JP2012219062A - 細胞傷害性t細胞誘導用組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、抗CD28抗体と、該抗CD28抗体が固相化された固体支持体と、MHCクラスI分子と結合可能な可溶性ペプチドとを含む、細胞傷害性T細胞誘導用組成物を提供する。本発明の細胞傷害性T細胞誘導用組成物において、前記MHCクラスI分子と結合可能な可溶性ペプチドは、患者のHLA適合型のHLA複合体によって抗原として提示され、前記細胞傷害性T細胞に認識される場合がある。本発明は腫瘍治療用医薬品組成物を提供する。本発明の腫瘍治療用医薬品組成物は、本発明の細胞傷害性T細胞誘導用組成物を含み、前記MHCクラスI分子と結合可能な可溶性ペプチドは、腫瘍細胞の特異的抗原タンパク質のアミノ酸配列の一部を含み、前記細胞傷害性T細胞は前記腫瘍細胞を認識する。前記腫瘍細胞の特異的抗原タンパク質はWT−1の場合がある。
【選択図】なし
Description
2 可溶性ペプチド
3 固体支持体
4 抗CD28抗体
5 CD28分子
6 T細胞レセプター/CD3/CD8複合体
7 HLAクラスI分子
8 HLAクラスI分子を発現する細胞
9 HLAクラスI分子7で制限された可溶性ペプチド2を認識する細胞傷害性T細胞
1.材料及び方法
(1)ヒト臍帯血
ヒト臍帯血試料は、母親のインフォームド・コンセント署名を得た後に採血され、理化学研究所バイオリソースセンター内の液体窒素システムで凍結保存された。採血方法はRubinstein,P.ら(Blood,81:1679−1690(1993))に説明され、凍結保存方法はRubinstein,P.ら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:10119−10122(1995))に説明される。
培地としてX−VIVO(商標)15(タカラバイオ株式会社、滋賀)が使用された。一部の実験では最終濃度0ないし5%のヒトAB型血清(Lonza、ロンザジャパン株式会社)が添加された。組換えヒトIL−7(Peprotech、東洋紡績株式会社)と、IL−15(Peprotech、東洋紡績株式会社)とが、それぞれ、0ないし10ng/mLと、0ないし300ng/mLとの最終濃度で添加された。可溶性ペプチドとしては、HLA−A*24:02WT−1(mu)CYTWNQMNLが用いられた。当該ペプチドのアミノ酸配列(CYTWNQMNL)は、添付される配列表に配列番号2として列挙される。固相化された抗CD28抗体としては、ビオチン化抗ヒトCD28マウスモノクローナル抗体(クローンCD28.2、BioLegend Japan株式会社)が磁気ビーズ(Dynabeads(商標) M−280 ストレプトアビジン、ライフテクノロジーズジャパン株式会社)と室温で30分間インキュベーションされ、ビオチン・アビジン反応により結合されてから用いられた。前記磁気ビーズに結合された抗CD28抗体は、以下、ビオチン化CD28抗体とビーズとの複合体、又は、固相化抗CD28抗体という。
理化学研究所から入手した臍帯血(ID番号:HCB00747、HLA−A遺伝子座の適合型:24:02及び02:06)25mLは37°Cの温水浴で解凍され、終濃度5%デキストセラン40(テルモ・ジャパン社)と終濃度2.5%ヒト血清アルブミン(日本赤十字社)が添加されたPBS中に浮遊された。得られた白血球は、5mM EDTA及び2%ヒト血清アルブミンが添加されたPBSでさらに3回洗浄された。その後、前記白血球懸濁液に細胞108個あたり25μLのDynal(商標)免疫磁気ビーズCD14(ライフテクノロジーズジャパン株式会社)が添加され、室温20°Cで10分間以上攪拌された。CD14陽性細胞と、ビーズを貪食した単球マクロファージとが磁気粒子分離器(DynaMag−15、ライフテクノロジーズジャパン株式会社)を用いて分離された。CD14陰性細胞の分画は以下の(4)節のとおり、CD3/CD28陽性細胞の精製及び増幅に用いられた。分離されたCD14陽性単球は、5%ヒトAB型血清が添加されたX−VIVO(商標)15培地に106個/mLの濃度で浮遊され、35mmシャーレ(EZ−BindShut(商標)、旭硝子株式会社)に移された後に、50ng/mLの組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF、Peprotech)と、50ng/mLの組換えヒトインターロイキン−4(IL−4、Peprotech)とが添加され、培養された。培養6日目に、50ng/mLのプロスタグランジンE2(第一化学)と、終濃度10μg/mLのピシバニル(OK432、ロシュ中外製薬)とが添加された。さらに1日間培養され、成熟樹状細胞が得られた。
(3)節で分離されたCD14陰性細胞分画からさらにCD4陽性細胞を除去するため、細胞2×107個あたり25μLのDynal(商標)免疫磁気ビーズCD4(ライフテクノロジーズジャパン株式会社)が添加され、室温20°Cで10分間以上攪拌された。CD4陽性細胞が磁気粒子分離器(DynaMag−15)を用いて除去された後、新たにDynabeads(商標)、Tcell Expander CD3/CD28(商標、ライフテクノロジーズジャパン株式会社)が単核球107個あたり25μL添加され、氷上又は4°Cで30分間攪拌された後、CD3/CD28陽性細胞が磁気粒子分離器(DynaMag−15)を用いて濃縮された。前記CD8陽性細胞は、5%ヒトAB型血清と、300ng/mL組換えヒトIL−15(Peprotech)とが添加されたX−VIVO(商標)15培地に106個/mLの濃度で浮遊培養された。培養開始後2ないし3日毎にサイトカインが添加された培地の交換が行われた。その際には、トリパンブルー染色を用いて生細胞数が測定され、106個/mLの細胞濃度になるように、IL−15が300ng/mL添加された新鮮な培地が添加された。前記CD3/CD28陽性細胞は、総細胞数が1×106個に達した段階で以下に説明する手順で可溶性ペプチド及び抗CD28免疫ビーズにより刺激された。
CD3/CD28陽性細胞が総細胞数1×106個に達した段階で、初回刺激が固相化抗CD28抗体及び可溶性ペプチドにより実施され、2回目の刺激は初回刺激から7日目に実施された。5%ヒトAB型血清と300ng/mL組換えヒトIL−15とが添加されたX−VIVO(商標)15培地に、最終濃度10μg/mLの可溶性ペプチドHLA−A*24:02WT−1(mu)CYTWNQMNLと、固相化抗CD28抗体とが添加された培地がCTL誘導のために用いられた。この際、磁気免疫ビーズ数とT細胞との比が4:1になるようビーズ濃度が調整され、その後の培地交換の際にビーズは細胞とともに希釈された。
前記CTL誘導以後の培地交換には、終濃度10μg/mLとなるよう可溶性ペプチドと、5%ヒトAB型血清と、300ng/mL組換えヒトIL−15とが添加されたX−VIVO(商標)15培地が用いられた。CTLの増幅のためには、最短で19日間、長い場合40日間を要した。
(7.1)末梢血の採血
健康なボランティア被検者2名(HLA−A遺伝子座の適合型:HLA−A*24:02及び02:07、HLA-A*24:02及び26:01)から末梢血が採取された。本実験は、東京大学医科学研究所倫理審査委員会の承認(承認番号20−56−0210、初回承認日:平成21年2月10日、変更承認日:平成22年11月19日)を得て実施され、前記ボランティア被検者からは書面による同意が得られている。採血には、21〜22G針を取り付けた真空採血管(TERUMO ベノジェクトII EDTA−2Na)が用いられた。
得られた血液は、常温に保たれた希釈液(PBS)で2倍希釈され、各遠心管に、希釈血20ないし35mLが、10ないし15mLのFicoll Paque(比重1.077、GEヘルスケア・ジャパン株式会社)に重層された。遠心は、500×g、室温で30分間行われ、ブレーキをかけずに停止された。遠心上清(血漿部分)は数mLを残して除去され、中間層が回収された。遠心管1ないし2本から回収された前記中間層が1本の新たな遠心管に集められ、前記希釈液により体積が50mLに調製された。2回目の遠心は、500×g、室温、5分間の条件で行われた。上清は除去され、ペレットが、前記希釈液30mLに懸濁された。3回目の遠心は、500×g、室温、5分間の条件で行われた。上清は除去され、ペレットは、細胞濃度が1×107個/mLになるように、2mM EDTAと、0.1%ヒト血清アルブミンとが添加されたPBSに懸濁された(以下、「単核球懸濁液」という。)。前記単核球懸濁液にDynal(商標)免疫磁気ビーズCD14(ライフテクノロジーズジャパン株式会社)を単核球108個あたり25μLずつ添加し、4°Cにて30分間撹拌した。反応後、磁気粒子分離器(DynaMag−15)を用いてCD14陽性単球が分離され、この単球は、50ng/mLのGM−CSFと、50ng/mLのIL−4と、5%ヒトAB型血清とが添加されたX−VIVO(商標)15培地にて培養された。6日間の培養期間中、培地交換は行われなかった。培養6日目に50ng/mLのプロスタグランジンE2と、10μg/mLのピシバニルとが添加された後さらに1日間培養され、成熟樹状細胞が得られた。
(4)節で説明された手順で精製及び増幅された臍帯血由来CD3/CD28陽性細胞は、5%ヒトAB型血清と、300ng/mLのヒトIL−15とが添加されたX−VIVO(商標)15培地中で、37°C、5%CO2の条件下培養された。CTL誘導は、総細胞数1×106個に達した段階での初回刺激と、初回刺激から7日目の第2回刺激との2回行われた。(7.2)節に記載の手順で調製された末梢血由来の成熟樹状細胞の培養液に、10μg/mLの可溶性ペプチドHLA−A*24:02WT−1(mu)CYTWNQMNL(HLA−A*24:02ドナーの場合)又はHLA−A*02:01WT−1 RMFPNAPYL(HLA−A*02:01ドナーの場合)が添加され、37°Cで3時間撹拌され、前記ペプチドが前記樹状細胞上のHLAクラスI分子上に結合された。その後、前記成熟樹状細胞と前記CD8陽性細胞とが、1:5ないし1:6.7の比で12穴プレートに混合されて、さらに初回刺激後12日間共培養された。
誘導された細胞傷害性T細胞のうちWT−1ペプチド抗原を認識する細胞の割合を測定するために、HLA−A*24:02分子上に突然変異型アミノ酸配列からなるWT−1ペプチド分子4個が固相化され、PEで蛍光標識されたビーズ(以下、「PE標識HLA−A*24:02WT−1(mu)−テトラマー」という。)が用いられた。しかし、このビーズはアビジンが共有結合により結合されており、ビオチン化されたPE標識WT−1ペプチドのテトラマーとは、アビジン−ビオチンの特異的相互作用によって結合されている。一方、誘導に用いた抗CD28抗体もビオチン化され、アビジン結合ビーズに固相化されている。そこで、誘導に用いられた固相化抗CD28抗体が、WT−1ペプチド特異的CTLの検出のためのフロー・サイトメトリー解析のサンプルに残存していると、PE標識HLA−A*24:02WT−1(mu)−テトラマーのビーズの一部でビオチン化されたPE標識WT−1ペプチドのテトラマーが脱落して、ビオチン化された抗CD28抗体に置換される可能性がある。かかる脱落・置換が起こると、WT−1ペプチド特異的CTLの検出の際に、CD28を発現する細胞も反応してしまう。そこで、以下の実験によって、かかる脱落・置換の可能性を検証した。
前記3種類の手順のいずれかでWT−1ペプチド特異的CTLの誘導処理が総細胞数1×106個に達した段階での初回刺激と、初回刺激から7日目の第2回刺激と2回施された臍帯血由来CD3/CD28陽性細胞は、初回刺激後12日目に回収され、FITC標識抗ヒトCD3モノクローナルマウスIgG2a抗体(クローンHIT3a、BioLegend Japan株式会社)と、APC標識抗CD8抗体と、PE標識HLA−A*24:02WT−1(mu)−テトラマーとで三重染色され、フロー・サイトメトリー解析が行われた。
図2AないしHは、前記3種類の手順のいずれかで総細胞数1×106個に達した段階での初回刺激と、初回刺激から7日目の第2回刺激と2回WT−1ペプチド特異的CTLの誘導処理が施された臍帯血由来CD8陽性細胞について、初回刺激後12日目にCD3+ゲートを通過した細胞のうち、HLA−A*24:02WT−1(mu)−テトラマーを特異的に認識する細胞(以下、「テトラマー陽性細胞」という。)の2次元フロー・サイトメトリー解析の結果図である。図2AないしHの結果図の縦軸はPE標識の蛍光強度で、横軸はAPC標識の蛍光強度である。図2A及びBのサンプルは、前記3種類のいずれの誘導処理も行わずに、5%ヒトAB型血清と、300ng/mL組換えヒトIL−15とを添加したX−VIVO(商標)15培地だけで培地交換して図2Cおよび図2Dの実験と同じ日数培養された臍帯血由来CD8陽性細胞である。図2C及びDのサンプルは、可溶性WT−1ペプチド及び抗CD28免疫ビーズによるWT−1ペプチド特異的CTL誘導を総細胞数1×106個に達した段階での初回刺激と、初回刺激後7日目の第2回刺激との2回行った後、初回刺激後12日目まで培養された臍帯血由来CD8陽性細胞である。図2E及びFは、WT−1変異ペプチド添加同種末梢血由来樹状細胞によるWT−1ペプチド特異的CTL誘導を総細胞数1×106個に達した段階での初回刺激と、初回刺激後7日目の第2回刺激との2回行った後、初回刺激後12日目まで培養された臍帯血由来CD8陽性細胞である。図2G及びHは、WT−1変異ペプチド添加自家臍帯血単球由来樹状細胞によるWT−1ペプチド特異的CTL誘導を総細胞数1×106個に達した段階での初回刺激と、初回刺激後7日目の第2回刺激との2回行った後、初回刺激後12日目まで培養された臍帯血由来CD8陽性細胞である。図2A、C、E及びGの結果図のサンプルは、FITC標識抗CD3抗体と、APC標識抗CD8抗体とを混合して染色された。図2B、D、F及びHの結果図のサンプルは、FITC標識抗CD3抗体と、APC標識抗CD8抗体と、PE標識HLA−A*24:02WT−1(mu)−テトラマーとを混合して染色された。
1.材料及び方法
実施例1と異なる臍帯血(ID番号:HCB00751、HLA−A遺伝子座の適合型:24:02及び33:03)由来CD8陽性細胞が、実施例1と同じ3種類の誘導処理を施され、テトラマー陽性細胞のフロー・サイトメトリー解析に供された。
図3は、可溶性WT−1ペプチド及び抗CD28免疫ビーズによって総細胞数1×106個に達した段階での初回刺激と、初回刺激から7日目の第2回刺激と2回WT−1ペプチド特異的CTLの誘導処理が施された臍帯血由来CD8陽性細胞について、初回刺激後12日目にCD3+ゲートを通過した細胞のうち、テトラマー陽性細胞の2次元フロー・サイトメトリー解析の結果図である。図3の結果図の縦軸はPE標識の蛍光強度で、横軸はAPC標識の蛍光強度である。図3のサンプルは、可溶性WT−1ペプチド及び抗CD28免疫ビーズによるWT−1ペプチド特異的CTL誘導を総細胞数1×106個に達した段階での初回刺激と、初回刺激から7日目の第2回刺激との2回行った後、初回刺激後12日目まで培養された臍帯血由来CD8陽性細胞であり、FITC標識抗CD3抗体と、APC標識抗CD8抗体と、PE標識HLA−A*24:02WT−1(mu)−テトラマーとを混合して染色された。
1.材料及び方法
実施例1で説明された手順にしたがって、HLA−A*24:02陽性であることが確認できた異なる臍帯血(ID番号:HCB00756、HLA−A遺伝子座の適合型:24:02及び33:03)からCD14陰性CD4陰性CD3/CD28陽性細胞が分離された。前記細胞は最初の1週間は10ng/mLのIL−7と、5%ヒトAB型血清とが添加されたX−VIVO(商標)15培地中で37°C、5%CO2で増幅され、その後、300ng/mLのIL−15と、5%ヒトAB型血清とが添加されたX−VIVO(商標)15培地が至適細胞濃度106個/mLとなるよう2〜3日に1回ずつ追加され、さらに28日間増幅された。その後前記細胞は、セルバンカー(商標)(十慈フィールド株式会社)に浮遊されて液体窒素中に凍結保存され、用時解凍して以下の実験に用いられた。5%ヒトAB型血清と、300ng/mLのIL−15とが添加されたX−VIVO(商標)15培地に、さらに、ビオチン化CD28抗体とビーズとの複合体と、癌抗原WT−1特異的変異可溶性ペプチドHLA−A*24:02WT−1(mu)CYTWNQMNL又はCMVpp65特異的ペプチドHLA−A*24:02CMVpp65 QYDPVAALF(配列番号5)とが添加された培地中で、解凍されたCD3/CD28陽性細胞が10日間培養された。10日目に前記細胞はPBSで回収され、PE標識HLA−A*24:02WT−1(mu)CYTWNQMNLテトラマーか、PE標識HLA−A*24:02CMVpp65 QYDPVAALFテトラマーかが細胞106個あたり20μL添加され、室温で20分間静置された後、FITC標識抗ヒトCD3モノクローナルマウスIgG2a抗体(クローンHIT3a、BioLegend Japan株式会社)と、APC標識抗CD8抗体(クローンRPA−T8、BioLegend Japan株式会社)とが20μLずつ添加され、0°Cないし4°Cで20分間撹拌されてから、フロー・サイトメトリー解析に供された。
実施例1及び2と同様のフロー・サイトメトリー解析の結果、最初の培養後1度凍結された臍帯血由来CD8陽性細胞について、再解凍後総細胞数1×106個に調製した段階で癌抗原WT−1特異的変異可溶性ペプチドHLA−A*24:02WT−1(mu)CYTWNQMNLか、CMVpp65特異的可溶性ペプチドHLA−A*24:02QYDPVAALFかと、CD28免疫ビーズとが添加された培地にて1回刺激が行われた後、刺激後10日目まで培養された細胞では、CD3+ゲートを通過した細胞のうち、WT−1ペプチドテトラマー陽性細胞は約2.72%であった(図示されない)。同様に、CMVpp65特異的可溶性ペプチドHLA−A*24:02QYDPVAALF及びCD28免疫ビーズが添加された培地にて1回刺激が行われた後、刺激後10日目まで培養された細胞では、CD3+ゲートを通過した細胞のうち、CMVpp65ペプチドテトラマー陽性細胞は約3.39%であった(図示されない)。ペプチド特異的CTL誘導が施されなかった対照実験の臍帯血由来CD3陽性細胞が、PE標識WT−1ペプチドテトラマーと、PE標識CMVpp65ペプチドテトラマーとを混合して染色されたサンプルでは、CD3+ゲートを通過した細胞のうち、PEの蛍光波長での蛍光を示す細胞は0.77%であった(図示されない)。WT−1ペプチド特異的CTL誘導が施された臍帯血由来CD3陽性細胞が、PE標識WT−1ペプチドテトラマーを混合しないで、APC標識抗CD8抗体のみと混合して染色されたサンプルでは、CD3+ゲートを通過した細胞のうち、PEの蛍光波長での蛍光を示す細胞は0.19%であった(図示されない)。CMVpp65ペプチド特異的CTL誘導が施された臍帯血由来CD3陽性細胞が、PE標識CMVpp65ペプチドテトラマーを混合しないで、APC標識抗CD8抗体のみと混合して染色されたサンプルでは、CD3+ゲートを通過した細胞のうち、PEの蛍光波長での蛍光を示す細胞は0.27%であった(図示されない)。ペプチド特異的CTL誘導が施されなかった対照実験の臍帯血由来CD3陽性細胞が、PE標識WT−1ペプチドテトラマー又はPE標識CMVpp65ペプチドテトラマーを混合しないで、APC標識抗CD8抗体のみと混合して染色されたサンプルでは、CD3+ゲートを通過した細胞のうち、PEの蛍光波長での蛍光を示す細胞は0.14%であった(図示されない)。
1.材料及び方法
実施例1(7.1)と同一の健康なボランティア被検者(HLA−A遺伝子座の適合型:HLA-A*24:02及び26:01)から末梢血が採取された。実施例1(7.1)と同じ手順で採血が行われ、実施例1(7.2)と同じ手順で単核球懸濁液が調製され、前記単核球懸濁液からCD14陽性単球が除去された。残りのCD14陰性分画から、フローコンプCD8キット(ライフテクノロジーズジャパン株式会社)を用いてCD8陽性細胞が精製された。具体的にはビオチン化抗CD8抗体とヒト末梢血単核球懸濁液CD14陰性分画とを氷上(0°Cないし4°C)で10分間反応させた後、アビジン結合磁気免疫ビーズと氷上(0°Cないし4°C)で15分間反応させ、磁気粒子分離器(DynaMag−15)を用いてCD8陽性細胞が分離された。その後、室温でリリースバッファーが添加されて10分間インキュベーションされて、前記アビジン結合磁気免疫ビーズがCD8陽性リンパ球から遊離された。回収されたCD8陽性細胞は、5%ヒトAB型血清と300ng/mL IL−15とが添加されたX−VIVO(商標)15培地中で37°C、5%CO2条件下培養された。総細胞数1×106個に調製後、癌抗原WT−1特異的変異可溶性ペプチドHLA−A*24:02WT−1(mu)CYTWNQMNLか、CMVpp65特異的ペプチドHLA−A*24:02 QYDPVAALFかと、CD28免疫ビーズとが添加された培地にて初回刺激、さらに初回刺激後7日目に同様の刺激が行われた後、初回刺激後11日目まで培養された。2〜3日毎に、IL−15が添加された新鮮な培地で細胞濃度が106個/mLとなるように希釈された。初回刺激後11日目にフロー・サイトメトリーによるテトラマー陽性率の解析が行われた。
実施例1ないし3と同様のフロー・サイトメトリー解析の結果、癌抗原WT−1特異的変異可溶性ペプチドHLA−A*24:02WT−1(mu)CYTWNQMNL及びCD28免疫ビーズが添加された培地にて総細胞数1×106個に達した段階で初回刺激、さらに初回刺激後7日目に同様の刺激を行った後、初回刺激後11日目までペプチド特異的CTLの誘導処理が施された末梢血由来CD8陽性細胞について、培養開始11日目にCD3+ゲートを通過した細胞のうち、WT−1ペプチドテトラマー陽性細胞は約5.13%であった(図示されない)。ペプチド特異的CTL誘導が施されなかった対照実験の末梢血由来CD3陽性細胞では、培養開始11日目にCD3+ゲートを通過した細胞のうち、WT−1ペプチドテトラマー陽性細胞は約0.15%であった(図示されない)。同様に末梢血由来CD8陽性細胞が、CMVpp65可溶性ペプチド及び抗CD28免疫ビーズによって培養開始初日と7日目との2回刺激された場合には、培養開始11日目にCD3+ゲートを通過した細胞のうち、WT−1ペプチドテトラマー陽性細胞は約4.53%であった(図示されない)。PE標識WT−1ペプチド−テトラマーを混合しないで、FITC標識抗CD3抗体と、APC標識抗CD8抗体とを混合して染色されたサンプルでは、CD3+ゲートを通過した細胞のうち、PEの蛍光波長での蛍光を示す細胞は0.13%以下であった(図示されない)。
1.材料及び方法
HLA−A*24:02陽性であることが確認できた異なる臍帯血(ID番号:HCB01100、HLA−A遺伝子座の適合型:24:02及び26:01)から、実施例1(3)で説明された手順に従って、磁気免疫ビーズを用いてCD14陰性CD4陰性CD3/CD28陽性細胞が分離された。前記細胞は、106個/mLの濃度に希釈され、10ng/mLのIL−7と、5%ヒトAB型血清とが添加されたX−VIVO(商標)15培地中で37°C、5%CO2濃度で培養開始後最初の1週間増幅され、その後7日目から、300ng/mLのIL−15と5%ヒトAB型血清とが添加されたX−VIVO(商標)15培地で、至適細胞濃度が106個/mLとなるよう2〜3日に1回ずつ希釈された。総細胞数1×106個に達した段階でhTERT由来可溶性ペプチドHLA−A*24:02 VYGFVRACL(配列番号3)及びCD28免疫ビーズが添加された培地にて初回刺激、さらに初回刺激後7日目に同様の刺激を行った後、初回刺激後14日目まで培養された。刺激時には、ビオチン化CD28抗体とビーズとの複合体は、ビーズ:細胞の比が4:1の濃度で添加された。初回刺激後14日目に細胞がPBSで回収され、細胞106個あたり20μLのPE標識HLA−A*24:02hTERT VYGFVRACLテトラマーが添加され、室温で20分間静置された後、FITC標識抗ヒトCD3モノクローナルマウスIgG2a抗体(クローンHIT3a、BioLegend Japan株式会社)と、APC標識抗CD8抗体(クローンRPA−T8、BioLegend Japan株式会社)とが20μLずつ添加され、0°Cないし4°Cで20分間撹拌され、フロー・サイトメトリー解析に供された。
図4AないしDは、FITC標識抗CD3抗体と、PE標識HLA−A*24:02hTERT VYGFVRACLテトラマーと、APC標識ヒト抗CD8抗体とを用いる2次元フロー・サイトメトリー解析の結果図である。図4AないしDの結果図の縦軸はPE標識の蛍光強度で、横軸はAPC標識の蛍光強度である。hTERT可溶性ペプチドHLA−A*24:02VYGFVRACL及びCD28免疫ビーズが添加された培地にてhTERT由来ペプチド特異的CTLの誘導処理が施された臍帯血由来CD8陽性細胞について、初回刺激後14日目にCD3+ゲートを通過した細胞のうち、hTERTペプチドテトラマー陽性細胞は約0.74%であった(図4C)。ペプチド特異的CTL誘導が施されなかった対照実験の臍帯血由来CD3陽性細胞では、培養開始11日目にCD3+ゲートを通過した細胞のうち、hTERTペプチドテトラマー陽性細胞は約0.06%であった(図4B)。hTERT可溶性ペプチドHLA−A*24:02VYGFVRACL及びCD28免疫ビーズが添加された培地にてhTERT由来ペプチド特異的CTLの誘導処理が施された臍帯血由来CD8陽性細胞にPE標識hTERTペプチド−テトラマーを混合しないで、FITC標識抗CD3抗体と、APC標識抗CD8抗体とを混合して染色されたサンプルでは、CD3+ゲートを通過した細胞のうち、PEの発光波長での発蛍光を示す細胞は0.08%以下であった(図4D)。ペプチド特異的CTL誘導が施されなかった対照実験の臍帯血由来CD3陽性細胞では、PE標識hTERTペプチド−テトラマーを混合しないで、FITC標識抗CD3抗体と、APC標識抗CD8抗体とで染色されたサンプル中のCD3+ゲートを通過した細胞のうち、PEの蛍光波長での蛍光を示す細胞は0.02%であった(図4A)。
1.材料及び方法
HLA−A*24:02陽性であることが確認できた異なる臍帯血(ID番号:HCB01100、HLA−A遺伝子座の適合型:24:02及び26:01)から、実施例1(3)で説明された手順に従って、磁気免疫ビーズを用いてCD14陰性CD4陰性CD3/CD28陽性細胞が分離された。前記細胞は106個/mLの濃度に希釈され、10ng/mLのIL−7と、5%ヒトAB型血清とが添加されたX−VIVO(商標)15培地中で37°C、5%CO2濃度で培養開始後最初の1週間増幅され、その後7日目から、300ng/mLのIL−15と5%ヒトAB型血清とが添加されたX−VIVO(商標)15培地で、至適細胞濃度106個/mLとなるよう2〜3日に1回ずつ希釈された。総細胞数1×106個に達した段階でsurvivin−2B由来可溶性ペプチドHLA−A*24:02 survivin−2B AYACNTSTL(配列番号4)及びCD28免疫ビーズが添加された培地にて初回刺激、さらに初回刺激後7日目に同様の刺激を行った後、初回刺激後10日目まで培養された。刺激時には、ビオチン化CD28抗体とビーズとの複合体が、ビーズ:細胞の比が4:1の濃度で添加された。刺激後10日目に前記細胞がPBSで回収され、細胞106個あたり20μLのPE標識HLA−A*24:02 survivin−2B AYACNTSTLテトラマーが添加され、室温で20分間静置された後、FITC標識抗ヒトCD3モノクローナルマウスIgG2a抗体(クローンHIT3a、BioLegend Japan株式会社)と、APC標識抗CD8抗体(クローンRPA−T8、BioLegend Japan株式会社)とが20μLずつ添加され、0°Cないし4°Cで20分間撹拌され、フロー・サイトメトリー解析に供された。
図5AないしDは、FITC標識抗CD3抗体、PE標識HLA−A*24:02survivin−2B AYACNTSTLテトラマーと、APC標識抗CD8抗体とで染色し、CD3+ゲートを通過した細胞のうち、PE及びAPCによる2次元フロー・サイトメトリー解析の結果図である。図5AないしDの結果図の縦軸はPE標識の蛍光強度で、横軸はAPC標識の蛍光強度である。HLA−A*24:02 survivin−2B AYACNTSTL可溶性ペプチド及び抗CD28免疫ビーズによって総細胞数1×106個に達した段階で初回刺激、さらに初回刺激後7日目に同様の刺激を行った後、初回刺激後10日目まで培養された臍帯血由来CD8陽性細胞について、FITC標識抗CD3抗体と、PE標識HLA−A*24:02hTERT−テトラマーと、APC標識抗CD8抗体とで染色し、CD3+ゲートを通過した細胞のうち、survivin−2Bペプチドテトラマー陽性細胞は約1.16%であった(図5C)。PE標識survivin−2Bペプチド−テトラマーを混合しないで、FITC標識抗CD3抗体と、APC標識抗CD8抗体とで染色されたサンプルでは、CD3+ゲートを通過した細胞のうち、PEの蛍光波長での蛍光を示す細胞は0.00%以下であった(図5D)。ペプチド特異的CTL誘導が施されなかった対照実験の臍帯血由来CD3陽性細胞では、培養開始10日目にCD3+ゲートを通過した細胞のうち、survivin−2Bペプチドテトラマー陽性細胞は約0.03%であった(図5B)。PE標識survivin−2Bペプチド−テトラマーを混合しないで、FITC標識抗CD3抗体と、APC標識抗CD8抗体とを混合して染色されたサンプルでは、CD3+ゲートを通過した細胞のうち、PEの蛍光波長での蛍光を示す細胞は0.03%であった(図5A)。
1.材料及び方法
HLA−A*24:02陽性であることが確認できた異なる臍帯血(ID番号:RC2R10010、HLA−A遺伝子座の適合型:24:02/ブランクおそらく24:02ホモザイゴート)から単球が貼り付き法にて除去された後、実施例1で説明された手順にしたがって、磁気免疫ビーズを用いてCD4陰性CD8陽性細胞が分離された。前記細胞は106個/mLの濃度で300ng/mLIL−15と5%ヒトAB型血清とが添加されたX−VIVO(商標)15培地で培養が開始され、総細胞数1×106個に調製後、HLA−A*24:02拘束性の以下の4種のペプチド及びCD28免疫ビーズが添加された培地にて初回刺激が行われた。添加されたペプチドは、(1)WT−1特異的変異型ペプチド CYTWNQMNL、(2)CMVpp65ペプチド QYDPVAALF、(3)hTERT特異的ペプチド VYGFVRACL、及び、(4)survivin−2B特異的ペプチド AYACNTSTLの4種類であった。さらに初回刺激後7日目に同様の刺激を行った後、初回刺激後12日目まで培養された。刺激時には、ペプチドに加えて、ビオチン化CD28抗体とビーズとの複合体がビーズ:細胞比4:1の濃度で添加された。前記細胞は、至適細胞濃度106個/mLとなるよう2〜3日に1回ずつ希釈されながら、初回刺激から12日間培養増幅された。
図6AないしDは、FITC標識抗CD3抗体と、PE標識HLA−A*24:02WT−1(mu)−テトラマーと、APC標識抗CD8抗体とで染色し、CD3+ゲートを通過した細胞のうち、PE及びAPCによる2次元フロー・サイトメトリー解析の結果図である。図6AないしDの結果図の縦軸はPE標識の蛍光強度で、横軸はAPC標識の蛍光強度である。総細胞数が1×106個に調製された後、WT−1特異的変異型ペプチド CYTWNQMNL及び抗CD28免疫ビーズによって初回刺激が行われ、さらに初回刺激後7日目に同様の刺激を行い、初回刺激後12日目まで培養された臍帯血由来CD8陽性細胞について、FITC標識抗CD3抗体由来、PE標識HLA−A*WT−1−テトラマーと、APC標識抗CD8抗体とで染色が行われた。CD3+ゲートを通過した細胞のうち、WT−1ペプチド特異的テトラマー陽性細胞は約0.89%であった(図6A)。HLA−A*24:02CMVpp65ペプチドと抗CD28免疫ビーズとによって図6Aの実験と同じ日数培養され、染色された臍帯血由来CD8陽性細胞について、初回刺激後12日目にCD3+ゲートを通過した細胞のうち、CMVpp65特異的テトラマー陽性細胞は約0.66%であった(図6B)。hTERT由来ペプチド及び抗CD28免疫ビーズによって図6Aの実験と同じ日数培養され、染色された臍帯血由来CD8陽性細胞について、初回刺激後12日目にCD3+ゲートを通過した細胞のうち、hTERT特異的テトラマー陽性細胞は約0.95%であった(図6C)。survivin−2B由来可溶性ペプチド及び抗CD28免疫ビーズによって図6Aの実験と同じ日数培養され、染色された臍帯末梢血由来CD8陽性細胞について、培養開始12日目にCD3+ゲートを通過した細胞のうち、survivin−2B特異的テトラマー陽性細胞は約1.19%であった(図6D)。ペプチド特異的CTL誘導処理が施されずに図6Aないし図6Dの実験と同じ日数培養され、染色された臍帯血由来CD8陽性細胞では、初回刺激後12日目にCD3+ゲートを通過した細胞のうち、WT1ペプチド特異的テトラマー陽性細胞は約0.58%であった(図6E)。PE標識ペプチド−テトラマーを混合しないで、FITC標識抗CD3抗体と、APC標識抗CD8抗体とを混合して染色されたサンプルでは、CD3+ゲートを通過した細胞のうち、PEの発光波長での蛍光を示す細胞は0.05%であった(図6F)。
Claims (11)
- 抗CD28抗体と、該抗CD28抗体が固相化された固体支持体と、MHCクラスI分子と結合可能な可溶性ペプチドとを含むことを特徴とする、細胞傷害性T細胞誘導用組成物。
- 前記固体支持体は細胞培養容器であることを特徴とする、請求項1に記載の細胞傷害性T細胞誘導用組成物。
- 前記MHCクラスI分子と結合可能な可溶性ペプチドは、患者のHLA適合型のHLA複合体によって抗原として提示され、前記細胞傷害性T細胞に認識されることを特徴とする、請求項1又は2に記載の細胞傷害性T細胞誘導用組成物。
- 請求項3に記載の細胞傷害性T細胞誘導用組成物を含み、前記MHCクラスI分子と結合可能な可溶性ペプチドは、腫瘍細胞の特異的抗原タンパク質のアミノ酸配列の一部を含み、前記細胞傷害性T細胞は前記腫瘍細胞を認識することを特徴とする、腫瘍治療用医薬品組成物。
- 前記腫瘍細胞の特異的抗原タンパク質はWT−1であることを特徴とする、請求項4に記載の腫瘍治療用医薬品組成物。
- 請求項3に記載の細胞傷害性T細胞誘導用組成物を含み、前記MHCクラスI分子と結合可能な可溶性ペプチドは、ウイルスの特異的抗原タンパク質のアミノ酸配列の一部を含み、前記細胞傷害性T細胞は前記ウイルス感染細胞を認識することを特徴とする、ウイルス疾患治療用医薬品組成物。
- 前記ウイルスの特異的抗原タンパク質はサイトメガロウイルスのpp65タンパク質であることを特徴とする、請求項6に記載のウイルス疾患治療用医薬品組成物。
- 造血幹細胞由来のCD8陽性細胞に請求項1又は2に記載の細胞傷害性T細胞誘導用組成物を曝露して得られる、前記MHCクラスI分子と結合可能な可溶性ペプチドを認識する細胞傷害性T細胞を含むことを特徴とする、医薬品組成物。
- 前記造血幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞及び人工多能性幹(iPS)細胞からなるグループから選択されるいずれかの幹細胞由来の造血幹細胞と、臍帯血由来の造血幹細胞と、末梢血由来の造血幹細胞と、骨髄血由来の造血幹細胞とからなるグループから選択されることを特徴とする、請求項8に記載の医薬品組成物。
- (1)胚性幹細胞、成体幹細胞及び人工多能性幹(iPS)細胞からなるグループから選択されるいずれかの幹細胞由来の造血幹細胞と、臍帯血由来の造血幹細胞と、末梢血由来の造血幹細胞と、骨髄血由来の造血幹細胞とからなるグループから選択される少なくとも1種類の造血幹細胞からCD8陽性細胞を優占的に増殖させるステップと、
(2)前記CD8陽性細胞に、請求項1又は2に記載の細胞傷害性T細胞誘導用組成物を曝露させるステップと、
(3)前記MHCクラスI分子と結合可能な可溶性ペプチドを認識する細胞傷害性T細胞を培養するステップとを含むことを特徴とする、細胞傷害性T細胞を含む医薬品組成物の製造方法。 - 前記MHCクラスI分子と結合可能な可溶性ペプチドは、ヒトWT−1タンパク質か、サイトメガロウイルスのpp65タンパク質かのアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項10に記載の細胞傷害性T細胞を含む医薬品組成物の製造方法。
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