 수 있다. 합리적 약물 고안의 한 양태에서는, 해당 펩티드의 가장 안정적인 3차원적 입체 형태의 속성을 공유하도록 모방체를 고안한다. 따라서, 예를 들어 이러한 모방체는 본원에 기재되는 바와 같이, 본 발명의 펩티드에 의해 나타나는 바와 유사한 이온성, 소수성 또는 반 데르 발스 (van der Waals) 상호 작용을 유발시키기에 충분한 방식으로 배향되는 화학기를 보유하도록 고안할 수 있다.
합리적인 모방체 고안을 수행하기 위한 한 가지 방법은 홀(Hol)의 문헌들 (1989a, 1989b 및 1986)에 의해 예시된 바와 같이, 펩티드의 3차원 구조의 표시물을 형성할 수 있는 컴퓨터 시스템을 이용한다. 본 발명의 펩티드의 펩티드-, 유기- 및 화학적 모방체의 분자 구조는 당해 분야에서 시판중인 컴퓨터 이용 고안 프로그램을 사용하여 생성시킬 수 있다. 이러한 프로그램의 예에는 다음이 포함된다: SYBYL 6.5®, HQSAR™, 및 ALCHEMY 2000™ (Tripos); GALAXY™ 및 AM2000™ (공급처: AM Technologies, Inc., San Antonio, TX); CATALYST™ 및 CERIUS™ (공급처: Molecular Simulations, Inc., San Diego, CA); CACHE PRODUCTS™, TSAR™, AMBER™, 및 CHEM-X™ (공급처: Oxford Molecular Products, Oxford, CA) 및 CHEMBUILDER3D™ (공급처: Interactive Simulations, Inc., San Diego, CA).
예를 들어, 당해 분야에 인식되고 있는 분자 모델링 프로그램을 이용하여 본원에 기재된 펩티드를 사용하여 생성시킨 펩티드-, 유기- 및 화학적 모방체는 통상적인 화학적 합성 기술을 이용하여 생성시킬 수 있고, 고 처리능력 스크리닝을 도모하도록 고안할 수 있다 (조합 화학 방법 포함). 본 발명의 펩티드-, 유기- 및 화학적 모방체를 생성시키는데 유용한 조합 방법에는, 예를 들어 다음 공급처에 의해 공급되는 바와 같은 조합 화학 어레이 및 고체 상 합성이 포함된다: SIDDCO (Tuscon, Arizona); Tripos, Inc.; Calbiochem/Novabiochem (San Diego, CA); Symyx Technologies, Inc. (Santa Clara, CA); Medichem Research, Inc. (Lemont, IL); Pharm-Eco Laboratories, Inc. (Bethlehem, PA); 또는 N.V. Organon (Oss, Netherlands). 본 발명의 펩티드-, 유기- 및 화학적 모방체의 조합 화학 생성은 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들면 하기 문헌들에 기재된 기술에 따라 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다: [참고: Terrett, Combinatorial Chemistry, Oxford University Press, London, 1998; Gallop, et al., J. Med. Chem. 37: 1233-51, 1994; Gordon, et al., J. Med. Chem. 37: 1385-1401, 1994; Look, et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 6: 707-12, 1996; Ruhland, et al., J. Amer. Chem. Soc. 118: 253-4, 1996; Gordon, et al., Acc. Chem. Res. 29: 144-54, 1996; Thompson & Ellman, Chem. Rev. 96: 555-600, 1996; Fruchtel & Jung, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35: 17-42, 1996; Pavia, "The Chemical Generation of Molecular Diversity", Network Science Center, www.netsci.org, 1995; Adnan, et al., "Solid Support Combinatorial Chemistry in Lead Discovery and SAR Optimization," Id., 1995; Davies and Briant, "Combinatorial Chemistry Library Design using Pharmacophore Diversity," Id., 1995; Pavia, "Chemically Generated Screening Libraries: Present and Future," Id., 1996; 및 미국 특허 제5,880,972호; 제5,463,564호; 제5,331,573호; 및 5,573,905호].
새로이 합성된 폴리펩티드는 분취 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 실질적으로 정제할 수 있다 [참고: 예를 들어, Creighton, Proteins: Structures And Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York, N. Y., 1983]. 본 발명의 합성 폴리펩티드의 조성은 예를 들어, 에드만 (Edmann) 분해 과정 [Creighton, 상기 문헌]에 의해 아미노산 분석 또는 서열 분석함으로써 확인할 수 있다. 부가적으로, 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열의 모든 부분은 직접적인 합성 동안 변경시킬 수 있고/있거나 화학적 방법을 사용하여 기타 단백질로부터의 서열과 조합하여 변이체 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드를 생성시킬 수 있다.
또한 본 발명에는, 본 발명의 폴리펩티드와 선택적으로 결합하는 항체 및 항체 단편이 포함된다. 당해 분야에 공지된 모든 유형의 항체는 당해 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체를 생성시킬 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "항체"에는 본래의 면역글로불린 분자 뿐만 아니라 본 발명의 폴리펩티드의 에피토프와 결합할 수 있는 그의 단편, 예를 들면, Fab, F(ab')2, 및 Fv가 포함된다. 전형적으로, 에피토프를 형성하기 위해서는 6, 8, 10, 또는 12개 이상의 연속되는 아미노산이 요구된다. 그러나, 비-연속된 아미노산을 포함하는 에피토프는 보다 더 많은 아미노산, 예를 들어 15, 25, 또는 50개 이상의 아미노산을 요구할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체는 치료적으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 면역화학 검정, 예를 들어 웨스턴 블롯 (Western blot), ELISA, 방사성 면역검정, 면역조직화학 검정, 면역침전, 또는 당해 분야에 공지된 기타 면역화학 검정에 사용할 수 있다. 각종 면역검정을 이용하여 목적하는 특이성을 지닌 항체를 확인할 수 있다. 경쟁적 결합 또는 면역방사성 측정 검정을 위한 수 많은 프로토콜이 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 면역검정은 전형적으로, 면역원과 이러한 면역원과 특이적으로 결합하는 항체 간의 복합체 형성을 측정하는 것을 포함한다.
전형적으로, 본 발명의 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체는 면역화학 검정에 사용된 경우에 기타 단백질을 이용하여 제공된 탐지 신호 보다 5, 10 또는 20배 이상 더 높은 탐지 신호를 제공한다. 바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체는 면역화학 검정에서 기타 단백질을 탐지하지 못하며, 용액으로부터 본 발명의 폴리펩티드를 면역침전시킬 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 단편을 사용하여 포유류, 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼, 기니아 피그, 원숭이 또는 인간을 면역시켜 폴리클로날 항체를 생성시킬 수 있다. 경우에 따라, 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 단편을 캐리어 단백질, 예를 들어 소 혈청 알부민, 티로글로불린 및 키홀 림펫 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanin)과 접합시킬 수 있다. 숙주 종에 따라서, 다양한 아주반트를 사용하여 면역학적 반응을 증가시킬 수 있다. 이러한 아주반트에는 프로인트 (Freund) 아주반트, 무기 겔 (예: 수산화알루미늄), 및 표면 활성 물질 (예: 리소레시틴, 다가 폴리올, 다가음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌, 및 디니트로페놀)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 인간에게 사용되는 아주반트 중에서 BCG (칼메트-게랑 간균(bacilli Calmette-Guerin)) 및 코리네박테리움 파르붐 (Corynebacterium parvum)이 특히 유용하다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 단편과 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체는 배양 중인 연속적인 세포주에 의해 항체 분자 생성을 제공해 주는 모든 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 이들 기술에는 하이브리도마 기술, 인간 B 세포 하이브리도마 기술, 및 EBV 하이브리도마 기술이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다 [참고: Kohler, et al., Nature 256: 495-97, 1985; Kozbor, et al., J. Immunol. Methods 81: 3142, 1985; Cote, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 2026-30, 1983; Cole, et al., Mol. Cell Biol. 62: 109-20, 1984].
또한, "키메라 항체"를 생성시키기 위해 개발된 기술인, 마우스 항체 유전자를 인간 항체 유전자에 스플라이싱하여 적당한 항원 특이성과 생물학적 활성을 지닌 분자를 수득하는 기술을 사용할 수 있다 [참고: Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6851-55, 1984; Neuberger, et al., Nature 312: 604-08, 1984; Takeda, et al., Nature 314: 452-54, 1985]. 모노클로날 항체 및 기타 항체를 또한 "인간화"시켜, 이러한 항체가 치료적으로 사용되는 경우에 환자가 이에 대항한 면역 반응을 하지 못하도록 해줄 수 있다. 이러한 항체는 요법에 직접적으로 사용될 정도로 충분히 인간 항체와 서열 면에서 유사할 수 있거나, 또는 몇 가지 주요 잔기의 변경을 요구할 수 있다. 설치류 항체와 인간 항체 간의 서열 상이성은, 인간 서열 중의 잔기와 상이한 잔기를 개개 잔기의 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 대체시키거나, 또는 전체 상보성 결정 영역을 그래이팅(grating)함으로써 최소화할 수 있다. 또 다른 한편, 재조합 방법 [참고: 예를 들어, GB2188638B]을 이용하여 인간화 항체를 생성시킬 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체는 미국 특허 제5,565,332호에 기재된 바와 같이, 부분적으로 또는 완전히 인간화된 항원 결합 부위를 함유할 수 있다.
또 다른 한편, 단일 쇄 항체를 생성시키는 것으로 기재된 기술이 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여, 본 발명의 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 단일 쇄 항체를 생성시키도록 채택될 수 있다. 관련 특이성을 지니긴 하지만, 별개의 이디오타입 조성을 지닌 항체는 무작위 조합 면역글로불린 라이브러리로부터 쇄 셔플링함으로써 생성시킬 수 있다 [참고: Burton, Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 11120-23,1991].
단일 쇄 항체는 또한, 주형으로서 하이브리도마 cDNA를 사용하는 DNA 증폭 방법 (예: PCR)을 사용하여 구축할 수 있다 [참고: Thirion, et al., Eur. J. Cancer Prev. 5: 507-11, 1996]. 단일 쇄 항체는 단일-특이적 또는 이중-특이적일 수 있고, 2가 또는 4가일 수 있다. 4가의 이중-특이적 단일 쇄 항체의 구축이, 예를 들어 문헌 [참고: Coloma & Morrison, Nat. Biotechnol. 15: 159-63, 1997]에 기재되어 있다. 2가의 이중-특이적 단일 쇄 항체의 구축은 문헌 [참고: Mallender & Voss, J. Biol. Chem. 269: 199-206, 1994]에 기재되어 있다.
단일 쇄 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 다음에 기재되는 바와 같이, 수동 또는 자동화 뉴클레오티드 합성을 이용하여 구축하고, 이를 표준 재조합 DNA 방법을 이용하여 발현 구조물 내로 클로닝한 다음, 세포 내로 도입하여 암호화 서열을 발현시킬 수 있다. 또 다른 한편, 단일 쇄 항체는, 예를 들어 필라멘트상 파아지 기술을 이용하여 직접 생성시킬 수 있다 [참고: Verhaar, et al., Int. J. Cancer 61: 497-501, 1995; Nicholls, et al., J. Immunol. Meth. 165: 81-91, 1993].
본 발명의 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체는 또한, 림프구 집단에서 생체내 생성을 유도시킴으로써, 또는 다음 문헌에 기재된 바와 같은 고 특이적 결합 시약의 면역글로불린 라이브러리 또는 패널을 스크리닝함으로써 생성시킬 수 있다 [참고: Orlandi, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 38333-37, 1989; Winter, et al., Nature 349: 293-99, 1991].
기타 유형의 항체를 구축할 수 있고, 이를 본 발명의 방법에 치료적으로 사용할 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체는 WO 93/03151에 기재된 바와 같이 구축할 수 있다. 면역글로불린으로부터 유래되고 다가 및 다중-특이적인 결합성 단백질, 예를 들어 "디아보디 (diabody)"를 제조할 수도 있다 [참고: 예를 들어, WO 94/13804].
본 발명의 폴리펩티드와 결합할 수 있는 능력을 지니고 있는 인간 항체를, 다음과 같이 MorphoSys HuCAL® 라이브러리로부터 확인할 수도 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 미세역가 판 상에 피복시키고, 이를 MorphoSys HuCAL® Fab 파아지 라이브러리와 함께 항온 배양할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드와 결합하지 않는 파아지-연결된 Fab를 상기 판으로부터 세척 제거하여, 본 발명의 폴리펩티드와 단단하게 결합하고 있는 파아지 만을 잔존시킨다. 이와 같이 결합된 파아지를, 예를 들어 pH 변화시키거나 이. 콜라이로 용출시킴으로써 용출시킬 수 있고, 이. 콜라이 숙주 감염에 의해 증폭시킬 수 있다. 이러한 패닝(panning) 과정을 1회 또는 2회 반복하여 본 발명의 폴리펩티드와 단단하게 결합하고 있는 항체 집단을 강화시킬 수 있다. 그 다음, 이와 같이 강화된 풀로부터의 Fab를 발현 및 정제하고, ELISA 검정에서 스크리닝한다.
본 발명에 따르는 항체는 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 정제할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드가 결합되어 있는 칼럼 전반에 걸쳐 통과시킴으로써 항체를 친화성 정제할 수 있다. 이어서, 결합된 항체를 고 염 농도의 완충 용액을 이용하여 칼럼으로부터 용리시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 각종 용어는 다음과 같이 정의된다.
본 발명의 요소 또는 그의 바람직한 양태(들)을 도입하는 경우, 관사 (접두어) "하나의(a)", "하나의(an)", "그(the)" 및 "상기"는 해당 요소들 하나 이상이 존재한다는 것을 의미하고자 함이다. 용어 "포함하는", "포함되는" 및 "갖는"은 포괄적이며, 열거된 요소들 이외에도 부가의 요소가 존재할 수 있다는 것을 의미하고자 함이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "대상체"에는 포유류 (예: 인간 및 동물)이 포함된다.
용어 "치료 (처치)"에는 인간을 포함한 대상체의 질환을 직접 또는 간접적으로 개선시키거나 또는 대상체 내의 특정 질환이나 장애의 진행을 느리게할 목적으로, 상기 대상체에게 의료 원조를 제공하는 모든 과정, 작용, 적용, 요법 등이 포함된다.
용어 "병용 요법" 또는 "공동-요법"은 특정 질환 및/또는 장애를 치료하기 위해 2 가지 이상 치료제를 투여하는 것을 의미한다. 이러한 투여는 실질적으로 동시에 투여되는 방식으로, 예를 들면 고정 비의 활성 성분을 갖는 단일 캡슐로, 또는 각 억제제에 대한 여러 별개의 캡슐로 2 가지 이상 치료제를 공동-투여하는 것을 포괄한다. 또한, 상기 투여는 각 유형의 치료제를 순차적인 방식으로 사용하는 것을 포괄한다.
용어 "치료적으로 유효한"이란, 소정의 치료적 처치와 연관된 불리한 부작용을 피하거나 최소화시키면서, 당뇨병 질환 또는 장애 중증도 개선 목적을 달성시켜 줄, 각 약제의 투여량을 의미한다.
용어 "제약상 허용 가능한"이란 대상 물질이 제약 생성물에 사용하기 적당하다는 것을 의미한다.
본 발명의 폴리펩티드는 시험관 내에서 췌장 섬 세포로부터의 인슐린 분비를 자극할 수 있는 능력이 있고 생체 내에서 혈당 감소를 유발시킬 수 있기 때문에, 유형 2 당뇨병 (비-인슐린 의존성 진성 당뇨병)을 포함한 당뇨병을 치료하는데 이용할 수 있다. 이러한 치료는 당뇨병 및 당뇨병 합병증의 발병을 지연시킬 수도 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 사용하여 내당능 이상을 나타내는 대상체가 그 증상이 진행되어 유형 2 당뇨병을 발병하지 못하도록 할 수 있다. 본 발명의 방법에서 본 발명의 펩티드를 이용하여 치료 또는 예방할 수 있는 기타 질병 및 질환에는 아이들의 성인 당뇨병 (MODY) [참고: Herman, et al., Diabetes 43: 40, 1994]; 잠재성 성인 자가면역 당뇨병 (LADA) [참고: Zimmet, et al., Diabetes Med. 11: 299, 1994]; 내당능 이상 (IGT) [참고: Expert Committee on Classification of Diabetes Mellitus, Diabetes Care 22 (Supp. 1):S5, 1999]; 공복 글루코스 장애 (IFG) [참고: Charles, et al., Diabetes 40: 796, 1991]; 임신성 당뇨병 [참고: Metzger, Diabetes, 40: 197, 1991]; 및 대사 증후군 X가 포함된다.
본 발명의 폴리펩티드는 또한, 비만과 같은 장애에 유효할 수 있고; 아테롬성 경화증, 고지질혈증, 고콜레스테롤혈증, 저 HDL 수치, 고혈압, 심혈관계 질환 (아테롬성 경화증, 관상 심장 질환, 관상 동맥 질환 및 고혈압 포함), 뇌혈관계 질환 및 말초 혈관 질환을 치료하는데 유효할 수 있으며; 루푸스, 다낭성 난소 증후군, 발암 현상, 및 과다형성, 천식, 남성 생식 문제, 궤양, 수면 장애, 지질 및 탄수화물 대사 장애, 일주기성 기능장애, 성장 장애, 에너지 생체 항상성 장애, 면역 질환 [자가면역 질환 (예: 전신성 홍반성 루푸스) 포함] 뿐만 아니라 급성 및 만성 염증 질환, 및 패혈성 쇽의 치료에 유효할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 또한, 예를 들어 지질 축적성 세포를 생산하기 위한 세포 분화; 예를 들어, 비정상적인 췌장성 β-세포 기능, 인슐린 분비성 종양 및/또는 인슐린에 대한 자가항체, 인슐린 수용체에 대한 자가항체 또는 췌장성 β-세포에 자극성인 자가항체로 인한 자가면역 저혈당증에 관여하는 인슐린 민감성 및 혈당치 조절; 아테롬성 경화증성 플라크 형성을 유발시키는 대식세포 분화; 염증성 반응; 발암 현상, 과다형성; 지방세포 유전자 발현; 지방세포 분화; 췌장성 β-세포 질량 감소; 인슐린 분비; 인슐린에 대한 조직 민감성; 지방육종 세포 성장; 다낭성 난소 증후군; 만성 무배란; 고안드로겐혈증; 프로게스테론 생성; 스테로이드생성; 세포에서 산화환원 전위 및 산화적 스트레스; 산화질소 신타제 (NOS) 생성; 감마 글루타밀 트랜스펩티다제, 카탈라제, 혈장 트리글리세라이드, HDL 및 LDL 콜레스테롤 수치 증가 등과 관계가 있는 생리학적 장애를 치료하는데 유용할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 또한, 당뇨병의 이차 원인을 치료하기 위해 본 발명의 방법에 사용할 수 있다 [참고: Expert Committee on Classification of Diabetes Mellitus, Diabetes Care 22 (Supp. 1):S5, 1999]. 이러한 이차 원인에는 글루코코르티코이드 과다, 성장 호르몬 과다, 크롬친화세포종 (pheochromocytoma), 및 약물-유도성 당뇨병이 포함된다. 당뇨병을 유도시킬 수 있는 약물에는 피리미닐, 니코틴산, 글루코코르티코이드, 페니토인, 갑상선 호르몬, β-아드레날린제, α-인터페론, 및 HIV 감염을 치료하기 위해 사용되는 약물이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드는 천식 치료 [문헌 (참고: Bolin, et al., Biopolymer 37: 57-66, 1995; 미국 특허 제5,677,419호); 폴리펩티드 R3P0이 이완성 기니아 피그 기관지 평활근에서 활성이라는 것을 보여준다]; 저혈압 유도 (VIP는 천식 환자에게서 저혈압, 빈맥 (tachycardia), 및 안면 홍조를 유도시킨다) [참고: Morice, et al., Peptides 7: 279-280, 1986; Morice, et al., Lancet 2: 1225-1227, 1983]; 남성 생식 문제 [참고: Siow, et al., Arch. Androl. 43 (1): 67-71, 1999]; 항-세포사멸/신경보호제로서 [참고: Brenneman, et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 865: 207-12, 1998]; 허혈성 사건 동안 심장 보호 [참고: Kalfin, et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 1268 (2): 952-8, 1994; Das, et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 865: 297-308, 1998], 일주기 시계 조작 및 그와 연관된 장애 [참고: Hamar, et al., Cell 109: 497-508, 2002; Shen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 11575-80, 2000]; 및 최종적으로 항궤양제로서 [참고: Tuncel, et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 865: 309-22, 1998] 사용할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 단독으로 사용할 수 있거나, 또는 당뇨병 및 관련 장애를 치료하는데 있어 당업자에게 공지된 부가 요법 및/또는 화합물과 병용해서 사용할 수 있다. 또 다른 한편, 본원에 기재된 방법 및 폴리펩티드는 부분적으로 또는 완전히 병용 요법으로 사용할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 또한, 당뇨병을 치료하는 것으로 공지된 기타 요법과 병용해서 투여할 수 있는데, 이러한 기타 요법에는 PPAR 작용제, 설포닐우레아 약물, 비-설포닐우레아 분비촉진제, α-글루코시다제 억제제, 인슐린 감작제, 인슐린 분비촉진제, 간 내에서의 글루코스 생산 저하성 화합물, 인슐린 및 항비만 약물이 포함된다. 이러한 요법은 본 발명의 폴리펩티드를 투여하기 이전, 투여와 동시 또는 투여 후에 투여할 수 있다. 인슐린에는 장기간 작용하는 형태 및 제형의 인슐린과 단기간 작용하는 형태 및 제형의 인슐린 둘 다가 포함된다. PPAR 작용제에는 PPAR 소단위체 또는 그의 조합물 모두의 작용제가 포함될 수 있다. 예를 들어, PPAR 작용제에는 PPAR-α, PPAR-γ, PPAR-δ, 또는 PPAR 소단위체의 2개 또는 3개의 조합물의 작용제가 포함될 수 있다. PPAR 작용제에는, 예를 들어 로시글리타존, 트로글리타존 및 피오글리타존이 포함된다. 설포닐우레아 약물에는, 예를 들어 글리부리드, 글리메피리드, 클로르프로파미드, 톨부타미드 및 글리피지드가 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드와 함께 투여된 경우에 당뇨병을 치료하는데 유용할 수 있는 α-글루코시다제 억제제에는 프레코스 (Precose®), 미글리톨 (Miglitol®), 및 보글리보스 (Voglibose™)가 포함된다. 당뇨병을 치료하는데 유용할 수 있는 인슐린 감작제에는 PPAR-γ 작용제, 예를 들어 글리타존 (예: 트로글리타존, 피오글리타존, 엔글리타존, MCC-555, 로시글리타존 등); 비구아니드, 예를 들어 메트포르민 및 펜포르민; 단백질 티로신 포스파타제-1B (PTP-1B) 억제제; 디펩티딜 펩티다제 IV (DP-IV) 억제제; 및 티아졸리딘디온 및 비-티아졸리딘디온이 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드와 함께 투여된 경우에 당뇨병을 치료하는데 유용할 수 있는 간 내에서의 글루코스 생산 저하성 화합물에는 메트포르민, 예를 들어 글루코파아지® 및 글루코파아지 XR®이 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드와 함께 투여된 경우에 당뇨병을 치료하는데 유용할 수 있는 인슐린 분비촉진제에는 설포닐우레아 및 비-설포닐우레아 약물; GLP-1, GIP, 세크레틴, 나테글리니드, 메글리티니드, 레파글리니드, 글리벤클라미드, 글리메피리드, 클로르프로파미드, 글리피지드가 포함된다. GLP-1에는 본래의 GLP-1 보다 반감기가 더 긴 GLP-1의 유도체, 예를 들어 지방산 유도체화 GLP-1 및 엑센딘이 포함된다. 본 발명의 한 양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 인슐린 분비촉진제에 대한 췌장성 β-세포의 민감도를 증가시키기 위해 인슐린 분비촉진제와 병용해서 사용한다.
본 발명의 폴리펩티드는 항비만 약물과 병용해서 본 발명의 방법에 사용할 수도 있다. 항비만 약물에는 β-3 작용제; CB-1 길항제; 뉴로펩티드 Y 억제제; 식욕 억제제, 예를 들어 시부트라민 (Meridia®, Abbott Laboratories); 및 리파제 억제제, 예를 들어 오를리스타트 (Xenical®, Roche Pharmaceutical)가 포함된다.
본 발명의 폴리펩티드는 또한, 당뇨병 환자에게서 지질 장애를 치료하기 위해 통상 사용되고 있는 약물과 병용해서 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 이러한 약물에는 HMG-CoA 리덕타제 억제제, 니코틴산, 지질 저하 약물 (예: 스타놀 에스테르, 스테롤 글리코시드, 예를 들어 티퀘시드, 및 아제티디논, 예를 들어 에제티미베), ACAT 억제제 [예: 아바시미베 (avasimibe)], 담즙산 제어제, 담즙산 재흡수 억제제, 미크로솜성 트리글리세라이드 수송 억제제, 및 피브르산 유도체가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. HMG-CoA 리덕타제 억제제에는, 예를 들어 로바스타틴, 심바스타틴, 프라바스타틴, 플루바스타틴, 아토르바스타틴, 리바스타틴, 이타바스타틴, 세리바스타틴 및 ZD-4522가 포함된다. 피브르산 유도체에는, 예를 들어 클로피브레이트, 페노피브레이트, 벤자피브레이트, 시프로피브레이트, 베클로피브레이트, 에토피브레이트, 및 겜피브로질이 포함된다. 제어제에는, 예를 들어 콜레스티라민, 콜레스티폴, 및 가교결합된 덱스트란의 디알킬아미노알킬 유도체가 포함된다.
본 발명의 폴리펩티드는 또한, 항고혈압 약물, 예를 들어 β-차단제 및 ACE 억제제와 병용해서 사용할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드와 병용해서 사용하기 위한 부가의 항고혈압 약제의 예에는 칼슘 채널 차단제 (L-유형 및 T-유형; 예를 들면, 딜티아젬, 베라파밀, 니페디핀, 암로디핀 및 미베프라딜), 이뇨제 (예: 클로로티아지드, 히드로클로로티아지드, 플루메티아지드, 히드로플루메티아지드, 벤드로플루메티아지드, 메틸클로로티아지드, 트리클로로메티아지드, 폴리티아지드, 벤즈티아지드, 에타크린산 트리크리나펜, 클로르탈리돈, 푸로세미드, 무솔리민, 부메타니드, 트리암트레넨, 아밀로리드, 스피로놀락톤), 레닌 억제제, ACE 억제제 (예: 카프토프릴, 조페노프릴, 포시노프릴, 에날라프릴, 세라노프릴, 실라조프릴, 델라프릴, 펜토프릴, 퀴나프릴, 라미프릴, 리시노프릴), AT-1 수용체 길항제 (예: 로사르탄, 이르베사르탄, 발사르탄), ET 수용체 길항제 (예: 시탁센탄, 아트르센탄), 중성 엔도펩티다제 (NEP) 억제제, 바소펩시다제 억제제 (이중 NEP-ACE 억제제) (예: 오마파트릴라트 및 게모파트릴라트) 및 니트레이트가 포함된다.
이러한 공동-요법은 2 가지 이상 약물을 병용해서 투여할 수 있다 (예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드를 인슐린 감작제 및 항비만 약물과 병용해서 투여한다). 이러한 공동-요법은 상기 언급된 바와 같이, 제약 조성물 형태로 투여할 수 있다.
앞서 포유류에서 확인된 질환을 치료하기 위한 효능을 결정하기 위해 사용되는 것으로 널리 공지된 검정에 기초하고, 이들 결과를 상기 질환을 치료하기 위해 사용되는 공지된 의약 결과와 비교함으로써, 목적하는 각 증상을 치료하는데 유효한, 본 발명의 폴리펩티드의 투여량을 용이하게 결정할 수 있다. 이들 질환 중의 한 가지를 치료하는데 있어 투여될 활성 성분 (예: 폴리펩티드)의 양은 이용된 특정한 폴리펩티드 및 투여 단위, 투여 방식, 치료 기간, 치료받는 환자의 연령 및 성별, 및 치료하고자 하는 질환의 종류과 정도와 같은 요인들을 고려하여 광범위하게 다양할 수 있다.
투여될 활성 성분의 총 량은 일반적으로, 1일 약 0.00001 mg/체중 kg 내지 약 1 mg/체중 kg, 바람직하게는 1일 0.0001 mg/체중 kg 내지 0.1 mg/체중 kg의 범위일 수 있다. 단위 투여량은 활성 성분을 약 0.01 mg 내지 약 20 mg 함유할 수 있고, 매주 1회 이상 투여할 수 있다. 주사 투여 (정맥내, 근육내, 피하 및 비경구 주사 포함) 및 주입 투여하기 위한 매주 투여량은 약 0.0001 내지 약 0.1 mg/kg일 수 있다. 1일 직장 투약법은 총 체중 kg당 0.001 내지 1 mg일 수 있다. 경피 농도는 0.001 내지 1 mg/kg의 1일 용량을 유지하는데 요구되는 것일 수 있다.
물론, 각 환자에 대한 구체적인 초기 투약법과 지속적인 투약법은 담당의의 진단에 의해 결정된 바와 같은 해당 질환의 종류 및 중증도, 이용된 구체적인 폴리펩티드의 활성, 환자의 연령, 환자의 식이, 투여 시간, 투여 경로, 약물 배출 속도, 약물 병용 등에 따라서 다양할 것이다. 바람직한, 본 발명의 폴리펩티드의 투여 횟수 및 치료 방식은 통상적인 치료 시험을 이용하여 당업자에 의해 확인될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는, 이를 필요로 하는 환자에게 적당하게 제형화된 제약 조성물 형태로 투여함으로써 목적하는 약리학적 효과를 달성하기 위해 활용될 수 있다. 본 발명의 목적상, 특정 질환이나 질병에 대한 치료를 필요로 하는 환자는 포유류 (인간 포함)이다. 따라서, 본 발명은 제약상 허용 가능한 담체와 치료적 유효량의 폴리펩티드로 구성되는 제약 조성물을 포함한다. 제약상 허용 가능한 담체는 이러한 담체로 인한 어떠한 부작용도 활성 성분의 유익한 효과를 떨어뜨리지 않도록 활성 성분의 유효 활성과 일치되는 농도에서 환자에게 비교적 무독성이고 무해한 모든 담체이다. 치료적 유효량의 폴리펩티드는 치료받고자 하는 특정한 질환에 대해 일정 영향을 발휘하거나 결과를 가져다 주는 양이다. 본원에 기재된 폴리펩티드는 통상적인 모든 유효한 투여 단위 형태 (이에는, 예를 들어 즉시 방출형 및 지속 방출형 제제, 경구, 비경구, 국소용 제제 등이 포함된다)를 이용하여 제약상 허용 가능한 담체와 함께 투여할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 제약상 허용 가능한 계면활성제, 예를 들어 비누 또는 세정제, 현탁화제, 예를 들어 펙틴, 카르보머, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스 또는 카르복시메틸셀룰로스, 또는 유화제 및 기타 제약 아주반트를 부가하거나 부가하지 않으면서, 멸균성 액상물 또는 액상물의 혼합물, 예를 들어 물, 식염수, 수성 덱스트로스 및 관련 당 용액; 알코올, 예를 들어 에탄올, 이소프로판올 또는 헥사데실 알코올; 글리콜, 예를 들어 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜; 글리세롤 케탈, 예를 들어 2,2-디메틸-1,1-디옥솔란-4-메탄올, 에테르, 예를 들어 폴리(에틸렌글리콜) 400; 오일; 지방산; 지방산 에스테르 또는 글리세라이드; 또는 아세틸화 지방산 글리세라이드일 수 있는 제약 담체를 수반한 생리학적으로 허용 가능한 희석제 중의 본 발명의 폴리펩티드의 주사 투여제로서 비경구적으로, 즉 정맥내, 근육내, 복강내, 또는 바람직하게는 피하 투여할 수 있다.
본 발명의 비경구 제형에 사용될 수 있는 오일의 예는 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원 오일, 예를 들면, 땅콩유, 대두유, 참깨유, 면실유, 옥수수유, 올리브유, 광유 및 광물유이다. 적합한 지방산에는 올레산, 스테아르산 및 이소스테아르산이 포함된다. 적합한 지방산 에스테르는, 예를 들어 에틸 올레에이트 및 이소프로필 미리스테이트이다. 적합한 비누에는 지방 알칼리 금속, 암모늄 및 트리에탄올아민 염이 포함되고, 적합한 세정제에는 양이온성 세정제, 예를 들어 디메틸 디알킬 암모늄 할라이드, 알킬 피리디늄 할라이드 및 알킬아민 아세테이트; 음이온성 세정제, 예를 들어 알킬, 아릴 및 올레핀 설포네이트, 알킬, 올레핀, 에테르 및 모노글리세라이드 설페이트, 및 설포숙시네이트; 비이온성 세정제, 예를 들어 지방 아민 옥사이드, 지방산 알칸올아미드 및 폴리옥시에틸렌폴리프로필렌 공중합체; 및 양쪽성 세정제, 예를 들어 알킬-베타-아미노프로피오네이트 및 2-알킬이미다졸린 4급 암모늄 염 뿐만 아니라 이들의 혼합물이 포함된다.
본 발명의 비경구용 조성물은 전형적으로, 용액 중에 활성 성분을 약 0.5 내지 약 25 중량% 함유할 수 있다. 방부제 및 완충제를 유리하게 사용할 수도 있다. 주사 부위에서의 자극을 최소화하거나 피하기 위해서는, 상기 조성물이 친수성-소수성 밸런스 (HLB)가 약 12 내지 약 17인 비이온성 계면활성제를 함유할 수 있다. 이러한 제형 내에서 계면활성제의 양은 약 5 내지 약 15 중량%의 범위이다. 계면활성제는 상기 HLB를 갖는 단일 성분일 수 있거나, 또는 목적하는 HLB를 갖는 2 가지 이상 성분의 혼합물일 수 있다.
비경구용 제형에 사용되는 계면활성제의 예는 폴리에틸렌 솔비탄 지방산 에스테르 부류, 예를 들어 솔비탄 모노올레에이트, 및 프로필렌 옥사이드와 프로필렌 글리콜을 축합 반응시켜 형성된, 에틸렌 옥사이드와 소수성 염기와의 고분자량 부가물이다.
제약 조성물은 멸균성 주사용 수성 현탁제의 형태일 수 있다. 이러한 현탁제는 적합한 분산 또는 습윤제 및 현탁화제, 예를 들어 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸-셀룰로스, 나트륨 알지네이트, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸드 검 및 아카시아 검; 천연 발생적 포스파티드일 수 있는 분산제 또는 습윤제, 예를 들어 레시틴, 알킬렌 옥사이드와 지방산의 축합 생성물, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 에틸렌 옥사이드와 장쇄 지방족 알코올의 축합 생성물, 예를 들어 헵타데카에틸렌옥시세타놀, 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨로부터 유래된 부분 에스테르의 축합 생성물, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 솔비톨 모노올레에이트, 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유래된 부분 에스테르의 축합 생성물, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노올레에이트를 사용하여, 공지된 방법에 따라서 제형화할 수 있다.
멸균성 주사제는 또한, 비경구적으로 허용 가능한 무독성 희석제 또는 용매 중의 멸균성 주사용 용액제 또는 현탁제일 수 있다. 이용될 수 있는 희석제 및 용매는, 예를 들어 물, 링거액, 및 등장성 염화나트륨 용액이다. 또한, 멸균성 고정유가 용매 또는 현탁화 매질로서 통상적으로 이용된다. 이를 위해, 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함한 모든 블랜드의 고정유가 이용될 수 있다. 또한, 지방산, 예를 들어 올레산을 주사제에 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 해당 약물을 직장 투여하기 위한 좌제 형태로 투여할 수도 있다. 이들 조성물은 정상 온도에서는 고체지만 직장 온도에서는 액체이므로, 직장에서 용융되어 약물을 방출시키는데 적합한 비-자극 부형제를 약물 (예: 폴리펩티드)과 혼합함으로써 제조할 수 있다. 이러한 물질은, 예를 들어 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜이다.
본 발명의 방법에 이용된 또 다른 제형은 경피 전달 장치 ("패치")를 이용한다. 이러한 경피용 패치를 사용하여, 제어된 양의 본 발명의 폴리펩티드를 연속적 또는 비연속적으로 주입할 수 있다. 약제를 전달하기 위한 경피용 패치의 구축 및 사용은 당해 분야에 널리 공지되어 있다 [본원에 참고로 도입된 미국 특허 제5,023,252호 참고]. 이러한 패치는 약제를 연속적, 박동적, 또는 수요에 따라 전달하기 위해 구축할 수 있다.
제약 조성물을 기계적 전달 장치를 통하여 환자에게 도입하는 것이 바람직하거나 필요할 수 있다. 약제를 전달하기 위한 기계적 전달 장치의 구축 및 사용은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 특정 약물을 뇌에 직접적으로 투여하기 위한 직접적인 기술은 통상적으로, 약물 전달 카테터를 환자의 심실계에 놓아두어 혈액-뇌 장벽을 우회하도록 하는 것을 포함한다. 약제를 신체의 구체적 해부학적 부위에 수송하기 위해 사용되는, 한 가지 이식 가능한 전달 시스템이 미국 특허 제5,011,472호 (본원에 참고로 도입된다)에 기재되어 있다.
본 발명의 조성물은 또한, 필요에 따라, 일반적으로 담체 또는 희석제로서 지칭되는 기타 통상적인 제약상 허용 가능한 화합 성분을 함유할 수 있다. 모든 본 발명의 조성물은 아스코르브산과 같은 산화방지제를 부가하거나 기타 적합한 방부제에 의해 보존시킬 수 있다. 이러한 조성물을 적당한 투여 형태로 제조하기 위한 통상적인 과정을 활용할 수 있다.
조성물을 그의 의도하는 투여 경로용으로 제형화하기에 적당한 바 대로 사용할 수 있는, 통상적으로 사용되는 제약 성분에는 산성화제, 예를 들어 아세트산, 시트르산, 푸마르산, 염산, 질산 (단, 이들에 한정되지 않음); 및 알칼리화제, 예를 들어 암모니아 용액, 탄산암모늄, 디에탄올아민, 모노에탄올아민, 수산화칼륨, 붕산나트륨, 탄산나트륨, 수산화나트륨, 트리에탄올아민, 트롤아민 (단, 이들에 한정되지 않음)이 포함된다.
기타 제약 성분에는, 예를 들어 흡착제 (예: 분말상 셀룰로스 및 활성화 목탄); 에어로솔 추진체 (예: 이산화탄소, CCl2F2, F2ClC-CClF2 및 CClF3); 배기제 (air displacement agents) (예: 질소 및 아르곤); 항진균성 방부제 (예: 벤조산, 부틸파라벤, 에틸파라벤, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 나트륨 벤조에이트); 항미생물성 방부제 (예: 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 벤질 알코올, 세틸피리디늄 클로라이드, 클로로부탄올, 페놀, 페닐에틸 알코올, 페닐머큐릭 니트레이트 및 티메로살); 산화방지제 (예: 아스코르브산, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 차아인산 (hypophosphorous acid), 모노티오글리세롤, 프로필 갈레이트, 나트륨 아스코르베이트, 중아황산나트륨, 나트륨 포름알데히드 설폭실레이트, 나트륨 메타비설파이드); 결합 물질 (예: 블록 중합체, 천연 및 합성 고무, 폴리아크릴레이트, 폴리우레탄, 실리콘 및 스티렌-부타디엔 공중합체); 완충제 (예: 칼륨 메타포스페이트, 1가 인산칼륨, 나트륨 아세테이트, 나트륨 시트레이트 무수물 및 나트륨 시트레이트 이수화물); 운반제 (예: 아카시아 시럽, 방향족 시럽, 방향족 엘릭서, 체리 시럽, 코코아 시럽, 오렌지 시럽, 시럽, 옥수수유, 광물유, 땅콩유, 참깨유, 세균증식 억제성 염화나트륨 주사액 및 세균증식 억제성 주사용 수); 킬레이트제 (에: 에데테이트 이나트륨 및 에데트산); 착색제 (예: FD&C 적색 제3호, FD&C 적색 제20호, FD&C 황색 제6호, FD&C 청색 제2호, D&C 녹색 제5호, D&C 오렌지색 제5호, D&C 적색 제8호, 카라멜 및 산화철 적색); 정화제 (예: 벤토나이트); 유화제 (예를 들면, 아카시아, 세토마크로골, 세틸 알코올, 글리세릴 모노스테아레이트, 레시틴, 솔비탄 모노올레에이트, 폴리에틸렌 50 스테아레이트가 있지만, 이에 제한되지 않는다); 피막형성제 (예: 젤라틴 및 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트); 향미제 (예: 아니스 오일, 시나몬 오일, 코코아, 멘톨, 오렌지 오일, 페퍼민트 오일 및 바닐린); 보습제 (예: 글리세린, 프로필렌 글리콜 및 솔비톨); 연화제 (예: 광물유 및 글리세린); 오일 (예: 아라키스 오일, 광물유, 올리브유, 땅콩유, 참깨유 및 식물성 오일); 연고 기제 (예: 라놀린, 친수성 연고, 폴리에틸렌 글리콜 연고, 광유, 친수성 광유, 백색 연고, 황색 연고 및 장미 수 연고); 침투 증강제 (경피 전달) (예: 모노히드록시 또는 폴리히드록시 알코올, 포화 또는 불포화 지방 알코올, 포화 또는 불포화 지방 에스테르, 포화 또는 불포화 디카르복실산, 정유 (essential oil), 포스파티딜 유도체, 세팔린, 테르펜, 아미드, 에테르, 케톤 및 우레아); 가소제 (예: 디에틸 프탈레이트 및 글리세린); 용매 (예: 알코올, 옥수수유, 면실유, 글리세린, 이소프로필 알코올, 광물유, 올레산, 땅콩유, 정제수, 주사용수, 주사용 멸균수 및 관주용 멸균수); 경화제 (stiffening agent) (예: 세틸 알코올, 세틸 에스테르 왁스, 미세결정성 왁스, 파라핀, 스테아릴 알코올, 백색 왁스 및 황색 왁스); 좌제 기제 (예: 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜 (혼합물)); 계면활성제 (예: 벤즈알코늄 클로라이드, 모녹시놀 10, 옥스톡시놀 9, 폴리솔베이트 80, 나트륨 라우릴 설페이트 및 솔비탄 모노팔미테이트); 현탁화제 (예: 한천, 벤토나이드, 카르보머, 카르복시메틸셀룰로스 나트륨, 히드록시에틸 셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 카올린, 메틸셀룰로스, 트라가칸트 및 비굼); 감미제 (예: 아스파르탐, 덱스트로스, 글리세린, 만니톨, 프로필렌 글리콜, 사카린 나트륨, 솔비톨 및 슈크로스); 정제 항-접착제 (예: 마그네슘 스테아레이트 및 탈크); 정제 결합제 (예: 아카시아, 알진산, 카르복시메틸셀룰로스 나트륨, 압축성 당, 에틸셀룰로스, 젤라틴, 액상 글루코스, 메틸셀룰로스, 포비돈 및 예비젤라틴화 전분); 정제 및 캅셀제 희석제 (예: 2가 인산칼슘, 카올린, 락토스, 만니톨, 미세결정성 셀룰로스, 분말상 셀룰로스, 침전형 탄산칼슘, 탄산나트륨, 인산나트륨, 솔비톨 및 전분); 정제 피복제 (예: 액상 글루코스, 히드록시에틸 셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트 및 쉘락); 정제 직접 압축용 부형제 (예: 2가 인산칼슘); 정제 붕해제 (예: 알진산, 카르복시메틸셀룰로스 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴라크릴린 칼륨, 나트륨 알지네이트, 나트륨 전분 글리콜레이트 및 전분); 정제 활탁제 (예: 콜로이드상 실리카, 옥수수 전분 및 탈크); 정제 윤활제 (예: 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 스테아르산 및 아연 스테아레이트); 정제/캅셀제 불투명화제 (예: 이산화티탄); 정제 연마제 (예: 카누바 왁스 및 백색 왁스); 증점제 (예: 밀랍, 세틸 알코올 및 파라핀); 등장성제 (예: 덱스트로스 및 염화나트륨); 점도 증가제 (예: 알진산, 벤토나이트, 카르보머, 카르복시메틸셀룰로스 나트륨, 메틸셀룰로스, 포비돈, 나트륨 알지네이트 및 트라가칸트); 및 습윤제 (예: 헵타데카에틸렌 옥시세타놀, 레시틴, 폴리에틸렌 솔비톨 모노올레에이트, 폴리옥시에틸렌 솔비톨 모노올레에이트, 및 폴리옥시에틸렌 스테아레이트)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 기재된 폴리펩티드는 단독 약제로서 투여할 수 있거나, 또는 병용이 허용되지 않는 불리한 효과를 유발시키지 않는 경우에는 한 가지 이상 기타 약제와 병용해서 투여할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드는 공지된 항비만제, 또는 공지된 항당뇨병제 또는 기타 지시제 등 뿐만 아니라 이들의 혼합물 및 조합물과 병용할 수 있다.
본원에 기재된 폴리펩티드는 또한, 유리 염기 형태 또는 조성물로 활용될 수 있거나, 연구 및 진단에 활용될 수 있거나, 또는 분석용 기준 표준물 등으로서 활용될 수 있다. 따라서, 본 발명에는 불활성 담체 및 본원에 기재된 방법에 의해 확인된 폴리펩티드 또는 그의 염 또는 에스테르의 유효량으로 구성되는 조성물이 포함된다. 불활성 담체는 운반될 폴리펩티드와 상호 작용하지 않고, 운반될 폴리펩티드에 지지체, 운송 수단, 벌크, 추적 가능한 물질 등을 제공해주는 모든 물질이다. 폴리펩티드의 유효량은 수행되는 특정한 과정에 대해 영향을 발휘하거나 결과를 가져다 주는 양이다.
폴리펩티드는 수성 및 비-수성 환경 하에서 가수분해, 탈아미드화, 산화, 라세미화 및 이성체화를 진행하는 것으로 공지되어 있다. 분해, 예를 들어 가수분해, 탈아미드화 또는 산화는 모세관 전기영동, 질량 분광측정법 또는 에드만 분해에 의해 용이하게 탐지할 수 있다. 효소적 분해에도 불구하고, 혈장 반감기가 연장되나 생물학적 체류 시간이 연장된 폴리펩티드는 최소한 수용액 중에서 안정해야 한다. 폴리펩티드가 체온에서 하루 동안 10% 미만 정도의 분해를 나타내야 하는 것이 필수적이다. 폴리펩티드가 체온에서 하루 동안 5% 미만 분해되는 것이 보다 바람직하다. 만성 당뇨병 환자는 평생 치료을 받아야 하기 때문에, 훨씬 더 바람직하게는, 이들 치료제를 비경구 경로로 투여하는 경우에는 이를 아주 가끔씩 투여하는 것이 간편하다. 체온에서 수주에 걸쳐 안정한 것은 (즉, 수 % 미만의 분해를 나타냄) 투약 횟수를 줄여줄 것이다. 수일 내지 수주에 걸쳐 혈장에서 또는 DPP4에 관해서는 단백질분해를 통한 분해에 대해 안정한 것은 (즉, 수 % 미만의 분해를 나타냄) 추가로 투약 횟수를 줄여줄 것이다. 냉동 온도에서 수년 간에 걸쳐 안정한 것은 제조업자가 액상 제형을 제시할 수 있게 해주므로, 재구성의 불편함을 피하게 해준다. 부가적으로, 유기 용매 중에서 안정하다는 것은 폴리펩티드를 신규한 투여 형태 (예: 이식물)로 제형화시켜줄 수 있다.
피하, 정맥내, 근육내 등에 적합한 제형; 적합한 제약 담체; 및 제형 및 투여 기술은 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다 [참고: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 20th edition, 2000].
본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 요지 또는 범위를 벗어나지 않고서도 본 발명에 대한 변화 및 변형을 수행할 수 있다는 것은 당업자에게 명백한 일이다.
본 발명을 보다 잘 이해할 수 있도록 하기 위해, 다음 실시예가 제시된다. 이들 실시예는 단지 예시 목적이며, 이로써 본 발명의 범위가 제한되지 않는다. 본원에 언급된 모든 공개 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.
실시예 1. 펩티드 합성 방법론
다음 일반적인 과정을 수행하여 본 발명의 몇몇 폴리펩티드를 합성하였다:
랍-폴리메레 (Rapp-Polymere) PEG-폴리스티렌 수지 (공급처: Rapp-Polymere, Tubingen, Germany)를 사용하여 연속적인 유동 조건 하에 FMOC/t-부틸 전략 [참고: Pennington & Dunn, Peptide Synthesis Protocols, Volume 35, 1994]에 의해 펩티드 합성을 수행하였다. 합성 완료시, 펩티드를 상기 수지로부터 절단시키고 TFA/DTT/H20/트리이소프로필 실란 (88/5/5/2)을 이용하여 탈보호시켰다. 찬 디에틸 에테르를 사용하여 펩티드를 절단 칵테일로부터 침전시켰다. 이러한 침전물을 찬 에테르로 3회 세척한 다음, 동결건조에 앞서 5% 아세트산에 용해시켰다. 0 내지 100% 아세토니트릴 구배로서 물/아세토니트릴 (3% TFA 수반)을 이용하여 워터스 (Waters) ALLIANCE® 시스템 (공급처: Waters Corporation, Milord, MA) 하에 YMC-팩 ODS-AQ 칼럼 (공급처: YMC, Inc., Wilmington, NC) 상에서 역상 크로마토그래피 하고, VOYAGER DE™ MALDI 질량 분광계 (모델 5-2386-00; 공급처: PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) 상에서 MALDI 질량 분광측정함으로써 펩티드를 검사하였다. 펩티드 샘플을 매트릭스 (Matrix) 완충액 (50/50 dH20/3% TFA를 수반한 아세토니트릴)에 1/1 비로 가하였다. >95% 순도 기준에 충족되지 못한 펩티드는 워터스 델타 프렙 4000 HPLC 시스템 (공급처: Waters Corporation, Milord, MA) 상에서 역상 크로마토그래피함으로써 정제하였다.
실시예 2. 펩티드 아세틸화
당해 분야에 널리 공지된 표준 방법에 의해 펩티드를 합성하였다. 링크 (Rink) 아미드 수지 상에서 HBTU 활성화를 수반한 FMOC 화학을 이용하여 어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems) 430A 펩티드 합성기로 펩티드를 합성하고, 아세트산 무수물을 이용하여 N-말단을 아세틸화하였다. 이 펩티드를 84.6% TFA, 4.4% 페놀, 4.4% 물, 4.4% 티오아니솔, 및 2.2% 에탄디티올로 절단시켰다. 찬 3급-부틸메틸 에테르를 사용하여 절단 칵테일로부터 펩티드를 침전시켰다. 이 침전물을 찬 에테르로 세척하고, 아르곤 하에 건조시켰다. 0.1% TFA를 함유하는 선형 물/아세토니트릴 구배를 이용하여 역상 C18 크로마토그래피함으로써 펩티드를 정제하였다. MALDI 및 전자분무 질량 분광측정법을 이용하고 아미노산 분석을 수행하여 펩티드 실체를 확인하였다.
실시예 3. 펩티드 PEG 화
폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 부분을 펩티드에 부착시킴으로써 신장에 의한 펩티 드 청소율을 감소시키고 펩티드의 프로테아제 분해를 저하시킴으로써, 생체내 펩티드 반감기를 증가시킬 수 있다. VPAC2 수용체 작용제 펩티드의 사용은 그의 극히 짧은 생체내 반감기로 인해 엄격하게 제한되지만, PEG 부분을 펩티드에 부착시키면 (PEG화) 1일 1회 내지 1주 1회 치료가 허용되기에 충분한 수준으로 펩티드의 반감기가 연장되었다.
PEG화는 당업자에게 공지된 모든 방법에 의해 수행할 수 있다. 그러나, 본 실시예에서는 독특한 시스테인 돌연변이를 펩티드 내로 도입한 다음, 메톡시-PEG-말레이미드 시약 [공급처: Nektar (Inhale/Shearwater), San Carlos, CA; NOF, Tokyo, Japan]의 말레이미드기와 펩티드의 설프히드릴 간의 안정적인 티오에테르 연쇄를 통하여 시스테인을 PEG화시킴으로써 PEG화를 수행할 수 있다. 이러한 독특한 시스테인은 펩티드의 C-말단에 도입하여 PEG화에 의한 잠재적 활성 저하를 최소화시킬 수 있다.
한 예로서, 2배 몰 과량의 mPEG-mal (MW 22 kD 및 43 kD) 시약을 1 mg의 펩티드 (예: 펩티드의 C-말단에 시스테인 돌연변이를 나타내는 서열 1)에 가하고, 이를 pH 6의 반응 완충액 ((0.1 M Na 인산염/0.1 M NaCl/0.1 M EDTA)에 용해시켰다. 실온에서 30분 후, 2배 몰 과량의 DTT 내지 mPEG-mal를 이용하여 상기 반응을 종결시켰다. 펩티드-PEG-mal 반응 혼합물을 양이온 교환 칼럼에 적용하여 잔류성 PEG 시약을 제거한 다음, 겔 여과 칼럼에 적용하여 잔류성 유리 펩티드를 제거하였다. PEG화 부위의 순도, 질량 및 수를 SDS-PAGE 및 MALDI-TOF 질량 분광측정법에 의해 결정하였다. 22 kD PEG를 본 발명의 펩티드에 부착시킨 경우에는, 강력한 VPAC2 수용체 활성화가 유지되었다. 더우기, VPAC1 및 PAC1에 비해 VPAC2에 대한 수용체 활성화 선택성이 유지되기도 하였다. 보다 작은 PEG (예: 선형 22 kD PEG)를 이용한 PEG화는 펩티드의 활성을 보다 덜 저하시킬 수 있는 것으로 예상되는 반면, 보다 큰 PEG (예: 분지된 43 kD PEG)는 펩티드의 활성을 보다 더 저하시킬 수 있는 것으로 예상된다. 그러나, 보다 큰 PEG는 혈장 반감기를 추가로 증가시켜 1주 1회 주사도 가능하도록 할 것이다 [참고: Harris, et al., Clin. Pharmacokinet. 40: 539-551, 2001].
실시예 4. 제약 조성물 - 정맥내 ( IV ) 및 피하 ( SC ) 제형
당해 분야에 널리 공지된 모든 제조 과정을 이용하여, 4 mg의 서열 1의 폴리펩티드, 또는 등가의 4 mg 폴리펩티드 함량을 갖는 유도체화 폴리펩티드 및 1 L 멸균 식염수로 멸균성 정맥내 주사용 제형을 제조하였다. 보다 고농도의 폴리펩티드를 피하 제형에 사용할 수 있다. 서열 1로서 확인된 폴리펩티드, 또는 유도체화 폴리펩티드의 경우에는, 4 mg을 100 mL 식염수 또는 DMSO에 용해시키고, 무균 여과시킨 후 멸균성 바이알에 조성물을 충진시켰다.
실시예 5. 펩티드의 질량 분광측정 분석
40 pmol/2 ㎕ 분취량의 펩티드를 물로 희석시켜 10 ㎕ 이하가 되도록 하였다. 제조업자의 지시에 따라서 샘플 50% (20 pmol/5 ㎕)를 조정 밀리포어 C18 ZipTip에 적용함으로써 HEPES 완충제를 제거하였다. 매트릭스 (50% ACN, 0.1% TFA 중의 10 mg/ml 알파-시아노히드록시신남산)를 이용하여 샘플을 ZipTip로부터 MALDI 판 상으로 직접 용리시켰다. 반사기 이온 모드로 작동되는 어플라이드 바이오시스 템즈 보이저 (Applied Biosystems Voyager) DE-PRO MALDI 상에서 샘플을 분석하였다. 데이터를 500 내지 4000 Da 범위에서 수집하고, 이로써 생성된 질량을 수동 계산에 의해 예측된 질량과 비교하였다.
실시예 6. 펩티드의 에드만 분석
에드만 분해를 위해, 펩티드 샘플을 10 mM HEPES, pH 7.4, 5% TFA 중의 1 nmol/10 ㎕로 공급하였다. 에드만 분석에 앞서, 제조업자의 지시에 따라서 어플라이드 바이오시스템즈 ProSorb 샘플 카트릿지를 사용함으로써 HEPES 완충제 염을 제거하였다. 간략하게 언급하면, 샘플을 PVDF 막에 적용하고, 0.1% TFA로 세척한 다음, 막을 꺼내고 에드만 분해를 위해 단백질 서열 분석기 내로 삽입하였다. 제조업자의 지시에 따라서 펄스된-액체 방법을 이용하여 어플라이드 바이오시스템즈 프로시스 (Procise) 494HT 단백질 서열분석 시스템 상에서 에드만 분해를 수행하였다. 서열 이름은 수동으로 만들어졌다.
실시예 7. 펩티드의 안정성
실시예 4에 기재된 제형을 일정한 안정성 챔버 내에 놓아두었다. 펩티드를 대상으로 하여, DPP4 용액 및 혈장 중에서의 분해에 대한 안정성 여부를 알아보기 위해 분석하였다. 폴리펩티드의 분해를 탐지하기 위한 민감한 방법들인 모세관 전기영동, 질량 분광측정법, 에드만 분해, ELISA, 및 펩티드 활성 검정에 의해 분석하기 위해 샘플을 주기적으로 꺼냈다. 각종 피크 면적을 합계내고, 모 폴리펩티드의 피크 면적을 총 피크 면적으로 나누었다. 계수는 % 순도이다. 신선한 폴리펩티드에는 불순물이 존재하기 때문에, 순도 변화는 상이한 시점에서의 순도를 초기 순도로 나눔으로써 표준화시켰다. DPP4 및 혈장에 대한 안정성을 알아보기 위해, 20 pmol/㎕의 펩티드를 100 mM HEPES, pH 7.4 중의 300 pM DPP-IV의 존재 하에 37℃에서 항온 배양하였다 (도 2a). 각종 시점에서, 1 μM DPP-IV 억제제를 부가하고 동결시킴으로써 반응 (2 ㎕ 분취량)을 종결시켰다. MALDI 질량 분광측정 분석을 위해, T = 0 hr, 1 hr, 5 hr, 및 24 hr 시점을 평가하였다. 그 결과를 분해 생성물과 비교해서 본래의 펩티드 또는 펩티드 유도체 %로서 플롯하였다.
실시예 8. PACAP1 및 VPAC1 및 2 수용체에 대한 펩티드의 결합
PAC1, VPAC1, 및 VPAC2 수용체를 과발현하는 CHO 세포를 밀집 성장시키고, 그들의 플라스크로부터 긁어내어 50 ml 튜브 내에서 연질 스핀으로 펠릿화하였다. 이 펠릿을 트리스-이용 균질화 완충액에 재현탁시키고, 얼음 상에서 30 내지 40번의 수동 스트로크로 다운스 (Dounce) 조직 연마기에서 균질화시켰다. 현탁액을 초원심분리기에서 회전시키면, 막이 펠릿화되었다. 이 펠릿을 소량의 균질화 완충액에 재현탁시키고, BCA 키트 (공급처: Pierce)를 사용하여 단백질 농도를 결정하였다.
10 ㎍ 막 단백질, 0.1 nM 125I-PACAP 27, 및 시험하고자 하는 화합물(용량을 달리 함)을 함유하는 결합 반응물을 37℃에서 20분 동안 96-웰 판에서 항온 배양하였다. 상기 판을 얼음 위에 20분 동안 놓아둠으로써 반응을 중지시켰다. 0.1% PEI와 함께 예비항온 배양시킨 필터 판에 상기 반응물을 가하여 비-특이적 결합을 피하고, 진공 분기관 상에서 처리한 다음, BSA계 세척 용액을 이용하여 수회 세척 하였다. 필터 판을 건조시키고, 신틸란트 (scintilant)를 가한 다음, 마이크로베타 (MicroBeta) 계수기 상에서 판독하였다. 데이터를 분석하고, 프리즘 그래프로 제시하였다.
실시예 9. 펩티드로 인한 cAMP 상승
VPAC2 펩티드를 발현하는 CHO 세포를 96-웰 판에 8 x 104개 세포/웰로 도말하고, αMEM, 뉴클레오시드, 글루타민 (공급처: Gibco/BRL, Rockville, MD), 5% FBS, 100 ㎍/mL Pen/Strep, 0.4 mg/mL 히그로마이신 및 1.5 mg/mL 제네티신 (Geneticin) (공급처: Gibco/BRL)에서 37℃ 하에 24시간 동안 성장시켰다. 배지를 제거하고 판을 PBS로 세척하였다. 세포를 (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, 1.2 mM KH2PO4, 1.2 mM MgS04, 25 mM NaHCO3 (pH 7.4), 1% BSA 및 100 μM IBMX 중에서) 특정 펩티드와 함께 37℃ 하에 15분 동안 항온 배양하였다. cAMP SPA 직접 스크리닝 검정 시스템 (공급처: Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ)을 이용하여, 세포 추출물 중의 사이클릭 AMP를 정량화하였다. 용해물 내에 존재하는 cAMP의 양은, 본 키트에 제공된 지시사항에 따라서 결정하였다. 각 펩티드 농도에서 생성된 cAMP의 양 (pmol)을 플롯하고, 프리즘 소프트웨어를 이용하여 비-선형 회귀에 의해 분석하여 각 펩티드에 대한 EC50을 결정하였다.
또 다른 한편, 수용체 활성화에 반응하여 cAMP가 상승되는 것은, 목적하는 수용체를 발현할 뿐만 아니라 cAMP 반응 요소 (CRE)에 연결된 리포터 (reporter), 예를 들어 루시퍼라제를 발현하는 리포터 세포주 (예: CHO)에서 측정할 수 있다. 이러한 세포를 웰당 104개 세포로 96 웰 판에 도말하고, αMEM, 뉴클레오시드, 글루타민 (공급처: Gibco/BRL, Rockville, MD), 5% FBS, 100 ㎍/mL Pen/Strep, 0.4 mg/mL 히그로마이신 및 1.5 mg/mL 제네티신 (공급처: Gibco/BRL)에서 37℃ 하에 48시간 동안 성장시켰다. 그 다음, 세포를 펩티드와 함께 6시간 동안 항온 배양하고, 배지를 제거한 다음, 브라이트-글로 (Bright-Glo) 시약 (공급처: Promega)을 가하였다. 신틸레이션 계수기를 이용하여 신호를 탐지하였다.
PAC1에서의 활성이 결여된 것으로 밝혀진 VIP에 기초하여 본 발명의 폴리펩티드를 고안하였다 [참고: Vaudry, et al., Pharmacol. Rev. 52: 269-324, 2000]. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 PAC1에서 인지할 만한 활성을 보유하지 않는 것으로 여겨진다.
본 발명의 대표적인 폴리펩티드를 이용한 상기 검정 결과가 도 3에 도시되어 있다. 서열 1 및 112로서 확인된 펩티드는 VPAC2 수용체의 강력한 작용제인데, 이는 내인성 펩티드 PACAP-27에 의해 달성된 수용체 활성화의 최대 수준 100% 까지 수용체를 활성화시킨다. 더우기, 서열 1, 112, 152, 및 154로서 확인된 펩티드는 선택적인 VPAC2 수용체 작용제인데, 이는 VPAC1에 대해서는 극히 약한 작용제 활성을 보유하고 있다. PACAP-27은 VPAC1의 강력한 작용제이다.
실시예 10. 분산된 랫트 섬 세포로부터의 인슐린 분비
본 발명의 수 많은 펩티드에 의해 매개된 분산된 랫트 섬 세포의 인슐린 분비를 다음과 같이 측정하였다: SD 랫트 (200 내지 250 g)로부터 분리한 랑게르한스 섬을, 콜라게나제를 이용하여 분해시켰다. 분산된 섬 세포를 트립신으로 처리하고, 96 V-바닥 판에 시딩한 다음, 펠릿화하였다. 그 다음, 본 발명의 펩티드를 수반하거나 수반하지 않은 배지에서 상기 세포를 밤새 배양하였다. 이 배지를 흡인시키고, 세포를 3 mM 글루코스를 함유하는 크렙스-링거 (Krebs-Ringer)-HEPES 완충액과 함께 37℃에서 30분 동안 예비항온 배양하였다. 예비항온 배양 완충액을 제거하고, 세포를 적당한 시간 동안 펩티드를 수반하거나 수반하지 않은, 적당한 글루코스 농도 (예: 8 mM)를 함유하는 크렙스-링거-HEPES 완충액과 함께 37℃에서 항온 배양하였다. 몇몇 연구에서는, 적당한 농도의 GLP-1을 또한 포함시켰다. 상등액 일부를 꺼내고, 그의 인슐린 함량을 SPA에 의해 측정하였다. 그 결과를 "대조군에 비해 몇배" (FOC)로서 표현하였다.
본 검정에서는, 분산된 랫트 섬 세포로부터의 인슐린 분비를 1.4배 이상 증가로서 정의하였다. 본 발명의 폴리펩티드의 VPAC2 수용체 작용제 성분은 분산된 랫트 섬 세포로부터 1.4배 이상 내지 약 1.7배 정도의 인슐린 분비 상의 증가를 가져다 주었다.
실시예 11. 펩티드 특이적 항체의 생성 및 ELISA 에 의한 펩티드 측정
ABI 433A 펩티드 합성기를 사용하여 본 발명의 폴리펩티드의 특이적 단편을 합성함으로써, 본 발명의 폴리펩티드에 특이적인 폴리클로날 항체를 생성시켰다. 그 다음, 이 펩티드를 수지로부터 절단시키고, 벡크만 시스템 골드 분석 및 분취 (Beckman System Gold Analytical and Preparative) HPLC 시스템 상에서 정제하였다. 투시 MALDI 질량 분광광도계 시스템을 사용하여 정확한 생성물을 확인하였다. 동결건조기를 사용하여 펩티드를 건조시켰다. 그 다음, 펩티드 (2 mg)를 Cys 상의 유리 설프히드릴기를 통하여 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)에 접합시켰다.
암컷 뉴질랜드산 백색 토끼를 0, 14, 35, 56, 및 77일 째에 면역시켰다. 0일 째에는, 각 토끼에게 250 ㎍ 펩티드 및 완전 프로인트 아주반트를 피하 주사하였다. 후속 면역화는 토끼 한 마리당 125 ㎍ 펩티드를 활용하였다. 21일 째에 채혈하기 시작하고, 그 후에는 21일 간격으로 지속하였다. 조 혈청을 특이적 펩티드 친화 정제 칼럼 상으로 통과시킴으로써 항-펩티드 항체의 정제를 수행하였다. 항체 역가를 ELISA에 의해 결정하였다.
96-웰 임뮤론 (Immulon) 4HBX 판을, 본 발명의 펩티드에 대해 특이적인 C-말단 Morphosys F(ab) 항체로 피복시키고, 4℃ 하에 밤새 항온 배양하였다. 그 다음, 판을 블로킹하여 비-특이적 결합을 방지하였다. 이어서, 펩티드 표준물 (2500 ng/mL 내지 160 pg/mL)을 33% 혈장에서 희석시키고, 샘플을 완충액 중에서 1:3으로 희석시킨 다음, 실온에서 1.5시간 동안 항온 배양하였다. 세척 후, 본 발명의 펩티드에 대해 특이적인 폴리클로날 N-말단 항체를 상기 판 상에서 1시간 동안 항온 배양하였다. 이어서, 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)-당나귀-항-토끼 항체를 부가하고, 샘플과 표준물을 1시간 더 항온 배양하였다. 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 용액과 함께 항온 배양한 후에 탐지를 평가하고, 판을 OD450에서 판독하였다 (도 4a).
또 다른 한편, 96-웰 임뮤론 4HBX 판을, 본 발명의 펩티드에 대해 특이적인 폴리클로날 N-말단 항체로 피복시키고, 4℃ 하에 밤새 항온 배양하였다. 그 다음, 판을 블로킹하여 비-특이적 결합을 방지하였다. 이어서, 펩티드 표준물 (2500 ng/mL 내지 160 pg/mL)을 50% 혈장에서 희석시키고, 샘플을 완충액 중에서 1:2으로 희석시킨 다음, 실온에서 1.5시간 동안 항온 배양하였다. 세척 후, 본 발명의 펩티드에 대해 특이적인 모노클로날 항-PEG 항체를 상기 판 상에서 1시간 동안 항온 배양하였다. 이어서, 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)-항-마우스 항체를 부가하고, 샘플과 표준물을 1시간 더 항온 배양하였다. 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 용액과 함께 항온 배양한 후에 탐지를 평가하고, 판을 OD450에서 판독하였다 (도 4b).
실시예 12. 정맥내 및 피하 투약 후 펩티드의 약력학
혈장 샘플을 미세원심분리용 튜브에 옮기고, 등용적의 아세토니트릴을 샘플에 가하였다 (50% 최종 농도). 샘플을 약 5분 동안 격렬하게 와동시키고, 얼음 상에 10분 동안 정치시켜 두었다. 샘플을 약 1분 동안 다시 와동시킨 다음, 미세원심분리기 (4℃)에서 30분 동안 최대 속도 (약 15,000 x g)로 원심분리시켰다.
원심분리시킨 후, 수성 상을 청정한 원심분리용 튜브에 조심스럽게 옮기고, 샘플을 미세원심분리기 (4℃)에서 5분 동안 최대 속도 (약 15,000 x g)로 원심분리시켰다. 건조될 때까지 중간 열 세팅을 수반한 스피드 백 (Speed Vac) SC110 (공급처: Savant)을 이용하여, 상기 추출된 샘플을 진공 하에 건조시켰다. 샘플을 적당한 용적의 멸균수에 재현탁시키고 4℃ 하에 유지시켰다. 그 다음, 분석하기에 앞서, 샘플을 초음파 욕에서 실온 하에 10분 동안 초음파처리하였다. 실시예 9에 기재된 바와 같은 리포터 검정을 활용하여 펩티드 농도를 결정하였다.
이러한 방법을 사용하여, 서열 112의 약력학적 특성을 서열 154의 약력학적 특성과 비교하였다 (도 5a). 서열 112 상에 존재하는 펩티드 아세틸화는 개선된 약력학적 특성을 나타내었는데, 이는 24시간 및 48시간에 탐지된 반면, 비-아세틸화 펩티드인 서열 154는 단지 6시간에 탐지되었다. 이들 두 펩티드를 비교한 추가의 연구 결과, 서열 112는 랫트에서의 반감기가 10.9시간인 반면, 비-아세틸화 서열 154의 반감기는 대략 6시간인 것으로 입증되었다 (도 5b).
실시예 11에 기재된 바와 같이 ELISA를 사용하여 혈장 펩티드 농도를 측정할 수도 있다. 이러한 방법론을 사용하여, 서열 112의 약력학을 추가로 특성화하였다 (도 5c). 개에서는, 서열 112가 1주 동안 탐지 가능한 농도로 여전히 존재하였다.
실시예 13. 랫트에서 복강내 글루코스 내성에 대한 PEG 화 펩티드의 효과
피하 투여된 경우 본 발명의 PEG화 펩티드의 생체내 활성을 랫트에서 검사하였다. 밤새 단식시킨 랫트에게 대조군 또는 PEG화 펩티드 (1 내지 100 ㎍/kg)를 피하 주사하였다. 3시간 후에, 기본 혈당을 측정하고, 랫트에게 2 g/kg의 글루코스를 복강내 투여하였다. 혈당을 15, 30, 및 60분 후에 다시 측정하였다. IPGTT (복강내 글루코스 내성 시험)에 따르면, 본 발명의 PEG화 펩티드는 비히클에 비해 혈당치를 상당히 저하시켰는데, 글루코스 AUC가 17 내지 28% 감소하였다 (도 6a-6d). 이는 PEG화 펩티드가 생체 내에서 연장된 글루코스 저하 활성을 지니고 있다는 것을 입증해준다. 본 발명의 PEG화 펩티드의 글루코스 저하 활성 이외에도, 이 는 생체내 펩티드 반감기가 연장되었다는 지표이기도 하다. PACAP-27은 생체 내에서의 반감기가 극히 짧다 (< 10 분). 펩티드를 투여한지 24시간 후 (도 6b), 41시간 후 (도 6c), 65시간 후 (도 6c), 및 72시간 후 (도 6d)에 혈당을 저하시킬 수 있는 본 발명의 PEG화 펩티드의 능력은, 이러한 펩티드가 상기 시점에서 순환시 존재하므로, PACAP-27에 비해 반감기가 연장되었다는 명백한 지표이다 (도 6c). 더우기, 서열 112의 펩티드는 서열 154 및 155의 펩티드와 비교해서 보다 긴 시점에서 보다 강력한 효력과 효능을 입증해준다 (도 6b 및 6d).
본 발명의 폴리펩티드의 활성 입증은 당해 분야에 널리 공지되어 있는 시험관내, 생체외 또는 생체내 검정을 통하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 당뇨병 및 관련 장애, 예를 들어 증후군 X, 내당능 이상, 공복 글루코스 장애, 및 고인슐린혈증; 아테롬성 경화증 및 관련 장애, 예를 들어 고중성지방혈증 및 고콜레스테롤혈증; 및 비만을 치료하기 위한 약제의 효능을 입증하기 위해, 다음 검정을 사용할 수 있다.
혈당치를 측정하는 방법
db/db 마우스 (공급처: Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)를 채혈하고 (눈 또는 꼬리 정맥을 통하여 채혈함), 당량 평균 혈당치에 따라서 여러 무리로 분류하였다. 이들에게 시험용 폴리펩티드를 14일 동안 매일 1회씩 경구 투약하였다 (제약상 허용 가능한 비히클 중에서 섭식시킴). 이때, 동물의 눈 또는 꼬리 정맥을 통해 다시 채혈하고, 혈당치를 결정하였다. 각 경우에 있어, 글루코미터 엘리트 (Glucometer Elite) XL (공급처: Bayer Corporation, Elkhart,IN)를 사용하여 혈당치를 측정하였다.
심혈관계 파라미터에 대한 효과를 측정하는 방법
심혈관계 파라미터 (예: 심박수 및 혈압)를 또한 평가하였다. SHR 랫트에게 비히클 또는 시험용 폴리펩티드를 2주 동안 매일 1회씩 경구 투약하였다. 문헌 [참고: Grinsell, et al., Am. J. Hypertens. 13: 370-375, 2000]에 기재된 바와 같은 테일-커프 (tail-cuff) 방법을 이용하여 혈압과 심박수를 결정하였다. 원숭이에서는, 문헌 [참고: Shen, et al., J. Pharmacol. Exp. Therap. 278: 1435-1443, 1996]에 기재된 바와 같이 혈압과 심박수를 모니터링하였다.
트리글리세라이드 수치를 측정하는 방법
hApoA1 마우스 (공급처: Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)를 채혈하고 (눈 또는 꼬리 정맥을 통하여 채혈함), 당량 평균 혈청 트리글리세라이드 수치에 따라서 여러 무리로 분류하였다. 이들에게 시험용 폴리펩티드를 8일 동안 매일 1회씩 경구 투약하였다 (제약상 허용 가능한 비히클 중에서 섭식시킴). 그 다음, 동물의 눈 또는 꼬리 정맥을 통해 다시 채혈하고, 혈청 트리글리세라이드 수치를 결정하였다. 각 경우에 있어, 테크니콘 악손 (Technicon Axon) 자동분석기 (공급처: Bayer Corporation, Tarrytown, NY)를 사용하여 트리글리세라이드 수치를 측정하였다.
HDL -콜레스테롤 수치를 측정하는 방법
혈장 HDL-콜레스테롤 수치를 결정하기 위해, hApoA1 마우스를 채혈하고, 당량 평균 혈장 HDL-콜레스테롤 수치에 따라서 여러 무리로 분류하였다. 이들 마우 스에게 비히클 또는 시험용 폴리펩티드를 7일 동안 매일 1회씩 경구 투약한 다음, 8일 째에 다시 채혈하였다. 신크론 (Synchron) 클리니컬 시스템 (CX4) (공급처: Beckman Coulter, Fullerton, CA)을 사용하여 HDL-콜레스테롤을 알아보기 위해 혈장을 분석하였다.
총 콜레스테롤, HDL -콜레스테롤, 트리글리세라이드 , 및 글루코스 수치를 측정하는 방법
또 다른 생체내 검정에서는, 비만인 원숭이를 채혈한 다음, 비히클 또는 시험용 폴리펩티드를 4주 동안 매일 1회씩 경구 투약한 후, 다시 채혈하였다. 신크론 클리니컬 시스템 (CX4) (공급처: Beckman Coulter, Fullerton, CA)을 사용하여 총 콜레스테롤, HDL-콜레스테롤, 트리글리세라이드, 및 글루코스를 알아보기 위해 혈청을 분석하였다. 문헌 [참고: Oliver, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 5306-5311, 2001]에 기재된 바와 같이 NMR 분광법에 의해 지단백질 아부류 분석을 수행하였다.
상기 명세서에 언급된 모든 공개 문헌 및 특허는 본원에 참고로 도입된다. 기재된 본 발명의 조성물 및 방법의 각종 변형 및 변이가 본 발명의 범위 및 요지를 벗어나지 않고서도 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 구체적인 바람직한 양태와 연계해서 기재되긴 하였지만, 청구된 바와 같은 본 발명은 이러한 구체적 양태들로 제한되지 않는다는 것을 인지해야 한다. 실제로, 생화학 분야 또는 관련 분야의 숙련인에게 명백한, 본 발명을 실시하기 위한 상기 언급된 방식의 각종 변형이 다음 청구의 범위 내에 포함된다. 당업자는 통상적인 실험을 수행하고서도, 본원에 기재된 본 발명의 구체적 양태들에 대한 많은 등가 양태를 인식하거나 확인할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Bayer Pharmaceuticals Corporation Clairmont, Kevin Lumb, Kevin Buckholz, Thomas Salhanick, Arthur <120> PITUITARY ADENYLATE CYCLASE ACTIVATING PEPTIDE (PACAP) RECEPTOR (VPAC2) AGONISTS AND THEIR PHARMACOLOGICAL METHODS OF USE <130> 5189 <150> US 60/539,550 <151> 2004-01-27 <150> US 60/566,499 <151> 2004-04-29 <160> 155 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(31) <223> ACETYLATION <400> 1 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Tyr 20 25 30 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(31) <223> ACETYLATION <400> 2 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Tyr 20 25 30 <210> 3 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(29) <223> ACETYLATION <400> 3 His Ser Asp Ala Val 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Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Leu Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Thr Ile Lys Gln Lys Arg Tyr 20 25 30 <210> 8 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(31) <223> ACETYLATION <400> 8 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Thr Ile Lys Gln Lys Arg Tyr 20 25 30 <210> 9 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(31) <223> ACETYLATION <400> 9 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala His Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Tyr 20 25 30 <210> 10 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(31) <223> ACETYLATION <400> 10 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys His Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Tyr 20 25 30 <210> 11 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(30) <223> ACETYLATION <400> 11 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Gly Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg 20 25 30 <210> 12 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(30) <223> ACETYLATION <400> 12 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Lys Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg 20 25 30 <210> 13 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(30) <223> ACETYLATION <400> 13 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Arg Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg 20 25 30 <210> 14 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(30) <223> ACETYLATION <400> 14 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ser Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg 20 25 30 <210> 15 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(30) <223> ACETYLATION <400> 15 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Pro Gln Lys Arg 20 25 30 <210> 16 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(30) <223> ACETYLATION <400> 16 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Gln Gln Lys Arg 20 25 30 <210> 17 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(30) <223> ACETYLATION <400> 17 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Arg Gln Lys Arg 20 25 30 <210> 18 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(30) <223> ACETYLATION <400> 18 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Arg Arg 20 25 30 <210> 19 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(30) <223> ACETYLATION <400> 19 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp 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is PEGylated. <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(31) <223> ACETYLATION <400> 126 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Pro Gln Lys Arg Cys 20 25 30 <210> 127 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(31) <223> Cysteine at position 31 is PEGylated. <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(31) <223> ACETYLATION <400> 127 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Gln Gln Lys Arg Cys 20 25 30 <210> 128 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(31) <223> Cysteine at position 31 is PEGylated. <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(31) <223> ACETYLATION <400> 128 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Arg Gln Lys Arg Cys 20 25 30 <210> 129 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(31) <223> Cysteine at position 31 is PEGylated. <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(31) <223> ACETYLATION <400> 129 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Arg Arg Cys 20 25 30 <210> 130 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(31) <223> Cysteine at position 31 is PEGylated. <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(31) <223> ACETYLATION <400> 130 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Ala Cys 20 25 30 <210> 131 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(31) <223> Cysteine at position 31 is PEGylated. <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(31) <223> ACETYLATION <400> 131 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Phe Cys 20 25 30 <210> 132 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(31) <223> Cysteine at position 31 is PEGylated. <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(31) <223> ACETYLATION <400> 132 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys His Cys 20 25 30 <210> 133 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(31) <223> Cysteine at position 31 is PEGylated. <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(31) <223> ACETYLATION <400> 133 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Ile Cys 20 25 30 <210> 134 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(31) <223> Cysteine at position 31 is PEGylated. <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(31) <223> ACETYLATION <400> 134 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Lys Cys 20 25 30 <210> 135 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(31) <223> Cysteine at position 31 is PEGylated. <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(31) <223> ACETYLATION <400> 135 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Leu Cys 20 25 30 <210> 136 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(31) <223> Cysteine at position 31 is PEGylated. <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(31) <223> ACETYLATION <400> 136 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Met Cys 20 25 30 <210> 137 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(31) <223> Cysteine at position 31 is PEGylated. <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(31) <223> ACETYLATION <400> 137 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Pro Cys 20 25 30 <210> 138 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(31) <223> Cysteine at position 31 is PEGylated. <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(31) <223> ACETYLATION <400> 138 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Gln Cys 20 25 30 <210> 139 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(31) <223> Cysteine at position 31 is PEGylated. <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(31) <223> ACETYLATION <400> 139 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Ser Cys 20 25 30 <210> 140 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(31) <223> Cysteine at position 31 is PEGylated. <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(31) <223> ACETYLATION <400> 140 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Thr Cys 20 25 30 <210> 141 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(31) <223> Cysteine at position 31 is PEGylated. <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(31) <223> ACETYLATION <400> 141 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Val Cys 20 25 30 <210> 142 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(31) <223> Cysteine at position 31 is PEGylated. <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(31) <223> ACETYLATION <400> 142 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Trp Cys 20 25 30 <210> 143 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(31) <223> Cysteine at position 31 is PEGylated. <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(31) <223> ACETYLATION <400> 143 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Tyr Cys 20 25 30 <210> 144 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(31) <223> Cysteine at position 31 is PEGylated. <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(31) <223> ACETYLATION <400> 144 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Gly Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Arg Ile Cys 20 25 30 <210> 145 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(31) <223> Cysteine at position 31 is PEGylated. <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(31) <223> ACETYLATION <400> 145 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Lys Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Arg Ile Cys 20 25 30 <210> 146 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(31) <223> Cysteine at position 31 is PEGylated. <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(31) <223> ACETYLATION <400> 146 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ser Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Arg Ile Cys 20 25 30 <210> 147 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(31) <223> Cysteine at position 31 is PEGylated. <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(31) <223> ACETYLATION <400> 147 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Pro Gln Arg Ile Cys 20 25 30 <210> 148 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(31) <223> Cysteine at position 31 is PEGylated. <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(31) <223> ACETYLATION <400> 148 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ser Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Arg Gln Arg Ile Cys 20 25 30 <210> 149 <211> 38 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 149 His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys 20 25 30 Gln Arg Val Lys Asn Lys 35 <210> 150 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 150 His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu 20 25 <210> 151 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 151 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn 20 25 <210> 152 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 152 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Tyr 20 25 30 <210> 153 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(31) <223> ACETYLATION <400> 153 His Thr Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Tyr 20 25 30 <210> 154 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(32) <223> Cysteine at position 32 is PEGylated. <400> 154 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Tyr Cys 20 25 30 <210> 155 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(32) <223> ACETYLATION <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(32) <223> Cysteine at position 32 is PEGylated. <400> 155 His Thr Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Tyr Cys 20 25 30

Claims (53)

  1. 서열 1 내지 148로 이루어진 군 중에서 선택된 폴리펩티드, 및 그의 기능적 등가 단편, 유도체 및 변이체.
  2. 제1항에 있어서, 서열 1, 2, 3, 4, 5, 112, 113, 114, 115 및 116으로 이루어진 군 중에서 선택되는 폴리펩티드.
  3. 제1항의 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체.
  4. 제3항에 있어서, 폴리클로날 항체인 항체.
  5. 제3항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
  6. 폴리에틸렌 글리콜과 특이적으로 결합하는 항체.
  7. 제6항에 있어서, 폴리클로날 항체인 항체.
  8. 제6항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
  9. a. 샘플을 제3항 또는 제6항의 항체와 접촉시키는 단계;
    b. 상기 항체를 탐지하는 단계; 및
    c. 항체의 탐지와 샘플 중의 폴리펩티드 양을 상관짓는 단계
    를 포함하는, 상기 샘플 중에서 서열 1 내지 148로 이루어진 군 중에서 선택된 폴리펩티드를 탐지하는 방법.
  10. a. 샘플을 제3항 또는 제6항의 제1 항체와 접촉시키는 단계;
    b. 상기 샘플을 제2의 표지된 항체 (상기 제2 항체는 제1 항체와 결합된다)와 접촉시키는 단계;
    c. 상기 표지를 탐지하는 단계; 및
    d. 표지의 탐지와 샘플 중의 폴리펩티드 양을 상관짓는 단계
    를 포함하는, 상기 샘플 중에서 서열 1 내지 148로 이루어진 군 중에서 선택된 폴리펩티드를 탐지하는 방법.
  11. 제3항 또는 제6항의 제1 항체와 제2 항체 (상기 제2 항체는 제1 항체와 결합된다)를 포함하는, 샘플 중에서 서열 1 내지 148로 이루어진 군 중에서 선택된 폴리펩티드를 탐지하기 위한 키트.
  12. 치료적 유효량의 제1항의 폴리펩티드, 또는 그의 기능적 등가 단편, 유도체 및 변이체를, 제약상 허용 가능한 담체와 조합하여 포함하는 제약 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 폴리펩티드가 서열 1, 2, 3, 4, 5, 112, 113, 114, 115 및 116으로 이루어진 군 중에서 선택되는 제약 조성물.
  14. 치료적 유효량의 제1항의 폴리펩티드, 또는 그의 기능적 등가 단편, 유도체 및 변이체를, 제약상 허용 가능한 담체 및 1 종 이상의 약제와 조합하여 포함하는 제약 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 약제가 PPAR 리간드, 인슐린 분비촉진제, 설포닐우레아 약물, α-글루코시다제 억제제, 인슐린 감작제, 간 내 글루코스 생산 저하성 화합물, 인슐린 및 인슐린 유도체, 비구아니드, 단백질 티로신 포스파타제-1B, 디펩티딜 펩티다제 IV, 11베타-HSD 억제제, 항비만 약물, HMG-CoA 리덕타제 억제제, 니코틴산, 지질 저하성 약물, ACAT 억제제, 담즙산 제어제, 담즙산 재흡수 억제제, 미크로솜성 트리글리세라이드 수송 억제제, 피브르산 유도체, β-차단제, ACE 억제제, 칼슘 채널 차단제, 이뇨제, 레닌 억제제, AT-1 수용체 길항제, ET 수용체 길항제, 중성 엔도펩티다제 억제제, 바소펩시다제 억제제, 및 니트레이트로 이루어진 군 중에서 선택되는 제약 조성물.
  16. 유효량의 제1항의 폴리펩티드, 또는 그의 기능적 등가 단편, 유도체 및 변이체를, 불활성 담체와 조합하여 포함하는 조성물.
  17. 치료적 유효량의 제1항의 폴리펩티드 또는 제12항의 제약 조성물을, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병 치료 방법.
  18. 제17항에 있어서, 당뇨병이 유형 2 당뇨병, 아이들의 성인 당뇨병, 잠재성 성인 자가면역 당뇨병 및 임신성 당뇨병으로 이루어진 군 중에서 선택되는 치료 방법.
  19. 치료적 유효량의 제1항의 폴리펩티드 또는 제12항의 제약 조성물을, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 증후군 X 치료 방법.
  20. 치료적 유효량의 제1항의 폴리펩티드 또는 제12항의 제약 조성물을, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병-관련 장애 치료 방법.
  21. 제20항에 있어서, 당뇨병-관련 장애가 고혈당증, 고인슐린혈증, 내당능 이상, 공복 글루코스 장애, 이상지질혈증, 고중성지방혈증, 및 인슐린 내성으로 이루어진 군 중에서 선택되는 치료 방법.
  22. 치료적 유효량의 제1항의 폴리펩티드를 1 종 이상의 약제와 조합하여, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병 치료 방법.
  23. 제20항에 있어서, 약제가 PPAR 작용제, 설포닐우레아 약물, 비-설포닐우레아 분비촉진제, α-글루코시다제 억제제, 인슐린 감작제, 인슐린 분비촉진제, 간 내 글루코스 생산 저하성 화합물, 인슐린 및 항비만제로 이루어진 군 중에서 선택되는 치료 방법.
  24. 제23항에 있어서, 당뇨병이 유형 2 당뇨병, 아이들의 성인 당뇨병, 잠재성 성인 자가면역 당뇨병 및 임신성 당뇨병으로 이루어진 군 중에서 선택되는 치료 방법.
  25. 치료적 유효량의 제1항의 폴리펩티드를 1 종 이상의 약제와 조합하여, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 증후군 X 치료 방법.
  26. 제25항에 있어서, 약제가 PPAR 작용제, 설포닐우레아 약물, 비-설포닐우레아 분비촉진제, α-글루코시다제 억제제, 인슐린 감작제, 인슐린 분비촉진제, 간 내 글루코스 생산 저하성 화합물, 인슐린 및 항비만제로 이루어진 군 중에서 선택되는 치료 방법.
  27. 치료적 유효량의 제1항의 폴리펩티드를 1 종 이상의 약제와 조합하여, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병-관련 장애 치료 방법.
  28. 제27항에 있어서, 당뇨병-관련 장애가 고혈당증, 고인슐린혈증, 내당능 이상, 공복 글루코스 장애, 이상지질혈증, 고중성지방혈증, 및 인슐린 내성으로 이루어진 군 중에서 선택되는 치료 방법.
  29. 제28항에 있어서, 약제가 PPAR 작용제, 설포닐우레아 약물, 비-설포닐우레아 분비촉진제, α-글루코시다제 억제제, 인슐린 감작제, 인슐린 분비촉진제, 간 내 글루코스 생산 저하성 화합물, 인슐린 및 항비만제로 이루어진 군 중에서 선택되는 치료 방법.
  30. 치료적 유효량의 제1항의 폴리펩티드를, HMG-CoA 리덕타제 억제제, 니코틴산, 지질 저하성 약물, ACAT 억제제, 담즙산 제어제, 담즙산 재흡수 억제제, 미크로솜성 트리글리세라이드 수송 억제제, 피브르산 유도체, β-차단제, ACE 억제제, 칼슘 채널 차단제, 이뇨제, 레닌 억제제, AT-1 수용체 길항제, ET 수용체 길항제, 중성 엔도펩티다제 억제제, 바소펩시다제 억제제, 및 니트레이트로 이루어진 군 중에서 선택된 1 종 이상의 약제와 조합하여, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병, 증후군 X, 또는 당뇨병-관련 장애 치료 방법.
  31. 제30항에 있어서, 당뇨병-관련 장애가 고혈당증, 고인슐린혈증, 내당능 이상, 공복 글루코스 장애, 이상지질혈증, 고중성지방혈증, 및 인슐린 내성으로 이루 어진 군 중에서 선택되는 치료 방법.
  32. 제22항 내지 제31항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1항의 폴리펩티드와 1 종 이상의 약제가 단일 제약 투여 제형으로서 투여되는 치료 방법.
  33. 치료적 유효량의 제1항의 폴리펩티드 또는 제12항의 제약 조성물을, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병의 이차 원인의 치료 또는 예방 방법.
  34. 제33항에 있어서, 이차 원인이 글루코코르티코이드 과다, 성장 호르몬 과다, 크롬친화세포종 (pheochromocytoma), 및 약물-유도성 당뇨병으로 이루어진 군 중에서 선택되는 치료 또는 예방 방법.
  35. 치료적 유효량의 제1항의 폴리펩티드를 1 종 이상의 약제와 조합하여, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병의 이차 원인의 치료 또는 예방 방법.
  36. 제35항에 있어서, 약제가 PPAR 작용제, 설포닐우레아 약물, 비-설포닐우레아 분비촉진제, α-글루코시다제 억제제, 인슐린 감작제, 인슐린 분비촉진제, 간 내 글루코스 생산 저하성 화합물, 인슐린 및 항비만제로 이루어진 군 중에서 선택되는 치료 또는 예방 방법.
  37. 치료적 유효량의 제1항의 폴리펩티드 또는 제12항의 제약 조성물을, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 호흡기 질환 치료 방법.
  38. 치료적 유효량의 제1항의 폴리펩티드 또는 제12항의 제약 조성물을, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 비만 치료 방법.
  39. 치료적 유효량의 제1항의 폴리펩티드 또는 제12항의 제약 조성물을, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 심혈관계 질환 치료 방법.
  40. 제39항에 있어서, 심혈관계 질환이 아테롬성 경화증, 관상 심장 질환, 관상 동맥 질환 및 고혈압으로 이루어진 군 중에서 선택되는 치료 방법.
  41. 치료적 유효량의 제1항의 폴리펩티드 또는 제12항의 제약 조성물을, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 지질 및 탄수화물 대사 장애 치료 방법.
  42. 치료적 유효량의 제1항의 폴리펩티드 또는 제12항의 제약 조성물을, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 수면 장애 치료 방법.
  43. 치료적 유효량의 제1항의 폴리펩티드 또는 제12항의 제약 조성물을, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 남성(수컷) 생식 장애 치료 방법.
  44. 치료적 유효량의 제1항의 폴리펩티드 또는 제12항의 제약 조성물을, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 성장 장애 또는 에너지 생체 항항성 장애 치료 방법.
  45. 치료적 유효량의 제1항의 폴리펩티드 또는 제12항의 제약 조성물을, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 면역 질환 치료 방법.
  46. 치료적 유효량의 제1항의 폴리펩티드 또는 제12항의 제약 조성물을, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 자가면역 질환 치료 방법.
  47. 치료적 유효량의 제1항의 폴리펩티드 또는 제12항의 제약 조성물을, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 급성 및 만성 염증 질환 치료 방법.
  48. 치료적 유효량의 제1항의 폴리펩티드 또는 제12항의 제약 조성물을, 이를 필 요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 패혈성 쇽 치료 방법.
  49. 제1항의 폴리펩티드 또는 제12항의 제약 조성물을, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써, 이러한 대상체에게서 글루코스-의존성 방식으로 인슐린 방출을 자극하는 방법.
  50. 제1항에 있어서, 당뇨병 및 당뇨병-관련 장애를 치료 및/또는 예방하기 위한 폴리펩티드.
  51. 하나 이상의 제1항 기재 폴리펩티드를, 하나 이상의 제약상 허용 가능하고 제약상 안전한 담체 또는 부형제와 조합하여 함유하는 의약.
  52. 당뇨병 및 당뇨병-관련 장애 치료 및/또는 예방용 의약을 제조하기 위한, 제1항 기재 폴리펩티드의 용도.
  53. 제51항에 있어서, 당뇨병을 치료 및/또는 예방하기 위한 의약.
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