JP2008092951A - アデノウィルスおよびaavの精製 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】アデノウイルス感染細胞を細胞溶解し、クロマトグラフィ材料との接触から生ずる、ウィルスに対する、特にウィルスの表面成分に対する何らかの損傷が最小にされるかまたは排除されるような様式で、そのようなウィルスを適当なクロマトグラフィ材料と接触させるための改良された方法。その結果は、治療的適用、例えば遺伝子導入/治療処置において使用するために適当な活性な(感染性の)ウィルスの商業的水準の量を迅速に且つ有効に精製することができる。
【選択図】なし
Description
本発明は、特に治療的適用における使用のための、活性な(感染性の)アデノウィルスおよびAAVの大規模な量の精製に関する。特に、本発明は適当なクロマトグラフ材料との接触から生ずる、ウィルスに対する、特にその表面成分に対する何らかの損傷を最小にするかあるいは排除するような様式で、そのようなウィルスを適当なクロマトグラフ材料と接触させるための改良された方法を提供する。その結果は、治療的適用、例えば遺伝子導入/治療処置において使用するために適当な活性な(感染性の)ウィルスの商業的水準量を迅速に且つ効率的に精製するその能力である。
病気の分子治療は治療上の利益を与えるために関連者の細胞への核酸の投与をしばしば包含する。最も普通には、ウィルスの自然のままの感染性の利点を取り入れそして細胞への異種核酸を移送する(遺伝子導入)それらの能力を取り入れる組み換え体ウィルスが技術的に検討される。そのような組み換え体ウィルスベクターの普及した使用は、そのようなウィルスのデザインおよび生産のための戦略により左右される。
本発明は、特に治療用途のための、感染性アデノウィルスおよびAAVの商業的に有用な量の精製のための方法に向けられている。
本発明は、特に遺伝子治療を包含する、遺伝子導入のような、治療適用において使用するための活性な(感染性の)アデノウィルスおよびアデノ随伴ウィルス(AAV)の精製のための大きな規模に適合することが出来るクロマトグラフィ分画化方法に向けられている。本発明のクロマトグラフィ方法は、ウィルス精製の密度勾配超遠心分離の現在の、大規模にすることが出来ない(non−scaleable)方法に代わって使用されそして工業的規模で活性な(感染性の)ウィルスの生産を可能にすることが意図される。該2種のウィルスの精製のためのデザイン戦略は相互に関連している。上に記載したように、AAVの増殖は、最も普通にはアデノウィルスによって提供されるヘルパーウィルス成分の存在を必要とする。AAVの精製はアデノウィルスの汚染の故に問題があった。
上に記載したように、たんぱく質または他のウィルスの精製において日常的に使用されているような慣用のクロマトグラフィ方法および材料をアデノウィルスの精製に適合させようとする先行技術の試みは成功しなかった。そのような方法を適用するにあたって、損傷からアデノウィルスを保護するためにそして特に感染性のために必要なそのマクロ分子成分に対して保護するために十分な注意が払われなかったと信じられる。理論に関して制限されることなしに、“繊維”として知られているたんぱく質種を最も特定的に含む、特有のアデノウィルスたんぱく質は、感染中に標的細胞へのアデノウィルスの結合において包含される。そのようなたんぱく質の多くのコピーが各々のアデノウィルス上に見い出されることが出来るけれども、ウィルス感染性は大抵の細胞タイプに対して相対的に低くそしてしたがって、例えば繊維分子または他のウィルスマクロ分子の小さい部分でさえ、それに対しての損傷は、首尾のよい感染の確立を実質的に防ぐ可能性がある。それ故に、高い感染性を維持することは、遺伝子治療のためのような治療的用途のために意図されるアデノウィルスベクターの商業的規模の生産に関してかなり重要なことである。
AAV−感染細胞の初期の溶解は、感染性ウィルス粒子を放出するために、細胞を物理的に処理するよりもむしろ化学的にまたは酵素的に処理する方法を介して行われることが出来る。そのような方法は、宿主細胞、非カプセル化または不完全なアデノウィルスDNAを酵素的に分解させるために(ベンゾナーゼR(benzonaseR):DNAse(デオキシリボヌクレアーゼの略)のような)ヌクレアーゼの使用を包含する。トリプシンのようなたんぱく質分解酵素は宿主細胞、アデノウィルスまたは遊離のAAVたんぱく質を酵素的に分解するために使用されることが出来る。当業界に知られている洗浄剤、界面活性剤及び他の化学剤はまた、単独で又は酵素処理と組み合わせて使用されることが出来る。
Tween−80およびトリプシンの存在下に、アデノウィルスでまた感染されているAAV感染293細胞の加圧溶解および溶解産物中のウィルスの回収;0.45μmまたは0.8μmの酢酸セルロースフィルターを通過させての濾過を介して溶解産物の清澄化;セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、そこで、結合されたAAVはpH6.4の100〜135mMの燐酸塩中の樹脂から溶離される;MemSepRカートリッジを用いるCHA溶離液のDEAEイオン交換クロマトグラフィ、そこで、結合されたAAVは200mMの塩(pH7.5の燐酸塩緩衝液)中の樹脂から溶離される;DEAE溶離液のCellufineRサルフェートクロマトグラフィ、そこで、結合されたAAVは425mMの塩(燐酸塩緩衝化食塩水、pH7.5)中の樹脂から溶離される;そして場合により亜鉛キレートクロマトグラフィ、そこでAAVは流通(flow−through)分画(Hepes緩衝液、pH7.5)において回収される。
(A.細胞からのアデノウィルスの抽出)
ヒトの胎児細胞系(293)がアデノウィルスを増殖するために用いられた。細胞単層が広範な細胞変性効果(CPE)を示すまでウィルス感染細胞をインキュベートした。通常の感染時間は48〜60時間であった。燐酸塩緩衝化食塩水(PBS)中に細胞を収穫しそして1000xgでの遠心分離により収集した。さらに使用するために細胞ペレットを−80℃で凍結させるかまたは0.1%Tween−80、10%グリセロール、2mMのMgCl2および50μmのZnCl2を含有するPBS中に再懸濁させた。再懸濁の後に1000psiでミクロ流動化器(Microfluidiser)(マサチューセッツ州ニュートンのMicrofluidics製のModel HC5000)を用いて細胞を溶解しそして室温で1時間ベンゾナーゼ(benzonase)(2500単位benzonaseR/108細胞)を用いて溶解産物をインキュベートした。細胞破片を除くために、溶解産物は、それを(真空でなしに)ガラスウール中に通過させることによりあるいは3.0μmガラス繊維フィルター(カリフォルニア州Sierra Court−DublinのMircoFiltration Systems製#C300A090C)中を通過させる真空濾過により清澄化された。次にこれは0.8μm酢酸セルロースフィルター(カリフォルニア州SierraCourt−DublinのMicroFiltration Systems製#CD80A090C)を用いて濾過された。清澄化の後に、溶解産物は直接にクロマトグラフィにかけられるか、あるいはクロマトグラフィにかける前に、Minitan限外濾過システム(マサチューセッツ州ベッドフォードのMillipore製#XX42MT060)を用いて追加の濾過工程に付された。
(上記のとおりにして造られた)アデノウィルスで感染された293細胞からの溶解産物は以下の緩衝液(燐酸塩緩衝化食塩水(PBS)、0.05%Tween−80、10%グリセロール、50μMのZnCl2)中で300ml/分から400ml/分までの変化させる流速でMinitan限外濾過システム(マサチューセッツ州ベッドフォードのMillipore製#XX42MT060)中に通過された。限外濾過の後に感染性単位の回収を測定するために、再調整物(retentate)はウィルス力価アッセイを用いてアデノウィルス感染性について検定し、一方では、再調整物(retentate)中のたんぱく質の回収がBCAアッセイ(イリノイ州ロックフォードのPierce Chemical Co.の#23220)を用いて測定された。
表1はアデノウィルス感染された細胞についての溶解の方法としてミクロ流動化器(microfluidiser)加圧溶解および凍結−解凍の両方を用いての活性アデノウィルスの回収間の比較を提供する。ミクロ流動化器(microfluidiser)および洗浄剤含有緩衝液を用いて、凍結−解凍による溶解と比較して加圧溶解で活性ウィルスの96%回収があった。したがって、ミクロ流動化器は多量の細胞を一回で処理させることを可能にする利点を有する、別の有効な溶解法を提供する。また、ミクロ流動化基が微粒子担体に結合された細胞を有効に溶解することが出来るので、微粒子担体上で細胞を増殖することを包含する細胞培養条件の規模を上昇させるための方法が可能である。細胞の溶解は、宿主細胞、カプセル化されていないかまたは不完全なアデノウィルスの核酸を分解するヌクレアーゼであるBenzonaseRの存在下に起こった。
カラム樹脂がPharmaciaのFPLCを用いてそれらの分離特性について試験された。
(1.DEAEクロマトグラフィ)
(A.アデノウィルス)
10%グリセロール、0.05%Tween−80及び50μMのZnCl2を含有する燐酸塩緩衝化食塩水(PBS)(1.5mMのKH2PO4、150mMのNaCl、5mMのNa2HPO4(pH7.5))を用いてDEAE MemSepR1010HP(Millipore製)カラム(5ml)を平衡化させた。例1において造られたとおりのアデノウィルスで感染された293細胞からの清澄化された溶解産物は、(PBS、10%グリセロール、0.05%Tween−80、2mMのMgCl2、50μMのZnCl2中の)予め平衡化されたカラムに5ml/分の流速で適用された。そのカラムを、10mMのNa2HPO4、100mMのNaClおよび100mMのKClで洗浄しそして10mMのNa2HPO4(pH7.5)、10%グリセロール、0.05%のTween−80および50μMのZnCl2中のKClとNaClとの線形勾配(100mM〜1M)を5ml/分の流速で樹脂に適用した。結合されたたんぱく質を樹脂から溶離しそして5mlの分画で集めた。各々の分画を(下に記載されたとおりにして)(a)アデノウィルスDNAおよび(b)アデノウィルスたんぱく質、について監視した。アデノウィルスのDNAおよびたんぱく質の両方について陽性であった分画を、ウィルス力価アッセイを用いて活性についてさらにアッセイした。
アデノ随伴ウィルスAAVで感染された293細胞からの細胞溶解産物はまた、上記のとおりにしてDEAE MemSepRクロマトグラフィを用いてクロマトグラフィにかけられた。しかしながら、細胞を溶解しそしてカラムを平衡化するために用いられた緩衝液は50mMのNaClおよび1%のNP−40を含有する10mMの燐酸ナトリウム(pH7.5)であった。結合されたたんぱく質はアデノウィルス精製のために上に記載されたとおりの塩勾配を用いて樹脂から溶離された。樹脂から集められた分画は、スロットブロットアッセイ(slot blot assay)を用いてAAV DNAについてアッセイされそしてAAVの3種のキャプシドたんぱく質、VP1、VP2およびVP3に対しての抗体(マサチューセッツ州ベルモントのAmerican Research Productsのカタログ03―65158)を用いて免疫ブロットによりAAVたんぱく質についてアッセイされた。
(A.アデノウィルス)
次に、PBS、10%グリセロール、2mMのMgCl2、50μMのZnCl2および0.05%のTween−80を用いて平衡化されたSuperdexR200HR26/60カラム(Phamacia製)を用いてゲル濾過クロマトグラフィが行われた。アデノウィルスのたんぱく質およびDNAの両方の存在を示した、DEAE樹脂から溶離された分画は貯留され(pooled)そしてかき混ぜセル(Amicon製)を用いて、15mlの容量に濃縮された。1ml/分の流速でサンプルをSuperdexR樹脂に適用しそして溶離中に1.5ml分画を集めた。下に記載されたとおりにして分画をアデノウィルスのDNAおよびたんぱく質についてアッセイした。
(下に記載された)塩化セシウム法により精製されたアデノウィルスは最終塩化セシウムは最終塩化セシウム密度勾配遠心分離の後に、SuperdexR樹脂に直接適用された。これは、通常透析により除去された、サンプル中の塩化セシウムの濃度を減少させるためであった。
図2はアデノウィルスを含有する293細胞溶解産物のクロマトグラフィの後に、DEAE MemSepR樹脂からのアデノウィルスの典型的な溶離プロフィルを示す。すべてのアデノウィルスは該DEAE樹脂に結合しそして(傾斜線により表される)樹脂に適用された塩勾配を用いて溶離された。溶離プロフィル上に示されるように、アデノウィルスは500〜700mMのNaCl間で樹脂から溶離した。このピークは初期全細胞溶解産物中の10%未満の合計たんぱく質を含有した一方で、典型的には60〜100%のアデノウィルス活性が回収された。この溶離された分画の追加の精製は、SuperdexR200樹脂を用いてゲル濾過クロマトグラフィにより達成された。最も高い力価を有した、DEAEカラムからの分画が貯留され、Amiconかき混ぜセルを用いて濃縮されそしてSuperdexR樹脂に適用された。アデノウィルスは、樹脂の空隙容量(void volume)で溶離した(図3)。この分画において約50〜70%のアデノウィルス活性が回収された。カラムから溶離されたすべての分画についてのたんぱく質評価(BCA)(Pierce Chemical Co.)は、ゲル濾過工程が約70%の汚染性たんぱく質を除去したことを示した。図4は先行技術の塩化セシウム法により精製されたアデノウィルスと比較された、DEAEおよびゲル濾過カラムクロマトグラフィの組み合わせにより精製されたアデノウィルスのSDS−PAGE分析を示す。カラムクロマトグラフィにより精製されたアデノウィルスにおいて存在するいくらかの追加のたんぱく質バンドがあった。アデノウィルスの追加の精製を達成させるために、他の樹脂が、これらの汚染性たんぱく質を除去するそれらの能力について評価された。
(方法)
4種のことなるタイプの疎水性樹脂が、例2のアデノウィルス製剤からの汚染物質を除くそれらの能力について試験された:BioRadのMacroprepRカラム(ブチルおよびメチル)およびTosohausR650M(65μm)(フェニルおよびエーテル)。2MのNaClを含有する10mMの燐酸塩緩衝液(pH7.5)中の各々の疎水性樹脂にアデノウィルスを適用した。0.15mMのKH2PO4、15mMのNaCl、0.5mMのNa2HPO4(pH7.5)を用いて、結合されたたんぱく質を樹脂から溶離した。
流通(flow−through)および溶離された分画のSDS−PAGE分析は、これらの樹脂を用いて、他の細胞成分からのアデノウィルスの分離が殆どなかったことを示した。
(方法)
CMおよびSP MemSepRカートリッジ(マサチューセッツ州ベッドフォードのMillipore製)、FractogelRSO3(EM Science製の触手イオン交換樹脂)およびBioRadのMacroprep SRは、25mMのNaCl、2mMのMgCl2、10%グリセロールおよび0.05%のTween−80を含有する10mMの燐酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)中で、別々に平衡化された。0.25%のTween−80を含有する同じ緩衝液中の樹脂の各々にアデノウィルスで感染された293細胞からの細胞溶解産物を適用した。それらのカラムを10mMのNa2HPO4、100mMのNaCl及び100mMのKClで洗浄しそして10mMのNa2HPO4(pH7.5)、10%グリセロール、0.05%のTween−80及び50μMのZnCl2中のKClとNaClの線形勾配(100mM〜1M)を用いて、結合されたたんぱく質を該樹脂から溶離した。Macroprep SRクロマトグラフィの結果を表5に示す。
(方法)
CellufineRサルフェート樹脂(マサチューセッツ州ビバリ−のAmicon製)を用いてのすべての実験のために、アデノウィルスで感染された293細胞からの細胞溶解産物は、また10%グリセロール(w/v)、0.05%のTween−80、2mMのMgCl2および50μMのZnCl2を含有する25mMのNaClおよび10mMの燐酸ナトリウム(pH7.5)の溶液中の該樹脂に適用された。10mMのNa2HPO4(pH7.5)、10%のグリセロール、0.05%のTween−80および50μMのZnCl2中のNaClとKClの線形塩勾配(100mM〜1M)を用いて、結合されたたんぱく質を樹脂から溶離した。流通(flow−through)および溶離された分画の両方はアデノウィルスDNAについてアッセイされそして下に記載されたとおりにして抗アデノウィルス抗体を用いて免疫ブロットされた。
たいていは有意義な精製を提供して来た樹脂、CellufineRサルフェートは、しかしながら、殆どのアデノウィルスが、活性形で存在する精製された生成物には導かなかった。CellufineRサルフェートは、繰り返しグルコース下位単位の第6炭素でエステル化されたスルホネート基を有するセルロースマトリックスからなる(P.F.O’Neil等によるBiotechnology 11(1993)pp173〜178)。この樹脂へのたんぱく質の結合はその多糖類部分を介して生ずると考えられる。アデノウィルスは表面糖たんぱく質を有しない、膜で包まれていないウィルスなので、それはこの樹脂に結合する筈がなく、一方では殆どの細胞の糖たんぱく質は汚染物質として存在するであろうと考えられた。
(方法)
以下のヘパリン樹脂の各々がアデノウィルスを精製するそれらの能力について評価された:Heparin SepharoseRCL6B(Pharmacia製)、Heparin Agarose(4%架橋、Sigma製)、HiTrapRHeparin(Pharmacia製)、Heparin Superflow PlusR(6%架橋、Sterogene製)、Heparin ACTI−MODRカートリッジR(American International Chemical Inc.製)。
CellufineRサルフェートの落胆する性能についての原因をさらに理解するためにヘパリン化重合体(樹脂)の性能がまた調べられた。CellufineRサルフェートと同様に、ヘパリンはスルホン化多糖類でありそして共通している或る結合特性を有すると予想される。しかしながら、CellufineRサルフェートとは異なって、それは種々の細孔寸法の種々の異なるビーズ化された樹脂に架橋された1種またはそれ以上の形で市販されている。表3は種々のヘパリン−結合樹脂のスクリーニングの結果を示す。試験された樹脂のすべてはウィルスサンプルを汚染した細胞たんぱく質(BCAにより測定されたものとして)の>40%を結合したが、しかし活性ウィルスの100%回収を提供した唯一の樹脂は6%架橋されたアガロースであるSterogeneRヘパリンアガロースである。一般的に言えば、約6百万ダルトンの排除限界を有する6%アガロースマトリックスは、例えば4%架橋および約2千万ダルトンの排除限界を有するアガロースゲルよりも小さな細孔を有するであろう。その平均細孔寸法の故に、該6%架橋アガロースはクロマトグラフィ中にアデノウィルスを完全に排除した可能性がある。結果として、活性アデノウィルスは流通(flow−through)分画において回収された。
25mMのNaCl、1mMのMgCl2および10%のグリセロールを含有する10mMの燐酸ナトリウム(pH7.5)を用いてBioRadヒドロキシアパタイトカラムを平衡化した。アデノウィルスまたはAAVを同じ緩衝液中の樹脂に適用した。すべてpH7.5で、燐酸ナトリウムの10mMから300mMに増加させている線形塩勾配を用いて、結合されたたんぱく質を樹脂から溶離した。
一連の分配用重合体(樹脂)が活性なアデノウィルスを精製するその能力についてスクリーニングされた(表4)。試験された重合体の大半は有意義な精製を提供したが、しかしほんの僅かのものだけが活性形で精製されたアデノウィルスの回収に導いたことが見い出された。一般に、MilliporeからのMemSepRカートリッジまたはACTI−MODRカートリッジ(American Chemical International)のような、膜−ベースカートリッジ重合体(樹脂)は活性なウィルスの良好な回収を与えた。これらの製品の優れた性能はこれらのカートリッジにおける膜マトリックスの開いているマクロ細孔構造に起因している可能性があると信じられる(これらの好ましい例において、DEAE基は、MemSepRの場合において重合体マトリックスセルロースに共有的に結合されており、あるいはACTI−MODRの場合においてシリケートに共有結合されている)。(幅において約12,000Å、即ち、1.2μmの開口(細孔)を有する)このタイプのマクロ細孔構造は、(繊維を含む)約140nmの直径を有するアデノウィルス粒子の迅速な通過を可能にする。
遺伝子治療におけるベクターとしてAAVを用いて伴う主な問題の一つは、十分な量のウィルスの生成である。現在、AAVは、一般に活性なウィルスの非常に低い収率(0.3〜5%)を生ずる、密度勾配超遠心分離技術により精製されている。しかしながら密度勾配超遠心分離は、293細胞においてAAVを増殖するのにヘルパーウィルスとして使用されるアデノウィルスから、AAVを分離するのに非常に有効である。本発明はAAVの収率を増大させるために、感染細胞からのAAVの抽出のための改良された方法をカラムクロマトグラフィ工程と組み合わせることを提供する。
ヒトの胎児細胞系(293)はまた、AAVを増殖するために用いられた。ウィルス感染された細胞は、細胞単層が広範な細胞変性効果(CPE)を示すまでインキュベートされた。細胞を収穫しそして1000 x gでの遠心分離により集めた。細胞ペレットはさらに使用するために−80℃で凍結されるかあるいは10mMのNaPi、10mMのNaCl、10%のグリセロール、2mMのMgCl2(pH6.4)中に再懸濁された。
PharmaciaのFPLCを用いて、有効なAAV精製特性について種々のクロマトグラフィ樹脂が試験された。以下のシリーズのクロマトグラフィ工程は特に有用であることが分かった。
(アデノウィルスの存在下に)AAVで感染された293細胞からの細胞溶解産物(例10)は、10mMのNaClおよび10%のグリセロールを含有する10mMのNa2HPO4(pH6.4)で予め平衡化されたBioRadヒドロキシアパタイトカラム上でクロマトグラフィにかけられた。AAVを同じ緩衝液中の該樹脂に適用した。pH6.4で10mMから400mMまでの増大させている燐酸ナトリウムの勾配を用いて樹脂から結合たんぱく質を溶離した。樹脂から集められた分画はスロットブロット(slot blot)アッセイを用いてAAV DNAについてアッセイされそしてAAVの3種のキャプシドたんぱく質のVP1、VP2およびVP3に対する抗体(マサチューセッツ州ベルモントのAmerican Research Productsからのカタログ03−65158)を用いて免疫ブロットによりAAVたんぱく質についてアッセイされた。樹脂から溶離された分画はまた、抗アデノウィルス抗体を用いて免疫ブロットによりアデノウィルス汚染性たんぱく質について分析された。
アデノウィルスからAAVを分離するために、DEAE−MemSepRカラムを用いるイオン交換クロマトグラフィが使用された。DEAE−MemSepR1010HP(Millipore製)カラム(5ml)は、50mMのNaCl、10%のグリセロールを含有する10mMの燐酸塩緩衝液(pH7.5)で平衡化された。(上記)ヒドロキシアパタイトカラムから溶離されたAAV含有分画は貯留されそしてDEAE樹脂の平衡化のために用いられたと同じ緩衝液中に透析された。10mMのNa2HPO4(pH7.5)および10%のグリセロール中のKClおよびNaClの線形塩勾配(50mM〜2M)が5ml/分の流速で樹脂に適用された。結合されたたんぱく質は、樹脂から溶離されそして2.5ml分画に集められた。AAVは200mMの塩で溶離した一方で、アデノウィルスは500〜700mM塩で溶離した。各分画は、a)AAVたんぱく質(クーマシーブルー染色および免疫ブロット);b)AAV DNA;c)汚染性アデノウィルスたんぱく質およびd)感染性、について監視された。
10%グリセロールを含有するPBSを用いてCellufineRサルフェート樹脂を平衡化した。AAVのたんぱく質およびDNAを含有するDEAE樹脂から溶離された分画を貯留しそして1ml/分の流速で樹脂に適用した。樹脂を250mMのNaClで洗浄しそしてPBS/グリセロール中の0.25〜1MのNaClの線形塩勾配を適用した。この塩勾配を用いて樹脂から溶離された物質および流通(flow−through)分画の両方は、a)AAVたんぱく質(免疫ブロット);b)AAV感染性(力価分析);c)アデノウィルスたんぱく質(免疫ブロット);およびd)アデノウィルス感染性(力価分析)について分析された。使用された緩衝液条件下、AAVは樹脂に結合しそして475mMの塩で溶離された(図9C)。アデノウィルスのたんぱく質およびDNAは流通分画において回収された。
汚染性アデノウィルスのすべてを完全に除去するために、亜鉛キレートクロマトグラフィを用いる追加のクロマトグラフィ工程が使用された。金属とのウィルス粒子(virions)の相互作用はウィルスおよびバクテリアファージの研究から推論された。本発明者の実験室からの以前の研究はアデノウィルスが亜鉛金属親和性カラムに吸着することが出来ることを示した。
標準の組み換え体アデノウィルスまたはAAVウィルスは、3工程遠心分離方法により造られた。感染された細胞は、benzonaseRの存在下に凍結−解凍の3サイクルにより溶解された。溶解産物は4℃で3500rpmで15分間、卓上遠心分離機において遠心分離された。ペレットは捨てられそして上澄液は、1.27g/cm3のCsClおよび1.4g/cm3のCsCl不連続ステップ勾配上に層状に置かれそして1.5時間26,000rpmで遠心分離された。ウィルスバンドを集め、1.34g/mlのCsClと混合しそして60,000rpmで少なくとも2時間遠心分離した。この第1平衡勾配からのウィルスバンドを集め、1.34g/mlのCsClと混合しそして一夜30,000rpmで再遠心分離した。この工程からの最終のウィルスのプールは1%のスクロースを補充した燐酸塩緩衝化食塩水(PBS)に対して広範に透析された。別法として、上に記載されたようなSuperdexR樹脂(Pharmacia製)上でのゲル濾過によりCsClを除去した。
カラム分画を、先ず15分間0.1%のSDSで処理し、次に室温で1時間プロナーゼ(Sigma製)で消化した。消化が完了した後に、フェノール:CHCl3:イソアミルアルコールの1容量で2回抽出し、次に−20℃で20分間氷冷95%エタノールの2容量で沈殿させた。沈殿物を4℃で20分間13,000 x gでペレット化した。サンプルをTE緩衝液(Tris、EDTA)中に再懸濁させた。アデノウィルスDNAの制限酵素消化を行いそして4時間、120Vでまたは一夜35Vで0.8%アガロースゲル上の診断アデノウィルス断片についてその消化物を分析した。
カラム分画を、スロットブロット(slot blot)分析によりAAV DNAについてアッセイした(AAV DNAは、またリポーター遺伝子としてlacZを含有する、マィアミのフロリダ大学のDr.N.Muzycziaにより提供されたベクター構成体中に存在した:図14参照)。サンプルはアデノウィルスを不活性化するために20分間56℃でインキュベートし、次に15分間37℃でDNaseI(デオキシリボヌクレアーゼIの略)で処理して非ウィルス粒子DNAを分解させた。次にDNaseIは10分間68℃での熱処理により不活性化された。サンプルのたんぱく質分解酵素K処理の後に、フェノール/クロロホルムを用いてDNAを抽出しそして3MのNaOAcで沈殿させた。DNAをGene Screen Plus膜に適用しそして予備ハィブリッド形成およびハィブリッド工程形成の後に、P32ランダム標識CMV β−galPvu II 断片を用いて膜をプローブした。サンプル中のAAVの粒子の数は、pTRlacZ DNA標準曲線を用いて計算された。
4〜20%勾配または10〜20%勾配(Daiichi製)ゲルのいずれかを用いて一次元のSDS−PAGEを行った。クーマシーブルーを用いてゲル中のたんぱく質を検出した。免疫ブロットのために、PVDF膜(Novex製)はメタノールで再湿潤されそして10%メタノールを含有する10mMのCAPS(pH11)中に浸された。ゲルは10分間この転移(transfer)緩衝液中で平衡化されそして次にNovex Blot Module中で1時間30Vでブロットされた。転移の後に、膜が1時間TBS(150mMのNaClを含有する20mMのTris−HCl(pH7.5))中の1%乾燥ミルクでブロックされた。ブロックの後に、膜は、抗アデノウィルス抗体(Lee Biomolecular製)でプローブされるかまたは2時間0.1%のBSAを含有する、20mMのTris−HCl、150mMのNaCl(pH7.5)および0.05%のTween−80(TBST)中の抗−VP1、VP2、VP3(AAV)抗体でプローブされた。膜は、20分間、ホースラデイシュペルオキシダーゼ(またの名は、わさびだいこんペルオキシダーゼ)標識化抗マウスIgGでインキュベートされそして免疫反応性バンドは、BM Chemiluminescent Western Blotting DetectionSystem(ベーリングマンハイム製)を用いて化学発光により可視化された。
Claims (20)
- (a)アデノウイルス感染細胞を溶解して活性なアデノウイルスを含む全細胞溶解産物を生成し、
(b)該溶解産物を少なくとも1つのクロマトグラフィーマトリックスに適用し、そして
(c)全細胞溶解物のアデノウイルス活性の60〜100%を有するアデノウイルス粒子の組成物を回収すること
を含むアデノウイルスの精製方法であって、
該クロマトグラフィーマトリックスが、アニオン交換材料、カチオン交換材料、疎水性相互作用材料、ヒドロキシアパタイト材料、ヘパリン材料、及びゲル濾過材料からなる群から選ばれる、上記方法。 - ステップ(b)に先立って、全細胞溶解物をヌクレアーゼとインキュベートすることを更に含む、請求項1に記載の方法。
- ステップ(b)に先立って、全細胞溶解物を清澄化することを更に含む、請求項1に記載の方法。
- ステップ(b)に先立って、溶解物を清澄化することを更に含む、請求項2に記載の方法。
- ステップ(b)に先立って、全細胞溶解物を限外濾過に付すことを更に含む、請求項1に記載の方法。
- ステップ(b)に先立って、溶解物を限外濾過に付すことを更に含む、請求項2又は4に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼはベンゾナーゼ(Benzonase:商標)である、請求項2に記載の方法。
- ステップ(a)は洗浄剤と加圧溶解の組み合わせを含む、請求項1に記載の方法。
- ステップ(a)は洗浄剤溶解を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記洗浄剤はトゥイーン−80(Tween−80)である、請求項8又は9に記載の方法。
- ステップ(a)は加圧溶解を含む、請求項1に記載の方法。
- 加圧溶解はミクロ流動化器(microfluidizer)を利用する、請求項11に記載の方法。
- (a)アデノウイルス感染細胞を溶解して活性なアデノウイルスを含む全細胞溶解産物を生成し(但し該溶解には繰り返しの凍結−解凍は含まれないものとする)、
(b)該溶解産物を少なくとも1つのクロマトグラフィーマトリックスに適用し、そして
(c)全細胞溶解物のアデノウイルス活性の60〜100%を有するアデノウイルス粒子の組成物を回収すること
を含むアデノウイルスの精製方法であって、
該クロマトグラフィーマトリックスが、アニオン交換材料、カチオン交換材料、疎水性相互作用材料、ヒドロキシアパタイト材料、ヘパリン材料、及びゲル濾過材料からなる群から選ばれる、上記方法。 - (a)アデノウイルス感染細胞を溶解して活性なアデノウイルスを含む全細胞溶解産物を生成し、
(b)該溶解産物を少なくとも1つのクロマトグラフィーマトリックスに適用し、そして
(c)全細胞溶解物のアデノウイルス活性の60〜100%を有するアデノウイルス粒子の組成物を回収する(但し、少なくとも約1mgの活性アデノウイルス粒子は回収される)こと
を含むアデノウイルスの精製方法であって、
該クロマトグラフィーマトリックスが、アニオン交換材料、カチオン交換材料、疎水性相互作用材料、ヒドロキシアパタイト材料、ヘパリン材料、及びゲル濾過材料からなる群から選ばれる、上記方法。 - ステップ(b)は、まず、溶解物をヘパリンクロマトグラフィーマトリックスに適用し、第2に該ヘパリンクロマトグラフィーマトリックスから回収された溶解物をDEAEクロマトグラフィーマトリックスに適用し、第3に該DEAEクロマトグラフィーマトリックスから回収された溶解物をゲル濾過マトリックスに適用することを含む、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜15のいずれか1項の方法により得られるアデノウイルス粒子の組成物。
- 一連の少なくとも2つのカラム分離を含む方法であって、
各分離が、セラミックヒドロキシアパタイト、イオン交換樹脂、親和性基を含有するマクロ細孔樹脂、硫酸化樹脂、ヘパリン化重合体樹脂、及び亜鉛キレート樹脂からなる群から選ばれるクロマトグラフィーマトリックス材料により行われ、
各分離が、アデノ随伴ウイルス(AAV)とアデノウイルスたんぱく質とを含有する細胞溶解産物組成物を、該クロマトグラフィーマトリックス材料と接触させ、次にAAV含有溶離液を該クロマトグラフィーマトリックス材料から回収することを含み、かつ
AAVが、該アデノウイルスたんぱく質から、該一連のカラム分離により分離されて感染性ウイルスとして最終溶離液中に回収される、
上記方法。 - 一連の少なくとも2つのカラム分離を含む方法であって、
各分離が、セラミックヒドロキシアパタイト、イオン交換樹脂、親和性基を含有するマクロ細孔樹脂、硫酸化樹脂、ヘパリン化重合体樹脂、及び亜鉛キレート樹脂からなる群から選ばれるクロマトグラフィーマトリックス材料により行われ、
各分離が、アデノ随伴ウイルス(AAV)とヘルパーウイルスとを含有する細胞溶解産物組成物を、該クロマトグラフィーマトリックス材料と接触させ、次にAAV含有溶離液を該クロマトグラフィーマトリックス材料から回収することを含み、かつ
AAVが、該ヘルパーウイルスから、該一連のカラム分離により分離されて感染性ウイルスとして最終溶離液中に回収される、
上記方法。 - 一連の少なくとも2つのカラム分離を含む方法であって、
各分離が、セラミックヒドロキシアパタイト、イオン交換樹脂、親和性基を含有するマクロ細孔樹脂、硫酸化樹脂、ヘパリン化重合体樹脂、及び亜鉛キレート樹脂からなる群から選ばれるクロマトグラフィーマトリックス材料により行われ、
各分離が、アデノ随伴ウイルス(AAV)を含有する細胞溶解産物組成物を、該クロマトグラフィーマトリックス材料と接触させ、次にAAV含有溶離液を該クロマトグラフィーマトリックス材料から回収することを含み、かつ
AAVが、該細胞溶解産物から、該一連のカラム分離により分離されて、感染性ウイルスとして最終溶離液中に回収される、
上記方法。 - 請求項17〜19のいずれか1項に記載の方法であって、前記一連のカラム分離が、下記:
1)前記組成物をヒドロキシアパタイト樹脂から構成されるクロマトグラフィーマトリックス材料と接触させ、次にAAV含有溶離液を該樹脂から回収すること、
2)該AAV含有溶離液をイオン交換性基を有するマクロ細孔樹脂から構成されるクロマトグラフィーマトリックス材料に適用させ、次に該AAV含有溶離液を該樹脂から回収すること、及び
3)該AAV含有溶離液を、硫酸化樹脂又はヘパリン化重合体樹脂のいずれかから構成されるクロマトグラフィーマトリックス材料に適用させ、次に該AAV含有溶離液を該樹脂から回収すること、
を含み、
AAVが、該組成物から該一連のカラム分離により分離されて、感染性ウイルスとして最終溶離液中に回収される、
上記方法。
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