JP2008500052A - 新規人工抗原提示細胞およびそれらの用途 - Google Patents

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スホスキ，ミーガン
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Abstract

本発明は新規人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）に関する。該ａＡＰＣは最低１種の刺激リガンドおよび最低１種の共刺激リガンドを含んでなり、該リガンドはそれぞれ目的のＴ細胞上のコグネイトの分子と特異的に結合し、それにより該Ｔ細胞の増殖を媒介する。本発明のａＡＰＣは、目的のＴ細胞を増殖させるために有用な付加的な分子をさらに含み得る。本発明のａＡＰＣは、目的のＴ細胞を増殖させるよう容易に設計し得る「在庫があり入手可能な」ＡＰＣとして使用し得る。また、本発明のａＡＰＣは、刺激、共刺激、ならびに目的Ｔ細胞の成長および増殖を媒介するいずれかの他の因子を同定するのに使用し得る。従って、本発明は、Ｔ細胞の活性化および増殖が利益を提供し得る新規治療薬の開発のための強力なツールを提供する。

Description

連邦の支援を受けた研究若しくは開発に関する声明
本研究は米国政府の資金（国立保健研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）助成金Ｒ２１ ＡＩ０６０４７７、Ｒ０１ ＣＡ１０５２１６およびＲ０１ ＡＩ０５７８３８により部分的に支援され、そして、米国政府は従って本発明においてある種の権利を有しうる。
養子移入は、同種移植片拒絶を研究するためにＭｅｄａｗａｒ（非特許文献１）により作られた用語である。養子免疫療法という用語は、癌若しくは感染性疾患の処置のための免疫担当細胞の移入を示す（非特許文献２；非特許文献３）。養子療法は、損傷を受けた組織若しくは系の生物学的機能を自己若しくは同種細胞によって置換、修復若しくは増強することを目的とした戦略とみなし得る。注入に際しての高度の生着を可能にした、ｅｘ ｖｉｖｏで増殖させたＨＩＶに感染したポリクローナルＣＤ４ Ｔ細胞の最初の成功裏の注入は、ＨＩＶに感染した個体のＴ細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖させるために抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ビーズで被覆した磁性ビーズ（ＣＤ３／２８被覆ビーズ）を使用して実施された。８例の患者に、このプロトコル下で、最少の有害事象を伴い、共刺激したＣＤ４細胞の５１回の注入を投与した（非特許文献４）。
ＨＩＶ感染はＨＩＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の顕著な増殖を誘導する。これらのＣＤ８ Ｔ細胞は、ＨＩＶの複製を制限しならびにＨＩＶ感染細胞を直接溶解する（非特許文献５；非特許文献６）可溶性因子を放出する（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。ＳＩＶ攻撃前のＣＤ８ Ｔ細胞の枯渇は確認されないウイルス複製および迅速な死につながり、ＨＩＶを慢性疾患にするのにＣＤ８ Ｔ細胞活性が必要であることを示す（非特許文献１０；非特許文献１１）。それにもかかわらず、ＣＤ８ Ｔ細胞は、ＨＩＶ感染を制御することに最終的には失敗する。ＨＩＶ特異的Ｔ細胞は、高度に低下されたパーフォリン発現（非特許文献１２；非特許文献１３）、２種の重要なシグナル伝達受容体ＣＤ３ζおよびＣＤ２８のダウンレギュレーション（非特許文献１４）、歪んだ成熟パターン（非特許文献１５）、ならびにＦａｓ誘発性のアポトーシスに対する高感受性（非特許文献１６）を有することが示された。従って、ＨＩＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の最適の活性化がエフェクター機能を修復することができることが考えられる。
抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８（ＣＤ３／２８）被覆ビーズは、ＨＩＶに感染したＣＤ４ Ｔ細胞の増殖を可能にした第一世代の人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）であった（非特許文献１７）。Ｔ細胞の活性化および増殖に必要とされるシグナルを送達することに加えて、ＣＤ３／２８ビーズ刺激は、ＣＣＲ５をダウンレギュレートしかつそのリガンドすなわちβ−ケモカインＲＡＮＴＥＳ、マクロファージ炎症タンパク質−１α（ＭＩＰ−１α）およびＭＩＰ−１βの発現をアップレギュレートすることにより、Ｔ細胞をＲ５感染に対し抵抗性にする（非特許文献１８；非特許文献１９）。数件のフェーズＩおよびフェーズＩＩ試験は、ＣＤ３／２８被覆ビーズを使用して増殖させた自己ＣＤ４ Ｔ細胞のＲ５に感染した個体への注入が、安全かつ実現可能の双方であることを示した（非特許文献１９；非特許文献４；非特許文献２０；非特許文献２１）。より重要なことには、総リンパ球数の持続性の増加、ＣＤ４対ＣＤ８ Ｔ細胞比、サイトカインを分泌するＴ細胞の画分、およびリコール抗原に応答する能力が観察され、養子Ｔ細胞免疫療法が、ＨＩＶに感染した個体に少なくとも制限された免疫機能を戻し得ることを示唆する（非特許文献４）。これらの初期の試験の成功にもかかわらず、（１）ＣＤ８Ｔ細胞の増殖、（２）Ｔ細胞のあるサブセットを増殖させるのに必要とされうる付加的な共刺激シグナルの追加、（３）注入前のビーズの除去、および（４）高生着能力をもつ抗原特異的Ｔ細胞の生成の困難さを包含するいくつかの制限が示された。
他者は、Ｔ細胞増殖ＣＤ３／２８被覆ビーズを、遺伝子を改変したＴ細胞をＨＩＶ感染患者に導入するのに使用した。これらの研究（非特許文献２０；非特許文献２２；非特許文献２３）において、ＣＤ４の細胞外ドメインおよびＣＤ３ζ鎖の細胞内ドメインよりなるキメラ分子（ＣＤ４ζはレトロウイルス形質導入を介してＣＤ４ Ｔ細胞に導入した）。ＣＤ４ζ改変Ｔ細胞は、ＤＮＡ ＰＣＲにより注入後の全患者の末梢血中で検出され、そして全末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の１〜３％という平均レベルが全部の注入後の時間点で持続された。延長された経過観察において、ＣＤ４ζは、注入後１年の１８例の患者の１７例の血液中で検出された。これらのレベルの持続性生着は、おそらく以前の細胞培養技術がアポトーシス若しくは複製老化に対する感受性を誘導していたかもしれないため、ヒトＴ細胞注入について以前に観察されたものより数桁より高い（非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２６；非特許文献２７；非特許文献２８）。これらの臨床結果は、ビーズに基づくａＡＰＣで増殖させた共刺激したＴ細胞が安全でありかつ長期の生着に対する能力を有することを示す。しかしながら、試験被験体の制限された数、およびＨＩＶ治療試験における臨床エンドポイントを達成するのに必要とされる時間の長さにより、ＨＩＶに感染した個体への自己ＣＤ４ Ｔ細胞移入の臨床上の利益の統計学的有意性は測定し得なかった。
免疫不全の制限において潜在的に有効な一方で、ポリクローナルＣＤ４ Ｔ細胞は、ＨＩＶ特異的応答に対する穏やかな効果のみを有することがありそうである。抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の養子移入を使用するヒトウイルス感染の免疫療法が、ＣＭＶ、ＥＢＶおよびＨＩＶ感染の設定で研究されている。このアプローチは、ＣＭＶに対するＨＬＡ拘束性の抗原特異性をもつＴ細胞クローンを使用して評価された（非特許文献２９；非特許文献３０）。ＭＨＣが同一の骨髄ドナーから単離したＣＭＶ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖させ、そして１４例の同種骨髄移植レシピエントに投与した。ＣＭＶ特異的ＣＴＬ活性の回復が各症例で見られ、そして、養子移入したＣＴＬはｉｎ ｖｉｖｏで１２週まで持続した。類似の一試験において、ネオマイシン耐性遺伝子で遺伝子的に印をつけた、ドナー由来のＥＢＶ特異的ＣＤ８＋およびＣＤ４＋ Ｔ細胞を、Ｔ細胞を枯渇させた同種骨髄同種移植片の６例のレシピエントに投与した（非特許文献３１；非特許文献３２）。ＥＢＶでのｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｅｘ ｖｉｖｏ攻撃に応答性の、遺伝子に印を付けたＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞は、注入後約１８ヵ月間、低頻度でｉｎ ｖｉｖｏで持続した。ＨＩＶに対する単一特異性をもつＣＤ８ Ｔ細胞（Ｎｅｆ）（非特許文献３３）の１例の患者への注入は、ウイルスバリアントのＣＴＬ選択を示し、複数の標的に対するＨＩＶ特異的Ｔ細胞の注入がＨＩＶ複製を制御するために必要でありうることを示す。これらの試験の全部において、これらのＴ細胞の大多数の生着することの不能は、抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞免疫療法の長期の効果の研究を制限した。該分野の主要な一課題は、生着しかつ慢性感染症とより効果的に戦うために強力なエフェクター機能を長期間有することができるＣＤ８ Ｔ細胞を増殖させることである。しかしながら、十分な数の治療的Ｔ細胞に対する長期の必要性にもかかわらず、これらの細胞を増殖させるのに利用可能な方法が存在しない。
ＨＩＶ特異的Ｔ細胞はＨＩＶを含有することが可能であるが、しかし根絶させることは可能でない。ＨＩＶ感染の前若しくは間にＣＤ８ Ｔ細胞を除去した研究は、確認されないウイルス複製およびＡＩＤＳへのはるかにより速い進行を示し、ＣＤ８ Ｔ細胞がＨＩＶの制御において重要であることを示す（非特許文献１０；非特許文献１１）。しかしながら、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞は、一般にパーフォリン発現（非特許文献３４）、およびＨＩＶを宿主から排除するための他の不可欠なエフェクター機能を欠く。長期非進行者の研究は、これらの個体からのＨＩＶ特異的Ｔ細胞が増殖しかつパーフォリンを含有することがよりありそうであることを示し、高められたエフェクター機能をもつＣＤ８ Ｔ細胞がＡＩＤＳへの進行を遅らせうることを示す（非特許文献３５）。他の研究者は、２種の重要なシグナル伝達受容体ＣＤ３ζおよびＣＤ２８が、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞上でダウンレギュレートされること（非特許文献１４；非特許文献３６；非特許文献３７）、また、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞がＦａｓ誘発性のアポトーシスに対しより感受性であること（非特許文献１６）を示した。Ａｐｐａｙら（非特許文献１５）は、ＣＤ２７およびＣＤ２８発現に基づくＨＩＶ、ＥＢＶおよびＣＭＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞間の差違を検査した。早期に分化したＴ細胞はＣＤ２７およびＣＤ２８双方を発現し、そして乏しいエフェクター機能、しかし優れた増殖能力を有した。中間のＴ細胞はＣＤ２７陽性しかしＣＤ２８陰性であり、そしてこれらの細胞は制限された増殖およびエフェクター機能を有した。最も分化したＴ細胞はＣＤ２７およびＣＤ２８双方を欠き、そしてこれらの細胞は増殖能力をほとんど有しなかったが、しかし高められたエフェクター機能を有した。ＨＩＶ特異的Ｔ細胞の大部分が該中間の表現型を有したことが観察された。従って、増殖能力およびエフェクター機能の双方を欠くこの中間のＴ細胞表現型に「留まって」いる細胞は、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞の無効性への要因でありうる（非特許文献１５）。さらに、ＣＤ８ Ｔ細胞の機能はＣＤ４ Ｔ細胞の機能に高度に依存し（非特許文献３８；非特許文献３９；非特許文献４０）、また、ＨＩＶはＣＤ４ Ｔ細胞を標的とするため、ＨＩＶ感染で観察されたＣＤ８ Ｔ細胞の欠点は、Ｔ細胞ヘルプの欠如の結果であり得る。
従って、多様な急性および慢性感染症と闘うためにＴ細胞を刺激し、かつ、養子免疫療法のため十分な数の治療的Ｔ細胞を広める方法を提供するという長年の切実な必要性が存在する。本発明はこれおよび他の必要性をかなえる。
Ｍｅｄａｗａｒ、１９５４、Ｐｒｏｃ．Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃ．１４３：５８−８０ Ｊｕｎｅ，Ｃ．Ｈ．編、２００１、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、ボルチモア中 Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅら、２００３、Ｉｍｍｕｎ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２７：１−１５ Ｌｅｖｉｎｅら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．８：４７−５３ Ｗａｌｋｅｒら、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ ３２８：３４５−３４８ Ｋｏｕｐら、１９９４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：４６５０−４６５５ Ｗａｌｋｅｒら、１９８６、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１５６３−１５６６ Ｚｈａｎｇら、２００２、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８：９９５−１０００ Ｃｏｃｃｈｉら、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：１８１１−１８１５ Ｓｃｈｍｉｔｚら １９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３：８５７−８６０ Ｊｉｎら、１９９９、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：９９１−９９８ Ｚｈａｎｇら、２００３、Ｂｌｏｏｄ １０１：２２６−２３５ Ａｐｐａｙら、２０００、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：６３−７５ Ｔｒｉｍｂｌｅら、２０００、Ｂｌｏｏｄ ９６：１０２１−１０２９ Ａｐｐａｙら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．８、３７９−３８５ Ｍｕｅｌｌｅｒら、２００１、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１５：８７１−８８２ Ｌｅｖｉｎｅら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：１９３９−１９４３ Ｒｉｌｅｙら、１９９７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：５５４５−５５５３ Ｃａｒｒｏｌｌら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：２７３−２７６ Ｗａｌｋｅｒら、２０００、Ｂｌｏｏｄ ９６：４６７−４７４ Ｒａｎｇａら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ９５：１２０１−１２０６ Ｍｉｔｓｕｙａｓｕら、２０００、Ｂｌｏｏｄ ９６：７８５−７９３ Ｄｅｅｋｓら、２００２、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．５：７８８−７９７ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、１９９０、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２３：５７０−５７８ Ｙｅｅら、２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１６１６８−１６１７３ Ｂｒｏｄｉｅら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．、５：３４−４１ Ｒｉｄｄｅｌｌら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２：２１６−２２３ Ｒｉｄｄｅｌｌら、２０００、Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ ６：Ｓ２５０−２５８ Ｒｉｄｄｅｌｌら、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：２３８−２４１ Ｗａｌｔｅｒら、１９９５、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３３：１０３８−１０４４ Ｒｏｏｎｅｙら、１９９５、Ｌａｎｃｅｔ ３４５：９−１３ Ｈｅｓｌｏｐら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２：５５１−５５５ Ｋｏｅｎｉｇら、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１：３３０−３３６ Ｇａｎｄｈｉら、２００２、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５３：１４９−１７２ Ｍｉｇｕｅｌｅｓら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：１０６１−１０６８ Ｔｒｉｍｂｌｅら、１９９８、Ｂｌｏｏｄ ９１：５８５−５９４ Ｔｒｉｍｂｌｅら、２０００、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４；７３２０−７３３０ Ｚａｊａｃら、１９９８、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：２２０５−２２１３ Ｓｈｅｄｌｏｃｋら、２００３、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３００：３３７−３３９ Ｓｕｎら、２００３、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３００：３３９−３４２
［発明の要約］
本発明は、単離された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を包含し、前記ａＡＰＣはレンチウイルスベクター（ＬＶ）を使用して形質導入されたＫ５６２細胞を含んでなり、前記ＬＶは最低１種の免疫刺激リガンドおよび最低１種の共刺激リガンドをコードする核酸を含んでなり、かつ、さらに、前記ａＡＰＣは前記刺激リガンドおよび前記共刺激リガンドを発現しそして前記ａＡＰＣと接触させたＴ細胞を刺激しかつ増殖させ得る。
本発明の一態様において、刺激リガンドは、抗原を負荷された主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ（ＭＨＣクラスＩ）分子、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体および抗ＣＤ２抗体よりなる群から選択されるポリペプチドである。
本発明の別の態様において、前記共刺激リガンドは、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＩＣＡＭ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンβ受容体、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、３／ＴＲ６、およびＢ７−Ｈ３と特異的に結合するリガンドよりなる群から選択される最低１種の共刺激リガンドである。
本発明のなお別の態様において、前記共刺激リガンドは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドよりなる群から選択される共刺激分子の最低１種と特異的に結合する。
本発明のさらに別の態様において、前記共刺激リガンドは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、Ｔｏｌｌリガンド受容体、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドよりなる群から選択される最低１種の分子と特異的に結合する抗体である。
本発明の一態様において、前記ａＡＰＣは、ＣＤ３２分子およびＣＤ６４分子よりなる群から選択されるＦｃγ受容体をさらに含んでなる。
本発明の別の態様において、前記ＬＶは、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、ペプチド−ＭＨＣ四量体、ペプチド−ＭＨＣ三量体、ペプチド−ＭＨＣ二量体、およびペプチド−ＭＨＣ単量体よりなる群から選択される最低１種の抗原をコードする核酸を含んでなる。
本発明のなお別の態様において、前記腫瘍抗原は、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＲＴ−１、ＧＰ１００、ＣＥＡ、ＨＥＲ−２／Ｎｅｕ、ＰＳＡ、ＷＴ−１、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ−３、ＭＵＣ−４およびテロメラーゼよりなる群から選択される。
本発明のさらに別の態様において、前記ＬＶは、サイトカインおよびケモカインから選択される最低１種のペプチドをコードする核酸を含んでなる。
本発明のなお別の態様において、前記サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、インターフェロン−α（ＩＦＮα）、インターフェロン−β（ＩＦＮβ）、インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）、腫瘍壊死因子−β（ＴＮＦβ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）よりなる群から選択される最低１種のサイトカインである。
本発明は、既知の共刺激分子を発現するＴ細胞の増殖の特異的誘導方法を包含し、前記方法は、前記Ｔ細胞を本発明のａＡＰＣと接触させることを含んでなり、さらに、前記共刺激リガンドは前記既知の共刺激分子と特異的に結合して、それにより前記Ｔ細胞の増殖を特異的に誘導する。
本発明は、既知の共刺激分子を発現するＴ細胞の増殖の特異的誘導方法を包含し、前記方法は、前記既知の共刺激分子を発現する最低１種のＴ細胞を含んでなるＴ細胞の集団を本発明のａＡＰＣと接触させることを含んでなり、前記ａＡＰＣは前記既知の共刺激分子と特異的に結合する最低１種の共刺激リガンドを発現し、前記既知の共刺激分子の前記共刺激リガンドとの結合が、前記Ｔ細胞の増殖を誘導する。
本発明は、Ｔ細胞集団のサブセットの特異的増殖方法を包含し、前記方法は、前記サブセットの最低１種のＴ細胞を含んでなるＴ細胞の集団を本発明のａＡＰＣと接触させることを含んでなり、前記ａＡＰＣは前記サブセットの前記Ｔ細胞上の共刺激分子と特異的に結合する最低１種の共刺激リガンドを含んでなり、前記共刺激分子の前記共刺激リガンドとの結合が前記サブセットの前記Ｔ細胞の増殖を誘導し、それによりＴ細胞集団の１サブセットを特異的に増殖させる。
本発明は、Ｔ細胞サブセットの活性化を特異的に誘導する共刺激リガンド若しくはその組合せの同定方法を包含し、前記方法は、本発明のａＡＰＣとＴ細胞の集団を接触させること、および、前記Ｔ細胞集団の増殖のレベルを、前記ａＡＰＣと接触されないＴ細胞のそれ以外は同一の集団の増殖のレベルと比較することを含んでなり、前記ａＡＰＣと接触されないＴ細胞の前記それ以外は同一の集団の増殖のレベルと比較した、前記ａＡＰＣと接触させた前記Ｔ細胞の増殖のより高いレベルが、前記共刺激リガンドが前記Ｔ細胞の活性化を特異的に誘導することの指標である。
本発明は、哺乳動物における抗原に対するＴ細胞応答の誘導方法を包含し、前記方法は本発明のａＡＰＣを前記哺乳動物に投与することを含んでなり、前記ａＡＰＣは前記抗原を負荷されたＭＨＣクラスＩ分子をさらに含んでなり、前記ａＡＰＣは、前記抗原に特異的なＴ細胞の増殖を誘導して、それにより前記哺乳動物における前記抗原に対するＴ細胞応答を誘導する。
本発明は、それの必要な哺乳動物における抗原に対するＴ細胞応答の誘導方法を包含し、前記方法は、前記哺乳動物から細胞の集団を得ること（前記集団はＴ細胞を含んでなる）、細胞の前記集団を本発明のａＡＰＣと接触させること（前記ａＡＰＣは前記抗原を負荷されたＭＨＣクラスＩ複合体をさらに含んでなり、それにより、前記細胞を前記ａＡＰＣと接触させることが、前記抗原に特異的な抗原特異的Ｔ細胞の増殖を誘導する）、前記抗原特異的Ｔ細胞を細胞の前記集団から単離すること、および前記抗原特異的Ｔ細胞を前記哺乳動物に投与して、それにより前記哺乳動物において前記抗原に対するＴ細胞応答を誘導することを含んでなる。
本発明は、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の集団の特異的増殖方法を包含し、該方法は前記集団を請求項１に記載のａＡＰＣと接触させることを含んでなり、前記ａＡＰＣは抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を負荷されたＦｃγ受容体をさらに含んでなり、該方法は、細胞の前記集団をサイトカインと接触させることをさらに含んでなり、前記抗ＣＤ３抗体および前記抗ＣＤ２８抗体の前記Ｔｒｅｇ細胞との結合が前記Ｔｒｅｇ細胞の増殖を誘導し、それによりＴｒｅｇ細胞の集団を特異的に増殖させる。
本発明の一態様において、前記サイトカインはインターロイキン−２である。
本発明は、既知の共刺激分子を発現するＴ細胞の増殖を特異的に誘導するためのキットを包含し、前記キットは有効量のａＡＰＣを含んでなり、前記ａＡＰＣはレンチウイルスベクター（ＬＶ）を使用して形質導入されたＫ５６２細胞を含んでなり、前記ＬＶは前記既知の共刺激分子を特異的に結合する最低１種の共刺激リガンドをコードする核酸を含んでなり、前記既知の共刺激分子の前記共刺激リガンドとの結合が前記Ｔ細胞を刺激しかつ増殖させ、前記キットは、アプリケーター、および前記キットの使用のための説明資料をさらに含んでなる。
本発明は、既知の刺激分子を発現するＴ細胞の増殖を特異的に誘導するためのキットを包含し、前記キットは有効量のａＡＰＣを含んでなり、前記ａＡＰＣはレンチウイルスベクター（ＬＶ）を使用して形質導入されたＫ５６２細胞を含んでなり、前記ＬＶは前記既知の刺激分子を特異的に結合する最低１種の刺激リガンドをコードする核酸を含んでなり、前記既知の刺激分子の前記刺激リガンドとの結合が前記Ｔ細胞を刺激しかつ増殖させ、前記キットは、アプリケーター、および前記キットの使用のための説明資料をさらに含んでなる。
本発明は、Ｔ細胞集団のサブセットを特異的に増殖させるためのキットを包含し、前記キットは有効量のａＡＰＣを含んでなり、前記ａＡＰＣはレンチウイルスベクター（ＬＶ）を使用して形質導入されたＫ５６２細胞を含んでなり、前記ＬＶは前記Ｔ細胞集団上の共刺激分子を特異的に結合する最低１種の共刺激リガンドをコードする核酸を含んでなり、前記共刺激分子の前記共刺激リガンドとの結合が前記Ｔ細胞集団を刺激しかつ増殖させ、前記キットは、アプリケーター、および前記キットの使用のための説明資料をさらに含んでなる。
本発明は、Ｔ細胞サブセットの活性化を特異的に誘導する、共刺激リガンド若しくは前記リガンドの組合せを同定するためのキットを包含し、前記キットは複数のａＡＰＣを含んでなり、各前記ａＡＰＣはレンチウイルスベクター（ＬＶ）を使用して形質導入されたＫ５６２細胞を含んでなり、前記ＬＶは共刺激分子と特異的に結合する最低１種の既知の共刺激リガンドをコードする核酸を含んでなり、前記キットは、アプリケーター、および前記キットの使用のための説明資料をさらに含んでなる。
［発明の詳細な記述］
本発明は、レンチウイルスベクターを使用して、多数のＴ細胞刺激および共刺激リガンド、ならびにそれらに対する抗体、ならびに、とりわけ抗原、サイトカインを安定に発現するａＡＰＣを効率的に製造し得るという驚くべき発見に関する。本発明はまた、製造される新規ａＡＰＣ、ならびに所望のＴ細胞を増殖させ、特定のＴ細胞サブセットを活性化しかつ／若しくは増殖させ、特定のＴ細胞サブセットの増殖を促進し得る刺激分子、共刺激分子およびそれらの組合せを同定するためのそれらの使用方法、ならびに該新規ａＡＰＣを使用するＴ細胞の増殖および刺激に関する多数の治療的用途にも関する。
本明細書に開示されるデータにより示されるとおり、Ｔ細胞活性化に際して、ＩＦＮγのような因子が分泌され、それらは順にＫ５６２細胞中でのＩＬ−１５のようなサイトカインおよびＢ７−Ｈ３のような共刺激リガンドの発現を誘導する（Ｔｈｏｍａｓら、２００２、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０５：２５９−２７２）。ａＡＰＣとＴ細胞の間の交換すなわち「クロストーク」は、細胞に基づくａＡＰＣがビーズに基づくａＡＰＣより効率的なＴ細胞増殖系である理由である。これらの細胞が継続的に更新可能な「在庫があり入手可能な」樹状細胞（ＤＣ）置換系であるようなＫ５６２細胞が工作される。ａＡＰＣの使用は、細胞培養のためのＡＰＣの供給源としての自己ＤＣを生成させるのに必要とされる時間および費用を未然に除くとみられる。付加的な共刺激シグナルは、ＨＩＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞からのエフェクター機能をレスキューするために必要とみられ、また、本明細書のデータにより示されるとおり、ａＡＰＣ細胞はこうしたシグナルを所望のとおり発現するよう改変し得る。再度、これは、Ｔ細胞のあるサブセットを増殖させることを必要としうる付加的な共刺激シグナルを追加することを包含しない、ビーズに基づく系を上回る一利点である。
以前、細胞に基づくａＡＰＣは、ＣＤ３２および４−１ＢＢＬ発現プラスミドを用いるＫ５６２細胞の電気穿孔法により創製された。薬物選択、細胞分取および限界希釈の組合せを使用して、高発現クローンが単離された（Ｍａｕｓら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１４３−１４８）。有効ではあるものの、このアプローチは時間がかかり、かつ、薬物選択マーカーを使用することの必要性により制限されるの双方である。薬物選択の依存は、Ｋ５６２細胞に導入され得る構築物の数を制限し、そして臨床使用が企図される場合にＧＭＰ遵守の問題を引き起こす。
定義
本明細書で使用されるところの以下の用語のそれぞれは、この節でそれと関連した意味するところを有する。
冠詞「ａ」および「ａｎ」（１つの）は、該冠詞の文法上の目的語の１つ若しくは１つ以上（すなわち最低１つ）を指すために本明細書で使用する。例として、「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ」（要素）は１個の要素若しくは１個以上の要素を意味している。
本明細書で使用されるところの疾患を「軽減する」ことは、疾患の１種若しくはそれ以上の症状の重症度を低下させることを意味している。
本明細書で使用されるところの「アミノ酸」は、以下の表に示されるところのそれらの完全な名称、それらに対応する三文字記号、若しくはそれらに対応する一文字記号により表される：
「アンチセンス」は、とりわけ、タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の非コーディング鎖の核酸配列、若しくは該非コーディング鎖に実質的に相同である配列を指す。本明細書で定義されるところのアンチセンス配列は、タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の配列に相補的である。アンチセンス配列が該ＤＮＡ分子のコーディング鎖のコーディング部分のみに相補的であることは必要でない。アンチセンス配列は、タンパク質をコードするＤＮＡ分子のコーディング鎖上の指定される制御配列に対し相補的であることができ、その制御配列は該コーディング配列の発現を制御する。
該用語が本明細書で使用されるところの「アプリケーター」という用語により、本発明の化合物および組成物を投与するための、限定されるものでないが皮下注射器、ピペットなどを挙げることができるいかなる装置も意味している。
「疾患」は、動物が恒常性を維持し得ない、および該疾患が軽減されない場合には該動物の健康状態が悪化し続ける、動物の一健康状態である。対照的に、動物における「障害」は、該動物が恒常性を維持することが可能であるが、しかし、該動物の健康状態がそれが該障害の非存在下にありうるよりも少なく好都合である健康状態である。処置されないまま放置されれば、障害は動物の健康状態の将来の低下を必ずしも引き起こすわけではない。
本明細書で使用されるところの「有効量」という用語により、哺乳動物に投与される場合に、該化合物の非存在下で検出されるＴ細胞応答に比較してのＴ細胞応答の検出可能なレベルを引き起こす量を意味している。Ｔ細胞応答は、無数の技術に認識される方法により容易に評価され得る。
当業者は、本明細書で投与される化合物若しくは組成物の量が変動し、また、処置されている疾患若しくは状態、処置されている哺乳動物の齢ならびに健康および身体状態、疾患の重症度、投与されている特定の化合物などのような多数の因子に依存して容易に決定され得ることを理解するであろう。
該用語が本明細書で使用されるところの「説明資料」は、本明細書で列挙される多様な疾患若しくは障害を軽減若しくは処置することを遂げるためのキット中の本発明の組成物および／若しくは化合物の有用性を知らせるのに使用し得る、刊行物、録音・録画、図若しくはいかなる他の表現媒体も包含する。場合によっては、若しくはあるいは、説明資料は、本明細書の別の場所に開示されるところを包含する細胞若しくは組織若しくは哺乳動物における疾患若しくは障害の１種若しくはそれ以上の軽減方法を記述しうる。
キットの説明資料は、例えば、本発明の化合物および／若しくは組成物を含有する容器に付属されうるか、または該化合物および／若しくは組成物を含有する容器と一緒に発送されうる。あるいは、説明資料は、受領者が該説明資料および化合物を共同して使用するという意図をもって、容器と別個に発送されうる。
本明細書で使用されるところの「製薬学的に許容できる担体」という用語は、有効成分が組合せられることができかつ組合せ後に被験者に有効成分を投与するのに使用し得る化学物質組成物を意味している。
本明細書で使用されるところの「生理学的に許容できる」エステル若しくは塩という用語は、製薬学的組成物が投与されることになる被験体にとって有害でない、該組成物のいかなる他の成分とも適合性である有効成分のエステル若しくは塩の形態を意味している。
本発明のタンパク質「をコードする核酸の一部分若しくは全部に対し相補的」により、例えば共刺激リガンドタンパク質をコードしない核酸の配列を意味している。むしろ、細胞中で発現されている配列は、該タンパク質をコードする核酸の非コーディング鎖に同一であり、そして従って該タンパク質をコードしない。
本明細書で使用されるところの「共刺激」および「アンチセンス」という用語は全くの同義ではない。「アンチセンス」は、とりわけ、タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の非コーディング鎖の核酸配列、若しくは該非コーディング鎖に実質的に相同である配列を指す。
本明細書で使用されるところの「相補的」は、２種の核酸、例えば２種のＤＮＡ分子の間のサブユニットの配列の相補性の広範な概念を指す。該分子の双方中のあるヌクレオチド位置が相互と塩基対形成することが通常可能なヌクレオチドにより占有される場合には、該核酸はこの位置で相互に対し相補的であるとみなされる。従って、２種の核酸は、該分子のそれぞれ中の実質的な数の対応する位置（最低５０％）が、通常相互と塩基対形成する（例えばＡ：ＴおよびＧ：Ｃヌクレオチド対）ヌクレオチドにより占有されている場合に、相互に対し相補的である。本明細書で定義されるところのアンチセンス配列は、タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の配列に相補的である。アンチセンス配列がＤＮＡ分子のコーディング鎖のコーディング部分のみに相補的であることは必要でない。アンチセンス配列は、タンパク質をコードするＤＮＡ分子のコーディング鎖上の指定される制御配列に相補的であることができ、その制御配列はコーディング配列の発現を制御する。
遺伝子の「コーディング領域」は、該遺伝子の転写により産生されるｍＲＮＡ分子のコーディング領域とそれぞれ相同であるか若しくはそれに相補的である、該遺伝子のコーディング鎖のヌクレオチド残基、および該遺伝子の非コーディング鎖のヌクレオチドよりなる。
ｍＲＮＡ分子の「コーディング領域」もまた、ｍＲＮＡ分子の転写の間に転移ＲＮＡ分子のアンチコドン領域と一致するか若しくは終止コドンをコードするｍＲＮＡ分子のヌクレオチド残基よりなる。コーディング領域は、従って、ｍＲＮＡ分子によりコードされる成熟タンパク質中に存在しないアミノ酸残基（例えばタンパク質輸出シグナル配列中のアミノ酸残基）に対応するヌクレオチド残基を包含しうる。
「コードすること」は、ヌクレオチドの定義された配列（すなわちｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）若しくはアミノ酸の定義された配列のいずれかを有する、生物学的過程において他のポリマーおよび巨大分子の合成のための鋳型としてはたらく、遺伝子、ｃＤＮＡ若しくはｍＲＮＡのようなポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性、ならびにそれら由来の生物学的特性を指す。従って、遺伝子は、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞若しくは他の生物学的系中でタンパク質を産生する場合にタンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列に同一でありかつ通常は配列表に提供されるコーディング鎖、および遺伝子若しくはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コーディング鎖の双方が、その遺伝子若しくはｃＤＮＡのタンパク質若しくは他の産物をコードすると称され得る。
別の方法で明記されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、相互の縮重バージョンでありかつ同一のアミノ酸配列をコードする、全部のヌクレオチド配列を包含する。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列はイントロンを包含しうる。
「発現ベクター」は、発現されるべきヌクレオチド配列に効果的に連結された発現制御配列を含んでなる組換えポリヌクレオチドを含んでなるベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なｃｉｓに作用する要素を含んでなり；発現のための他の要素は、宿主細胞により、若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系中で供給され得る。発現ベクターは、組換えポリヌクレオチドを組み込む、コスミド、プラスミド（例えば裸の若しくはリポソーム中に含有される）、ならびにウイルス（例えばレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような、当該技術分野で既知の全部のものを包含する。
オリゴヌクレオチドの第一の領域は、２領域が相互に隣接する場合、若しくは２領域が約１０００ヌクレオチド残基を超えない、および好ましくは約１００ヌクレオチド残基を超えないだけ離れている場合に、該オリゴヌクレオチドの第二の領域に「隣接する」。
本明細書で使用されるところの、核酸に適用されるところの「フラグメント」という用語は、通常、長さ最低約１８ヌクレオチド、好ましくは最低約２４ヌクレオチド、より典型的には約２４から約５０ヌクレオチドまで、好ましくは最低約５０ないし約１００ヌクレオチド、なおより好ましくは最低約１００ヌクレオチドないし約２００ヌクレオチド、さらになおより好ましくは最低約２００ないし約３００、なおより好ましくは最低約３００ヌクレオチドないし約４００ヌクレオチド、さらになおより好ましくは最低約４００ないし約５００であることができ、そして、最も好ましくは、核酸フラグメントは長さが約５００ヌクレオチドより大きいことができる。
タンパク質に適用されるところの刺激若しくは共刺激リガンドタンパク質または抗原の「フラグメント」は長さが約６アミノ酸である。より好ましくは、タンパク質のフラグメントは、長さが約８アミノ酸、なおより好ましくは最低約１０、なおより好ましくは最低約１５、なおより好ましくは最低約２０、なおより好ましくは最低約３０、なおより好ましくは約４０、およびより好ましくは最低約５０、より好ましくは最低約６０、なおより好ましくは最低約７０、なおより好ましくは最低約８０、ならびにより好ましくは最低約１００アミノ酸長さのアミノ酸である。
「ゲノムＤＮＡ」は、それが天然の宿主中で存在するところの遺伝子と相同なヌクレオチド配列を有するＤＮＡ鎖である。例として、染色体のフラグメントはゲノムＤＮＡである。
本明細書で使用されるところの「相同な」は、２種のポリマー分子間、例えば２種の核酸分子、例えば２種のＤＮＡ分子若しくは２種のＲＮＡ分子間、または２種のポリペプチド分子間のサブユニット配列の類似性を指す。該２種の分子の双方中のあるサブユニット位置が同一の単量体サブユニットにより占有される場合、例えば、２種のＤＮＡ分子のそれぞれ中の一位置がアデニンにより占有される場合には、それらはその位置で完全にすなわち１００％相同である。２配列間の相同性パーセントは、一致する若しくは相同な位置の数の直接の関数であり、例えば、２種の化合物の配列中の位置の半分（例えば長さ１０サブユニットのポリマー中の５位置）が相同である場合には、該２配列は５０％同一であり、位置の９０％、例えば１０のうち９が一致する若しくは相同である場合は、該２配列は９０％の相同性を共有する。例として、ＤＮＡ配列５’ＡＴＴＧＣＣ３’および５’ＴＡＴＧＧＣ３’は５０％の相同性を共有する。
加えて、「相同性」若しくは「同一性」という用語が核酸およびタンパク質を指すのに本明細書で使用される場合は、それは核酸およびアミノ酸配列双方のレベルでの相同性若しくは同一性に適用されると解釈されるべきである。
「単離された核酸」は、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から分離されている核酸セグメント若しくはフラグメント、例えば、該フラグメントに通常隣接する配列、例えばそれが天然に存在するゲノム中のフラグメントに隣接する配列から取り出されたＤＮＡフラグメントを指す。該用語は、細胞中でそれに天然に付随する核酸、例えばＲＮＡ若しくはＤＮＡまたはタンパク質に天然に付随する他の成分から実質的に精製された核酸にもまた当てはまる。該用語は、従って、例えばベクター、自律複製プラスミド若しくはウイルス、または原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれているか、あるいは他の配列から独立した別個の分子として（例えば、ＰＣＲ若しくは制限酵素消化により生じられたｃＤＮＡまたはゲノム若しくはｃＤＮＡフラグメントとして）存在する組換えＤＮＡを包含する。それはまた、付加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも包含する。
本発明の文脈において、一般に存在する核酸塩基の以下の略語を使用する。「Ａ」はアデノシンを指し、「Ｃ」はシチジンを指し、「Ｇ」はグアノシンを指し、「Ｔ」はチミジンを指し、そして「Ｕ」はウリジンを指す。
２種のポリヌクレオチドを「操作可能に連結される」として記述することにより、一本鎖若しくは二本鎖核酸部分が、該２種のポリヌクレオチドの最低１種が、それが他者に対して特徴づけられる生理学的効果を発揮することが可能であるような様式で、核酸部分内に配置された２種のポリヌクレオチドを含んでなることを意味している。例として、ある遺伝子のコーディング領域に操作可能に連結されたプロモーターは、該コーディング領域の転写を促進することが可能である。
好ましくは、所望のタンパク質をコードする核酸がプロモーター／制御配列をさらに含んでなる場合、該プロモーター／制御は、それが細胞中での該所望のタンパク質の発現を駆動するような、所望のタンパク質コーディング配列の５’端に配置される。一緒にすれば、所望のタンパク質およびそのプロモーター／制御配列をコードする核酸は「導入遺伝子」を含んでなる。
本明細書で使用されるところの「プロモーター／制御配列」という用語は、該プロモーター／制御配列に操作可能に連結された遺伝子産物の発現に必要とされる核酸配列を意味している。いくつかの場合には、この配列はコアプロモーター配列であることができ、そして、他の場合には、この配列は、エンハンサー配列、および該遺伝子産物の発現に必要とされる他の調節エレメントもまた包含しうる。プロモーター／制御配列は、例えば組織特異的様式で遺伝子産物を発現するものでありうる。
「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコード若しくは指定するポリヌクレオチドと操作可能に連結される場合に、細胞の大部分の若しくは全部の生理学的条件下の生存ヒト細胞中で該遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列である。
「誘導可能な」プロモーターは、遺伝子産物をコード若しくは指定するポリヌクレオチドと操作可能に連結される場合に、実質的に該プロモーターに対応する誘導物質が細胞中に存在する場合にのみ生存ヒト細胞中で該遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列である。
「部位特異的」プロモーターは、遺伝子産物をコード若しくは指定するポリヌクレオチドと操作可能に連結される場合に、実質的に細胞が該プロモーターに対応する組織型の細胞である場合にのみ生存ヒト細胞中で該遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列である。
「ポリアデニル化配列」は、転写されたメッセンジャーＲＮＡ配列へのポリＡ尾部の付加を指図するポリヌクレオチド配列である。
「ポリヌクレオチド」は、核酸の一本鎖若しくは平行および反平行鎖を意味している。従って、ポリヌクレオチドは一本鎖若しくは二本鎖いずれの核酸でもありうる。
「核酸」という用語は、典型的に大型のポリヌクレオチドを指す。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、典型的に、一般には約５０ヌクレオチドを超えない短いポリヌクレオチドを指す。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（すなわちＡ、Ｔ、ＧＣ）により表される場合に、これは「Ｕ」が「Ｔ」の変わりに用いられるＲＮＡ配列（すなわちＡ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）もまた包含することが理解されるであろう。
ポリヌクレオチド配列を記述するのに慣習的表記法を本明細書で使用する。すなわち、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端が５’端であり；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左の方向は５’の方向と称される。
生来のＲＮＡ転写物へのヌクレオチドの５’ないし３’付加の方向が転写方向と称される。ｍＲＮＡと同一の配列を有するＤＮＡ鎖は「コーディング鎖」と称され；該ＤＮＡ上の参照点に対し５’に位置する該ＤＮＡ鎖上の配列は「上流配列」と称され；該ＤＮＡ上の参照点に対し３’である該ＤＮＡ鎖上の配列は「下流配列」と称される。
ポリヌクレオチドの一「部分」は、該ポリヌクレオチドの最低少なくとも約２０の連続したヌクレオチド残基を意味している。ポリヌクレオチドの一部分は該ポリヌクレオチドのすべてのヌクレオチド残基を包含しうることが理解される。
「プライマー」は、指定されたポリヌクレオチド鋳型に特異的にハイブリダイズしかつ相補ポリヌクレオチドの合成のための開始点を提供することが可能であるポリヌクレオチドを指す。こうした合成は、合成が誘発される条件下、すなわちヌクレオチド、相補ポリヌクレオチド鋳型、およびＤＮＡポリメラーゼのような重合のための剤の存在下にポリヌクレオチドプライマーが置かれる場合に起こる。プライマーは典型的には一本鎖であるが、しかし二本鎖であってもよい。プライマーは典型的にはデオキシリボ核酸であるが、しかし多様な合成および天然に存在するプライマーが多くの応用に有用である。プライマーは、合成の開始の部位としてはたらくためにそれにハイブリダイズするようそれが設計されている鋳型に対し相補的であるが、しかし該鋳型の正確な配列を反映する必要はない。こうした場合には、鋳型へのプライマーの特異的ハイブリダイゼーションはハイブリダイゼーション条件の緊縮性に依存する。プライマーは、例えば色素生産性、放射活性若しくは蛍光部分で標識し得、そして検出可能な部分として使用し得る。
「プローブ」は、別のポリヌクレオチドの指定された配列に特異的にハイブリダイズすることが可能であるポリヌクレオチドを指す。プローブは標的の相補ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするが、しかし鋳型の正確な相補配列を反映する必要はない。こうした場合には、標的へのプローブの特異的ハイブリダイゼーションはハイブリダイゼーション条件の緊縮性に依存する。プローブは、例えば色素生産性、放射活性若しくは蛍光部分で標識し得、そして検出可能な部分として使用し得る。
「組換えポリヌクレオチド」は、天然に一緒に結合されない配列を有するポリヌクレオチドを指す。増幅若しくは集成した組換えポリヌクレオチドを適するベクター中に包含することができ、そして該ベクターを使用して適する宿主細胞を形質転換し得る。
組換えポリヌクレオチドは、非コーディング機能（例えばプロモーター、複製起点、リボソーム結合部位など）を同様に供しうる。
「組換えポリペプチド」は組換えポリヌクレオチドの発現に際して産生されるものである。
「ポリペプチド」は、アミノ酸残基から構成されるポリマー、関係する天然に存在する構造バリアント、ならびにペプチド結合を介して連結されたそれらの合成の天然に存在しないアナログ、関係する天然に存在する構造バリアント、およびそれらの合成の天然に存在しないアナログを指す。合成ポリペプチドは、例えば自動ポリペプチド合成機を使用して合成し得る。
「タンパク質」という用語は典型的に大型のポリペプチドを指す。
「ペプチド」という用語は典型的に短いポリペプチドを指す。
ポリペプチド配列の特徴を描くのに本明細書で慣習的表記法を使用する。すなわち、ポリペプチド配列の左端がアミノ末端であり；ポリペプチド配列の右端がカルボキシル末端である。
本明細書で使用されるところの「レポーター遺伝子」という用語は、その発現が既知の方法を使用して検出され得る遺伝子を意味している。例として、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｌｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のｌａｃＺ遺伝子を培地中でのレポーター遺伝子として使用しうる。ｌａｃＺ遺伝子の発現は、ｏ−ニトロフェニル−β−ガラクトシドのような色素生産性基質を培地に添加することにより、既知の方法を使用して検出し得るからである（Ｇｅｒｈａｒｄｔら編、１９９４、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、ワシントンＤＣ、ｐ．５７４）。
「制限部位」は制限エンドヌクレアーゼにより認識される二本鎖核酸の一部分である。
第一のオリゴヌクレオチドは、最低約７３％、より好ましくは最低約７５％、なおより好ましくは最低約８０％、なおより好ましくは最低約８５％、なおより好ましくは最低約９０％、および最も好ましくは最低約９５％相補的であるオリゴヌクレオチドのみが相互とアニーリングする条件下で２種のオリゴヌクレオチドがアニーリングする場合に、「高緊縮性で」第二のオリゴヌクレオチドとアニーリングする。２種のオリゴヌクレオチドをアニーリングするのに使用される条件の緊縮性は、とりわけ、アニーリング媒体の（欠落）温度、イオン強度、インキュベーション時間、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドのＧ−Ｃ含量、および既知の場合は該２種のオリゴヌクレオチド間の非相同性の期待される程度の関数である。アニーリング条件の緊縮性の調節方法は既知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨークを参照されたい）。
本明細書で使用されるところの「導入遺伝子」という用語は、外因性核酸がトランスジェニック細胞若しくは哺乳動物によりコードされる外因性核酸配列を意味している。
「組換え細胞」は導入遺伝子を含んでなる細胞である。こうした細胞は真核生物細胞でも若しくは原核生物細胞でもありうる。また、トランスジェニック細胞は、限定されるものでないが、ａＡＰＣ、導入遺伝子を含んでなる胚性幹細胞、細胞が導入遺伝子を含んでなるトランスジェニックＥＳ細胞由来のキメラ哺乳動物から得られる細胞、トランスジェニック哺乳動物から得られる細胞、またはその胎児若しくは胎盤組織、および該導入遺伝子を含んでなる原核生物細胞を挙げることができる。
「外因性核酸」という用語により、細胞若しくは動物中への核酸の導入を助長する目的上開発された技術を使用して核酸が細胞若しくは動物中に導入されたことを意味している。
「標識」ポリペプチドは、目的のタンパク質にペプチド結合により連結された場合に、タンパク質の位置を推定するため、それを細胞抽出物から精製するため、それを結合アッセイでの使用のため固定するため、またはその生物学的特性および／若しくは機能を別の方法で研究するために使用しうる、いかなるタンパク質も意味している。
本明細書で使用されるところの「処置する」ことは、疾患（すなわちウイルス感染症、腫瘍増殖および／若しくは転移、または、Ｔ細胞の減少された数および／若しくは低下された活性により媒介される他の効果など）の症状が患者により経験される頻度を低下させることを意味している。
本明細書で使用されるところの「ベクター」という用語により、外因性核酸をコードするいかなるプラスミド若しくはウイルスも意味している。該用語は、例えばポリリシン化合物などのような、ビリオン若しくは細胞中への核酸の移入を容易にする非プラスミドおよび非ウイルス化合物を包含するともまた解釈されるべきである。ベクターは、本発明のタンパク質および／若しくは抗体をコードする核酸の患者若しくはａＡＰＣへの送達のための送達ベヒクルとして適するウイルスベクターでありうるか、または、ベクターは、同一の目的上適する非ウイルスベクターでありうる。
細胞および組織へのＤＮＡの送達のためのウイルスおよび非ウイルスベクターの例は当該技術分野で公知であり、そして例えばＭａら（１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１２７４４−１２７４６）に記述されている。ウイルスベクターの例は、限定されるものでないがレンチウイルスベクター、組換えアデノウイルス、組換えレトロウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス、組換え鶏痘ウイルスなどを挙げることができる（Ｃｒａｎａｇｅら、１９８６、ＥＭＢＯ Ｊ．５：３０５７−３０６３；１９９４年８月１８日公開の国際特許出願第ＷＯ９４／１７８１０号明細書；１９９４年１０月２７日公開の国際特許出願第ＷＯ９４／２３７４４号明細書）。非ウイルスベクターの例は、限定されるものでないがリポソーム、ＤＮＡのポリアミン誘導体などを挙げることができる。
「治療的」処置は、病的状態の兆候を縮小若しくは排除しかつ／またはそれらの兆候の頻度、持続期間および強度を低下若しくは減少させる目的上、該兆候を表す患者に投与される処置である。
化合物の「有効量」は、Ｔ細胞のそれ以外は同一の集団、またはａＡＰＣ若しくはそれにより増殖されたＴ細胞が投与されない哺乳動物に比較した場合に、ａＡＰＣが投与されかつ／若しくはそれと接触されるＴ細胞の集団若しくは哺乳動物に検出可能な効果を提供するのに十分である細胞（例えば、ａＡＰＣまたはそれにより刺激かつ／若しくは増殖されたＴ細胞）の量である。
当業者は、有効量が変動し、かつ、処置されている疾患若しくは状態、処置されている哺乳動物の齢ならびに健康および身体状態、疾患の重症度、投与されている特定の化合物若しくは細胞、ａＡＰＣ若しくはそれにより増殖されたＴ細胞の活性若しくは発現のレベルなどのような多数の因子に基づき容易に決定し得ることを理解するであろう。一般に、有効量は約０．１ｍｇ／ｋｇないし約１００ｍｇ／ｋｇの間、より好ましくは約１ｍｇ／ｋｇおよび２５ｍｇ／ｋｇから設定することができる。化合物若しくは細胞（例えば、サイトカイン、刺激分子若しくはそれに対するリガンド、共刺激分子若しくはそれに対するリガンド、リガンドと特異的に結合する抗体、こうしたタンパク質をコードする核酸、ａＡＰＣ、それにより増殖されたＴ細胞など）は静脈内注入により投与し得るか、または腫瘍部位に送達し得、そしてとりわけボーラス注入を包含する。しかしながら、本発明はこれ若しくはいずれかの他の投与方法に制限されない。
「治療的」処置は、病的状態の兆候を縮小若しくは排除しかつ／またはそれらの兆候の頻度、持続期間および強度を低下若しくは減少させる目的上、該兆候を表す患者に投与される処置である。
「刺激」という用語により、そのコグネイトのリガンドとの刺激分子（例えばＴＣＲ／ＣＤ３複合体）の結合により誘導されて、それにより限定されるものでないがＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介するシグナル伝達を挙げることができるシグナル伝達事象を媒介する、一次応答を意味している。刺激はＴＧＦ−βのダウンレギュレーションのようなある分子の変えられた発現、および／若しくは細胞骨格構造の再構成などを媒介し得る。
本明細書で使用されるところの「活性化」は、検出可能な細胞増殖を誘導するのに十分に刺激されたＴ細胞の状態を指す。活性化は、誘導されたサイトカイン産生および検出可能なエフェクター機能もまた伴い得る。「活性化されたＴ細胞」という用語は、とりわけ、細胞分裂を受けているＴ細胞を指す。
本明細書で使用されるところの「特異的に結合する」という用語により、サンプル中に存在するコグネイトの結合パートナー（例えばＴ細胞上に存在する刺激および／若しくは共刺激分子）タンパク質を認識かつそれと結合する抗体若しくはリガンドを意味しているが、しかしその抗体若しくはリガンドはサンプル中の他の分子を実質的に認識若しくは結合しない。
本明細書で使用されるところの「刺激リガンド」は、抗原提示細胞（例えばａＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞など）上に存在する場合にＴ細胞上のコグネイトの結合パートナー（本明細書で「刺激分子」と称される）と特異的に結合し得、それにより、限定されるものでないが免疫応答の活性化、開始、増殖などを挙げることができるＴ細胞による一次応答を媒介するリガンドを意味している。刺激リガンドは当該技術分野で公知であり、そして、とりわけ、ペプチドを負荷されたＭＨＣクラスＩ分子、抗ＣＤ３抗体、スーパーアゴニスト抗ＣＤ２８抗体、およびスーパーアゴニスト抗ＣＤ２抗体を包含する。
該用語が本明細書で使用されるところの「刺激分子」は、抗原提示細胞（例えばとりわけ本発明のａＡＰＣ）上に存在するコグネイトの刺激リガンドと特異的に結合するＴ細胞上の分子を意味している。
本明細書で使用されるところのペプチドを「負荷される」は、ＭＨＣ分子の情況の抗原の提示を指す。本明細書で使用されるところの「負荷される」は、ＣＤ３２および／若しくはＣＤ６４のような細胞上のＦｃ結合受容体への抗体の結合もまた意味している。
該用語が本明細書で使用されるところの「共刺激リガンド」は、Ｔ細胞上のコグネイトの共刺激分子を特異的に結合してそれにより例えばペプチドを負荷されたＭＨＣ分子とのＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合により提供される一次シグナルに加えて限定されるものでないが増殖、活性化、分化などを挙げることができるＴ細胞応答を媒介するシグナルを提供する、抗原提示細胞（例えばａＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞など）上の分子を包含する。共刺激リガンドは、限定されるものでないが、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導可能な共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンβ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＨＶＥＭ、Ｔｏｌｌリガンド受容体を結合するアゴニスト若しくは抗体、およびＢ７−Ｈ３と特異的に結合するリガンドを挙げることができる。共刺激リガンドは、とりわけ、限定されるものでないがＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドを挙げることができる、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体もまた包含する。
「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合して、それにより、限定されるものでないが増殖を挙げることができるＴ細胞による共刺激応答を媒介する、Ｔ細胞上のコグネイトの結合パートナーを指す。共刺激分子は、限定されるものでないがＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡおよびＴｏｌｌリガンド受容体を挙げることができる。
本明細書で使用されるところの「スーパーアゴニスト抗体」は、Ｔ細胞上の分子と特異的に結合しかつＴＣＲ／ＣＤ３複合体若しくはＴ細胞上のＣＤ２の相互作用を伴わずにＴ細胞中での一次活性化シグナル事象を媒介し得る抗体を意味している。こうしたスーパーアゴニスト抗体は、限定されるものでないがスーパーアゴニスト抗ＣＤ３抗体、スーパーアゴニスト抗ＣＤ２８抗体およびスーパーアゴニスト抗ＣＤ２抗体を挙げることができる。
「スーパーアゴニスト」と称されない限り、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ２８抗体などは、本明細書の別の場所で定義されるところの共刺激リガンドであり、そして一次活性化シグナルよりはむしろ共刺激シグナルを提供する。
該用語が本明細書で使用されるところの疾患を「処置する」ことは、１種若しくはそれ以上の症状疾患若しくは障害の１症状が動物により経験される頻度を低下させて疾患若しくは障害の頻度を低下させることを意味している。
本明細書で使用されるところの「ワクチン」という用語により、ワクチンが投与されていないそれ以外は同一の動物に比較して、若しくは該ワクチンの投与前の該動物と比較して免疫応答を誘導することにより、疾患に対し動物を保護しかつ／若しくは疾患に既に苦しめられている動物を処置するようはたらく、本発明の組成物、タンパク質若しくはタンパク質をコードする核酸、またはａＡＰＣを意味している。
本明細書で使用されるところの「免疫ワクチン」は、動物に投与される場合に検出可能な免疫応答を導き出し得るａＡＰＣを意味している。より好ましくは、免疫ワクチンは、動物に投与される場合にＴ細胞を刺激かつ活性化して、その結果、免疫ワクチンが投与されないそれ以外は同一の動物にあればＴ細胞免疫応答に比較した場合に、それが病原体、腫瘍細胞などに対する検出可能なＴ細胞免疫応答を生成させるａＡＰＣである。
記述
本発明は、ＭＨＣクラスＩ若しくはクラスＩＩ分子を発現せずかつ遺伝子操作技術に反応しないと以前は考えられていたヒト赤白血病細胞株Ｋ５６２が、限定されるものでないが、刺激リガンド、共刺激リガンド、抗原（例えば腫瘍、ウイルスなど）、サイトカインなどを挙げることができる多数の分子を発現するように、レンチウイルスベクターを使用して容易に形質導入し得るという驚くべき発見に関する。
さらに、本明細書に開示されるデータは、数種のタンパク質を発現する数種（少なくとも９種）の外因性核酸がこれらの細胞中に容易に導入されかつそれら中で発現され得ること、しかし該タンパク質の発現のレベルがプラスミドに基づく発現系を使用して達成されるものより高くかつ該発現が検出可能な低下を伴わずに数か月間安定でありかつ継続することを示す。加えて、ＭＨＣクラスＩ若しくはＩＩ分子を発現しないＫ５６２に基づく人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を、それらで形質導入し得かつそれらを容易に発現させ得る。際立っては、目的の抗原をコードする核酸で形質導入したａＡＰＣは、抗原をプロセシングしかつそれをＴ細胞に適正に提示し、それにより該Ｔ細胞により認識されるエピトープを同定する必要性を伴わずに抗原特異的Ｔ細胞を産生した。驚くべきことに、本明細書に開示されるデータにより示されるとおり、該ａＡＰＣ細胞は抗原を適正にプロセシングかつ提示した。
Ｉ．組成物
本発明は、単離された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を包含し、該細胞はレンチウイルスベクター（ＬＶ）を使用して形質導入されたＫ５６２細胞を含んでなる。さらに、該ＬＶは最低１種の免疫刺激および共刺激リガンドをコードする。本明細書に開示されるデータは、Ｋ５６２細胞に形質導入された約９種の異なる分子をコードする約９種の核酸が、長期培養において安定かつ高度に発現されたことを示す一方、これがこれらの細胞中に導入され得る分子の数若しくは種類の制限であることを示唆するものは何も存在しない。代わりに、いかなる分子若しくはリガンドも、刺激、共刺激、サイトカイン、抗原、Ｆｃγ受容体などであろうと、これらの細胞中に導入して本発明のａＡＰＣを生じさせ得る。
当業者は、本明細書に提供される教示を一旦備えれば、多数の免疫調節分子を使用してほぼ無制限に多様なａＡＰＣを製造し得ることを、本明細書に提供される開示に基づき認識するであろう。すなわち、Ｔ細胞の活性化および誘導に関与する事象および分子に関して当該技術分野に膨大な知識が存在し、そして、Ｔ細胞媒介性の免疫応答およびそれらを媒介する因子を論考する学術論文が当該技術分野で公知である。さらに、第ＷＯ ０３／０５７１７１号および第ＵＳ２００３／０１４７８６９号明細書に提供される膨大な開示が、本明細書にそっくりそのまま示されるかのように引用することにより組み込まれる。より具体的には、通常はＴ細胞上のＴ細胞受容体／ＣＤ３複合体を介して媒介される一次シグナルが、Ｔ細胞活性化過程を開始する。加えて、Ｔ細胞の表面上に存在する多数の共刺激分子が、休止Ｔ細胞から細胞増殖への移行の調節に関与している。それらのそれぞれのリガンドと特異的に結合する「共刺激物質」ともまた称されるこうした共刺激分子は、限定されるものでないがＣＤ２８（Ｂ７−１［ＣＤ８０］、Ｂ７−２［ＤＥ８６］と結合する）、ＰＤ−１（リガンドＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２と結合する）、Ｂ７−Ｈ３、４−１ＢＢ（リガンド４−１ＢＢＬを結合する）、ＯＸ４０（リガンドＯＸ４０Ｌを結合する）、ＩＣＯＳ（リガンドＩＣＯＳ−Ｌを結合する）およびＬＦＡ（リガンドＩＣＡＭを結合する）を挙げることができる。従って、一次刺激シグナルはＴ細胞刺激を媒介するが、しかし、共刺激シグナルはその後、増殖により示されるところのＴ細胞活性化に必要とされる。
従って、本発明のａＡＰＣは、一次シグナルが伝達されるようなＴＣＲ／ＣＤ３複合体と特異的に結合する刺激リガンドを含んでなる細胞を包含する。加えて、本明細書に提供される開示に基づき当業者により認識されるであろうとおり、該ａＡＰＣは、Ｔ細胞上に存在する最低１種の共刺激分子と特異的に結合する最低１種の共刺激リガンドをさらに含んでなり、その共刺激分子は、限定されるものでないがＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ７、、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、４−１ＢＢ、ＰＤ−１、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ３０Ｌ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＭＨＣクラスＩ、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体およびＬＩＧＨＴを挙げることができる。これは、以前に論考されかつ本明細書の別の場所に開示されるデータにより示されるとおり、共刺激シグナルがＴ細胞の活性化および関連した増殖を誘導するのに必要とされるためである。他の共刺激リガンドが、本明細書に提供される教示を備えた当業者により理解されるであろうとおり、本発明に包含される。こうしたリガンドは、限定されるものでないが、前述された天然のリガンドの変異体、バリアント、フラグメントおよびホモログを挙げることができる。
これらおよび他のリガンドは当該技術分野で公知であり、そして例えば、Ｓｃｈｗａｒｔｚら、２００１、Ｎａｔｕｒｅ ４１０：６０４−６０８；Ｓｃｈｗａｒｔｚら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：４２７−４３４；およびＺｈａｎｇら、２００４、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０：３３７−３４７に記述されるとおり十分に特徴付けられている。リガンドに関する当該技術分野の膨大な知識を使用して、当業者は、本明細書に提供される教示を備え、リガンドの変異体若しくはバリアントが本明細書に包含されかつ本発明のａＡＰＣを製造するためにＬＶを使用して細胞中に形質導入し得ることを認識することができ、そしてこうした変異体およびバリアントは本明細書の別の場所でより完全に論考する。すなわち、本発明は、目的のリガンドの変異体若しくはバリアントを使用することを包含し、そしてこうした変異体およびバリアントの製造方法は当該技術分野で公知でありかつ本明細書でさらに論考されない。
従って、本発明のａＡＰＣは最低１種の刺激リガンドおよび最低１種の共刺激リガンドを含んでなり、その結果、該ａＡＰＣは、該ａＡＰＣ上のリガンドとＴ細胞上の対応する分子の間の相互作用がとりわけＴ細胞増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）および免疫応答を所望のように媒介するような、ａＡＰＣ上の刺激リガンドと特異的に結合するコグネイトの結合パートナーの刺激分子、およびａＡＰＣ上の共刺激リガンドと特異的に結合するコグネイトの結合パートナーの共刺激分子を含んでなるＴ細胞を刺激しかつ増殖させ得る。当業者は、目的のＴ細胞上の特定の刺激および共刺激分子が既知である場合に、そのＴ細胞を増殖させるために本発明のａＡＰＣを容易に製造し得ることを認識するであろう。逆に、目的のＴ細胞上の刺激および共刺激分子が既知でない場合は、本発明の一団のａＡＰＣを使用してどの分子およびそれらの組合せがそのＴ細胞を増殖させ得るかを決定し得る。従って、本発明は、所望のＴ細胞の増殖のためのツール、ならびにＴ細胞の活性化および増殖を媒介する特定のＴ細胞上の分子を解明するためのツールを提供する。
当業者は、本発明の核酸が、本発明のタンパク質をコードするＲＮＡ若しくはＤＮＡ配列、ならびに、該核酸配列が細胞を含まない場合若しくはそれが細胞を伴う場合にそれをより安定にするＤＮＡ若しくはＲＮＡの化学修飾を包含するそれらのいかなる改変された形態も包含することを理解するであろう。ヌクレオチドの化学修飾は、核酸配列が細胞により取り込まれる効率、若しくはそれが細胞中で発現される効率を高めるのにもまた使用しうる。ヌクレオチド配列の改変いずれかのおよび全部の組合せを本発明で企図している。
さらに、いかなる数の処置も、例えばＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｓｅｌｌ（２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）およびＡｕｓｕｂｅｌら（２００２、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク）に記述されるもののような当該技術分野で公知の組換えＤＮＡの方法論を使用する、本発明のタンパク質の変異体、誘導体若しくはバリアントの形態の生成に使用しうる。ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を変えることによるタンパク質若しくはポリペプチド中のアミノ酸変化の導入のための手順は当該技術分野で公知であり、そしてまたこれらおよび他の学術論文にも記述されている。
本発明は共刺激リガンド若しくは抗原をコードする核酸を包含し、ここで標識ポリペプチドをコードする核酸がそれに共有結合される。すなわち、本発明は、標識ポリペプチドをコードする核酸配列が本発明の最低１種のタンパク質若しくはその生物学的に活性のフラグメントをコードする核酸に共有結合されているキメラ核酸を包含する。こうした標識ポリペプチドは当該技術分野で公知であり、そして例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、インフルエンザウイルスヘマグルチニン標識ポリペプチド、ヘルペスウイルス標識ポリペプチド、ｍｙｃ、ｍｙｃ−ピルビン酸キナーゼ（ｍｙｃ−ＰＫ）、Ｈｉｓ６、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ＦＬＡＧ標識ポリペプチド、およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）標識ポリペプチドを包含する。しかしながら、本発明は上に列挙された標識ポリペプチドをコードする核酸に制限されるといかなる方法でも解釈されるべきでない。むしろ、これらの標識ポリペプチドに実質的に類似の様式で機能しうるポリペプチドをコードするいかなる核酸配列も本発明に包含されると解釈されるべきである。
標識ポリペプチドをコードする核酸を含んでなる核酸は、細胞、組織および／若しくは生物体全体（例えばヒトなど）内での本発明のタンパク質若しくはその生物学的に活性のフラグメントの位置を推定し、かつ、細胞中での該タンパク質の役割（１種若しくは複数）を研究するのに使用し得る。さらに、標識ポリペプチドの付加は、本発明のタンパク質が容易に産生かつ精製され得るような「標識」タンパク質の単離および精製を助長する。より重要なことに、本明細書の別の場所に示されるとおり、標識を含んでなる共刺激リガンドの発現は該リガンドの発現の検出を可能にし、そしてさらに、限定されるものでないが細胞分取を挙げることができる多くの方法を使用しての該リガンドを発現する細胞の単離を可能にする。
本発明はまた、本明細書に開示されるところの共刺激リガンドを含んでなるタンパク質若しくはペプチドのアナログも提供する。アナログは、保存的アミノ酸配列の差違若しくは配列に影響を及ぼさない修飾または双方により、天然に存在するタンパク質若しくはペプチドと異なりうる。例えば、それらがタンパク質若しくはペプチドの一次配列を変えるとは言えその機能を通常は変えない保存的アミノ酸変化を作成しうる。保存的アミノ酸置換は、典型的には、以下の群：
グリシン、アラニン；
バリン、イソロイシン、ロイシン；
アスパラギン酸、グルタミン酸；
アスパラギン、グルタミン；
セリン、トレオニン：
リシン、アルギニン；
フェニルアラニン、チロシン
内の置換を包含する。修飾（通常は一次配列を変えない）は、ポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏの化学的誘導体化、例えばアセチル化若しくはカルボキシル化を包含する。グリコシル化の改変、例えばその合成およびプロセシングの間若しくはさらなるプロセシング段階におけるポリペプチドのグリコシル化パターンを改変することにより；例えばグリコシル化に影響を及ぼす酵素、例えば哺乳動物のグリコシル化若しくは脱グリコシル化酵素にポリペプチドを曝露させることにより作成されるものもまた包含される。リン酸化されたアミノ酸残基、例えばホスホチロシン、ホスホセリン若しくはホスホトレオニンを有する配列もまた包含される。
タンパク質分解性の分解に対するそれらの抵抗性を向上させる、若しくは溶解性の特性を至適化する、若しくはそれらを治療薬としてより安定にするように、通常の分子生物学技術を使用して改変したポリペプチドもまた包含される。こうしたポリペプチドのアナログは、天然に存在するＬ−アミノ酸以外の残基、例えばＤ−アミノ酸、若しくは天然に存在しない合成アミノ酸を含有するものを包含する。本発明のペプチドは、本明細書に列挙される特定の例示的方法のいずれかの生成物に制限されない。
本発明はまた、本発明のペプチド（若しくはそれらをコードするＤＮＡ）の「変異体」、「誘導体」および「バリアント」を包含するとも解釈されるべきであり、それら変異体、誘導体およびバリアントは、生じるペプチド（若しくはＤＮＡ）が本明細書に列挙される配列に同一でないがしかし本発明の共刺激リガンド、サイトカイン、抗原などの生物学的／生化学的特性（例えば、該タンパク質を発現するａＡＰＣをＴ細胞と接触させることがＴ細胞の増殖を媒介するか若しくは別の方法でそれに影響を及ぼすａＡＰＣによる発現）を有するために本明細書に開示されるペプチドと同一の生物学的特性を有するような１個若しくはそれ以上のアミノ酸が変えられている（または、それをコードするヌクレオチド配列に言及する場合は１個若しくはそれ以上の塩基対が変えられている）共刺激リガンド、サイトカイン、抗原（例えば腫瘍細胞、ウイルスおよび他の抗原）である。
本明細書で使用されるところの「生物学的活性」のなかに、Ｋ５６２細胞に形質導入された場合に発現される共刺激リガンドが包含され、そして、該細胞がその表面上にコグネイトの共刺激分子を発現するＴ細胞と接触される場合に、それは誘導された増殖を伴うＴ細胞の活性化および刺激を媒介する。
事実、本発明は、潜在的な新規の形態の共刺激リガンドが本発明のａＡＰＣに形質導入されかつその中で発現され得るために、共刺激リガンドの変異体、バリアント、フラグメントおよびホモログの同定のための強力な新規スクリーニングアッセイを提供する。Ｔ細胞を刺激かつ／若しくは活性化するａＡＰＣの能力を評価し得、そして野性型すなわち「天然の」共刺激リガンドを含んでなるａＡＰＣのそれ以外は同一のＴ細胞を刺激かつ／若しくは活性化する能力と比較し得る。こうして、対照の野性型リガンドほどより大きい、より小さい若しくは等しい程度までＴ細胞を活性化／刺激する能力を示す機能的バリアントを、容易に同定、単離かつ特徴付けし得る。共刺激リガンドのこうした新規バリアントはＴ細胞過程の解明のための潜在的研究ツールであり、そしてまた、限定されるものでないが、天然のリガンドと競合して限定されるものでないが移植片拒絶を挙げることができる不要なＴ細胞応答を阻害し得る阻害活性をもつバリアントの投与を挙げることができる、Ｔ細胞の活性化／刺激を阻害若しくは誘導することに基づく重要な潜在的な治療薬も提供する。逆に、より大きな共刺激リガンド活性を示すバリアントを使用して、限定されるものでないが免疫抑制患者への投与を挙げることができる所望のＴ細胞応答を増大させ得る。例えば、一例示的バリアントリガンドを、より有効なその天然のリガンドとなるか、若しくは負の調節因子（ＣＴＬＡ−４）を犠牲にして正の共刺激分子（ＣＤ２８）の結合に好都合であるように工作し得る。これらおよび多くの他のバリアントが本発明に包含される。
当業者は、共刺激リガンドが、該リガンドもまた結合するＴ細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体を包含することを、本明細書に提供される開示に基づき認識するであろう。すなわち、本発明は、Ｔ細胞上の共刺激分子（例えばＣＤ２８）を結合する共刺激リガンド（例えばとりわけＣＤ８０およびＣＤ８６）を含んでなるａＡＰＣを包含するのみならず、しかしまた共刺激分子と特異的に結合する最低１種の抗体（例えば抗ＣＤ２８）も包含する。共刺激分子に対する多数の抗体が現在入手可能であるか、若しくは、それらは当該技術分野で公知である手順に従って製造し得る。
当業者は、抗体を含んでなるａＡＰＣが、本明細書の別の場所に例示されるとおり、ＣＤ３２（ヒトＦｃγ受容体）をコードする核酸をａＡＰＣに導入することにより製造され得ることを、本明細書に提供される開示に基づき理解するであろう。さらに、本明細書の別の場所に開示されるとおり、ＣＤ３抗体若しくはＣＤ２８抗体のような抗体を結合するａＡＰＣは、ＣＤ６４をコードする核酸をａＡＰＣ上で発現させることにより製造し得る。ＣＤ６４は高親和性ヒトＦｃγＲＩ受容体である。ａＡＰＣ表面上で発現されるＣＤ３２および／若しくはＣＤ６４にその後、限定されるものでないがＣＤ３を特異的に結合する抗体およびＣＤ２８と特異的に結合する抗体を挙げることができるＣＤ３２および／若しくはＣＤ６４と結合するいずれかの所望の抗体を「負荷し」得る。さらに、本発明は、おそらくＩＲＥＳ配列に連結された目的の抗体リガンドをコードする核酸をａＡＰＣに形質導入しかつその表面上で発現させてそれによりＣＤ３２および／若しくはＣＤ６４の発現およびそれらの負荷の必要性を排除する、ａＡＰＣを包含する。従って、本発明は、とりわけＣＤ３、ＣＤ２８、ＰＤ−１、Ｂ７−Ｈ３、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ３０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＭＨＣＩＩ、Ｔｏｌｌリガンド受容体およびＬＦＡと特異的に結合する最低１種の抗体をコードする核酸で形質導入したａＡＰＣ、ならびに、ＣＤ３２および／若しくはＣＤ６４で形質導入しかつ前述の分子と特異的に結合する最低１種の抗体を負荷したａＡＰＣを包含する。
さらに、本発明は、共刺激リガンドが、共刺激分子と特異的に結合するコグネイトの結合パートナーであり、ならびに、リガンドが共刺激分子と特異的に結合する抗体およびそれらのいずれかの組合せであり、その結果、単一のａＡＰＣが、共刺激リガンドをコードする核酸および／若しくはＴ細胞上に存在する共刺激分子に特異的な抗体の双方、ならびにそれらのいずれかの組合せを含み得る、ａＡＰＣを包含する。
本発明はまた、目的の抗原をコードする核酸を含んでなるａＡＰＣも包含する。限定されるものでないが、腫瘍抗原、例えばテロメラーゼ、Ｔ細胞により認識される黒色腫抗原（ＭＡＲＴ−１）、黒色腫抗原をコードする遺伝子、１、２および３（ＭＡＧＥ−１、−２、−３）、黒色腫ＧＰ１００、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、乳癌抗原ＨＥＲ−２／Ｎｅｕ、血清前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ−１）、ムチン抗原（ＭＵＣ−１、−２、−３、−４）ならびにＢ細胞リンパ腫イディオタイプを挙げることができる、無数の抗原が包含される。これは、本明細書の別の場所に開示されるデータにより示されるとおり、抗原を含んでなるＫ５６２に基づくａＡＰＣが、ＭＨＣの情況（ＭＨＣクラスＩ若しくはクラスＩＩ分子をコードする核酸でもまた細胞が形質導入される場合）で抗原をプロセンシングかつ提示して、それにより抗原特異的Ｔ細胞を生じさせ得かつその集団を増殖させ得るからである。開示されるデータは、ｈＴＥＲＴ特異的ＣＴＬが、ＣＤ３２および４−１ＢＢＬで形質転換したａＡＰＣ（Ｋ３２／４−１ＢＢＬ）を使用してｈＴＥＲＴ＋ Ｔ細胞を増殖させることにより生じられたことを示す。従って、ａＡＰＣは、それの必要な患者にＴ細胞を投与し従って抗原を担持する腫瘍細胞に向けられた免疫ワクチン処置を提供するために、十分な抗原特異的Ｔ細胞を増殖かつ産生させるのに使用し得る。従って、目的の抗原を本発明のａＡＰＣに導入し得、ここでａＡＰＣはその後、抗原をＭＣＨクラスＩ若しくはＩＩ複合体の情況で提示し、すなわちＭＨＣ分子が抗原を「負荷」され、そして該ａＡＰＣを使用して抗原特異的Ｔ細胞を生じさせ得る。
同様に、ウイルス若しくはいずれかの他の病原体の抗原もまた該ａＡＰＣにより形質導入しかつ発現させ得る。本明細書の別の場所に開示されるデータは、選別されたマトリックスタンパク質（ｆｌｕ−ＭＰ四量体）陽性Ｔ細胞および抗ＣＤ２８抗体を負荷した刺激した照射したａＡＰＣ細胞（Ｋ２／ＣＤ３／４−１ＢＢＬ／ＦＬＵ−ＧＦＰ）が、Ｔ細胞を増殖させて、該ウイルス抗原に特異的な多数の抗原特異的ＣＴＬを提供したことを示す。これらのデータは、本発明のａＡＰＣを使用して、ウイルスおよび他の病原体の感染を処置するのに使用されるべき抗原特異的Ｔ細胞を増殖かつ製造し得ることを示す。
加えて、本発明は、最低１種のサイトカイン、最低１種のケモカイン若しくは双方をコードする核酸で形質導入したａＡＰＣを包含する。これは、本明細書の別の場所に開示されるデータが、インターロイキン（例えばＩＬ−７、ＩＬ−１５など）をコードする核酸で形質導入したａＡＰＣがインターロイキンを安定に発現したことを十分に示すからである。さらに、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含んでなるＬＶベクターを使用して、インターロイキンをａＡＰＣから分泌させ得る（例えば、限定されるものでないがｐＣＬＰＳ ＣＤ３２−ＩＲＥＳ−ＩＬ−７、−１２、−１５、−１８および−２１を挙げることができるＬＶベクターで形質導入したＫ５６２）。ａＡＰＣにより発現させ得る他のサイトカインは、限定されるものでないが、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、ＳＬＣ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７などを挙げることができる。本発明はさらに、限定されるものでないがケモカインＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１ｂ、ＳＤＦ−１、エオタキシンなどを挙げることができる。
従って、本発明は、完全長、フラグメント、ホモログ、バリアント若しくは変異体のサイトカインを包含するサイトカインを包含する。サイトカインは、別の細胞の生物学的機能に影響を及ぼすことが可能であるタンパク質を包含する。サイトカインにより影響を及ぼされる生物学的機能は、限定されるものでないが細胞増殖、細胞分化若しくは細胞死を挙げることができる。好ましくは、本発明のサイトカインは、細胞の表面上の特異的受容体に結合することが可能であり、それにより細胞の生物学的機能に影響を及ぼす。
好ましいサイトカインは、とりわけ、造血成長因子、インターロイキン、インターフェロン、免疫グロブリンスーパーファミリー分子、腫瘍壊死因子ファミリー分子および／若しくはケモカインを包含する。本発明のより好ましいサイトカインは、とりわけ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、インターフェロンα（ＩＦＮα）、インターフェロンβ（ＩＦＮβ）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、およびＩＧＩＦを包含する。
それらのホモログ、バリアント、変異体若しくはフラグメントを包含するケモカインは、限定されるものでないがＣ５ａ、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、単球走化性タンパク質１α（ＭＩＰ１α）、単球走化性タンパク質１β（ＭＩＰ１β）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、単球走化性タンパク質３（ＭＣＰ−３）、血小板活性化因子（ＰＡＦＲ）、Ｎ−ホルミル−メチオニル−ロイシル−［３Ｈ］フェニルアラニン（ＦＭＬＰＲ）、ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４Ｒ）、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）、ＲＡＮＴＥＳ、エオタキシン、リンホタクチン、ＩＰ１０、Ｉ−３０９、ＥＮＡ７８、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−２、および／若しくはＭＧＳＡ／ｇｒｏを挙げることができるα−ケモカイン若しくはβ−ケモカインを包含する。当業者は、本明細書に提供される教示を一旦備えれば、本発明が、当該技術分野で公知であるようなケモカインおよびサイトカイン、ならびに将来発見されるいずれも包含することを認識するであろう。
当業者は、本発明のａＡＰＣがいずれかの特定の抗原、サイトカイン、共刺激リガンド、共刺激分子を特異的に結合する抗体などにいかなる方法でも制限されないことを、本明細書に提供される教示を一旦備えれば認識するであろう。むしろ、本発明は、単一のプロモーター／制御配列の制御下若しくは１種以上のこうした配列の制御下のいずれかで全部発現される多数の分子を含んでなるａＡＰＣを包含する。さらに、本発明は、多様なａＡＰＣが多様な分子をコードする本発明の１種若しくはそれ以上のａＡＰＣの投与を包含する。すなわち、多様な分子（例えば共刺激リガンド、抗原、サイトカインなど）は、ｃｉｓ（すなわち、同一のａＡＰＣ中、および／または同一の連続する核酸により若しくは同一のａＡＰＣ内の別個の核酸分子上でコードされる）あるいはｔｒａｎｓ（すなわち多様な分子が異なるａＡＰＣにより発現される）で機能し得る。
こうして、当業者により理解されるであろうとおり、本明細書に提供される開示に基づき、ａＡＰＣの用量および投与のタイミングは各応用について特別に調整し得る。より具体的には、１種のａＡＰＣ若しくは数種のａＡＰＣにより発現されるある種の分子を使用してＴ細胞に対する刺激、次いで重なる場合であっても異なる一組の分子を発現する別のａＡＰＣ若しくは数種のａＡＰＣを使用する刺激を提供することが望ましい場合には、ｃｉｓおよびｔｒａｎｓのアプローチの組合せを利用し得る。本質的に、本発明のａＡＰＣおよび本明細書に開示される方法はほぼ無制限の数の変形物を提供し、そして、本発明はいずれかの特定の組合せ若しくはアプローチにいかなる方法でも制限されない。当業者は、本明細書に提供される教示および当該技術分野で入手可能な知識を備えれば、各特定のＴ細胞についての所望のアプローチを容易に決定し得る。あるいは、本明細書に開示されるＴ細胞の刺激および増殖方法の有効性の評価方法を提供する本明細書に提供される開示に基づき、当業者は、増殖若しくは刺激されるべき特定のＴ細胞にどのアプローチ（１種若しくは複数）を適用し得るかを決定し得る。
当業者は、本発明のａＡＰＣ中で発現されるべき分子の多様な組合せが好ましいかもしれないことを、本明細書に提供される開示に基づき理解するであろう。限定されるものでないが表１、２、３および４に例示される組合せを挙げることができる、分子のこれらの組合せのいくつかが、本明細を通じて示される一方、本発明は、これら、若しくは分子のいずれかの特定の組合せを含んでなるいずれかの他のａＡＰＣにいかなる方法でも制限されない。むしろ、当業者は、分子の多様な組合せを細胞に形質導入して本発明のａＡＰＣを製造し得ることを、本明細書に提供される教示に基づき認識するであろう。該分子は、本明細書で論考されるもののような当該技術分野で既知のもの、ならびに将来開示されるはずである分子を包含する。
本発明は、有効成分として本発明のａＡＰＣを含んでなる製薬学的組成物の製剤および使用を包含する。こうした製薬学的組成物は、有効成分単独、被験体への投与に適する形態の最低１種の有効成分（例えば有効用量のａＡＰＣ）の組合せとしてよりなりうるか、あるいは、製薬学的組成物は、有効成分および１種若しくはそれ以上の製薬学的に許容できる担体、１種若しくはそれ以上の付加的な（活性および／若しくは不活性の）成分、またはこれらのいくつかの組合せを含みうる。
本明細書で使用されるところの「製薬学的に許容できる担体」という用語は、有効成分をそれと組み合わせることができかつ組合せ後に有効成分を被験者に投与するのに使用し得る、化学物質組成物を意味している。
本明細書に記述される製薬学的組成物の製剤は、薬理学の技術分野で既知の若しくは今後開発されるいずれの方法によっても製造しうる。一般に、こうした調剤方法は、有効成分を担体または１種若しくはそれ以上の他の付属成分との連合にもたらす段階、およびその後、必要な若しくは所望の場合は、生成物を所望の単一若しくは複数の投薬単位に造形若しくは包装する段階を包含する。
本明細書に提供される製薬学的組成物の記述は、原則として、ヒトへの倫理的投与に適する製薬学的組成物に向けられるとは言え、こうした組成物は一般に全部の種類の動物への投与に適することが当業者により理解されるであろう。組成物を多様な動物への投与に適するようにするためのヒトへの投与に適する製薬学的組成物の改変は十分に理解されており、そして、通常の熟練の獣医薬理学者は、わずかな通常の（あれば）実験でこうした改変を設計かつ実施し得る。本発明の製薬学的組成物の投与が企図されている被験体は、限定されるものでないが、ヒトおよび他の霊長類、ヒト以外の霊長類、畜牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコおよびイヌのような商業的に適切な哺乳動物を包含する哺乳動物、ニワトリ、アヒル、ガチョウおよびシチメンチョウのような商業的に適切な鳥類を包含する鳥類、養殖魚および水族館の魚を包含する魚類、ならびに養殖貝のような甲殻類を挙げることができることを企図している。
本発明の方法で有用である製薬学的組成物は、経口、直腸、膣、非経口、局所、肺、鼻内、病変内、頬側、眼、静脈内、臓器内若しくは別の投与経路に適する製剤で製造、包装若しくは販売しうる。他の企図される製剤は、突起付きナノ粒子、リポソーム製剤、有効成分を含有する再封止赤血球、および免疫学的に基づく製剤を包含する。
本発明の製薬学的組成物は、バルクで、単一単位用量として、若しくは複数の単一単位用量として製造、包装若しくは販売しうる。本明細書で使用されるところの「単位用量」は、予め決められた量の有効成分を含んでなる、個別の量の製薬学的組成物である。有効成分の量は、一般に、被験体に投与されるであろう有効成分の投薬量、または例えばこうした投薬量の１／２若しくは１／３のようなこうした投薬量の便宜的な画分に等しい。
本発明の製薬学的組成物中の有効成分、製薬学的に許容できる担体、およびいずれかの付加的な成分の相対量は、処置される被験体の正体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、大きさおよび状態に依存して、また、該組成物が投与されるはずである経路にさらに依存して変動することができる。例として、該組成物は０．１％と１００％（ｗ／ｗ）の間の有効成分を含みうる。
有効成分に加えて、本発明の製薬学的組成物は、１種若しくはそれ以上の付加的な製薬学的有効成分をさらに含みうる。とりわけ企図される付加的な剤は、制吐剤、ならびにシアン化物およびシアン酸塩スカベンジャーのようなスカベンジャー、ならびにＡＺＴ、プロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、インターロイキン−２、インターフェロン、サイトカインなどを包含する。
本発明の製薬学的組成物の制御若しくは持続放出製剤を、慣習的技術を使用して作成しうる。
本明細書で使用されるところの、製薬学的組成物の「非経口投与」は、被験体の組織の物理的断裂を特徴とする投与、および組織中の断裂を通しての製薬学的組成物の投与のいずれかの経路を包含する。非経口投与は、従って、限定されるものでないが、組成物の注入、外科的切開による組成物の適用、組織を貫通する非外科的創傷による組成物の適用などによる製薬学的組成物の投与を挙げることができる。とりわけ、非経口投与は、限定されるものでないが皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内注入、および腎透析注入技術を挙げることができることを企図している。
非経口投与に適する製薬学的組成物の製剤は、滅菌水若しくは滅菌の等張生理的食塩水のような製薬学的に許容できる担体と組み合わせた有効成分を含んでなる。こうした製剤は、ボーラス投与若しくは連続投与に適する形態で製造、包装若しくは販売しうる。注入可能な製剤は、保存剤を含有するアンプル若しくは複数用量容器中のような単位投薬形態物で製造、包装若しくは販売しうる。非経口投与のための製剤は、限定されるものでないが、懸濁剤、溶液、油性若しくは水性ベヒクル中の乳剤、パスタ剤、および植入可能な徐放性若しくは生物分解性製剤を挙げることができる。こうした製剤は、さらに、限定されるものでないが懸濁化剤、安定剤若しくは分散助剤を挙げることができる１種若しくはそれ以上の付加的な成分を含みうる。
製薬学的組成物は、滅菌の注入可能な水性若しくは油性の懸濁剤若しくは溶液の形態で製造、包装若しくは販売しうる。この懸濁剤若しくは溶液は既知技術に従って処方し得、そして、有効成分に加え、本明細書に記述される分散助剤、湿潤剤若しくは懸濁化剤のような付加的な成分を含みうる。こうした滅菌の注入可能な製剤は、例えば水若しくは１，３−ブタンジオールのような非毒性の非経口で許容できる希釈剤若しくは溶媒を使用して製造しうる。他の許容できる希釈剤および溶媒は、限定されるものでないが、リンゲル液、等張塩化ナトリウム溶液、および合成モノ若しくはジグリセリドのような不揮発性油を挙げることができる。有用である他の非経口で投与可能な製剤は、有効成分を微晶質の形態で、リポソーム製剤中に、若しくは生物分解性のポリマー系の成分として含んでなるものを包含する。徐放性若しくは植入のための組成物は、乳剤、イオン交換樹脂、わずかに溶解性のポリマー若しくはわずかに溶解性の塩のような製薬学的に許容できるポリマー若しくは疎水性物質を含みうる。
本発明のａＡＰＣ、および／若しくは該ａＡＰＣを使用して増殖させたＴ細胞は動物、好ましくはヒトに投与し得る。本発明のａＡＰＣを使用して増殖させたＴ細胞を投与する場合、投与される細胞の量は約百万細胞から約３千億細胞までの範囲にわたり得る。それにより増殖されたＴ細胞を伴い若しくは伴わずのいずれかでａＡＰＣそれら自身を投与する場合は、それらは約１００，０００から約十億細胞までの範囲にわたる量で投与し得、ここで該細胞をそれの必要な動物、好ましくはヒト患者に注入する。一方、投与される正確な投薬量は、限定されるものでないが動物の型および処置されている疾患の型、動物の齢ならびに投与経路を挙げることができるいずれかの数の因子に依存して変動することができる。
ａＡＰＣは１日に数回くらい頻繁に動物に投与しうるか、あるいはそれは１日１回、週１回、２週ごとに１回、月１回のようにより少なく頻繁に、あるいは数か月ごとに１回またはなお年１回若しくはそれ未満のようななおより少なく頻繁に投与しうる。投与の頻度は当業者に容易に明らかであることができ、そして、限定されるものでないが、処置されている疾患の型および重症度、動物の型および齢などを挙げることができるいずれかの数の因子に依存することができる。
ａＡＰＣ（若しくはそれにより増殖させた細胞）は多様な他の化合物（とりわけサイトカイン、化学療法剤および／若しくは抗ウイルス薬）と共投与しうる。あるいは、該化合物（１種若しくは複数）を、ａＡＰＣ（若しくはそれにより増殖させた細胞）またはそれらのいずれかの順列の１時間、１日、１週間、１か月若しくはなおより前に投与しうる。さらに、該化合物は、ａＡＰＣ（若しくはそれにより増殖させた細胞）の投与１時間、１日、１週間若しくはなおより後に投与し（欠落）る。頻度および投与レジメンは当業者に容易に明らかであることができ、そして、限定されるものでないが、処置されている疾患の型および重症度、動物の齢および健康状態、投与されている化合物（１種若しくは複数）の正体、多様な化合物およびａＡＰＣ（若しくはそれにより増殖させた細胞）の投与経路などを挙げることができるいずれかの数の因子に依存することができる。
さらに、ａＡＰＣを哺乳動物に投与すべきである場合に、それらが「増殖なしの状態」にある；すなわち該細胞が哺乳動物に投与される場合に分裂することが不可能であるように該細胞を処理することが、本明細書に提供される開示に基づき、当業者により認識されるであろう。本明細書の別の場所に開示されるとおり、該細胞を照射して、哺乳動物に一旦投与されればそれらを増殖若しくは分割を不可能にし得る。とりわけヒトに投与されるべき細胞を増殖を不可能にするためのハプテン化（ｈａｐｔｅｎｉｚａｔｉｏｎ）（例えばジニトロフェニルおよび他の化合物を使用する）を包含する他の方法が当該技術分野で既知であり、そしてこれらの方法は本明細書でさらに論考されない。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏで分割することを不可能にされたａＡＰＣの投与の安全性は、本明細書に論考される分子のいくつかをコードするプラスミドベクターでトランスフェクトしたａＡＰＣを使用するフェーズＩ臨床試験で確立された。
ＩＩ．方法
本発明は、既知の共刺激分子を発現するＴ細胞の増殖の特異的誘導方法を包含する。該方法は、増殖されるべきであるＴ細胞を、その共刺激分子と特異的に結合するリガンドをコードするレンチウイルスベクターを含んでなるａＡＰＣと接触させることを含んでなる。本明細書の別の場所に示されるとおり、とりわけＴ細胞表面上で発現されるコグネイトの共刺激分子を特異的に結合する共刺激リガンドを含んでなるＫ５６２に基づくａＡＰＣとＴ細胞を接触させることは、Ｔ細胞を刺激し、そして、多数の特異的Ｔ細胞が容易に産生され得るようなＴ細胞増殖を誘導する。ａＡＰＣは、特定の共刺激分子を発現するＴ細胞のみが該ａＡＰＣにより増殖されるために、「特異的に」Ｔ細胞を増殖させる。従って、発現されるべきＴ細胞が、そのいくつか若しくは大部分が共刺激分子を発現しない細胞の混合物中に存在する場合は、目的のＴ細胞のみを誘導して増殖させかつ細胞数を大きくすることができる。Ｔ細胞は、当該技術分野で既知かつ／若しくは本明細書の別の場所に記述されるもののような多様な細胞分離および精製技術を使用してさらに精製し得る。
当業者により認識されるであろうとおり、本明細書に提供される開示に基づけば、目的のＴ細胞はａＡＰＣを使用する増殖の前に同定若しくは単離される必要はない。これは、該ａＡＰＣが選択的でありかつコグネイトの共刺激分子を発現するＴ細胞（１種若しくは複数）のみを増殖させることができるからである。
好ましくは、ある種のＴ細胞の増殖は、限定されるものでないが抗原、サイトカイン、共刺激リガンド、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体リガンドを挙げることができる多様な分子を発現する数種のａＡＰＣ若しくは単一のａＡＰＣを使用することにより達成される。本明細書の別の場所に開示されるとおり、ａＡＰＣは、ａＡＰＣ表面上で発現されるＣＤ３２および／若しくはＣＤ６４がＦｃγ受容体であるＣＤ３２および／若しくはＣＤ６４を結合する限りは、それらに所望のいずれかの抗体を「負荷し」得るような、ＣＤ３２および／若しくはＣＤ６４をコードする核酸を含み得る。これは、「在庫があり入手可能な」ａＡＰＣを、いずれかの所望のＴ細胞を刺激するように容易に調整させる。
本発明は、既知の共刺激分子を発現するＴ細胞の増殖の特異的誘導方法を包含する。該方法は、既知の共刺激分子を発現する最低１種のＴ細胞を含んでなるＴ細胞の集団を、共刺激分子のリガンドをコードするＬＶを含んでなるａＡＰＣと接触させることを含んでなる。本明細書の別の場所に開示されるとおり、ａＡＰＣがＴ細胞上の共刺激分子と特異的に結合する最低１種の共刺激リガンドを発現する場合は、そのコグネイトの共刺激リガンドとの共刺激分子の結合が、Ｔ細胞の増殖を誘導する。従って、目的のＴ細胞は、細胞の集団から細胞を最初に精製する必要なく、増殖するよう誘導される。また、この方法は、集団中のいずれかの細胞が目的の特定の共刺激分子を発現しているかどうかを決定するための迅速なアッセイを提供する。細胞をａＡＰＣと接触させることは、成長する細胞の増殖および検出を誘導することができ、それにより目的の共刺激分子を発現するＴ細胞がサンプル中に存在したことを同定するからである。こうして、細胞の表面上の最低１種の共刺激分子が既知である目的のいかなるＴ細胞も増殖させかつ単離し得る。
本発明は、あるＴ細胞集団サブセットの特異的増殖方法を包含する。より具体的には、該方法は、目的の１サブセットの最低１種のＴ細胞を含んでなるＴ細胞の集団を、そのＴ細胞を増殖することが可能なａＡＰＣ、若しくは該Ｔ細胞の表面上のコグネイトの共刺激分子と特異的に結合する最低１種の共刺激リガンドを発現する最低１種のａＡＰＣと接触させることを含んでなる。本明細書の別の場所に以前に示されたとおり、共刺激分子のその結合パートナーの共刺激リガンドとの結合は、Ｔ細胞の増殖を誘導し、それによりＴ細胞集団サブセットを特異的に増殖させる。当業者は、Ｔ細胞サブセットが、Ｔヘルパー（ＴＨ１およびＴＨ２）ＣＤ４を発現する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）（Ｔｃ１若しくはＴｃ２）制御性Ｔ（ＴＲＥＧ）、ＴＣ／Ｓ、ナイーブ、メモリー、セントラルメモリー、エフェクターメモリー、ならびにγδＴ細胞を包含することを、本明細書に提供される開示に基づき理解するであろう。従って、特定の１Ｔ細胞サブセットについて濃縮された細胞集団を、本発明の方法を使用して容易に製造し得る。
本発明はまた、１Ｔ細胞サブセットの活性化を特異的に誘導する、１種の共刺激リガンド若しくはそれらの組合せの同定方法も包含する。簡潔には、該方法は、Ｔ細胞の１集団を、最低１種の共刺激リガンドをコードするＬＶを含んでなるａＡＰＣと接触させること、およびａＡＰＣと接触させたＴ細胞サブセットの増殖のレベルを、ａＡＰＣと接触されないそれ以外は同一のＴ細胞サブセットの増殖のレベルと比較することを含んでなる。ａＡＰＣと接触させなかったそれ以外は同一のＴ細胞サブセットの増殖のレベルと比較しての、ａＡＰＣと接触させたＴ細胞サブセットの増殖のより高いレベルは、該共刺激リガンドでそのＴ細胞が属するＴ細胞サブセットの活性化を特異的に誘導することの指標である。
該方法は、どの因子（１種若しくは複数）があるＴ細胞サブセットを増殖させるかが以前に知られていない場合にそのＴ細胞サブセットを特異的に増殖させる共刺激リガンドの同定を可能にする。当業者は、スクリーニングの数を最小限にするために、アッセイの数を減少させ得るような共刺激リガンドをコードする同じ数だけの核酸を形質導入することが好ましいことを認識するであろう。さらに、該方法は、多様なタンパク質（例えば刺激リガンド、共刺激リガンド、抗原、サイトカインなど）を組み合わせることにより、因子のどの組合せ（１種若しくは複数）が最も効果的なａＡＰＣを作成することができるか、すなわちＴ細胞サブセットを増殖させるためのａＡＰＣの組合せを評価することを可能にする。こうして、各Ｔ細胞サブセットについての増殖および活性化のための多様な要件を検査し得る。
一態様において、該方法は、多様なａＡＰＣを、Ｔ細胞サブセットの表面上の共刺激分子を最初に特徴づけることなくＴ細胞サブセットと接触させることを含んでなる。また、本発明は、Ｔ細胞サブセットの表面上に存在する共刺激分子（１種若しくは複数）を、ａＡＰＣを該細胞と接触させる前に検査する方法を包含する。従って、本発明は、多様なＴ細胞サブセットに対する増殖の要件を決定するための新規アッセイを提供する。
本発明は、哺乳動物における抗原に対するＴ細胞応答の誘導方法を包含する。該方法は、抗原に特異的なＴ細胞の増殖を特異的に誘導するａＡＰＣを投与することを含んでなる。十分な数の抗原特異的Ｔ細胞が、該Ｔ細胞を増殖させるためにａＡＰＣを使用して一旦得られれば、そのように得られた抗原特異的Ｔ細胞を、本明細書の別の場所に開示される方法に従って哺乳動物に投与し、それにより該哺乳動物における該抗原に対するＴ細胞応答を誘導する。これは、本明細書に開示されるデータにより示されるとおり、抗原特異的Ｔ細胞が、本発明のａＡＰＣを使用して休止Ｔ細胞を刺激することにより容易に産生され得るからである。
本発明は、それの必要な哺乳動物における抗原に対するＴ細胞応答の誘導方法を包含し、該方法は、哺乳動物から細胞の集団を得ること（該集団はＴ細胞を含んでなる）、該Ｔ細胞を、ＭＨＣ複合体の情況で抗原を提示するａＡＰＣと接触させること（Ｔ細胞をａＡＰＣと接触させることは該抗原に特異的なＴ細胞の増殖を誘導する）を含んでなる。抗原特異的Ｔ細胞を哺乳動物に投与し、それによりそれの必要な哺乳動物において該抗原に対するＴ細胞応答を誘導する。本明細書の別の場所に以前に述べられたとおり、別の場所に開示されるデータは、抗原特異的ＣＴＬが、ａＡＰＣ（該ａＡＰＣはＭＨＣ複合体の情況で抗原を提示する）とＴ細胞を接触させることにより容易に産生され得ることを十分に示す。本明細書の別の場所に以前に示されたとおり、多様な分子（共刺激リガンド、抗体、抗原、ＭＨＣなど）の多数の組合せを含んでなる多様なａＡＰＣを使用して、それの必要な哺乳動物への投与のための抗原特異的Ｔ細胞の最適な増殖方法を決定し得る。
ＩＩＩ．キット
本発明は、本発明のａＡＰＣ、多様なタンパク質をコードする核酸、Ｔ細胞の表面上の共刺激分子に特異的に結合する抗体、および／または本発明の抗体、抗原若しくはサイトカインをコードする核酸、アプリケーター、ならびに本発明の方法を実施するためのキットの使用を記述する説明資料を含んでなる多様なキットを包含する。例示的キットを下述するとは言え、他の有用なキットの内容は本開示に照らして当業者に明らかであろう。これらのキットのそれぞれが本発明内に包含される。
本発明は、既知の共刺激分子を発現するＴ細胞の増殖を特異的に誘導するためのキットを包含する。これは、Ｔ細胞をａＡＰＣと接触させることがＴ細胞の増殖を特異的に誘導するからである。該キットは本発明に開示される方法に従い使用する。簡潔には、該キットを使用して、最低１種の共刺激分子を発現するＴ細胞に本発明のａＡＰＣを投与しうる。これは、本明細書の別の場所により完全に開示されるとおり、本明細書に開示されるデータが、Ｔ細胞上に存在するコグネイトの共刺激分子と特異的に結合する共刺激リガンドを含んでなるａＡＰＣとＴ細胞を接触させることがＴ細胞の刺激および活性化を媒介することを示すからである。さらに、本キットを使用して生じられるＴ細胞を動物に投与して、治療結果を達成し得る。
該キットはさらに、ａＡＰＣをＴ細胞に投与するのに有用なアプリケーターを含んでなる。該キットに包含される特定のアプリケーターは、例えばａＡＰＣ、ならびにａＡＰＣにより増殖されるＴ細胞を投与するのに使用される方法に依存することができ、そしてこうしたアプリケーターは当該技術分野で公知であり、かつ、とりわけピペット、シリンジ、スポイトなどを包含しうる。さらに、該キットは該キットの使用のための説明資料を含んでなる。これらの資料は、本明細書に提供される開示を単に例示する。
該キットは製薬学的に許容できる担体を包含する。該組成物は、本明細書の別の場所に示されるところの適切な量で提供される。さらに、投与経路および投与頻度は、本明細書の別の場所に以前に示されたとおりである。
該キットは、限定されるものでないが本明細書の別の場所で表１、２、３および４に示されるものを挙げることができる、無数の分子を含んでなるａＡＰＣを包含する。しかしながら、本明細書に提供される教示を備えた当業者は、本発明が分子のこれら若しくはいずれかの他の組合せにいかなる方法でも制限されないことを容易に認識するであろう。むしろ、本明細書に示される組合せは具体的に説明する目的上であり、そしてそれらは本発明により包含される組合せをいかなる方法でも制限しない。さらに、該キットは、ａＡＰＣ中に形質導入されるべき各分子が、分子をコードする単離された核酸、分子をコードする核酸を含んでなるベクター、および最低２分子が連続する核酸によりコードされかつ／若しくは同一ベクターによりコードされる場合を包含するそれらのいずれかの組合せとして提供されるキットを含んでなる。当業者は、本発明が本発明のａＡＰＣに導入されるべき目的の分子をコードする無数の構築物を包含することを理解するであろう。
本発明は以下の実験実施例を参照することにより詳細にさらに記述される。これらの実施例は具体的に説明する目的上のみに提供され得、そして別の方法で明記されない限り、制限することを意図していない。従って、本発明は、以下の実施例に制限されるといかなる方法でも解釈されるべきでなく、しかしむしろ、本明細書に提供される教示の結果として明らかになるいかなるおよび全部の変形物も包含すると解釈されるべきである。
実施例
養子免疫療法のための細胞に基づく人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）の開発
ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞の固有の増殖要件は異なることが示されている（Ｄｅｅｔｈｓら、１９９７、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５９８−６０８；Ｌａｕｘら、２０００、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９６：１８７−１９７；Ｆｏｕｌｄｓら、２００２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：１５２８−１５３２）。ＣＤ８細胞の長期増殖のためのＣＤ２８に加えて多様な共刺激分子の発現の遺伝子操作を可能にするように、細胞に基づくａＡＰＣを設計した。該培養系は、共刺激シグナルが、ＣＤ２８により提供されるものに加えて最適なＣＤ８細胞の増殖に必要とされるという事実に基づいた。ヒト赤白血病ＣＭＬ細胞株Ｋ５６２（Ｌｏｚｚｉｏら、１９７５、Ｂｌｏｏｄ ４５：３２１−３３４）は、同種応答を促進するとみられるＨＬＡタンパク質を発現しないため、この細胞株を細胞性ａＡＰＣの足場構造として使用した。しかしながら、Ｋ５６２はＩＣＡＭ（ＣＤ５４）およびＬＦＡ−３（ＣＤ５８）を発現し、それらの双方はＴ細胞との相互作用を促進する（図１）。Ｋ５６２細胞を使用することの他の利点は、限定されるものでないが、照射したＫ５６２細胞が臨床の設定に導入され得るという事実を挙げることができる。これらの細胞はマイコプラスマを含まず、血清を含まない培地中で増殖し、そしてナチュラルキラー（ＮＫ）細胞により容易に死滅されるからである。こうしたａＡＰＣを産生するためにＫ５６２を使用することの望ましさにもかかわらず、Ｋ５６２細胞は形質導入するのが有名に困難であった（Ｋａｈｌら、２００４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：１４２１）。驚くべきことに、本明細書に開示されるデータは、Ｋ５６２細胞が、無数の外因性核酸で連続してかつ／若しくは同時にのいずれでも形質導入されて多数の分子を発現し、それにより所望の表現型をもつａＡＰＣのライブラリーを得ることができることを初めて示す。こうしたＬＶに基づく形質導入は、連続してかつ／若しくは同時に実施され、そしてＭｏＦｌｏを使用して所望の表現型を示す細胞がクローン化される。さらに、該データは、最適のプロモーターを選択し得、そして、プロモーターの競合を評価し得かつ必要若しくは所望の場合は排除し得ることを示す。本発明の方法を使用して製造されるａＡＰＣのライブラリーをその後、限定されるものでないがＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスモデルを挙げることができる、技術に認識されたモデルを使用して、生物学的機能についてｉｎ ｖｉｖｏで評価する。
ａＡＰＣを製造するためのＫ５６２の使用に関して、米国特許出願第１０／３３６，１３５号明細書（現在、米国特許出願公開第ＵＳ２００３／０１４７８６９Ａ１号明細書として公開されている）、および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０３／００３３９号明細書（現在、国際公開第ＷＯ ０３／０５７１７１Ａ２号明細書として公開されている）の開示が、そっくりそのまま本明細書に示されるかのように引用することにより組み込まれる。
レンチウイルスベクターの製造
Ｋ５６２細胞に遺伝子を導入するための以前に記述されたトランスフェクションに基づくアプローチの制限を回避するため、一連の高力価レンチウイルスベクターを、本明細書の別の場所に開示されるとおり使用して、Ｋ５６２細胞中に多数の共刺激リガンドおよびＭＨＣ分子を安定に導入した。これは、多様なａＡＰＣの系統的かつ迅速な産生を見込み、また、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞に対する最適の増殖およびエフェクター機能を生じる共刺激分子の組合せの決定を見込む。本明細書に開示されるデータはこのアプローチを示す。
制限しない一例として、本発明のａＡＰＣは、とりわけ本明細書に記述されるリガンドの数種若しくは全部を含み得る。これらの多様な構築物を、ＬＶを使用してＫ５６２細胞を形質導入するのに使用する。これらは単に例示的であり、そして、本発明は、該細胞中で発現されるべき目的の既知分子を用いる本発明のａＡＰＣの形質導入のためのこれらの構築物若しくはいずれかの他の特定の構築物に制限されない。
ＣＤ３２：ＣＤ３２を含んでなるＬＶで形質導入したａＡＰＣは、好中球ＲＮＡから調製したｃＤＮＡから増幅したＣＤ３２（配列番号８）を使用して製造した。簡潔には、好中球を、正常な無名のドナーから得たアフェレーシス産物からＦｉｃｏｌｌ勾配により単離した。このＰＣＲ産物を、各増幅プライマーの端に付加したＫｐｎ ＩおよびＮｏｔ Ｉ制限部位を介してｐｃＤＮＡ３．１にクローン化した。このベクターをＸｂａＩおよびＳａｌ Ｉで消化し、そしてｐＣＬＰＳ（Ｐａｒｒｙら、２００３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：１６６−１７４）にクローン化して、ｐＣＬＰＳ ＣＤ３２を創製した。高力価レンチウイルスベクターを含有する上清を、Ｄｕｌｌら（１９９８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３−８４７１）およびＰａｒｒｙら（２００３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：１６６−１７４）に記述されたところのスプリットゲノムトランスフェクション法を使用してトランスフェクトした、トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を収集することにより得た。
ＩＬ−７：一態様において、ＩＬ７を含んでなるａＡＰＣを、ｃＤＮＡから増幅しかつｐｃＤＮＡ３．１ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎにクローン化したＩＬ−７核酸（配列番号９）を使用して製造した。５’のＣＤ３２ ＸｂａＩおよび３’のＩＬ−７ ＳａｌＩを用いて設計したプライマーを使用するＰＣＲ（３個の別個の反応よりなる）によるＳＯＥを実施した。反応の間に使用した付加的な鋳型はＣＤ３２−ｐＣＤＮＡ３．１およびｐＣＬＰＳ ｍ８ｈ２８−ＩＲＥＳ−ＹＦＰを包含し、次いでＰＣＲ産物を制限酵素消化してＣＤ３２−ＩＲＥＳ−ＩＬ−７ ｐＣＬＰＳを生じた。レンチウイルスは本明細書の別の場所に以前に記述されたとおり作成した。
ＩＬ−１５：別の態様において、成熟ＩＬ−１５配列に結合されたＩｇＥリーダーペプチドを含んでなるプラスミドｐＶＡＸ Ｈｕｍ ＩＬ−１５（配列番号１０を含んでなる）を使用した。ＰＣＲプライマーは、プラスミド配列にＭｌｕＩおよびＳａｌＩ制限部位を付加するように設計した。ＰＣＲ産物を制限酵素で消化し、そしてＣＤ３２−ＩＲＥＳ−ＩＬ−７ ｐＣＬＰＳ（ＩＬ−７遺伝子を除去するためＭｌｕＩおよびＳａｌＩでもまた切断した）にクローン化した。レンチウイルスは本明細書に記述されるとおり調製した。
ＩＬ−２１：別の態様において、活性化したヒトＰＢＭＣからＩＬ−２１（配列番号１１）を増幅し、そしてＴＯＰＯ ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）にクローン化した。ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩを使用して、ヒトＩＬ−２１遺伝子を該ベクターから切り出し、そして、該挿入物をその後、ＮＫＧ２Ｄ−ＩＲＥＳ−ＤＡＰ１２ ｐＣＬＰＳ構築物（ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩを使用して製造した）の第一の位置にクローン化した。ヒトＣＤ３２を、ＭｌｕＩおよびＳａｌＩ部位を含んでなる端に隣接したＰＣＲプライマーを使用してＣＤ３２−ｐＣＬＰＳ（上述されたところの）から増幅した。ＰＣＲ産物をそれぞれの酵素で消化し、そして第二の位置にクローン化して、ＩＬ２１−ＩＲＥＳ−ＣＤ３２ ｐＣＬＰＳを創製した。レンチウイルスは本明細書の別の場所に以前に記述されたとおり製造した。
ＯＸ４０Ｌ：別の態様において、ＯＸ４０Ｌ（配列番号１２）を、成熟樹状細胞から得たｃＤＮＡから増幅し（Ｓｃｈｌｉｅｎｇｅｒら、２０００、Ｂｌｏｏｄ）、そしてｐＣＤＮＡ３．１ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎにクローン化した。制限酵素部位ＭｌｕＩおよびＳａｌＩをＰＣＲプライマーの端に付加し、そしてＰＣＲ産物をそれぞれの酵素で消化し、そして、またＭｌｕＩおよびＳａｌＩで切断してＩＬ−７挿入物を除去したＣＤ３２−ＩＲＥＳ−ＩＬ−７ ｐＣＬＰＳにクローン化した。ＣＤ３２−ＩＲＥＳ−ＯＸ４０Ｌ ｐＣＬＰＳレンチウイルスベクターは、本明細書の別の場所に以前に記述されたとおり作成した。
４−１ＢＢＬ：別の態様において、４−１ＢＢＬ（配列番号１３）を、以前に記述されたとおり陰性選択により精製しかつＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化した、活性化したＢ細胞から得たｃＤＮＡから増幅した。Ｋｐｎ ＩおよびＮｏｔＩ部位を端に導入したＰＣＲ産物を、ＫｐｎＩ／Ｎｏｔ Ｉ消化したｐｃＤＮＡ３．１ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎにクローン化した。該ベクターをＸｂａＩおよびＳａｌ Ｉで消化し、そしてＸｂａＩ／Ｓａｌ Ｉで消化したｐＣＬＰＳレンチウイルスベクターにクローン化した。ｐＣＬＰＳ ４−１ＢＢＬレンチウイルスベクターは、本明細書の別の場所に以前に記述されたとおり作成した。
ＣＤ８０：なお別の態様において、ＣＤ８０（配列番号１４）を、ＰＣＲ産物の端にＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ部位を導入したＰＣＲプライマーを使用して、不死化Ｂ細胞株（Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅら、１９９９、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：６７３−６７９）から得たｃＤＮＡから増幅した。これらの酵素での消化後に、ＣＤ８０をＢａｍＨＩ／ＳａｌＩで消化したｐＣＬＰＳレンチウイルスベクターにクローン化した。ＣＤ８０−ｐＣＬＰＳレンチウイルスベクターは、本明細書の別の場所に以前に記述されたとおり製造した。
ＣＤ８３：なおさらなる一態様において、ＣＤ８３（配列番号１５）を、ＰＣＲ産物の端にＸｂａＩおよびＸｈｏＩ制限部位を導入するためのプライマーを使用して、Ｒａｍｅｓｈ細胞株から調製したｃＤＮＡから増幅した。これらの酵素での消化後に、ＣＤ８３ ＰＣＲ産物をｐＣＬＰＳ（ＸｂａＩ／ＳａｌＩで消化した）に連結した。ＣＤ８３−ｐＣＬＰＳレンチウイスルベクターは、本明細書の別の場所に以前に記述されたとおり製造した。
ＣＤ８６：別の態様において、ＣＤ８６（配列番号１６）を、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔ Ｉ制限部位を端に付加したＰＣＲプライマーを使用して成熟樹状細胞から得たｃＤＮＡ（Ｓｃｈｌｉｅｎｇｅｒら、２０００、Ｂｌｏｏｄに記述されたとおり調製した）から増幅した。ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＮｏｔ Ｉで消化し、そして同様に消化したｐｃＤＮＡ３．１ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎに連結した。このベクターをＢａｍＨＩおよびＳａｌ Ｉで消化しかつｐＣＬＰＳにクローン化した。ｐＣＬＰ ＣＤ８６レンチウイルスベクターは、本明細書の別の場所に以前に記述されたとおり製造した。
ＩＣＯＳ−Ｌ：別の態様において、ＩＣＯＳ−Ｌ：（配列番号１７）を、樹状細胞から得たｃＤＮＡを使用して、端にＫｐｎ ＩおよびＮｏｔ Ｉ制限部位を含んでなるＰＣＲプライマーを使用して増幅した。ＰＣＲ産物を、ＫｐｎＩおよびＮｏｔ Ｉで消化したｐｃＤＮＡ３．１ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎにクローン化した。該プラスミドをＢａｍＨＩおよびＸｈｏ Ｉで消化してＩＣＯＳ−Ｌ挿入物を切り出し、それをｐＣＬＰＳ（ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで消化した）にクローン化してＩＣＯＳ−Ｌ−ｐＣＬＰＳを生成させた。レンチウイルスベクターは、本明細書の別の場所に以前に記述されたとおり製造した。
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１：なお別の態様において、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１ ｃＤＮＡクローンを、国際組織適合性ワーキンググループ組織（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）の細胞および遺伝子バンク共用資源（ｃｅｌｌ ａｎｄ ｇｅｎｅｂａｎｋ ｓｈａｒｅｄ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）（ｃｂａｎｋｏｖｅｒ）のウェブサイト（ｉｈｗｇ．ｏｒｇ）から公的に利用可能である国際細胞・遺伝子バンク（Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ）から得た。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１を、端にＢａｍ ＨＩおよびＳａｌ制限部位を含んでなるプライマーを使用するＰＣＲにより増幅し、そして増幅産物をｐＣＬＰＳにクローン化した。ｐＣＬＰＳ ＨＬＡ−Ａ２レンチウイルスベクターは、本明細書の別の場所に以前に記述されたとおり製造した。
Ｆｌｕ−ＧＦＰ：一態様において、Ｆｌｕマトリックスタンパク質１のヌクレオチド１１３−２９０（配列番号１８）に融合した増強緑色蛍光タンパク質（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州パロアルト）のコーディング領域全体を含んでなるＦｌｕ−ＧＦＰ融合ベクターを使用した。この構築物をＢａｍＨＩおよびＸｈｏ Ｉで消化し、そしてＢａｍ ＨＩおよびＳａｌ Ｉで消化したｐＣＬＰＳにクローン化した。ｐＣＬＰＳ ＧＦＰ−ｆｌｕレンチウイルスベクターは、本明細書の別の場所に以前に記述されたとおり製造した。
ＤＲα：別の態様において、ＤＲα（配列番号１９）およびＤＲＢ４（配列番号２０）を、標準的技術を使用して、ＣＤ３／２８で活性化したＣＤ４ Ｔ細胞から得たｃＤＮＡを使用してクローン化し、そして各核酸をｐＣＬＰＳにクローン化した。ＤＲ４を発現するＫ５６２細胞を製造するため、（欠落）をＫ５６２およびＨＬＡ−ＤＲ細胞に同時に形質導入し、そして、ＤＲ４を発現する細胞を、本明細書の別の場所に記述されるところのフローサイトメトリーを使用して単離した。
加えて、ＩＬＴ３（配列番号２１）およびＩＬＴ４（配列番号２２）を、本明細書の別の場所に開示されかつ当該技術分野で既知の方法に本質的に従って、本発明のａＡＰＣ中で発現させた。
高力価、高効率の第三世代のレンチウイルスベクター（ＬＶ）を使用してａＡＰＣを効率的に製造した。これらのベクターは、それらをヒト治療薬に理想的に適するようにする多数の固有の安全性の特徴を有する。とりわけ、ＨＩＶ−１配列のおよそ９０％が移入ベクターから除去され、ペイロード遺伝子に物理的に連結されたパッケージングおよび組込み配列のみを残す。複製能力のないパッケージングされたＬＶはスプリットゲノムアプローチを使用して生成させる。とりわけ、２９３ Ｔ細胞を、ＨＩＶ ｇａｇ／ｐｏｌ、ＶＳＶ Ｇタンパク質（ｅｎｖ）、ＨＩＶ ｒｅｖおよび移入ベクターをコードする４種の別個のプラスミドでトランスフェクトする。レンチウイルスベクターが、ＲＰＭＩ １６４０（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｉｎｃ．、メリーランド州ロックビル）、１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミンおよび１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン中で培養した２９３Ｔ ＨＥＫ細胞のトランスフェクション後に生じられた。細胞をトランスフェクションの２４時間前にＴ １５０組織培養フラスコあたり５×１０６で接種した。全部のプラスミドＤＮＡはＣｓＣｌ勾配を使用して二重精製した。細胞を、７μｇのｐＭＤＧ．１（ＶＳＶ−Ｇエンベロープ）、１８μｇのｐＲＳＶ．ｒｅｖ（ＨＩＶ−１ Ｒｅｖをコードするプラスミド）、１８μｇのｐＭＤＬｇ／ｐ．ＲＲＥ（パッケージングプラスミド）および１５μｇのｐＣＬＳ移入プラスミドで、Ｆｕｇｅｎｅ ６（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インジアナ州インジアナポリス）を使用してトランスフェクトした。培地をトランスフェクション６時間後に交換し、そしてウイルス上清をトランスフェクション後２４時間および４８時間に収集した。ウイルス粒子を、Ｒｅｉｓｅｒ（２０００、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：９１０−９１３）に記述されるとおり、Ｂｅｃｋｍａｎｎ ＳＷ２８ローターを用いての２８，０００ＲＰＭで３時間の超遠心により１０倍濃縮した。
この戦略の結果として、３つの独立かつ高度にありそうにない組換え事象が起きて複製コンピテントなベクターを創製させたと言わざるを得ない。付加的な安全措置として、このベクターを、３’ＬＴＲプロモーターを欠失させることにより自己不活性化にさせた（Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、１９９８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−９８８０）。従って、組込みに際して、機能するプロモーターのみが、ペイロード遺伝子と並置される供給された内的プロモーター（この場合はＣＭＶ）であり、そして従ってＨＩＶ配列は転写されない。
このレンチウイルスベクター形質導入アプローチを使用して、数種の高力価レンチウイルスベクターが、ＣＤ８３およびＩＣＯＳ−ＬならびにＫＡ２／３２／８６／４−１ＢＢＬ ａＡＰＣについて創製され、また、親ＫＡ２／３２／８６（図３）、ならびに本明細書の別の場所に記述される他のａＡＰＣを創製した。簡潔には、Ｋ５６２細胞を、ＣＤ３２、ＨＬＡ−Ａ２、４−１ＢＢＬおよびインフルエンザＭＰ１ＧＦＰ融合タンパク質をコードするレンチウイルス発現ベクターで形質導入し、全４種のマーカーを発現する単一クローンについて選別し、そして４週間増殖させた（図３）。加えて、Ｋ５６２に基づくａＡＰＣの形質導入に有用な分子の多数の組合せを含んでなる多様なレンチウイルスベクターが、表１に示されるとおり、製造（Ｐ）されているか若しくは設計（Ｄ）されている。
Ｋ５６２細胞
Ｋ５６２細胞は、末期の急性転化の慢性骨髄性白血病を伴う患者から単離した（Ｌｏｚｚｉｏら、１９７５、Ｂｌｏｏｄ、４５：３２１−３３４）。Ｋ５６２はＭＨＣ分子若しくはＴ細胞共刺激リガンドを発現しないＤＣ前駆細胞を表しうるが、しかし、限定されるものでないがサイトカイン産生、接着分子発現およびマクロ飲作用を挙げることができる、ＤＣを効果的なＡＰＣにする多くの他の属性を保持する。単球細胞株Ｕ−９３７は効果的なａＡＰＣとして機能することが不可能であったため、これらの属性はＫ５６２細胞に独特でありうる。従って、Ｋ５６２細胞は、その上に所望のＭＨＣ分子および共刺激リガンドを導入してＣＤ様ａＡＰＣを樹立し得る理想的な足場構造を表す。こうしたａＡＰＣは、高レベルのＭＨＣ発現、多数の共刺激リガンド、およびＴ細胞とのサイトカインのクロストークに携わる能力を包含するＤＣの全部の利点を有する。Ｋ５６２に基づくａＡＰＣはまた、それらの制限された寿命、複製能力の欠如、および明確に定義されていない成熟要件のようなＤＣの欠点も欠く（Ｌｅｅら、２００２、Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：Ａ８−Ａ２２）。
ａＡＰＣを製造するためのＫ５６２細胞の形質導入
本明細書に開示されるデータは、Ｋ５６２細胞がＤＣの強力なＴ細胞刺激能力を良好に模倣することを可能にする、共刺激リガンドのレンチウイルスに媒介される導入を介するＫ５６２ ａＡＰＣの創製を示す。
Ｋ５６２細胞をヒトＦｃ受容体ＣＤ３２でトランスフェクトして（「Ｋ３２細胞」）抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体の負荷を可能にし、そして、該細胞を、追加された共刺激のためヒト４−１ＢＢＬでもまたトランスフェクトした（「Ｈ３２／４−１ＢＢＬ細胞」）（図１）。ＫＡ２／３２／８６／４−１ＢＢＬ／ＣＤ８３ ａＡＰＣを、スピン感染（ｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）（Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙら、２０００、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１００７４−１００８０）によりＣＤ８３レンチウイルスベクターを用いて生じ（欠落）、ＫＡ２／３２／８６／４−１ＢＢＬ親を形質導入した。およそ５百万のＫＡ２／３２／８６／４−１ＢＢＬ細胞を５００μｌの濃縮ウイルス（５×１０７〜５×１０８ＩＦＵ／ｍｌ）と混合し、そして１２００ｇで２時間回転した。形質導入５日後に細胞をＣＤ８３特異的Ａｂで染色し、そしてＭｏｆｌｏソーターを使用して高発現クローンを単離した。選別１５〜２０日後に単一クローンのコロニーが見え、そして単一クローンのこれらのコロニーをＣＤ８３発現によりスクリーニングした。高発現体をさらに増殖させ、そして他の導入したマーカー（ＨＬＡ−Ａ２、４−１ＢＢＬ、ＣＤ８６およびＣＤ３２）の発現レベルを測定して、子孫がＣＤ８３発現のほかはすべて親細胞株に類似であることを確認した。Ｋ３２／８６／４−１ＢＢＬ／ＩＣＯＳ−ＬおよびＫ３２／８６／４−１ＢＢＬ／ＩＣＯＳ−Ｌ／ＣＤ８３ ａＡＰＣを、適切なウイルスを使用してこの様式で創製した。
本明細書に記述される方法を使用して、最低９種の遺伝子の安定な発現がＫ５６２ ａＡＰＣで達成された。以下の遺伝子をＫ５６２細胞に形質導入し、そして、フローサイトメトリーを使用して検出されたとおり安定に発現された：Ｆｌｕ−ＧＦＰ（図８Ａ）；ＣＤ８０（図８Ｂ）；ＣＤ８６（図８Ｃ）；４−１ＢＢＬ：（図８Ｄ）；およびＨＬＡ ＡＢＣ（図８Ｅ）。ＫＴ３２／Ａ２／４−１ＢＢＬ／４０Ｌ／ＣＤ８０／ＣＤ８３／ＣＤ８６は、検出可能なレベルのＣＤ３２、ＣＤ８３、ＣＤ４０ＬおよびＩＣＯＳ−Ｌもまた安定に発現した。これらの発現レベルは、いかなる選択も伴わずに３か月以上の連続培養について一定のままであった。加えて、数種のａＡＰＣの製造を図３に具体的に説明する。これらのａＡＰＣは、ＣＭＶプロモーターにより駆動される導入遺伝子の全部の発現を含んでなる。ＣＭＶ特異的転写因子の隔絶により導入遺伝子の発現レベルを減少させることが起こり得たとは言え、（Ｃａｈｉｌｌら、１９９４、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３４４：１０５−１０８；Ｋａｎｇら、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４５２−１４５６）今日まで、５種の異なるレンチウイルスベクターでＫ５６２細胞を連続的に形質導入することに伴ういかなる問題の証拠も検出されていない（図３）。
Ｋ５６２細胞の上述された形質導入方法を使用して、親Ｋ５６２ｃｃを、ＬＶで形質導入したＫ５６２細胞（例えば５種および８種の遺伝子で形質導入されかつそれらを発現する）と比較した。図７および８に具体的に説明されるとおり、ＬＶで形質導入した細胞は、それ以外は同一のしかし形質導入されていない親細胞に比較して、好都合な増殖のキネティクスを表す。
共刺激リガンドの発現に加え、本発明のａＡＰＣは、ＣＤ３２／ＩＲＥＳ／ＩＬ−７およびＣＤ３２／ＩＲＥＳ／ＩＬ−１５ベクターで形質導入したＫ５６２細胞によるＩＬ−７およびＩＬ−１５の産生により例示されるとおり、多様なサイトカインを産生させるのに使用し得る。該細胞を高ＣＤ３２発現について選別し、そしてそれぞれのインターロイキンの産生を評価して（図１３）、適切なサイトカインが産生されたことを示した。
さらに、上述されたＫ５６２細胞の形質導入方法を使用して、ａＡＰＣは、プラスミドベクターを使用してトランスフェクトしたそれ以外は同一のＫ５６２細胞中でのＣＤ３２の発現より高レベルで、ＬＶからＣＤ３２を発現する（図１１）。これらのデータは、驚くべきことに、Ｋ５６２がレンチウイルスベクターを使用して容易に形質導入されたことを示す。図１１Ｄは、Ｋ５６２細胞を形質導入するためＬＶを使用するＣＤ３２の発現が、プラスミドベクターを使用してトランスフェクトしたそれ以外は同一のＫ５６２細胞中でのＣＤ３２発現のレベルより大きいことを描くグラフである。さらに、本明細書に開示されるデータは、ＣＤ３２発現のレベルが９か月間以上維持されたことを示す。さらに、このレベルのＣＤ３２発現は９か月間以上維持された。ＣＤ６４を発現するａＡＰＣ細胞の特徴付けを下述する。
加えて、本明細書に開示されるデータは、該ａＡＰＣがウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含まない培地中の培養物中で増殖することを示す（ヒト患者の処置での使用のためのａＡＰＣの製造に重要な考慮）（図７を参照されたい）。これらのデータは、本発明の新規ａＡＰＣが３％ＡＢ血清を含んでなる合成培地（Ａｉｍ Ｖ）中で増殖することを示す。すなわち、多様なＫ５６２に基づくａＡＰＣを、レンチウイルスベクター（「ＬＶ」）すなわちＫＴ３２（１遺伝子）；ＫＴ３２／４−１ＢＢＬ／ＣＤ８６（３遺伝子）；ＫＴ３２／４−１ＢＢＬ／ＣＤ８６／Ａ２／Ｆｌｕ−ＧＦＰ（５遺伝子）を使用して親Ｋ５６２（ｋ５６２ｃｃ）を形質導入することにより製造した。加えて、図７に具体的に説明されるとおり、レンチウイルスベクターの導入はＫ５６２細胞の増殖速度を有意に変えない。これらのデータは、ＬＶで形質導入したＫ５６２ ａＡＰＣを使用してマスター細胞バンクを製造し得ること、およびａＡＰＣが親細胞と同じくらい良好に増殖することを示す。
本データは、Ｋ５６２細胞の形質導入方法、ならびにこれらのａＡＰＣの発現および増殖特性を示した。加えて、Ｋ５６２に基づくａＡＰＣに形質導入したサイトカイン／共刺激分子の長期安定性および十分な発現が評価されている。ＣＤ３２は、形質導入したＫ５６２細胞中で９ヵ月より長い間安定に発現された。さらに、Ｋ５６２に基づくａＡＰＣに導入された最低８種の外因性分子の検出可能かつ安定な発現もまた達成され（ＫＴ３２−Ａ２−４１ＢＢＬ−４０Ｌ−８０−８３−８６）、また、付加的な分子が同様に発現されることができないことを示唆するデータは存在しない。事実、現時点で、６０日より長い間９種の遺伝子（ＩＣＯＳ−Ｌを包含する）を発現したａＡＰＣが製造されている。従って、現在、単一のａＡＰＣ中で多様な分子を発現する本発明のａＡＰＣの能力は制限されない。さらに、本発明のａＡＰＣはマイコプラスマについて陰性かつ複製コンピテントなレンチウイルス（ＲＣＬ）であり、また、それらの安全性およびいずれかの汚染する病原体の欠如は容易に評価し得る。
本発明は、限定されるものでないが表２に示されるものを挙げることができる、本明細書に示される方法により製造される多数のＫ５６２に基づくａＡＰＣを含んでなる。多様な免疫刺激分子の組合せを含んでなるこれらのａＡＰＣは、あるＴ細胞サブセットの増殖、Ｔ細胞サブセットを増殖させる因子の組合せの同定、ならびにａＡＰＣおよび若しくはそれにより増殖されたＴ細胞がそれの必要な患者に投与される、細胞に基づくおよび遺伝子治療を含んでなる、ｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ双方の方法に使用し得る。もちろん、本発明はこれら若しくはいずれかの特定のａＡＰＣに制限されず、そして、表２に並べられる一覧は本明細書に提供される教示を単に具体的に説明する。
ａＡＰＣのｉｎ ｖｉｔｒｏの治療的使用
本発明は、治療的使用のためのＴ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ治療的ワクチン接種およびｅｘ ｖｉｖｏ増殖のためのＬＶで工作したＫ５６２ ａＡＰＣを包含する。抗原、サイトカインおよび／若しくは共刺激分子を、同一若しくは別個のプロモーター／制御配列の制御下にＫ５６２細胞に形質導入し得る。さらに、腫瘍細胞抗原をコードする核酸を細胞中に形質導入し得るか、若しくは、細胞が適切なエピトープをプロセシングしかつＭＨＣタンパク質の情況で提示するような細胞に別の方法で抗原を負荷し得る。これは、Ｋ５６２細胞が、必要とされる特異的抗原若しくはエピトープを最初に同定若しくは単離する必要性を伴わずに抗原をプロセシングかつ提示する能力を有することが、本明細書の別の場所で示されているからである。従って、細胞抽出物（腫瘍細胞の最低１種の膜成分を含んでなる）をＫ５６２に基づくａＡＰＣに負荷し得、そして、関連する抗原をプロセシングかつ提示する該細胞の天然の能力を活用する。カスタマイズしたａＡＰＣを本明細書に示す一方、これらは具体的説明の目的上のみであり、そして本発明は表３に示されるこれらの態様に制限されない。これは、本明細書の別の場所に提供される教示を備えた当業者により認識されるであろうとおり、無数の分子を事実上無制限の組合せでａＡＰＣにより形質導入しかつ発現させ得るからである。
ａＡＰＣのｅｘ ｖｉｖｏでの治療的使用
他のａＡＰＣを、限定されるものでないが養子免疫療法および遺伝子治療を挙げることができるｅｘ ｖｉｖｏの使用のため製造し得る。こうしたｅｘ ｖｉｖｏ使用のためのａＡＰＣのカスタマイズしたバージョンのいくつかは、とりわけ下の表４に開示される構築物である。すなわち、被験体から単離したＴ細胞を、これら若しくは無数の他のａＡＰＣを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激かつ増殖させ得、その後、該Ｔ細胞を被験体に導入してそれによりそれに対する養子免疫療法を提供し得る。加えて、増殖させたＴ細胞を、遺伝子工作前若しくはその非存在下での該Ｔ細胞中での該タンパク質の発現に比較して、発現されなかったか若しくはより低レベルで発現された外因性タンパク質を発現するように遺伝子的に工作し得る。従って、本発明は、それの必要な被験体の自己移植に使用されるＴ細胞を増殖させるために本発明のａＡＰＣを使用するｅｘ ｖｉｖｏの細胞に基づく養子免疫療法および遺伝子治療の双方を提供する。表４は単にこうした細胞／遺伝子治療に使用し得るａＡＰＣのいくつかの具体的に説明する例を示すが、しかし、本発明は、本発明のこれらの例示的な「在庫があり入手可能な」ａＡＰＣに制限されない。
ヒトＣＤ ４ Ｔ細胞のａＡＰＣでの刺激
本明細書に開示されるデータは、ＣＤ４ Ｔ細胞の長期増殖が、外因性サイトカインの存在下でＫ３２／ＣＤ３／２８およびＫ３２／８６ＣＤ３ ａＡＰＣを使用して得られたが、しかしＵ９３７に基づくａＡＰＣは有効でなかったことを示す（図５）。さらに、該データは、Ｋ５６２に基づくａＡＰＣ（例えばＫ３２／ＣＤ３／２８、Ｋ３２／８６／ＣＤ３）が、ビーズおよび細胞双方にＣＤ３およびＣＤ２８を負荷する場合にＣＤ４ Ｔ細胞の長期増殖をより効果的にビーズに基づくａＡＰＣ（ＣＤ３／２８被覆ビーズ）を媒介することを示す。これらの結果は、ビーズに基づく系を使用して可能でない、検出可能な「クロストーク」がＫ５６２に基づくａＡＰＣとＴ細胞の間に存在することを示す。図５に具体的に説明されるとおり、全部の腫瘍細胞株が人工ＡＰＣとしてはたらく能力を有するわけではなく、また、該データは、予期されなかった、強力なＡＰＣとしてはたらくＫ５６２細胞の能力をさらに示す。これらの驚くべき結果は、Ｋ５６２に基づくａＡＰＣを使用して可能である、従来技術の方法を上回る有意の改良を裏付ける。
本明細書に開示されるデータは、ＣＤ４ Ｔ細胞によるサイトカインおよび／若しくは共刺激分子発現を誘導するためのＫ５６２に基づくａＡＰＣの有用性をさらに示す（図６Ａ−６Ｄ）。これらのデータは、全部、Ｋ５６２に基づくａＡＰＣが、Ｔ細胞によるサイトカインおよび共刺激（ｃｏｓｔｉｍ）遺伝子の発現の誘導において、Ｕ９３７に基づくａＡＰＣよりもはるかに優れていること、また、数種のａＡＰＣ構築物が、発現されているサイトカインおよび／若しくは共刺激分子にいくぶん依存して、他者よりも良好であることを示す。より具体的には、Ｋ３２／ＣＤ３／２８は他のａＡＰＣと比較して一般に優れていた一方、Ｂ７−Ｈ３の発現は、類似の条件下でＫ３２／ＣＤ３／２８に比較した場合に、ＣＤ４の存在下でＫ３２／ＣＤ３により実際により大きかった。これらのデータは、Ｋ５６２ ａＡＰＣが、Ｔ細胞と相互作用する際に、Ｔ細胞の活性化および増殖をさらに高め得る一連の付加的なサイトカインおよび共刺激分子を産生する（ＡＰＣおよびＴ細胞のクロストーク）ことを示す。より具体的には、ある種の分子（例えばＫ３２／ＣＤ３／２８、Ｋ３２／ＣＤ３、Ｋ３２、Ｕ３２／ＣＤ３／２８、Ｕ３２／ＣＤ３、Ｕ３２）をコードする多様なベクターで形質導入した多様なＫ５６２およびＵ９３７に基づくａＡＰＣを、目的の分子（例えばＩＬ−１５、ＰＤ−Ｌ−１、ＰＤ−Ｌ２およびＢ７−Ｈ３）の発現を誘導するそれらの能力についてアッセイした。本明細書に開示されるデータは、Ｋ５６２に基づくａＡＰＣがこれらの分子の検出可能な発現を誘導し、かつ、Ｕ９３７に基づく細胞よりもはるかにより大きい程度までそうしたことを示す。これらのデータは、本発明の新規ａＡＰＣの有用性、および従来技術の方法を上回る有意の改良をさらに示す。これらのデータは、全部、Ｋ５６２に基づくａＡＰＣが、Ｔ細胞によるサイトカインおよび共刺激（ｃｏｓｔｉｍ）遺伝子の発現の誘導においてＵ９３７に基づくａＡＰＣよりはるかに優れていることを示すからである。これらの結果は、Ｋ５６２親細胞株が乏しいＴ細胞刺激活性を示すことを示す以前の教示（Ｂｒｉｔｔｅｎら、２００２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５９：９５−１１０）を考えれば、とりわけ注目に値する。
親Ｋ５６２細胞、Ｕ９３７に基づくａＡＰＣおよびビーズに比較しての本発明のａＡＰＣの優れた結果を考えて、本明細書に開示される多様なａＡＰＣの相対的能力を評価した。数種のａＡＰＣ構築物は、ある種のＴ細胞に対する効果の媒介で他者よりも良好であり、また、有効性が、発現されているサイトカインおよび／若しくは共刺激分子またはそれらの組合せにいくぶん依存して変動すること。より具体的には、Ｋ３２／ＣＤ３／２８は他のａＡＰＣと比較して全般的に優れていた一方、Ｂ７−Ｈ３の発現は、類似の条件下でＫ３２／ＣＤ３／２８と比較した場合にＣＤ４の存在下でＫ３２／ＣＤ３により実際により大きかった。これらのデータは、新規Ｋ５６２に基づくａＡＰＣ中で発現される分子のある種の組合せが、Ｔ細胞のある種の集団に対しより大きな効果を有することをさらに示す。これらのデータは、従って、所望の効果（１種若しくは複数）を達成しかつ／または目的のＴ細胞サブセットを刺激しかつ増殖させること（それらのいずれも本発明の前に可能でなかった）の分子の多様な組合せの有効性を評価するための新規の系を提供する。
ヒトＣＤ８ Ｔ細胞のａＡＰＣでの刺激
簡潔には、５０，０００の照射したＫＴ３２／４−１ＢＢＬ／ＣＤ８６を抗ＣＤ３ Ａｂで被覆し、そして健康なドナーからの１００，０００の新たに単離したＣＤ８ Ｔ細胞と混合した。１０〜１２日ごとに、ＣＤ８ Ｔ細胞を、新たに照射したＫＴ３２／４−１ＢＢＬ／ＣＤ８６ ａＡＰＣで再刺激した。細胞を廃棄しなかった場合に蓄積していたとみられる細胞の総数を、培養日数に対する総細胞数の半対数プロットとして描く（図９）。図９でまた具体的に説明されるとおり、ＣＤ３２および４−１ＢＢＬで形質導入したａＡＰＣ（Ｋ３２／４−１ＢＢＬ）により増殖させたポリクローナルＣＤ８ Ｔ細胞は、４３日後に１８，６００倍増殖した。
本明細書に開示されるデータは、ａＡＰＣ（例えばＫ３２／Ｋ−４１ＢＢＬ ａＡＰＣ）を使用しての抗原特異的ＣＤ８ ＴＣＭの増殖をさらに示す。簡潔には、ｆｌｕ ｔｅｔ＋およびｆｌｕ ｔｅｔ−双方のＴ細胞を、培養日数の関数として増殖させ（図１０Ａ−１０Ｃ）、ここでインターロイキン２（ＩＬ−２）を第２０日に培地に添加した。該データは、細胞をＦｌｕ ｔｅｔ−若しくはＦｌｕ ｔｅｔ＋であるとして選別したフローサイトメトリーを使用してＣＤ８増殖について染色した細胞中での第１６日までの移動を示し、Ｋ３２／４−１ＢＢＬ ａＡＰＣとともに培養したＣＤ８ ＴＣＭ細胞の抗原特異的増殖を示す。第２６日に、細胞を、Ｔ２ヌルであったか若しくはＴ２−ｆｌｕを発現したｔｅｔ＋若しくはｔｅｔ−細胞を特異的に溶解するそれらの能力についてアッセイした。該データは、細胞死滅が、クロム放出アッセイにより示されるとおり、ｔｅｔ＋のＴ２−ｆｌｕ標的細胞に特異的であったことを示す（図１０Ｅ）。特異的溶解パーセントはエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）細胞比の関数であり、最大の特異的細胞溶解は１０：１の比で検出され、そしてその後、ＥＴ：比を１：１まで減少させた際に減少した。検査した全部のＥ：Ｔ比で、ｔｅｔ＋のＴ２−ｆｌｕに特異的な細胞溶解が、該ａＡＰＣを使用して増殖させた細胞を使用して観察された。
本発明のａＡＰＣが抗原／ＭＨＣ特異的様式で作用し得るかどうかを決定するため、Ｋ５６２細胞を、ＧＦＰに連結したＡ２拘束性エピトープＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列番号１）をコードするＨＬＡ−Ａ２、ＣＤ８６、４−１ＢＢＬ、ＣＤ３２、ＣＤ６４およびインフルエンザＭＰ１ミニ遺伝子で形質導入した。このＫＡ２／３２／８６／４１−ＢＢＬ／Ｆｌｕ ＧＦＰ ａＡＰＣのＦＡＣＳ分析は、全５種のマーカーが高レベルで発現されることを示し（図３および１２）、また、全部の導入遺伝子の安定な発現が約９か月の連続培養の間観察された。
これらのａＡＰＣが抗原特異的細胞を増殖させるのに十分であったことを示すため、１５００のｆｌｕ四量体陽性細胞をＨＬＡ−Ａ２ドナーから単離し、そして３０００の照射したＫＡ２／３２／８６／４−１ＢＢＬ／Ｆｌｕ ＧＦＰ ａＡＰＣと混合した。１０日ごとに、新たに照射したＫＡ２／３２／８６／４−１ＢＢＬ Ｆｌｕ ＧＦＰ ａＡＰＣを、２Ｔ細胞ごとについておよそ１ａＡＰＣとなりうるように培養物に添加する。２２日後に、およそ一千万のＣＤ８ Ｔ細胞が存在した。これらの細胞をＦｌｕ特異的Ａ２四量体で染色し、そして細胞の９０％以上がＦｌｕ特異的であり（図１２）、選別前細胞と比較しておよそ２５０倍の濃縮であった（図１２Ｅ）。これらのデータは、Ｋ５６２細胞が、抗体の使用を伴わずに抗原をプロセシングかつ提示しそして抗原特異的Ｔ細胞を増殖させる能力を有することを示す。重要なことには、ＫＡ２／３２／８６／４−１ＢＢＬ／Ｆｌｕ ＧＦＰ ａＡＰＣは、細胞の四量体陰性画分からＴ細胞を増殖させることが不可能であった。
類似の実験プロトコルを使用してｆｌｕ特異的Ｔ細胞を増殖させたが、しかし、シグナル「１」を送達するのに、ＭＨＣクラスＩにより結合されたペプチドよりむしろ抗ＣＤ３を使用した（図２）。簡潔には、細胞を、インフルエンザマトリックスタンパク質ペプチドのアミノ酸配列（ＧＩＬＧＦＶＴＶＬ；配列番号１）を負荷したＡ＊０２０１四量体ＭＨＣで染色し、そして陽性および陰性画分に選別した。Ｋ３２／４−１ＢＢＬ／ＣＤ３／２８ ａＡＰＣを使用する１７日の増殖後に、最初の選別に使用した同一の四量体で細胞の各集団を染色した。細胞の約６０％のみがｆｌｕ四量体陽性であり、そして全体の染色レベルはより低かった。これは、ＫＡ２／３２／８６／４−１ＢＢＬ／Ｆｌｕ ＧＦＰ ａＡＰＣが、ＨＬＡ−Ａ２により提示されるＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列番号１）ペプチドに対する最高の親和性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を選択的に増殖させることを示唆する。
抗ＣＤ３およびＣＤ２８ Ａｂで被覆したＫ３２／４−１ＢＢＬ ａＡＰＣを、抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞を増殖させるのに使用し得るかどうかを決定するために、ＭＨＣ四量体で選別した初代ＣＤ８＋ Ｔ細胞の集団を、Ｋ３２／４−１ＢＢＬ／ＣＤ３／２８ ａＡＰＣとともに１０週間培養した（図２Ａ）。インフルエンザに対する免疫をもつＡ＊０２０１の個体からのＴ細胞を、抗ＣＤ８ ｍＡｂ、および、インフルエンザマトリックスタンパク質のＡ＊０２０１拘束性ペプチドエピトープに複合体形成させたＡ＊０２０１ ＭＨＣ四量体（ｆｌｕ ＭＰ四量体）で染色した。低頻度（約０．１％未満）の四量体＋集団を選別し、そして抗ＣＤ３およびＣＤ２８ Ａｂで被覆した照射したＫ３２／４−１ＢＢＬ ａＡＰＣで刺激した。全細胞を、Ｋ３２／４−１ＢＢＬ ａＡＰＣで約１０日間隔で再刺激した。培養の間に特異的ｆｌｕ刺激を提供しなかった。数か月の培養の間、指数増殖曲線が得られた。代表的な一実験において、およそ８，０００の抗原特異的Ｔ細胞が培養１か月後に１．５×１０９細胞を生じ（図２Ｂ）、これは効果的な免疫療法に十分な数である（Ｒｉｄｄｅｌｌら、１９９５、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：５４５−５８６）。培養物の表現型分析は、休止ヒトＴ細胞と混合した照射したａＡＰＣが純粋なＴ細胞の集団を１週間以内に生じたことを示した。さらに、ｆｌｕ ＭＰ四量体陽性細胞は、Ｆｌｕ−ＭＰペプチドでパルスしたＴ２標的に対する強力な細胞傷害性を表した（図２Ｃ）。この戦略は、ＨＩＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞を増殖させ、および広範な特異性をもつＣＤ８ Ｔ細胞を増殖させるためにこれらのａＡＰＣを使用するように適合させ得る。
Ｋ３２／４−１ＢＢＬ ａＡＰＣを、ｈＴＥＲＴ特異的細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）を増殖させるのにもまた使用した。Ｋ３２／４−１ＢＢＬ ａＡＰＣを使用して増殖させたｈＴＥＲＴ特異的ＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ２を発現しかつテロメラーゼ＋の癌細胞（ＯＶ−７）を特異的に溶解したが、しかし、テロメラーゼ＋かつＨＬＡ−Ａ２−である癌細胞（ＳＫ−ＯＶ−３）はしなかった（図１０Ｅ）。従って、ａＡＰＣは、ＨＬＡ−Ａ２の情況で認識されるために抗原を必要とする抗原特異的ＣＴＬの増殖を誘導した。さらに、増殖の間に、ｈＴＥＲＴをワクチン接種した乳癌患者から得たＣＴＬは、ＭｏＦｌｏ選別を使用して評価されるとおり、Ｋ３２／４−１ＢＢＬ ａＡＰＣによる増殖の間にｔｅｔ＋ ＣＤ８ ＣＴＬの割合の検出可能な増加を示した。それぞれ１０Ａ〜１０Ｃに対応するＭｏＦｌｏ選別のタイミングを、矢印により示されるところの集団の倍加を示すグラフ上で示す（図１０Ｄ）。
驚くべきことに、本明細書に開示されるデータは、Ｋ５６２に基づくａＡＰＣが、その後Ｔ細胞に提示される抗原をプロセシングする能力を有し、それにより増殖を司る特定のエピトープが演繹的に知られていない抗原特異的Ｔ細胞を増殖させることを初めて示す。より具体的には、精製したＴ細胞をＨＬＡ Ａ＊０２０１ドナーから得、そして該細胞を抗ＣＤ８ ｍＡｂ、およびインフルエンザマトリックスタンパク質のＡ＊０２０１拘束性エピトープと複合体形成させたＡ＊０２０１ ＭＨＣ四量体（ｆｌｕ−ＭＰ−四量体）で染色した。およそ１，５００細胞の四量体陽性集団を選別し、そして抗ＣＤ２８抗体を負荷した照射したＫＴＡ２／ＣＤ３２／４−１ＢＢＬ／ＦＬＵ−ＧＦＰ ａＡＰＣを使用して刺激した。細胞をおよそ１０〜１２日ごとにＫＴＡ２／ＣＤ３２／４−１ＢＢＬ／ＦＬＵ−ＧＦＰ ａＡＰＣで再刺激した。インターロイキン−２を供給（ｆｅｅｄｉｎｇ）ごとに（およそ２〜３日ごとに）培養物に添加した。
培養２６日後に、Ｔ細胞の大部分は最初の選別前集団に比較してｆｌｕ−ＭＰ四量体陽性となり、ａＡＰＣがｆｌｕ特異的抗原をプロセシングかつ提示し、そしてｆｌｕ特異的ＣＴＬを効率的に増殖させたことを示した（図１２Ａ−１２Ｆ）。これらの結果は、本発明のａＡＰＣが、細胞を産生するのに必要とされる抗原の正確なエピトープが知られていない場合であっても抗原特異的Ｔ細胞を増殖および産生させるのに使用し得ることを示す。これは、Ｔ細胞を刺激する正確な抗原が知られていない移入療法の開発に重要である。これは、とりわけ、ほとんどが知られていない腫瘍特異的抗原の場合である。従って、本発明は、病原体（例えばウイルス）、若しくはそれに対する特異的Ｔ細胞応答が望ましい他の分子をＫ５６２細胞に提供すること、および該細胞に該抗原をプロセシングかつ提示させてそれにより所望の抗原特異的応答を生じさせることに関する。
付加的な一実験において、特異的リガンドが抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の予期されない増殖を促進することが示された。図２１は、四量体選別により単離しかつＣＦＳＥで染色しそして２：１の比でａＡＰＣと混合したＣＭＶ特異的Ｔ細胞を具体的に説明する。図２１ＡはＣＭＶ特異的ＣＤ８細胞を具体的に説明し、図２１Ｂは、抗ＣＤ３抗体を負荷したＫ３２細胞と接触させたＣＭＶ特異的ＣＤ８細胞を具体的に説明する。図２１Ｃは、ＣＤ３２、ＩＬ−１５、４−１ＢＢＬ、ＣＤ８０および抗ＣＤ３を発現するａＡＰＣと接触させたＣＭＶ特異的ＣＤ８細胞を描く。これらのデータは、共刺激リガンド（この場合はＣＤ８０ ＩＬ−１５および４−１ＢＢＬ）の添加が、抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖を予想外に促進することを示す。
修復された（ｒｅｓｔｏｒｅｄ）エフェクター機能を伴うＨＩＶ−１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞のａＡＰＣ増殖
抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の自己移入によるＨＩＶ特異的Ｔ細胞応答を増強するための試みは、ＨＩＶ感染の長期抑制をもたらしていない（Ｔａｎら、１９９９、Ｂｌｏｏｄ ９３：１５０６；Ｋｏｅｎｉｇら、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１：３３０−３３６；Ｂｒｏｄｉｅら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．５：３４（欠落）、Ｒｉｄｄｅｌｌら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２：２１６−２２３；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら、１９９７、Ｂｌｏｏｄ ９０：２１９６−２２０６）。これらの細胞のｉｎ ｖｉｖｏで生存することの不能は、臨床上意味のある方法で抗ＨＩＶ応答を測定するためのいかなる試みも不可能にした。若干の症例において、これらの細胞の早期の死亡は選択可能なマーカーの免疫認識として容易に説明された（Ｒｉｄｄｅｌｌら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２：２１６−２２３）。他の症例においては、注入に際してのＴ細胞の死の理由はより少なく明確であった。これらの早期の研究は、ＨＩＶ特異的ペプチドを末梢単核血液細胞（ＰＭＢＣ）若しくはリンパ芽球腫細胞株（ＬＣＬ）に負荷すること、限界希釈を実施してクローンを単離すること、ならびに、高濃度の外因性ＩＬ−２および共刺激の非存在下でトリガーするＴＣＲを使用してＴ細胞をｅｘ ｖｉｖｏで数か月間増殖させて１×１０９までのＨＩＶ特異的Ｔ細胞を生じさせることというわずかに異なる変形物を使用した。いずれかの特定の論理により拘束されることを願わないが、もしかしたら高濃度のＩＬ−２への依存性と結合された長期のｅｘ ｖｉｖｏ培養が、それらの宿主に一旦戻し注入されればこれらの細胞でのアポトーシスの開始につながったのかもしれない。
ビーズに基づくａＡＰＣ（ＣＤ３／２８被覆ビーズ）は、ＨＩＶに感染した個体からＣＤ４ Ｔ細胞を増殖させるための効率的なベヒクルである（Ｌｅｖｉｎｅら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：１９３９−１９４３）一方、ＨＩＶ養子移入臨床試験での使用に細胞に基づくａＡＰＣ（遺伝子を改変したＫ５６２細胞）を使用することに対する多数の潜在的な利点が存在する。第一に、細胞に基づくａＡＰＣはビーズに基づく系よりもはるかにより確実にＴ細胞を増殖させる（Ｐａｒｒｙら、２００３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：１６６−１７４）。これは治療的量のＴ細胞を得るのに必要とされる時間を短縮して、これらの治療の費用を低減し、そしておそらく、それらが患者に一旦戻し注入されれば該細胞の機能を向上させる。次に、付加的な共刺激分子はレンチウイルス形質導入によりａＡＰＣに容易に導入し得る。重要なことに、ＣＤ３／２８被覆ビーズはＣＤ４ Ｔ細胞を増殖させるためにのみ有効である（Ｌａｕｘら、２０００、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９６：１８７−１９７；Ｄｅｅｔｈｓら、１９９９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：１０２−１１０）。従って、ＣＤ４およびＣＤ８双方のｅｘ ｖｉｖｏで増殖させたＴ細胞をＨＩＶに感染した個体に戻し注入することの免疫再構成能力を試験するために、新たな増殖系を開発しなければならず、そしてこうした系は本明細書に開示される。
ＨＩＶに感染した個体からＣＤ８ Ｔ細胞を最適に増殖させるＡＰＣを創製することが有用である。以前、Ｋ５６２細胞が、ＣＤ８ Ｔ細胞の長期増殖を誘導する最低限のａＡＰＣとして、ＣＤ３２（刺激性Ａｂを結合するため）および４−１ＢＢＬでトランスフェクトされた。また、ＣＤ８６でトリガーされたＣＤ２８は、抗ＣＤ２８Ａｂを与えられたＴ細胞をトリガーすることと同一の増殖能力をＴ細胞に与えたことが示された（Ｔｈｏｍａｓら、２００２、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０５：２５９−２７２）。Ａｂに依存しない培養系を開発することが望ましかったため、ＣＤ８６を、むしろ抗ＣＤ２８よりも、Ｔ細胞増殖およびＨＩＶ複製双方に対するＣＤ２８の共刺激効果をトリガーするのに使用した。従って、以下の５種のａＡＰＣ、すなわち、ＫＡ２／３２／８６、ＫＡ２／３２／８６／４−１ＢＢＬ、ＫＡ２／３２／８６／４−１ＢＢＬ／ＣＤ８３、ＫＡ２／３２／８６／４−１ＢＢＬ／ＩＣＯＳ−ＬおよびＫＡ２／３２／８６／４−１ＢＢＬ／ＣＤ８３／ＩＣＯＳ−Ｌを使用して、ＨＩＶ感染患者からのＣＤ８ Ｔ細胞を増殖かつ機能的に試験し得る。ＫＡ２／３２／８６はＣＤ８ Ｔ細胞を刺激し得るが、しかしそれらに長期増殖能力を与えない（Ｍａｕｓら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１４３−１４８）。このａＡＰＣは、他の共刺激リガンドをそれと比較し得る陰性（すなわち基礎）対照としてはたらく。創製したａＡＰＣの全部はＨＬＡ−Ａ２およびＣＤ３２双方を発現する。これは、ＣＤ３２が結合した抗ＣＤ３ Ａｂにより送達されるシグナル１を有することによりポリクローナルＣＤ８ Ｔ細胞を（図１）、若しくはＨＬＡ−Ａ２に結合されたペプチドにより開始されるシグナル１を有することにより抗原特異的Ｔ細胞を増殖させるための同一のａＡＰＣの使用を可能にする。
ＫＡ２／３２／８６／４−１ＢＢＬは、健康なドナーからのＣＤ８ Ｔ細胞を増殖させるための最低限のａＡＰＣである（Ｍａｕｓら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１４３−１４８）。付加的な共刺激シグナルが、向上されたエフェクター機能をもつＨＩＶ特異的Ｔ細胞を増殖させるのに必要とされうる。このａＡＰＣで増殖させた細胞の、下に列挙されるａＡＰＣで増殖させた細胞との比較は、いかなる付加的な所望の共刺激シグナルの同定も見込む。
ＫＡ２／３２／８６／４−１ＢＢＬ／ＣＤ８３は、ＣＤ８３が、Ｔ細胞活性化におけるその役割が最近検討された成熟ＤＣのマーカーであるために使用される。抗ＣＤ３およびＣＤ８３Ｉｇ融合タンパク質で被覆した磁性ビーズでのＴ細胞の刺激は、ＣＤ４ Ｔ細胞に対するＣＤ８の比を高め、ＣＤ８３の連結がＣＤ８ Ｔ細胞を優先的に活性化することを示唆した。さらに、ＣＤ８を発現する腫瘍細胞は、ＣＤ８ Ｔ細胞によりより効率的に死滅され、また、ＣＤ８３欠乏性の腫瘍もまた拒絶するように免疫系をプライミングした（Ｓｃｈｏｌｌｅｒら、２００１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：３８６５−３８７２；Ｓｃｈｏｌｌｅｒら、２００２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：２５９９−２６０２）。
ＫＡ２／３２／８６／４−１ＢＢＬ／ＩＣＯＳ−Ｌは、ＩＣＯＳ−ＬがＣＤ２８関連分子の誘導可能な共刺激タンパク質（ＩＣＯＳ）を結合して、エフェクターサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＩＬ−１３）の産生を高めるがしかし高レベルのＩＬ−２を産生（Ｈｕｔｌｏｆｆら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ ３９７：２６３−２６６）若しくは生存因子Ｂｃｌ−ｘＬを誘導（Ｐａｒｒｙら、２００３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：１６６−１７４）することが不思議なことに不可能であるＴ細胞に強力な共刺激シグナルを送達するために使用される。ＩＣＯＳおよびＣＤ２８が免疫系で演じている正確な役割は未だ不明確であるが、しかし、いくつかの疾患モデルでのＩＣＯＳおよびＣＤ２８阻害の結果を比較することが手掛かりを明らかにした。ＩＣＯＳ若しくはＣＤ２８いずれかの阻害は、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）（Ｋｏｐｆら、２０００、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：５３−６１）およびトキソプラスマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）（Ｖｉｌｌｅｇａｓら、２００２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：９３７−９４３）感染モデルにおいて、ＩＦＮ−γ産生および保護免疫の生成の双方を妨害し、ＩＣＯＳとＣＤ２８共刺激の間の非重複の関係を示唆する。さらに、共刺激の阻害が投与される場合の検査は、ＣＤ２８がプライミングに決定的に重要である一方、ＩＣＯＳはＴ細胞応答を維持することに対してより重要であることを示した（Ｇｏｎｚａｌｏら、２００１、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：５９７−６０４；Ｃｏｙｌｅら、２０００、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：９５−１０５）。ＩＣＯＳ−Ｌ刺激はＣＤ４およびＣＤ８双方のＴ細胞におけるエフェクター機能を促進する（Ｖｉｌｌｅｇａｓら、２００２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：９３７−９４３；Ｍｉｔｔｒｕｃｋｅｒら、２００２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：５８１３−５８１７；Ｗａｌｌｉｎら、２００１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：１３２−１３９）。
ＫＡ２／３２／８６／４−１ＢＢＬ／ＣＤ８３／ＩＣＯＳ−Ｌは、とりわけ、免疫応答の生成においてＣＤ８３とＩＣＯＳ−Ｌのシグナル伝達の間に相乗効果が存在するかどうかの検査を可能にする。
これらのａＡＰＣは、最適なｅｘ ｖｉｖｏ増殖により、ＨＩＶ−１に感染したドナーからのＴ細胞に対して、エフェクター機能が修復され得るかどうかの実験を可能にする。ａＡＰＣの創製の完了に際して、ＨＩＶ感染患者から単離したポリクローナルＣＤ８ Ｔ細胞を増殖させるそれらの能力を評価し、そして、ｅｘ ｖｉｖｏ増殖が、抗原刺激に応答する能力のＨＩＶ特異的Ｔ細胞を変えたかどうか、およびどのように変えたかを決定した。次に、ＨＩＶに感染したおよび感染していない個体から単離したＰｏｌ特異的細胞を使用した類似の分析を実施した。これらの研究は、臨床試験へのａＡＰＣの潜在的な使用を示し、そして、ＨＩＶ感染がＨＩＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の発生にどのように影響を及ぼすかの研究を可能にする。
本実施例に記述される方法は、ＨＩＶに感染したおよび感染していない個体からのＰｏｌ特異的およびポリクローナルのＣＤ８ Ｔ細胞の精製に関する。これらの細胞は、本明細書に開示される方法で使用される原料としてはたらく。
ＨＩＶ−１に感染したＴ細胞の供給源および精製
ＨＬＡ−Ａ２ドナーを、該集団中でのこの対立遺伝子の高頻度のため使用する。最初は、ウイルス表現型をＨＬＡ−Ａ２ドナーの患者選択基準として使用しない。ナイーブなＣＤ８ Ｔ細胞が活性化後にそれらの細胞表面上に少量のＣＤ４を発現して、それらをＨＩＶ感染に感受性にすることが示されている（Ｙａｎｇら、１９９８、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：１１３９−１１４４；Ｋｉｔｃｈｅｎら、１９９８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９０５４−９０６０；Ｆｌａｍａｎｄら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ９５：３１１１−３１１６；Ｉｍａｌｃｈら、２００１、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１１５５５−１１５６４）。しかしながら、ナイーブなＣＤ８ Ｔ細胞のみがこの可塑性を有するようであり、そして使用されたＰｏｌ特異的Ｔ細胞は本質的にメモリーＴ細胞である。従って、いずれかの特定の論理に拘束されることを願わず、これらの細胞は感染せず、そしてｅｘ ｖｉｖｏ増殖に際して感染した状態になることができない。
ＨＬＡ−２ドナーを使用することに加え、ＰＢＭＣを使用し得る。ＰＢＭＣを、ＦＩＴＣ標識したＨＬＡ−Ａ２特異的Ａｂ、ＢＢ７．２（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色する。所望の細胞はＨＬＡ−Ａ２ドナーのアフェレーシスから得ることができる。ＣＤ４ Ｔ細胞数の断面（ｃｒｏｓｓ−ｓｅｃｔｉｏｎ）およびウイルス負荷量をアフェレーシス生成物から得る。アフェレーシス生成物のサンプルを使用してＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ勾配を実施し、そしてＰＢＭＣを５千万／バイアルのアリコートで凍結させる。残存するアフェレーシス生成物を用い、単球を溶出により除去してＰＢＬを創製し、そして、およそ５千万のＣＤ４ Ｔ細胞を陰性選択（Ｍａｕｓら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１４３−１４８）により単離する。ＰＢＬの残りを使用して、精製されたＣＤ８ Ｔ細胞を（陰性選択により）作成し、そして本明細書に記述される方法および実験で使用する。
四量体染色によるＨＩＶ Ｐｏｌ特異的Ｔ細胞のパーセントがおよそ０．７％±１．１であると見出されることが測定された（Ｓｕｎら、２００３、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ２７２：２３−３４；Ｋｏｓｔｅｎｓｅら、２００２、Ｂｌｏｏｄ ９９：２５０５−２５１１；Ｒｉｎａｌｄｏら、２０００、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：４１２７−４１３８）。従って、１億のＣＤ８ Ｔ細胞から約７００，０００のＨＩＶ Ｐｏｌ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞が回収される。ＨＩＶに感染したＴ細胞を生存選別すること（ｌｉｖｅ ｓｏｒｔｉｎｇ）は多数の技術的および安全性の問題を提示する。Ｖａｎｔａｇｅ ＳＥ／ＤｉＶａは、１２色ならびに前方および側方散乱を測定することが可能なフル装備のソーターである。Ｖａｎｔａｇｅ ＳＥ／ＤｉＶａは、それが感染性物質を一度に４集団に安全に選別することを可能にする高められた安全性機能（Ｐｅｒｆｅｔｔｏら、２００３、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ５２Ａ：１２２−１３０）を供給されている。
非ＨＩＶ感染宿主からのＰｏｌ特異的Ｔ細胞の供給源および精製
７例のＨＬＡ−Ａ２乳癌患者を、ＰｏｌペプチドＩＬＫＥＰＶＨＧＶ（配列番号３）に対し、対照治療群としてｈＴＥＲＴペプチドワクチンに対し、ワクチン接種した（Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ、２００４、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０：８２８−８３９）。ワクチン接種したＨＬＡ−Ａ２乳癌患者からの細胞を使用して、ＨＩＶ陰性宿主からのＰｏｌ特異的細胞を増殖させる。これらの患者からの凍結ＰＭＢＣを使用してＰｏｌ特異的Ｔ細胞を精製する。これらのＰｏｌ特異的Ｔ細胞の頻度は、ＨＩＶに感染したドナーから期待される頻度より低く（およそ０．１％）、従って、より少数（しかしなお十分な数）のこれらの細胞が、実験を開始するために得られる。Ｐｏｌ特異的Ｔ細胞患者は、Ｐｏｌペプチドでワクチン接種していたいずれの患者からも得ることができる。
ｅｘ ｖｉｖｏ増殖の間に、ｐ２４ ＥＬＩＳＡを使用することによりＨＩＶ感染の証拠について培養物をモニターする。ＨＩＶ感染は結果を歪ませるからである。感染が観察される場合は、Ｒ５ウイルスに感染している患者を使用する。Ｒ５ウイルスは、ＣＣＲ５の天然のリガンドＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１およびＭＩＰ−１βの高レベルの分泌、ならびにＣＣＲ５転写物の定常状態のレベルをダウンレギュレートすることにより、ＣＤ３／２８で共刺激したＴ細胞中で複製することが不可能である（Ｒｉｌｅｙら、１９９７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：５５４５−５５５３；Ｃａｒｒｏｌｌら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：２７３−２７６）。従って、ＣＤ２８共刺激は、Ｔ細胞の増殖特性を変えうる抗ウイルス成分の添加を伴わずに、Ｒ５に感染したＴ細胞の長期増殖を可能にする。ウイルスの向性はＬｉｔｔｍａｎらにより開発されたＧＨＯＳＴ細胞アッセイを使用して測定される。
また、本明細書に開示される実験は純粋なＰｏｌ特異的Ｔ細胞を必要としない。四量体被覆した磁性ビーズにより単離したＨＩＶ−１ Ｐｏｌ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞を使用し得る（Ｍａｕｓら、２００３、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０６：１６−２２）。この方法はＰｏｌ特異的Ｔ細胞の十分な濃縮を提供し得、また、Ｐｏｌ特異的細胞を単離するのに使用し得る。
ｅｘ ｖｉｖｏで増殖させたポリクローナルＣＤ８ Ｔ細胞の特徴付け
ＨＩＶ感染患者からの大量のＴ細胞を増殖させる能力を、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞を増殖させるこれらのａＡＰＣの能力を特徴付けする前に検査する。これは、特定の１Ｔ細胞サブセットが１種のａＡＰＣにより他者を上回って優先的に増殖されるかどうかを決定するための増殖率の測定を見込む。加えて、ＩＦＮ−γ分泌およびパーフォリン発現と結合された四量体染色の分析を使用して、特定の１ａＡＰＣが、ｆｌｕ、ＣＭＶ、ＥＢＶ若しくはＨＩＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞を優先的に増殖しかつ／若しくはそれらに向上されたエフェクター機能を与えるかどうかを決定する。
ＨＩＶ特異的Ｔ細胞が増殖およびエフェクター機能の誘導に対する独特の共刺激リガンドの要件を有するかどうかを決定するための、ＨＩＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞を分離して増殖させるものとのこれらの研究の比較。以下の属性を測定する：
Ｔ細胞増殖
治療レベルのＨＩＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞を生成させるため、Ｔ細胞を約１０，０００と約１，０００，０００倍の間（約１３〜２０回の集団倍加）まで増殖させる（Ｒｉｄｄｅｌｌら、１９９５、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：５４５−５８６）。ＨＩＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞がｅｘ ｖｉｖｏ培養物中で過ごす時間の量と、これらの細胞がＨＩＶ感染患者に提供する潜在的な臨床上の利益の間に逆相関が存在する。従って、ＨＩＶ感染患者からのＣＤ８ Ｔ細胞を最も迅速に増殖させるａＡＰＣを決定し、そして本明細書に開示される方法で使用する。
Ｔ細胞の生存および複製能力
ｅｘ ｖｉｖｏ増殖後のＴ細胞の健康状態は、ｉｎ ｖｉｖｏで機能するそれらの能力の優れた予測因子である。これらのａＡＰＣの重要な細胞生存遺伝子Ｂｃｌ−ｘＬを誘導する能力もまた測定する。増殖過程の間の培養物中のアポトーシス細胞の比率を使用して、細胞に基づくａＡＰＣのいずれかが増殖されたＴ細胞に特定の生存の利点を与えるかどうかを決定する。加えて、ｅｘ ｖｉｖｏ増殖後の細胞のテロメア長を測定して、特定の１ａＡＰＣが、それが増殖させる細胞の複製能力の保存においてより効果的であるかどうかを決定する。各染色体の端に、テロメアと呼ばれる多数のＴＴＡＧＧＧヌクレオチド反復配列が存在する。細胞が分割する度ごとにそれは損失そのテロメアの一部分。大部分の細胞は、染色体の端の該ＤＮＡ反復配列のコピーを修復し得る酵素テロメラーゼを発現しないため、細胞がその遠隔測定（ｔｅｌｅｍｅｔｒｉｃ）長さの決定的な量を一旦喪失してしまえばそれは分割するその能力を喪失すると考えられている。テロメア長は、細胞が何回複製したかを計るため、および推論によりその将来の複製能力を評価するための一方法として、当該技術分野で使用されている（Ｐａｌｍｅｒら、１９９７、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１３８１−１３８６；Ｗｅｎｇら、１９９７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３２１５−３２２０）。しかしながら、Ｔリンパ球はテロメラーゼ活性を誘導し得る数種の細胞型の１つであり（Ｗｅｎｇら、１９９６、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：２４７１−２４７９）、そして従って異なる方法を使用して増殖させたＴ細胞間の相対的差違は、Ｔ細胞の有糸分裂事象の回数ならびにテロメラーゼが誘導された程度の双方を反映する。最も高い複製能力を有する細胞を注入することは、養子移入したＨＩＶ特異的Ｔ細胞がＨＩＶ感染を長期間制御することを確実にするために最も重要である。
サイトカイン産生
サイトカインは重要なエフェクター分子であり、そしてＴ細胞分化への洞察を提供する。ＨＩＶに感染した個体由来のＣＤ８ Ｔ細胞からの以下のサイトカインすなわちＩＬ−２（ｅｘ ｖｉｖｏ増殖のための重要なＴ細胞増殖因子であり、そして、ＩＬ−２を誘導する細胞の能力はその長期増殖能力と良好に相関する）；ＩＬ−４（ＴＨ２分化のマーカー）；およびＩＬ−１０（制御性Ｔ細胞の増殖の代理となりうる免疫抑制性サイトカイン）を誘導するａＡＰＣのそれぞれの能力を定量する。ＨＩＶ感染患者には、低レベルのＩＬ−１０を産生するようにＴ細胞を誘導するａＡＰＣが好ましい。他のサイトカインは、限定されるものでないがＴＧＦ−β（ＩＬ−１０と同一の論理的根拠のため）；ＩＦＮ−γ（ＴＨ１分化のマーカーかつ重要なエフェクターサイトカイン）；およびＴＮＦα（重要なエフェクターサイトカイン）を挙げることができる。
四量体およびエフェクターの機能分析
Ｉｍｍｕｎｏｍｉｃｓにより開発された四量体／細胞内ＩＦＮ−γおよびパーフォリン染色アッセイ（製造元の説明書による）は、表現型分析と結合された抗原特異的Ｔ細胞の検出および機能アッセイ双方を可能にする。この流れに基づく（ｆｌｏｗ ｂａｓｅｄ）方法は、現在利用可能な抗原特異的Ｔ細胞機能の最も正確なアッセイである。このアッセイを使用して、ｅｘ ｖｉｖｏ増殖がＨＩＶ特異的Ｔ細胞の総数および機能にどのように影響を及ぼすかを決定する。
Ｔ細胞増殖
これらのａＡＰＣが大量のＨＩＶ−１に感染したＴ細胞をどのように増殖するかを評価するため、各ａＡＰＣに照射し、抗ＣＤ３ Ａｂで被覆し、そしてＨＩＶ−１感染患者からの精製したＣＤ８ Ｔ細胞と１：２のａＡＰＣ対Ｔ細胞比で混合した。細胞増殖の初期速度を比較するため、細胞を３Ｈチミジン取り込みよりはむしろＣＦＳＥ染色にかけて、各ａＡＰＣが全Ｔ細胞の増殖をどのくらい良好に誘導したかを決定した。ＣＦＳＥ染色ははるかにより定量的な終点を提供しかつ増殖させた細胞の同時の表現型分類を可能にするからである。ＨＩＶに感染した個体からのおよそ２千万の精製したＣＤ８ Ｔ細胞を３μＭのＣＦＳＥと８分間混合し、徹底的に洗浄して未結合のＣＦＳＥを除去し、そしてａＡＰＣで刺激する。刺激後毎日、細胞のアリコートを各培養物から取り出し、そしてフローサイトメトリーにより分析する。ＣＦＳＥ染色は細胞を高度に蛍光性にする。細胞分裂に際して蛍光は半分になり、そして従って細胞が多く分裂するほどそれはより少なく蛍光性になる。Ｔ細胞増殖を誘導する各ａＡＰＣの能力を、１回、２回、３回、など分裂した細胞の数を測定することにより定量する。特定の時間点で最も多数の細胞分裂を誘導するａＡＰＣは、ＨＩＶに感染した個体からのＣＤ８ Ｔ細胞の最も強力な増殖体（ｅｘｐａｎｄｅｒ）と考えられる（Ｗｅｌｌｓら、１９９７、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：３１７３−３１８３）。
しかしながら、ＣＦＳＥ染色は制限された数のＴ細胞分裂（およそ７回）しか検出し得ず、そして、免疫療法のために治療的量のＴ細胞を生成させるためには、１３〜２０回の集団倍加が必要でありうる。従って、これらのａＡＰＣがＴ細胞の長期増殖をどのくらい良好に促進するかを決定するために、細胞増殖曲線を作成する。これらの実験は、本明細書に別の場所に記述されるところのＣＦＳＥ実験と同じくらい正確に設定されているが、しかしＣＦＳＥは使用しない。培養２〜３日ごとに、Ｔ細胞をそれぞれの培養物から取り出し、そしてどのくらい多くの細胞が存在するかおよび細胞の平均体積を測定するコールターカウンターを使用してカウントする。平均細胞体積は細胞を再刺激すべき時期の最良の予測因子である。一般に、Ｔ細胞が適正に刺激される場合、それらはそれらの細胞体積を三倍にする。この体積が最初の芽細胞の約半分以上まで低下される場合、Ｔ細胞を再刺激して対数線形増殖を維持することが必要でありうる（Ｌｅｖｉｎｅら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：１９３９−１９４３；Ｌｅｖｉｎｅら、１９９７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：５９２１−５９３０）。それが各ａＡＰＣを２０回の集団倍加を誘導するのにかかる時間を計算する。このレベルのＴ細胞増殖を誘導するための各ａＡＰＣの相対的差違は、特定の一ａＡＰＣを使用して臨床試験を前進させる重要な基準である。
各ａＡＰＣにより増殖させた細胞の表現型を特徴付けして、特定の１サブセットが優先的に増殖されるかどうかを決定する。各再刺激前に、増殖するＴ細胞集団の表現型分析を実施して、Ａｐｐａｙら（２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．８、３７９−３８５）により提案されたＣＤ２７およびＣＤ２８の定義、ならびにＳａｌｌｕｓｔｏら（１９９９、Ｎａｔｕｒｅ ４０１：７０８−７１２）により提案されたＣＣＲ７の定義を使用して、増殖されたＴ細胞の分化状態を定義する。パーフォリンおよびグランザイムＢ細胞内染色を使用して、細胞溶解能力を推定するための全体的測定を実施する。
アポトーシス率およびテロメア長
アネキシンＶ／Ｔｏ−Ｐｒｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）染色を各再刺激前に実施して、増殖速度の差違がアポトーシスを受けている細胞の数の差違を反映するかどうか決定する。このアッセイの実験の詳細はＭａｕｓら（２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１４３−１４８）に詳細に記述されている。最少量のアポトーシスに至る培養条件が望ましい。
テロメア長は、当該技術分野で既知の多様な確立した技術を使用して測定されるが、しかし、好ましい一方法はｆｌｏｗ ＦＩＳＨ法を使用することである。それははるかにより少ない細胞を使用して比較的迅速に実施し得、そして定量するのがより容易であるからである。この方法において、およそ百万のＴ細胞（とは言えはるかにより少ないものが必要とされる）を熱および７５％ホルムアミドを使用して変性させ、そしてその後、ＦＩＴＣ複合ＤＮＡプローブを用いてＴＴＡＧＧＧ配列にハイブリダイズさせる。未結合のプローブを洗い流し、そしてＤＮＡをＬＤＳ ７５１で対染色する。それぞれ既知の量の可溶性蛍光色素（ＭＥＳＦ）の分子同等物を有するＦＩＴＣ標識ビーズの４集団の混合物を各実験で分析して、較正曲線の創製および長時間の各培養物の相対テロメア長の測定を見込む（Ｂａｅｒｌｏｃｈｅｒら、２００２、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ４７：８９−９９）。相対テロメア長を各再刺激前に測定し、そしてａＡＰＣのいずれかが、有意により長いテロメアを有するＴ細胞を増殖させるかどうかについて記録する。
サイトカインおよびＢｃｌ−ｘＬ発現
サイトカイン産生およびＢｃｌ−ｘＬ発現レベルを検討するため、およそ百万の細胞から各刺激２４時間後にＲＮＡを単離し、そして限定されるものでないがＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＢｃｌ−ｘＬの相対的発現を検査するため定量的ＲＴ−ＰＣＲにかける。これらの確立したアッセイの実験の詳細はＭａｕｓら（２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１４３−１４８）、Ｔｈｏｍａｓら（２００２、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０５：２５９−２７２）およびＰａｒｒｙら（２００３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：１６６−１７４）に見出し得る。ＴＧＦ−α ｍＲＮＡレベルと分泌されたサイトカインの間の多くの矛盾が示され（Ａｓｓｏｉａｎら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：６０２０−６０２４）、従ってＴＧＦ−α産生はＥＬＩＳＡにより測定する。
四量体およびＥＬＩＳＰＯＴ分析
共通のリコール抗原およびＨＩＶを認識する増殖されたＣＤ８ Ｔ細胞の能力を比較する。増殖前に、精製したＣＤ８ Ｔ細胞を、以下、とりわけＨＬＡ−Ａ２四量体ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ（配列番号４）（ＥＢＶ ＢＭＬＦ）、ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号５）（ＣＭＶ ｐ６５）、ＳＬＹＮＴＶＡＴＬ（配列番号６）（ＨＩＶ ｇａｇ ｐ１７）、ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ（配列番号３）（ＨＩＶ ＲＴ ｐｏｌ）、ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列番号１）（Ｆｌｕマトリックス）およびＬＬＦＧＹＰＶＹＶ（配列番号７）（ＨＴＬＶ Ｔａｘ）を使用して染色し、そしてこれらの四量体の頻度をｅｘ ｖｉｖｏ増殖前に測定する。次に、ＨＩＶに感染したドナーからの大量のＣＤ８ Ｔ細胞を、本明細書に開示されるａＡＰＣを使用して刺激し、そして、本明細書に記述される方法を使用して該細胞を増殖させる。各再刺激前に、増殖させたＴ細胞を四量体染色にかけて、ＥＢＶ、ＣＭＶおよびＨＩＶ特異的Ｔ細胞の相対頻度が特定の一ａＡＰＣによる刺激により変えられたかどうか決定する。
抗原認識後のＩＦＮ−γを分泌する細胞の頻度および高レベルのパーフォリンを発現する細胞の頻度を決定することが重要である。細胞内サイトカインアッセイを四量体染色と組合せて抗原特異的細胞を使用する流れに基づく機能アッセイを実施する、Ｉｍｍｕｎｏｍｉｃｓにより開発された四量体／細胞内ＩＦＮ−γ染色アッセイを使用し得る。該アッセイはパーフォリン発現についての細胞内染色の組込みを包含し得る。各患者から単離したＰＢＭＣを凍結する前に、本明細書の別の場所に列挙されるペプチドのそれぞれを使用する四量体／細胞内ＩＦＮ−γおよびパーフォリン染色アッセイを使用して、初期の四量体陽性／ＩＦＮ−γ分泌／パーフォリン産生集団を決定する。対応する四量体を伴う各ペプチドについて、およそ百万のＰＢＭＣを、以下の実験条件および対照、すなわち１）ペプチドで刺激していない対照、２）ペプチド刺激を伴わない対照四量体染色、ならびに３）四量体およびペプチドのチューブについて３本のチューブに入れる。次に、適切な四量体を各チューブに添加し、そして室温で３０分間インキュベートする。２マイクログラムのペプチドを第三のチューブに添加し、そしてサンプルを３７℃で１時間インキュベートする。ブレフェルジンＡを全３本のチューブに添加し、そしてチューブを別の４時間インキュベートする。四量体の全部はＰ５−Ｃｙ５．５およびＡＰＣ−Ｃｙ７で標識されるため、ＰｅｒＣＰ、ならびにＡＰＣ標識ＣＤ２７およびＣＤ２８ Ａｂを使用して、ウイルス特異的Ｔ細胞の分化状態を決定し得る。細胞を溶解し、固定し、かつ浸透化し、そして当該技術分野で既知の方法および本明細書に開示される方法を使用してＩＦＮ−γ ＦＩＴＣ標識プロトコルを実施する。ＩＦＮ−γ発現およびパーフォリン発現の同時測定を可能にする、ＰＥ標識抗パーフォリンＡｂをＩＦＮ−γ Ａｂとともにインキュベートすることによりパーフォリン発現の測定に成功している。ＩＦＮ−γを分泌するＨＩＶ特異的Ｔ細胞と死滅させる能力を有するものとの間の報告された矛盾（Ｚｈａｎｇら、２００３、Ｂｌｏｏｄ １０１：２２６−２３５）を考えれば、この分析を使用して、多様な細胞に基づくａＡＰＣを用いるｅｘ ｖｉｖｏ増殖がこれらの機能的属性のいずれかをどのように変えるかが決定される。細胞をＰＦＡに固定しかつフローサイトメトリーにより分析する。この分析は、ＩＦＮ−γ パーフォリン発現細胞の基礎の表現型を確立する。四量体陽性細胞、またはＩＦＮ−γを分泌するか若しくは高レベルのパーフォリンを発現する細胞の表現型がｅｘ ｖｉｖｏ増殖後に変えられるかどうかを決定するため、示差的に増殖させたＣＤ８ Ｔ細胞を使用して四量体／細胞内ＩＦＮ−γ染色アッセイを実施する。これを行うために、自己ＰＢＭＣを使用し、そして存在するＣＤ８ Ｔ細胞の割合を測定し、そしてＣＤ８ Ｔ細胞を磁性ビーズ枯渇により取り出す。枯渇させたＣＤ８ Ｔ細胞を、本明細書の別の場所に記述されるＫ５６２に基づくａＡＰＣにより増殖させたものを用いて再構成し、そして本明細書の別の場所に記述されるところの四量体／細胞内ＩＦＮ−γ染色アッセイにかける。これらの実験は、どのａＡＰＣがｅｘ ｖｉｖｏ増殖の間にＨＩＶ特異的Ｔ細胞の機能的表現型を変えることが可能であったかに関する指標を提供する。
本明細書に開示されるデータは、細胞に基づくａＡＰＣにより増殖させた、ＨＩＶに感染した個体から単離したＣＤ８ Ｔ細胞の表現型を示す。いずれかの特定の論理に拘束されることを願わない一方で、それは、ａＡＰＣのあるサブセットが向上されたエフェクター機能をもつＨＩＶ特異的Ｔ細胞を増殖させ得ることを予測した。この結果は、これらのエフェクター機能がｅｘ ｖｉｖｏ増殖により（欠落）され得ることを確認するとみられる。排除の過程により、どのシグナルがこの形質転換に必要であるかが、本明細書に記述される方法に従って決定される。この知見は、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞を分離して増殖させることにより確認され、そして、ａＡＰＣ ａ ＧＭＰ試薬を作成しかつ改良されたｅｘ ｖｉｖｏで増殖させたＣＤ８ Ｔエフェクター細胞が患者でのＨＩＶ感染を制御するのを助け得るかどうかを知るためのフェーズＩ臨床試験を実施するための理論的根拠を提供する。加えて、この結果は、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞の欠点（１個若しくは複数）を媒介する機構、および特定の１共刺激リガンドがどのようにこの欠点を克服若しくは逆転し得るかを研究するための実験系を確立する。
ｅｘ ｖｉｖｏで増殖させたＰｏｌ特異的Ｔ細胞の特徴付け
本明細書に開示される方法は、ポリクローナルＴ細胞増殖の環境内でこれらの細胞の増殖および機能を検査することにより、ＨＩＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖においてどのａＡＰＣが最良であるかへの重要な洞察を提供する。しかしながら、恒常性の機構がＣＤ４ Ｔ細胞の喪失について補正しかつＨＩＶ非特異的ＣＤ８ Ｔ細胞に全体的な異常がないように思われる際に、全ＣＤ８ Ｔ細胞の数が大部分のＨＩＶ感染患者で増大しているため、ＨＩＶに感染した個体からのｅｘ ｖｉｖｏで増殖させたポリクローナルＴ細胞の翻訳値は低い（Ｇａｎｄｈｉら、２００２、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５３：１４９−１７２）。従って、自己養子移入によりＨＩＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答を向上させるため、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞のみを増殖させかつ長期間ＨＩＶ感染を除外し得るエフェクター機能をそれらに与える系が望ましい。
細胞に基づくａＡＰＣのそれぞれを使用して四量体単離されたＰｏｌ特異的Ｔ細胞を増殖させ、そしてどれが最高の複製および生存能力を伴いＨＩＶ感染細胞を最良に死滅させ得るＰｏｌ特異的Ｔ細胞を生成させるかを決定することが望ましい。これらの研究は、ＨＩＶに感染した個体から単離したＰｏｌ特異的細胞を、Ｐｏｌ特異的ペプチドでワクチン接種した癌患者から単離したＰｏｌ特異的Ｔ細胞とともに使用して実施する。この比較は、ＨＩＶが該世代の抗原特異的細胞に対し有する影響に関する独特な洞察を提供する。同一の試薬およびアッセイを使用して、これら２種の疾患型から単離したこれらのＰｏｌ特異的Ｔ細胞を研究し得るからである。これらの研究は、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞の欠点の性質への洞察を提供しかつこれらの欠点を克服する方法に関する新たな仮説を導きうる。
Ｔ細胞の増殖および表現型
平均して７００，０００のＰｏｌ特異的Ｔ細胞をＨＬＡ−Ａ２陽性のＨＩＶに感染した個体から、また、およそ１００，０００のＰｏｌ特異的Ｔ細胞をワクチン接種した癌患者から単離する。抗原特異的増殖は約１，５００のＴ細胞を使用して達成し得る（図３）。培養条件を同等にするため、培養は、９６ウェルプレート中合計１００μｌの培地中で、７，５００のＰｏｌ特異的Ｔ細胞および１５，０００の本明細書の別の場所に記述されるａＡＰＣを０．５ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３ Ａｂと混合することにより開始する（Ｔ細胞対ＡＰＣ比を逆転させることが非常に少ない細胞を増殖させる場合に重要であることが観察されている）。これらの細胞を刺激する抗ＣＤ３およびＫ５６２にプロセシングかつ提示される抗原の能力を比較するため、そのａＡＰＣもまたＰｏｌ−ＧＦＰ発現ベクターで形質導入した理想的な一組の培養物を増殖させる。従って、各ドナーの細胞について１０個の培養物が利用可能である。新たに照射したａＡＰＣを、２Ｔ細胞ごとに対し推定される１ａＡＰＣの比で、増殖するポリクローナルＴ細胞に１０〜１２日ごとに添加する。存在する細胞の数の正確な量がコールターカウンターを使用して計算され得る点まで該集団が一旦増殖したら、各集団の増殖速度を追跡する。Ｔ細胞増殖の前および後にＨＩＶおよび癌患者から単離したＰｏｌ特異的Ｔ細胞のＣＤ２８／ＣＤ２７表現型を比較する。
サイトカイン産生、Ｂｃｌ−ｘＬ発現、アポトーシス率およびテロメア長の評価
これらの研究は、存在する数百万の細胞を使用すること（およそ３０日）から分析が構成されることを除き、本明細書の別の場所に開示される方法を使用して実施する。にもかかわらず、これらの研究は、ポリクローナルＴ細胞を使用して本明細書の別の場所に開示される結果を確認するはずである。
ＨＩＶに感染した標的の死滅
抗原特異的Ｔ細胞を分離して増殖させることの一利点は、複数の死滅および他の機能アッセイを非常に定量的様式で実施し得ることである。第一の試験は四量体／細胞内ＩＦＮ−γおよびパーフォリン発現アッセイである。本明細書の別の場所に開示されるとおり、ｅｘ ｖｉｖｏで増殖させたＣＤ８ Ｔ細胞を、自己ＣＤ８を枯渇したＰＢＭＣと混合する。ＣＤ８ Ｔ細胞の大部分は四量体陽性であるため、Ｐｏｌペプチドとの接触に際して最高レベルのＩＦＮ−γおよびパーフォリンを産生するＴ細胞をどのａＡＰＣが生じさせるかに関する定量的データが得られる。加えて、四量体細胞の数は制限しないため、ＣＣＲ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ ＲＯ、ＣＤ４５ ＲＡおよびＣＤ５７を使用するこれらの細胞の完全な表現型分析（Ｂｒｅｎｃｈｌｅｙら、２００３、Ｂｌｏｏｄ １０１：２７１１−２７２０）を実施し、それによりエフェクター機能（１種若しくは複数）をＴ細胞表現型と相互に関連づける。
５１Ｃｒ放出アッセイを介して、Ｐｏｌペプチドを負荷したＴ２細胞を死滅させる示差的に増殖させたＰｏｌ特異的Ｔ細胞の能力を評価する。このアッセイにおいて、Ｔ２細胞に、５１Ｃｒの取り込み前にＰｏｌペプチドＩＬＫＥＰＶＨＧＶを負荷する。徹底的に洗浄した後、標識したＴ２細胞を抗原特異的Ｔ細胞とともに１：３０、１：１０、１：３および１：１ならびに１：３の比で４時間インキュベートする。抗原特異的Ｔ細胞がＴ２細胞上に提示されるペプチドを認識しかつこれらの細胞を死滅させる能力を有する場合には、５１Ｃｒが放出されかつ検出され得る。いかなるペプチド対照および洗剤溶解対照も特異的溶解の測定を可能にしない。高度の特異的溶解が観察される最低の標的対エフェクター比は、最高の死滅能力をもつＴ細胞をどのａＡＰＣが増殖させるかを示す。
ｅｘ ｖｉｖｏで増殖させたＰｏｌ特異的Ｔ細胞のＴ２細胞を死滅させる能力を、Ｐｏｌを発現するＣＤ４ Ｔ細胞を死滅させるこれらの細胞の能力と比較する。このシナリオは、ｅｘ ｖｉｖｏで増殖させたＣＤ８ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ標的をより緊密に模倣する。ＨＩＶに感染したＣＤ４ Ｔ細胞を死滅させるこれらの細胞の能力は原理の最終的な証明である。さらに、このレベルで感染している細胞が５１Ｃｒ放出アッセイにおいて非常に高いバックグラウンドを生成させて、増殖されたＣＤ８ Ｔ細胞の有効性を決定することを困難にするとみられることがありそうである。一代替として、自己ＣＤ４ Ｔ細胞を、ＧＦＰ発現によるＰｏｌ発現細胞の追跡を可能にするＰｏｌ ＩＲＥＳ ＧＦＰ発現レンチウイルスベクターで形質導入する。５１Ｃｒ放出アッセイの十分な標的を生じさせるこれらのベクターにより形質導入されたＴ細胞のそのおよそ５０％が観察された（Ｔ細胞をレンチウイルスベクターでどのように形質導入するかの詳細については、Ｐａｒｒｙら、２００３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：１６６−１７４を参照されたい）。Ｐｏｌで形質導入されたならびに形質導入されないＣＤ４ Ｔ細胞を５１Ｃｒで標識する。ＣＤ４ Ｔ細胞ならびにＴ２細胞は５１Ｃｒを取り込まず、従って該標的は１：１００、１：３０、１：１０および１：３のエフェクター比に移動してアッセイの感度を向上させる。Ｐｏｌを発現するＣＤ４ Ｔ細胞を死滅させるそれらの能力の増殖されないおよび増殖されたＣＤ８ Ｔ細胞の間の差違は、別のものを上回る１種のａＡＰＣをさらに開発するための強い理論的根拠を提供する。
ＣＤ８ Ｔ細胞の長期のｅｘ ｖｉｖｏ増殖にＣＤ２８発現が必要とされる。レトロウイルス形質導入によるＣＤ２８発現の復帰が、ＣＤ４ Ｔ細胞の存在を伴わずにＩＬ−２を産生しかつ増殖させるＣＤ２８陰性細胞の能力を復帰させることが最近観察された（Ｔｏｐｐら、２００３、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９８：９４７−９５５）。最近、ＩＬ−１２が、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞にＣＤ２８発現を復帰することが示された（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎら、２００３、Ｂｌｏｏｄ １０１：３５４３−３５４９）。ＩＬ−１２がＰｏｌ特異的Ｔ細胞のＣＤ２８発現を高め得かつ長期増殖能力を向上させ得るかどうかを決定するため、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２を多様なａＡＰＣ／Ｐｏｌ特異的培養物に添加し、そして、該細胞を、Ｐｏｌ特異的細胞においてＣＤ２８発現がどのくらい良好に向上されるか、また、ａＡＰＣのいずれかが長期培養物中でＰｏｌ特異的細胞を増殖させ得るかどうかについて評価する。ＩＬ−２１およびＩＬ−１５のような他のサイトカインが、ＩＬ−１２と協力して作用してＨＩＶ特異的Ｔ細胞増殖を誘導しうる。ＩＬ−２１は、ＴおよびＢ細胞増殖ならびにナチュラルキラー（ＮＫ）細胞分化を誘導する多機能サイトカインである（Ｐａｒｒｉｃｈ−Ｎｏｖａｋら、２００２、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．７２：８５６−８６３）。ＩＬ−２１は、活性化されたＣＤ４ Ｔ細胞により独占的に産生され、そしてＩＬ−２およびＩＬ−１５と相乗作用を与えてＣＤ８ Ｔ細胞増殖を促進する。同様に、ＩＬ−１５は重要なＣＤ８ Ｔ細胞生存因子であり、そして、活性化されたマクロファージおよびＤＣ（その添加もまたＣＤ８ Ｔ細胞増殖を高めうる）により産生される（Ｗａｌｄｍａｎｎら、２００１、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １４：１０５−１１０）。
サイトカインがＨＩＶ特異的Ｔ細胞の長期増殖を可能にすることに失敗する場合は、ＣＤ２８を発現するレンチウイルスでＰｏｌ特異的Ｔ細胞を形質導入する。Ｐａｒｒｙら、２００３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：１６６−１７４に概説されるとおり、Ｔ細胞の９０％以上を単一の導入遺伝子ベクターで形質導入し得る（本明細書に開示されるところのＩＲＥＳ含有ベクターはより少なく効率的である）。従って、ＣＤ２８の形質導入がＰｏｌ特異的Ｔ細胞に長期増殖を復帰するかどうかを試験するため、Ｐｏｌ特異的Ｔ細胞を、これらの細胞をａＡＰＣと混合する直前にＣＤ２８を発現するレンチウイルスベクターにスピン感染させる（Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙら、２０００、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１００７４−１００８０）。これらのａＡＰＣにより誘導されるＴ細胞活性化はこのベクターの組込みを助長し、そして、導入遺伝子の発現は形質導入１２時間後に観察され得る。これらの細胞、および回収されるＰｏｌ特異的Ｔ細胞を、本明細書の別の場所に開示されるとおり培養する。これは、ＣＤ２８共刺激がこれらの細胞の長期増殖に必要とされることの指標である。ＨＩＶ特異的Ｔ細胞を増殖させるための必要な一段階としてレンチウイルス形質導入を使用する場合、それはこれらの結果の解釈の影響を遅らせうる。しかしながら、ＨＩＶに感染した個体からのＴ細胞のレンチウイルス形質導入が実現可能な治療オプションでありうることが最近示された。
広範な特異性をもつＨＩＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖
Ｎｅｆエピトープを認識した単一のＣＤ８クローンの注入は、このエピトープを発現しなかったウイルスの選択につながり（Ｋｏｅｎｉｇら、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１：３３０−３３６）、ＨＩＶエスケープミュータントを予防するために複数の特異性をもつＴ細胞が必要とされることを示す。ある患者からの特定の１ウイルスの複数のエピトープを認識するＴ細胞を生成させる潜在的に強力な一方法は、細胞に基づくａＡＰＣ取り込みを有し、そして天然のＡＰＣの抗原に類似の抗原を提示させることである。ＭＨＣを発現するＫ５６２に基づくａＡＰＣに、患者の化学的に不活性化されたウイルスを負荷すること、および自己Ｔ細胞に混合することにより、患者特異的抗ＨＩＶ Ｔ細胞を増殖させ得る。ＨＩＶ特異的Ｔ細胞がＨＩＶ特異的抗原に遭遇するこの最適な状況を提供することにより、免疫優性および潜在（ｃｒｙｐｔｉｃ）双方の抗原を認識するＴ細胞を増殖させ得、従ってＨＩＶ感染を制御するためのより大きな潜在能力をもたらす。さらに、共有されるＨＬＡクラスＩ対立遺伝子をもつ、感染していない健康な人からのＴ細胞を、レシピエントの化学的に不活性化したウイルスでｅｘ ｖｉｖｏでワクチン接種し得、増殖させ得、そしてＨＩＶ感染患者に注入し得る。これは、進行した疾患を伴いかつ制限されたＴ細胞レパートリーをもつ個体にとって強力な潜在的処置の一選択肢を表す。
最近、Ｌｕら（２００３、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．９：２７−３２）は、化学的に不活性化した形態のＳＩＶを負荷したＤＣを注入したサルが有意により低いウイルスＲＮＡおよびＤＮＡレベルを有したことを示し、この免疫療法のアプローチを使用して開始されるＴ細胞応答がＳＩＶ感染を制御し得ることを示唆する。これらのデータは、適正にプライミングされたＴ細胞がＳＩＶ感染を制御し得かつヒトにおける細胞に基づくＨＩＶワクチンの期待を強める（Ｂｈａｒｄｗａｊら、２００３、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．９：１３−１４）ことを示唆する。不活性化したウイルスを使用して、本明細書の別の場所に記述される化学的に不活性化したＳＩＶ研究に同様に、ＭＨＣを発現するＫ５６２に基づくａＡＰＣに負荷する。該複合体を使用して、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖させて、患者特異的Ｔ細胞治療ワクチンを創製する。該複合体はまた、ｉｎ ｖｉｖｏのアプローチを使用して患者にも投与し得る。
ＣＤ１０７ａおよび１０７ｂは、Ｔ細胞表面上で通常は見出されないリソソーム関連タンパク質である。ＴＣＲのトリガーに際して、ＣＤ８ Ｔ細胞の脱顆粒が迅速に発生し、そしてＣＤ１０７および他のリソソームタンパク質が細胞膜に輸送されて、パーフォリンおよびグランザイムの放出を助長する。Ｂｅｔｔｓら（２００３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８１：６５−７８）は、ＣＤ１０７発現が、刺激後４時間の最大発現を伴い、刺激後約３０分に抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞上で検出され得ることを示した。従って、抗原特異的エフェクターが所望のＴ細胞を死滅させずに同定され得、それによりどの抗原が細胞を活性化するかを同定する。ＨＩＶ特異的Ｔ細胞を同定しかつ増殖させるための類似の研究が本明細書に開示されるとおり実施される。
図４は、いずれかの特定の論理により拘束されることを願わずに、広範な特異性をもつＨＩＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞を増殖させるための実験的アプローチを具体的に説明する。保存Ｔ細胞、および最近完了した養子移入臨床試験からの高力価の自己ウイルス単離物が利用可能であり（Ｌｅｖｉｎｅら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．８：４７−５３）、そして本明細書に開示される方法で使用される。患者のウイルス単離物を、該ウイルスの融合能力を保存するために２５０μＭのアルドリチオール−２（ＡＴ−２）を使用して不活性化する（Ｌｕら、２００１、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：８９４９−８９５６）。ＨＩＶを不活性化するＡＴ−２の能力は、ＰＨＡ芽細胞をこの処理したウイルスに感染させること、およびｐ２４産生を２週間にわたり測定することにより検証する。ＨＩＶ融合を可能にするために、Ｐｏｌ特異的Ｔ細胞の増殖を最良に可能にした細胞に基づくａＡＰＣを、既に利用可能である（Ｓｉｍｍｏｎｓら、２００３、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３０５：１１５−１２３）ＣＤ４およびＣＣＲ５レンチウイルス発現ベクターで形質導入する。Ｋ５６２細胞はＣＸＣＲ４を天然に発現する（Ｇｕｐｔａら、１９９９、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６６：１３５−１４３）。これらのａＡＰＣを、不活性化したウイルス（５０ｎｇのｐ２４／百万の細胞に基づくａＡＰＣ）で３７℃で２時間パルスする（Ｌｕら、２００１、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：８９４９−８９５６）。患者からの５千万のＣＤ８ Ｔ細胞を、抗原を負荷したａＡＰＣと二重で混合する。一方の培養物で、高められたエフェクター機能を与えられた抗原特異的Ｔ細胞の代理物としてのＣＤ１０７の可動化（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）を使用することの利用性を評価する。刺激４時間後に細胞をＣＤ８およびＣＤ１０７について染色し、ＢＬＳ ３ソーターを使用してＣＤ８＋ＣＤ１０７＋細胞を選別し、そして「感染した」ａＡＰＣを使用して分離して増殖させる。他の組の細胞において、ポリクローナル集団からＨＩＶ特異的Ｔ細胞を選択的に増殖させるこれらのａＡＰＣの能力を試験する。化学的に不活性化したＨＩＶに感染させたａＡＰＣを使用して、ＨＩＶに感染した個体からの大量のＣＤ８ Ｔ細胞を１０日ごとに刺激する。対照として、Ｋ５６２抗原を認識する細胞のみを増殖させるはずである、ウイルスでパルスしていないａＡＰＣ細胞、および全部の細胞を増殖させるαＣＤ３被覆したａＡＰＣの双方を使用する。２週間の増殖後に培養物をモニターし、そして細胞を評価して、患者自身のウイルスを参照株のＨＩＶより良好に認識するＨＩＶ特異的Ｔ細胞が濃縮されているかどうかを決定する。ＰＨＡが使用されて刺激し、そして高力価の患者ウイルス（およそ５×１０（欠落）ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）、または類似性高力価Ｂａｌ（Ｒ５患者について）若しくはＮＬ４−３（Ｘ４患者について）いずれかのウイルスで、患者のＣＤ８ Ｔ細胞を枯渇させたＰＢＭＣを３日間重複感染させる。ｅｘ ｖｉｖｏで増殖させた自己ＣＤ４ Ｔ細胞を受領した患者の大部分は検出不可能なウイルス負荷量を有し（Ｌｅｖｉｎｅら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．８：４７−５３）、そして従って、わずか３日後に、複製するウイルスの大多数が重複感染したウイルスを表すことができる。感染したＣＤ８を枯渇させた患者から得たおよそ４００，０００のＰＢＭＣを、患者自身のウイルスに感染させたａＡＰＣから増殖させた１００，０００のＣＤ８ Ｔ細胞と混合する。２４時間後に、ＩＮＦ−λおよびパーフォリンを発現するＣＤ８ Ｔ細胞の割合を細胞内フローサイトメトリーにより測定する。患者自身のウイルスと重複感染させたＰＢＭＣと混合した場合に、Ｂａｌ若しくはＮＬ４−３参照株と重複感染させたものに比較してＩＦＮ−λおよびパーフォリンを発現するより多くのＣＤ８ Ｔ細胞が観察される場合、該患者ウイルスのａＡＰＣ提示はおそらく、該患者のウイルスエピトープを選択的に認識するＴ細胞の増殖を可能にした。このアプローチは、彼若しくは彼女自身のウイルスに対する患者のＨＩＶ応答の幅を増大させる甚だしい潜在能力を有し、そして、潜在的に、天然のＨＩＶ感染の間に十分に提示されない潜在エピトープに対する応答を導き出し得る（Ｓｅｗｅｌｌら、１９９９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：７０７５−７０７９）。さらに、これらの実験は、ＣＤ１０７染色がＨＩＶ特異的Ｔ細胞を同定しかつ増殖させるためのより確実な方法を提供するかどうかの決定を提供する。
高親和性ＣＴＬがより低い抗原レベルを発現するＡＰＣから生成されたことが以前に示された（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ−Ｍｉｌｌｅｒら、１９９６、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：４１０２−４０１７；Ｏｈら、２００３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：２５２３−２５３０）。より低レベルのＭＨＣクラスＩを発現するａＡＰＣが、それらの標的を死滅させるより高い能力を有する高親和性Ｔ細胞の生成においてより効果的であるかどうかを評価する。本明細書の開示に基づき、ＫＡ２細胞を負荷するのに使用したウイルスの量を滴定するか、若しくは、より少量のＨＬＡ−Ａ２を発現するａＡＰＣを使用して、養子移入免疫療法に有用である高親和性Ｔ細胞応答が生成されることを確認する（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ−Ｍｉｌｌｅｒら、１９９６、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：４１０２−４０１７）。
化学的に不活性化したウイルスを負荷したａＡＰＣが患者特異的Ｔ細胞を増殖させるための効果的な方法でない場合は、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞のこの生成方法を、Ｌａｒｓｓｏｎら（２００２、ＡＩＤＳ １６：１３１９−１３２９）により記述される交差プライミング法と比較する。この方法を機能させるため、Ｋ５６２に基づくａＡＰＣは死につつある若しくは死んだＴ細胞から抗原を取り込む能力を有する。Ｔ細胞をＧＦＰ若しくはｆｌｕマトリックス−ＧＦＰ融合ＬＶ構築物のいずれかで形質導入する。これらの細胞を、Ｓｃｈｌｉｅｎｇｅｒら（２００３、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９：１５１７−１５２７）に記述されるところのＵＶＢ放射にかけ、そして最適なＨＬＡ−Ａ２を発現するａＡＰＣと混合する。ａＡＰＣが死んだインフルエンザに感染したＴ細胞を適正に有する場合は、ｆｌｕマトリックス−ＧＦＰ融合タンパク質を発現するアポトーシス性Ｔ細胞とともにインキュベートしたＫＡ２細胞は、本明細書の別の場所に記述されるところのｆｌｕ特異的細胞を増殖させ得るが、しかしＧＦＰだけを発現するＴ細胞とともにインキュベートしたものはしない。ＫＡ２が死んだ細胞からの抗原をプロセシングかつ提示する場合は、患者のＴ細胞は彼／彼女のウイルスに重複感染させ得る。これらの細胞をＵＶＢ放射にかけ、そしてａＡＰＣとともにインキュベートする。アポトーシス性のＨＩＶに感染した細胞を負荷したａＡＰＣの、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞の増殖を促進する能力を、その後、本明細書の別の場所に記述されるとおり評価する。
あるいは、複数の特異性をもつＨＩＶ特異的Ｔ細胞を、ＨＩＶ特異的四量体の一団を使用して増殖させる。このアプローチにおいて、同一の蛍光色素で標識した多数のＨＩＶ特異的四量体を、ＨＩＶに感染したドナーからのＴ細胞と混合し、そしてこれらの種々雑多の四量体を結合するＴ細胞を単一集団に選別する。抗原特異的Ｔ細胞のこの集団を、本明細書の別の場所に記述されるところの最適なａＡＰＣを使用して増殖させ、そしてこの様式で増殖させたＴ細胞の、参照株に対し自己ウイルスを認識しかつそれに応答する能力を、本明細書の別の場所に記述されるとおり評価する。現在、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｎｅｆ中の保存されたエピトープを認識する定義されたＨＬＡ−Ａ２四量体が存在し、そして、ＨＩＶ特異的ペプチドを提示する新たな四量体を創製し得る。このアプローチは制限された数の抗原特異的Ｔ細胞を増殖させる一方、それはウイルスのエスケープを予防するのに十分であるはずである。さらに、本明細書に開示される方法はフェーズＩ臨床試験に迅速に移され得る。
ＣＤ３２若しくはＣＤ６４を含んでなるＫ５６２細胞の製造および評価
Ｋ５６２細胞を、（ｉ）抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体の外因性の負荷を可能にするためのヒトＦｃγ受容体ＣＤ３２、ならびに、細胞の別個の集団を、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８および他の受容体の高親和性負荷を可能にするヒトＦｃγ受容体ＣＤ６４で形質導入した、ならびに（ｉｉ）ヒト４−１ＢＢリガンドで安定にコトランスフェクトした。ＣＤ１３７としてもまた知られる４−１ＢＢは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の生存を促進するＴＮＦ受容体ファミリーの１メンバーである（Ｈｕｒｔａｄｏら、１９９７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：２６００−２６０９；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９９９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：５０３７−５０４０；Ｔｒａｎら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１０００−１００９）。４−１ＢＢ刺激は、優先的に、ＣＤ８ Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化し、ＣＴＬ応答をｉｎ ｖｉｖｏで増幅し、そして活性化されたＣＴＬの生存を向上させる（Ｓｈｕｆｏｒｄら、１９９７、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：４７−５５）。４−１ＢＢはＣＤ８ Ｔ細胞の長期のｅｘ ｖｉｖｏ増殖を促進し得る候補分子である。ＣＤ３／２８ビーズ、若しくは抗ＣＤ３およびＣＤ２８ Ａｂで被覆したＫ３２／４−１ＢＢＬ ａＡＰＣ（Ｋ３２／４−１ＢＢＬ ＣＤ３／２８）いずれかで刺激したＣＤ８ Ｔ細胞の初期増殖速度は同等であった。しかしながら、再刺激に際して、Ｋ３２／４−１ＢＢＬ ＣＤ３／２８ ａＡＰＣで活性化したＣＤ８ Ｔ細胞のみが増殖し続けた。増殖するこの能力は、細胞生存遺伝子Ｂｃｌ−ｘＬおよびサイトカインＩＬ−２のアップレギュレーションと相関した。誘導されているこれらの遺伝子の非存在下で、培養物の大きな割合がアネキシンＶ陽性（アポトーシスの初期の兆候）になった（Ｍａｕｓら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１４３−１４８）。細胞に基づくａＡＰＣとＴ細胞の間の「クロストーク」が観察された（Ｔｈｏｍａｓら、２００２、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０５：２５９−２７２）。
ＣＤ６４でのＫ５６２細胞の形質導入は後に続くとおり達成した。すなわち、Ｋ５６２細胞を、本明細書に記述される方法に従って、ＣＤ６４（配列番号２）を発現するレンチウイルスベクターで形質導入した。高発現体を選別し、そして単一クローンをＣＤ６４発現についてスクリーニングした。１クローンを選択したをさらなる特徴付けであった（図１４）。
ＣＤ６４を発現するＫ５６２細胞（Ｋ６４細胞）の結合能力を、後に続くとおり評価した。百万のＫ６４細胞に、０．５〜５０μｌのＩｇＧ２ａ−ＦＩＴＣ標識した抗体を４℃で１時間負荷し、その後１回洗浄しかつ固定した。既知の抗体濃度（５０μｇ／ｍｌ）、既知のＦＩＴＣ／タンパク質比（３．５）およびＩｍｍｕｎｏ−Ｂｒｉｔｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）ビーズを使用して、Ｋ６４細胞に結合した抗体の量は、各細胞に結合した約２０００と６０００抗体の間になることが計算された（図１５）。
抗体を負荷しかつＴ細胞を刺激するＫ６４細胞の能力を評価するために、Ｋ６４およびＫ３２細胞を１００Ｇｙで照射し、そして、タンパク質を含まないＰＦＨＭ ＩＩ培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）中１０６細胞あたり１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８混合物を負荷しかつ４℃で１時間回転した。細胞をその後、同一のタンパク質を含まない培地で３回洗浄し、同一培地に再懸濁し、そしてＣＤ４ Ｔ細胞に２：１の比で添加した。Ｔ細胞を、１ミリリットルあたり１０６細胞の濃度でＲＰＭＩ＋１０％ＨＳＡＢに再懸濁した。対照としてＫ６４およびＫ３２細胞もまた、慣習的方法（洗浄を伴わず室温で１０分）を使用して負荷し、そしてその後ＣＤ４ Ｔ細胞と混合した。
図１６に具体的に説明されるとおり、Ｋ６４細胞をＫ３２細胞と比較する場合、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体を負荷しかつ過剰の未結合の個体を除去するため３回洗浄したＫ６４細胞は、Ｔ細胞を効率的に刺激することがなお可能である。とりわけ、図１６に描かれるとおり、休止ＣＤ４ Ｔ細胞は約１４０ｆｌの平均細胞体積を有する。細胞のこの集団の消失はＣＤ４ Ｔ細胞が活性化されたことを示す。従って、本発明のａＡＰＣ細胞は、本明細書の別の場所に記述されるとおりｉｎ ｖｉｖｏの応用で使用し得る。それらは、モノクローナル抗体を本発明のｉｎ ｖｉｖｏの応用で使用する場合に、ＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）応答をもたらし得る過剰の抗体の存在を伴わずにＴ細胞の刺激および増殖を開始させることが可能であるからである。
さらに、図１７に示されるとおり、はるかにより少ない抗体がＫ６４細胞に最適に負荷するために必要とされるが、しかし、哺乳動物に投与される場合にＨＡＭＡ反応を予防するためにＫ６４細胞を洗浄することは、Ｔ細胞を刺激するａＡＰＣの能力に対してあるとしても最小限の影響を有する。Ｋ６４細胞を１００Ｇｙで照射し、そして、タンパク質を含まないＰＦＨＭ ＩＩ培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）中二重で１０６細胞あたり１、１／４、１／１６、１／６４若しくは１／２５ｍｇ／ｍｌいずれかの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８混合物を負荷し、そして４℃で１時間回転した。一組の細胞をＰＦＨＭ ＩＩで３回洗浄し、そして同一培地に再懸濁した。他の組の細胞は洗浄しなかった。双方の組のＫ６４細胞を、ＣＦＳＥ標識したＣＤ４ およびＣＤ８ Ｔ細胞に比２：１で添加した。Ｔ細胞を、上述されたとおりＲＰＭＩ＋１０％ＨＳＡＢに再懸濁した（１０６／ｍｌ）。対照として、Ｋ６４およびＫ３２細胞もまた慣習的方法（洗浄を伴わず室温で１０分）を使用して負荷し、そしてその後ＣＤ４ Ｔ細胞と混合した。ＣＦＳＥ希釈をフローサイトメトリーにより測定した。
図１７に具体的に説明されるとおり、過剰の抗体を除去するための３回の洗浄は、ＣＤ４およびＣＤ８細胞双方を刺激するためのＣＤ６４を含んでなるａＡＰＣの効果をほとんど有しない。
Ｔｒｅｇの増殖および機能の特徴付け
天然に存在するＣＤ２５＋ＣＤ４＋サプレッサー細胞（Ｔｒｅｇ）細胞は、自己の構成要素（すなわち免疫学的自己寛容）に対する免疫学的非応答性、および非自己抗原に対する多様な免疫応答の負の制御の確立および維持において能動的部分を演じている。Ｔｒｅｇを定義するための少数の信頼できるマーカーが存在するが、しかし、蓄積する証拠が、天然に存在するＣＤ２５＋ＣＤ４＋ Ｔｒｅｇが、免疫学的自己寛容の維持、および病理学的ならびに生理学的免疫応答の負の制御において決定的に重要な役割を演じていることを示すため、この集団が最も広範に研究されている。表現型上別個の集団としての免疫系におけるそれらの天然の存在は、それらを、免疫学的疾患を処置若しくは予防しかつ病理学的ならびに生理学的免疫応答を制御するための方法を設計するための良好な標的にする。しかしながら、細胞のこの集団を増殖させかつ操作するための方法はあるとしてもほとんど存在しない。
刺激および増殖を誘導しかつａＡＰＣと接触させたＴｒｅｇ細胞の機能を検討するために、以下の実験を実施した。
末梢血リンパ球を抗ＣＤ４および抗ＣＤ２５抗体で標識し、そしてＣＤ２５＋を発現する最上の１％の細胞を細胞選別により単離した。これらの細胞を、抗ＣＤ３およびＣＤ２８抗体で被覆したビーズ、若しくは抗ＣＤ３およびＣＤ２８抗体を負荷したＫ３２細胞いずれかで刺激した。３０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の存在下でＴ細胞を培養すること、およびＴ細胞濃度を１ミリリットルあたり８十万と２百万細胞の間に維持することにより細胞増殖を測定した。細胞を２ないし３日ごとにコールターカウンターＩＩＥでカウントした。図１８に具体的に説明されるとおり、Ｔｒｅｇ集団のａＡＰＣ刺激は、ビーズ刺激に比較した場合に細胞の数のより大きな増大をもたらした。加えて、より多数のＴｒｅｇ細胞が、ビーズのような慣習的手段を用いるよりも迅速に産生される。
ａＡＰＣにより刺激したＴｒｅｇ細胞の機能性を評価するため、ＣＤ４およびＣＤ２５陽性ならびにＣＤ４ ＣＤ２５陰性の細胞を、抗ＣＤ３およびＣＤ２８ Ａｂを負荷したＫ３２細胞ならびに３０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を使用して１７日間増殖させた。これらの細胞を、同一ドナーからの休止期のＣＦＳＥ染色した細胞と１：４の比（４個の休止細胞ごとについて１個の増殖させた細胞）で混合した。この混合物を同種樹状細胞上に置き、そしてＣＦＳＥ希釈をフローサイトメトリーにより測定した。図１９に具体的に説明されるとおり、ａＡＰＣで増殖させたＴｒｅｇ細胞は、同種の混合リンパ球反応および増殖されたＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性の抑制されたＴ細胞増殖を抑制する一方、ＣＤ２５陰性集団はしなかった。
類似の実験を、ＯＸ４０Ｌを発現するＣＤ３２を発現するａＡＰＣ（Ｋ３２細胞）を使用して実施した。図２０に具体的に説明されるとおり、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔｒｅｇ細胞はａＡＰＣでのこうした処理後に非抑制性にされる。
本明細書に引用されるそれぞれのおよびすべての特許、特許出願および刊行物の開示は、ここにそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる。
本発明は特定の態様に関して開示された一方、本発明の他の態様および変形物が、本発明の真の技術思想および範囲から離れることなく当業者により考案されうることが明らかである。付属の請求の範囲は、全部のこうした態様および同等な変形物を包含すると解釈されることを意図している。
本発明を具体的に説明する目的上、本発明のある態様が図面に描かれる。しかしながら、本発明は、該図面に描かれる態様の正確な配置および手段に制限されない。
親Ｋ５６２ヒト赤白血病細胞株を使用する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）に基づくＴ細胞培養系の構築のモデルを具体的に説明する図である。図１はＣＤ８＋ Ｔ細胞と相互作用する、工作されたＫ３２／４−１ＢＢＬ ａＡＰＣを描く。 図２Ａから２Ｃを含んでなり、Ｋ３２／４−１ＢＢＬ／ＣＤ３／２８ ａＡＰＣを使用する四量体選別したインフルエンザウイルス（ｆｌｕ）特異的セントラルメモリーＴ細胞の増殖を描く。図２Ａは、インフルエンザウイルスに曝露されていたＨＬＡ−Ａ２ドナーからのＣＤ８ Ｔ細胞の選別を示す一連の画像を描く。図２Ｂは、これらの細胞が培養物中で７０日間維持されることが可能であったことを示すグラフである。細胞が廃棄されなかった場合に蓄積していたとみられる細胞の総数を、培養日数に対する総細胞数の半対数プロットとして描く。図２Ｃは、ｆｌｕペプチドを負荷したか、若しくはそれらを指定されるエフェクター対標的比でパルスされないまま残すかのいずれかの、ＴＡＰ欠損ＨＬＡ−Ａ２陽性Ｔ２細胞を使用するクロム放出アッセイを示す。 図３Ａから３Ｅを含んでなり、ｆｌｕ特異的Ｔ細胞を増殖させるのに使用し得るａＡＰＣの創製を具体的に説明する。図３は、ａＡＰＣによるマーカーＣＤ３２（図３Ａ）、ＫＡ２（図３Ｂ）、４−１ＢＢＬ（図３Ｄ）およびＦｌｕＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質、図３Ｅ）のそれぞれについてのＦＡＣＳ分析を示し、かつ、アイソタイプ対照もまた描く、一連の５つの画像を描く。 広範な特異性をもつＨＩＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖方法を示す実験モデルを具体的に説明する図である。 Ｋ５６２に基づくａＡＰＣ（例えばＫ３２／ＣＤ３／２８、Ｋ３２／８６／ＣＤ３）がＣＤ４ Ｔ細胞の長期増殖を媒介し、そしてＵ９３７に基づくａＡＰＣ（Ｕ３２／ＣＤ３／２８）若しくはビーズに基づくａＡＰＣ（ＣＤ３／２８被覆ビーズ）よりも効果的にそうすることを示すグラフである。 図６Ａから６Ｄを含んでなり、Ｋ５６２に基づくａＡＰＣ上での、しかしＵ９３７に基づくａＡＰＣでないサイトカインおよび共刺激遺伝子の発現の誘導を示すグラフである。図６Ａは、Ｋ３２／ＣＤ３／２８、Ｋ３２／ＣＤ３、Ｋ３２、Ｕ３２／ＣＤ３／２８、Ｕ３２／ＣＤ３、Ｕ３２、および休止ＣＤ４ Ｔ細胞によるインターロイキン１５（ＩＬ−１５）の誘導のその該レベルを描くグラフである。図６Ｂは、Ｋ３２／ＣＤ３／２８ ａＡＰＣが実質的により高レベルのＰＤ−Ｌ１を発現することを示す、細胞中でのＰＤ−Ｌ１誘導を描く。図６Ｃは、上述されたところの多様なａＡＰＣによるＰＤ−Ｌ２の誘導を描くグラフである。図６Ｄは、多様なａＡＰＣによるＢ７−Ｈ３の誘導を描くグラフである。 ３％ヒトＡｂ血清（（欠落）、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、バージニア州ウィンチェスター）を補充した（欠落）、カリフォルニア州カールズバッド）中で培養した、レンチウイルス（ＬＶ）で形質導入したａＡＰＣの増殖速度を描くグラフである。多様なＫ５６２に基づくａＡＰＣは、以下のＬＶベクター構築物、すなわちＫＴ３２（１遺伝子；濃四角）；ＫＴ３２／４−１ＢＢＬ／ＣＤ８６（３遺伝子；淡三角）；ＫＴ３２／４−１ＢＢＬ／ＣＤ８６／Ａ２／Ｆｌｕ−ＧＦＰ（５遺伝子；「Ｘ」）を使用して親Ｋ５６２（ｋ５６２ｃｃ；濃菱形）を形質導入することにより製造した。細胞が廃棄されていなかった場合に蓄積していたとみられる細胞の総数を、培養日数に対する全細胞数の半対数プロットとして描く。 図８Ａから８Ｅを含んでなり、単一Ｋ５６２ ａＡＰＣ中の最低８遺伝子（８−ＴＨＲＥＡＴ）の安定な共発現を描くグラフである。以下の遺伝子、すなわちＦｌｕ−ＧＦＰ（図８Ａ）；ＣＤ８０（図８Ｂ）；ＣＤ８６（図８Ｃ）；４−１ＢＢＬ（図８Ｄ）；およびＨＬＡ ＡＢＣ（図８Ｅ）をＫ５６２細胞に形質導入し、そしてフローサイトメトリーを使用して検出されたとおり、安定に発現された。 ＬＶで形質導入したａＡＰＣを使用するポリクローナルＣＤ８ Ｔ細胞の長期増殖を示すグラフである。 図１０Ａ−１０Ｅを含んでなり、Ｋ３２／４−１ＢＢＬ ａＡＰＣがｈＴＥＲＴ特異的細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）を増殖させたことを示す一連のグラフである。図１０Ａから１０Ｃは、Ｋ３２／４−１ＢＢＬ ａＡＰＣによる増殖の間のｔｅｔ＋ ＣＤ８ ＣＴＬの増大する割合を描くグラフである。各図１０Ａ−１０Ｃに対応するＭｏＦｌｏ選別のタイミングを、集団倍加を示すグラフ上で示す（図１０Ｄ）。図１０Ｄは、ａＡＰＣによるｈＴＥＲＴ特異的ＣＴＬの増殖を描くグラフであり、ここでＣＴＬはｈＴＥＲＴでワクチン接種した乳癌患者から得た。図１０Ｅは、ａＡＰＣを使用して増殖させたｈＴＥＲＴ特異的ＣＴＬが、ＨＬＡ−Ａ２およびテロメラーゼ＋を発現する癌細胞（ＯＶ−７）を特異的に溶解するが、しかしテロメラーゼ＋であるがしかしＨＬＡ−Ａ２−である癌細胞（ＳＫ−ＯＶ−３）はしなかったことを示すグラフである。 図１１Ａから図１１Ｄを含んでなり、プラスミドを使用するａＡＰＣのトランスフェクションを、ＬＶを使用してそれ以外は同一のａＡＰＣに形質導入した分子の発現と比較するデータを描く。図１１Ａは、本明細書の別の場所に開示されるところの特定の改変を描く、本明細書で使用される例示的一ＬＶを描く図である。図１１Ｂおよび１１Ｃは、ＧＦＰ（単シストロン性）若しくはｍＣＤ８ ＩＲＥＳ ＧＦＰ（二シストロン性）を発現するウイルスの単回接種のＫ５６２細胞の形質導入効率を描く。ｍＣＤ８およびＧＦＰの表面発現を形質導入５日後に測定した。 図１２Ａから１２Ｆを含んでなり、８，０００の抗原特異的Ｔ細胞が１か月培養後に２×１０６細胞を生じることが観察された代表的一実験を描く。簡潔には、ＨＬＡ Ａ＊０２０１ドナーから得た精製したＴ細胞を、抗ＣＤ８ ｍＡｂ、およびインフルエンザマトリックスタンパク質のＡ＊０２０１拘束性エピトープに複合体形成させたＡ＊０２０１ ＭＨＣ四量体（ｆｌｕ−ＭＰ四量体）で染色した。四量体陽性の集団（約８０００細胞）を選別し、そして抗ＣＤ２８抗体を負荷した照射したＫＴＡ２／ＣＤ３２／４−１ＢＢＬ／ＦＬＵ ＧＦＰ ａＡＰＣで刺激した。該細胞を、ＫＴＡ２／ＣＤ３２／４−１ＢＢＬ／ＦＬＵ ＧＦＰ ａＡＰＣで（図１２Ａ−Ｄ）およそ１０〜１２日ごとに再刺激した。インターロイキン２（ＩＬ−２）をそれぞれの細胞供給時（２〜３日ごと）に培養物に添加した。図１２Ｅおよび１２Ｆ増殖前および２６日後のｆｌｕ四量体反応性細胞の純度を示すグラフ。すなわち、四量体陽性集団の約２５０倍の増殖がこれらの培養条件下で観察された。 ＣＤ３２ ＩＲＥＳ ＩＬ−７で形質導入したＫ５６２ ａＡＰＣ（ＫＴ３２−ＩＬ７）およびＣＤ３２ ＩＲＥＳ ＩＬ−１５で形質導入したＫ５６２（ＫＴ３２−ＩＬ１５）を使用してのサイトカイン発現のレベルを描く棒グラフであり、ここで、細胞を高ＣＤ３２発現について選別した。 ＣＤ６４を発現するレンチウイルスベクターで形質導入したＫ５６２細胞の表面上のＣＤ６４の安定な発現を示すプロットである。 ＣＤ６４を発現するレンチウイルスベクターで形質導入したＫ５６２細胞（Ｋ６４細胞）の増大した抗体結合能力を具体的に説明するグラフである。 抗体を負荷しかつ複数回洗浄したＫ６４細胞が、ＣＤ３２を発現するＫ５６２細胞（Ｋ３２細胞）と比較した場合にＴ細胞の刺激において優れているが、とは言えＫ６４細胞およびＫ３２細胞双方がＴ細胞を刺激することが可能であることを具体的に説明する一連のグラフである。 図１７Ａから１７Ｄを含んでなり、Ｋ３２細胞に比較した場合にはるかにより少ない抗体がＫ６４細胞に最適に負荷するのに必要とされることを具体的に説明する一連の画像である。図１７Ａおよび１７ＢはＣＤ４細胞を描き、図１７Ｃおよび１７ＤはＣＤ８細胞を描く。 抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８被覆ビーズで刺激したＴｒｅｇ細胞に比較しての、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を負荷したＫ３２細胞で刺激したＴｒｅｇ細胞の増大した増殖を具体的に説明するグラフである。 同種混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を抑制するＴｒｅｇ細胞の能力を描くグラフである。 ＯＸ４０Ｌを発現するＫ３２細胞を使用して刺激したＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ Ｔｒｅｇ細胞がＴｒｅｇ細胞を非抑制性にすることを示すグラフである。 図２１Ａから２１Ｃを含んでなり、抗ＣＤ３抗体を負荷しかつＩＬ−１５、４−１ＢＢおよびＣＤ８０を発現するＫ３２を使用する抗原特異的ＣＤ８細胞の増殖を具体的に説明する一連の画像である。

Claims (22)

  1. 単離された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、レンチウイルスベクター（ＬＶ）を使用して形質導入されたＫ５６２細胞を含んでなり、かつ、前記ＬＶは最低１種の免疫刺激リガンドおよび最低１種の共刺激リガンドをコードする核酸を含んでなり、かつ、さらに、前記ａＡＰＣは前記刺激リガンドおよび前記共刺激リガンドを発現しそして前記ａＡＰＣと接触されたＴ細胞を刺激かつ増殖させ得る、上記細胞。
  2. 前記刺激リガンドが、抗原を負荷された主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ（ＭＨＣクラスＩ）分子、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体および抗ＣＤ２抗体よりなる群から選択されるポリペプチドである、請求項１に記載の単離されたａＡＰＣ。
  3. 前記共刺激リガンドが、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＩＣＡＭ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンβ受容体、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、３／ＴＲ６、およびＢ７−Ｈ３と特異的に結合するリガンドよりなる群から選択される最低１種の共刺激リガンドである、請求項１に記載の単離されたａＡＰＣ。
  4. 前記共刺激リガンドが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドよりなる群から選択される共刺激分子の最低１種と特異的に結合する、請求項１に記載の単離されたａＡＰＣ。
  5. 前記共刺激リガンドが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、Ｔｏｌｌリガンド受容体、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドよりなる群から選択される最低１種の分子と特異的に結合する抗体である、請求項１に記載の単離されたａＡＰＣ。
  6. 前記ａＡＰＣが、ＣＤ３２分子およびＣＤ６４分子よりなる群から選択されるＦｃγ受容体をさらに含んでなる、請求項１に記載の単離されたａＡＰＣ。
  7. 前記ＬＶが、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、ペプチド−ＭＨＣ四量体、ペプチド−ＭＨＣ三量体、ペプチド−ＭＨＣ二量体、およびペプチド−ＭＨＣ単量体よりなる群から選択される最低１種の抗原をコードする核酸を含んでなる、請求項１に記載の単離されたａＡＰＣ。
  8. 前記腫瘍抗原が、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＲＴ−１、ＧＰ１００、ＣＥＡ、ＨＥＲ−２／Ｎｅｕ、ＰＳＡ、ＷＴ−１、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ−３、ＭＵＣ−４およびテロメラーゼよりなる群から選択される、請求項７に記載の単離されたａＡＰＣ。
  9. 前記ＬＶが、サイトカインおよびケモカインから選択される最低１種のペプチドをコードする核酸を含んでなる、請求項１に記載の単離されたａＡＰＣ。
  10. 前記サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、インターフェロン−α（ＩＦＮα）、インターフェロン−β（ＩＦＮβ）、インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）、腫瘍壊死因子−β（ＴＮＦβ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）よりなる群から選択される最低１種のサイトカインである、請求項９に記載の単離されたａＡＰＣ。
  11. 既知の共刺激分子を発現するＴ細胞の増殖の特異的誘導方法であって、前記Ｔ細胞を請求項１に記載のａＡＰＣと接触させることを含んでなり、かつ、さらに、前記共刺激リガンドが前記既知の共刺激分子と特異的に結合してそれにより前記Ｔ細胞の増殖を特異的に誘導する、上記方法。
  12. 既知の共刺激分子を発現するＴ細胞の増殖の特異的誘導方法であって、前記既知の共刺激分子を発現する最低１種のＴ細胞を含んでなるＴ細胞の集団を請求項１に記載のａＡＰＣと接触させることを含んでなり、かつ、前記ａＡＰＣは前記既知の共刺激分子と特異的に結合する最低１種の共刺激リガンドを発現し、前記既知の共刺激分子の前記共刺激リガンドとの結合が前記Ｔ細胞の増殖を誘導する、上記方法。
  13. Ｔ細胞集団の、サブセットの特異的増殖方法であって、前記サブセットの最低１種のＴ細胞を含んでなるＴ細胞の集団を請求項１に記載のａＡＰＣと接触させることを含んでなり、かつ、前記ａＡＰＣは、前記サブセットの前記Ｔ細胞上の共刺激分子と特異的に結合する最低１種の共刺激リガンドを含んでなり、前記共刺激分子の前記共刺激リガンドとの結合が前記サブセットの前記Ｔ細胞の増殖を誘導して、それによりＴ細胞集団の１サブセットを特異的に増殖させる、上記方法。
  14. Ｔ細胞サブセットの活性化を特異的に誘導する共刺激リガンド若しくはその組合せの同定方法であって、請求項１に記載のａＡＰＣとＴ細胞の集団を接触させること、および、前記Ｔ細胞集団の増殖のレベルを、前記ａＡＰＣと接触されないＴ細胞のそれ以外は同一の集団の増殖のレベルと比較することを含んでなり、かつ、前記ａＡＰＣと接触されないＴ細胞の前記それ以外は同一の集団の増殖のレベルと比較した、前記ａＡＰＣと接触させた前記Ｔ細胞の増殖のより高いレベルが、前記共刺激リガンドが前記Ｔ細胞の活性化を特異的に誘導することの指標である、上記方法。
  15. 哺乳動物における抗原に対するＴ細胞応答の誘導方法であって、請求項１に記載のａＡＰＣを前記哺乳動物に投与することを含んでなり、かつ、前記ａＡＰＣが前記抗原を負荷されたＭＨＣクラスＩ分子をさらに含んでなり、前記ａＡＰＣが、前記抗原に特異的なＴ細胞の増殖を誘導して、それにより前記哺乳動物における前記抗原に対するＴ細胞応答を誘導する、上記方法。
  16. それの必要な哺乳動物における抗原に対するＴ細胞応答の誘導方法であって、前記哺乳動物から細胞の集団を得ること（前記集団はＴ細胞を含んでなる）、細胞の前記集団を請求項１に記載のａＡＰＣと接触させること（前記ａＡＰＣは前記抗原を負荷されたＭＨＣクラスＩ複合体をさらに含んでなり、かつ、それにより、前記細胞を前記ａＡＰＣと接触させることが前記抗原に特異的な抗原特異的Ｔ細胞の増殖を誘導する）、前記抗原特異的Ｔ細胞を細胞の前記集団から単離すること、および前記抗原特異的Ｔ細胞を前記哺乳動物に投与して、それにより前記哺乳動物において前記抗原に対するＴ細胞応答を誘導することを含んでなる、上記方法。
  17. 制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の集団の特異的増殖方法であって、前記集団を請求項１に記載のａＡＰＣと接触させることを含んでなり、かつ、前記ａＡＰＣは抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を負荷されたＦｃγ受容体をさらに含んでなり、該方法は、細胞の前記集団をサイトカインと接触させることをさらに含んでなり、前記抗ＣＤ３抗体および前記抗ＣＤ２８抗体の前記Ｔｒｅｇ細胞との結合が前記Ｔｒｅｇ細胞の増殖を誘導して、それによりＴｒｅｇ細胞の集団を特異的に増殖させる、上記方法。
  18. 前記サイトカインがインターロイキン−２である、請求項１７に記載の方法。
  19. 既知の共刺激分子を発現するＴ細胞の増殖を特異的に誘導するためのキットであって、有効量のａＡＰＣを含んでなり、前記ａＡＰＣはレンチウイルスベクター（ＬＶ）を使用して形質導入されたＫ５６２細胞を含んでなり、かつ、前記ＬＶは前記既知の共刺激分子を特異的に結合する最低１種の共刺激リガンドをコードする核酸を含んでなり、前記既知の共刺激分子の前記共刺激リガンドとの結合が前記Ｔ細胞を刺激しかつ増殖させ、前記キットが、アプリケーター、および前記キットの使用のための説明資料をさらに含んでなる、上記キット。
  20. 既知の刺激分子を発現するＴ細胞の増殖を特異的に誘導するためのキットであって、有効量のａＡＰＣを含んでなり、かつ、前記ａＡＰＣはレンチウイルスベクター（ＬＶ）を使用して形質導入されたＫ５６２細胞を含んでなり、前記ＬＶは前記既知の刺激分子を特異的に結合する最低１種の刺激リガンドをコードする核酸を含んでなり、前記既知の刺激分子の前記刺激リガンドとの結合が前記Ｔ細胞を刺激しかつ増殖させ、前記キットが、アプリケーター、および前記キットの使用のための説明資料をさらに含んでなる、上記キット。
  21. Ｔ細胞集団のサブセットを特異的に増殖させるためのキットであって、有効量のａＡＰＣを含んでなり、かつ、前記ａＡＰＣはレンチウイルスベクター（ＬＶ）を使用して形質導入されたＫ５６２細胞を含んでなり、前記ＬＶは前記Ｔ細胞集団上の共刺激分子を特異的に結合する最低１種の共刺激リガンドをコードする核酸を含んでなり、前記共刺激分子の前記共刺激リガンドとの結合が前記Ｔ細胞集団を刺激しかつ増殖させ、前記キットが、アプリケーター、および前記キットの使用のための説明資料をさらに含んでなる、上記キット。
  22. Ｔ細胞サブセットの活性化を特異的に誘導する、共刺激リガンド若しくは前記リガンドの組合せ物を同定するためのキットであって、複数のａＡＰＣを含んでなり、かつ、各前記ａＡＰＣはレンチウイルスベクター（ＬＶ）を使用して形質導入されたＫ５６２細胞を含んでなり、前記ＬＶは共刺激分子と特異的に結合する最低１種の既知の共刺激リガンドをコードする核酸を含んでなり、前記キットが、アプリケーター、および前記キットの使用のための説明資料をさらに含んでなる、上記キット。
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