JP2006225374A - 循環器および神経疾患の患者における細胞治療および組織再生の衝撃波による改良方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】上記患者における患部組織へ幹および/または前駆細胞を漸増させることを目的とする治療手段として衝撃波を用いる。本発明はまた、循環器または神経疾患の患者における組織再生を改良する方法、および患者における循環器または神経疾患の治療方法に関する。本発明はまた、循環器疾患または神経疾患の患者の治療用医薬組成物を製造するための幹および/または前駆細胞の使用であって、患者に幹および/または前駆細胞を投与する前、中または後に衝撃波による治療を施すことを特徴とする。
【選択図】図1
Description
本発明は、循環器疾患または神経疾患の患者における細胞治療を改良する方法であって、該細胞治療が、患者の患部組織を対象とした幹および/または前駆細胞を漸増するための治療手段として衝撃波を用いることにより行われる方法に関する。本発明はまた、循環器疾患または神経疾患の患者における組織再生を改良する方法であって、患者の患部組織を衝撃波を用いて治療することにより、組成再成を改良する方法に関する。また、患者における循環器または神経疾患を治療する方法であって、患者に幹細胞および/または前駆細胞の治療上有効量を投与する方法も提供される。本発明はまた、循環器疾患または神経疾患の患者を治療するための医薬組成物を製造するための幹および/または前駆細胞の使用であって、患者の患部組織の衝撃波による治療を含んでなり患者に幹および/または前駆細胞を投与する前、中または後に衝撃波による治療を施すことを特徴とする、使用にも関する。
骨髄に由来する幹および前駆細胞は、継続的な内皮修復に関与することがある(Kalka et al., 2000)。これらの細胞の流動化障害または枯渇は、内皮機能不全や循環器疾患の進行に影響することがある。実際に、健康なヒトでは、循環する前駆細胞のレベルは、血管機能および累積的な循環器リスクに関する生物マーカーの代わりとすることができる。基礎科学における最近の進歩によって、出産後の新血管形成および心臓再生における内皮幹および前駆細胞の基本的役割も確立された。重篤な虚血後の新血管形成(neorascularization)の改善は、心筋梗塞または四肢虚血の後における、重要な治療上の選択肢である。最近まで、成人における虚血組織の新血管形成は、「新脈管形成(angiogenesis)」と呼ばれる工程である、成熟内皮細胞の移動および増殖に限定されると考えられていた。一方、循環する幹および前駆細胞が虚血部位に戻り、新たな血管の形成に寄与することが、増大する証拠によって示唆されている。原始的内皮前駆細胞(血管芽細胞)からの血管の胚発生と同様に、この工程は「脈管形成(vasculogenesis)」と呼ばれる。循環する幹および前駆細胞の重要性は、それらの漸増を遺伝学的に阻害することにより腫瘍新脈管形成が阻害されるという事実によって明らかにされている。幹および前駆細胞は、血管内皮増殖因子(VEGF)またはストロマ細胞由来因子1(SDF-1)によって、骨髄から血液循環移動させることができる。VEGFおよびSDF-1は両方とも低酸素組織で大きくアップレギュレーションされていることから、VEGFおよびSDF-1は循環する幹および前駆細胞を補充して重大な虚血後の内在修復機構を増強するための帰還シグナルを構成しうることが示唆される。
a) 上記患者における上記疾患の患部組織を衝撃波によって治療し、
b) 幹細胞および/または前駆細胞の治療上有効量を上記患者に投与すること
を含んでなる、方法に関する。
a) 上記患者における上記疾患の患部組織を衝撃波によって治療し、
b) 幹細胞および/または前駆細胞の治療上有効量を上記患者に投与すること
を含んでなる、方法に関する。
循環器疾患または神経疾患の患者における細胞治療を改良するための、衝撃波を発生する衝撃波生成装置の使用であって、細胞治療を衝撃波生成装置の使用の前、中または後に行うことを特徴とする、使用。
したがって、患部組織は好ましくは心臓または骨格筋に位置している。
− CD34 + CD133 + 骨髄由来幹細胞
− CD34 + CD38 - 骨髄由来幹細胞
− CD34 + CD45 + 骨髄由来前駆細胞
− CD34 + KDR + 骨髄由来内皮前駆細胞
− CD34 + CD45 - 骨髄由来間葉幹細胞(MSC)
− eNOS + KDR + CD105 + VE-カドヘリン + vWF + CD45 + 末梢血由来の内皮前駆細胞
− 発生段階特異的胎児性抗原、SSEA-4 + Oct4 + 胚幹細胞
− CD34 + CD133 + 臍帯血由来幹細胞
− CD34 + CD45 + 臍帯血由来幹細胞
a. 幹/前駆細胞の漸増を高めることは、高齢個体および循環器危険因子を有する患者における自家細胞治療後の臨床効果を改良するための新規なターゲットであり、
b. 衝撃波を用いて標的組織を治療することによって、新脈管形成支持因子(pro-angiogenic)、化学誘引因子および生存支持因子(pro-survival factors)の高レベルの発現を回復することができ、
c. 自家細胞治療の前に衝撃波を単回または反復投与することによる慢性的損傷組織の治療により、細胞治療後の臨床効果が改良されること
を明らかにした。
実施例
1. 末梢血から内皮前駆細胞を調製するための出発材料
内皮前駆細胞を調製するための出発材料として、末梢血を採取してヘパリンモノベット(monovettes)(10ml)に集めた。
下記の材料を、以下の実施例で用いた。
カルシウムおよびマグネシウムを含まないダルベッコのリン酸緩衝食塩水(カタログ番号H-15-002)を、注射用の細胞を懸濁するのに用いた。PAAは、Laboratories GmbH (パッシング、オーストリア)から購入した。EGM Bullet Kit (EBM培地)(カタログ番号CC-3124)および1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニンを標識した、アセチル化した低密度リポタンパク質(Dil-Ac-LDL)(カタログ番号#4003)は、CellSystems(サンカタリネン、ドイツ)から入手した。ウシ胎児血清(カタログ番号10270-106)は、Invitrogen GmbH(カールスルーエ、ドイツ)から得た。Biocoll Separating Solution, Density: 1.077(カタログ番号L6115)は、Biochrom AG(ベルリン、ドイツ)から購入した。ヒトフィブロネクチン、1mg/ml(カタログ番号F-0895)およびUlex europaeus由来のレクチン(カタログ番号L-9006)は、Sigma(タウフキルヒェン、ドイツ)から購入した。ヒト組換え血管内増殖因子(VEGF)(カタログ番号100-20)は、Cell Concepts (ウムキルヒ、ドイツ)から入手した。EDTA二ナトリウム塩二水和物(カタログ番号A1104)は、AppliChem(ダルムシュタット、ドイツ)から入手した。TURK'S溶液(カタログ番号1.09277.0100)は、Merck(ダルムシュタット、ドイツ)から購入した。
2.1 末梢血から内皮前駆細胞の単離
フィコール勾配遠心分離を用いて、新たに採取した末梢血または血液供与センター由来の軟膜から、単核細胞(MNC)を分離する。最初に、15mlのBiocoll分離溶液を、50ml試験管に供給する。末梢血(PB)をPBSにて希釈する(PB 1:1または軟膜1:4)。希釈した血液25mlを、慎重かつゆっくりとBiocoll分離溶液15ml上に重層する。試験管を、800xgにて室温にて20分間ブレーキなしで遠心分離する。これは、赤血球および顆粒球(ペレット)および上部の血清相における血小板から、中間相における単核細胞を分離する上で重要な工程である。一方、ウェルを10μg/mlのヒトフィブロネクチン/PBSでコーティングし、ウェルを室温で少なくとも30分間インキュベーションする。単核細胞を、中間相から慎重にピペットで採取して新しい50ml試験管に移す。PBSを50mlになるまで加えて、細胞を洗浄する。細胞を、800xgで室温にて(ブレーキをかけながら)10分間遠心分離した。上清を除いて、細胞ペレットを50ml PBSに再懸濁した。細胞を800xgで室温にて(ブレーキをかけながら)10分間遠心分離し、上清を除いて、細胞ペレットを10ml PBSに再懸濁した。細胞の一部(50μl)をTURK'S溶液で希釈し(1:10)、計数した。PBSを50ml試験管における残りの細胞に加えて、細胞を再度洗浄した後、800xgで室温にて(ブレーキをかけながら)10分間遠心分離した。洗浄工程は少なくとも3回行うべきであるが、上清が透明になるまで繰り返すべきである(全体で3-5回)。
EPC をPBSで洗浄し、トリプシン処理した後、反応を血清含有RPMI培地で停止した。分離したEPCを再度PBSで洗浄し、PBSで希釈したCM-Dil(分子プローブ)(1:100)と37℃で5分間インキュベーションした後、氷上で15分間インキュベーションした。洗浄後、1x106個のCM-Dilを標識したEPCを、衝撃波療法で予備治療したヌードラットの頸静脈に注射した。
衝撃波を、等級付けした容量のフラックス密度(0.13-0.64mJ/mm2; 3Hz; 500回の衝撃数)でヌードラットの右後上肢に加えた。100回の衝撃の後毎に、焦点を2mm遠位移動させながら、エネルギーを上肢に集めた。
24時間後に投与されるVEGF受容体1または2陽性の幹および前駆細胞の化学誘引因子である、VEGFのような新脈管形成支持増殖因子を、衝撃波治療がアップレギュレーションするかどうかを評価するために、衝撃波治療を行った。ヌードラットの右後肢を、0.13、0.22、0.43および0.64mJ/mm2のフラックス密度で処理した(図1)。左後肢を、ネガティブコントロールとして用いた(0mJ/mm2)。24時間後に、衝撃波によって誘導されたVEGFタンパク質発現のアップレギュレーションを、ウェスタンブロット分析により処理対未処理後肢の間にて分析した。0.43mJ/mm2までのフラックス密度では、衝撃波処理対未処理肢の間に好ましいVEGFタンパク質発現比が得られ、VEGFタンパク質発現が少なくとも2倍に誘導されることが分かった。最良の比率(2倍を超過する誘導)は、0.22mJ/mm2を用いることによって得た。0.64mJ/mm2より高いフラックス密度はまた、VEGFタンパク質発現のバックグラウンドレベルを強力に高めたので、処理特異的なVEGFタンパク質誘導を得るには不十分な比率が得られた。これらのデーターは、対側後肢の非特異的VEGFタンパク質誘導を回避するため、閾値を上回る衝撃波処理を行うべきでないことを示唆している。
衝撃波によって誘導されるVEGFのような化学誘引因子のアップレギュレーションが、実際に全身投与したヒトEPCの漸増を高める可能性があるという仮定をテストするため、EPCを赤色蛍光細胞トラッカーで標識して、右後肢の衝撃波療法の24時間後に静脈内に注入した。冷凍切片でのVEGF染色についての最良の結果は0.43mJ/mm2のエネルギーを用いて得られたので、以下の実験を同一のフラックス密度を用いて行った。
1. Kalka C, Masuda H, Takahashi T, Kalka-Moll WM, Silver M, Keaney M, Li T, Isner JM, Asahara T. 「新血管形成治療のための、エクス・ビボで膨張した内皮前駆細胞の移植」Proc Natl Acad Sci USA. 2000; 97: 3422-7.
2. Heeschen et al., 2004, Circulation 109(13): 1615-22.
3. Heeschen et al., 2003, Circulation 107(4): 524-30.
4. Lee at al., 2000, NEJM 342:626-33
5. Ogden JA, Toth-Kischkat A, Schultheiss R. 「衝撃波療法の原理」Clin Orthop. 2001:8-17.
6. Maier M, Milz S, Tischer T, Munzing W, Manthey N, Stabler A, Holzknecht N, Weiler C, Nerlich A, Refior HJ, Schmitz C.「イン・ビボ動物モデルにおける正常な骨への体外衝撃波適用の影響。シンチグラフィー、MRIおよび組織病理学」J Bone Joint Surg Br. 2002; 84:592-9.
7. Kruger A, Ellerstrom C, Lundmark C, Christersson C, Wurtz T.「骨芽細胞漸増のマーカーであるRP59は原始的間葉細胞、赤血球系細胞、および骨髄巨核球にも検出される」Dev Dyn 2002; 223:414-8.
8. Wang CJ, Huang HY, Pai CH.「腱-骨接合部における衝撃波による新血管形成の増加; イヌでの実験」J Foot Ankle Surg. 2002; 41:16-22.
9. Wang CJ, Wang FS, Yang KD, Weng LH, Hsu CC, Huang CS, Yang Lc.「衝撃波療法は腱-骨接合部に新血形成を誘発する。ウサギでの研究」J Orthop Res. 2003; 21:984-9.
10. Wang FS, Wang CJ, Sheen-Chen SM, Kuo YR, Chen RF, Yang KD.「スーパーオキシドは、ERK依存性骨形成転写因子(CBFA1)および前骨芽細胞の、間葉細胞への分化の衝撃波による誘導を伝達する」J Biol Chem. 2002;277:10931-7.
11. Chen YJ, Wurtz T, Wang CJ, Kuo YR, Yang KD, Huang HC, Wang FS.「ラットにおける部分欠損の衝撃波によって促進される骨再生の初期段階における、間葉幹細胞の漸増およびTGF-β1およびVEGFの発現」J Orthop Res. 2004; 22:526-34.
12. Nishida T et al.「体外心臓衝撃波療法はイン・ビボでの虚血によって誘発されるブタの心筋障害を顕著に改善する」Circulation 2004; 110:3055-3061.
13. Schratzberger P, Schratzberger G, Silver M, Curry C, Keaney M, Magner M, Alroy J, Adelman LS, Weinberg DH, Ropper AH, Isner JM.「虚血性末梢ニューロパシーでのVEGF遺伝子導入の好ましい効果」Nat Med. 2000 Apr; 6(4):405-13.
Claims (85)
- 循環器疾患または神経疾患の患者における細胞治療の改良方法であって、前記患者における前記疾患の患部組織を衝撃波によって治療することを含んでなり、前記組織が細胞治療の標的とされている、方法。
- 前記疾患が循環器疾患である、請求項1に記載の方法。
- 前記循環器疾患の病因が非虚血性である、請求項2に記載の方法。
- 前記循環器疾患が拡張型心筋症である、請求項3に記載の方法。
- 前記循環器疾患の病因が虚血性である、請求項2に記載の方法。
- 前記循環器疾患が心筋梗塞または虚血性心筋症である、請求項5に記載の方法。
- 前記疾患が神経疾患である、請求項1に記載の方法。
- 前記神経疾患が末梢ニューロパシーまたはニューロパシー痛である、請求項7に記載の方法。
- 前記患部組織が心臓または骨格筋にある、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1つの化学誘引物質因子の発現が、前記患者における患部組織において誘発される、請求項1に記載の方法。
- 上記の少なくとも1つの化学誘引物質因子が、血管内皮増殖因子(VEGF)またはストロマ細胞由来因子1(SDF-1)である、請求項10に記載の方法。
- 前記衝撃波が体外衝撃波である、請求項1に記載の方法。
- 循環器疾患または神経疾患の患者における組織再生の改良方法であって、
a) 前記患者における前記疾患の患部組織を衝撃波によって治療し、
b) 幹細胞および/または前駆細胞の治療上有効量を前記患者に投与すること
を含んでなる、方法。 - 前記疾患が循環器疾患である、請求項13に記載の方法。
- 前記循環器疾患の病因が非虚血性である、請求項14に記載の方法。
- 前記循環器疾患が拡張型心筋症である、請求項15に記載の方法。
- 前記循環器疾患の病因が虚血性である、請求項14に記載の方法。
- 前記循環器疾患が心筋梗塞または虚血性心筋症である、請求項17に記載の方法。
- 前記疾患が神経疾患である、請求項13に記載の方法。
- 前記神経疾患が末梢ニューロパシーまたはニューロパシー痛である、請求項19に記載の方法。
- 前記患部組織が心臓または骨格筋にある、請求項13に記載の方法。
- 少なくとも1つの化学誘引物質因子の発現が患者の損傷組織において影響を受ける、請求項13に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの化学誘引物質因子が、血管内皮増殖因子(VEGF)またはストロマ細胞由来因子1(SDF-1)である、請求項22に記載の方法。
- 前記衝撃波が体外衝撃波である、請求項13に記載の方法。
- 前記幹および/または前駆細胞が胚細胞または臍帯血(vmbrial cord-blood)由来細胞である、請求項13に記載の方法。
- 前記幹および/または前駆細胞が成人細胞である、請求項13に記載の方法。
- 成人幹および/または前駆細胞が、骨髄、末梢血および臓器からなる群から選択される供給源に由来する、請求項26に記載の方法。
- 幹および/または前駆細胞を、全身注入、局所動脈注入、静脈注入を経て、または前記患部組織への直接注射によって投与する、請求項13に記載の方法。
- 患者における循環器疾患または神経疾患の治療方法であって、
a) 前記患者における前記疾患の患部組織を衝撃波によって治療し、
b) 幹細胞および/または前駆細胞の治療上有効量を前記患者に投与すること
を含んでなる、方法。 - 前記疾患が循環器疾患である、請求項29に記載の方法。
- 前記循環器疾患の病因が非虚血性である、請求項30に記載の方法。
- 前記循環器疾患が拡張型心筋症である、請求項31に記載の方法。
- 前記循環器疾患の病因が虚血性である、請求項30に記載の方法。
- 前記循環器疾患が心筋梗塞または虚血性心筋症である、請求項34に記載の方法。
- 前記疾患が神経疾患である、請求項29に記載の方法。
- 前記神経疾患が末梢ニューロパシーまたはニューロパシー痛である、請求項35に記載の方法。
- 前記患部組織が心臓または骨格筋にある、請求項29に記載の方法。
- 少なくとも1つの化学誘引物質因子の発現が、前記患者の組織にて誘発される、請求項29に記載の方法。
- 前記の少なくとも1つの化学誘引物質因子が、血管内皮増殖因子(VEGF)またはストロマ細胞由来因子1(SDF-1)である、請求項38に記載の方法。
- 前記衝撃波が体外衝撃波である、請求項29に記載の方法。
- 前記幹および/または前駆細胞が胚細胞または臍帯血由来細胞である、請求項29に記載の方法。
- 前記幹および前駆細胞が成人細胞である、請求項29に記載の方法。
- 成人幹および/または前駆細胞が、骨髄、末梢血および臓器からなる群から選択される供給源に由来する、請求項42に記載の方法。
- 前記幹および/または前駆細胞を、全身注入、局所動脈注入、静脈注入を経て、または患部組織への直接注入によって投与する、請求項29に記載の方法。
- 循環器疾患または神経疾患の患者を治療するための医薬組成物を製造するための幹および/または前駆細胞の使用であって、前記幹および/または前駆細胞の投与前、中または後に、衝撃波による治療を患者が受けることを特徴とする、使用。
- 前記疾患が循環器疾患である、請求項45に記載の使用。
- 前記循環器疾患の病因が非虚血性である、請求項46に記載の使用。
- 前記循環器疾患が拡張型心筋症である、請求項47に記載の使用。
- 前記循環器疾患の病因が虚血性である、請求項46に記載の使用。
- 前記循環器疾患が心筋梗塞または虚血性心筋症である、請求項49に記載の使用。
- 前記疾患が神経疾患である、請求項45に記載の使用。
- 前記神経疾患が末梢ニューロパシーまたはニューロパシー痛である、請求項51に記載の使用。
- 患部組織が心臓または骨格筋にある、請求項45に記載の使用。
- 少なくとも1つの化学誘引物質因子の発現が、前記患者における患部組織にて誘発される、請求項45に記載の使用。
- 前記少なくとも1つの化学誘引物質因子が、血管内皮増殖因子(VEGF)またはストロマ細胞由来因子1(SDF-1)である、請求項54に記載の使用。
- 前記衝撃波が体外衝撃波である、請求項45に記載の使用。
- 前記幹および/または前駆細胞が胚細胞または臍帯血由来細胞である、請求項45に記載の使用。
- 前記幹および前駆細胞が成人細胞である、請求項45に記載の使用。
- 成人幹および/または前駆細胞が、骨髄、末梢血および臓器からなる群から選択される供給源に由来する、請求項58に記載の使用。
- 前記幹および/または前駆細胞を、全身注入、局所動脈注入、静脈注入を経て、または患部組織への直接注射によって投与する、請求項45に記載の使用。
- 循環器疾患または神経疾患の患者における細胞治療を改良するための、衝撃波を発生する衝撃波生成装置の使用であって、前記衝撃波生成装置の使用の前、中または後に前記細胞治療を行うことを特徴とする、使用。
- 循環器疾患または神経疾患の患者における細胞治療を改良するための、衝撃波を発生する衝撃波生成装置の使用であって、衝撃波を細胞治療の前、中または後に患者に加えるのに適していることを特徴とする、使用。
- 循環器疾患または神経疾患の患者における細胞治療を介した組織再生を改良するための、衝撃波を発生する衝撃波生成装置の使用であって、衝撃波生成装置の使用の前、中または後に細胞治療を行うことを特徴とする、使用。
- 循環器疾患または神経疾患の患者における細胞治療を介した組織再生を改良するための、衝撃波を発生する衝撃波生成装置の使用であって、衝撃波を細胞治療の前、中または後に患者に加えるのに適していることを特徴とする、使用。
- 患者の循環器疾患または神経疾患の治療のための、衝撃波を発生する衝撃波生成装置の使用であって、前記治療が細胞治療をさらに含んでなりかつ前記衝撃波生成装置の使用の前、中または後に前記細胞治療を行うことを特徴とする、使用。
- 患者における循環器疾患または神経疾患の治療のための、衝撃波を発生する衝撃波生成装置の使用であって、前記治療が細胞治療を含んでなりかつ衝撃波を前記細胞治療の前、中または後に患者に加えるのに適していることを特徴とする、使用。
- 循環器疾患または神経疾患の患者を細胞治療によって治療するための医薬組成物を製造するための、幹および/または前駆細胞の使用であって、前記治療がさらに衝撃波を患者に加えることを含んでなる、使用。
- 循環器疾患または神経疾患の患者における細胞治療を改良するための医薬組成物を製造するための、幹および/または前駆細胞の使用であって、細胞治療の前または後に前記患者に衝撃波治療を施すことを特徴とする、使用。
- 循環器疾患または神経疾患の患者における細胞治療を介した組織再生を改良するための医薬組成物の製造のための、幹および/または前駆細胞の使用であって、前記細胞治療の前または後に前記患者に衝撃波治療を施すことを特徴とする、使用。
- 前記医薬組成物が、衝撃波を患者に加える前、中または後に患者に加えるのに適している、請求項67〜69のいずれか一項に記載の使用。
- 前記疾患が循環器疾患である、請求項61〜70のいずれか一項に記載の使用。
- 前記循環器疾患の病因が非虚血性である、請求項71に記載の使用。
- 前記循環器疾患が拡張型心筋症である、請求項72に記載の使用。
- 前記循環器疾患の病因が虚血性である、請求項71に記載の使用。
- 前記循環器疾患が心筋梗塞または虚血性心筋症である、請求項74に記載の使用。
- 前記疾患が神経疾患である、請求項61〜70のいずれか一項に記載の使用。
- 前記神経疾患が末梢ニューロパシーまたはニューロパシー痛である、請求項76に記載の使用。
- 前記細胞治療が心臓または骨格筋にある患部組織を標的とする、請求項61〜70のいずれか一項に記載の使用。
- 少なくとも1つの化学誘引物質因子の発現が、前記患者の患部組織に誘発される、請求項61〜70のいずれか一項に記載の使用。
- 前記少なくとも1つの化学誘引物質因子が、血管内皮増殖因子(VEGF)またはストロマ細胞由来因子1(SDF-1)である、請求項79に記載の使用。
- 前記衝撃波が体外衝撃波である、請求項61〜70のいずれか一項に記載の使用。
- 前記細胞治療に用いる細胞が胚細胞または臍帯血細胞由来の幹および/または前駆細胞である、請求項61〜70のいずれか一項に記載の使用。
- 前記細胞治療に用いる細胞が成人の幹および/または前駆細胞である、請求項61〜70のいずれか一項に記載の使用。
- 前記成人の幹および/または前駆細胞が、骨髄、末梢血、および臓器からなる群から選択される供給源に由来する、請求項83に記載の使用。
- 前記幹および/または前駆細胞が全身注入、局所動脈注入、静脈注入を介して、または患部組織への直接注射によって、細胞治療のために投与される、請求項61〜70のいずれか一項に記載の使用。
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